CN109796526B - 一种大麦HvSnRK1激酶磷酸化调控转录因子HvWRKY3的方法及其应用 - Google Patents

一种大麦HvSnRK1激酶磷酸化调控转录因子HvWRKY3的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大麦HvSnRK1激酶磷酸化调控转录因子HvWRKY3的方法及其应用。本发明保护降解植物中HvWRKY3蛋白的方法，为方法A或方法B。所述方法A为采用蛋白激酶激活植物中的HvSnRK1蛋白。所述方法B为使植物中HvWRKY3蛋白第83位氨基酸和/或第112位氨基酸磷酸化。本发明的发明人通过实验验证了HvSnRK1蛋白能磷酸化HvWRKY3蛋白的S83和S112两个位点，进一步导致HvWRKY3降解；HvWRKY3在大麦对白粉病抗性中起负调控作用，HvSnRK1蛋白能够通过降解HvWRKY3解除HvWRKY3对大麦抗性的负调控作用。本发明对于调控大麦对白粉病抗性研究有重要意义。

Description

一种大麦HvSnRK1激酶磷酸化调控转录因子HvWRKY3的方法及 其应用
技术领域
本发明涉及一种大麦HvSnRK1激酶磷酸化调控转录因子HvWRKY3的方法及其应用。
背景技术
大麦可做食品、饲料和啤酒酿制原料，其世界播种面积仅次于小麦、水稻和玉米，具有重要的经济价值。大麦白粉病是由布氏白粉菌大麦专化型(Blumeriagraminisf.sp.Hordei，简称Bgh)引起的，是大麦主要的真菌病害之一。大麦白粉菌是专化性活体寄生真菌，可侵染大麦植株的地上部分各器官，但以危害叶片和叶鞘为主，严重时可侵染大麦茎秆及穗部。大麦白粉病多发生在潮湿和半潮湿的大麦产区，一般可造成20％-25％的产量损失，而在病害流行的年份里严重损失可达30％。由于大麦种植品种单一、种植密度高及过量施用氮肥等栽培因素，使得大麦白粉病发病日趋严重。
目前对于大麦白粉病的防治仍以喷施化学农药(如三唑类杀菌剂)为主。三唑类杀菌剂可抑制病原真菌麦角甾醇的生物合成，从而降低病原真菌的致病力。但三唑类杀菌剂不仅有杀菌作用，还有植物生长调节作用，会影响作物的产量和品质。同时，大量施用化学农药会带来生产成本增加、环境污染等问题。因此，筛选、培育和推广种植抗病品种，是防治大麦白粉病最经济有效和环保的方法。
大麦对白粉病的抗性包括：一，依赖小种专化抗性抗病基因(如Mla基因)产生的特异性抗性；二，依赖非小种专化抗性抗病基因(如mlo基因)产生的广谱抗性；三，依赖非小种专化抗性抗病基因产生的部分抗性。由于主栽的大麦抗病品种的白粉病抗性往往与当地的白粉菌优势生理小种不同，因此不能产生有效的小种专化抗性；并且大麦白粉菌变异速度快，使得许多一时有效的小种专化抗性抗病基因在短时间内丧失抗性。而运用mlo基因尽管可以使大麦对白粉菌产生高效的广谱抗性，但是同时也会加速作物的细胞凋亡、降低作物对其他病害的防御能力，最终影响作物产量。因此，不断克隆、鉴定和利用新的大麦抗白粉病基因，保障抗源多样化是防治大麦白粉病的有效策略之一。
WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子大家族，通过结合靶标基因启动子区域的顺式作用元件W-box调控基因的表达，参与植物的各种生理活动。大麦HvWRKY3是其成员之一，定位于大麦细胞核中，受大麦白粉菌诱导表达。在大麦叶表皮细胞中瞬时过表达HvWRKY3能抑制大麦对白粉菌的本底抗性，表明HvWRKY3在大麦对白粉病抗性中起负调控作用。蛋白质的翻译后修饰往往对其功能有重要的调节作用，尽管已知HvWRKY3的负调控抗病功能，但其翻译后的磷酸化修饰对其功能的调节作用尚未报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大麦HvSnRK1激酶磷酸化调控转录因子HvWRKY3的方法及其应用。
本发明首先提供了一种蛋白质(命名为突变蛋白质)，是将HvWRKY3蛋白进行如下(a1)和/或(a2)所示的两个点突变得到的：
(a1)第83位氨基酸残基突变为其他氨基酸残基；
(a2)第112位氨基酸残基突变为其他氨基酸残基。
所述蛋白质是将HvWRKY3蛋白进行如下(c1)和/或(c2)所示的两个点突变得到的：
(c1)第83位氨基酸残基突变为丙氨酸；
(c2)第112位氨基酸残基突变为丙氨酸。
所述蛋白质为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：
(d1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d2)由序列表中序列12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d3)由序列表中序列14所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d4)将序列10或序列12或序列14的氨基酸序列经过除第83位氨基酸残基和第112位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列10或序列12或序列14衍生的蛋白质。
与HvWRKY3蛋白相比，突变体蛋白第83位和/或第112位不会被磷酸化，因此不会被降解。
本发明还保护所述蛋白质的编码基因。
所述蛋白质的编码基因为如下(e1)-(e5)中的任一种：
(e1)编码区如序列表中序列9所示的DNA分子；
(e2)编码区如序列表中序列11所示的DNA分子；
(e3)编码区如序列表中序列13所示的DNA分子；
(e4)在严格条件下与(e1)或(e2)或(e3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(e5)与(e1)或(e2)或(e3)或(e4)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
本发明还保护降解植物中HvWRKY3蛋白的方法，为方法A或方法B。
所述方法A包括如下步骤：采用蛋白激酶激活植物中的HvSnRK1蛋白。
所述方法B包括如下步骤：使植物中HvWRKY3蛋白第83位氨基酸和/或第112位氨基酸磷酸化。
所述方法A中，所述蛋白激酶具体可为HvGRIK1蛋白。
本发明还保护一种抑制HvWRKY3蛋白磷酸化的方法(方法C)，包括如下步骤：将HvWRKY3蛋白进行如下(a1)和/或(a2)所示的两个点突变：
(a1)第83位氨基酸残基突变为其他氨基酸残基；
(a2)第112位氨基酸残基突变为其他氨基酸残基。
所述方法C包括如下步骤：将HvWRKY3蛋白进行如下(c1)和/或(c2)所示的两个点突变：
(c1)第83位氨基酸残基突变为丙氨酸；
(c2)第112位氨基酸残基突变为丙氨酸。
所述“抑制HvWRKY3蛋白磷酸化”为“抑制由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白磷酸化”。
本发明还保护一种抑制由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白磷酸化的方法(方法D)，包括如下步骤：将HvSnRK1蛋白第139位氨基酸残基突变为其他氨基酸残基。
所述方法D包括如下步骤：将HvSnRK1蛋白第139位氨基酸残基突变为精氨酸。
本发明还保护一种抑制植物中HvWRKY3蛋白降解的方法(方法E)，包括如下步骤：将HvWRKY3蛋白进行如下(a1)和/或(a2)所示的两个点突变：
(a1)第83位氨基酸残基突变为其他氨基酸残基；
(a2)第112位氨基酸残基突变为其他氨基酸残基；
所述方法E包括如下步骤：将HvWRKY3蛋白进行如下(c1)和/或(c2)所示的两个点突变：
(c1)第83位氨基酸残基突变为丙氨酸；
(c2)第112位氨基酸残基突变为丙氨酸。
所述“抑制植物中HvWRKY3蛋白降解”为“抑制植物中由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白降解”。
本发明还保护一种抑制植物中由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白降解的方法(方法F)，包括如下步骤：将HvSnRK1蛋白第139位氨基酸残基突变为其他氨基酸残基。
所述方法F包括如下步骤：将HvSnRK1蛋白第139位氨基酸残基突变为精氨酸。
本发明还保护所述突变体蛋白质或所述基因或以上任一所述方法在调控植物白粉病抗性和/或制备白粉病抗性改变的植物中的应用。
所述蛋白质或所述基因或所述方法C-方法F中任一方法可以应用于负向调控植物白粉病抗性和/或制备白粉病抗性降低的植物。
所述方法A或方法B可以应用于正向调控植物白粉病抗性和/或制备白粉病抗性提高的植物。
本发明还保护用于抑制由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白磷酸化的物质或用于抑制植物中由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白降解的物质在调控植物白粉病抗性和/或制备白粉病抗性改变的植物中的应用。所述物质具体可为蛋白酶体抑制剂，更具体可为蛋白酶体抑制剂MG132。所述调控为负向调控。所述制备白粉病抗性改变的植物为制备白粉病抗性降低的植物。
本发明还保护用于激活由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白磷酸化的物质或用于激活植物中由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白降解的物质在调控植物白粉病抗性和/或制备白粉病抗性改变的植物中的应用。所述物质具体可为HvGRIK1蛋白。所述调控为正向调控。所述制备白粉病抗性改变的植物为制备白粉病抗性提高的植物。
以上任一所述HvSnRK1蛋白具体可由HvGRIK1蛋白激活。
以上任一所述HvWRKY3蛋白是如下(b1)或(b2)：
(b1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将序列8的氨基酸序列经过除第83位氨基酸残基和第112位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列8衍生的蛋白质。
以上任一所述所述HvSnRK1蛋白是如下(b3)或(b4)：
(b3)由序列表中序列16所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b4)将序列16的氨基酸序列经过除第139位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列16衍生的蛋白质。
以上任一所述HvGRIK1蛋白是如下(b5)或(b6)：
(b5)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b6)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
以上任一所述应用中，激活由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白磷酸化或由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白降解可以得到白粉病抗性增加的植物。
以上任一所述应用中，抑制由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白磷酸化或由HvSnRK1蛋白介导的HvWRKY3蛋白降解可以得到白粉病抗性降低的植物。
以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族植物。所述夜香树族植物可为烟草属植物。所述烟草属植物所述植物具体可为烟草，例如本氏烟。所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为小麦族植物。所述小麦族植物可为大麦属植物。所述大麦属植物所述植物具体可为大麦。
本发明的发明人通过实验验证了HvSnRK1蛋白能磷酸化HvWRKY3蛋白的S83和S112两个位点，这两个位点磷酸化后导致HvWRKY3降解；HvWRKY3在大麦对白粉病抗性中起负调控作用，HvSnRK1蛋白能够通过降解HvWRKY3解除HvWRKY3对大麦抗性的负调控作用。本发明对于调控大麦对白粉病抗性研究有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中体外磷酸化反应。
图2为实施例2中HvSnRK1通过磷酸化S83和S112位点降解HvWRKY3。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pGEX-4T-1载体：GE医疗生命科学，货号：28-9545-49。
pET-32a(+)载体：Novagen，货号：69015-3。
CTAPi-GW-3×Myc载体：参考文献：Bai S,Liu J,Chang C,et al.Structure-Function Analysis of Barley NLR Immune Receptor MLA10Reveals Its CellCompartment Specific Activity in Cell Death and Disease Resistance[J].PLoSPathogens,2012,8(6):e1002752.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
CTAPi-GW-mYFP载体：参考文献：Bai S,Liu J,Chang C,et al.Structure-Function Analysis of Barley NLR Immune Receptor MLA10Reveals Its CellCompartment Specific Activity in Cell Death and Disease Resistance[J].PLoSPathogens,2012,8(6):e1002752.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
CTAPi-GW-3×HA载体：参考文献：Bai S,Liu J,Chang C,et al.Structure-Function Analysis of Barley NLR Immune Receptor MLA10Reveals Its CellCompartment Specific Activity in Cell Death and Disease Resistance[J].PLoSPathogens,2012,8(6):e1002752.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
大肠杆菌BL21(DE3)：Novagen，货号：69450。
大肠杆菌Rosetta(DE3)：Novagen，货号：70954。
农杆菌GV3101：参考文献：Holsters M,Silva B,Van V F,et al.The functionalorganization of the nopaline A.tumefaciens plasmid pTiC58[J].Plasmid,1980,3(2):212.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
本氏烟：参考文献：Macfarlane S A,Davies J W.Plants transformed with aregion of the201-kilodalton replicase gene from pea early browning virusRNA1are resistant to virus infection.[J].Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,1992,89(13):5829.；公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
磷酸反应buffer：20mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM MgCl2，0.1mM CaCl2，50μM ATP，2mMDTT。
实施例1、HvSnRK1磷酸化HvWRKY3
一、重组蛋白GST-GRIK1的制备
1、HvGRIK1重组表达载体的构建：将pGEX-4T-1载体的EcoRI和SalI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列1所示的DNA分子，得到HvGRIK1重组表达载体(已经测序验证)。序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质(HvGRIK1蛋白)。HvGRIK1是拟南芥AtSnRK1上游激酶AtGRIK1在大麦中的同源蛋白，用于激活HvSnRK1激酶活性。
2、将步骤1得到的HvGRIK1重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
3、将步骤2得到的重组菌采用200ml LB液体培养基37℃、220rpm摇荡培养至OD600nm约0.6，向培养体系中加入终浓度0.5mM的IPTG，22℃、220rpm摇荡培养5小时，离心收集菌体。
4、采用GST融合蛋白纯化凝胶Glutathione Sepharose 4B(GE医疗生命科学，货号：17-0756-01)对步骤3收集的菌体进行裂解和蛋白纯化(方法参照产品手册)，得到带有GST标签的重组蛋白GST-GRIK1。
二、重组蛋白GST-SnRK1-KD的制备
1、HvSnRK1-KD重组表达载体的构建：将pGEX-4T-1载体的EcoRI和SalI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列3所示的DNA分子，得到HvSnRK1-KD重组表达载体(已经测序验证)。序列3所示的DNA分子编码序列4所示的蛋白质(HvSnRK1-KD蛋白)。HvSnRK1-KD为仅包含HvSnRK1的KD和UBA结构域的截短蛋白(HvSnRK1全长蛋白可溶性较低)。
2、采用HvSnRK1-KD重组表达载体替代HvGRIK1重组表达载体，按照步骤一的2-4进行操作，得到带有GST标签的重组蛋白GST-SnRK1-KD。
三、重组蛋白WRKY3-His的制备
1、因pET-32a(+)载体中Trx标签编码的肽段含有SnRK1识别底物的共有序列，为避免干扰后续结果分析，对pET-32a(+)载体进行改造。将pET-32a(+)载体中序列5所示的DNA分子替换为序列6所示的DNA分子，得到pET-32aT78D(+)表达载体(已经测序验证)。
2、HvWRKY3重组表达载体的构建：将步骤1得到的pET-32aT78D(+)载体的MscI和SalI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列7所示的DNA分子，得到HvWRKY3重组表达载体(已经测序验证)。序列7所示的DNA分子编码序列8所示的蛋白质(HvWRKY3蛋白)。
3、将步骤2得到的HvWRKY3重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌。
4、将步骤3得到的重组菌采用800ml LB液体培养基37℃、220rpm摇荡培养至OD600nm约0.6，向培养体系中加入终浓度0.1mM IPTG，18℃、220rpm摇荡培养16小时，收集菌体。
5、采用Ni-NTA agrose(Qiagen，货号30210)对步骤4收集的菌体进行裂解和蛋白纯化(方法参照产品手册)，得到带有His标签的重组蛋白WRKY3-His。
四、体外磷酸化反应
按照如下分组进行试验：
(1)将2μg重组蛋白GST-GRIK1和3μg重组蛋白GST-SnRK1-KD在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(2)将3μg重组蛋白WRKY3-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(3)将2μg重组蛋白GST-GRIK1和3μg重组蛋白WRKY3-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(4)将3μg重组蛋白GST-SnRK1-KD和3μg重组蛋白WRKY3-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(5)将2μg重组蛋白GST-GRIK1、3μg重组蛋白GST-SnRK1-KD和3μg重组蛋白WRKY3-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟。
将上述各组磷酸化反应结果通过Phos-tag迁移实验检测(Phos-tag Acrylamide，购自WAKO，货号：AAL-107)。
结果如图1的泳道1-5所示。结果表明，HvSnRK1能在体外磷酸化HvWRKY3。
五、磷酸化位点的确定
1、将步骤四分组中实验组(5)的产品用SDS-PAGE凝胶电泳分离，将WRKY3-His对应条带切下，送质谱分析公司进行质谱鉴定，鉴定出S83、T160和T167三个磷酸化位点，质谱所得磷酸肽段110KRSRESMDTSDSGDGNSDKK129数据仅能推测S112或S115是磷酸化的，由于S112位点符合SnRK1识别底物的共有序列，故推测S112是磷酸化位点而非S115。
2、重组蛋白WRKY3S112A-His的制备
(1)将步骤三的1得到的pET-32aT78D(+)载体的MscI和SalI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列9所示的DNA分子，得到HvWRKY3S112A重组表达载体(已经测序验证)。序列9所示的DNA分子编码序列10所示的蛋白质(HvWRKY3S112A蛋白，HvWRKY3S112A蛋白和HvWRKY3蛋白只有第112位氨基酸不同，其余氨基酸相同；HvWRKY3S112A蛋白第112位氨基酸为丙氨酸，HvWRKY3蛋白第112位氨基酸为丝氨酸)。
(2)采用HvWRKY3S112A重组表达载体替代HvWRKY3重组表达载体，按照步骤三的3-5进行操作，得到带有His标签的重组蛋白WRKY3S112A-His。
3、重组蛋白WRKY3S83A-His的制备
(1)将步骤三的1得到的pET-32aT78D(+)载体的MscI和SalI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列11所示的DNA分子，得到HvWRKY3S83A重组表达载体(已经测序验证)。序列11所示的DNA分子编码序列12所示的蛋白质(HvWRKY3S83A蛋白，HvWRKY3S83A蛋白和HvWRKY3蛋白只有第83位氨基酸不同，其余氨基酸相同；WRKY3S83A蛋白第83位氨基酸为丙氨酸，HvWRKY3蛋白第83位氨基酸为丝氨酸)。
(2)采用HvWRKY3S83A重组表达载体替代HvWRKY3重组表达载体，按照步骤三的3-5进行操作，得到带有His标签的重组蛋白WRKY3S83A-His。
4、重组蛋白WRKY3S83A/S112A-His的制备
(1)将步骤三的1得到的pET-32aT78D(+)载体的MscI和SalI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列13所示的DNA分子，得到HvWRKY3S83A/S112A重组表达载体(已经测序验证)。序列13所示的DNA分子编码序列14所示的蛋白质(HvWRKY3S83A/S112A蛋白，HvWRKY3S83A /S112A蛋白和HvWRKY3蛋白只有第83位和第112位氨基酸不同，其余氨基酸相同；HvWRKY3S83A /S112A蛋白第83位和第112位氨基酸均为丙氨酸，HvWRKY3蛋白第83位和第112位氨基酸均为丝氨酸)。
(2)采用HvWRKY3S83A/S112A重组表达载体替代HvWRKY3重组表达载体，按照步骤三的3-5进行操作，得到带有His标签的重组蛋白WRKY3S83A/S112A-His。
5、按照如下分组进行试验：
(1)将3μg重组蛋白WRKY3S112A-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(2)将2μg重组蛋白GST-GRIK1、3μg重组蛋白GST-SnRK1-KD和3μg重组蛋白WRKY3S112A-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(3)将3μg重组蛋白WRKY3S83A-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(4)将2μg重组蛋白GST-GRIK1、3μg重组蛋白GST-SnRK1-KD和3μg重组蛋白WRKY3S83A-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(5)将3μg重组蛋白WRKY3S83A/S112A-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟；
(6)将2μg重组蛋白GST-GRIK1、3μg重组蛋白GST-SnRK1-KD和3μg重组蛋白WRKY3S83A/S112A-His在30μl磷酸反应buffer中30℃孵育30分钟。
将上述各组磷酸化反应结果通过Phos-tag迁移实验检测(Phos-tag Acrylamide，购自WAKO，货号：AAL-107)。
结果如图1的泳道6-11所示。结果表明，HvSnRK1在体外磷酸化HvWRKY3的主要位点为S83和S112。
实施例2、HvSnRK1磷酸化HvWRKY3促进其降解
一、重组菌GRIK1-3Myc的制备
1、GRIK1-3Myc重组表达载体的构建：将CTAPi-GW-3×Myc载体的重组位点之间的片段替换为序列表的序列1自5’端第1-1281位核苷酸所示的DNA分子，得到GRIK1-3Myc重组表达载体(已经测序验证)。
2、将步骤1得到的GRIK1-3Myc重组表达载体转化农杆菌GV3101，得到重组菌。
3、挑取步骤2得到的重组菌的单菌落，用LB液体培养基28℃、220rpm摇荡培养过夜；次日，按体积比1：20转接到8ml LB液体培养基(含10mM MES和20μM乙酰丁香酮)中，继代培养至OD600nm为1.2-1.5时收集菌体，用重悬液(0.5％MS(w/v)，10mM MES，200μM乙酰丁香酮)重悬菌体至OD600nm为1.5，得到用于注射烟草的带有3×Myc标签的GRIK1-3Myc重组菌液。室温避光静置4小时备用。
二、重组菌SnRK1-YFP的制备
1、SnRK1-YFP重组表达载体的构建：将CTAPi-GW-mYFP载体的重组位点之间的片段替换为序列表的序列15所示的DNA分子，得到SnRK1-YFP重组表达载体(已经测序验证)。序列15所示的DNA分子编码序列16所示的蛋白质(HvSnRK1蛋白)。
2、采用SnRK1-YFP重组表达载体替代GRIK1-3Myc重组表达载体，按照步骤一的2和3进行操作，得到用于注射烟草的带有mYFP标签的SnRK1-YFP重组菌液。室温避光静置4小时备用。
三、重组菌SnRK1K139R-YFP的制备
1、SnRK1K139R-YFP重组表达载体的构建：将CTAPi-GW-mYFP载体的重组位点之间的片段替换为序列表的序列17所示的DNA分子，得到SnRK1K139R-YFP重组表达载体(已经测序验证)。序列17所示的DNA分子编码序列18所示的蛋白质(HvSnRK1K139R蛋白，HvSnRK1K139R蛋白和HvSnRK1蛋白只有第139位氨基酸不同，其余氨基酸相同；HvSnRK1K139R蛋白第139位氨基酸为精氨酸，HvSnRK1蛋白第139位氨基酸为赖氨酸)。
2、采用SnRK1K139R-YFP重组表达载体替代GRIK1-3Myc重组表达载体，按照步骤一的2和3进行操作，得到用于注射烟草的带有mYFP标签的SnRK1K139R-YFP重组菌液。室温避光静置4小时备用。
四、重组菌WRKY3-3HA的制备
1、WRKY3-3HA重组表达载体的构建：将CTAPi-GW-3×HA载体的重组位点之间的片段替换为序列表的序列7所示的DNA分子，得到WRKY3-3HA重组表达载体(已经测序验证)。
2、采用WRKY3-3HA重组表达载体替代GRIK1-3Myc重组表达载体，按照步骤一的2和3进行操作，得到用于注射烟草的带有3×HA标签的WRKY3-3HA重组菌液。室温避光静置4小时备用。
五、重组菌WRKY3S112A-3HA的制备
1、WRKY3S112A-3HA重组表达载体的构建：将CTAPi-GW-3×HA载体的重组位点之间的片段替换为序列表的序列9所示的DNA分子，得到WRKY3S112A-3HA重组表达载体(已经测序验证)。
2、采用WRKY3S112A-3HA重组表达载体替代GRIK1-3Myc重组表达载体，按照步骤一的2和3进行操作，得到用于注射烟草的带有3×HA标签的WRKY3S112A-3HA重组菌液。室温避光静置4小时备用。
六、重组菌WRKY3S83A-3HA的制备
1、WRKY3S83A-3HA重组表达载体的构建：将CTAPi-GW-3×HA载体的重组位点之间的片段替换为序列表的序列11所示的DNA分子，得到WRKY3S83A-3HA重组表达载体(已经测序验证)。
2、采用WRKY3S83A-3HA重组表达载体替代GRIK1-3Myc重组表达载体，按照步骤一的2和3进行操作，得到用于注射烟草的带有3×HA标签的WRKY3S83A-3HA重组菌液。室温避光静置4小时备用。
七、重组菌WRKY3S83A/S112A-3HA的制备
1、WRKY3S83A/S112A-3HA重组表达载体的构建：将CTAPi-GW-3×HA载体的重组位点之间的片段替换为序列表的序列13所示的DNA分子，得到WRKY3S83A/S112A-3HA重组表达载体(已经测序验证)。
2、采用WRKY3S83A/S112A-3HA重组表达载体替代GRIK1-3Myc重组表达载体，按照步骤一的2和3进行操作，得到用于注射烟草的带有3×HA标签的WRKY3S83A/S112A-3HA重组菌液。室温避光静置4小时备用。
八、蛋白积累量检测
按照如下分组进行试验：
(1)向本氏烟叶片中注射按照重组菌液体积1:1:1的比例混合的GRIK1-3Myc重组菌、SnRK1-YFP重组菌和WRKY3-3HA重组菌，注射三天后取注射位置本氏烟叶片；
(2)向本氏烟叶片中注射按照重组菌液体积1:1:1的比例混合的GRIK1-3Myc重组菌、SnRK1-YFP重组菌和WRKY3S83A-3HA重组菌，注射三天后取注射位置本氏烟叶片；
(3)向本氏烟叶片中注射按照重组菌液体积1:1:1的比例混合的GRIK1-3Myc重组菌、SnRK1-YFP重组菌和WRKY3S112A-3HA重组菌，注射三天后取注射位置本氏烟叶片；
(4)向本氏烟叶片中注射按照重组菌液体积1:1:1的比例混合的GRIK1-3Myc重组菌、SnRK1-YFP重组菌和WRKY3S83A/S112A-3HA重组菌，注射三天后注射位置取本氏烟叶片；
(5)向本氏烟叶片中注射按照重组菌液体积1:1:1的比例混合的GRIK1-3Myc重组菌、SnRK1K139R-YFP重组菌和WRKY3-3HA重组菌，注射三天后取注射位置本氏烟叶片；
(6)向本氏烟叶片中注射按照重组菌液体积1:1:1的比例混合的GRIK1-3Myc重组菌、SnRK1K139R-YFP重组菌和WRKY3S83A-3HA重组菌，注射三天后取注射位置本氏烟叶片；
(7)向本氏烟叶片中注射按照重组菌液体积1:1:1的比例混合的GRIK1-3Myc重组菌、SnRK1K139R-YFP重组菌和WRKY3S112A-3HA重组菌，注射三天后取注射位置本氏烟叶片；
(8)向本氏烟叶片中注射按照重组菌液体积1:1:1的比例混合的GRIK1-3Myc重组菌、SnRK1K139R-YFP重组菌和WRKY3S83A/S112A-3HA重组菌，注射三天后取注射位置本氏烟叶片；
取上述各组注射位置的本氏烟叶片提取总蛋白，利用Western blotting及对应标签的抗体检测蛋白表达。
组(1)-组(4)的结果如图2A的泳道1-泳道4所示。
组(5)-组(8)的结果如图2B所示。
结果表明，S83或S112位点单突变为A后，导致HvWRKY3蛋白积累量略有上升，而当两个位点双突变为A后，HvWRKY3的蛋白积累量显著上升(图2A)。而当HvWRKY3与催化活性丧失的突变蛋白HvSnRK1K139R共注射时，S83或S112位点的单突变或双突变均不改变HvWRKY3的蛋白积累量(图2B)。
上述实验结果证实HvSnRK1磷酸化HvWRKY3的S83和S112位点能促进其降解。
为了检测HvWRKY3的降解是否通过26S蛋白酶体途径，在组(1)-组(4)样品检测前12-14小时在叶片中注射100μM蛋白酶体抑制剂MG132，结果如图2A的泳道5-泳道8所示，结果表明HvWRKY3的降解被MG132抑制了，证明HvSnRK1磷酸化HvWRKY3并促进其通过26S蛋白酶体系统降解。
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 一种大麦HvSnRK1激酶磷酸化调控转录因子HvWRKY3的方法及其应用
<160> 18
<210> 1
<211> 1284
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）
<400> 1
atggctgacc tcacggacat gggctgctgt agctgtttca gcttcctaag gaagcccagc 60
gtgaaggtat gtcagcctcg gtacactgat ggcatgttgt ccaaagattt gctgaagcgc 120
cagtctagtg aggatttcga cgggagcttc tacactggag atgatcccga catgagcttt 180
tacaatgggg atggccttga tagaagcttc tttaataatg gtgatgatcc cgatagaagt 240
ttctatgaga gagatggcac tgactataat cacgagagtg acgacgagcc cccgcggaag 300
aggtctgaag atattatact gacaagggct caaagcggct ttgcatgtag agaaagcctg 360
gttaaggaga ctaaaaaagt cgttcgctca gaggacgatc ttggcaataa gatgatcaat 420
cagtatgttc acctgggcaa gatcggtgct ggaagctacg gcaaagtggt tctataccga 480
aacatcgaag atgggaagtt atatgcagtg aaggtgctga ataaacctca catgatgaaa 540
gtacgcgtcg tacggtcaga gaccgccatg acagatgtta ttcgggaagt atccctcatg 600
aaaatgttga gtcatcccaa tatcgtaaat ctcattgagg tgattgatga tccaaactca 660
gataaattct acatggttct tgagtatgtg gaaggaaaaa ttgtgtggga taaaggttta 720
ggagaagcta cttgcagaaa gtatttgcgg gacattattt ctggtgttat atatcttcac 780
tctcataaca ttattcatag tgatatcaaa ccggataatc tcttggtcac aagtaccggc 840
aatgtgaaga taggggactt cagtgttagc cagattttcg aggatgatga tgatatgctt 900
cggagatctc caggcactcc tgttttcact gcacccgagt gctgtcaagg ttcagcttac 960
catggtagat cggctgatac atgggcagtc ggtgttactc tgtattgtat gattactggg 1020
tgttatccat ttctaggaga aactttgcag gaaacatacg acaagattgt caatgatgca 1080
gcggatatac ctagtgccgt gagcccccaa cttgttgatt tgctggaaag gcttctctgc 1140
aaagatccag gagaccgtat caccctggaa gctgcggctg cgcatccttg ggttgcaggg 1200
gacgaggggc cagtccccga atacatgtgt agatgtggct ttggccgcag gaacagaaat 1260
ggttcacaag cagcagtaca ataa 1284
<210> 2
<211> 427
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）
<400> 2
Met Ala Asp Leu Thr Asp Met Gly Cys Cys Ser Cys Phe Ser Phe Leu
1 5 10 15
Arg Lys Pro Ser Val Lys Val Cys Gln Pro Arg Tyr Thr Asp Gly Met
20 25 30
Leu Ser Lys Asp Leu Leu Lys Arg Gln Ser Ser Glu Asp Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Phe Tyr Thr Gly Asp Asp Pro Asp Met Ser Phe Tyr Asn Gly Asp
50 55 60
Gly Leu Asp Arg Ser Phe Phe Asn Asn Gly Asp Asp Pro Asp Arg Ser
65 70 75 80
Phe Tyr Glu Arg Asp Gly Thr Asp Tyr Asn His Glu Ser Asp Asp Glu
85 90 95
Pro Pro Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Ile Leu Thr Arg Ala Gln Ser
100 105 110
Gly Phe Ala Cys Arg Glu Ser Leu Val Lys Glu Thr Lys Lys Val Val
115 120 125
Arg Ser Glu Asp Asp Leu Gly Asn Lys Met Ile Asn Gln Tyr Val His
130 135 140
Leu Gly Lys Ile Gly Ala Gly Ser Tyr Gly Lys Val Val Leu Tyr Arg
145 150 155 160
Asn Ile Glu Asp Gly Lys Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Lys Pro
165 170 175
His Met Met Lys Val Arg Val Val Arg Ser Glu Thr Ala Met Thr Asp
180 185 190
Val Ile Arg Glu Val Ser Leu Met Lys Met Leu Ser His Pro Asn Ile
195 200 205
Val Asn Leu Ile Glu Val Ile Asp Asp Pro Asn Ser Asp Lys Phe Tyr
210 215 220
Met Val Leu Glu Tyr Val Glu Gly Lys Ile Val Trp Asp Lys Gly Leu
225 230 235 240
Gly Glu Ala Thr Cys Arg Lys Tyr Leu Arg Asp Ile Ile Ser Gly Val
245 250 255
Ile Tyr Leu His Ser His Asn Ile Ile His Ser Asp Ile Lys Pro Asp
260 265 270
Asn Leu Leu Val Thr Ser Thr Gly Asn Val Lys Ile Gly Asp Phe Ser
275 280 285
Val Ser Gln Ile Phe Glu Asp Asp Asp Asp Met Leu Arg Arg Ser Pro
290 295 300
Gly Thr Pro Val Phe Thr Ala Pro Glu Cys Cys Gln Gly Ser Ala Tyr
305 310 315 320
His Gly Arg Ser Ala Asp Thr Trp Ala Val Gly Val Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Met Ile Thr Gly Cys Tyr Pro Phe Leu Gly Glu Thr Leu Gln Glu Thr
340 345 350
Tyr Asp Lys Ile Val Asn Asp Ala Ala Asp Ile Pro Ser Ala Val Ser
355 360 365
Pro Gln Leu Val Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu Cys Lys Asp Pro Gly
370 375 380
Asp Arg Ile Thr Leu Glu Ala Ala Ala Ala His Pro Trp Val Ala Gly
385 390 395 400
Asp Glu Gly Pro Val Pro Glu Tyr Met Cys Arg Cys Gly Phe Gly Arg
405 410 415
Arg Asn Arg Asn Gly Ser Gln Ala Ala Val Gln
420 425
<210> 3
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
atggacgcag caggcaggga tgccaacccc ttggccggct accggatcgg caaaaccctc 60
ggcatcgggt cctttggcaa ggtcaagatc gccgagcata taattacggg acacaaggtc 120
gcaatcaaga tcctcaatcg ccgcaagatc aagagcatgg agatggaaga gaaagtgaaa 180
agagaaatca agatactgag attatttatg catcctcata tcatacggct ttatgaggtc 240
atagataccc cagcggatat ttatgttgtt atggagtatg ttaaatctgg agagttattt 300
gactatattg ttgagaaggg aagattacaa gaggaagaag ctcgtcgctt tttccagcaa 360
attatatctg gtgtggaata ttgccataga aacatggtgg ttcaccgtga tctgaagcca 420
gagaaccttc tgttggattc gaaatgtaat gttaagattg cagattttgg cttaagtaat 480
gttatgcgtg acggacactt tctgaagact agttgtggta gcccaaatta tgcagcaccc 540
gaggtgatat caggtaaact gtacgctggc cctgaagttg atgtttggag ctgtggagtt 600
attctttatg ctcttctttg tggcactctt ccatttgacg atgagaatat accaaacctt 660
tttaagaaaa taaagggtgg aatatacacc cttcctagtc acttgtctcc tttagcaaga 720
gatttgatcc caagaatgct ggttgttgat cctatgaaga ggattactat acgtgaaatt 780
cgtgaacatt catggttcaa agctagactt ccacgctatt tggccgtgcc tcctccagac 840
actgctcaac aagttaaaaa gcttgacgat gaaactctga atgatgtcat caaaatggga 900
tttgacaaga atcagctaac tgaatctctt caaaagagat tgcaaaatga ggcgacagtt 960
gcatattatt tactcttgga caataaactt cgtacaacca gttga 1005
<210> 4
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
Met Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ala Asn Pro Leu Ala Gly Tyr Arg Ile
1 5 10 15
Gly Lys Thr Leu Gly Ile Gly Ser Phe Gly Lys Val Lys Ile Ala Glu
20 25 30
His Ile Ile Thr Gly His Lys Val Ala Ile Lys Ile Leu Asn Arg Arg
35 40 45
Lys Ile Lys Ser Met Glu Met Glu Glu Lys Val Lys Arg Glu Ile Lys
50 55 60
Ile Leu Arg Leu Phe Met His Pro His Ile Ile Arg Leu Tyr Glu Val
65 70 75 80
Ile Asp Thr Pro Ala Asp Ile Tyr Val Val Met Glu Tyr Val Lys Ser
85 90 95
Gly Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Val Glu Lys Gly Arg Leu Gln Glu Glu
100 105 110
Glu Ala Arg Arg Phe Phe Gln Gln Ile Ile Ser Gly Val Glu Tyr Cys
115 120 125
His Arg Asn Met Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu
130 135 140
Leu Asp Ser Lys Cys Asn Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Asn
145 150 155 160
Val Met Arg Asp Gly His Phe Leu Lys Thr Ser Cys Gly Ser Pro Asn
165 170 175
Tyr Ala Ala Pro Glu Val Ile Ser Gly Lys Leu Tyr Ala Gly Pro Glu
180 185 190
Val Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ala Leu Leu Cys Gly
195 200 205
Thr Leu Pro Phe Asp Asp Glu Asn Ile Pro Asn Leu Phe Lys Lys Ile
210 215 220
Lys Gly Gly Ile Tyr Thr Leu Pro Ser His Leu Ser Pro Leu Ala Arg
225 230 235 240
Asp Leu Ile Pro Arg Met Leu Val Val Asp Pro Met Lys Arg Ile Thr
245 250 255
Ile Arg Glu Ile Arg Glu His Ser Trp Phe Lys Ala Arg Leu Pro Arg
260 265 270
Tyr Leu Ala Val Pro Pro Pro Asp Thr Ala Gln Gln Val Lys Lys Leu
275 280 285
Asp Asp Glu Thr Leu Asn Asp Val Ile Lys Met Gly Phe Asp Lys Asn
290 295 300
Gln Leu Thr Glu Ser Leu Gln Lys Arg Leu Gln Asn Glu Ala Thr Val
305 310 315 320
Ala Tyr Tyr Leu Leu Leu Asp Asn Lys Leu Arg Thr Thr Ser
325 330
<210> 5
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggcc 327
<210> 6
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc ggatctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggcc 327
<210> 7
<211> 993
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）
<400> 7
atggaaacgg cgcggtggtc gcccgtctgc ctcgacctca tggtcgggct acccatggtg 60
cgcgagccgt ctccggcgag gcgcgccgga atgagaaccc aagctgacat tgctagctca 120
ccctgcggca gagcagcttc catgaccaac ggcgaggcta gtaagatgat ggaggcgaaa 180
ttcacggagg taagcgagga gaaccggagg ctgacggaga tgatcggcta cctgtacgct 240
aaccagagtt tcgcgcgaca cagccccgaa ggggacggcg agcagcccgc gagcaccgcc 300
gcgtcgccga catcgccggt gggcaagaaa aggagcaggg agagcatgga cacgtcggat 360
tccggcgatg gcaacagcga caagaagatg gctggtatgg tcgaggccga gcatgttgac 420
gtcgagagcc cgctgagcaa cggcacttgc cggagaatca aggtcaagag ggtctgcacc 480
cggatcgacc catcggacac gagcctcgtt gtgaaagacg ggtatcaatg gcggaagtac 540
gggcagaagg tgacacggga caacccctcc ccccgagcct acttccgatg cgccttcgcg 600
ccgtcctgcc ctgtcaagaa gaaggtgcag agaagcgccg aggacagctc gatggtggag 660
gcgacgtacg agggcgagca caaccacccg cgccccacgc gggccggcga gctgccgagc 720
tgcgcggcgg ggggcggcgg cccggtgccg tgctccatct ccatcaactc ctccggcccg 780
accatcacgc tggacctcac caaggacggg ggaggtgtgc aggtggtcga ggcagcaggg 840
gaggcgcagc cggacctgaa gaaggtgtgc cgggaggtcg cgtcgccgga gttccgggcg 900
gctctggtgg agcagatggc ccgcgagctc accggcgacc gaaagttcac cgacgcgctc 960
gccgccgcca tcctgcggaa gctgccggat tat 993
<210> 8
<211> 331
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）
<400> 8
Met Glu Thr Ala Arg Trp Ser Pro Val Cys Leu Asp Leu Met Val Gly
1 5 10 15
Leu Pro Met Val Arg Glu Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ala Gly Met Arg
20 25 30
Thr Gln Ala Asp Ile Ala Ser Ser Pro Cys Gly Arg Ala Ala Ser Met
35 40 45
Thr Asn Gly Glu Ala Ser Lys Met Met Glu Ala Lys Phe Thr Glu Val
50 55 60
Ser Glu Glu Asn Arg Arg Leu Thr Glu Met Ile Gly Tyr Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Asn Gln Ser Phe Ala Arg His Ser Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gln Pro
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Ala Ser Pro Thr Ser Pro Val Gly Lys Lys Arg Ser
100 105 110
Arg Glu Ser Met Asp Thr Ser Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ser Asp Lys
115 120 125
Lys Met Ala Gly Met Val Glu Ala Glu His Val Asp Val Glu Ser Pro
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Thr Cys Arg Arg Ile Lys Val Lys Arg Val Cys Thr
145 150 155 160
Arg Ile Asp Pro Ser Asp Thr Ser Leu Val Val Lys Asp Gly Tyr Gln
165 170 175
Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Thr Arg Asp Asn Pro Ser Pro Arg
180 185 190
Ala Tyr Phe Arg Cys Ala Phe Ala Pro Ser Cys Pro Val Lys Lys Lys
195 200 205
Val Gln Arg Ser Ala Glu Asp Ser Ser Met Val Glu Ala Thr Tyr Glu
210 215 220
Gly Glu His Asn His Pro Arg Pro Thr Arg Ala Gly Glu Leu Pro Ser
225 230 235 240
Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Pro Val Pro Cys Ser Ile Ser Ile Asn
245 250 255
Ser Ser Gly Pro Thr Ile Thr Leu Asp Leu Thr Lys Asp Gly Gly Gly
260 265 270
Val Gln Val Val Glu Ala Ala Gly Glu Ala Gln Pro Asp Leu Lys Lys
275 280 285
Val Cys Arg Glu Val Ala Ser Pro Glu Phe Arg Ala Ala Leu Val Glu
290 295 300
Gln Met Ala Arg Glu Leu Thr Gly Asp Arg Lys Phe Thr Asp Ala Leu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ile Leu Arg Lys Leu Pro Asp Tyr
325 330
<210> 9
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
atggaaacgg cgcggtggtc gcccgtctgc ctcgacctca tggtcgggct acccatggtg 60
cgcgagccgt ctccggcgag gcgcgccgga atgagaaccc aagctgacat tgctagctca 120
ccctgcggca gagcagcttc catgaccaac ggcgaggcta gtaagatgat ggaggcgaaa 180
ttcacggagg taagcgagga gaaccggagg ctgacggaga tgatcggcta cctgtacgct 240
aaccagagtt tcgcgcgaca cagccccgaa ggggacggcg agcagcccgc gagcaccgcc 300
gcgtcgccga catcgccggt gggcaagaaa agggcgaggg agagcatgga cacgtcggat 360
tccggcgatg gcaacagcga caagaagatg gctggtatgg tcgaggccga gcatgttgac 420
gtcgagagcc cgctgagcaa cggcacttgc cggagaatca aggtcaagag ggtctgcacc 480
cggatcgacc catcggacac gagcctcgtt gtgaaagacg ggtatcaatg gcggaagtac 540
gggcagaagg tgacacggga caacccctcc ccccgagcct acttccgatg cgccttcgcg 600
ccgtcctgcc ctgtcaagaa gaaggtgcag agaagcgccg aggacagctc gatggtggag 660
gcgacgtacg agggcgagca caaccacccg cgccccacgc gggccggcga gctgccgagc 720
tgcgcggcgg ggggcggcgg cccggtgccg tgctccatct ccatcaactc ctccggcccg 780
accatcacgc tggacctcac caaggacggg ggaggtgtgc aggtggtcga ggcagcaggg 840
gaggcgcagc cggacctgaa gaaggtgtgc cgggaggtcg cgtcgccgga gttccgggcg 900
gctctggtgg agcagatggc ccgcgagctc accggcgacc gaaagttcac cgacgcgctc 960
gccgccgcca tcctgcggaa gctgccggat tat 993
<210> 10
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
Met Glu Thr Ala Arg Trp Ser Pro Val Cys Leu Asp Leu Met Val Gly
1 5 10 15
Leu Pro Met Val Arg Glu Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ala Gly Met Arg
20 25 30
Thr Gln Ala Asp Ile Ala Ser Ser Pro Cys Gly Arg Ala Ala Ser Met
35 40 45
Thr Asn Gly Glu Ala Ser Lys Met Met Glu Ala Lys Phe Thr Glu Val
50 55 60
Ser Glu Glu Asn Arg Arg Leu Thr Glu Met Ile Gly Tyr Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Asn Gln Ser Phe Ala Arg His Ser Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gln Pro
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Ala Ser Pro Thr Ser Pro Val Gly Lys Lys Arg Ala
100 105 110
Arg Glu Ser Met Asp Thr Ser Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ser Asp Lys
115 120 125
Lys Met Ala Gly Met Val Glu Ala Glu His Val Asp Val Glu Ser Pro
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Thr Cys Arg Arg Ile Lys Val Lys Arg Val Cys Thr
145 150 155 160
Arg Ile Asp Pro Ser Asp Thr Ser Leu Val Val Lys Asp Gly Tyr Gln
165 170 175
Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Thr Arg Asp Asn Pro Ser Pro Arg
180 185 190
Ala Tyr Phe Arg Cys Ala Phe Ala Pro Ser Cys Pro Val Lys Lys Lys
195 200 205
Val Gln Arg Ser Ala Glu Asp Ser Ser Met Val Glu Ala Thr Tyr Glu
210 215 220
Gly Glu His Asn His Pro Arg Pro Thr Arg Ala Gly Glu Leu Pro Ser
225 230 235 240
Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Pro Val Pro Cys Ser Ile Ser Ile Asn
245 250 255
Ser Ser Gly Pro Thr Ile Thr Leu Asp Leu Thr Lys Asp Gly Gly Gly
260 265 270
Val Gln Val Val Glu Ala Ala Gly Glu Ala Gln Pro Asp Leu Lys Lys
275 280 285
Val Cys Arg Glu Val Ala Ser Pro Glu Phe Arg Ala Ala Leu Val Glu
290 295 300
Gln Met Ala Arg Glu Leu Thr Gly Asp Arg Lys Phe Thr Asp Ala Leu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ile Leu Arg Lys Leu Pro Asp Tyr
325 330
<210> 11
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
atggaaacgg cgcggtggtc gcccgtctgc ctcgacctca tggtcgggct acccatggtg 60
cgcgagccgt ctccggcgag gcgcgccgga atgagaaccc aagctgacat tgctagctca 120
ccctgcggca gagcagcttc catgaccaac ggcgaggcta gtaagatgat ggaggcgaaa 180
ttcacggagg taagcgagga gaaccggagg ctgacggaga tgatcggcta cctgtacgct 240
aaccaggcgt tcgcgcgaca cagccccgaa ggggacggcg agcagcccgc gagcaccgcc 300
gcgtcgccga catcgccggt gggcaagaaa aggagcaggg agagcatgga cacgtcggat 360
tccggcgatg gcaacagcga caagaagatg gctggtatgg tcgaggccga gcatgttgac 420
gtcgagagcc cgctgagcaa cggcacttgc cggagaatca aggtcaagag ggtctgcacc 480
cggatcgacc catcggacac gagcctcgtt gtgaaagacg ggtatcaatg gcggaagtac 540
gggcagaagg tgacacggga caacccctcc ccccgagcct acttccgatg cgccttcgcg 600
ccgtcctgcc ctgtcaagaa gaaggtgcag agaagcgccg aggacagctc gatggtggag 660
gcgacgtacg agggcgagca caaccacccg cgccccacgc gggccggcga gctgccgagc 720
tgcgcggcgg ggggcggcgg cccggtgccg tgctccatct ccatcaactc ctccggcccg 780
accatcacgc tggacctcac caaggacggg ggaggtgtgc aggtggtcga ggcagcaggg 840
gaggcgcagc cggacctgaa gaaggtgtgc cgggaggtcg cgtcgccgga gttccgggcg 900
gctctggtgg agcagatggc ccgcgagctc accggcgacc gaaagttcac cgacgcgctc 960
gccgccgcca tcctgcggaa gctgccggat tat 993
<210> 12
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
Met Glu Thr Ala Arg Trp Ser Pro Val Cys Leu Asp Leu Met Val Gly
1 5 10 15
Leu Pro Met Val Arg Glu Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ala Gly Met Arg
20 25 30
Thr Gln Ala Asp Ile Ala Ser Ser Pro Cys Gly Arg Ala Ala Ser Met
35 40 45
Thr Asn Gly Glu Ala Ser Lys Met Met Glu Ala Lys Phe Thr Glu Val
50 55 60
Ser Glu Glu Asn Arg Arg Leu Thr Glu Met Ile Gly Tyr Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Asn Gln Ala Phe Ala Arg His Ser Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gln Pro
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Ala Ser Pro Thr Ser Pro Val Gly Lys Lys Arg Ser
100 105 110
Arg Glu Ser Met Asp Thr Ser Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ser Asp Lys
115 120 125
Lys Met Ala Gly Met Val Glu Ala Glu His Val Asp Val Glu Ser Pro
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Thr Cys Arg Arg Ile Lys Val Lys Arg Val Cys Thr
145 150 155 160
Arg Ile Asp Pro Ser Asp Thr Ser Leu Val Val Lys Asp Gly Tyr Gln
165 170 175
Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Thr Arg Asp Asn Pro Ser Pro Arg
180 185 190
Ala Tyr Phe Arg Cys Ala Phe Ala Pro Ser Cys Pro Val Lys Lys Lys
195 200 205
Val Gln Arg Ser Ala Glu Asp Ser Ser Met Val Glu Ala Thr Tyr Glu
210 215 220
Gly Glu His Asn His Pro Arg Pro Thr Arg Ala Gly Glu Leu Pro Ser
225 230 235 240
Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Pro Val Pro Cys Ser Ile Ser Ile Asn
245 250 255
Ser Ser Gly Pro Thr Ile Thr Leu Asp Leu Thr Lys Asp Gly Gly Gly
260 265 270
Val Gln Val Val Glu Ala Ala Gly Glu Ala Gln Pro Asp Leu Lys Lys
275 280 285
Val Cys Arg Glu Val Ala Ser Pro Glu Phe Arg Ala Ala Leu Val Glu
290 295 300
Gln Met Ala Arg Glu Leu Thr Gly Asp Arg Lys Phe Thr Asp Ala Leu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ile Leu Arg Lys Leu Pro Asp Tyr
325 330
<210> 13
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
atggaaacgg cgcggtggtc gcccgtctgc ctcgacctca tggtcgggct acccatggtg 60
cgcgagccgt ctccggcgag gcgcgccgga atgagaaccc aagctgacat tgctagctca 120
ccctgcggca gagcagcttc catgaccaac ggcgaggcta gtaagatgat ggaggcgaaa 180
ttcacggagg taagcgagga gaaccggagg ctgacggaga tgatcggcta cctgtacgct 240
aaccaggcgt tcgcgcgaca cagccccgaa ggggacggcg agcagcccgc gagcaccgcc 300
gcgtcgccga catcgccggt gggcaagaaa agggcgaggg agagcatgga cacgtcggat 360
tccggcgatg gcaacagcga caagaagatg gctggtatgg tcgaggccga gcatgttgac 420
gtcgagagcc cgctgagcaa cggcacttgc cggagaatca aggtcaagag ggtctgcacc 480
cggatcgacc catcggacac gagcctcgtt gtgaaagacg ggtatcaatg gcggaagtac 540
gggcagaagg tgacacggga caacccctcc ccccgagcct acttccgatg cgccttcgcg 600
ccgtcctgcc ctgtcaagaa gaaggtgcag agaagcgccg aggacagctc gatggtggag 660
gcgacgtacg agggcgagca caaccacccg cgccccacgc gggccggcga gctgccgagc 720
tgcgcggcgg ggggcggcgg cccggtgccg tgctccatct ccatcaactc ctccggcccg 780
accatcacgc tggacctcac caaggacggg ggaggtgtgc aggtggtcga ggcagcaggg 840
gaggcgcagc cggacctgaa gaaggtgtgc cgggaggtcg cgtcgccgga gttccgggcg 900
gctctggtgg agcagatggc ccgcgagctc accggcgacc gaaagttcac cgacgcgctc 960
gccgccgcca tcctgcggaa gctgccggat tat 993
<210> 14
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
Met Glu Thr Ala Arg Trp Ser Pro Val Cys Leu Asp Leu Met Val Gly
1 5 10 15
Leu Pro Met Val Arg Glu Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ala Gly Met Arg
20 25 30
Thr Gln Ala Asp Ile Ala Ser Ser Pro Cys Gly Arg Ala Ala Ser Met
35 40 45
Thr Asn Gly Glu Ala Ser Lys Met Met Glu Ala Lys Phe Thr Glu Val
50 55 60
Ser Glu Glu Asn Arg Arg Leu Thr Glu Met Ile Gly Tyr Leu Tyr Ala
65 70 75 80
Asn Gln Ala Phe Ala Arg His Ser Pro Glu Gly Asp Gly Glu Gln Pro
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Ala Ser Pro Thr Ser Pro Val Gly Lys Lys Arg Ala
100 105 110
Arg Glu Ser Met Asp Thr Ser Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ser Asp Lys
115 120 125
Lys Met Ala Gly Met Val Glu Ala Glu His Val Asp Val Glu Ser Pro
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Thr Cys Arg Arg Ile Lys Val Lys Arg Val Cys Thr
145 150 155 160
Arg Ile Asp Pro Ser Asp Thr Ser Leu Val Val Lys Asp Gly Tyr Gln
165 170 175
Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Thr Arg Asp Asn Pro Ser Pro Arg
180 185 190
Ala Tyr Phe Arg Cys Ala Phe Ala Pro Ser Cys Pro Val Lys Lys Lys
195 200 205
Val Gln Arg Ser Ala Glu Asp Ser Ser Met Val Glu Ala Thr Tyr Glu
210 215 220
Gly Glu His Asn His Pro Arg Pro Thr Arg Ala Gly Glu Leu Pro Ser
225 230 235 240
Cys Ala Ala Gly Gly Gly Gly Pro Val Pro Cys Ser Ile Ser Ile Asn
245 250 255
Ser Ser Gly Pro Thr Ile Thr Leu Asp Leu Thr Lys Asp Gly Gly Gly
260 265 270
Val Gln Val Val Glu Ala Ala Gly Glu Ala Gln Pro Asp Leu Lys Lys
275 280 285
Val Cys Arg Glu Val Ala Ser Pro Glu Phe Arg Ala Ala Leu Val Glu
290 295 300
Gln Met Ala Arg Glu Leu Thr Gly Asp Arg Lys Phe Thr Asp Ala Leu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ile Leu Arg Lys Leu Pro Asp Tyr
325 330
<210> 15
<211> 1500
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）
<400> 15
atggacgcag caggcaggga tgccaacccc ttggccggct accggatcgg caaaaccctc 60
ggcatcgggt cctttggcaa ggtcaagatc gccgagcata taattacggg acacaaggtc 120
gcaatcaaga tcctcaatcg ccgcaagatc aagagcatgg agatggaaga gaaagtgaaa 180
agagaaatca agatactgag attatttatg catcctcata tcatacggct ttatgaggtc 240
atagataccc cagcggatat ttatgttgtt atggagtatg ttaaatctgg agagttattt 300
gactatattg ttgagaaggg aagattacaa gaggaagaag ctcgtcgctt tttccagcaa 360
attatatctg gtgtggaata ttgccataga aacatggtgg ttcaccgtga tctgaagcca 420
gagaaccttc tgttggattc gaaatgtaat gttaagattg cagattttgg cttaagtaat 480
gttatgcgtg acggacactt tctgaagact agttgtggta gcccaaatta tgcagcaccc 540
gaggtgatat caggtaaact gtacgctggc cctgaagttg atgtttggag ctgtggagtt 600
attctttatg ctcttctttg tggcactctt ccatttgacg atgagaatat accaaacctt 660
tttaagaaaa taaagggtgg aatatacacc cttcctagtc acttgtctcc tttagcaaga 720
gatttgatcc caagaatgct ggttgttgat cctatgaaga ggattactat acgtgaaatt 780
cgtgaacatt catggttcaa agctagactt ccacgctatt tggccgtgcc tcctccagac 840
actgctcaac aagttaaaaa gcttgacgat gaaactctga atgatgtcat caaaatggga 900
tttgacaaga atcagctaac tgaatctctt caaaagagat tgcaaaatga ggcgacagtt 960
gcatattatt tactcttgga caataaactt cgtacaacca gtggctatct tggagccgag 1020
tatcaagagt caatggactc atctttctcc caaatttcac ctgaaacacc aagttcagct 1080
tctgaagcta ggcagtatgg ttctcccggg tttggcttga ggcaacattt tgcagctgag 1140
aggaaatggg ctctcggtct tcagtctcga gcgcatccac gagaaatcat aactgaagtg 1200
cttaaagctc tgcaagagct aaatgtttgc tggaagaaga ttgggcacta taacatgaag 1260
tgcaggtgga gtcctggctt ttttgagaat atgatgcata acaacaatgg attcggtgtg 1320
gagtctgcta taattgaagc tgatggcctc ggtgacaaat caacccacat cgtgaagttt 1380
gaaattcagc tgtacaaaac aagggatgat aagtatcttc tcgacttgca aagggttagt 1440
ggaccacagc tcctctttct ggacctgtgt tctgcctttc taacccagct gagagtcctt 1500
<210> 16
<211> 500
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare L.）
<400> 16
Met Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ala Asn Pro Leu Ala Gly Tyr Arg Ile
1 5 10 15
Gly Lys Thr Leu Gly Ile Gly Ser Phe Gly Lys Val Lys Ile Ala Glu
20 25 30
His Ile Ile Thr Gly His Lys Val Ala Ile Lys Ile Leu Asn Arg Arg
35 40 45
Lys Ile Lys Ser Met Glu Met Glu Glu Lys Val Lys Arg Glu Ile Lys
50 55 60
Ile Leu Arg Leu Phe Met His Pro His Ile Ile Arg Leu Tyr Glu Val
65 70 75 80
Ile Asp Thr Pro Ala Asp Ile Tyr Val Val Met Glu Tyr Val Lys Ser
85 90 95
Gly Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Val Glu Lys Gly Arg Leu Gln Glu Glu
100 105 110
Glu Ala Arg Arg Phe Phe Gln Gln Ile Ile Ser Gly Val Glu Tyr Cys
115 120 125
His Arg Asn Met Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu
130 135 140
Leu Asp Ser Lys Cys Asn Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Asn
145 150 155 160
Val Met Arg Asp Gly His Phe Leu Lys Thr Ser Cys Gly Ser Pro Asn
165 170 175
Tyr Ala Ala Pro Glu Val Ile Ser Gly Lys Leu Tyr Ala Gly Pro Glu
180 185 190
Val Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ala Leu Leu Cys Gly
195 200 205
Thr Leu Pro Phe Asp Asp Glu Asn Ile Pro Asn Leu Phe Lys Lys Ile
210 215 220
Lys Gly Gly Ile Tyr Thr Leu Pro Ser His Leu Ser Pro Leu Ala Arg
225 230 235 240
Asp Leu Ile Pro Arg Met Leu Val Val Asp Pro Met Lys Arg Ile Thr
245 250 255
Ile Arg Glu Ile Arg Glu His Ser Trp Phe Lys Ala Arg Leu Pro Arg
260 265 270
Tyr Leu Ala Val Pro Pro Pro Asp Thr Ala Gln Gln Val Lys Lys Leu
275 280 285
Asp Asp Glu Thr Leu Asn Asp Val Ile Lys Met Gly Phe Asp Lys Asn
290 295 300
Gln Leu Thr Glu Ser Leu Gln Lys Arg Leu Gln Asn Glu Ala Thr Val
305 310 315 320
Ala Tyr Tyr Leu Leu Leu Asp Asn Lys Leu Arg Thr Thr Ser Gly Tyr
325 330 335
Leu Gly Ala Glu Tyr Gln Glu Ser Met Asp Ser Ser Phe Ser Gln Ile
340 345 350
Ser Pro Glu Thr Pro Ser Ser Ala Ser Glu Ala Arg Gln Tyr Gly Ser
355 360 365
Pro Gly Phe Gly Leu Arg Gln His Phe Ala Ala Glu Arg Lys Trp Ala
370 375 380
Leu Gly Leu Gln Ser Arg Ala His Pro Arg Glu Ile Ile Thr Glu Val
385 390 395 400
Leu Lys Ala Leu Gln Glu Leu Asn Val Cys Trp Lys Lys Ile Gly His
405 410 415
Tyr Asn Met Lys Cys Arg Trp Ser Pro Gly Phe Phe Glu Asn Met Met
420 425 430
His Asn Asn Asn Gly Phe Gly Val Glu Ser Ala Ile Ile Glu Ala Asp
435 440 445
Gly Leu Gly Asp Lys Ser Thr His Ile Val Lys Phe Glu Ile Gln Leu
450 455 460
Tyr Lys Thr Arg Asp Asp Lys Tyr Leu Leu Asp Leu Gln Arg Val Ser
465 470 475 480
Gly Pro Gln Leu Leu Phe Leu Asp Leu Cys Ser Ala Phe Leu Thr Gln
485 490 495
Leu Arg Val Leu
500
<210> 17
<211> 1500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
atggacgcag caggcaggga tgccaacccc ttggccggct accggatcgg caaaaccctc 60
ggcatcgggt cctttggcaa ggtcaagatc gccgagcata taattacggg acacaaggtc 120
gcaatcaaga tcctcaatcg ccgcaagatc aagagcatgg agatggaaga gaaagtgaaa 180
agagaaatca agatactgag attatttatg catcctcata tcatacggct ttatgaggtc 240
atagataccc cagcggatat ttatgttgtt atggagtatg ttaaatctgg agagttattt 300
gactatattg ttgagaaggg aagattacaa gaggaagaag ctcgtcgctt tttccagcaa 360
attatatctg gtgtggaata ttgccataga aacatggtgg ttcaccgtga tctgagacca 420
gagaaccttc tgttggattc gaaatgtaat gttaagattg cagattttgg cttaagtaat 480
gttatgcgtg acggacactt tctgaagact agttgtggta gcccaaatta tgcagcaccc 540
gaggtgatat caggtaaact gtacgctggc cctgaagttg atgtttggag ctgtggagtt 600
attctttatg ctcttctttg tggcactctt ccatttgacg atgagaatat accaaacctt 660
tttaagaaaa taaagggtgg aatatacacc cttcctagtc acttgtctcc tttagcaaga 720
gatttgatcc caagaatgct ggttgttgat cctatgaaga ggattactat acgtgaaatt 780
cgtgaacatt catggttcaa agctagactt ccacgctatt tggccgtgcc tcctccagac 840
actgctcaac aagttaaaaa gcttgacgat gaaactctga atgatgtcat caaaatggga 900
tttgacaaga atcagctaac tgaatctctt caaaagagat tgcaaaatga ggcgacagtt 960
gcatattatt tactcttgga caataaactt cgtacaacca gtggctatct tggagccgag 1020
tatcaagagt caatggactc atctttctcc caaatttcac ctgaaacacc aagttcagct 1080
tctgaagcta ggcagtatgg ttctcccggg tttggcttga ggcaacattt tgcagctgag 1140
aggaaatggg ctctcggtct tcagtctcga gcgcatccac gagaaatcat aactgaagtg 1200
cttaaagctc tgcaagagct aaatgtttgc tggaagaaga ttgggcacta taacatgaag 1260
tgcaggtgga gtcctggctt ttttgagaat atgatgcata acaacaatgg attcggtgtg 1320
gagtctgcta taattgaagc tgatggcctc ggtgacaaat caacccacat cgtgaagttt 1380
gaaattcagc tgtacaaaac aagggatgat aagtatcttc tcgacttgca aagggttagt 1440
ggaccacagc tcctctttct ggacctgtgt tctgcctttc taacccagct gagagtcctt 1500
<210> 18
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
Met Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ala Asn Pro Leu Ala Gly Tyr Arg Ile
1 5 10 15
Gly Lys Thr Leu Gly Ile Gly Ser Phe Gly Lys Val Lys Ile Ala Glu
20 25 30
His Ile Ile Thr Gly His Lys Val Ala Ile Lys Ile Leu Asn Arg Arg
35 40 45
Lys Ile Lys Ser Met Glu Met Glu Glu Lys Val Lys Arg Glu Ile Lys
50 55 60
Ile Leu Arg Leu Phe Met His Pro His Ile Ile Arg Leu Tyr Glu Val
65 70 75 80
Ile Asp Thr Pro Ala Asp Ile Tyr Val Val Met Glu Tyr Val Lys Ser
85 90 95
Gly Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Val Glu Lys Gly Arg Leu Gln Glu Glu
100 105 110
Glu Ala Arg Arg Phe Phe Gln Gln Ile Ile Ser Gly Val Glu Tyr Cys
115 120 125
His Arg Asn Met Val Val His Arg Asp Leu Arg Pro Glu Asn Leu Leu
130 135 140
Leu Asp Ser Lys Cys Asn Val Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Asn
145 150 155 160
Val Met Arg Asp Gly His Phe Leu Lys Thr Ser Cys Gly Ser Pro Asn
165 170 175
Tyr Ala Ala Pro Glu Val Ile Ser Gly Lys Leu Tyr Ala Gly Pro Glu
180 185 190
Val Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ala Leu Leu Cys Gly
195 200 205
Thr Leu Pro Phe Asp Asp Glu Asn Ile Pro Asn Leu Phe Lys Lys Ile
210 215 220
Lys Gly Gly Ile Tyr Thr Leu Pro Ser His Leu Ser Pro Leu Ala Arg
225 230 235 240
Asp Leu Ile Pro Arg Met Leu Val Val Asp Pro Met Lys Arg Ile Thr
245 250 255
Ile Arg Glu Ile Arg Glu His Ser Trp Phe Lys Ala Arg Leu Pro Arg
260 265 270
Tyr Leu Ala Val Pro Pro Pro Asp Thr Ala Gln Gln Val Lys Lys Leu
275 280 285
Asp Asp Glu Thr Leu Asn Asp Val Ile Lys Met Gly Phe Asp Lys Asn
290 295 300
Gln Leu Thr Glu Ser Leu Gln Lys Arg Leu Gln Asn Glu Ala Thr Val
305 310 315 320
Ala Tyr Tyr Leu Leu Leu Asp Asn Lys Leu Arg Thr Thr Ser Gly Tyr
325 330 335
Leu Gly Ala Glu Tyr Gln Glu Ser Met Asp Ser Ser Phe Ser Gln Ile
340 345 350
Ser Pro Glu Thr Pro Ser Ser Ala Ser Glu Ala Arg Gln Tyr Gly Ser
355 360 365
Pro Gly Phe Gly Leu Arg Gln His Phe Ala Ala Glu Arg Lys Trp Ala
370 375 380
Leu Gly Leu Gln Ser Arg Ala His Pro Arg Glu Ile Ile Thr Glu Val
385 390 395 400
Leu Lys Ala Leu Gln Glu Leu Asn Val Cys Trp Lys Lys Ile Gly His
405 410 415
Tyr Asn Met Lys Cys Arg Trp Ser Pro Gly Phe Phe Glu Asn Met Met
420 425 430
His Asn Asn Asn Gly Phe Gly Val Glu Ser Ala Ile Ile Glu Ala Asp
435 440 445
Gly Leu Gly Asp Lys Ser Thr His Ile Val Lys Phe Glu Ile Gln Leu
450 455 460
Tyr Lys Thr Arg Asp Asp Lys Tyr Leu Leu Asp Leu Gln Arg Val Ser
465 470 475 480
Gly Pro Gln Leu Leu Phe Leu Asp Leu Cys Ser Ala Phe Leu Thr Gln
485 490 495
Leu Arg Val Leu
500

Claims (4)

1.蛋白质，是将HvWRKY3蛋白进行如下(a1)和/或(a2)所示的两个点突变得到的：
(a1)第83位氨基酸残基突变为丙氨酸；
(a2)第112位氨基酸残基突变为丙氨酸；
所述HvWRKY3蛋白其氨基酸序列如序列表中序列8所示。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.一种抑制HvWRKY3蛋白磷酸化的方法，包括如下步骤：将HvWRKY3蛋白进行如下(a1)和/或(a2)所示的两个点突变：
(a1)第83位氨基酸残基突变为丙氨酸；
(a2)第112位氨基酸残基突变为丙氨酸；
所述HvWRKY3蛋白其氨基酸序列如序列表中序列8所示。
4.一种抑制植物中HvWRKY3蛋白降解的方法，包括如下步骤：将HvWRKY3蛋白进行如下(a1)和/或(a2)所示的两个点突变：
(a1)第83位氨基酸残基突变为丙氨酸；
(a2)第112位氨基酸残基突变为丙氨酸；
所述HvWRKY3蛋白其氨基酸序列如序列表中序列8所示。
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