CN109430045A - 一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法 - Google Patents
一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109430045A CN109430045A CN201811341621.0A CN201811341621A CN109430045A CN 109430045 A CN109430045 A CN 109430045A CN 201811341621 A CN201811341621 A CN 201811341621A CN 109430045 A CN109430045 A CN 109430045A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- powdery mildew
- wheat
- mutant
- mosaic type
- creating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,属于作物遗传育种研究领域;本发明以抗白粉病小麦品种与感白粉病小麦品种的杂交种子为诱变对象,用0.8%甲基磺酸乙酯(EMS)磷酸缓冲液处理杂交种子8小时,自来水冲洗24小时后放置于培养皿中,露白后种植于温室大棚,成株期进行白粉菌接种鉴定,即可筛选嵌合型突变体,其特征为白粉菌孢子堆沿叶脉方向呈条状分布;鉴定出的嵌合型突变体可直接在其下一代筛选感病突变体;本发明以抗、感白粉病双亲的杂交种为诱变对象,在诱变当代即可筛选出嵌合型突变体,极大减小了突变体筛选规模,对于基因克隆和功能研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明公开了一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,属于作物遗传育种领域。
背景技术
小麦是世界重要粮食作物,小麦生产面临着很多生物胁迫和非生物胁迫,生物胁迫包括白粉病、赤霉病、条锈病、叶锈病、秆锈病、纹枯病、病毒病等,其中白粉病是重要的小麦病害之一,在世界范围内均有发生。我国黄淮麦区和长江中下游麦区分别是我国第一大和第二大麦区,小麦白粉病是两大麦区小麦生产重要威胁之一。在普通小麦及其野生物种中已发现100多个抗白粉病基因,通过常规杂交和远缘杂交方式,已有很多抗病基因被导入到小麦主导品种中,部分抗白粉病病基因如Pm2、Pm4、Pm8、Pm21等在生产上已得到广泛应用。由于小麦基因组的复杂性,在数量众多的小麦抗白粉病基因中,仅有Pm2、Pm3b、Pm8、Pm21等少数几个基因被成功克隆。
在小麦抗白粉病基因克隆策略上,抗白粉病基因Pm3b是通过经典的亚基因组图位克隆的方式获得。抗白粉病基因Pm8通过与Pm3b的同源性克隆获得。抗白粉病基因Pm21是通过精细定位和抗病基因类似物(RGA)的比较作图克隆获得。
由于小麦基因组序列缺乏,传统的小麦基因克隆必须利用图位克隆策略。但由于小麦基因组庞大,DNA组成高达17G碱基对,其中超过80%为重复序列,给基因的精细定位带来巨大困难。近几年,随着小麦基因组序列的公布,二代或三代测序及基因芯片等高通量检测技术在基因克隆中的作用开始凸显,基因组重测序、外显子捕获、抗病基因类似物测序、突变染色体测序等策略开始涌现并获得成功。突变体已成为极其重要的基因克隆和功能验证的基础材料。
然而,抗病基因突变体的创制受很多因素影响,往往表现为突变频率低,鉴定工作繁琐,难以实现高通量创制。大部分抗白粉病基因表现为显性,突变后表现为隐性,在诱变当代(M1代)不表现感病症状,需要到下一个分离世代(M2代)才能进行白粉病接种鉴定,这极大增加了试验规模和接种鉴定的工作量。因此,研发抗白粉病基因高效诱变新方法,对于小麦基因克隆和功能研究意义重大。
发明内容
本发明旨在公布一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,是一种操作简单,在诱变当代(M1代)即可通过表型鉴定获得抗白粉病野生型和感白粉病突变型组织细胞表现于同一植株的嵌合型突变体。比常规的诱变方法在M2代进行表型筛选,节省了大量的工作量。
其技术方案如下:
本发明公布的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其步骤如下:
(1)将抗白粉病小麦品种与感白粉病小麦品种杂交,收获杂交种子。
(2)用化学诱变剂但不限于EMS,剂量用但不限于0.8%EMS磷酸缓冲液处理杂交种子8小时,进而用自来水冲洗24小时,在培养皿中露白。
(3)将露白后的杂交种子种到温室大棚中生长形成M1代诱变群体,出苗后适当施用有机肥促苗生长,大棚内保持一定湿度,利于白粉菌繁殖。同时种植的还有抗白粉病亲本、感白粉病亲本及和未诱变处理的F1植株作为对照(CK)。
(4)在成株期利用白粉病孢子在大棚内播撒接种。
(5)当感白粉病亲本充分发病后,分单株考察发病情况。当某个单株的某个茎蘖叶片上出现沿叶脉方向的条状白粉病孢子堆,而其它茎蘖叶片均表现正常抗病性状时,确定该单株是抗病和感病性状嵌合的突变体。此时,感病亲本的叶片上白粉菌孢子堆呈无规则散点状分布于全部叶片,抗病亲本和正常F1单株的叶片上不出现白粉菌孢子堆。
(6)嵌合体的分类:当条状白粉病孢子堆宽度大于1/4叶宽时,称为高度嵌合型突变体,小于1/6叶片宽度时,称为低度嵌合型突变体,介于二者之间的,称为中度嵌合型突变体。
(7)将出现嵌合型突变的茎蘖的穗子收获后,在下一代(M2)种成穗行,大棚内种植模式同上一代。苗期进行白粉菌接种,将感白粉病的小麦单株筛选出来,利用抗白粉病基因紧密连锁标记或功能标记鉴定,如果是小麦遗传背景内不交换的野生物种染色体,可以用抗病基因所在外源染色体专化性标记对感病单株的DNA进行鉴定,当标记显示阳性时,说明该单株为携带了丧失抗白粉病功能的感病突变体。
本发明的有益效果
本发明提供的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法为首次报道。常规的化学诱变方法是用化学诱变剂处理抗性纯合的小麦种子,当抗白粉病性状为显性基因控制时,诱变当代(M1)难以观察到感病突变体,需在下一代(M2)大规模种植才能进行白粉菌接种鉴定,导致工作量大,感病突变体检出率效率低。
EMS(甲基磺酸乙酯,Ethyl methyl sulfone,简称EMS)诱变具有操作简单、环境要求低、主要为点突变等优点。通过对一定数量抗病基因突变体进行基因组重测序等分析,可以直接推导抗病基因序列。在物种参考基因组序列完备的前提下,可以通过重测序手段完成对目的基因序列的推导。
本方法以抗白粉病和感白粉病小麦品种杂交获得的杂交种子为对象进行化学诱变,在诱变当代(M1)成株期即可筛选到抗、感白粉病嵌合型突变体,继而只需将发生嵌合症状的单穗种成穗行(M2),在感病单株中筛选目的基因标记阳性的单株,即为感病突变体。该方法可大幅减少M2代家系的种植规模和标记筛选的工作量,实现高通量创制感病突变体。结合近年来发展起来的重测序、外显子捕获、突变染色体测序等技术,将极大提高抗白粉病基因克隆和功能研究的效率。
附图说明
图1为本发明的嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法流程图。
图2为抗白粉病基因嵌合型突变体症状表现的结果。
图3为分子标记MBH1鉴定嵌合型突变体电泳图;图中泳道M为Marker, DL 2000DNA梯度;泳道1为抗病CK扬麦18;泳道2为感病CK扬麦9号; 泳道3~20为 M1代嵌合型突变体单株;右侧箭头分别表示6AS染色体特异的456bp条带、6DS染色体特异的394bp条带和抗白粉病基因Pm21特异的341bp条带。
图4为分子标记MBH1对M2代感白粉病单株鉴定电泳图;
泳道M为Marker,DL 2000 DNA梯度; 泳道1为抗病CK扬麦18; 泳道2为感病CK扬麦9号;泳道3~18为M2代感白粉病单株;右侧箭头分别表示6AS染色体特异的456bp条带、6DS染色体特异的394bp条带和抗白粉病基因Pm21特异的341bp条带。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案(见图1的流程图)。
实施例
(1)抗白粉病小麦品种扬麦18和感白粉病小麦品种扬麦9号来源于江苏里下河地区农科所育成,扬麦18是利用Pm21基因供体小麦-簇毛麦T6VS.6AL易位系育成,组合为“宁麦9´4/3/扬麦158´ 6//扬麦88-128/T6VS.6AL”;高感白粉病品种扬麦9号组合为“鉴三/扬麦5号”。将扬麦18与扬麦9号进行杂交,收获杂交种子(F1)2000粒。
(2)用0.8% EMS磷酸缓冲液处理杂交种子(F1)8小时,进而用自来水冲洗24小时,在培养皿中露白。
(3)将露白后的杂交种子种到温室大棚中生长形成M1代诱变群体,出苗后适当施用有机肥促苗生长,大棚内保持一定湿度,利于白粉菌繁殖。双亲扬麦18和扬麦9号种植于大棚内,分别作为抗白粉病和感白粉病对照。
(4)在成株期用发明人自行采集自扬州地区的混合白粉病孢子在大棚内播撒接种。
(5)当感白粉病对照扬麦9号充分发病后,分单株考察发病情况。充分发病的扬麦9号叶片上的白粉菌孢子堆呈无规则散点状分布于全部叶片,而在49个M1单株的叶片上出现呈条状分布的白粉菌孢子堆,说明上述单株为嵌合型突变体,如图2所示,扬麦18(Yangmai18)对白粉病表现免疫,叶片不出现白粉菌孢子堆。扬麦9号(Yangmai 9)出现不规则弥散状白粉菌孢子堆。杂种F1(F1 plant)表现同抗病亲本扬麦18。嵌合型M1植株(M1 plants)症状表现为单一叶片上出现与叶脉方向平行的条状孢子堆,分为高度嵌合型、中度嵌合型和低度嵌合型。
(6)提取上述49个嵌合型突变体叶片DNA进行标记鉴定。标记采用Pm21基因共显性分子标记MBH1(Tongde Bie等. Development and characterization of an efficientbreeding-practical marker MBH1 simultaneously tagging Pm21 and PmV genesconferring resistance to wheat powdery mildew. Mol. Breeding, 2015, 35, 189)。结果显示上述嵌合型突变单株均为Pm21基因杂合型,均来自于真杂种的诱变效果,未出现嵌合症状的M1植株均没有白粉菌孢子堆出现,与抗病亲本扬麦18表现一致。结果如图3所示,1号泳道为抗病CK扬麦18,表现6DS-394和Pm21特异性标记阳性,为纯合抗白粉病小麦品种;2号泳道为感病CK扬麦9号,表现6AS-456和6DS-394标记阳性,为纯合感病品种;3号泳道为杂种F1,含有全部3个阳性条带;4~20号泳道均表现3个阳性条带,与杂种F1带型一致,为Pm21杂合型,说明嵌合型突变体本身来自于真杂种。
(7)收获上述49个嵌合型突变症状叶片所在茎蘖的穗子,脱粒,在温室大棚内种植M2穗行,再次接种白粉菌鉴定,对每一穗行中的感病单株用MBH1分子标记鉴定,MBH1标记阳性的感病单株即为Pm21基因感病突变体,结果如图4所示,1号泳道为抗病CK扬麦18,表现6DS-394和Pm21特异性标记阳性,为纯合抗白粉病小麦品种;2号泳道为感病CK扬麦9号,表现6AS-456和6DS-394标记阳性,为纯合感病品种;3号泳道为杂种F1,含有全部3个阳性条带;4~8号泳道的M2感白粉病单株,条带与扬麦9号一致,表现6AS-456和6DS-394标记阳性,为纯合感病;9~18号泳道的M2感白粉病单株,均含有Pm21基因特异的341-bp条带,说明这些M2单株为真实的Pm21基因感病突变体。
最终在14个穗行中分离出Pm21基因感病突变体,说明嵌合型突变体Pm21突变基因的可遗传的频率达到28.6%(表1)。
表1.嵌合突变率和突变基因重现率分析
杂种数 | 嵌合突变体数 | 嵌合突变率 | 感病突变体数 | 突变基因重现率 |
2000 | 49 | 2.5% | 14 | 28.6% |
Claims (9)
1.一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,首先将抗白粉病小麦品种和感白粉病小麦品种的杂交,再利用化学诱变剂但不限于甲基磺酸乙酯对杂交种子进行诱变,诱变剂的量为但不限于0.8%EMS磷酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)将抗白粉病小麦品种与感白粉病小麦品种杂交,收获杂交种子;
(2)用化学诱变剂处理杂交种子,进而用自来水冲洗,直至在培养皿中露白;
(3)将露白后的杂交种子种到温室大棚中生长形成M1代诱变群体,同时种植的还有抗白粉病亲本、感白粉病亲本及和未诱变处理的F1植株作为对照;
(4)在成株期利用白粉病孢子在大棚内播撒接种;
(5)当感白粉病亲本充分发病后,分单株考察发病情况;
(6)嵌合体的分类,分为高度嵌合型突变体、低度嵌合型突变体、中度嵌合型突变体;
(7)将出现嵌合型突变的茎蘖的穗子收获后,在下一代(M2)种成穗行,大棚内种植模式同上一代;苗期进行白粉菌接种,筛选感白粉病但抗病基因标记阳性的小麦单株。
3.根据权利要求2所述的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,步骤(2)中所述化学诱变剂为甲基磺酸乙酯,诱变剂的量为但不限于0.8%EMS磷酸缓冲液。
4.根据权利要求2所述的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,步骤(2)中诱变时间为8小时。
5.根据权利要求2所述的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,步骤(5)中所述的发病情况植株确认如下:
当某个单株的某个茎蘖叶片上出现沿叶脉方向的条状白粉病孢子堆,而其它茎蘖叶片均表现正常抗病性状时,确定该单株是抗病和感病性状嵌合的突变体;此时,感病亲本的叶片上白粉菌孢子堆呈无规则散点状分布于全部叶片,抗病亲本和正常F1单株的叶片上不出现白粉菌孢子堆。
6.根据权利要求2所述的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,步骤(6)中所述高度嵌合型突变体表现为条状白粉病孢子堆宽度大于1/4叶宽;所述低度嵌合型突变体表现为条状白粉病孢子堆宽度小于1/6叶片宽度;所述中度嵌合型突变体表现为条状白粉病孢子堆宽度介于1/4和1/6之间。
7.根据权利要求2所述的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,步骤(7)中所述筛选感白粉病的小麦单株的方法为:
利用抗白粉病基因紧密连锁标记或功能标记鉴定,如果是小麦遗传背景内不交换的野生物种染色体,则用抗病基因所在外源染色体专化性标记对感病单株的DNA进行鉴定,当标记显示阳性时,说明该单株为携带了丧失抗白粉病功能的感病突变体。
8.根据权利要求2所述的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,在诱变当代(M1)植株的同一张叶片上即可观察到抗病和感病嵌合症状,表现为白粉菌孢子堆在叶片上延叶脉方向呈条状分布。
9.根据权利要求7所述的一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法,其特征在于,抗病基因为显性遗传。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811341621.0A CN109430045A (zh) | 2018-11-12 | 2018-11-12 | 一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811341621.0A CN109430045A (zh) | 2018-11-12 | 2018-11-12 | 一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109430045A true CN109430045A (zh) | 2019-03-08 |
Family
ID=65552652
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811341621.0A Pending CN109430045A (zh) | 2018-11-12 | 2018-11-12 | 一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109430045A (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013050593A1 (en) * | 2011-10-07 | 2013-04-11 | Basf Plant Science Company Gmbh | Method of producing plants having increased resistance to pathogens |
CN108026540A (zh) * | 2015-07-17 | 2018-05-11 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 抗白粉病的小麦植物 |
-
2018
- 2018-11-12 CN CN201811341621.0A patent/CN109430045A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013050593A1 (en) * | 2011-10-07 | 2013-04-11 | Basf Plant Science Company Gmbh | Method of producing plants having increased resistance to pathogens |
CN108026540A (zh) * | 2015-07-17 | 2018-05-11 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 抗白粉病的小麦植物 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
马燕欣: ""南农9918感白粉病突变体NM14的创制及在抗病机理研究中的应用"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lammer et al. | A single chromosome addition from Thinopyrum elongatum confers a polycarpic, perennial habit to annual wheat | |
CN106688878B (zh) | 利用长雄野生稻无性繁殖特性培育多年生稻的方法 | |
KR102206251B1 (ko) | 토마토 식물의 뿌리혹 선충 저항성 마커, 뿌리혹 선충 저항성 토마토 식물, 뿌리혹 선충 저항성 토마토 식물의 제조 방법 및 뿌리혹 선충 저항성 토마토 식물의 스크리닝 방법 | |
CN109997683B (zh) | 一种基于单倍体诱导系的水稻双单倍体育种方法 | |
US20200196546A1 (en) | Breeding method and application of new downy mildew-resistant interspecific hybrid cucumis sativus variety | |
CN108541578A (zh) | 一种早熟优质耐病棉花的育种方法 | |
CN111011131B (zh) | 小麦快速发育技术、分子标记技术与常规育种相结合的育种方法 | |
CN103936843A (zh) | 水稻Os05g26890.1蛋白、编码该蛋白的基因及其应用 | |
CN110607382A (zh) | 来源于新陆早24的单铃重主效基因的snp分子标记 | |
CN102731635B (zh) | 水稻雌性不育基因及其在杂交水稻制种中的应用 | |
CN105331689B (zh) | 小麦-长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法及其分子标记 | |
CN109321673B (zh) | 一种鉴定与黄瓜嫩果皮色相关的qtl及基因的方法 | |
CN107236810A (zh) | 玉米雄性核不育基因、其分子标记及应用 | |
CN114277175B (zh) | 一种快速高效的小麦抗赤霉病分子设计育种方法 | |
Rerkasem et al. | Agrodiversity for in situ conservation of Thailand’s native rice germplasm | |
CN109430045A (zh) | 一种嵌合型小麦抗白粉病基因突变体的创制方法 | |
CN112501341B (zh) | 调控水稻抽穗期的主效qtl及分子标记与应用 | |
CN112889664B (zh) | 一种聚合互补抗稻瘟病基因培育广谱、持久抗性水稻育种材料的方法 | |
CN108504760B (zh) | 水稻优良耐盐资源的qtl挖掘及应用 | |
CN110951906A (zh) | 高代回交分子轮回选择(mrsab)育种方法i--一种显性早穗不降产材料的培育及利用方法 | |
Subedi | Developing Chenopodium ficifolium as a diploid model system relevant to genetic characterization and improvement of allotetraploid C. quinoa | |
Mallick et al. | Prospect and commercial production of economically important plant mulberry (Morus sp.) towards the upliftment of rural economy | |
CN115336510B (zh) | 一种白酒制曲专用型多抗小麦品种的聚合育种方法 | |
CN114931092B (zh) | 聚合多性状有利等位变异的小麦抗赤霉病分子育种方法 | |
Wu | Classic genetics and breeding of bioenergy related traits in switchgrass |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190308 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |