CN110982818A - 核定位信号f4nls在高效创制水稻除草剂抗性材料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了核定位信号F4NLS在高效创制水稻除草剂抗性材料中的应用。所述核定位信号F4NLS由核定位信号甲和核定位信号乙组成，所述核定位信号甲包括3*Flag2标签蛋白和NLS2蛋白；所述核定位信号乙包括所述NLS2蛋白。本发明还公开了一种ACCase抑制除草剂抗性水稻的制备方法。所述方法包括使受体水稻中表达esgRNA、腺嘌呤脱氨酶、Cas9核酸酶、核定位信号甲和核定位信号乙的步骤；所述腺嘌呤脱氨酶、所述Cas9核酸酶、所述核定位信号甲和所述核定位信号乙在所述esgRNA的向导下，可将受体水稻基因组中OsACC1基因靶点序列的第7位由A突变为G，从而获得ACCase抑制除草剂抗性水稻。

Description

核定位信号F4NLS在高效创制水稻除草剂抗性材料中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及核定位信号F4NLS在高效创制水稻除草剂抗性材料中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2017年，David Liu实验室报道了一种新型的腺嘌呤碱基编辑器(adenine baseeditors，ABE)。通过七轮进化，研究者将来源于大肠杆菌的tRNA腺嘌呤脱氨酶(tRNAadenosinedeaminase，ecTadA)融合在Cas9 nickase(Cas9n)的5’端，在细胞内能够直接实现对单个碱基A到G(Guanine，G)的替换，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了A替换为G的碱基编辑效率。具体过程为：当含有基因组靶向序列的sgRNA与ecTadA&ecTadA&Cas9n结合时，复合体定位到靶点，ecTadA催化非配对的单链DNA上的A发生腺嘌呤脱氨反应变成肌苷(Inosine，I)，在DNA修复的过程中，I会被视为G，Cas9n会在切割配对的DNA链的磷酸二酯键，引入一个胞嘧啶C与I配对。最终在接下来的修复过程中产生C-G配对，从而实现了A到G的转换。

单碱基编辑系统被广泛应用于作物单碱基突变材料的创制。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase，ACCase)是调节脂肪酸生物合成的一种关键酶，ACCase抑制除草剂自1975年开发以来，品种不断增多，目前已成为世界上重要的除草剂。ACCase抑制除草剂包括最早开发的APP(芳氧苯氧丙酸)和CHD(环已烯二酮)以及后开发的DEN(苯基吡唑啉)，共三类。随着ACCase抑制除草剂的使用，很多杂草产生了抗性，ACCase氨基酸内8种氨基酸置换控制着杂草对不同类ACCase抑制除草剂的抗性，它们分别是谷氨酰胺1756→谷氨酸，异亮氨酸1781→亮氨酸或缬氨酸，色氨酸1999→半胱氨酸或丝氨酸，色氨酸2027→半胱氨酸，异亮氨酸2041→天冬酰胺或缬氨酸，天冬酰胺2078→甘氨酸，半胱氨酸2088→精氨酸，甘氨酸2096→丙氨酸。其中1781、2078或2088位置的氨基酸突变抗所有ACCase抑制除草剂。水稻OsACC1中第2099位的半胱氨酸(C)正好对应上述杂草中的第2088位的半胱氨酸，将其突变为精氨酸(R)，即C2099R能够使水稻产生ACCase抑制除草剂抗性。C2099R可通过单碱基编辑技术获得，但目前已报道的突变C2099R创制ACCase抑制除草剂抗性水稻的碱基编辑系统大多编辑效率较低，且产生的突变体不只含有OsACC1第2099位这一个位点的突变，有的还会含有其他位点的突变，突变体分子鉴定成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种ACCase抑制除草剂抗性水稻的制备方法。

本发明提供的ACCase抑制除草剂抗性水稻的制备方法包括使受体水稻中表达esgRNA、腺嘌呤脱氨酶、Cas9核酸酶、核定位信号甲和核定位信号乙的步骤；

所述esgRNA靶向OsACC1基因靶点序列；所述OsACC1基因靶点序列含有目标位点；

所述目标位点为序列14第6295位所示碱基T的互补碱基A；

所述腺嘌呤脱氨酶、所述Cas9核酸酶、所述核定位信号甲和所述核定位信号乙在所述esgRNA的向导下，可将受体水稻基因组中所述目标位点由碱基A突变为碱基G，从而获得OsACC1蛋白第2099位由半胱氨酸突变为精氨酸的ACCase抑制除草剂抗性水稻；

所述核定位信号甲包括3*Flag2标签蛋白和NLS2蛋白；

所述核定位信号乙包括所述NLS2蛋白；

所述3*Flag2标签蛋白的氨基酸序列为序列10第1-22位；

所述NLS2蛋白的氨基酸序列为序列9。

上述方法中，所述核定位信号甲中，所述3*Flag2标签蛋白的个数可为1个或2个或多个；所述NLS2蛋白的个数可为1个或2个或多个。在本发明的具体实施例中，所述3*Flag2标签蛋白的个数为1个；所述NLS2蛋白的个数为4个。

所述核定位信号乙中，所述NLS2蛋白的个数可为1个或2个或多个。在本发明的具体实施例中，所述NLS2蛋白的个数为4个。

进一步的，所述核定位信号甲为A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列10所示的蛋白质；

A2)将序列表中序列10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

所述核定位信号乙为B1)或B2)：

B1)氨基酸序列是序列11所示的蛋白质；

B2)将序列表中序列11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

更进一步的，所述核定位信号甲的编码基因序列为a1)或a2)或a3)：

a1)序列表中序列6第1-183位所示的cDNA分子或DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述核定位信号甲的cDNA分子或DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述核定位信号甲的cDNA分子或DNA分子；

所述核定位信号乙的编码基因序列为b1)或b2)或b3)：

b1)序列表中序列6第73-183位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述核定位信号乙的cDNA分子或DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述核定位信号乙的cDNA分子或DNA分子。

上述方法中，所述OsACC1基因靶点序列为序列12，所述目标位点为序列12第7位所示的碱基A。

上述方法中，所述esgRNA结构如下：所述OsACC1基因靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架；

所述esgRNA骨架为1)或2)或3)：

1)将序列1第617-702位中的T替换为U得到的RNA分子；

2)将1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

上述方法中，所述Cas9核酸酶为Cas9n蛋白质；

所述Cas9n蛋白质为C1)或C2)：

C1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

C2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述腺嘌呤脱氨酶为ecTadA蛋白质和/或ecTadA*蛋白质；具体为ecTadA蛋白质和ecTadA*蛋白质；

所述ecTadA蛋白质为D1)或D2)：

D1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

D2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

所述ecTadA*蛋白质为E1)或E2)：

E1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

E2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

上述A2)、B2)、C2)、D2)或E2)中的蛋白质，为与序列10、序列11、序列4、序列2或序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)、B2)、C2)、D2)或E2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)、B2)、C2)、D2)或E2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列6的第1-183位(编码序列10所示的蛋白质)、序列6第73-183位(编码序列11所示的蛋白质)、序列1第5035-9135位(编码序列4所示的蛋白质)、序列1第3847-4344位(编码序列2所示的蛋白质)或序列1第4441-4938位(编码序列3所示的蛋白质)所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连接上表所示的标签的编码序列得到。

进一步的，所述Cas9n蛋白质的编码基因为c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列1第5035-9135位所示的cDNA分子或DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9n的cDNA分子或DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Cas9n的cDNA分子或DNA分子。

所述ecTadA蛋白质的编码基因为d1)或d2)或d3)：

d1)序列表中序列1第3847-4344位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述ecTadA的cDNA分子或DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述ecTadA的cDNA分子或DNA分子；

所述ecTadA*蛋白质的编码基因为e1)或e2)或e3)：

e1)序列表中序列1第4441-4938位所示的cDNA分子或DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述ecTadA*的cDNA分子或DNA分子；

e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述ecTadA*的cDNA分子或DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述核定位信号甲、所述核定位信号乙、所述Cas9n、所述ecTadA、所述ecTadA*的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述核定位信号甲、所述核定位信号乙、所述Cas9n、所述ecTadA、所述ecTadA*的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述核定位信号甲、所述核定位信号乙、所述Cas9n、所述ecTadA、所述ecTadA*且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列10、11、4、2、3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述方法中，所述使受体水稻中表达esgRNA、腺嘌呤脱氨酶、Cas9核酸酶、核定位信号甲和核定位信号乙的方法为将转录esgRNA的DNA分子、ecTadA蛋白质的编码基因、ecTadA*蛋白质的编码基因、Cas9n蛋白质的编码基因、核定位信号甲的编码基因和核定位信号乙的编码基因导入受体水稻中。

进一步的，所述转录esgRNA的DNA分子、所述ecTadA蛋白质的编码基因、所述ecTadA*蛋白质的编码基因、所述Cas9n蛋白质的编码基因、所述核定位信号甲的编码基因和所述核定位信号乙的编码基因通过重组表达载体导入受体水稻中。

更进一步，所述重组表达载体包括依次由启动子、所述核定位信号甲的编码基因、所述ecTadA蛋白质的编码基因、所述ecTadA*蛋白质的编码基因、所述Cas9n蛋白质的编码基因和所述核定位信号乙的编码基因和终止子组成的表达盒。

在本发明的具体实施例中，所述重组表达载体具体为F4NLS-sABE-1重组表达载体。

所述F4NLS-sABE-1重组表达载体为将sABE-1重组表达载体序列中序列1第3796-3846位所示的bpNLS核苷酸序列替换为序列6，且将第9136-9186位所示的bpNLS核苷酸序列替换为序列6第55-201位所示的核苷酸序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

上述方法中，所述腺嘌呤脱氨酶、所述Cas9核酸酶、所述核定位信号甲和所述核定位信号乙在所述esgRNA的向导下，可将受体水稻基因组中OsACC1蛋白的编码基因的非编码链(序列14的反向互补序列)上第690位(5'-3’方向)的碱基A突变为碱基G，进而使OsACC1蛋白的编码基因的编码链(序列14)上第6295位(5'-3’方向)的碱基T突变为碱基C，导致OsACC1蛋白第2099位的半胱氨酸(C)的密码子由“TGC”变成“CGC”，所以OsACC1蛋白第2099位由半胱氨酸(C)突变成精氨酸(R)，发生该突变的水稻突变体即为本发明的ACCase抑制除草剂抗性水稻。所述ACCase抑制除草剂抗性水稻具有ACCase抑制除草剂抗性。所述ACCase抑制除草剂具体为盖草能。

本发明的ACCase抑制除草剂抗性水稻也即为C2099R突变体或A7>G7突变体。所述C2099R突变体为OsACC1蛋白(序列13)第2099位由半胱氨酸(C)突变成精氨酸(R)的水稻突变体。所述A7>G7突变体为OsACC1基因靶点序列(序列12)第7位由碱基A突变为碱基G的水稻突变体。

上述方法在提高目标位点的A·G碱基替换效率或制备仅目标位点发生A·G碱基替换的ACCase抑制除草剂抗性水稻中的应用也均属于本发明的保护范围；所述目标位点为所述OsACC1基因靶点序列的第7位。

上述应用中，所述A·G碱基替换为由碱基A突变为碱基G。

上述方法或应用中，所述OsACC1蛋白的氨基酸序列如序列13所示，所述OsACC1蛋白的编码基因序列如序列14所示(LOC4338322)。

在实际应用中，不同水稻品种中的OsACC1基因可能会含有不同的等位基因，具体表现为OsACC1蛋白的氨基酸序列可能会与本发明的OsACC1蛋白的氨基酸序列存在1个或2个或多个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加；此外，本领域不同技术人员对OsACC1基因外显子序列的注释结果也会存在差异，具体表现为OsACC1蛋白的氨基酸序列长度可能会与本发明的OsACC1蛋白的氨基酸序列不同(如本发明的OsACC1蛋白的第2099位也即为LOC_Os05g22940所示的OsACC1编码基因序列编码的OsACC1蛋白的第2186位，两者为同一位点，但氨基酸序列长度不同)。因此，所述目标位点在不同的水稻品种中所对应的OsACC1基因核苷酸位置及由所述目标位点突变导致的OsACC1蛋白氨基酸序列的突变位置都有可能发生变化，即非序列14第6295位或序列13第2099位。但由于上述情况导致的目标位点发生的变化和/或氨基酸突变位点的变化，只要是运用本发明方法获得的ACCase抑制除草剂抗性水稻，均属于本发明的保护范围。

上述方法或应用中，所述水稻品种具体可为日本晴。

本发明的有益效果：本发明方法可提高目标位点(序列12第7位)的A·G碱基替换效率，且产生的突变体仅目标位点一个位点发生突变，大大提高了C2099R突变体的创制效率。

本发明提供了一种ACCase抑制除草剂抗性水稻的制备方法，该方法包括使受体水稻中表达esgRNA、腺嘌呤脱氨酶、Cas9核酸酶、核定位信号甲和核定位信号乙的步骤；所述腺嘌呤脱氨酶、所述Cas9核酸酶、所述核定位信号甲和所述核定位信号乙在所述esgRNA的向导下，可将受体水稻基因组中OsACC1基因靶点序列的第7位由A突变为G，从而获得ACCase抑制除草剂抗性水稻，该ACCase抑制除草剂抗性水稻具有ACCase抑制除草剂抗性。

附图说明

图1为四种腺嘌呤碱基编辑器的重组表达载体结构示意图。

图2为C2099R突变体创制过程中靶点序列中目标位点的变化情况。

图3为发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗中靶点序列(靶点序列的反向互补序列峰图)的测序结果。

图4为1680ug/l的盖草能对WT苗和发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗生长情况的影响。

图5为发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗抽穗结实情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

引物对T由引物T-F：5’-GCATTGCTGGACTTCAACC-3’和引物T-R：5’-CAAACCGTATCGCAATCTGAG-3’组成，用于扩增靶点OsACC-T。

A·G碱基替换效率＝发生A·G碱基替换的阳性T0苗数/分析的总阳性T0苗数×100％。

日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。

恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。

筛选培养基：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。

分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

下述实施例中的OsACC1蛋白的氨基酸序列如序列13所示，OsACC1蛋白的编码基因序列如序列14所示。

实施例1、一种ACCase抑制除草剂抗性水稻的制备方法

一、重组表达载体的设计与构建

1、重组表达载体的设计

本发明使用四种类型的腺嘌呤碱基编辑器制备ACCase抑制除草剂抗性水稻，四种不同类型的腺嘌呤碱基编辑器的重组表达载体结构示意图如图1所示。具体如下：

sABE系统：在ecTadA&ecTadA*&Cas9n碱基编辑系统中的ecTadA元件前添加bpNLS核定位信号，且在Cas9n元件后添加bpNLS核定位信号。bpNLS核定位信号的氨基酸序列如下：KRTADGSEFEPKKKRKV(序列7)。将该种设计类型记做bpNLS-bpNLS。

FNLS-sABE系统：在ecTadA&ecTadA*&Cas9n碱基编辑系统中的ecTadA元件前添加3*Flag1&1*NLS1核定位信号，且在Cas9n元件后添加1*NLS1核定位信号。3*Flag1&1*NLS1的氨基酸序列如下：

(序列8)，其中，3*Flag1标签蛋白的氨基酸序列如下划线所示，NLS1蛋白的氨基酸序列如波浪线所示。1*NLS1核定位信号包括1个NLS1蛋白，1*NLS1的氨基酸序列如下：PKKKRKV(序列9)。将该种设计类型记做3*Flag1&1*NLS1-1*NLS1(FNLS)。

F4NLS-sABE系统：在ecTadA&ecTadA*&Cas9n碱基编辑系统中的ecTadA元件前添加3*Flag2&4*NLS2核定位信号，且在Cas9n元件后添加4*NLS2核定位信号。3*Flag2&4*NLS2核定位信号依次包括1个3*Flag2标签蛋白和4个NLS2蛋白，3*Flag2&4*NLS2核定位信号的氨基酸序列如下：

(序列10)；其中，3*Flag2标签蛋白的氨基酸序列如下划线所示，NLS2蛋白的氨基酸序列如波浪线所示。4*NLS2核定位信号包括4个NLS2蛋白，4*NLS2核定位信号的氨基酸序列如下：

(序列11)。将该种设计类型记做3*Flag2&4*NLS2-4*NLS2(F4NLS)。

4NLS-sABE系统：在ecTadA&ecTadA*&Cas9n碱基编辑系统中的Cas9n元件后添加4*NLS2核定位信号。将该种设计类型记做4*NLS2(4NLS)。

上述四种腺嘌呤碱基编辑器对应的重组表达载体中均包括esgRNA，该esgRNA靶向序列12所示的OsACC1基因靶点序列，该靶点序列第7位为目标位点。上述四种腺嘌呤碱基编辑器可将受体水稻基因组中OsACC1蛋白的编码基因的非编码链上第6295位的碱基A突变为碱基G，进而使OsACC1蛋白的编码基因的编码链上(序列14)的第6295位的碱基T突变为碱基C，导致OsACC1蛋白第2099位的半胱氨酸(C)的密码子由“TGC”变成“CGC”(图2)，所以OsACC1蛋白第2099位由半胱氨酸(C)突变成精氨酸(R)，发生该突变的水稻突变体即为本发明的ACCase抑制除草剂抗性水稻，将其记做C2099R突变体，也即下文中的A7>G7突变体。C2099R突变体(A7>G7突变体)能够使水稻产生ACCase抑制除草剂抗性。

2、重组表达载体的构建

人工合成步骤1中四种腺嘌呤碱基编辑器对应的重组表达载体，各载体均为环状质粒：

一个含有bpNLS-bpNLS的重组表达载体：sABE-1；

一个含有3*Flag1&1*NLS1-1*NLS1(FNLS)的重组表达载体：FNLS-sABE-1；

一个含有3*Flag2&4*NLS2-4*NLS2(F4NLS)的重组表达载体：F4NLS-sABE-1；

一个含有4*NLS2(4NLS)的重组表达载体：4NLS-sABE-1。

sABE-1重组表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。其中，序列1的第131-596位为OsU6a启动子的核苷酸序列，第710-1090位为OsU3启动子的核苷酸序列，第1204-1945位为OsU6c启动子的核苷酸序列，第597-702位、第1091-1196位和第1946-2051位均为esgRNA核苷酸序列，第597-616位、第1091-1110位和第1946-1965位分别为T1、T2和OsACC-T靶点序列，第617-702位、第1111-1196位和第1966-2051位均为esgRNA骨架核苷酸序列；序列1的第2070-3783位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3796-3846位为bpNLS核苷酸序列，第3847-4344位为ecTadA蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列2所示的ecTadA蛋白质；序列1的第4441-4938位为ecTadA*蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列3所示的ecTadA*蛋白质；序列1的第5035-9135位为Cas9n蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列4所示的Cas9n蛋白质；序列1的第9136-9186位为bpNLS核苷酸序列；序列1的第9529-9781位为Nos终止子序列；序列1的第9822-11814位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第11821-12846位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，第12873-13088位为CaMV35S polyA的核苷酸序列。sABE-1重组表达载体中的三个靶点分别为T1、T2和OsACC-T，序列见表1。

FNLS-sABE-1重组表达载体为将sABE-1重组表达载体序列中序列1第3796-3846位所示的bpNLS核苷酸序列替换为序列5，且将第9136-9186位所示的bpNLS核苷酸序列替换为序列5第73-93位所示的核苷酸序列，且保持其他序列不变后得到的序列。其中，序列5的第1-66位为3*Flag1核苷酸序列，第73-93位为NLS1核苷酸序列，序列5中共计含有1个NLS1核苷酸序列。

F4NLS-sABE-1重组表达载体为将sABE-1重组表达载体序列中序列1第3796-3846位所示的bpNLS核苷酸序列替换为序列6，且将第9136-9186位所示的bpNLS核苷酸序列替换为序列6第55-201位所示的核苷酸序列，且保持其他序列不变后得到的序列。其中，序列6第1-66位为3*Flag2核苷酸序列，第73-93位、第103-123位、第133-153位和第163-183位均为NLS2核苷酸序列，序列6中共计含有4个NLS2核苷酸序列。

4NLS-sABE-1重组表达载体为将sABE-1重组表达载体序列中序列1第3796-3846位所示的bpNLS核苷酸序列删除，且将第9136-9186位所示的bpNLS核苷酸序列替换为序列6第55-201位所示的核苷酸序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

各载体的靶点核苷酸序列及相应的PAM序列如表1所示。

表1

二、水稻阳性T0苗的获得

将步骤一获得的sABE-1载体，FNLS-sABE-1载体，F4NLS-sABE-1载体和4NLS-sABE-1载体分别按照如下步骤1-9进行操作：

1、将载体导入农杆菌EHA105(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)，得到重组农杆菌。

2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD₆₀₀为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD₆₀₀为0.2，得到农杆菌侵染液。

3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。

4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。

5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。

6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基上，28℃暗培养2周。

7、取步骤6得到的水稻愈伤，再次置于筛选培养基上，28℃暗培养2周，得到水稻抗性愈伤。

8、取步骤7得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右，将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取水稻T0苗。

9、提取水稻T0苗的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-CCGAGGAGACTATCACCCCT-3’)和引物R(5’-CGACCCATAACCTTGACAAGC-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约853bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为水稻阳性T0苗；如果PCR扩增产物中不含有约853bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗不为水稻阳性T0苗。

三、结果分析

1、每载体分别取步骤二所获得的水稻阳性T0苗的基因组DNA作为模板，对于OsACC-T靶点，采用引物对T进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。测序结果只针对靶点区进行分析。统计OsACC-T靶点发生A·G碱基替换的阳性T0苗数，计算得出A·G碱基替换效率，结果见表2。

sABE系统使用的核定位信号为bpNLS-bpNLS；FNLS-sCBE系统使用的核定位信号为3*Flag1&1*NLS1-1*NLS1；F4NLS-sCBE系统使用的核定位信号为3*Flag2&4*NLS2-4*NLS2；4NLS-sABE系统使用的核定位信号为4*NLS2。

结果表明，四种系统(sABE系统、FNLS-sABE系统、F4NLS-sABE系统、4NLS-sABE系统)均只产生单一的A7>G7突变体(图3)，且A·G碱基替换效率均高于50％。其中，FNLS-sABE系统的A·G碱基替换效率最高，高达78.3％，sABE系统和F4NLS-sABE系统的A·G碱基替换效率次之，分别为66.7％和61.9％，4NLS-sABE系统最低，为52.2％。由此可见，sABE、FNLS-sABE和F4NLS-sABE这三种系统只产生单一的A7>G7突变体(仅有目标位点发生突变，其余位点均未发生突变)，且A·G碱基替换效率高，大大提高了A7>G7突变体的创制效率。

表2

实施例2、A7>G7突变体的ACCase抑制除草剂抗性检测

一、除草剂喷施实验

随机选择实施例1步骤三所获得的15株发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗和15株未发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗(记为WT苗)，分别按照如下步骤1-4进行操作：

1、水稻阳性T0苗在生根培养基中长至15-20厘米左右时，打开培养皿盖子，放入清水进行炼苗，25℃光照培养5天。

2、炼苗结束后，从培养基中取出T0苗，用清水将根中残留的培养基洗干净，送进温室移栽至小盆中，15天后转移至大盆进行培养。

3、在6-10叶期，随机选择三株发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗和三株未发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗作为一组，共五组。每组分别用喷雾器喷施1L浓度分别为0ug/l、42ug/l、84ug/l、168ug/l、1680ug/l的盖草能(69806-34-4，陶氏益农，有效成分吡氟氯禾灵含量为108克/升)，每隔两周喷施一次，共喷施3次。

4、待未发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗生长停止甚至枯死时，以及发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗正常抽穗结实时进行拍照。

二、结果分析

盖草能属于ACCase抑制除草剂中APP类型的一个品种。对于五种浓度0ug/l、42ug/l、84ug/l、168ug/l、1680ug/l，前四种浓度均未对未发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗有明显抑制效果，即WT苗均生长正常，只有1680ug/l的盖草能对WT苗表现出明显抑制效果，而发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗则生长正常(图4)，且发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗抽穗结实也表现为正常(图5)。由此可见，发生A7>G7突变的水稻阳性T0苗具有ACCase抑制除草剂抗性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>核定位信号F4NLS在高效创制水稻除草剂抗性材料中的应用

<160>14

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>19494

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacatg gcactagcct caccgtcttc gcagacgagg 60

ccgctaagtc gcagctacgc tctcaacggc actgactagg tagtttaaac gtgcacttaa 120

ttaaggtacc tggaatcggc agcaaaggat tttttcctgt agttttccca caaccatttt 180

ttaccatccg aatgatagga taggaaaaat atccaagtga acagtattcc tataaaattc 240

ccgtaaaaag cctgcaatcc gaatgagccc tgaagtctga actagccggt cacctgtaca 300

ggctatcgag atgccataca agagacggta gtaggaacta ggaagacgat ggttgattcg 360

tcaggcgaaa tcgtcgtcct gcagtcgcat ctatgggcct ggacggaata ggggaaaaag 420

ttggccggat aggagggaaa ggcccaggtg cttacgtgcg aggtaggcct gggctctcag 480

cacttcgatt cgttggcacc ggggtaggat gcaatagaga gcaacgttta gtaccacctc 540

gcttagctag agcaaactgg actgccttat atgcgcgggt gctggcttgg ctgccgagtg 600

cacggtgtcc gtggccgttt cagagctatg ctggaaacag catagcaagt tgaaataagg 660

ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttta ggaatcttta 720

aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact taaagttatc aggcatgcat 780

ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc acaagacagg cgtcttctac 840

tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt acgttggaaa ccacgtgtga 900

tgtgaaggag taagataaac tgtaggagaa aagcatttcg tagtgggcca tgaagccttt 960

caggacatgt attgcagtat gggccggccc attacgcaat tggacgacaa caaagactag 1020

tattagtacc acctcggcta tccacataga tcaaagctgg tttaaaagag ttgtgcagat 1080

gatccgtggc gttgatagca agataaaccc gtttcagagc tatgctggaa acagcatagc 1140

aagttgaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 1200

tttctcatta gcggtatgca tgttggtaga agtcggagat gtaaataatt ttcattatat 1260

aaaaaaggta cttcgagaaa aataaatgca tacgaattaa ttctttttat gttttttaaa 1320

ccaagtatat agaatttatt gatggttaaa atttcaaaaa tatgacgaga gaaaggttaa 1380

acgtacggca tatacttctg aacagagagg gaatatgggg tttttgttgc tcccaacaat 1440

tcttaagcac gtaaaggaaa aaagcacatt atccacattg tacttccaga gatatgtaca 1500

gcattacgta ggtacgtttt ctttttcttc ccggagagat gatacaataa tcatgtaaac 1560

ccagaattta aaaaatattc tttactataa aaattttaat tagggaacgt attatttttt 1620

acatgacacc ttttgagaaa gagggacttg taatatggga caaatgaaca atttctaaga 1680

aatgggcata tgactctcag tacaatggac caaattccct ccagtcggcc cagcaataca 1740

aagggaaaga aatgaggggg cccacaggcc acggcccact tttctccgtg gtggggagat 1800

ccagctagag gtccggccca caagtggccc ttgccccgtg ggacggtggg attgcagagc 1860

gcgtgggcgg aaacaacagt ttagtaccac ctcgctcacg caacgacgcg accacttgct 1920

tataagctgc tgcgctgagg ctcagcatag cactcaatgc ggtctgtttc agagctatgc 1980

tggaaacagc atagcaagtt gaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 2040

cgagtcggtg cttttttttt tttaagctta caaattcggg tcaaggcgga agccagcgcg 2100

ccaccccacg tcagcaaata cggaggcgcg gggttgacgg cgtcacccgg tcctaacggc 2160

gaccaacaaa ccagccagaa gaaattacag taaaaaaaaa gtaaattgca ctttgatcca 2220

ccttttatta cctaagtctc aatttggatc acccttaaac ctatcttttc aatttgggcc 2280

gggttgtggt ttggactacc atgaacaact tttcgtcatg tctaacttcc ctttcagcaa 2340

acatatgaac catatataga ggagatcggc cgtatactag agctgatgtg tttaaggtcg 2400

ttgattgcac gagaaaaaaa aatccaaatc gcaacaatag caaatttatc tggttcaaag 2460

tgaaaagata tgtttaaagg tagtccaaag taaaacttat agataataaa atgtggtcca 2520

aagcgtaatt cactcaaaaa aaatcaacga gacgtgtacc aaacggagac aaacggcatc 2580

ttctcgaaat ttcccaaccg ctcgctcgcc cgcctcgtct tcccggaaac cgcggtggtt 2640

tcagcgtggc ggattctcca agcagacgga gacgtcacgg cacgggactc ctcccaccac 2700

ccaaccgcca taaataccag ccccctcatc tcctctcctc gcatcagctc cacccccgaa 2760

aaatttctcc ccaatctcgc gaggctctcg tcgtcgaatc gaatcctctc gcgtcctcaa 2820

ggtacgctgc ttctcctctc ctcgcttcgt ttcgattcga tttcggacgg gtgaggttgt 2880

tttgttgcta gatccgattg gtggttaggg ttgtcgatgt gattatcgtg agatgtttag 2940

gggttgtaga tctgatggtt gtgatttggg cacggttggt tcgataggtg gaatcgtggt 3000

taggttttgg gattggatgt tggttctgat gattgggggg aatttttacg gttagatgaa 3060

ttgttggatg attcgattgg ggaaatcggt gtagatctgt tggggaattg tggaactagt 3120

catgcctgag tgattggtgc gatttgtagc gtgttccatc ttgtaggcct tgttgcgagc 3180

atgttcagat ctactgttcc gctcttgatt gagttattgg tgccatgggt tggtgcaaac 3240

acaggcttta atatgttata tctgttttgt gtttgatgta gatctgtagg gtagttcttc 3300

ttagacatgg ttcaattatg tagcttgtgc gtttcgattt gatttcatat gttcacagat 3360

tagataatga tgaactcttt taattaattg tcaatggtaa ataggaagtc ttgtcgctat 3420

atctgtcata atgatctcat gttactatct gccagtaatt tatgctaaga actatattag 3480

aatatcatgt tacaatctgt agtaatatca tgttacaatc tgtagttcat ctatataatc 3540

tattgtggta atttcttttt actatctgtg tgaagattat tgccactagt tcattctact 3600

tatttctgaa gttcaggata cgtgtgctgt tactacctat ctgaatacat gtgtgatgtg 3660

cctgttacta tctttttgaa tacatgtatg ttctgttgga atatgtttgc tgtttgatcc 3720

gttgttgtgt ccttaatctt gtgctagttc ttaccctatc tgtttggtga ttatttcttg 3780

cagtacgtaa gcatgaagag gaccgccgac ggcagcgagt tcgagccgaa gaagaagagg 3840

aaggtgtccg aggtggagtt ctcccacgag tactggatga ggcacgcact caccctcgca 3900

aagagggcat gggacgagag ggaggtgcct gtgggagcag tgctcgtgca caacaacagg 3960

gtgatcggag agggatggaa caggcctatc ggaaggcacg accctaccgc acacgcagag 4020

atcatggcac tcaggcaggg aggcctcgtg atgcagaact acaggctcat cgacgccacc 4080

ctctacgtga ccctcgagcc ttgcgtgatg tgcgcaggag ccatgatcca ctccaggatc 4140

ggaagggtgg tgttcggagc aagggacgca aagaccggag cagccggctc cctcatggac 4200

gtgctccacc acccgggcat gaaccacagg gtggagatca ccgagggaat cctcgcagac 4260

gagtgcgcag ccctcctctc cgacttcttc aggatgagga ggcaggagat caaggcccag 4320

aagaaggccc agtcctccac cgactccggc ggctcatcag gcggctcctc cggctccgag 4380

acaccgggca cctccgagtc cgccaccccg gagtcctccg gcggctcctc cggcggctcc 4440

tccgaggtgg agttctccca cgagtactgg atgaggcacg cactcaccct cgcaaagagg 4500

gcaagggacg agagggaggt gcctgtggga gcagtgctcg tgctcaacaa cagggtgatc 4560

ggagagggat ggaacagggc aatcggcctc cacgacccta ccgcacacgc agagatcatg 4620

gcactcaggc agggaggcct cgtgatgcag aactacaggc tcatcgacgc caccctctac 4680

gtgaccttcg agccttgcgt gatgtgcgca ggagccatga tccactccag gatcggcagg 4740

gtggtgttcg gcgtgaggaa cgcaaagacc ggagcagcag gctccctcat ggacgtgctc 4800

cactacccgg gcatgaacca cagggtggag atcaccgagg gaatcctcgc agacgagtgc 4860

gcagccctcc tctgctactt cttcaggatg ccgaggcagg tgttcaacgc ccagaagaag 4920

gcccagtcct ccaccgactc cggcggctca tcaggcggct cctccggctc cgagacaccg 4980

ggcacctccg agtccgccac cccggagtcc tccggcggct cctccggcgg ctccgacaag 5040

aagtactcca tcggcctcgc catcggcacc aacagcgtcg gctgggcggt gatcaccgac 5100

gagtacaagg tcccgtccaa gaagttcaag gtcctgggca acaccgaccg ccactccatc 5160

aagaagaacc tcatcggcgc cctcctcttc gactccggcg agacggcgga ggcgacccgc 5220

ctcaagcgca ccgcccgccg ccgctacacc cgccgcaaga accgcatctg ctacctccag 5280

gagatcttct ccaacgagat ggcgaaggtc gacgactcct tcttccaccg cctcgaggag 5340

tccttcctcg tggaggagga caagaagcac gagcgccacc ccatcttcgg caacatcgtc 5400

gacgaggtcg cctaccacga gaagtacccc actatctacc accttcgtaa gaagcttgtt 5460

gactctactg ataaggctga tcttcgtctc atctaccttg ctctcgctca catgatcaag 5520

ttccgtggtc acttccttat cgagggtgac cttaaccctg ataactccga cgtggacaag 5580

ctcttcatcc agctcgtcca gacctacaac cagctcttcg aggagaaccc tatcaacgct 5640

tccggtgtcg acgctaaggc gatcctttcc gctaggctct ccaagtccag gcgtctcgag 5700

aacctcatcg cccagctccc tggtgagaag aagaacggtc ttttcggtaa cctcatcgct 5760

ctctccctcg gtctgacccc taacttcaag tccaacttcg acctcgctga ggacgctaag 5820

cttcagctct ccaaggatac ctacgacgat gatctcgaca acctcctcgc tcagattgga 5880

gatcagtacg ctgatctctt ccttgctgct aagaacctct ccgatgctat cctcctttcg 5940

gatatcctta gggttaacac tgagatcact aaggctcctc tttctgcttc catgatcaag 6000

cgctacgacg agcaccacca ggacctcacc ctcctcaagg ctcttgttcg tcagcagctc 6060

cccgagaagt acaaggagat cttcttcgac cagtccaaga acggctacgc cggttacatt 6120

gacggtggag ctagccagga ggagttctac aagttcatca agccaatcct tgagaagatg 6180

gatggtactg aggagcttct cgttaagctt aaccgtgagg acctccttag gaagcagagg 6240

actttcgata acggctctat ccctcaccag atccaccttg gtgagcttca cgccatcctt 6300

cgtaggcagg aggacttcta ccctttcctc aaggacaacc gtgagaagat cgagaagatc 6360

cttactttcc gtattcctta ctacgttggt cctcttgctc gtggtaactc ccgtttcgct 6420

tggatgacta ggaagtccga ggagactatc accccttgga acttcgagga ggttgttgac 6480

aagggtgctt ccgcccagtc cttcatcgag cgcatgacca acttcgacaa gaacctcccc 6540

aacgagaagg tcctccccaa gcactccctc ctctacgagt acttcacggt ctacaacgag 6600

ctcaccaagg tcaagtacgt caccgagggt atgcgcaagc ctgccttcct ctccggcgag 6660

cagaagaagg ctatcgttga cctcctcttc aagaccaacc gcaaggtcac cgtcaagcag 6720

ctcaaggagg actacttcaa gaagatcgag tgcttcgact ccgtcgagat cagcggcgtt 6780

gaggaccgtt tcaacgcttc tctcggtacc taccacgatc tcctcaagat catcaaggac 6840

aaggacttcc tcgacaacga ggagaacgag gacatcctcg aggacatcgt cctcactctt 6900

actctcttcg aggataggga gatgatcgag gagaggctca agacttacgc tcatctcttc 6960

gatgacaagg ttatgaagca gctcaagcgt cgccgttaca ccggttgggg taggctctcc 7020

cgcaagctca tcaacggtat cagggataag cagagcggca agactatcct cgacttcctc 7080

aagtctgatg gtttcgctaa caggaacttc atgcagctca tccacgatga ctctcttacc 7140

ttcaaggagg atattcagaa ggctcaggtg tccggtcagg gcgactctct ccacgagcac 7200

attgctaacc ttgctggttc ccctgctatc aagaagggca tccttcagac tgttaaggtt 7260

gtcgatgagc ttgtcaaggt tatgggtcgt cacaagcctg agaacatcgt catcgagatg 7320

gctcgtgaga accagactac ccagaagggt cagaagaact cgagggagcg catgaagagg 7380

attgaggagg gtatcaagga gcttggttct cagatcctta aggagcaccc tgtcgagaac 7440

acccagctcc agaacgagaa gctctacctc tactacctcc agaacggtag ggatatgtac 7500

gttgaccagg agctcgacat caacaggctt tctgactacg acgtcgacca cattgttcct 7560

cagtctttcc ttaaggatga ctccatcgac aacaaggtcc tcacgaggtc cgacaagaac 7620

aggggtaagt cggacaacgt cccttccgag gaggttgtca agaagatgaa gaactactgg 7680

aggcagcttc tcaacgctaa gctcattacc cagaggaagt tcgacaacct cacgaaggct 7740

gagaggggtg gcctttccga gcttgacaag gctggtttca tcaagaggca gcttgttgag 7800

acgaggcaga ttaccaagca cgttgctcag atcctcgatt ctaggatgaa caccaagtac 7860

gacgagaacg acaagctcat ccgcgaggtc aaggtgatca ccctcaagtc caagctcgtc 7920

tccgacttcc gcaaggactt ccagttctac aaggtccgcg agatcaacaa ctaccaccac 7980

gctcacgatg cttaccttaa cgctgtcgtt ggtaccgctc ttatcaagaa gtaccctaag 8040

cttgagtccg agttcgtcta cggtgactac aaggtctacg acgttcgtaa gatgatcgcc 8100

aagtccgagc aggagatcgg caaggccacc gccaagtact tcttctactc caacatcatg 8160

aacttcttca agaccgagat caccctcgcc aacggcgaga tccgcaagcg ccctcttatc 8220

gagacgaacg gtgagactgg tgagatcgtt tgggacaagg gtcgcgactt cgctactgtt 8280

cgcaaggtcc tttctatgcc tcaggttaac atcgtcaaga agaccgaggt ccagaccggt 8340

ggcttctcca aggagtctat ccttccaaag agaaactcgg acaagctcat cgctaggaag 8400

aaggattggg accctaagaa gtacggtggt ttcgactccc ctactgtcgc ctactccgtc 8460

ctcgtggtcg ccaaggtgga gaagggtaag tcgaagaagc tcaagtccgt caaggagctc 8520

ctcggcatca ccatcatgga gcgctcctcc ttcgagaaga acccgatcga cttcctcgag 8580

gccaagggct acaaggaggt caagaaggac ctcatcatca agctccccaa gtactctctt 8640

ttcgagctcg agaacggtcg taagaggatg ctggcttccg ctggtgagct ccagaagggt 8700

aacgagcttg ctcttccttc caagtacgtg aacttcctct acctcgcctc ccactacgag 8760

aagctcaagg gttcccctga ggataacgag cagaagcagc tcttcgtgga gcagcacaag 8820

cactacctcg acgagatcat cgagcagatc tccgagttct ccaagcgcgt catcctcgct 8880

gacgctaacc tcgacaaggt cctctccgcc tacaacaagc accgcgacaa gcccatccgc 8940

gagcaggccg agaacatcat ccacctcttc acgctcacga acctcggcgc ccctgctgct 9000

ttcaagtact tcgacaccac catcgacagg aagcgttaca cgtccaccaa ggaggttctc 9060

gacgctactc tcatccacca gtccatcacc ggtctttacg agactcgtat cgacctttcc 9120

cagcttggtg gtgataagag gaccgccgac ggcagcgagt tcgagccgaa gaagaagagg 9180

aaggtgtaga ctagttcagc cagtttggtg gagctgccga tgtgcctggt cgtcccgagc 9240

ctctgttcgt caagtatttg tggtgctgat gtctacttgt gtctggttta atggaccatc 9300

gagtccgtat gatatgttag ttttatgaaa cagtttcctg tgggacagca gtatgcttta 9360

tgaataagtt ggatttgaac ctaaatatgt gctcaatttg ctcatttgca tctcattcct 9420

gttgatgttt tatctgagtt gcaagtttga aaatgctgca tattcttatt aaatcgtcat 9480

ttacttttat cttaatgagc tttgcaatgg cctatgggat ataaaagaga tcgttcaaac 9540

atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata 9600

taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt 9660

atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac 9720

aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat 9780

cggcgcctgt ccgggcgcgc ctggtggatc gtccgcctag gctgcagtgc agcgtgaccc 9840

ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac 9900

atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa 9960

actttactct acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat 10020

catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact 10080

ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc 10140

tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt 10200

tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa 10260

ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa 10320

gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc 10380

ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa 10440

ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg 10500

ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca 10560

tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc 10620

ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc 10680

ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt 10740

tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt 10800

caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc 10860

ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt 10920

gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc 10980

tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg 11040

cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt 11100

tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt 11160

tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct 11220

gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt 11280

catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg 11340

atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt 11400

ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac 11460

ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag 11520

tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg 11580

atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat 11640

ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg 11700

catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct 11760

tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcaggagctc 11820

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cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 12060

ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gttcacaggg tgtcacgttg 12120

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aaatagagta gatgccgacc gggatctgtc gatcgacaag ctcgagtttc tccataataa 12900

tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta gggttcctat agggtttcgc tcatgtgttg 12960

agcatataag aaacccttag tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat caataaaatt 13020

tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta aaatccagat cccccgaatt aattcggcgt 13080

taattcagcc tgcaggacgc gtttaattaa gtgcacgcgg ccgcctactt agtcaagagc 13140

ctcgcacgcg actgtcacgc ggccaggatc gcctcgtgag cctcgcaatc tgtacctagt 13200

gtttaaacta tcagtgtttg acaggatata ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt 13260

ttattagaat aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta 13320

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cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc gccctgccct tttcctggcg ttttcttgtc 13500

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ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag 14040

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tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata 14520

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tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag 15360

accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga 15420

ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc 15480

aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag 15540

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cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 15840

ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 15900

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tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 16440

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ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 16620

tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 16680

agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg 16740

tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 16800

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gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt 17100

cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag gcaccctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac 17160

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gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca 17280

gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag 17340

agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 17400

gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 17460

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 17520

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 17580

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 17640

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 17700

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 17760

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 17820

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cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 18000

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aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 18240

actcacgtta agggattttg gtcatgcatt ctaggtacta aaacaattca tccagtaaaa 18300

tataatattt tattttctcc caatcaggct tgatccccag taagtcaaaa aatagctcga 18360

catactgttc ttccccgata tcctccctga tcgaccggac gcagaaggca atgtcatacc 18420

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caaagatgtt gctgtctccc aggtcgccgt gggaaaagac aagttcctct tcgggctttt 18540

ccgtctttaa aaaatcatac agctcgcgcg gatctttaaa tggagtgtct tcttcccagt 18600

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tgtctaagct attcgtatag ggacaatccg atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc 18720

actccgcata cagctcgata atcttttcag ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc 18780

aaaggacgcc atcggcctca ctcatgagca gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt 18840

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ccacatcata ggtggtccct ttataccggc tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat 18960

tttctcccac cagcttatat accttagcag gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc 19020

ggtatttttc gatcagtttt ttcaattccg gtgatattct cattttagcc atttattatt 19080

tccttcctct tttctacagt atttaaagat accccaagaa gctaattata acaagacgaa 19140

ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa 19200

gttgttttca aagttggcgt ataacatagt atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg 19260

atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat 19320

ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc gttcttccga atagcatcgg taacatgagc 19380

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<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>2

Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val

20 25 30

Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile

35 40 45

Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln

50 55 60

Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser

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Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala

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Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg

115 120 125

Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu

130 135 140

Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gln Ser Ser Thr Asp

165

<210>3

<211>166

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>3

Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val

20 25 30

Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile

35 40 45

Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln

50 55 60

Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser

85 90 95

Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala

100 105 110

Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg

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Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu

130 135 140

Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys

145 150 155 160

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165

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<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>4

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Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

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Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

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Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

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Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

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Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

500 505 510

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

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Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

625 630 635 640

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

645 650 655

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

660 665 670

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

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Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

785 790 795 800

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

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Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

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Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

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Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

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Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

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Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu

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Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg

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Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

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Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser

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Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe

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Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

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Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg

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Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr

1280 1285 1290

Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile

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Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe

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Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr

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Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly

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Leu Ser Glu Leu Glu Met Phe Thr Glu Glu Ser Lys Gly Leu Ser

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Arg Ala Tyr Lys Glu Thr Phe Thr Leu Thr Phe Val Thr Gly Arg

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Val Ile Lys Lys Val Val Asp Trp Glu Glu Ser Arg Ser Phe Phe

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atgacatcca cacatgtggc gacattggga gttggtgccc aggcacctcc tcgtcaccag 60

aaaaagtcag ctggcactgc atttgtatca tctgggtcat caagaccctc ataccgaaag 120

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aagcttaacc actctattcg ccaaggtctt gctggcatca ttgacctccc aaatgacgca 240

gcttcagaag ttgatatttc acatggttcc gaagatccca gggggcctac ggtcccaggt 300

tcctaccaaa tgaatgggat tatcaatgaa acacataatg ggaggcatgc ttcagtctcc 360

aaggttgttg agttttgtac ggcacttggt ggcaaaacac caattcacag tgtattagtg 420

gccaacaatg gaatggcagc agctaagttc atgcggagtg tccgaacatg ggctaatgat 480

acttttggat cagagaaggc aattcagctg atagctatgg caactccgga ggatctgagg 540

ataaatgcag agcacatcag aattgccgat caatttgtag aggtacctgg tggaacaaac 600

aacaacaact atgcaaatgt ccaactcata gtggagatag cagagagaac aggtgtttct 660

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gcaaaaggaa ttgtttttct tgggccacca gcatcatcaa tgcatgcatt aggagacaag 780

gttggctcag ctctcattgc tcaagcagct ggagttccaa cacttgcttg gagtggatca 840

catgtggaag ttcctctgga gtgttgcttg gactcaatac ctgatgagat gtatagaaaa 900

gcttgtgtta ctaccacaga ggaagcagtt gcaagttgtc aggtggttgg ttatcctgcc 960

atgattaagg catcttgggg tggtggtggt aaaggaataa ggaaggttca taatgatgat 1020

gaggttagga cattatttaa gcaagttcaa ggcgaagtac ctggttcccc aatatttatc 1080

atgaggctag ctgctcagag tcgacatctt gaagttcagt tgctttgtga tcaatatggc 1140

aacgtagcag cacttcacag tcgagattgc agtgtacaac ggcgacacca aaagataatc 1200

gaggaaggac cagttactgt tgctcctcgt gagactgtga aagagcttga gcaggcagca 1260

cggaggcttg ctaaagctgt gggttatgtt ggtgctgcta ctgttgaata cctttacagc 1320

atggaaactg gtgaatatta ttttctggaa cttaatccac ggctacaggt tgagcatcct 1380

gtcactgagt ggatagctga agtaaatttg cctgcggctc aagttgctgt tggaatgggt 1440

ataccccttt ggcagattcc agagatcagg cgcttctacg gaatgaacca tggaggaggc 1500

tatgaccttt ggaggaaaac agcagctcta gcgactccat ttaactttga tgaagtagat 1560

tctaaatggc caaaaggcca ctgcgtagct gttagaataa ctagcgagga tccagatgat 1620

gggtttaagc ctactggtgg aaaagtaaag gagataagtt tcaagagtaa accaaatgtt 1680

tgggcctatt tctcagtaaa gtctggtgga ggcatccatg aattcgctga ttctcagttc 1740

ggacatgttt ttgcgtatgg aactactaga tcggcagcaa taactaccat ggctcttgca 1800

ctaaaagagg ttcaaattcg tggagaaatt cattcaaacg tagactacac agttgaccta 1860

ttaaatgcct cagattttag agaaaataag attcatactg gttggctgga taccaggata 1920

gccatgcgtg ttcaagctga gaggcctcca tggtatattt cagtcgttgg aggggcttta 1980

tataaaacag taactgccaa cacggccact gtttctgatt atgttggtta tcttaccaag 2040

ggccagattc caccaaagca tatatccctt gtctatacga ctgttgcttt gaatatagat 2100

gggaaaaaat atacaatcga tactgtgagg agtggacatg gtagctacag attgcgaatg 2160

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attgatggaa agacatgcat gttacagaat gaccatgacc catcaaagtt attagctgag 2340

acaccatgca aacttcttcg tttcttggtt gctgatggtg ctcatgttga tgctgatgta 2400

ccatatgcgg aagttgaggt tatgaagatg tgcatgcccc tcttatcacc cgcttctggt 2460

gtcatacatg ttgtaatgtc tgagggccaa gcaatgcagg ctggtgatct tatagctagg 2520

ctggatcttg atgacccttc tgctgttaag agagctgagc cgttcgaaga tacttttcca 2580

caaatgggtc tccctattgc tgcttctggc caagttcaca aattatgtgc tgcaagtctg 2640

aatgcttgtc gaatgatcct tgcggggtat gagcatgata ttgacaaggt tgtgccagag 2700

ttggtatact gcctagacac tccggagctt cctttcctgc agtgggagga gcttatgtct 2760

gttttagcaa ctagacttcc aagaaatctt aaaagtgagt tggagggcaa atatgaggaa 2820

tacaaagtaa aatttgactc tgggataatc aatgatttcc ctgccaatat gctacgagtg 2880

ataattgagg aaaatcttgc atgtggttct gagaaggaga aggctacaaa tgagaggctt 2940

gttgagcctc ttatgagcct actgaagtca tatgagggtg ggagagaaag tcatgctcac 3000

tttgttgtca agtccctttt tgaggagtat ctctatgttg aagaattgtt cagtgatgga 3060

attcagtctg atgtgattga gcgtctgcgc cttcaacata gtaaagacct acagaaggtc 3120

gtagacattg tgttgtccca ccagagtgtt agaaataaaa ctaagctgat actaaaactc 3180

atggagagtc tggtctatcc aaatcctgct gcctacaggg atcaattgat tcgcttttct 3240

tcccttaatc acaaagcgta ttacaagttg gcacttaaag ctagtgaact tcttgaacaa 3300

acaaaactta gtgagctccg tgcaagaata gcaaggagcc tttcagagct ggagatgttt 3360

actgaggaaa gcaagggtct ctccatgcat aagcgagaaa ttgccattaa ggagagcatg 3420

gaagatttag tcactgctcc actgccagtt gaagatgcgc tcatttcttt atttgattgt 3480

agtgatacaa ctgttcaaca gagagtgatt gagacttata tagctcgatt ataccagcct 3540

catcttgtaa aggacagtat caaaatgaaa tggatagaat cgggtgttat tgctttatgg 3600

gaatttcctg aagggcattt tgatgcaaga aatggaggag cggttcttgg tgacaaaaga 3660

tggggtgcca tggtcattgt caagtctctt gaatcacttt caatggccat tagatttgca 3720

ctaaaggaga catcacacta cactagctct gagggcaata tgatgcatat tgctttgttg 3780

ggtgctgata ataagatgca tataattcaa gaaagtggtg atgatgctga cagaatagcc 3840

aaacttccct tgatactaaa ggataatgta accgatctgc atgcctctgg tgtgaaaaca 3900

ataagtttca ttgttcaaag agatgaagca cggatgacaa tgcgtcgtac cttcctttgg 3960

tctgatgaaa agctttctta tgaggaagag ccaattctcc ggcatgtgga acctcctctt 4020

tctgcacttc ttgagttgga caagttgaaa gtgaaaggat acaatgaaat gaagtatacc 4080

ccatcacggg atcgtcaatg gcatatctac acacttagaa atactgaaaa ccccaaaatg 4140

ttgcaccggg tatttttccg aacccttgtc aggcaaccca gtgtatccaa caagttttct 4200

tcgggccaga ttggtgacat ggaagttggg agtgctgaag aacctctgtc atttacatca 4260

accagcatat taagatcttt gatgactgct atagaggaat tggagcttca cgcaattaga 4320

actggccatt cacacatgta tttgcatgta ttgaaagaac aaaagcttct tgatcttgtt 4380

ccagtttcag ggaatacagt tttggatgtt ggtcaagatg aagctactgc atattcactt 4440

ttaaaagaaa tggctatgaa gatacatgaa cttgttggtg caagaatgca ccatctttct 4500

gtatgccaat gggaagtgaa acttaagttg gactgcgatg gtcctgccag tggtacctgg 4560

aggattgtaa caaccaatgt tactagtcac acttgcactg tggatatcta ccgtgagatg 4620

gaagataaag aatcacggaa gttagtatac catcccgcca ctccggcggc tggtcctctg 4680

catggtgtgg cactgaataa tccatatcag cctttgagtg tcattgatct caaacgctgt 4740

tctgctagga ataatagaac tacatactgc tatgattttc cactggcatt tgaaactgca 4800

gtgaggaagt catggtcctc tagtacctct ggtgcttcta aaggtgttga aaatgcccaa 4860

tgttatgtta aagctacaga gttggtattt gcggacaaac atgggtcatg gggcactcct 4920

ttagttcaaa tggaccggcc tgctgggctc aatgacattg gtatggtagc ttggaccttg 4980

aagatgtcca ctcctgaatt tcctagtggt agggagatta ttgttgttgc aaatgatatt 5040

acgttcagag ctggatcatt tggcccaagg gaagatgcat tttttgaagc tgttaccaac 5100

ctagcctgtg agaagaaact tcctcttatt tatttggcag caaattctgg tgctcgaatt 5160

ggcatagcag atgaagtgaa atcttgcttc cgtgttgggt ggtctgatga tggcagccct 5220

gaacgtgggt ttcagtacat ttatctaagc gaagaagact atgctcgtat tggcacttct 5280

gtcatagcac ataagatgca gctagacagt ggtgaaatta ggtgggttat tgattctgtt 5340

gtgggcaagg aagatggact tggtgtggag aatatacatg gaagtgctgc tattgccagt 5400

gcttattcta gggcatataa ggagacattt acacttacat ttgtgactgg aagaactgtt 5460

ggaataggag cttatcttgc tcgacttggc atccggtgca tacagcgtct tgaccagcct 5520

attattctta caggctattc tgcactgaac aagcttcttg ggcgggaagt gtacagctcc 5580

cacatgcagt tgggtggtcc caaaatcatg gcaactaatg gtgttgtcca tcttactgtt 5640

tcagatgacc ttgaaggcgt ttctaatata ttgaggtggc tcagttatgt tcctgcctac 5700

attggtggac cacttccagt aacaacaccg ttggacccac cggacagacc tgttgcatac 5760

attcctgaga actcgtgtga tcctcgagcg gctatccgtg gtgttgatga cagccaaggg 5820

aaatggttag gtggtatgtt tgataaagac agctttgtgg aaacatttga aggttgggct 5880

aagacagtgg ttactggcag agcaaagctt ggtggaattc cagtgggtgt gatagctgtg 5940

gagactcaga ccatgatgca aactatccct gctgaccctg gtcagcttga ttcccgtgag 6000

caatctgttc ctcgtgctgg acaagtgtgg tttccagatt ctgcaaccaa gactgcgcag 6060

gcattgctgg acttcaaccg tgaaggatta cctctgttca tcctcgctaa ctggagaggc 6120

ttctctggtg gacaaagaga tctttttgaa ggaattcttc aggctggctc gactattgtt 6180

gagaacctta ggacatacaa tcagcctgcc tttgtctaca ttcccatggc tgcagagcta 6240

cgaggagggg cttgggttgt ggttgatagc aagataaacc cagaccgcat tgagtgctat 6300

gctgagagga ctgcaaaagg caatgttctg gaaccgcaag ggttaattga gatcaagttc 6360

aggtcagagg aactccagga ttgcatgagt cggcttgacc caacattaat tgatctgaaa 6420

gcaaaactcg aagtagcaaa taaaaatgga agtgctgaca caaaatcgct tcaagaaaat 6480

atagaagctc gaacaaaaca gttgatgcct ctatatactc agattgcgat acggtttgct 6540

gaattgcatg atacatccct cagaatggct gcgaaaggtg tgattaagaa agttgtggac 6600

tgggaagaat cacgatcttt cttctataag agattacgga ggaggatctc tgaggatgtt 6660

cttgcaaaag aaattagagc tgtagcaggt gagcagtttt cccaccaacc agcaatcgag 6720

ctgatcaaga aatggtattc agcttcacat gcagctgaat gggatgatga cgatgctttt 6780

gttgcttgga tggataaccc tgaaaactac aaggattata ttcaatatct taaggctcaa 6840

agagtatccc aatccctctc aagtctttca gattccagct cagatttgca agccctgcca 6900

cagggtcttt ccatgttact agataagatg gatccctcta gaagagctca acttgttgaa 6960

gaaatcagga aggtccttgg ttga 6984

Claims (10)

1.一种ACCase抑制除草剂抗性水稻的制备方法，包括使受体水稻中表达esgRNA、腺嘌呤脱氨酶、Cas9核酸酶、核定位信号甲和核定位信号乙的步骤；

所述esgRNA靶向OsACC1基因靶点序列；所述OsACC1基因靶点序列含有目标位点；

所述目标位点为序列14第6295位所示碱基T的互补碱基A；

所述腺嘌呤脱氨酶、所述Cas9核酸酶、所述核定位信号甲和所述核定位信号乙在所述esgRNA的向导下，可将受体水稻基因组中所述目标位点由碱基A突变为碱基G，从而获得OsACC1蛋白第2099位由半胱氨酸突变为精氨酸的ACCase抑制除草剂抗性水稻；

所述核定位信号甲包括3*Flag2标签蛋白和NLS2蛋白；

所述核定位信号乙包括所述NLS2蛋白；

所述3*Flag2标签蛋白的氨基酸序列为序列10第1-22位；

所述NLS2蛋白的氨基酸序列为序列9。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核定位信号甲包括1个所述3*Flag2标签蛋白和4个所述NLS2蛋白；

和/或，所述核定位信号乙包括4个所述NLS2蛋白；

和/或，所述核定位信号甲为A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列10所示的蛋白质；

A2)将序列表中序列10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述核定位信号乙为B1)或B2)：

B1)氨基酸序列是序列11所示的蛋白质；

B2)将序列表中序列11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述核定位信号甲的编码基因序列为a1)或a2)或a3)：

a1)序列表中序列6第1-183位所示的cDNA分子或DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2中所述核定位信号甲的cDNA分子或DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述核定位信号甲的cDNA分子或DNA分子；

和/或，所述核定位信号乙的编码基因序列为b1)或b2)或b3)：

b1)序列表中序列6第73-183位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2中所述核定位信号乙的cDNA分子或DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述核定位信号乙的cDNA分子或DNA分子；

和/或，所述OsACC1基因靶点序列为序列12，所述目标位点为序列12第7位所示的碱基A。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述esgRNA结构如下：所述OsACC1基因靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架；

所述esgRNA骨架为1)或2)或3)：

1)将序列1第617-702位中的T替换为U得到的RNA分子；

2)将1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述Cas9核酸酶为Cas9n蛋白质；

所述Cas9n蛋白质为C1)或C2)：

C1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

C2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述Cas9n蛋白质的编码基因为c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列1第5035-9135位所示的cDNA分子或DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求4中所述Cas9n的cDNA分子或DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求4中所述Cas9n的cDNA分子或DNA分子。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述腺嘌呤脱氨酶为ecTadA蛋白质和/或ecTadA*蛋白质；

所述ecTadA蛋白质为D1)或D2)：

D1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

D2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

所述ecTadA*蛋白质为E1)或E2)：

E1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

E2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述ecTadA蛋白质的编码基因为d1)或d2)或d3)：

d1)序列表中序列1第3847-4344位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求6中所述ecTadA的cDNA分子或DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求6中所述ecTadA的cDNA分子或DNA分子；

所述ecTadA*蛋白质的编码基因为e1)或e2)或e3)：

e1)序列表中序列1第4441-4938位所示的cDNA分子或DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求6中所述ecTadA*的cDNA分子或DNA分子；

e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求6中所述ecTadA*的cDNA分子或DNA分子。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述使受体水稻中表达esgRNA、腺嘌呤脱氨酶、Cas9核酸酶、核定位信号甲和核定位信号乙的方法为将转录esgRNA的DNA分子、ecTadA蛋白质的编码基因、ecTadA*蛋白质的编码基因、Cas9n蛋白质的编码基因、核定位信号甲的编码基因和核定位信号乙的编码基因导入受体水稻中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述转录esgRNA的DNA分子、所述ecTadA蛋白质的编码基因、所述ecTadA*蛋白质的编码基因、所述Cas9n蛋白质的编码基因、所述核定位信号甲的编码基因和所述核定位信号乙的编码基因通过重组表达载体导入受体水稻中；

所述重组表达载体包括依次由启动子、所述核定位信号甲的编码基因、所述ecTadA蛋白质的编码基因、所述ecTadA*蛋白质的编码基因、所述Cas9n蛋白质的编码基因和所述核定位信号乙的编码基因和终止子组成的表达盒。

10.权利要求1-9任一所述的方法在提高目标位点的A·G碱基替换效率中的应用；

或，权利要求1-9任一所述的方法在制备仅目标位点发生A·G碱基替换的ACCase抑制除草剂抗性水稻中的应用；

所述目标位点为序列14第6295位所示碱基T的互补碱基A；

所述A·G碱基替换为由碱基A突变为碱基G。

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