ES2334539B1 - Utilizacion del enzima fosfopanteteina adeniltransferasa, implicado en la biosintesis del coenzima a, en la mejora del crecimiento vegetal,resistencia al estres salino/osmotico, incremento de lipidos de reserva y modificacion del contenido aminoacidico. - Google Patents

Abstract

Utilización del enzima fosfopanteteina adeniltransferasa, implicado en la biosíntesis del coenzima A, en la mejora del crecimiento vegetal, resistencia al estrés salino/
osmótico, incremento de lípidos de reserva y modificación del contenido aminoacídico.

La presente invención se refiere a la utilización del gen que codifica la fosfopanteteina adenil transferasa (PPAT) como regulador de la biosíntesis de CoA para la generación de nuevas variedades vegetales que presentan crecimiento mejorado, resistencia al estrés osmótico y salino, aumento del contenido en lípidos en sus semillas y composición aminoacídica alterada. Concretamente la invención se refiere a la utilización de este gen como regulador de la biosíntesis de CoA en plantas para modificar el fenotipo de la planta, así como a las plantas obtenidas genéticamente modificadas, cuyo crecimiento, resistencia a estrés osmótico y salino y contenido en lípidos de sus semillas es mayor que en las plantas sin modificar, y que presentan su composición aminoacídica alterada.

Description

Utilización del enzima fosfopanteteina adeniltransferasa, implicado en la biosíntesis del coenzima A, en la mejora del crecimiento vegetal, resistencia al estrés salino/osmótico, incremento de lípidos de reserva y modificación del contenido aminoacídico.

Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a la utilización del gen que codifica la fosfopanteteina adeniltransferasa (PPAT) como regulador de la biosíntesis de CoA para la generación de nuevas variedades vegetales que presentan crecimiento mejorado, resistencia al estrés osmótico y salino, aumento de contenido en lípidos en sus semillas y composición aminoacídica alterada. Concretamente, la invención se refiere tanto a la utilización de este gen como regulador de la biosíntesis de CoA como a las plantas obtenidas, genéticamente modificadas que presentan su fenotipo modificado, cuyo crecimiento, resistencia a estrés osmótico y salino y contenido en lípidos de sus semillas es mayor que en las plantas sin modificar, y que presentan su composición aminoacídica alterada.

Antecedentes de la invención

La coenzima A (CoA) es un cofactor esencial en numerosas rutas biosintéticas, degradativas y metabólicas productoras de energía (Begley et al., 2001). La síntesis de CoA, partiendo de pantotenato como precursor, se produce en cinco etapas y se han clonado las correspondientes enzimas biosintéticas tanto en procariotas como en eucariotas superiores (Begley et al., 2001; Daugherty et al., 2002; Kupke et al., 2003; Leonardi et al., 2005). La ruta universal para la biosíntesis de CoA a partir de pantotenato está iniciada por la fosforilación de este precursor para generar 4'-fosfopantotenato, que está catalizada por la pantotenato kinasa (PK, CoaA). En organismos unicelulares y sistemas animales, la velocidad de biosíntesis de CoA parece estar regulada mediante inhibición por retroalimentación de PK. Recientemente, se han caracterizado dos PK de plantas, concretamente AtPANK1 y AtPANK2 en Arabidopsis y, como resultado, se encontró que un doble mutante pank1-1pank2-1 era letal para los embriones (Tilton et al, 2006). La segunda etapa de la biosíntesis de CoA supone la adición de cisteina a 4'-fosfopantotenato mediada por 4'-fosfo-N-pantotenoilcisteín sintetasa (PPCS, CoaB). En la siguiente etapa, la 4'-fosfo-N-pantotenoilcisteín descarboxilasa (PPCDC, CoaC) cataliza la generación de 4'-fosfopanteteina. Dos genes de Arabidopsis, AtHAL3A y AtHAL3B, codifican para enzimas PPCDC esenciales, y una inactivación combinada de ambos genes abortó la embriogénesis en la fase globular temprana (Rubio et al., 2006). La penúltima etapa en la ruta biosintética de CoA está catalizada por la enzima 4'-fosfopanteteina adeniltransferasa (PPAT, CoaD), que cataliza la adenilación reversible de 4'-fosfopanteteina para formar 3'-desfosfo-CoA (dPCoA) y pirofosfato (PPi) (véase más adelante la figura 5a). Finalmente, la desfosfo-CoA kinasa (DPCK, CoaE) cataliza la última etapa de la ruta biosintética de CoA, que supone la fosforilación del grupo 3'-hidroxilo del resto del azúcar ribosa de dPCoA para formar CoA y ADP.

Considerando el papel fundamental de CoA en el metabolismo de las plantas, el análisis de mutantes con alteración en la biosíntesis de CoA ha recibido una atención limitada (Rubio et al., 2006; Tilton et al., 2006). Recientemente, hemos notificado que un doble mutante HAL3A-1 HAL3B-1 era letal para los embriones, mientras que las plántulas que eran nulas para HAL3A y heterocigóticas para HAL3B (mutante aaBb hal3), presentaron un fenotipo dependiente de sacarosa (Sac) para el establecimiento de las plántulas (Rubio et al., 2006).

La presente solicitud de patente, se centra en la siguiente etapa de la biosíntesis de CoA, que está catalizada por la enzima PPAT. Los estudios en sistemas modelo de los productos intermedios en la biosíntesis de CoA han mostrado que, además del control de la síntesis al nivel de PK, la modulación adicional del flujo a través de la ruta se produce en PPAT, ya que tanto pantotenato como 4'-fosfopanteteina pueden acumularse en la célula en condiciones limitantes para la biosíntesis de CoA (Jackowski y Rock, 1984; Rock et al., 2000). En seres humanos, ambas actividades PPAT y DPCK están codificadas en un único gen que da lugar a una enzima bifuncional denominada CoA sintasa (Daugherty et al., 2002). Por el contrario, las plantas tienen diferentes enzimas monofuncionales codificadas por genes distintos (Kupke et al., 2003).

Así, se ha identificado el producto génico PPAT de Arabidopsis por su fuerte homología con el equivalente en seres humanos en CoA sintasa, y se ha confirmado su actividad bioquímica in vitro (Kupke et al., 2003).

Esta solicitud de patente presenta el análisis de mutantes de ganancia de función y reducción de función en PPAT, proporcionando una evidencia de su función sobre el crecimiento de las plantas, la resistencia al estrés osmótico y el metabolismo de los lípidos, llegando a la conclusión de que las plantas que sobreexpresan PPAT, presentan crecimiento mejorado, resistencia al estrés osmótico, aumento de contenido en lípidos en sus semilla y composición aminoacídica modificada.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención se refiere a la utilización del gen que codifica la fosfopanteteina adeniltransferasa (PPAT) de Arabidopsis thaliana (SEQ. ID. NO:2) (Gen At2g18250) como regulador de la biosíntesis de CoA plantas para modificar el fenotipo de la planta de manera que la planta resultante presente crecimiento mejorado, resistencia al estrés osmótico, aumento de contenido en lípidos en sus semillas y composición aminoacídica alterada.

Otro objeto de la presente invención se refiere al uso del gen que codifica la PPAT en especies de interés agronómico e industrial como regulador de la biosíntesis de CoA en plantas. Este uso conlleva la sobreexpresión de PPAT conduciendo a la generación de plantas que presentan crecimiento y resistencia al estrés osmótico mejorados así como mayor contenido en lípidos de sus semillas y composición aminoacídica alterada en comparación con plantas de tipo silvestre.

Como regulador se entiende el gen, y por tanto la proteína (enzima) por él codificada que regula la ruta de biosíntesis (o parte de la ruta que subyace) de CoA, cuya función está relacionada con el crecimiento de las plantas, su resistencia al estrés osmótico, el contenido en lípidos de sus semillas y el metabolismo de aminoácidos.

Como gen que codifica la PPAT en especies de interés agronómico e industrial se entiende tanto el gen PPAT como secuencias homólogas de genes PPAT de otros organismos y con función equivalente a la PPAT de Arabidopsis.

Entre estas especies de interés agronómico e industrial se incluyen, aunque no de forma exclusiva: arroz, colza, col, chopo, vid, tomate, patata, leguminosas, maíz, soja, algodón, etc. Puesto que el gen que codifica la enzima PPAT está conservado desde musgo hasta especies arbóreas (pícea, chopo) y desempeña una función imprescindible en la célula vegetal, es razonable suponer que está conservado en todas las especies vegetales. De hecho se muestra en los alineamientos de la exposición detallada de un modo de realización que el producto génico PPAT está presente en aquellos genomas vegetales disponibles en bases de datos públicas.

En la descripción de la invención, se realizan estudios sobre la implicación del gen PPAT en el aumento o disminución del crecimiento de las plantas, su resistencia al estrés osmótico, el contenido en lípidos de sus semillas y la alteración de su composición aminoacídica. Los experimentos se realizan con la línea mutante ppat-1 que muestra una reducción de un 90% en la expresión de PPAT, generada por inserción de ADN-T en el gen PPAT (SEQ. ID. NO: 2) de Arabidopsis, así como con la línea de sobreexpresión de PPAT OE, generada por transformación de plantas de tipo silvestre con una copia adicional del gen que codifica la PPAT.

Otro objeto de la presente invención se refiere a las plantas obtenidas, genéticamente modificadas, cuyo crecimiento, resistencia a estrés osmótico y salino y contenido en lípidos de sus semillas es mayor que en las plantas sin modificar, y que presentan su composición aminoacídica modificada.

Otro objeto de la invención se refiere a las semillas producidas por las plantas modificadas genéticamente, que sobreexpresan PPAT, caracterizadas por presentar mayor contenido en ácidos grasos en las semillas, que las semillas de plantas silvestres.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de las semillas y plantas transgénicas, que sobreexpresan PPAT, caracterizado porque los aceites vegetales obtenidos de las mismas son para uso en alimentación o en la industria del biodiesel.

Otro objeto de la invención se refiere a las semillas y plantas transgénicas, que sobreexpresan PPAT, caracterizadas por presentar su composición aminoacídica modificada.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de las semillas y plantas transgénicas, que sobreexpresan PPAT, caracterizadas por presentar su composición aminoacídica modificada en la industria alimenticia.

Descripción de las figuras

Figura 1. Caracterización molecular del mutante ppat-1. (a) Esquema del gen PPAT (SEQ. ID. NO: 2) y localización de la inserción de ADN-T. La numeración comienza en el codón de iniciación de la traducción ATG. Se indica el cebador del extremo izquierdo de ADN-T (LBb1) que se utilizó para ubicar la inserción de ADN-T. Los recuadros negros representan exones. (b) Análisis de RT-qPCR de la expresión de PPAT en ARN de tipo natural y de ppat-1 preparados a partir de hojas en roseta de 3 semanas. Los datos son promedios \pm DE de tres experimentos independientes. Se usó la expresión de \beta-actina-8 para normalizar los datos.

Figura 2. Fenotipo de crecimiento del mutante ppat-1 y la complementación genética. (a) Crecimiento de la línea de tipo natural (wt), ppat-1 y complementada (Comp) en medio complementado con sacarosa al 1% (+Sac) o que carece de Sac (-Sac). (b) Cuantificación del crecimiento de raíces. Los valores son promedios \pm DE (n=100). (c, d) Crecimiento de plántulas y establecimiento de plantas wt, ppat-1 y aaBb. La barra de escala corresponde a 1 cm. Los valores en d son promedios \pm DE para tres experimentos independientes (200 semillas cada uno). (e) Crecimiento en suelo de la línea wt, ppat-1 y complementada, y cuantificación del área de la hoja. Los valores son promedios \pm DE (n=20). (f) Producción de semillas. Los valores son promedios \pm DE (n=20).

Figura 3. Fenotipo de las líneas OE de PPAT. (a) Se determinó la suma de los niveles de CoA y AcCoA en plántulas de 12 días a partir de líneas de tipo silvestre, ppat-1 y OE de PPAT hechas crecer en medio complementado con sacarosa al 1% (+Sac) o que carecen de Sac (- Sac). Los valores son promedios \pm EE de dos experimentos independientes. Los valores de las líneas OE representan los datos de pooles de tres líneas independientes. (b, c) Aumento del crecimiento de hojas en las líneas OE de PPAT en comparación con las plantas de tipo silvestre. Cuantificación del área de la hoja y fotografía de las plantas hechas crecer en el suelo durante 2 semanas. Los valores son promedios \pm EE (n=20).
* Indica P<0,01 (prueba de la t de Student) con respecto a wt. (d) Aumento del crecimiento reproductor de las líneas OE en comparación con las plantas wt. (e) Crecimiento de las líneas wt y OE en medio +Sac o -Sac. (f) Cuantificación tanto del crecimiento de raíces como del peso fresco para las líneas wt y OE en medio +Sac o -Sac. Se muestra una línea OE representativa en (d), (e) y (f).

Figura 4. Aumento de la resistencia tanto al estrés salino como osmótico en las líneas OE en comparación con wt. Las plántulas hechas crecer en medio que contenía sacarosa al 1% se transfirieron a medio complementado con NaCl 75 mM (Na1), NaCl 125 mM (Na2), manitol 150 mM (M1) o manitol 250 mM (M2), en presencia o ausencia de sacarosa exógena. Las plántulas control (C) se transfirieron a medio que carecía de NaCl o manitol para medir el crecimiento en ausencia de estrés. Se muestra una línea OE representativa a partir de tres líneas independientes. (a) Fotografía representativa tomada tras 11 días. Las barras de escala corresponden a 4 cm. (b) Cuantificación del peso fresco (FW) tras 11 días. Los datos de las plántulas control corresponden al 50% de los verdaderos valores. (c) Cuantificación del crecimiento de raíces primarias tras 7 días. (d) Cuantificación del crecimiento de raíces secundarias tras 11 días. Los valores son promedios \pm EE para dos experimentos independientes (30 plántulas cada uno). (e) Determinación del contenido en prolina en líneas wt y OE tras el tratamiento con NaCl 125 mM durante 48 h.

Figura 5. Caracterización bioquímica de la enzima PPAT en la reacción inversa. (a) Esquema de la reacción reversible catalizada por PPAT. (b) Proteína de fusión MBP-PPAT recombinante en extracto bruto de E. coli (1) y tras la purificación mediante cromatografía de afinidad (2). Se indica el peso molecular aparente de la proteína. (c) Cinética enzimática de MBP-PPAT recombinante. Se sometió a ensayo la enzima (40 nM) tal como se describe en los procedimientos experimentales y se monitorizó la velocidad de reducción de NADP en NADPH midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Se realizó el análisis de regresión de los datos (R2=0,99) usando el software Microsoft Excel con el fin de calcular la velocidad inicial (Vo) de la reacción a diferentes concentraciones de sustrato. (d) Inhibición de la actividad de PPAT por CoA(\Delta) y AcCoA(\sqbullet). Los valores son promedios \pm DE para dos experimentos independientes. Se realizó el análisis de regresión de los datos usando el software Graph Pad 4.0.

Figura 6. Mediciones de ácidos grasos (AG) y acilCoA. (a) Contenido total en AG en semillas secas de los genotipos indicados. (b) Contenido en acilCoA en plántulas hechas crecer en +Sac al 1% o -Sac a los 5 DAI. (c, e) Contenido total en AG a los 0, 2 y 5 DAI de plántulas hechas crecer con +Sac al 1% o -Sac, respectivamente (d, f) Contenido en ácido eicosaenoico a los 0, 2 y 5 DAI de plántulas hechas crecer con +Sac o -Sac, respectivamente. Los valores son promedios \pm DE para 5 determinaciones separadas, expresados en una base de por semilla/plántula; * indica P<0,03 (prueba de la t de Student) en comparación con los datos de cada genotipo y wt en las mismas condiciones de crecimiento.

Figura 7. Velocidad de crecimiento en suelo de las líneas de tipo silvestre (wt), ppat-1, complementadas (Comp) y de sobreexpresión (OE). Se llevó a cabo un experimento en el tiempo para medir el número de hojas en roseta por planta a los 2, 5 10, 12 y 15 días tras la transferencia al suelo de plántulas de 5 días de los fenotipos indicados. Los valores son promedio \pm SD (n=20). Se muestra una línea OE representativa.

Figura 8. Mayor producción de semillas de las líneas OE en comparación con el tipo silvestre. Los valores son promedio \pm SD de dos experimentos independientes (n=20). Los valores de las líneas OE representan datos de pool de tres líneas independientes.

Figura 9. Mayor generación de raíces secundarias en las líneas OE que las de tipo natural. Las plántulas crecidas en medio con 1% de sacarosa fueron transferidas a un medio suplementado con 125 nM de NaCII o 250 mM de manitol, en presencia o ausencia de sucrosa exógena. Las plántulas control (C) fueron transferidas a un medio carente de NaCl o manitol para medir el crecimiento en ausencia de estrés. Fotografía representativa tomada pasados 11 días. Las barras de escala corresponden a 4 cm. Se muestra una línea OE representativa de tres líneas independientes.

Figura 10. Contenido en Ácidos Grasos principales a partir de las líneas de tipo silvestre Col, ppat-1, complementadas (Comp) y de sobreexpresión (OE). Los valores son promedio \pm DE para 5 determinaciones separadas, expresados por semilla. El contenido de ácido oleico (18:1), linoléico (18:2), linolénico (18:3) y eicosanoico (20:1) fueron entre un 35-50% superior en las líneas OE que en las de tipo silvestre.

Figura 11. Contenido en aminoácidos de plantas silvestres Col (Col) y líneas de sobreexpresión (OE). La determinación del contenido de aminoácidos (expresado en ng) se realizó mediante HPLC/MS en extractos de 30 plántulas, las cuales fueron crecidas en medio con 1% sacarosa (plus suc), sin sacarosa (minus suc), con 1% sacarosa y 125 mM NaCl (plus suc, plus salt) o bien sin sacarosa y 125 mM NaCl (minus suc plus salt).

Figura 12. Representación gráfica de la modificación encontrada en los aminoácidos prolina (A) y glutamina (B).

Descripción detallada de la invención

Tanto las bacterias como los organismos eucariotas siguen una ruta universal de cinco etapas para sintetizar CoA a partir de pantotenato. En las plantas, se ha notificado que dobles mutaciones nulas que conducen a un bloqueo completo de o bien la primera o bien la tercera etapa de la ruta biosintética de CoA, es decir de las actividades de PK y PPCDC, son letales para los embriones (Tilton et al., 2006; Rubio et al., 2006).

Con el propósito de averiguar la función del gen PPAT, la presente solicitud de patente lleva a cabo el estudio de una mutación de reducción de función viable que afecta a la penúltima etapa de la ruta biosintética de CoA, para estudiar su impacto sobre el crecimiento de las plantas y la respuesta al estrés. Así, se demuestra que la función de PPAT está relacionada con el crecimiento de las plantas y la resistencia al estrés, y el aumento de la biosíntesis de CoA a través de la sobreexpresión de PPAT, condujo a plantas con mayor vigor y resistencia al estrés que plantas de tipo silvestre. Por tanto, la presente invención amplía el conocimiento existente sobre la biosíntesis de CoA en plantas y su impacto sobre el crecimiento y la tolerancia al estrés.

El mutante ppat-1 estudiado por el presente documento muestra una alteración notable en el crecimiento, que es evidente tanto en ausencia como en presencia de sacarosa exógena. Sin embargo, se observó que la expresión restante de PPAT es suficiente para el establecimiento de las plántulas, aunque el crecimiento adicional se vio alterado gravemente en comparación con las plantas de tipo silvestre. Así mismo, durante el crecimiento fotoautótrofo, se vieron alterados tanto el crecimiento vegetativo como reproductor en ppat-1. Resulta probable que estos fenotipos sean un reflejo del papel clave desempeñado por CoA en una multitud de reacciones enzimáticas, tales como la oxidación de los ácidos grasos, hidratos de carbono y aminoácidos, así como muchas reacciones biosintéticas (Begley et al., 2001).

Así, con el fin de comprobar que, además del papel bien conocido tanto en el metabolismo primario como en el secundario, los efectos reguladores inesperados de CoA pueden ser responsables en parte de esta alteración del crecimiento (por ejemplo, efectos sobre la expresión génica a través de la modulación de la acetilación de histonas mediante los niveles de AcCoA), se complementaron los defectos de crecimiento de ppat-1 con la introducción de una copia de PPAT de tipo silvestre bajo el control del promotor 35S. Aunque la mayor parte de las características de las líneas complementadas fueron similares a las de tipo silvestre, el contenido en ácidos grasos fue mayor que en las de tipo silvestre, de alguna manera asemejándose a una línea de sobreexpresión débil.

Por ello, se quiso comprobar si la introducción de PPAT (SEQ. ID. NO:2) bajo el control de un promotor 35S del VMCo pudiera conducir a niveles de expresión mayores de PPAT en ciertos tejidos que los obtenidos a partir del promotor nativo.

La sobreexpresión de PPAT condujo a un aumento del crecimiento vegetativo en comparación con el tipo natural. Por tanto, durante el crecimiento fotoautótrofo en el suelo, tanto el crecimiento vegetativo como el reproductor fueron mayores en las líneas OE que en las plantas de tipo silvestre (figura 3). De manera similar, tanto el crecimiento de raíces como el peso fresco fueron mayores en las plántulas procedentes de las líneas OE hechas crecer in vitro en ausencia de Sac.

El aumento de la biomasa de raíces se asocia normalmente con un aumento de la tolerancia a la sequía (Park et al., 2003; Verlues et al., 2006). Las líneas OE, que mostraron mayor crecimiento de raíces que las de tipo natural en condiciones sin estrés, también mostraron mayor crecimiento de raíces primarias y secundarias que las plantas de tipo silvestre en condiciones de estrés. Como resultado, se encontró una mejor integración del crecimiento de las plantas con el estrés ambiental en estas líneas OE.

Sin embargo, es difícil establecer la verdadera magnitud de la implicación de CoA en la tolerancia osmótica. Por tanto, además de evitar el estrés mediante el aumento de la biomasa de raíces, podría conseguirse tolerancia al estrés a través tanto de la acumulación de solutos compatibles como de diferentes cambios metabólicos que evitan el daño celular provocado por la pérdida de agua. En relación con este aspecto, la presente invención muestra de manera interesante que, en condiciones de estrés osmótico, las líneas OE sintetizan niveles de prolina 2 veces mayores que las de tipo silvestre en medio carente de Sac exógena (figura 4e). Así mismo se comprobó que la Sac exógena estimuló 2 veces la síntesis de prolina en el tipo silvestre, mientras que tuvo un efecto moderado sobre las líneas
OE.

Por tanto, la presente invención muestra que las líneas OE parecen ser menos dependientes que las de tipo silvestre de la complementación exógena de Sac para sintetizar prolina, hecho que se considera ventajoso para soportar el estrés hídrico, ya que se ven alterados la reducción de carbono y el transporte del floema en estas condiciones (Wardlaw, 1967; Tully et al., 1979). La prolina se sintetiza principalmente a través de una ruta derivada del glutamato y, por tanto, la estructura principal del esqueleto de carbono se deriva del ciclo del ácido cítrico. Las líneas OE de PPAT de la presente invención tienen mayores niveles de CoA y AcCoA que las de tipo silvestre, lo que podría aumentar la síntesis de los diferentes productos intermedios del ciclo del ácido cítrico.

Estudios en E. y mamíferos indican que PPAT (SEQ. ID. NQ:1) cataliza una etapa reguladora secundaria en la biosíntesis de CoA tras el punto regulador maestro de PK (Jackowski y Rock, 1984; Rock et coli al., 2000; Rock et al., 2003). En E. coli, se acumulan tanto pantotenato como 4'-fosfopanteteina en la célula en condiciones limitantes para la biosíntesis de CoA (Jackowski et al., 1984). El aumento del flujo de la ruta biosintética de CoA a través de la introducción de una versión de PK que no responde a la inhibición por CoA, condujo a una mayor acumulación de 4'-fosfopanteteina que de CoA, que ilustra que PPAT es un segundo sitio para la regulación de la biosíntesis de CoA tras PK (Rock et al., 2003). En mamíferos, se acumula la 4'-fosfopanteteina como el segundo metabolito más abundante de la ruta de la CoA tras el pantotenato, lo que sugiere que tanto PPAT como PK catalizan etapas limitantes de la velocidad en la biosíntesis de CoA (Rock et al., 2000). La sobreexpresión transitoria de PK1\beta suprimió la acumulación de pantotenato y dio como resultado un aumento de al menos 10 veces de los niveles de CoA intracelular, aunque también se midió una acumulación de 3 veces de 4'-fosfopanteteina (Rock et al., 2000). Estos resultados ilustran que se produce una restricción de la velocidad de flujo tanto en las etapas catalizadas por PK como por PPAT, aunque la regulación en la etapa de PPAT parece ser secundaria a PK (Rock et al., 2000).

A los efectos de estudiar el efecto limitante de PPAT en la producción de CoA, la presente invención comprobó que las líneas de sobreexpresión de PPAT contenían un aumento de los niveles de especies de CoA (figuras 3a y 6e), lo que indica que PPAT limita la producción de CoA en plantas en un cierto grado. Desgraciadamente, no pudo demostrarse directamente la actividad de PPAT (SEQ. ID. NO:1) en plántulas u hojas de Arabidopsis ni en extractos vegetales brutos ni tras la purificación parcial a través de filtración en gel de Sephadex G-25 y precipitación con sulfato de amonio (datos no mostrados). La abundancia presumiblemente baja de las enzimas de la biosíntesis de CoA podría explicar la no detección de actividad de PPAT en los extractos de plantas. Por ejemplo, la actividad de una enzima de la planta implicada en la biosíntesis del pantotenato sólo podía detectarse en mitocondrias purificadas a actividades específicas de 0,5 nmol/min por mg de proteína (Ottenhof et al., 2004).

La presente invención lleva a cabo la caracterización enzimática de la PPAT de Arabidopsis. Para ello, se procedió a medir fácilmente la actividad de PPAT (SEQ. ID. NO:1) utilizando proteína recombinante y proporcionar parámetros cinéticos en el estado estacionario de la enzima (figura 5). La Kcat para PPAT (3,4 s-1) fue comparable a la notificada para PPAT de E. coli (3,3 s-1) y la enzima hepática de cerdo bifuncional (7,7 s-1), mientras que la Km de PPAT de Arabidopsis para dPCoA (37 \muM) fue notablemente mayor que en las enzimas de bacterias y mamíferos (7 y 11 \muM, respectivamente) (Geerlof et al., 1999; Aghajanian y Worrall, 2002).

Con el fin de evaluar la relevancia fisiológica del CoA cobre la actividad de PPAt (SEQ. ID. NO:1), se procedió a estimar la concentración de CoA libre en los diferentes tejidos de la planta, en diferentes fases de desarrollo. Así, esta invención presenta el efecto inhibidor de CoA (CI50= 38 \muM) sobre la actividad de PPAT. Es difícil estimar con precisión la concentración de CoA libre en los diferentes tejidos de la planta, en diferentes fases de desarrollo (Tumaney et al., 2004). En las hojas de espinaca, la concentración de AcCoA fuera del plastidio (probablemente dominada por el conjunto citosólico) es del orden de 40-65 \muM (Tumaney et al., 2004). AcCoA está presente en un gran exceso con respecto a CoA libre en las semillas, pero en las hojas de espinaca o en las paredes de la silicua verde, ambas especies de CoA están en el mismo orden de magnitud (Tumaney et al., 2004; Gibon et al., 2002). Además, la CI50 de CoA en la actividad de PPAT es muy próxima a la Km para el sustrato dPCoA. Por tanto, parece razonable que CoA tenga un efecto inhibidor sobre la actividad de PPAT en condiciones fisiológicas que podría actuar como un mecanismo regulador por retroalimentación negativa. De hecho, el CoA está estrechamente unido a la enzima purificada de E. coli (Geerlof et al., 1999), y se ha resuelto la estructura cristalina de PPAT de E. coli complejada con dPCoA, 4'-fosfopanteteina o CoA (Izard y Geerlof, 1999; Izard, 2002; Izard, 2003). El análisis de la estructura de PPAT:CoA revela que CoA se une al sitio activo de una forma distinta a dPCoA y 4'-fosfopanteteina (Izard, 2003). Estos resultados confirman por tanto que, el CoA no es un sustrato para PPAT y su unión a PPAT sugiere una regulación por retroalimentación negativa sobre la actividad de PPAT, tal como ya se ha establecido para PK
(Rock et al., 2003).

Para evaluar el papel regulador de PPAT en la acumulación de ácidos grasos en las semillas, se estudió este aspecto en los mutantes ppat-1 y PPAT (O.E.). La mutación ppat-1 tuvo un efecto moderado sobre la acumulación de AG en las semillas, mientras que la sobreexpresión de PPAT dio como resultado un aumento del 35-50% de algunos AG con respecto al tipo natural (figura 10). La alteración de la biosíntesis de CoA en el mutante aaBb hal3 tampoco tuvo un efecto importante sobre la acumulación de AG en las semillas (Rubio et al., 2006). Estos resultados sugieren que la expresión residual de PPAT y HAL3B a lo largo de la vida de la planta proporciona un suministro de CoA suficiente para la biosíntesis de AG. Aunque no se evito el establecimiento de las plántulas en ppat-1, tal como se notificó para aaBb hal3 (Rubio et al., 2006), se observó una alteración grave del crecimiento temprano de las plántulas en comparación con las plántulas de tipo natural (figura 2c). El catabolismo temprano de los lípidos se detuvo en ppat-1 cuando el medio se complementó con Sac exógena; mientras que en el medio que carecía de sacarosa exógena, el mutante ppat-1 no mostró tal fenotipo con alteración drástica, aunque el uso de ácido eicosanoico fue más lento que en el tipo natural (figura 6). El retraso en el consumo de AG en ppat-1 podría atribuirse a la alteración de la \beta-oxidación debido a la disminución de la biosíntesis de CoA, tal como se sugirió anteriormente para otro mutante de la ruta biosintética de CoA (Rubio et al., 2006). Por el contrario, la presente invención demuestra que el retraso inesperado en el consumo de AG observado en la línea OE sugiere que el aumento de la biosíntesis de CoA puede conducir o bien a un uso más eficaz de la sacarosa exógena como fuente de energía y/o a un aumento de la sensibilidad a la inhibición relacionada con la señalización de azúcares del catabolismo de los lípidos de reserva.

Finalmente, el aumento de la producción de semillas de las líneas OE de PPAT de Arabidopsis, junto con la mayor acumulación de AG por semilla, demuestra que el refuerzo de la biosíntesis de CoA constituye un enfoque para la obtención por ingeniería genética de semillas de cultivo con mayor rendimiento de aceite.

Así mismo, las plantas y semillas obtenidas a partir de la invención presentan su composición aminoacídica alterada (Figuras 11 y 12) con respecto a las plantas silvestres, presentando gran utilidad en la industria de la alimentación animal.

Así, en conclusión, es evidente el interés de la presente invención en la producción mejorada de aceites vegetales tanto para su uso en alimentación como de biodiesel. Adicionalmente, el aumento del crecimiento vegetativo y reproductor, así como la mejora concomitante en la resistencia al estrés osmótico de las líneas OE de PPAT y la alteración de su composición aminoacídica, hacen que la presente invención sea de gran interés para la obtención por ingeniería genética de cosechas con una mayor producción de biomasa y para ofrecer soluciones sostenibles a largo plazo para el uso de los terrenos agrícolas.

\vskip1.000000\baselineskip

Aislamiento y caracterización de una mutación por inserción de ADN-T en el gen PPAT de Arabidopsis

Se identificó un alelo alterado por ADN-T de PPAT en la colección de SALK (http://signal.salk.edu/cgi-bin/
tadnexpress), correspondiente al número de reserva de donante SALK_093728 y designado como ppat-1 (figura 1 a). La inserción de ADN-T en ppat-1 se ubica en el segundo intrón, 652 nucleótidos en sentido 3' del codón de iniciación ATG. Se identificaron tres líneas de ADN-T adicionales en las proximidades de la unidad de transcripción de PPAT, pero no afectaron significativamente a la expresión del gen PPAT (datos no mostrados). El mutante ppat-1 mostró una reducción de un \sim90% en la expresión de PPAT en comparación con el tipo natural (figura 1b). El análisis por PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) detectó sistemáticamente una expresión residual de un -10%, lo que sugiere que se produjo en cierto grado corte y empalme del intrón en el que se insertó el ADN-T.

Se observó una grave alteración en el crecimiento vegetativo para las plántulas de ppat-1 tanto en medio que carece de o complementado con Sac al 1% (figura 2a y 2b); no obstante, el fenotipo no tuvo una alteración tan grave como la de las plántulas con aaBb hal3 en medio que carece de sacarosa (Rubio et al., 2006) (figura 2c), y a diferencia de la progenie con aaBb hal3, no se vio comprometido el establecimiento de las plántulas en ppat-1 (figura 2d). El mutante ppat-1 era viable pero el porcentaje de supervivencia tras la transferencia de las plántulas germinadas en placas de MS al suelo fue inferior al 30% (datos no mostrados). El posterior crecimiento en el suelo y la producción de semillas de plantas con ppat-1 se redujeron en comparación con las plantas de tipo natural (figura 2e y 2f). En general, se vio afectado el crecimiento reproductor en plantas con ppat-1, ya que estaban presentes menos tallos con inflorescencia por planta (véase más adelante la figura 3d). Con el fin de verificar que los fenotipos observados eran una consecuencia de la expresión alterada de PPAT, se generaron líneas de complementación para ppat-1. Con este fin, se puso ADNc de PPAT bajo el control del promotor 35S y se introdujo en ppat-1 mediante Agrobacterium tumefaciens. Se seleccionaron los transformantes primarios (T1) por su resistencia a la higromicina y se obtuvo una población T3 homocigótica para el transgén. La introducción de un alelo de PPAT de tipo natural complementó los fenotipos descritos anteriormente (figura 2; véase más adelante la figura 3d), lo que demostró que una mutación de reducción de función en PPAT era responsable de estos fenotipos.

\vskip1.000000\baselineskip

La sobreexpresión de PPAT conduce a un aumento del crecimiento y/o a la resistencia al estrés salino/osmótico

Las plantas que sobreexpresan el gen que codifica la PPCDC de AtHAL3A muestran una velocidad de crecimiento más rápida y una tolerancia al estrés salino y osmótico mejorada (Espinosa-Ruiz et al., 1999). La sobreexpresión de HAL3 de Nicotiana tabacum también aumenta la tolerancia al estrés salino y osmótico en células de tabaco en cultivo (Yonamine et al., 2004). Estos resultados sugieren que la regulación de la biosíntesis de CoA parece desempeñar un papel importante en la integración del crecimiento de las plantas y la resistencia al estrés. Para someter a prueba la magnitud de esta hipótesis, se generaron líneas de sobreexpresión (OE) de PPAT en una referencia de tipo silvestre. Se seleccionaron tres líneas homocigóticas para el marcador de selección en la generación T3 y se usaron para análisis adicionales. Se determinó la cantidad combinada de CoA libre y acetil-CoA usando el ensayo espectrofotométrico de ciclación de enzimas descrito originariamente por Alfred y Guy (1969) (figura 3a). Las líneas OE mostraron niveles 1,6-7 veces mayores en promedio de CoA libre + acetil-CoA que los de tipo natural (figura 3a). Por el contrario, el mutante ppat-1 mostró una reducción de o bien un \sim60% o bien un \sim80% en comparación con el tipo natural en medio +Sac o -Sac, respectivamente (figura 3a). Aunque se redujo el crecimiento de hojas en plantas ppat-1 en comparación con las de tipo silvestre (figura 2d), las líneas OE mostraron un aumento del crecimiento de hojas (figura 3b y 3c). La velocidad de crecimiento, estimada a partir del número de hojas en roseta por planta en un periodo de tiempo, no se vio alterada significativamente en las líneas OE (figura 7), aunque la producción de tallos florales fue 2 días más rápida en promedio en las líneas OE en comparación con las de tipo natural (18\pm1 días en las líneas OE, 20\pm1 días en wt). Adicionalmente, el crecimiento reproductor (figura 3d) y la producción de semillas (figura 8) fueron significativamente mayores en las líneas OE que en las de tipo natural. Las plántulas procedentes de las líneas OE hechas crecer en medio que carece de sacarosa mostraron tanto un peso fresco como un crecimiento de raíces mayores que en las de tipo silvestre (figura 3e y 3f). Estas diferencias se atenuaron cuando se hicieron crecer las plantas en medio complementado con sacarosa (figura 3e y 3f).

Para someter a prueba la sensibilidad al estrés salino y osmótico de las líneas OE, se transfirieron plántulas de 7 días hechas crecer en medio que contenían sacarosa al 1% a medio complementado con o bien NaCl o bien manitol, ambos en ausencia o presencia de sacarosa (figura 4). En comparación con las plantas de tipo silvestre, las líneas OE mostraron un peso fresco y un crecimiento de raíces primarias mayores en condiciones de estrés salino y osmótico (figuras 4b y c). Teniendo en cuenta que en ausencia de estrés, las líneas OE también mostraron un crecimiento mayor que las de tipo natural, la inhibición del crecimiento inducida por el aumento de la resistencia al estrés salino y osmótico podría ser, al menos parcialmente, una consecuencia del aumento del vigor observado en estas líneas. En estas condiciones de baja disponibilidad de agua, se observó una drástica reducción en el número y la longitud de las raíces secundarias en las plantas de tipo natural (figura 4d; figura 9). Las líneas OE experimentaron una reducción menos grave y la biomasa total de raíces fue notablemente mayor que en las plantas de tipo silvestrel (figura 4d; figura 9). Una explicación parcial del crecimiento mejorado con estrés osmótico observado en las líneas OE podría ser un aumento de la acumulación de osmolitos compatibles, tales como prolina. De hecho, el ajuste osmótico debido a un aumento de la deposición de prolina desempeña un papel importante en el mantenimiento del alargamiento de las raíces a bajos potenciales hídricos (Voetberg y Sharp, 1993). La figura 4e muestra que las líneas OE contenían niveles de prolina aproximadamente dos veces mayores que las de tipo silvestre en medio que carecía de complementación exógena de Sac. Por el contrario, con la complementación del medio con Sac, el contenido en prolina en ambos genotipos era alto y similar (figura 4e).

\vskip1.000000\baselineskip

Caracterización enzimática de PPAT

Previamente, se ha sometido a ensayo la actividad de PPAT de Arabidopsis añadiendo diferentes combinaciones de enzimas recombinantes a una mezcla de reacción que contenía pantotenato, ATP, Mg^{2+}, cisteína y DTT (Kupke et al., 2003). Por ejemplo, una mezcla de CoaA, CoaB, CoaC y PPAT pudo catalizar la síntesis de dPCoA. Cuando se omitió la CoaC del ensayo, no se generó dPCoA, lo que indica que PPAT no acepta 4'-fosfopantotenoilcisteína como sustrato (producida por la acción combinada de CoaA y CoaB). Sin embargo, no se han investigado la cinética en estado estacionario ni la regulación bioquímica para la enzima PPAT individual. PPAT cataliza la transferencia reversible de un grupo adenilo desde Mg^{2+}-ATP hasta 4'-fosfopanteteina para formar dPCoA y PPi (figura 5a). Por tanto, es posible someter a ensayo la actividad de PPAT en sentido inverso usando hexokinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para acoplar la producción de ATP a la reducción de NADP (Geerlof et al., 1999). Por tanto, usando MBP-PPAT recombinante (figura 5b), se midió la velocidad inicial de la reacción inversa a concentraciones variables del sustrato comercial dPCoA (figura 5c). Se halló que los parámetros cinéticos para la reacción inversa eran
K_{M(dPCoA)} = 37 \pm 2,1 \muM, K_{cat} = 3,4 \pm 0,2 s^{-1} y V_{max} = 0,34 \pm 0,02 \mumol min^{-1} mg^{-1} de proteína.

El producto intermedio metabólico de CoA, 4'-fosfopanteteina, está presente en cantidades significativas tanto en E. coli como en mamíferos, lo que sugiere que PPAT cataliza una etapa limitante de la velocidad en la ruta (Jackowski y Rock, 1984; Rock et al., 2000). Tales enzimas están sometidas a menudo a regulación por retroalimentación por subproductos de la ruta. Por tanto se examinó el efecto de CoA y AcCoA sobre la actividad de PPAT (figura 5d). Aunque AcCoA casi no tuvo efecto sobre la actividad de PPAT hasta 40 \muM, CoA tuvo una CI_{50} = 38,6 \pm 1,9 \muM, que es próxima a la Km para dPCoA.

\vskip1.000000\baselineskip

Mediciones de ácidos grasos y acil-CoA

Se analizó el contenido en ácidos grasos (AG) en semilla seca de líneas de tipo natural, ppat-1, complementadas (Comp) y de sobreexpresión (OE) (figura 6a). El contenido total en ácidos grasos en ppat-1 pareció ser menor que en las de tipo natural, aunque no fue estadísticamente significativo (p<0,15). Por tanto, aunque el rendimiento de semilla por planta fue menor para las plantas de ppat-1, se produjo la deposición normal de aceite dentro de las semillas individuales durante el desarrollo de las semillas. Se midió un aumento estadísticamente significativo en el contenido total en ácidos grasos tanto en las líneas complementadas (p<0,026) así como en OE (p<0,012). Los perfiles individuales de los ácidos grasos principales de semillas secas de Arabidopsis mostraron que las líneas OE contenían entre un 35-50% más de AG, concretamente de ácido oleico, linoleico, linolénico y eicosanoico, que las semillas de tipo natural (figura 10). La medición del conjunto total de acil-CoA se realizó a los 5 DAI tanto en medio que carecía de cómo complementado con Sac tal como describieron Larson y Graham (2001). De acuerdo con los resultados previos (Rubio et al., 2006), la complementación con Sac condujo a la estimulación de la biosíntesis de acil-CoA en comparación con medio que carecía de Sac (figura 6b). Los niveles totales de acil-CoA en ppat-1 fueron del \sim68 y el 50% de los niveles en el tipo natural a los 5 DAI en medio +Sac y -Sac, respectivamente. Por el contrario, las líneas OE de PPAT contenían niveles \sim1,4 y 1,3 veces mayores de las acil-CoA que las de tipo natural en medio +Sac y -Sac, respectivamente. Estos cambios imitaron ampliamente los observados para los niveles de CoA y AcCoA en plantas con más tiempo en estas líneas (figura 3); lo que indica una relación entre la disponibilidad de CoA libre y el tamaño del conjunto de acil-CoA.

Se realizó un análisis en el tiempo del contenido en AG de diferentes referencias genéticas a los 0, 2 y 5 cinco días tras la inhibición (DAI, days after imbibition) en medio complementado con Sac (figura 6c). La complementación con Sac condujo a un consumo más lento de estos lípidos de reserva (Eastmond et al., 2000; Martin et al., 2002; Jennifer et al., 2002) y este retraso aumentó notablemente tanto en las líneas ppat-1 como en las OE a los 2 DAI, cuando se detuvo el consumo de ácidos grasos (figura 6c). En particular, el nivel del ácido graso específico de reserva triacilglicerol, ácido eicosaenoico (20:1n9), disminuyó un \sim40% en las plántulas de tipo natural a los 2 DAI, mientras que no se observó casi reducción en las líneas de mutante ppat-1 y OE (figura 6d). La acumulación de 20:1 n9 en las líneas ppat-1 y OE sugiere que se detuvo el catabolismo temprano de ácidos grasos en estas condiciones de germinación, a diferencia del intenso catabolismo observado en wt. Sin embargo, 20:1 n9 se había consumido en su mayor parte a los 5 DAI, lo que sugiere que sólo se comprometió en estas líneas el uso temprano de los lípidos de reserva.

En medio que carecía de Sac exógena, se observó un consumo más rápido de los AG en los diferentes genotipos (figura 6e y 6f). La grave alteración del catabolismo de los ácidos grasos a los 2 DAI notificada anteriormente para las líneas ppat-1 y OE no se observó en medio que carecía de Sac exógena. Por tanto, el nivel de ácido eicosanoico disminuyó un \sim60% en las plántulas de tipo silvestre a los 2 DAI, mientras que se observó una reducción de un \sim40% y un \sim60% en las líneas de mutante ppat-1 y OE, respectivamente (figura 6d).

\vskip1.000000\baselineskip

Exposición detallada de un modo de realización Material vegetal y condiciones de crecimiento

Se hicieron crecer plantas de Arabidopsis thaliana rutinariamente en condiciones de invernadero en macetas que contenían una mezcla de vermiculita-tierra 1:3. Para el cultivo in vitro, las semillas se esterilizaron en superficie mediante el tratamiento con etanol al 70% durante 20 min, seguido por lejía comercial (hipoclorito de sodio al 2,5%) que contenía Triton X-100 al 0,05% durante 10 min, y finalmente cuatro lavados con agua destilada estéril. Las semillas se sembraron en placas con medio Murashige-Skoog (1962) (MS) compuesto por sales basales de MS, ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico al 0,1%, agar al 1% y un pH ajustado hasta 5,7 con KOH antes de esterilizarlas en autoclave. Una vez establecido, se incluyó sacarosa al 1% en el medio. Se llevó a cabo la estratificación de las semillas en la oscuridad a 4ºC durante 3 días. Tras la estratificación (=0 DAI), las placas se transfirieron a una cámara de crecimiento de entorno controlado a 22ºC con un fotoperiodo de 16 h de luz, 8 h de oscuridad a 80-100 \muE m^{-2} s^{-1}.

\vskip1.000000\baselineskip

Generación de líneas OE de PPAT

Un grupo internacional conocido como AGI (iniciativa para el genoma de Arabidopsis, Nature, 408:796-815) secuenció el genoma de la planta modelo Arabidopsis thaliana. La disponibilidad de la secuencia completa de este genoma permitió que se creasen diversos proyectos para aclarar la función y el uso biotecnológico de los más de 25.000 genes identificados en esta planta modelo. En el caso de la enzima PPAT (SEQ. ID. NO:1), la secuencia codificante corresponde al gen At2g18250 (SEQ. ID. NO:2). Se amplificó por PCR la secuencia codificante del ADNc de At2g18250 usando los siguientes pares de cebadores: FCoaD, 5'-GGATCCATGGCAGCTCCGGAA
GATTC y RCoaD, 5'-GGATCCTCATGATGCTTTTTCTTCTG. Se clonó el producto de PCR en el vector de entrada pCR8/GW/TOPO (Invitrogen) y se recombinó mediante reacción de LR en el vector de destino pMDC32 (Curtis y Grossniklaus, 2003). Se transfirió el constructo pMDC32-35S:PPAT a Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pGV2260; Deblaere et al., 1985) mediante electroporación y se usó para transformar plantas de tipo natural. Se usó el método de inmersión floral (Clough y Bent, 1998). Se hicieron crecer bacterias en la fase estacionaria en un cultivo de LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl por litro) complementado con 25 mg/ml de kanamicina. Se recuperaron las células mediante centrifugación y se resuspendieron en un medio de infiltración (sacarosa al 5% y Silwet L-77 al 0,05%). Se invirtieron plantas de Arabidopsis de cuatro semanas y se sumergieron en esta suspensión, tras lo cual se cubrieron con plástico para mantener la humedad. Tras 12-24 horas, se retiró la cubierta de plástico y se devolvieron las plantas al invernadero. Se recogieron las semillas de las plantas tratadas tras 3-5 semanas. Éstas se almacenaron durante 3-4 semanas, tras las que se realizó una selección de los transformantes que contenían ADN-T transferido por Agrobacterium. Se recogieron las semillas de las plantas transformadas y se cultivaron en placa sobre medio de selección con higromicina (20 \mug/ml) para identificar las plantas transgénicas T1. Se usaron para estudios adicionales las progenies T3 que eran homocigóticos para el marcador de selección.

\vskip1.000000\baselineskip

Aislamiento de mutantes

Se identificó una línea (referencia Columbia) que contenía una única inserción de ADN-T en PPAT (At2g18250) a partir de la colección de ADN-T de SALK (Alonso et al., 2003), correspondiente al número de reserva de donante SALK_093728. Con el fin de identificar individuos homocigóticos para la inserción de ADN-T, se obtuvo el ADN genómico a partir de plántulas resistentes a kanamicina (50 \mug/ml) y se sometió a genotipado por PCR usando los siguientes cebadores: 5'-GGGAGTCTGTGATGGCCCAAT y 5'-CTTGACATAGGTCTCCACATTA. Como cebador del extremo izquierdo de ADN-T del vector pROK2 se usó el siguiente: 5'-GCCGATTTCGGAACCACCATC. La línea mutante marcada con el ADN-T se retrocruzó una vez con el tipo silvestre, se verificó mediante hibridación de inmunotransferencia en gel de ADN y también mediante el análisis de segregación del gen de resistencia a antibióticos codificado.

\vskip1.000000\baselineskip

Generación de líneas complementadas y de sobreexpresión

Se amplificó la secuencia codificante del ADNc de At2g18250 (obtenida a partir de ABRC, clon U61663) mediante PCR usando los siguientes pares de cebadores: FCoaD, 5'-GGATCCATGGCAGCTCCGGAAGATTC y RCoaD, 5'-GGATCCTCATGATGCTTTTTCTTCTG. Se clonó el producto de PCR en el vector de entrada pCR8/GW/TOPO (Invitrogen) y se recombinó mediante reacción de LR en el vector de destino pMDC32 (Curtis y Grossniklaus, 2003). Se transfirió el constructo pMDC32-35S:PPAT a Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pGV2260; Deblaere et al., 1985) mediante electroporación y se usó para transformar plantas mutantes ppat-1 (líneas complementadas) y de tipo silvestre (líneas de sobreexpresión). Se recogieron las semillas de las plantas transformadas y se sembraron en medio de selección con higromicina (20 \mug/ml) para identificar las plantas transgénicas T1. Se usaron para estudios adicionales las progenies T3 que eran homocigóticas para el marcador de selección.

\newpage

Ensayos de estrés y establecimiento de las plántulas

Se clasificó el establecimiento de las plántulas de las diferentes referencias genéticas como el porcentaje de semillas que desarrollaron cotiledones expandidos verdes y el primer par de verdaderas hojas. Se realizaron ensayos de tolerancia al estrés salino y osmótico mediante la transferencia de plántulas de 7 días hechas crecer en medio que contenía sacarosa a un medio complementado con NaCl 75 mM, NaCl 125 mM, manitol 150 mM o manitol 250 mM, respectivamente. Las plántulas se hicieron crecer verticalmente durante de 7 a 11 días y se exploraron periódicamente las placas en un escáner de lecho plano para producir archivos de imágenes adecuados para el análisis cuantitativo usando el software NIH Image (ImageJ v1.37).

\vskip1.000000\baselineskip

Determinación del contenido en aminoácidos

El contenido en aminoácidos se determinó mediante HPLC/EM en extractos vegetales preparados en etanol al 80% a partir de plántulas que o bien eran simuladas o bien se trataron con NaCl 125 mM durante 48 h. Se derivatizaron los aminoácidos libres en los extractos hasta sus derivados de cloroformiato de isobutilo tal como describe Husek (1991) y se analizaron mediante CL-EM como sus fragmentos MS2.

\vskip1.000000\baselineskip

Análisis de ARN

Se recogieron hojas en roseta y se congelaron en nitrógeno líquido. Se extrajo el ARN total utilizando un Mini Kit RNeasy Plant de Qiagen y se sometió a transcripción inversa 1 \mug de la disolución de ARN obtenida utilizando 0,1 \mug de cebador de oligo(dT)_{15} y la transcriptasa inversa de VLM-M (Roche), hasta obtener finalmente una disolución de ADNc de 40 \mul. Se realizaron mediciones y amplificaciones por RT-qPCR utilizando un sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7000 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Las secuencias de los cebadores usados para las amplificaciones por PCR fueron las siguientes: para PPAT, directo 5'-GGGAGTCTGTGATGGCCCAAT e inverso 5'-CTTGACATAGGT CTCCACATTA y para \mu-actina-8 (At1g49420), directo 5'-AGTGGTCGTACAACCGGTATTGT e inverso 5'-GAGGATAGC ATGTGGAAGTGAGAA.

Se monitorizaron las amplificaciones por RT-Q-PCR utilizando la cepa fluorescente Eva-Green^{TM} (Biotium). Se llevó a cabo la cuantificación relativa de los datos de expresión génica utilizando el método 2^{\Delta\Delta CT} o de C_{T} comparativo (Livak y Schmittgen 2001). Se normalizaron los niveles de expresión utilizando los valores de CT obtenidos para el gen de la \mu-actina-8. Se verificó adicionalmente la presencia de un único producto de PCR mediante análisis de disociación en todas las amplificaciones. Todas las cuantificaciones se realizaron por triplicado en las muestras de ARN.

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayo de la enzima PPAT

Se sometió a ensayo la actividad de PPAT en el sentido inverso utilizando hexocinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para acoplar la producción de ATP a la reducción de NADP (Geerlof et al., 1999). La mezcla de ensayo contenía dPCoA 0,1 mM, PPi 2 mM, MgCl_{2} 2 mM, NADP^{+} 1 mM, glucosa 5 mM, DTT 1 mM, 4 unidades de hexocinasa y 1 unidad de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8. Se obtuvo PPAT recombinante como una proteína de fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP). Para este fin, se escindió la secuencia codificante de PPAT del vector de entrada pCR8/GW/TOPO utilizando digestión con BamHI y se clonó en pMalc2. Se indujo la expresión de MBP-PPAT recombinante con IPTG 1 mM en células DH5a de E. coli y se purificó la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad con amilosa según las instrucciones del fabricante (New England Biolabs).

Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 25ºC y se monitorizó el aumento de la absorbancia a 340 nm. Una unidad de actividad corresponde a la formación de 1 \mumol de producto/min usando un coeficiente de extinción para el NADPH de 6220 M^{-1} cm^{-1}. Se corrigieron las velocidades para la reducción de la referencia de NADP.

\vskip1.000000\baselineskip

Determinación de acetil coenzima A y coenzima A

Se determinaron AcCoA y CoA básicamente tal como se describe en Gibon et al., (2002) con modificaciones minoritarias. Se redujeron a polvo muestras de tejido (100-200 mg de FW) utilizando mortero y mano de mortero y se extrajeron con (100-200 \mul) de ácido tricloroacético al 16%. Tras la centrifugación, el sobrenadante se llevó a pH 6-7 mediante la adición de base Tris 2 M. Se determinó la suma de CoA y AcCoA utilizando el ensayo espectrofotométrico de ciclación de enzimas descrito originariamente por Allred y Guy (1969). Se colocaron alícuotas de extracto de 20 \mul en una microplaca y se añadieron 150 \mul de Tris/HCl pH 7,4 que contenía 0,25 \mumol de DTT y 12,5 \mumol de malato y se incubaron durante 10 min. A continuación, se añadieron 80 \mul de una mezcla que contenía 0,25 \mumol de DTT, 0,2 \mumol de NAD^{+}, 0,6 pmol de fosfato de acetilo, 2,5 unidades de fosfotransacetilasa, 1,25 unidades de citrato sintasa y 3 unidades de malato deshidrogenasa en Tris 100 mM/HCI pH 7,4, se incubó la mezcla de reacción a 25ºC durante 20 min y se leyó la absorbancia a 340 nm. Con cada conjunto de determinaciones, se incluyeron curvas de calibración utilizando patrones de CoA y AcCoA (que oscilaban desde 0,5 hasta 10 pmol).

\vskip1.000000\baselineskip

Obtención de perfiles de ácidos grasos y acil-CoA

Se extrajeron los lípidos de 20 semillas secas por repetición y se transmetilaron en sus ésteres metílicos de ácidos grasos (EMAG) junto con tripentadecanoína como un patrón interno utilizando un procedimiento de 1 etapa (Browse et al., 1986). Se disolvieron los EMAG en hexano y se inyectaron alícuotas de 2 \muL para el análisis de CG-FID utilizando una columna capilar BPX70 de 60 m x 0,25 mm de di. x 0,25 \mum de espesor de película (SGE) y un CG GC8000 Top de CE Instruments (Thermoquest). Se realizó la inyección en una corriente de gas portador de hidrógeno a 1,3 ml\cdotmin^{-1} (velocidad lineal promedio de 35 cm\cdots^{-1}) a una razón de fraccionamiento de 30:1. La temperatura se elevó tal como sigue: 110ºC isoterma 1 min; 7,5ºC\cdotmin 1 hasta 260ºC; se enfrió a 70ºC\cdotmin^{-1} hasta 110ºC; el tiempo total de análisis fue de 23 min. Se identificaron los EMAG mediante su comparación con una mezcla de 37 EMAG (Supelco). Se extrajeron cien plántulas por repetición (aproximadamente 3 mg para las plántulas de 0 DAI, 20 mg para las de 2 DAI y 30 mg para las de 5 DAI) para el análisis cuantitativo de acil CoA mediante HPLC con detección por fluorescencia de derivados de acil eteno CoA (Larson et al., 2001; con modificaciones descritas por Larson et al., 2002). Se utilizó la porción lipídica de los extractos de acil CoA para las determinaciones de ácidos grasos tal como se describió anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Alineamiento de la proteína PPAT de Arabidopsis Thaliana con sus proteínas ortólogas

Teniendo en cuenta que el gen que codifica la enzima PPAT está conservado desde musgo hasta especies arbóreas (pícea, chopo) y desempeña una función imprescindible en la célula vegetal, para comprobar su conservación en las especies vegetales, se llevaron a cabo alineamientos de la proteína PPAT de Arabidopsis thaliana con algunas proteínas ortólogas (con función equivalente) de otras especies vegetales.

Para ello, se llevó a cabo una búsqueda en las base de datos públicas que presentan los genomas vegetales disponibles.

La base de datos http://www.ncbi.nlm.nih.gov incluye secuencias génicas y productos génicos de vid, arroz, pícea, musgo, colza y col. Los alineamientos de la proteína PPAT de Arabidopsis thaliana obtenidos en esta base de datos permitió la identificación de los siguientes genes o productos génicos con los porcentajes de homología que se indican a continuación:

En vid (Vitis vinifera) se detectó la proteína con número de acceso emb|CAO16378.1| y nombre desconocido, que presenta una homología del 92% con PPAT de Arabidopsis Thaliana.

En arroz (Oryza sativa Japonica Group), se detectó un gen con número de identificación GENE ID: 4342557 Os07g0179400 | Os07g0179400, que presenta un 83% de homología con PPAT de Arabidopsis Thaliana.

En Pícea (Picea sitchensis), se detectó una proteína desconocida identificada como gb|ABK25768.1, con homología del 86% frente a PPAT de Arabidopsis Thaliana.

En Musgo (Physcomitrella patens subsp. patens), se identificó la proteína gb|EDQ82844.1 que presenta homología del 86% con PPAT de Arabidopsis Thaliana.

En Colza (Brassica napus) se detectó gi|95827801|gb|DW998276.1 que presenta homología del 85% con Arabidopsis Thaliana.

En Col (Brassica oleracea) se detectó gi|150912248|gb|ES942706.1, con homología del 85% frente a Arabidopsis Thaliana

La base de datos de especies de solanáceas http://www.sgn.cornell.edu/ incluye secuencias génicas y productos génicos de tomate y patata. Los alineamientos de la proteína PPAT de Arabidopsis thaliana obtenidos en esta base de datos permitó la identificación de los siguientes genes o productos génicos con los porcentajes de homología que se indican a continuación:

En tomate (Solanum lycopersicum) se identificó tomato|TC155758, que presenta homología del 88% con Arabidopsis Thaliana.

En patata (Solanum tuberosum) se identificó SGN-U279993 que presenta homología del 94% con Arabidopsis Thaliana.

Los alineamientos de la proteína PPAT de Arabidopsis thaliana obtenidos en la base de datos del chopo (http://genome.jgi-psf.org/Poptr1 1/Poptr1 1.home.html) permitó la identificación de los siguientes genes o productos génicos con los porcentajes de homología que se indican a continuación:

En chopo (Populus trichocarpa) se identificó eugene3.00570163 que presenta homología del 80% con Arabidopsis Thaliana.

Así, los resultados de estos alineamientos corroboran la presencia del producto génico PPAT en los genomas vegetales y por tanto su conservación en distintas especies vegetales.

A continuación se muestran los alineamientos de la proteína PPAT de Arabidopsis thaliana con algunas proteínas ortólogas (con función equivalente) de otras especies vegetales como: vid (Vitis vinifera), arroz (Oryza sativa), pícea (Picea sitchensis), musgo (Physcomitrella patens), colza (Brassica napus), col silvestre (Brassica oleracea), tomate (Solanum lycopersicum), patata (Solanum tuberosum), chopo (Populus trichocarpa). Se llevó a cabo una búsqueda en la base de datos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (la cual incluye secuencias génicas y productos génicos de vid, arroz, pícea, musgo, colza y col), la base de datos de especies de solanáceas http://www.sgn.cornell.edu/ (la cual incluye secuencias génicas y productos génicos de tomate y patata) y la base de datos del chopo (http://genome.igi-psf.org/Poptr1 1/Poptr1 1.home.html). El gen que codifica las proteínas ortólogas en estas especies vegetales está indicado en el encabezamiento de cada uno de los alineamientos.

1

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

13

Referencias

Aghajanian, S. and Worrall, D.M. (2002). Identification and characterization of the gene encoding the human phosphopantetheine adenylyltransferase and dephospho-CoA kinase bifunctional enzyme (CoA synthase). Biochem. J. 365, 13-18.

Allred, J.B. and Guy, D.G. (1969). Determination of coenzyme A and acetyl CoA in tissue extracts. Anal. Biochem. 29, 293-299.

Alonso, J.M., et al., (2003). Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301, 653-657.

Begley, T.P., Kinsland, C. and Strauss, E. (2001). The biosynthesis of coenzyme A in bacteria. Vitam. Horm. 61, 157-171.

Browse, J., McCourt, P.J. and Somerville, C.R. (1986). Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue. Anal. Biochem. 152, 141-145.

Curtis, M.D. and Grossniklaus, U. (2003). A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta. Plant Physiol 133, 462-469.

Daugherty, M., Polanuyer, B., Farrell, M., Scholle, M., Lykidis, A., Crecy-Lagard, V. and Osterman, A. (2002). Complete reconstitution of the human coenzyme A biosynthetic pathway via comparative genomics. J. Biol. Chem. 277, 21431-21439.

Deblaere, R., Bytebier, B., De Greve, H., Deboeck, F., Schell, J., Van Montagu, M. and Leemans, J. (1985). Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer to plants. Nucleic Acids Res. 13, 4777-4788.

Eastmond, P.J., Germain, V., Lange, P.R., Bryce, J.H., Smith, S.M. and Graham, I.A. (2000). Postgerminative growth and lipid catabolism in oilseeds lacking the glyoxylate cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 5669-5674.

Espinosa-Ruiz, A., Belles, J.M., Serrano, R. and Culianez-Macia, F.A. (1999). Arabidopsis thaliana AtHAL3: a flavoprotein related to salt and osmotic tolerance and plant growth. Plant J. 20, 529-539.

Geerlof, A., Lewendon, A. and Shaw, W.V. (1999). Purification and characterization of phosphopantetheine adenylyltransferase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274, 27105-27111.

Gibon, Y., Vigeolas, H., Tiessen, A., Geigenberger, P. and Stitt, M. (2002). Sensitive and high throughput metabolite assays for inorganic pyrophosphate, ADPGIc, nucleotide phosphates, and glycolytic intermediates based on a novel enzymic cycling system. Plant J. 30, 221-235.

Husek, P. (1991). Amino acid derivatization and analysis in five minutes. FEBS Lett. 280,354-356.

Izard, T. and Geerlof, A. (1999). The crystal structure of a novel bacterial adenylyltransferase reveals half of sites reactivity. EMBO J. 18, 2021-2030.

Izard, T. (2002). The crystal structures of phosphopantetheine adenylyltransferase with bound substrates reveal the enzyme's catalytic mechanism. J. Mol. Biol. 315, 487-495.

Izard, T. (2003). A novel adenylate binding site confers phosphopantetheine adenylyltransferase interactions with coenzyme A. J. Bacteriol. 185, 4074-4080.

Jackowski, S. and Rock, C.O. (1984). Metabolism of 4'-phosphopantetheine in Escherichia coli. J. Bacteriol. 158, 115-120.

Kupke, T., Hernandez-Acosta, P. and Culianez-Macia, F.A. (2003). 4'-phosphopantetheine and coenzyme A biosynthesis in plants. J. Biol. Chem. 278, 38229-38237.

Larson, T.R. and Graham, I.A. (2001). Technical Advance: a novel technique for the sensitive quantification of acyl CoA esters from plant tissues. Plant J. 25, 115-125.

Larson, T.R., Edgell, T., Byrne, J., Dehesh, K. and Graham, I.A. (2002). AcyI CoA profiles of transgenic plants that accumulate medium-chain fatty acids indicate inefficient storage lipid synthesis in developing oilseeds. Plant J. 32, 519-527.

Leonardi, R., Zhang, Y.M., Rock, C.O. and Jackowski, S. (2005). Coenzyme A: back in action. Prog. Lipid Res. 44, 125-153.

Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408.

Martin, T., Oswald, O. and Graham, I.A. (2002). Arabidopsis seedling growth, storage lipid mobilization, and photosynthetic gene expression are regulated by carbon:nitrogen availability. Plant Physiol 128, 472-481.

Murashige, T. and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15, 473-497.

Ottenhof, H.H., Ashurst, J.L., Whitney, H.M., Saldanha, S.A., Schmitzberger, F., Gweon, H.S., Blundell, T.L., Abell, C. and Smith, A.G. (2004). Organisation of the pantothenate (vitamin B5) biosynthesis pathway in higher plants. Plant J. 37, 61-72.

Park, S., Li, J., Pittman, J.K., Berkowitz, G.A., Yang, H., Undurraga, S., Morris, J., Hirschi, K.D. and Gaxiola, R.A. (2005). Up-regulation of a H+-pyrophosphatase (H+-PPase) as a strategy to engineer drought-resistant crop plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 18830-18835.

Rock, C.O., Calder, R.B., Karim, M.A. and Jackowski, S. (2000). Pantothenate kinase regulation of the intracellular concentration of coenzyme A. J. Biol. Chem. 275, 1377-1383.

Rock, C.O., Park, H.W. and Jackowski, S. (2003). Role of feedback regulation of pantothenate kinase (CoaA) in control of coenzyme A levels in Escherichia coli. J. Bacteriol. 185, 3410-3415.

Rubio, S., Larson, T.R., Gonzalez-Guzman, M., Alejandro, S., Graham, I.A., Serrano, R. and Rodriguez, P.L. (2006). An Arabidopsis mutant impaired in coenzyme A biosynthesis is sugar dependent for seedling establishment. Plant Physiol 140, 830-843.

Tilton, G.B., Wedemeyer, W.J., Browse, J. and Ohlrogge, J. (2006). Plant coenzyme A biosynthesis: characterization of two pantothenate kinases from Arabidopsis. Plant Mol. Biol. 61, 629-642.

To, J.P., Reiter, W.D. and Gibson, S.I. (2002). Mobilization of seed storage lipid by Arabidopsis seedlings is retarded in the presence of exogenous sugars. BMC. Plant Biol. 2, 4.

Tully, R.E., Hanson, A.D. and Nelsen, C.E. (1979). Proline Accumulation in Water-stressed Barley Leaves in Relation to Translocation and the Nitrogen Budget. Plant Physiol 63, 518-523.

Tumaney, A.W., Ohlrogge, J.B. and Pollard, M. (2004). Acetyl coenzyme A concentrations in plant tissues. J. Plant Physiol 161, 485-488.

Verslues, P.E., Agarwal, M., Katiyar-Agarwal, S., Zhu, J. and Zhu, J.K. (2006). Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status. Plant J. 45, 523-539.

Voetberg, G.S. and Sharp, R.E. (1991). Growth of the Maize Primary Root at Low Water Potentials: III. Role of Increased Proline Deposition in Osmotic Adjustment. Plant Physiol 96, 1125-1130.

Wardlaw, I.F. (1967). The effect of water stress on translocation in relation to photosynthesis and growth. I. Effect during grain development in wheat. Aust. J. Biol. Sci. 20, 25-39.

Yonamine, I., Yoshida, K., Kido, K., Nakagawa, A., Nakayama, H. and Shinmyo, A. (2004). Overexpression of NtHAL3 genes confers increased levels of proline biosynthesis and the enhancement of salt tolerance in cultured tobacco cells. J. Exp. Bot. 55, 387-395.

<110> Universidad Politécnica de Valencia y Consejo Superior de Investigaciones Científicas

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Utilización del enzima fosfopanteteina adeniltrasferasa, implicado en la biosíntesis del coenzima a, en la mejora del crecimiento vegetal, resistencia al estrés salino/osmótico, Incremento de lípidos de reserva y modificación del contenido Aminoacídico.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> Referencia de la solicitud

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de la enzima PPAT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

25

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 531

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de nucleótidos del ADNc de PPAT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

27

Claims (32)

1. Uso del gen que codifica la enzima PPAT en especies vegetales como regulador de la síntesis de CoA.

2. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicación 1, donde dicho gen es homólogo al gen PPAT de A. Thaliana.

3. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque dicha regulación se produce por ganancia de función del gen que codifica la PPAT.

4. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha ganancia de función es por sobreexpresión de PPAT.

5. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la sobreexpresión es producida por inserción de una copia adicional del gen PPAT en el genoma de la planta.

6. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según la reivindicación 5, caracterizado porque la copia adicional del gen PPAT es insertada bajo el control de un promotor constitutivo.

7. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según la reivindicación 6, caracterizado porque la copia adicional del gen PPAT es insertada bajo el control del promotor constitutivo 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor en el genoma de la planta.

8. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según la reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque dicha regulación implica un aumento en los niveles de síntesis de CoA.

9. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque dicha regulación implica un aumento en los niveles de síntesis de CoA+ACoA de 1,6 veces superior a los niveles de CoA+ACoA en plantas silvestres.

10. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque dicha regulación implica un aumento en el crecimiento vegetativo y reproductivo de las plantas, aumento de la producción de semillas, disminución del tiempo de floración, mayor resistencia al estrés osmótico y salino, aumento del contenido en ácidos grasos en las semillas y composición aminoacídica modificada.

11. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicación 10 caracterizado porque dicha regulación implica una disminución de dos días en el tiempo de floración en comparación con plantas de tipo silvestre.

12. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 10 y 11 caracterizado porque dicha regulación implica mayor resistencia al estrés osmótico y salino debido a la acumulación de prolina.

13. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicación 12 caracterizado porque dicha regulación implica una acumulación de prolina dos veces mayor que los niveles de prolina en plantas silvestres.

14. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 10 a 13 caracterizado porque dicha regulación implica que el aumento del contenido en ácidos grasos se produzca en ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y ácido eicosanoico.

15. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según reivindicaciones 10 a 14 caracterizado porque dicha regulación implica que el contenido en ácidos grasos en las semillas sea 35-50% superior que en las semillas de plantas silvestres.

16. Uso del gen que codifica la enzima PPAT según las reivindicaciones 1 a 15, para la obtención de plantas transgénicas que presenten mayor crecimiento vegetativo y reproductivo, mayor producción de semillas, disminución del tiempo de floración, mayor resistencia al estrés osmótico y salino, aumento del contenido en ácidos grasos en las semillas y composición aminoacídica modificada.

17. Plantas modificadas genéticamente, según la reivindicación 16, caracterizada por su ganancia de función del gen PPAT para regular la síntesis de CoA.

18. Planta modificada genéticamente según reivindicación 17 caracterizada porque la ganancia de función del gen PPAT es producida por inserción de una copia adicional del gen PPAT.

19. Planta modificada genéticamente según reivindicaciones 17 y 18 caracterizada porque la inserción de la copia adicional del gen PPAT se produce bajo el control de un promotor constitutivo.

20. Planta modificada genéticamente según reivindicaciones 17 a 19 caracterizada porque la inserción de la copia adicional del gen PPAT se produce bajo el control del promotor constitutivo 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor.

21. Planta modificada genéticamente según reivindicaciones 17 a 20 caracterizada por presentar mayor crecimiento vegetativo y reproductivo, mayor producción de semillas, disminución del tiempo de floración, mayor resistencia al estrés osmótico y salino y mayor contenido en ácidos grasos en las semillas, que las plantas silvestres, así como composición aminoacídica modificada.

22. Semillas producidas por las plantas modificadas genéticamente según reivindicaciones 17 a 21, caracterizadas por presentar mayor contenido en ácidos grasos en las semillas, que las semillas de plantas silvestres.

23. Semillas producidas por las plantas modificadas genéticamente según reivindicaciones 17 a 22, caracterizadas porque el aumento del contenido en ácidos grasos se produce principalmente en ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y ácido eicosanoico.

24. Semillas producidas por las plantas modificadas genéticamente según reivindicaciones 17 a 23, caracterizadas porque el contenido en ácidos grasos en las semillas es 35-50% superior que en las semillas de plantas silvestres.

25. Uso de las semillas y/o plantas transgénicas según reivindicaciones 17 a 24 en la producción de aceites vegetales.

26. Uso de las plantas según reivindicación 25 en la producción de aceites vegetales.

27. Uso de las semillas según reivindicación 25 en la producción de aceites vegetales.

28. Uso de las semillas y plantas transgénicas según reivindicaciones 25 a 27 caracterizado porque dichos aceites son para uso en alimentación.

29. Uso de las semillas y/o plantas transgénicas según reivindicaciones 25 a 27 caracterizado porque dichos aceites son para uso en la industria del biodiesel.

30. Uso de las semillas y/o plantas transgénicas según reivindicaciones 17 a 24 en la industria de la alimentación animal.

31. Uso de las semillas transgénicas según reivindicación 30 en la industria de la alimentación animal.

32. Uso de las plantas transgénicas según reivindicación 30 en la industria de la alimentación animal.