CN102933709A - 编码来源于麻风树属树的ppat的多核苷酸及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明发现了来源于麻风树属树的SEQ ID NO:1的PPAT多肽和SEQ ID NO:2的PPAT多核苷酸等。通过用这种PPAT多核苷酸转化麻风树属树，与野生型相比，可以过表达PPAT多肽，并且这种多肽能够促进辅酶A的生物合成、增强该转化的麻风树属树的代谢功能和生存能力、并显著提高例如胁迫抗性。
Description
技术领域
本发明涉及麻风树属（Jatropha）树的新基因、即编码磷酸泛酰巯基乙胺腺苷转移酶（在下文中称为“PPAT”）的多核苷酸及其应用，特别是用于产生生长增强的胁迫抗性的麻风树属树的应用。
背景技术
因为麻风树（Jatropha curcas）能够产生不可食用的麻风树属树油，因此，它作为用于生产生物柴油燃料的生物资源引起了关注。此外，已知麻风树属树是甚至可以在水和无机养料方面不适合其他作物生长的地区栽培的植物，并且麻风树属树被认为对有效利用半干旱地区以及绿化非常有益。另一方面，虽然麻风树属植物生长在贫瘠之地，但因为该植物一年结果一次并且果实的大小显著小于手掌的大小，所以通过天然栽培获得的油的生产效率不高。为此理由，需要开发高生产力的麻风树属树。
作为提高麻风树属树油生产效率的一种措施，转化麻风树属树使得乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）能够被过表达以增加种子的含油量的方法是已知的，例如在专利文献1中所提议的。
另一方面，从提高麻风树属树本身的生长的观点来看，还可以想到的是赋予环境胁迫抗性以确保即使在缺水等的环境中也有高生存能力。
可以想到的是环境胁迫抗性的基因重组植物——这是其中的胁迫应答性信号强度和机制被改变以便适应或应答环境胁迫例如干旱胁迫的植物，以及用来实现过量生产参与抗性的蛋白质分子（环境胁迫应答性蛋白质）的改进的方法等。
例如，关于在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中调控干旱胁迫抗性的机制，非专利文献1报告了，NF-YA5转录因子是ABA-依赖性的并由干旱胁迫强诱导，而且过表达NF-YA5的转化的拟南芥在对干旱胁迫的抗性上优于野生型拟南芥。
在此，脱落酸（ABA）是一种植物激素，其参与种子休眠、气孔的打开／关闭和渗透压胁迫抗性，并且已知ABA深入参与一组胁迫应答性基因的表达。
作为环境胁迫抗性的拟南芥的制备方法，专利文献2提出了一种方法，所述方法利用了在转录因子调控下的一组基因的激活功能，所述转录因子通过与由于环境胁迫引起表达的胁迫应答性蛋白质的编码基因上游存在的顺式元件结合而激活转录（胁迫应答性转录因子）。具体地，专利文献2公开了SRK2C基因是诱导DREB/CBF表达的信号转导因子的新编码基因，其中DREB/CBF是胁迫应答性转录因子，并且专利文献2还公开了转化后过表达SRK2C的拟南芥与对照相比，即使在停止供水之后仍表现出占优势的高存活率。
此外，非专利文献2报告了，鉴定出NF-YB因子，并且用该因子转化后的玉米在缺水条件下显示出比野生型更高的生产率。
此外，关于拟南芥，非专利文献3报告了，在磷酸泛酰巯基乙胺腺苷转移酶（PPAT）编码基因被破坏的个体（ppat-1突变株）中，营养生长和种子产率显著降低（图2），而相反，在过表达PPAT的个体（OE株）中，与野生型相比，获得了盐抗性和渗透压抗性（利用甘露糖醇进行测试）增强的效果，并且与野生型相比，促进了生长（参见图3和4）。
本文中使用的PPAT也被缩写为AtCoaD，是参与辅酶A的生物合成的酶。如图1所示，辅酶A是从泛酸生物合成的，并且PPAT催化4’-磷酸泛酰巯基乙胺与脱磷酸辅酶A之间的交换反应。辅酶A由泛酸、腺苷二磷酸和2-硫氧基乙胺构成，并由化学式C21H36P3N7O16S表示。它通过将各种化合物的酰基与它的末端硫醇基以硫酯键连接来参与多种代谢反应。代表性地，它是参与在原核和真核细胞中有共同功能的TCA循环的辅酶。
引用列表
专利文献
专利文献1：日本特表2009-536029号公报
专利文献2：日本特开2005-253395号公报
非专利文献
非专利文献1：Wen-Xue Li等,“转录和转录后调节拟南芥NFYA5转录因子以促进干旱抗性（The Arabidopsis NFYA5 Transcription FactorIs Regulated Transcriptionally and Posttranscriptionally to PromoteDrought Resistance）”,The Plant Cell,Vol.20:2238-2251(2008)
非专利文献2：Donald E.Nelson等,“植物核因子Y（NF-Y）B亚单位赋予干旱抗性并导致玉米在水受限土地上的产率提高（Plantnuclear factor Y(NF-Y)B subunits confer drought tolerance and lead toimproved corn yields on water-limited acres）”,PNAS,vol.104,No.42,16450-16455(2007)
非专利文献3：Rubio S.等,“辅酶A生物合成酶磷酸泛酰巯基乙胺腺苷转移酶在植物生长、盐/渗透压胁迫抗性和种子脂质储存中发挥关键性的作用（The coenzyme A biosynthetic enzyme phosphopantetheineadenylyltransferase plays a crucial role in plant growth,salt/osmotic stressresistance,and seed lipid storage）”,Plant Physiol.,148:546-556(2008)
发明内容
技术问题
因为植物中关于植物生长和环境胁迫的信号转导途径的机制是复杂的，因此如上所述，已经提出了各种转化方法，用于产生在生产率和环境胁迫抗性方面优异的植物。然而，就麻风树属树而言，尚没有阐明与胁迫相关的调节蛋白和与抗性相关的功能蛋白等，并且没有发现具有优异的生存能力的转化的麻风树属树的有关信息。
本发明要实现的目标是产生具有优异的生存能力的胁迫抗性的麻风树属树，并且由此提供能够转化野生型麻风树属树以使其具有优异的生存能力和胁迫抗性的基因等。
问题的解决方案
为了实现前述的目标，作为用于转化麻风树属树以使其具有优异的生存能力和胁迫抗性的基因的考查结果，本发明的发明人成功地分离和鉴定了参与辅酶A的生物合成的酶之一，即编码麻风树属树的磷酸泛酰巯基乙胺腺苷转移酶（PPAT）的多核苷酸，并完成了本发明。本发明具体如下所述：
[1]分离的多核苷酸，其选自以下多核苷酸：
(a)具有由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的多核苷酸；和
(b)具有的核苷酸序列与(a)的多核苷酸的核苷酸序列有90%或更高同源性的多核苷酸，其中由此编码的多肽保持由(a)的多核苷酸编码的多肽的胁迫抗性。
[2]如[1]所述的多核苷酸，其具有由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列。
[3]分离的PPAT多肽，其选自以下多肽：
(a)具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的多肽；和
(b)具有的氨基酸序列与(a)的多肽的氨基酸序列有90%或更高同源性的多肽，其中所述多肽保持(a)的多肽的胁迫抗性。
[4]如[3]所述的PPAT多肽，其具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。
[5]编码如[3]或[4]所述的多肽的多核苷酸。
[6]麻风树属植物的转化载体，其中整合了如[1]、[2]或[5]所述的多核苷酸。
[7]含有如[6]所述的载体的转化体。
[8]用如[6]所述的载体转化的麻风树属植物，所述植物是与野生型相比能够过表达PPAT多肽的胁迫抗性的转化的麻风树属树。
[9]从如[8]所述的胁迫抗性的转化的麻风树属树收获的种子。
[10]通过挤压如[9]所述的种子并对其纯化来生产麻风树属树油的方法。
[11]通过如[10]所述的生产方法生产的麻风树属树油。
发明的有益效果
当用本发明的多核苷酸转化麻风树属树时，转化的麻风树属树允许表达本发明的来源于麻风树属树的PPAT多肽、或其等效多肽。这些多肽促进了辅酶A的生物合成，并且增强了转化的麻风树属树的代谢功能和生存能力，并且能够显著提高例如胁迫抗性。
附图说明
图1显示了植物（拟南芥）中始于泛酸的辅酶A生物合成途径（转载自Kupke T等,“植物中4-磷酸泛酰巯基乙胺和辅酶A的生物合成（4-Phosphopantetheine and Coenzyme A Biosynthesis in Plants）”J.Biol.Chem.,278:38229-38237(2003)）。
图2是显示实施例中JcPPAT cDNA凝胶电泳结果的照片。
图3显示了麻风树属树基因组与通过PCR方法扩增的JcPPAT基因之间的关系。
图4是pGWB 11质粒的基因图谱（参见Nakagawa等,“开发Gateway二元载体系列pGWB，用于实现高效构建供植物转化用的融合基因（Development of Series of Gateway Binary Vectors,pGWBs,forRealizing Efficient Construction of Fusion Genes for PlantTransformation）”,Journal of Bioscience and Bioengineering,Vol.104(2007),No.1,p.38）。
具体实施方式
[JcPPAT多肽和编码JcPPAT多肽的JcPPAT基因]
本发明的分离的新麻风树属树基因是编码麻风树属树的磷酸泛酰巯基乙胺腺苷转移酶（PPAT）的多核苷酸。具体而言，本发明中包括：(a)具有由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的多核苷酸；和(b)具有的核苷酸序列与(a)的多核苷酸的核苷酸序列有90%或更高同源性的多核苷酸，其中由此编码的多肽保持由(a)的多核苷酸编码的多肽的胁迫抗性（在下文中，这些统称为“JcPPAT基因”等）。(b)的多核苷酸的核苷酸序列与(a)的多核苷酸的核苷酸序列具有优选95%或更高、更优选98%或更高、并特别优选99%或更高的同源性。
本发明的PPAT多肽例如也包括：(a)具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的多肽；和(b)具有的氨基酸序列与(a)的多肽的氨基酸序列有90%或更高同源性的多肽，其中所述多肽保持(a)的多肽的胁迫抗性（在下文中，这些统称为“JcPPAT”）。(b)的多肽与(a)的多肽的氨基酸序列具有优选95%或更高、更优选98%或更高、并特别优选99%或更高的同源性。本发明的基因的核苷酸序列还包括编码(a)和(b)的多肽的多核苷酸。
作为本发明的JcPPAT基因，优选列举的是编码由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的基因，具有由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的多核苷酸被优选用于产生转化的麻风树属树，因为它来源于麻风树属树基因组。
虽然制备本发明的JcPPAT基因的方法没有特别的限制，但是，例如，通过使用下列引物组（SEQ ID NO:3和4）进行RT-PCR反应，与来源于麻风树属树的PPAT基因相对应的SEQ ID NO:2的DNA可以作为靶多核苷酸的PCR产物（编码PPAT的cDNA）从麻风树属树mRNA中获得。此外，可以根据常规方法来获得JcPPAT基因，并且可以人工合成JcPPAT基因，例如，通过在SEQ ID NO:2等的DNA中取代、删除或添加预定的碱基。
[化学式1]
正向引物：5’-AAAAAGCAGGCTCAAAAATGGCGTTATTAGACGAATCTATGGTTAAT-3’
反向引物：5’-AGAAAGCTGGGTATGCTACTTCTTGTTTTTTCACCTTCTCGG-3’
可以通过通常采用的方法来制备mRNA。例如，在研钵等中磨碎冷冻的植物之后，通过乙二醛法、硫氰酸胍-氯化铯法、氯化锂-尿素法、蛋白酶K-脱氧核糖核酸酶法等可以从得到的磨碎物质中提取和制备粗RNA组分。还可以使用可商购的试剂盒。
用作材料的植物组织没有特别的限制，并且可以使用在成熟过程中的种子或发芽种子、成熟叶子、及其他组织例如茎。在这些组织当中，从发芽种子中能够得到较大量的PPAT mRNA，在所述发芽种子中，通过种子储存的脂质代谢产生能量是活跃的。据推测，因为种子发芽时需要大量的能量，所以为了代谢储存在种子中的脂质，PPAT活性增强。还推测，因为为了蓄积脂质，PPAT活性增强，所以在成熟过程中的种子中能够有效获得PPAT mRNA。然而，当组织如种子等中含有大量油时，优选在纯化磨碎的物质之后再提取RNA。
可以通过常规已知的方法例如Maxim-Gilbert化学修饰法或使用M13噬菌体的双脱氧核苷酸链终止法来对所获得的PCR产物的核苷酸序列进行测定和确认。
[产生胁迫抗性的转化的麻风树属树]
通过将表达盒基因导入到野生型麻风树属树中，产生了本发明的胁迫抗性的转化的麻风树属树，所述表达盒具有与用于表达或表达调控的启动子可操作连接的如上所述制备的JcPPAT基因。
本发明所意指的麻风树属物种没有特别的限制，可以使用麻风树（Jatropha curcas）、佛肚树（Jatropha potagurica）、红珊瑚（Jatrophamultifida）、锦珊瑚（Jatropha berlandieri）、琴叶珊瑚（Jatrophaintegerrima）等。这些物种当中，从含油量大的观点而言，优选使用麻风树（Jatropha curcas）。
可以通过任何方法实现基因导入，所述方法包括将DNA直接导入细胞的方法，例如原生质体融合法、电穿孔法和基因鸟枪法；和利用根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）或R.rhizogenes间接导入DNA的方法，并且利用土壤杆菌的方法是优选的。在下面，描述了利用土壤杆菌的转化方法。
土壤杆菌是植物病原体并具有Ti质粒，Ti质粒在LB（左侧边界）和RB（右侧边界）之间夹有一个区（T-DNA（转移DNA）区），该区能够被切掉并插入到宿主基因组中。当宿主植物感染了具有质粒的土壤杆菌并且所述质粒在这个T-DNA区中整合了待导入的基因、即JcPPAT cDNA时，所述T-DNA区被切掉并与vir区编码的一组蛋白质形成复合体并进入植物细胞，进一步实现插入到宿主基因组中。
作为利用土壤杆菌的转化方法，二元载体法是优选的。二元载体法是通过将靶外源基因整合到具有T-DNA区边界（LB和RB）的质粒的T-DNA区中，将这样的质粒与Ti质粒的T-DNA缺陷质粒（例如pAL4404）分别导入到土壤杆菌中，并用所述土壤杆菌感染植物，来将靶基因插入到植物基因组中的方法。
利用二元载体法产生转化的麻风树属树时使用的表达盒在T-DNA区中包含本发明的JcPPAT基因、用于表达所述核苷酸的启动子、标记基因和报告基因。
作为启动子，可以列举出35S花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶（NOS）启动子、及其他胚乳特异性启动子例如β菜豆素（βphaseolin）、芸苔素（napin）和泛素。
作为选择标记基因，使用赋予选择剂例如抗生素或除草剂抗性的基因。其具体实例包括卡那霉素抗性基因、巴龙霉素B抗性基因、或针对除草剂例如草铵膦和草甘磷的抗性基因。还可用的是所表达的选择标记使得能够目测识别转化体的基因，所述选择标记例如为显色蛋白或荧光蛋白如荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）；或表达各种显色底物已知的β葡萄糖醛酸酶或GUS的基因。这样的选择标记还可以被用作报告基因。
如有必要，可以进一步包含增强子、终止子、标签等。增强子用于提高靶基因的表达效率，例如，可以列举出包含CaMV 35S启动子中的上游序列的增强子区。终止子可以是能够终止由启动子转录的基因转录的任何序列，例如，可以列举出胭脂碱合酶（NOS）基因的终止子、和章鱼碱合酶（OCS）以及CaMV 35S RNA基因的终止子。
作为通过二元载体法转化麻风树属树中使用的二元载体，可以使用在T-DNA区中包含前述表达盒的那些二元载体，具体地是那些通过将前述的表达盒整合到可商购载体例如pBI系列、pPZP系列、pSMA系列和pGWB系列中而制备的二元载体。特别是，优选适用于Gateway（注册商标）克隆系统的植物转化用二元载体，可以列举出的这样的载体是pGWB系列载体。在这些pGWB系列载体中，利用花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子作为启动子；潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因作为选择标记基因；β-葡萄糖醛酸酶（GUS）、绿色荧光蛋白（GFP）、荧光素酶（LUC）、黄色荧光蛋白（YFP）或青色荧光蛋白（CFP）作为报告子；以及6xHis、FLAG、3xHA、4xMyc、GST或T7-表位作为标签，将靶基因与报告基因可操作地连接起来。此外，在N末端和C末端上都有编码报告子和允许融合的标签的序列。
Gateway（注册商标）克隆系统通过利用Gateway（注册商标）信号（att）促进了表达载体的构建。在这种方法中，通过具有attP1和attP2序列的供体载体与各端添加了attB1和attB2序列的靶基因之间的反应（BP反应），产生了在其中整合了靶基因的入门载体（各端具有attL1和attL2序列），然后通过这种入门载体与在其中整合了表达时需要的启动子的目的载体（添加了attR1和attR2序列）之间的重组反应（LR反应），产生了在其中插入了靶基因的载体（表达载体）。
因此，首先让克隆的JcPPAT cDNA与供体载体进行BP反应，以制备具有被整合在所述供体载体中的克隆的JcPPAT cDNA的入门载体，然后通过入门载体与目的载体（pGWB）之间的LR反应，可以产生在其中整合了靶DNA（JcPPAT基因）的表达载体。
利用Gateway（注册商标）二元载体（pGWB）构建植物转化用表达盒的详细说明参见Nakagawa等,“开发Gateway二元载体系列pGWB，用于实现高效构建供植物转化用的融合基因（Development ofSeries of Gateway Binary Vectors,pGWBs,for Realizing EfficientConstruction of Fusion Genes for Plant Transformation）”,Journal ofBioscience and Bioengineering,Vol.104,No.1,34-41(2007)。
如上所述产生的表达载体（植物转化载体）可以在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行扩增。扩增的转化载体可以通过电穿孔法等导入到土壤杆菌中。以这种方式导入了表达载体的土壤杆菌被用于转化麻风树属树。
通过具有植物转化载体的土壤杆菌的感染而将JcPPAT基因导入到麻风树属树中，这可以通过利用已知的方法例如叶盘法来实现。
具体地说，制备在MS培养基中悬浮了土壤杆菌的感染用菌液，并将所述菌液与作为宿主的麻风树属树的一部分（优选为子叶的切块，在下文中称为“麻风树属树叶块”）共培养约3天。在共培养之前，将麻风树属树的叶块在MS培养基中浸泡约2天，并优选进行超声处理。以这种方式可以提高导入效率。还优选向其中已经加入了砂子的土壤杆菌悬液施加振动的Sandvortex法，因为该方法提高了土壤杆菌的可感染性。
作为共培养培养基，使用掺入了植物激素例如3-吲哚丁酸（IBA）或6-苄氨基嘌呤（BA）的MS培养基等。
在共培养之后，洗涤麻风树属树叶块，并将其转移到选择培养基（含有与转化载体的表达盒中使用的选择标记基因相对应的抗生素）中并孵育，然后切下叶块中形成的愈伤组织，并将其转移到选择培养基中，进行进一步筛选转化的麻风树属树（重组细胞）。
作为选择培养基，优选使用的是通过向含有作为植物激素的IBA或BA等的预培养用培养基（MS培养基等）中添加选择用物质、即抗生素（卡那霉素，潮霉素）而制备的选择培养基。
接下来，将选定的愈伤组织转移到培养基例如诱导生根（RI）培养基或MS培养基中，并让其生根并再分化成植物苗。通过适当设定培养基中包括植物生长调节物质例如植物生长素和细胞分裂素以及碳源在内的各种成分的种类和数量以及光和温度等，可以实现诱导再分化。
[转化的麻风树属树]
因为本发明的转化的麻风树属树与野生型相比具有更大量的编码PPAT的JcPPAT基因，所述PPAT是参与辅酶A的合成反应的酶之一，而辅酶A参与细胞中的各种代谢反应，所以据推测，与野生型相比，在转化的麻风树属树中，PPAT可能被过表达，并且辅酶A的合成被促进。正如前面提到的非专利文献3所公开的，据报告，在拟南芥中，过表达PPAT的个体（OE）与野生型相比显示出辅酶A浓度增加，并且获得了盐抗性和渗透压抗性（利用甘露糖醇进行测试）增强的效果，并提高了植物生长（图2至4）。类似地，在本发明的转化的麻风树属树中，通过PPAT的过表达，增加了辅酶A的浓度，因此可以预期的是增强和促进盐、渗透压和干旱胁迫抗性和生长的效果。进而，可以预期到种子产率的增加。
此外，在非专利文献3中报告了，在过表达PPAT的植株中，种子的含油量增加了30%到50%，并且还观察到脂肪酸组成的变化。因此在本发明的转化的麻风树属树中，还可预期到种子的含油量增加，并且得到脂肪酸组成不同于野生型的果实。
本发明的转化植物不仅包括受到了转化处理的“T1代”，而且包括后代植物，包括从这种植物的种子得到的子代“T2代”，和通过由药物选择或由Southern法的分析等被证明是转化体的“T2代”植物自花授粉获得的下一代（T3代）。
[麻风树属树油的生产]
可以按照常规方法从本发明的转化的麻风树属树收获的种子中生产麻风树属树油。例如，通过挤压种子获得原料油并将原料油通过过滤器过滤，可以生产能够用作生物柴油的麻风树属树油。当计划将麻风树属树油进一步纯化时，例如，可通过蒸馏进行纯化，并且可通过日本特开2010-209177号公报记载的方法去除佛波酯。
实施例
通过实施例来描述用于执行本发明的实施方式。以下实施例不限制本发明的范围。
[分离和鉴定麻风树属树中的PPAT编码DNA]
(1)麻风树属树中的PPAT编码DNA
根据Kazusa DNA研究所和大阪大学在住友电气工业株式会社资助下进行的麻风树属树基因组计划中绘制的麻风树属树基因组信息（邻接图谱），通过TBLASTN检索搜索了与拟南芥PPAT（At2g18250）显示出同源性的基因。至于拟南芥的PPAT基因信息，参考在拟南芥信息资源（TAIR）中的基因登录信息（http://arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=locus&name=AT2G18250）。结果，据推测，在麻风树属树的基因组DNA序列上存在编码PPAT的基因序列的一个克隆（Contig 948.1，Contig 6725.1）。
(2)制备麻风树属树的总RNA
使用从日光种苗株式会社购买的泰国种系麻风树属树（麻风树）的发芽4天的种子。用70%乙醇和次氯酸钠将去壳麻风树属树种子的表面灭菌之后，所述种子被放在1/2MS培养基上，并以16小时/8小时的明/暗周期在30℃培养4天，使之发芽。利用ConcertTM植物RNA试剂（Invitrogen）从一粒发芽种子（约1g）制备含有总RNA的样品。由于制备的样品含有大量的油脂含量，因此，通过RNeasy微型柱（QIAGEN）去除这些物质来纯化RNA样品，并获得总RNA。
同样利用ConcertTM植物RNA试剂（Invitrogen）从由前面提到的麻风树属树种子长成的成熟叶子（1g）制备含有总RNA的样品。
(3)克隆和扩增麻风树属树PPAT cDNA
使用在(2)中分别从发芽种子和成熟叶子制备的总RNA作为模板，利用逆转录系统（Promega），通过AMV逆转录酶进行cDNA的合成。使用所述系统附带的Oligo(dT)15作为引物。
为了扩增据推测存在于基因组DNA序列上的编码PPAT的候选基因，利用上面制备的麻风树属树cDNA作为模板和下列引物组（SEQ IDNO:3和4）进行PCR反应，以扩增靶JcPPAT cDNA。
[化学式2]
正向引物：5’-AAAAAGCAGGCTCAAAAATGGCGTTATTAGACGAATCTATGGTTAAT-3’
反向引物：5’-AGAAAGCTGGGTATGCTACTTCTTGTTTTTTCACCTTCTCGG-3’
具体地说，向下面显示的PCR反应液中加入1μL在(1)中制备的麻风树属树cDNA溶液，使总量为20μL，并在下列条件下进行PCR反应。
将反应液在94°C保持2分钟之后，将[94°C，15秒→55°C，30秒→68°C，3分钟]的循环重复40次，然后将反应冷却到4°C。用于PCR的反应液如下。
在反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检查扩增获得的JcPPATcDNA。电泳结果显示在图2中。S是从发芽种子制备的JcPPAT cDNA样品，L是从成熟叶子制备的JcPPAT cDNA样品，N是阴性对照。在400至500bp附近观察到的条带被认为是JcPPAT cDNA。发芽种子的cDNA样品的条带比成熟叶子的cDNA样品的条带浓。这意味着发芽种子表达更多的PPAT，因为它需要活跃地代谢被储存在其中的脂质，并需要大量能量。
[产生植物重组用载体（构建转化质粒）]
为了将Gateway（注册商标）克隆系统应用于上面扩增的cDNA，进行PCR反应以添加下面显示的衔接子序列attB1（SEQ ID NO:5）和attB2（SEQ ID NO:6）。
[化学式3]
attB1：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’
attB2：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’
作为PCR反应液，使用的反应液如下制备：向以下溶液添加1μL前述通过PCR扩增得到的DNA的溶液，使总量为50μL。
PCR反应的温度循环如下。在94°C保持2分钟之后，将[94°C，15秒→45°C，30秒→68°C，1分钟]的循环重复5次，然后将[94°C，15秒→55°C，30秒→68°C，1分钟]的循环重复20次，然后将反应冷却到4°C。在反应结束后，通过琼脂糖电泳检查PCR产物。
由此获得的PCR产物的序列通过DNA测序仪进行测序。多肽编码区的序列显示在SEQ ID NO:2中。麻风树属树基因组DNA、JcPPAT基因和PCR反应中使用的引物之间的关系如图3所示。
利用可得自Invitrogen的Gateway（注册商标）系统的供体载体（pDONR221）来克隆由SEQ ID NO:2表示的DNA。具体地说，在将PCR扩增的JcPPAT基因（在各端具有attB1和attB2）与供体载体pDONR221混合之后，利用BP克隆酶（Invitrogen）进行重组反应（BP反应）以获得入门载体pENTRJcPPAT，然后将其导入到大肠杆菌DH5α菌株中。pDONR221具有被导入作为标记基因的卡那霉素抗性基因。
从大肠杆菌提取pENTRJcPPAT质粒并将它与被限制性内切酶XhoI（TAKARA BIO）直链化的质粒载体（目的载体）pGWB 11混合之后，利用LR克隆酶（Invitrogen）进行重组反应。
如图4所示，pGWB 11具有35S启动子作为启动子，并具有添加到它的C末端的FLAG标签。此外，35S启动子-R1-Cmr-ccdB-R2-FLAG被插入在HindIII与SacI之间。R1-Cmr-ccdB-R2部分可以通过与入门载体的LR反应而被attB1-(PPAT)-attB2取代。以这种方式，获得了植物重组用载体pGWB11JcPPAT。
[产生转化体]
(1)制备转化用土壤杆菌
通过电穿孔法将前述重组用载体导入到土壤杆菌中以实现转化。将这种转化的土壤杆菌在YEB液体培养基（添加了50mg/L卡那霉素，50mg/L潮霉素）中30°C下振荡培养2天，然后通过离心收获。收获的菌细胞被重悬在YEB培养基中，以制备感染用菌液。
(2)转化的麻风树属树
作为宿主的麻风树属树细胞，使用泰国种系麻风树属树（麻风树），其与用于基因组提取的麻风树属物种相同。使用麻风树属树的成熟叶子，通过叶盘法进行转化。具体而言，首先将宿主麻风树属树的成熟叶子的切块（约25mm2，在下文中称为“麻风树属树叶块”）用自来水稀释10倍后的厨房用漂白剂进行灭菌，并在通过向MS基础培养基中添加植物激素（IBA，BA）而制备的预调节琼脂培养基上在25°C下静置2天。通过将土壤杆菌悬浮在MS培养基中来制备感染用菌液，并将前述的麻风树属树叶块浸泡在所述菌液中并振荡10分钟。然后，在25°C的遮光环境下在琼脂培养基上进行3天的共培养。作为共培养培养基，使用向预调节培养基添加乙酰丁香酮而制备的共培养培养基。
(3)筛选转化的麻风树属树
筛选具有上面制备的、被稳定插入到麻风树属树的染色体基因组中的表达盒的转化体。
具体地说，用头孢噻肟钠的水溶液（200mg/L）洗涤共培养后的麻风树属树叶块，并筛选转化的麻风树属树（重组细胞）。使用卡那霉素（20mg/L）作为筛选用抗生素。在转移到芽再生I（SR-I）琼脂培养基之后，其中在25°C下培养后观察到形成愈伤组织的叶块被转移到芽再生II（SR-II）琼脂培养基中。
接下来，将选定的愈伤组织转移到芽伸长I（SE-I）琼脂培养基和芽伸长II（SE-II）琼脂培养基中，让胚状体分化，并在RI琼脂培养基中诱导生根，以获得再分化的麻风树属植物（T1）。
下面显示了使用的培养基的组成。
<MS基础培养基>
<1/2MS培养基>
<预调节培养基>
MS基础培养基
6-苄氨基嘌呤（BA）1mg/L
3-吲哚丁酸（IBA）0.075mg/L
<共培养培养基>
MS基础培养基
6-苄氨基嘌呤（BA） 1mg/L
3-吲哚丁酸（IBA） 0.075mg/L
乙酰丁香酮（AS） 20mg/L
<SR-I培养基>
MS基础培养基
<SR-II培养基>
MS基础培养基
<SE-I培养基>
MS基础培养基
6-苄氨基嘌呤（BA） 2mg/L
头孢噻肟钠 200mg/L
卡那霉素 20mg/L
<SE-II培养基>
MS基础培养基
6-苄氨基嘌呤（BA） 2mg/L
卡那霉素 20mg/L
<RI培养基>
MS基础培养基（1/2浓度的MS）
3-吲哚丁酸（IBA） 0.2mg/L
(4)确认JcPPAT基因表达
经检查，在通过所述筛选而选择的转化体中，PPAT是过表达的。
在培养转化的细胞（通过启动子表达PPAT多肽的转化的双子叶细胞）和对照（野生型麻风树属树的双子叶细胞）之后，提取mRNA并利用由SEQ ID NO:1表示的核苷酸作为模板通过RT-PCR反应进行扩增，对JcPPAT的mRNA量进行定量并与对照进行比较。
[产生转化的麻风树属树并确认生存能力]
其中导入了JcPPAT基因的转化的愈伤组织所诱导的胚状体被转移到RI培养基中，并使所述胚状体生根，以产生再分化的麻风树属植物（T1）。
在产生的过程中，测量生根的根长度、叶面积和辅酶A浓度，并与野生型的相比较。
此外，将通过再分化获得的植物苗进行砂基培养，并在任意时间点停止灌溉之后在水分不足的条件下进行培养，将植物苗的光合速率和叶绿素荧光、蒸腾速率、以及成熟叶子的黄变、卷曲和掉落与野生型的相比较，并评价干旱胁迫抗性。
工业实用性
本发明的新的多核苷酸等可以用于产生生长增强的麻风树属树和干旱胁迫抗性的麻风树属树。此外，它们可以用于产生种子的脂肪酸含量增加并且脂肪酸组成改变的麻风树属品种。
Claims (11)
1.分离的多核苷酸，其选自以下多核苷酸：
(a)具有由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的多核苷酸；和
(b)具有与(a)的多核苷酸的核苷酸序列有90%或更高同源性的核苷酸序列的多核苷酸，其中由此编码的多肽保持由(a)的多核苷酸编码的多肽的胁迫抗性。
2.权利要求1的多核苷酸，其具有由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列。
3.分离的PPAT多肽，其选自以下多肽：
(a)具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的多肽；和
(b)具有与(a)的多肽的氨基酸序列有90%或更高同源性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽保持(a)的多肽的胁迫抗性。
4.权利要求3的PPAT多肽，其具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。
5.编码权利要求3或4的多肽的多核苷酸。
6.麻风树属植物的转化载体，其中整合了权利要求1、2或5的多核苷酸。
7.含有权利要求6的载体的转化体。
8.用权利要求6的载体转化的麻风树属植物，所述植物是与野生型相比能够过表达PPAT多肽的胁迫抗性的转化的麻风树属树。
9.从权利要求8的胁迫抗性的转化的麻风树属树收获的种子。
10.通过挤压权利要求9的种子并对其纯化来生产麻风树属树油的方法。
11.通过权利要求10的生产方法生产的麻风树属树油。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130213 |