CN105122032B - 胶体考马斯染剂 - Google Patents

Abstract

提供用于对蛋白质染色的胶体制剂及其使用方法。

Description

胶体考马斯染剂

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年3月12日提交的美国临时专利申请第61/777,801号的优先权，该文通过引用纳入本文。

发明背景

可采用考马斯亮蓝G-250对电泳凝胶进行染色至确定的终点，因为所述染料可以胶体形式制备，其不进入供染色的凝胶，而是被该凝胶中的蛋白质条带吸附，用充足的时间来扩散遍及所述条带将条带饱和。因为所述胶体形式不进入凝胶本身，使得背景非常低，由此降低对脱色步骤的需求，所述脱色步骤可导致染色的蛋白质条带强度下降。

通常采用2-部分(two-part)染剂对电泳凝胶进行染色。所述2-部分染剂需在每次使用之前新鲜配制，以具有所需性能(例如，低背景)。2-部分染剂会快速形成沉淀物，这使溶液不可使用–通常在24小时内。2-部分染剂制剂还基于甲醇(作为醇)的使用。简单地用乙醇替代甲醇将使所述制剂的性能不可接受。

发明内容

提供用于对电泳凝胶中的蛋白质染色的稳定化的胶体染剂制剂。

在一些实施方式中，所述制剂包含：考马斯亮蓝；表面活性剂；乙醇；硫酸铵；和可任选的正磷酸。在一些实施方式中，所述考马斯亮蓝是考马斯亮蓝G-250或考马斯亮蓝R-250。在一些实施方式中，所述表面活性剂是泊洛沙姆407。在一些实施方式中，所述制剂包含0.01-0.05％重量/重量的考马斯亮蓝；0.01-0.10％重量/重量的泊洛沙姆407；10-20％重量/重量的乙醇；5-10％重量/重量的硫酸铵；和0.5-5％的正磷酸。

在一些实施方式中，所述制剂包含考马斯亮蓝染料；表面活性剂；乙醇或甲醇；和硫酸铵。在一些实施方式中，该制剂还包含正磷酸。在一些实施方式中，所述制剂包含乙醇(并且在一些进一步实施方式中，不包含甲醇)。在一些实施方式中，所述制剂包含甲醇(并且在一些进一步实施方式中，不包含乙醇)。

在一些实施方式中，所述考马斯亮蓝以式1表示。在一些实施方式中，所述考马斯亮蓝以式2表示。

在一些实施方式中，所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂。在一些实施方式中，所述表面活性剂是泊洛沙姆表面活性剂。在一些实施方式中，所述表面活性剂是泊洛沙姆407。

在一些实施方式中，所述制剂包含：0.01-0.05％重量/重量的考马斯亮蓝染料；0.01-0.10％重量/重量的表面活性剂；10-20％重量/重量的乙醇；5-10％重量/重量的硫酸铵；和0.5-5％正磷酸。在一些实施方式中，所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂。在一些实施方式中，所述表面活性剂是泊洛沙姆表面活性剂。在一些实施方式中，所述表面活性剂是泊洛沙姆407。

还提供采用本文所述的制剂对电泳凝胶中的蛋白质染色的方法。在一些实施方式中，所述方法包括：使所述凝胶与本文所述的权利要求1～10中任一项所述的制剂在一定条件下接触充足的时间以对该凝胶中的蛋白质染色，和，检测所述凝胶中至少一个区域内蛋白质的存在或量。在一些实施方式中，所述制剂在所述接触之前储存至少三天。

还提供储存用于电泳凝胶中蛋白质的胶体制剂的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将本文所述的胶体制剂储存至少3(例如，至少7、10、15、30或更多)天。

还提供包含本文所述的胶体制剂的试剂盒。

附图简述

图1说明染色制剂中普流罗尼克F-127的不同浓度(0.5％-0.05％)对染色强度的影响。

图2说明染色制剂中普流罗尼克F-127较低的不同浓度(0.05％及以下)对染色强度的影响。

发明详述

引言

发明人发现，通过在所述制剂中纳入表面活性剂和乙醇可生成稳定的胶体考马斯亮蓝染剂。所得的胶体制剂i)保质期长，ii)环境友好(采用乙醇的低环境影响配方)，和iii)比2-部分染剂更易使用，因为采用所述制剂所需的步骤较少。本文所述的制剂的性能与传统的保质期短的2-部分胶体考马斯染剂(例如，见述于Neuhoff等，ELECTROPHORESIS 9(6):255–262(1988))基本相同。

本文所述的制剂具有至少两个显著方面。首先，采用乙醇作为醇。可使乙醇以及硫酸铵的量最优化以增加考马斯剂在EtOH对比MeOH中的溶解度，由此允许稳定的胶体考马斯制剂。

第二，添加表面活性剂(例如，普流罗尼克^TMF-127(一般称为泊洛沙姆407))来使所述制剂稳定并防止沉淀，由此允许长期稳定保质的1-部分溶液。

制剂组分

用于对蛋白质染色的胶体染料可用于本文所述的制剂。考马斯亮蓝是一类染料的商品名，此类染料通常用于蛋白质染色。示例包括考马斯亮蓝G-250和考马斯亮蓝R-250。考马斯亮蓝R-250以式1表示。

考马斯亮蓝G-250(CAS编号6104-58-1)与R-250不同，其包含两个甲基基团，如下方式2所示。

考马斯亮蓝R-250(CAS编号6104-59-2)的通用名包括二甲花青亮蓝G，以及C.I.42655、C.I.酸性蓝90、艳靛青G，和艳吲哚青G。

如上所述，在所述制剂中纳入表面活性剂使所述试剂稳定(例如，无显著沉淀)，允许所述制剂在使用前的长时间储存(例如，基于加速的保质期研究，至少两年)。鉴于所述制剂的稳定性，所述制剂可被制备作为“1-部分”制剂(即，全部染色成分存在于同一溶液中)，由此避免了当前业内实行的由“2-部分”制剂制备新鲜染料溶液的步骤。并不意在限制可用于所述制剂中的表面活性剂的范围，在一些实施方式中，所述表面活性剂是含聚氧丙烯的表面活性剂，例如泊洛沙姆表面活性剂。泊洛沙姆表面活性剂的特点是，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。因为该聚合物嵌段部分的长度可定制，存在多种性质稍有差异的不同的泊洛沙姆。泊洛沙姆共聚物的常用命名采用"P"(表示泊洛沙姆)后跟三个阿拉伯数字，前两个阿拉伯数字×100即是聚氧丙烯核心的大致分子量，最末阿拉伯数字×10即是聚氧乙烯的含量百分比(例如，P407＝这样的泊洛沙姆，其具有4,000g/mol的聚氧丙烯分子量和70％的聚氧乙烯含量)。对于普流罗尼克和辛普罗尼克(Synperonic)泊洛沙姆商品名，这些共聚物的代称(coding)以一个字母起始以确定其在室温下的物理形式(L＝液态，P＝糊状，F＝片状(固态))后跟两个或三个阿拉伯数字，在该数字标记中，首个阿拉伯数字(三个阿拉伯数字中的前两位)乘以300，指示疏水部分的大致分子量；而最末阿拉伯数字×10即是聚氧乙烯的含量百分比(例如，L61指示1,800g/mol的聚氧丙烯分子量和10％的聚氧乙烯含量)。在该给出示例中，泊洛沙姆181(P181)＝普流罗尼克L61和辛普罗尼克PE/L 61。示例性泊洛沙姆表面活性剂包括但不限于，普流罗尼克F-127、F-108、F-68、P-105、L-35和P-123。在其它实施方式中，所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂，即，包含一个或多个聚氧乙基基团的表面活性剂。

所述制剂将包含醇，例如，乙醇或甲醇。甲醇曾被用于染剂制剂，因为采用乙醇的标准制剂具有不可接受的性能问题。然而，如本文中所讨论的，表面活性剂的纳入允许包含乙醇来代替甲醇。鉴于甲醇的环境和身体危险性，在许多情况下优选纳入乙醇替代甲醇。不过，在一些实施方式中，所述制剂可包含甲醇。

所述制剂的离子强度和pH决定了所述染剂制剂的胶体性质。离子强度可通过添加一定水平的离子型物质来控制以使染剂具有所需胶体性质。示例性离子型物质是硫酸铵。类似地，可向所述制剂纳入弱酸以调节并维持所述制剂的pH。示例性的酸包括但不限于，正磷酸、乙酸、三氯乙酸(TCA)和原儿茶酸(PCA)。用于获得离子强度和pH的最优条件的其它考虑方面可见述于，例如，Neuhoff等，Electrophoresis 6:427-448(1985)；Neuhoff等，Electrophoresis 11:101-117(1990)；和Neuhoff等，Electrophoresis 9:255-262(1988)。

所述胶体制剂中组分的浓度可在一定范围内变化，但显示最佳稳定性提升同时维持非稳定化(即，标准的2-部分甲醇型)制剂的灵敏度的制剂是：约10-20重量％(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20重量％)的乙醇、约5-10重量％(例如，5、6、7、8、9或10，例如，7％～8重量％)的硫酸铵、约0.01-0.10重量％(例如，0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.10重量％)的表面活性剂(例如，泊洛沙姆407，例如，由BASF以Pluronic^TMF-127名称销售)或如上所述的其它表面活性剂)、0.01-0.05重量％(例如，0.01重量％、0.02重量％、0.03、0.04或0.05重量％)的考马斯亮蓝(据信可采用考马斯亮蓝R-250或考马斯亮蓝G-250)，和约0.5-5重量％(例如，0.5，1，2，3，4，或5重量％)的正磷酸。所述制剂可配制在水(例如，去离子水)中。

方法

其中已进行蛋白质电泳的任何凝胶均可用本文所述的制剂按照标准染色方案染色(例如，通过如下文献所述的方法：Sambrook等，Molecular Cloning-A LaboratoryManual(《分子克隆——实验室手册》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory)，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology(《新版分子生物学方案》)，第1-3卷，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)(1994-1998))。凝胶的示例包括，例如，聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。所述制剂还可用于其中已有蛋白质通过例如等电聚焦法分离的凝胶以及2-D凝胶中。基质还可是多孔颗粒。此外，本发明可用于对天然或人工材料(例如纤维素或其衍生物(例如硝化纤维素)，以及尼龙或其衍生物(例如，PVDF))制成的膜或滤器之上和/或其内的蛋白质染色。所述蛋白质还可通过毛细作用或吸湿作用、色谱、电泳或电聚焦，或其它方法(例如，western印迹和免疫印迹)被施加至该固体基质或支持物。

实施例

产生一系列配方以制备比现有甲醇型2-部分蛋白质染剂更加安全和稳定的染剂。包含8％硫酸铵、1.6％正磷酸、0.08％考马斯亮蓝G-250和20％甲醇的示例性标准2-部分染色制剂配制在去离子水中。最初过于简单的采用乙醇替代甲醇的尝试失败，制成的制剂出现显著沉淀物。

之后，向包含7.8％硫酸铵、2.2％正磷酸和14.2％乙醇的考马斯亮蓝G-250制剂添加表面活性剂普流罗尼克F-127。所述制剂用不同水平的普流罗尼克F-127配制，并将染剂置于带盖皿器中储存5天。倾倒去除材料，并观察余留的沉淀物。低至0.05％普流罗尼克F-127的浓度阻止了沉淀物形成。此外，测试表面活性剂浓度对于相对蛋白质染色的影响。结果示于图1-2，并且显示表面活性剂的浓度对蛋白质(碳酸酐酶)染色仅具有极小影响，尤其是普流罗尼克F-127浓度处于或低于0.005％时更是如此(图2)。

采用具有0.05％普流罗尼克F-127的制剂进行加速的保质期试验。将所述制剂在37℃储存30周，并且将第二批所述制剂在50℃储存11周。然后采用这些经储存的各制剂对蛋白质聚丙烯酰胺凝胶染色，并获得可接受的结果，即，等效于新鲜制备的2-部分甲醇型染剂的染色结果。

在所附的权利要求书中，术语“一个”或“一种”是用来表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示可任选且不排除添加其它的步骤或要素。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料以及任何现有技术之间存在矛盾之处的时候，以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或短语的定义与本说明书对相同的词或短语明确给出的定义之间的差异。

Claims (20)

1.一种用于对电泳凝胶中的蛋白质染色的胶体制剂，所述制剂包含

考马斯亮蓝染料；

表面活性剂，其中所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂或泊洛沙姆表面活性剂；

乙醇或甲醇；

硫酸铵。

2.如权利要求1所述的胶体制剂，其特征在于，所述胶体制剂还包含正磷酸。

3.如权利要求1所述的胶体制剂，其特征在于，所述制剂包含乙醇。

4.如权利要求3所述的胶体制剂，其特征在于，所述制剂不包含甲醇。

5.如权利要求1所述的胶体制剂，其特征在于，所述制剂包含甲醇且不包含乙醇。

6.如权利要求1所述的胶体制剂，其特征在于，所述考马斯亮蓝以式1表示。

7.如权利要求1所述的胶体制剂，其特征在于，所述考马斯亮蓝以式2表示。

8.如权利要求1-7中任一项所述的胶体制剂，其特征在于，所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂。

9.如权利要求1-7中任一项所述的胶体制剂，其特征在于，所述表面活性剂是泊洛沙姆表面活性剂。

10.如权利要求1或6所述的胶体制剂，其特征在于，所述表面活性剂是泊洛沙姆407。

11.如权利要求1所述的胶体制剂，其包含：

0.01-0.05％重量/重量的考马斯亮蓝；

0.01-0.10％重量/重量的表面活性剂；

10-20％重量/重量的乙醇；

5-10％重量/重量的硫酸铵；和

0.5-5％正磷酸。

12.如权利要求11所述的胶体制剂，其特征在于，所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂。

13.如权利要求11所述的胶体制剂，其特征在于，所述表面活性剂是泊洛沙姆表面活性剂。

14.如权利要求13所述的胶体制剂，其特征在于，所述表面活性剂是泊洛沙姆407。

15.一种对电泳凝胶中的蛋白质染色的方法，所述方法包括：

在对所述凝胶中的蛋白质染色的条件下，使所述凝胶与权利要求1-14中任一项所述的制剂接触充足的时间，和

检测所述凝胶中至少一个区域内蛋白质的存在或蛋白质的量。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述制剂在所述接触之前储存至少三天。

17.一种储存用于电泳凝胶中蛋白质的胶体制剂的方法，所述方法包括：

储存权利要求1-14中任一项所述的胶体制剂至少3、7、10、15、或30天。

18.一种试剂盒，其包含权利要求1-14中任一项所述的胶体制剂。

19.一种用于对电泳凝胶中的蛋白质染色的胶体制剂，所述制剂由以下组成：

考马斯亮蓝染料；

表面活性剂，其中所述表面活性剂是含聚氧乙烯的表面活性剂或泊洛沙姆表面活性剂；

乙醇或甲醇；

硫酸铵；和

任选的正磷酸。

20.如权利要求1所述的胶体制剂，其还包含正磷酸。