ES2827785T3 - Kit para tinción con hematoxilina y eosina - Google Patents
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Abstract
Un equipo para realizar la tinción con hematoxilina y eosina, equipo que comprende (i) una solución de lavado tamponada de pH y (ii) una solución de hematoxilina, en donde dicha solución de lavado tamponada de pH comprende un ácido orgánico y un alcohol polihidroxílico, en donde el ácido orgánico es ácido tartárico, y en donde la solución de lavado tamponada de pH tiene un intervalo de amortiguación de pH de aproximadamente pH 2,0 a aproximadamente pH 5,0.
Description
DESCRIPCIÓN
Kit para tinción con hematoxilina y eosina
Antecedentes
La técnica de tinción con hematoxilina y eosina ("H y E") es la técnica histológica más utilizada para la visualización de patología en muestras de tejidos. Un sistema de tinción típico con H y E está compuesto por soluciones que comprenden hematoxilina a base de aluminio, eosina, una solución diferenciadora y un agente azulante. La hematoxilina es un colorante natural que cuando se compleja con iones de aluminio produce una molécula cargada positivamente que se une al ácido desoxirribonucleico para producir una coloración púrpura de los núcleos celulares. Las soluciones de diferenciación suelen ser soluciones ligeramente ácidas que agudizan el contraste de la extensión teñida al eliminar la tinción de fondo excesiva del tejido y de la extensión. Los agentes azulantes son soluciones de pH básico que cuando se aplican a muestras teñidas modifican la estructura de la hematoxilina unida para producir una coloración azul/púrpura vibrante. La eosina es un colorante cargado negativamente que se une a proteínas cargadas positivamente dentro del citoplasma y del tejido conectivo para producir una coloración rosa/naranja que contrasta con la coloración azul/morado de los núcleos. La tinción H y E se realiza más frecuentemente en un formato "por lotes" en el que los teñidores automáticos contienen generalmente una serie de recipientes de reactivos de tinción y utilizan un brazo robótico para el movimiento secuencial de portaobjetos/estantes de un recipiente a otro. Por lo general, un estante o soporte es capaz de transportar de 20 a 30 portaobjetos, aunque algunos instrumentos de tinción incorporan estantes que contienen menos o más portaobjetos por estante y, en el caso de al menos un teñidor, se pueden colocar varios estantes en un recipiente de tinción simultáneamente. . El programa informático que controla un teñidor automático permite al operador programar la duración de cada uno de las etapas, así como la secuencia de las etapas. Si bien el formato por lotes de tinción es sencillo, económico y relativamente rápido, existen inconvenientes con la técnica.
El movimiento de los estantes que llevan portaobjetos de un recipiente al siguiente da como resultado el arrastre de reactivos de tinción o del agua. El arrastre se produce debido a la adherencia de los reactivos de tinción o el agua a las extensiones, las muestras, el estante de portaobjetos, etc. El arrastre no es deseable porque puede afectar a la funcionalidad de los reactivos de tinción aguas abajo de varias formas. El arrastre diluye la concentración de los colorantes o reactivos funcionales dentro de una solución. El arrastre y la dilución también pueden afectar la funcionalidad del reactivo de tinción al cambiar las características del disolvente y, por lo tanto, afectar parámetros tales como el pH y la fuerza iónica del disolvente. Por último, el arrastre puede introducir contaminantes al reactivo de tinción. Al actuar mediante estos mecanismos, la transferencia afecta negativamente el rendimiento, la funcionalidad, la estabilidad, la previsibilidad y la capacidad del sistema de tinción. Aunque un solo caso de arrastre puede resultar en dichos impactos negativos, los impactos negativos del arrastre son especialmente problemáticos en el transcurso de múltiples series de tinción a medida que los impactos negativos se acumulan o se amplifican como resultado de los efectos acumulativos de arrastre repetido.
Debido a los efectos negativos del arrastre, la capacidad o la vida útil de los reactivos en los sistemas de tinción actuales es muy impredecible. Los reactivos a menudo se cambian después de una cantidad predeterminada de utilización en base a la experiencia pasada o se cambian una vez que comienzan a mostrar signos de fallo o llegan al punto de fallo. Por lo tanto, las soluciones en los sistemas actuales a menudo se cambian a diferentes velocidades, es decir, en diferentes momentos. Esto agrega complejidad e ineficiencia ya que la tinción se detiene continuamente para cambiar solo una o menos de todas las soluciones. Por otro lado, si se cambian todas las soluciones a la vez, algunas de ellas se descartan mientras todavía tienen capacidad útil para procesar más portaobjetos y, por lo tanto, se desperdicia dinero.
Los intentos típicos de abordar las consecuencias negativas del arrastre han implicado reemplazar los reactivos de tinción con soluciones nuevas, ya sea de forma regular y frecuente o incluso para cada una de las muestras. Por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. n° 7.468.161 y n° 8.048.373. Además, ha habido mejoras en la química de cada uno de los reactivos (hematoxilina, eosina, diferenciador y tampón azulante) que pueden retrasar algunos de los efectos del arrastre. El documento WO 2009/148885 A2 trata de resolver el problema técnico de la tinción en gradiente cuando se cambia sustancialmente el pH de la muestra utilizando solo agua desionizada para el lavado. Con este fin, se sugieren varios reactivos de lavado tamponados, p. ej. tampón de cloroacetato 100 mM a un pH de aproximadamente 3,0 y reactivos de lavado o composiciones, que están en o aproximadamente el pH de la propia tinción de hematoxilina, p. ej. de aproximadamente 1 a aproximadamente 6, más generalmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, más generalmente de aproximadamente 2,1 a aproximadamente 2,8, e incluso más generalmente de aproximadamente 2,2 a aproximadamente 2,7. Además, se sugiere que dichas composiciones se pueden tamponar a un pH que sea igual o aproximadamente al pH de la tinción con hematoxilina. Sin embargo, las composiciones de lavado (tamponadas) no contienen un alcohol polihidroxílico.
El documento WO 2008/112993 A1 describe una composición de hematoxilina estabilizada que incluye un disolvente, p. ej. seleccionado del grupo que consiste en agua, un alcanol inferior y un poliol, hematoxilina, una cantidad de un oxidante químico suficiente para convertir al menos una parte de la hematoxilina en hemateína, un mordiente y uno o ambos de un compuesto hospedador y un antioxidante.
E. T. Graham, Biotechnic & Histochemistry, vol. 66, 1991, 279-281 propone dos soluciones madre que se mantienen por separado para preparar una solución de tinción de hematoxilina de aluminio de mezcla rápida.
G. Clark, Stain Technology, vol. 50, 1975, 115-118 informa sobre los efectos de los aditivos (alcohol etílico, glicerina, hidrato de cloral, etileno y propilenglicol, y ácidos cítrico, malónico y maleico) sobre soluciones de tinción de hematoxilina de aluminio. Los aditivos en diversos grados limitan la conversión de hemateína en compuestos insolubles.
En al menos un caso, se ha intentado eliminar los efectos del arrastre debido al diseño mecánico del instrumento (Dako CoverStainer).
Sin embargo, la imprevisibilidad y la pérdida de la eficacia de la tinción debida al arrastre sigue siendo un problema importante sin resolver.
Compendio de la invención
Algunas realizaciones de la presente invención proporcionan soluciones de una composición definida útiles en un protocolo de tinción cuando se utilizan en algunos puntos del protocolo de tinción. Las formulaciones de estas soluciones son tales que el arrastre de las soluciones no impactará negativamente, o preferiblemente, estabilizará o modificará favorablemente las soluciones de reactivo de tinción que entren en contacto con las soluciones definidas en la presente memoria. En determinadas realizaciones de la invención, las soluciones se tamponan para mantener un pH específico que cuando se transfiere, p-ejemplo a la hematoxilina, no influirá significativamente en el pH del siguiente reactivo de tinción.
Algunas realizaciones de la invención se refieren a métodos para reducir el impacto indeseable del arrastre de la solución en un sistema de tinción con H y E. En determinadas realizaciones, se utilizan soluciones definidas en varias etapas del protocolo de tinción, como antes de determinados etapas del reactivo de tinción, para reducir el impacto indeseable del arrastre.
En particular, determinadas realizaciones de la invención se llevan a una solución tamponada de pH que comprende un ácido orgánico y un alcohol polihidroxílico. En determinadas realizaciones, la solución tamponada de pH tiene un intervalo de amortiguación de pH que comprende desde aproximadamente pH 2,0 hasta aproximadamente pH 5,0. En determinadas realizaciones, la solución tamponada de pH tiene un intervalo de amortiguación de pH de aproximadamente pH 1,0 a aproximadamente pH 7,0, o de aproximadamente pH 1,0 a aproximadamente pH 6,0, o de aproximadamente pH 1,0 a aproximadamente pH 5,0., O de aproximadamente pH 2,0 a aproximadamente pH 7,0, o de aproximadamente pH 2,0 a aproximadamente pH 6,0. Preferiblemente, dicha solución tamponada de pH tiene un intervalo de amortiguación de pH de aproximadamente pH 2,0 a aproximadamente pH 5,0.
La solución tamponada de pH puede comprender de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% (v/v) de un alcohol polihidroxílico seleccionado del grupo que consiste en etilenglicol, propilenglicol, glicerina y polietilenglicol y puede comprender de 10 mM a aproximadamente 100 mM de un ácido orgánico seleccionado del grupo que consiste en ácido málico, ácido cítrico, ácido maleico, ácido acético y ácido tartárico. En determinadas realizaciones, la solución tamponada de pH también puede comprender un agente antimicrobiano que sea eficaz en al menos un intervalo de pH de aproximadamente pH 2,0 a aproximadamente pH 5,0.
Algunas realizaciones de la invención se llevan a una solución con un pH de aproximadamente pH 2,0 a aproximadamente pH 5,0 que comprende sales de aluminio y de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% (v/v) de un alcohol polihidroxílico seleccionado del grupo que consiste en etilenglicol, propilenglicol, glicerina y polietilenglicol.
Algunas realizaciones de la invención también se refieren a un método de tinción de una muestra de tejido con hematoxilina, el método comprende las etapas de (i) poner en contacto la muestra con una solución definida de la invención y (ii) transferir la muestra a una solución de tinción de hematoxilina. Además, el método puede comprender las etapas de enjuagar la muestra con agua y luego ponerla en contacto con la solución tamponada.
Algunas realizaciones de la invención se llevan a un equipo para realizar la tinción con hematoxilina y eosina, equipo que comprende una solución definida de la invención y al menos un reactivo de tinción con hematoxilina y eosina seleccionado del grupo que consiste en una solución de hematoxilina, una solución de eosina, una solución diferenciadora y solución de agente azulante.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. La figura 1 muestra las etapas de un protocolo típico de tinción con hematoxilina y eosina.
Figura 2. La figura 2 muestra los cambios en el pH de una solución de hematoxilina durante la tinción sucesiva de 2.500 portaobjetos con muestras. La tinción de múltiples extensiones produce un aumento del pH de la solución de hematoxilina (línea continua). La colocación de una solución tamponada de composición definida antes de la hematoxilina evita un aumento del pH de la hematoxilina (línea discontinua).
Figura 3. La figura 3 muestra los cambios en la calidad de la tinción con hematoxilina de las muestras tras la tinción sucesiva de 2.500 extensiones. El aumento de la tinción de fondo citoplasmático y la pérdida de detalles están presentes en la extensión 2.500a en comparación con la primera extensión.
Figura 4. La figura 4 muestra una tinción de hematoxilina constante observada en la primera y la 2.500a muestras teñidas sucesivamente. Las extensiones se tiñeron con un protocolo usando una solución tamponada de composición definida de la invención entre el enjuague con agua corriente y la solución de hematoxilina.
Descripción detallada
En la presente memoria los títulos se proporcionan únicamente para facilitar la lectura y no deben interpretarse como restrictivos.
I. Definiciones
Las siguientes definiciones se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica en la puesta en práctica de la invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica correspondiente.
Cuando se proporciona un término en singular, los inventores también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de ese término a menos que se indique lo contrario.
Como se emplea en la presente memoria, un "reactivo de tinción" se refiere a cualquier reactivo utilizado en un protocolo de tinción histológica. Cuando es necesario comprender la invención refiriéndose específicamente a "un reactivo que es un tinte" en comparación con "un reactivo en el proceso de tinción que no es un tinte", se hace explícitamente tal distinción.
Como se emplea en la presente memoria, una solución de "concentración de trabajo" o "lista para usar" es una solución en la que los componentes de la solución están en la concentración deseada para su uso en los métodos de la presente invención. "Lista para usar" también puede implicar que la solución no requiere ninguna manipulación adicional por parte del usuario final, como filtración, desnatado y/o mezcla.
Como se emplea en la presente memoria, los "sustitutos del xileno" que se usan extensamente incluyen dos clases: terpenos y disolventes alifáticos. Los ejemplos representativos de terpenos incluyen limoneno y trementina.
Por lo general, el agua corriente es la más económica para usar como etapa de enjuague en los protocolos de tinción con H y E de alta capacidad. Por tanto, como se emplea en la presente memoria, el término "agua" se refiere al agua corriente, pero también abarca el agua destilada o desionizada o soluciones acuosas utilizadas para tratar o enjuagar muestras en un sistema de tinción con H y E.
II. Resumen
Se ha descubierto que el impacto indeseable del arrastre de la solución en los protocolos de tinción con H y E puede mejorarse mediante el empleo de determinadas soluciones definidas entre algunas etapas del protocolo. Se cree que la adopción de estas soluciones y métodos aumentará la capacidad para teñir muestras (como las montadas en portaobjetos o portaobjetos en estantes, etc.), lo que puede traducirse en ahorros de costes para el usuario final. Otros beneficios esperados incluyen una mejor experiencia del usuario debido a una mayor facilidad de uso, más previsibilidad en el rendimiento de los reactivos y menor esfuerzo y mano de obra. Además, se cree que las soluciones y métodos descritos en la presente memoria ahorrarán tiempo y aumentarán la eficiencia, ya que se reducirá el tiempo de inactividad necesario para cambiar los reactivos. También se mejorará la consistencia (calidad) de los resultados a medida que se minimice la variabilidad introducida por el arrastre y la dilución de los reactivos y también se mejorará la previsibilidad del rendimiento de los reactivos.
III. Tinción con hematoxilina y eosina ("H y E")
La tinción con H y E es un método de tinción extensamente utilizado con fines histológicos. Un experto en la técnica reconocerá que se han desarrollado muchas variaciones y protocolos para la tinción con H y E y, cuando la presente invención es aplicable, la presente invención no se limita a ninguna variación, protocolo, sistema o similar específico. Un sistema de tinción con H y E típico se puede definir como compuesto por cuatro reactivos de tinción de núcleo: hematoxilina, diferenciador, reactivo azulante y eosina, así como los enjuagues y disolventes necesarios utilizados para el desparafinado, la rehidratación, la deshidratación y el aclarado.
Un protocolo de tinción típico y representativo con H y E comprende las etapas de (i) desparafinado (usando xilenos o sustitutos del xileno), (ii) rehidratación (usando alcoholes), (iii) enjuague con agua, (iv) hematoxilina, (v) enjuague con agua, (vi) diferenciador, (vii) enjuague con agua, (viii) azulado (ix) enjuague con agua, (x) alcohol, (xi) eosina, (xii) deshidratación (usando alcoholes) y (xiii) aclarado (usando xilenos) o sustitutos del xileno) (Sheenan, D.C. y Hrapchak, B.B.: Theory and Practice o f Histotechnology 2a ed. Columbus, OH, Battelle Press, 1980) (Figura 1). En algunas realizaciones de la invención, un etapa del uso de una solución definida precede inmediatamente a una etapa en el protocolo de tinción con H y E. La composición de la solución viene impuesta por el reactivo de tinción cuya solución
está diseñada para proteger del arrastre. En algunas realizaciones preferidas, una etapa del uso de una solución definida de la invención precede inmediatamente a una etapa de reactivo de tinción del núcleo.
En determinadas realizaciones de la invención, una etapa del uso de una solución definida precede inmediatamente a la etapa de la hematoxilina. En determinadas realizaciones de la invención, un etapa del uso de una solución definida precede inmediatamente al etapa del diferenciador. En determinadas realizaciones de la invención, una etapa del uso de una solución definida precede inmediatamente a la etapa del reactivo azulante. En determinadas realizaciones de la invención, una etapa del uso de una solución definida precede inmediatamente a la etapa de la eosina.
En determinadas realizaciones de la invención, se coloca una solución con una composición definida entre una etapa de enjuague con agua y la solución de hematoxilina. En determinadas realizaciones, el agua de aclarado es agua corriente. En esta posición, la solución definida mitiga varios efectos adversos del agua sobre la solución de hematoxilina. Al reducir el volumen real de agua correspondiente a la etapa de enjuague a la hematoxilina, se reduce el volumen de componentes (por ejemplo, iones, cloro, etc.) en el agua (y especialmente tal como se encuentran en el agua corriente) que pueden afectar la calidad de la tinción o la capacidad de tinción de la hematoxilina. La adición de un tampón a la solución reduce la capacidad del agua para aumentar el pH de la hematoxilina (figura 2). Esto tiene ventajas porque un aumento en el pH de la hematoxilina da como resultado una tinción de fondo de los tejidos y una pérdida del detalle de la tinción (figuras 3 y 4).
Además de mitigar los efectos adversos del arrastre, la solución definida puede formularse para mejorar la estabilidad de una hematoxilina expuesta al arrastre de la solución. La adición de un alcohol polihidroxílico a la solución que se trasladará a la hematoxilina puede reducir la probabilidad de precipitación de la hematoxilina y puede proporcionar valor al usuario ya que no será necesaria la filtración de la hematoxilina.
Se entiende que una etapa de "uso" de una solución significa exponer una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido montada en un portaobjetos, a una solución. Una muestra puede exponerse a una solución, por ejemplo, mojándola o sumergiéndola en la solución. Una muestra puede exponerse a una solución, por ejemplo, haciendo pasar la solución sobre la muestra, como al pasar una solución sobre un portaobjetos que contiene una muestra. Una muestra puede exponerse a una solución, por ejemplo, al dejar caer o rociar la solución sobre una muestra. Un experto en la técnica reconocerá que puede haber varios métodos alternativos para exponer una muestra a una solución durante el proceso de tinción, y que el método y las soluciones de la presente invención no se limitan a ningún método concreto de exponer una muestra a una solución.
IV. Soluciones definidas para mitigar los efectos del arrastre
Un aspecto de la presente invención proporciona soluciones de composición definida para mitigar los efectos del arrastre de agua o del reactivo de tinción en un protocolo de tinción histológica.
En determinadas realizaciones, la solución definida es una solución tamponada que comprende un ácido, siendo la solución tamponada capaz de tamponar entre aproximadamente pH 2,0 y aproximadamente pH 5,0. En determinadas realizaciones, el ácido tiene un pKa de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 5,0. En determinadas realizaciones, la concentración del ácido en la solución es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM. En determinadas realizaciones, la concentración del ácido en la solución es de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM. En determinadas realizaciones, la concentración del ácido en la solución es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM o de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM. En determinadas realizaciones, el ácido es un ácido orgánico. Los ejemplos representativos de ácidos orgánicos útiles incluyen, pero no se limitan a, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido maleico y ácido acético. En determinadas realizaciones, la solución tamponada comprende un alcohol polihidroxílico a una concentración de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% (v/v). Los ejemplos representativos de alcoholes polihidroxílicos incluyen, entre otros a, etilenglicol, polietilenglicol, propilenglicol y glicerina. En determinadas realizaciones, la solución comprende tanto un ácido como un alcohol polihidroxílico en las cantidades y como se definen en la presente memoria. En una determinada realización específica, la solución tamponada es una solución que comprende ácido tartárico 20 mM y etilenglicol al 15% (v/v) y el pH de la solución se ajusta a un pH de 3,3. Un experto en la técnica comprenderá que existen numerosos reactivos que se pueden usar para ajustar el pH. Por ejemplo, hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (KOH) u otros compuestos a base de hidróxido y ácido tartárico y su base conjugada. En una realización, el pH se ajusta con hidróxido de sodio (NaOH).
En determinadas realizaciones, la solución definida es una solución no tamponada con un pH de aproximadamente pH 2,0 a aproximadamente pH 5,0 que comprende sales de aluminio. Los ejemplos representativos de sales de aluminio incluyen, entre otras a, sulfato de aluminio y amonio [AlNH4((SO4)2], sulfato de aluminio [Al2(SO4)3], y sulfato de aluminio y potasio AlK(SO4)2. En determinadas realizaciones, la solución de sal de aluminio no tamponada también comprende un alcohol polihidroxílico como se describe en la presente memoria a una concentración de aproximadamente 15% a aproximadamente 30% (v/v).
En determinadas realizaciones, la solución definida es una formulación ligeramente modificada o no modificada del reactivo de tinción utilizado como diferenciador. En determinadas realizaciones, la formulación ligeramente modificada o no modificada del reactivo de tinción utilizado como diferenciador es una solución tamponada con cualquier ácido,
donde el ácido tiene un pKa de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0 y es capaz de tamponar entre un pH desde aproximadamente pH 1,5 hasta aproximadamente pH 5,0. En determinadas realizaciones, el ácido es un ácido orgánico. Los ejemplos representativos de ácidos orgánicos útiles incluyen, entre otros a, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido acético y ácido tartárico.
En realizaciones que abarcan cualquiera de las soluciones de la invención, o soluciones útiles en la puesta en práctica de los métodos de la invención, se puede añadir un agente antimicrobiano para inhibir el crecimiento microbiano. En determinadas realizaciones, el agente antimicrobiano es el que es eficaz en al menos un intervalo de pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente pH 5,0. Los ejemplos representativos de agentes microbianos incluyen azida de sodio, PROCLIN 300®, PROCLIN 150®, PROCLIN 200® y PROCLIN 950®. Por ejemplo, en una realización, la solución contiene de aproximadamente 0,03% a aproximadamente 0,04% (v/v) de PROCLIN 300® (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) para inhibir el crecimiento microbiano. Debe entenderse que el producto de ejemplo o los nombres comerciales conocidos por los expertos en la técnica se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no suponen limitar el género más amplio de reactivos descritos.
Se contempla que las soluciones definidas, tales como las soluciones tamponadas, de la invención se proporcionarán como una concentración de trabajo o una solución lista para usar para los protocolos de tinción con H y E. Sin embargo, también se contempla que se pueden preparar soluciones concentradas de dos o más componentes en las que un usuario puede agregar agua y/u otros componentes (como un antimicrobiano) a la solución definida para preparar una concentración de trabajo o una solución lista para usar con las formulaciones descritas en la presente memoria. Por tanto, la presente invención también se formula para soluciones concentradas que se pueden usar para preparar las soluciones definidas de la invención. Dadas las cantidades de componentes en las soluciones definidas proporcionadas, está dentro de la habilidad de un experto en la técnica determinar cuáles deben ser las cantidades de componentes en una solución concentrada para proporcionar una concentración de trabajo o una solución lista para usar. Por ejemplo, si el concentrado se va a diluir 1:1 con agua, entonces la concentración de un ácido, alcohol polihidroxílico, etc., sería el doble de la concentración final deseada.
V. Métodos para mitigar los efectos del arrastre
Un aspecto de la presente invención proporciona métodos para mitigar los efectos del arrastre de agua o del reactivo de tinción en un protocolo de tinción histológica. En general, dichos métodos utilizan una solución definida como un etapa en el proceso de tinción entre dos etapas de reactivo de tinción o entre un etapa de enjuague con agua y un etapa de reactivo de tinción.
En los protocolos de tinción en los que las muestras se ponen en contacto con los reactivos de tinción sumergiendo las muestras en los reactivos de tinción, las muestras también se pueden sumergir en la solución definida. En los protocolos de tinción en los que las muestras se ponen en contacto con los reactivos de tinción de una manera distinta a la inmersión, las muestras pueden ponerse en contacto con la solución definida de la misma manera. Sin embargo, se entiende que la forma en que las muestras se ponen en contacto con los reactivos de tinción no limita la forma en que la muestra puede ponerse en contacto con la solución definida dentro del mismo protocolo de tinción.
En un sistema de tinción con H y E, los efectos perjudiciales del arrastre son mayores en las soluciones de hematoxilina y diferenciador, pero pueden afectar a todas los tintes/reactivos en un sistema de tinción. La hematoxilina y el diferenciador siguen a los enjuagues con agua en un programa de tinción típico con H y E. El rendimiento de estas dos soluciones depende en gran medida del pH y la introducción de agua en estas soluciones da como resultado un aumento del pH. Un efecto del aumento del pH en estas soluciones es un aumento en la tinción de fondo de la hematoxilina. En determinadas realizaciones, una muestra se pone en contacto con una solución definida inmediatamente antes de entrar en contacto con una solución de tinción de hematoxilina. En determinadas realizaciones, la muestra se pone en contacto con una solución definida inmediatamente después de enjuagarla con agua e inmediatamente antes de entrar en contacto con una solución de tinción de hematoxilina. En determinadas realizaciones, el pH de la solución de hematoxilina aumentará menos de 0,30 unidades de pH cuando se exponga a una solución tamponada arrastrada desde la inmersión previa de la muestra en la solución tamponada. En determinadas realizaciones, el pH de la solución de hematoxilina aumentará menos de 0,20 unidades de pH cuando se exponga a una solución tamponada arrastrada desde la inmersión previa de la muestra en la solución tamponada. Se entiende que el pH de la solución de hematoxilina no solo aumentará menos de 0,30 unidades de pH, o menos de 0,2 unidades de pH, cuando se exponga a una solución tamponada arrastrada desde la inmersión previa de la muestra en la solución tamponada al realizar las etapas. del método una vez, pero que una ventaja concreta de las invenciones es que el pH de la solución de hematoxilina no aumentará después de exposiciones repetidas al arrastre de la solución tamponada.
En determinadas realizaciones, una muestra se pone en contacto con una solución definida inmediatamente antes de entrar en contacto con una solución diferenciadora. En determinadas realizaciones, la muestra se pone en contacto con una solución definida inmediatamente después de enjuagarla con agua e inmediatamente antes de entrar en contacto con una solución diferenciadora.
El uso de los métodos descritos puede permitir que se procesen hasta 2.000 portaobjetos de muestras normales con los procedimientos de tinción normal con H y E antes de sustituir los nuevos reactivos. En determinadas realizaciones,
el empleo de los métodos puede permitir procesar hasta 2.700 portaobjetos antes de que se sustituyan los nuevos reactivos. Además, en determinadas realizaciones, el uso de los métodos puede permitir procesar hasta 3.000 portaobjetos antes de que se sustituyan los nuevos reactivos. Los expertos en la técnica entienden que la capacidad de procesar un determinado número de portaobjetos de muestras se refiere a la capacidad de procesar dicho número sin observar un efecto adverso en la tinción que sería inaceptable para el propósito para el que se están tiñendo las extensiones. Se contempla además que el uso de los reactivos y métodos de la invención usados en combinación con métodos mecánicos que reducen, pero no eliminan completamente el arrastre, también mejorará significativamente el número de extensiones que se pueden teñir usando un conjunto dado de reactivos.
Los métodos de la invención también pueden incluir la etapa de diluir una solución concentrada, tal como diluir con agua, hasta una concentración de trabajo final o una solución definida lista para usar. Los métodos de la invención también pueden incluir la etapa de añadir un componente, como un agente antimicrobiano, para preparar una solución definida lista para usar. Este etapa se realizaría antes de utilizar la solución definida en un protocolo de tinción con H y E.
VI. Equipos y métodos de uso
Un aspecto de la presente invención se refiere a los equipos para realizar la tinción con H y E. Dichos equipos comprenden al menos una solución definida que mitiga los efectos del arrastre de la solución. Las soluciones definidas útiles se describen en detalle en esta solicitud e incluyen soluciones tamponadas y no tamponadas. Los equipos representativos de la invención también pueden comprender uno o más reactivos de tinción u otros componentes usados para la tinción con H y E. Los ejemplos de reactivos de tinción utilizados para la tinción con H y E incluyen solución de hematoxilina, solución de eosina, una solución diferenciadora y una solución de agente azulante. Ejemplos de otros componentes usados para la tinción con H y E incluyen xilenos, sustitutos de xileno y alcoholes. En determinadas realizaciones, el equipo comprende al menos los cinco reactivos siguientes: (1) solución de hematoxilina, (2) solución de eosina, (3) una solución diferenciadora, (4) una solución de agente azulante y (5) una solución definida que mitiga los efectos de arrastre de la solución.
Otro aspecto de la invención se refiere a los métodos de uso de un equipo para realizar la tinción con H y E. El procedimiento para realizar la tinción con H y E incluye el uso de una solución definida que mitiga los efectos del arrastre como se describe en detalle en esta solicitud. El uso de un equipo aporta numerosos beneficios. Los procedimientos y reactivos de tinción con H y E actuales están sujetos a los efectos negativos del arrastre de la solución, lo que a menudo requiere que las soluciones se cambien a diferentes velocidades. La inclusión de una solución definida que mitiga los efectos del arrastre de la solución en un equipo proporciona una vida útil predecible de todos los reactivos del equipo que es constante, de modo que los reactivos del equipo deben cambiarse al mismo tiempo. Por ejemplo, el uso de los reactivos del equipo puede permitir procesar hasta 2.000 extensiones de muestras normales utilizando procedimientos de tinción normal con H y E antes de que se sustituyan por nuevos reactivos. O el uso del equipo puede permitir procesar hasta 2700 extensiones antes de sustituir los nuevos reactivos. O el uso del equipo puede permitir procesar hasta 3.000 extensiones antes de que se sustituyan los nuevos reactivos.
Ejemplos
Las siguientes realizaciones descritas son simplemente representativas de la invención que puede realizarse de diversas formas. Por tanto, los detalles estructurales, funcionales y de procedimiento específicos descritos en los siguientes ejemplos no deben interpretarse como restrictivos.
Ejemplo 1.
Todas las tinciones se realizaron en el LEICA® ST-5010 AUTOSTAINER ™ o el LEICA® ST-5020 MULTISTAINER ™ utilizando un programa habitual con H y E como se describe en la figura 1 y la tabla 1. El objetivo del estudio de agotamiento fue evaluar los cambios químicos y funcionales (tinción) que ocurren durante la tinción sucesiva de numerosas extensiones. En un estudio de agotamiento típico (tabla 1), la hematoxilina, el diferenciador, el agente azulante y la eosina no se cambiaron durante todo el estudio de agotamiento, mientras que todos los demás componentes (alcoholes y xilenos) se rotaron o cambiaron a intervalos de 300 extensiones. La tinción de las muestras de tejido de referencia en extensiones de referencia de tejidos múltiples (tinción funcional) y la determinación del pH de la hematoxilina se realizaron a intervalos de 150 extensiones. Un estudio de agotamiento convencional incorporó un total de 2.700 extensiones (90 estantes de 30 extensiones).
Otras series de tinción incorporaron un reactivo tamponado adicional de lugares de composición definidos entre el enjuague con agua corriente y la etapa de hematoxilina (Tabla 2). Esta solución se diseñó para mitigar los efectos del arrastre del agua corriente en la hematoxilina. Esta solución, como la hematoxilina, el diferenciador, el agente azulante y la eosina, no se modificó durante el estudio de agotamiento. Como en el estudio descrito anteriormente, la tinción de las muestras de tejido de referencia en extensiones de referencia de múltiples tejidos (tinción funcional) y la determinación del pH de la hematoxilina se realizaron a intervalos de 150 extensiones.
La figura 2 demuestra el aumento en el pH de la hematoxilina que se produce cuando los estantes de portaobjetos con extensiones arrastran agua corriente a la hematoxilina. Por el contrario, la colocación de un reactivo tamponado de composición definida entre el agua corriente y la hematoxilina desplaza el agua corriente de las extensiones antes del movimiento hacia la solución de hematoxilina. Como resultado, el pH de la hematoxilina permanece estable.
La tabla 1 muestra un protocolo habitual con H y E realizado en un LEICA® ST-5010XL™ Automated Sreiner.
La Tabla 2 muestra un protocolo con H y E usando una solución tamponada de lugares de composición definidos entre la etapa de enjuague con agua corriente y la etapa de hematoxilina (Etapa 10 en la tabla 2) en un LEICA® ST-5010XL™ Automated Steiner.
La Tabla 3 muestra un ejemplo representativo de una solución tamponada de composición definida de la invención, tal como para usar inmediatamente antes de poner en contacto una extensión de una muestra con una solución de hematoxilina. El pH se ajusta a 3,33 con NaOH 2N.
Claims (8)
1. Un equipo para realizar la tinción con hematoxilina y eosina, equipo que comprende (i) una solución de lavado tamponada de pH y (ii) una solución de hematoxilina,
en donde dicha solución de lavado tamponada de pH comprende un ácido orgánico y un alcohol polihidroxílico, en donde el ácido orgánico es ácido tartárico, y en donde la solución de lavado tamponada de pH tiene un intervalo de amortiguación de pH de aproximadamente pH 2,0 a aproximadamente pH 5,0.
2. El equipo de la reivindicación 1 que comprende (i) la solución de lavado tamponada de pH como se define en la reivindicación 1 y (ii) una solución de hematoxilina, (iii) una solución de eosina, (iv) una solución diferenciadora y (v) una solución de agente azulante.
3. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la solución de lavado tamponada de pH comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% (v/v) de un alcohol polihidroxílico seleccionado del grupo que consiste en etilenglicol, propilenglicol, glicerina y polietilenglicol. .
4. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la solución de lavado tamponada de pH comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% (v/v) de etilenglicol.
5. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la solución de lavado tamponada de pH comprende una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM del tartárico ácido.
6. El equipo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la solución de lavado tamponada de pH se tampona de manera que el pH se mantiene entre aproximadamente un pH de 2,0 y aproximadamente un pH de 5,0 cuando se introduce agua en la solución.
7. El equipo de la reivindicación 1, en el que la solución de lavado tamponada de pH comprende ácido tartárico de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM y etilenglicol de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% (v/v).
8. El equipo de la reivindicación 1, que comprende además al menos un reactivo de tinción de hematoxilina y eosina seleccionado del grupo que consiste en una solución de eosina, una solución de diferenciación y una solución azulante.
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