BR112019021717B1

BR112019021717B1 - Formulação de hematoxilina estabilizada, método para corar uma amostra biológica e kit

Info

Publication number: BR112019021717B1
Application number: BR112019021717-7A
Authority: BR
Inventors: Edward E. Durrant; Christopher A. Koerber
Original assignee: Ventana Medical Systems, Inc
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2024-03-26

Abstract

A presente invenção fornece formulações estabilizadas de hematoxilina com um pH inferior a 2,4. A presente invenção também fornece métodos de uso de tais formulações estabilizadas de hematoxilina para corar amostras biológicas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A DEPÓSITOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido de patente reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório US No. 62/504.066 depositado em 10 de maio de 2017, cuja invenção é aqui incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As composições compreendendo hematoxilina e hemateina são comumente usadas em patologia (exame microscópico de espécimes citológicos fixos, isto é, células individuais em um esfregaço ou bloco de células) e histologia (exame microscópico de agregados celulares que formam uma estrutura com uma função específica). Por exemplo, hematoxilina e hemateina são frequentemente usadas para corar os núcleos celulares antes do exame microscópico.

[003] A coloração torna as células, normalmente transparentes, coloridas, o que facilita a análise. A coloração de hematoxilina pode ser realizada manualmente usando uma técnica de imersão (imersão e submersão) ou usando sistemas automatizados, como o sistema automatizado Symphony® fornecido pela Ventana Medical Systems, Inc. Os processos de coloração geralmente envolvem: (a) remoção de parafina de uma amostra fixada em uma lâmina de microscópio e hidratando a amostra por imersão em água; (b) aplicar hematoxilina para corar os núcleos celulares; (c) remover o excesso de hematoxilina enxaguando com água; (d) colocar em contato a lâmina com uma solução concentrada com pH acima de 5,0 para tornar a hematoxilina azul (por exemplo, uma solução azulada); e (e) remover a solução azulada enxaguando com água.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[004] Em um aspecto da presente invenção é uma formulação de hematoxilina estabilizada com um pH inferior a 2,4. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,3. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,2. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 2,1 e cerca de 2,2. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada permanece livre de precipitados por um período de pelo menos trinta dias. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada permanece livre de precipitados por um período de pelo menos sessenta dias. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada pode ser tratada com uma solução de reajuste para fornecer uma solução de hematoxilina adequada para corar uma amostra de tecido.

[005] Em outro aspecto da presente invenção é uma formulação de hematoxilina estabilizada compreendendo um solvente, corante de hematoxilina e um ácido (por exemplo, um ácido forte), em que o ácido está presente na formulação de hematoxilina estabilizada em uma quantidade que varia entre cerca de 0,05% a cerca de 10% em volume total da formulação de hematoxilina estabilizada, e em que a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,4. Em algumas formas de realização, o pH da formulação de hematoxilina estabilizada é menor que 2,3. Em algumas formas de realização, o pH da formulação de hematoxilina estabilizada é menor que 2,2. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 2,1 e cerca de 2,2. Em algumas formas de realização, o ácido é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido perclórico e ácido nítrico.

[006] Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada compreende ainda um mordente e um oxidante. Em algumas formas de realização, o oxidante é iodato de sódio; e o mordente compreende alumínio. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada compreende ainda um agente prolongador de vida útil. Em algumas formas de realização, o agente prolongador de vida útil é um poliol. Em algumas formas de realização, a formulação consiste essencialmente em corante de hematoxilina, um mordente, um oxidante e o ácido. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada permanece livre de precipitados por um período de pelo menos trinta dias. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada permanece livre de precipitados por um período de pelo menos sessenta dias.

[007] Em outro aspecto da presente invenção, é um método para formar uma formulação de hematoxilina estabilizada, compreendendo reduzir o pH de uma composição inicial de coloração de hematoxilina (por exemplo, uma incluindo corante de hematoxilina e opcionalmente um mordente) para um pH menor que 2,4, em que o pH é reduzido adicionando um ácido à composição de coloração de hematoxilina. Em algumas formas de realização, o pH é reduzido pela introdução de ácido clorídrico a 1M na solução de coloração de hematoxilina. Em algumas formas de realização, o pH é reduzido usando ácido sulfúrico a 0,5M. Em algumas formas de realização, o pH da formulação de hematoxilina estabilizada varia de entre 2,1 e cerca de 2,3. Em algumas formas de realização, o pH da formulação de hematoxilina estabilizada varia de entre 2,1 e cerca de 2,25.

[008] Em outro aspecto da presente invenção é um método de reajustar o pH de uma formulação de hematoxilina estabilizada (tal como uma formulação de hematoxilina estabilizada com um pH menor que 2,4) para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina, em que o pH é reajustado adicionando um de uma base forte ou um tampão à formulação de hematoxilina estabilizada até o pH aumentar para pelo menos 2,4. Em algumas formas de realização, uma base forte pré-formulada ou um tampão pré-formulado é titulado na formulação de hematoxilina estabilizada até que um pH predeterminado seja alcançado. Em algumas formas de realização, o pH predeterminado é aquele que é adequado para corar uma amostra biológica (por exemplo, um pH maior que 2,4; um pH entre 2,4 e 2,7; um pH entre 2,4 e 2,6, etc.). Em algumas formas de realização, o pH predeterminado varia entre cerca de 2,4 e cerca de 2,6. Em algumas formas de realização, o pH predeterminado varia entre cerca de 2,45 e cerca de 2,6. Em algumas formas de realização, o pH predeterminado varia entre cerca de 2,5 e cerca de 2,6. Em algumas formas de realização, o pH predeterminado varia entre cerca de 2,55 e cerca de 2,6. Em algumas formas de realização, o método de reajuste compreende ainda adicionar mordente ou oxidante adicional à solução de coloração de hematoxilina resultante.

[009] Em outro aspecto da presente invenção é um método para corar uma amostra biológica compreendendo: (i) aumentar o pH de uma formulação de hematoxilina estabilizada para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina com um pH adequado para coloração; e (ii) aplicação da solução de coloração de hematoxilina a uma amostra biológica. Em algumas formas de realização, o pH adequado para coloração varia de 2,4 a cerca de 2,6. Em algumas formas de realização, o pH adequado para coloração varia de 2,5 a cerca de 2,6. Em algumas formas de realização, o pH da formulação de hematoxilina estabilizada é aumentado titulando na formulação uma quantidade predeterminada de uma base forte. Em algumas formas de realização, o pH da formulação de hematoxilina estabilizada é aumentado titulando na formulação uma quantidade predeterminada de um tampão.

[0010] Em outro aspecto da presente invenção é um kit compreendendo o primeiro e o segundo componentes, o primeiro componente compreendendo uma formulação de hematoxilina estabilizada com um pH inferior a 2,4; e o segundo componente compreendendo uma solução de reajuste. Em algumas formas de realização, a solução de reajuste é comparativamente básica em relação à formulação de hematoxilina estabilizada. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda instruções para misturar o primeiro e o segundo componentes para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina com um pH maior que 2,4. Em algumas formas de realização, as instruções descrevem uma quantidade específica do segundo componente a ser adicionada ao primeiro componente para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina com um pH predeterminado. Em algumas formas de realização, o primeiro e o segundo componentes são alojados em um recipiente separado. Em algumas formas de realização, o primeiro e o segundo componentes são fornecidos em distribuidores de fluido separados, cada distribuidor de fluido adequado para uso em um aparelho de coloração automatizado, tal como aqui divulgado.

[0011] Em outro aspecto da presente invenção é um kit compreendendo um primeiro componente e um segundo componente, o primeiro componente compreendendo uma formulação de hematoxilina estabilizada compreendendo um corante de hematoxilina e um ácido em uma quantidade que varia de cerca de 0,2% a cerca de 4% em volume total da formulação de hematoxilina estabilizada, e em que a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,4; e o segundo componente compreendendo uma base forte ou um tampão, o segundo componente fornecido em uma quantidade relativa ao primeiro componente, de modo que quando o primeiro e o segundo componentes são misturados, o pH da solução de coloração por hematoxilina resultante aumenta para maior que 2,4. Em algumas formas de realização, uma quantidade de segundo componente é fornecida de modo que o pH aumente para pelo menos 2,5.

[0012] Em outro aspecto da presente invenção é um sistema para corar uma amostra biológica (tal como uma montada em um substrato, por exemplo, uma lâmina de microscópio) compreendendo: um primeiro recipiente compreendendo uma formulação de hematoxilina estabilizada compreendendo corante de hematoxilina e um ácido em uma quantidade que varia desde cerca de 0,1% a cerca de 6% em volume total da formulação de hematoxilina estabilizada, e em que a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,4; um segundo recipiente compreendendo uma solução de reajuste, o primeiro e o segundo recipientes conectados fluidamente (tal como através de um receptáculo de mistura), de modo que a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste possam ser combinadas para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina com um pH maior que 2,4. Em algumas formas de realização, o pH da solução de coloração por hematoxilina resultante é maior que 2,45. Em algumas formas de realização, o pH da solução de coloração por hematoxilina resultante é maior que 2,5.

[0013] Os procedimentos padrão de coloração de hemateina utilizam um material pré-misturado contendo a hematoxilina-hemateina e um mordente. Os precipitados geralmente se formam nessas soluções estoque pré- misturadas. Isso geralmente não é um problema para procedimentos de coloração manual, onde as lâminas são tratadas com a solução de coloração de hematoxilina em um recipiente, como um recipiente de vidro. No entanto, os precipitados podem ser um problema para sistemas de coloração automatizados, nos quais o precipitado pode sujar ou entupir as linhas de distribuição e dificultar a limpeza ou purga das linhas de distribuição. Essas alterações na hematoxilina e nos precipitados nas soluções de coloração podem resultar em inconsistências na coloração. Por exemplo, os estoques de coloração de hematoxilina contendo mordente costumam amadurecer por um longo período de tempo, permitindo o desenvolvimento de complexos de hemateina-mordente. Embora este processo possa permitir bons resultados de coloração, também resulta na formação do precipitado indesejável.

[0014] O acúmulo de precipitados de hemateina em superfícies de tubos, válvulas, coletores de distribuição, etc. pode ter impactos que variam de precipitados em lâmina a interferência ou oclusão da distribuição de hematoxilina. A precipitação também é exacerbada pelo contato com o metal. Isso é especialmente problemático para sistemas automatizados que contêm peças metálicas como bicos e cabeças de pulverização com aberturas de diâmetro muito pequeno que podem ser entupidas por precipitados. No caso de precipitado na lâmina, o impacto pode ser tão baixo quanto um incômodo para o patologista que está lendo a lâmina, até o impacto da utilidade diagnóstica. O acúmulo substancial de precipitado no módulo de coloração pode exigir a substituição de peças ou, na pior das hipóteses, a substituição de um módulo inteiro de coloração para corrigir esse problema. O técnico no assunto também apreciará que qualquer precipitado de hematoxilina pode afetar a utilidade diagnóstica da coloração.

[0015] As Depositantes desenvolveram uma composição de duas partes de coloração de hematoxilina que permite o armazenamento a longo prazo da formulação de hematoxilina estabilizada sem formação substancial de precipitado. De fato, os Depositantes demonstraram que, ao formular inicialmente a solução de coloração de hematoxilina a um pH baixo (por exemplo, um pH menor que cerca de 2,4), é possível fornecer uma formulação estável de hematoxilina que não precipite rapidamente. As Depositantes surpreendente descobriram que a este pH baixo, a solução pode ser armazenada e permanecer estável por semanas ou mesmo meses. As Depositantes apresentam, ainda, que as formulações estabilizadas de hematoxilina propostas são capazes de ser facilmente utilizadas em qualquer aplicação de diagnóstico sem transformações químicas complicadas. Na verdade, no momento em que a solução é para ser utilizada para corar o tecido, as formulações estabilizadas de hematoxilina descritas aqui podem ser misturadas com uma solução de reajuste pré-formulada que restaura o pH da formulação de hematoxilina estabilizada a um nível que é adequado para a coloração (por exemplo, um pH variando entre cerca de 2,45 e cerca de 2,6). Estes e outros resultados inesperadamente superiores serão descritos mais adiante neste documento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0016] A Figura 1 ilustra quatro tubos compreendendo formulações estabilizadas de hematoxilina com pHs de 2,16, 2,26, 2,37 e 2,48 (pH reduzido usando ácido clorídrico). Aos sete dias de incubação a 60 °C, os tubos tendo um pH de 2.16 e 2.26 mostraram a menor quantidade de precipitado.

[0017] A Figura 2 ilustra quatro tubos compreendendo formulações estabilizadas de hematoxilina com pHs de 2,16, 2,26, 2,37 e 2,48 (pH reduzido usando ácido clorídrico). Aos trinta dias de incubação a 45 °C, os tubos com um pH de 2,16 e 2,26 mostraram a menor quantidade de precipitado.

[0018] A Figura 3 ilustra cinco tubos compreendendo formulações estabilizadas de hematoxilina com pHs de 2,16, 2,25, 2,33, 2,43 e 2,53 (pH reduzido usando ácido sulfúrico). Aos sete dias de incubação a 60 °C, os tubos tendo um pH de 2,16 e 2,25 mostraram a menor quantidade de precipitado.

[0019] A Figura 4 ilustra cinco tubos compreendendo formulações estabilizadas de hematoxilina com pHs de 2,16, 2,25, 2,33, 2,43 e 2,53 (pH reduzido usando ácido sulfúrico). Aos vinte e nove dias de incubação a 45 °C, os tubos com um pH de 2,16 e 2,25 mostraram a menor quantidade de precipitado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO VISÃO GLOBAL

[0020] A presente invenção fornece métodos e composições para mitigar ou impedir o acúmulo de precipitados em soluções de coloração de hematoxilina. Como um resultado dos métodos e composições aqui divulgados, recipientes de armazenamento de hematoxilina, as linhas de distribuição, bocais, dispensadores de líquidos, e outros componentes de fornecimento de reagentes de um aparelho de coloração de hematoxilina automatizado deve permanecer substancialmente livre de precipitado.

[0021] Em algumas formas de realização, a presente divulgação fornece formulações estabilizadas de hematoxilina que permanecem substancialmente livres de precipitado durante um período prolongado de tempo, por exemplo, para um período de tempo de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses ou mais. Após o armazenamento, a presente invenção fornece métodos e composições para facilitar o uso das formulações estabilizadas de hematoxilina em um aparelho de coloração automatizado. Outros aspectos da presente invenção se referem a processos para a coloração de amostras biológicas, e, em particular, a processos automatizados para a coloração da amostra biológica com uma solução de coloração de hematoxilina.

DEFINIÇÕES

[0022] Também deve ser entendido que, a menos que seja claramente indicado o contrário, em qualquer método aqui reivindicado que inclua mais de uma etapa ou ato, a ordem das etapas ou atos do método não é necessariamente limitada à ordem na qual as etapas ou atos do método são recitados.

[0023] Como usados aqui, os termos singulares “um”, “uma” e “o/ a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra “ou” deve incluir “e”, a menos que o contexto indique claramente o contrário. O termo “inclui” é definido inclusivamente, de modo que “inclua A ou B”, incluindo A, B ou A e B.

[0024] A frase “e/ ou”, conforme usada aqui no relatório descritivo e nas reivindicações, deve ser entendida como significando “um ou ambos” os elementos assim conjugados, isto é, elementos que estão conjuntamente presentes em alguns casos e disjuntivamente presentes em outros casos. Vários elementos listados com “e/ ou” devem ser interpretados da mesma maneira, ou seja, “um ou mais” dos elementos combinados. Outros elementos podem opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados pela cláusula “e/ ou”, relacionados ou não a esses elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitativo, uma referência a “A e/ ou B”, quando usada em conjunto com uma linguagem aberta como “compreendendo”, pode se referir, em uma forma de realização, apenas a A (opcionalmente incluindo elementos que não sejam B); em outra forma de realização, apenas a B (opcionalmente incluindo elementos que não sejam A); em ainda outra forma de realização, a A e B (incluindo opcionalmente outros elementos); etc.

[0025] Conforme usada aqui no relatório descritivo e nas reivindicações, a frase “pelo menos um”, em referência a uma lista de um ou mais elementos, deve ser entendida como significando pelo menos um elemento selecionado a partir de qualquer um ou mais dos elementos na lista de elementos, mas não necessariamente incluindo pelo menos um de cada elemento listado especificamente na lista de elementos e não excluindo nenhuma combinação de elementos na lista de elementos. Esta definição também permite que elementos possam opcionalmente estar presentes, além dos elementos especificamente identificados na lista de elementos a que a frase “pelo menos um” se refere, relacionada ou não a esses elementos especificamente identificados. Assim, como um exemplo não limitativo, “pelo menos um de A e B” (ou, equivalentemente, “pelo menos um de A ou B” ou, equivalentemente, “pelo menos um de A e/ ou B”) pode se referir, em uma forma de realização, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, A, sem B presente (e opcionalmente incluindo elementos que não sejam B); em outra forma de realização, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, B, sem A presente (e opcionalmente incluindo elementos além de A); em ainda outra forma de realização, a pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, A e pelo menos um, incluindo opcionalmente mais de um, B (e opcionalmente incluindo outros elementos); etc.

[0026] Os termos “compreendendo”, “incluindo”, “tendo” e similares) são usados de forma intercambiável e têm o mesmo significado. Da mesma forma, “compreende”, “inclui”, “possui” e similares são usados de forma intercambiável e têm o mesmo significado. Especificamente, cada um dos termos é definido de acordo com a definição comum da lei de patentes dos Estados Unidos de “compreendendo” e, portanto, é interpretada como um termo aberto que significa “pelo menos o seguinte” e também é interpretado como não excluindo características, limitações, aspectos, etc. Assim, por exemplo, “um dispositivo com componentes a, b e c” significa que o dispositivo inclui pelo menos os componentes a, b e c. Da mesma forma, a frase: “um método envolvendo as etapas a, b e c” significa que o método inclui pelo menos as etapas a, b e c. Além disso, embora as etapas e processos possam ser descritos aqui em uma ordem específica, o técnico no assunto reconhecerá que a ordem das etapas e processos podem variar.

[0027] Como usado aqui no relatório descritivo e nas reivindicações, “ou” deve ser entendido como tendo o mesmo significado que “e/ ou” como definido acima. Por exemplo, ao separar itens em uma lista, “ou” ou “e/ ou” devem ser interpretados como inclusivos, ou seja, a inclusão de pelo menos um, mas também incluindo mais de um, de um número ou lista de elementos, e, opcionalmente, itens não listados adicionais. Somente termos claramente indicados ao contrário, como “apenas um de” ou “exatamente um de” ou, quando usados nas reivindicações “consistindo em”, se referirão à inclusão de exatamente um elemento de um número ou lista de elementos. Em geral, o termo “ou” como aqui usado só serão interpretados como indicando alternativas exclusivas (por exemplo, “um ou o outro, mas não ambos”) quando precedido por termos de exclusividade, tais como “um ou outro”, “um de”, “apenas um de” ou “exatamente um de”. “Consistindo essencialmente em”, quando usado nas reivindicações, terá seu significado comum, conforme usado no campo do direito de patentes.

[0028] O termo “amostra biológica” refere-se a qualquer amostra que é obtida de ou de outra forma derivada de uma entidade biológica, como um animal, por exemplo, uma amostra obtida de um humano ou um animal veterinário, como um cachorro, gato, cavalo ou vaca. Exemplos de amostras biológicas incluem amostras de citologia, amostras de tecidos e fluidos biológicos. Exemplos particulares não limitativos de amostras biológicas incluem sangue, urina, pré-ejaculado, aspirados de mamilo, sêmen, leite, escarro, muco, líquido pleural, líquido pélvico, líquido sinovial, líquido de ascites, lavagens de cavidades corporais, escovação de olhos, raspagens de pele, um esfregaço bucal, um esfregaço vaginal, um esfregaço de Papanicolau, um esfregaço retal, um aspirado, uma biópsia por agulha, uma secção de tecido obtida, por exemplo, por cirurgia ou autópsia, plasma, soro, líquido espinhal, líquido linfático, suor, lágrimas, saliva, tumores, órgãos e amostras obtidas a partir de culturas de células ou tecidos in vitro. Normalmente, a amostra será uma amostra de biópsia que foi fixada, processada para remover a água e incorporada em parafina ou outra substância cerosa adequada para cortar em seções de tecido. Amostras biológicas podem ser montadas em substratos como lâminas de microscópio para tratamento e/ ou exame.

[0029] O termo “mordente” refere-se a uma espécie de metal iônico com a qual um corante (tal como hemateina) pode formar um complexo (tal como um complexo catiônico) que serve para ligar o corante (tal como hemateina) a componentes celulares específicos, como DNA nuclear, mielina, fibras elásticas e de colágeno, estrias musculares e mitocôndrias.

FORMULAÇÕES ESTABILIZADAS DE HEMATOXILINA

[0030] A presente invenção fornece formulações estabilizadas de hematoxilina. Em geral, as formulações estabilizadas de hematoxilina compreendem um solvente, um corante de hematoxilina, e um ácido. Em algumas formas de realização, as formações estabilizadas de hematoxilina compreendem pelo menos uma dentre um mordente, um oxidante, um agente que prolonga a vida útil, um antioxidante e um estabilizador. Os componentes adicionais adequados para utilização em qualquer das formulações estabilizadas de hematoxilina da presente invenção são apresentados por Avwioro et al. “Histochemical Uses of Hematoxylin - A Review”, Vol JPCS (1), Abril-Junho de 2011, e Bryan D Llewellyn, “Hematoxylin Formulae”, http://stainsfile.info, Outubro de 2013, o revelado nas mesmas são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Por exemplo, as formulações estabilizadas de hematoxilina podem incluir um agente de captura (por exemplo, iodo).

[0031] Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,4. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,375. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,35. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,325. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,3. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,275. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,25. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,225. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,2. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,175. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,15. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,125. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,1.

[0032] Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 1,5 e cerca de 2,4. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 1,5 e cerca de 2,3. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 1,6 e cerca de 2,3. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 1,8 e cerca de 2,3. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 2 e cerca de 2,3. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 2 e cerca de 2,3. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 2 e cerca de 2,2. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre cerca de 1,5 e cerca de 2,2. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH entre 1,6 e 2,2.

[0033] Qualquer ácido pode ser utilizado nas formações de hematoxilina estabilizadas. Exemplos não limitativos de ácidos adequados incluem ácido iodídrico, ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fluorídrico, ácido nitroso e ácido fórmico.

[0034] Em algumas formas de realização, o ácido é um ácido forte. Em algumas formas de realização, o ácido forte é selecionado a partir de ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido perclórico, ácido nítrico ou misturas dos mesmos. Em outras formas de realização, o ácido forte é o ácido clorídrico. Em algumas formas de realização, o ácido forte é o ácido clorídrico a 1M. Em outras formas de realização, o ácido forte é o ácido clorídrico a 0,5M. Em outras formas de realização, o ácido forte é o ácido sulfúrico a 0,5M. Em ainda outras formas de realização, o ácido forte é o ácido sulfúrico a 0,25M. Obviamente, o técnico no assunto será capaz de selecionar qualquer ácido que permita que a composição atinja um pH predeterminado.

[0035] O técnico no assunto apreciará que a quantidade de ácido na formulação pode variar dependendo, é claro, do ácido específico selecionado, da molaridade do ácido, da normalidade do ácido e/ ou da presença de outros componentes na formulação de hematoxilina estabilizada. Em algumas formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,05% a cerca de 15% em volume total da formulação. Em outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,05% a cerca de 12% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,1% a cerca de 10% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,1% a cerca de 7,5% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,1% a cerca de 6% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,1% a cerca de 5% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,1% a cerca de 4% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido, em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,2% a cerca de 4%, em volume total da formulação.

[0036] Em outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,5% a cerca de 12% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,5% a cerca de 10% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,5% a cerca de 7,5% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,5% a cerca de 6% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,5% a cerca de 5% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 0,5% a cerca de 4% em volume total da formulação. Em ainda outras formas de realização, a quantidade de ácido em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada varia de cerca de 1% a cerca de 4% em volume total da formulação.

[0037] Vários solventes podem ser utilizados dentro das formulações estabilizadas de hematoxilina. Em algumas formas de realização, o solvente inclui um ou mais de água, um alcanol inferior, tal como etanol e um poliol. Em outras formas de realização, o solvente inclui um solvente aquoso em que o solvente aquoso compreende água e um poliol. Exemplos adequados de polióis úteis incluem glicerol, etileno glicol, propileno glicol, poli (etileno glicol) e poli (propileno glicol). As composições aquosas de solvente tipicamente compreenderão 5 a 45% em volume de um ou mais de etileno glicol e propileno glicol e mais tipicamente 10 a 30% em volume de um ou mais de etileno glicol e propileno glicol.

[0038] Mordentes adequados para uso em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada incluem um mordente de alumínio, um mordente de ferro, um mordente de bismuto, um mordente de cobre, um mordente de molibdênio, um mordente de vanádio e um mordente de zircônio. Em algumas formas de realização, o mordente compreende um alume. Em outras formas de realização, o mordente compreende sulfato de alumínio. Em algumas formas de realização, o mordente pode estar presente na composição em uma concentração maior que a concentração da hemateina na composição (determinável por refratometria, cromatografia em camada fina ou espectroscopia) ou pode estar presente na composição em uma concentração menor do que a concentração da hemateina na composição. Alternativamente, em algumas formas de realização, a razão molar de hematoxilina para mordente na composição está entre 2:1 e 1:100. Em outras formas de realização, a razão molar de hematoxilina para mordente na composição está entre 1:5 e 1:20.

[0039] Os oxidantes adequados incluem oxigênio molecular de ocorrência natural na atmosfera que difunde e oxida a hematoxilina e um “oxidante químico” que é ativamente combinado com hematoxilina (normalmente em solução) para converter pelo menos uma porção da hematoxilina em hemateina. Soluções de hematoxilina semi-oxidadas são soluções nas quais o oxidante é incluído em uma quantidade que oxida aproximadamente metade da hematoxilina disponível, conforme descrito por Gill, Acta Cytologica, 18 (4): 30011 (1974), cujo revelado é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Exemplos de oxidantes químicos úteis incluem um ou mais de um sal de iodato (tal como iodato de sódio e iodato de potássio), óxido mercúrico, um sal de permanganato (tal como permanganato de potássio), um sal de periodato (tal como periodato de sódio e periodato de potássio) e um peróxido (tal como peróxido de hidrogênio). Em formas de realização particulares, o oxidante químico compreende iodato de sódio.

[0040] O oxidante pode estar presente em uma quantidade suficiente para oxidar completamente (tal como substancialmente quantitativamente) a hematoxilina em hemateina, ou suficiente apenas para oxidar parcialmente a hematoxilina em hemateina. Em formas de realização particulares, mais da metade da hematoxilina é oxidada em hemateina pelo oxidante químico e, em outras, menos da metade da hematoxilina é oxidada em hemateina pelo oxidante químico. Por exemplo, entre 1% e 50% da hematoxilina pode ser oxidada em hemateina pelo oxidante químico, mas mais tipicamente, entre cerca de 10% e cerca de 30% da hematoxilina é oxidada em hemateina pelo oxidante químico. Em exemplos particulares, a razão molar de hematoxilina para oxidante usada na composição está entre 6:1 e 1:1. Deve-se entender que, embora o oxidante químico seja considerado parte da composição, ele é convertido em seus produtos de redução após reação com a hematoxilina, cujos produtos de redução permanecerão na composição.

[0041] Exemplos de antioxidantes adequados para uso em qualquer formulação de hematoxilina estabilizada incluem hidroquinonas; ácido gálico; açúcares redutíveis tais como sorbitol e manitol; benzoatos e hidroxibenzoatos; sulfitos e metabissulfitos; certos ácidos como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido lático, ácido eritórbico, ácido ascórbico, ácido úrico, ácido tânico e sais desses ácidos (tal como sais de Mg2+, NH4+, Na+, K+ e Ca2+).

[0042] Exemplos de estabilizantes incluem, entre outros, amilose, uma ciclodextrina, uma criptande, um criptofano, um cavitande e um éter de coroa, um dendrímero, um nanotubo, um calixareno, uma valinomicina e uma nigericina.

[0043] Em algumas formas de realização, os recipientes (incluindo tubos, etc.) compreendendo uma formulação de hematoxilina estabilizada de acordo com a presente invenção são substancialmente livres de precipitados por um período de pelo menos 1 mês. Em outras formas de realização, os recipientes são substancialmente livres de precipitados por um período de pelo menos 3 meses. Em ainda outras formas de realização, os recipientes são substancialmente livres de precipitados por um período de pelo menos 6 meses. Em ainda outras formas de realização, os recipientes são substancialmente livres de precipitados por um período de pelo menos 12 meses. Em ainda outras formas de realização, os recipientes são substancialmente livres de precipitados por um período de pelo menos 18 meses. Em ainda outras formas de realização, os recipientes são substancialmente livres de precipitados por um período de pelo menos 24 meses.

MÉTODOS PARA FAZER UMA FORMULAÇÃO DE HEMATOXILINA ESTABILIZADA

[0044] Alguns aspectos da presente invenção são direcionados a métodos para fazer uma formulação de hematoxilina estabilizada. Sem desejar estar vinculado a nenhuma teoria em particular, acredita-se que, ao diminuir o pH de uma formulação de hematoxilina, a ocorrência de precipitados pode ser mitigada ou totalmente evitada.

[0045] O ingrediente ativo da coloração de hematoxilina é o hemalum (um complexo de íon alumínio e hemateina). Sem desejar estar vinculado a nenhuma teoria em particular, acredita-se que os prótons (H+) do ácido introduzido possam reverter uma reação de formação do hemalum (ou seja, Al3+ + Hm- ^ HmAl+ + H) e deslocar o alumínio do hemalum. Novamente, sem desejar estar vinculado a nenhuma teoria específica, acredita-se que, para que um precipitado se forme, o hemalum deve estar presente em níveis altos o suficiente para começar a formar cadeias de moléculas de hemateina e átomos de alumínio. Em baixos níveis de pH, acredita-se que não exista hemalum suficiente para formar essas cadeias.

[0046] Em geral, qualquer solução de hematoxilina, como as que compreendem um mordente e um oxidante, pode ser estabilizada diminuindo o pH da formulação de hematoxilina usando as composições e métodos aqui descritos. A título de exemplo, as soluções de hematoxilina divulgadas por Avwioro et al. “Histochemical Uses of Hematoxylin - A Review”, JPCS Vol (1), abril-junho de 2011, e Bryan D Llewellyn, “Hematoxylin Formulae”, http://stainsfile.info, outubro de 2013 podem ser estabilizadas usando os métodos e componentes divulgados aqui. Em algumas formas de realização, a formulação inicial de hematoxilina é uma das hematoxilinas Alume de Ehrlich (por exemplo, uma formulação que compreende hematoxilina, etanol, alume de potássio, água, glicerol, ácido acético glacial), hematoxilinas Alume de Harris (por exemplo, uma formulação que compreende hematoxilina, alume de potássio, água, etanol, óxido mercúrico e ácido acético glacial), Haemalum de Mayer (por exemplo, uma formulação que compreende hematoxilina, alume de amônio, alume de potássio, água, etanol, glicerol, iodato de sódio e ácido acético glacial), Hematoxilina de Cole (por exemplo, uma formulação que compreende hematoxilina, alume de amônio, água, etanol, glicerol, iodo e ácido acético glacial), hematoxilina de Gill (por exemplo, uma formulação que compreende hematoxilina, sulfato de alumínio, água, etileno glicol, iodato de sódio e ácido acético glacial), hematoxilina de Carazzi (por exemplo, uma formulação que compreende hematoxilina, alume de potássio, água, glicerol e iodato de sódio), Iyiola e hematoxilina Alume de Avwioro.

[0047] Em algumas formas de realização, a solução inicial de hematoxilina é a solução de hematoxilina VENTANA HE 600 (disponível em Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Em algumas formas de realização, a solução inicial de hematoxilina compreende água, um poliol, corante de hematoxilina, iodato de sódio e hidrato de sulfato de alumínio. Em outras formas de realização, a solução inicial de hematoxilina compreende água desionizada destilada, um poliol, corante de hematoxilina, iodato de sódio, hidrato de sulfato de alumínio, hidroquinona e uma beta-ciclodextrina.

[0048] Em geral, o pH de uma solução de hematoxilina pode ser reduzido adicionando um ácido à formulação de hematoxilina. Em algumas formas de realização, uma quantidade de um ácido é adicionada de tal modo que o pH da formulação hematoxilina é reduzida em entre cerca de 2% a cerca de 20%, ou seja, um pH inicial da solução de hematoxilina é reduzida em entre cerca de 2% a cerca de 20% para fornecer uma solução de hematoxilina com um segundo pH mais baixo. Em outras formas de realização, uma quantidade de um ácido é adicionada de tal modo que o pH da formulação hematoxilina é reduzida em entre cerca de 2,5% a cerca de 15%. Em ainda outras formas de realização, uma quantidade de um ácido é adicionada de tal modo que o pH da formulação de hematoxilina é reduzida em entre cerca de 3% a cerca de 12,5%. De acordo com outras formas de realização, uma quantidade de um ácido é adicionada de tal modo que o pH da formulação hematoxilina é reduzida em entre cerca de 4% a cerca de 12%. Em ainda outras formas de realização, uma quantidade de um ácido é adicionada de tal modo que o pH da formulação hematoxilina é reduzida em entre cerca de 5% a cerca de 10%. O técnico no assunto será capaz de adicionar uma quantidade apropriada de ácido para reduzir o pH da solução de hematoxilina, independentemente da solução de hematoxilina inicial escolhida.

[0049] Em algumas formas de realização, uma mudança no pH (ou seja, uma redução no pH) da formulação de hematoxilina após a adição do ácido é de cerca de 0,25 (ou seja, uma redução de cerca de 0,25 pH unidades). Em outras formas de realização, uma mudança no pH da formulação de hematoxilina após a adição do ácido é de cerca de 0,225. Em outras formas de realização, uma mudança no pH da formulação de hematoxilina após a adição do ácido é de cerca de 0,2. Em algumas formas de realização, uma mudança no pH da formulação de hematoxilina após a adição do ácido é de cerca de 0,175. Em outras formas de realização, uma alteração no pH da formulação de hematoxilina após a adição do ácido é de cerca de 0,15. Em outras formas de realização, uma mudança no pH da formulação de hematoxilina após a adição do ácido é de cerca de 0,125. Em outras formas de realização, uma alteração no pH da formulação de hematoxilina após a adição do ácido é de cerca de 0,1. Em outras formas de realização, uma mudança no pH da formulação de hematoxilina após a adição do ácido é de cerca de 0,075.

[0050] Em algumas formas de realização, uma quantidade de ácido é adicionada a uma formulação de hematoxilina, de modo que o pH da formulação seja reduzido para abaixo de 2,4. Em outras formas de realização, uma quantidade de ácido é adicionada a uma formulação de hematoxilina, de modo que o pH da formulação seja reduzido para abaixo de 2,35. Em outras formas de realização, uma quantidade de ácido é adicionada a uma formulação de hematoxilina, de modo que o pH da formulação seja reduzido para abaixo de 2,3. Em outras formas de realização, uma quantidade de ácido é adicionada a uma formulação de hematoxilina, de modo que o pH da formulação seja reduzido para abaixo de 2,25. Em outras formas de realização, uma quantidade de ácido é adicionada a uma formulação de hematoxilina, de modo que o pH da formulação seja reduzido para abaixo de 2,2. Em outras formas de realização, uma quantidade de ácido é adicionada a uma formulação de hematoxilina, de modo que o pH da formulação seja reduzido para abaixo de 2,15. Em outras formas de realização, uma quantidade de ácido é adicionada a uma formulação de hematoxilina, de modo que o pH da formulação seja reduzido para abaixo de 2,1.

[0051] Em algumas formas de realização, uma solução acidificante é adicionada a uma formulação de hematoxilina, a solução acidificante compreendendo uma base forte e um aditivo. Em algumas formas de realização, o aditivo da solução acidificante é um de um mordente, um oxidante, um agente que prolonga a vida útil e um antioxidante. O aditivo da solução acidificante pode ser apresentado nas mesmas quantidades ou proporções, tal como aqui descrito para as formulações estabilizadas de hematoxilina descritas aqui.

SOLUÇÃO DE REAJUSTE

[0052] A presente invenção também fornece soluções de reajuste que podem ser misturadas com as formulações estabilizadas de hematoxilina aqui divulgadas. Em geral, a solução de reajuste compreende um solvente e um de uma base forte ou um tampão. Em algumas formas de realização, o solvente é selecionado a partir dos citados aqui para formulações estabilizadas de hematoxilina aqui descritas. Em algumas formas de realização, o mesmo solvente é usado na composição estabilizada de hematoxilina e na solução de reajuste.

[0053] Em algumas formas de realização, a base forte é selecionada a partir do grupo que consiste em hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de lítio e amônia. Em algumas formas de realização, a base forte é hidróxido de sódio a 1M. Em outras formas de realização, a base forte é hidróxido de sódio a 0,5M. Em ainda outras formas de realização, a base forte é hidróxido de sódio a 0,1M.

[0054] Em algumas formas de realização, o tampão é selecionado a partir de um maleato, um fosfato, uma glicina, um citrato, uma glicilglicina, um malato, um formato, um cianoacetato, um succinato, um acetato, um propionato, fumarato, sulfato, alanina, arginina, isoleucina, leucina, noleucina, prolina, serina, treonina ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, o tampão tem um pKa variando de cerca de 1,5 a cerca de 3,5. Em outras formas de realização, o tampão tem um pKa variando de cerca de 1,8 a cerca de 3,2. Em ainda outras formas de realização, o tampão tem um pKa variando de cerca de 2 a cerca de 3.

[0055] Em algumas formas de realização, a solução de reajuste compreende ainda um aditivo selecionado a partir do grupo que consiste em mordente, um oxidante, um agente que prolonga a vida útil e um antioxidante. O aditivo pode ser apresentado nas mesmas quantidades ou razões descritas aqui.

MÉTODO DE REAJUSTE DO PH DE UMA FORMULAÇÃO DE HEMATOXILINA ESTABILIZADA

[0056] Alguns aspectos da presente invenção são direcionados ao reajuste do pH de uma formulação de hematoxilina estabilizada para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionar uma base forte ou uma solução tampão a uma formulação de hematoxilina estabilizada. Em algumas formas de realização, o método compreende adicionar uma solução de reajuste, como descrito aqui, a uma formulação de hematoxilina estabilizada.

[0057] Em algumas formas de realização, uma quantidade suficiente de base forte, solução tampão ou solução de reajuste é adicionada à formulação de hematoxilina, de modo que o pH da formulação de hematoxilina estabilizada seja aumentado para pelo menos 2,4. Em outras formas de realização, uma quantidade de base forte, solução tampão ou solução de reajuste é adicionada à formulação de hematoxilina, de modo que o pH seja aumentado para pelo menos 2,45. Em ainda outras formas de realização, uma quantidade de base forte, solução tampão ou solução de reajuste é adicionada à formulação de hematoxilina, de modo que o pH seja aumentado para pelo menos 2,5. Em outras formas de realização, uma quantidade de base forte, solução tampão ou solução de reajuste é adicionada à formulação de hematoxilina, de modo que o pH seja aumentado para pelo menos 2,55.

[0058] Em algumas formas de realização, o método compreende medir um pH inicial de uma alíquota de uma formulação de hematoxilina estabilizada e adicionar uma quantidade de uma base forte, uma solução tampão ou uma solução de reajuste até que o pH da alíquota seja aumentado para pelo menos cerca de 2,4. Em algumas formas de realização, o método compreende medir um pH inicial de uma alíquota de uma formulação de hematoxilina estabilizada e adicionar uma quantidade de uma base forte, uma solução tampão ou uma solução de reajuste até que o pH da alíquota seja aumentado para pelo menos cerca de 2,45. Em algumas formas de realização, o método compreende medir um pH inicial de uma alíquota de uma formulação de hematoxilina estabilizada e adicionar uma quantidade de uma base forte, uma solução tampão ou uma solução de reajuste até que o pH da alíquota seja aumentado para pelo menos cerca de 2,5. Em algumas formas de realização, o método compreende medir um pH inicial de uma alíquota de uma formulação de hematoxilina estabilizada e adicionar uma quantidade de uma base forte, uma solução tampão ou uma solução de reajuste até que o pH da alíquota seja aumentado para pelo menos cerca de 2,55.

[0059] Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece formulações reajustadas, como as soluções de coloração de hematoxilina que incluem um solvente, corante de hematoxilina, um mordente, um oxidante e um sal formado. Em algumas formas de realização, o sal formado é um subproduto de uma reação entre um ácido e uma base forte, por exemplo, NaCl).

KITS

[0060] Em outro aspecto da presente invenção são kits para preparar formulações estabilizadas de hematoxilina e kits para reajustar o pH de uma formulação de hematoxilina estabilizada.

[0061] Em algumas formas de realização, o kit compreende um primeiro componente e um segundo componente, em que o primeiro componente compreende uma composição estabilizada de hematoxilina compreendendo o corante de hematoxilina e um ácido, em que a composição estabilizada de hematoxilina tem um pH inferior a 2,4; e em que o segundo componente compreende uma base forte ou um tampão, o segundo componente fornecido em uma quantidade relativa ao primeiro componente, de modo que quando o primeiro e o segundo componentes são misturados, o pH de uma solução resultante de coloração de hematoxilina é maior que 2,4. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda um meio para determinar uma alteração no pH à medida que o primeiro e o segundo componentes são misturados. Em algumas formas de realização, pelo menos um dos primeiro ou segundo componentes compreende um mordente e um oxidante. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda instruções para misturar o primeiro e o segundo componentes. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda um corante adicional.

[0062] Em algumas formas de realização, o kit compreende um primeiro distribuidor de fluido e um segundo distribuidor de fluido, o primeiro distribuidor de fluido compreendendo uma formulação de hematoxilina estabilizada e o segundo distribuidor de fluido compreendendo uma solução de reajuste, um tampão ou uma base forte.

[0063] Em algumas formas de realização, o kit compreende primeiro e segundo componentes, o primeiro componente compreendendo uma formulação de hematoxilina estabilizada com um pH inferior a 2,4; e o segundo componente compreendendo uma solução de reajuste. Em algumas formas de realização, as formulações estabilizadas de hematoxilina compreendem um solvente, um corante de hematoxilina, um ácido, um mordente e um oxidante. Em algumas formas de realização, o kit compreende ainda instruções para misturar o primeiro e o segundo componentes para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina com um pH maior que 2,4. Em algumas formas de realização, as instruções descrevem uma quantidade específica do segundo componente a ser adicionada ao primeiro componente para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina com um pH predeterminado. Em algumas formas de realização, o primeiro e o segundo componentes são fornecidos em distribuidores de fluido separados, cada distribuidor de fluido adequado para uso em um aparelho de coloração automatizado, como aqui divulgado. Os distribuidores de fluido adequados incluem, mas não estão limitados aos divulgados no Número de Publicação PCT WO/2012/163992 e Patente US No. 6,192,945, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

MÉTODOS PARA CORAR DE UMA AMOSTRA BIOLÓGICA

[0064] Outros aspectos da presente invenção são direcionados a métodos para corar uma amostra biológica com uma formulação de hematoxilina. Em algumas formas de realização, o método para corar uma amostra biológica compreende (i) preparar uma solução de coloração de hematoxilina a partir de uma formulação de hematoxilina estabilizada; e (ii) introdução da solução de coloração de hematoxilina em uma amostra biológica. Em algumas formas de realização, a solução de coloração de hematoxilina é preparada por adição de uma quantidade de uma solução de reajuste a uma formulação de hematoxilina estabilizada, de tal modo que o pH da formulação de hematoxilina estabilizada aumenta para um valor de pH que é adequado para a coloração. Em algumas formas de realização, o pH é aumentado para maior que 2,4. Em algumas formas de realização, uma quantidade suficiente de solução de reajuste é adicionada de modo que o pH aumente para mais de 2,5. Em algumas formas de realização, a solução de reajuste compreende uma base forte. Em algumas formas de realização, a solução de reajuste compreende um tampão. Em algumas formas de realização, a solução de reajuste compreende um aditivo.

[0065] Em algumas formas de realização, o método para corar uma amostra biológica compreende (i) aumentar o pH de uma alíquota de uma formulação de hematoxilina estabilizada para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina com um pH variando entre cerca de 2,4 a cerca de 2,6; e (ii) colocar uma amostra biológica em contato com a solução resultante de coloração de hematoxilina. Em algumas formas de realização, o método compreende ainda a etapa de colocar a amostra em contato com um corante ou corante de contraste adicional. Em algumas formas de realização, a etapa de aumentar o pH da alíquota da formulação de hematoxilina estabilizada compreende titular na formulação de hematoxilina estabilizada uma quantidade de uma solução de reajuste até que o pH da formulação atinja um nível predeterminado.

[0066] Em algumas formas de realização, o método para corar uma amostra biológica compreende (i) misturar uma formulação de hematoxilina estabilizada e uma solução de reajuste para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina com um pH entre 2,4 e cerca de 2,6; e (ii) distribuir a solução de coloração de hematoxilina a uma amostra biológica. Em algumas formas de realização, uma proporção da formulação de hematoxilina estabilizada para a solução de reajuste varia de cerca de 5:1 a cerca de 25:1. Em outras formas de realização, a proporção varia de cerca de 10:1 a cerca de 20:1.

[0067] Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são misturadas por um período de tempo entre 1 segundo e cerca de 400 segundos antes da introdução da solução resultante de hematoxilina na amostra biológica. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são misturadas por um período de tempo entre 5 segundos e cerca de 240 segundos antes da introdução da solução resultante de hematoxilina na amostra biológica. Em ainda outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são misturadas por um período de tempo entre 5 segundos e cerca de 120 segundos antes da introdução da solução de hematoxilina resultante na amostra biológica. Em outras formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são misturadas por um período de tempo entre 5 segundos e cerca de 60 segundos antes da introdução da solução de hematoxilina resultante na amostra biológica.

[0068] Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são introduzidas separadamente na amostra biológica, simultaneamente ou sequencialmente, e deixadas misturar enquanto em contato com a amostra biológica. Em algumas formas de realização, a solução de reajuste compreende um tampão e o tampão é aplicado à amostra biológica antes da aplicação da formulação de hematoxilina estabilizada. Em algumas formas de realização, o tampão é aplicado à amostra e a formulação de hematoxilina estabilizada é titulada no tampão presente na amostra até que o pH da mistura atinja um nível predeterminado.

SISTEMAS PARA COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA

[0069] Em algumas formas de realização, as soluções e formulações descritas aqui são aplicadas manualmente ou introduzidas em uma amostra ou aplicadas usando uma técnica de imersão e encharcar. Em outras formas de realização, as soluções e formulações são aplicadas ou dispensadas a uma amostra, como por um aparelho de coloração automatizado. O técnico no assunto apreciará que a distribuição de qualquer solução ou formulação se refere à aplicação dessa solução ou formulação a uma amostra ou substrato (por exemplo, uma lâmina).

[0070] O método e as composições aqui divulgados podem ser adaptados para uso com sistemas de processamento automatizados existentes. Por exemplo, a Ventana Medical Systems, Inc. é a cessionária de várias patentes nos Estados Unidos que divulgam sistemas e métodos para realizar análises automatizadas, incluindo as Pat. US 5,650,327, 5,654,200, 6,296,809, 6,352,861, 6,827,901 e 6,943,029, e pedidos publicados US Nos. 20030211630 e 20040052685, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Estes sistemas podem ser adaptados para serem compatíveis com a presente invenção. Resumidamente, o sistema de processamento de lâmina automatizado que são descritos nos pedidos acima mencionados são sistema de processamento de lâmina de grande volume que transporta as bandejas que suporta uma pluralidade de lâminas em posições substancialmente horizontais (para minimizar a contaminação cruzada) entre as estações de trabalho que executam várias operações de processamento de lâmina sobre as lâminas. Reagentes frescos podem ser aplicados a cada lâmina durante o processamento, e a contaminação cruzada de lâminas com reagentes pode ser substancialmente eliminada porque as lâminas são tratadas separadamente de maneira espaçada na bandeja. Em uma configuração, o sistema inclui um aquecedor radiante, uma estação de trabalho combinada de desparafinizador/ corante/ trocador de solvente, um forno de convecção e um aplicador de lamínulas. Uma bandeja de lâminas contendo amostras de tecido embebidas em parafina pode ser aquecida sob o aquecedor radiante do sistema para espalhar a parafina nas amostras para facilitar a remoção e também para aderir as amostras às lâminas. A bandeja pode ser transportada para a estação de trabalho multifuncional de desparafinizador/ corante/ trocador de solventes, onde as lâminas podem ser desparafinizadas, coradas e trocadas por solvente. Uma bandeja de lâminas coradas, pronta para aplicação de lamínulas, pode ser transportada para o aplicador de lamínulas do sistema em que as lamínulas são adicionadas às lâminas. Depois que as lâminas são cobertas com lamínulas, a bandeja pode ser transportada para o forno de convecção para curar as lamínulas nas lâminas coradas. O corante de alto volume que acabamos de descrever está disponível comercialmente em Ventana Medical Systems, Inc, Tucson, Arizona.

[0071] Exemplos de outros sistemas de processamento de amostras disponíveis comercialmente através dos quais as soluções e formulações aqui descritas podem ser aplicadas incluem a série VENTANA SYMPHONY (corante de lâminas individuais) e VENTANA HE 600 (corante de lâminas individuais); o Dako CoverStainer (corante de lotes) da Agilent Technologies; o corante linear pequeno Leica ST4020 (corante de lotes), o corante multistainer Leica ST5020 (corante de lotes) e os corantes H&E da série Leica ST5010 Autostainer XL (corante de lotes) da Leica Biosystems Nussloch GmbH.

[0072] Enquanto os sistemas de coloração descritos acima podem ser configurados para realizar qualquer processo de coloração histológica, um protocolo exemplificativo de coloração por hematoxilina e eosina compreende uma etapa de cozimento para aderir as amostras às lâminas, uma etapa de desparafinização para remover parafina das amostras embebidas em parafina, uma etapa de coloração de hematoxilina (que pode utilizar as composições de hematoxilina divulgadas), uma etapa azulada que aumenta o pH e transforma o azul de hematoxilina para fornecer melhor contraste com a eosina adicionada a jusante, uma etapa de coloração com eosina, uma etapa de diferenciação usada para remover o excesso eosina e transforma a eosina em vários tons de vermelho para rosa, uma etapa de desidratação para remover a água da amostra usando etanol a 100%, etapa na qual as lâminas são expostas a uma temperatura e fluxo de ar elevados para remover o etanol, uma etapa de aplicação de lamínulas na qual limoneno é dispensado sobre a amostra e uma etapa de cura.

[0073] Em algumas formas de realização, um sistema de coloração automatizado compreende reservatórios ou recipientes separados contendo formulação de hematoxilina estabilizada separada e solução de reajuste. Em algumas formas de realização, os sistemas compreendem ainda um sistema de distribuição que entrega as formulações estabilizadas de hematoxilina e soluções de reajuste à amostra biológica, por exemplo, uma amostra biológica montada em uma lâmina. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são combinadas antes da aplicação na amostra biológica. Em algumas formas de realização, um recipiente de formulação de hematoxilina estabilizada e um recipiente de solução de reajuste são pressurizados e conectados fluidamente a um receptáculo de mistura. O receptáculo de mistura pode ser qualquer recipiente capaz de reter ou transportar a solução misturada, como um tubo rígido ou flexível. Em algumas formas de realização, o receptáculo de mistura é um tubo que é conectado fluidamente a um distribuidor. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são conectadas fluidamente a um encaixe em T via tubulação. A saída do encaixe em T é, por sua vez, conectada fluidamente ao distribuidor. Nestas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são alimentadas no encaixe em T e a mistura das soluções ocorre no tubo que sai do encaixe em T. Em algumas formas de realização, a formulação de hematoxilina estabilizada e a solução de reajuste são dispensadas separadamente na amostra biológica. Nestas formas de realização, as soluções podem ser misturadas por difusão na amostra ou mecanicamente misturadas, por exemplo, por agitação com uma pipeta.

[0074] Em algumas formas de realização, o aparelho de processamento automatizado de amostras pode incluir um carrossel para reter uma pluralidade de substratos, por exemplo, lâminas de microscópio, em que cada substrato inclui uma amostra biológica a ser corada. Em algumas formas de realização, o equipamento de coloração automática também pode incluir um dispositivo para girar o carrossel em velocidades predeterminadas e um mecanismo para direcionar e controlar a aplicação de reagentes, incluindo as soluções e formulações descritas neste documento, nos substratos e nas amostras durante a rotação do carrossel. Em algumas formas de realização, uma vez que as lâminas são carregadas no instrumento, os protocolos de teste determinam quais fluidos são dispensados nos substratos em momentos específicos. No momento apropriado, em algumas formas de realização, um rack dispensador girará para alinhar um fluido correto sobre um substrato e o instrumento dispensará uma quantidade predeterminada de fluidos no substrato. Em algumas formas de realização, o instrumento permitirá que o fluido permaneça em contato com a amostra biológica por um período de tempo predeterminado.

[0075] Em algumas formas de realização, o sistema é um sistema automatizado de processamento de lâminas que inclui uma bandeja de lâminas segurando uma pluralidade de lâminas em uma posição substancialmente horizontal (tal como em duas linhas em que as lâminas são mantidas em um ângulo entre cerca de 0,2 graus e cerca de 1,2 graus da horizontal) e uma ou mais estações de trabalho (por exemplo, organizadas em uma pilha vertical) que recebem a bandeja de lâminas e executam uma ou mais operações de processamento de lâminas nas lâminas da bandeja de lâminas. Em algumas formas de realização, a estação de trabalho pode executar uma operação de processamento de lâminas em uma ou mais lâminas individuais em uma bandeja de lâminas, por exemplo, pelo menos duas ou quatro lâminas em uma bandeja de lâminas, ou pode executar simultaneamente uma operação de processamento de lâminas em todas as lâminas em uma bandeja de lâminas. Em algumas formas de realização, as uma ou mais estações de trabalho dispensam um reagente nas lâminas da bandeja de lâminas sem uma quantidade substancial do reagente que entra em contato com uma primeira lâmina em contato com uma segunda lâmina, minimizando assim a contaminação cruzada entre as lâminas. Essas estações de trabalho podem incluir um ou mais bicos direcionais que dispensam o reagente nas lâminas, por exemplo, os um ou mais bicos direcionais podem incluir um par de bicos direcionais que dispensam o reagente em direções opostas através de uma superfície de uma lâmina. Em formas de realização mais particulares, os um ou mais bicos direcionais podem incluir ainda um bico direcional que dispensa o reagente em direção a uma superfície inferior de uma lâmina. Em outras formas de realização particulares, as uma ou mais estações de trabalho podem distribuir simultaneamente um reagente (por exemplo, o mesmo reagente) para pelo menos duas lâminas mantidas em uma bandeja de lâminas dentro de uma determinada estação de trabalho ou as uma ou mais estações de trabalho podem distribuir simultaneamente um reagente (tal como o mesmo reagente) para todas as lâminas contidas na bandeja de lâminas em uma determinada estação de trabalho. Componentes de sistema adicionais e configurações de bandeja (bem como sistemas de controle) são descritos nas Patentes US Nos. 8,663,991, 7,468,161 e 9,528,918, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[0076] Em algumas formas de realização, a presente invenção fornece um aparelho para o tratamento automático de amostras biológicas, compreendendo: pelo menos uma bandeja de lâminas segurando uma pluralidade de lâminas em posições substancialmente horizontais, em que as referidas amostras biológicas estão localizadas nas referidas lâminas; uma ou mais estações de trabalho que recebem a referida bandeja de lâminas e executam uma ou mais operações de processamento de lâminas na referida pluralidade de lâminas mantidas na referida bandeja de lâminas; um transportador que move a referida bandeja de lâminas para dentro e para fora das referidas uma ou mais estações de trabalho; um módulo de fluidos em comunicação fluida com as referidas uma ou mais estações de trabalho que fornece um reagente à referida uma ou mais estações de trabalho; um módulo pneumático em comunicação fluida com as referidas uma ou mais estações de trabalho e o referido módulo fluídico; em que o referido módulo pneumático fornece vácuo e/ ou gás pressurizado para as referidas uma ou mais estações de trabalho e o referido módulo de fluidos; e um módulo de controle em comunicação elétrica com o referido transportador, as referidas uma ou mais estações de trabalho, o referido módulo fluídico e o referido módulo pneumático, em que o referido módulo de controle coordena a função dos componentes do aparelho durante o tratamento das referidas amostras biológicas. O aparelho pode ser adaptado para fornecer uma ou mais das soluções e/ ou formulações descritas neste documento.

CONTRA-CORANTES

[0077] Em algumas formas de realização, os sistemas e métodos compreendem ainda a coloração de amostras biológicas com corantes adicionais, como corante de contrastes. Em algumas formas de realização, o contato da amostra com um corante de contraste compreende o contato da amostra com uma ou mais de eosina Y (número CAS 15086-94-9), laranja G (número CAS 1936-15-8), verde claro SF amarelado (número CAS 5141-20-8), marrom Bismark (número CAS: 8005-77-4), FCF verde rápido (número CAS 2353-45-9), O G -6 (incluindo laranja G), EA25 (incluindo SF verde claro, Marrom Bismarck e eosina Y), EA36 (incluindo SF verde claro, marrom Bismarck e eosina Y), EA50 (incluindo SF verde claro, marrom Bismarck e eosina Y) e EA65 (incluindo SF verde claro, marrom Bismarck e eosina Y). As fórmulas e métodos para fazer esses corantes de contrastes podem ser encontradas, por exemplo, no StainsFile (um recurso da Internet para histotecnologistas mantido por Bryan Llewellyn); Kiernan, “Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice”, 3a Ed. Butterworth Heinemann, Oxford, Reino Unido; e em Horobin e Kiernan, “Conn's Biological Dyes: A Handbook of Dyes, Stains, and Fluorochromes for Us in Biology and Medicine”, 10a ed., Oxford: BIOS, ISBN 1859960995, 2002. Em outras formas de realização, colocar a amostra em contato com a composição de hematoxilina compreende um protocolo progressivo de coloração de hematoxilina. Em outras formas de realização, o contato da amostra com a composição de hematoxilina compreende um protocolo de coloração regressivo de hematoxilina. O método pode ser automatizado e pode ser realizado em uma amostra biológica que é suportada em um substrato, como uma lâmina de microscópio. Em formas de realização particulares, o método é usado para corar uma secção de tecido ou uma amostra citológica montada em uma lâmina de microscópio. Em formas de realização particulares, incluindo ainda uma etapa de contra-coloração, o método pode ser um método de coloração de hematoxilina e eosina ou um método de coloração PAP e, mais particularmente, um método automatizado de coloração de hematoxilina e eosina ou PAP.

[0078] Outros corantes histológicos úteis em conjunto com os procedimentos de coloração da presente invenção incluem corantes como corantes de acridina, corantes de antraquinona, corantes de arilmetano, corantes azo, corantes de diazônio, corantes nitro, corantes de ftalocianina, corantes de quinina imina, corantes de tetrazólio e corantes de tiazol e corantes de xanteno. Exemplos de corantes úteis para coloração histológica incluem amarelo acetil, preto ácido 1, azul ácido 22, azul ácido 93, fucsina ácida, verde ácido, verde ácido 1, verde ácido 5, magenta ácido, laranja ácido 10, vermelho ácido 4, vermelho ácido 26, vermelho ácido 29, vermelho ácido 44, vermelho ácido 51, vermelho ácido 66, vermelho ácido 73, vermelho ácido 87, vermelho ácido 91, vermelho ácido 92, vermelho ácido 94, vermelho ácido 101, vermelho ácido 103, ácido roseina, ácido rubina, violeta ácido 19, amarelo ácido 1, amarelo ácido 9, amarelo ácido 23, amarelo ácido 24, amarelo ácido 36, amarelo ácido 73, amarelo ácido S, amarelo ácido T, acridina laranja, acriflavina, azul alciano, amarelo alciano, eosina solúvel em álcool, alizarina, alizarina azul, alizarina azul 2RC, alizarina carmina, alizarina cianina BBS, alizarol cianina R, alizarina vermelho S, alizarina purpurina, aluminão, amido preto 10B, amidonaftol vermelho, amidoschwarz, anilina azul WS, anilina roxa, anilacina SWR, azul antraceno SWX, auramina 0, azo-eosina, azocarmina B, azocarmina G, azoeosina G, diazo azóico 5, diazo azóico 48, azofloxina, azovan azul, azure A, azure B, azure C, azul básico 8, azul básico 9, azul básico 12, azul básico 15, azul básico 17, azul básico 20, azul básico 26, marrom básico 1, fúccia básico, verde básico 4, verde básico 5, laranja básico 14, vermelho básico 2, vermelho básico 5, vermelho básico 9, violeta básico 2, violeta básico 4, violeta básico 10, violeta básica 14, amarelo básico 1, amarelo básico 2, escarlate de Biebrich, escarlate de Biebrich R, marrom Bismarck Y, brazileina, brasilina, croceína brilhante, cristal escarlate brilhante 6R, vermelho de cálcio, carmim, ácido carmínico carmoisina 6R, azul celestino B, azul china, clorantina rápido vermelho 5B, cochonilha, azul celestino, azul Chicago 4B, cromo violeta CG, cromotrópio 2R, cromoxano cianina R, Congo Corinto, Congo vermelho, algodão azul algodão vermelho, croceína escarlate croceína escarlate 3B, croceína escarlate MOO, crocina, cristal ponceau 6R, cristal escarlate, cristal violeta, dália, diamante verde B, azul direto 14, azul direto 58, vermelho direto, vermelho direto 10, vermelho direto 28, vermelho direto 80, vermelho direto 81, amarelo direto 7, durazol azul 4R, durazol azul 8G, eosina B, eosina azulada, eosina, eosina Y, eosina amarelada, eosinol, Erie granada B, eriocromo cianina R, eritrosina B etil eosina, etil verde, etil violeta, azul de Evan, azul rápido B, verde rápido FCF, vermelho rápido B, amarelo rápido, amarelo rápido extra, amarelo rápido G, preto graxo HB, fluoresceína, alimento verde 3, galeão, galocianina azul de galamina, violeta de genciana, hélio rubin fast BBL, azul helvético, violeta de Hoffman, hidrazina amarelo, vermelho imperial, azul ingrain 1, amarelo ingrain 1, INT, Kermes, ácido quermesico, kemechtrot, Lac, ácido laccáico, violeta de Lauth, verde claro, amarelo rápido de lissamina, verde de lissamina SF, azul rápido de Luxol, magenta 0, magenta I, magenta II, magenta III, verde malaquita, marrom Manchester, amarelo Martius, malva, malveína, merbromina, mercurocromo, amarelo metanil, metileno azure A, metileno azure B, metileno azure C, azul metileno, verde metileno, metil azul, metil verde, metil violeta, metil bioleta 2B, metil violeta 10B, 3G amarelo mordente, azul mordente 3, azul mordente 10, azul mordente 14, azul mordente 23, azul mordente 32, azul mordente 45, vermelho mordente 3, vermelho mordente 11, violeta mordente 25, violeta mordente 39, preto azul naftaleno, preto azul naftol, verde naftol B, naftol amarelo S, preto natural 1, vermelho natural, vermelho natural 3, vermelho natural 4, vermelho natural 8, vermelho natural 16, vermelho natural 24, vermelho natural 25, vermelho natural 28, amarelo natural 6, NBT, vermelho neutro, nova fucsina, Niagara blue 3B, night blue, Nile blue, Nile blue A, Nile blue sulfato, Nile vermelho, nitro BT, nitro azul tetrazolio, vermelho rápido nuclear, vermelho óleo 0, laranja G, orceina, pararosanilina, violeta de Perkin, floxina B, ácido pítrico, Ponceau 2R, Ponceau 6R, Ponceau B, Ponceau de Xilidina, Ponceau S, pontamina azul céu 5B, primula, primulina, purpurina, pironina B, pironina G, pironina Y, rodamina B, rosanilina, rosa Bengala, açafrão, safranin 0, vermelho escarlate R escarlate, Scharlach R, goma-laca, sirius vermelho F3B, sirius vermelho 4B, sirius supra azul F3R, cianina solocromo R, solúvel em azul, solvente preto 3, solvente azul 38, solvente vermelho 23, solvente vermelho 24, solvente vermelho 27, solvente vermelho 45, solvente amarelo 94, eosina solúvel em álcool, Sudan III, Sudan IV, Sudan preto B, Sudan vermelho BK, amarelo enxofre S, azul suíço, tartrazina, tioflavina S, tioflavina T, tionina, azul de toluidina, vermelho de toluidina, tropaeolina G, tripaflavina, azul de tripano, uranina, azul Victoria 4R, azul Victoria B, azul Victoria R, verde Victoria B, azul água I, eosina solúvel em água, escarlate de corantes de madeira, xilidina ponceau e eosina amarelada e combinações dos mesmos. As fórmulas e métodos para produzir e utilizar as soluções de corantes histoquímicos descritos neste parágrafo (tal como em procedimentos de “coloração especial” em determinados contextos histológicos, ou como corante de contrastes) podem ser encontrados, por exemplo, no StainsFile (um recurso da Internet para histotecnólogos mantidos pela Bryan Llewellyn); Kiernan, “Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice”, 3a Ed. Butterworth Heinemann, Oxford, Reino Unido; e em Horobin e Kiernan, “Conn's Biological Stains: A Manual of Dyes, Stains, and Fluorochromes for US in Biology and Medicine”, 10a ed., Oxford: BIOS, ISBN 1859960995, 2002. O conteúdo das duas referências relacionadas citadas imediatamente acima são incorporados por referência aqui.

EXEMPLOS

[0079] Os seguintes exemplos não limitados são fornecidos para ilustrar ainda mais certas formas de realização da presente invenção.

[0080] Para produzir um corante funcional, a hematoxilina é oxidada em hemateina e subsequentemente é ligada a um dos vários íons metálicos, incluindo alumínio (Al+3), ferro (Fe+3) e cromo (Cr+3). Vários sais de alumínio diferentes podem ser usados como fonte de Al+3. Isso inclui sulfato de alumínio e amônio [AlNH4(SO4)2], sulfato de alumínio [Al2(SO4)3] e sulfato de alumínio e potássio [AlK(SO4)2]. Um íon metálico ligado a um corante envolvido na ligação do corante ao tecido é referido como mordente. A conversão de hematoxilina em hemateina pode ser realizada pela ação de vários agentes. Atualmente, a maioria das formulações incorpora um oxidante químico, como o iodato de sódio, que converte rapidamente hematoxilina em hemateina. As concentrações de iodato de sódio são tipicamente baseadas na quantidade de hematoxilina e geralmente variam de 0,10 a 0,20 gramas de iodato de sódio por grama de hematoxilina.

EXEMPLO 1

[0081] Um lote de 2 L de solução de hematoxilina VENTANA HE 600 foi dividido em quatro volumes iguais de 500 mL cada e seus níveis de pH foram ajustados pela adição de ácido clorídrico a 1M a cada um deles, como mostrado na Tabela 1. Em algumas formas de realização, a solução de hematoxilina VENTANA HE 600 compreendeu água desionizada destilada (cerca de 700 g/ L), etileno glicol (cerca de 280 g/ L), corante de hematoxilina (cerca de 6 g/ L), iodato de sódio (cerca de 0,65 g/ L), sulfato de alumínio 16-18 hidrato (cerca de 27 g/ L), hidroquinona (cerca de 9 g/ L) e beta-ciclodextrina (cerca de 11 g/ L).

[0082] Cada amostra de hematoxilina foi colocada em circuitos de tubo seladas de 4 mm (30 cm de comprimento) e os tubos contendo as amostras foram colocados em um forno mantido a 60 °C por 14 dias. Após 14 dias, os circuitos foram removidos do forno, drenados e lavados com água desionizada. Cada um dos tubos mostrou um revestimento precipitado, mas havia menos revestimento precipitado no tubo que continha EXP1-D (pH = 2,16).

[0083] O experimento do circuito de tubulação acima foi repetido com amostras mantidos nos circuitos da tubulação a 60 °C por 7 dias. Após apenas 7 dias de incubação, houve uma diferença notável na quantidade de revestimento de precipitado nos diferentes tubos (ver Figura 1). Houve um aumento distinto no revestimento precipitado à medida que o pH da solução foi aumentado.

[0084] O experimento do circuito de tubulação descrito acima foi repetido com amostras mantidas nos circuitos de tubulação a 45 °C por 30 dias. Novamente, foi observada uma diferença notável na quantidade de revestimento de precipitado nos tubos (ver Figura 2). Como antes, a quantidade de revestimento precipitado nos tubos aumentou à medida que o pH da solução de hematoxilina aumentou.

EXEMPLO 2

[0085] Após cerca de 180 dias, o pH de uma porção das amostras de hematoxilina previamente ajustadas ao pH (consulte a Tabela 1) foi reajustado para cerca de pH = 2,5 com solução de hidróxido de sódio a 0,1 M (consulte a Tabela 2).

[0086] As amostras reajustadas ao pH foram então utilizadas em experimentos de coloração (coloração de lâminas de 5 em 1 blocos de múltiplos tecidos (MTB)). O EXP1-A foi usado como controle e comparado com as outras três colorações (EXP2-A, EXP2-B e EXP2-C) em um estudo de comparação de 8 pares.

[0087] Cada lâmina corada com o controle (EXP1-A) mostrou uma quantidade significativa de precipitado nas lâminas. As lâminas coradas com soluções mantidas em níveis mais baixos de pH (EXP2-A, EXP2-B e EXP2-C) não mostraram precipitado nas lâminas. Além das diferenças notáveis no nível de precipitado, não foram observadas outras diferenças significativas entre as lâminas coradas.

EXEMPLO 3

[0088] Após cerca de 500 dias, notou-se que o frasco contendo a amostra que não recebeu nenhum ajuste de pH (EXP1-A) mostrou uma camada pesada de precipitado na superfície interna. Os frascos contendo as amostras submetidas ao ajuste do pH (EXP1-A, EXP1-B, EXP1-C e EXP1-D) não mostraram filme precipitado.

[0089] Neste momento (500 dias), os níveis de pH de uma porção das amostras de hematoxilina previamente ajustadas ao pH (consulte a Tabela 1) foram reajustados para cerca de pH = 2,5 com uma solução tampão a 1,2 M de ácido cianoacético/ cianoacetato (pH = 2,6). Consulte a Tabela 3. Nesse caso, um tampão em vez de uma base forte foi usado para reajustar o pH da solução a um nível aceitável para coloração. Durante o reajuste do pH, se muita base forte for adicionada, o nível de pH alvo pode ser facilmente ultrapassado em várias unidades de pH. Um tampão é mais tolerante quando se trata de reajustar o pH. Se for adicionado muito tampão, o pH alvo pode ser ultrapassado apenas por uma pequena quantidade ou não, dependendo do pH e da concentração do tampão usado.

[0090] As amostras reajustadas ao pH identificadas na Tabela 3 foram então usadas em experimentos de coloração (coloração de lâminas de 5 em 1 blocos de múltiplos tecidos (MTB)). Um controle (um lote atual e não vencido da solução de hematoxilina Ventana HE 600, peça n° 07024282001) foi comparado com as amostras EXP3-A, EXP3-B e EXP3-C. Verificou-se que os corantes mantidos abaixo de pH ~ 2,30 por 500 dias (EXP3-B e EXP3-C) apresentaram apenas um mínimo ou nenhum precipitado nas lâminas.

EXEMPLO 4

[0091] Após cerca de 550 dias, os níveis de pH de uma porção das amostras de hematoxilina previamente ajustadas ao pH (consulte a Tabela 1) foram ajustadas para cerca de pH = 2,5 com uma solução VENTANA HE 600 Bluing (tampão TRIS a 0,1 M, pH = 8-9). Veja a tabela 4.

[0092] Nenhum outro experimento foi realizado com soluções reajustadas para pH fornecidas na Tabela 4. O reajuste foi realizado para provar o conceito de que um reagente prontamente disponível (solução VENTANA HE 600 Bluing) poderia ser usado para reajustar o pH das soluções ácidas de hematoxilina.

EXEMPLO 5

[0093] Sem estar limitado por nenhuma teoria em particular, acredita-se que a presença de íon cloreto em uma solução de coloração de hematoxilina pode reduzir a taxa de formação de precipitado na solução. Os exemplos 1 a 4 foram concebidos e realizados utilizando ácido clorídrico como agente acidificante. Ele introduziu o íon cloreto nas soluções de coloração da hematoxilina e pode-se argumentar que os efeitos da inibição do precipitado podem ter sido devidos à presença do íon cloreto e não apenas aos baixos níveis de pH das soluções. Para separar os efeitos do íon cloreto e do pH baixo, os ajustes de pH para diminuir o pH de um corante de hematoxilina neste experimento foram realizados com a adição de ácido sulfúrico. Uma solução de coloração de hematoxilina foi preparada usando a seguinte fórmula mostrada na Tabela 5.

[0094] A solução foi dividida em 5 porções iguais de 200 mL cada. Os níveis de pH das 5 soluções diferentes foram ajustados com ácido sulfúrico 0,25 M, como mostrado na Tabela 6.

[0095] Uma amostra de cada solução de hematoxilina foi colocada em circuitos de tubo selados de 4 mm (30 cm de comprimento) e os tubos contendo as amostras foram colocados em um forno mantido a 60 °C por 7 dias. Os tubos foram drenados de sua solução de hematoxilina e lavados com água desionizada. Cada um dos tubos mostrou um filme de precipitado de hematoxilina, mas o nível de revestimento do precipitado foi diferente dependendo do pH da solução. Essas soluções com níveis mais altos de pH deixaram uma quantidade maior de revestimento precipitado na superfície do circuito do tubo. Isto é ilustrado na Figura 3.

[0096] O experimento do circuito de tubo foi então repetido, mas a 45 °C por 29 dias. A mesma tendência foi observada. As soluções com níveis mais altos de pH mostraram maiores quantidades de precipitação na superfície da tubulação (veja a Figura 4).

EXEMPLO 6

[0097] Após cerca de 360 dias, os níveis de pH das amostras de hematoxilina previamente ajustadas ao pH (ver Tabela 6) foram ajustadas para cerca de pH = 2,5 com uma solução tampão 1,2 M de ácido cianoacético/ cianoacetato (pH = 2,6). Veja a tabela 7.

[0098] As amostras reajustadas ao pH identificadas na Tabela 7 foram então usadas em experimentos de coloração (coloração de lâminas de 5 em 1 blocos de múltiplos tecidos (MTB)). Um controle (um lote atual e não expirado de Ventana Hematoxylin Solution, número de peça 07024282001) foi comparado com amostras ANS Rev D002 (um lote atual e não expirado) foi usado como controle e comparado com os outros quatro corantes (EXP5-A, EXP5-B, EXP5-C, EXP5-D). Os corantes mantidos abaixo de pH ~ 2,25 por 360 dias (EXP5-C e EXP5-D) mostraram apenas um mínimo ou nenhum precipitado nas lâminas.

EXEMPLO 7

[0099] Após cerca de 400 dias, os níveis de pH das amostras de hematoxilina previamente ajustadas ao pH (ver Tabela 6) foram ajustadas para cerca de pH = 2,5 com uma solução VENTANA HE 600 Bluing (tampão TRIS a 0,1 M, pH = 8-9). Veja a Tabela 8. Nenhum outro experimento foi realizado com essas soluções reajustadas ao pH. O reajuste do pH foi realizado para provar o conceito de que um reagente prontamente disponível (solução VENTANA HE 600 Bluing) poderia ser usado para reajustar o pH das soluções ácidas de hematoxilina.

ANÁLISE

[00100] As Depositantes descobriram que, mantendo o pH das soluções de coloração de hematoxilina baixo (por exemplo, um pH inferior a 2,4), a taxa de formação de precipitado pode ser significativamente reduzida. Isto foi demonstrado utilizando duas soluções diferentes de coloração de hematoxilina, usando ácido clorídrico e ácido sulfúrico como agentes acidificantes para diminuir o pH das soluções de coloração. Para trazer as soluções de coloração de hematoxilina previamente acidificadas de volta a um pH aceitável para coloração, verificou-se que uma solução de base forte (solução de hidróxido de sódio) ou soluções tamponadas de pH (solução de ácido cianoacético/ cianoacetato, solução TRIS/ H-TRIS+) foram todas eficazes.

[00101] As soluções de hematoxilina com idade superior a 1 ano apresentaram diferenças de coloração (matiz e coloração inespecífica) quando comparadas às soluções recém-preparadas. Isso não é surpreendente, pois esse efeito é comumente observado ao comparar formulações antigas e novas de coloração de hematoxilina. O que é notável é a falta de precipitado encontrado nas soluções envelhecidas quando seus níveis de pH caem durante o processo de envelhecimento.

[00102] Formulando inicialmente soluções de hematoxilina com pH baixo (pH <~ 2,4), a solução pode ser armazenada e permanecer estável por meses a fio. O reajuste do pH no momento da coloração fornece coloração normal com hematoxilina. Usando esta formulação, é possível produzir corantes de qualidade de hematoxilina a partir de soluções de coloração que não precipitam rapidamente.

[00103] Todas as patentes dos EUA, publicações de pedidos de patentes nos EUA, pedidos de patentes nos EUA, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiros e publicações não relacionadas a patentes mencionadas neste relatório descritivo e/ ou listadas na Folha de Dados do Pedido são incorporados aqui por referência, em sua totalidade. Aspectos das formas de realização podem ser modificados, se necessário, para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para fornecer ainda outras formas de realização.

[00104] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a várias formas de realização ilustrativas, deve ser entendido que inúmeras outras modificações e formas de realização podem ser planejadas por aqueles versados na técnica que se enquadram no espírito e no escopo dos princípios desta invenção. Mais particularmente, variações e modificações razoáveis são possíveis nas partes componentes e/ ou arranjos do arranjo de combinação de matéria dentro do escopo da invenção revelada anteriormente, nos desenhos e nas reivindicações anexas sem se afastar do espírito da invenção. Além de variações e modificações nas partes e/ ou disposições dos componentes, usos alternativos também serão evidentes para os técnicos no assunto.

Claims

1. FORMULAÇÃO DE HEMATOXILINA ESTABILIZADA, caracterizada por compreender corante de hematoxilina e um ácido em uma quantidade que varia de 0,2% a 4% em volume total da solução de hematoxilina, em que o ácido é ácido clorídrico ou ácido sulfúrico e em que a solução de hematoxilina tem um pH inferior a 2,4.

2. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pH ser inferior a 2,3, inferior a 2,2 ou inferior a 2,1.

3. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo pH variar entre 2,1 e 2,2.

4. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender ainda um mordente e um oxidante.

5. FORMULAÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender ainda um agente prolongador de vida útil.

6. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo agente prolongador de vida útil ser um poliol, opcionalmente em que o poliol é selecionado a partir do grupo que consiste em propileno glicol, etileno glicol, e misturas dos mesmos.

7. MÉTODO PARA CORAR UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, caracterizado por compreender aumentar o pH de uma alíquota da formulação de hematoxilina estabilizada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para fornecer uma solução de coloração de hematoxilina tendo um pH variando de 2,4 a 2,6 e colocando a amostra biológica em contato com a solução de coloração de hematoxilina tendo o pH variando de 2,4 a 2,6.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo pH da alíquota da formulação de hematoxilina estabilizada ser aumentado adicionando uma solução de reajuste compreendendo uma base forte ou um tampão.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela base forte ser selecionada a partir do grupo que consiste em hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de lítio e amônia, ou em que o tampão tem um pKa variando de 1,5 a 3,5, ou em que a solução de reajuste compreende um aditivo selecionado a partir do grupo que consiste em um agente prolongador de vida útil, um oxidante e um mordente.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo pH da formulação de hematoxilina estabilizada ser aumentado antes do contato da amostra biológica com a solução de coloração de hematoxilina.

11. KIT, caracterizado por compreender um primeiro componente e um segundo componente, o primeiro componente compreendendo uma formulação de hematoxilina estabilizada que compreende um corante de hematoxilina e um ácido em uma quantidade que varia de 0,1% a 10% em volume total da formulação de hematoxilina estabilizada, em que o ácido é ácido clorídrico ou ácido sulfúrico e em que a formulação de hematoxilina estabilizada tem um pH inferior a 2,4; e o segundo componente compreendendo uma base forte ou um tampão, o segundo componente fornecido em uma quantidade relativa ao primeiro componente de modo que quando o primeiro e o segundo componentes são misturados, o pH da solução de hematoxilina aumenta para um valor maior que 2,4.

12. KIT, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo segundo componente ser fornecido em uma quantidade em relação ao primeiro componente de modo que, quando o primeiro e o segundo componentes são misturados, o pH da solução de hematoxilina aumenta para um valor maior que 2,5, ou em que o segundo componente é fornecido em uma quantidade em relação ao primeiro componente de modo que, quando o primeiro e o segundo componentes são misturados, o pH da solução de hematoxilina varia entre 2,45 e 2,54, ou em que o segundo componente é fornecido em uma quantidade em relação ao primeiro componente de modo que, quando o primeiro e o segundo componentes são misturados, o pH da solução de hematoxilina varia entre 2,5 e 2,6.

13. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado pelo primeiro componente compreender ainda um mordente e um oxidante.

14. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo primeiro componente compreender ainda um agente prolongador de vida útil.

15. KIT, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo agente prolongador de vida útil ser um poliol, opcionalmente em que o poliol é selecionado a partir do grupo que consiste em propileno glicol, etileno glicol e misturas dos mesmos.

16. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo segundo componente compreender uma base forte selecionada a partir do grupo que consiste em hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e hidróxido de lítio, ou em que o segundo componente compreende um tampão selecionado a partir do grupo que consiste em um cianoacetato, fumarato e sulfato.

17. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado por compreender ainda um terceiro componente, o terceiro componente compreendendo um corante de contraste.