JP5921386B2

JP5921386B2 - 電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法

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Publication number: JP5921386B2
Application number: JP2012186713A
Authority: JP
Inventors: 雅道中越; 直樹細木
Original assignee: Jeol Ltd
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Priority date: 2012-08-27
Filing date: 2012-08-27
Publication date: 2016-05-24
Anticipated expiration: 2032-08-27
Also published as: JP2014044119A

Description

本発明は、電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法に関する。

生体試料の微細な構造等を観察する装置として、光学顕微鏡や電子顕微鏡が知られている。特に、電子顕微鏡は光学顕微鏡と比べて分解能が高いため、より微細な構造を観察する際に有効である。しかしながら、生体試料は、炭素、酸素、窒素、水素などの軽元素を含んで構成されているため、電子線を十分に散乱させることができない。したがって、電子顕微鏡で観察しても、電子顕微鏡像に十分なコントラストが得られない場合がある。そのため、電子顕微鏡で生体試料を観察する際には、一般的に、試料を重金属等で電子染色する。試料を電子染色することにより、電子線の散乱を促し、電子顕微鏡像にコントラストをつけることができる。

従来、電子染色剤（電子顕微鏡観察用染色剤）として、酢酸ウラニルが用いられていた。酢酸ウラニルは、高い染色効果を有しており、酢酸ウラニルで生体試料を染色することにより、高いコントラストの電子顕微鏡像を得ることができる。

また、特許文献１には、電子染色剤として、白金ブルー（［Ｐｔ_４（ＮＨ_３）_８（Ｃ_６Ｈ_１３Ｏ_５）_４］^＋５）が開示されている。

特開２００８−２８６７２９号公報

上述したように、酢酸ウラニルは高い染色効果を有しているが、放射性物質のため、入手や使用に厳しい規制がある。そのため、酢酸ウラニルに代替する電子染色剤が求められている。上述した特許文献１に開示された白金ブルーは、酢酸ウラニルに代替する電子染色剤の１つとして知られている。

白金ブルーは、時間が経過すると変質する場合があるため、使用にあわせて合成することが望ましい。しかしながら、白金ブルーの合成には、通常５〜７日程度の時間が必要であり、かつ高度な化学的知識を必要とする。したがって、白金ブルーを用いた電子染色では、白金ブルーの合成に時間や手間がかかってしまい、簡便に電子染色を行うことができないという問題があった。

本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、簡便に電子染色を行うことができ、かつ高い染色効果を有する電子顕微鏡観察用染色剤および電子顕微鏡観察用試料の染色方法を提供することができる。

（１）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤は、
四酸化オスミウムによる後固定を行った試料に対して用いられる電子顕微鏡観察用染色剤であって、
三酢酸イッテルビウムを含有し、
ｐＨが、５以下である。

このような電子顕微鏡観察用染色剤によれば、高い染色効果を有することができる。さらに、三酢酸イッテルビウムは、合成等の必要がなく、例えば、水に溶解させてｐＨを調整するだけで電子染色剤として用いることができる。したがって、簡便に電子染色を行うことができる。

（２）本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤において、
ｐＨが、２以上４以下であってもよい。

このような電子顕微鏡用染色剤によれば、高い染色効果を有することができる。

（３）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法は、
本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤に試料を接触させる工程を含む。

このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法によれば、試料を、簡便かつ良好に電子染色することができる。

（４）本発明に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法において、
前記電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程をさらに含んでいてもよい。

このような電子顕微鏡観察用試料の染色方法によれば、染色効果を高めることができる。

実施例１に係る染色剤（２質量％の三酢酸イッテルビウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。２質量％の酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。２質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストの値を示すグラフ。実施例２に係る染色剤（２質量％の三酢酸サマリウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。２質量％の三酢酸サマリウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストの値を示すグラフ。実施例３に係る染色剤（２質量％の三酢酸ガドリニウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。２質量％の三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストの値を示すグラフ。実施例４に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。三酢酸イッテルビウム水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。実施例５に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。三酢酸サマリウム水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。実施例６に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。三酢酸ガドリニウム水溶液とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。

１．第１実施形態
１．１．電子顕微鏡観察用染色剤
まず、第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤について説明する。

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤（以下単に「染色剤」ともいう）は、三酢酸イッテルビウム（Ｙｂ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_３）、三酢酸サマリウム（Ｓｍ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_３）、および三酢酸ガドリニウム（Ｃｄ（Ｇｄ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_３）からなる群より選択される少なくとも１種の酢酸塩を含有し、ｐＨが５以下である。

ここで、電子顕微鏡観察用染色剤とは、電子顕微鏡観察の対象となる試料を染色するための染色剤（電子染色剤）をいう。なお、染色とは、いわゆる電子染色をいい、試料の特定の部位に電子の散乱を促す物質（重金属等）を吸着または結合させることをいう。電子顕微鏡観察用染色剤を用いて試料を染色することにより、電子顕微鏡像にコントラストをつけることができる。

また、染色された試料の観察に用いられる電子顕微鏡としては、例えば、走査電子顕微鏡（ＳｃａｎｎｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＥＭ）、透過電子顕微鏡（ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）、走査透過電子顕微鏡（ＳｃａｎｎｉｎｇＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＳＴＥＭ）などが挙げられる。

また、染色剤が三酢酸イッテルビウムを含有するとは、三酢酸イッテルビウムの水和物を含有する場合も含むものとする。三酢酸イッテルビウムの水和物としては、例えば、酢酸イッテルビウム四水和物（Ｙｔｔｅｒｂｉｕｍ（III）ａｃｅｔａｔｅｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ，Ｙｂ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_３・４Ｈ_２Ｏ）が挙げられる。また、染色剤が三酢酸サマリウムを含有するとは、三酢酸サマリウムの水和物を含有する場合も含むものとする。三酢酸サマリウムの水和物としては、例えば、酢酸サマリウム四水和物（Ｓａｍａｒｉｕｍ（III）ａｃｅｔａｔｅｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ，Ｓｍ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_３・４Ｈ_２Ｏ）が挙げられる。また、電子顕微鏡観察用染色剤が三酢酸ガドリニウムを含有するとは、三酢酸ガドリニウムの水和物を含有する場合も含むものとする。三酢酸ガドリニウムの水和物としては、例えば、酢酸ガドリニウム四水和物（Ｇａｄｏｒｉｎｉ
ｕｍ（III）ａｃｅｔａｔｅｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ，Ｇｄ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_３・４Ｈ_２Ｏ）が挙げられる。

本実施形態に係る染色剤は、ｐＨが５以下である。これにより、高い染色効果を有することができる。これは、ｐＨを５以下にすることで、中性の染色剤と比べて脂溶性が増し、試料内により良く染色剤が浸透すると考えられるためである。また、本実施形態に係る染色剤のｐＨは２以上４以下であることがより好ましい。例えばｐＨが２より小さくなると、染色剤が試料や、試料を支持する支持膜等にダメージを与える場合があるためである。

本実施形態に係る染色剤は、例えば、三酢酸イッテルビウム水溶液に酢酸等を加えてｐＨを５以下に調整したものである。また、本実施形態に係る染色剤は、例えば、三酢酸サマリウム水溶液に酢酸等を加えてｐＨを５以下に調整したものである。また、本実施形態に係る染色剤は、例えば、三酢酸ガドリニウム水溶液に酢酸等を加えてｐＨを５以下に調整したものである。なお、三酢酸イッテルビウム水溶液、三酢酸サマリウム水溶液、三酢酸ガドリニウム水溶液の濃度は特に限定されず、例えば、１〜１０質量％である。

本実施形態に係る染色剤は、三酢酸イッテルビウム、三酢酸サマリウム、および三酢酸ガドリニウム三酢酸イッテルビウムからなる群より選択される少なくとも１種の酢酸塩に加えて、さらに、その他の物質を含有していてもよい。

本実施形態に係る染色剤は、例えば、タンパク質などの生体高分子を含んで構成される生体試料、ウイルス、リポソーム等の微粒子、炭素、酸素、窒素、水素などの軽元素を含んで構成される試料等を染色することができる。

１．２．電子顕微鏡観察用試料の作製方法
次に、第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法について説明する。本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法を含む。以下、本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法を、生体試料に適用した場合について説明する。

まず、生体試料をエポキシ樹脂に包埋する。具体的には、まず、灌流固定または浸漬固定した生体試料を切り出す。そして、切り出された生体試料を、カコジル酸緩衝１〜４％パラホルムアルデヒドと１〜４％グルタールアルデヒドとの混合液に浸漬し、前固定する。なお、前固定は、カコジル酸緩衝１〜４％パラホルムアルデヒドだけで行ってもよいし、１〜４％グルタールアルデヒドだけで行ってもよい。次に、前固定された生体試料を、カコジル酸緩衝液で洗浄し、１〜２％四酸化オスミウムで後固定する。そして、後固定された生体試料を上昇エタノール系列で脱水した後、エポキシ樹脂に包埋する。このようにして、生体試料をエポキシ樹脂に包埋することができる。なお、生体試料を包埋するための材料はエポキシ樹脂に限定されず、例えば、メタクリル酸樹脂、ポリエステル樹脂、パラフィン等を用いてもよい。

次に、エポキシ樹脂に包埋された生体試料を薄片化する。薄片化は、例えば、ミクロトーム（ウルトラミクロトーム）を用いて行われる。

次に、薄片化された生体試料を染色する。染色は、本実施形態に係る染色剤を薄片化された生体試料に接触させることにより行われる。例えば、染色は、本実施形態に係る染色剤に、薄片化された生体試料を浸漬させることにより行われる。ここで、電子顕微鏡観察用染色剤の温度は、例えば、５℃以上５０℃以下である。また、浸漬時間は、例えば、１分以上１０時間以下である。その後、染色された生体試料を純水等で洗浄する。

以上の工程により、電子顕微鏡観察用試料を作製することができる。

１．３．実施例
以下、実施例を挙げて本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。

１．３．１実施例１
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸イッテルビウムを含有し、ｐＨが３である染色剤で生体試料を染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、ほうれん草の葉を用いた。本実施例では、まず、浸漬固定した生体試料（ほうれん草の葉）を切り出し、カコジル酸緩衝２％パラホルムアルデヒドと２％グルタールアルデヒドとの混合液に浸漬し、前固定した。次に、前固定された生体試料を、カコジル酸緩衝液で洗浄し、２％四酸化オスミウムで後固定した。そして、上昇エタノール系列で脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。

次に、エポキシ樹脂に包埋された生体試料を薄片化した。薄片化は、ウルトラミクロトームを用いて行った。次に、薄片化された生体試料を、本実施例に係る染色剤に室温で２０分間浸漬した。その後、生体試料を純水で洗浄した。なお、ここでは、本実施例に係る染色剤として２つの染色剤を準備し、各染色剤でそれぞれ生体試料を染色して２種類の電子顕微鏡観察用試料を作製した。一方の染色剤は、三酢酸イッテルビウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を蒸留水で溶解して２質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液を作製し、この水溶液に酢酸を加えてｐＨを３に調整したものである。他方の染色剤は、三酢酸イッテルビウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を蒸留水で溶解して１０質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液を作製し、この水溶液に酢酸を加えてｐＨを３に調整したものである。このようにして、２種類の電子顕微鏡観察用試料を作製した。

なお、比較例として、２質量％の酢酸ウラニルで染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。試料作製方法は、染色剤として、２質量％の酢酸ウラニルを用いた点を除いて、上述した試料作製方法と同様である。さらに、比較例として、２質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液で染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料と、１０質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液で染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。試料作製方法は、染色剤として、２質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液と、１０質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液を用いた点を除いて、上述した試料作製方法と同様である。なお、三酢酸イッテルビウム水溶液は、中性である。

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図１は、実施例１に係る染色剤（２質量％の三酢酸イッテルビウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。図２は、２質量％の酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。図３は、２質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。なお、図１〜図３に示すスケールバーは、２μｍに相当する。

図１に示すように、実施例１に係る染色剤（２質量％の三酢酸イッテルビウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像では、核、葉緑体、細胞壁等が、高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図１に示す透過電子顕微鏡像では、図２に示す酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や図３に示す三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像よりも、高いコントラストが得ら
れた。

（３）コントラストの定量的な比較
次に、各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストの定量的な比較を行った。ここでは、実施例１に係る染色剤（１０質量％の三酢酸イッテルビウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、２質量％の酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、１０質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、を比較した。

コントラストの比較は、倍率、照射条件を一定にして各染色剤で染色された試料を撮影し、撮影した画像のコントラストを、真空中（試料や支持膜がない箇所）で撮影した画像のコントラストを基準として規格化することで行った。規格化は、下記式（１）を用いて行った。

コントラスト（％）＝（Ｉ_ｖａｃ−Ｉ）／Ｉ_ｖａｃ×１００
ただし、Ｉ_ｖａｃは真空中の電子線透過量であり、真空中を撮影した画像全体の強度の平均値から算出した。Ｉは試料部分の電子線透過量であり、染色された試料を撮影した画像全体の強度の平均値から算出した。

図４は、各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストを示すグラフである。図４に示す各染色剤におけるコントラストの値は、異なる視野で撮影された５枚の画像の平均値である。

図４に示すように、実施例１に係る染色剤（１０質量％の三酢酸イッテルビウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像は、２質量％の酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や、１０質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と比べて、高いコントラストを有していることがわかった。したがって、実施例１に係る染色剤は、酢酸ウラニルや、三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）と比べて、高い染色効果を有していることがわかった。

１．３．２．実施例２
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸サマリウムを含有し、ｐＨが３である染色剤で生体試料を染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、ほうれん草の葉を用いた。本実施例に係る試料作製方法は、染色剤が異なる点を除いて、実施例１の試料作製方法と同様である。本実施例に係る染色剤は、三酢酸サマリウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を蒸留水で溶解して２質量％の三酢酸サマリウム水溶液を作製し、この水溶液に酢酸を加えてｐＨを３に調整したものである。

なお、比較例として、２質量％の三酢酸サマリウム水溶液で染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。試料作製方法は、染色剤として、２質量％の三酢酸サマリウム水溶液を用いた点を除いて、実施例１の試料作製方法と同様である。なお、三酢酸サマリウム水溶液は、中性である。

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図５は、実施例２に係る染色剤（２質量％の三酢酸サマリウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。図６は、２質量％の三酢酸サマリウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。なお、図５および図６に示すスケールバーは、２μｍに相当する。

図５に示すように、実施例２に係る染色剤（２質量％の三酢酸サマリウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像では、核、葉緑体、細胞壁等が、高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図５に示す透過電子顕微鏡像では、図２に示す酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や、図６に示す三酢酸サマリウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像よりも、高いコントラストが得られた。

（３）コントラストの定量的な比較
次に、各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストの定量的な比較を行った。ここでは、実施例２に係る染色剤（２質量％の三酢酸サマリウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、２質量％の酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、２質量％の三酢酸サマリウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、を比較した。比較方法は、上述した実施例１と同様である。

図７は、各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストを示すグラフである。

図７に示すように、実施例２に係る染色剤（２質量％の三酢酸サマリウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像は、酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や、三酢酸サマリウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と比べて、高いコントラストを有していることがわかった。したがって、実施例２に係る染色剤は、酢酸ウラニルや、三酢酸サマリウム水溶液（中性）と比べて、高い染色効果を有していることがわかった。

１．３．３．実施例３
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸ガドリニウムを含有し、ｐＨが３である染色剤で生体試料を染色して電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、ほうれん草の葉を用いた。本実施例に係る試料作製方法は、染色剤が異なる点を除いて、実施例１の試料作製方法と同様である。本実施例に係る染色剤は、三酢酸ガドリニウム四水和物（和光純薬工業株式会社製）を蒸留水で溶解して２質量％の三酢酸ガドリニウム水溶液を作製し、この水溶液に酢酸を加えてｐＨを３に調整したものである。

なお、比較例として、２質量％の三酢酸ガドリウム水溶液で染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。試料作製方法は、染色剤として、２質量％の三酢酸ガドリニウム水溶液を用いた点を除いて、実施例１の試料作製方法と同様である。なお、三酢酸ガドリニウム水溶液は、中性である。

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図８は、実施例３に係る染色剤（２質量％の三酢酸ガドリニウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。図９は、２質量％の三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。なお、図８および図９に示すスケールバーは、２μｍに相当する。

図８に示すように、実施例３に係る染色剤（２質量％の三酢酸ガドリニウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像では、核、葉緑体、細胞壁等が、高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図８に示す透過電子顕微鏡像では、図２に示す酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や、図９に示す三酢酸ガドリニウム水溶
液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像よりも、高いコントラストが得られた。

（３）コントラストの定量的な比較
次に、各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストの定量的な比較を行った。ここでは、実施例３に係る染色剤（２質量％の三酢酸ガドリニウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、２質量％の酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、２質量％の三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と、を比較した。比較方法は、上述した実施例１と同様である。

図１０は、各染色剤で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像のコントラストを示すグラフである。

図１０に示すように、実施例３に係る染色剤（２質量％の三酢酸ガドリニウム、ｐＨ＝３）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像は、酢酸ウラニルで染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や、三酢酸ガドリウム水溶液（中性）で染色された生体試料の透過電子顕微鏡像と比べて、高いコントラストを有していることがわかった。したがって、実施例３に係る染色剤は、酢酸ウラニルや、三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）と比べて、高い染色効果を有していることがわかった。

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤によれば、三酢酸イッテルビウム、三酢酸サマリウム、および三酢酸ガドリニウムからなる群より選択される少なくとも１種の酢酸塩を含有し、ｐＨが５以下である。これにより、高い染色効果を有することができる。さらに、三酢酸イッテルビウム、三酢酸サマリウム、および三酢酸ガドリニウムは、合成等の必要がなく、例えば、水等に溶解させてｐＨを調整することで電子染色剤として用いることができる。したがって、簡便に電子染色を行うことができる。

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の染色方法によれば、上述したように、簡便に電子染色を行うことができ、かつ高い染色効果を有する本実施形態に係る電子顕微鏡観察用染色剤を用いて染色するため、試料を、簡便かつ良好に染色することができる。

２．第２実施形態
２．１．電子顕微鏡観察用試料の作製方法
次に、第２実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法について説明する。

第２実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法は、上述した第１実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製工程に加えて、さらに、本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程を含む。すなわち、第２実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法では、試料を、本発明に係る電子顕微鏡観察用染色液と鉛化合物を含有する染色液とによって二重染色する。

鉛化合物としては、例えば、クエン酸鉛が挙げられる。このクエン酸鉛を含有する染色液（クエン酸鉛染色液）としては、例えば、レイノルド（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）法で処方されたものが挙げられる。クエン酸鉛染色液の温度は、例えば、５℃以上５０℃以下である。また、浸漬時間は、例えば、１分以上１０時間以下程度である。クエン酸鉛染色液に浸漬された試料は、純水等によって洗浄される。また、鉛化合物として、例えば、硝酸鉛を用いてもよい。

２．２．実施例
以下、実施例を挙げて本実施形態をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。

２．２．１．実施例４
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸イッテルビウムを含有し、ｐＨが３である染色剤とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、ほうれん草の葉を用いた。本実施例では、上述した実施例１と同様の工程で、生体試料を実施例１に係る染色剤（２質量％の三酢酸イッテルビウム、ｐＨ＝３）で染色した後、染色された生体試料をレイノルドのクエン酸鉛染色液に室温で１０分間浸漬し、その後、純水で洗浄した。以上の工程で、生体試料を二重染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

また、比較例として、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。試料作製方法は、染色剤として、酢酸ウラニルを用いた点を除いて、上述した試料作製方法と同様である。さらに、比較例として、２質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。試料作製方法は、染色剤として、２質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）を用いた点を除いて、上述した試料作製方法と同様である。

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図１１は、実施例４に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。図１２は、２質量％の酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。図１３は、２質量％の三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。なお、図１１〜図１３に示すスケールバーは、２μｍに相当する。

図１１に示すように、実施例４に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像では、核、葉緑体、細胞壁等が、高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図１１に示す透過電子顕微鏡像は、図１２に示す酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や、図１３に示す三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像よりも、高いコントラストが得られた。したがって、実施例４に係る染色方法によれば、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された場合や、三酢酸イッテルビウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された場合と比べて、高い染色効果を有していることがわかった。

２．２．２．実施例５
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸サマリウムを含有し、ｐＨが３である染色剤とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、ほうれん草の葉を用いた。本実施例では、上述した実施例２と同様の工程で、生体試料を染色した後、染色された生体試料をレイノルドのクエン酸鉛染色液に室温で１０分間浸漬し、その後、純水で洗浄した。以上の工程で、生体試料を二重染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

また、比較例として、２質量％の三酢酸サマリウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。試
料作製方法は、染色剤として、２質量％の三酢酸サマリウム水溶液（中性）を用いた点を除いて、上述した試料作製方法と同様である。

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図１４は、実施例５に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。図１５は、２質量％の三酢酸サマリウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。なお、図１４および図１５に示すスケールバーは、２μｍに相当する。

図１４に示すように、実施例５に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像では、核、葉緑体、細胞壁等が、高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図１４に示す透過電子顕微鏡像では、図１２に示す酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や、図１５に示す三酢酸サマリウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像よりも、高いコントラストが得られた。したがって、実施例５に係る染色方法によれば、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された場合や、三酢酸サマリウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された場合と比べて、高い染色効果を有していることがわかった。

２．２．３．実施例６
（１）試料作製
本実施例では、三酢酸ガドリニウムを含有し、ｐＨが３である染色剤とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の電子顕微鏡観察用試料を作製した。生体試料としては、ほうれん草の葉を用いた。本実施例では、上述した実施例３と同様の工程で、生体試料を染色した後、染色された生体試料をレイノルドのクエン酸鉛染色液に室温で１０分間浸漬し、その後、純水で洗浄した。以上の工程で、生体試料を二重染色し、電子顕微鏡観察用試料を作製した。

また、比較例として、２質量％の三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料（ほうれん草の葉）の電子顕微鏡観察用試料を作製した。試料作製方法は、染色剤として、２質量％の三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）を用いた点を除いて、上述した試料作製方法と同様である。

（２）観察結果
このようにして作製された電子顕微鏡観察用試料を、透過電子顕微鏡で観察した。図１６は、実施例６に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。図１７は、２質量％の三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像である。なお、図１６および図１７に示すスケールバーは、２μｍに相当する。

図１６に示すように、実施例６に係る染色方法で二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像では、核、葉緑体、細胞壁等が、高いコントラストで鮮明に観察できた。また、図１６に示す透過電子顕微鏡像では、図１２に示す酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像や、図１７に示す三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された生体試料の透過電子顕微鏡像よりも、高いコントラストが得られた。したがって、実施例６に係る染色方法によれば、酢酸ウラニルとクエン酸鉛染色液とで二重染色された場合や、三酢酸ガドリニウム水溶液（中性）とクエン酸鉛染色液とで二重染色された場合と比べて、高い染色効果を有していることがわかった。

本実施形態に係る電子顕微鏡観察用試料の作製方法によれば、三酢酸イッテルビウム、三酢酸サマリウム、および三酢酸ガドリウムからなる群より選択される少なくとも１種の酢酸塩を含有し、ｐＨが５以下である染色剤と、鉛染色液と、で二重染色を行うことにより、より染色効果を高めることができる。

なお、本発明は上述した実施形態に限定されず、本発明の要旨の範囲内で種々の変形実施が可能である。

例えば、上述した実施形態では、本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤をポジティブ染色を行うための染色剤として用いたが、本発明に係る電子顕微鏡観察用染色剤をネガティブ染色を行うための染色剤として用いてもよい。

なお、本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

Claims

四酸化オスミウムによる後固定を行った試料に対して用いられる電子顕微鏡観察用染色剤であって、
三酢酸イッテルビウムを含有し、
ｐＨが、５以下である、電子顕微鏡観察用染色剤。
請求項１において、
ｐＨが、２以上４以下である、電子顕微鏡観察用染色剤。
請求項１または２に記載の電子顕微鏡観察用染色剤に試料を接触させる工程を含む、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。
請求項３において、
前記電子顕微鏡観察用染色剤に接触した試料を、鉛化合物を含有する染色液に接触させる工程をさらに含む、電子顕微鏡観察用試料の染色方法。