JP6688057B2 - グラム染色用後染色試液及びグラム染色方法 - Google Patents
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Description
染色性の違いは細菌壁の構造の違いによる。グラム陽性菌とグラム陰性菌の間に見られる細胞壁の大きな違いは、この両者が生物学的に大きく違うことを反映しており、グラム染色は細菌の分類上、重要な手法といえる。
これらの染色が困難な菌を染色法を向上させる手段として、クリスタルバイオレット処理後に5%炭酸水素ナトリウムを添加する方法が開発された(バーミーの変法)。しかし、この方法では、染色のステップが多くなる、炭酸水素ナトリウムは長期保存で効果が低下するため頻回調製が必要である、染色液と炭酸水素ナトリウムの混合液は短期間に化学変化を起こして沈殿するので混合できない等の問題がある。
従って、本発明の課題は、フクシンによる後染色性を増強し、Helicobacter spp.などの菌も良好に染色できる新たなグラム染色法を提供することにある。
4.5〜7.5にする塩基を含有する試液を用いれば、後染色性が顕著に向上し、Helicobacter spp.などの菌も良好に染色できることを見出した。また、これにキレート剤を加えれば、後染色試液の長期保存安定性も向上することを見出し、本発明を完成した。
〔2〕さらに、(D)キレート剤を含有する〔1〕記載のグラム染色用後染色試液。
〔3〕成分(A)が、塩基性フクシンである〔1〕又は〔2〕記載のグラム染色用後染色試液。
〔4〕(D)キレート剤が、アミノポリカルボン酸、芳香族又は脂肪族カルボン酸、ホスホン酸及びヒドロキシカルボン酸から選ばれるキレート剤である〔2〕又は〔3〕記載のグラム染色用後染色試液。
〔5〕(1)試料をクリスタルバイオレット又はビクトリアブルーを含有する前染色試液で処理する工程、(2)ヨウ素又はピクリン酸を含有する媒染試液で処理する工程、(3)極性有機溶媒を含有する脱色試液で処理する工程、並びに(4)〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のグラム染色用後染色試液で処理する工程、を含むことを特徴とするグラム染色方法。
〔6〕工程(1)と工程(2)の間に、炭酸塩水溶液又は炭酸水素塩水溶液で処理する工程を含む〔5〕記載のグラム染色方法。
spp.などの菌も明確に染色できるため、広範囲のグラム陽性菌とグラム陰性菌との分割が可能である。また、キレート剤を含有する本発明の後染色剤は、長期保存しても沈殿等が生じることがなく、キット試薬として特に有用である。
キレート剤としては、金属イオンをキレートする能力を有する化合物であればよく、例えばアミノポリカルボン酸、芳香族又は脂肪族カルボン酸、アミノ酸、エーテルポリカルボン酸、ホスホン酸、ヒドロキシカルボン酸、リン酸系等が挙げられる。このうち、アミノポリカルボン酸、芳香族又は脂肪族カルボン酸、ホスホン酸、ヒドロキシカルボン酸がより好ましい。
芳香族又は脂肪族カルボン酸としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタール酸、アジピン酸、イタコン酸、アコニット酸、ピルビン酸、サリチル酸、アセチルサリチル酸、ヒドロキシ安息香酸、アミノ安息香酸、フタル酸、トリメリット酸、没食子酸、及びこれらの塩が挙げられる。
ホスホン酸としては、イミジノホスホン酸、アルキルジホスホン酸、1−ヒドロキシエタン−1,1−ジホスホン酸、及びこれらの塩が挙げられる。ヒドロキシカルボン酸としてはクエン酸、グルコン酸、酒石酸及びこれらの塩が挙げられる。
以下、各工程(1)〜(4)毎に説明する。
炭酸塩水溶液又は炭酸水素塩水溶液による処理は、試料に、室温でこれらの水溶液を滴下すればよい。
ヨウ素を含有する媒染試液としては、ヨウ素−ヨウ化カリウム水溶液、ヨウ素−水酸化ナトリウム水溶液等が挙げられる。媒染試液中のヨウ素濃度は、0.1〜0.3質量%が好ましく、0.15〜0.25質量%がより好ましい。
ピクリン酸を含有する媒染試液としては、ピクリン酸−エタノール液等が挙げられる。媒染試液中のピクリン酸濃度は、1〜2質量%が好まししい。
極性有機溶媒としては、アルコール、ケトン、これらの混合溶媒が挙げられる。アルコールとしては、炭素数1〜4のアルコール、例えばエタノール、プロパノール、イソプロパノール等が挙げられる。ケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。混合溶媒としてはエタノール−アセトン混合溶液が挙げられる。また、エタノールやアセトンの溶液は、80%以上の水溶液であってもよい。
Campylobacter spp.、Legionella spp.、Haemophilus spp.、嫌気性菌等の菌も明確に染色できる。
(1)試料の調製
グラム染色で難染色性菌といわれるHelicobacter pylori(純培養菌)1菌株を用いてスライドガラスに塗抹し、自然乾燥させた後、火炎固定した塗抹標本を試料とした。
(前染色試液)
フェイバーG「ニッスイ」染色液A(0.2%ビクトリアブルー溶液)(日水製薬製品)を用いた。
フェイバーG「ニッスイ」脱色液(2%ピクリン酸エタノール溶液)(日水製薬製品)を用いた。
表1に示す試液を用いた。
1)前染色試液を試料上に満載し、1分間染色後、流水で穏やかに水洗浄した。
2)媒染、脱色試液を試料上に満載し、1分間反応後、流水で穏やかに水洗浄した。
3)後染色試液を試料上に満載し、1分間染色後、流水で穏やかに水洗浄した。
4)試料を自然乾燥後、1000倍の倍率で、鏡検した。
染色結果を図1〜図2に示す。
Helicobacter pyloriの示す、特徴的ならせん状の形態が明瞭に確認できた。
実施例1の後染色試液において、pH調整剤(HEPES)を変更した以外は、同様の操作により、Helicobacter pyloriのグラム染色を行った。その結果を表2に示す。
さらに、キレート剤の添加により、後染色試液が4ヶ月安定であり、沈殿等が発生しなかった。
実施例1の後染色試液において、フクシン濃度を変化させて、Helicobacter pyloriの染色性を検討した。その結果、表3に示すようにフクシン濃度は0.005〜0.2質量%の範囲で染色性が良好であった。
実施例1の後染色試液において、エタノール濃度を変化させて、Helicobacter pyloriの染色性を検討した。その結果、表4に示すように、エタノール濃度10〜40質量%で良好な染色性が得られた。
実施例1の後染色試液において、キレート剤の種類及び濃度を変化させて、Helicobacter pyloriの染色性を検討した。その結果、表5に示すようにキレート剤の種類によらず、良好な染色性が得られた。
Claims (6)
- (A)塩基性フクシン 0.005〜0.2質量%、(B)炭素数1〜5のアルコール
5〜40質量%、及び(C)pHを4.5〜7.5にする緩衝剤を含有するグラム染色
用後染色試液。 - (C)緩衝剤が、pHを5.0〜7.3にする緩衝剤である請求項1記載のグラム染色用後染色試液。
- さらに、(D)キレート剤を含有する請求項1又は2記載のグラム染色用後染色試液。
- (D)キレート剤が、アミノポリカルボン酸、芳香族又は脂肪族カルボン酸、ホスホン酸及びヒドロキシカルボン酸から選ばれるキレート剤である請求項3記載のグラム染色用後染色試液。
- (1)試料をクリスタルバイオレット又はビクトリアブルーを含有する前染色試液で処理する工程、(2)ヨウ素又はピクリン酸を含有する媒染試液で処理する工程、(3)極性有機溶媒を含有する脱色試液で処理する工程、並びに(4)請求項1〜4のいずれか1項記載のグラム染色用後染色試液で処理する工程、を含むことを特徴とするグラム染色方法。
- 工程(1)と工程(2)の間に、炭酸塩水溶液又は炭酸水素塩水溶液で処理する工程を含む請求項5記載のグラム染色方法。
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