JPH04234998A - 蛍光基質液の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は蛍光基質液の安定化法に
関する。より詳細には、臨床検査などの分野で用いられ
る酵素免疫測定法において、標識酵素として用いられる
過酸化酵素の蛍光基質である３−（４−ヒドロキシフェ
ニル）プロピオン酸の安定化法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査などの分野では、生体試料中の
微量成分（例えば、蛋白質、酵素、脂質、薬物など）の
測定法（定量法）として、抗原抗体反応を利用した免疫
学的測定法（例えば、酵素免疫測定法、放射免疫測定法
、赤血球凝集反応試験法など）が汎用されている。これ
らの免疫学的測定法において、放射性物質を用いない酵
素免疫測定法（以下、ＥＩＡという）は取扱が容易なの
で一般の検査室で広く利用されており、中でも、西洋ワ
サビパーオキシダーゼ、ラクトパーオキシダーゼなどの
過酸化酵素（以下、ＰＯＤという）はＥＩＡの標識酵素
としてよく利用されている。標識酵素としてＰＯＤを用
いるＥＩＡにおいては、発色試薬としてｏ−フェニレン
ジアミンを用いる方法が一般的であるが放射免疫測定法
に比べて感度が低いことが指摘されている。そのため、
高感度で広い測定範囲の測定が可能なＥＩＡが求められ
ており、その解決法のひとつとして反応指示系として蛍
光性物質を用いる蛍光法が知られている。ＰＯＤの蛍光
基質としては４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−
ヒドロキシフェニル）プロピオン酸及びそれらの塩など
が用いられているが、３−（４−ヒドロキシフェニル）
プロピオン酸（以下、ＨＰＰＡという）の方が高感度化
により有利であり、通常ＨＰＰＡが使用されている。

【０００３】上記のＨＰＰＡは、溶液状態においては、
溶液中の酸素や自己酸化によって縮合し、蛍光物質へと
変化する。また、ＨＰＰＡ溶液中への金属イオン（特に
２価の銅イオン）等の混入によっても酸化縮合は容易に
起こる。このようなＨＰＰＡの酸化縮合による蛍光物質
への変化は、測定時において試薬ブランクの上昇となっ
て現れ、高感度な測定の妨げとなる。このＨＰＰＡの酸
化縮合は、ＨＰＰＡとＨ２Ｏ２が共存している溶液にお
いては更に容易に起り、ブランクの著しい上昇をもたら
し測定感度は低下する。この為、測定試薬としてＨＰＰ
Ａ液を用いるときには、ＨＰＰＡとＨ２Ｏ２を別々の溶
液として調製し、使用時に２段階の添加により反応を開
始させていた。しかも、ＨＰＰＡ液は使用時に毎回調製
されるか、又は調製後１〜２週間以内の冷蔵保存された
ＨＰＰＡ液を使用する必要がある。また、長期に亘りＨ
ＰＰＡ液を使用するときは、小分けし凍結保存したもの
を使用時に融解して用いていた。更に、金属イオンは酸
化縮合を促進するので、金属イオンの混入を防ぐ為に、
イオン交換や蒸留を繰り返した精製水を用いてＨＰＰＡ
を溶解する必要があり、また容器等の洗浄にも多大な注
意を払う必要があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のようにＨＰＰＡ
液は非常に不安定であり、容易に酸化されて蛍光物質に
変換する。そのため、ＨＰＰＡを用いた蛍光ＥＩＡは本
質的には高感度の測定法であるが、ＨＰＰＡの酸化に起
因するブランク上昇が生じ易く、測定精度及び感度が著
しく低下するという問題がある。かかる問題から、ＨＰ
ＰＡの調製及び保存には細心の注意を払う必要があり、
ＨＰＰＡ液の安定化が強く要望されているが安定化法と
して十分に満足できる方法は知られていない。本発明は
、上記の従来技術の欠点を解消するためになされたもの
で、ＨＰＰＡ液の安定性を改善する方法を提供すること
を目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＰＰＡ
液の安定化について鋭意検討した結果、ＨＰＰＡ液に、
安定化剤としてアミノポリカルボン酸系キレート剤又は
アミノポリホスホン酸系キレート剤を添加することによ
りＨＰＰＡの安定化が図れることを見出して本発明を完
成した。すなわち、本発明は、ＰＯＤの蛍光基質である
ＨＰＰＡの安定化剤として、アミノポリカルボン酸系キ
レート剤又はアミノポリホスホン酸系キレート剤を用い
るものである。

【０００６】本発明で用いられるアミノポリカルボン酸
系キレート剤としては、アミノ基の窒素に結合したアル
キレンカルボン酸基を２以上有する化合物で、キレート
力を有するものであれば特に限定されないが、キレート
力の点からのアミノ基の窒素に結合したアルキレンカル
ボン酸基を３以上有するキレート剤が好ましい。また、
分子内に、他の置換基、例えば、ホスホノ基、スルホ基
、水酸基などを有していてもよい。上記アルキレンカル
ボン酸基のアルキレン基としては、例えば、メチレン基
、エチレン基などが挙げられる。アミノポリホスホン酸
系キレート剤としては、アミノ基の窒素に結合したアル
キレンホスホン酸基を２以上有する化合物でキレート力
を有するものであれば特に限定されないが、キレート力
の点からアミノ基の窒素に結合したアルキレンホスホン
酸基を３以上有するキレート剤が好ましい。また、分子
内に、他の置換基、例えば、カルボキシ基、スルホ基、
水酸基などを有していてもよい。上記アルキレンホスホ
ン酸基のアルキレン基としては、例えば、メチレン基、
エチレン基などが挙げられる。ＨＰＰＡ液が金属イオン
（特に、２価の銅イオン）を含む場合には、上記アミノ
ポリカルボン酸系キレート剤及びアミノポリホスホン酸
系キレート剤は、銅の２価イオンとの生成定数が１２以
上のキレート剤を用いるのが好ましい。

【０００７】本発明においては、上記アミノポリカルボ
ン酸系キレート剤及びアミノポリホスホン酸系キレート
剤を併用してもよく、またアミノポリカルボン酸系キレ
ート剤及びアミノポリホスホン酸系キレート剤は塩であ
ってもよい。塩としては、例えば、アルカリ金属塩（例
えば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類
金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩など）
、無機酸又は有機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩
、酢酸塩、クエン酸塩など）が挙げられる。

【０００８】本発明で用いられるキレート剤の例をより
具体的に示すと、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸
（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ
’，Ｎ”，Ｎ”−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ：
以下、ＤＴＰＡという）、ジアミノプロパノール四酢酸
（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎ−２−ｏｌ−Ｎ
，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ
：以下、ＤＰＴＡ−ＯＨという）、トリエチレンテトラ
ミン六酢酸（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎ
ｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’，Ｎ”’−ｈｅｘａａ
ｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ：以下、ＴＴＨＡという）、グリ
コールエーテルジアミン四酢酸（Ｇｌｙｃｏｌｅｔｈｅ
ｒｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａ
ｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ：以下、ＧＥＤＴＡという）、ニ
トリロ三酢酸（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａ
ｃｉｄ：以下、ＮＴＡという）、エチレンジアミン四酢
酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅ
ｔｉｃ　ａｃｉｄ：以下、ＥＤＴＡという）、エチレン
ジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（Ｅｔｈｙ
ｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔ
ｒａｋｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ
　ａｃｉｄ）：以下、ＥＤＴＰＯという）、エチレンジ
アミン二酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，
Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ：以下、ＥＤＤＡと
いう）、エチレンジアミン二プロピオン酸（Ｅｔｈｙｌ
ｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎ
ｉｃ　ａｃｉｄ：以下、ＥＤＤＰという）、ヒドロキシ
エチルエチレンジアミン三酢酸（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｅ
ｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ：以下、ＥＤＴＡ
−ＯＨという）、及びこれらの塩が挙げられる。特に好
ましいキレート剤としては、ＴＴＨＡ、ＤＴＰＡ、ＤＰ
ＴＡ−ＯＨ及びこれらの塩が挙げられる。

【０００９】本発明は、ＨＰＰＡ液に、上記のアミノポ
リカルボン酸系キレート剤及び／又はアミノポリホスホ
ン酸系キレート剤を添加してＨＰＰＡの安定化を図るも
ので、当該キレート剤の添加量は、キレート剤の種類、
ＨＰＰＡの濃度、含まれる過酸化水素及び／又は金属イ
オン（特に銅の２価イオン）濃度などにより適宜調整さ
れるが、通常、０．００１〜１００ｍＭ程度、好ましく
は０．０１〜５０ｍＭ程度、より好ましくは０．１〜１
０ｍＭ程度に調整される。 ＨＰＰＡ液への当該キレート剤の添加時期は特に限定さ
れないが、ＨＰＰＡの安定化を図る上でＨＰＰＡ液の調
製時に添加するのが好ましい。ＨＰＰＡ液の調製例を示
すと、適当な精製水又は緩衝液（例えば、リン酸緩衝液
、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液など、ｐＨ２〜９程度
、好ましくはｐＨ３〜７程度）にＨＰＰＡを０．５〜３
０ｍｇ／ｍｌ程度、通常３〜１０ｍｇ／ｍｌ程度となる
ように溶解すると共に上記のアミノポリカルボン酸系キ
レート剤及び／又はアミノポリホスホン酸系キレート剤
を０．００１〜１００ｍＭ程度、好ましくは０．０１〜
５０ｍＭ程度、より好ましくは０．１〜１０ｍＭ程度と
なるように添加することにより、ＨＰＰＡ液が調製され
る。また、過酸化水素を含むＨＰＰＡ液を調製するには
、上記工程中に適当量の過酸化水素（通常、０．０００
５〜０．０３％程度となるように）を添加すればよい。 かくして得られたＨＰＰＡ液は、好ましくは冷暗所に保
存される。なお、本発明のＨＰＰＡの安定化法はＥＩＡ
のみならず、試薬としてＨＰＰＡ液を用いる測定方法で
あれば何れの方法においても利用することができる。

【００１０】

【発明の効果】本発明によれば、キレート剤の添加によ
りＨＰＰＡを溶液状態で安定化させることができ、ＨＰ
ＰＡの酸化縮合に起因するブランクの上昇が抑制され、
蛍光ＥＩＡの測定感度及び測定精度を著しく向上させる
ことができる。従って、微量成分も再現性よく且つ高感
度で測定でき、臨床検査などの分野においてＥＩＡの適
用範囲を拡大することができる。特に、本発明の方法に
よりＨＰＰＡを過酸化水素と共存させたり、金属イオン
の混入による影響を防止することが可能となり、試薬の
調製、保存などが容易となり、日常の検査業務に利便を
もたらす。

【００１１】

【実施例】以下、実施例に基いて本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ （１）ＨＰＰＡ液の調製 ＨＰＰＡを蒸留水に溶解後、表１に示される各種キレー
ト剤を添加し、以下の最終濃度のＨＰＰＡ液を調製した
。 ＨＰＰＡ：６ｍｇ／ｍｌ、キレート剤：１ｍＭなお、こ
の時のＨＰＰＡ液のｐＨは、２．８〜３．８の範囲内で
あった。 （２）過酸化水素液の調製 ０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に過酸化
水素水を添加して０．０１５％とした。 （３）試薬ブランクの測定法 ＨＰＰＡ液０．２ｍｌに０．０１５％過酸化水素液０．
１ｍｌを添加後、３７℃で９分加温した。その後、０．
１Ｎ水酸化カリウム液１ｍｌを添加し、生じた蛍光を励
起波長３２０ｎｍ／測定波長４０５ｎｍで測定した。な
お、この時の蛍光強度は１μｇ／ｍｌキニーネ液の蛍光
強度を１００とした相対値で表した。 （４）　　上記（１）で調製したＨＰＰＡ液を３７℃に
１２日間保存後、（３）に示した測定法で蛍光強度の測
定を行った。このとき比較例及び対照として、キレート
剤無添加のＨＰＰＡ液を１２日間それぞれ３７℃（比較
例）及び凍結（対照）保存した試料の蛍光強度を測定し
た。その結果を表１に示す。

【００１２】

【表１】

【００１３】表１に示されるように、比較例（キレート
剤無添加、３７℃保存）においては相対蛍光強度が著し
く上昇しており、ＨＰＰＡの酸化縮合が進行しているこ
とが示された。それに対して、キレート剤を添加した本
発明の溶液においては、相対蛍光強度が対照（凍結保存
品）と略同程度であり、ＨＰＰＡの酸化縮合が著しく抑
制されていることが判明した。

【００１４】実施例２　　（過酸化水素存在下における
ＨＰＰＡの安定化） （１）ＨＰＰＡ−過酸化水素液の調製 ０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にＨＰＰ
Ａ、表２に示される各キレート剤及び過酸化水素水を添
加溶解し、最終濃度を以下の通りとした。ＨＰＰＡ：６
ｍｇ／ｍｌ、キレート剤：０．１ｍＭ　（但し、ＥＤＴ
ＰＯのみ０．００５〜０．１ｍＭ）、過酸化水素：０．
００５％（２）試薬ブランクの測定法 ＨＰＰＡ−過酸化水素液０．３ｍｌに０．１Ｎ水酸化カ
リウム液１ｍｌを添加し、生じた蛍光を実施例１と同様
の方法で測定した。 （３）　　上記（１）で調製したＨＰＰＡ−過酸化水素
液を３７℃に２ケ月間保存後、（２）に示した測定法で
蛍光強度の測定を行った。なお、この時も実施例１と同
様に、比較例及び対照として、キレート剤無添加のＨＰ
ＰＡ液を２ケ月間それぞれ３７℃（比較例）及び凍結（
対照）保存した試料の蛍光強度を測定した。その結果を
表２に示す。

【００１５】

【表２】

【００１６】表２に示されるように、比較例（キレート
剤無添加、３７℃保存）においては相対蛍光強度が著し
く上昇しており、ＨＰＰＡの酸化縮合が進行しているこ
とが示された。それに対して、キレート剤を添加した本
発明の溶液においては、相対蛍光強度が対照（凍結保存
品）と略同程度であり、過酸化水素の存在下においても
ＨＰＰＡの酸化縮合が著しく抑制されていることが判明
した。また、キレート剤の濃度としては、０．００５ｍ
Ｍでも効果を発現できることが明らかとなった。

【００１７】実施例３ （１）ＴＴＨＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ及びＤＴＰＡのキレー
ト剤について、濃度範囲が０．１ｍＭ〜２ｍＭのＨＰＰ
Ａ−過酸化水素液を実施例２と同様にして調製した。 （２）上記（１）で調製したキレート剤を含むＨＰＰＡ
−過酸化水素液を３７℃に３９日間保存後、実施例２に
示した測定法で蛍光強度の測定を行った。その結果を表
３に示す。なお、比較例及び対照は実施例２に準じて調
製し、同様にして蛍光強度を測定した。

【００１８】

【表３】

【００１９】表３に示されるように、広範囲のキレート
剤濃度でＨＰＰＡの酸化縮合を抑制できることが明らか
となった。

【００２０】実施例４　　（銅イオン存在下におけるＨ
ＰＰＡの安定化） （１）銅イオン添加ＨＰＰＡ液の調製 ＨＰＰＡを蒸留水に溶解後、塩化第二銅（二水和物）及
び表４に示される各キレート剤を添加し、以下の最終濃
度の銅イオン添加ＨＰＰＡ液を調製した。 ＨＰＰＡ：６ｍｇ／ｍｌ、銅イオン：１０μＭ、キレー
ト剤：０．１ｍＭ （２）過酸化水素液の調製 ０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に過酸化
水素水を添加し、０．０１５％とした。 （３）試薬ブランクの測定法 銅イオン添加ＨＰＰＡ液０．２ｍｌに，０．０１５％過
酸化水素液０．１ｍｌを添加後室温に２０分放置する。 その後、０．１Ｎ水酸化カリウム液１ｍｌを添加し、生
じた蛍光を実施例１と同様に測定した。 （４）上記（１）で調製した銅イオン添加ＨＰＰＡ液を
調製後、（３）に示した測定法で蛍光強度の測定を行っ
た。このとき比較例及び対照として、それぞれキレート
剤無添加の銅イオン添加ＨＰＰＡ液（比較例）及び銅イ
オン無添加のＨＰＰＡ液（対照）の蛍光強度を測定した
。その結果を表４に示す。なお、参考として、表４に各
キレート剤の２価の銅イオンとの生成定数を併せて示し
た。

【００２１】

【表４】

【００２２】表４に示されるように、２価の銅イオンと
の生成定数が１２以上のキレート剤を用いた場合に顕著
な効果が認められた。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　過酸化酵素の蛍光基質である３−（４
   −ヒドロキシフェニル）プロピオン酸の安定化剤として
   、アミノポリカルボン酸系キレート剤又はアミノポリホ
   スホン酸系キレート剤を用いることを特徴とする蛍光基
   質液の安定化法。
2. 【請求項２】　　窒素に結合したアルキレンカルボン酸
   基又はアルキレンホスホン酸基が３個以上存在するキレ
   ート剤を用いる請求項１記載の蛍光基質液の安定化法。
3. 【請求項３】　　銅の２価イオンとの生成定数が１２以
   上のキレート剤を用いる請求項１記載の蛍光基質液の安
   定化法。
4. 【請求項４】　　下記の化合物又はその塩から選ばれた
   １種又は２種以上のキレート剤を用いる請求項１記載の
   蛍光基質液の安定化法。ジエチレントリアミン五酢酸、
   ジアミノプロパノール四酢酸、トリエチレンテトラミン
   六酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロ
   三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテ
   トラキス（メチレンホスホン酸）、エチレンジアミン二
   酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、ヒドロキシエ
   チルエチレンジアミン三酢酸。