WO2020052645A1 - 表面包含免疫调节剂的细胞及其用途 - Google Patents

表面包含免疫调节剂的细胞及其用途 Download PDF

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黄经纬
陈思晔
凌有国
李慧娇
杨焕凤
何晓文
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Definitions

  • the application provides a pharmaceutical composition comprising the cells described herein, and optionally a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • FIG. 12 shows the content of TNF ⁇ expressed after the cells described in the present application are incubated with target cells.
  • NFAT binding site generally refers to a DNA sequence that can bind members of the NFAT family.
  • the NFAT family (Nuclear Factor of Activated Cells) generally refers to activated T cell nuclear factors, which are a family of transcription factors that play an important role in inducing gene transcription in immune responses. In addition to T cells, these proteins can also be expressed on many immune cells, such as B lymphocytes, mast cells, and eosinophils. Its activity is regulated by calcium-dependent calmodulin phosphatase C.
  • the term “constitutive transcriptional activation control domain” generally refers to a type of transcriptional activation control domain capable of continuously regulating the transcription level of a nucleic acid of the immune modulator.
  • the regulation may be to maintain the expression level of the immunomodulator in the cell relatively constant (unaffected by space-time, tissue, organ, or external inducing factors).
  • the expression level of the immunomodulatory agent in different cell individuals in the cell can be up-regulated or down-regulated up to 5%, up to 4%, up to 3%, up to 2 compared to containing the conditional transcriptional activation control domain. %, At most 1%, at most 0.5%, at most 0.1%, at most 0.01% or less.
  • the pharmaceutical composition may contain a therapeutically effective amount of the cells.
  • the therapeutically effective amount is a dose required to prevent and / or treat (at least partially treat) a condition or disorder (eg, cancer) and / or any complications thereof in a subject having or at risk for development.
  • transmembrane region comprises a portion selected from the group consisting of a transmembrane region of CD8, a transmembrane region of CD28, and a transmembrane region of CD24.
  • a method for up-regulating the expression of an immunomodulator in a cell comprising the following steps:
  • NFAT-4D5CAR lentivirus NFAT-4D5CAR lentivirus, EF1a-4D5CAR lentivirus, EF1a-FRP5CAR lentivirus infected T lymphocytes to obtain NFAT-4D5CAR-T (NH-CAR-T) cells, EF1a-4D5CAR-T (EH-CAR-T) Cells, EF1a-FRP5CAR-T (EF-CAR-T) cells.
  • the cell density of the infected cells was monitored to maintain the density at 1 ⁇ 10 6 cells / ml. It can be expanded 30-100 times within 14 days.
  • the target cells obtained in Example 4 were digested with trypsin / EDTA. After centrifugation, approximately 2,000,000 cells were taken and resuspended in 100 ⁇ l of PBS, and Human ErbB2 / HER2PE-conjugated with a final concentration of 5 ⁇ g / ml was added to the resuspension.
  • HER2 expression of each target cell constructed are shown in Figure 7 and Table 3.
  • MB468 cells hardly express HER2 molecules
  • MB468-HER2 TET-ON cells have very low expression
  • MB231 cells have low expression.
  • These target cells can mimic normal tissue cells that express antigens to varying degrees.
  • Target cells SKOV3 purchased from ATCC
  • that highly express HER2 can mimic tumor tissue cells.

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Abstract

表面包含免疫调节剂的细胞及其用途，细胞的表面包含能够特异性识别和/或结合靶标的免疫调节剂，细胞中编码免疫调节剂的核酸与其转录激活控制域可操作地连接，转录激活控制域为条件性转录激活控制域，且细胞表面的免疫调节剂对靶标的特异性识别和/或结合使得转录激活控制域令免疫调节剂在细胞中的表达上调。

Description

表面包含免疫调节剂的细胞及其用途 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种表面包含免疫调节剂的细胞及其用途。
背景技术
目前，新兴的具有靶向性过继细胞治疗技术嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)在多种恶性肿瘤治疗中均发挥着重要作用。通过将单链抗体、特异性受体等针对肿瘤相关抗原(TAA)特异性识别肽段与T细胞激活信号如CD3ζ偶联得到融合蛋白，并通过慢病毒等方式将该融合蛋白特异性表达于T细胞表面，使修饰过的T细胞(CAR-T)可以对肿瘤细胞进行特异性识别和/或杀伤。由于这种杀伤不依赖于主要组织相容性抗原(MHC)，避免了由于MHC缺失导致的肿瘤免疫逃逸。
尽管在恶性血液病的治疗中，CAR-T展现出了良好的应用价值，但在实体瘤治疗中，CAR-T往往并不能达到预期效果，甚至在临床研究中，CAR-T可能会存在由于不能与肿瘤细胞有效结合的脱靶效应而产生的毒性。此外，由于目前CAR-T多采用EF1a等强启动子表达CAR，使其表达丰度往往维持在过高的水平而产生其他副作用。这种现象在以HER2为靶点的CAR-T中体现明显：4D5是高亲和力靶向HER2的抗体，将其序列用于CAR-T时，CAR-T细胞会对不同HER2表达丰度的细胞产生接近相同的杀伤水平，因此也会对低表达HER2的正常组织造成损伤。
为了避免因不能与肿瘤细胞有效结合的脱靶效应而产生的毒性，有研究者通过大量的抗体筛选工作，选择了具有较低亲和力但对高靶抗原表达靶细胞杀伤未明显降低的抗体FRP5作为CAR-T的scFv序列。虽然能够一定程度上避免了基于4D5抗体序列的CAR-T的问题，但是筛选工作增加，使大量高亲和力抗体不能应用于CAR-T领域。
发明内容
本申请提供了一种表面包含免疫调节剂的细胞及其用途，其具有下列性质中的一种或多种：1)组织特异性增高；2)避免对正常组织的误伤；3)降低所述细胞的凋亡水平，延长所述细胞发挥免疫效应的时间；4)扩大所述免疫调节剂的适用范围；5)抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖。
一方面，本申请提供了一种细胞，其表面包含能够特异性识别和/或结合靶标的免疫调节剂，所述细胞中编码所述免疫调节剂的核酸与其转录激活控制域可操作地连接，所述转录激 活控制域为条件性转录激活控制域，且其中所述细胞表面的所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合使得所述转录激活控制域令所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
在某些实施方式中，所述的免疫调节剂在所述细胞中的表达不受组成型转录激活控制域的调控。在某些实施方式中，所述的免疫调节剂在所述细胞中的表达受且仅受与其可操作连接的所述条件性转录激活控制域的调控。
在某些实施方式中，所述的细胞中的所述免疫调节剂选自：嵌合抗原受体(CAR)、免疫检查点抑制剂和细胞因子。
在某些实施方式中，所述的条件性转录激活控制域位于编码所述免疫调节剂的核酸的上游。在某些实施方式中，所述的编码所述免疫调节剂的核酸通过连接子与所述条件性转录激活控制域可操作地连接，所述连接子包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
在某些实施方式中，所述的条件性转录激活控制域包含NFAT结合位点。在某些实施方式中，所述的NFAT结合位点结合NFAT家族成员。在某些实施方式中，所述的NFAT家族成员选自下组：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、NFAT5、Spl和NKκB。在某些实施方式中，所述的NFAT结合位点包括至少1个拷贝的NFAT结合序列。在某些实施方式中，所述的NFAT结合序列包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:26。
在某些实施方式中，所述的细胞表面的所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合促进所述NFAT家族成员与所述条件性转录激活控制域中所述NFAT结合位点的结合，从而提高所述免疫调节剂的转录水平。
在某些实施方式中，所述的条件性转录激活控制域还包含启动子。在某些实施方式中，所述的条件性转录激活控制域中，所述NFAT结合位点位于所述启动子的上游。在某些实施方式中，所述的NFAT结合位点与所述启动子直接或间接连接。在某些实施方式中，所述的启动子选自下组：最小IL2启动子和最小CMV启动子。
在某些实施方式中，所述的条件性转录激活控制域包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1。
在某些实施方式中，所述的免疫调节剂为嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括细胞内结构域，所述细胞内结构域包括信号传导结构域和/或共刺激结构域。在某些实施方式中，所述的信号传导结构域包含选自下组的部分：CD3ζ的信号传导结构域、CD3δ的信号传导结构域和CD3ε的信号传导结构域。在某些实施方式中，所述的共刺激结构域包含选自下组的部分：CD27的共刺激结构域、CD28的共刺激结构域、CD137的共刺激结构域、ICOS 的共刺激结构域和OX40的共刺激结构域。
在某些实施方式中，所述的CAR包含铰链区。在某些实施方式中，所述的铰链区包含选自下组的部分：IgG4的铰链区、IgG1的铰链区和CD8的铰链区。
在某些实施方式中，所述的CAR包含跨膜区。在某些实施方式中，所述的跨膜区包含选自下组的部分：CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD24的跨膜区。
在某些实施方式中，所述的CAR包含靶向部分。在某些实施方式中，所述的靶向部分包括ScFv。在某些实施方式中，所述的靶向部分特异性结合和/或识别肿瘤抗原。在某些实施方式中，所述的靶向部分特异性结合和/或识别选自下组的靶标：HER家族成员、CD19、CD20、CD33、CD138、BCMA、EGFR、EGFRVIII、PSMA、GD2、CEA和GPC3。在某些实施方式中，所述的靶向部分特异性结合和/或识别选自下组的靶标：HER2和GPC3。
在某些实施方式中，所述的编码所述免疫调节剂的核苷酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
在某些实施方式中，所述的细胞选自下组：免疫细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞。在某些实施方式中，所述的免疫细胞选自下组：T细胞、B细胞和NK细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包括本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了一种使免疫调节剂在细胞中的表达上调的方法，其包括以下的步骤：(a)提供本申请所述的细胞；(b)使(a)的所述细胞与可与所述免疫调节剂特异性识别和/或结合的靶标接触，从而使得所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
另一方面，本申请提供了一种所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖。
另一方面，本申请提供了一种抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖的方法，所述方法包括使所述的细胞和/或所述的药物组合物与所述肿瘤或肿瘤细胞接触。在某些实施方式中，所述接触为体外接触。
另一方面，本申请提供了一种抑制受试者中的肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述的细胞和/或所述的药物组合物。在某些实施方式中，所述肿瘤选自下组：肝癌、肺癌、白血病和乳腺癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉 及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述的CAR-T的核酸与其转录激活控制域的连接示意图。
图2显示的是本申请所述的传统CAR-T的核酸与其启动子的连接示意图。
图3显示的是本申请所述的细胞的作用原理。
图4显示的是本申请所述以HER2靶向的具有自激活特性的4D5序列为识别序列时细胞的扩增能力。
图5显示的是本申请所述的细胞以HER2靶向的具有自激活特性的4D5序列为识别序列时表达免疫调节剂的细胞在扩增过程中占比变化情况。
图6显示的是本申请所述的不同靶细胞的HER2表达情况。
图7显示的是本申请所述的细胞在激活前后CAR的表达情况。
图8显示的是本申请所述的不同浓度包被的靶蛋白对CAR表达丰度的影响。
图9显示的是本申请所述的不同的细胞对不同靶蛋白表达水平的靶细胞的杀伤活性。
图10显示的是本申请所述细胞与靶细胞接触后免疫调节剂表达水平的变化与维持情况。
图11显示的是本申请所述细胞与靶细胞孵育后表达IFN-γ的含量。
图12显示的是本申请所述细胞与靶细胞孵育后表达TNFα的含量。
图13显示的是本申请所述细胞与靶细胞孵育后表达IL-2的含量。
图14显示的是本申请所述细胞与靶细胞孵育4小时后细胞凋亡死亡情况。
图15显示的是本申请所述细胞与靶细胞孵育24小时后细胞凋亡死亡情况。
图16A显示的是本申请所述细胞在小鼠体内对抗原HER2低表达的M231细胞的抑瘤消瘤情况。
图16B显示的是本申请所述细胞在小鼠体内对抗原HER2高表达的SKOV3肿瘤细胞的抑瘤消瘤情况。
图16C显示的是本申请所述小鼠在注射本申请所述细胞后体内IFN-γ的含量变化。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“免疫调节剂”通常是指一种具有功能的、可以特异性地或非特异性地增强、减少免疫反应，并且直接或间接调节细胞介导免疫的分子。所述免疫调节剂的作用机制可以包括抑制过敏反应或自免疫反应；也可以包括保留或增强对外来入侵物或肿瘤细胞的抵抗作用。所述免疫调节剂可以选自但不限于以下组：白介素、细胞因子、趋化因子、免疫检查点(immune checkpoint)抑制剂、胞嘧啶磷酸和葡聚糖。例如，所述白介素可以选自但不限于以下组：IL2、IL7和IL12。例如，所述细胞因子可以选自但不限于以下组：干扰素(例如IFNα、IFNβ和IFNγ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα)和集落刺激因子(例如GMCSF、G-CSF、M-CSF、SCF、Epo和LIF)。所述趋化因子可以选自但不限于以下组：CCL1-28、CXCL1-17、XCL1-2和CXCL。所述免疫检查点可以选自但不限于以下组：CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7H3、B7H4、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1和TIM-3。
在本申请中，术语“靶标”通常是指所述免疫调节剂发挥免疫抑制作用的对象。
在本申请中，术语“转录激活控制域”通常是指能够调控编码所述免疫调节剂的核酸的转录水平的DNA片段。所述转录激活控制域可以与DNA结合域共同作用，从而通过提高RNA聚合酶与启动子的结合；或者通过转录复合体(如构象的改变)的改变，调控所对应控制的核酸的转录水平。例如，所述转录激活可以包括将编码所述免疫调节剂的核酸的DNA转录成RNA，并翻译为所述免疫调节剂的过程。在本申请中，所述转录激活控制域可以为条件性转录激活控制域。
在本申请中，术语“条件性转录激活控制域”通常是指当满足一定条件时能够调控所述免疫调节剂的核酸的转录水平的一类转录激活控制域。在本申请中，所述的调控可以为使所述免疫调节剂在所述细胞中的表达水平上调或下调。例如，与不含有所述条件性转录激活控制域相比，所述免疫调节剂在所述细胞中的表达水平可以上调至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少500％、至少1000％或以上。在本申请中，所述的一定条件可包括所述细胞表面的所述免疫调节剂进行特异性识别和/或结合了所述靶标。当所述细胞表面的所述免疫调节剂特异性识别和/或结合了所述靶标后，所述条件性转录激活控制域可以上调所述免疫调节剂在所述细胞中的表达水平。所述条件性转录激活控制域可以位于编码所述免疫调节剂的核酸的上游。在本申请中，所述的条件性转录激活控制 域可以包括阻遏型启动子系统和激活型启动子系统。例如，所述的条件性转录激活控制域可以包含NFAT结合位点。
在本申请中，术语“NFAT结合位点”通常是指可以结合NFAT家族成员的DNA序列。本申请中，所述NFAT家族(Nuclear Factor of Activated T Cells)通常是指活化T细胞核因子，其是一类转录因子家族，在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用。除T细胞外，这类蛋白质还可以在许多免疫细胞上进行表达，如B淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等。其活性受到钙离子依赖性的钙调蛋白磷酸酯酶C的调节。在本申请中，所述NFAT家族成员选自但不限于下组：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、NFAT5、Spl和NKκB。NFAT家族成员一般均具备调控区、DNA结合域和C端区。NFAT靶基因中的启动子和增强子可含有至少1个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多)供NFAT特异性结合的NFAT结合序列。一般这些NFAT结合序列中，可都含有共有序列GAGGAAAA。当NFAT被激活和核定位后，NFAT作为一种反式作用因子与所述至少1个NFAT结合序列结合，可以激活该细胞起始NFAT依赖性的靶基因的转录。
在本申请中，术语“组成型转录激活控制域”通常是指能够持续地调控所述免疫调节剂的核酸的转录水平维持在一定的水平上的一类转录激活控制域。在本申请中，所述的调控可以为使所述免疫调节剂在所述细胞中的表达水平较为恒定地(不受时空、组织器官或外界诱导因素的影响)维持。例如，与含有所述条件型转录激活控制域相比，所述免疫调节剂在所述细胞中不同细胞个体中的表达水平可以上调或下调至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、至多0.5％、至多0.1％、至多0.01％或更少。在本申请中，所述组成型转录激活控制域可以位于编码所述免疫调节剂的核酸的上游。所述组成型转录激活控制域可以为CaMV35S启动子、CsVMV启动子、NOS启动子、act in启动子、Ubiquitin启动子和F1a启动子。例如，本申请中，所述组成型转录激活控制域可以为EF1a启动子。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体”通常又称“CAR”，是指一组多肽，(典型地，在最简单的实施方案中通常为两个)，这一组多肽在免疫效应细胞中使得该免疫效应细胞对靶细胞(通常为癌细胞)具有特异性，并产生胞内信号。本申请中，所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包括信号传导结构域和/或共刺激结构域。在本申请中，参与诱导的信号经CD3和ζ链转导入T细胞的细胞质。在本申请中，细胞内结构域可包含一个一级信号传导结合域(例如，CD3ζ的信号传导结构域、CD3δ的信号传导结构域和CD3ε的信号传导结构域)。在一个方面，细胞质信号结构域还可包含一种或多种衍生自至少一种共刺激分子的共刺激结构域。例如，所述共刺激结构域可为4-1BB(即CD137)，CD27和/或CD28。在本 申请中，所述CAR还可包含铰链区、跨膜区和靶向部分中的一种或多种。
在本申请中，术语“靶向部分”可以为单链抗体或者特异性受体，保证修饰的T细胞可以特异性的识别靶细胞，并被激活，对靶细胞产生特异性杀伤作用。
在本申请中，术语“铰链区”通常是位于ScFv和T细胞的细胞膜之间的一段区域，是提供结构柔性以及与侧翼多肽区域的间隔的由天然或合成多肽组成得柔性多肽连接件区域。铰链区通常来源于IgG家族，例如，可来源于IgG1和IgG4，还可以来源于IgD和CD8。在本申请中，铰链区可以包含选自但不限于下组的部分：IgG4的铰链区、IgG1的铰链区和CD8的铰链区。
在本申请中，术语“跨膜区”可以连接胞外抗原结合域和胞内信号域，铰链区一般采用如CD8a、CD28ECD、IgG FC片段等，保证T细胞与靶细胞接触距离，影响到T细胞作用，能将CAR结构锚定于T细胞膜上。跨膜区不同的设计能影响导入的CAR基因的表达。在本申请中，所述跨膜区可以包含选自但不限于下组的部分：CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD24的跨膜区。
在本申请中，术语“共刺激结构域”通常是指选自但不限于以下一个或多个的蛋白质的功能性信号传导结构域:CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D。在本申请中，所述共刺激结构域可以包括：CD27、CD28和4-1BB。
在本申请中，术语“信号传导结构域”通常是指是指选自但不限于CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(Fc Epsilon R1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12的蛋白质的功能性信号传导结构域。在本申请中，所述信号传导结构域可以包括：CD3ζ、CD3δ和CD3ε。
在本申请中，术语“免疫检查点抑制剂”通常是指整体或部分减少、抑制、干扰或调节 一种或多种检查点蛋白质的分子。检查点蛋白质调控T细胞活化或功能。已知多种检查点蛋白质，如CTLA-4以及其配体CD80和CD86；以及PD1及其配体PDL1和PDL2(Pardoll，Nature ReviewsCancer12:252-264，2012)。这些蛋白质负责T细胞反应的共刺激或抑制相互作用。免疫检查点蛋白调控并维持自身耐受性以及生理免疫反应的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或源自于抗体。
在本申请中，术语“细胞因子”通常是指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。所述细胞因子可具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。在本申请中，所述细胞因子可包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子和生长因子。例如，所述细胞因子为白细胞介素和肿瘤坏死因子。
在本申请中，术语“上游”通常是指与DNA的脱氧核苷酸从转录起始点开始的转录方向相反的方向上的DNA片段位置。
在本申请中，术语“拷贝”通常是指在DNA中，代表同一个基因重复的次数的单位。
在本申请中，术语“HER家族成员”通常是指属于HER(人表皮生长因子human epidermal growth factor receptor)家族的成员。HER家族成员可以包括EGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、HER3(ErbB-3)以及HER4(ErbB-4)。在本申请中，所述HER家族成员可以包括HER2。
在本申请中，术语“HER2”通常是指人类HER2蛋白，其属于HER家族成员。例如，参见Semba et al.,PNAS(USA)82：6497-6501(1985)和Yamamoto et al.,Nature 319：230-234(1986)，HER2的GenBank登录号X03363)。
在本申请中，术语“免疫细胞”通常是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布很广泛，主要是T淋巴细胞、B淋巴细胞受抗原刺激而被活化(activation)，分裂增殖、发生特异性免疫应答。在本申请中，所述免疫细胞可以包括T细胞、B细胞和NK细胞。
在本申请中，术语“T细胞”又称T淋巴细胞，是白细胞的一种亚型，其在细胞介导的免疫中发挥中心作用。T细胞可以通过细胞表面存在的T细胞受体与其他淋巴细胞如B细胞和自然杀伤细胞区分开来。其来源于骨髓的多能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝)。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的 诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。
在本申请中，术语“B细胞”又称B淋巴细胞，是白细胞的一种亚型，其在体液介导的免疫中发挥中心作用。其来源于骨髓的多能干细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。B淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞，浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。
在本申请中，术语“NK细胞”(Natural killer,NK)又叫自然杀伤细胞，是白细胞的一种亚型，它是先天免疫系统的组成部分。NK细胞在肿瘤和病毒感染细胞的宿主排斥中起主要作用。NK细胞具有细胞毒性，其细胞质中的小颗粒包含特殊蛋白质，例如，穿孔素和颗粒酶。穿孔素可在靶细胞的细胞膜中形成孔隙，使颗粒酶和其他分子通过该孔进入靶细胞，诱导细胞凋亡。NK细胞可应答干扰素或巨噬细胞产生的细胞因子而被激活。其可用于抑制病毒感染，通过适应性免疫应答产生抗原特异性细胞毒性T细胞从而清除感染。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物(neogrowth)，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物(neoplasm)。在本申请中，癌症可以包括肝癌、肺癌、白血病和间皮瘤。例如，可以包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、头颈癌、B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡型NHL、中等级弥漫性NHL、高级免疫母细胞NHL、高级淋巴细胞性NHL、高级小型非切割细胞NHL、艾滋病相关淋巴瘤、Waldenstrom的巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病慢性成髓细胞白血病和移植后淋巴增生性疾病(PTLD))。在本申请中，所述癌症可以包括肝癌、肺癌、白血病和间皮瘤。
在本申请中，术语“慢病毒载体”是指以病毒为基础发展起来的基因治疗载体。在本申请中，所述病毒可以为HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)。所述慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以有效地感染包括神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等几乎所有的哺乳动物细胞，并且感染效率高。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
表面包含免疫调节剂的细胞
一方面，本申请提供了一种表面包含免疫调节剂的细胞，所述细胞表面包含能够特异性识别和/或结合靶标的免疫调节剂，所述细胞中编码所述免疫调节剂的核酸与其转录激活控制域可操作地连接，所述转录激活控制域为条件性转录激活控制域，且其中所述细胞表面的所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合使得所述转录激活控制域令所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
在本申请中，所述免疫调节剂在所述细胞中的表达可以不受组成型转录激活控制域的调控。所述细胞中所述免疫调节剂的表达量可以并不持续、恒定地维持在相同的水平上。例如，所述免疫调节剂在所述细胞中不同细胞个体中的表达水平可以上调或下调至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、至多0.5％、至多0.1％、至多0.01％或更少。
在本申请中，所述组成型转录激活控制域可以为组成型启动子。例如，所述组成型启动子可以为EF1a启动子。如图2所示，所述组成型转录激活控制域EF1a启动子可以与编码所述免疫调节剂的核酸可操作地连接(例如，位于编码所述免疫调节剂(例如，嵌合抗原受体)的上游)。
在本申请中，所述免疫调节剂在所述细胞中的表达可以受且仅受与其可操作连接的所述条件性转录激活控制域的调控。在一些实施方式中，所述免疫调节剂在所述细胞中的表达可以被外界因素所影响。例如，所述免疫调节剂在所述细胞中的表达可以受所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合所影响。当所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合后，该特异性识别和/或结合能够使得所述条件性转录激活控制域令所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调(例如，可以上调至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少500％、至少1000％或以上)。
在本申请中，所述条件性转录激活控制域可位于编码所述免疫调节剂的核酸的上游。在本申请中，编码所述免疫调节剂的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。在本申请中，编码所述免疫调节剂的核酸可以通过连接子与所述条件性转录激活控制域可操作地连接。例如，所述连接子可以包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
在本申请中，所述条件性转录激活控制域可包含NFAT结合位点。所述NFAT结合位点可以位于编码所述免疫调节剂的核酸的上游。在本申请中，所述NFAT结合位点可结合NFAT家族成员。例如，所述NFAT家族成员可以选自但不限于下组：NFATc1、NFATc2、NFATc3、 NFATc4、NFAT5、Spl和NKκB。当NFAT家族成员受一定外界条件(包括但不限于受体-Ca 2+-钙调磷酸酶(CN)信号路径)被激活后，激活的NFAT家族成员可具备去磷酸化、核定位以及与DNA结合亲和力上升的特性。激活的NFAT家族成员可以作为一种反式作用因子与DNA结合，激活NFAT靶基因的转录(其中，启动子可含有至少一个NFAT结合位点的基因，可称为所述NFAT靶基因)，从而发挥反式激活功能。在本申请中，当所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合后，该特异性识别和/或结合能够激活NFAT家族成员，激活的NFAT家族成员与所述NFAT结合位点结合，令与所述NFAT结合位点可操作地连接的、并且受所述NFAT结合位点调控的所述免疫调节剂(例如，嵌合抗原受体(CAR)、免疫检查点抑制剂和细胞因子)在所述细胞中的表达上调(例如，可以上调至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少500％、至少1000％或以上)。
在本申请中，所述NFAT结合位点可包括至少1个(例如，至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，或至少9个)拷贝的NFAT结合序列。在本申请中，所述NFAT结合序列可包含选自但不限于下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:26。
在本申请中，所述条件性转录激活控制域还可以包含启动子。在所述条件性转录激活控制域中，所述NFAT结合位点可位于所述启动子的上游。所述NFAT结合位点与所述启动子可直接或间接连接。例如，所述NFAT结合位点可以直接连接于所述启动子的上游，或所述NFAT结合位点间接连接于所述启动子的上游。例如，所述NFAT结合位点可以通过连接子与所述启动子间接连接。
在本申请中，所述细胞通过条件性转录激活控制域可以调控所述免疫调节剂的表达。例如，所述条件性转录激活控制域可包含NFAT结合位点。在某些情况下，所述NFAT结合位点可以通过与受所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合而激活的NFAT家族成员的结合，促进所述条件性转录激活控制域所调控的所述免疫调节剂的表达量进一步上调。例如，所述免疫调节剂可以是嵌合抗原受体(CAR)、免疫检查点抑制剂或细胞因子。例如，所述嵌合抗原受体(CAR)可以为4D5CAR。
与组成型转录激活控制域相比，条件性转录控制域对所述免疫调节剂的调控可以具有以下优点：
(1)可以降低其筛选要求，例如4D5序列在正常CAR-T细胞结构中会导致明显的自激活，进而诱导了细胞的程序性死亡(AICD)，导致CAR-T细胞表达的阳性率低、扩增倍数 少和体内治疗半衰期短，使其不适宜作为CAR-T细胞的识别序列。而NFAT-4D5CAR-T细胞可以有效降低序列导致的自激活效应，使得4D5可以作为识别序列应用于CAR-T细胞中。
(2)有效避免对低靶抗原表达的正常组织的损伤，例如NFAT-4D5CAR-T细胞对低水平表达HER2的靶细胞MB231几乎没有抑制作用，对高水平表达HER2的靶细胞SKOV3具有显著的抑制作用并能够消除肿瘤；
(3)延长所述细胞发挥免疫效应的时间，例如，NFAT-4D5CAR-T细胞在与高水平表达HER2的靶细胞SKOV3接触24小时后没有明显凋亡死亡，而EF1a-4D5CAR-T细胞发生了明显的凋亡死亡。
(4)促进细胞因子的生成，所述细胞因子可以为白细胞介素(例如IL2)、干扰素(例如IFN-γ)和肿瘤坏死因子(例如TNFα)等，例如，NFAT-4D5CAR-T细胞在接触高水平表达HER2的靶细胞SKOV3后，所表达的IFN-γ水平显著高于低水平表达HER2的靶细胞MB231和极低水平表达HER2的靶细胞MB468-HERTET-ON所表达的IFN-γ水平。
(5)抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖，例如NFAT-4D5CAR-T细胞能够特异性地抑制高水平表达HER2的肿瘤细胞的生长和/或增殖。
在本申请中，所述启动子可选自下组：最小IL2启动子和最小CMV启动子。在本申请中，编码最小IL2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，编码最小CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在本申请中，条件性转录激活控制域可以包括所述NFAT结合位点和最小IL2启动子，NFAT结合序列(SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:21)可以直接连接在最小IL2启动子(SEQ ID NO:22)的上游。
在本申请中，NFAT结合序列(SEQ ID NO:26)可以直接连接在最小IL2启动子(SEQ ID NO:22)的上游，得到NFAT结合位点启动子(SEQ ID NO:1)，所述条件性转录激活控制域可以是NFAT结合位点启动子。
在本申请中，所述条件性转录激活控制域可以包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1。
在本申请中，所述免疫调节剂可选自但不限于下组：嵌合抗原受体(CAR)、免疫检查点抑制剂和细胞因子。
本申请所述免疫调节剂可以为嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体可包括细胞内结构域，所述细胞内结构域可包括信号传导结构域和/或共刺激结构域。例如，所述信号传导结构域可包含选自但不限于下组的部分：CD3ζ的信号传导结构域、CD3δ的信号传导结构域 和CD3ε的信号传导结构域。在本申请中，所述信号传导结构域可以是CD3ζ。
又例如，所述共刺激结构域可包含选自但不限于下组的部分：CD27的共刺激结构域、CD28的共刺激结构域、CD137的共刺激结构域、ICOS的共刺激结构域和OX40的共刺激结构域。在本申请中，所述共刺激结构域可以是CD137。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可包含铰链区。例如，所述铰链区可包含选自但不限于下组的部分：IgG4的铰链区、IgG1的铰链区和CD8的铰链区。在本申请中，所述铰链区可以是CD8。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可包含跨膜区。例如，所述跨膜区可包含选自但不限于下组的部分：CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD24的跨膜区。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可包含靶向部分。其中所述靶向部分可包括ScFv。例如，所述靶向部分可特异性结合和/或识别肿瘤抗原。例如，所述靶向部分特异性结合和/或识别可选自但不限于下组的靶标：HER家族成员、CD19、CD20、CD33、CD138、BCMA、EGFR、EGFRVIII、PSMA、GD2、CEA和GPC3。例如，所述靶标可以选自但不限于以下组：HER2和GPC3。在本申请中，所述靶标可以是HER2。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可以包括靶向HER2靶标的ScFv、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、CD137的共刺激结构域和CD3ζ的信号传导结构域，得到4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体，编码所述scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
在本申请中，所述嵌合抗原受体可以包括靶向HER2靶标的ScFv、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、CD137的共刺激结构域和CD3ζ的信号传导结构域，得到FRP5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体，编码所述scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述FRP5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
在本申请中，编码所述免疫调节剂的核苷酸包含选自但不限于下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
在本申请中，所述条件型转录激活控制域的NFAT结合位点可以与编码所述免疫调节剂的核酸可操作地连接(例如，位于编码所述免疫调节剂(例如，嵌合抗原受体)的上游)；且所述条件型转录激活控制域NFAT结合序列的下游和编码所述免疫调节剂的核酸上游之间还可以有最小IL2启动子或最小CMV启动子。
在本申请中，所述的细胞可以含有如图1所示的核酸，其中NFAT结合序列(SEQ ID NO:26)可以直接连接在最小IL2启动子(SEQ ID NO:22)的上游，得到条件性转录激活控制域， 即NFAT结合位点启动子(SEQ ID NO:1)，NFAT结合位点启动子可操作地连接于编码所述4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体(SEQ ID NO:24)的核酸的上游，得到编码NFAT-4D5CAR的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)。
换言之，在本申请中，所述细胞表面的所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合可以促进所述NFAT家族成员与所述条件性转录激活控制域中所述NFAT结合位点的结合，从而提高所述免疫调节剂的转录水平。由此，本申请提供的所述细胞可以是一种受NFAT信号通路(或者受所述条件性转录激活控制域)调控的所述免疫调节剂的表达系统。在所述免疫调节剂没有对所述靶标的特异性识别和/或结合的情况下，所述细胞可以相对低水平地表达所述免疫调节剂(例如，与受所述组成型转录激活控制域调控相比，所述免疫调节剂的表达量可以下调至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少500％、至少1000％或以上)；而在所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合的情况下，所述细胞可以相对高水平地表达所述免疫调节剂(例如，与受所述组成型转录激活控制域调控相比，所述免疫调节剂的表达量可以上调调至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少500％、至少1000％或以上)。
图3对本申请所述细胞表达所述免疫调节剂进行了示意：对于高表达肿瘤抗原的组织细胞，本申请所述细胞表面表达的免疫调节剂可以与该组织上的肿瘤抗原进行特异性结合，从而产生活化NFAT信号，促使活化后的NFAT家族成员与所述细胞中的NFAT结合位点相结合，促进所述细胞上调表达所述免疫调节剂(例如，抗HER2的嵌合抗原受体)，进一步发挥杀伤高表达肿瘤抗原组织的作用；反之，本申请所述细胞表面表达的免疫调节剂难以与低表达肿瘤抗原组织上的抗原进行特异性结合，也无法通过活化NFAT家族成员使所述免疫调节剂表达上调，也不会杀伤该低表达肿瘤抗原的组织，如体内的正常组织。
在本申请中，所述细胞可选自但不限于下组：免疫细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞。例如，所述免疫细胞可选自但不限于下组：T细胞、B细胞和NK细胞。在本申请中，所述免疫细胞可以是T细胞，例如，所述细胞可以为表面表达所述嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)。
在本申请中，可以采用包含编码NFAT-4D5CAR核苷酸序列的慢病毒感染T淋巴细胞，得到能够表达4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体的T细胞，命名为NFAT-4D5CAR-T细胞，且4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体的表达量受到条件性转录激活控制域(即 NFAT结合位点启动子)的调控。
在本申请中，对于高表达HER2肿瘤抗原的组织细胞，例如，高表达HER2的靶细胞SKOV3(购买于ATCC)可以模拟肿瘤组织细胞，本申请所述NFAT-4D5CAR-T细胞表面表达的4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体可以与SKOV3靶细胞特异性结合，促进所述NFAT-4D5CAR-T细胞中4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体表达量的上调，进一步发挥杀伤SKOV3靶细胞的作用。反之，本申请构建的MB468-HER2 TET-ON细胞中的HER2表达水平较低，MB231肿瘤细胞有略高的HER2表达，可以模拟低水平表达肿瘤抗原的正常组织细胞。本申请所述NFAT-4D5CAR-T细胞表面表达的4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体难以与MB468-HER2 TET-ON细胞中的HER2抗原进行特异性结合，与MB231细胞的HER2抗原结合水平也较低，无法通过活化NFAT家族成员使所述4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ嵌合抗原受体的表达有效上调，避免了对MB468-HER2 TET-ON细胞及MB231细胞的高强度特异性杀伤。
由此，本申请所述的细胞可以达到至少一项以下的优异的技术效果；1)组织特异性增高：针对所述靶标表达量相对低水平的正常组织，所述免疫调节剂可不与所述靶标发生特异性识别和/或结合，此时所述细胞可以相对低水平地表达所述免疫调节剂，因此所述细胞也不会对该正常组织进行杀伤；而针对所述靶标表达量相对高水平的病理组织(例如，肿瘤组织)，所述免疫调节剂可与所述靶标发生特异性识别和/或结合，此时所述细胞可以相对高水平地表达所述免疫调节剂，使得所述细胞特异性地对该病理组织发挥杀伤活性。2)避免对正常组织的误伤：针对所述靶标表达量相对低水平的正常组织，所述细胞表达所述免疫调节剂(例如嵌合抗原受体(CAR))的表达水平相对很低，从而降低对正常组织的误伤，又例如，数量有限的细胞因子不会对正常组织引起细胞因子风暴(即细胞因子数量过多导致地对其靶向细胞的负面作用)。3)降低所述细胞的凋亡水平，延长所述细胞发挥免疫效应的时间：针对所述靶标表达量相对低水平的正常组织，所述细胞表达所述免疫调节剂(例如嵌合抗原受体(CAR))的表达水平相对很低，有限数量的所述免疫调节剂极大地降低单链抗体间的碰撞几率和二硫键的形成，而更趋向于在单链抗体重链和轻链间形成二硫键，从而防止由于自活化所带来的所述细胞的凋亡反应。4)扩大所述免疫调节剂的适用范围。例如，降低了CAR相关抗体序列的要求，不需要特意筛选低亲和力但高杀伤活性的抗体序列，扩大了可选择的抗体序列的范围。(5)抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖，例如NFAT-4D5CAR-T细胞能够特异性地抑制高水平表达HER2的肿瘤细胞的生长和/或增殖。
药物组合物、应用
在另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，所述药物组合物可包括所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
所述药物组合物可以用于抑制肿瘤生长。例如，本申请的药物组合物可以抑制或延缓疾病的发展或进展，可以通过促进细胞因子的表达减小肿瘤的大小(甚至基本消除肿瘤)，和/或可以减轻和/或稳定疾病状态。
在本申请中，所述药物组合物可以含有治疗有效量的所述细胞。所述治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的病症或病症(例如癌症)和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面，本申请还提供了一种所述细胞、药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物可用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖。
另一方面，本申请还提供了一种抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖的方法，所述方法可包括所述的细胞和/或药物组合物与所述肿瘤或肿瘤细胞接触，所述接触可以为体外接触。
另一方面，本申请还提供了一种抑制受试者中的肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖的方法可包括向所述受试者施用包括所述的细胞和/或药物组合物。
在本申请中，所述肿瘤可选自但不限于下组：肝癌、肺癌、白血病和乳腺癌。
在本申请中，所述的细胞和/或药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
在本申请中，所述的细胞和/或药物组合物也可被配制为试剂盒。并且以试剂盒的形式被使用。
在另一方面，本申请还提供了一种可使免疫调节剂在细胞中的表达上调的方法，其包括以下的步骤：(a)提供所述的细胞；(b)使(a)的所述细胞与可与所述免疫调节剂特异性识别和/或结合的靶标接触，从而使得所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
本申请所述细胞可与所述免疫调节剂所能特异性识别和/或结合的靶标接触，使得所述转录激活控制域令所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
在本申请中，所述表达上调可以指，与不含有所述条件性转录激活控制域相比，所述免 疫调节剂在所述细胞中的表达水平上调至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少500％、至少1000％或以上。
在本申请中，所述接触可以在包括体内(例如，人体或动物模型中)和体外(例如体外培养的细胞和组织)的条件下进行。在本申请中，所述接触可以为表达所述靶标的细胞和所述细胞共孵育。例如，可以共孵育4小时以上、12小时以上或24小时以上。所述共孵育的条件(例如，包括共孵育所需的时间、温度、湿度、含氧量、CO 2浓度、培养基和转速等)均为本领域常规，并且可以根据所述细胞和表达所述靶标的细胞的实际情况来进行调整，只要能够使所述细胞表达的所述免疫调节剂所能特异性识别和/或结合所述靶标即可。
因此，本申请还涉及以下具体实施方案：
1、细胞，其表面包含能够特异性识别和/或结合靶标的免疫调节剂，所述细胞中编码所述免疫调节剂的核酸与其转录激活控制域可操作地连接，所述转录激活控制域为条件性转录激活控制域，且其中所述细胞表面的所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合使得所述转录激活控制域令所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
2、根据实施方案1所述的细胞，其中所述免疫调节剂在所述细胞中的表达不受组成型转录激活控制域的调控。
3、根据实施方案1-2中任一项所述的细胞，其中所述免疫调节剂在所述细胞中的表达受且仅受与其可操作连接的所述条件性转录激活控制域的调控。
4、根据实施方案1-3中任一项所述的细胞，其中所述免疫调节剂选自下组：嵌合抗原受体(CAR)、免疫检查点抑制剂和细胞因子。
5、根据实施方案1-4中任一项所述的细胞，其中所述条件性转录激活控制域位于编码所述免疫调节剂的核酸的上游。
6、根据实施方案1-5中任一项所述的细胞，其中编码所述免疫调节剂的核酸通过连接子与所述条件性转录激活控制域可操作地连接，所述连接子包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
7、根据实施方案1-6中任一项所述的细胞，其中所述条件性转录激活控制域包含NFAT结合位点。
8、根据实施方案7所述的细胞，其中所述NFAT结合位点结合NFAT家族成员。
9、根据实施方案8所述的细胞，其中所述NFAT家族成员选自下组：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、NFAT5、Spl和NKκB。
10、根据实施方案7-9中任一项所述的细胞，其中所述NFAT结合位点包括至少1个拷贝的NFAT结合序列。
11、根据实施方案10所述的细胞，所述NFAT结合序列包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:26。
12、根据实施方案7-11中任一项所述的细胞，其中所述细胞表面的所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合促进所述NFAT家族成员与所述条件性转录激活控制域中所述NFAT结合位点的结合，从而提高所述免疫调节剂的转录水平。
13、根据实施方案1-12中任一项所述的细胞，所述条件性转录激活控制域还包含启动子。
14、根据实施方案13所述的细胞，在所述条件性转录激活控制域中，所述NFAT结合位点位于所述启动子的上游。
15、根据实施方案13-14中任一项所述的细胞，所述NFAT结合位点与所述启动子直接或间接连接。
16、根据实施方案13-15中任一项所述的细胞，其中所述启动子选自下组：最小IL2启动子和最小CMV启动子。
17、根据实施方案1-16中任一项所述的细胞，所述条件性转录激活控制域包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1。
18、根据实施方案1-17中任一项所述的细胞，其中所述免疫调节剂为嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括细胞内结构域，所述细胞内结构域包括信号传导结构域和/或共刺激结构域。
19、根据实施方案18所述的细胞，其中所述信号传导结构域包含选自下组的部分：CD3ζ的信号传导结构域、CD3δ的信号传导结构域和CD3ε的信号传导结构域。
20、根据实施方案18-19中任一项所述的细胞，其中所述共刺激结构域包含选自下组的部分：CD27的共刺激结构域、CD28的共刺激结构域、CD137的共刺激结构域、ICOS的共刺激结构域和OX40的共刺激结构域。
21、根据实施方案18-20中任一项所述的细胞，其中所述CAR包含铰链区。
22、根据实施方案21所述的细胞，其中所述铰链区包含选自下组的部分：IgG4的CD8、IgG1的铰链区和CD8的铰链区。
23、根据实施方案18-22中任一项所述的细胞，其中所述CAR包含跨膜区。
24、根据实施方案23所述的细胞，其中所述跨膜区包含选自下组的部分：CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD24的跨膜区。
25、根据实施方案18-24中任一项所述的细胞，其中所述CAR包含靶向部分。
26、根据实施方案25所述的细胞，其中所述靶向部分包括ScFv。
27、根据实施方案25-26中任一项所述的细胞，其中所述靶向部分特异性结合和/或识别肿瘤抗原。
28、根据实施方案25-27中任一项所述的细胞，其中所述靶向部分特异性结合和/或识别选自下组的靶标：HER家族成员、CD19、CD20、CD33、CD138、BCMA、EGFR、EGFRVIII、PSMA、GD2、CEA和GPC3。
29、根据实施方案25-28中任一项所述的细胞，其中所述靶向部分特异性结合和/或识别选自下组的靶标：HER2和GPC3。
30、根据实施方案1-29中任一项所述的细胞，其中编码所述免疫调节剂的核苷酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25。
31、根据实施方案1-30中任一项所述的细胞，所述细胞选自下组：免疫细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞。
32、根据实施方案31所述的细胞，所述免疫细胞选自下组：T细胞、B细胞和NK细胞。
33、药物组合物，其包括实施方案1-32中任一项所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
34、使免疫调节剂在细胞中的表达上调的方法，其包括以下的步骤：
(a)提供实施方案1-32中任一项所述的细胞；
(b)使(a)的所述细胞与可与所述免疫调节剂特异性识别和/或结合的靶标接触，从而使得所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
35、实施方案1-32中任一项所述的细胞和/或实施方案33所述的药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖。
36、抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖的方法，所述方法包括使实施方案1-32中任一项所述的细胞和/或实施方案33所述的药物组合物与所述肿瘤或肿瘤细胞接触。
37、实施方案36所述的方法，其中所述接触为体外接触。
38、抑制受试者中的肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用实施方案1-32中任一项所述的细胞和/或实施方案33所述的药物组合物。
39、实施方案35所述的用途或实施方案36-38中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自下组：肝癌、肺癌、白血病和乳腺癌。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的装置、方法和系统的工 作方式，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
下面显示的实施例意在说明本申请的具体实施方案，并且不意在以任何方式限制本说明书或权利要求书的范围。
实施例1、慢病毒载体的构建
(1)重组慢病毒载体构建
分别人工合成NFAT结合位点启动子(SEQ ID NO:1)、4D5ScFv(SEQ ID NO:2)、FRP5ScFv(SEQ ID NO:3)、CD8-CD137-CD3ζ(SEQ ID NO:4)、2A(SEQ ID NO:5)、GFP(SEQ ID NO:6)、EF1a(SEQ ID NO:7)、PEST(SEQ ID NO:8)、HER2(SEQ ID NO:9)和mCHERRY(SEQ ID NO:10)，然后构建如表1所示的慢病毒载体，其中NFAT结合位点启动子作为条件性转录激活控制域。具体步骤如下：
表1、慢病毒载体的结构
编号 慢病毒 结构示意
1 NFAT-4D5CAR NFAT-4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ-2A-GFP
2 EF1a-4D5CAR EF1a-4D5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ-2A-GFP
3 EF1a-FRP5CAR EF1a-FRP5ScFv-CD8-CD137-CD3ζ-PEST-2A-GFP
4 Tet-on-HER2 HER2-2A-mCHERRY
将NFAT结合序列(SEQ ID NO:26)和最小IL2启动子(SEQ ID NO:22)顺序融合，得到NFAT启动子序列(SEQ ID NO:1)。将慢病毒载体pHAGE(Addgene)用SpeI及NotI进行双酶切，回收载体片段。通过PCR扩增4D5ScFv(其中扩增引物4D5ScFv f和4D5ScFv r的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示)，并在其5’及3’端分别加入NotI及BamHI酶切位点。回收PCR扩增片段后，用NotI/BamH1对PCR扩增的4D5ScFv进行双酶切，回收酶切片段，并用T4连接酶对上述提到的载体及酶切回收片段进行连接。CD8-CD137-CD3ζ-2A-GFP通过全基因合成获得。最终得到NFAT-4D5CAR载体，编码NFAT-4D5CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，其结构类似如图1所示。
类似地，将包含EF1a启动子的慢病毒载体pHAGE用SpeI及NotI进行双酶切，回收载体片段。分别对4D5ScFv、FRP5ScFv序列进行PCR扩增(其中扩增引物FRP5ScFv f和FRP5ScFv r的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示)，并在5’和3’端加入BamHI酶切位点，扩增后回收扩增片段，用BamHI进行酶切；同时对慢病毒载体pHAGE 用BamHI进行酶切，回收载体片段，并将PCR片段连接入载体。CD8-CD137-CD3ζ-PEST-2A-GFP部分也用类似的方法进行扩增、酶切和连接。最终得到EF1a-4D5CAR和EF1a-FRP5CAR载体，编码EF1a-4D5CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO:16，编码EF1a-FRP5CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO:17。其中EF1a-4D5CAR载体的结构类似如图2所示。
通过全基因合成方式合成HER2全基因，并在HER2的上游下游分别加入AgeI/MluI酶切位点识别序列。对基因片段及tet-on3G慢病毒载体(购买于Addgene)进行AgeI/MluI双酶切，并用T4连接酶进行连接转化，构建TET-ON-HER2慢病毒载体。
(2)慢病毒包装及纯化
按照24小时传代周期提供HEK-293T细胞(购买于ATCC)，转染前更换培养液，每盘细胞用电动移液器更换5ml含2％FBS的DMEM培养基。
转染前取两支EP管，每支加500μl optim-MEM，向其中一支管加入慢病毒辅助载体7.5μg PSPAX2、5μg pMD2.G及步骤(1)中制备的载体(NFAT-4D5CAR载体、EF1a-4D5CAR载体、EF1a-FRP5CAR载体和Tet-on-HER2载体)10μg，混匀，得到含有质粒的支管；向另一支管加入浓度为1mg/ml PEI 45μl，充分混匀。然后将上述另一支管中的加有PEI的溶液逐滴加入至所述含有质粒的支管中，边加边混匀，室温静止30min后，逐滴均匀加入至前述HEK-293T细胞中。转染后6-8小时更换10ml含10％FBS的DMEM培养基。
48小时后，收取上清液至离心管中，3000g 4℃离心10min，并将上清液用0.45μm的滤器过滤后，准备进行纯化。
将上清液用超速离心机进行离心，27000rpm 4℃离心2小时。弃干上清，用200μl预冷PBS对沉淀进行重悬，无颗粒后置于4℃重悬过夜。过夜后，将病毒悬液取出并分装。将NFAT-4D5CAR载体、EF1a-4D5CAR载体、EF1a-FRP5CAR载体和Tet-on-HER2载体转染HEK-293T细胞后分别得到表达NFAT-4D5CAR、EF1a-4D5CAR、EF1a-FRP5CAR和Tet-on-HER2的HEK-293T细胞。
实施例2、重组慢病毒感染T淋巴细胞
感染实验可以按照本领域技术人员已知的常规方法进行。感染步骤如下：
(1)通过血液单采系统获得＞1×10 7个外周血单核淋巴细胞(PBMC)细胞。
(2)用抗人CD3/CD28抗体处理细胞
用PBS稀释抗人CD3及抗人CD28抗体(购买于近岸生物科技有限公司)至终浓度为1μg/ml的抗体混合液。向细胞培养皿中加入该抗体混合液，使其铺满培养皿，室温孵育2小 时。2小时后用PBS洗一次，备用。
(3)对T淋巴细胞进行激活处理
将分离的PBMC用T淋巴细胞培养液(TexMACS培养基+10％FBS+30IU/重组人IL-2)进行重悬，使终浓度为1×10 6个细胞/ml，并放入步骤(2)中处理过的培养皿中培养，培养条件为37℃、5％CO 2，培养时间为24小时，得到已激活的T淋巴细胞。
(4)对激活的T淋巴细胞进行感染
(4.1)感染试剂配制
取一定量的T细胞培养液，加入终浓度为1mg/ml的synperonic F108，混匀，水浴锅加热至37℃待用。
(4.2)培养板处理
取1mg/mlαCD3及0.5mg/mlαCD28按1:1000的体积比稀释至适量的PBS缓冲液中，并取retronectin试剂，按终浓度5μg/cm 2稀释至该PBS缓冲液中，混匀后均匀铺至细胞皿，室温孵育2小时。2小时后用PBS进行洗涤并待用。
(4.3)慢病毒感染T淋巴细胞及T淋巴细胞维持
用步骤(4.3)中所配感染试剂稀释步骤(3)所得的已激活的T淋巴细胞，未感染慢病毒的T淋巴细胞为NT-T细胞，并按MOI＝3加入实施例1制备的慢病毒并混匀。均匀铺在步骤(4.2)中所处理的培养皿中。NFAT-4D5CAR慢病毒、EF1a-4D5CAR慢病毒、EF1a-FRP5CAR慢病毒感染T淋巴细胞后分别得到NFAT-4D5CAR-T(NH-CAR-T)细胞、EF1a-4D5CAR-T(EH-CAR-T)细胞、EF1a-FRP5CAR-T(EF-CAR-T)细胞。监测感染后的细胞的细胞密度，使密度维持在1×10 6个细胞/ml。14天内可扩增30-100倍。
(5)CAR-T细胞的分离
使用流式检测表达绿色荧光蛋白的细胞，分离得到NFAT-4D5CAR-T(NH-CAR-T)细胞、EF1a-4D5CAR-T(EH-CAR-T)细胞、EF1a-FRP5CAR-T(EF-CAR-T)细胞。
实施例3、CAR-T细胞的扩增、阳性率检测及抑制性表型检测
(3.1)CAR-T细胞扩增和阳性率检测
完成NFAT-4D5CAR-T(NH-CAR-T)细胞、EF1a-4D5CAR-T(EH-CAR-T)细胞、EF1a-FRP5CAR-T(EF-CAR-T)细胞等CAR-T细胞的病毒感染后24小时，500g离心5分钟后弃上清，用含有5％血清和500U/ml的IL2的X-VIVO 15(Lonza)培养基(或市售无血清T淋巴细胞培养基)重悬CAR-T细胞，调整密度到0.5x10e5/ml，静置于37℃CO 2培养箱中静置 培养。每两天进行一次细胞计数并将密度重新调整至0.5x10e5/ml，确保CAR-T细胞在良好的培养状态下扩增。在合适的时间通过流式细胞仪对CAR-T阳性率进行检测：由于GFP与CAR基因偶联表达，GFP的表达率代表了T淋巴细胞中CAR表达的阳性率，可通过流式细胞仪直接检测。
NH-CAR-T细胞、EH-CAR-T细胞和NT-T细胞的扩增结果如图4所示，结果显示EH-CAR-T细胞的扩增倍数明显低于NH-CAR-T细胞和NT-T细胞的扩增倍数。
扩增过程中NH-CAR-T细胞、EH-CAR-T细胞的阳性率变化如图5所示，结果显示，EH-CAR-T细胞的阳性率在扩增过程中随时间的增加在持续下降，而NH-CAR-T细胞的阳性率在扩增过程中保持相对稳定。分析EH-CAR-T细胞出现上述扩增结果的原因可能是CAR抗体的二聚化导致了EH-CAR-T细胞的高水平自激活进而诱导了程序性死亡(AICD)，使EH-CAR-T细胞的阳性率和总体扩增倍数均受到了影响。
(3.2)抑制性表型TIM3和PD-1检测
在CAR-T细胞扩增的第9天，将5x10e5T淋巴细胞与1μg TIM3-BV421(biolegend)抗体及1μg PD-1-APC(BD)抗体在50μl PBS体系中4℃孵育30分钟，2mlPBS洗涤并500g离心5分钟去上清后重悬于200μl PBS中用流式细胞仪首先检测GFP、确定CAR表达的T淋巴细胞，然后检测CAR表达的T淋巴细胞中的BV421、APC，检测结果如下表2所示。
结果显示NFAT-4D5CAR-T(NH-CAR-T)细胞的抑制性指标TIM3和PD-1明显低于EF1a-4D5CAR-T(EH-CAR-T)细胞。由于PD-1的高表达与T淋巴细胞激活程度有一定的正相关性，该结果进一步表明在接触HER2抗原前，EF1a-4D5CAR-T(EH-CAR-T)细胞比NFAT-4D5CAR-T(NH-CAR-T)细胞更易发生CAR抗体的二聚化进而发生EH-CAR-T细胞的高水平自激活进而诱导了程序性死亡(AICD)。
表2、抑制性指标TIM3和PD-1的检测结果
Figure PCTCN2019105667-appb-000001
实施例4、构建靶细胞
将实施例1制备的Tet-on-HER2慢病毒按MOI＝30感染总量为3×10 6个MDA-MB-468(以下写作MB468)细胞(购买于ATCC)。48小时后更换含有1μg/ml嘌呤霉素(puromycin) 的培养液继续培养，每天更换培养液。培养7天后，将培养液更换为含有50ng/ml阿霉素(dox)及1μg/ml puromycin的完全培养液。24小时后通过BD FACSAria II将细胞分选为单克隆，并铺于96孔板。待细胞铺满96孔板后，荧光显微镜镜下观察并筛选红色荧光较高的克隆株进行扩大培养，得到表达HER2细胞株MDA-MB-468-HER2 TET-ON。
消化分离MDA-MB-468-HER2 TET-ON细胞，用培养液将细胞稀释至1×10 6/ml，并将细胞铺至六孔板。向其中一孔中加入终浓度为10ng/ml的dox，将此组记为MDA-MB-468-HER2 TET- ONdoxy+(以下写作MB468-HER2 TET-ON)；向其中一孔中加入终浓度为1μg/ml dox，将此组记为MDA-MB-468-HER2 TET-ONdoxy++(以下写作MB231)，上述构建获得的靶细胞，即MDA-MB-468-HER2 TET-ON细胞、MB468-HER2 TET-ON细胞和MB231细胞均培养24小时，培养条件为1640+10％FBS，37摄氏度培养箱5％二氧化碳浓度培养。24小时后消化细胞，离心，并用20μl FBS重悬，加入终浓度为100μCi的 51Cr，37℃孵育20分钟。洗涤这些细胞，并将细胞用含有2％FBS+50IU/ml IL-2的1640稀释至1×10 5/ml，以备后续试验。
实施例5、靶细胞流式检测抗原表达
用胰蛋白酶/EDTA对实施例4得到的靶细胞进行消化，离心后取约2000000个细胞用100μl PBS重悬，并向重悬液中加入终浓度为5μg/ml的Human ErbB2/HER2PE-缀合抗体(R&D)，以同型对照抗体(R&D Mouse IgG1 PE-conjugated Antibody)做对照，4℃孵育30分钟，向其中加入1ml含2％BSA的PBS缓冲液，重复混匀后300g室温离心5分钟，弃上清后，用200μlPBS重悬，用流式细胞仪检测PE平均荧光强度。
构建的各靶细胞的HER2表达结果如图7和表3所示。其中，MB468细胞几乎不表达HER2分子，MB468-HER2 TET-ON细胞有极低表达，MB231细胞有较低表达，这些靶细胞分别可以模拟不同程度低表达抗原的正常组织细胞。高表达HER2的靶细胞SKOV3(购买于ATCC)可以模拟肿瘤组织细胞。
表3、各靶细胞的HER2表达结果
靶细胞名称 HER2平均荧光强度
MB468 325
MB468-HER2 TET-ON 2102
MB231 5864
SKOV3 25487
实施例6、CAR-T体外功能
(1)CAR-T感染效率流式检测
按照实施例2的方法，用EF1a-4D5CAR慢病毒及NFAT-4D5CAR慢病毒按MOI＝3来感染αCD3/αCD28激活24小时的T淋巴细胞，分别得到EF1a-4D5CAR-T细胞和NFAT-4D5CAR-T细胞。48小时后通过流式检测GFP表达水平。
通过流式细胞计数检测GFP阳性细胞百分比即可代表CAR表达的阳性细胞百分比，检测结果如图7所示，其中横坐标代表FITC荧光强度，纵坐标代表对应细胞强度下的细胞数。结果显示，NFAT-4D5CAR-T细胞在T淋巴细胞激活后CAR/GFP表达阳性率明显提高，而EF1a-4D5CAR-T细胞在T淋巴细胞激活前后都能持续性高表达CAR/GFP。
类似地，用实施例1制备的EF1a-FRP5CAR按MOI＝3来感染αCD3/αCD28激活24小时的T淋巴细胞，得到EF1a-FRP5CAR-T细胞。EF1a-4D5CAR-T细胞、NFAT-4D5CAR-T细胞和EF1a-FRP5CAR-T细胞可被称为效应细胞。
(2)激活条件下CAR表达丰度验证
向NFAT-4D5CAR-T细胞培养液中加入终浓度为2μg/ml的PHA-L，培养箱中放置12-24小时后取出，300g室温离心5分钟，检测GFP荧光强度。
在12孔细胞培养皿中，分别加入浓度为0ng/ml、10ng/ml、10ug/ml的HER2-FC融合蛋白500ul，室温放置4小时后，用PBS溶液洗三遍。然后将培养8天的NFAT-4D5CAR-T和EF1a-4D5CAR-T分别置于三个浓度组孔中培养24小时，24小时后用流式细胞仪检测GFP荧光强度，结果如图8。结果显示，NFAT-4D5CAR-T与靶蛋白接触24小时后的CAR表达阳性率与包被的靶蛋白的密度(浓度)成正相关，表明NFAT-4D5CAR-T细胞在遇到高表达靶蛋白的肿瘤细胞后CAR表达可能会上调，而EF1a-4D5CAR-T细胞的CAR表达不依赖于靶蛋白的丰度、持续高表达CAR分子。
(3)特异性杀伤检测
将效应细胞用2％FBS+50IU/ml IL-2的1640稀释至2*10 6/ml，将靶细胞(即MDA-MB-468-HER2 TET-ON细胞、MB468-HER2 TET-ON细胞和MB231细胞以及SKOV3细胞)各自与前述3种效应细胞(EF1a-4D5CAR-T、NFAT-4D5CAR-T和EF1a-FRP5CAR-T)分别以ET比为1、ET比为2及ET比为6的比例(ET比即效靶比，效应细胞，指CAR-T细胞，靶细胞指肿瘤细胞)，混合在圆底96孔板中，以1000rpm/min离心3分钟后，在培养箱中培养18小时。
并设置靶细胞自发释放组(与上述实验组等量靶细胞培养于含2％FBS的1640培养液)、靶细胞最大释放组(与实验组等量靶细胞培养于含2％FBS的1640培养液并加入细胞裂解液)、效应细胞自身释放组(与实验组对应等量的效应细胞培养于含2％FBS的1640培养液)、 培养液背景对照组(含2％FBS的1640培养液)。其中靶细胞最大释放组在检测前1小时加入10倍的裂解缓冲液，该裂解缓冲液为promega生产的CytoTox
Figure PCTCN2019105667-appb-000002
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒。
4小时后，收集50μl上清液，用promega生产的CytoTox
Figure PCTCN2019105667-appb-000003
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒进行检测LDH释放量，用酶标仪读取OD490吸光度。
其中，特异性裂解水平＝[(实验组-培养液对照组)-(靶细胞自身释放组-培养液对照组)]/[(靶细胞最大释放组-培养液对照组)-靶细胞自身释放组-培养液对照组)]×100％。
特异性裂解水平的测试结果如图9所示。图9说明，NFAT-4D5CAR-T细胞对高水平表达HER2的靶细胞肿瘤细胞SKOV3的特异性裂解水平非常高，然而对低水平表达HER2的靶细胞MB231和极低水平表达HER2的MB468-HER TET-ON的特异性裂解水平很低；而EF1a-4D5CAR-T细胞和EF1a-FRP5CAR-T细胞对低水平表达HER2的靶细胞MB231和MB468-HER TET-ON仍然有明显的杀伤能力。可见，NFAT-4D5CAR-T细胞显示了对肿瘤细胞的特异性杀伤能力。这是由于NFAT-4D5CAR-T细胞与HER2抗原接触后，激活NFAT通路促进NFAT-4D5CAR-T的表达水平所导致的。
(4)CAR表达情况持续监测
通过对NFAT-4D5CAR-T细胞及EF1a-4D5CAR-T细胞与SKOV3靶细胞接触72小时内的CAR/GFP表达情况持续监测(图10)，结果表明NFAT-4D5CAR-T细胞的CAR表达只有在接触高丰度靶抗原细胞后才快速升高并维持高表达，而EF1a-4D5CAR-T细胞无论是否与高丰度靶抗原细胞接触均能够持续性高表达CAR分子。
(5)CAR-T细胞因子释放检测
将效应细胞离心去上清，用2％FBS的1640稀释至5*10 5/ml，将无靶细胞(即不与肿瘤细胞共培养的CAR-T细胞)、MB468细胞、MB468-HER2 TET-ON细胞和MB231细胞以及SKOV3细胞均按ET比为1的比例与三种效应细胞(EF1a-4D5CAR-T、NFAT-4D5CAR-T和EF1a-FRP5CAR-T)混合于圆底96孔板中，共孵育18小时后，吸取上清，用BD生产的Cytometric Bead Array(CBA)Human Th1/Th2 Cytokine Kit检测上清液中IFN-γ及TNFα的含量。测试结果如图11、图12、图13所示。如图11所示，NFAT-4D5CAR-T细胞在接触高水平表达HER2的靶细胞SKOV3后所表达的IFN-γ的水平非常高，然而在接触低水平表达HER2的靶细胞MB231时IFN-γ的水平明显降低，接触极低水平表达HER2的靶细胞MB468-HER TET-ON所表达的IFN-γ水平与对照组(MB468细胞)接近；而EF1a-4D5CAR-T细胞在接触低水平表达HER2的靶细胞MB231以及极低表达HER2的靶细胞MB468-HER TET-ON后均 有大量IFN-γ产生，此外，EF1a-4D5CAR-T细胞本身就有明显的IFN-γ分泌，这可能与4D5系列形成的CAR-T本身会引起一定的细胞自激活有关，而NFAT-4D5CAR-T细胞很好的避免了这一问题。细胞因子TNFα和IL-2的情况与前述IFN-γ的情况类似(如图12和图13所示)。此外，根据图11和图12，我们发现NFAT-4D5CAR-T细胞的细胞因子释放效应和EF1a-FRP5CAR-T的细胞因子释放效应接近，且EF1a-FRP5CAR-T在临床上已经被证实是安全的。
(6)效应细胞的细胞凋亡反应(AICD)检测
将SKOV3细胞分别与NT-T细胞(即未转染的T细胞)、NFAT-4D5CAR-T细胞和EF1a-4D5CAR-T细胞按ET比1共孵育4小时，4小时后吸取悬浮的共孵育的细胞，用PI进行染色，流式检测GFP阳性细胞中PI显色细胞所占的百分比，即代表效应细胞被激活后，在行驶效应功能后，效应细胞自身凋亡死亡的百分比。
其中共孵育4小时后的结果如图14所示。图14说明NFAT-4D5CAR-T细胞与SKOV3细胞接触后，NFAT-4D5CAR-T细胞没有发生明显的凋亡死亡，而EF1a-4D5CAR-T细胞与SKOV3细胞接触后，EF1a-4D5CAR-T细胞发生了明显的凋亡死亡。共孵育24小时后的结果如图15所示。图15的结果与图14类似，与SKOV3细胞接触24小时后，EF1a-4D5CAR-T细胞发生了明显的凋亡死亡，而NFAT-4D5CAR-T没有明显凋亡死亡。
可见NFAT-4D5CAR-T相比于EF1a-4D5CAR-T对抗原表达量低的细胞(如非肿瘤的正常细胞)杀伤更弱，在保证对肿瘤细胞杀伤作用情况下，NFAT-4D5CAR-T具有更低的AICD作用，因此对靶细胞的作用时间更持久。
实施例7、CAR-T体内功能
从百奥赛图购买免疫中度缺陷的NSG小鼠，在经过一周的环境适应后，分别在每只小鼠的背部左侧接种低水平表达HER2的MB231细胞、用于模拟正常组织器官中低水平表达HER2的细胞，在背部右侧接种高水平表达HER2的SKOV3细胞、用于模拟高水平表达HER2的肿瘤组织。在肿瘤生长14天后进行CAR-T尾静脉注射，实验组分别注射NFAT-4D5CAR-T细胞、EF1a-FRP5CAR-T细胞以及EF1a-4D5CAR-T细胞，对照组注射未感染的NT-T细胞，剂量均为2x10e6，观察肿瘤的生长情况(图16)。结果显示，NFAT-4D5CAR-T细胞、EF1a-FRP5CAR-T细胞以及EF1a-4D5CAR-T细胞均能有效抑制SKOV3肿瘤的生长并消除肿瘤(图16B)，但是EF1a-4D5CAR-T对HER2低表达的MB231细胞也具有抑制和消除的效果，而EF1a-FRP5CAR-T细胞对MB231细胞虽然也有抑制效果，但MB231肿瘤细胞仍在生长，NFAT-4D5CAR-T细胞对MB231细胞几乎没有抑制作用，其肿瘤生长速度与对照组相当(图 16A)。CAR-T注射后第7天检测血清中IFN-γ浓度(图16C)，结果显示EF1a-4D5CAR-T组的IFN-γ水平显著高于NFAT-4D5CAR-T组和EF1a-FRP5CAR-T组。结果表明本申请所述的细胞能够在杀伤靶抗原高表达的肿瘤的同时有效避免对靶抗原低表达的正常组织的损伤，且其避免由于不能与肿瘤细胞有效结合的脱靶效应而产生的毒性的效果优于通过筛选低亲和力高杀伤活性抗体的策略，实施容易度也显著高于低亲和力高杀伤活性抗体筛选策略。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (10)

  1. 细胞，其表面包含能够特异性识别和/或结合靶标的免疫调节剂，所述细胞中编码所述免疫调节剂的核酸与其转录激活控制域可操作地连接，所述转录激活控制域为条件性转录激活控制域，且其中所述细胞表面的所述免疫调节剂对所述靶标的特异性识别和/或结合使得所述转录激活控制域令所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
  2. 根据权利要求1所述的细胞，其中所述免疫调节剂在所述细胞中的表达受且仅受与其可操作连接的所述条件性转录激活控制域的调控。
  3. 根据权利要求1-2中任一项所述的细胞，其中所述条件性转录激活控制域包含NFAT结合位点。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的细胞，所述条件性转录激活控制域还包含启动子。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的细胞，所述条件性转录激活控制域包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的细胞，其中所述免疫调节剂为嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括细胞内结构域，所述细胞内结构域包括信号传导结构域和/或共刺激结构域。
  7. 药物组合物，其包括权利要求1-6中任一项所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
  8. 使免疫调节剂在细胞中的表达上调的方法，其包括以下的步骤：
    (a)提供权利要求1-7中任一项所述的细胞；
    (b)使(a)的所述细胞与可与所述免疫调节剂特异性识别和/或结合的靶标接触，从而使得所述免疫调节剂在所述细胞中的表达上调。
  9. 抑制肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖的方法，所述方法包括使权利要求1-8中任一项所述的细胞和/或权利要求7所述的药物组合物与所述肿瘤或肿瘤细胞接触。
  10. 抑制受试者中的肿瘤或肿瘤细胞生长和/或增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-9中任一项所述的细胞和/或权利要求7所述的药物组合物。
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