RU2178306C2 - Растворимые полипептидные фракции протеина lag-3, способ получения, терапевтическая композиция, антитело - Google Patents
Растворимые полипептидные фракции протеина lag-3, способ получения, терапевтическая композиция, антитело Download PDFInfo
- Publication number
- RU2178306C2 RU2178306C2 RU96123299/14A RU96123299A RU2178306C2 RU 2178306 C2 RU2178306 C2 RU 2178306C2 RU 96123299/14 A RU96123299/14 A RU 96123299/14A RU 96123299 A RU96123299 A RU 96123299A RU 2178306 C2 RU2178306 C2 RU 2178306C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lag
- cells
- soluble polypeptide
- polypeptide fraction
- class
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 101710114827 Protein lag-3 Proteins 0.000 title claims abstract 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 167
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims abstract description 166
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 32
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 30
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 13
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 106
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 26
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 8
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 7
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- NZHMRCRLJQRBCZ-UHFFFAOYSA-N N=C=S.F Chemical compound N=C=S.F NZHMRCRLJQRBCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- XZKAKQROJCKAOP-YWZUXTQFSA-N p20 peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 XZKAKQROJCKAOP-YWZUXTQFSA-N 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical class C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710094503 Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000000285 follicular dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и включает растворимые полипептидные фракции протеина LAG-3, способ получения, терапевтическую композицию и антитело. Сущность изобретения включает растворимые полипептидные фракции мембранного протеина LAG-3, пригодные для использования в качестве иммуносупрессоров, способ их получения, а также антитела, способные предотвращать специфическую фиксацию протеина LAG-3 на молекулах СМН (главного комплекса гистосовместимости) класса II, для применения в качестве иммуностимуляторов. Преимущество изобретения заключается в том, что заявляемые пептиды обладают способностью связываться с молекулами СМН второго класса и обладать иммуноподавляющим действием, а также неожиданным иммуно-стимулирующим действием анти-СД4-антител. 6 с. и 8 з. п. ф-лы, 15 ил. , 5 табл.
Description
Изобретение относится к растворимым формам, происходящим от мембранного протеина LAG-3 и пригодным в качестве иммунодепрессоров, так же, как к антителам, способным предотвращать специфическую фиксацию протеина LAG-3 на молекулах CMH (главный комплекс гистосовместимости) класса II, в качестве иммуностимуляторов.
В ВОИС - А 91/10682 описывается протеин, обозначаемый LAG-3.
Протеин LAG-3 представляет собой протеин, селективно экспрессируемый активированными NK-клетками и активированными T-лимфоцитами. Сходство последовательности аминокислот, сравнительная экзон-интронная структура и хромосомная локализация показывают, что LAG-3 является родственным CD 4. Первоначальная характеристика гена LAG-3 описывается TRIEBEL и др. (I).
Соответствующая ДНК кодирует трансмембранный протеин из 498 аминокислот типа I, включающий 4 внеклеточных последовательности иммуноглобулинового типа. LAG-3 является членом надсемейства иммуноглобулинов.
Зрелый протеин включает 476 аминокислот (последовательность N 1) с теоретической молекулярной массой 52 кД. Внеклеточная область содержит 8 цистеиновых остатков и 4 потенциальных сайта N-гликозилирования. С помощью Вестерн-блоттинг-анализа показано, что LAG-3 внутри ФГА-бластов или активированных NK-клеток имеет кажущуюся массу Mr = 70000. После обработки с помощью N-гликозидазы - достигают уменьшения размера до 60 кД, демонстрирующего также, что нативный LAG-3 гликолизирован. Подробности описаны в ВОИС-А 91/10682.
BAIXERAS и др. в J. Exp. Med, 176, 327-337 (2), кроме того, описывают, что образование розеток между трансфицированными с помощью LAG-3 клетками (экспрессирующими LAG-3 на своей поверхности) и B-лимфоцитами, экспрессирующими CMH класса II, специфически зависит от взаимодействия LAG-3 с CMH класса II.
Неожиданно оказалось, что этот лиганд CMH класса II обнаруживается в более высоких количествах на активированных лимфоцитах CD8 (ограниченных CMH класса I), чем на активированных лимфоцитах CD4. Ин виво, некоторые одиночные рассеянные клетки LAG-3 (ограниченные CMH класса II) находят в лимфоидной негиперплазической ткани, включающей первичные лимфодные органы, то есть тимус и костный мозг.
Клетки LAG-3 находят в лимфоидных гиперплазических узлах и миндалинах, так же как в одноядерных клетках периферической крови (PBMC) пациентов, получающих инъекции повышенных доз интерлейкина-2.
Эти наблюдения подтверждают, что LAG-3 представляет собой активационный антиген в противоположность CD4, экспрессируемый в субпопуляции покоящихся лимфоцитов и других клеточных типов, особенно в макрофагах.
CMH включает молекулы класса I и класса II, являющиеся мембранными гликопротеинами, которые представляют собой фрагменты протеиновых антигенов к рецепторам T-лимфоцитов (TCR). Молекулы класса I ответственны за презентацию цитотоксическими клетками CD8+ пептидов, происходящих большей частью от синтезированных эндогенным путем протеинов, тогда как молекулы класса II представляют собой вспомогательные лимфоциты CD4+ пептидов, происходящих в первую очередь от чужеродных протеинов, которые вводят эндоцитным, то есть экзогенным, путем. Вспомогательные T-лимфоциты регулируют и амплифицируют иммуноответ, тогда как цитотоксические лимфоциты необходимы для разрушения клеток, каковы бы ни были ткани, экспрессирующие антигены чужеродного ("не своего") типа, например, вирусные антигены. Механизм распознавания вводит в действие внутриклеточные сигналы, приводящие к эффективной активации T-лимфоцитов.
Оказывается, что для инициации иммуноответа на медиацию T-лимфоцитов (CD4+) чужеродные антигены должны быть "захвачены", интернализованы в форме пептидов специализированными клетками: антигенпредставляющими клетками (АПК). Получаемые в результате антигенные пептиды реэкспрессируют на поверхности антигенпредставляющих клеток, где они ассоциируются с молекулами CMH второго класса. Этот комплекс CMH второго класса / пептид специфически распознается T-лимфоцитным рецептором, откуда возникает активация вспомогательных T-лимфоцитов.
Кроме того, создаваемые способами рекомбинации животные модели позволяют подчеркнуть роль, которые играют ин виво молекулы CMH второго класса и их лиганды.
Так, мыши с недостатком молекул CMH второго класса (3) и практически не имеющие периферических T-лимфоцитов CD4+ и содержащие только несколько незрелых лимфоцитов CD4+ в тимусе, полностью неспособны отвечать T-зависимым антигенам.
Мутантные мыши CD4-/- (4) обладают заметно уменьшенной активностью T-лимфоцитов, но показывают нормальные развитие и функцию T-лимфоцитов CD8+, что демонстрирует, что экспрессия CD4 в дочерних клетках и тимоцитах CD4+CD8+ не является обязательной для развития. По сравнению с нормальными мышами, мыши с недостатком CD4 имеют большее количество клеток CD4-CD8-.
Эти клетки с двойным отрицательным зарядом ограничены CMH второго класса и способны распознавать антиген.
Когда их инфицируют с помощью Leishmania, эти мыши показывают популяцию вспомогательных функциональных T-лимфоцитов несмотря на отсутствие CD4. Эти клетки ограничены CMH второго класса и продуцируют γ -интерферон, когда они активированы антигеном. Это указывает на то, что происхождение T-лимфоцитов и их периферическая функция необязательно должны зависеть от функции CD4.
В настоящее время считают, что кодированные участком CMH второго класса протеины вовлекаются в многочисленные аспекты иммунного распознавания, включая туда взаимодействие между различными лимфоидными клетками, как лимфоциты и антигенпредставляющие клетки. Различные наблюдения также показывают, что другие механизмы, не через посредство CD4, принимают участие в активационной функции вспомогательных T-лимфоцитов.
Эти различные наблюдения подчеркивают главную роль, которую играет CMH второго класса и его лиганды в иммунной системе.
Кроме того, известно участие химерных молекул, образованных внецитоплазматическим доменом протеинов, способных фиксироваться на лигандах, и константной областью цепей человеческих иммуноглобулинов (Ig) в получении растворимых форм протеинов и клеточных рецепторов, пригодных особенно в качестве терапевтических агентов.
Так, растворимые формы CD4 проявляют свою эффективность в ингибировании инфекции за счет ВИЧ ин витро зависимым от дозы образом.
Однако, клинические испытания с растворимыми молекулами CD4, особенно CD4 - Ig, не позволили выявить значительное уменьшение вирусных титров. Были "созданы" трансгенные мыши, экспрессирующие вплоть до 20 мкг/мл растворимых CD4 в их сыворотке. Эти мыши не показывают никакого отличия в том, что касается их иммунной функции, по сравнению с контрольными мышами. Вплоть до настоящего времени не установлено никакой прямой связи с CMH второго класса происходящих от CD4 молекул. Это наводит на мысль, что растворимые CD4 не взаимодействуют ин виво с окрашенными молекулами CMH второго класса.
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что растворимые молекулы, содержащие различные фрагменты внецитоплазматического домена протеина LAG-3, способны связываться с молекулами CMH второго класса и обладать иммуноподавляющим действием.
Внецитоплазматический участок LAG-3, обозначаемый последовательностью N 1, включает домены Д1, Д2, Д3, Д4, охватывающие аминокислоты 1-149, 150-239, 240-330 и 331-412, соответственно.
Предметом изобретения также является полипептидная растворимая (часть) фракция, образованная целиком или частью по крайней мере одного из четырех внеклеточных доменов иммуноглобулинового типа протеина LAG-3 (аминокислоты 1-149, 150- 239, 240-330 и 331-412 последовательности N 1) или пептидной последовательностью, происходящей от этих доменов за счет замены, присоединения и/или делеции одной или нескольких аминокислот, и которая обладает специфичностью, по крайней мере равной или выше таковой LAG-3 в его лиганде.
Настоящее изобретение особенно относится к растворимым полипептидным фракциям, обладающим последовательностью, образованной от нативной последовательности LAG-3 вследствие хорошо известного явления политипии.
Растворимая полипептидная фракция отличается тем, что она включает пептидный участок LAG-3, ответственный за сродство LAG-3 к молекулам CMH второго класса.
Растворимая полипептидная фракция в особенности включает пептидную последовательность, образованную из этих доменов за счет замены, присоединения и/или делеции одной или нескольких аминокислот, и которая обладает специфичностью, равной или выше таковой LAG-3 в его лиганде, например, совокупность двух первых доменов иммуноглобулинового типа LAG-3 или 4 домена иммуноглобулинового типа внецитоплазматического участка LAG-3.
Предпочтительно, растворимая полипептидная фракция образована целиком или частью по крайней мере одного из четырех внеклеточных доменов иммуноглобулинового типа протеина LAG-3 (аминокислоты 1-149, 150-239, 240-330 и 331-412 последовательности N 1), включающего замещение глутаминовой кислотой (Glu) одного или нескольких аргининовых остатков (Arg) в положениях 73, 75 и 76 последовательности N 1.
Предпочтительно, растворимая полипептидная фракция включает петлю, среднее положение атомов которой, образующих основную цепь, представлено позицией аминокислот 46-47 (последовательность N 1), представленной в таблице 1 или таблице 2, или отличается от нее самое большее на 5%.
Растворимая полипептидная фракция, кроме того, предпочтительно включает второй внеклеточный домен (Д2) иммуноглобулинового типа LAG-3 (аминокислоты 150 -239).
Предпочтительно, растворимая полипептидная фракция включает, кроме вышеуказанной пептидной последовательности LAG-3, дополнительную пептидную последовательность на C-конце и/или N-конце, так, чтобы образовать слитый белок. Термин "слитый белок" означает часть любого протеина, позволяющую осуществлять модификацию физико-химических характеристик субфрагмента внецитоплазматического домена протеина LAG-3. Такие слитые белки, например, содержат фрагменты внецитоплазматического домена LAG-3, такие, как указанные выше, связанные с областью связывания -CH2-CH3 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, предпочтительно иммуноглобулина изотипа IgG4.
Такие слитые белки могут быть димерными или мономерными. Эти слитые белки могут быть получены с помощью хорошо известных специалисту методов рекомбинации, например, с помощью способа, описанного Traunecker и др. (5).
Вообще, способ получения этих слитых белков, включающих иммуноглобулиновую область, соединенную с вышеописанной пептидной последовательностью LAG-3, состоит в том, что в вектор вставляют фрагменты кДНК, кодирующие полипептидные области, соответствующие LAG-3 или производным LAG-3, возможно после амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), и кДНК, кодирующую подходящую область иммуноглобулина, соединенную с кДНК, кодирующей соответствующие полипептидные или образованные от LAG-3 области, и после трансфекции фрагменты кДНК экспрессируют в системе экспрессии, особенно в клетках млекопитающих, например, в клетках яичника хомяка.
Слитые белки согласно изобретению также могут быть получены путем расщепления конъюгата LAG-3 - - Ig, сконструированного так, что он содержит соответствующий сайт расщепления.
Предметом изобретения также является терапевтическая композиция с иммуноподавляющей активностью, включающая растворимую полипептидную фракцию согласно изобретению. Эта композиция пригодна для лечения патологий, при которых необходима иммуносупрессия, например, аутоиммунных заболеваний.
Предметом изобретения также является использование антител, направленных против LAG-3, или растворимых полипептидных фракций, образованных от LAG-3, таких, как указанные выше, или фрагментов таких антител, особенно фрагментов Fab, Fab', F(ab')2, для приготовления терапевтической композиции с иммуностимулирующей активностью. Термин "иммуностимулирующий" обозначает молекулярную совокупность, способную стимулировать созревание, дифференцирование, пролиферацию и/или функцию клеток, экспрессирующих LAG-3, то есть активированных T-лимфоцитов или NK-клеток (естественных киллерных клеток). Антитела против LAG-3 (анти-LAG-3-антитела) могут быть использованы в качестве потенциализаторов (усилителей) вакцин или иммуностимуляторов в случае пациентов с подавленной (угнетенной) иммунной системой, таких, как больные, инфицированные ВИЧ или обработанные иммуноподавляющими средствами, или они могут быть использованы для стимуляции иммунной системы за счет удаления из нее клеток, обладающих анормальным состоянием, например, раковых клеток.
Иммуностимулирующая активность анти-LАG-3 -антител является неожиданной там, где анти-CD4-антитела оказывают иммуноподавляющее воздействие.
Такие антитела могут быть поликлональными или моноклональными; однако, предпочтительны моноклональные антитела. Поликлональные антитела могут быть получены хорошо известными методами, например, таким, как описанный BENEDICT А. А. и др. (6). Предпочтительны моноклональные антитела вследствие того, что они специфичны для одного эпитопа и дают результаты с лучшей воспроизводимостью. Методы получения моноклональных антител хорошо известны из уровня техники, в особенности метод, описанный KOHLER и MILSTEIN. Этот метод, так же, как его варианты, описаны YELTON и др. (7).
Предметом изобретения также являются антиидиотипические антитела, направленные против антител согласно изобретению, которые включают "внутренний образ" LAG-3 и, следовательно, способны связываться с CMH второго класса. Такие антитела могут быть использованы особенно в качестве иммуноподавляющих средств и, например, при аутоиммунных патологиях.
Терапевтические композиции согласно настоящему изобретению включают растворимые протеины LAG-3 или антитела, такие, как указанные выше, так же как фармацевтически приемлемый эксципиент. Эти композиции могут быть сформулированы обычными способами. Эксципиент может изменяться в зависимости от выбранного пути введения: орально, парентерально, подъязычно, ректально или через нос.
В случае предназначенных для парентерального введения композиций эксципиент обычно включает стерильную воду, так же, как другие возможные ингредиенты, повышающие растворимость или пригодность для хранения композиции. Парентеральные пути введения могут заключаться во внутривенных, внутримышечных или подкожных инъекциях.
Терапевтическая композиция может быть пролонгированного действия, особенно для обработок в течение длительного периода времени, например, в случае аутоиммунных заболеваний. Вводимая доза зависит от излечиваемого субъекта, особенно от способности его иммунной системы достигать желательной степени защиты. Точные количества вводимого активного ингредиента могут быть легко определены практикующим врачом, который назначает лечение.
Терапевтические композиции согласно изобретению могут включать, кроме растворимого LAG-3 или антител согласно изобретению, другой активный ингредиент, возможно связанный химической связью с LAG-3 или с антителом согласно изобретению. В качестве примера можно назвать растворимые протеины LAG-3 согласно изобретению, связанные с токсином: например, как рицин или дифтерийный анатоксин, способные фиксироваться на молекулах CMH второго класса и убивать клетки, против которых они направлены, например, лейкемические клетки или клетки меланомы; или связанные с радиоактивным изотопом.
Следующие примеры, так же, как прилагаемые стандартизованные чертежи, иллюстрируют подробно изобретение.
Пример 1: Пролиферация линий активированных T-лимфоцитов в присутствии моноклональных антител против LAG-3
Моноклональными анти-LAG-3-антителами, которые используют, являются 17. B4, описанное BAIXERAS и др. (2) и депонированное в Национальной коллекции культур и микроорганизмов под номером 1-1240 10 июля 1992 г. , и 11 E3, описанное HUARD и др. (8).
Моноклональными анти-LAG-3-антителами, которые используют, являются 17. B4, описанное BAIXERAS и др. (2) и депонированное в Национальной коллекции культур и микроорганизмов под номером 1-1240 10 июля 1992 г. , и 11 E3, описанное HUARD и др. (8).
Эти антитела принадлежат к изотипу IgGI. Эти антитела испытывают в отношении их биологического воздействия на активированные T-лимфоциты, стимулированные специфическими антигенными пептидами или перестроенными антигенами, представляемыми молекулами CMH второго класса, экспрессированными автологичными антигенпредставляющими клетками, экспрессирующими LAG-3.
Моноклональное антитело против CD48, обозначаемое 10 H3, используют в качестве неподходящего антитела IgGI (отрицательный контроль).
Насыщающие концентрации анти-LAG-3- и анти-CD48-антител определяют путем иммунофлуоресценции на ФГА-бластах (фитогемагглютинин) и линиях клеток, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (ЭБВ). В опытах по пролиферации, моноклональные антитела добавляют в количестве, в 5 раз превышающем насыщенную концентрацию.
Используемые линии T-лимфоцитов представляют собой, с одной стороны, клон 154, происходящий от лимфоцитов периферической крови, выращенной против пептида, имитирующего фрагмент гемагглютинина (HA) гриппа, который обладает аминокислотной последовательностью, охватывающей аминокислоты 306 - 329 (пептид p20); с другой стороны, клон 28, T-лимфоцитный клон, происходящий от периферических лимфоцитов одного человеческого донора, выращенный против дифтерийного анатоксина (ДТ). Антигенпредставляющие клетки (АПК), соответствующие клону 154, являются B-лимфоцитами, трансформированными вирусом Эпштейна-Барра того же самого донора (DR 3/DR 11), что и T 154. Антигенпредставляющие клетки, соответствующие клону 28, являются B-лимфоцитами, трансформированными вирусом Эпштейна-Барра одного и того же донора. Этот клон ограничен главным комплексом гистосовме-стимости человека - донора 7.
В случае клона 154, АПК (5•106) инкубируют при 37oC в течение 1,5 часов с изменяемыми дозами пептида p20, затем промывают и облучают (10000 рад. ). Клетки наносят монослоем на микротитрационный планшет с 96 углублениями одновременно с клетками клона 154 (0,5•105 - 10•105 клеток на мл) в соотношении 3: 1. Для клона 28 соотношение отвечающие клетки/стимулирующие клетки составляет 1.
Антигенпредставляющие клетки главного комплекса гистосовместимости человека DR 7/ ЭБВ обрабатывают митомицином или облучают, затем добавляют к T-лимфоцитам в присутствии ДТ (который остается в культуре). Конечная концентрация клеток клона 28 составляет 100000 клеток на мл.
3H-Тимидин (1 микрокюри/углубление) добавляют в интервалы времени, изменяющиеся от дня 2 до дня 10 культивирования.
Каждый эксперимент повторяют трижды.
Результаты выражают в виде среднеарифметического числа импульсов в минуту и после вычитания числа импульсов в минуту, обнаруженных в отрицательном контроле (T-лимфоциты, сокультивированные с незаряженными, в виде иммуногенов, АПК). Опыты по пролиферации осуществляют на планшетах с 96 углублениями. Абсорбцию меченного тритием тимидина в индивидуальных углублениях по 200 мкл измеряют после добавления 1 микрокюри тимидина в последние 18 часов культивирования. Результаты выражают в виде среднего из трех опытов. Типичное отклонение обычно составляет величину менее 12% (немного больше в случае измерений очень незначительного числа импульсов в минуту). С другой стороны, недостаточные жидкости смешанной культуры (клон 154/АПК) собирают, отфильтровывают при использовании мембран с порами размером 0,22 мкм, разделяют на образцы и замораживают при -20oC вплоть до момента титрации с помощью имеющихся в продаже наборов для иммуно-испытаний: набор для титрации IL-2 и INF- α фирмы Иммунотех; набор IFN-γ фирмы Гензим и набор IL-4 фирмы Саумап Chemicals.
Изучение в отношении определения дозы осуществляют для установления профилей (контуров) пролиферации клона 154 в присутствии специфического антигена p20 в изменяемых концентрациях и в присутствии или нет моноклональных анти-LAG-3-антител или моноклональных чужеродных (неподходящих) антител (отрицательный контроль).
Индивидуальные результаты 16 различных опытов показывают, что, какова бы ни была концентрация добавленного антигена, начальная точка вплоть до пика пролиферации не изменяется, однако систематически наблюдают значительное продление пролиферации T-лимфоцитов, инкубируемых с моноклональными анти-LAC2-3-антителами. Фрагменты Fab моноклонального антитела 17B4 получают и используют в опыте по пролиферации клона 154. Профиль пролиферации T-лимфоцитов, активированных антигеном с фрагментами Fab 17B4 (15 мкг/мл), подобен таковому клеток, инкубированных в присутствии целого моноклонального антитела 17B4 (40 мкг/мл) (фиг. 1). Эти результаты показывают, что наблюдаемые биологические эффекты нельзя приписать неспецифической реакции, индуцируемой областью Fc моноклональных анти-LAG-3-антител.
Подобные результаты получают при использовании моноклональных анти-LAG3-антител IIE3.
Клон 28 также стимулируют антигеном (столбнячный анатоксин, 10 мкг/мл) в присутствии моноклональных антител 17B4 после сокультивирования с соответствующими антигенпредставляющими клетками (АПК) в присутствии ДТ. Результаты представлены на фиг. 2.
Эффекты моноклональных анти-LAG-3-антител, наблюдаемые в случае клона 28, а именно прологация пролиферации, подобны таковым, наблюдаемым в случае клона 154.
Были проведены опыты, предназначенные для определения разнообразных клеточных событий (les evenements), происходящих после антигенной стимуляции клеток клона 154, инкубированных в присутствии моноклональных анти-LAG-3-антител.
Клетки собирают во время классической антигенной стимуляции клона 154 в присутствии моноклональных анти-LAG-3- или анти-CD48-антител или в присутствие антител и испытывают для экспрессии трансмембранных рецепторов LAG-3 и CBB25 и образцы культуральных надосадочных жидкостей отбирают в различные интервалы времени после стимуляции и испытывают на наличие γ -интерферона, α -фактора некроза опухоли, интерлейкина-4 и интерлейкина-2.
Опыты в случае прямой иммунофлуоресценции с 2 красителями (моноклональные анти-CD3-антитела и моноклональные анти-CD25-антитела) показывают, что рецепторы для интерлейкина-2 слабо, но значительно увеличиваются спустя 5 дней после антигенной стимуляции. Подобные опыты с моноклональными анти-CD3- и IIE3 (анти-LAG-3)-антителами показывают, что LAG-3, начиная со дня активации, сверхэкспрессируется. Кроме того, секреция интерлейкина-2, интерлейкина-4, γ -интерферона и α -фактора некроза опухоли также модулируется за счет инкубации с моноклональными анти-LAG-3-антителами, что свидетельствует о том, что различные события в клетках изменяются вследствие присутствия моноклональных анти-LAG-3-антител и что некоторые события происходят уже спустя 24 часа после стимуляции.
Эти результаты косвенно показывают, что LAG-3 играет роль регулятора в случае клеток CD4+. Тот факт, что моноклональные анти-LAG-3-антитела увеличивают пролиферацию, следовательно действуют как иммуноусилители, свидетельствует о том, что LAG-3 принимает участие в "дезактивации" T-лимфрцитов CD4+ при отрицательной роли LAG-3 в отношении зависимой от антигена стимуляции.
Пример 2: Транзиторная экспрессия слитых белков LAG-3
Растворимые протеины (белки), происходящие от LAG-3, получают по методу рекомбинантной ДНК с помощью соответствующих векторов, включающих ДНК, кодирующую LAG-3, и ДНК, кодирующую фрагмент иммуноглобулина. Система транзиторной экспрессии состоит из трансфицированных клеток Cos. Эта система позволяет продуцировать несколько миллиграммов рекомбинантных слитых белков. Методы рекомбинантной ДНК осуществляют как описано MANIATIS и др. (22). Изменения делают в соответствии с рекомендациями изготовителя.
Растворимые протеины (белки), происходящие от LAG-3, получают по методу рекомбинантной ДНК с помощью соответствующих векторов, включающих ДНК, кодирующую LAG-3, и ДНК, кодирующую фрагмент иммуноглобулина. Система транзиторной экспрессии состоит из трансфицированных клеток Cos. Эта система позволяет продуцировать несколько миллиграммов рекомбинантных слитых белков. Методы рекомбинантной ДНК осуществляют как описано MANIATIS и др. (22). Изменения делают в соответствии с рекомендациями изготовителя.
Конструкция LAG-3 Д1-Д4 Ig и LAG-3 Д1 Д2 Ig
Фрагменты, кодирующие области Д1 Д2 или Д1-Д4, амплифицируют (30 циклов) из фрагментов кДНК (последовательность фолликулярной дендритной клетки, FDC), включающего кДНК LAG-3 (TRIEBEL и др. , /1/), с помощью Tag-полимеразы, лишенной активности 5'-эндонуклеазы и относительно устойчивой к выдерживанию при очень высокой температуре; после амплификации следует денатурация при 98oC (с помощью "термальной кольцевой ДНК, Перкин Элмер Цетус").
Фрагменты, кодирующие области Д1 Д2 или Д1-Д4, амплифицируют (30 циклов) из фрагментов кДНК (последовательность фолликулярной дендритной клетки, FDC), включающего кДНК LAG-3 (TRIEBEL и др. , /1/), с помощью Tag-полимеразы, лишенной активности 5'-эндонуклеазы и относительно устойчивой к выдерживанию при очень высокой температуре; после амплификации следует денатурация при 98oC (с помощью "термальной кольцевой ДНК, Перкин Элмер Цетус").
Используют специфические праймеры, перечисленные в нижеприводимой таблице.
Полученные в результате амплифицированные фрагменты (739 пар оснований и 1312 пар оснований для LAG-3 Д1Д2 и LAG-3 Д1-Д4, соответственно) вставляют в плазмиду pBS (Стратаген).
Вставки получают после переваривания с помощью XhoI и BglII и вводят в сайты XhoI/BamHI вектора pCDM7 - CD8 - IgGI (причем pCDM7 происходит от pCDM8, выпускаемого в продажу фирмой Стратаген), как проиллюстрировано на фиг. 3, чтобы обменять последовательности ДНК, кодирующие CD8, на клетки, кодирующие субфрагменты LAG-3. Полученные в результате экспрессирующие векторы содержат последовательности, кодирующие Д1Д2 или Д1-Д4, соединенные с последовательностями ДНК, кодирующими участок соединения -CH2-CH3 цепи человеческого IgHI.
CDM7 представляет собой эукариотный экспрессирующий вектор, происходящий от векторов, описанных SEED и др. (10) для клонирования ДНК и ее экспрессии в E. coli и эукариотных клетках. CDM7 имеет следующие характеристики: (I) промотор человеческого цитомегаловируса для транзиторной экспрессии в клетках млекопитающих; (II) вирусный источник SV40 для аутосомной репликации клеток млекопитающих, экспрессирующих T-антиген; (III) π VX (тип Col El) в качестве плазмидного источника для увеличенного числа копий; (IV) селекция SupF по резистентности к ампициллину и тетрациклину в штаммах E. coli Tetamb и Ampamb; (V) источник репликации MI3 для высвобождения однонитевой РНК (un simple brin); (VI) промотор РНК Т7; (VII) полилинкер для эффективного клонирования гетерологичной ДНК.
Транзиторная экспрессия в клетках Cos
Клетки Cos (5•106) трансфицируют с помощью 30 мкг ДНК соответствующих экспрессирующих векторов (кодирующей либо LAG-3 Д1Д2 Ig, либо LAG-3 Д1-Д4 Ig, либо CD8 Ig) путем электропорации (200 вольт, 1500 мкфарад, 30-40 мсек) с помощью аппарата Cellject (Eurogentech, Льеж, Бельгия). Клетки снова наносят тонким слоем (монослоем) и культивируют при использовании среды, содержащей 5% плодной телячьей сыворотки. Надосадочные жидкости отбирают спустя 6 дней после трансфекции.
Клетки Cos (5•106) трансфицируют с помощью 30 мкг ДНК соответствующих экспрессирующих векторов (кодирующей либо LAG-3 Д1Д2 Ig, либо LAG-3 Д1-Д4 Ig, либо CD8 Ig) путем электропорации (200 вольт, 1500 мкфарад, 30-40 мсек) с помощью аппарата Cellject (Eurogentech, Льеж, Бельгия). Клетки снова наносят тонким слоем (монослоем) и культивируют при использовании среды, содержащей 5% плодной телячьей сыворотки. Надосадочные жидкости отбирают спустя 6 дней после трансфекции.
За синтезом получающихся слитых белков следят путем анализирования надосадочных жидкостей, так же, как экстрактов трансфицированных клеток по методу Вестерн-блоттинга с моноклональными антителами 17B4. Иммунореактивные материалы обнаруживают в надосадочной жидкости клеток, трансфицированных с помощью ДНК, кодирующей LAG-3 Д1Д2 Ig или LAG-3 Д1-Д4 Ig.
Параллельно, рекомбинантный иммуноадгезин CD8 (CD8 Ig) получают в качестве отрицательного контроля с помощью той же самой системы экспрессии и экспрессирующего вектора pCDM7-CD8 (фиг. 3).
Рекомбинантные протеины LAG-3 Д1Д2 Ig, LAG-3 Д1-Д4 Ig и CD8 Ig очищают по классическому методу на протеин A-сефарозе. Получающийся материал анализируют путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия с последующим Coomassie - окрашиванием или анализом по методу Вестерн-блоттинга с помощью человеческого анти-Ig-антитела.
Пример 3: Получение растворимых субфрагментов LAG-3
Для того чтобы получить большие количества рекомбинантных протеинов, была разработана стабильная система экспрессии, состоящая из трансфицированных клеток млекопитающих. Клетками-хозяевами являются клетки яичника хомяка (CHO), зависимые от анкеровки, выделяемые из CHO-клеток с недостатком дигидрофолатредуктазы (dhfr) и, следовательно, требующими для своего роста глицина, пурина и тимидина. Главная роль dhfr в синтезе нуклеиновых предшественников в сочетании с чувствительностью клеток dhfr с недостатком в отношении аналогов тетрагидрофолата, таких, как метотрексат (МТХ), имеет два значительных преимущества. Трансфекция этих клеток экспрессирующими векторами, содержащими ген dhfr, позволяет выделять dhfr - резистентные рекомбинантные клоны, и культура этих клеток на селективных средах, содержащих возрастающие количества МТХ, происходит из амплификации гена dhfr и ДНК, которая ассоциирована с ним.
Для того чтобы получить большие количества рекомбинантных протеинов, была разработана стабильная система экспрессии, состоящая из трансфицированных клеток млекопитающих. Клетками-хозяевами являются клетки яичника хомяка (CHO), зависимые от анкеровки, выделяемые из CHO-клеток с недостатком дигидрофолатредуктазы (dhfr) и, следовательно, требующими для своего роста глицина, пурина и тимидина. Главная роль dhfr в синтезе нуклеиновых предшественников в сочетании с чувствительностью клеток dhfr с недостатком в отношении аналогов тетрагидрофолата, таких, как метотрексат (МТХ), имеет два значительных преимущества. Трансфекция этих клеток экспрессирующими векторами, содержащими ген dhfr, позволяет выделять dhfr - резистентные рекомбинантные клоны, и культура этих клеток на селективных средах, содержащих возрастающие количества МТХ, происходит из амплификации гена dhfr и ДНК, которая ассоциирована с ним.
Конструкция LAG-3 Д1, LAG-3 Д1Д2, LAG-3 Д1-Д4
Фрагменты ДНК, кодирующей области Д1, Д2Д2 или Д1-Д4, амплифицируют с помощью способа полимеразной цепной реакции, идентичного таковому, описанному выше, с помощью праймеров, представленных в таблице 4.
Фрагменты ДНК, кодирующей области Д1, Д2Д2 или Д1-Д4, амплифицируют с помощью способа полимеразной цепной реакции, идентичного таковому, описанному выше, с помощью праймеров, представленных в таблице 4.
Результирующие амплифицированные фрагменты переваривают с помощью SalI и вставляют в сайт SalI pUC18 (Стратаген).
Амплифицированные последовательности идентифицируют и вставки субклонируют в экспрессирующем векторе pCLH3 AXSV2 DHFR h α IVS, как описано COLE и др. (Biotechnology, II, 1014-1024, 1993) (фиг. 4).
Этот вектор представляет собой многофункциональный эукариотный экспрессирующий вектор для экспрессии кДНК и ее амплификации в эукариотных клетках. Он имеет следующие характеристики: (I) мышиный промотор гена металлотионеина-1 и последовательность полиаденилирования SV40 (включающая сайт донорно-акцепторного связывания) для осуществления транскрипции целевого гена; (II) человеческий интрон A, включающий сайт донорно-акцепторного связывания гена субъединицы α -гликопротеина, для достижения высоких степеней транскрипции кДНК; (III) последовательность pML, содержащая источник репликации pBR322 и ген устойчивости к ампицилину, для бактериальной амплификации; (IV) единица транскрипции dhfr SV 40 для осуществления транскрипции последовательностей, используемых для селекции и амплификации трансфектантов.
Стабильная экспрессия в CHO-клетках
Экспрессирующие векторы, кодирующие LAG-3 Д1, LAG-3 Д1Д2 и LAG-3 Д1-Д4, используют для трансфекции клеток CHO DUKX и эти клетки культивируют на селективной среде. Клетки, способные размножаться в этих условиях, собирают и культивируют на среде, содержащей возрастающие количества МТХ. Степень экспрессии определяют с помощью анализа по методу Вестерн-блоттинга при использовании моноклонального антитела 17B4. Клоны, продуцирующие большие количества растворимых рекомбинантных молекул, происходящих от LAG-3, размножают в биореакторах и происходящий от LAG-3 материал очищают путем ионообменной и иммуноаффинной хроматографии.
Экспрессирующие векторы, кодирующие LAG-3 Д1, LAG-3 Д1Д2 и LAG-3 Д1-Д4, используют для трансфекции клеток CHO DUKX и эти клетки культивируют на селективной среде. Клетки, способные размножаться в этих условиях, собирают и культивируют на среде, содержащей возрастающие количества МТХ. Степень экспрессии определяют с помощью анализа по методу Вестерн-блоттинга при использовании моноклонального антитела 17B4. Клоны, продуцирующие большие количества растворимых рекомбинантных молекул, происходящих от LAG-3, размножают в биореакторах и происходящий от LAG-3 материал очищают путем ионообменной и иммуноаффинной хроматографии.
Анализы по методу Вестерн-блоттинга выявляют в надосадочных жидкостях клеток, трасфицированных с помощью экспрессирующих векторов, кодирующих LAG-3 Д1, LAG-3 Д1Д2, LAG-3 Д1-Д4, полосы с кажущимися молекулярными массами Mr 15-18 кД, 34-36 кД (дублеты) и 55 кД (2 возможные полосы). Соответствующие Mr этих иммунореактивных материалов соответствуют ожидаемым Mr для гликолизированных LAG-3 Д1 Ig (139 аминокислот и предполагаемый сайт гликолизирования), LAG-3 Д1Д2 Ig (239 аминокислот, включающих 3 сайта гликолизирования) и LAG-3 Д1-Д4 Ig (412 аминокислот, включающих 4 сайта гликолизирования).
Пример 4: Специфическое связывание LAG-3 Ig с клетками, экспрессирующими CMH второго класса
Реакционноспособность моноклональных антител и LAG-3 Д1-Д4 Ig изучают путем косвенной (непрямой) иммунофлуоресценции. Целевые клетки (4х10) культивируют в течение 30 минут при 4oC в присутствии LAG-3 Д1-Д4 Ig, CD8 Ig, мышиного моноклонального антитела, (949) человеческого анти-CMH второго класса (DR, DP, DO), конъюгированного с изотиоцианатфторидом (FITC), клона Coulter или мышиного Ig - изотиоцианатфторида: чужеродный иммуноглобулин G, конъюгированный с изотиоцианатфторидом. Клетки промывают и инкубируют при 4oC в течение 30 минут либо с поликлональным козьим F(ab') против челевеческого иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином, либо с поликлональным козьим антителом против мышиного иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином (клон Coulter).
Реакционноспособность моноклональных антител и LAG-3 Д1-Д4 Ig изучают путем косвенной (непрямой) иммунофлуоресценции. Целевые клетки (4х10) культивируют в течение 30 минут при 4oC в присутствии LAG-3 Д1-Д4 Ig, CD8 Ig, мышиного моноклонального антитела, (949) человеческого анти-CMH второго класса (DR, DP, DO), конъюгированного с изотиоцианатфторидом (FITC), клона Coulter или мышиного Ig - изотиоцианатфторида: чужеродный иммуноглобулин G, конъюгированный с изотиоцианатфторидом. Клетки промывают и инкубируют при 4oC в течение 30 минут либо с поликлональным козьим F(ab') против челевеческого иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином, либо с поликлональным козьим антителом против мышиного иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином (клон Coulter).
Для подтверждения связи LAG-3/CMH второго класса, LAG-3 Д1-Д4 инкубируют с положительными или отрицательными клетками CMH второго класса. Четыре линии B-лимфоцитов, экспрессирующих CMH второго класса (L31, Phil ЭВВ, Raji, Sanchez и Personnaz), обрабатывают моноклональным антителом 949 против класса II, или надосадочными жидкостями клеток Cos, трансфицированных ДНК, кодирующей либо LAG-3 Д1-Д4 Ig, либо CD8 Ig. Пять линий клеток, экспрессирующих различные гаплотипы молекул CMH второго класса, распознаются LAG-3 Ig таким же образом, как и моноклональными антителами против класса II (положительный контроль), тогда содержащая CD8 Ig надосадочная жидкость (отрицательный контроль) не связана с этими линиями клеток, как можно было ожидать. Четыре линии отрицательных клеток CMH второго класса (CEM, RJ, HSB2, K562) обрабатывают теми же реагентами, что и указанные выше. Отсутствие реакции с анти-CMH второго класса (отрицательный контроль), а также отсутствие реакции с LAG-3 Д1-Д4 Ig показывает, что связь LAG-3 Д1-Д4 с молекулами CMH второго класса является специфичной.
Дополнительные эксперименты реализуют с помощью (I) мышиных фибробластов, трансфицированных или нетрансфицированных с помощью генов, кодирующих человеческий DR7 или человеческий DP4, (II) мышиных клеток, экспрессирующих или неэкспрессирующих молекулы CMH второго класса, (III) активированных человеческих клеток CD4+ или CD8+, и (IV) линий T-лимфоцитов, экспрессирующих различные гаплотипы молекул CMH второго класса (фиг. 8).
В противоположность CD8 Ig, LAG-3 Д1-Д4 Ig связывается с любыми из клеток, экспрессирующих CMH второго класса, также эффективно, как моноклональное антитело 949 против CMH второго класса. LAG-3 Д1-Д4 Ig связывается с любыми из исследованных гаплотипов DR и DP, с молекулами человеческого CMH второго класса, экспрессируемыми трансфицированными мышиными клетками, с молекулами мышиного CMH второго класса, так же, как с молекулами CMH второго класса, экспрессируемыми T-лимфоцитами CD4+ или CD8+.
Эти результаты впервые служат доказательством того, что растворимые молекулы, происходящие от лиганда CMH второго класса, способны фиксироваться на клетках, экспрессирующих CMH второго класса.
Подобные эксперименты показывают, что LAG-3 Д1Д2 связывается с клетками, экспрессирующими CMH второго класса, также специфически и с такой же эффективностью, что и LAG-3 Д1-Д4.
Активность связи LAG-3 Ig и распределение в клетках лиганда LAG-3 Ig
Способность этого иммуноадгезина связываться с клеточными лигандами определяют с помощью козьей сыворотки, направленной против человеческих иммуноглобулинов, маркированной флуоресцеином.
Способность этого иммуноадгезина связываться с клеточными лигандами определяют с помощью козьей сыворотки, направленной против человеческих иммуноглобулинов, маркированной флуоресцеином.
В этих экспериментах целевые клетки сначала инкубируют с человеческим моноклональным антителом или иммуноадгезином в течение 30 минут при 4oC в RPMI 1640, содержащей 10% плодной телячьей сыворотки (FCS). Клетки затем инкубируют с козьей сывороткой против мышиных иммуноглобулинов, маркированной FITC (Coulter), для моноклональных мышиных антител или с козьей сывороткой против человеческих иммуноглобулинов, маркированной FITC (Tago), для иммуноадгезинов. Флуоресценцию измеряют после двух промывок, анализируя 3000 клеток на цитометре Elite (Coultronics, Hialeah, Финляндия). На фиг. 9 представлены степени фиксации LAG-3 Ig, CD8 Ig, антитела 949 или антитела ОКЗТ (анти-CD3, ATCC), в виде числа подсчитанных клеток в зависимости от логарифма интенсивности измеренной флуоресценции.
LAG-3 Ig фиксируется на мышиных трансфицированных фибробластах для гена молекулы HLA DR4, но не фиксируется на нетрансфицированных клетках. CD8 Ig неспособен связываться с фибробластами HLA DR4 + в тех же условиях. Распределение по клеткам лигандов LAG-3 Ig оценивают на образе клеточных популяций путем иммунофлуоресценции.
LAG-3 Ig обнаруживают во всех положительных испытуемых клетках второго класса, включая туда линии B-клеток, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (производные генетически неродственных доноров, включающих 10 гомозиготных линий типа DR1-DR10), так же как в активированных T-клетках и NK-клетках (естественных киллерных клетках).
На фиг. 9 в качестве примера представлено соединение LAG-3 Ig положительных субклеток DAUDI с антигенами второго класса.
Средняя интенсивность флуоресценции с LAG-3 Ig подобна таковой, наблюдаемой в случае специфического антитела 949 атнигенов второго класса. Фиксация LAG-3 Ig на DR4 (фиг. 9), DR2, DR7 или DPw4 (не представлено), экспрессированных на поверхности мышиных фибробластов, напротив, более слабая, чем таковая, наблюдаемая для антител 949.
Не обнаружено никакого связывания с отрицательными линиями клеток для антигенов второго класса T-происхождения (T-клетки периферической крови, линии CEM, HSB2, REX), B-происхождения (линии Rf 2.2.5), или нелимфоидного происхождения (человеческие линии K562 критро-миклоидного происхождения и линии, происходящие от клеток меланомы - /не представлены/).
Кроме того, LAG-3 Ig фиксируется на ксеногенных молекулах второго класса CMH, таких, как антигены, экспрессированные мышиной лимфомой A 20, и обезьяньих классов II, экспрессированные бластами, стимулированными фитогемагглютинином (данные не представлены).
Специфичность фиксации LAG-3 Ig также подтверждают путем использования моноклонального антитела 17B4, способность которого блокировать взаимодействия LAG-3 с CMH второго класса в тестах по клеточной адгезии была показана ранее (фиг. 10).
В этих экспериментах молекулы LAG-3 Ig предварительно инкубируют в течение 30 минут при 4oC либо в одной среде, либо с 17B4 (1 мг/мл), либо с ОКТЗ (1 мг/мл), до введения в соприкосновение с клетками DAUDI.
На фиг. 10 показано, что предварительная инкубация LAG-3 Ig с 17B4 ингибирует фиксацию на клетках класса II+, тогда как никакого ингибирования не наблюдают с контролем ОКТЗ.
Пример 5: Ингибированные взаимодействия LAG-3 с CMH класса II с помощью растворимых фрагментов LAG-3
Ингибирование взаимодействия LAG-3 с CMH класса II с помощью растворимых фрагментов LAG-3 может наблюдаться непосредственно при фиксации LAG-3 Ig на CMH второго класса в экспериментах по конкуренции с растворимыми фрагментами.
Ингибирование взаимодействия LAG-3 с CMH класса II с помощью растворимых фрагментов LAG-3 может наблюдаться непосредственно при фиксации LAG-3 Ig на CMH второго класса в экспериментах по конкуренции с растворимыми фрагментами.
Для подтверждения того, могут ли растворимые фрагменты LAG-3 Д1Д2, продуцируемые клетками яичника хомяка, заменять связь иммуноадгезинов, происходящих от LAG-3, осуществляют следующие опыты:
Клетки DAUDI инкубируют с растворимыми фрагментами LAG-3 Д1Д2, чтобы могла осуществиться фиксация этих молекул на антигенах второго класса CMH, экспрессированных на поверхности клеток DAUDI.
Клетки DAUDI инкубируют с растворимыми фрагментами LAG-3 Д1Д2, чтобы могла осуществиться фиксация этих молекул на антигенах второго класса CMH, экспрессированных на поверхности клеток DAUDI.
Во второй стадии, клетки инкубируют в присутствии LAG-3 - Д1Д4 Ig в димерной форме или LAG-3 Д1Д2Ig в мономерной форме.
Фиксацию этих иммуноадгезинов, происходящих от LAG-3, определяют с помощью козьего F(ab')2 против человеческого иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином (GAH FITC).
Контрольные группы представлены клетками DAUDI, инкубированными с димерной формой LAG-3 Д1Д2 Ig или мономерной формой LAG-3 Д1Д2 Ig без предварительной инкубации с растворимыми фрагментами LAG-3 Д1Д2.
Результаты представлены в таблице 5, где указывается, что растворимые фрагменты LAG-3 Д1Д2 способны замещать иммуноадгезины, происходящие от LAG-3 в мономерной или димерной форме.
Эти данные подтверждают, что растворимые фрагменты LAG-3 Д1Д2 фиксируются на молекулах второго класса CMH.
Ингибирование взаимодействия LAG-3/CMH второго класса и CD4/CMH второго класса
Образование розеток между клетками Cos, трансфицированными LAG-3 дикого типа, и B-лимфоцитами, трансформированными вирусом Эпштейн-Барра, экспрессирующим молекулы CMH второго класса, показано BAIXERAS и др. (2). Это взаимодействие ингибируется одновременно моноклональными антителами и против человеческой гемоглобиновой клетки (MHC).
Образование розеток между клетками Cos, трансфицированными LAG-3 дикого типа, и B-лимфоцитами, трансформированными вирусом Эпштейн-Барра, экспрессирующим молекулы CMH второго класса, показано BAIXERAS и др. (2). Это взаимодействие ингибируется одновременно моноклональными антителами и против человеческой гемоглобиновой клетки (MHC).
Описанный в этой публикации метод видоизменяют, заменяя визуальное наблюдение и подсчет связывающихся с B-лимфоцитами клеток Cos подсчетом остаточной радиоактивности после инкубации меченных с помощью 51Cr B-лимфоцитов с клетками Cos, экспрессирующими LAG-3 (опыт в отношении связывания).
Изучают возможные ингибирующие воздействия растворимых молекул, происходящих от LAG-3, на взаимодействие LAG-3/CMH второго класса, а также на взаимодействие CD4/CMH второго класса.
Клетки Cos трансфицируют соответствующим экспрессирующим вектором (кодирующим LAG-3 дикого типа или CD4). Спустя 2 дня клетки Cos обрабатывают трипсином и снова наносят тонким слоем (монослой) по 0,05 • 106 клеток/углубление на планшеты для культивирования ткани с 12 углублениями. Спустя 24 часа меченные с помощью 51Cr клетки DAUDI (5,5•106) инкубируют на этом монослое клеток Cos (конечный объем 1 мл) в течение 1 часа. Дикие B-клетки затем отсасывают и углубления промывают 5-7 раз, добавляя туда медленно по капле 1 мл среды. Края углублений промывают путем аспирации с помощью пипетки Пастера. Оставшиеся клетки лизируют с помощью 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (ЗФР), с 1% Тритона, в течение 15 минут при 37oC. Лизаты центрифугируют со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут и получают 100 мкл результирующей надосадочной жидкости.
LAG-3 Д1-Д4 Ig используют для ингибирования взаимодействия LAG-3/CMH класса II и CD4/CMH класса II в опыте по связыванию в случае 51Cr. Человеческие CD8 Ig и IgGI испытывают параллельно и используют в качестве отрицательных контролей.
Значительное ингибирование взаимодействия LAG-3/класс II обнаруживают за счет LAG-3 Д1-Д4 Ig (фиг. 5A). Однако, взаимодействие LAG-3/CMH второго класса может быть частично и неспецифически ингибировано с помощью CD8 Ig и человеческих IgGI. С другой стороны, LAG-3 Ig оказывается потенциальным ингибитором взаимодействия CD4/класс II (фиг. 5В) в экспериментальных условиях, где взаимодействие CD4/CMH класса II не модифицировано с помощью CD8 Ig или человеческих IgGI. Это подтверждает тот факт, что взаимодействие LAG-3/класс II более слабое, чем взаимодействие CD4/класс II. Эти результаты служат первым доказательством возможной конкуренции растворимых молекул при взаимодействии CMH второго класса с его лигандами.
Пример 6: Иммунно-супрессивная активность LAG-3 Д1-Д4
Соответствующие опыты проводят с помощью испытаний в отношении пролиферации, описанных выше для биологической активности моноклональных антител против LAG-3.
Соответствующие опыты проводят с помощью испытаний в отношении пролиферации, описанных выше для биологической активности моноклональных антител против LAG-3.
Спустя 3 дня и 5 дней (день 3 и день 5) после антигенной стимуляции, LAG-3 Д1-Д4 Ig показывает сильное ингибирование в отношении пролиферации клона 28, тогда как на человеческие CD8 Ig и IgG не оказывает никакого воздействия (фиг. 6). Подобные эксперименты осуществляют при использовании клона 154 (фиг. 7) и обнаруживают частичное ингибирование в присутствии LAG-3 Ig.
Реализуемый с моноклональными антителами против LAG-3 контроль показывает обратные эффекты, как наблюдалось выше.
Значительное ингибирование пролиферации клеток, инкубированных в присутствии LAG-3 Д1-Д4 Ig, также наблюдается для клона 28.
Эти наблюдения показывают, что LAG-3 Д1-Д4 Ig является потенциальным иммуно-супрессором пролиферации T-лимфоцитов, стимулированных антигеном, и указывают на то, что LAG-3 может действовать как "поглотитель" вторичного иммунного ответа, индуцированного вспомогательными T-лимфоцитами, активированными CD4+.
Роль Lag-3 Ig в отрицательной регуляции иммунных ответов T-клеток
Для того чтобы показать, что растворимая форма LAG-3, имитирующая функции мембранной молекулы, может ингибировать активацию T-клонов CD4 +, стимулированных антигеном, проводят следующие опыты при использовании клона T154: T-клетки предварительно инкубируют с насыщенным количеством LAG-3 Ig (100 нмоль). Клетки затем промывают два раза с помощью холодной RPMI и инкубируют с 10 мкг/мл козьих антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов (Tago), при 4oC в течение 30 минут.
Для того чтобы показать, что растворимая форма LAG-3, имитирующая функции мембранной молекулы, может ингибировать активацию T-клонов CD4 +, стимулированных антигеном, проводят следующие опыты при использовании клона T154: T-клетки предварительно инкубируют с насыщенным количеством LAG-3 Ig (100 нмоль). Клетки затем промывают два раза с помощью холодной RPMI и инкубируют с 10 мкг/мл козьих антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов (Tago), при 4oC в течение 30 минут.
После двух новых промывок клетки снова суспендируют в RPMI, содержащий 10% плодной телячьей сыворотки, и инкубируют в течение 2 часов при 37oC перед добавлением "сигнала". Для перекрестного сшивания моноклональных антител используют антимышиные козьи антитела в концентрации 10 мкг/мл (Tago).
На фиг. 11 представлен эксперимент, при котором клон T154 предварительно инкубируют с LAG-3 Ig, связанным ("перекрестно-сшитым") со вторым реагентом (поликлональная специфическая сыворотка для константной области человеческих иммуноглобулинов). Степень фиксации LAG-3 Ig на клетках определяют с помощью иммунофлуоресценции (фиг. 11A). На фиг. 11B показано, что ингибирования более 50% пролиферации клона T154 достигают за счет LAG-3 Ig. В тех же экспериментальных условиях никакого эффекта не наблюдают с контролем CD8 Ig или с LAG-3 Ig без "поперечной сшивки" (на фиг. не представлено).
На фиг. 11C также показано, что никакого эффекта не наблюдают, когда LAG-3 Ig используют для связывания ("поперечное сшивание") молекул второго класса CMH, экспрессированных антигенпредставляющими B-клетками.
Возможные эффекты связанных ("поперечно-сшитых") моноклональных антител против второго класса на уровне пролиферации T-клеток сравнивают с таковыми LAG-3 Ig. Слабое ингибирование (ниже 50%) наблюдают в случае использования антитела 949 и антитела Д1.12 (анти-DR), связанных с антимышиной козьей поликлональной сывороткой (фиг. 12). Ингибирование пролиферации, следовательно, зависит от эпитопа, причем наиболее значительного эффекта достигают со специфическим эпитопом LAG-3 связи с молекулами класса II.
Воздействие LAG-3 Ig на пролиферацию T-клеток также изучают, используя различные сигнальные последовательности, на другом клоне T CD4 +, специфическом клоне TDEL пептида 34-53 основного протеина миелина.
Ингибирование пролиферации наблюдают (n = 2), когда TDEL стимулируют антигеном (не представлено), иммобилизированным ОКТЗ (фиг. 13A), пектинами (PHA /фитогемагглютинин/ + PMA /форболмиристатацетат/) (фиг. 13B) и 5 МЕ/мл интерлейкина-2 (фиг. 13C). Никакого ингибирования не наблюдают со 100 МЕ/мл интерлейкина-2 (фиг. 13D).
В заключение, совокупность этих результатов указывает на то, что LAG-3 и молекулы CMH второго класса, которые представляют собой, каждый из этих факторов, активационные антигены T-клеток, способны к ассимиляции с молекулами-эффекторами, принимающими участие в фазе инактивации ответов T-клеток. Кроме того, эти результаты иллюстрируют значение взаимодействий между T-клетками в контроле иммунного ответа клеток.
Пример 7: Стимуляция клеточной цитотоксичности за счет LAG-3 Ig
Роль LAG-3 Ig в отношении клеточной цитотоксичности изучают при использовании двух типов эффекторных клеток:
- свежевыделенные человеческие лимфоциты периферической крови (PBL);
- клетки линии SIB5 (клон человеческих NK-клеток /естественных киллерных клеток/).
Роль LAG-3 Ig в отношении клеточной цитотоксичности изучают при использовании двух типов эффекторных клеток:
- свежевыделенные человеческие лимфоциты периферической крови (PBL);
- клетки линии SIB5 (клон человеческих NK-клеток /естественных киллерных клеток/).
Цитотоксическую активность этих клеток определяют путем подсчета 51Cr, содержащегося в среде за счет предварительно меченых целевых клеток, в присутствии или в отсутствие в среде LAG-3 Ig.
На фиг. 14 показана степень цитотоксичности SIB5 для линии человеческих B-клеток, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра и несущих антигены первого и второго классов главного комплекса гистосовместимости (линия LAZ 388), в зависимости от различных реагентов, добавляемых к культурам.
Измерения осуществляются спустя 4 часа после сокультивирования для соотношений эффекторные клетки/целевые клетки (SIB5/LAZ 388) 3: 1 (белые колонки) или 1: 1 (заштрихованные колонки).
Отрицательные контроли представляют собой: одна среда (MED), иммуноадгезин CD8 Ig и моноклональное антитело 17. B4 (анти-LAG-3).
Положительные контроли образованы тремя различными моноклональными антителами:
- антитело L243, направленное против антигенов класса II DR;
- антитело 9.49, направленное против антигенов класса II DR, DP, DO;
- антитело W632, направленное против антигенов класса I главного комплекса гистосовместимости человека.
- антитело L243, направленное против антигенов класса II DR;
- антитело 9.49, направленное против антигенов класса II DR, DP, DO;
- антитело W632, направленное против антигенов класса I главного комплекса гистосовместимости человека.
Антитела против главного комплекса гистосовместимости человека класса I (W632) или класса II (1.243) увеличивают лизис целевых клеток (но не контроля 17B4). Иммуноадгезин LAG-3 Ig повышает лизис; контроль CD8 Ig не оказывает воздействия.
На фиг. 15 представлены результаты эксперимента, аналогичного предыдущему, при котором измеряют цитотоксичность PBL по отношению к клеткам DAUDI (главный комплекс гистосовместимости человека класса I-) для соотношения эффекторы/цели 50: 1 (белые колонки) и 15: 1 (заштрихованные колонки). Добавляемыми в среду реагентами являются те же, что и реагенты, используемые в первом эксперименте, без антитела 9.49 и антитела 17. B4. Антитело 10H3 представляет собой специфический иммуноглобулин изотипа IgGI поверхностного антигена CD45. Его используют в качестве отрицательного контроля.
Никакого изменения не наблюдают при использовании антитела, направленного против антигенов класса I главного комплекса гистосовместимости (W632).
Данные этих двух серий измерений указывают на то, что, по сравнению с отрицательными контролями, LAG-3 Ig активирует цититоксичность NK-клеток. Этот эффект подобен таковому, наблюдаемому с антителами, направленными против молекул второго класса CMH.
Литература
1. TRIEBEL T. et al. , 1990, J. Exp. Med. 171, 1393-1405.
1. TRIEBEL T. et al. , 1990, J. Exp. Med. 171, 1393-1405.
2. BAIXERAS E. et al. , 1992, J. Exp. Med. 176, 327-337.
3. COSGROVE D. et al. , 1991, Cell 66, 1051-1066.
4. RAHEMTULLA A. et al. , 1991, Nature 353, 180-184.
5. TRAUNECKER A. et al. , 1988, Nature 331, 84-86.
6. BENEDICT A. A. et al. , 1967, Methods in Immunology 1, 197-306 (1967).
7. YELTON D. E. et al. , Ann. Rev. of Biochem. 50, 657-680 (1981).
8. HUARD B. et al. , Immunogenetics 39: 213.
9. MANIATIS T. et al. (1982), Molecular cloning: A laboratory manual - Cold Spring Harbor Laboratory, New-York.
10. SEED B. , 1987, Nature 329, 840-842.
11. COLE S. C. et al. Biotechnology II, 1014-1024, 1993.
12. COLE S. C. et al. Biotechnology II, 1014-1024, 1993.
Claims (14)
1. Растворимая полипептидная фракция, образованная по меньшей мере первым из четырех внеклеточных доменов иммуноглобулинового типа протеина LAG-3 (аминокислоты 1-149), в котором один или несколько остатков аргинина (Arg) в положениях 73, 75 и 76 последовательности SEQ ID no 1 заменены глутаминовой кислотой (Glu), и, возможно, одним или несколькими из трех других внеклеточных доменов иммуноглобулинового типа протеина LAG-3 (аминокислоты 150-239, 240-330 и 331-412 последовательности SEQ ID no 1).
2. Растворимая полипептидная фракция по п. 1, в которой по меньшей мере один из внеклеточных доменов протеина LAG-3 слит с по меньшей мере одной дополнительной пептидной последовательностью в виде слитого протеина.
3. Растворимая полипептидная фракция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что дополнительной пептидной последовательностью является последовательность иммуноглобулина человека.
4. Растворимая полипептидная фракция по п. 3, отличающаяся тем, что дополнительной пептидной последовательностью является последовательность иммуноглобулина человека типа IgG4.
5. Растворимая полипептидная фракция по одному из пп. 1-4, отличающаяся тем, что она дополнительно связана с токсином или радиоизотопом.
6. Способ получения растворимой полипептидной фракции по одному из пп. 1-5, отличающийся тем, что фрагменты кДНК, кодирующие внеклеточные домены иммуноглобулинового типа протеина LAG-3, и, возможно, фрагмент кДНК, кодирующий дополнительную пептидную последовательность, встраивают в вектор, выбранный из группы, включающей CDM7, pCDM7-CD8, pCLH3 AXS V2 DHFR hαIVS и pCDM-7-CD8-IgGl, и осуществляют экспрессию фрагментов кДНК после трансфекции в систему экспрессии.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что система экспрессии состоит из клеток яичника хомяка.
8. Растворимая полипептидная фракция, образованная целым или частью по меньшей мере одного из четырех внеклеточных доменов иммуноглобулинового типа протеина LAG-3 (амнокислоты 1-149, 150-239, 240-330 и 331-412 последовательности SEQ ID no 1), отличающаяся тем, что пептидная последовательность LAG-3 дополнительно содержит на своем С-и/или N-конце дополнительную пептидную последовательность типа иммуноглобулина человека, образуя слитый протеин.
9. Растворимая полипептидная фракция по п. 8, отличающаяся тем, что иммуноглобулином человека является иммуноглобулин изотипа IgG4.
10. Растворимая полипептидная фракция по п. 8 или 9, отличающаяся тем, что она дополнительно связана с токсином или радиоизотопом.
11. Способ получения растворимой полипептидной фракции по одному из пп. 8-10, отличающийся тем, что фрагменты к ДНК, кодирующие внеклеточные домены иммуноглобулинового типа протеина LAG-3, и, возможно, фрагмент кДНК, кодирующий дополнительную пептидную последовательность, встраивают в вектор, выбранный из группы, включающей CDM7, pCDM7-CD8, pCLH3 AXS V2 DHFR hαIVS и pCDM-7-CD8-IgGl, и осуществляют экспрессию фрагментов кДНК после трансфекции в систему экспрессии.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что система экспрессии состоит из клеток яичника хомяка.
13. Фармацевтическая композиция, обладающая иммуно-подавляющей активностью, включающая растворимую полипептидную фракцию по одному из пп. 1-5 или растворимую полипептидную фракцию по одному из пп. 8-10 и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Антитела, специфически распознающие растворимую полипептидную фракцию по одному из пп. 1-5, выбранные из моноклональных антител или фрагментов этих антител, в частности, фрагментов Fab, Fab', F(ab')2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9405643 | 1994-05-06 | ||
| FR9405643 | 1994-05-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96123299A RU96123299A (ru) | 1999-01-20 |
| RU2178306C2 true RU2178306C2 (ru) | 2002-01-20 |
Family
ID=9463004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96123299/14A RU2178306C2 (ru) | 1994-05-06 | 1995-05-05 | Растворимые полипептидные фракции протеина lag-3, способ получения, терапевтическая композиция, антитело |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | USRE38313E1 (ru) |
| EP (1) | EP0758383B1 (ru) |
| JP (1) | JP3700859B2 (ru) |
| KR (1) | KR100257466B1 (ru) |
| CN (1) | CN1110557C (ru) |
| AT (1) | ATE352617T1 (ru) |
| BR (1) | BR9507618A (ru) |
| CA (1) | CA2189657C (ru) |
| DE (1) | DE69535375T2 (ru) |
| DK (1) | DK0758383T3 (ru) |
| ES (1) | ES2281899T3 (ru) |
| IL (1) | IL113617A (ru) |
| MX (1) | MX9605365A (ru) |
| NO (1) | NO325828B1 (ru) |
| PT (1) | PT758383E (ru) |
| RU (1) | RU2178306C2 (ru) |
| WO (1) | WO1995030750A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA953629B (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2755503C2 (ru) * | 2016-10-13 | 2021-09-16 | Симфоген А/С | Анти-lag-3 антитела и их композиции |
| RU2771384C2 (ru) * | 2017-12-22 | 2022-05-04 | Цзянсу Хэнжуй Медсин Ко., Лтд. | Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к lag-3, и ее применение |
| RU2793400C2 (ru) * | 2016-10-28 | 2023-03-31 | МЕРК ШАРП И ДОУМ ЭлЭлСи | Способ очистки для удаления вариантов антител с сульфатированием тирозина; очищенные композиции |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0843557T3 (da) * | 1995-07-21 | 2003-03-10 | Inst Nat Sante Rech Med | Fremgangsmåder til detektion, identifikation, isolation og selektiv mærkning og målsøgning af Th1-lymfocytter ved hjælp af LAG-3 protein |
| AU728911B2 (en) * | 1996-11-28 | 2001-01-18 | Institut Gustave Roussy | Mutants of the LAG-3 proteins, products for the expression of these mutants and use |
| EA003772B1 (ru) * | 1996-11-29 | 2003-08-28 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | Средство для обеспечения защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина на основе штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих днк, кодирующую трансмембранный белок lag-3 |
| EP0900841A1 (en) * | 1997-06-18 | 1999-03-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | LAG-3 splice variants |
| EP0893507A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-01-27 | Institut Gustave Roussy | Use of MHC class II ligands (CD4 and LAG-3) as adjuvant for vaccination and of LAG-3 in cancer treatment |
| US6660843B1 (en) * | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| US6434012B2 (en) * | 2000-02-11 | 2002-08-13 | Tyco Electronics Logistics Ag | Circuit board interconnect |
| JP2003533187A (ja) * | 2000-05-03 | 2003-11-11 | アムジエン・インコーポレーテツド | 治療薬としてのＦｃドメインを含む修飾ペプチド |
| US20040258678A1 (en) * | 2002-02-22 | 2004-12-23 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
| FI1897548T4 (fi) | 2003-02-28 | 2024-09-03 | The Johns Hopkins University | T-solujen säätely |
| FR2868781B1 (fr) * | 2004-04-13 | 2008-02-22 | Immutep | Composition de vaccin comprenant un ligand cmh de classe ii couple a un antigene, procede de preparation et utilisations |
| EP2044949A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Immutep | Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response |
| AR072999A1 (es) | 2008-08-11 | 2010-10-06 | Medarex Inc | Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos |
| UY34887A (es) | 2012-07-02 | 2013-12-31 | Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware | Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos |
| RS58705B1 (sr) | 2013-09-20 | 2019-06-28 | Bristol Myers Squibb Co | Kombinacija anti-lag-3 antitela i anti-pd-1 antitela za lečenje tumora |
| GB201322626D0 (en) | 2013-12-19 | 2014-02-05 | Immutep S A | Combined preparations for the treatment of cancer |
| JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
| CU24481B1 (es) | 2014-03-14 | 2020-03-04 | Immutep Sas | Moléculas de anticuerpo que se unen a lag-3 |
| SG11201609721WA (en) | 2014-05-28 | 2016-12-29 | Agenus Inc | Anti-gitr antibodies and methods of use thereof |
| TWI693232B (zh) | 2014-06-26 | 2020-05-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法 |
| JO3663B1 (ar) | 2014-08-19 | 2020-08-27 | Merck Sharp & Dohme | الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين |
| GB201500374D0 (en) | 2015-01-09 | 2015-02-25 | Immutep S A | Combined preparations for the treatment of cancer |
| MA41463A (fr) | 2015-02-03 | 2017-12-12 | Anaptysbio Inc | Anticorps dirigés contre le gène d'activation 3 des lymphocytes (lag-3) |
| TWI773646B (zh) | 2015-06-08 | 2022-08-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 結合lag-3的分子和其使用方法 |
| KR20180063881A (ko) | 2015-07-16 | 2018-06-12 | 바이오카인 테라퓨틱스 리미티드 | 암 치료용 조성물 및 방법 |
| PL3328419T3 (pl) | 2015-07-30 | 2021-12-27 | Macrogenics, Inc. | Cząsteczki wiążące pd-1 i sposoby ich zastosowania |
| US20180230431A1 (en) | 2015-08-07 | 2018-08-16 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Combination Therapy |
| TWI756187B (zh) | 2015-10-09 | 2022-03-01 | 美商再生元醫藥公司 | 抗ｌａｇ３抗體及其用途 |
| WO2017087780A1 (en) | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3 |
| IL299072A (en) | 2015-12-02 | 2023-02-01 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Antibodies and methods for using them |
| KR102424513B1 (ko) | 2015-12-14 | 2022-07-25 | 마크로제닉스, 인크. | Pd-1 및 ctla-4과의 면역반응성을 가진 이중특이적 분자, 및 이것의 사용 방법 |
| BR112018012352A2 (pt) | 2015-12-16 | 2018-12-11 | Merck Sharp & Dohme Corp. | anticorpos anti-lag3 e fragmentos de ligação ao antígeno |
| DK3411476T3 (da) * | 2016-02-04 | 2024-07-15 | Trianni Inc | Forøget produktion af immunoglobuliner |
| EP3471753A1 (en) | 2016-06-20 | 2019-04-24 | Kymab Limited | Anti-pd-l1 and il-2 cytokines |
| PT3476399T (pt) | 2016-06-23 | 2022-05-31 | Jiangsu Hengrui Medicine Co | Anticorpo lag-3, fragmento de ligação a antigénio deste e aplicação farmacêutica deste |
| AU2017343621B2 (en) | 2016-10-11 | 2021-12-02 | Agenus Inc. | Anti-LAG-3 antibodies and methods of use thereof |
| WO2018083087A2 (en) | 2016-11-02 | 2018-05-11 | Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited | Binding proteins |
| CN118557758A (zh) | 2017-02-10 | 2024-08-30 | 瑞泽恩制药公司 | 用于免疫-pet成像的放射性标记的抗-lag3抗体 |
| CA3058960C (en) | 2017-04-05 | 2023-08-29 | Symphogen A/S | Combination therapies targeting pd-1, tim-3, and lag-3 |
| US11339218B2 (en) * | 2017-05-10 | 2022-05-24 | Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co., Ltd. | Human monoclonal antibodies against LAG3 and uses thereof |
| MX2019012032A (es) | 2017-05-30 | 2019-10-30 | Bristol Myers Squibb Co | Tratamiento de tumores positivos a gen 3 de activacion de linfocitos (lag-3). |
| MX2019012076A (es) | 2017-05-30 | 2019-12-09 | Bristol Myers Squibb Co | Composiciones que comprenden un anticuerpo anti gen-3 de activacion del linfocito (lag-3) o un anticuerpo anti-lag-3 y un anticuerpo anti muerte celular programada 1 (pd-1) o anti ligando 1 de muerte celular programada (pd-l1). |
| EP3675898A4 (en) | 2017-08-30 | 2021-09-01 | Phanes Therapeutics, Inc. | ANTI-LAG-3 ANTIBODIES AND THEIR USES |
| JP2022532490A (ja) | 2019-05-13 | 2022-07-15 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 癌の治療における有効性の増強のためのｐｄ－１阻害剤とｌａｇ－３阻害剤の組み合わせ |
| CN112010972B (zh) * | 2019-05-31 | 2023-01-10 | 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 | 与人lag-3蛋白结合的抗体及其编码基因和应用 |
| CN110950966B (zh) * | 2019-12-13 | 2020-12-11 | 启辰生生物科技(珠海)有限公司 | 融合蛋白、编码核酸和细胞及用途 |
| WO2024192033A1 (en) | 2023-03-13 | 2024-09-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Combination of pd-1 inhibitors and lag-3 inhibitors for enhanced efficacy in treating melanoma |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0325224B1 (en) | 1988-01-22 | 1996-07-31 | ZymoGenetics, Inc. | Methods of producing secreted receptor analogs |
| US5116964A (en) | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| FR2656800B1 (fr) | 1990-01-08 | 1992-05-15 | Roussy Inst Gustave | Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques. |
| US5976877A (en) | 1990-01-08 | 1999-11-02 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Proteins produced by human lymphocytes DNA sequence encoding these proteins and their pharmaceutical and biological uses |
| JPH06508501A (ja) * | 1990-07-02 | 1994-09-29 | ブリストル―マイアーズ スクイブ カンパニー | Ｂ細胞上のｃｄ２８レセプターに対するリガンドおよび該リガンドを用いた細胞間相互作用の調節方法 |
-
1995
- 1995-05-05 JP JP52872995A patent/JP3700859B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 MX MX9605365A patent/MX9605365A/es active IP Right Grant
- 1995-05-05 EP EP95920125A patent/EP0758383B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 ES ES95920125T patent/ES2281899T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 US US09/931,103 patent/USRE38313E1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 DE DE69535375T patent/DE69535375T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 RU RU96123299/14A patent/RU2178306C2/ru active
- 1995-05-05 KR KR1019960706281A patent/KR100257466B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-05-05 CA CA002189657A patent/CA2189657C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 IL IL113617A patent/IL113617A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-05-05 CN CN95193718A patent/CN1110557C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 US US08/737,271 patent/US5955300A/en not_active Ceased
- 1995-05-05 ZA ZA953629A patent/ZA953629B/xx unknown
- 1995-05-05 DK DK95920125T patent/DK0758383T3/da active
- 1995-05-05 BR BR9507618A patent/BR9507618A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-05-05 PT PT95920125T patent/PT758383E/pt unknown
- 1995-05-05 AT AT95920125T patent/ATE352617T1/de active
- 1995-05-05 WO PCT/FR1995/000593 patent/WO1995030750A2/fr active IP Right Grant
-
1996
- 1996-11-04 NO NO19964650A patent/NO325828B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-13 US US09/058,555 patent/US6143273A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LINSLEY et al., T-cell antigen CD-28 mediated adhesion with B cell by interacting with activation antigen B7/BB-1, Proc . of Natl. Acad. Sci USA, 1990, v.87, № 8, p.5031-5035 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2755503C2 (ru) * | 2016-10-13 | 2021-09-16 | Симфоген А/С | Анти-lag-3 антитела и их композиции |
| RU2793400C2 (ru) * | 2016-10-28 | 2023-03-31 | МЕРК ШАРП И ДОУМ ЭлЭлСи | Способ очистки для удаления вариантов антител с сульфатированием тирозина; очищенные композиции |
| RU2771384C2 (ru) * | 2017-12-22 | 2022-05-04 | Цзянсу Хэнжуй Медсин Ко., Лтд. | Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к lag-3, и ее применение |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2281899T3 (es) | 2007-10-01 |
| NO964650L (no) | 1997-01-06 |
| EP0758383B1 (fr) | 2007-01-24 |
| AU708825B2 (en) | 1999-08-12 |
| WO1995030750A8 (fr) | 1999-07-29 |
| IL113617A (en) | 2007-09-20 |
| CA2189657A1 (fr) | 1995-11-16 |
| DE69535375T2 (de) | 2007-11-08 |
| PT758383E (pt) | 2007-05-31 |
| AU2570195A (en) | 1995-11-29 |
| CA2189657C (fr) | 2002-03-12 |
| CN1155904A (zh) | 1997-07-30 |
| ZA953629B (en) | 1996-11-05 |
| WO1995030750A2 (fr) | 1995-11-16 |
| BR9507618A (pt) | 1997-08-19 |
| CN1110557C (zh) | 2003-06-04 |
| EP0758383A1 (fr) | 1997-02-19 |
| DK0758383T3 (da) | 2007-05-29 |
| ATE352617T1 (de) | 2007-02-15 |
| JPH09508023A (ja) | 1997-08-19 |
| NO964650D0 (no) | 1996-11-04 |
| MX9605365A (es) | 1997-12-31 |
| WO1995030750A3 (fr) | 1995-12-21 |
| US6143273A (en) | 2000-11-07 |
| DE69535375D1 (de) | 2007-03-15 |
| JP3700859B2 (ja) | 2005-09-28 |
| KR970702917A (ko) | 1997-06-10 |
| NO325828B1 (no) | 2008-07-28 |
| US5955300A (en) | 1999-09-21 |
| KR100257466B1 (ko) | 2000-07-01 |
| IL113617A0 (en) | 1995-08-31 |
| USRE38313E1 (en) | 2003-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2178306C2 (ru) | Растворимые полипептидные фракции протеина lag-3, способ получения, терапевтическая композиция, антитело | |
| AU764257B2 (en) | Methods of using human receptor protein 4-1BB | |
| EP0555880B1 (en) | The CD40CR receptor and ligands therefor | |
| US5525503A (en) | Signal transduction via CD28 | |
| AU694760B2 (en) | B7-1-specific ligands, and their use for the induction of T cell anergy | |
| US20020103151A1 (en) | Methods and compositions for immunomodulation | |
| KR100620334B1 (ko) | 헤르페스 심플렉스 바이러스 유입 매개체에 대한 리간드및 사용 방법 | |
| JPH11507843A (ja) | タンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体 | |
| WO1994017184A1 (en) | Modulation of physiological responses of lymphocytes by cd38 or antibodies thereto | |
| US6472510B1 (en) | CD40 receptor ligands | |
| US7138243B2 (en) | NTB-A, a surface molecule involved in natural killer cells activity | |
| WO1995006738A1 (en) | B70(b7-2):ctla-4 bonding protein | |
| WO1997021450A1 (en) | Ox-2 costimulatory molecule | |
| WO1996017939A1 (en) | Isolated herpesvirus saimiri proteins that bind mhc class ii molecules | |
| JP2007008958A (ja) | 哺乳動物細胞表面抗原をコードする精製された遺伝子；タンパク質および抗体 | |
| CA2362783A1 (en) | Adjuvant and cell maturation agent | |
| AU2003205043B2 (en) | Methods of using human receptor protein 4-1BB | |
| Hercend et al. | Soluble polypeptide fractions of the LAG-3 protein, production method, therapeutic composition, anti-idiotype antibodies | |
| WO1998035692A1 (en) | Materials and methods relating to the protection of useful immune cells | |
| MXPA97003956A (en) | Purified genes that codify antigens of surface of mammali cells, proteins and antibody | |
| BG107210A (bg) | Разтворими ctla4 мутантни молекули и тяхното използване |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20111212 |