NO325828B1 - Anvendelse av et antistoff dannet mot et antigen. - Google Patents
Anvendelse av et antistoff dannet mot et antigen. Download PDFInfo
- Publication number
- NO325828B1 NO325828B1 NO19964650A NO964650A NO325828B1 NO 325828 B1 NO325828 B1 NO 325828B1 NO 19964650 A NO19964650 A NO 19964650A NO 964650 A NO964650 A NO 964650A NO 325828 B1 NO325828 B1 NO 325828B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- lag
- cells
- antigen
- mhc class
- antibody
- Prior art date
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 38
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 37
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 104
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims abstract description 103
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 98
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 51
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 33
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 30
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 26
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 21
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 7
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 7
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 4
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 4
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- XZKAKQROJCKAOP-YWZUXTQFSA-N p20 peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 XZKAKQROJCKAOP-YWZUXTQFSA-N 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical class C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 1
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010045634 B7 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000005738 B7 Antigens Human genes 0.000 description 1
- 101100217502 Caenorhabditis elegans lgg-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000854908 Homo sapiens WD repeat-containing protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710094503 Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 102100020705 WD repeat-containing protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000003352 cell adhesion assay Methods 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- -1 methotrexate (MTX) Chemical class 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000005211 primary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av antistoffer i stand til å forhindre den spesifikke bindingen av LAG-3 proteinet til MHC ("Major Histocompatibility Complex") klasse II molekyler som immunstimulerende midler.
I WO-A 91/10682 er et protein betegnet LAG-3 blitt beskrevet.
LAG-3 proteinet er et protein som selektivt uttrykkes ved NK celler og aktiverte T lymfocytter. Likhet i aminosyresek-vensen, den komparative exon/intron organisering og den kromosomale lokalisering viser at LAG-3 er relatert til CD4. Den initiale karakterisering av LAG-3 genet er blitt beskrevet av TRIEBEL et al. (1).
Det tilsvarende DNA koder for et type I transmembranprotein med 498 aminosyrer inneholdende 4 ekstracellulære sekvenser av immunglobulintypen. LAG-3 er et medlem av immunglobulin-storfamilien.
Det modne protein omfatter 476 aminosyrer (SEQ ID No. 1) med en teoretisk molekylvekt på 52 kD. Den ekstracellulære region inneholder 8 cysteinrester og 4 potensielle N-glykosyleringsseter. Ved Western blot analyse ble det vist at LAG-3 inne i PHA-blaster eller aktiverte NK celler har en tilsynelatende masse Mr på 70.000. Etter behandling med N-glykosidase F, ble det oppnådd en reduksjon i størrelse til 60kD, som derved demonstrerer at nativ LAG-3 er glykosylert. Mere detaljer er beskrevet i WO-A 91/10682.
I WO-A 92/00092 er B7 antigen og CD28 reseptor, fragmenter og derivater beskrevet.
BAIXERAS et al., J. Exp. Med. 176, 327-337 (2), har i tillegg beskrevet at rosettdannelse mellom celler transfektert med LAG-3 (som uttrykker LAG-3 på deres overflate) og B lymfocytter som uttrykker MHC klasse II var spesifikt avhengige av LAG-3/MHC klasse II interaksjon.
Overraskende ble denne ligand for MHC klasse II detektert med høyere nivåer på aktiverte CD8<+>lymfocytter (MHC klasse I-begrenset) enn på aktiverte CD4<+>lymfocytter. In vivo ble kun noen få disseminerte LAG-3<+>celler (MHC klasse II-begrenset) funnet i ikke-hyperplastisk lymfoid vev omfattende de primære lymfoide organer, dvs. thymus og benmarg. LAG-3<+>celler ble funnet i hyperplastiske lymfeknuter og lymfoide tonsiller, så vel som blant mononukleære celler i perifert blod (PBMC) hos pasienter som mottar injeksjoner av høye doser av IL-2.
Disse observasjoner bekrefter at LAG-3 er et aktiverings-antigen i motsetning til CD4 uttrykt i en subpopulasjon av
hvilende lymfocytter og andre celletyper, særlig makrofager.
MHC omfatter klasse I og klasse II molekylene som er membran-glykoproteiner som presenterer fragmenter av proteinantigener for T lymfocyttreseptorene (TCR). Klasse I molekyler er
ansvarlige for presentasjonen av peptider avledet hovedsake-lig fra endogent syntetiserte proteiner for CD8<4>cytotoksiske celler, mens klasse II molekyler presenterer peptider som først og fremst stammer fra fremmede proteiner som har kommet inn den endocytiske vei, dvs. eksogent, for CD4<+>hjelperlymfocytter. T hjelperlymfocytter regulerer og amplifiserer immunresponsen, mens cytotoksiske lymfocytter behøves for å ødelegge celler uten hensyn til vevene som uttrykker "non-self" antigener, for eksempel virusantigener. Gjenkjennel-sesmekanismen involverer intracellulære signaler som fører til en effektiv aktivitet av T lymfocytter.
Det er åpenbart at, for å initiere en immunrespons mediert ved T (CD4<+>) lymfocytter, må de fremmede antigener pågripes og internaliseres i form av peptider ved spesialiserte celler, de antigen-presenterende celler (APC). De resulterende antigeniske peptider re-uttrykkes på overflaten av de antigen-presenterende celler, hvor de kombineres med MHC klasse II molekyler. Dette MHC klasse II/peptidkompleks gjenkjennes spesifikt ved T lymfocyttreseptoren, resulterende i en aktivering av T hjelperlymfocyttene.
Dessuten har dyremodeller dannet ved rekombineringsteknikker gjort det mulig å fremheve den rolle som MHC klasse II molekyler og deres ligander har spilt in vivo.
Mus som mangler MHC klase II molekyler (3) og som nesten ikke har perifere CD4<+>T lymfocytter og som kun har noen få umodne CD4<+>lymfocytter i thymus, har således vist seg å være helt ute av stand til å reagere på T-avhengige antigener.
CD4~ / ~ mutante mus (4) har en vesentlig nedsatt T lymfocytt-aktivitet men viser normal utvikling og funksjon av CD8<+>T lymfocyttene, noe som viser at ekspresjonen av CD4 på datter-cellene og CD4<+>CD8<+>thymocyttene ikke er obligatorisk for utviklingen. Sammenlignet med normale mus har disse mus med CD4-mangel en stor mengde CD4" CD8" celler.
Disse doble negative celler er begrenset til MHC klasse II og er i stand til å gjenkjenne antigenet.
Når de infiseres med Leishmania, viser disse mus en popula-sjon av funksjonelle T hjelperlymfocytter til tross for fravær av CD4. Disse celler er restriktive overfor MHC klasse II og danner interferon-y når de aktiveres ved antigenet. Dette indikerer at herkomsten av T lymfocyttene og deres perifere funksjon ikke nødvendigvis behøver å avhenge av funksjonen av CD4.
Det er nå kjent at proteinene som kodes for av MHC klasse II regionen er involvert i en rekke aspekter av immungjenkj enn-else, inkluderende interaksjonen mellom forskjellige lymfoide celler som lymfocytter og antigen-presenterende celler. Forskjellige observasjoner har også vist at andre mekanismer som ikke finner sted via CD4 deltar i effektorfunksjonen av T
hj elperlymfocytter.
Disse forskjellige observasjoner understreker den fremtred-ende rolle spilt av MHC klasse II og deres ligander i immunsystemet .
Dessuten kjenner man viktigheten av kimære molekyler som ut-gjøres av ekstracytoplasma-domenet av proteiner i stand til å binde til ligander og en konstant region av humane immunglobulin (lg) kjeder for å oppnå oppløselige former av proteiner og av cellereseptorer som spesielt er anvendbare som terapeutiske midler.
Således har oppløselige former av CD4 bevist deres effektivitet i å inhibere en HIV infeksjon in vitro på en doseav-hengig måte.
Uansett har kliniske forsøk med oppløselige CD4 molekyler,
spesielt CD4-Ig, ikke muliggjort demonstrasjon av en signifikant nedgang i virustitere. Transgene mus som uttrykker opp-til 20 g/ml av oppløselig CD4 i deres serum ble skapt. Disse mus viste ingen forskjell når det gjelder deres immunfunksjon i forhold til kontrollmus. Til nå er ingen direkte binding
av molekyler avledet fra CD4 til MHC klasse II blitt rapportert. Dette er en sterk indikasjon på at oppløselige CD4 molekyler ikke interagerer in vivo med MHC klasse II molekyler.
Overraskende har man nå vist at oppløselige molekyler som inneholder forskjellige fragmenter av ekstracytoplasma-domenet av LAG-3 proteinet var i stand til å binde til MHC klasse II molekyler og til å ha en immunsuppresjonsvirkning.
Ekstracytoplasma-regionen til LAG-3 representert ved sekvensen SEQ ID No. 1 omfatter domenene Dl, D2, D3 og D4 som strekker seg henholdsvis fra 1 til 149, 150 til 239, 240 til 330 og 331 til 412.
Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et antistoff dannet mot et antigen valgt fra gruppen bestående av minst ett av de to immunoglobulin-type ekstracellulære domener av LAG-3 proteinet (Dl og D2 tilsvarende aminosyrer 1-149 og 150-239 av SEQ ID N0:1), og et substituert LAG-3 eller et substituert aminoglobulin-type ekstracellulært domene av LAG-3 bestående av aminosyrerester 1-149, hvor en eller flere argininrester i restposisjoner 73, 75 og 76 av SEQ ID N0:1 er erstattet med glutaminsyrerester, for fremstilling av et terapeutisk preparat for å stimulere immunsystemet .
Med "å stimulere immunsystemet" eller "immunstimulerende" menes en molekylenhet i stand til å stimulere modningen, differensiering, proliferasjon og/eller funksjon av celler som uttrykker LAG-3, dvs. T lymfocytter eller aktive NK celler. Anti-LAG-3 antistoffene kan anvendes som forsterkere for vaksiner eller som immunstimulerende midler i pasienter med nedsatt immunforsvar, som pasienter infisert med HIV eller behandlet med immunsuppresjonssubstanser, eller de kan anvendes til å stimulere immunsystemet ved å eliminere "seif cells" som utviser unormal opptreden, for eksempel cancer-celler.
Den immunstimulerende aktivitet til anti-LAG-3 antistoffer er overraskende ettersom anti-CD4 antistoffer har en immunundertrykkende virkning.
Slike antistoffer kan være polyklonale eller monoklonale, idet monoklonale antistoffer imidlertid er foretrukket. De polyklonale antistoffer kan fremstilles i henhold til vel kjente metoder, som den beskrevet av BENEDICT A.A. et al. (6). Monoklonale antistoffer er foretrukket på grunn av det faktum at de er spesifikke for en enkel epitop og gir resultater med bedre reproduserbarhet. Fremgangsmåter for fremstilling av monoklonale antistoffer er vel kjente innen tek-nikken, særlig den beskrevet av KOHLER og MILSTEIN. Denne metode, sammen med varianter derav, er beskrevet av YELTON et al. (7).
I en utførelsesform av oppfinnelsen er antigenet det første aminoglobulin-type ekstracellulære domenet av LAG-3 proteinet (Dl tilsvarende aminosyrer 1-149 av SEQ ID N0:1).
I en utførelsesform av oppfinnelsen er antigenet det andre aminoglobulin-type ekstracellulære domenet av LAG-3 proteinet (D2 tilsvarende aminosyrer 150-239 av SEQ ID N0:1).
I en utførelsesform av oppfinnelsen er antigenet et monoklonalt antistoff eller et antigen-bindingsfragment derav.
I en utførelsesform av oppfinnelsen er antigenet et Fab, Fab'eller F(ab)'2fragment.
I en utførelsesform av oppfinnelsen er antigenet bundet til et cytotoksisk molekyl eller en radioisotop.
Det terapeutiske preparat kan også omfatte en farmasøytisk
tålbar vehikkel. Preparatet kan utformes i henhold til van-lige teknikker. Vehikkelen kan variere i form i henhold til den valgte administreringsmåte: oralt, parenteralt, subling-valt, rektalt eller nasalt.
For preparater for parenteral adminstrering vil vehikkelen generelt omfatte sterilt vann så vel som andre eventuelle bestanddeler som fremmer preparatets oppløselighet eller lag-ringsevne. De parenterale administreringsruter kan utgjøres av intravenøse, intramuskulære eller subkutane injeksjoner.
Det terapeutiske preparat kan være av typen med forlenget frigivelse, spesielt for langtidsbehandlinger, for eksempel autoimmune sykdommer. Dosen som administreres avhenger av individet som behandles, spesielt av kapasiteten til hans/- hennes immunsystem for å oppnå ønsket grad av beskyttelse. De nøyaktige mengder aktiv bestanddel som skal administreres kan lett bestemmes av legen som vil starte behandlingen.
Det terapeutiske preparat kan i tillegg til antistoffene anvendt i henhold til oppfinnelsen omfatte en annen aktiv bestanddel, om passende bundet via en kjemisk binding til et antistoff anvendt i henhold til oppfinnelsen. Som et eksempel kan man nevne et toksin, for eksempel ricin eller difteritoksoid, eller en radioisotop.
De etterfølgende eksempler vil sammen med de vedlagte figurer illustrere oppfinnelsen mere detaljert.
Eksempel 1
Proliferasjon av aktive T lymfocyttlinjer i nærvær av anti-LAG- 3 monoklonale antistoffer
Anti-LAG-3 monoklonale antistoffer som anvendes var 17B4, beskrevet i BAIXERAS et al. (2) og deponert ved CNCM under nr. 1-1214 10. juli 1992, og 11E3, beskrevet i HUARD et al. (8) .
Disse antistoffer tilhører isotypen IgGl. Disse antistoffer ble testet for deres biologiske effekter på aktiverte T lymfocytter, stimulert ved spesifikke antigene peptider eller bearbeidede antigener presentert ved MHC klasse II molekyler uttrykt ved autologe antigen-presenterende celler, uttrykk-ende LAG-3.
Et anti-CD48 monoklonalt antistoff betegnet 10 H3 ble anvendt som irrelevant IgGl antistoff (negativ kontroll).
Metningskonsentrasjonene for anti-LAG-3 og anti-CD48 antistoffer ble bestemt ved immunfluorescens på PHA (fytohemagglutinin)-blastceller og cellelinjer transformert med Epstein-Barr virus (EBV). I proliferasjonstestene, ble de monoklonale antistoffer tilsatt i forholdet 5 ganger metningskonsentrasj onen.
T lymfocyttlinjer som ble anvendt var, på den ene side, klonet 154 avledet fra perifere blodlymfocytter, dannet mot et peptid som har likhet med et influensahemagglutinin (HA) fragment med en aminosyresekvens som strekker seg fra aminosyre 306 til 329 (p20 peptid), og, på den annen side, klonet 28, et T lymfocyttklon avledet fra perifere lymfocytter av en enkel human donor, dannet mot difteritoksoid (DT). De antigen-presenterende celler (APC) svarende til klon 154 var EBV-transformerte B lymfocytter av den samme donor (DR3/DR11) som T 154. De antigen-presenterende celler svarende til klon 2 8 var EBV-transformerte B lymfocytter av den samme donor. Dette klon ble begrenset til HLA DR7.
For klon 154 ble APC (5 x IO<6>) inkubert ved 37°C i en og en halv time med variable doser av p2 0 peptidet, deretter vasket og bestrålt (10.000 rad). Cellene ble platet ut på mikro-titerplater med 96 brønner samtidig som klon 154 cellene (0,5 xIO<5>til 10 x IO<5>celler/ml) i et forhold 3:1. For klon 2 8 var forholdet responderende celler/stimulerende celler lik 1.
HLA DR7/EBV APC cellene ble enten behandlet med mitomycin eller bestrålt, deretter tilsatt til T lymfocyttene i nærvær av DT (som forble i kulturen). Sluttkonsentrasjonen av klon 28 celler var 100.000 celler/ml.
[3H] tymidin (1^Ci/brønn) ble tilsatt ved ulike tidsinter-valler fra dag 2 til dag 10 under dyrking.
Hvert forsøk ble gjennomført in triplo. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlig cpm og etter subtraksjon av cpm funnet i den negative kontroll (T lymfocytter ko-dyrket med APC ikke mettet med immunogener). Proliferasjonstestene ble utført på plater med 96 brønner. Absorpsjon av tritiert tymidin i de individuelle 200/il brønnene ble målt etter tilsetning av 1/iCi tymidin i minst 18 timers dyrking. Resultatene ble uttrykt i form av gjennomsnittet av 3 forsøk. Standard avvik var vanligvis mindre enn 12 % (litt mere i tilfellet med svært lave cpm målinger). Dessuten ble blandede kultur (klon 154/APC) supernatanter kombinert, filtrert gjennom 0,22fim membraner, oppdelt i prøver og frosset ved -20°C inntil titreringstidspunktet ved anvendelse av kommersielle immunoassay kit: Immunotech IL-2 og INF-a titreringskit, Genzyme IFN-y kit og Cayman Chemicals IL-4 kit.
Et studium for å bestemme dose ble gjennomført for å etablere proliferasjonsprofilene av klon 154 bragt i kontakt med det p2 0 spesifikke antigen ved varierende konsentrasjoner og i nærvær eller fravær av anti-LAG-3 monoklonale antistoffer eller irrelevante monoklonale antistoffer (negativ kontrol).
De individuelle resultater av 16 separate forsøk viste at, uansett konsentrasjonen av tilsatt antigen, ble det initiale punkt opp til proliferasjonstoppen ikke modifisert, men en signifikant forlengelse av proliferasjonen av T lymfocytter inkubert med anti-LAG-3 monoklonale antistoffer ble system-atisk observert. Fab fragmenter av det monoklonale antistoff17B4ble fremstilt og anvendt i en test for proliferasjon av klon 154. Proliferasjonsprofilen til T lymfocytter aktivert ved antigenet med 17B4 Fab fragmentene (15 /ig/ml) var lik den til celler inkubert i nærvær av hele det 17B4 monoklonale antistoff (40/xg/ml) (fig. 1) . Disse resultater viser at de observerte biologiske effekter ikke skyldes en ikke-spesifikk reaksjon indusert ved Fc regionen til de anti-LAG-3 monoklonale antistoffer.
Lignende resultater ble oppnådd med 11E3 anti-LAG-3 monoklonale antistoffer.
Klon 2 8 ble også stimulert med antigenet (tetanustoksoid
10/ig/ml) i nærvær av 17B4 monoklonale antistoffer etter ko-dyrking med de tilsvarende APC i nærvær av DT. Resultatene er vist i fig. 2.
Effektene av anti-LAG-3 monoklonale antistoffer observert med klon28, nemlig forlengelsen av proliferasjonen, er lik dem observert med klon 154.
Tester ble gjennomført som var utformet til å måle de forskjellige cellulære hendelser som oppnås etter den antigene stimulering av klon 154 celler inkubert i nærvær av anti-LAG-3 monoklonale antistoffer.
Cellene ble høstet under konvensjonell antigen stimulering av klon154 i nærvær av anti-LAG-3 eller anti-CD48 monoklonale antistoffer eller i fravær av antistoffer, og testet for ekspresjon av LAG-3 og CD25 transmembranreseptorer, og prøver av kultursupernatanter ble samlet ved forskjellige tidsinter- valler etter stimuleringen og testet for tilstedeværelsen av IFN-Y, TNF-a, IL-4 og IL-2.
To-farge direkte immunfluorescensforsak (anti-CD3 monoklonale antistoffer og anti-CD25 monoklonale antistoffer) viste at IL-2 reseptorer var svakt men signifikant økt 5 døgn etter den antigene stimulering. Lignende tester med anti-CD3 og 11E3 (anti-LAG-3) monoklonale antistoffer vist at LAG-3 var rikelig uttrykt allerede fra dagen etter aktivering. I tillegg var sekresjonen av IL-2, IL-4, IFN-y og TNF-a også modu-lert ved inkubasjon med anti-LAG-3 monoklonale antistoffer, og viser således at ulike cellulære hendelser modifiseres ved tilstedeværelsen av anti-LAG-3 monoklonale antistoffer og at enkelte hendelser allerede finner sted 24 timer etter stimulering.
Disse resultater viser indirekte at LAG-3 spiller en reguler-ende rolle for CD4<+>celler. Det faktum at anti-LAG-3 monoklonale antistoffer øker proliferasjon, og følgelig virker som immunpotensatorer, foreslår at LAG-3 er involvert i "deaktiveringen" av CD4<+>T lymfocytter med en negativ rolle av LAG-3 på den antigen-avhengige stimulering.
Eksempel 2
Transient ekspresjon av LAG- 3 fusjonsproteiner
Oppløselige proteiner avledet fra LAG-3 ble oppnådd ved en rekombinant DNA teknikk ved anvendelse av passende vektorer omfattende DNA som koder for LAG-3 og DNA som koder for et immunglobulinfragment. Det transiente ekspresjonssystem besto av transfekterte Cos celler. Dette system gjør det mulig å danne flere mg av rekombinante fusjonsproteiner. Rekombinante DNA teknikker ble gjennomført som beskrevet av MANIATIS et al. (22). Modifikasjonene ble utført som anbefalt av produsenten.
Konstruksjon av LAG- 3 D1- D4 lg og LAG- 3 D1D2 l<g>
Fragmenter som koder for D1D2 eller D1-D4 regionene ble amplifisert (30 sykluser) fra et fragment av cDNA (FDC sekvens) omfattende LAG-3 cDNA (TRIEBEL et al. (1)), ved anvendelse av Taq polymerase uten 5<1->endonukleaseaktivitet og relativt resistent mot eksponering for en svært høy temper-atur, idet amplifikasjonen ble etterfulgt av en denaturering ved 98°C (med en Perkin Eimer Cetus "DNA thermal cycler"). Spesifikke primere ble anvendt som angitt i den etterfølgende tabell.
De oppnådde amplifiserte fragmenter (73 9 bp og 1312 bp for henholdsvis LAG-3 D1D2 og LAG-3 D1-D4) ble innskutt i et pBS plasmid (Stratagene).
Innskudd ble fremstilt etter spalting med Xhol og Bglll og innført i XhoI/BamHI setene i vektoren pCDM7-CD8-IgGl (pCDM7 er avledet fra pCDM8 markedsført av Stratagene), som vist i fig. 3, for å bytte de DNA sekvenser som koder for CD8 med dem som koder for subfragmentene av LAG-3. De resulterende ekspresjonsvektorer inneholdt sekvenser som koder for D1D2 eller D1-D4 fusjonert til DNA sekvensene som koder for
-CH2-CH3 forbindelsesregionen i en human IgGl kjede.
CDM7 er en eukaryotisk ekspresjonsvektor avledet fra vektorene utviklet av SEED et al. (10) for kloningen av DNA og ekspresjonen derav i E. coli og eukaryotiske celler. CDM7 har følgende trekk: (i) den humane cytomegaloviruspromoter for transient ekspresjon i pattedyrceller, (ii) etviralt SV40 origo for en auto-somal replikasjon av pattedyrceller som uttrykker T antigen, (iii) ti VX (type Col El) som plasmidorigo for et høyt kopi-tall, (iv) en Sup F seleksjon for resistens overfor ampi-cillin og tetracyklin i Tet<a>rnb og Amp<amb>E. coli stammer, (v) et replikasjonsorigo av M13 for frigivelse av en enkel-tråd, (vi) en T7 RNA promoter, og (vii) en polylinker for en effektiv kloning av heterolog DNA.
Transient ekspresjon i Cos celler
Cos celler (5 x 10<e>) ble transfektert med 30 . ug DNA av passende ekspresjonsvektorer (kodende for enten LAG-3 D1D2 lg eller LAG-3 D1-D4 lg eller CD8 lg) ved elektroporering (200 V, 1500 nF, 30-40 msek) ved anvendelse av et Cellject apparat (Eurogentech, Liége, BE). Cellene ble platet ut igjen og dyrket på et medium som inneholdt 5 % føtalt kalveserum. Supernatantene ble tatt ut 6 døgn etter transfeksjon.
Syntesen av de resulterende fusjonsproteiner ble analysert ut fra supernatantene så vel som fra celleekstrakter fra transfekterte celler, ved Western blot analyser med 17B4 monoklonale antistoffer. Immunreaktive materialer ble observert i supernatanten av celler transfektert med DNA kodende for LAG-3 D1D2 lg eller LAG-3 D1-D4 lg.
Samtidig ble et rekombinant CD8 immunadhesin (CD8 lg) oppnådd som negativ kontroll ved anvendelse av det samme' ekspresjonssystem og ekspresjonsvektoren pCDM7-CD8 (fig. 3).
De rekombinante proteiner LAG-3 D1D2 lg, LAG-3 D1-D4 lg og CD8 lg ble renset ved hjelp av standardmetoden på protein-A-Sepharose. Det oppnådde material ble analysert ved SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie farging eller en Western blot analyse ved anvendelse av anti-humant lg antistoff.
Eksempel 3
Fremstilling av oppløselige subfragmenter av LAG- 3
For å fremstille store mengder av rekombinante proteiner, ble et stabilt ekspresjonssystem som utgjøres av transfekterte pattedyrceller utviklet. Vertscellene er forankrings-avhengige hamster ovarieceller (CHO) isolert fra CHO celler som mangler dihydrofolatreduktase (DHFR) og som følgelig trenger glycin, et purin og tymidin for deres vekst. Den sentrale rolle til DHFR i syntesen av nukleinsyre-forløpere, kombinert med sensitiviteten til DHFR-manglende celler når det gjelder tetrahydrofolatanaloger som metotreksat (MTX), har to betydelige fordeler. Transfeksjon av disse celler med ekspresjonsvektorer inneholdende DHFR genet tillater sekre sjonen av rekombinante DHFR-resistente kloner, og dyrkingen av disse celler på selektive medier inneholdende økende mengder av MTX resulterer i amplifikasjon av DHFR genet og DNA assosiert dermed.
Konstruksjon av LAG- 3 Dl. LAG- 3 D1D2. LAG- 3 D1- D4 Fragmenter av DNA som koder for Dl, D1D2 eller D1-D4 regionene ble amplifisert ved anvendelse av en PCR metode som er identisk med den som er beskrevet tidligere, ved anvendelse av de primere som er spesifisert i den etterfølgende tabell. De oppnådde amplifiserte fragmenter ble spaltet med Sali og innskutt i Sali setet til pUC 18 (Stratagene).
De amplifiserte sekvenser ble verifisert, og innskuddene ble subklonet inn i ekspresjonsvektoren pCLH3 AXS V2 DHFR ho IVS som beskrevet av COLE et al. (Biotechnology 11, 1014-1024, 1993) (fig. 4).
Denne vektor er en eukaryotisk ekspresjonsvektor som er multifunksjonell for ekspresjonen av cDNA og amplifikasjon derav i eukaryotiske celler. Den innehar følgende trekk: (i) den murine promoter til metallotionein-1 genet og en SV 4 0 polyadenyleringssekvens (omfattende et donor-akseptor-spleisesete) for å bevirke transkripsjon av genet av inter-esse, (ii) en human intervenerende sekvens A inneholdende donor-akseptor spleisesetet av genet for subenheten av a glykoprotein for å oppnå høye nivåer av transkripsjon av cDNA, (iii) pML sekvensen inneholdende replikasjonsorigoet av pBR 322 og et ampicillinresistens-gen for bakteriell amplifikasjon, og (iv) en DHFR transkripsjonsenhet av SV 40 for å bevirke transkripsjon av sekvensene anvendt for seleksjon og amplifikasjon av trasfektantene.
Stabil ekspresjon i CHO celler
Ekspresjonsvektorene som koder for LAG-3 Dl, LAG-3 D1D2 OG LAG-3 D1-D4 ble anvendt til å transfektere CHO DUKX celler, og disse celler ble dyrket på et selektivt medium. Celler som var i stand til å formere seg under disse betingelser ble kombinert og dyrket på et medium inneholdende økende mengder MTX. Ekspresjonsnivåer ble målt ved Western blot analyser ved anvendelse av det 17B4 monoklonale antistoff. Kloner som gir høye nivåer av rekombinante oppløselige molekyler avledet fra LAG-3 ble propagert i bioreaktorer, og materialet avledet fra LAG-3 ble renset ved ionebytterkromatografi og immun-affinitet.
Western blot analyser viste, i supernatanter fra celler transfektert med ekspresjonsvektorer som koder for LAG-3 Dl, LAG-3 D1D2 OG LAG-3 D1-D4, bånd med tilsynelatende Mr verdier fra 15 til 18 kD, 34-36 kD (dubletter) og 55 kD (2 mulige bånd). De respektive Mr verdier for disse immunreaktive materialer svarer til de forventede Mr verdier for glykosylert LAG-3 Dl lg (139 aminosyrer og et putativt N-glykosyleringssete), glykosylert LAG-3 D1D2 lg (239 aminosyrer inneholdende 3 glykosyleringsseter) og glykosylert LAG-3 D1-D4 lg (412 aminosyrer inneholdende 4 glykosyleringsseter).
Eksempel 4
Spesifikk binding av LAG- 3 l<g>til celler som uttrykker MHC klasse II
Reaktiviteten til de monoklonale antistoffer og til LAG-3 D1-D4 lg ble studert ved indirekte immunfluorescens. Mål-celler (4 x IO<5>) ble inkubert i 30 minutter ved 4°C i nærvær av LAG-3 D1-D4 lg, CD8 lg, et murint monoklonalt antistoff,
(949) anti-human MHC klasse II (DR, DP, DQ) konjugert til FITC (fluorescein-isotiocyanat) fra et Coulter klon, eller murin Ig-FITC: et irrelevant immunglobulin G konjugert til FITC. Cellene ble vasket og inkubert ved 4°C i 30 minutter med enten et geit anti-humant lg polyklonalt F(ab')2konjugert til fluorescein eller et geit anti-mus lg polyklonalt antistoff konjugert til fluorescein (Coulter klon).
For å bekrefte LAG-3/MHC klasse II binding, ble LAG-3 D1-D4 lg inkubert med MHC klasse II-positive eller negative celler. Fire B lymfocyttlinjer som uttrykker MHC klasse II (L31, Phil EBV, Raji, Sanchez and Personnaz) ble behandlet med anti-klasse II monoklonalt antistoff 949, eller supernatantene av Cos celler transfektert med DNA som koder for enten LAG-3 D1-D4 lg eller for CD8 lg. De fem cellelinjer som uttrykker de forskjellige haplotyper av MHC klasse II molekyler ble gjenkjent ved LAG-3 lg på samme måte som ved anti-klasse II monoklonale antistoffer (positiv kontroll), mens supernatanten inneholdende CD8 lg (negativ kontroll) ikke binder til disse cellelinjer, som kunne forventes. Fire MHC klasse II-negative cellelinjer (CEM, RJ, HSB2, K562) ble behandlet med de samme reagenser som i det foregående. Ingen reagerte hverken med anti-MHC klasse II (negativ kontroll) eller med LAG-3 D1-D4 lg, noe som viser at bindingen av LAG-3 D1-D4 er spesifikk for MHC klasse II molekyler.
Ytterligere forsøk ble gjennomført ved anvendelse av
(i) musefibroblaster tranfektert, eller på annen måte, med gener som koder for human DR 7 eller human DP4, (ii) museceller som uttrykker, eller på annen måte, MHC klasse II molekyler, (iii) aktiverte humane CD4<+>eller CD8<+>celler, og (iv) T lymfocyttlinjer som uttrykker de forskjellige haplotyper av MHC klasse II molekyler (fig. 8).
I motsetning til CD8 lg, binder LAG-3 D1-D4 lg til alle celler som uttrykker MHC klasse II like effektivt som det
anti-MHC klasse II monoklonale antistoff 949. LAG-3 D1-D4 lg binder til alle DR og DP haplotyper som er testet, til human MHC klasse II molekyler uttrykt ved transfekterte museceller, til murin MHC klasse II molekyler og også til MHC klasse II molekyler uttrykt ved CD4<+>eller CD8<+>T lymfocytter.
Disse resultater gir for første gang bevis for at oppløselige molekyler avledet fra en ligand for MHC klasse II er i stand til binding til celler som uttrykker MHC klasse II.
Lignende forsøk viste at LAG-3 D1D2 bandt til celler som uttrykker MHC klasse II på en like spesifikk måte og med den samme effektivitet som LAG-3 D1-D4.
Bindingsaktivitet av LAG- 3lg og cellefordeling av ligander for LAG- 3lg
Dette immunadhesins evne til å binde til celleligander måles ved anvendelse av et fluorescein-merket geiteserum rettet mot humane immunglobuliner.
I disse forsøk blir målcellene først inkubert med et humant monoklonalt antistoff eller et immunadhesin i 30 minutter ved 4°C i RPMI 1640 inneholdende 10 % FCS (føtalt kalveserum). Cellene inkuberes deretter med et FITC-merket geit anti-mus immunglobulinserum (Coulter) for de murine monoklonale antistoffer eller med et FITC-merket geit anti-humant immunglo bulinserum (Tago) for immunadhesinene. Flurorescensen måles etter to vaskinger, ved analyse av 3.000 celler med et Elite cytometer (Coultronics, Hialeah, FL). Fig. 9 viser bindingsgraden av LAG-3lg, CD8Ig, antistoff 949 eller antistoff OKT3 (anti-CD3, ATCC) representert ved antall talte celler som en funksjon av logaritmen av den målte fluorescensintensitet.
LAG-3IG binder til musefibroblaster tranfektert for genet for HLA DR4molekylet, og binder ikke til utransfekterte celler. CD8Ig er ikke i stand til binding til HLA DR4<+>under de samme betingelser.
Den cellulære fordeling av ligandene for LAG-3lg ble evaluert på en cellepopulasjonsprøve ved immunfluorescens.
LAG-3lg visualiseres på alle positive klasse II celler som ble testet, inkluderende B cellelinjer transformert ved Epstein-Barr virus (avledet fra genetisk ikke-beslektede donorer, inkluderende 10 homozygote-linjer av typing DR^^ til DR10), så vel som på aktiverte T og NK celler.
Fig. 9 viser, som et eksempel, bindingen av LAG-3lg til Daudi celler som er positive for klasse II antigener.
Den gjennomsnittlige fluorescensintensitet med LAG-3lg er lik den som observeres med antistoff 949 som er spesifikk for klasse II antigener. Bindingen av LAG-3lg til DR4(fig. 9), DR2, DR7eller DPw4 (ikke vist) uttrykt på overflaten av musefibroblaster er, i motsetning til dette, svakere enn det som observeres for antistoff 949.
Ingen binding detekteres på cellelinjer som er negative for klasse II antigener av T opprinnelse (perifere blod T celler, CEM, HSB2, REX linjer), av B opprinnelse (RJ 2.2.5 linje) eller av ikke-lymfoid opprinnelse (humane linjer, K562 av erytromyoloid opprinnelse og linje som stammer fra melanom-celler (ikke vist)).
Dessuten binder LAG-3lg til xenogene klasse II molekyler av MHC, slik som antigenene uttrykt ved muselymfom A 20 og ape klasser II uttrykt ved fytohemagglutinin-stimulerte blast-celler (data ikke vist).
Spesifisiteten av LAG-3lg binding ble også bekreftet ved anvendelse av de monoklonale antistoffer 17B4, hvis kapasitet til å blokkere LAG-3/MHC klasse II interaksjoner i celleadhe-sjonstester var demonstrert tidligere (fig. 10).
I disse forsøk er LAG-3lg molekylene preinkubert i 30 minutter ved 4°C, enten med medium alene, eller med 17B4
(1 mg/ml), eller med 0KT3 (1 mg/ml), før de bringes i kontakt med Daudi celler.
Fig. 10 viser at en preinkubasjon av LAG-3lg med 17B4 inhi-berer bindingen til klasse II<+>celler, mens ingen inhibering detekteres med 0KT3 kontrollen.
Eksempel 5
Inhibering av LAG- 3/ MHC klasse II interaksjon ved oppløselige fragmenter av LAG-3
Inhibering av LAG-3/MHC klasse II interaksjon ved de oppløse-lige fragmenter av LAG-3 kan observeres direkte med hensyn til bindingen av LAG-3lg ved klasse II MHC molekyler, ved konkurrerende forsøk med de oppløselige fragmenter.
For å bekrefte om de oppløselige LAG-3D.]P2fragmenter dannet ved CHO celler kunne erstatte bindingen av immunadhesiner avledet fra LAG-3, ble følgende tester gjennomført: Daudi celler inkuberes med oppløselige LAG-3D1D2fragmenter for å tillate bindingen av disse molekyler til MHC klasse II antigenene uttrykt på overflaten av Daudi cellene.
I et andre trinn inkuberes cellene i nærvær av LAG-30^lg i dimer form eller LAG-SD^DjIg i monomer form.
Bindingen av disse immunadhesiner avledet fra LAG-3 måles ved anvendelse av et geit anti-humant IG F(ab')2konjugert til fluorescein (GAH-FITC).
Kontrollgruppene er representert ved Daudi celler inkubert med dimer LAG-lg eller monomer LAG-30^2lg uten preinkubasjon med de oppløselige LAG-30^2 fragmenter.
Resultatene er angitt i tabell 5, som viser at de oppløselige LAG-30^2 fragmenter kan deplassere immunadhesinene avledet fra LAG-3 i monomer eller dimer form.
Disse data bekrefter at de oppløselige LAG-3D1D2 fragmenter binder til MHC klasse II molekyler.
Inhibering av LAG- 3/ MHC klasse II og CD4/ MHC klasse II interaksjon
Rosettdannelse mellom Cos celler transfektert med villtype LAG-3 og B lymfocytter transformert med EBV som uttrykker MHC klasse II molekyler er vist av BAIXERAS et al. (2). Denne interaksjon inhiberes av både anti-LAG-3 og anti-MHC klasse II monoklonale antistoffer.
Metoden som er beskrevet i denne publikasjon ble modifisert ved å erstatte visualiseringen og tellingen av Cos celler som binder til B lymfocytter med telling av radioaktiviteten som var tilbake etter inkubasjon av<51>Cr-merkede B lymfocytter med Cos celler som uttrykker LAG-3 (bindingsanalyse).
var tilbake etter inkubasjon av<51>Cr-merkede B lymfocytter med Cos celler som uttrykker LAG-3 (bindingsanalyse).
De eventuelle inhiberende effekter av oppløselige molekyler avledet fra LAG-3 på LAG-3/MHC klasse II interaksjon og også på CD4/MHC klasse II interaksjon ble undersøkt.
Cos celler ble transfektert med en passende ekspresjonsvektor (som koder for villtype LAG-3 eller for CD4). To dager senere ble Cos cellene behandlet med trypsin og platet ut igjen i et antall på 0,05 x IO<6>celler/brønn på vevskultur-plater som var flatbunnet og med 12 brønner. 24 timer senere ble<51>Cr-merkedeDaudi celler (5,5 x IO<6>) inkubert på dette monolag av Cos celler (volum: 1 ml) il time. Target B cellene ble deretter avsugd og brønnene vasket fra 5 til 7 ganger, med forsiktig dråpevis tilsetning av 1 ml medium. Brønnkantene ble vasket ved avsuging ved anvendelse av en Pasteur pipette. Resten av cellene ble lysert med 1 ml PBS, 1 % Triton i 15 minutter ved 37°C. Lysatene ble sentrifugert ved 3.000 opm i 10 minutter, og 100/xl av den oppnådde super-natant ble talt.
LAG-3 D1-D4 IG ble anvendt til inhibere LAG-3/MHC klasse II og CD4/MHC klasse II interaksjon i<51>Cr bindingsforsøket. Human CD8 lg og IgGl ble testet parallelt og anvendt som negative kontroller.
En signifikant inhibering av LAG-3/klasse II interaksjon ved LAG-3 D1-D4 lg ble detektert (fig. 5A). LAG-3/MHC klasse II interaksjonen kan imidlertid være delvis og ikke-spesifikt inhibert med humant CD8 lg og IgGl. LAG-3 lg viste seg dessuten å være en potensiell inhibitor av CD4/MHC klasse II interaksjon (fig. 5B) under forsøksbetingelser hvori CD4/MHC klasse II interaksjon ikke var modifisert med human CD8 lg eller IgGl. Dette foreslår at LAG-3/klasse II interaksjon er svakere enn CD4/klasse II interaksjon. Disse resultater representerer det første bevis på en mulig konkurranse av oppløselige molekyler i en interaksjon av MHC klasse II med ligander derav.
Eksempel 6
Immunundertrykkende aktivitet for LAG- 3 D1- D4 lg Funksjonelle tester ble utført ved anvendelse av prolifera-sj onstestene beskrevet i det foregående for den biologiske aktiviteten til anti-LAG-3 monoklonale antistoffer. 3 og 5 døgn (D3 og D5) etter antigenisk stimulering viste LAG-3 D1-D4 en sterk inhibering av profilerasjon av klon 28, mens human CD8 lg og IgG ikke hadde noen effekt (fig. 6). Lignende forsøk ble gjennomført med klon 154 (fig. 7), og viste en delvis inhibering i nærvær av LAG-3 lg. En kontroll gjennomført med anti-LAG-3 monoklonale antistoffer hadde motsatt effekt, som tidligere observert.
En signifikant inhibering av celleprofilerasjon av celler inkubert i nærvær av LAG-3 D1-D4 lg ble også observert for klon 28.
Disse observasjoner viser at LAG-3 D1-D4 lg er en potensiell immunundertrykker av proliferasjonen av T lymfocytter stimulert ved et antigen, og indikerer at LAG-3 kan virke som en "tilintetgjører" av den sekundære immunrespons indusert ved aktiverte CD4<+>T hjelperlymfocytter.
Rollen til LAG- 3lg i den negative reguleringen av T celle immunresponser
For å demonstrere at en oppløselig form av LAG-3, som etter-ligner funksjonene til membranmolekylet, vil kunne inhibere aktiveringen av CD4<+>T kloner stimulert ved et antigen, ble følgende tester gjennomført på klon T154: T-cellene inkuberes på forhånd med en mettende mengde LAG-3lg (100 nM). Cellene ble deretter vasket to ganger med kald RPMI og inkubert med 10/xg/ml geiteantistoffer rettet mot humane immunglobuliner (Tago) ved 4°C i 30 minutter.
Etter to ytterligere vaskinger resuspenderes cellene i RPMI inneholdende 10 % føtalt kalveserum og inkuberes i to timer ved 3 7°C før signaltilsetning. For å koble ("tverrbinde") de monoklonale antistoffer, anvendes et geit anti-mus antistoff i en konsentrasjon på 10^g/ml (Tago). Fig. 11 viser et forsøk hvor klon T154 er blitt preinkubert med LAG-3lg bundet ("tverrbundet") til en andre reaktant (polyklonalt serum spesifikt for den konstante region i humane immunglobuliner). Graden av binding for LAG-3lg til cellene måles ved hjelp av immunfluorescens (fig. 11A) . Fig. 11B viser at mer enn 50 % inhibering av proliferasjonen av klon T154 oppnås med LAG-3lg. Under de samme forsøksbeting-elser observeres ingen effekt med kontroll CD8Ig eller med LAG-3lg uten "tverrbinding" (ikke vist i figuren). Fig. 11C viser også at det ikke observeres noen effekt når LAG-3lg anvendes til å binde ("tverrbinde") MHC klasse II molekylene uttrykt ved antigenpresenterende B-celler.
De eventuelle effekter av bundet ("tverrbundet") anti-klasse II monoklonale antistoffer med hensyn til proliferasjon av T-celler ble sammenlignet med dem for LAG-3lg. En svak inhibering (mindre enn 50 %) observeres med antistoff 949 og antistoff Dl.12 (anti-DR) bundet til et geit anti-mus polyklonalt serum (fig. 12). Inhiberingen av proliferasjon er følgelig epitopavhengig, idet den største effekt oppnås med epitopen av LAG-3 som er spesifikk for bindingen til klasser II.
Effektene av LAG-3lg på proliferasjonen av T-celler ble også studert ved anvendelse av forskjellige signaler på et annet CD4<+>T-klon, klon TDEL spesifikt for peptid 34-53 i basis-myelinproteinet.
En inhibering av proliferasjon observeres (n = 2) når TDEL stimuleres med antigenet (ikke vist), med immobilisert 0KT3 (fig. 13A), med lektiner (PHA + PMA) (fig. 13B) og med 5 IU/ml IL2(fig. 13C). Ingen inhibering observeres med 100 IU/ml IL2(fig. 13D).
Som konklusjon viser disse resultater samlet at LAG-3 og MHC klasse II molekyler, som hver er T celle-aktiverende antigener, kan bindes til effektormolekyler involvert i fasen med inaktivering av T celleresponser. Disse resultater illu-strerer videre viktigheten av interaksjoner mellom T celler i kontrollen av den cellulære immunrespons.
Eksempel 7
Stimulering av cellecytotoksisitet ved LAG- 3lg.
Den rolle som LAG-3lg spiller når det gjelder cellecytotoksisitet er studert på to typer av effektorceller: lymfocytter fra nytappet humant perifert blod (PBL),
S1B5 linje celler (klon av humane NK-celler).
Den cytotoksiske aktivitet til disse celler måles ved å telle det<51>Cr som frigis inn i mediet ved tidligere merkede targetceller, i nærvær eller fravær av LAG-3lg i mediet.
Fig. 14 viser graden av SlB5-cytotoksisitet for en linje av humane B-celler transformert ved Epstein-Barr virus og som bærer "Major Histocompatibility Complex" klasse I og II antigener (LAZ 388 linje), som en funksjon av forskjellige reaktanter tilsatt til kulturene.
Målinger gjennomføres etter fire timers ko-dyrking for effektor/target (S1B5/LAZ 388) celleforhold på 3:1 (uskraverte søyler) eller 1:1 (skraverte søyler).
De negative kontroller utgjøres av medium alene (MEF), immun-adhesinet CD8Ig og det monoklonale antistoff 17.B4 (anti-LAG-3) .
De positive kontroller utgjøres av tre forskjellige monoklonale antistoffer: antistoff L243 rettet mot klasse II DR antigener, antistoff 9.49 rettet mot klasse II DR, DP, DQ antigener, antistoff W632 rettet mot humane "Major Histocompatibility Complex" klasse I antigener.
Anti-HLA klasse I (W632) eller klasse II (L243) antistoffer øker lysis av målcellene (og ikke 17B4 kontrollen). Immun- adhesinet LAG-3lg øker lysis. CD8Ig-kontrollen har ingen effekt.
Fig.15 viser resultatene fra et forsøk som er tilsvarende det ovennevnte, hvori cytotoksisiteten til PBL med hensyn til Daudi-celler (HLA klasse I") måles, for effektor/target forhold på 50:1 (uskraverte søyler) og 15:1 (skraverte søyler). Reaktantene som tilsettes til mediet er de samme som anvendes i det første forsøk, unntatt for antistoff 9.49 og antistoff 17.B4. Antistoff 10H3 er et isotype IgGl immunglobulin som er spesifikt for CD45 overflateantigenet. Det anvendes som negativ kontroll.
Det observeres ingen forandring med et antistoff rettet mot "Major Histocompatibility Complex" klasse I antigener (W632).
Dataene fra disse to måleserier viser at sammenlignet med de negative kontroller, aktiverer LAG-3lg cytotoksisiteten til NK-celler. Denne effekt er lik den som er observert med antistoffer rettet mot MHC klasse II molekyler.
LITTERATURREFERANSER
1. Triebel T. et al., 1990, J. Exp. Med. 171, 1393-1405..
2. Baixeras E. et al., 1992, J. Exp. Med. 176, 327-337.
3. Cosgrove D. et al., 1991, Cell 66, 1051-1066.
4. Rahemtulla A. et al., 1991, Nature 353, 180-184.
5. Traunecker A. et al., 1988, Nature 331, 84-86.
6. Benedict A.A. et al., 1967, Methods in Immunology 1, 197-306 (1967). 7. Yelton D.E. et' al., Ann. Rev. of Biochem. 50, 657-680
(1981).
8. Huard B. et al., Immunogenetics 39:213.
9. Maniatis T. et al. (1982), Molecular cloning:
A laboratory manual - Cold Spring Harbor Laboratory,
New York.
10. SeedB., 1987, Nature, 329, 840-842. 11. Cole S.C. et al., Biotechnology 11, 1014-1024, 1993. 12. Cole S.C. et al., Biotechnology 11, 1014-1024, 1993.
Claims (6)
1. Anvendelse av et antistoff dannet mot et antigen valgt fra gruppen bestående av minst ett av de to immunoglobulin-type ekstracellulære domener av LAG-3 proteinet (Dl og D2 tilsvarende aminosyrer 1-149 og 150-239 av SEQ ID NO:l), og et substituert LAG-3 eller et substituert aminoglobulin-type ekstracellulært domene av LAG-3 bestående av aminosyrerester1-149, hvor en eller flere argininrester i restposisjoner 73, 75 og 76 av SEQ ID NO:l er erstattet med glutaminsyrerester, for fremstilling av et terapeutisk preparat for å stimulere immunsystemet.
2. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor antigenet er det første aminoglobulin-type ekstracellulære domenet av LAG-3 proteinet (Dl tilsvarende aminosyrer 1-149 av SEQ ID N0:1).
3. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor antigenet er det andre aminoglobulin-type ekstracellulære domenet av LAG-3 proteinet (D2 tilsvarende aminosyrer 150-239 av SEQ ID NO:l).
4. Anvendelse som angitt i ett eller flere av kravene 1-3, hvor nevnte antistoff er et monoklonalt antistoff eller et antigen-bindingsfragment derav.
5. Anvendelse som angitt i krav 4, hvor nevnte antistoff er et Fab, Fab' eller F(ab)'2fragment.
6. Anvendelse som angitt i ett eller flere av kravene 1 til5, hvor nevnte antistoff er bundet til et cytotoksisk molekyl eller en radioisotop.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9405643 | 1994-05-06 | ||
| PCT/FR1995/000593 WO1995030750A2 (fr) | 1994-05-06 | 1995-05-05 | Fractions polypeptidiques solubles de la proteine lag-3; procede de production; composition therapeutique; anticorps anti-idiotype |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO964650D0 NO964650D0 (no) | 1996-11-04 |
| NO964650L NO964650L (no) | 1997-01-06 |
| NO325828B1 true NO325828B1 (no) | 2008-07-28 |
Family
ID=9463004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19964650A NO325828B1 (no) | 1994-05-06 | 1996-11-04 | Anvendelse av et antistoff dannet mot et antigen. |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | USRE38313E1 (no) |
| EP (1) | EP0758383B1 (no) |
| JP (1) | JP3700859B2 (no) |
| KR (1) | KR100257466B1 (no) |
| CN (1) | CN1110557C (no) |
| AT (1) | ATE352617T1 (no) |
| BR (1) | BR9507618A (no) |
| CA (1) | CA2189657C (no) |
| DE (1) | DE69535375T2 (no) |
| DK (1) | DK0758383T3 (no) |
| ES (1) | ES2281899T3 (no) |
| IL (1) | IL113617A (no) |
| MX (1) | MX9605365A (no) |
| NO (1) | NO325828B1 (no) |
| PT (1) | PT758383E (no) |
| RU (1) | RU2178306C2 (no) |
| WO (1) | WO1995030750A2 (no) |
| ZA (1) | ZA953629B (no) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0843557B1 (en) | 1995-07-21 | 2002-11-13 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Methods for detecting, identifying, isolating, and selectively labelling and targeting th1 lymphocytes by means of the lag-3 protein |
| AU728911B2 (en) * | 1996-11-28 | 2001-01-18 | Institut Gustave Roussy | Mutants of the LAG-3 proteins, products for the expression of these mutants and use |
| DE69632967T2 (de) | 1996-11-29 | 2005-08-11 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Verfahren zur Verhinderung der Transplantabstoßung bei einer Transplantation und zur Herstellung einer universalen Gentherapie-Wirtszelle unter Anwendung von Lymphocyten-Aktivierungsgen (LAG-3) |
| EP0900841A1 (en) * | 1997-06-18 | 1999-03-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | LAG-3 splice variants |
| EP0893507A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-01-27 | Institut Gustave Roussy | Use of MHC class II ligands (CD4 and LAG-3) as adjuvant for vaccination and of LAG-3 in cancer treatment |
| US6660843B1 (en) * | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| US6434012B2 (en) * | 2000-02-11 | 2002-08-13 | Tyco Electronics Logistics Ag | Circuit board interconnect |
| WO2001083525A2 (en) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Amgen Inc. | Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents |
| EP2388265A1 (en) * | 2002-02-22 | 2011-11-23 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases |
| SI1897548T1 (sl) * | 2003-02-28 | 2013-12-31 | The Johns Hopkins University | Regulacija celic T |
| FR2868781B1 (fr) * | 2004-04-13 | 2008-02-22 | Immutep | Composition de vaccin comprenant un ligand cmh de classe ii couple a un antigene, procede de preparation et utilisations |
| EP2044949A1 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Immutep | Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response |
| AR072999A1 (es) | 2008-08-11 | 2010-10-06 | Medarex Inc | Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos |
| UY34887A (es) * | 2012-07-02 | 2013-12-31 | Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware | Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos |
| HUE044730T2 (hu) | 2013-09-20 | 2019-11-28 | Bristol Myers Squibb Co | Anti-LAG-3 antitestek és Anti-PD-1 antitestek kombinációja tumorok kezelésére |
| GB201322626D0 (en) | 2013-12-19 | 2014-02-05 | Immutep S A | Combined preparations for the treatment of cancer |
| JOP20200094A1 (ar) | 2014-01-24 | 2017-06-16 | Dana Farber Cancer Inst Inc | جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها |
| TWI777174B (zh) | 2014-03-14 | 2022-09-11 | 瑞士商諾華公司 | 針對lag-3之抗體分子及其用途 |
| RS61678B1 (sr) | 2014-05-28 | 2021-05-31 | Agenus Inc | Anti-gitr antitela i postupci za njihovu primenu |
| TWI693232B (zh) | 2014-06-26 | 2020-05-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法 |
| JO3663B1 (ar) | 2014-08-19 | 2020-08-27 | Merck Sharp & Dohme | الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين |
| GB201500374D0 (en) | 2015-01-09 | 2015-02-25 | Immutep S A | Combined preparations for the treatment of cancer |
| MA41463A (fr) | 2015-02-03 | 2017-12-12 | Anaptysbio Inc | Anticorps dirigés contre le gène d'activation 3 des lymphocytes (lag-3) |
| TWI773646B (zh) | 2015-06-08 | 2022-08-11 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 結合lag-3的分子和其使用方法 |
| EP3943098A3 (en) | 2015-07-16 | 2022-05-11 | Biokine Therapeutics Ltd. | Compositions and methods for treating cancer |
| PE20231958A1 (es) | 2015-07-30 | 2023-12-06 | Macrogenics Inc | Moleculas de union a pd-1 y metodos de uso de las mismas |
| US20180230431A1 (en) | 2015-08-07 | 2018-08-16 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Combination Therapy |
| TWI756187B (zh) | 2015-10-09 | 2022-03-01 | 美商再生元醫藥公司 | 抗ｌａｇ３抗體及其用途 |
| MX2018005389A (es) * | 2015-11-20 | 2018-09-05 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que tienen un gen 3 de activacion linfocitaria humanizado. |
| JP7089470B2 (ja) | 2015-12-02 | 2022-06-22 | アジェナス インコーポレイテッド | 抗体およびその使用方法 |
| TW202208440A (zh) | 2015-12-14 | 2022-03-01 | 美商宏觀基因股份有限公司 | 對於pd-1和ctla-4具有免疫反應性的雙特異性分子及其使用方法 |
| MX2018007406A (es) | 2015-12-16 | 2018-08-15 | Merck Sharp & Dohme | Anticuerpos anti-lag3 y fragmentos de enlace al antigeno. |
| KR20180104149A (ko) * | 2016-02-04 | 2018-09-19 | 트리아니, 인코포레이티드 | 면역글로불린의 증대된 생성 |
| CN109475603B (zh) | 2016-06-20 | 2023-06-13 | 科马布有限公司 | 抗pd-l1抗体 |
| AU2017282892B2 (en) | 2016-06-23 | 2023-10-26 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | LAG-3 antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical application thereof |
| CA3037380A1 (en) | 2016-10-11 | 2018-04-19 | Agenus Inc. | Anti-lag-3 antibodies and methods of use thereof |
| KR20230136711A (ko) | 2016-10-13 | 2023-09-26 | 치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사 | 항-lag-3 항체 및 조성물 |
| TW201829462A (zh) | 2016-11-02 | 2018-08-16 | 英商葛蘭素史克智慧財產（第二）有限公司 | 結合蛋白 |
| EA201991673A1 (ru) | 2017-02-10 | 2020-01-17 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Меченные радиоактивным изотопом антитела к lag3 для иммуно-пэт-визуализации |
| JP2020513009A (ja) | 2017-04-05 | 2020-04-30 | シムフォゲン・アクティーゼルスカブＳｙｍｐｈｏｇｅｎ Ａ／Ｓ | Ｐｄ−１、ｔｉｍ−３、およびｌａｇ−３を標的とする併用治療 |
| WO2018208868A1 (en) * | 2017-05-10 | 2018-11-15 | Smet Pharmaceutical Inc | Human monoclonal antibodies against lag3 and uses thereof |
| CN110678200B (zh) | 2017-05-30 | 2024-05-17 | 百时美施贵宝公司 | 包含抗lag-3抗体或抗lag-3抗体和抗pd-1或抗pd-l1抗体的组合物 |
| BR112019020610A2 (pt) | 2017-05-30 | 2020-04-22 | Bristol-Myers Squibb Company | tratamento de tumores positivos para o lag-3 |
| KR20200042937A (ko) | 2017-08-30 | 2020-04-24 | 페인스 테라퓨틱스 인코포레이티드 | 항-lag-3 항체 및 이의 용도 |
| RU2771384C2 (ru) * | 2017-12-22 | 2022-05-04 | Цзянсу Хэнжуй Медсин Ко., Лтд. | Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к lag-3, и ее применение |
| CA3136568A1 (en) | 2019-05-13 | 2020-11-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Combination of pd-1 inhibitors and lag-3 inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer |
| CN112010972B (zh) * | 2019-05-31 | 2023-01-10 | 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 | 与人lag-3蛋白结合的抗体及其编码基因和应用 |
| CN110950966B (zh) * | 2019-12-13 | 2020-12-11 | 启辰生生物科技(珠海)有限公司 | 融合蛋白、编码核酸和细胞及用途 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68926888T2 (de) | 1988-01-22 | 1997-01-09 | Zymogenetics Inc | Verfahren zur Herstellung von sekretierten Rezeptoranalogen |
| US5116964A (en) | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| FR2656800B1 (fr) | 1990-01-08 | 1992-05-15 | Roussy Inst Gustave | Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques. |
| US5976877A (en) | 1990-01-08 | 1999-11-02 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Proteins produced by human lymphocytes DNA sequence encoding these proteins and their pharmaceutical and biological uses |
| WO1992000092A1 (en) | 1990-07-02 | 1992-01-09 | Bristol-Myers Squibb Company | Ligand for cd28 receptor on b cells and methods |
-
1995
- 1995-05-05 EP EP95920125A patent/EP0758383B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 CA CA002189657A patent/CA2189657C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 KR KR1019960706281A patent/KR100257466B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-05-05 MX MX9605365A patent/MX9605365A/es active IP Right Grant
- 1995-05-05 DK DK95920125T patent/DK0758383T3/da active
- 1995-05-05 US US09/931,103 patent/USRE38313E1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 DE DE69535375T patent/DE69535375T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 AT AT95920125T patent/ATE352617T1/de active
- 1995-05-05 IL IL113617A patent/IL113617A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-05-05 BR BR9507618A patent/BR9507618A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-05-05 US US08/737,271 patent/US5955300A/en not_active Ceased
- 1995-05-05 PT PT95920125T patent/PT758383E/pt unknown
- 1995-05-05 ZA ZA953629A patent/ZA953629B/xx unknown
- 1995-05-05 WO PCT/FR1995/000593 patent/WO1995030750A2/fr active IP Right Grant
- 1995-05-05 ES ES95920125T patent/ES2281899T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 RU RU96123299/14A patent/RU2178306C2/ru active
- 1995-05-05 CN CN95193718A patent/CN1110557C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-05 JP JP52872995A patent/JP3700859B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-11-04 NO NO19964650A patent/NO325828B1/no not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-04-13 US US09/058,555 patent/US6143273A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO964650L (no) | 1997-01-06 |
| CA2189657A1 (fr) | 1995-11-16 |
| DE69535375T2 (de) | 2007-11-08 |
| KR100257466B1 (ko) | 2000-07-01 |
| EP0758383B1 (fr) | 2007-01-24 |
| IL113617A0 (en) | 1995-08-31 |
| BR9507618A (pt) | 1997-08-19 |
| CN1110557C (zh) | 2003-06-04 |
| US6143273A (en) | 2000-11-07 |
| ES2281899T3 (es) | 2007-10-01 |
| AU708825B2 (en) | 1999-08-12 |
| RU2178306C2 (ru) | 2002-01-20 |
| PT758383E (pt) | 2007-05-31 |
| WO1995030750A2 (fr) | 1995-11-16 |
| IL113617A (en) | 2007-09-20 |
| NO964650D0 (no) | 1996-11-04 |
| WO1995030750A3 (fr) | 1995-12-21 |
| US5955300A (en) | 1999-09-21 |
| DK0758383T3 (da) | 2007-05-29 |
| MX9605365A (es) | 1997-12-31 |
| JPH09508023A (ja) | 1997-08-19 |
| ATE352617T1 (de) | 2007-02-15 |
| ZA953629B (en) | 1996-11-05 |
| AU2570195A (en) | 1995-11-29 |
| WO1995030750A8 (fr) | 1999-07-29 |
| CA2189657C (fr) | 2002-03-12 |
| KR970702917A (ko) | 1997-06-10 |
| CN1155904A (zh) | 1997-07-30 |
| JP3700859B2 (ja) | 2005-09-28 |
| DE69535375D1 (de) | 2007-03-15 |
| USRE38313E1 (en) | 2003-11-11 |
| EP0758383A1 (fr) | 1997-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO325828B1 (no) | Anvendelse av et antistoff dannet mot et antigen. | |
| US11414490B2 (en) | Regulatory T cell mediator proteins and uses thereof | |
| US7034121B2 (en) | Antibodies against CTLA4 | |
| Hewitt et al. | Major histocompatibility complex independent clonal T cell anergy by direct interaction of Staphylococcus aureus enterotoxin B with the T cell antigen receptor. | |
| US7745215B2 (en) | Methods and compositions for expanding T regulatory cells | |
| US6015884A (en) | Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins | |
| US20050107314A1 (en) | Modulation of cd200 receptors | |
| KR20010031205A (ko) | 가용성 주요 조직적합 복합체 및 그의 사용 방법 | |
| US20230015969A1 (en) | Regulatory t cell mediator proteins and uses thereof | |
| US20060233795A1 (en) | Methods for selectively modulating a Th2-type response within a population of activated CD4+ T cells | |
| US20030086932A1 (en) | Surface-bound antigen binding portions of antibodies that bind to CTLA-4 and CD28 and uses therefor | |
| Subramanyam et al. | Soluble human lymphocyte activation gene-3 modulates allospecific T cell responses. | |
| WO1996017939A1 (en) | Isolated herpesvirus saimiri proteins that bind mhc class ii molecules | |
| Foreman et al. | Expression of costimulatory molecules CD80 and/or CD86 by a Kaposi's sarcoma tumor cell line induces differential T-cell activation and proliferation | |
| WO1997035004A1 (en) | Cell stimulation | |
| KR100544449B1 (ko) | 단백질의 가용성2가 및 다가 헤테로 이량체 유사체 | |
| Hercend et al. | Soluble polypeptide fractions of the LAG-3 protein, production method, therapeutic composition, anti-idiotype antibodies | |
| Chiampanichayakul1ą et al. | Engagement of Na, K-ATPase b3 subunit by a specific mAb suppresses T and B lymphocyte activation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CREP | Change of representative |
Representative=s name: ONSAGERS AS, POSTBOKS 6963 ST OLAVS PLASS, 0130 OS |
|
| MK1K | Patent expired |