KR100544449B1 - 단백질의 가용성2가 및 다가 헤테로 이량체 유사체 - Google Patents

단백질의 가용성2가 및 다가 헤테로 이량체 유사체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역 조절과 관련된 단백질의 가용성 2가 헤테로이량체 유사체 및 다가 헤테로이량체 유사체를 포함하는 조성물과, 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
면역 반응시 특이성은 부분적으로 동종 리간드, 펩티드/MHC 분자와 T 세포 수용체의 선택적인 상호작용으로 조절된다. 이 상호작용의 차이로 인하여 가용성 형태의 이들 분자는 면역 반응을 선택적으로 조절하는 데 사용할 수 있다. 이들 단백질의 가용성 유사체를 개발하려는 시도는 제한되어 왔는데, 이는 이들 분자의 리간드에 대한 화합력이 본질적으로 작기 때문이다. 생물학적으로 적절한 농도로 동종에 대한 가용성 유사체의 화합력을 증가시키기 위해서, 2가 펩티드/MHC 복합체 또는 T 세포 수용체(초이량체)를 작제하였다. 재조합 DNA 기법을 이용하여, MHC 클래스 II/펩티드 또는 TCR 헤테로이량체를 암호하는 DNA를 쥐 Ig 중쇄 및 경쇄를 암호하는 DNA에 결찰시켰다. 이어서, 이 작제물을 바큘로바이러스 발현계에서 발현시켰다. 분자의 MHC 또는 TCR 부분의 Ig 및 다형성 결정자에 특이적인 효소결합 면역흡착법(ELISA)으로 감염된 세포가 약 1㎍/㎖의 가용성이고 구조적으로 완전한 키메라 초이량체를 분비한다는 것을 알 수 있다. 정제 단백질의 SDS PAGE 겔 분석으로 예상 분자량 종을 알 수 있다. 유동 세포계측 결과 TCR 및 클래스 II 키메라가 동종 수용체를 보유하는 세포에 강한 화합력으로 특이적으로 결합함을 보여준다. 이들 초이량체는 TCR/MHC 상호작용 연구, 림프구 추적, 새 항원 동정에 유용하며 면역 반응의 특이적 조절인자로도 사용가능하다.

Description

단백질의 가용성 2가 및 다가 헤테로이량체 유사체
본 출원은 1996년 3월 28일에 출원된 가명세서 출원 일련번호 제60/014,367호의 일부연속 출원이다.
본 발명은 면역 조절과 관련된 단백질의 가용성 2가 헤테로이량체 유사체 및 다가 헤테로이량체 유사체를 포함하는 조성물과, 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다. 이들 복합체는 동종 리간드에 대해 높은 친화력을 가지고 있으므로, 이식 거부반응 및 자가면역 질병과 일반적으로 관련되어 있는 MHC 분자 및 T 세포 수용체에 대한 효과적인 경쟁자이다. 2가 T 세포 수용체와 같은 분자는, 항종양 반응을 증가시키는 데 사용될 수 있거나, 또는 독소에 접합시킨 후 종양 제거를 보조하는 데 사용될 수 있다는 점에서 암의 진단 및 치료에 영향을 줄 수 있다. 이 조성물을 사용하면 면역계의 전체적인 성능을 손상시키지 않고 선택적으로 면역을 조절할 수 있다.
신호 전달 과정은 종종 세포외 도메인, 경막 도메인 및 세포내 도메인을 보유하는 단백질과 관련이 있다. 리간드 결합 과정에서, 신호를 세포의 세포내 성분에 효과적으로 전달하기 위해서 종종 수용체 분자들이 올리고머화된다. 면역계는 이러한 방법에 의해 작동되는 신호 전달 경로의 좋은 예이다[Rosen 등, J. Med. Chem. 38:48-55].
면역계는 고등 척추동물의 가장 진화된 형태에서 발견되는 방어 시스템이다. 올바르게 작용하는 림프계와 면역계는 자가와 비자가를 구별한다. 건강한 신체는 외래 침입자, 예컨대, 박테리아, 바이러스, 진균류 및 기생체에 대해 방어기능을 보유한다. 신체가 항원이라고도 알려진 외래 물질(비자가)을 만나게 되면, 면역계가 활성화된다. 항원은 그 표면상의 특정적인 형상, 즉 에피토프에 의해 인식된다. 이 방어 기작은 병원성 미생물의 침입에 대해 유기체를 방어하는데 사용하는 신속한 고도의 특이적 반응 수단을 제공한다. 다수의 병원성 미생물이 중심이 되어 면역계를 현재의 형태로 진화시켰다. 특이적 면역 응답은 감염원에 대한 방어 외에도, 종양 성장에서 관찰되는 바와 같은 자가 항원의 변형에 대한 감시 역할에도 관련이 있는 것으로 생각된다. 또한, 면역 응답은 자가면역 질병, AIDS의 형성뿐만 아니라 이식된 조직의 거부 반응과도 관련이 있다.
림프구
면역계내에서 림프구는 중추적인 역할을 한다. 외래 유기체에 대한 림프구 반응은 면역계의 효과기 지류를 조정하여, 최종적으로 감염의 결과를 결정한다. 림프구는 2개의 주부류, 즉 B 세포 및 T 세포로 나눌 수 있다. 이들 2 종류의 림프구는 특이적 면역 반응의 형성에 서로 다른 역할을 하며 상이한 효과기 기능을 갖는다는 점에서 분류된다. 각각의 림프구는 구조적으로 관련된 항원의 한정된 세트에 반응한다는 점에서 분류된다. 개개 림프구에서 발현되는 독특한 세포 표면 수용체세트에 의해 특이성이 부여된다. 이들 수용체는, B 세포의 경우 가용성 단백질과, T 림프구의 경우 항원성 펩티드/주조직적합성복합체(MHC) 분자와 상호작용한다. 이들 리간드와의 상호작용 특성은 B 세포 및 T 세포간에 차이가 있다. B 세포에 의해 생성되는 항원 수용체인 면역글로블린(Ig)은 고 친화도로 리간드와 상호작용한다. 대조적으로, T 세포 수용체는 저 친화도로 리간드와 상호작용한다. 따라서, T 세포 반응은, 항원 제시 세포의 표면상의 다중 항원 펩티드/MHC 복합체와 상호작용하는, 개개의 T 세포의 표면상에 여러 T 세포 수용체(TcR)의 상호작용에 의해 유도된다. 따라서, 이들 2개의 세포 표면 당단백질의 다른 군, 즉 TcR 및 MHC 당단백질은 항원에 대한 T 림프구 반응에서 특이성을 나타내는 중요한 성분을 형성한다.
T 세포는 면역계에서 주요 조절 세포이다. T 세포의 조절 기능은 독특한 T 세포 수용체의 발현뿐만 아니라, 개개의 T 세포 반응과 관련된 각종 보조 분자의 발현 및 효과기 기능에 따라 달라진다. 효과기 기능은, 효과기 분자, 즉 림포킨의 분비를 특징으로 하는 반응, 예컨대 세포독성 반응 또는 기타 반응을 포함한다. 이 조절 작용은 종종 자가면역 질병의 진행을 방지한다. 여러 효과기 기능은 조직 이식 거부반응에 중요한 역할을 하며, 이는 종양 거부반응에서도 중요할 수 있다.
T 세포는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자 하에서 항원에 응답한다. 세포독성 T 세포는 주로 클래스 I 당단백질 하에서 이종 항원, 예컨대 바이러스 감염 세포, 종양 항원 및 이식 항원에 대해 반응한다. 대조적으로, 헬퍼 T 세포는 주로 클래스 II 분자 하에서 이종 항원에 대해 응답한다. MHC 분자의 클래스 I 및 클래스 II의 두 유형은 구조적으로 구별되지만, 매우 유사한 모양으로 중첩된다. 각 MHC 분자는 짧은 펩티드 또는 단백질 단편이 결합할 수 있는 깊은 홈(groove)을 보유한다. 이 펩티드는 MHC 분자 자체의 일부가 아니기 때문에, 여러 MHC 분자에서 다양하다. MHC 홈에 배치된 이종 펩티드의 존재는 개개의 T 세포상의 클론형 T 세포 수용체와 연결되어, 이종 항원에 대한 반응을 유도한다.
T 세포에 의한 항원 특이적 인식은 MHC 분자에 내재하는 각종 항원 펩티드를 구별할 수 있는 클론형 T 세포 수용체의 능력에 기초한 것이다. 이들 수용체는 항원 및 MHC에 대한 이중 특이성을 가진다[Zinkernagel 등, Nature 248:701-702 (1974)]. 따라서, T 세포는 항원 특이적이면서 MHC-제한적이다. T 세포에 의한 MHC 제한적 인식의 단순 분자 수준의 해석은 TcR이 MHC 펩티드 복합체에 존재하는 펩티드 잔기는 물론, MHC 잔기도 인식한다는 것이다. 정확한 인식 기작과는 무관하게, 클론형 T 세포 수용체는 MHC에 내재하는 다수의 펩티드를 구별하기에 충분하고 필수적인 분자이다.
T 세포는 2개의 광범위한 서브세트로 나눌 수 있다; α/β TcR을 발현하는 것과 γ/δ TcR을 발현하는 제2세트. α/β TcR을 발현하는 세포는 광범위하게 연구되어 있으며, 바이러스 감염, 자가면역 반응, 동종이식 거부반응 및 종양 특이적 면역 반응에서 발견되는 항원성 펩티드/MHC 복합체를 인식할 수 있는 대부분의 항원-특이적 T 세포를 포함하는 것으로 알려져 있다. α/β TcR를 발현하는 세포는 CD8 보조 분자를 발현하는 세포와 CD4 보조 분자를 발현하는 세포로 더 분류할 수 있다. CD4 및 CD8 양성 세포 중 어느 하나에서 발현되는 클론형 α/β T 세포 수용체들 간에는 본질적인 차이가 없지만, 대개 보조 분자는 상이한 클래스의 MHC 분자에 대해 반응하는 T 세포의 능력과 상관관계가 있다. 클래스 I MHC 분자는 CD8+, 즉 세포독성 T 세포에 의해 인식되고, 클래스 II 분자는 CD4+, 즉 헬퍼 T 세포에 의해 인식된다.
γ/δ T 세포는 특정 조직에서는 물론, 순환계에서도 발견되는 또 다른 T 세포의 중요한 군을 구성한다. 이들 세포는 잘 알려져 있지 않다; 항원/MHC 특이성은 규명하기 어려우며 대부분의 경우 리간드는 전혀 알려져 있지 않다. 이들 세포는 피부 및 장 상피를 비롯하여 특정 조직에 다량 존재하며, 이들 기관의 면역 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 이들은 자가면역 반응과도 연루되어 있으며, 열쇼크 단백질의 인식과 관련되어 있을 수 있다. 본 발명에서 약술한 바와 같이 항원성 복합체를 동정하는 일반적인 접근법은 이들 세포가 정상적인 면역 반응과 비정상적인 면역 반응의 형성에 어떻게 영향을 주는지를 쉽게 알 수 있도록 한다. 설치류와 인간에서 발현되는 α/β TcR과 γ/δ TcR 사이의 상동성은 높다. 일반적으로 이러한 광범위한 상동성으로 인해 쥐 실험 모델을 개발하여, 그로부터 얻은 결과 및 관련성으로 해당 인간 대응체에 관한 것을 추정할 수 있다.
건강 상태 및 질병 상태에서의 MHC 분자
주조직적합성 항원은 주조직적합성 복합체라고 불리우는 유전자 복합체가 암호하는 항원류로 구성된다. 마우스에서, MHC 항원은 H-2 항원(조직적합성-2 항원)이라고 부른다. 인간의 경우, MHC 항원은 HLA 항원(인간 백혈구 관련 항원)이라고 부른다. MHC 당단백질을 암호하는 위치는 다형성이다. 이는 각 종이 각각의 위치에서 몇가지 다른 대립유전자를 가진다는 것을 의미한다. 예를 들어, 대체로 1종에서 다수의 상이한 클래스 I 항원이 발견되지만, 임의의 개체는 각각의 위치에서 각각의 어버이로부터 단일 대립유전자만을 물려받으므로, 각 클래스 I 항원이 기껏해야 2개의 다른 형태로 발현된다.
쥐 시스템의 경우, 클래스 II MHC 분자는 I-A 및 I-E 위치에 의해 암호되며, 인간의 경우, 클래스 II 분자는 DR, DP 및 DQ 위치에서 암호된다. 클래스 II 대립 유전자의 다형성은 알파쇄 및 베타쇄에 의한 것이며, 특이성은 세계 보건 기구(WHO)가 작성한 명명법을 사용하여 표시한다[Immunogenetics (1992) 36:135].
MHC 분자의 역할- 이식
MHC 분자는 이식 결과를 결정하는데 중요한 역할을 한다. 여러 종은 MHC와 연관된 주 면역학적 작용 특성을 나타내며, 비제한적인 예로는 심한 조직 이식 거부반응, 항체 생성 자극, 혼합 림프구 반응 (MLR) 자극, 이식편 대 숙주 반응(GVH), 세포 매개성 림프구용해(CML), 면역 응답 유전자 및 면역 반응 제한이 있다. 피부, 기관(예, 신장, 간, 폐), 또는 기타 조직(예, 혈액, 골수)이 MHC 부적합 상태로 이식된 경우 이식거부 반응이 발생한다. 심한 이식 거부 반응은, 면역계가 공여체 조직에서 존재하지만 수용체 조직에는 존재하지 않는 부당한 이식 항원에 의해 활성화될 때 발생한다. 이식 거부반응은 이종 항원에 순환 면역 세포가 노출되므로써 이식편 그 자체에서도 발생할 수 있으며, 또는 포집된 이식 항원 또는 이식 세포의 축적에 기인하는 림프절 배수시 발생할 수 있다. MHC 항원의 광범위한 다양성으로 인해, 다양한 특이성이 생리학적 및 병태생리학적 면역관련 활성(예, 이식, 바이러스 감염 및 종양 형성) 과정에서 가능하다. 인식된 HLA 특이성은, 예컨대 Bodmer 등의 문헌[Dupont B.(Ed) Immunobiology of HLA(Vol I) 뉴욕; Springer-Verlag(1989)]에 개시되어 있다.
MHC 분자의 역할-자가면역 응답
여러 자가면역 질병에 대한 감수성은 중요한 유전 성분 및 가족계와의 연관성을 보여준다. 대부분의 자가면역 질병은 특정 클래스 II MHC 대립유전자와 유전적 연관성이 있다(참고 표 1a 및 표 1b, 개요). MHC 위치 중 어느 하나에서의 대립 유전자와 특정 질병 사이의 연관 정도를 "상대적 위험율"이라고 부른다. 이 용어는 특정 항원이 없는 개체에서의 질병 빈도수와 비교하여 그 항원을 보유한 개체에서의 질병 빈도수를 나타낸 것이다. 예를 들어, 인슐린 의존성 진성 당뇨병에서는 DQβ 유전형과 강한 연관성을 가진다; 정상적인 DQβ 서열은 57번 위치에 아스파르트산을 가지지만, 코카서스인의 경우, 당뇨병이 있는 환자는 대부분 그 위치에 발린, 세린 또는 알라닌을 가진다.
[표 1a]
자가면역 질병에 대한 감수성과 HLA 유전형과의 관계
[표 1b]
면역 반응 조절
정상 및 비정상 T 세포-매개 면역 반응의 분석에 관심을 기울인 결과 특이적 T 세포 반응을 탐침하여 조절하는 MHC 분자 및 T 세포 수용체의 일련의 신규한 가용성 유사체를 개발하게 되었다. 몇가지 사실로 인하여 이들 시약의 개발은 쉽지 않았다. 첫째, T 세포 수용체는 비교적 저 친화도로 펩티드/MHC 복합체와 상호작용한다[Matsui 등, Science 254:1788-1891 (1991), Sykulev 등 Immunity 1:15-22 (1994), Corr 등, Science 265:946-949 (1994)]. 면역 반응을 특이적으로 조절하기 위해서, T 세포 수용체 또는 펩티드/MHC 복합체에 대해 고 친화도/화합력을 가지는 가용성 분자가 필요하다. 그러나, 단순하게 제조한 T 세포 수용체 또는 펩티드/MHC 복합체의 가용성 1가 유사체는 요구되는 특이성 및 화합력으로 면역 응답을 조절하는데 효과적인 것으로 보이지 않는다.
면역 반응을 선택적으로 조절하기 위해서, 연구진들은 면역 응답과 관련된 단백질의 가용성 형태를 제조하였다. 단일 경막 도메인으로 면역 응답을 조절하는데 연루되어 있는 단백질의 가용성 2가 유사체를 몇몇 실험실에서 제조하였다. 먼저, CD4/Ig 키메라[Capon 등 Nature 337:525-531 (1989); Bryn 등, Nature 344:667-670 (1990)]와, CR2/Ig 키메라[Hebell 등, Science 254:102-105 (1991)]를 제조하였다. 후에, 특이적 CTLA-4/Ig 키메라를 사용하여 면역 반응을 변형시킬 수 있다는 것을 입증하였다[Linsley 등, Science 257:7920-795 (1992); 미국 특허 제5,434,131호; Lenschow 등, Science 257:789-791 (1992)]. 또한, 클래스 I MHC/Ig 키메라를 사용하여 시험관내에서 동종 반응을 변형시켰다[Dal porto, 상기 문헌 참조]. 그러나, 이들 예는 단일 경막 폴리펩티드 분자의 가용성 2가 유사체만을 포함하며, 헤테로이량체가 모두 경막 폴리펩티드인 α 및 β 폴리펩티드로 구성된 헤테로이량체 단백질의 키메라 분자는 포함하지 않는다. 본 발명은 내재막 단백질 복합체의 가용성 2가 및 다가 헤테로이량체 유사체의 생성 방법을 개시하고 있으며, 이는 면역 조절시 유효 용도를 가진 작용 유니트를 형성하기 위해서 적당하게 중첩된 알파 및 베타 다형성 내재막 폴리펩티드로 구성되어 있다.
종래에는, 다가 유사체의 생성시 2개의 경막 도메인을 복위시킬 수 없었다. 이들 분자의 생성 가능성은 2개의 폴리펩티드의 적당한 중첩 및 발현과 관련이 있으며, 이는 모두 일반적으로 경막 도메인을 필요로 한다(도 1). 또한, 헤테로이량체 단백질의 가용성 다가 유사체는 일반적으로 증가된 친화력을 가지므로, 바람직한 치료제이다. 적절하게 중첩되어 작용 유니트를 형성할 수 있는 α 및 β 다형성 내재막 폴리펩티드로 구성되어 있는 이들 가용성 단백질 복합체는, 면역 조절제로서의 잠재적 유용성을 갖는다.
도 1A. 헤테로이량체 이중 경막 단백질의 전형적인 구조.
도 1B. 외막 영역을 항체에 공유 결합시킨 2가 및 가용성의 헤테로이량체 경막 단백질.
도 1C. 항체에 공유 결합된 MHC 클래스 II의 외막 영역.
도 1D. IgG1 중쇄에 결합된 TcR α 폴리펩티드(어두운 부분)와 Ig 카파 경쇄에 결합된 TcR β 폴리펩티드(어두운 부분)를 나타내는 키메라 단백질의 개략도가 도시되어 있다. 키메라쇄 사이의 링커는 짧은 글리신/세린 스페이서로 이루어져 있다. 추정 2C TcR/Ig 구조상에 2개의 모노클로널 항체(mAb), H57(TcR 특이적) 및 1B2(2C TcR 특이적)의 예상 결합 부위가 나타나 있다.
도 2. 가용성 2가 헤테로이량체 단백질을 암호하는 발현 벡터의 지도. 키메라 면역글로블린 분자를 형성하기 위해서 Ig 중쇄 및 경쇄에 결합된 α 및 β 폴리펩티드 서브유니트의 융합을 묘사하기 위한 다단계 작제 개략도가 도시되어 있다.
도 3. 플라스미드 작제물내로 도입된 DNA 서열 상세도.
도 4. TcR/MHC 상호작용의 개략도.
도 5A 내지 도 5C. ELISA 분석법에 의한 가용성 헤테로이량체 단백질의 검출.
도 6. I-Ek/Ig 및 2C TcR/Ig 키메라 단백질의 SDS-PAGE 분석.
도 7. 펩티드/H-2Ld 복합체에 대한 가용성 2가 TcR Ig의 친화도가 가용성 1가 2C TcR의 친화도보다 높은 것을 보여주는 그래프가 도 7에 도시되어 있다. RMA S-Ld 세포는 펩티드(QL9; p2Ca; 또는 pMCMV)를 적재한 후, FITC 표지된 30.5.7 Fab의 양을 일정하게 하고 2C TcR/Ig(고딕선) 또는 가용성 1가 2C TcR, sm2C TcR(파선)의 농도를 다양하게 하여 항온처리하였다. FITC-30.5.7 Fab의 결합은 유동 세포계측법으로 측정하였다. 최대(비 2C TcR 유사체) 30.5.7 결합(%) 대 2C TcR 유사체 농도를 플롯하였다. 겉보기 친화력은 1/(최대 30.5.7 결합(%)) 대 [TcR 유사체]를 재플롯하여 측정하였다. 추가의 연구를 위해 원문 및 표 II 참고. 제시된 데이터는 3회 이상 반복한 실험의 대표값이다. 각 데이터점은 2개의 평균값이다.
도 8. 전술한 바와 같이 세포를 회수하고 유동 세포계측 분석을 수행하였다. 20∼40 ㎍/ml의 최종 농도로 희석한 정제된 mAb, 30.5.7(패널 A-D), 또는 2C TcR/Ig 배양 상등액(패널 E-H)을 사용하여 세포를 염색하였다. 각 패널에서, 임의의 펩티드로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 세포의 히스토그램(고딕선)과 펩티드 처리하지 않고 배양한 세포의 히스토그램(점선)은 대조를 이룬다. 히스토그램은 3회 이상 반복한 실험의 대표값이다.
도 9. 펩티드-안정화된 H-2Ld 분자에서 2C TcR/Ig 반응성 대 mAb 30.5.7 반응성 비교. RMA-S Ld 세포를 각종 조건하에서 항온처리하였다. 밤새 RMA-S Ld 세포를 27℃에서 항온처리한 후에, 각종 H-2Ld 결합 펩티드의 존재 또는 부재하에서 세포를 배양하였다. 펩티드 부재하의 세포는 27℃ 유지하고(패널 A 및 E); tum-(패널 B 및 F); p2Ca(패널 C 및 G); 및 QL9(패널 D 및 H)를 전술한 바와 같이 배양물에 첨가하였다.
도 10. 가용성 2C TcR/Ig 초이량체에 의해 2C T 세포 매개 용해의 시험관내 억제를 나타내는 그래프.
도 11. 가용성 2가 2C TcR/Ig가 SIY/MHC 복합체와는 상호작용하지만 dEV-8/MHC 복합체와는 상호작용하지 않는다는 것을 보여주는 형광 데이터가 도 11에 도시되어 있다. H-2 Kb, H-2 Kbm3, 또는 H-2 Kbmll로 형질감염시킨 T2 세포를 밤새 27℃에서 항온처리하고 전술한 바와 같이 펩티드 dEV-8(-----), SIY(QQ), 또는 pVSV(aaaaa)를 적재하였다. 본원의 방법에 개시한 바와 같이 정제된 2C TcR/Ig(∼50㎎/㎖) 및 GAM-IgG-RPE로 세포를 염색하고, FACS로 분석하였다. 결과의 히스토그램을 나타내었다; 패널 A, T2-Kb 세포; 패널 B, T2-Kbm3; 패널 C, T2- Kbmll. 제시한 히스토그램에서 dEV-8(-----) 또는 pVSV(aaaaa)와 2C TcR/Ig의 반응성은 거의 동일하여 이들 두 히스토그램의 차이를 구분하기 어렵다.
도 12. 각종 펩티드/MHC 표적상에 2C CTL 매개된 세포 용해를 도 12에 도시하고 있다. H-2Ld(패널 A), H-2Kb(패널 B) 또는 H-2Kbm3(패널 C)로 형질감염시킨 T2 세포를 전술한 바와 같이 크롬으로 표지한 후, 펩티드의 양을 다양하게 하여 1.5 시간 동안 25℃에서 항온처리함으로써 펩티드를 적재하였다: p2Ca() 및 pMCMV()(패널 A); 및 dEV-8(); SIY(); 또는 pVSV()(패널 B 및 C). 이어서, 펩티드가 적재된 표적 세포를 10:1의 효과기:표적 세포 비율에서 항온처리하고 특이적 세포용해를 전술한 바와 같이 계산하였다. 제시된 데이타는 3회의 별도 실험의 대표값이다.
도 13. γ-IFN에 의한 RENCA 세포 표면에 내인성 2C 특이적 펩티드/H-2Ld 복합체의 조절을 나타내는 형광 데이터가 도 13에 도시되어 있다. RENCA 세포를 48 시간 동안 0 유니트/㎖ γ-IFN(패널 A 및 E), 5 유니트/㎖ γ-IFN(패널 B 및 F), 10 유니트/㎖ γ-IFN(패널 C 및 G) 또는 50 유니트/㎖ γ-IFN(패널 D 및 H)과 함께 배양하였다. 결과에 개시된 바와 같이, γ-IFN은 클래스 I 발현에 직접적인 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 이로 인해 γ-IFN 처리 세포에 대한 2C TcR/Ig의 백그라운드 결합을 확립할 필요가 있다. 이는 임의의 2C 반응성 펩티드를 비롯하여, 내인성 H-2Ld 결합 펩티드를 효과적으로 치환하는 H-2Ld 결합 펩티드, MCMV의 포화량과 함께 RENCA 세포를 항원처리하여 수행하였다. 세포를 회수하고, 후술하는 바와 같이 2C TcR/Ig(75 ㎎/㎖)[패널 A∼D] 또는 mAb 30.5.7(45 ㎎/㎖)[패널 E∼H]로 염색하였다. 이어서, 세포를 GAM-IgG-RPE로 염색하고 FACS로 분석하였다. 결과 히스토그램이 도시되어 있다. 고딕선(Q)은 펩티드를 첨가하지 않은 배양물의 히스토그램이고 점선(aaa)은 pMCMV와 함께 항온처리한 배양물의 히스토그램이다. 모든 실험은 이중으로 실시하였고 3회 이상 반복하였다. 2C-TcR/Ig을 이용한 염색 대 30.5.7을 이용한 염색시 형광 범위(히스토그램의 스케일 참고)에 차이가 있다.
발명의 상세한 설명
면역계의 활성을 조절하기 위해서 표적 분자에 특이적으로 결합하는 헤테로이량체 단백질의 가용성 재조합 2가 및 다가 유사체를 제조하였다. 헤테로이량체 단백질의 가용성 재조합 2가 및 다가 유사체의 작제 및 발현은 헤테로이량체 단백질에서 유래한 폴리펩티드 서열을 면역글로블린 중쇄 및 경쇄에 결합시키는 것을 포함한다. 특히, 헤테로이량체 단백질의 가용성 재조합 2가 및 다가 유사체는 면역글로블린 중쇄에 헤테로이량체 경막 단백질의 폴리펩티드쇄를, 면역글로블린 경쇄에 헤테로이량체 경막 단백질의 제2 폴리펩티드쇄를 결합시킨다. 이들 가용성 하이브리드 작제물은 동일한 리간드에 대해 2개 이상의 결합 부위를 포함한다.
"폴리펩티드"는 헤테로이량체 단백질의 임의의 폴리펩티드를 의미한다. "폴리펩티드"는 단백질 전체 또는 그 일부를 의미할 수 있다. 최소한 선택한 폴리펩티드 서열은, 분자의 기능에 필수적인 임의의 기타 영역 또는 결합 부위의 적절한 입체구조 및 중첩에 필수적인 단백질 영역을 비롯하여, 조절을 위해 특이적인 면역 반응과 관련된 임의의 결합 부위를 포함할 것이다. "결합 부위"는 리간드 또는 표적 세포와의 관계 또는 상호작용을 매개하는 대상 단백질로부터 유래한 아미노산의 서열 또는 도메인을 의미한다. 결합 부위는 3차 구조와 관련이 있는 아미노산의 불연속 서열로부터 형성할 수 있다. 또한 결합 부위는 당단백질의 세포외 도메인내에서 발견할 수 있다. 당단백질은 하나 이상의 탄수화물기를 포함하는 단백질이다.
폴리펩티드 서열은 약 5개의 아미노산 내지 약 1000개의 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 서열은 200개 이하의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 포유동물의 폴리펩티드가 바람직하며, 경막 단백질에서 유래한 인간의 폴리펩티드는 더욱 바람직하다. 동일한 리간드에 대해 2개 이상의 결합 부위를 포함하는 실제 서열에서 유래한 중요하지 않은 약간의 서열 변형이 일어난 DNA, RNA 및 아미노산 서열은 본 발명에 속한다. 아미노산, 펩티드 및 이의 유도체에 대한 통상적인 약어는 펩티드 업계에서 일반적으로 허용되고 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회(European J.Biochem (1984) 138:9-37)에서 추천한 바대로 사용한다. "중요하지 않은 약간의" 서열 변형은 상동성이 있는 서열이 거의 동일한 방식으로 작용하여 본 발명의 단백질 및 폴리펩티드와 거의 동일한 것을 생성한다는 것을 의미한다. 기능적으로 등가인 폴리펩티드도 본 발명에 속한다. 보존적 치환은 생물학적 또는 화학적 기능을 손실하지 않고 이러한 아미노산 서열 내에 이루어질 수 있다.
본원에서 사용한 "가용성"은 37℃에서 또는 체액, 혈장 등에서 충분히 가용성이어서, 조성물이 본 발명에 따라 의도하는 작용을 할 수 있도록 필요한 특정 범위의 농도에서 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
"2가"는 동일한 리간드에 대해 2개의 결합 부위를 가지는 자연 발생적 또는 유전적으로 조작한 해당 키메라 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 키메라 단백질은 동일한 폴리펩티드상에 상이한 리간드에 대한 2개의 결합 부위를 가진다는 점에서 2작용성과는 대조된다. 따라서, 모든 면역글로불린는 2작용성인 동시에, 최소한 2가이다. 모든 면역 글로불린은 Fc-수용체 결합을 위한 별도의 부위 및 항원을 위한 1개 이상의 결합 부위를 가진다는 점에서 2작용성이다. 또한, 면역글로블린은 항원을 위한 2개 이상의 동일하나 별도의 결합부위를 가진다는 점에서 최소한 2가이다.
"다가"는 동일한 리간드에 대해 2개 이상의 결합 부위를 가지는 자연 발생적 또는 유전적으로 조작한 해당 키메라 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, "다가"는 각각 5가와 4가인 본 발명의 IgM 및 IgA 키메라 분자를 포함한다. 또한, "다가"는 1개 이상의 키메라 항체 분자를 가지는 조성물을 나타낼 수 있다. 각각의 2가 헤테로이량체 IgG 분자가 2개의 결합 부위(2가)를 가지기 때문에, 4개의 IgG 분자를 함유하는 키메라 항체 복합체는 8개의 항원 결합 부위(8가)를 가질 것이다. 비-키메라인 유사한 다가 항체 복합체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 작제할 수 있다. 예컨대, Sano 및 Cantor는 미국 특허 제5,328,985호에서 분자당 4개 이상의 IgG 결합 부위를 가지는 스트렙타비딘-단백질 A를 사용하여 다가 항체를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 접합 분자당 항체 분자의 수는 스트렙타비딘-단백질 A와 대상 항체를 적절한 비율로 혼합하므로써 조절한다. 또한, 당업계에 알려진 항체를 접합시키는 기타의 방법을 사용하여 본 발명의 가용성 다가 키메라 조성물을 형성할 수 있다.
"링커"는 면역글로불린 분자와 헤테로이량체 폴리펩티드 사이에 삽입된 결합 영역을 의미한다. 링커 서열의 길이는 항원 결합 및 가교 정도를 조절하기 위해서 필요한 가요성에 따라 다양할 것이다. "링커"는 선택적인 특징인 것으로 간주해야 한다. 헤테로이량체 폴리펩티드가 추가의 링커 영역 없이 면역글로불린 분자에 직접, 공유결합을 이용하여 고정되도록 작제물을 고안할 수 있다. 링커 영역이 포함되는 경우, 이 영역은 3 개 이상 30 개 이하의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 링커가 약 5 이상 내지 20개 이하의 아미노산인 것이 더욱 바람직하며, 링커가 10 미만의 아미노산인 것이 가장 바람직하다. 일반적으로 링커는 짧은 글리신/세린 스페이서로 구성되어 있으나, 임의의 알려진 아미노산을 사용할 수 있다.
"면역글로불린(들) 또는 Ig(s)"는 항체 분비 세포의 생성물인 단백질의 군을 의미한다. Ig는 하나 또는 몇 개의 유니트로 구성되며, 각각은 2개의 중(H)쇄 폴리펩티드와 2개의 경(L)쇄 폴리펩티드로 구성된다. 각 유니트는 항원에 대한 2개의 결합 부위를 포함한다. H쇄 및 L쇄는 일련의 도메인으로 구성되어 있다. L쇄는 2개의 도메인으로 구성되며, 2개의 주요 유형(κ 및 λ)이 있다. Ig 분자의 H쇄는, μ, δ와 γ(몇개의 서브클래스가 있음), α 및 ε를 비롯하여 여러 유형이 있다. 중쇄 아이소타입에 의해 규정되는 8개의 유전자적 및 구조적으로 동정된 Ig 클래스 및 서브클래스가 있다: IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE 및 IgA. 또한, 예컨대 "IgG"는 G 클래스의 면역글로블린을 의미하며, "IgG1"은 G 클래스의 서브클래스 1인 IgG 분자를 의미한다. "Fab" 및 "F(ab')2"는 완전한 Ig 분자의 단백질 분해에 의해 생성될 수 있는 Ig 분자의 단편이다. 파파인을 IgG 분자를 분해하면 2개의 Fab 단편과 Fc 단편이 형성되고, 펩신으로 분해하면 F(ab')2 단편과 Fc 부분의 서브단편이 형성된다.
본원에서 언급하고 있는 "이식 항원"은 이식편 인식과 거부반응에 관여하는 분자이다. 수용자의 면역학적 상태는 이식편 생존에 영향을 주는 중요한 인자이기 때문에, 다양한 항원계가 수용/거부 과정과 관련이 있을 수 있다. 이들은 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자 등의 잘 인식되는 HLA 시스템은 물론, ABO 혈액군 시스템, (탄수화물, 비제한적인 예로서 이당류, 삼당류, 사당류, 오당류, 올리고당류, 다당류 및 더욱 바람직하게는 탄수화물 α(1,3) 갈락토실 에피토프[α(1,3)Gal] 등을 포함), T 및 B 세포상에 자가항원 및 단핵구/내피 세포 항원 등의 기타 부(minor) 조직적합성 항원을 포함한다. 본 발명은 주로 2개의 서브유니트 분자를 포함하는 2가 및 다가 헤테로이량체 화합물에 관한 것이기 때문에, 일반적으로 본 발명의 조건하에 경막 도메인, 이식 항원을 자연상태에서 보유하는 것으로 알려진 각각은 MHC 클래스 II 항원을 포함한다. 이식편 거부 반응을 억제 또는 감소시키기 위한 치료 또는 처치에 관련된 임상 응용에서, 항원 특이적 반응을 선택적으로 억제하는 것을 표적으로 한다. 이식 항원은 임의의 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자일 수 있으며, 더욱 구체적으로 인간의 경우, 임의의 MHC 분자는 A(예, A1-A74), B(예, B1-B77), C(예, C1-C11), D(예, D1-D26), DR(예, DR1-DR8), DQ(예, DQ1-DQ9) 및 DP(예, DP1-DP6) 등의 HLA 특이성을 포함한다. HLA 특이성은 A1, A2, A3, A11, A23, A24, A28, A30, A33, B7, B8, B35, B44, B53, B60, B62, DR1, DR2, DR3, DR4, DR7, DR8 및 DR11을 포함하는 것이 더욱 바람직하다[Zachary 등, Transplant. 62:272-283)]. 자가면역 질병의 치료와 관련된 임상 응용에서, 이식 항원은 대상 질병과 관련되거나 연결되어 있는 임의의 MHC 클래스 II 분자이다. 특히 이러한 이식 항원은 임의의 D 및 DR 대립유전자를 포함하나, 자가면역 질병과 관련된 것으로 보이는 DQ 및 DP 대립유전자도 포함한다. 특히, 치료 용도는 본 발명의 가용성 단백질(또한, "특이적 항원 억제인자"라고도 칭함)을 사용하여 이식 항원을 특이적으로 억제하는 것을 포함한다. 구체적으로, 어느 한 치료 용도는 특이적 항원 억제인자를 사용하여 수행된 항-탄수화물 항체 응답을 특이적으로 억제하는 것을 포함한다.
"헤테로이량체"는 대상 단백질이 2개의 별도 폴리펩티드쇄로 이루어진다는 것을 의미한다. 여기서는, 경막 도메인과 세포내 도메인을 가지는 폴리펩티드쇄만을 고려한다. 헤테로이량체 경막 단백질의 다른 클래스는, 서로 결합하여 면역 인식과 관련된 기능적 유니트를 형성하는 α 및 β 다형성 내재막 폴리펩티드를 함유하며, 그 예로는 T 세포 수용체와 같은 단백질과, 클래스 II MHC 분자, 인테그린 (예, 20 개 이상의 세포 표면 헤테로이량체 포함) 및 시토킨 수용체(예, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, 에리트로포이에틴(EPO), 백혈병 억제 인자(LIF), G-CSF, 온코스타틴 M, 모양체 신경영양성 인자(CNTF), 성장 호르몬 및 프로락틴)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
중쇄 면역글로불린과 경쇄 면역글로불린을 모두 동일한 세포외 도메인(즉, 클래스 I MHC 분자 또는 당단백질로부터 유래한 세포외 도메인)에 융합시켜 본 발명의 조성물을 제조하는 것도 가능하다. 단백질 발현 및 중첩은, 모두 동일한 폴리펩티드에 융합된 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 포함하는 키메라 동종사량체 조성물을 형성한다.
"인테그린(integrin)"은 유사 세포와 상이한 세포 사이에 유착을 매개하는 것과 관련된 것으로 알려져 있으며 유착 특성을 가진 단백질의 클래스를 의미한다. 또한 이들 분자는 α 및 β 폴리펩티드로 구성된 헤테로이량체 경막 단백질이다.
"초이량체(superdimer)"는 헤테로이량체 단백질의 이량체를 의미한다. 이 용어는 항원 제시 세포의 표면상에 MHC 분자의 입체구조를 설명하기 위해서 만들어졌다. 본원에서, 이 용어는 클래스 II MHC 또는 TcR 분자의 가용성 2가 또는 다가 형태와 같은 가용성 "초이량체"만을 서술하는 데 사용된다.
"시토킨"은 다른 세포의 활동에 영향을 주는 단백질을 의미한다. 림프구에 의해 만들어진 시토킨은 종종 림포킨 또는 인터루킨이라고 부르지만, 일반명 "시토킨"이 문헌에 가장 자주 사용된다. 시토킨은, 이들이 영향을 미치는 세포상에 존재하는 특이적 "시토킨 수용체"에 대해 작용한다. 시토킨 수용체는, 2개 이상의 성분 폴리펩티드가 경막 스패닝(spanning) 단백질인 분자의 과(科)에 속한다. 이 시스템은 면역계의 세포를 비롯하여 여러 세포 유형의 성장 및 조절의 중심이 된다. 시토킨/시토킨 수용체는 하기와 같은 비제한적인 예를 포함한다: I) 헤마토포이에틴과 (科)(예, 에리트로포이에틴(Epo)/EpoR; IL-2(T-세포 성장 인자)/CD25, CD122; IL-3(다중콜로니 CSF)/CD123; IL-4(BCGF-1, BSF-1)/CD124; IL-5(BCGF-2)/CD125; IL-6(INF-β2, BSF-2, BCDF)/CD126, Cdw130; IL-7/CDw127; IL-9/IL-9R; IL-11/IL-11R, Cdw130; IL-13(P600)/IL-13R; IL-15(T-세포 성장 인자)/IL-15R; GM-CSF(과립구 대식세포 콜로니 자극과)/CDw116; OSM(OM, 온코스타틴 M)/ OMR, CDw130; LIF(백혈병 억제 인자)/LIFR, Cdw130); II) 인터페론과(예, IFN-γ/CD119; INF-α/CD118; INF-β/CD118); III) 면역글로불린 상과(上科; superfamily) (예, B7.1(CD80)/CD28; CTLA-4; B7.2/CD28, CTLA-4); IV) TNF과 (예, TNF-α(카섹틴)/p55, p75, CD120a, CD120b; TNF-β(림포톡신, LT, LT-α)/p55, p75, CD120a, CD120b), LT-β), CD40 리간드(CD40-L)/CD40; Fas 리간드/CD95(Fas); CD27 리간드/CD27; CD30 리간드/CD-30; 4-1BBL/4-1BB; V) 케모킨과(예, IL-8(NAP-1)/CDw128; MP-1(MCAP); MIP-1α; MIP-1β; RANTES); 및 VI) 기타(TFG-β; IL-1α; IL-1β; IL-10(시토킨 합성 억제제 F); IL-12(자연 킬러 세포 자극 인자); 및 MIF).
일반적으로 본 발명의 키메라 화합물을 암호하는 DNA 작제물은 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 가변부 서열의 제 1 아미노산에 융합된 헤테로이량체 복합체(즉, TCRα 또는 β, 또는 MHC 클래스 II α 또는 β) 중 하나의 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시그널 서열을 암호하는 서열을 포함한다. 이러한 DNA 작제물은 면역글로불린 분자의 온전한 가변부에 스플라이싱된 N-말단에 대상 폴리펩티드의 세포외 영역(경막 영역은 포함되지 않음)을 포함하는 단백질을 분비 및 발현한다(도 1 참조). 하나 이상의 아미노산이 삽입되거나 결실되었지만 표적 리간드에 대한 결합 능력을 보유하는 일반적인 구조의 변형체 또는 절두체도 본 발명에 속한다.
표준 클로닝 방법: TcR 및 MHC 분자와 같은 내재막 단백질, 가용성 융합 단백질 및 α 및 β 폴리펩티드 서브유니트로 구성된 하이브리드 융합 단백질의 2가 헤테로이량체 유사체의 결합 부위에 대응하는 아미노산 서열을 암호하는 DNA 서열을 발현 및 클로닝하는 기술, 예컨대 올리고뉴클레오티드 합성, PCR, 세포의 형질 전환, 벡터 작제, 발현계 등이 당업계에 공지되어 있으며, 당업자들은 특정 조건 및 과정을 위한 표준 공급원 물질을 잘 알 것이다.
일반적으로, 각종 발현계가 당업계에 공지되어 있다. 원핵세포는 변형 DNA 서열을 클로닝하는 데 유용하다. 예를 들어, 이.콜리(E.coli) 균주 SR101(Messing 등, Nucl Acids Res 9(2):309-321(1981), 이.콜리 K12 균주 294(ATTC 31446호), 이.콜리 B, UM101 및 이.콜리 χ1776(ATTC 31537호)가 특히 유용하다. 발현을 위해 프로모터와 조절 서열을 포함하는 벡터내로 작제물을 삽입하며, 이 프로모터와 조절 서열은 목적하는 숙주 세포와 적합한 종에서 유래한 것이다. 필수적인 것은 아니지만, 일반적으로 벡터는 하나 이상의 마커 서열과 복제 부위를 포함하여, 마커서열은 형질전환된 세포에서 표현형의 선별을 가능하게 한다. 예를 들어, 이.콜리는 전형적으로 이.콜리 종에서 유도된 플라스미드인 pBR322의 유도체를 사용하여 형질전환시킨다[Bolivar 등, Gene 2:95 (1977)]. pBR322는 앰피실린 내성 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하여 형질전환된 세포를 쉽게 동정할 수 있는 수단을 제공한다. pBR322 플라스미드 또는 기타 미생물 플라스미드는 재조합 DNA 작제에 통상 사용되는 프로모터 및 기타 조절 성분을 포함하거나 또는 포함하도록 변형되어야 한다.
원핵세포 숙주에 사용하기 적절한 프로모터는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템(Chang 등, Nature 275:615(1978); Goeddel 등, Nature 281:544 (1979)), 알카리 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템(Goeddel 등, Nucl Acid Res 8:4057(1980)) 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터(de Boer 등, Proc Natl Sci USA 80:21-25 (1983))가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 작용성 박테리아 프로모터가 적절하다. 링커 또는 어댑터라고 불리우는 뉴클레오티드 서열이 일반적으로 알려져 있으며, 당업자들은 이를 대상 DNA 서열에 작동가능하게 결찰시킬 수 있다[Siebenlist 등, Cell 20:269(1980)]. 또한 박테리아계에 사용하기 위한 프로모터는 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함할 것이다.
원핵 세포외에, 효모 배양물과 같은 진핵 미생물은 클로닝 또는 발현 숙주로 유용하다. 특히, 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 빵 효모(일반 명칭)는 널리 사용된다(기타 균주들도 상업적으로 유용함). 사카로마이시스에서 발현시키기 위해서, 예컨대 플라스미드 YRp7이 널리 사용된다[Stinchcomb 등, Nature 282:39(1979)]. 이 플라스미드는 이미 trp1 유전자를 포함하고 있으며, 이 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 결핍된 효모의 돌연변이 균주 (ATTC 44076호)에 대한 선별 마커를 제공한다. 효모 숙주 세포 게놈의 특성으로서 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재하에서의 성장에 의한 효과적인 선별 수단을 제공한다. 효모 숙주에 사용하기 적절한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 기타 당분해 효소, 예컨대, 에놀라제, 헥소키나아제, 피루베이트 키나아제 및 글루코키나아제를 위한 프로모터를 포함한다. 성장 조건에 의해 조절되는 전사의 또 다른 장점을 가진 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모터는, 예컨대 알코올 탈수소효소 2, 산 포스파타제, 메탈로티오네닌에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 적절한 벡터 및 프로모터는 문헌[R.Hitzeman 등, 유럽 특허 공보 제73,657A호]에 더 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사를 조절하기 위한 프로모터는 각종 공급원, 예컨대 폴리오마 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 시토메갈로바이러스(CMV)와 같은 바이러스의 게놈에서 얻거나, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예컨대 베타 액틴 프로모터에서 얻을 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 통상 SV40 제한 단편으로서 얻을 수 있으며, 이는 SV40 바이러스의 복제 기점도 포함한다[Fiers 등, Nature 273:113(1978)]. 인간 CMV의 즉시 초기(immediate early) 프로모터는 통상 HindIII E 제한 단편으로서 얻어진다[Greenaway 등, Gene 18:355-360(1982)].
고등 진핵 세포에서의 DNA 전사는 벡터내로 인핸서(inhancer) 서열을 삽입하여 증가시킨다. 인헨서는 일반적으로 10 bp 내지 300 bp DNA의 시스-작용 성분으로서, 프로모터의 전사 개시 능력을 증가시키는 작용을 한다. 인헨서는 전사 단위에 대해 5' 및 3' 위치에서 발견되는 상대적으로 배향 및 위치가 독립적인 것으로, 인트론내 뿐만 아니라 암호서열 자체내에 존재한다. 포유동물 유전자에서 유래한 여러 인핸서 서열이 알려져 있다(예, 글로빈, 엘라스타제, 알부민 및 인슐린). 그러나, 진핵 세포 바이러스로부터 유래한 인헨서를 이용하는 것이 통상적이다. 예로서 복제 기점의 후측에 있는 SV40 인핸서(bp 100-270), CMV 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후측에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 있다.
또한 진핵 숙주 세포(효모, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 전사 종결에 필수적인 서열을 포함할 수 있으며, 이 서열은 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있다. 이들 영역은 원하는 서열을 암호하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 분절로서 전사된다. 가용성 구조물을 암호하는 DNA를 함유하는 클론을 발현에 적절한 숙주 세포내로 형질감염시킨다. 사용된 숙주 세포에 따라서, 표준 기술(포유동물 세포내로의 형질감염은, DEAE-덱스트란 매개형질감염, CaPO4 동시 침전법, 리포펙션(lipofection), 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 원형질 융합)과, 비제한적인 예로서 리소자임 융합 또는 직접 흡수법, 삼투압 또는 수크로즈 충격법, 직접 미소주입법, 간접 미소주입법 및/또는 세포에 전류를 가하는 것 등을 비롯하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 형질감염시킨다.
본 발명의 펩티드, 단백질 또는 분자는, 본 발명의 특정 분자의 특이적 결합 활성 또는 분자의 특정 농도 검출에 사용하기 위해서 방사능표지(예, 32P), 형광 표지, 효소, 기질, 고체 매트릭스 또는 담체(예, 비오틴 또는 아비딘) 등을 비롯하여 리포터군에 접합시킬 수 있다. 본 발명의 하이브리드 작제물은 독소를 포함하도록 더 변형시킬 수 있다.
본 발명의 2가 및 다가 헤테로이량체 화합물은 면역계를 조절하는 방법에서 면역 조절제로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 활성화되거나 억제될 수 있는 면역조절 작용은 하기 면역 반응을 자극, 억제 또는 제거하는 능력을 포함한다: 적혈구계 선조 생성, T 세포 증식, 조혈작용 생성, B 세포 활성화, 클래스 스위칭(예, IgE 스위치), 호산구 성장 및 분화, T 세포와 B 세포의 성장 및 분화, 급성상 반응, 프리-B 세포와 프리-T 세포의 성장, 마스트(mast) 세포 활성, 조혈작용에서의 IL-3 및 IL-4의 관여, 시토킨 활성화 또는 억제; 골수단핵구 계열의 분화; 암 세포 성장 및 발달; 대식세포 활성화, MHC 발현, 항-바이러스 활성, T-세포 반응, 염증, 항-염증, 내피세포 활성, B 세포 활성, 아폽토시스, 칼슘 비의존성 세포독성; 호중구, T 세포, 호산구 및 대식세포의 화학주성 활성, 열, 세포(대식 세포, T 세포, B 세포, 호중구, 호산구, 자연 킬러 세포) 작용, 항원 프로세싱, 세포독성 및 수용체 가교결합. 필수적으로, 본 발명의 하이브리드 작제물은 특이적 T 세포 서브세트의 세포 활성화, 증식, 무감작(내성) 또는 결실을 선택적으로 증가, 감소 또는 제거한다[Hewitt 등, J. Exp. Med. 175:1493(1992); Choi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:8941(1989); Kappler 등, Science 244:811 (1989); Minasi 등, J. Exp. Med. 177:1451(1993); Sundstedt 등, Immunology 82:117(1994); 및 White 등, Cell 56:27(1989)].
또한, 본 발명의 화합물은 면역 장애와 관련된 질병을 치료하는 데 사용할 수 있다. 면역 반응의 억제 또는 활성화로 이득을 얻을 수 있는 증상으로는 하기와 같은 질환 및 질병을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 자가면역 질병, 예컨대 특발성 혈소판 감소성 자반, 전신 홍반성 루푸스, 중증 근무력증, 관절염, 자가면역 용혈, 사구체신염, 다발성 경화증, 건선, 유년기 당뇨병, 1차 특발성 점액 수종, 전신 홍반성 루푸스, 자가면역 천식, 경피증, 만성 간염, 아디손병, 성선기능 저하증, 악성 빈혈, 백반, 원형 탈모증, 복강병, 자가면역 장질환 증후군, 특발성 용해성 자반, 후천적 스페닉(spenic) 위축증, 특발성 요붕증, 항스페르마타조안(antispermatazoan) 항체로 인한 불임, 갑작스러운 청각 상실, 감각신경의 청각 상실, 다발성근염, 자가면역 수초탈락 질병, 횡단 척수염, 실조성 경화증, 진행성 전신성 경화증, 피부근염, 결절성 다발성 관절염, 용혈성 빈혈, 사구체신염, 특발성 안면 마비, 심상성 펨피구스, 저온형 글로불린혈증 및 AIDS, 엡스타인 바르 바이러스와 관련된 질병, 예컨대 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염, 부키트 림프종, 호지킨병, 바이러스(AIDS 또는 EBV) 관련 B 세포 림프종, 만성 피로 증후군, 기생충병, 예컨대 레시마니아(Lesihmania) 및 면역억제 질병 상태, 예컨대 동종 이식 후에 바이러스 감염 또는 AIDS, 암, 만성 활성 간염, 당뇨병, 독소 충격 증후군, 식중독 및 이식 거부반응.
본 발명의 벡터 작제물에는 키메라 헤테로이량체 분자의 각 성분의 분비를 위한 시그널 서열이 병입되어 있기 때문에, 본 발명의 치료 방법은 유전자 치료를 위해 고안된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 사용하여 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 DNA인 경우, 자체 비복제성 이나 복제성 플라스미드 벡터내로 삽입되는 DNA 서열일 수도 있다. 숙주 세포 게놈내로 통합되지 않도록 폴리뉴클레오티드를 유전자 조작할 수 있다. 대안적으로, 염색체내에 통합되도록 폴리뉴클레오티드를 유전자 조작할 수 있으나, 단 폴리펩티드의 발현을 조절할 수 있어야 한다. 이러한 생체내 적응성을 가지는 조절가능한 유전자 발현계가 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, HSV 티미딘 키나아제와 같은 세포독성 펩티드를 암호하는 유전자 서열을 폴리뉴클레오티드 또는 벡터내에 포함시켜서 형질감염된 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다[Borrelli 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:7572, (1988)]. 환자가 간사이클로비르(gancyclovir)에 노출되는 경우, 티미딘 키나아제 유전자가 형질감염된 세포의 자살 유전자로 작용한다. 따라서, 본 발명의 암호된 펩티드의 발현양이 너무 많은 경우, 간사이클로비르를 투여하여 펩티드를 발현하는 세포의 비율(%)을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 조성물, 더욱 구체적으로 상이한 클래스의 헤테로이량체 경막 단백질 또는 이를 암호하는 폴리뉴클레오티드는 약학적으로 허용가능한 적절한 담체 또는 희석제, 예컨대 거대분자와 함께 약학 조성물을 제조될 수 있으며, 헤테로이량체 경막 단백질은 서로 결합하여 면역 인식과 관련된 작용 단위를 형성하는 α 및 β 다형성 내재막 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 약학적으로 허용가능한 담체는 당업자들이 치료계획안의 일부로서 환자에게 상기 담체를 주사하는 것을 허용하도록 생리학적 허용성이 있으며 순환계에서 가용성인 것을 의미한다. 담체는 순환계에서 비교적 안정하고, 제거를 위해 허용가능한 혈장 반감기를 가진다. 적절한 담체의 비제한적인 예로는 염수 및 완충 매질 등을 비롯하여 물, 알코올 용액/수용액, 유화액 또는 현탁액, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 헤파린, 면역글로불린, 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리옥시에틸화 폴리올, 또는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜로 유도하므로써 항원성을 감소시키도록 변형된 단백질이 있다. 적절한 담체가 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 제4,745,180호, 제4,766,106호 및 제4,847,325호에 개시되어 있으며, 본원에서 이를 참고로 인용하였다. 필요에 따라, 약학 조성물은 각 투여 경로에 통상적인 방식으로 예컨대 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태 등의 제제로 제형화할 수 있으며, 예를 들어 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사제, 흡입제 및 에어로졸이 있다. 당업계에 공지된 방법을 이용하여 조성물이 표적 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 또는 흡수를 방지하거나 또는 조성물이 시간이 경과한 후 방출되도록 한다. 본 발명의 조성물을 유효하게 하는 약학적으로 허용가능한 형태를 사용해야 한다. 약학적 제형에서, 조성물은 단독으로 또는 적절한 복합형태 뿐만 아니라 기타 약학적으로 활성인 화합물과의 조합 형태로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 가용성 작제물, 또는 더 구체적으로 서로 결합하여 면역 인식과 관련된 작용 단위를 형성하는 α 및 α/β 내재막 폴리펩티드를 포함하는 상이한 클래스의 헤테로이량체 경막 단백질을 전달하기 위해 본 발명의 방법을 사용하는 경우, 이러한 전달은 예를 들어 감염성 질병, 자가면역, 암의 치료하는 기타의 방법과 병행하여 사용할 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로, 또는 기타 진단제, 치료제 또는 추가 제제와 함께 투여할 수 있다. 치료제는 시토킨 또는 림포킨, 예컨대 IL-2, α-인터페론 및 인터페론-γ를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은 각종 경로를 통하여 동물체의 각 부위에 전달되어 특정 효과를 얻을 수 있다. 신체강내로 제제의 점적 또는 도포, 에어로졸 흡입 또는 취입을 비롯한 투여, 또는 근육내, 정맥내, 복강내, 피하, 피내와 국소 투여를 포함하는 비경구적 주입으로 국부 또는 전신 전달을 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물은 단위 제형으로 제공할 수 있으며, 각각의 복용 단위, 예를 들어 찻숟가락양, 정제, 용액 또는 좌약은 소정량의 조성물을 단독 또는 기타 약학적 활성제와 함께 적절히 조합된 형태로 포함한다. "단위 제형"은 인간 및 동물 검체를 위해 단위 복용량으로 사용하기 적절한 물리적으로 분리된 단위체를 의미하며, 각 단위체는 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체(예, 염수 용액, 완충 용액 또는 기타 생리 수용액 등의 액상 담체) 또는 부형제와 함께 본 발명의 조성물을 단독 또는 기타 활성화제와 조합한 형태로 소정량을 포함하며, 이 양은 원하는 효과를 얻기에 충분한 양으로 계산된 것이다. 본 발명의 신규 단위 제형에 대한 구체적 사항들은 얻고자 하는 특정 효과와, 특정 숙주에서 약학 조성물과 관련된 특정 약동학에 따라 달라진다.
또한, 본 발명은 숙주에 본 발명의 가용성 작제물을 투여하는 방법을 제공하며, 이는 특정 용도로 적합하고 당업자에게 알려진 임의의 전술한 투여 경로 또는 대체 경로를 사용하여 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 조성물의 "유효량"은 당업자들에게 알려진 몇가지 종점을 사용하여 모니터링될 수 있는, 숙주에서의 원하는 효과를 생성할 수 있는 양이다. 예를 들어, 원하는 효과가 숙주 세포로의 효과적인 핵산 전달일 수 있다. 이러한 전달은 치료할 질병과 관련된 일부 증상의 경감과 같은 치료 효과; 또는 예컨대, 숙주 세포내에 핵산을 검출하기 위한 전사 분석법이나 PCR, 노던 하이브리드화 기술, 또는 서던 하이브리드화 기술이나 , 또는 실시예에 개시한 바와 같이 전달된 핵산에 의해 암호되거나, 또는 이 전달로 인하여 농도 또는 작용에 영향을 받는 폴리펩티드 또는 단백질을 검출하기 위한 면역블롯 분석법, 항체-매개 검출 또는 특수 분석법을 사용하여 숙주내 유전자의 발현 또는 유전자 전달 증거를 모니터링한다. 개시된 이 방법이 전부가 아니며, 당업자라면 특정 용도에 적합한 또 다른 방법을 알 것이다.
특정 치료 방법에 사용할 2가 및 다가 헤테로이량체 화합물의 특정 사용량은 치료할 증상, 표적에 대한 특정 시약의 결합 친화도, 질병 진행 정도에 따라 다양할 것이다. 그러나, 사용량은 일반적으로 매일 체중 1kg 당 1 pg 내지 100 ㎎의 범위에 속한다. 약학 조성물의 활성 성분이 핵산이면, 일반적으로 사용량은 체중 1 kg당 1 nM 내지 50μM이다. 본원의 실시예에서 사용한 조성물에 포함된 각 활성제의 양은, 시험관내 또는 생체내 실시를 위해 본 발명의 방법을 최적화하기 위해 당업자가 이용하는 각 성분 범위에 대한 일반적인 지침을 제공한다. 더구나, 상기 범위는 특정 용도로 사용해야 하는 경우 더 다량의 성분 또는 더 소량의 성분을 사용하는 것을 배제하는 것은 아니다. 예를 들어, 실제 사용량과 계획은 조성물이 기타 약학 조성물과 함께 투여되는지의 여부, 또는 약력학, 약물 소인 및 대사에 대한 개인적 차이에 따라 달라질 수 있다. 이와 유사하게, 이용된 특정 세포주, 예컨대 그 세포주에서 복제하기 위해 사용된 플라스미드의 능력에 따라 시험관내 응용에서 양을 달리할 수 있다. 또한, 세포당 첨가되는 핵산의 양 또는 처리시 첨가되는 핵산의 양은 핵산의 길이 및 안정성과 서열의 특성에 따라 다양할 것이며, 특히 실험적으로 측정할 필요가 있는 변수이며, 예컨대 합성과 관련된 비용과 같이 본 발명의 방법에 고유하지 않은 인자에 의해서 변경될 수 있다. 당업자는 특정 상항의 필요에 따라서 쉽게 필요한 조정을 행할 수 있다.
발명의 개요
본 발명의 제1목적은 헤테로이량체 단백질의 가용성 재조합 2가 및 다가 유사체를 제공하는 것이며, 이들 유사체는 표적 분자에 특이적으로 결합하여 면역 반응을 조절할 수 있다.
본 발명의 제2목적은 표적 분자에 대해 증가된 친화력을 보유하는 가용성 재조합 2가 헤테로이량체 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3목적은 헤테로이량체 내재막 단백질의 가용성 2가 유사체를 암호하는 발현 벡터를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 면역글로블린 중쇄에 융합된 α폴리펩티드 및 면역글로블린 경쇄에 융합된 β폴리펩티드와 같이, 2개 이상의 DNA 서열을 삽입시킴으로써 면역글로불린 분자에 대한 발현 벡터를 변형시키는 단계를 포함한다(도 2). 이는 면역글로블린 중쇄에 융합된 β폴리펩티드 및 면역글로불린 경쇄에 융합된 α폴리펩티드와 같이, 2개 이상의 DNA 서열을 삽입시킴으로써 수행할 수 있다. α 및 β 폴리펩티드는 결합 부위 또는 인식 부위를 암호한다. 또한 본 발명의 융합 단백질은 2개의 상용성 발현 벡터에 의해 암호될 수 있다.
본 발명의 제4목적은 α 및 β 폴리펩티드 서브유니트를 함유하는 가용성 2가 헤테로이량체 단백질을 발현할 수 있는 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 제5목적은 면역 반응을 억제 또는 감소시키는 방법을 제공하는 것이다. 특히, T 세포와 항원 제시 세포 사이의 항원-특이적 상호작용은 TcR 또는 클래스 II MHC 분자의 가용성 2가 유사체를 사용하여 억제할 수 있다. 예로서, 증증 근무력증, 다발성 경화증, 관절염 및 알러지 질병에서 발견되는 자가면역 반응을 억제한다. 인테그린(integrin)의 상호작용으로 매개된 세포의 유착은 인테그린 분자의 가용성 2가 유사체를 사용하여 억제할 수 있다. 시토킨 수용체의 가용성 2가 형태가 가용성 시토킨에 결합되어 세포 증식을 매개하는 시토킨의 능력을 억제한다는 점에서 시토킨-매개 세포 자극의 억제 역시 포함된다.
본 발명의 제6목적은 면역 반응을 증대시키는 방법을 제공하는 것이다. 특히, T 세포와 항원 제시 세포 사이의 항원 특이적 상호작용은, 항원-특이적 T 세포 응답을 자극하기 위해서 기질에 고정된 클래스 II MHC 분자 또는 TcR의 가용성 2가 유사체를 사용하여 증가시킬 수 있다. 항원성 펩티드를 제시하는 고정된 MHC/Ig 분자의 경우, 이 시스템은 T 세포 서브세트를 동정 및 정제하는 데 사용할 수 있다. 즉, 클론형 TcR의 동정에 사용할 수 있다. 이와 유사하게, 고정된 TcR/Ig는 암 또는 AIDS 등의 감염성 질병과 관련이 있는 알려지지 않은 펩티드/MHC 복합체를 동정 및 정제하는 데 사용할 수 있다. 또한 유착 수용체를 통한 세포 자극은, 고체 기재, 예컨대 조직 배양판 또는 비이드상에 고정된 인테그린 분자의 가용성 2가 유사체를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 제7목적은 단백질의 가용성 재조합 2가 헤테로이량체 유사체를 투여하여, α 및 β 폴리펩티드가 유니트를 형성하고, 청구된 작제물이 특이적 T 세포 서브세트의 세포 활성, 증식, 무감작, 또는 결실을 선택적으로 증가 또는 감소시킴으로써 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 질병으로는 자가면역 질환, 이식 거부반응, 암 및 AIDS가 있다. 본 발명의 2가 및 다가 복합체가 각각의 표적에 대한 증가된 친화력을 보유하기 때문에, 이 화합물의 투여는 지정된 표적 분자에 결합하고 세포-대-세포 상호작용을 억제함으로써 자가 항원 및 특이적 이식 항원의 T 세포 인식을 선택적으로 억제 또는 차단한다.
당업계에 공지된 기술을 사용하여 리신(ricin) 및 슈도모나스 외독소 등의 독소 분자를 본 발명의 화합물에 접합시킬 수 있다. 본 발명의 제8목적은 이 접합 분자를 이용하여 암 및 AIDS를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 예를 들어, 바이러스 감염된 세포 또는 종양 세포의 MHC 분자상에 나타나는 바이러스 특이적 펩티드 또는 종양 특이적 펩티드를 동정한 후에, 독소가 접합된 가용성 헤테로이량체 TCR 분자는 HIV 바이러스를 보유하는 세포 또는 암 세포에 각각 결합되어 이를 파괴하도록 고안할 수 있다. 또한, 종양 관련 펩티드 또는 AIDS 관련 펩티드를 나타내는 가용성 2가 또는 다가 MHC/IG 분자는 면역화 프로토콜에 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 제9목적은 가용성 2가 TcR을 사용하여 미지의 항원 또는 이것에서 유도된 펩티드를 동정하는 방법을 제공하는 것이다. 가용성의 고 친화도를 가진 TCR/Ig 키메라의 뚜렷한 장점은, 리간드에 대하여 알고 있는 것이 없더라도 자가면역 반응에 관련된 T 세포 및 특성화되지 않은 종양 특이적 T 세포에 의해 인식되는 특이적 펩티드/MHC 리간드를 규정하는 데 사용할 수 있다는 것이다. 가용성 2가 TcR/Ig 분자는 특이적 펩티드/MHC 복합체를 정량적으로 검출하기 위한 효과적인 프로브이며, 표적 분자에 대한 강한 친화력 때문에, 결과적으로 복합체의 정제시 중요한 역할을 하고 특성화를 용이하게 한다.
본 발명의 내재막 단백질의 가용성 2가 헤테로이량체 유사체는, 이들 재조합 단백질이 면역 응답을 조절하기 위해 증가된 결합 친화도를 보유하기 때문에 중요한 잇점을 제공한다. 본 발명의 2가 키메라 분자와 같이, 높은 친화력을 가진 2가 리간드를 사용하여 특이적 T 세포 반응을 선택적으로 조절하고 다가 리간드-수용체 상호작용에 의해 유래하는 세포-세포 상호작용을 연구할 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 가장 좋은 방법을 단지 예시한 것이며, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
세포 및 배양 조건: RMA-S, RMA-S Ld, T2, T2 Kb, T2 Kbm3, T2 Kbm11 및 RENCA 세포는 2 mM 글루타민, 비필수 아미노산, 50 5 g/㎖의 젠타미이신, 5×10-5M 2-머캅토에탄올 및 10% 태아 소 혈청으로 보강한 RPMI-1640에서 매주 3회 1:10 계대배양으로 유지하였다.
가용성 2C TcR 유사체의 발현: 가용성 2가 2C TcR/Ig의 작제, 발현, 정제 및 특성화에 관한 세부사항은 다른 문헌[O'Herrin 등, manuscript in preparation]에 개시된 것을 참고로 실시하였다. 간단히 요약하면, 가용성 2가 2C TcR을 생성하기 위해서, 2 C TcR α 및 β쇄를 암호하는 cDNA는 각각 IgG1 중쇄와 k 경쇄를 암호하는 cDNA에 6개의 아미노산 글리신/세린 스페이서를 통해 유전자적으로 결합시켰다(참고 도 1의 단백질 개략도). 가용성 1가 2C TcR을 제조하고 전술한 바와 같이 정제하였다[Corr 등, Science 265:946-949 (1994)].
세포의 펩티드 적재: RMA-S 및 T2 세포주는 항원 프로세싱에 결함이 있으며 세포 표면상에 기능 없는(empty) 클래스 I MHC를 발현시킨다[Spies 등, Nature 355:644-646(1992); Townsend 등, Nature 340:443-448 (1989)]. 이들 기능 없는 MHC 분자에 문헌[Catipovic 등, Journal of Experimental Medicine 176:1611-1618 (1992); Townsend 등(1989), 상기 문헌 참조]에 개시된 바와 같이 펩티드를 적재할 수 있다. 간단히 요약하면, 세포(RMA-S, RMA-S Ld, T2, T2 Ld, T2 Kb, T2 Kbm3 또는 T2 Kbm11)를 밤새 27℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 각종 항원 펩티드(100 5M 최종 농도)의 존재 또는 부재하에 27℃에서 1.5 시간, 37℃에서 1시간 더 항온배양하였다.
RENCA 세포는 37℃에서 >2 시간동안 펩티드(100 5M 최종 농도)와 함께 항온처리하여 펩티드를 적재하였다. 이어서, 세포를 회수하고 개시된 바와 같이 FACS 분석을 진행하였다.
H-2 L d 분자에 대한 가용성 2C TcR의 친화도 측정: 펩티드 적재 세포에 대한 가용성 2C TcR 유사체의 친화도는 전술한 방법[Schlueter 등, Journal of Molecular Biology 256:859-869(1996)]과 유사하게 FITC-30.5.7 Fab를 사용한 경쟁 분석으로 측정하였다. 30.5.7은 H-2 Ld의 펩티드에 노출된 면 부근의 에피토프를 인식하는 모노클로널 항체이다; 따라서 30.5.7 및 2C TcR은 H-2 Ld의 펩티드에 노출된 면에 결합하기 위해서 경쟁한다. 펩티드-적재 RMA-S Ld세포에 대한 30.5.7 Fab의 Kd는 하기와 같이 측정하였다. 세포(0.3×106/㎖)에 전술한 바와 같이 펩티드를 적재하였다. 이어서, 펩티드-적재 세포 또는 대조 세포를 FITC-30.5.7 Fab의 농도를 다양하게 하여 4℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 유동 세포 계측법으로 분석하기 바로 전에 FACS 세척 완충액(PBS, 1% FCS, 0.02% NaN3)를 사용하여 1:6으로 희석하였다. Kd는 1/(평균 채널 형광) 대 1/[FITC-30.5.7 Fab]를 플롯하여 추정하였다.
2C TcR 유사체의 친화도는 일정한 농도의 FITC-30.5.7 Fab와 경쟁시켜 측정하였다. 세포에 펩티드를 적재한 후, 일정 농도의 FITC-30.5.7 Fab와 다양한 농도의 2C TcR 유사체를 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 세포는 유동 세포계측법으로 분석하기 직전에 FACS 세척 완충액을 사용하여 1:6으로 희석하였다. FITC-30.5.7 Fab 결합의 최대 억제율은 30.5.7 mAb(75 ㎎)의 존재하에 항온처리함으로써 측정하였다. Kapp는 1/(% 최대 억제율) 대 [2C TCR 유사체]를 플롯하여 결정하였다. Kapp는 등식 Kd, TcR=Kapp/(1+[FITC 30.5.7 Fab]/Kd, 30.5.7))에 따라 펩티드 적재 세포에 대해 FITC-30.5.7 Fab의 친화도를 보정하였다[Schlueter 등, (1996) 상기 문헌 참조].
직접 유동 미소형광측정법 : 약 3×105 펩티드-적재 세포 또는 대조 세포를 60분 동안 4℃에서 30 ㎖∼50 ㎖ 부피의 ∼50 ㎎/㎖의 mAb 30.5.7 배양 상등액, 50 ㎖의 2C TcR/Ig 배양 상등액(10 5g/㎖ 최종 농도), 또는 30 ㎖ 부피의 정제된 2C TcR/Ig 25∼50 ㎎/㎖를 사용하여 항온처리하였다. 세포를 1×PBS, 1% FBS, 0.02% Na-아지드(FACS 세척 완충액)로 1회 세척한 후, 염소 항-마우스 IgG-RPE(서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠, 인코포레이티드에서 입수) 1/20 희석액 20 5ℓ중 4℃에서 60 분동안 추가로 항온처리하였다. 이어서, 세포를 FACS 세척 완충액으로 1회 세척하고, 250 ㎕ FACS 세척 완충액에 현탁시키고, 벡톤 디킨슨 FACScan 유동 세포계측기에서 분석하였다.
CTL 분석(CTL의 생성)- 2C TCR 형질전환 마우스의 비장세포[Sha 등, Nature 336:73-76 (1988)]를 1㎖당 1.25×106으로 재현탁시키고, 3,000 cGy 방사선에 노출된 1.75×106 BALB/c 비장세포로 자극시켰다. 7일 째에, 2C T 세포가 농축된 배양액을 BALB/c 비장세포 2.5×106/㎖와 5×105/㎖로 재자극시켰다. 실험은 이 시기와 4일 째 후속 자극시에 수행하였다. 모든 후속 자극은 IL-2(5 U/㎖)의 존재하에 2C 비장세포 3.75×105/㎖과 BALB/c 세포 2.5×106/㎖로 수행하였다.
기존의 CTL 프로토콜에 따라 3회 분석을 수행하였다. 간단히 요약하면, 표적 세포(2∼4×106)를 1시간 동안 37℃에서 100 5Ci51[Cr]과 함께 항온처리하였다. 3회 세척후에, 세포를 V자 바닥 96 웰 플레이트(3×103/100 5ℓ)에 첨가하고, 표시 농도의 펩티드와 함께 항온처리(1.5 시간 동안 25℃)하였다. 2C T 세포(3×104/100 5ℓ)를 표적에 첨가하고, 4.5 시간 동안 37℃에서 플레이트를 항온처리하였다. 5% 트리톤×100과 함께 표적세포를 항온처리함으로써 최대 방출율을 얻었다. 특이적 세포용해율(%)은 [(실험적 방출값-자발적 방출값)/(최대 방출값-자발적 방출값)] x 100을 이용하여 데이터원으로부터 계산하였다.
키메라 분자의 일반적인 작제 및 생화학적 특성규명
골격으로서 면역글로블린을 사용하여, 헤테로이량체 경막 단백질의 가용성 재조합 2가 유사체의 발현을 위한 일반 시스템을 고안하였다(도 1B∼D 및 도 2). 도 2에 도시된 바와 같이, 부위 지정 돌연변이 유발법을 이용하여 KpnI 및 Hind III 등의 제한 효소 부위를 각각 Ig 중쇄와 경쇄의 5' 영역으로 삽입하였다. 효소 부위는 리더 서열 바로 뒤와, 완전한 가변부 도메인을 암호하는 성숙 단백질의 개시부 앞에 도입하였다. 이 방법은 키메라 폴리펩티드의 발현을 위한 유전자 시스템을 제공하며, 헤테로이량체 단백질의 2가지 다른 클래스의 가용성 2가 유사체의 작제를 위한 기본 분자로서 작용한다. 서로 결합하여 면역 인식과 관련된 기능 유니트를 형성하는 α 및 β 다형성 내재막 폴리펩티드를 포함하는, 상이한 클래스의 헤테로이량체 경막 단백질은 T 세포 수용체 등의 단백질과, 클래스 II MHC 분자, 인테그린 및 시토킨 수용체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다단계 작제법을 사용하여 유전적으로 α 및 β 폴리펩티드를 Ig 중쇄와 경쇄에 융합시켜 키메라 IgG 분자를 형성시켰다. 키메라 융합쌍은 쥐 IgG1 아르조네이트-특이적 중쇄 93G7 및 κ 경쇄 91A3을 암호하는 cDNA로 구성하였다[Haseman 등, Proc Natl Acad Sci USA 87:3942-3946 (1990)]. 이들 Ig 폴리펩티드는 모두 바큐로바이러스 감염 세포에서 가용성인 완전한 IgG1 분자를 발현 및 형성하였다. 경쇄 클론 91A3을 암호하는 cDNA는 성숙 단백질의 개시시 위치 1 아미노산 잔기, 즉 Asp 바로 앞에 링커와 5' HindIII 부위를 도입하여 변형시켰다. KpnI 제한 효소 엔도뉴클레아제 부위는 성숙 κ 폴리펩티드 중의 종지 코돈 후에 도입시켰다. 93G7 클론을 암호하는 cDNA를 변형시켰으나, 성숙 단백질의 개시부에 위치한 아미노산 잔기 위치 Glu의 5' 바로 앞에 KpnI 제한 효소 엔도뉴클레아제 부위와, 성숙 IgG1 단백질의 종지 코돈의 3'에 SpHI 제한 효소 엔도뉴클레아제 부위를 도입시켰다.
실시예 1
가용성 2가 클래스 II MHC 분자 및 T 세포 수용체의 작제 및 발현
가용성 2가 클래스 II MHC 분자 및 T 세포 수용체(TcR) 등의 가용성 헤테로이량체 내재 단백질의 작제 및 발현시 난점은 α 및 β 쇄 폴리펩티드를 면역글로불린 중쇄 및 경쇄에 결합시킴으로써 극복하였다(도 1 및 도 2). 가용성 2가 TcR을 사용하면, 이 가용성 단백질이 펩티드/MHC 복합체에 대해 높은 친화력이 있는 리간드임을 데이타로부터 알 수 있다.
TcR 해석 및 작제:
2C TcR을 선택하여 가용성 2가 TcR 유사체를 생성하였다. 2C는 잘 규명된 동종반응성(alloreactive), 펩티드 특이적 세포독성 T 림프구(CTL) 클론이다[Kranz 등, Proc Natl Acad Sci USA 81:573-577 (1984)]. 이 클론은 쥐 클래스 I 분자 H-2Ld에 의해 결합된 알파-케토글루타레이트 탈수소효소로부터 유도된 자연 발생적인 내인성 펩티드에 특이적이다[Udaka 등, Cell 69:989-998 (1992)]. 본래 2C 반응성 펩티드인 p2Ca는 8개의 아미노산 잔기로서 동정되었다. 2C 세포와 반응성이 있는 p2Ca의 고 친화도 변형체와 저 친화도 변형체가 규정되었다[Sykulev, Immunity, 상기 문헌 참조; Sykulev 등, Proc Natl Acad Sci USA 91:11487-11491 (1994)](참고 표 3).
2C TcR에 특이적인 클론형 모노클로널 항체인 1B2가 개발되어왔다[Kranz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:573-577 (1984)]. 2C 특이성을 부여하는 TcR을 클로닝하고 2C TcR을 발현하는 형질전환 마우스 역시 생성하였다[Sha 등, Nature 336:73-76 (1988); Sha 등, Nature 335:271-274(1988)]. 전술한 종래 기술로 2C TcR은 우수한 연구 모델이 되었다.
가용성 2가 TcR을 생성하기 위해서, TcR의 TcR α 및 β쇄를 암호하는 cDNA를 각각 IgG1 중쇄와 κ 경쇄를 암호하는 cDNA에 유전자적으로 연결하였다. 부위-지정 돌연변이유발법을 이용하여 제한 엔도뉴클레아제 효소 부위를 리더 서열 전에 5' 영역내와 경막 도메인을 암호하는 영역의 바로 앞의 TcR α 및 β 유전자의 3' 영역내로 도입시켰다(참조 도 1B∼D 단백질의 개략도, 도 2 발현 벡터 및 도 3 돌연변이를 유도하기 위해 사용한 올리고뉴클레오티드). TcRα 및 βcDNA내에 있는 3' 영역에 도입된 부위는 각각 면역글로블린(Ig) 중쇄 및 경쇄 cDNA내로 도입된 부위와 양립가능하였다. 발현을 위해서, 작제물을 변형된 형태의 바큐로바이러스 발현 벡터 pAcUW51 및 다른 바큐로바이러스 발현 시스템내로 클로닝하였다[Kozono 등, Nature 369:151-154(1994)]. 발현 벡터에는 2개의 별도 바이러스 프로모터인 폴리헤드론 및 P10이 있으며, 이로 인해 단일 바이러스 감염 세포내에서 2개의 폴리펩티드가 발현될 수 있다.
2C TcR α쇄는 α 폴리펩티드의 경막 도메인과 세포외 도메인의 계면에 있는 Gln 잔기의 바로 3'쪽에 KpnI 제한 효소 엔도뉴클레아제 부위와 링커를 도입시켜 변형시켰다. 유전자의 5' 영역은 적절한 제한 효소 엔도뉴클레아제 부위를 이미 발현시켰으며, 추가의 변형을 요하지 않았다.
2C TcR β쇄는 β 폴리펩티드의 경막 도메인과 세포외 도메인의 계면에 있는 Ile 잔기의 바로 3'쪽에 HindIII 제한 효소 엔도뉴클레아제 부위와 β쇄에 대한 시그널 서열의 개시의 5' 쪽에 XhoI 부위를 도입시켜 변형시켰다.
클래스 II MHC 해석 및 작제:
클래스 II MHC 분자를 연구하기 위해서, 잘 규명된 쥐 I-Ek 분자를 모델 항원으로서 선택하였다. 기타 선택될 수 있는 클래스 II 분자로는 쥐 I-A 분자와 인간 HLA-DR, DP 및 DQ 분자가 있다. 쥐 I-Ek는 모델 클래스 II 항원 나방 시토크롬 C(MCC)에 대해 알려진 제한 요소이다. 관련 TcR 및 클래스 II MHC/펩티드 복합체의 가용성 1가 변형체는 생성된 바 있다[Wettstein 등, J Exp Med 174:219-228(1991); Lin 등, Science 249:251(1990)]. 이 복합체에 대한 T 세포 반응은 잘 규명되어 있고[Jorgensen 등, Nature 355:224 (1992)], MCC/I-Ek 복합체에 대한 특이적 T 세포 클론의 친화도를 측정된 바 있다[Matsui Proc. Natl. Acad. Sci 91:12862-12866 (1994)]. MCC에 공유적으로 결합된, 유전자적으로 조작된 가용성 형태의 쥐 I-Ek 역시 MCC-특이적 T 세포를 자극하는 것으로 나타났다[Kozono, 상기 문헌 참조]. 따라서, 잘 특성규명된 MHC 시스템을 모델로 사용하여 2가 클래스 II MHC가 T 세포 반응성에 미치는 영향을 연구하였다.
가용성 2가 클래스 II MHC 분자를 발현시키기 위해서, I-Ek β 쇄를 암호하는 cDNA를 IgG 중쇄를 암호하는 cDNA에 유전자적으로 결합시켰다. I-Eα 쇄를 암호하는 cDNA는 카파 경쇄를 암호하는 cDNA에 결합시켰다. β쇄의 5'아미노 말단은 MCC(81-101)에서 유래한 I-Ek-제한 항원성 펩티드에 트롬빈 절단 부위를 통해 유전자적으로 미리 결합시켜 두었다(Kozono, 상기 문헌 참고). 부위 지정 돌연변이유발법을 이용하여 경막 도메인을 암호하는 영역 바로 앞에 있는 I-Ek β의 3' 영역내로 KpnI 제한 효소 엔도뉴클레아제 효소 부위를 도입시켰다. I-Eα 쇄를 암호하는 cDNA는 경막 도메인의 바로 앞에 HindIII 제한 효소 엔도뉴클레아제를 도입하여 변형시켰다. 유전자의 5' I-Eα 및 I-Eβ 영역은 추가의 변형이 필요하지 않았다.
일반적인 링커 영역 해석 및 작제:
또한 6개 아미노산 잔기로 된 링커를 TcR α 및 β와 I-E α 및 β 폴리펩티드의 말단부와 성숙 IgG 폴리펩티드의 개시부 사이의 접합 부위에 첨가하였다. Igγ1 폴리펩티드를 접합시키기 위해서, 링커는 Gly-Gly-Gly-Thr-Ser-Gly로 구성되어 있다. Igκ 폴리펩티드를 접합시키기 위해서, 링커는 Gly-Ser-Leu-Gly-Gly-Ser로 구성되어 있다. 상기 모든 돌연변이를 도입시키기 위해 사용한 올리고뉴클레오티드는 도 3에 도시되어 있다.
가용성 2가 T 세포 수용체 유사체를 생성하는데 사용한 발현 벡터는 바큐로바이러스 발현 벡터 pAcUW51(캘리포니아에 소재하는 파민겐)로부터 유도하였다. 이 벡터는 2개의 별도 바이러스 프로모터인 폴리헤드론 및 P10을 보유하고 있어, 동일한 세포에서 키메라 폴리펩티드 쇄를 모두 발현할 수 있다. 벡터내로 상이한 유전자의 클로닝을 용이하게 하기 위해서, 각 프로모터 뒤에 다중 클로닝 부위를 미리 도입시켰다[Kozono, 상기 문헌 참조].
실시예 2: 가용성 헤테로이량체 단백질의 검출
전술한 가용성 키메라 Ig 작제물을 암호하는 전달 벡터를 함유하는 바큘로바이러스로 감염시킨 세포는, 감염시킨 지 4∼5일 후에 특이적 ELISA 분석법으로 검출되는 가용성 키메라 Ig 유사 분자를 분비한다. 2C TcR/IgG의 경우, 분석은 쥐 IgG1 Fc에 특이적인 1차 항체(10 ㎍/㎖로 사용) 및 여러 TcR의 β쇄에 발현되는 구조적 에피토프에 특이적인 비오틴화된 2차 항체, H57(1:5000의 최종 희석액으로 사용)(도 5, 패널 A) 또는 2C TcR상에 발현되는 클론형 에피토프에 특이적인 비오틴화된 1B2나 모노클로널 항체(도 5, 패널 B)를 기준으로 하였다. I-E/IgG 키메라 분자를 검출하기 위해서, 동일한 1차 항체를 사용하였고 비오틴화된 2차 항체는 I-Eα 쇄에 특이적인 14.4.4이었다(도 5, 패널 C). 감염된 세포에서 유래한 상등액을 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 인산염 완충 염수로 충분히 세척하고, 비오틴화된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, HRP-접합된 스트렙타비딘(100 ㎕의 1:10000 희석액)(미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마사에서 입수 가능)과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, 세척하고, 3∼5분 동안 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 디히드로클로라이드(TMB) 기질을 사용하여 전개하였다. 2C TcR/Ig 및 I-E/Ig 전달 벡터를 함유하는 뱌큘로바이러스로 감염시킨 세포에서 유래한 상등액을 야생형 바큘로바이러스로 감염시킨 세포에서 얻은 대조 상등액과 비교하였다.
키메라 단백질은 도 5에 도시한 바와 같이 구조적으로 완전하다. 가용성 2가 2C TcR/Ig는, 도 5A 및 도 5B에 도시된 바와 같이 대부분의 TcR β쇄에서 발현된 구조적 에피토프에 특이적인 모노클로널 항체 H57와, 2C TcR에 특이적인 안티클론형 모노클로널 항체 결정자 1B2와 반응성이 있다. 가용성 2가 클래스 II 분자는, 도 5C에 도시된 바와 같이 완전한 I-E 분자에서만 발현되는 자연 α 쇄 결정자에 특이적인 구조적 의존성 모노클로널 항체, 14.4.4와 반응성이 있다. 또한 키메라 분자의 면역글로블린 부분은 구조적으로 완전하다. 이는 전술한 바와 같이 ELISA에 특이적인 면역글로블린과 반응성이 있으며, 키메라 분자를 정제하는 데 사용할 수 있다. 단백질 G 또는 아르세네이트-세파로스 친화 정제 칼럼 방법을 사용할 수도 있다(데이타는 도시되어 있지 않음).
정제된 물질의 분자량은, 도 6에 도시한 SDS-PAGE로 분석시 예상 분자량이었다. 키메라 TcRβ/Igκ의 겉보기 분자량(MW)은 55,000이고, 키메라 TcRα/Igγ1의 겉보기 분자량은 약 89,000이다. 키메라 I-Eα/Igκ의 분자량은 약 44,000이고 I-Eβ/Igγ1의 겉보기 분자량은 약 76,000이다(도 6).
실시예 3: 펩티드/MHC 복합체와 가용성 2가 TCR 상호작용의 친화도 측정.
경쟁 억제 분석을 수행하여 펩티드/MHC 복합체에 대한 가용성 2C TcR/Ig의 친화도를 측정하였다. 펩티드/MHC 복합체에 대한 가용성 1가 2C TCR의 친화도를 측정하는데 사용한 것과 유사하게[Schlueter 등, Journal of Molecular Biology 256:859-869 (1996)], 이 분석법은 TCR 수용체 결합과 중복되는 H-2 Ld의 a2 나선 영역에 대한 mAb 30.5.7 결합을 기초로한다[Solheim 등, Journal of Immunology 154:1188-1197 (1995); Solhiem 등, Journal of Immunology 150:800-811 (1993)]. 간단히 요약하면, RMA-S Ld 세포에 대한 30.5.7 Fab 단편의 친화도는 유동 세포계측법으로 분석한 세포에 결합한 30.5.7 Fab의 직접 포화 분석으로 측정하였다. 세포는 FITC 표지된 30.5.7 Fab의 양을 증가시키면서 항온처리하고, Kd'는 1/MCF 대 1/[30.5.7 Fab]를 플롯하여 추정하였다. 2C TCR 유사체의 친화도는 문헌[Method]에 개시된 바와 같이 RMA-S Ld 세포에 대해 FITC 표지된 30.5.7 Fab 단편의 양을 일정하게 하고 2C TCR 유사체를 경쟁시켜 측정하였다. Kapp는 (최대 30.5.7 Fab 결합(%))-1 대 [2C TCR 유사체]를 플롯하여 게산하였다. 등식 Kd.TCR=Kapp'(1+[30.5.7 Fab]'Kd.30.5.7)에 따라 RMA-S Ld 세포에 대한 30.5.7 Fab의 친화도를 보정하였다[Schlueter 등, 1996]. 표 2에 제시된 값은 3회 반복한 실험의 대표값이다. Kd의 측정시 사용한 각 데이터 값은 2회값의 평균이다. 따라서, 가용성 PCR 유사체의 친화도는 30.5.7 결합의 억제 측면에서 측정하였다.
가용성 2C TCR 유사체의 친화도를 측정하기 위해서, 먼저 펩티드 적재 H-2 Ld 분자에 대한 30.5.7 Fab 단편의 Kd를 측정해야 한다. 이 측정은, RMA-S Ld 세포의 표면상의 H-2 Ld 분자에 대한 30.5.7-FITC Fab 결합력의 직접 포화 분석으로 결정하였다. RMA-S 세포는, 이들 세포가 특이적 펩티드를 용이하게 적재할 수 있는 중공 MHC 분자를 발현하기 때문에 선택하였다[Catipovic 등, Journal of Experimental Medicine 176:1611-1618 (1992); Townsend 등 Nature 340:443-428 (1989)]. H-2 Ld 분자에 대한 30.5.7의 친화도는 H-2 Ld내에 적재된 펩티드에 따라 달라진다(표 2). QL9 적재된 H-2 Ld 분자에 대한 30.5.7의 친화도는 12.2 nM인 반면, p2Ca, pMCMV 및 SL9 적재 H-2 Ld 분자에 대한 친화도는 4.8 nM∼ 6.4 nM이다. 작고, 펩티드 의존성인 친화도의 차이는 재연가능하고, 친화도의 변화로 경쟁 결합 분석을 행할 수 있었다. 이들 값은 미리 측정한 동일한 펩티드/H-2 Ld 복합체에 대한 125I-30.5.7 Fab의 친화도(8.8 nM∼16 nM)와 일치한다[Schlueter 등, 1996].
2C TCR/Ig는 QL9 또는 p2Ca 펩티드를 적재한 H-2Ld 분자에 대한 30.5.7의 결합은 억제하였으나, pMCMV를 적재한 H-2 Ld 분자에 대한 30.5.7 Fab 결합을 억제하지는 않았다(도 7). QL9가 적재된 분자에 대한 가용성 2가 TCR/Ig의 친화도는 13.3 nM이다(도 7 및 표 2). 예상한 바와 같이, p2Ca 적재 분자에 대한 2C TCR/Ig의 친화도 90 nM는 QL9가 적재된 H-2 Ld에 대한 친화도보다 낮다. 약간의 경쟁 억제가 SL9 적재 세포에서 나타나지만, SL9 적재 분자에 대한 가용성 2가 2C TCR/Ig 키메라의 친화도는 너무 낮아서 시험 조건하에서는 정확하게 측정할 수 없다(데이타는 도시하지 않음).
분석한 모든 경우에, 가용성 2가 2C TCR/Ig의 친화도는 동종의 리간드에 대한 가용성 1가 2C TCR의 친화도보다 상당히 높았다(도 7 및 표 2). 가용성 2가 2C TCR/Ig의 친화도는 동일한 펩티드/MHC 복합체에 대한 가용성 1가 2C TCR의 친화도보다 QL9-적재 H-2 Ld의 경우 50 배 높고, p2Ca-적재 H-2 Ld 분자의 경우 20배 이상 높다(표 2). 따라서, 가용성 2C TCR/Ig 키메라의 2가 특성은 동종 리간드에 대한 TCR 유사체의 친화도를 상당히 증가시켰다. 본 발명의 키메라 분자가 1가 분자의 경우 관찰되는 것보다 특이적 리간드에 대해 증가된 친화력을 나타낸다는 것을 입증한 본 발견은 예상하지 못했던 것이다. 사실, Capon 등의 문헌에 개시된 키메라 CD4-IgG 분자는 개선된 표적 친화도를 나타내지 않았으며, 이는 본 발명의 조성물이 가치있고 신규한 것임을 입증하는 것이다.
[표 2]
펩티드 적재 RMA-SL d 세포에 대한 TCR 유사체의 친화도 측정값
실시예 4; 펩티드 적재 H-2 Ld 분자에 대한 가용성 2가 TCR 키메라의 결합 특이성
펩티드/MHC 복합체에 대한 가용성 2가 2C TCR/Ig의 상대적으로 높은 친화도를 근거로, 이들 분자가 직접 유동 세포계측법 분석에 의한 펩티드/MHC 복합체의 분석시 유용하다고 가정하였다. 2C TcR/Ig의 펩티드 특이성을 연구하기 위해서, 직접 유동 세포계측 분석시 H-2 Ld와 반응성이 있는 mAb, 30.5.7의 반응성과 2C TcR/Ig의 반응성을 비교하였다. 특이적 펩티드(참고 표 3의 서열)를 RMA-S Ld 세포상의 H-2 Ld 분자내로 적재하였다. 표 2에 열거된 펩티드는 가용성 2가 2C TCR/Ig의 반응성 분석시 사용한 H-2 Ld 및 H-2 Kd 결합 펩티드의 콜렉션이다. 세포 용해 및 친화도 데이타는 주 참고 문헌[Corr 등, 1994; Huang 등, 1996; Solheim 등, 1993; Sykulev 등, 1994a; Sykulev 등, 1994b; Tallquist 등, 1996; Udaka 등, 1996; Van Bleek 및 Nathanson, 1990]에 요약되어 있다.
[표 3]
본 연구에 사용한 펩티드: 2C CTL 분석시 보고된 효과 및 펩티드/MHC 복합체에 대한 2C TCR의 친화도
2C TCR/Ig와 RMA-S Ld의 온도 의존 반응성은 mAb 30.5.7과 RMA-S Ld의 반응성과는 상당히 달랐다. 예상한 바와 같이[Solheim 등(1995) 상기 문헌 참조; Solheim 등 (1993) 상기 문헌 참조], RMA-S Ld 세포는, 세포를 37℃에서 배양했을 때 보다 27℃에서 배양한 세포에서 mAb 30.5.7에 의해 인식되는 혈청학적으로 반응성이 있는 H-2Ld 분자를 더 발현하였다(도 8A); 평균 채널 형광(MCF)은 약 5배 증가하였다. 따라서, mAb 30.5.7에 의해 인식되는 H-2Ld 분자상의 에피토프는 저온에서 세포를 항온처리하므로써 안정화시킬 수 있다. 대조적으로, RMA-S Ld 세포는 27℃ 또는 37℃에서 배양한 세포의 2C TcR/Ig에 의해 인식되는 매우 소량의 H-2 Ld 분자를 발현시켰다(도 8, 패널 E). 이는 감소된 온도에서 구조적으로 안정화된 경우에도 비적재 MHC를 인식하지 않는 2C TcR/Ig의 예상 펩티드-의존 반응성과 일치하는 결과이다.
또한 2C TcR/Ig 반응성은 우수한 펩티드 특이성을 나타내었다. 예상한 바와 같이, 모든 H-2 Ld-결합 펩티드는 mAb 30.5.7에 의해 인식되는 에피토프의 발현을 안정화시켰다(도 8, 패널 B∼D 및 도 9). 2C 반응성 펩티드, 펩티드 p2Ca, QL9 및 SL9를 적재한 H-2 Ld 분자만이 2C TcR/Ig와 반응성이 있는 펩티드/H-2Ld 에피토프를 발현시켰다(도 8, 패널 F-H 및 도 9). MCF는, 무관한 H-2Ld 결합 펩티드를 적재한 세포 또는 비적재 세포의 경우 10에서 펩티드 QL9를 적재한 RMA-S Ld 세포의 경우 2200으로, 약 10∼200배 증가하였다(도 9). 반응성의 패턴은 펩티드/H-2 Ld 복합체의 경우 1가 2C TcR의 알려진 친화도와 유사하였다(참고, 표 3 친화도). 펩티드 QL9, p2Ca 또는 SL9를 적재한 RMA-S Ld 세포는, 2C TcR/Ig로 염색한 경우, 각각 2200, 550 및 100의 MCF 값을 가진다. 따라서, 가용성 2가 2C TcR/Ig 키메라는 QL9/H-2Ld 복합체와 강하게 반응하고, p2Ca/H-2Ld 복합체와 적당히 반응하고, SL9/H2 Ld 복합체와 약하게 반응하였다. 2C TcR/Ig가 SL9 적재 H-2 Ld 분자에 결합한다는 사실은, 직접 유동 세포계측법에서 가용성 2가 TcR/Ig 키메라를 사용하여 1가 2C TcR에 대해 71 mM 정도의 약한 친화력을 가지는 특이적 펩티드/MHC 복합체를 검출할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 5: 가용성 2가 2C TcR/Ig 분자에 의한 2C T 세포 매개 세포 용해의 시험관내 억제
가용성 2가 2C TcR/Ig는 2C 반응성 T 세포 응답을 차단한다. 가용성 2가 2C TcR/Ig는 유동 세포계측법에서 적절한 펩티드를 적재한 H-2Ld 분자와 높은 결합력으로 상호작용하기 때문에, 시약이 세포독성 CTL 분석에서 2C T 세포를 효과적으로 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이는 H-2Ld 를 발현하는 종양 표적 세포를 용해시키는 2C 형질전환 마우스에서 유래한 세포주를 사용하여 분석하였다. CTL은 일반적인 51Cr 세포독성 분석으로 4시간 시험하였다. 모든 CTL 분석의 경우 표적으로서, 형질감염되지 않은 세포 MC57G 및 Ld 형질감염세포 MC57G Ld 세포를 사용하였다. 특이적 용해율(%)은 하기와 같이 측정하였다: 51Cr cpm(실험치)-CPM(자발적)/cpm(최대)-cpm(자발적). 표준 오차는 대개 5% 미만이며, 자발적 방출율은 일반적으로 최대 방출율의 10∼15%이었다.
형질감염되지 않은 MC57G와 Ld 형질 감염된 MC57G Ld를 모두 사용하여, 2C CTL주에 의해 매개된 H-2 Ld 특이적 세포용해의 관찰 도구를 확립할 수 있었다. 2C TcR/Ig의 영향을 조사하기 위해서, 표적 세포를 2C TcR/Ig 또는 I-Eκ/Ig로 전처리하고 2C 형질전환 마우스에서 유래한 CTL 세포주에 의한 세포 용해물을 분석하였다. 세포를 2C TcR/Ig로 처리한 경우, 각 효과기에서 상당한 세포 용해 억제가 분석한 표적 세포에서 발견되었다(도 10 참고). 일부 비특이적 억제가 I-Ek/Ig 처리 표적 세포에서 발견되었지만, 2C TcR/Ig 처리 표적 세포에서 훨씬 더 많은 억제가 관찰되었다.
이 분석에서, 표적 세포는 각종 상이한 내인성 펩티드로 세포 표면 MHC 분자를 적재한 통상의 종양 세포이었다. 이들 표적 세포를 사용하여 p2Ca 펩티드를 H-2 Ld 분자에 특이적으로 적재할 필요는 없는데, 그 이유는 다수의 무관한 펩티드와 함께 p2Ca 또는 p2Ca-유사 펩티드가 세포 MHC 분자상에 내재적으로 적재되기 때문이다. CTL-매개 세포용해의 억제는, 가용성 2가 2C TcR/Ig가 주위의 다수 무관한 펩티드 중에서도 관련 펩티드와 효과적으로 상호작용할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 접근법을 사용하여 보편적인 펩티드/MHC 복합체를 조사함으로써 해당 특이적 T 세포 응답과 관련이 있는 복합체만을 동정할 수 있다. 특히, 이들 결합력이 큰 헤테로이량체 단백질의 가용성 유사체는 알려지지 않은 종양과 자가면역 항원을 동정하는데 특히 유용할 수 있다.
실시예 6: 자가 제한된 펩티드/MHC 복합체에 대한 가용성 2가 TCR 키메라의 결합
펩티드/H-2 Ld 리간드를 인식하는 것 외에도, 2C CTL에 의한 세포 용해를 위해 H-2 Kb 또는 H-2 Kbm3 표적을 감작시키는 2개의 펩티드 SIY와 dEV-8 역시 규명되었다(참고 표 3의 서열). 이들 교번 2C-반응성 복합체에 결합하는 2C TcR/Ig의 능력을 분석하기 위해서, 펩티드를 적재한 형질감염된 T2 세포에 대한 2C TcR/Ig의 결합을 연구하였다. T2 세포는 인간 세포주에서 유래한 것이기 때문에, T2 세포는 RMA-S 세포와 같이 자연적으로 H-2 Kb를 발현하지 않는다. 따라서, 펩티드 적재 H-2 Kb 또는 각종 H-2 Kbm 돌연변이 분자에 대한 2C TcR/Ig의 결합력을 연구하기 위해서 T2 시스템을 선택하였으며, 이는 T2 시스템이 어버이 세포주에서 유래한 MHC 분자의 발현에 의해 복잡하게 되지 않기 때문이다. RMA-S Ld 세포와 유사하게, T2 세포역시 상이한 펩티드를 쉽게 적재할 수 있는 중공 MHC 분자를 발현한다. 이 연구를 위해서, H-2 Kb, T2 Kb; H-2 Kbm3, T2 Kbm3; 및 H-2 Kbm11, T2 Kbm11로 형질감염시킨 펩티드 적재 T2 세포[Tallquist 등, Journal of Immunology 155:2419-2426(1995); Tallquist 등, Journal Experimental Medicine 184:1017-1026 (1996)]를 이용하였다.
펩티드 SIY 적재 T2 Kb 또는 T2 Kbm11 세포는 모두 2C TcR/Ig가 인식하는 에피토프를 발현하였다(도 11A, 11C). 2C TcR/Ig와 함께 항온처리한 세포의 MCF는, pVSV 적재 T2 Kb의 경우 14로부터 SIY 적재 T2 Kb의 경우 276으로, pVSV 적재 T2 Kbm11의 경우 16에서 SIY 적재 T2 Kbm11의 경우 250으로 약 20 배 증가하였다. SIY 적재 T2 Kbm3세포는 휠씬 약하기는 하지만 2C TcR/Ig와 여전히 상당한 상호작용을 나타내었다(도 11B); SIY-적재 T2 Kbm3 세포(고딕선; MCF, 36)와 PVSV-적재 Kbm3 세포(점선; MCF, 12) 비교. SIY/MHC 복합체에 대한 2C TcR/Ig 결합 데이터는 각종 SIY/MHC 표적상에서의 2C CTL 매개 세포용해와 일치하였다(도 12). 2C CTL은 SIY 적재 T2 Kb 및 T2 Kbm11 세포의 효과적인 세포용해를 매개하였다(도 12B, 데이터는 도시하지 않음, SIY/T2 Kb의 경우 LD50 ∼10 ng/㎖). SIY 적재 T2 Kbm3 세포의 2C CTL 매개 세포 용해는 휠씬 덜 효과적이었다(도 12C, LD50 ∼100 ng/㎖).
dEV-8 적재 세포에 대한 2C TcR/Ig의 결합은 dEV-8/MHC 복합체에 대한 2C TcR/Ig의 친화도와 2C CTL에 의해 세포용해를 매개하는 동일한 펩티드/MHC 복합체의 능력 사이의 현저한 차이를 나타내었다. 예상한 바와 같이, dEV-8 적재 T2 Kb 세포는 2C CTL에 의해 세포용해되지 않으며(도 12B), 또한 유동 세포계측법에서 2C TcR/Ig에 의해 인식되지 않았다(도 12A). dEV-8 적재 T2 Kbm3 세포에 대한 2C TcR/Ig의 유의적인 결합이 발견되지 않는다는 것은 흥미로운 일이다(도 12B). 2C TcR/Ig로 염색한 세포의 MCF는 세포의 dEV-8 또는 대조 H-2 Kb 결합 펩티드, pVSV 적재 여부와 관계없이 유사하다(도 12; 점선과 파선 비교). 이전에 보고된 것과 일치하게도[Tallquist 등 (1996), 상기 문헌 참조], dEV-8 적재 T2 Kbm3 세포가 2C TCR에 의해 효과적으로 세포 용해되었다는 것이 가장 놀랍다(도 12). 실제로, dEV-8 적재 T2 Kbm3 세포는 SIY 적재 T2 Kbm3 세포(LD50 ∼100ng/㎖) 보다 휠씬 더 우수한 표적 세포(LD50 ∼0.5-1.0 ng/㎖)였으며, 2C TcR/Ig의 유의적인 결합이 관찰되었다(도 12B). dEV-8 적재 T2 Kbm3 세포의 2C CTL에 의한 세포 용해 효율은, 2C TcR/Ig 결합 분석(도 8)에서도 효과적으로 인식되는 p2Ca 적재 T2 Ld 세포(도 12A, LD50, ∼0.5 ng/㎖)의 것과 동일한 정도였다. 정도가 훨씬 더 약하기는 하지만, 세포용해 및 2C TcR/Ig 결합 사이의 유사한 상관관계 부족이 dEV-8 적재 T2 Kbm11 세포의 경우 에도 관찰되었다. dEV-8 적재 T2 Kbm11 세포는 2C CTL에 대해 상대적으로 불량한 표적이지만(Tallquist 등 (1996) 상기 문헌 참조)(데이터는 도시되지 않음), 유동 세포계측 분석에서 2C TcR/Ig와 반응성이 없다(도 11C).
실시예 7: γ-IFN가 내인성 2C-특이적 펩티드/MHC 복합체의 발현에 미치는 영향 분석
펩티드/MHC 복합체에 대한 2C TcR/Ig의 특이성 및 친화도를 이용하여 림포킨이 내인성, 세포 표면, 펩티드/MHC 복합체에 미치는 영향을 검사할 수 있다. 상기 가능성을 분석한 후 이종 펩티드/MHC 환경내에 내인성 2C-반응성 펩티드/H-2 Ld 복합체를 발현시키기 위해서, γ-IFN가 H-2 Ld를 발현하는 쥐 세포주 RENCA에 미치는 영향을 연구하였다. RENCA 세포는 다양한 양의 γ-IFN하에 배양하여 자연 적재 펩티드/MHC 복합체의 조절을 증가시켰다. RENCA 세포에 대한 2C TcR/Ig 결합은 γ-IFN 유도의 함수로서 증가하였다(도 13A-D, 고딕선). γ-IFN의 영향은 용량 의존방식이며, 10 유니트/㎖의 γ-IFN으로 처리한 세포에서 최대 2∼3배 증가가 관찰되었다. γ-IFN이 클래스 I 발현에 직접적인 영향을 주는 것으로 알려져 있기 때문에(도 13E∼H)(Hengel 등, Journal of virology 68:289-297 (1994)), H-2 Ld 발현 증가에 부수적으로 나타나는 임의의 비특이적 2C TcR/Ig 결합을 표준화시킬 필요가 있다. 대조군의 무관한 H-2 Ld 결합 펩티드 pMCMV와 함께 RENCA 세포를 항온처리하여 이를 수행하였다. p2Ca는 H-2 Ld에 대해 친화력이 약한 것으로 알려져 있으므로(Sykulev 등, Immunity 1:15∼22 (1994a)), pMCMV와 같이 친화도가 높은 H-2 Ld 결합 펩티드와의 상호 교환은(Sykulev (1994a) 상기 문헌 참조) 매우 효과적이어야한다. 따라서, 2C TcR/Ig의 백그라운드 반응성은, 포화량의 대조 pMCMV 펩티드와 함께 세포를 항온처리하여 내인성 p2Ca 또는 p2Ca 유사 펩티드를 효율적으로 치환하여 측정할 수 있다. 모든 경우에, 2C TcR/Ig 결합은 대조 H-2 Ld 결합, pMCMV와 함께 세포를 미리 항온처리하여 차단할 수 있다(도 13A-D, 점선). 2C 특이적 펩티드 QL9와 함께 RENCA 세포를 미리 항온처리하면, 2C TcR/Ig 결합의 급격한 증가를 유도한다(데이타는 나타나지 않음). 이 실험 결과는 2C TcR/Ig를 내인성 2C 반응성 펩티드/MHC 복합체의 세포 표면 발현을 분석하기 위한 감응성 프로브로서 사용할 수 있다는 것을 보여준다.
γ-IFN이 2C TcR/Ig 반응성에 미치는 영향은 30.5.7 반응성에 미치는 영향과는 차이가 있었다. 분석된 모든 농도, 5∼50 유니트/㎖에서, γ-IFN은 mAb 30.5.7에 의해 인식되는 바와 같이 혈청학적으로 반응성이 있는 H-2 Ld에서 5∼6배의 증가를 유도하였다(도 13E∼H). 비자극 RENCA 세포의 MCF는 500이었지만, γ-IFN 자극 세포의 MCF는 2666 내지 3038이었다. γ-IFN의 최대 효과는 본 실험에서 사용한 최저량, 5U/㎖에서 관찰되었으며, 기타 실험에서는 1 유니트/㎖정도의 낮은 γ-IFN의 사용량에서 관찰되었다(데이타는 도시되지 않음). 2C TcR/Ig 반응성에 대한 γ-IFN의 용량 반응 곡선이 이동한다는 것은 흥미로운 일이다. 5 U/㎖의 용량에서, γ-IFN은 상대적으로 작긴 하지만 2C TcR/Ig 반응성에 유의적인 영향을 미쳤다. 2C TcR/Ig에 대한 γ-IFN의 최대 효과를 얻기 위해서는 10 유니트/㎖의 γ-IFN 처리를 필요로하며, 이는 30.5.7 반응성에 미치는 γ-IFN의 최대 효과를 위해 필요한 것 보다 약 10배 큰 것이다. 이들 결과는, γ-IFN이 특이적 펩티드 항원/MHC 복합체 발현에 미치는 영향과 γ-IFN이 MHC 중쇄 발현에 미치는 영향은 차이가 있다는 것을 나타낸다.
이들 결과는 이 접근법이 헤테로이량체 단백질의 가용성 2가 형태를 생성하는 데 일반적인 것임을 보여준다. 본 발명의 헤테로이량체 단백질의 가용성 2가 유사체는 표적에 대한 높은 결합력을 보유하는 것을 특징으로 한다.
가용성 2가 헤테로이량체 단백질을 생성하는 데 단일 쥐 클래스 II MHC 및 α/β TcR에 대해 수행한 것과 동일한 기술, 동일한 방법을 사용하여, 기타 포유동물 시스템을 개발할 수 있다. 여기에는 설치류와 인간 클래스 II HLA 분자와 α/β 및 γ/δ T 세포 수용체를 모두 포함된다.
본 발명은 본 발명의 취지 또는 본질적 특성을 벗어나지 않고 구체적으로 전술한 것 이외의 형태로 실시될 수 있다. 따라서 전술한 특정 양태들은 예시적인 것이며 제한하기 위한 것이 아니다. 모든 참고문헌과 특허 출원은, 각 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 참고로 인용된 것과 동일한 정도로 참고로 인용하였다.
참고문헌
다음 참고문헌은 본 명세서에서 참고 인용한다.
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Claims (35)

  1. 제1 융합 단백질을 암호하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로서,
    상기 제1 융합 단백질은 (a) 가변부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 및 (b) 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 것인 발현 벡터.
  2. 제l항에 있어서, 제2 융합 단백질을 암호하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터로서 ,
    상기 제2 융합 단백질은 (c) 면역글로불린 경쇄 및 (d) 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 것인 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질이 상기 면역글로불린 중쇄 및 상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 사이에 제1 펩티드 링커를 추가로 포함하는 것인 발현 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질이 상기 면역글로불린 중쇄 및 상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 사이에 제1 펩티드 링커를 포함하고, 상기 제2 융합 단백질이 상기 면역글로불린 경쇄 및 상기 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 사이에 제2 펩티드 링커를 포함하는 것인 발현 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  6. 적어도 4개의 융합 단백질을 포함하는 분자 복합체로서,
    (a) 2개의 제1 유합 단백질은 (i) 가변부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 및 (ii) 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 것이고,
    (b) 2개의 제2 융합 단백질은 ( 1 ) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하는 것이며,
    여기에서
    상기 융합 단백질들은 회합하여 분자 복합체를 형성하고,
    상기 분자 복합체는 2개의 리간드 결합 부위를 포함하며,
    상기 각각의 리간드 결합 부위는 상기 제1 및 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의하여 형성된 것이고,
    상기 분자 복합체의 동종 리간드(cognate ligand)에 대한 친화력은 상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 상기 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성된 분자 복합체에 비하여 증가된 것인 분자 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 경막 폴리펩티드는 MHC 클래스 II β쇄이고, 상기제2 경막 폴리펩티드는 MHC 클래스 Ilα쇄인 것인 분자 복합체.
  8. 제6항에 있어서, 상기 제1 경막 폴리펩티드는 T 세포 수용체(TCR) α쇄이고, 상기 제2 경막 폴리펩티드는 TCS β 쇄인 것인 분자 복합체.
  9. 제6항에 있어서, 상기 제1 경막 폴리펩티드는 T 세포 수용체(TCR) γ쇄이고, 상기 제2 경막 폴리펩티드는 TCR δ 쇄인 것인 분자 복합체.
  10. 제6항에 있어서, 상기 면역글로불린 중쇄가 IgGl 중쇄인 것인 분자 복합체.
  11. 제6항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄가 Igk쇄인 것인 분자 복합체.
  12. 제6항에 있어서, 상기 제1 융합 단백질은 상기 면역 글로불린 중쇄 및 상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 사이에 제1 펩티드 링커를 포함하고, 상기 제2 융합 단백질은 상기 면역글로불린 경쇄 및 상기 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 사이에 제2 펩티드 링커를 포함하는 것인 분자 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 펩티드 링커가 GLY-CLY-GLY-THR-SER-GLY(서열 번호 10)인 것인 분자 복합체.
  14. 제항에 있어서, 상기 제2 펩티드 링커가 GLY-SER-LEU-GLY-GLY-SER(서열 번호 11)인 것인 분자 복합체.
  15. 제6항에 있어서, 항원성 펩티드가 상기 리간드 결합 부위에 결합되는 것인 분자 복합체.
  16. 제6항에 있어서, 독소에 접합시킨 것인 분자 복합체.
  17. 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 제1 융합 단백질은 (i) 가변부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 및 (ii)헤테로 이량체 단백질의 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하며, 이 때,상기 면역글로불린 중쇄는 상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인에 대한 C-말단이고,
    상기 제2 융합 단백질은 (j) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) 상기 헤테로 이량 체 단백질의 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인을 포함하며, 이 때, 상기 면역글로불린 경쇄는 상기 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 부분에 대한 C-말단이며,
    여기에서,
    상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 상기 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인이 동종 리간드(cognate ligaild)에 대한 리간드 결합 부위를 형성하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  18. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 분자 복합체의 제1 및 제2 융합 단백질을 암호하는 1종 이상의 발현 벡터를 제조하는 방법으로서,
    상기 분자 복합체의 제1 및 제2 융합 단백질을 생성하도록, 제1 및 제2 경막폴리펩티드의 세포외 도메인을 암호하는 DNA 서열을 삽입시켜 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 위한 발현 벡터를 변형시키는 단계를 포함하는 것인 발현 벡터의 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 및 제2 융합 단백질이 별도의 발현 벡터에서 암호되는 것인 방법.
  20. 2개의 벡터를 포함하는 숙주 세포로서,
    상기 2개의 벡터 중 하나는 제6항의 분자 복합체의 제1 융합 단백질을 암호하는 DNA서열을 포함하는 것이고,
    상기 2개의 벡터 중 다른 하나는 제6항의 분자 복합체의 제2 융합 단백질을
    암호하는 DNA서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
  21. 면역 반응의 선택적 억제 또는 감소용 약학 조성물로서,
    약학적 허용 담체 내에 제6항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 기재된 분자 복합체를 포함하는 것인 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 면역 반응이 외래 이식 항원에 대해 유도되는 것인 약학 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 면역 반응이 자가면역 질병을 초래하는 것인 약학 조 성물.
  24. 인간이 아닌 동물에 있어서 항원 특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법으로 서,
    제15항에 기재된 분자 복합체를 기재에 고정시키는 단계, 및 그 고정된 분자 복합체를 T 세포군에 노출시켜 항원 특이적 T 세포 반응을 자극하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 방법이 특정 T 세포 서브세트를 동정 및 정제하는 데 사용되는 것인 방법.
  26. 미지의 펩티드/MHC 복합체를 검출하는 방법으로서,
    제8항 또는 제 9항에 기재된 분자 복합체를 기재상에 고정시키는 단계, 및 그 고정된 분자 복합체를 펩티드/MHC 복합체 군에 노출시켜 특정 펩티드/MHC 복합체가 상기 분자 복합체의 TCR부분에 결합되도록 하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 펩티드/MHC 복합체의 펩티드가 종양 또는 바이러스 항원인 것인 방법.
  28. 시험관 내에서 항원 특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법으로서,
    제15항에 기재된 분자 복합체를 기재에 고정시키는 단계, 및 그 고정된 분자 복합체를 T 세포군에 노출시켜 항원 특이적 T 세포 반응을 자극하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 방법이 특정 T 세포 서브세트를 동정 및 정제하는 데 사용되는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 분자 복합체를 고체 지지체에 고정시키는 것인 방법.
  31. 제4항에 있어서, 상기 제1 및 제2 융합 단백질이 회합하여 이량체를 형성하는 것인 발현 벡터.
  32. 제1 융합 단백질을 암호하는 DNA서열을 포함하는 발현 벡터로서,
    상기 제1 융합 단백질은 (a) 가변부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 및 (b) 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성되는 것인 발현 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 제2 융합 단백질을 암호하는 DNA 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터로서 ,
    상기 제2 융합 단백질은 (c) 면역글로불린 경쇄 및 (d) 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성되는 것인 발현 벡터.
  34. 적어도 4개의 융합 단백질을 포함하는 분자 복합체로서,
    (a) 2개의 제1 융합 단백질은 (i) 가변부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 및(ii) 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성되는 것이고,
    (b) 2개의 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성되는 것이며,
    여기에서 ,
    상기 융합 단백질들은 회합하여 분자 복합체를 형성하고,
    상기 분자 복합체는 2개의 리간드 결합 부위를 포함하며,
    상기 각각의 리간드 결합 부위는 상기 제1 및 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인에 의하여 형성된 것이고,
    상기 분자 복합체의 동종 리간드(cognate ligand)에 대한 친화력은 상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 상기 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성된 분자 복합체에 비하여 증가된 것인 분자 복합체.
  35. 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 제1 융합 단백질은 (i) 가변부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 및 (ii) 헤테로 이량체 단백질의 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성되며, 이 때, 상기 면역글로불린 중쇄는 상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인에대한 C-말단이고,
    상기 제2 융합 단백질은 (i) 면역글로불린 경쇄 및 (ii) 상기 헤테로 이량체 단백질의 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인으로 구성되며, 이 때, 상기 면역글로불린 경쇄는 상기 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 부분에 대한 C-말단이며,
    여기에서,
    상기 제1 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 상기 제2 경막 폴리펩티드의 세포외 도메인이 동종 리간드(cognate ligand)에 대한 리간드 결합 부위를 형성하는 것인 폴리뉴클레오티드.
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