KR20010031205A - 가용성 주요 조직적합 복합체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주요 조직적합 복합체(MHC) 분자의 신규 복합체 및 이러한 복합체의 용도에 관한 것이다. 일면에 있어서, 본 발명은 클래스 II β2 쇄 변형, 예컨대 본질적으로 전체 클래스 II β2 쇄의 결실을 포함하는 단일쇄 MHC 클래스 II 복합체에 관한 것이다. 다른 일면에 있어서, 본 발명은 면역글로빈 불변 영역 또는 단편을 포함하는 단일쇄 MHC 클래스 II 복합체에 특징이 있다. 추가로 제공되는 것은 하나 이상의 단일쇄 MHC 클래스 II 분자를 포함하는 다특이성 MHC 복합체이다. 본 발명의 MHC 복합체는 1) T 세포 수옹체 길항질 및 부분적 아고니스트인 펩티드를 포함하는 선택된 T-세포의 활성을 조정하는 펩티드의 동정 및 단리를 위한 시험관내 스크리닝 및 2) 포유류에서 면역 응답을 감소 또는 유발하기 위한 방법을 제공한다.

Description

가용성 주요 조직적합 복합체 및 그의 사용 방법{Soluble MHC Complexes and Methods of Use Thereof}

항원-특이성-T-세포 응답은 항원성 펩티드에 의해서 유발된다. 펩티드들은 일반적으로 외래 항원을 확인하여 이것에 반응하기 위한 면역체계의 일부로서 MHC의 결합 그루브(groove)에 결합된다. 결합 항원 펩티드는 T-세포 수용체와 상호 작용하여 면역 반응을 조정한다. 항원성 펩티드들은 비공유적 수단에 의해 다형성 아미노산 잔기로 구성된 특정 "결합 포켓(binding pockets)"에 결합된다.

천연 발생 MHC 클래스 II 분자들은 α 및 β 쇄로 이루어진 헤테로이합체성성(heterodimeric) 당단백질이다. 이들 분자의 α1 및 β1 도메인은 서로 겹쳐져서 펩티드 결합 그루브를 형성한다. 항원성 펩티드들은 펩티드 상의 앵커 아미노산 α1 및 β1 도메인 사이의 상호작용을 통하여 MHC 분자와 결합한다. 인플루엔자 바이러스 펩티드에 결합되는 인간 클래스 II HLA-DRA1 복합체에 대한 결정학적 분석 결과에 의하면 결합 펩티드(bound peptide)의 N- 및 C-말단이 결합 그루브의 내부로부터 신장되어 펩티드의 C-말단이 β 쇄의 N-말단에 근접되어 있는 것으로 나타났다[참조: J. Brown et al., Nature, 364:33 (1993); L. Stern et al., Nature, 368:215(1994)]. MHC 클래스 I 및 II 분자는 상이한 도메인 체계를 가지고 있다[참조: A. Rudensky et al., Nature, 353:622 (1991). 또한, MHC 분자의 논의에 대한 미국 특허 제 5,284,935; 제 5,260,422; 제 5,194,425; 제 5,130,297; WO 92/18150; WO 93/10220 및 WO 96/04314를 참조하기 바란다.

특히 제이. 브라운 등(상기함)은 MHC 클래스 II β2 쇄가 MHC 클래스 II 복합체의 적합한 겹칩에 결정적인 역할을 하는 것으로 보고하였다.

α 및 β 쇄 막내외(transmembrane) 도메인은 MHC 분자의 어셈블리 및(또는) 세포내 수송에 중요한 역할을 한다. 예를 들면, TM 도메인의 아미노산 변화는 결손형 MHC 분자를 초래한다. MHC α 및 β 쇄 막내외 및 세포질 도메인이 개시되었다 [참조: P. Cosson et al., Science, 258:659(1992); W. Wade et al., Immunology, 32:433(1995); H. Kozono et al., Nature, 369:151 (1994) and J. Brown et al., (상기함)].

항원성 펩티드와 복합체를 이룬 MHC 분자는 몇가지 다른 기작에 의해 선택적 면역억제를 유발할 수 있다[참조: 예를 들면, J. Guery et al., Critical Reviews in Immunology, 13(3/4):195(1993)].

더욱 구체적으로, 항원 제시 세포(APCs)의 표면 상의 펩티드-MHC 복합체는 항원 제시 세포가 또한 동시-자극성 신호(co-stimulatory signals)를 전달할 경우, MHC 결합 펩티드에 대해 특이적인 T-세포주의 클론 팽창만(clonal expansion)을 유도할 것이라고 보고되었다. 한가지 제안된 접근법은 T-세포 활성화에 이러한 요건을 이용하는 것이며, 동시 조절 신호의 부재하에 MHC 분자에 결합되는 항원성 펩티드와의 상호작용에 의해 T-세포 발달의 억제를 보고하고 있다[참조: M. Nicolle et al., J. Clin. Invest., 93:1361-1369 (1994); and S. Sharma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:11465-11469 (1991)].

또다른 제안된 접근법은 T-세포 발달을 결합 펩티드(bound peptide)를 포함하는 MHC 분자로 억제하는 것을 포함한다. 결합 펩티드는 T-세포 수용체(TCR)에 대한 길항질 이거나 부분적인 아고니스트일 수 있다[참조: B. Evavold et al., Immunology Today, 14(12):602-609 (1993)].

TCR-결합 항원성 펩티드의 변형이 특정 T-세포 응답에 관여하는 잔기를 검사하기 위하여 시도되었다. 항원성 펩티드의 그러한 "활성화" 아미노산의 결정은 잠재적으로 TCR 아고니스트 또는 길항질로 작용할 수 있는 그러한 아미노산 서열에 대한 고찰을 제공할 수 있다[참조: Evavold, B. et al., 상기함].

또한 새로운 백신은 MHC 분자에 결합된 다양한 항원 펩티드의 성질의 결정에 기초하여 개발될 수도 있다는 것이 고려되었다[참조: R. Chicz et al., Immunolgy Today, 15(4):155-160(1994)].

이전의 연구에 의해 MHC 클래스 II 헤테로이합체성성 분자가 외인성 펩티드에 결합될 수 있음이 밝혀졌다. 그러나, MHC 클래스 II 쇄는 간혹 해리한다. 분산된 상태에서, 이 MHC II 쇄들은 존재하는 펩티드에 결합하기에 적합하지 않다[참조: Stern, L. J. and D. C. Wiley, Cell 68:465(1992); Scheirle, A. B. et al., J. Immunol. 149: 1994 (1992); Kozano H. et al., Nature 369:151 (1994)].

완전히 가용성이고 기능적인 MHC 복합체를 얻으려는 몇번의 시도가 있었다. 예를 들면, 한 접근 방법에 있어서, MHC 복합체들을 단백질 가수분해 효소, 염류 및(또는) 세제 등의 강한 시약에 노출시키는 것을 포함하는 생화학적 기술들을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 이들 시약들은 간혹 투석 또는 결합 반응에 의해 제거해줘야 한다[참조: 예컨대, J. M. Turner et al., J. Biol. Chem. 252:7555 (1977); T. A. Springer et al. PNAS (USA) 73:2481 (1976)].

그러나, 이들 방법들은 간혹 완전히 가용성이고 기능적인 MHC 복합체를 의미있는 양으로 단리하기에 최적은 아니다.

T-세포의 활성화를 조정할 수 있는 아주 유용한 MHC 클래스 II 및 클래스 II 복합체 및 그의 제조 방법이 1995년 7월 31일자 출원된 WO 96/04314에 기재되었다. 이 MHC 복합체는 특정 펩티드 리간드에 전반적으로 결합되는 것으로 개시되어 있다.

〈발명의 요약〉

본 발명은 완전히 가용성이고 기능성인, 예를 들면 빈(empty) 단일쇄 MHC 클래스 II 복합체, 부하된(loaded) 단일쇄 MHC 클래스 II 복합체, 단일쇄 MHC 클래스 II 펩티드 융합 복합체, 다특이성 단일쇄 MHC 클래스 II 복합체(빈, 부하된 또는 융합 펩티드를 포함하는) 신규의 MHC 클래스 I 및 II 복합체 및 이러한 복합체들의 용도에 관한 것이다.

전반적으로 설명하자면, 본 발명자들은 MHC 복합체의 가용성 발현은 면역 글로빈 경쇄 불변 영역을 MHC 복합체에 융합시킴으로써 촉진됨을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, MHC 복합체의 가용성 발현이 전체 클래스 II β-쇄의 결실을 포함하는 MHC 클래스 II 복합체의 클래스 II β-쇄를 변형시킴으로써 촉진될 수 있음을 발견하였다.

본 발명자들은 이전에 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 1996년 1월 31일자 출원된 공개된 PCT 출원 제 WO 97/28191호에서 고도로 유용한 단일쇄("sc-") MHC 클래스 I 및 클래스 II 복합체를 개시하였으며, 그 내용을 전부 본 명세서에 참고문헌으로 인용한다. 이 개시된 sc-MHC 클래스 I 및 II 복합체는 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드(presenting pepetide, 제시 펩티드라고도 함)(sc-MHC 펩티드 융합 분자), 빈-sc-MHC 분자(재조합에 의해 융합된 제공 펩티드가 없음), 및 부하된 sc-MHC 복합체(비-공유적으로 부착된 제공 펩티드를 포함함)을 갖는 MHC 분자를 포함한다.

본 발명자들은 면역글로빈 경쇄 불변 영역(즉, Ig-C_L)을 융합시키고 및(또는) 클래스 II sc-MHC 분자에서 β2 쇄를 변형시킴으로써 이전에 개시된 sc-MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자의 가용성 발현을 촉진시키는 것이 가능함을 밝혀내었다. Ig-C_L융합은 Ig-C_L쇄 또는 그의 적합한 단편을 sc-MHC 클래스 I 또는 클래스 II 복합체에 부가하는 것을 포함한다. 클래스 II β2 쇄 변형은 전체 클래스 II β2쇄의 결실을 포함한 아미노산의 결실, 치환 또는 클래스 II β2 쇄에 대한 부가를 포함한다. Ig-C_L융합 및 클래스 II β2 쇄 변형은 sc-MHC 분자의 가용성 발현을 증대시키며 sc-MHC 분자의 특이적 결합 활성에 중요한 영향을 미치지 않는다.

본 발명은 추가로 신규 다특이성 MHC 복합체를 제공한다. 이 복합체는 전반적으로 하나 이상의 sc-MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자, 하나 이상의 리간드 연결 분자(joining molecule), 하나 이상의 연결 분자 및 하나 이상의 임의의 효과기 분자(effector molecule)들을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바의 용어 "리간드 연결 분자"는 면역글로빈, 면역글로빈-유도 단일쇄 분자 및 수용체 리간드를 포함한다. 이 sc-MHC 및 복합체의 리간드 연결 분자 부분을 선택하여 목적하는 표적 구조에 결합시켜 하나의 MHC 복합체에서 잠재적으로 다중 결합 특이성을 제공한다. 완전히 기능성인 다특이적 MHC 복합체의 가용성 발현은 필요에 따라 후술하는 바의 Ig-C_L융합 및(또는) 클래스 II β2 쇄 변형에 의해 다양한 세포 형태에서 촉진될 수 있다.

용어 "본 발명의 MHC 복합체" 또는 이에 관련된 용어는 본 명세서에서 개시된 sc-MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자 및 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 개시된 것을 포함하며, 여기서 sc-MHC 분자는 변형된 클래스 II β2 쇄 및(또는) 융합된 Ig-C_L쇄 또는 여기에서 제공되는 바의 적당한 Ig-C_L쇄 단편을 포함한다. 이 용어는 또한 변형된 클래스 II β2 쇄 및(또는) 융합된 Ig-C_L쇄 또는 Ig-C_L쇄 단편을 포함하거나 포함하지 않고 제공되는 다특이성 MHC 복합체를 포괄한다.

본 발명의 MHC 복합체는 시험관내 및 생체내에서 수많은 용도를 가지고 있다.

예를 들면, 본 발명의 MHC 복합체는 펩티드 등의 다양한 리간드를 검출하고 분석하는데 사용될 수 있다. 특이 MHC 클래스 II 복합체들은 또한 병원성 특성을 가진 T-세포의 검출 등과 같은 진단 목적에 제공되는 것으로 사용될 수 있다. MHC 복합체는 추가로 X-선 결정학, 핵자기공명 영상화, 컴퓨터 그래픽 디스플레이 등의 컴퓨터 관련 기술들을 포함하는 기능적인, 세포성 및 분자 분석 및 구조 분석에 이용될 수 있다. 중요하게는, MHC 복합체의 단일쇄 형식 및 증대된 가용성 발현은 데이터 수집 및 분석의 몇가지 관점을 단순화시킬 것으로 기대된다. MHC 복합체는 또한 스크리닝에 사용되어 TCR 및(또는) MHC 아고니스트 및 길항제, 특히 천연 발생 TCRs 및 MHC 복합체 사이의 상호작용을 억제하는 작은 분자를 동정하고 단리하는데에 사용될 수 있다. 추가로, 다양한 공지의 기술들이 본 발명의 MHC 복합체 및 TCR 또는 MHC 복합체-특이성 항체 사이의 상호작용을 잠재적으로 차단하는 작은 분자의 스크리닝에 사용될 수 있다.

본 발명의 MHC 복합체는 생체내에서 중요한 용도를 가지고 있다. 예를 들면, 이 복합체는 면역-관련 질환 또는 질병에 수반된 것과 같은 병원성 항원 제시 세포(APCs)와 경쟁시키는데; 또는 포유류, 예컨대 사람을 APCs의 표면에서 발생하고 병원성이거나 또는 달리 해로운 기능을 수행하거나 다른 분자들이 수행하는 것을 돕는 세포외 영역 등의 MHC 구조에 대하여 면역화시키는 데에 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 MHC 클래스 II 복합체는 후술하는 바와 같은 공지의 면역학적인 방법에 따라 항체를 기르는데 사용될 수 있다. 치료 전략에 사용될 수 있는 방법에 의해 생성된 항체는 예컨대 목적 항원을 인식하는 특정 APCs의 수를 억제하거나 감소시킴으로써 생체내에서 면역 응답을 조정하도록 설계된다. 특히, MHC 에피토프와 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 선별하여 면역 질환 또는 질병 또는 기타 병리에 수반되는 제한된 APC 서브세트 또는 집단을 표적화하여 바람직하게 제거할 수 있다. 더욱 상세히 설명하겠지만, APCs 또는 항체 결합 APCs는 비변형시킬 수 있거나 또는 필요에 따라 약물, 독소, 방사선핵종 또는 효소 등의 기타 동인에 공유적으로 연결시킬 수 있다.

추가로, 본 발명의 MHC 복합체는 시험관 내에서 목적하는 표적 구조를 발현하는 T-세포 등의 면역 세포들을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이것은 몇가지 환경하에서 세포 수용체 당단백질, 지질단백질, 지질, 당지질 및 탄수화물 등의 표적 구조를 발현하는 선택된 T-세포를 얻어 팽창시키는데 유용하였다. 중요하게도, 본 발명의 단일 다특이성 MHC 복합체는 다중 표적 구조를 발현하는 세포를 선별하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바의 용어 "제공 펩티드(presenting peptide)"는 T-세포 수용체의 활성을 조정하여 T-세포 증식을 유발하거나 또는 T-세포를 배양하여 이를 증식시키고, T-세포를 본 발명의 MHC 복합체(융합되거나 또는 비-공유적으로 결합된 펩티드를 가짐)와 접촉시킨 후 복합체가 T-세포의 추가의 발달을 억제하는지를 평가하는 순차적인 단계들을 포함하는 분석을 포함하는 후술하는 분석들에 의해 결정되는 바의 T-세포 발달을 억제하거나 불활성화시킬 수 있는 펩티드를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바의 용어, "빈(empty)"은 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 제공 펩티드가 결핍된 본 발명의 MHC 복합체를 의미한다. 예시적인 빈 MHC 복합체는 폴리펩티드의 복합체 보다는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성된 빈 클래스 II MHC 복합체를 포함한다. 빈 MHC 복합체의 다른 예로는 융합 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 sc-MHC 클래스 II 분자를 포함하는 빈 다특이성 클래스 II MHC 복합체가 있다. 빈 MHC 복합체는 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드 결합 그루브 또는 클레프트(cleft)를 포함한다.

본 발명에서 사용된 바의 용어, "부하된(loaded)"은 MHC 복합체의 펩티드 결합 그루브 또는 클레프트에 비공유적으로 결합된 제공 펩티드를 포함하는 본 발명의 빈 MHC 복합체를 의미한다. 비공유적 결합은 제공 펩티드 및 빈 MHC 복합체의 펩티드 결합 그루브 또는 클레프트 사이의 안정된 수소 결합을 경유한다. 비공유 결합은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 부하된 MHC 복합체의 예로는 폴리펩티드의 복합체 보다는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성된 부하된 sc-MHC 클래스 II 복합체가 있다.

본 발명의 MHC 복합체는 중요한 이점을 제공한다. 예를 들면, 상기한 바와 같이, 제공된 변형된 클래스 II β2 쇄 및(또는) Ig-C_L쇄는 복합체의 가용성 발현을 촉진한다. 따라서 MHC 복합체의 생산 및 용도는 긍정적으로 영향을 미친다. 또한, 목적하는 제공 펩티드(부하된, 또는 공유적으로 연결된)를 포함하는 MHC 복합체에 관련하여, 종래의 관례들은 항원 제시 세포로부터 부하된 MHC 분자의 정제를 필요로 하였다. 그러한 부하된 펩티드들은 일반적으로 단단히 결합되고 목적하는 펩티드와 효율적으로 교환될 수 없다. 반대로, MHC 복합체들은 발현 세포로부터 유의성있는 양으로 용이하게 단리될 수 있는 단일 항원성 펩티드를 포함할 수 있다. T-세포 수용체와의 상호작용의 분석은 그러한 MHC 복합체의 사용에 의해 촉진될 것이다. 추가로, 다양한 펩티드가 펩티드 중의 단지 소수의 아미노산(약 4 내지 6)이 특정 MHC 분자에 결합하는데 중요한 역할을 한다는 사실에 비추어 T-세포와 상호작용에 제시될 수 있다. 즉, 상이한 펩티드의 라이브러리를 T-세포의 제시를 위해 MHC 분자에 연결시킬 수 있다.

본 발명의 MHC 복합체는 추가의 이점을 갖는다. 예를 들면, 다특이성 MHC 복합체는 하나 이상의 표적 구조에 특이적으로 결합하여 단일 복합체를 갖는 다중 표적 구조를 발현하는 세포를 검출할 수 있는 수단을 제공할 수 있다. 다특이성 MHC 복합체는 다중 결합 부위를 포함할 수 있기 때문에, 결합강도가 증대될 수 있다. 더욱이, 적당한 크기의 많은 다특이성 MHC 복합체(예컨대 약 50-70 kDa 이하의 것)는 세포를 영상화하고 목적하는 소량의 분자를 약물, 독소, 방사선핵종 등의 세포에 전달하는 다양한 응용에 대하여 전체 항체 보다 더 잠재적으로 유용할 수 있도록 한다.

본 발명의 다특이성 MHC 복합체는 추가의 용도 및 이점을 가진다. 예를 들면, 본 발명에 따라 시험관 내에서 다특이성 MHC 복합체의 단일쇄 부분을 조절된 온도, 농도, 완충액 조건 등의 조건하에서 합하는 것이 가능하다. 특히, 다중쇄 다특이성 MHC 복합체의 단일 쇄를 합하여 신규의 호모- 또는 헤테로이합체성 다특이성 MHC 복합체를 생성할 수 있다. 생성된 복합체는 필요에 따라 이하 구체적으로 설명하는 하나의 기술 또는 조합에 의해 정제할 수 있다. 별법으로, 다특이성 MHC 복합체의 단일 쇄는 반응기 자체, 예컨대 배양된 세포에서 합하여 후술하는 바와 같이 그러한 세포들로부터 정제할 수 있다.

본 발명의 MHC 복합체는 추가의 이점을 제공한다. 예를 들면, 빈 클래스 I 또는 클래스 II MHC 복합체들을 스크리닝에 사용하여 천연 발생 TCR에 의해 인식되는 펩티드들을 동정할 수 있다. MHC 복합체의 추가의 이점은 면역 응답을 억압하기 위한 방법(예, 자가면역 질환 또는 앨러지 등의 면역질환을 가진 개체의 치료), 및 예를 들면 포유류가 면역화해되거나 될 것 같은 경우, 예를 들면 면역계가 바이러스 감염(예, AIDS에서 처럼) 또는 화학요법(예, 암을 치료하는 방사선 요법에 있어서 처럼)에 의해 억압되는 경우, 목적하는 면역 응답을 유도하는 방법 및 HLA 타이핑(typing) 및 생체내 진단 영상화 등의 진단 방법에 있어서 용도를 포함한다. MHC 펩티드 융합 복합체를 코딩하는 DNA 구조물의 직접적인 투여도 또한 고려된다.

본 발명의 빈 MHC 분자는 추가의 이점을 제공한다. 예를 들면, 빈 sc-MHC 또는 다특이성 클래스 II 분자는 다양한 적합한 제시 항원과 용이하게 합하여 부하된 MHC 분자를 형성시킬 수 있다. 본 발명의 빈 MHC 분자를 편리하게 부하하는 능력은 많은 제공 펩티드의 스크리닝을 가능케하여 각각의 제공 펩티드가 T-세포 수용체 활성을 조정하는 능력을 평가할 수 있다.

본 발명의 다특이성 MHC 복합체는 일반적으로 하나 이상의 sc-MHC 클래스 I 또는 II 분자(동일하거나 또는 상이한) 내지 2 내지 5 개 까지의 그러한 분자를 포함한다. 본 발명에 따르면, sc-MHC 분자는 변형된 β2 클래스 II 및(또는) 융합된 Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편을 포함하여 복합체의 가용성 발현을 촉진할 수 있다. 예시적인 다특이성 MHC 복합체는 간혹 변형된 β2 클래스 II쇄를 포함하는 하나의 sc-MHC 클래스 II 분자를 포함하는 클래스 II 복합체를 포함한다. 추가로, 하나 이상의 공지된 클래스의 sc-MHC 분자를 포함하는 키메릭 다특이성 MHC 복합체도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.

바람직한 sc-MHC 분자(클래스 I 및 II)의 구조는 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 완전히 개시되어 있다.

간단히 설명하자면, 이전에 공개된 sc-MHC 클래스 I 및 II 분자는 빈, 부하된 것일 수 있거나 또는 상기한 바의 융합 또는 부하된 제공 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, sc-MHC 클래스 II 분자는 MHC α및 β 쇄에 공유적으로 연결된 제공 펩티드를 가질 수 있다. 통상적으로, 이 제공 펩티드는 펩티드 링커를 통해 α또는 β쇄의 N-말단에 연결된다. sc-MHC 분자는 일반적으로 절두형(특히, 막내외부분의 전부를 함유하지는 않는)이거나, 또는 필요에 따라 몇몇 경우에 있어서는 전체 길이일 수 있으며 막내외 부분 또는 그의 일부 및 세포질 도메인 또는 그의 일부를 포함한다. sc-MHC 분자는 또한 막내외 도메인에 인접한, 간혹 이 분야에서 "힌쥐(hinge)"라고 하는 부분을 포함할 수 있다[참조: Kabat, G. A. 후술함].

완전히 가용성인 MHC 복합체를 얻는 것이 요망되는 경우, sc-MHC 클래스 II 분자는, 일반적으로 적합한 그의 단편(예를 들면, 1 내지 5 아미노산)이 단일쇄 분자가 완전히 기능성이고 가용성인 한 포함될 수도 있으나, 막내외 부분의 전부를 함유하지는 않을 것이다. 바람직한 sc-MHC 클래스 II 분자는 이하 제공되는 β2 클래스 II 변형 및(또는) Ig-C_L쇄 또는 Ig-C_L쇄 단편 융합부를 포함할 것이다. MHC 복합체의 용해도를 높이고 정제를 돕거나 또는 절단부위를 첨가하는 것이 필요할 경우에는 후술하는 바와 같은 단백질 태그(tag)를 MHC 복합체에 첨가할 수 있다.

PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 개시된 바와 같이, 융합 제공 펩티드를 포함하는 sc-MHC 분자는 또한 MHC 쇄 및 제공 펩티드 사이에 삽입된 신축성(flexible) 링커 서열을 포함한다. 이 링커 서열은 바람직하게는 MHC 결합 그루브에 대한 제공 펩티드의 효율적인 자리잡음(positioning)을 허용하여 제공 펩티드가 T-세포 수용체의 활성을 조정하여 T-세포 증식을 유발하거나 또는 T-세포 발달을 억제 또는 불활성화시킬 수 있다. T-세포 활성은 이후 설명하는 다양한 시험관내 및 생체내 분석에 의해 결정할 수 있다. 예시적인 분석은 T-세포를 배양하여 이를 증식시키고, T-세포를 MHC 펩티드 융합 복합체와 접촉시킨 후 MHC 복합체가 T-세포의 추가의 발달을 억제하는지를 평가하는 순차적인 단계들을 포함하는 그러한 시험관내 분석을 포함한다.

PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 추가로 개시되어 있는 바와 같이, 펩티드 융합을 포함하는 sc-MHC 분자에 관련하여, MHC α 및 β쇄 소단위들은 단일 쇄 융합 단백질로서 연결시키며 제공 펩티드는 통상적으로 융합 단백질의 β쇄에 연결한다. 그러한 연결된 단일쇄 복합체는 다수의 이점을 제공할 수 있다.

특히, 복합체를 단일 분자로 환원시킴에 있어서, 분자의 수율 및 안정성이 상당히 향상된다. 이것은 특히 활성화된 형태로 효율적으로 생성되지 않을 수도 있는 가용성 분자에 대해 효과적일 수 있다. 이후 보다 자세히 설명하는 바와 같이, sc-MHC 분자의 수율은 후술하는 바의 클래스 II β2 쇄 변형 및(또는) Ig-C_L쇄 또는 Ig-C_L쇄 단편 융합에 의해 더 증대될 수 있다.

이후 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 MHC 복합체는 다양한 클래스 I(H-2 또는 HLA) 또는 클래스 II(IA, IE, DR, DQ 또는 DP) MHC 분자를 포함할 수 있는 sc-MHC 분자를 포함한다. 예시적인 MHC 쇄는 앨러지 또는 자가면역 응답 등의 면역 응답에 관련된 것들을 포함한다. 다른 예들은 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 개시되어 있다.

주목하는 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 MHC 클래스 II 복합체가 증대된 가용성 발현을 나타냈으며, 클래스 II β2쇄가 변형되었을 때, 특히 결실되었을 때 특이성 결합을 할 수 있음을 놀랍게도 발견하였다. 클래스 II β2쇄는 예를 들면 공지의 DNA 서열의 IA, IE, DR, DQ 또는 DP쇄일 수 있다. 본 발명의 한 예시적인 실시태양에 있어서, 본 발명의 MHC 복합체는 β2 클래스 II 사슬의 하나 이상의 아미노산이 결실된 sc-MHC 클래스 II 분자를 포함한다. 이 결실된 아미노산은 본질적으로 β2 클래스 II 쇄의 전체 길이까지 인접되거나 또는 인접되지 않을 수 있다.

또다른 예시적인 실시태양에 있어서, MHC 복합체는 클래스 II β2쇄에 있어서 하나 이상의 아미노산 부가 또는 치환을 포함한다. 특히 고려되는 것은 Cys 잔기들 사이의 가교를 최소화하거나 제거하는 클래스 II β2쇄에 있어서 아미노산 치환들이다. 이 치환은 본질적으로 전체 길이의 클래스 II β2 쇄까지 인접되거나 또는 인접되지 않을 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명자들은 sc-MHC 복합체에 대한 Ig-C_L쇄의 융합이 그 복합체의 가용성 발현을 촉진하는 것을 또한 발견하였다. 따라서, 한 예시적인 실시태양에 있어서, 본 발명의 MHC 복합체는 Ig-C_L쇄에 융합된 sc-MHC 분자를 포함한다. 이 Ig-C_L쇄는 적합한 펩티드 링커 서열을 통하여 직접적으로 또는 간접적으로 단일쇄 MHC β 또는 α쇄에 융합될 수 있다.

이 Ig-C_L쇄는 공지의 DNA 서열의 κ- 또는 λ-타입 면역글로빈 경쇄 불변 영역으로부터 얻어질 수 있다. κ-타입 Ig-C_L쇄는 본 명세서에서 간혹 "Cκ쇄"로서 언급하기도 하며, 반면 λ-타입 Ig-C_L쇄는 "Cλ쇄"라고도 한다.

추가로 제공되는 것은 목적하는 sc-MHC 분자에 융합된 적합한 Ig-C_L단편을 포함하는 본 발명의 MHC 복합체이다. 이 단편은 목적하는 전체 길이의 Cκ또는 Cλ 쇄의 하나 이상의 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 하나 이상의 결실된 아미노산은 본질적으로 전체 길이의 Cκ또는 Cλ 쇄까지 인접되거나 또는 인접되지 않을 수 있다.

본 발명은 추가로 적어도 하나의 아미노산이 치환된 융합된 Ig-C_L쇄를 포함하는 본 발명의 MHC 복합체를 제공한다. 이 치환은 본질적으로 전체 길이의 Cκ또는 Cλ 쇄까지 인접되거나 또는 인접되지 않을 수 있다. Ig-C_L쇄는 또한 필요에 따라 하나 이상의 아미노산 부가를 포함할 수 있다.

상기한 바와 같이, Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편에 융합된 본 발명의 MHC 복합체는 또한 필요에 따라 변형된 클래스 II β2쇄를 포함하여 가용성 발현을 증대시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 MHC 복합체의 가용성 발현을 촉진하고 복합체의 특이적 결합 활성을 유지하는 클래스 II β2쇄 변형 및(또는) Ig-C_L쇄(또는 적합한 단편)의 융합을 포함할 수 있는 다양한 클래스 II MHC 복합체를 제공한다.

본 발명은 또한 다특이성 MHC 복합체에 특징이 있다. 다특이성 복합체는 전반적으로 하나 이상의 sc-MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자, 하나 이상의 리간드 연결 분자 및 하나 이상의 효과기 분자를 포함한다. 이 복합체는 추가로 하나 이상의 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 연결 분자(joining molecule)를 포함한다. 각 성분의 순서는 각 성분들이 의도하는 기능을 제공하는 한 중요하지 않다.

더욱 구체적으로, 한 실시태양에 있어서, 다특이성 MHC 복합체는 연결 분자에 의해 연결된 다중 쇄들을 포함한다. 예를 들면, 한 쇄는 제1 연결 분자 및 임의의 효과기 분자에 연결된 sc-MHC 분자를 포함할 수 있다. 제1 연결 분자는 제2 연결 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있으며 이는 또 리간드 연결 분자 및 임의의 효과기 분자에 연결될 수 있다. 제1 및 제2 연결 분자들은 공유 또는 비공유 결합(예, 수소 결합)에 의해 함께 연결될 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에 있어서, 다특이성 MHC 복합체는 단일 쇄로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 이 쇄는 리간드 연결 분자 및 임의의 효과기 분자에 공유적으로 연결된 sc-MHC 클래스 II 분자를 포함할 수 있다. 따라서, 용어, "다특이성(polyspecific)"은 잠재적으로 다중 결합 특이성을 포함하는 단일 MHC 복합체로 이루어진 단일 및 다중-쇄 분자를 의미한다.

본 발명의 다특이성 MHC 복합체에 관련하여 본 발명에서 사용된 바의 용어, "연결 분자(joining molecule)"는 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 공유적(예, 이황화 결합) 또는 수소 결합에 의한 비공유적으로 특이적으로 결합하여 특정 결합 쌍을 형성할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로 연결 분자에 의해 특이적으로 결합되는 분자는 본 명세서에서 간혹 제2 연결 분자로서 언급하며, 이 제2 연결 분자는 (제1) 연결 분자와 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 연결 분자의 예로는 이하에 자세히 설명하는 바와 같은 면역글로빈 불변 영역(H 또는 L) 또는 그의 적합한 단편 뿐만 아니라 코일된-코일 및 나선-회전-나선 모티브 (helix-turn-helix)를 포함한다. 특히, Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄의 단편은 연결 분자의 한 형태이다.

본 명세서에서 본 발명의 다특이성 MHC 분자에 관련하여 사용된 바의 용어 "효과기 분자"는 항체(다클론, 단일클론 또는 키메릭을 포함함)에 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프를 포함하는 분자를 의미한다. 통상적으로 항체는 단일클론 항체일 것이다. 이 용어는 또한 세포 독소, 수용체 리간드, 약물, 방사선핵종, 또는 잘 알려진 myc, 6xHIS 또는 EE tag 등의 단백질 "태그"를 포함함을 의미한다. 예시적인 태그는 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 개시되어 있다. 이후의 설명으로부터 더욱 명확해지는 바와 같이, 일부의 경우에 있어서 연결 분자들이 여기에서 제공되는 한 효과기 분자(예, Ig-C_L쇄 또는 단편)일 수 있다.

다특이성 복합체의 소단위는 필요에 따라 간혹 적합한 펩티드 링커를 통하여 또다른 소단위에 연결될 수 있다. 용어, "소단위(subnuit)"는 예컨대 sc-MHC 분자, 리간드 연결 분자, 또는 효과기 분자로 이루어진 다특이성 MHC 복합체의 단일 부분을 의미한다. 이 소단위들은 일반적으로 의도한 용도에 따라 선택된 일련의 순서대로 서로 결합되어 있다. 적합한 펩티드 링커를 사용하여 필요에 따라 공간을 제공하여 소단위들 간에 증가된 신축성(flexibility)를 제공할 수도 있다. 예시적인 펩티드 링커 서열 및 펩티드 링커 서열의 기능성을 시험하는 분석법에 대하여 이후 설명한다.

본 발명은 또한 본 발명의 MHC 복합체를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 세그먼트(RNA, mRNA, cDNA 또는 게놈 DNA)에 관한 것이다. 다양한 sc-MHC 클래스 I 및 클래스 II 복합체를 코딩하는 DNA 세그먼트를 얻는 방법은 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 기재되어 있다.

간략히 설명하자면, 목적하는 sc-MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자를 코딩하는 핵산은 공공 입수가능한 MHC 서열의 폴리머라아제 사슬 반응(PCR)을 포함하는 다양한 원들로부터 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, 핵산 세그먼트는 β2 클래스 II 변형 및(또는) 융합된 Ig-C_L쇄 또는 완전히 가용성이고 기능성인 복합체의 발현을 촉진하는 적합한 Ig-C_L쇄를 포함한다. 대부분의 경우에 있어서, 핵산 세그먼트는 바람직한 세포, 통상적으로 진핵 또는 원핵 세포에서 MHC 복합체를 발현할 수 있는 DNA 벡터(즉, DNA 발현 벡터) 내로 삽입시킨다. 이 핵산 세그먼트는 프로모터, 리더 및(또는) 임의의 면역증강제(enhancer) 서열 등의 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하거나 이들에 연결되어 세포 내에서 MHC 복합체의 발현을 증대시킬 수 있다. 별법으로, 핵산 세그먼트는 필요에 따라 공지의 방법에 의해 무세포 번역 시스템에 사용하기에 최적화시킬 수 있다.

후술하는 논의로부터 더욱 명백해지는 바와 같이, 핵산 세그먼트 또는 이를 포함하는 DNA 벡터는 본 발명의 MHC 복합체의 부분만을 코딩할 것이다. 예를 들면 제공된 일부의 다특이성 MHC 복합체는 하나 이상의 DNA 벡터로부터 발현될 수 있는 다중쇄 분자이다. DNA 벡터에 의해서 코드화되는 발현된 단일쇄는 시험관내 또는 반응기 자체내에서(예를 들면 세포내에서) 다른 발현된 단일쇄와 합하여 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들면 다특이성 MHC 복합체는 다중 핵산 세그먼트 또는 이를 포함하는 DNA 벡터를 적합한 세포내로 도입시키고 복합체를 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 이어서 다특이성 MHC 복합체는 번역, 가공 및 어셈블리 경로를 경유하여 세포내에서 어셈블링시킨다. 별법으로, 복합체의 단일쇄를 별도로 수확하여 조절된 조건, 예컨대 투석 반응에 의해 시험관 내에서 합할 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 핵산 세그먼트는 천연 발생 MHC 조절 요소의 발생을 최소화하여 제조한다. 용어, "조절 요소(control elements)"란 전사, 번역 및(또는) 목적 단백질의 프로세싱에 형향을 미치는 공지의 핵산 서열을 의미한다. 대부분의 경우, 단백질 발현은 프로모터, 임의의 면역증강제 요소 및 리더 서열을 포함하는 핵산 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 예정된 전사 조절 요소에 의해 유도될 것이다. 본 발명의 일면에 따르면, Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편은 핵산 세그먼트에 연결되며 간혹, 예컨대 MHC 복합체가 RNA 스플라이싱을 수행할 수 있는 세포 형태에서 발현되는 경우, Ig-C_L쇄로부터의 인트론 및 엑손 서열을 포함할 것이다. MHC 복합체를 원핵 세포 내에서 발현시키고자 할 경우, 인트론은 제거할 수 있다. 이하 자세히 설명하는 바와 같이, 다양한 Ig-C_L쇄 또는 그의 적합한 단편을 MHC 복합체에 융합시켜 가용성 발현을 촉진시킬 수 있다.

본 발명은 또한 실질적인 양의 충분히 가용성이고 기능성인 MHC 복합체를 얻는 방법을 제공한다. 일반적으로 설명하자면, 이 방법은 적합한 세포내에서 MHC의 발현, 세포 내에서 배양, 및 이들로부터 복합체를 정제하여(필요에 따라) 실질적으로 순수한 MHC 복합체를 얻는 것을 포함한다. 상기한 바와 같이, 일부 다특이성 복합체의 경우에, MHC 단일 쇄를 시험관내 또는 반응기 자체 내에서 합하여 목적하는 MHC 복합체의 생산을 촉진할 수 있다. 이 방법들은 목적하는 MHC 복합체들을 회전 병, 스피너 플라스크, 조직배양 플레이트, 생물반응기, 또는 발효기를 포함한 다양한 설비로부터 대규모로(예컨대, 밀리그램 이상의 양으로) 발현시켜 정제하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 단리 및 정제 방법은 제공된 클래스 II β2 쇄 변형 및(또는) Ig-C_L쇄 또는 융합된 Ig-C_L쇄 단편에 의해 긍정적으로 영향을 받을 수 있다는 것이 중요하다.

본 발명의 MHC 복합체를 단리 및 정제하는 방법은 고도로 유용하다. 예를 들면, 목적하는 결합 활성 또는 잠재적으로 다중 결합 활성(예컨대, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 면역 반응성인 T-세포의 억압 또는 목적하는 면역 세포에 대한 특이적 결합)을 나타내는 MHC 복합체에 대하여, MHC 복합체를 발현하고 정제하는 방법을 사용하는 것이 아주 유용하다. 목적하는 MHC 복합체를 적어도 밀리그램의 양으로 생산하여, 예를 들면, MHC 복합체들이 의료용, 연구용, 가정 또는 상업적인 용도로 적합한 키트의 한 성분으로 제조될 수 있도록 하는 방법을 사용하는 것이 특히 유용하다. 더욱이, 구조적 분석을 단순화할 뿐만 아니라 필요시 추가의 정제 및(또는) 시험에 유용한 MHC 복합체를 대량으로 갖는 것이 유용하다.

본 발명의 정제 방법은 일반적으로 전연적으로 이를 수반하는 세포 성분으로부터 목적하는 MHC 복합체를 정제하도록 가공된(tailored) 크로마토그래피에 의한 접근방법을 포함한다. 통상적으로, 이 접근법은 MHC 복합체의 소단위의 특이적 결합을 수반한다. 중요한 점은 하나 이상의 sc-MHC 분자, 리간드 연결 분자, 연결 분자, 효과기 분자 및 융합 Ig-C_L쇄 또는 Ig-C_L쇄 단편을 선별하도록 설계된 크로마토그래피에 의한 접근법을 포함한 몇몇 전략을 사용하여 본 명세서에 기재된 다특이성 MHC 복합체를 정제하는 것에 있다.

본 발명은 T-세포 발달을 유도하는 펩티드들 뿐만아니라 MHC 길항질 또는 부분적인 아고니스트 등의 천연 발생 MHC 복합체를 길항할 수 있는 펩티드들을 포함하는 천연 발생 MHC 복합체에 의해 인식되는 펩티드들을 검출하는 시험관내 스크리닝에 특징이 있다.

본 발명은 또한 포유류에 유효량의 본 발명의 MHC 복합체, 예컨대 sc-MHC 클래스 II 융합 복합체, 부하된 sc-MHC 클래스 II 복합체, 다특이성 클래스 II 펩티드 융합 복합체, 부하된 다특이성 클래스 II 융합 복합체 등을 투여하는 것을 포함하는 포유류, 특히 인간에 있어서 면역 응답을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다발성 경화증, 인슐린 의존성 당뇨병, 류마티스성 관절염 등의 자가면역 질환으로 고통을 겪거나 또는 이들 질환에 민감한 환자 또는 만성적인 앨러지가 있는 환자 등의 바람직하지 못한 면역 응답에 민감한 포유류 또는 기관 또는 피부 이식 수술 등의 이식 수술을 겪는 환자의 치료를 포함한다.

면역 응답은 본 발명에 의하여 하나의 별도의 전략 또는 이들의 조합에 의해 억압시킬 수 있다. 구체적으로, 무력증, 또는 T-세포의 사멸은 동시-자극적인 신호의 부재 또는 거의 부재하에 하나 이상의 본 발명의 MHC 복합체의 유효량을 투여함으로써 유도할 수 있다. 통상적으로, MHC 복합체는 전체 길이의 MHC 복합체 또는 그의 일부의 완전한 막내외 도메인을 함유하지 않는다.

또한 본 발명은 본 발명의 MHC 복합체를 코드하는 DNA 세그먼트의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 면역 응답을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 앞서 언급한 바와 같이, 다중 쇄를 포함하는 본 발명의 다특이성 MHC 복합체를 코드하는 DNA 세그먼트를 사용하는 것이 바람직할 경우, 각각의 쇄들을 코드하는 둘 이상의 DNA 서열을 유효량으로 투여하는 것이 간혹 유용할 수 있을 것이다. 통상적으로 생체내에서 또는 시험관내에서 코드된 단백질의 동시발현 및 어셈블리는 다특이성 MHC 복합체를 형성한다. 또한 일부의 경우에 있어서, CD80 또는 CD86 등의 적합한 T-세포 자극 인자를 코딩하는 유전자와 함께 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 서열 하나 이상을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 여기에서 사용된 바의 용어, "T-세포 동시자극 인자(T-cell co-stimulatory factor)"는 동시 자극적인 신호를 제공함으로써 하나 이상의 MHC 융합 복합체의 존재하에서 T-세포 증식을 활성화시킬 수 있는 펩티드를 의미한다. 그러한 T-세포 증식의 활성화는 본 명세서에 개시된 분석법에 의해서 결정할 수 있다.

추가로 제공되는 것은 방사선핵종(예,¹²⁵I,³²P 또는⁹⁹Tc) 또는 기타의 검출가능한 태그를 포함하도록 변형된 MHC 복합체를 포함하는 본 발명의 MHC 복합체를 사용하는 HLA 타이핑 및 시험관내 진단 영상화를 포함하는 진단 방법이다.

본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 MHC 복합체를 사용함으로써 T-세포 등의 면역 세포의 검출 및 정제를 위한 방법을 포함한다. 이어서 MHC 복합체와 특이적으로 결합하는 T-세포 등의 그러한 세포들은 공지의 방법(예, 플로우 사이토메트리, 이뮤노팬닝(immunopanning))에 따라서 T-세포의 실질적으로 순수한 집단를 제조하기에 충분하지 못한 세포로부터 실질적으로 분리될 수 있다. 그러한 T-세포들은 예를 들면, 면역화해된 환자의 면역 시스템의 재구성 및 바람직하지 못한 면역 반응과 관련된 제공 펩티드의 검출을 위한 시험관내 스크리닝 등의 몇몇의 임상 및 연구 환경에 유용하다.

본 발명은 주요 조직적합 복합체(MHC) 분자의 신규 복합체 및 그의 발현 방법 및 이러한 복합체의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 일면에 있어서 본 발명은 변형된 클래스 II β2 쇄를 포함하는 MHC 클래스 II 분자에 관한 것이다. 다른 일면에 있어서, 본 발명은 공유적으로 연결된 면역글로빈 불변 영역을 포함하는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 복합체에 관한 것이다. 더욱 다른 일면에 있어서, 본 발명은 다특이성 MHC 복합체 뿐만 아니라 MHC 복합체의 발현 및 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명의 MHC 복합체는 시험관 및 생체내에서 T-세포 활성을 조정하는 펩티드의 능력을 스크리닝하는 것을 포함하는 다양한 용도로 사용된다.

도 1은 단일쇄 IA^d/OVA 323-339 MHC 융합 분자(예, IA^d/OVA)(서열 번호: 24)를 코딩하는 유전자의 개략도이다. IA^dβ2 쇄는 IA^d/OVA 단일 쇄 유전자(서열 번호:24)의 뉴클레오시드 452 내지 734에 의해 코드화된다. IA^dβ2 쇄는 아미노산 150 내지 243(서열번호: 25)에 걸친다. 코작(Kozak) 공통 서열이 나타나 있다. 화살은 신호 펩티다아제 절단 부위를 나타낸다. IA^dβ1 - β2 및 IA^dα 도메인에서 "//"는 명확하게 하기 위해 생략된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이 OVA 323-339 펩티드(서열 번호: 25)(대시선)는 sc-IA^d/블랭크 MHC 분자에서는 존재하지 않는다.

도 2A 및 2B는 sc-IA^d/OVA 분자의 세포 표면 발현(2A) 및 T-세포 유도 활성( 2B)를 나타내는 그래프이다.

도 3A-3N은 DNA 벡터들 SDE3, pMB959, pMB808, pIADK 및 pDHK의 합성의 개요를 그린 도면들이다.

도 4A 및 4B는 (4A) IA^d및 (4B) DR-2 쇄들을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 펩티드 융합의 도면이다. 사용된 약어들은 다음과 같다: SP: 신호 펩티드 서열; PEP, 융합된 항원성 펩티드 서열; L1, 10 아미노산 링커; L2, 아미노산 링커; EE, 항체 태그; Ig-C_L, 면역글로빈 경쇄 불변 영역, αTM C_y, 세포질 막내외 도메인. 대응하는 빈 분자들은 서열 "PEP"를 제거한 것을 제외하고는 동일한 도면으로 나타낼 것이다. 부하된 분자들은 sc-MHC 클래스 II 결합 그루브와 비공유적으로 연결된 "PEP" 서열을 가질 것이다.

도 5A 및 5B는 가용성 단일쇄 MHC 클래스 II/펩티드 단백질의 발현을 나타내는 폴리아그릴아미드 겔 또는 면역 블롯이다. 도 5A는 12% SDS-PAGE에 의해 분석되고 쿠마시 블루로 염색된 sc-IA^d시료(레인 1-3)를 나타낸다. 분자량 표준의 이동을 나타냈다. sc-클래스 II 단백질(레인 4-6)을 또한 나일론 막으로 이동시키고 OVA 323-339 펩티드에 특이적인 마우스 항-혈청으로 표지시켰다. 도 5B는 10% SDS-PAGE에 의해 분석한 scDR2△β2 시료의 앤티-DR 친화 정제 프로필을 나타낸다. 친화 정제된 단백질은 레인 3-5(환원 조건) 및 레인 7-9(비환원 조건)에 나타낸다.

도 6A-C는 단일쇄 클래스 II/펩티드 단백질들이 특이적으로 T-세포 응답을 활성화시킴을 설명하는 그래프이다. 도 6A는 IA^d에 결합된 OVA323-339에 특이적인 DO11.10 T-세포 하이브리도마를 나타내며, 이들은 IL-2를 생성하도록 자극되었다. 도 6B는 두 개의 상이한 T-세포 하이브리도마, GD12(gD 246-261 및 IA^d에 특이적인) 또는 DO11.10을 나타내며 이들은 제공 펩티드 특이적인 방식으로 IL-2를 분비하도록 자극되었다. 도 6C는 DO11.10 세포로부터 IL-2의 방출을 자극한 OVA 펩티드 또는 sc-IA^d/OVA 융합 단백질(그러나 블랭크 융합 단백질이 아님)과 함께 고정화된 IA^d/블랭크 단백질을 나타낸다.

도 7은 앤티-T-세포 수용체 항체(항-TcR mAb) 또는 sc-IA^d/OVA가 T-세포 세포소멸(apoptosis)을 유발함을 나타내는 에티듐 브로마이드 염색된 겔의 사진이다. 레인 3 및 4의 뉴클레오섬 래더는 사멸을 나타낸다.

도 8A 및 8B는 sc-IA^d/OVA의 생체내 발현이 T-세포 클론 팽창을 억압함을 입증하는 그래프도이다.

도 9A 및 9B는 다특이성 sc-클래스 II/펩티드 Ig-C_L이합체(9A) 및 sc-클래스 II/펩티드 Ig-C_L: 단일쇄 항체 분자(9B)의 개략도이다.

도 10A 및 10B는 이후의 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오타이드(10A) 및 폴리펩티드 서열(10B)를 나타낸다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 완전히 가용성이고 기능성인 신규한 MHC 복합체를 제공한다. 이 MHC 복합체는 융합된 Ig-C_L쇄 또는 단편 및(또는) 변형된 클래스 II β2 쇄를 포함하는 sc-MHC 클래스 I 및 클래스 II 복합체를 포함한다. Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L단편을 MHC 복합체에 융합시키고 및(또는) 클래스 II β2 쇄를 변형시킴으로써 MHC 복합체의 가용성 발현을 상당히 증대시키는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 다특이성 MHC 복합체는 변형된 클래스 II β2 쇄 및(또는) Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단변을 포함하여 필요에 따라 가용성 발현을 촉진시킬 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 MHC 복합체의 제조는 예를 들면 올리고뉴클레오티드 프라이머 유도되고 부위 특이적인 돌연변이유발, 폴리머라아제 연쇄 증폭 반응(PCR), 플라스미드 DNA의 제조, 제한 효소를 사용한 DNA의 절단, DNA의 연결, mRNA의 단리, 이 DNA의 적합한 세포내로의 도입, 세포의 배양, 발현된 MHC 복합체의 단리 및 정제를 포함하는 통상의 재조합 단계를 포함한다[참조: 일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Lboratory Manual. (2nd ed. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York (1989)].

이 방법들은 빈 또는 부하된 MHC 복합체, 예를 들면, 빈 또는 부하된 다특이성 MHC 복합체, 부분적으로 빈 또는 부하된 sc-MHC 클래스 II 분자 및 융합된 제공 펩티드를 포함하는 MHC 복합체를 포함하는 본 명세서에 개시된 MHC 복합체들을 제조하는데 적합하다.

융합 제공 펩티드, 펩티드 링커, 등을 포함하는 sc-MHC 펩티드 융합 복합체의 제조에 관한 다음의 논의는 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 기재되어 있다.

이 논의는 일반적으로 빈 또는 부하된 복합체들을 포함하는 본 발명의 MHC 복합체를 제조하고 사용하는데 적용될 수 있음은 이해될 것이다. 다음의 기재 사항으로부터 빈 또는 부하된 MHC 복합체를 제조하기 위해, 융합된 제공 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 빈 또는 부하된 분자를 코딩하는 핵산 구조물에 포함되지 않음을 이해할 수 있을 것이다.

목적하는 MHC 단백질(예컨대, 헤테로이합체성성 MHC 분자)를 코딩하는 DNA는 예를 들면 후술하는 실시예 1에 개시된 세포주를 포함한 몇 개의 원 중 임의의 것으로부터 얻을 수 있다. MHC 단백질을 코딩하는 다른 원들은 알려져 있으며, 예를 들면 인간 림프아구 세포이다. 일단 단리되면, MHC 단백질을 코딩하는 유전자를 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 또는 기타 당업계에 공지된 수단에 의해 증폭시킬 수 있다. MHC 단백질 유전자를 증폭하기 위한 적합한 PCR 프라이머를 PCR 생성물의 제한 부위에 부가할 수 있다. 이 PCR 생성물은 또한 링커 서열 또는 그러한 서열의 연결을 위한 제한 효소 부위를 포함하는 것이 바람직하다. 적합한 프라이머, PCR 조건 및 발현 벡터 제작 기술은 예를 들면 후술하는 실시예 및 도면에 기재되어 있다.

링커 서열은 제공 펩티드를 MHC 분자의 결합 그루브 내에 효과적으로 위치시킬 수 있는 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열이 바람직하다. 본 발명에서 사용된 바의 용어, "제공 펩티드를 MHC 분자의 결합 그루브 내에 효과적으로 위치시킨다" 또는 "T-세포의 활성을 조정할 수 있는 MHC 복합체" 또는 기타 유사한 문구들은 제공 펩티드 융합 복합체가 T-세포 수용체의 활성을 조정하여 후술하는 분석들에 의해 결정되는 바와 같이 T-세포의 증식을 유도하거나 또는 T-세포 발달을 억제하거나 불활성화시킬 수 있도록 MHC 단백질에 연결된 제공 펩티드가 위치되는 것을 의미한다. 한 예시적인 분석은 T-세포를 배양하여 이를 증식시키고, T-세포를 본 발명의 MHC 펩티드 융합 복합체와 접촉시킨 후 MHC 복합체가 T-세포의 추가의 발달을 억제하는지를 평가하는 순차적인 단계들을 포함한다.

일반적으로, sc-MHC 펩티드 융합 복합체는 공유적으로 연결된 펩티드 링커 서열에 의해 분리된 MHC 단일쇄를 포함한다. 예를 들면, sc-MHC 클래스 II 분자들은 일반적으로 적합한 단일쇄 링커 서열을 통하여 MHC 클래스 α1, α2 쇄에 연결된 MHC 클래스 II β1, β2 쇄를 포함할 것이다. 상기 언급한 바와 같이, 클래스 II β2 쇄는 간혹 후술하는 바와 같이 변형될 수 있을 것이다. 따라서, 단일쇄 링커 서열은 연결된 MHC 복합체를 활성 형, 예컨대 MHC 분자가 T-세포의 활성을 조정할 수 있는 형태로 겹치게 할 수 있을 것이다.

그러한 효율적인 단일 쇄 링커 서열들은 실험적으로 용이하게 결정될 수 있을 것이다. 따라서, 예를 들면 α 및 β 쇄가 링커 서열에 의해 연결된 단일 쇄 MHC 복합체를 코드화하는 DNA 구조물을 클로닝하고 발현시켜서 단일쇄 MHC 복합체를 시험하여 이 복합체가 후술하는 분석들에 의해 결정되는 바와 같이 T-세포의 활성을 조정하여 T-세포의 증식을 유도하거나 또는 T-세포 발달을 억제하거나 불활성화시킬 수 있는지를 결정한다.

단일쇄 링커는 바람직하게는 글리신, 알라닌 및 세린 등의 작은 측쇄를 갖는 아미노산을 우세하게 포함하여 신축성을 제공하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 링커 서열의 약 80% 또는 90% 이상이 글리신, 알라닌 또는 세린 잔기, 특히 바람직하게는 글리신 및 세린 잔기들을 포함하는 것이 좋다. 일반적으로, 링커 서열은 신축성을 억제할 수 있는 임의의 프롤린 잔기들을 함유하지 않는다. 공유적으로 연결된 펩티드를 가진 sc-MHC 클래스 II 분자를 포함하는 그러한 MHC 융합 복합체에 대하여, 비록 링커 펩티드 서열은 또한 필요에 따라 MHC 분자의 α쇄에도 부착될 수 있지만 링커 서열은 MHC 분자의 α 및 β 쇄에 적합하게 연결된다. 예시적인 펩티드 링커 서열은 약 7 내지 20개의 아미노산, 바람직하게는 약 8 내지 16 개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 8 내지 12 개의 아미노산을 포함한다. 이 링커 서열은 일반적으로 단일의 바람직하지 않는 구조 중에 제공 펩티드를 갖지 않도록 신축적이다. 제공 펩티드를 MHC 클래스 β 쇄 분자에 공유적으로 연결시키기 위해서, 링커 서열의 아미노산 서열은 MHC 클래스 II β쇄의 N-말단 잔기부터 제공 펩티드의 C-말단 잔기 까지 대략 30 옹스트롬에 걸칠 수 있어야 한다. 예를 들면, 공개된 PCT 출원의 도 1A 및 IB를 참고하기 바람. 그러한 β+펩티드 쇄가 α 쇄와 함께 발현될 때, 연결된 제공 펩티드는 α1 및 β1 결합 그루브 내로 겹쳐져서 공개된 PCT 출원의 도 1C에 일반적으로 나타낸 기능적인 MHC 분자를 초래해야 한다.

한 적합한 링커 서열은 예를 들면 MHC 클래스 II 단백질의 β1 도메인의 제1 아미노산에 연결된 ASGGGGSGGG(서열 번호: 35)(즉, Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly)이다. 항체 가변 영역을 함께 연결시키는데 성공적으로 사용되었던 다수의 신축성 링커 디자인 중 임의의 것을 포함하는 상이한 링커 서열을 사용할 수 있다(예컨대, M. Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105(1991). 적합한 크기 및 서열의 단일쇄 링커 서열도 또한 통상적인 컴퓨터 기술에 의해 결정할 수 있다.

기타 적합한 링커 서열은 실험적으로 결정할 수 있다. 예를 들면, 링커 서열을 포함하는 MHC 융합 복합체를 코딩하는 DNA 구조물을 클로닝하고 발현시켜서 융합 복합체를 시험하여 이 복합체가 후술하는 분석들에 의해 결정되는 바와 같이 T-세포 수용체의 활성을 조정하여 T-세포의 증식을 유도하거나 또는 T-세포 발달을 억제하거나 불활성화시킬 수 있는지를 결정한다. 적합한 크기 및 서열의 링커 서열도 또한 MHC 복합체의 예측된 크기 및 모양에 기초하여 통상적인 컴퓨터 모델링 기술에 의해 결정할 수 있다.

대부분의 경우, 제한 부위들을 링커 서열 및 MHC 단백질을 코딩하는 융합된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구조물 내에 공학적으로 만들어서 목적하는 제공 펩티드(예컨대, 항원성 또는 길항질 제공 펩티드)를 코딩하는 본질적으로 임의의 뉴클레오티드 서열을 구조물에 부착시킬 수 있다. 예를 들면, 후술하는 실시예에 예시된 한 시스템에 있어서, 적합한 제한 부위들(예, AflII 및 Nhel 부위)을 리더 서열의 말단 및 링커 서열의 시작부에 포함시켜 다양한 제공 펩티드의 MHC 분자의 β쇄 유전자에의 삽입을 촉진시킬 수 있다. 예를 들면, 공개된 PCT 출원의 도 3 및 후술하는 실시예 3을 참조하기 바람. 예시적인 리더 서열의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들은 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 호의 도 18A 및 18B에 나타냈다. 또한, 후술하는 실시예 및 공개된 PCT 출원 제 WO 97/28191호를 참조하기 바란다.

MHC 융합 복합체의 제공 펩티드 성분은 상기 논의한 바와 같이 T-세포의 활성을 조정할 수 있어야 한다. 클래스 II MHC 분자를 포함하는 MHC 융합 복합체에 대하여 제공 펩티드는 통상 약 4 내지 약 35 개의 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 약 6 내지 약 30 개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 약 8 내지 약 25 개의 아미노산을 갖는다. 클래스 I MHC 분자를 포함하는 MHC 융합 복합체에 대하여 제공 펩티드는 통상 약 4 내지 약 25 개의 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 약 6 내지 약 20 개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 약 6 내지 약 15 개의 아미노산 및 가장 바람직하게는 약 8 내지 약 10 개의 아미노산을 갖는다. 클래스 I 및 II MHC 분자들은 상이한 펩티드 서열들에 대하여 선별적인 결합을 나타낸다. 최근에, MHC 대립인자-특이성 펩티드 모티브을 규정하는 앵커 잔기들이 클래스 II 결합 펩티드들에서 동정되었다[참조: F. Sinigaglia et al., Curr. Opin. in Immun., 6:52-56 (1994)]. 예를 들면, 인간 클래스 II HLA-DR1 분자에서, 방향족 아미노산(예, Tyr, Phe 또는 Trp)이 펩티드의 아미노 말단 근처(위치 1), 4 번위치의 소수성 잔기(예, Met 또는 Leu), 및 6 번 위치의 작은 아미노산(예, Ala 또는 Gly)에서 보통 발견된다. 기타 MHC 분자들은 상이한 모티브를 가진다. 예를 들면, 클래스 II 분자에 대하여 상기한 Sinigaglia 참조; 클래스 I 분자에 대하여 K. Parker et al., J. Immunol., 152:163-175(1994) 참조.

바람직한 제공 펩티드들은 최적 MHC 결합을 촉진하기 위하여 목적하는 MHC 결합 모티브를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 인간 클래스 II HLA-DR1 MHC 분자에 있어서, 방향족 아미노산(예, Tyr, Phe, 또는 Trp)는 바람직하게는 제공 펩티드의 아미노 말단 근처(위치 1)에 위치하고, 소수성 잔기(예, Met 또는 Leu)는 제공 펩티드의 4 번 위치에서 및 작은 아미노산(예, Ala 또는 Gly)은 제공 펩티드의 6 번 위치에 위치한다. 본 발명의 면역 억제 방법(예를 들면, 자가면역 질병 또는 앨러지를 치료하거나 또는 달리 원치않는 T-세포 응답을 억제하는)에 대하여, 제공 펩티드들은 바람직하게는 표적화된 질환에서 T-세포를 활성화시키는데 관여하는 것으로 알려지거나 또는 예측되는 펩티드와 동일하거나 또는 상동성(예컨대, 적어도 약 80 또는 90% 이상)일 수 있다. 따라서, 예를 들면, MPB 펩티드 80-105는 다발성 경화증 환자로부터 단리된 MPB-특이성 T-세포의 30% 이상에 의해 인식되며[참조: E. Meinl et al., J. Clin. Invest., 92:2633-2643 (1993)], 본 명세서에 개시된 면역억압 응용에 사용되는 MHC 융합 복합체 중에서 제공 펩티드로서 적합해야 한다. 하기 실시예 3을 참조하기 바란다. 추가로, 특정 제공 펩티드, 예컨대 항원성 또는 길항질 또는 부분적 아고니스트의 활성은 후술하는 시험관내 분석을 포함한 본 명세서에 개시된 방법에 의해 용이하게 실험적으로 결정될 수 있다.

상기 및 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에서 논의한 바와 같이, 단일쇄, MHC 융합 복합체들이 바람직하며, 예컨대, 다중 쇄 보다 단일 폴리펩티드로 이루어진 융합 복합체가 그러한 천연 헤테로삼합체 클래스 II/펩티드 복합체를 이루고, 이때 α 및 β 쇄 및 펩티드들이 비공유적 상호작용을 통해 연결된다. 단일쇄 MHC 클래스 II 복합체의 경우에, α 및 β 쇄 소단위들은 단일 쇄 펩티드 단백질로서 제공 펩티드에 연결되고, 바람직하게는 융합 단백질의 β쇄에 연결된다. 예시적인 sc-MHC 클래스 II 융합 복합체는 도 1, 4A 및 4B에 나타냈다. 바람직하게는 링커 서열은 α 및 β 쇄들을 연결하는데 사용된다. MHC 분자의 도메인들을 연결하는데 사용되는 그러한 링커 서열은 본 명세서에서 간혹 "단일쇄 링커 서열"이라고도 언급하며 이것에 의해 제공 펩티드 및 MHC 분자 사이에 삽입되고 이들을 공유적으로 연결하는 상기 언급한 바의 링커 서열과 구별된다. 그러한 링커 서열의 예는 하기 도 1에 나타나 있다.

바람직하게는 단일쇄 MHC 클래스 II 복합체는 비록 MHC 복합체의 다중 도메인이 다른 위치를 통하여 연결될 수도 있으나, β2 도메인의 카르복시 말단 및 α1 도메인의 아미노 말단 사이에 연결된다.

본 명세서에서 제공되는 복합체의 MHC 분자는 적합하게는 아미노산 서열에 있어서 천연 발생 MHC 분자, 예컨대 인간, 마우스 또는 기타 설치류 또는 기타 포유류의 MHC 분자(클래스 I 및 II)에 대응한다. 바람직하게는 융합 복합체의 MHC 분자의 아미노산 서열의 약 70% 이상이 상기한 바의 천연 발생 MHC 분자의 아미노산 서열과 동일하고, 더욱 바람직하게는 융합 복합체의 MHC 분자의 아미노산 서열의 약 90% 이상이 천연 발생 MHC 분자의 아미노산 서열과 동일하고, 더 더욱 바람직하게는 융합 복합체의 MHC 분자의 아미노산의 약 98% 이상이 천연 발생 MHC 분자의 아미노산 서열과 동일할 것이다.

본 발명의 빈 MHC 복합체, 특히 단일 빈 MHC 복합체는 제공 펩티드를 이 분자에 공유적으로 연결시키는 것을 제외하고는 상기한 바의 임의의 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면 PCT 출원 제 WO 97/28191호 및 후술하는 실시예 1-3에 기술된 바와 같이, OVA 제공 펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 펩티드 링커-β1-β2 유전자 단편에 결합시키는 단계를 생략할 수 있다. 또다른 실시예에 있어서, 제공 펩티드는 표준 재조합 DNA 조작법을 사용하여 이미 공유적으로 연결된 제공 펩티드를 가진 본 발명의 MHC 분자로부터 배제시킬 수 있다. 예를 들면, sc-IA^d/OVA 제공 펩티드를 코딩하는 DNA를 적합한 제한 효소(예, AfIII 및 NheI)로 제거할 수 있다.

상기 논의한 바와 같이, 본 발명자들은 클래스 II β2 쇄를 변형시킴으로써 다양한 sc-MHC 복합체의 가용성 발현을 촉진시키는 것이 가능함을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 β2 클래스 II 쇄는 MHC 복합체의 특이적인 결합에 필수적이 아님을 발견하였다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라서 변형된 클래스 II β2 쇄는 그의 DNA가 알려진 임의의 IA, IE, DR, DQ 또는 DP 쇄일 수 있다. 클래스 II β2 쇄에 대한 서열은 다양한 원들, 예컨대 본 명세서에 참고로 인용하는 문헌[Kabat, E. A, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5^thed,) Public Health Services, National Institutes of Health]으로부터 얻을 수 있다.

특히, 인간 클래스 II β1 및 β2 쇄 도메인은 통상적으로 각각 1 내지 94 및 95 내지 188에 대응하며 여기서 위치 1은 성숙한 클래스 II β 쇄의 N-말단 아미노산에 대응한다. 이 위치들은 특정 클래스 II 분자에 따라서 1 내지 5 아미노산 사이에서 다양하다. 예시적인 클래스 II β2 쇄 결실은 β2 도메인의 개시부에서 위치 95의 아미노산 내지 β2 도메인의 말단에서 위치 188까지의 아미노산의 결실을 포함한다. 하기 실시예 3을 참조하기 바람. 별법으로, 하나 이상의 연속적인 또는 비연속적인 아미노산을 클래스 II β2 쇄의 위치 95 및 188 사이에서 전체 길이까지 결실시킬 수 있다.

더욱 구체적으로, 클래스 II β2 IA^d쇄는 IA^d/OVA 323-229 MHC 분자의 뉴클레오시드 452 내지 734에 걸친 DNA 서열(도 1 및 서열 번호: 24 참조)에 의해 코드화된다. IA^d/OVA β2 쇄는 아미노산 150 내지 243(서열 번호: 25)에 걸친다. 또한, 클래스 II IA^d또는 DR β2 쇄를 포함하는 단일쇄 MHC 복합체를 제조하는 것에 관련된 하기 실시예 1 및 3을 참조하기 바람.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 한 실시태양에 있어서, MHC 클래스 II 복합체는 β2 클래스 II 쇄가 결실되어 제공된다. β2 클래스 II 쇄 결실은 클래스 II β2 쇄의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 5, 10, 25, 50, 60, 70, 80 또는 90 아미노산 및 더욱 바람직하게는 본질적으로 모든 아미노산의 결실에 걸친다. 또다른 실시태양에 있어서, MHC 복합체는 본질적으로 클래스 II β2 쇄의 하나 이상의 비연속적 아미노산의 결실 내지 전체 서열의 결실을 포함하는 변형된 β2 클래스 II 쇄를 포함한다.

바람직한 비연속적인 결실은 클래스 II β2 쇄의 적어도 2 아미노산, 바람직하게는 적어도 5 내지 10 아미노산, 또는 그 이상에 걸칠 수 있다.

본 발명의 또다른 예시적인 실시태양에 있어서, MHC 클래스 II 복합체는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 β2 클래스 II 쇄 변형을 포함할 수 있다. 클래스 II β2 쇄의 바람직한 치환은 쇄의 아미노산의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2, 5, 10, 25, 50, 60, 70, 80, 90 또는 그이상의 아미노산이 보존적 또는 비보존적 아미노산으로 치환된 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다.

따라서, 티로신의 페닐알라닌으로의 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환의 일례일 것이며, 반면 아르기닌의 알라닌으로의 치환은 비보존적 아미노산 치환을 나타낼 것이다. 바람직하게는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환은 친수성 또는 중성 아미노산이다. 특히, β2 클래스 II 쇄에서 하나 이상의 Cys 잔기들은 비-Cys 잔기로 치환되어 가교 결합에 대한 전위가 실질적으로 감소되거나 제거될 수 있다. 바람직하게는 Cys 잔기의 하나 이상 및 더욱 바람직하게는 모두가 비-Cys 잔기로 치환되는 것이 좋다. Cys 잔기가 Ser로 치환된 클래스 II β2 쇄를 나타낸 하기 실시예 3을 참조하기 바람.

다른 클래스 II β2 쇄 변형은 본 발명의 범위 이내에 있다. 예를 들면, 클래스 II β2 쇄는 클래스 II β2 도메인의 위치 95 내지 최종 위치 188 사이의 하나 이상의 아미노산 부가를 포함한다. 더욱 구체적으로, β2 쇄는 바람직하게는 중성 또는 친수성 잔기들의 하나 이상의 부가를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 바람직하게는, 변형된 클래스 II β2 쇄는 하나 이상의 중성 또는 친수성 아미노산, 더욱 바람직하게는 2, 5, 10, 15 또는 20개의 아미노산 내지 약 25 내지 30개의 아미노산을 포함한다. 이 실시태양에 있어서, 보통 부가된 아미노산 잔기의 수를 약 클래스 II β2 쇄의 길이로 억제하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 대부분의 경우에 있어서, 쇄에 첨가되는 각 아미노산에 대하여 클래스 II β2 쇄의 동등한 수 또는 거의 동등한 수를 제거하는 것이 바람직할 것이다. 일부 경우에 있어서, β2 클래스 II 쇄에 인접한 링커 서열 및(또는) β1 쇄 서열 등의 부가 서열의 제거는 제공 펩티드 결합 및 MHC 분자 사이이 특이적 결합에 부정적인 영향을 미침이 없이 용해도를 더 개선시킬 수 있다. 그러한 구조물들은 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 용이하게 제조하여 시험할 수 있다.

본 발명에 따른 클래스 II β2 쇄 변형은 제한 효소 또는 PCR 프라이머의 사용을 포함하는 다양한 표준 재조합 기술에 의해 클래스 II β2 쇄를 코딩하는 미리 증폭시킨 DNA 서열로부터 하나 이상의 아미노산을 코딩하는 핵산을 절단함으로써 수행할 수 있다. 그러한 결실을 만드는 바람직한 방법은 예정된 β2 쇄 부위를 증폭시키는 돌연변이유발성 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 PCR을 사용한 올리고뉴클레오티드 유발 부위 특이성 돌연변이를 포함한다.

상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 MHC 복합체는 예컨대 복합체의 C-말단에 연결된 공유적으로 연결된 Ig-C_L쇄를 포함한다. 한 실시태양에 있어서, MHC 복합체는 융합된 포유류 Ig-C_L쇄, 바람직하게는 전체 길이의 쥐 또는 인간 Ig-C_L쇄(Cκ또는 Cλ)를 포함한다. 쥐 또는 인간 Ig-C_L쇄의 핵산 및 단백질 서열은 공개되었다[참조: Fundamental Immunology, (1993) 3rd Ed., W. Paul. Ed. Resn. Press Ltd. New York; and Kabat, E. A. 상기함].

용어, Ig-C_L쇄는 또한 하나 이상의 아미노산 치환 또는 부가에 의해 공개된 전체 길이 서열과는 상이한 면역글로빈 경쇄 불변 영역을 의미한다. 아미노산은 예를 들면 종래의 재조합 방법에 의해 쇄의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 공개된 Ig-C_L쇄 서열에 첨가될 수 있다. 또한, 재조합 방법은 필요시 쇄 중의 하나 이상의 구체적인 아미노산을 바람직하게는 중성 또는 친수성 아미노산으로 치환시키는데 사용될 수 있다. 이 치환은 필요에 따라 보존적 또는 비보존적일 수 있다. 일반적으로 아미노산 부가는 약 1 내지 30 중성 또는 친수성 아미노산, 바람직하게는 약 2, 5, 10, 20 또는 25개의 그러한 아미노산을 포함할 것이다. Ig-C_L쇄에서 다른 아미노산에 대해서 치환되는 아미노산은 통상적으로 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환일 것이다. Ig-C_L쇄 분획에 대해 나중에 지적하는 바와 같이, 융합된 Ig-C_L쇄를 포함하는 본 발명의 MHC 분자는 완전히 가용성이고 기능성일 것이다.

일부의 경우에 있어서 쥐 또는 인간 Cκ 쇄 단편 등의 적합한 Ig-C_L쇄 단편을 여기에서 개시된 MHC 복합체에 융합시키는 것이 바람직할 것이다. 구 "가용성 Ig-C_L쇄 단편"은 목적하는 MHC 복합체에 융합되었을 때, 후술하는 바와 같이 완전히 가용성이고 기능적인 복합체를 형성하는 전체 길이 Ig-C_Lλ 또는 κ의 일부를 의미한다. Ig-C_L쇄 단편(두 Cκ 및 Cλ)는 표준 재조합 방법에 따라 제조할 수 있으며, 전체 길이 서열의 연속적인 또는 불연속적인 결실일 수 있다. 예를 들면, 적합한 Ig-C_L단편은 목적하는 쥐 또는 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄 단편을 PCR 증폭시키고 이어서 PCR 생성물을 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 세그먼트 또는 벡터에 연결시킴으로써 제조할 수 있다. PCR 생성물은 필요에 따라 제한 효소 절단 부위를 포함하도록 조작할 수 있다. Ig-C_L쇄 단편을 제조하는 특히 바람직한 방법은 예정된 β2 쇄 부위를 증폭시키는 돌연변이유발성 DNA 프라이머 및 PCR을 사용한 올리고뉴클레오티드 유발 부위 특이성 돌연변이를 포함한다.

일반적으로, 적합한 쥐 또는 인간 Cκ쇄 단편은 약 80 내지 130 아미노산, 바람직하게는 약 90 내지 120 아미노산, 및 더욱 바람직하게는 약 100 내지 110 아미노산 길이 일 것이다. PCR 증폭에 적합한 쥐 또는 인간 Cκ쇄 단편 DNA를 포함하는 세포는 당분야에서 공지되어 있다. 후술하는 실시예를 참조하기 바람.

상기 논의한 클래스 β2 쇄 변형, Ig-C_L쇄 및 Ig-C_L쇄 단편은 본 발명의 MHC 복합체의 리간드에 대한 특이적 결합 능력에 중대한 영향을 미치지 않는다. 즉, 클래스 β2 쇄를 변형시키고 및(또는) Ig-C_L쇄 또는 Ig-C_L쇄 단편을 MHC 복합체에 융합시킴으로써, MHC 복합체에 의한 특이적 결합은 전체 길이의 클래스 β2 쇄를 포함하고 융합된 Ig-C_L쇄 또는 단편이 결핍된 sc-MHC 복합체 등의 적당한 콘트롤에 비교했을 때 약 30% 이상 줄어들지 않으며, 바람직하게는 10% 이상, 및 더욱 바람직하게는 5% 이상으로 줄어들지 않는다. 예시적인 결합 분석은 후속 실시예에 기재되어 있으며 표준 웨스턴 블롯 및 T-세포 자극 분석들을 포함한다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 MHC 복합체는 완전히 가용성이고 기능성이다. 용어, "완전히 기능성" 또는 유사한 용어는 융합 단백질이 클래스 β2 쇄 쇄 변형 및(또는) 융합된 Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편의 존재하에서 리간드에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 그러한 특이적 결합을 검출하기 위한 분석은 본 명세서에 개시되어 있다.

용어, "완전히 가용성" 또는 유사한 용어는 융합 단백질이 수용성 완충액, 예컨대 세포 배지로부터 낮은 중력(G-force) 원심분리(예, 표준 원심분리에 있어서 분당 약 30,000 회전 이하)하에서 용이하게 침전되지 않는 것을 의미한다. 또, MHC 복합체는 융합 단백질이 약 5 내지 37℃ 이상의 온도에서 또는 중성 또는 그 근처의 pH에서 낮은 농도의 음이온성 또는 비이온성 세제의 존재 또는 부재하에서 남아있을 경우 가용성이다. 이러한 조건하에서, 가용성 단백질은 간혹 낮은 침전값, 예컨대 약 10 내지 50 스베드베리(svedverg) 단위 이하를 갖는다. 여기에서 언급된 바의 수용액은 통상적으로 pH, 통상적으로 약 5-9의 범위 이내의 pH 및 약 2mM 및 500 mM 사이의 이온 농도를 설정하도록 완충기능을 하는 화합물을 갖는다. 때때로 프로테아제 억제제 또는 온화한 비이온성 세제를 첨가한다. 추가로, 송아지 혈청 알부민(BSA) 등의 캐리어 단백질을 필요에 따라 몇 mg/ml 까지 첨가할 수도 있다. 예시적인 수성 완충액은 표준 인산염 완충된 염수, 트리스-완충된 염수 기타 공지의 완충액 및 세포 배지 제형들을 포함한다.

본 발명은 또한 단일쇄 및 다중쇄 다특이성 MHC 클래스 I 및 클래스 II 복합체에 관한 것이다. 이 다중 쇄 다특이성 복합체는 다음의 일반식으로 표시된다.

식 중,

a) A는 하나 이상의 sc-MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자이고,

b) B₁, B₂는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 하나 이상의 연결 분자이며,

c) C₁, C₂는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 하나 이상의 효과기 분자이거나 -H이며,

d) D는 상기 정의한 A와 동일하거나 또는 상이한 하나 이상의 sc-MHC 클래스 I 및 II 분자이거나 또는 D는 하나 이상의 리간드 연결 분자이다.

추가로 제공되는 것들은 다음의 화학식으로 표시되는 단일쇄 다특이성 MHC 클래스 I 또는 II 복합체이다: A-B₁-C₁, B₁-A-C₁, 및 A-C₁-B₁(여기서, A, B₁, C₁은 다특이성 클래스 I 및 II 복합체가 A-C₁-B₁으로 표시될 때, C₁은 H가 아님을 전제로 하여 상기 정의한 바와 같다).

상기 제공된 각각의 화학식에 관련하여, 단일선은 공유 결합(예컨대, 펩티드 결합)을 나타내는 반면, 이중선은 하나 이상의 공유 결합, 예컨대 면역글로빈 중쇄를 연결하는 것과 같은 이황화 결합을 나타내거나; 또는 이중선은 수소 결합을 나타낸다. 꺽쇠묶음은 꺽쇠묶음 분자(즉, 소단위들)의 순차적인 정렬에 있어서 신축성을 나타낸다. 따라서, 소단위들의 순서는 각각의 소단위가 의도한 기능을 수행하는 한 중요하지 않다.

상기 주목한 바와 같이, 다특이성 MHC 복합체를 나타내는 각각의 화학식에 있어서, 소단위들, A, B₁, B₂, C₁, C₂및 D는 각각 독립적으로 하나 또는 복수의 분자를 나타낸다. 이 소단위들이 복수의 분자를 나타내는 경우에, 각 분자들은 통상적으로 동일한 타입의 분자에 부착될 것이다(예컨대, sc-MHC 클래스 II 분자는 재조합에 의해 다른 sc-MHC 클래스 II 분자에 부착된다). 또한, 그러한 연결된 분자의 수는 일반적으로 약 2 내지 10, 바람직하게는 약 2 내지 5, 더욱 바람직하게는 2개의 그러한 분자, 및 가장 바람직하게는 그러한 분자 1개일 것이다. sc-MHC 클래스 II 분자는 각각 독립적으로 공유적으로 연결된 제공 펩티드를 포함하거나 또는 별법으로, sc-MHC 클래스 II 분자는 빈 것일 수 있고 적합한 제공 펩티드가 본 명세서에 기재된 방법에 따라 부하될 수도 있다. 각각의 소단위 또는 이를 포함하는 복수의 분자들은 적합한 펩티드 링커에 의해 거리를 두게 되어 원하는 바의 신축성을 증대시킬 수 있다.

본 발명에 따라, 클래스 II β2 쇄를 포함하는 그러한 다특이성 MHC 복합체의 β2 클래스 II 쇄를 변형하는 것이 간혹 바람직할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편을 다특이성 MHC 복합체에 융합시킬 수도 있다. 예를 들면, 제공된 다특이성 MHC 복합체에 관련하여 상기 화학식들에서 B₁또는 B₂는 각각 Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편, 즉 쥐 또는 인간 Cκ쇄 단편을 나타낼 수 있다. 이 실시태양에 있어서, 다중쇄 다특이성 MHC 분자는 CH₁등의 적합한 중쇄 불변 도메인 또는 그의 적합한 단편을 포함하여 복합체가 특이적 결합쌍을 형성할 수 있다.

본 발명의 다특이성 MHC 복합체는 면역글로빈으로부터 전체 또는 부분적으로 유도된 하나 이상의 연결 분자(joining molecule)를 포함할 수 있다. 복합체가 하나 이상의 연결 분자(예컨대, 다중쇄 다특이성 분자)를 포함하는 경우, 연결 분자는 동일하거나 또는 상이한 클래스(IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE 클래스)일 수 있다. 따라서, 키메릭 다특이성 MHC 복합체는 본 발명의 범위 이내에 있다. 예를 들면, 연결 분자는 면역글로빈 경쇄(κ또는 λ 타입)이거나 또는 연결 분자는 상기 나타낸 바와 같이 중쇄 불변 영역 또는 단편일 수 있다. 따라서, 예시적인 연결 분자 쌍은 C_L(κ또는 λ 타입), CH₁; CH₂CH₂; 또는 CH₃, CH₃쇄 또는 본 명세서에 기재된 분석법들에 의해 결정되는 바의 특이적 결합쌍을 형성할 수 있는 이들의 단편들을 포함한다. 기타 적합한 연결 분자들은 특이적 결합 쌍을 형성할 수 있는 나선-회전-나선 및 코일된 코일 단백질 결합 모티브를 포함한다.

면역글로빈 연결 분자들은 동물(예컨대, 마우스 또는 래트 등의 설치류) 또는 인간 기원의 것일 수 있으며 키메릭 또는 인간화된 것일 수도 있다[참조: Morrison et al., PNAS 81, 6851 (1984); Jones et al, Nature 321, 522 (1986)]. 예시적인 연결 분자들은 이하 기재하는 것과 같은 항-이디오타입 항체 뿐만 아니라 예를 들면 문헌[Linscott's Directory(40 Glen Drive, Mill Valley California 94941]에 기재되고 ATCC[American Type Culture Collection 12301 Parkloan Drive, Rockville, Md 20852]에 의해 입수되는 것과 같은 상업적으로 입수되는 항-이디오타입 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 것들을 포함한다.

본 발명의 다특이성 MHC 복합체의 예시적인 보기는 도 9A에 나타낸 이특이성 복합체이다. 이 실시태양에 있어서, 이특이성 MHC 복합체는 특이적 결합쌍을 형성하는 두 개의 sc-MHC 클래스 II 복합체 및 두 개의 Ig-C_L연결 분자를 포함한다. 몇몇 경우에는 이들이 동일하여 이특이성 MHC 복합체의 결합 강도를 증가하는 것이 바람직하긴 하지만 이 두 sc-MHC 클래스 II 펩티드 복합체는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

다른 예시적인 보기는 도 9B에 나타내었다. 이 실시태양에 있어서, 이특이성 복합체는 sc-MHC 클래스 II 복합체 및 sc-Fv 항체(간혹 "단일쇄 항체"라고도 함)을 포함한다. 리간드 연결 분자는 도 9B에 나타낸 바와 같이 단일쇄 항체일 수 있거나 또는 이것은 그의 단편 또는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로빈 가변 영역(예컨대, Fv)일 수 있다. 그러한 항원-결합 면역글로빈 단편 또는 가변 영역은 공지되어 있다[참조: Brookhaven Protein Data Bank(Brookhaven Protein Data Base, Chemistry Dept. Brookhaven National Laboratory, Upton, N.Y. (1973); Kabat, et al., 상기함].

본 발명의 다특이성 복합체에 포함시키기에 적합한 단일쇄 항체는 몇가지 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다[참조: 일반적으로, Pastan, I and Fitzgerald D., (1991) Science 254:1173; Webber, et al., Molecular Immunol. (1995), 32:249; 및 단일쇄 항체를 제조하고 사용하는 것에 관련된 개시에 대한 공개된 PCT 출원 제 WO 96/05228 및 WO 97/28191호]. 예시적인 단일쇄 항체는 당단백질 및 지질단백질 등의 세포 표면 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 것들이다. 특정 당단백질의 예로는, 이들에 한정되지 않고, CD2, CD3, CD4, CD8, CD28, CD40, CD45, CTLA4, 및 Fas를 포함한다[참조: 이들 분자에 결합하는 단일쇄 항체를 발생시키고 특성화하는 것에 관련된 Gilliland L. K., et al., (1996) Tissue Antigens 47:1].

또다른 예시적인 실시태양에 있어서, 화학식 I로 나타낸 리간드 연결 분자 D는 수용체 리간드일 수 있으며, 이 리간드는 복합체를 세포 수용체 결합 파트너에 고정시킨다. 예시적인 수용체 리간드는 FasL을 포함한다.

융합 단일쇄 항체를 포함하는 다특이성 MHC 복합체를 제조하기 위한 별법으로서, 몇몇 경우에 목적하는 항체(또는 그의 항원 결합 단편), 예컨대 단일클론 항체를 본 발명의 MHC 복합체에 커플링시키는 것이 유용할 수도 있다. 예를 들면, 그러한 접근법은 목적하는 항체 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열이 이 공지되지 않았을 때 유용할 수 있다. 통상적으로, 커플링은 문헌[G. E. and Feeney, R. E.(1974) in Chemical Modification of Proteins, Holden-Day]의 수단에 일반적으로 기재된 것과 같은 표준 단백질 커플링 반응을 포함할 것이다. 또한, 문헌[S. S. Wong (1991) in Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press]을 참조하기 바람. 예시적인 단일클론 항체는 CD28, CTLA4 또는 FAS에 특이적으로 결합하는 것들을 포함한다.

이전에 언급한 바와 같이, 본 발명은 비-면역글로빈 연결 분자를 포함하는 다특이성 MHC 복합체에 특징이 있다. 예를 들면, 제1 및 제2 연결 분자는 예를 들면, 나선-회전-나선 또는 류신 지퍼(zipper) 모티브 등의 단백질-단백질 결합 모티브를 포함하는(또는 이들로 이루어진) 단백질(또는 폴리펩티드)일 수 있다. 이들 결합 모티브의 많은 예들은 문헌[예컨대, Horberg, et al., (1993) Science 262:1401; Kamtekar, et al., (1993) Science 262:1680; Harris, et al., J. Mol. Biol. (1996) 236:1356)]에 기재되어 있다. 그러한 단백질-단백질 결합 모티브들은 일반적으로 특이적 결합 쌍을 형성하며 간혹, 예를 들면 fos, jun 등의 전사 인자에서 발견된다. 하기 실시예 14는 바람직한 비-면역글로빈 연결 분자를 개시하고 있다.

추가로, 본 발명의 다특이성 MHC 복합체는 의도한 용도에 맞게 몇가지 잘 알려진 방식으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 이 복합체들은 잘 알려진 방법에 따라 이황화-안정화시킬 수 있다(참조: 공개된 PCT 출원 제 WO 29350호).

본 발명의 MHC 분자의 분자량은 이 분자가 가용성이거나 또는 전체의 길이(막결합된 것을 포함함) 및(또는) Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄의 단편이 MHC 분자에 대한 융합을 위해 선택되는지를 포함하는 몇가지 변수에 따라 다르다. 가용성 MHC 클래스 II 융합 복합체는 일반적으로 약 45 kDa 이상의 분자량을 가질 것이며, 성숙한 막내외 및 세포질 도메인이 없는 α 및 β 쇄들은 약 20 kDa 이상, 더욱 통상적으로는 약 21 내지 약 26 kDa 사이의 분자량을 가질 것이다. 통상적으로, 막내외 및 세포질 도메인이 없는 성숙한 단일쇄 MHC 클래스 II 복합체는 약 48 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량을 가질 것이다. 전체 길이(막 결합된) 분자에 대해서, 성숙 α 및 β쇄들은 일반적으로 약 25 kDa, 바람직하게는 약 26 내지 약 30 kDa의 분자량을 가질 것이다. 통상적으로, 단일 (α 또는 β쇄에 연결된) 막내외 또는 막 앵커 도메인을 갖는 성숙 단일쇄 MHC 클래스 II 융합 분자들은 일반적으로 약 49 kDa, 바람직하게는 약 50 내지 약 52 kDa의 분자량을 가질 것이다. 상기 언급한 모든 분자량은 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 측정될 수 있다.

다가 sc-MHC 복합체는 다수의 적용에 바람직하다. MHC-항원성 펩티드 복합체의 결합가(valence)는 T-세포 수용체 상의 복합체에 영향을 미친다. 예를 들면, 3DT52.5T-세포 하이브리도마의 활성화는 다가로 제조된 MHC-항원성 분자를 요한다. 일가, 가용성 MHC 복합체는 이 T-세포를 자극시킬 수 없다[참조: J. McCluskey et al., J. Immunology, 141:1451-1455 (1988). 목적하는 다가 MHC 복합체는 면역글로불린, 예, IgG, IgM 또는 Fab'2에 연결된 것들을 포함한다. 화학적으로 가교된 MHC 융합 복합체(예를 들면, 덴드리머(dendrimer)에 가교된)는 또한 다가 종(species)에 적합하다. 예를 들면, MHC 복합체는 Cys 또는 His 등의 화학적으로 반응성인 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 코딩하는 서열을 포함시킴으로써 유전적으로 변형시킬 수 있다.

그러한 화학적으로 반응성인 측쇄를 갖는 아미노산 잔기는 MHC 융합 복합체의 다양한 위치, 바람직하게는 MHC 융합 복합체의 제공 펩티드 및 결합 도메인으로부터 멀리 위치시킬 수 있다. 예를 들면 제공 펩티드로부터 먼 MHC 분자의 β쇄의 C-말단은 그러한 반응성 아미노산(들)을 포함해도 좋다. 적합한 측쇄를 사용하여 둘 이상의 MHC 복합체를 적합한 덴드리머(dendrimer) 입자에 화학적으로 연결시켜 다가 MHC 복합체를 얻는다. 덴드리머는 이들의 표면의 다수의 상이한 기들 중 임의의 하나를 가질 수 있는 합성한 화학적 중합체들이다[참조: D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26:91:101 (1993)]. 본 발명에서 사용하기 위한 덴드리머는 예를 들면 시스테인 잔기들을 연결할 수 있는 E9 스타버스트(starburst) 폴리아민 덴드리머 및 E9 컴버스트(comburst) 폴리아민 덴드리머를 포함한다.

본 발명의 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 세그먼트는 몇가지 재조합 기술에 의해 적합한 DNA 벡터 내로 삽입시킬 수 있다. 융합된 제공 펩티드를 포함하는 그러한 복합체들에 대하여, 제공 펩티드를 코딩하는 DNA는 천연원으로부터 DNA를 단리하거나 또는 공지의 합성 방법, 예컨대 인산염 트리에스터법에 의해 얻을 수 있다[참조; 예를 들면, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. Gait, et., 1984]. 합성 올리고뉴클레오티드들도 또한 상업적으로 입수가능한 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 제조할 수 있다. MHC 복합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 제공 펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 직접적으로 연결시킬 수 있거나, 더욱 통상적으로는 상기 논의한 바의 링커 서열을 코딩하는 DNA 서열을 MHC 분자를 코딩하는 서열 및 제공 펩티드를 코딩하는 서열 사이에 배치시켜 적당한 리가아제를 사용하여 연결시킬 수 있다.

다른 뉴클레오티드 서열도 또한 DNA 세그먼트에 포함시킬 수 있다. 예를 들면, MHC 복합체를 코딩하는 서열의 발현을 조절하는 프로모터 서열, MHC 복합체를 세포 표면 또는 배양 배지에로 안내하는 리더 서열을 구조물에 포함시키거나 구조물이 삽입된 발현 벡터 내에 제공할 수 있다. 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 등의 면역글로불린 또는 바이러스 프로모터를 포함한다. 이후의 실시예를 참조하기 바람. 강한 번역 개시 서열을 또한 구조물 내에 삽입시켜 번역 개시의 효율을 증대시킬 수 있다. 바람직한개시 코돈은 코작(Kozak) 공통 서열 (CCACCATG)(서열 번호: 1)을 포함한다.

바람직하게는 DNA 구조물 중에 삽입된 리더 서열은 효율적으로 위치된 제한 부위를 함유하여 목적하는 제공 펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 필요하다면 MHC 복합체에 부착시킬 수 있다. 적합하게는 제한 부위를, 본 명세서에서 때때로 접합 서열(junction sequence)이라고도 하는, 예를 들면 제공 펩티드에 대한 코딩 영역의 앞에 위치된 약 2 내지 10 코돈의 리더 서열의 3-말단에 혼입시킬 수 있다. 예시적인 제한 부위는, 다른 절단 부위도 역시 제공 펩티드의 코딩 영역의 앞에 혼입시킬 수 있으나, AflII 부위이다. 상기 논의한 바와 같이, 통상적으로 링커를 코딩하는 서열의 시작부에 위치된 제2 제한 부위와 함께 그러한 제한 부위의 사용은 다양한 제공 펩티드를 코딩하는 서열을 MHC 복합체에 대한 DNA 구조물 내로의 신속하고 직접적인 삽입을 가능하게 한다. 예시적인 리더 서열은 강한 번역 개시 부위 및 그들의 mRNA의 3'-말단에서 cap 부위를 포함한다. 예를 들면, 리더 서열은 클래스 II MHC 분자의 β1 도메인에 부착시킬 수 있다. 바람직한 리더 서열은 MHC 융합 복합체의 분비성 발현을 제공한다.

특정 sc-MHC 클래스 II 구조물의 예는 서열 중에: β쇄 리더/제공 펩티드/링커 서열/β1-Δβ2쇄/단일쇄 링커 서열/α1-α2쇄; β쇄 리더/제공 펩티드/링커 서열/β1-Δβ2쇄/단일쇄 링커 서열/α1-α2쇄/Ig-C_L쇄; β쇄 리더/제공 펩티드/링커 서열/β1-β2쇄/단일쇄 링커 서열/α1-α2쇄/Ig-C_L쇄;(여기서, Δ(델타) 부호는 상기한 바와 같이, β2 클래스 II 쇄 변형, 바람직하게는 본질적으로 전체 β2쇄 까지의 및 이를 포함하는 β2 클래스 II 쇄 결실을 나타낸다)을 코딩하는 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. sc-MHC 클래스 II 구조물의 추가의 예로는 Ig-C_L쇄를 적합한 Ig-C_L쇄 단편으로 치환한 것을 제외하고는 바로 앞서 언급한 연결된 뉴클레오티드 서열이 있다. MHC DNA 서열들은 본 명세서에 기재된 구체적인 발현계를 포함하는 박테리아, 바큘로바이러스-곤충 세포 및 포유류 발현계 내로 적절히 도입시킨다. 이어서 MHC 복합체들을 발현하고 필요하다면 정제하여 실질적으로 순수한 MHC 복합체를 얻는다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 MHC 복합체들은 클래스 II β2 쇄 변형 및(또는) Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편 융합을 포함하는 그러한 복합체들을 포함하여 완전히 가용성이고 기능성인 분자들의 발현을 촉진시킨다. 그러나, 필요에 따라, MHC 복합체들은 세포막, 예컨대 면역 세포막의 일부로서 제공될 수도 있다. MHC 복합체의 막-결합 형태를 제조하고 이용하는 방법은 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 호에 기재되어 있다.

본 발명의 MHC 복합체의 두 쇄를 발현하는 단일 발현 벡터를 제작하는 것이 바람직할 수 있는데, 예를 들면, MHC 융합 복합체의 α 및 β쇄 모두를 코드하는 서열을, 단일쇄 분자는 아니더라도, 단일 발현 벡터에 연결시킨다. 그러한 발현 벡터는 별도의 벡터를 MHC 복합체의 각 쇄에 사용하는 경우, 특히 벡터가 도입된 세포에 대하여 선별히 어려운 경우에 비하여 더 나은 결과를 제공할 수 있다.

MHC 복합체의 두쇄(예컨대, 다특이성 MHC 복합체) 뿐만 아니라, 기타 동인(agents), 특히 B7 또는 B7-2 등의 T-세포 동시자극 인자를 코드하는 단일 발현 벡터를 제조하는 것이 또한 바람직할 수 있는데, 예컨대 MHC 복합체의 두 쇄를 코드하는 서열 및 동시자극 인자를 코드하는 서열 각각을 단일 발현 벡터에 연결하여 단일 형질전환 절차를 가능하게 할 수 있다. 재차, 이 접근법은 2회 이상 형질전환되거나 형질감염된 세포에 대한 잠재적으로 어려운 선별을 피할 수 있다.

본 발명의 다특이성 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 벡터의 예로서, DNA 벡터는 적합한 연결 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트를 함유할 수 있으며, 이 DNA 세그먼트는 예컨대, 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드를 포함하는 sc-MHC 클래스 II 분자를 코딩하는 다른 DNA 세그먼트의 5' 또는 3' 말단에 재조합 기술에 의해 연결시킨다. 이 DNA 서열은 필요에 따라 임의로 효과기 분자를 코딩하는 서열에 융합시켜도 좋다. 바람직한 연결 분자들은 다른 면역글로빈 경쇄 또는 중쇄 불변 영역에 특이적으로 결합할 수 있고 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 결정된 바의 약 20 내지 30 kDa 사이의 분자량을 갖는 면역글로빈 경쇄 또는 중쇄 불변 영역으로 부터 유도되는 것이 좋다.

본 발명의 다특이성 MHC 복합체는 하나 이상의 전략을 병합하여 생성시킬 수 있다. 예시적인 예로서, 이특이성 MHC 복합체는 적합한 세포 중에서 상기 정의한 바의 1) A-B₁-C₁쇄를 코딩하는 DNA 발현 벡터, 2) D-B₂-C₂쇄를 코딩하는 DNA 분자를 동시 발현시킴으로서 제조할 수 있다. 연결 분자가 면역글로빈으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유도된 경우에는, 면역글로빈 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 발현 벡터를 제조하고 사용하는 적합한 방법들을 사용할 수 있다[참조: 예를 들면, Near et al. Mol. Immunol. 30, 4, 369 (1993); Near et al. Mol. Immunol. 27, 901 (1990)]. 별법으로, 이특이성 MHC 복합체는 각 단일쇄를 코딩하는 DNA 세그먼트를 포함하는 단일 DNA 벡터에 의해 코딩시킬 수 있다.

또한 앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 MHC 복합체는 연구, 임상 및 상업적인 용도를 포함한 다양한 적용에 적합한 킷트의 형태로 제공될 수도 있다. 예를 들면, 그러한 킷트는 본 발명에 따라 목적하는 세포 표면 분자를 포함하는 세포 등의 목적하는 구조의 검출에 사용될 수 있다. 특히 관심있는 것은 목적하는 TCRs를 포함한 T-세포 등의 면역 세포 또는 기타 수용체, 당단백질, 지질단백질 등의 기타 세포 표면 분자 또는 tag 또는 항체, 예컨대 단일클론 항체로 표지된 세포들이다. 일반적으로 이 킷트는 원하는 결합 특이성 또는 본 명세서에 기재된 다특이성 MHC 복합체의 경우에 하나 이상의 원하는 결합 특이성에 특징이 있는 하나 이상의 본 발명의 MHC 복합체를 포함할 것이다. 적합한 수성 완충액은 통상 예컨대, 하나 이상의 MHC 복합체를 개체에 투여하거나 또는 생물학적 시료에 있어서 MHC 복합체 및 목적하는 표적 구조 사이의 특이적 결합 반응을 수행하기 위해 제공될 것이다. 필요에 따라, 이 킷트는 비결합 형태 또는 목적 고상 지지체 상에 고정화된 형태의 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 MHC 복합체를 포함할 수 있다. 별법으로, 이 킷트는 본 명세서에 기재된 검출 가능한 표지로 복합체를 표지시키는데 필요한 지시 사항을 포함해도 좋다.

PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 기재되어 있는 바와 같이, 다수의 전략을 이용하여 본 발명의 MHC 복합체를 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 기재된 MHC 유전자 융합 구조물을 제한 효소를 사용하여 구조물의 삽입을 위한 벡터내의 절단부를 만들고 이어서 연결시키는 것과 같은 공지의 수단에 의하여 적합한 벡터내로 혼입시킬 수 있다. 이어서 유전자 구조물을 함유하는 벡터를 MHC 복합체의 발현을 위한 적합한 숙주 내로 도입시킨다. 일반적으로 상기한 Sambrook et al.,을 참조 바람. 적합한 벡터의 선별은 클로닝 프로토컬에 관련된 요소들에 기초하여 실험적으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 벡터는 사용되는 숙주에 혼화성이어야 하고 이에 대한 적절한 리플리콘(replicon)을 가져야 한다. 또, 벡터는 발현되는 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 서열을 수용할 수 있어야 한다.

가용성 MHC 융합 복합체를 제조하기 위한 한 바람직한 프로토컬에 있어서, MHC 분자(클래스 II)의 제공 펩티드 및 β1-β2 쇄들을 코딩하는 DNA 서열들을 제공 펩티드의 C-말단이 β1 도메인의 첫 아미노산, 바람직하게는 신축성 링커 서열에 의해 β1 도메인의 첫 아미노산에 부착되게 배열시킨다. 그러한 구조는 하기 도 4에 나타냈다. 클래스 I MHC 분자에 대하여, 바람직하게는 제공 펩티드를코딩하는 DNA 서열을 MHC 분자의 α 도메인에 바람직하게는 제공 펩티드가 α쇄의 N-말단에 연결될 수 있도록 부착시킨다. 앞서 논의한 바와 같이, 바람직하게는 제한 효소 부위를 리더 서열의 말단 및 링커의 시작 사이에 공학적으로 발생시켜 본질적으로 목적하는 제공 펩티드(즉, 항원성 또는 길항질)를 코딩하는 임의의 올리고뉴클레오티드를 β쇄 유전자에 부착시킬 수 있다.

이전에 기술한 바와 같이, β2 클래스 II 쇄를 변형시키고 및(또는) Ig-C_L쇄 또는 단편을 MHC 복합체에 융합시켜 가용성 발현을 촉진시킬 수 있다. 발현된 MHC 복합체는 공지의 방법에 따라 단리하여 정제할 수 있다. 예를 들면, 한 특별한 방법에 있어서 배양 배지를 원심분리한 후, 이어서 상층액을 친화 또는 면역친화 크로마토그래피, 예컨대 단백질-A, 단백질-G 친화 크로마토그래피 또는 연결된 MHC 또는 그의 면역글로불린 영역 등의 발현된 융합 복합체와 결합하는 단일클론 항체들의 사용을 포함하는 면역친화 프로토컬에 의해 정제한다. 예를 들면, 인간 HLA-DR1 서열을 포함하는 MHC 융합 복합체는 일반적으로 알려지고 문헌[참조, 예컨대 Harlow, E. et al., Antibodies, A Laboratory Manual (1988)]에 기재된 절차에 의해 단일클론 항체 L243-세파로스 칼럼 상에서 친화 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 이 L243 단일클론 항체는 적절히 겹친 HLA-DR1 분자의 형태학적인 에피토프에 특이적이며[참조: J. Gorga et al., J. Biol. Chem., 262:16087-16094], 따라서 생물학적으로 활성인 MHC 융합 복합체를 정제하는데 바람직하다. 이 MHC 복합체는 또한 정제를 돕기 위한 서열을 포함해도 좋다. 예를 들면, 6xHis 및 EE tags의 사용을 기재하고 있는 후술하는 실시예 7 및 도 4A를 참조 바람.

단일 쇄 MHC 복합체는 상기 및 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 논의된 것 뿐만 아니라 실시예 1 내지 8을 포함한 이후의 실시예에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 MHC 단백질을 코딩하는 DNA를 적합한 세포주로부터 얻고, 단리된 유전자를 PCR 또는 다른 수단에 의해 증폭시킬 수 있다. MHC 클래스 II 분자의 경우에, α1-α2 유전자 단편을 벡터 내에 클로닝시키고, 이어서β1-β2 도메인에 대한 유전자 단편을 삽입된 단일쇄 링커 서열과 함께 클로닝시킬 수 있다. 이어서 단일 벡터를 적합한 숙주 내에서 발현시키고 단일쇄 분자를 수확하고 필요에 따라 정제한다. 후술하는 실시예 1 - 8을 참조 바람. 또한 단일쇄 항체의 제조에 관하여 논의한 Ladner et al.,에 허여된 미국특허 제 5,260,203호를 참조 바람: 여기에 기재된 방법은 본 발명의 단일쇄 MHC 융합 복합체에 일반적으로 사용될 수 있다.

예시적인 제조 방법에 있어서, MHC 클래스 II 분자의 α 및 β 쇄의 코딩 영역을, 특히 B 세포주 또는 다른 MHC 분자 원으로부터 PCR에 의해 코딩 영역을 단리함으로써 얻는다. 단일쇄 β-α 융합 MHC 융합 분자를 코딩하는 서열은 β쇄 유전자의 막내외부에 걸친 도메인을 코딩하는 서열들을 β쇄자를 성숙α쇄 (특히, α쇄 유전자의 첫 번째 코돈에) 연결하는 상기 논의한 바의 단일쇄 링커 서열로 대체함으로써 제작할 수 있다. α쇄 유전자는 적합하게는 단일쇄 융합 복합체의 막 결합 발현을 위한 막내외 영역을 포함하거나 또는 α쇄 유전자는 단일쇄 MHC 융합 복합체의 가용성 발현을 위한 세포외 영역의 말단에서 끝부분이 절단될(truncated) 수 있다. 제공 펩티드에 대한 적합한 제한 부위 및 링커는 바람직하게는 β쇄 리더 및 β쇄의 제1 코돈 사이에 포함되는 것이 좋다. 상기 제공한 바와 같이, 클래스 II β2 쇄를 결실시켜 가용성 발현을 촉진할 수 있고, 그 경우에 β1 쇄는 단일쇄 링커에 연결될 것이다.

별법으로, 또는 추가로 생성된 구조물은 적합합 Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편을 분자에, 바람직하게는 β쇄를 코딩하는 말단에 융합시킴으로써 더 변형시킬 수 있다. 이어서, 본질적으로 임의의 제공 펩티드의 코딩 영역을 올리고뉴클레오티드로서 생성된 제한 부위에 도입시킬 수 있다. 이어서 이 구조물을 본 명세서에 개시된 특정 프로모터를 포함하는 포유류 또는 세균성 프로모터의 조절하에 적합하게 위치시킬 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편의 융합은 목적하는 Ig-C_L쇄 또는 단편을 코딩하는 적합한 벡터내에 연결시킴으로서 성취할 수 있다[참조: 예를 들면, Near, et al., (상기함) 및 후술하는 적합한 벡터의 논의에 대한 실시예].

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 MHC 복합체는 다양한 효과기 분자들을 포함할 수 있다. 적합한 효과기 분자들은 목적하는 생물학적, 화학적 또는 물리학적 특성을 MHC 복합체에 부여하는 것들을 포함한다. 더욱 구체적으로, 효과기 분자들은 예컨대 식물 또는 세균 기원의 세포 독소, 예를 들면 디프테리아 독소(DT), 시가 독소, 아브린, 콜레라 독소, 리신, 사포린, 슈도모나스 외독소(PE), 미국자라공 항바이러스성 단백질 또는 겔로닌 등일 수 있다. 그러한 독소의 생물학적으로 활성인 단편은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 DT A 쇄 리신(ricin) A를 포함한다. 부가적으로, 이 독소는 예를 들면 포스포리파아제 효소(예, 포스포리파아제 C) 등의 세포 표면에서 활성인 동인일 수 있다. 또다른 예로서 효과기 분자는, 예를 들면 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메쏘트렉세이트, 아드리아마이신, 블레오마이신 또는 시스플라틴 등의 화학요법약일 수 있거나 또는 부가적으로 효과기 분자들은 예컨대 요오드-131, 이트륨-90, 레늄-188 또는 비스무드-212 등의 방사선핵종일 수 있다[참조: Moskaug, et al. J. Biol. Chem. 264, 15709 (1989); Pastan, I. et al. Cell 47, 641, 1986; Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61, 331, (1992); "Chimeric Toxins" Olsones and Phil, Pharmac. Ther., 25:355 (1982); 공개된 PCT 출원 제 WO 94/29350 및 WO 94/04689; 미국 특허 제 5,620,939호; 각각은 본 명세서에 참고로 인용함].

적합한 효과기의 또 다른 예는 생리학적 pH에서 하전을 갖는 예컨대 6xHIS 등의 폴리펩티드인 단백질 tag이다. 이 경우에 있어서, MHC 복합체를 정제하기 위한 적합한 합성 매트릭스는, 필요에 따라, 예컨대 Ni-세파로오스 등의 상업적으로 입수가능한 메탈로-세팔로오스 또는 약 6-9의 pH에서 6xHIS와 결합할 수 있는 다른 적합한 매트릭스일 것이다. EE 에피토프 및 myc 에피토프는 적합한 단백질 tag의 또다른 예로서, 이 에피토프들은 하나 이상의 상업적으로 입수가능한 단일 클론 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있다. 일반적으로, 항체, 바람직하게는 상업적으로 입수 가능한 단일클론 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 다양한 에피토프는 본 발명의 MHC 복합체의 tag로서 작용할 수 있다.

본 발명의 일부 실시태양에 있어서, 단백질 tag를 예를 들면, 트롬빈 또는 뱀 독액 프로테아제 절단 부위 등의 화학적 또는 프로테아제 절단 부위에 융합시켜 tag(또는 tag에 융합되는 기타 MHC 소단위)를 제어된 양상으로 제거할 수 있다.

이상으로부터 일부의 경우에 있어서 단백질 tag와 같은 효과기 분자는 또한 연결 분자일 수 있음이 이해될 것이다. 효과기 분자는, 예컨대 SPDP, 카르보디이미드, 등의 헤테로이관능성 단백질 가교제의 수단에 의해 MHC 복합체에 접합시킬 수도 있다[참조: Meany and Feeney, 상기함; Wong, 상기함].

일부 응용을 위해 본 발명의 MHC 복합체를 비재조합 방식으로 변형시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들면, 이는 비록 간혹 이 시약은 필요에 따라 복합체에 재조합 기술에 의해 융합될 수도 있으나 목적하는 동인의 접합(conjugation)에 의해 성취될 수 있다. 예를 들면, MHC 복합체는 예를 들면 방사선핵종에 결합할 수 있는 약물, 효소, 호르몬, 킬레이트제 또는 질병의 진단 및 치료에 유용한 기타 단백질 및 폴리펩티드 등의 상기한 것들 이외에 다양한 제약학적 약물을 포함할 수 있다. 진단 목적으로, MHC 복합체는 표지시키거나 또는 표지시키지 않을 수 있다. 예를 들면, 방사선 핵종, 형광제, 효소, 효소 기질, 효소 조인자, 효소 억제제, 리간드, 예컨대 합텐 등의 다양한 표지들을 적합하게 이용할 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에는 본 발명의 MHC 복합체의 소단위를 융합된 펩티드 링커 서열을 포함시킴으로써 신축성 있게 위치시킬 수 있다. 몇가지 적합한 펩티드 링커 및 이들을 시험하는 방법들이 기술되어 있고 이 복합체들에 사용하도록 용이하게 채택될 수 있다. 또한, 일부의 경우에 동인을 잘 알려진 기술에 따라 MHC 복합체에 융합된 펩티드 링커를 부가하는데 유용할 수 있다. 유용한 동인의 예로는 예컨대, 염료 또는 형광제; 효소(예, β-갈락토시다아제, 알칼린 포스파타아제, 양고추냉이 퍼옥시다아제; 이들 효소는 광도계에 의해 검출가능한 표지를 형성할 수 있다) 등의 광도계에 의해 검출 가능한 표지를 포함한다. 적합한 분광계에 의해 검출 가능한 표지에 대한 논의를 위해 일반적으로 미국 특허 제 5,434,051호를 참조 바람. 별법으로, 동인들은 펩티드 링커를 수반하지 않는 다양한 다른 수단에 의해 본 명세서에 개시된 다특이성 MHC 복합체에 접합시킬 수 있으며, 이들 수단의 일부는 아래에 설명한다.

또한, 본 발명의 MHC 복합체는 필요에 따라 후번역 단계에서 예컨대 탄수화물 또는 지방산 첨가에 의해 변형시킬 수 있다. 예를 들면, MHC 복합체는 글리코실화에 의해 변형시킬 수 있다. 단백질 상의 글리코실화 부위는 당 업계에 공지되어 있으며 통상적으로는 N-연결된(아스피린-연결된) 또는 O-연결된(세린- 또는 쓰레오닌-연결된) 것 중 어느 하나일 수 있다. 그러한 글리코실화 부위는 MHC 복합체 단백질 서열의 검사에 의해 용이하게 확인할 수 있다. MHC 복합체는 예를 들면, SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 입증되는 바와 같이 적당한 진핵 세포에 의해 글리코실화시킬 수 있다. SDS-PAGE 겔 전기영동 및 기타 관련된 방법들은 예컨대 효소적 분해 등의 통상의 생화학적 기술과 병용하여 본 발명의 MHC 복합체에 결합된 탄수화물을 검출할 수 있다. 바람직한 분해 효소의 예로는 예컨대 New England Biolabs(Beverly MA)으로부터 입수가능한 엔도글리코시다아제 및 엑스글리코시다아제이며 제조자의 지시에 따라서 사용한다. 따라서, 본 발명의 MHC 복합체는 탄수화물의 존재, 특히 올리고당 그룹의 존재에 대하여 용이하게 분석할 수 있다.

일부 경우에 있어서, 본 발명의 실질적으로 순수한 MHC 복합체를 글리코실화된 형태로 얻는 것이 유용할 수 있다. 특히, 그러한 글리코실화된 MHC 복합체는 치료제로서 투여되었을 때 어떤 환경에서는 더 적은 생체내 분해를 나타냄으로써 계산 반감기를 증가시킨다[참조: Goto, M. et al. Bio/Technology 6:67 (1988)]. 따라서, 본 발명의 방법은 실질적으로 순수한 글리코실화된 MHC 복합체를 대규모로 얻는데 아주 적합하다.

본 발명의 MHC 복합체는 필요에 따라 하나 또는 복합 기술에 의해 정제할 수 있다. MHC 복합체의 생산을 위한 예시적인 방법은 복합체를 발현할 수 있는 세포에서 발현을 포함한다. 예를 들면, MHC 복합체는 MHC 복합체를 곤충 세포, 예컨대 바큘로바이러스-기초 단백질 발현계에서 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 하기 실시예 5를 참조하기 바람. 적합한 곤충 세포는 스포돕테라 프레우기페르다(Spodoptera freugiperda, 예, SF9 세포) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni, 참조: Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New York, 1989; Summer and Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedure: Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555, College Station, Texas (1988); D.r. O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman ＆ Co., New York (1992)]로부터 유도된 세포 등의 바쿨로바이러스에 의해 감염될 수 있는 것들을 포함한다. 적합한 곤충 세포는 또한 바람직하게는 외래 단백질을 예컨대 스피너 플라스크, 회전 병, 다중 조직 배양 플레이트, 생물반응기 또는 발효기 등에서 대규모로 생성할 수 있다.

본 발명의 MHC 복합체를 곤충 세포에서 발현시키는 것 이외에, 포유류 세포 등의 기타 진핵 세포도 MHC 복합체를 생산하는데 사용할 수 있다. 이 경우에 대하여는 하기 실시예 6을 참조하기 바람. 일반적으로, 이 방법은 MHC 복합체를 코딩하는 적합한 포유류 발현 벡터를 포유류 세포내에 도입시키고 세포를 MHC 복합체의 생산을 지지하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 적합한 포유류 세포는 바람직하게는 외래 단백질을 예컨대 스피너 플라스크, 회전 병, 다중 조직 배양 플레이트, 생물반응기 또는 발효기 등에서 대규모로 생성할 수 있는 것들이다.

본 명세서에서 사용된 바의 용어, "벡터"(발현 벡터를 포함함)는 숙주 세포 내로 혼입된 목적하는 핵산의 발현을 초래할 수 있는 임의의 목적하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 예를 들면, 선형 핵산 서열, 플라스미드, 코스미드, 파아지미드 및 염색체외 DNA를 포함할 수 있다. 구체적으로, 벡터는 재조합 DNA 일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바의 용어, "발현", 또는 "유전자 발현"은 DNA의 전사 및 RNA 전사물의 번역을 포함하는 목적하는 핵산 서열의 단백질 생성물의 생산을 의미한다.

본 발명의 MHC 복합체를 발현하기에 적합한 기타의 세포는 예를 들면, 대장균(E. coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등의 원핵생물; 및 예를 들면 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 및 에스. 폼베(S. pombe) 등의 동물 세포 및 효모 균주 등의 기타 진핵 생물을 포함한다. 포유류 세포가 간혹 바람직한데, 그 예로서는 J558, NSO, COS, CV-1, SP2-O, CHO, HeLa, p3-X63Ag8 또는 골수종 세포 등을 들수 있다. 후술하는 실시예 4 내지 6 참조.

본 명세서에 기재된 특정 세포 이외에도, 다른 세포를 MHC 복합체를 발현하는 능력에 대해 시험할 수 있다. 일반적으로, 거의 모든 식물, 곤충, 포유류, 세균, 균류 또는 효모 세포를 바람직하게는 대규모로 본 명세서에 기재된 MHC 복합체를 발현하는 능력에 대해 시험하는 것이 가능하다.

예를 들면, 세포에 대해서 본 발명의 MHC 복합체의 발현 여부를 시험하는 한 방법은 다음과 같다. 단백질 발현 실험은 바람직하게는 적합한 벡터 중의 목적하는 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 서열을 세포 내로 예컨대 형질전환 또는 형질감염에 의해 도입시킴으로써 수행한다. 목적하는 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 서열을 도입시킨 후, 숙주 세포를 MHC 복합체를 생산에 유리한 조건 하에서 배양시킨다. 이어서 단백질 발현을 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블롯 또는 SDS-PAGE 겔 전기영동에 의해 모니터링하여 세포가 세포 또는 세포 배지 중에서 적절한 예정된 분자량을 나타내는 MHC 복합체를 발현하는지의 여부에 대해 결정한다. 일반적으로, 적합한 세포는 예컨대 ELISA 또는 SDS-PAGE 겔 에 의해 결정된 바의 일일 약 1 ng/1 X 10⁶세포 내지 일일 약 1000 ng/1 X 10⁶세포 이상을 생산할 수 있을 것이다.

몇몇 경우에 있어서, 본 발명의 MHC 복합체를 적합한 진핵 세포 중에서 일시적으로 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면 진핵 세포가 곤충 또는 포유류 세포일 경우, 적합한 DNA 발현 벡터의 수단에 의해 MHC 복합체를 일시적으로 발현시키는 것이 유용할 수 있다.

본 명세서에 기재된 MHC 복합체를 발현시키는 적합한 벡터의 선별은 리스트 적합성(compatibility)에 관계된 요인들에 기초하여 실험적으로 행할 수 있다. 예를 들면, 벡터는 사용되는 숙주에 대한 적절한 리플리콘과 양립성이 있어야 하고 이를 가져야 한다. 또한 벡터는 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 서열을 수용할 수 있어야 한다. 특히 본 발명의 다특이성 MHC 복합체에 관련하여, 벡터는 다특이성 복합체의 일부, 예컨대 그의 절반 또는 원하는 바의 다른 미리-선택한 부분을 코드할 것이다.

더욱 구체적으로 세균에서 복제를 위한 적합한 벡터는 예를 들면, 일반적으로 (i) 대장균에서 기능적이고, 예를 들면 pBR322, 바람직하게는 잘 알려진 pUC19 벡터로부터 유도된 복제 기점, (ii) 선별가능한 항생제 내성 유전자, 예컨대 앰피실린 및(또는) 네오마이신 내성 유전자, (iii) 전사 종결 영역, 예컨대 대장균 trp 오페론의 종결 영역, (iv) 전사 프로모터, 예컨대 phoA, tac, tac-lac, lacZ, lac^uvs, T7, 또는 T3 프로모터, (v) 리더 서열, 예컨대 pelB 또는 ompA 리더, (vi) 목적하는 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 세그먼트, 및 (vii) 전사 종결 인자, 예컨대 대장균의 리보솜의 RNA로 부터의 T1T2 서열을 포함한다. 이미 언급한 바와 같이, MHC 복합체는 본질적으로 전체 쇄의 결실과 같은 변형된 클래스 II β2 쇄를 포함하고 및(또는) MHC 복합체는 쥐 또는 인간 Cκ쇄 단편 등의 융합된 Ig-C_L쇄를 포함할 것이다.

본 발명자들은 본 발명의 MHC 복합체의 가용성 발현은 특정 유도 조건에 의해 세균에서 촉진될 수 있음을 발견하였다. 용어 "유도 조건"은 필수 영양소(예, 아미노산 또는 인산염 등의 무기염)가 배지로부터 고갈됨으로써 MHC 복합체를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 특정 프로모터의 발현을 유도하는 배양 조건을 의미한다. 따라서, 세균용 발현을 위한 MHC 복합체를 코딩하는 벡터 또는 세그먼트는 이들 유도 조건 하에서 발현을 최적화하도록 구성하는 것이 바람직하다. 특히 유도 조건하에서 배양될 수 있는 숙주 세포의 예는 후술하는 실시예에 제공되는 세균을 포함한다.

예를 들면, 하기 phoA 프로모터는 인산염이 고갈된 유도 조건 하에서 세균에서 MHC 복합체를 발현시키기 위한 특히 적합한 요소의 일례이다. 후술하는 실시예 4 참조 바람. 강한 번역 개시 서열을 또한 구조물 내에 포함시켜 번역 효율을 증대시킬 수 있다. 일반적으로 phoA 프로모터의 유도는 배지에서 인산염이 소모될 때 신속히 개시된다.

MHC 복합체를 코딩하는 DNA 벡터들은 연장된 성장 기간에 걸쳐 숙주 세포를유도함으로써 세균 세포에서 발현시킬 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 본 발명자들은 대략 2 내지 8 시간, 바람직하게는 4 내지 6 시간에 걸친 유도가 MHC 복합체의 발현을 증대시키는 것으로 나타남을 발견하였다. 예를 들면, 목적하는 MHC 복합체를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 phoA 프로모터(강한)를 포함하는 DNA 벡터를 제조하였다. 하기 실시예 3 및 4 참조. 이어서 숙주들을 이 DNA 벡터로 형질전환시키고 숙주 세포의 배지에서 인산염을 몇시간에 걸쳐서 일반적으로 약 2 내지 10 시간, 더욱 일반적으로는 4 내지 6 시간 에 걸쳐서 배지로부터 고갈되게 하였다. 배지 인산염이 고갈되었을 때 강력한 phoA 프로모터가 유발되어 유의하게 증가되는 양의 가용성이고 완전히 기능성인 MHC 복합체를 유발하는 것이 밝혀졌다.

추가의 DNA 벡터들을 설계하여 진핵 세포에서 MHC 복합체를 발현시킬 수 있다. 예시적인 DNA 벡터들은 바람직하게는 세균 숙주에서 복제용으로 구성하여 적합한 양의 DNA 벡터를 얻을 수 있다.

예를 들면, DNA 벡터들은 일반적으로 (i) 대장균에서 기능적인 복제 기점, (ii) 선별가능한 항생제 내성 유전자, (iii) 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 등의 강력한 바이러스 프로모터 및 임의의 면역증강제 요소, (iii) 목적하는 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 세그먼트, (iv) 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 예컨대 송아지 성장 호르몬(bgh) 폴리A 서열 및 (v) 바이러스 폴리아데닐화 서열(예, SV40 폴리A 서열)에 융합된 항생제 내성 유전자(예, 네오마이신)에 연결된 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터 등의 강력한 바이러스 프로모터 등의 선별 진핵성 마커를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다. 적합한 DNA 벡터들은 하기 실시예 6에 개시되어 있다. 이미 언급한 바와 같이, MHC 복합체는 간혹 바람직하게는 본질적으로 전체 쇄의 결실과 같은 변형된 클래스 II β2 쇄를 포함하고 및(또는) MHC 복합체는 쥐 또는 인간 Cκ쇄 단편 등의 융합된 Ig-C_L쇄 또는 적합한 Ig-C_L쇄 단편을 포함할 것이다.

목적하는 포유류 세포에서 사용하기 위한 본 발명의 DNA 벡터는 통상의 기술에 따라 변형하여 하나 또는 다수의 다른 포유류 세포에서 가용성 발현을 최적화시킬 수 있다. 예를 들면, 상기한 바의 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 진핵성 마커를 예를 들면, 티미딘 키나아제(TK) 유전자를 코딩하는 DNA로 대체하여 TK-(TK 결핍) 포유류 세포에서 sc-MHC 융합 단백질의 발현을 촉진시킬 수 있다. 이 DNA 벡터는 당업계에 잘 알려진 다른 방식으로 변형하여(예, 프로모터의 교체, 항생제 내성 유전자, CMV 프로모터를 면역글로불린, SV40, 아데노바이러스 또는 파필로마바이러스 프로모터로 대체, 등) 목적하는 포유류 세포에서 MHC 복합체 발현을 최적화시킬 수 있다. 별법으로, sc-MHC 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 잘 알려진 효모 또는 곤충 세포에서 발현에 적합한 잘 알려진 벡터 내로 삽입시킬 수 있다[참조: Ausubel, 상기함].

포유류 세포에서 본 발명의 MHC 복합체를 발현시키기 위한 추가의 DNA 발현 벡터는 pEE13 또는 pCDN-3 벡터, 예컨대 SCE1로부터 유도된 DNA 벡터를 포함하며, 여기서 MHC 복합체는 적합한 사이토메갈로바이러스 프로모터의 하류에 위치한다. 공개된 PCT 출원이 실시예 및 하기 실시예 6을 참조하기 바람. 기타 공지된 DNA 발현 벡터를 본 발명에 따라 사용하여 MHC 복합체를 발현시킬 수 있다[예컨대, Ausubel et al, 상기함 및 Sambrook et al, 상기함, 참조].

다양한 표준 방법들을 사용하여 목적하는 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 세그먼트 또는 이것을 가진 DNA 벡터를 원하는 세포 내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, DNA 세그먼트 또는 DNA 벡터를 임의의 허용가능한 경로, 예를 들면, 통상적인 기술에 따라 인산 칼슘, 또는 DEAE 덱스트란 매개 형질감염 또는 형질전환, 바이러스 또는 파아지 감염(MHC 복합체를 코딩하는 재조합 바이러스와 함께), 리포좀-매개 전이 또는 바이오리스틱(biolistic) 전이에 의해 적합한 숙주 내로 도입시킬 수 있다[참조: 예컨대, Cockett, et al, Bio/Technology 8:662 (1990); Ausubel et al., 상기함; Sambrook et al., 상기함]. 이어서, 세포를 예를 들면, 마이크로캐리어 또는 공동섬유 배양 시스템, 현탁 시스템, 회전병, 스피너 플라스크, 생물반응기 또는 발효기 등에 관련된 배양 시스템 등의 MHC 복합체의 발현을 지지하는 조건 하에서 배양시키고, 선별된 배양 시스템을 배지, 기압 및 온도의 최적 조건하에 유지시킨다. 필요에 따라, 배양 조건을 목적하는 MHC 복합체의 대규모 생산에 최적화시킨다. 하기 실시예 4-6을 참조하기 바람.

일부 경우에, MHC 복합체를 코딩하는 벡터(선별 마커를 포함함)를 포함하는 진핵 세포를 벡터의 염색체 내로의 통합을 초래하는 조건하에서 증식시키는 것이 바람직하다. 마커의 선별에 의해 얻어지는 세포주는 MHC 복합체를 연속적으로 발현시키는 능력을 위해 특히 유용하다.

본 발명의 MHC 복합체는 다양한 클래스 I 및 클래스 II MHC 복합체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 도 1에 설명한 가용성 sc-MHC 클래스 II 펩티드 융합 분자에 관련하여, IA^dβ1-β2 및 IA^dα1-α2 클래스 II 분자는 독립적으로 다른 클래스 I(H-2 또는 HLA) 또는 클래스 II(IA, IE, DR, DQ 또는 DP) 분자로 치환해도 좋다. 별법으로, IA^dβ1-β2 및 IA^dα1-α2 클래스 II 분자는 독립적으로 클래스 I 또는 클래스 II 분자의 제공 펩티드 결합 부로 치환될 수 있다. 예를 들면, 도 4A 및 4B는 IA^d(도 3A) 또는 DR2(도 4B) 쇄를 포함하는 sc-MHC 클래스 II 분자를 나타낸다. 일반적으로 클래스 I 및 클래스 II 분자는 공지된 DNA 서열로 되어 있어서 분자(또는 그의 제공-펩티드 결합 부분)는 본 명세서에 기재된 재조합 DNA 기술에 의해 MHC 복합체의 부분을 구성할 수 있다.

더욱 구체적으로, 본 발명의 MHC 클래스 I 또는 II 분자는 예를 들면, 다발성 경화증(MS)에 관련된 HLA-DR2(DRB1*1501); 각각 류마티스성 관절염(RA)에 관련된 HLA-DQ4, HLA-DQ8, 및 HLA-DQ7; 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)에 관련된 HLA-Q8(DQB1*0302); 복강내 질병에 관련된 HLA-DQw2; SJL/J 마우스에서 실험적인 자가면역 뇌척수염에 관련된 IAs 도메인; NOD 마우스에서 자발적인 당뇨병에 관련된 IAg7; DBA/1 마우스에서 콜라겐 유발 관절염에 관련된 IAq; 또는 그의 펩티드-결합 부분 등의 앨러지- 또는 자가면역 질환 관련된 MHC 복합체를 포함한다. 하기 실시예 3 참조.

클래스 I 및 클래스 II MHC 분자의 제공 펩티드-결합부는 검출 가능한 분자(예,¹²⁵I,¹³¹I,³H, 또는 비오틴)으로 제공 펩티드를 표지시키고, 제공 펩티드를 대응하는 전체 길이의 MHC 분자에 부하시키기에 충분한 조건 하에서 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자를 표지된 제공 펩티드와 접촉시킴으로써 용이하게 확인할 수 있다. 일반적으로, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자의 제공 펩티드 결합부는 동일하거나 또는 관련된 부하 조건 하에서 대응하는 전체 길이 MHC 분자에 비교하였을 때 표지된 제공 펩티드의 적어도 50%(몰%), 더욱 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90% 이상과 결합할 것이다. 특정 MHC 분자의 특정 제공-펩티드 결합 부도 또한 보고되었다.

일반적으로, 빈 MHC 분자에 제공 펩티드를 부하하기 위한 방법은 정제된 MHC 복합체를 약 20-50배 몰과량의 제공 펩티드와 함께 약 20-60 시간 동안 승온, 예컨대 약 37℃에서 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 이들 부하 반응의 최적 pH는 사용된 MHC 복합체 중의 특정 MHC 클래스 II 분자 및 제공 펩티드에 따라 다르지만, 일반적으로 약 pH 4.5 내지 pH 7까지 일 것이다. 이들 방법은 궁극적으로 임의의 제공 펩티드를 MHC 클래스 II 복합체에 부하시키는데 용이하게 적용될 수 있다. 후술하는 실시예 8을 참조하기 바람. 또한 문헌[Stern, L. J. et al., 1992 Cell 68:465; Sette, A.S. et al. 1992, J. Immunol.]을 참조하기 바람.

또한, 부하 pH는 제공 펩티드를 적합한 검출 가능한 분자로 표지시키고, 표지된 제공 펩티드를 MHC 복합체에 접촉시키고, 이어서 목적하는 pH 또는 pH 범위에서 예를 들면, HPLC 겔 여과 막 여과, 면역 흡착 또는 스핀 한외여과에 의해 부하여부를 모니터링함으로써 제공 펩티드 및 MHC 복합체 쌍에 대하여 최적화시킬 수 있다. 특정 pH 또는 pH 범위에서 부하를 나타내는 MHC 복합체는 표준 분리 기술에 의해 비부하된 표지 펩티드로부터 분리시킬 수 있다. 일반적으로, 특정 제공 펩티드를 클래스 II MHC 복합체에 부하하기 위한 최적 pH 또는 pH 범위는 펩티드에 의해 결합되는 클래스 II MHC 복합체의 적어도 50%(몰%), 더욱 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90% 이상을 초래하는 pH 또는 pH 범위이다.

다양한 제공 펩티드를 MHC 복합체에 부하시키거나 또는 공유적으로 연결(예, 재조합에 의해 융합)시킬 수 있다. 예를 들면 OVA(323-339) 및 HSV-1 gD (246-261) 제공 펩티드를 가용성 sc-IA^dMHC 클래스 II 분자에 융합시키거나 또는 부하시킬 수 있다(예를 들면, 후술하는 실시예 1 및 3을 참조 바람). 기타 적합한 제공 펩티드들은 예를 들면, 집 먼지 진드기 알레르겐 DER p I 등의 곤충 알레르겐으로부터 유도한 펩티드; 예컨대 고양이 알레르겐 FeldI 등의 길들여진 동물 알레르겐; 두드러기쑥 알레르겐 Amb a I 및 Amb a V 등의 식물 알레르겐; 신경초 단백질 등의 앨러지-관련 펩티드를 포함한다. 예컨대, 후술하는 실시예 3는 아미노산 84-102의 면역우월성 MBP 에피토프를 제공한다. 기타의 가능성 있는 목적하는 제공 펩티드는 단백지질 단백질(각각이 MS에 관련된 아미노산 30-49의 면역우월성 에피토프 및 아미노산 180-199의 면역우월성 에피토프), 예컨대 RA에 관련된 타입 II 콜라겐 등의 구조 단백질로부터 유도된 펩티드; 효소로부터 유도된 펩티드 및 글루탐산 데카르복실라아제 등의 펩티드 호르몬 및 IDDM에 관련된 인슐린을 포함한다.

MHC 복합체의 예시적인 제공 펩티드는 약 4 내지 35 개의 아미노산, 바람직하게는 약 6 내지 30 개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 8 내지 25 개의 아미노산을 가질 것이다. 바람직하게는, 그러한 제공 펩티드는, 그러한 펩티드의 DNA 서열이 당업계의 공지된 기술에 의해 용이하게 결정될 수 있다 하더라도, 공지의 서열의 DNA에 의해 코딩된다. 기타 적합한 제공 펩티드는 앨러지, 자가면역 질환 또는 앨러지 및 자가면역질환 모두에 관련된 것으로 추정되는 것들을 포함한다. 그러한 펩티드는 후술하는 T-세포 분석 및 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 따라서 T-세포 활성을 조정하는 능력에 대하여 용이하게 시험할 수 있다.

이미 언급한 바와 같이, 본 발명의 MHC 복합체는 다양한 방식으로 정제될 수 있다. 예를 들면, 실질적으로 순수한 MHC 복합체는 일반적으로 적어도 90 내지 95% 상동성을 갖는 것이 바람직하고 적어도 98 내지 99%의 상동성은 많은 제약학적, 임상적 및 연구 응용에 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 제조에 있어서 원하는 상동성까지 정제되면, MHC 복합체는 치료에의 응용을 위해 오염이 없어야 한다.

다양한 다른 정제 방법들이 본 명세서에 개시된 sc-클래스 II MHC 복합체 및 다특이성 MHC 복합체에 대하여 적합하다. 예를 들면, EE 등의 tag 또는 myc 등의 이 분야에서 공지된 다른 것들을 목적하는 sc-클래스 II MHC 복합체 및 다특이성 MHC 복합체에 융합시켜 "태그된(tagged)" 복합체를 제조한다.

그러한 "태그된" 복합체는 tag 및, 간접적으로, 부착된 MHC 분자에 특이적으로 결합하는 메탈로세파로오스 지지체 또는 항체 또는 그의 항체 결합 단편, 바람직하게는 단일클론 항체 단편을 포함하는 기타 그로마토그래피 지지체를 이용하는 크로마토그래피 등의 몇가지 공지된 면역친화 방법에 의해 분리할 수 있다. 또다른 기타 공지의 단백질 정제 방법은 "태그된" 분자를 정제하는데 사용될 수 있으며, 예컨대 면역침전이 있다. 그러한 방법은 하기 실시예 7에 기재되어 있다.

대부분의 경우, 본 발명의 MHC 복합체는 T-세포 등의 면역 세포의 활성을 변형시킬 수 있다. 통상적으로, 적합한 제공 펩티드는 목적하는 MHC 복합체와 결합시키기 위해 선택되어(부하 또는 재조합 수단에 의하여) 펩티드-특이성 T-세포 응답(예, 시토킨 분비)를 활성화시킬 수 있다. 별법으로, 제공 펩티드는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 펩티드-특이성 T-세포에서 예컨대 세포치사를 유발함으로써 T-세포 활성을 억압하도록 선택될 수 있다. 본 명세서에 개시된 MHC 복합체의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 몇가지 분석법은 후술한다. 하기 실시예 2, 9-13을 참조하기 바람.

더욱 구체적으로, 본 발명의 MHC 복합체는 세포소멸, 무력증, 시토킨 분비, 면역억압 및 면역 세포 유도 등의 다양한 면역 시스템 응답을 조정하는 것을 포함하는 다수의 치료 및 관련된 응용에 유용하다. 특히 관심있는 부분은 직접 또는 간접적으로 T-세포에 영향을 미치는 면역 시스템 응답이다. 예를 들면 융합(공유적으로 연결된) 또는 비공유적으로 부하된 제공 펩티드를 포함하는 MHC 복합체는 Ig 클래스 스위칭(switching)의 억제 및 생체내에서 T-세포 팽창의 억제를 탐지하기 위한 스크리닝 방법을 개시한 실시예 11에 설명된 절차에 따라 면역반응성 T-세포를 억압하는 능력에 대해 시험할 수 있다. 이들 방법들은 생체내에서 면역 반응성 T-세포를 억압하는 능력에 대하여 거의 모든 본 발명의 MHC 복합체를 시험하도록 용이하게 적응시킬 수 있다.

특정 치료상의 적용을 위해, 제공 펩티드에 연결된 본 발명의 목적하는 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 발현 벡터를 MHC 융합 복합체의 생체내 발현을 위해 투여할 수 있다. 그러한 접근법은 통상적으로 재조합 단백질의 제조와 관련된 고가의 정제단계를 피하고 통상의 접근법에 관련된 항원 수용의 복잡성 및 프로세싱을 피할 수 있다. 후술하는 실시예 12 참조.

본 발명은 또한 T-세포 발달을 유도하는 펩티드 뿐만 아니라 T-세포 수용체, 즉 T-세포 수용체(TcR) 길항질 또는 부분적 아고니스트를 인식할 수 있는 펩티드를 포함하는 T-세포 수용체에 의해 인식되는 펩티드의 시험관내 동정을 위한 방법을 포함한다.

면역 응답의 억압을 위한 다른 방법은 유효량의 T-세포 길항질 또는 부분적 아고니스트인 제공 펩티드를 포함하는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 다특이성 MHC 복합체의 투여를 제공한다.

APCs의 표면 상에서 펩티드-MHC 복합체는 APCs가 또한 동시자극적인 신호를 전달할 경우 MHC 결합 펩티드에 특이적인 반응성 T-세포주의 클로날 팽창만을 유도하는 것으로 밝혀졌다.

APCs에 의한 동시자극적인 신호의 부재하에서, 이들 반응성 TH 세포들은 에너지의 상태로 유발되는 것으로 보인다. APCs로부터 단리된 가용성 헤테로이합체성성 펩티드/MHC 클래스 II 복합체는 TH 세포 면역 응답을 억압하는 것으로 나타났다[참조: Sharma, S. D. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11465-11469; Nicolle, M. W., 1994, J. Clin. INvest. 93:1361-1369].

T-세포 수용체 길항질 또는 부분적인 아고니스트인 제공 펩티드를 포함하는 본 발명의 MHC 복합체는 동시자극적인 신호가 결핍된 가용성 복합체로서 투여될 수 있다.

추가로, CD4 수용체에 대한 결합을 변형시킨 변형된 클래스 II β2 도메인을 포함하는 본 명세서에 기재된 MHC 복합체는 또한 T-세포를 무력한 상태로 유도하는데 작용할 수 있다.

별법으로, 본 발명의 MHC 복합체의 투여는 "전체-길이" MHC 융합 복합체, 즉 MHC 복합체에 공유적으로 연결된 길항질 또는 부분적 아고니스트 활성을 가진 막내외 부분 및 제공 펩티드를 포함하는 하나 이상의 전체 길이 MHC 단백질을 포함하는 복합체를 코딩하는 DNA 벡터를 포함하는 유효량의 DNA 서열의 형태를 취할 수 있다.

상기 PCT 출원 제 WO 96/04314에 개시된 바와 같이, sc-MHC 클래스 I 및 II 분자는 펩티드를 검출하고 특성화하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 다음과 같이 T-세포에 대한 비특성화된 에피토프를 맵핑(mapping)하는데 사용될 수 있다: 무작위 펩티드 또는 선별된 펩티드의 라이브러리 중 어느 하나를 코딩하는 서열들을 sc-MHC 복합체를 코딩하는 DNA 서열 및, 임의로, 링커 서열을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 상기 정의된 바의 본 발명의 벡터 시스템의 제공 펩티드 내로 클로닝시킨다. 적합한 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리의 제한 단편 (참조: Sambrook, et., 상기함, Ausubel et al., 상기함)을 발현 벡터 내로 삽입되는 서열의 원으로서 사용하는 것이 적합하고 또는 별법으로는 공지된 서열의 합성 올리고뉴클레오티드 등의 선별된 올리고뉴클레오티드를 삽입되는 서열로서 사용한다. 포유류 세포 및 상기 언급한 기타의 것 등의 적합한 숙주를 유전자 융합, 즉 추가의 펩티드를 코딩하는 서열에 연결된 MHC 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시킨다. 형질전환체들을 적합한 조건 하에서 배양시키고 세포들을 후술하는 분석법에 의해 결정되는 바의 T-세포 클론과 반응하는 목적하는 융합 복합체의 발현에 대해서 스크리닝한다. 이어서, 반응성 클론들을 선택하고 벡터를 단리한다. DNA 삽입물의 서열 분석은 클로닝된 펩티드 서열이 T-세포 클론에 의해 인식되는 에피토프에 대응하였음을 나타낼 것이다. 펩티드를 재조합 방법에 의해 펩티드를 부가하기 보다는 펩티드를 빈 분자 상에 부하시키는 것을 제외하고는, 빈 sc-MHC 분자를 동일한 방식으로 이용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 다특이성 MHC 복합체의 관련된 사용은, 특정 다특이성 MHC 복합체에 대하여, 하나 이상의 적합한 벡터를 사용하고, 이 벡터가 다특이성 MHC 복합체의 적합한 부분을 코드하는 것이라면, 본 발명의 범위 내에 포함된다.

sc-MHC 분자(부하되거나 또는 융합된 제공 펩티드를 포함)의 T-세포 수용체의 활성을 조정(T-세포 응답의 불활성화를 포함)하는 능력은 시험관내 및 생체내 분석에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 통상적으로 이 분석을 위한 T-세포는 T-세포 하이브리도마 또는 포유류, 예컨대 인간 또는 쥐 등의 설치류로부터 단리된 T-세포 등의 형질전환된 T-세포주에 의해 제공될 것이다. 기타 적합한 T-세포는 1) 공공 입수가 가능하거나 공지의 방법에 의해 제조될 수 있는 T-세포 하일브리도마, 2) T-헬퍼 세포, 및 3) T 세포독성 세포, 바람직하게는 세포독성 CD4+ 세포를 포함한다. T-세포는 공지의 방법에 의해 포유류로부터 단리할 수 있다[참조: R. Shimonkevitz et al., J. Exp. Med., 158:303 (1983) 및 후술하는 실시예]. 적합한 시험관내 분석의 예는 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에에 개시되어 있다. 특히, 공개된 PCT 출원들은 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드를 포함하는 분자 뿐만 아니라 빈 또는 부하된 펩티드 결합 부위를 포함하는 sc-MHC 클래스 II 분자에 대한 분석 및 그의 사용 방법을 개시하고 있다. 다음의 기재 사항으로부터 이해할 수 있는 바와 같이, 공개된 PCT 출원들에 기재된 분석 및 사용 방법은 본 발명의 MHC 복합체의 사용에 용이하게 채택할 수 있다. 본 발명의 다특이성 MHC 복합체의 관련된 사용에 관해서는 이전에 이미 언급하였으며 본 발명의 범위 내에 속한다.

융합된 펩티드를 포함하는 본 발명의 MHC 복합체가 T-세포의 활성을 조정할 수 있는지를 결정하기 위한 예시적인 분석에 관하여 기술한다. 이 분석은 본 명세서에 기재된 부하된 MHC 복합체와 같은 다양한 MHC 복합체에 적합함을 이해할 것이다. 이 분석은 일반적으로 다음과 같이 순차적인 단계 1-4에 의해 수행한다: T-세포는 분석될 수 있고 T-세포 활성화 또는 활성화후 T-세포 활성의 변조를 나타낸 마커를 적합하게 발현시킨다. 따라서, 예컨대 후술하는 실시예 2, 및 9에 기재한 바와 같이, 활성화시 인터류킨-2(IL-2)를 발현하는 쥐의 T-세포 하이브리도마 DO 11.10를 사용할 수 있다. IL-2 농도를 측정하여 특정 제공 펩티드가 T-세포 하이브리도마의 활성을 조정할 수 있는지를 결정할 수 있다. 그러한 적합한 분석은 다음의 순차적인 단계에 의해 수행한다:

1. 펩티드/MHC 복합체에 특이적인 T-세포 수용체를 갖는 T-세포들을 예를 들면 목적하는 T-세포 하이브리도마로부터 또는 포유류로부터 단리함으로써 얻는다.

2. 이 T-세포를 증식을 허용하는 조건 하에서 배양시킨다.

3. 증식하는 T-세포들을 선별된 MHC 융합 복합체와 접촉시킨다.

4. T-세포들을 항원 제시 세포와 접촉시켜 활성화에 필요한 신호를 제공하고 마커에 대해서 분석하는데, 예를 들면, IL-2 생산을 측정한다. IL-2 생산에 있어서 증가, 예를 들면 24 시간의 기간 후에 IL-2 생산에 있어서 100% 이상의 증가, 더욱 일반적으로는 24 시간의 기간후에 IL-2 생산에 있어서 1000% 이상의 증가는 MHC 융합 복합체가 T-세포의 활성을 조정하고 면역 응답을 억제함을 나타낸다. 후술하는 실시예 9는 그러한 분석을 예시한다. 이 분석은 막내외 부분을 함유하지 않은 "절단된(truncated)" 가용성 MHC 복합체의 활성의 분석에 적합하게 사용된다. 또한, 이 분석은 T-세포 수용체 길항질 또는 부분적인 아고니스트로서 기능하는 공유적으로 연결된 제공 펩티드를 함유하는 MHC 융합 복합체의 동정에 적합하게 사용될 수 있다. 이 분석은 또한 부하된 본 발명의 MHC 복합체에 편리하게 채택할 수 있다.

이 분석에서 이용되는 T-세포들은 증식에 적합한 조건하에서 인큐베이션시킨다. 예를 들면, DO11.10 T-세포 하이브리도마를 완전 배양 배지(10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민 및 5 x 10^-5M 2-머캅토에탄올을 보충한 RPMI 1640) 중에서 약 37℃ 및 5% CO₂에서 적절히 인큐베이션시킨다. MHC 융합 복합체의 순차적 희석물을 T-세포 배양 배지에 첨가할 수 있다. T-세포에 첨가되는 MHC 융합 복합체의 적합한 농도는 통상적으로 10^-12내지 10^-6M의 범위일 것이다. T-세포 활성화 신호는 적절한 항원성 펩티드를 부하시킨 항원 제시 세포에 의해 제공된다. 항원 투여량 및 약간의 최대이하의 T-세포 활성화를 나타내는 APC 갯수의 사용은 T-세포의 MHC 융합 복합체와의 응답의 억제를 탐지하는데 바람직한 것으로 보인다. MHC 융합 복합체와의 접촉후 IL-2의 생산에 있어서 감소는 융합 복합체가 T-세포의 활성화를 조정하며 면역 응답을 억압함을 나타낸다.

별법으로, IL-2 등의 발현된 단백질의 측정 보다도, T-세포 활성화의 조정은 당업계에서 인식되고 있는 바와 같은 방사선 표지화 기술에 의해 측정되는 바의 항원-의존성 T-세포 증식에 있어서 변화에 의해 적절히 결정할 수 있다. 예를 들면, 표지된(예컨대, 삼중수소처리된) 뉴클레오티드를 분석 배양 배지에 도입시킬 수 있다. 그러한 태그된 뉴클레오티드의 DNA 내로의 혼입은 T-세포 증식의 척도로서 작용한다. 이 분석은 성장을 위해 항원 제시를 요하지 않는 T-세포, 예를 들면, T-세포 하이브리도마에는 적합하지 않다. 이것은 포유류로 부터 단리된 비형질전환된 T-세포의 T-세포 활성화의 MHC 융합 복합체에 의한 조정의 측정에 적합하다. MHC 융합 복합체와의 접촉후 T-세포 증식의 레벨에 있어서 감소는 융합 복합체가 T-세포의 활성화를 조정하며 면역 응답을 억압할 수 있음을 나타낸다. 시험관내 T-세포 증식 분석은 시험관내 T-세포 클론의 팽창에 있어서 항원-특이성 변화에 대한 MHC 융합 복합체의 효과를 측정하는데 바람직하다.

이들 시험관내 분석은 T-세포 수용체의 활성을 조정할 수 있는(활성화 또는 T-세포 발달의 억제를 포함함) 무작위 라이브러리로부터의 DNA 또는 기타 뉴클레오티드에 코드화되는 펩티드(들)을 선별하고 동정하는데 이용될 수 있다. 구체적으로, 무작위 펩티드들 또는 선별된 펩티드들 중 어느 하나의 라이브러리를 코딩하는 DNA 서열을 MHC 분자를 코딩하는 DNA 서열 및, 임의로, 링커 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 상기 언급한 바의 발현 벡터 시스템의 제공 펩티드 위치 내에 클로닝시킨다. 적합하게는, 게놈성 DNA 라이브러리의 적절한 cDNA의 제한 단편[참조: Sambrook, et al., 상기함]을 발현 벡터 내로 삽입되는 서열들의 원으로 사용하거나, 또는 별법으로, 공지된 서열의 합성 올리고뉴클레오티드 등의 선별된 올리고뉴클레오티드를 삽입되는 서열로서 사용한다. 포유류 세포 및 상기한 바의 기타의 것 등의 적합한 숙주를 유전자 융합, 즉 제공 펩티드를 코딩하는 서열에 연결된 MHC 분자를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터로 형질전환시킨다. 형질전환체들을 적합한 조건 하에서 배양시키고 세포들을 이것을 선별된 T-세포와 접촉시킴으로써 목적하는 MHC 복합체의 발현에 대해서 스크리닝한다.

상기한 바의 분석, 예컨대 IL-2 생산 또는 T-세포 증식의 측정은 MHC 복합체와의 접촉이 T-세포 활성화를 조정하였는지를 결정하는데 이용한다. 예를 들면, APC-자극된 T-세포의 IL-2 생성에 있어서 증가는 T-세포의 활성화를 조정하는 MHC 융합 복합체를 동정한다. 별법으로, 시험관내 분석을 사용하여 T-세포 응답을 증가시키는 제공 펩티드를 포함한 상기한 바의 다가 MHC 복합체를 동정한다.

시험관내 분석은 또한 T-세포 발달을 억제하거나 또는 불활성화시키는 능력을 포함하는, MHC 복합체의 T-세포의 활성을 조정하는 능력을 결정하는데 사용하여도 좋다. 예를 들면, MHC 융합 복합체를 면역글로불린 클래스 스위칭(예, IgM에서 IgG로의)을 억제하는 그의 능력에 대하여 분석할 수 있다[참조: P. Linsley et al., Science, 257:792-795 (1992)]. 그러한 분석은 후술하는 실시예 13에 구체적으로 나타냈다.

본 발명은 생체내 진단 영상화 및 HLA 타이핑을 포함하는 MHC 융합 분자를 포함하는 본 발명의 MHC 복합체를 사용한 진단 방법을 또한 제공한다[참조:예를 들면, A. K. Abbas, Cellular and Molecular Immunology, page 328 (W.B. Saunders Co. 1991]. 예를 들면, 생체내 영상화 응용을 위해, 방사성 표지 (예,¹²⁵I,³²P 또는⁹⁹Tc) 또는 기타의 검출 가능한 태그를 포함하는 MHC 융합 분자를 포유류에 투여하고 개체를 MHC 분자의 결합을 위한 공지의 절차에 의해 스캐닝한다. 포유류의 그러한 분석은 본 명세서에 기재한 바의 예컨대, 바람직하지 못한 면역 응답을 포함한 다수의 질병의 진단 및 치료를 도울 수 있다.

빈 펩티드 결합 도메인, 예컨대 본 명세서에 개시된 빈 sc-MHC 클래스 II 분자를 포함하는 본 발명의 MHC 복합체는 MHC 분자의 펩티드 결합 그루브 또는 클레프트에 비공유적으로 결합하는 제공 펩티드를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 그러한 스크리닝은 특정 MHC 분자, 예컨대 IA^d, DR1, IE, DP 및 DQ 등의 MHC 클래스 II 분자를 결합시키는 그러한 제공 펩티드를 동정하는데 유용하다. 예시적인 보기로서, sc-IA^d/블랭크 분자를 검출 가능한 태그(예,¹²⁵I, 비오틴 또는 본 명세서에 기재된 다른 단백질 태그)로 변형시킬 수 있다. 단백질을 태그시키고 라이브러리를 스크리닝하는 절차는 잘 알려져 있다[참조: 예를 들면, 본 명세서에 참고로 인용하는 Sambrook et al., 상기함; 및 Ausubel et al., 상기함, John Wiley ＆ Sons, New York, 1989]. 몇몇의 무작위 펩티드 라이브러리 중 임의의 것을 적합하게 사용할 수도 있다[참조:예를 들면, J. Scott et al., Science, 249:386 (1990); J. Devlin et al., Science, 249:404 (1990); S. Cwirla et al., PNAS (USA) 87:6378 (1990); J. Hammer et al., J. Exp. Med., 176:1007 (1992); D. O'Sullivan et al., J. Immunol., 147:2663 (1991)]. sc-IA^d/블랭크 분자에 결합하는 펩티드를 사용하여 대응하는 부하된 분자를 제조할 수 있다. 이어서 부하된 분자를 여기에 기재된 임의의 T-세포 분석으로 시험하여 확인된 펩티드가 T-세포 활성을 조정할 수 있는지를 결정한다.

분석은 또한 면역 질환의 치료를 위한 본 발명의 MHC 복합체의 잠재적인 용도를 평가하는데 이용해도 좋다. 예를 들면, 실험적인 앨러지성 뇌척수염(EAE)은 마우스에서의 자가면역 질환으로 다발성 경색증의 인정된 모델이다. 적합한 마우스 혈통을 처리하여 EAE를 전개시키고 MHC 융합 복합체를 투여한 후 이 동물을 EAE 전개가 MHC 융합 복합체의 투여 후에 억제 또는 방지되었는지를 평가할 수 있다. 그러한 분석은 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314 및 WO 97/28191호에 구체적으로 기재되어 있다.

표적화된 질병에 대한 백신처리를 포함한 본 발명의 MHC 복합체의 면역 응답을 유도하는 능력은 생체내 분석에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 융합된 재조합 펩티드를 포함하는 본 발명의 MHC 복합체 또는 MHC 융합 복합체를 코딩하는 DNA를 마우스 등의 포유류에 투여하고, 혈액 시료를 초기 투여시 및 그후에 주기적으로 몇회(예컨대, 융합 복합체 또는 DNA의 투여후 2, 5 및 8주에) 얻었다. 혈청을 혈액 시료로부터 수집하여 면역화에 의해 유도된 항체의 존재에 대하여 분석하였다. 항체 농도를 결정할 수 있다. 후술하는 실시예 12 및 13은 그러한 분석에 관하여 구체적으로 기술하고 있다.

일부의 경우에 있어서 본 발명의 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 구조물, 특히 융합된 제공 펩티드를 포함하는 것을 직접적으로 투여하여 개체의 세포 내에서 복합체를 발현시키는 것이 유용하다. 일례로서, 적합하게는 CMV 프로모터 등의 적절한 프로모터 및 임의의 면역증강제의 조절하에, 융합된 제공 펩티드를 포함하는 MHC 복합체의 코딩 영역을 갖는 DNA를 개체의 골격근에 직접 주사한다. MHC 융합 분자가 개체에서 면역 응답을 유발하는지를 확인하기 위하여, 동시 유발 인자를 코드하는 DNA 벡터를 MHC-제공 펩티드 융합을 코딩하는 DNA와 함께 투여하는 것이 바람직하다. 바람직한 동시투여되는 DNA 벡터는 예를 들면, CMV 프로모터의 조절하에 CD80 또는 CD86 중 어느 하나의 코딩 영역을 포함하는 것들을 포함한다. 발현된 CD80 및 CD86 단백질은 동시 자극 신호를 제공하여 면역 응답의 개시를 도울 수 있다.

포유류 등의 개체에서 면역 응답을 유도하기 위한 그러한 접근법은 종래의 접근법에 비하여 중요한 이점을 제공한다. 외래 단백질 항원의 제시에 있어서, 첫 번째 단계는 천연 항원의 항원 제시 세포(APC)에로의 결합이다. APCs에 결합시킨 후 항원은 식작용, 수용체 매개 내식작용 또는 피노시토시스 중 어느 하나에 의해 세포내로 들어간다. 그러한 내부화된(internalized) 항원은 엔도솜이라고 하는 세포간 막-결합 비히클에 국재화된다. 엔도솜-라이소솜 융합후, 항원들은 라이소솜에 존재하는 세포성 프로테아제에 의해 작은 펩티드들로 가공된다. 펩티드들은 이들 라이소솜 내에서 MHC 클래스 II 분자의 α 및 β쇄와 결합되게 된다.

조면 소포체에서 미리 합성된 이들 MHC 클래스 II 분자들은 골지체에 이어 리소솜의 구획으로 순서대로 운송된다. 이 펩티드-MHC 복합체는 T 및 B 세포 활성화를 위한 APCs의 표면에 제시된다. 따라서, 항원 내의 단백질분해 처리 부위의 접근성, 생성된 펩티드의 라이소솜 내에서의 안정성 및 MHC 분자에 대한 펩티드의 친화도는 특정 에피토프의 면역원성에 대한 결정 인자들이다. 이들 인자들은 면역보조제의 투여에 의해 변화되지 않을 수 있다. 그러나, MHC 융합 복합체(즉, 제공 펩티드에 직접 공유적으로 연결된 MHC)의 직접 발현은 그러한 복잡성을 우회할 수 있으며 MHC 융합 분자 상에 전달되는 에피토프에 대하여 면역 응답을 유발한다.

그러나, MHC 복합체를 코딩하는 DNA를 개체에 직접 투여하기 보다는, 그러한 DNA가 도입된 숙주 양립성 항원 제시 세포를 개체에 투여할 수도 있다. 즉, 본 발명의 하나 이상의 MHC 복합체를 코딩하는 DNA를 숙주 양립성 항원 제시 세포 내로 도입시키고, 그러한 형질전환 또는 형질감염된 항원 제시 세포를 및 적절한 T-세포와 가장 효율적인 상호작용이 일어나는 표적 부위와 함께 표적 숙주에 투여할 수 있다. 개체에 투여시, 그러한 공학적으로 처리된 세포는 생체 내에서 세포 표면상에 DNA에 의해 코드된 MHC 복합체를 발현할 수 있다. 그러한 공학적 처리된 세포들을 개체에 투여하여 세포의 다른 동시 자극 신호들의 발현에 따라서 면역 응답을 유도하거나 또는 별법으로 면역 응답을 억제할 수 있다. 즉, 투여시 세포들이 충분량의 동시 자극 신호의 부재하에서 또는 충분량의 관용-유발 신호의 부재하에서 MHC 복합체를 제공하거나, 또는 길항질 또는 부분적 아고니스트 활성을 가진 제공 펩티드를 함유하는 MHC 복합체를 제공한다면, 세포들은 숙주에 투여되어 면역 응답을 유발한다. 예를 들면 충분량의 관용-유도 신호는 예컨대 T-세포 상의 CTLA-4 또는 Fas 등의 관용-유발 수용체와 상호작용하는 세포의 표면에서 발현되는 인자에 의해 제공될 수 있다. 별법으로, 세포가 충분량의 동시 자극 신호의 존재하에서 MHC 복합체를 제공할 수 있다면, 즉 B7 또는 B7-2 등의 T-세포 동시 자극 인자가 세포의 표면에서 발현된다면, 이 세포들은 포유류 숙주에 투여되어 본 명세서에 기재된 바의 포유류에서 면역 응답을 일으킬 수 있다. 사용될 경우 T-세포 동시 자극 인자 뿐만 아니라 MHC 복합체의 두 쇄를 코드하는 단일 발현 벡터를 상기한 바와 같이 제조하여, 이 벡터를 숙주 양립성 APC에 도입시켜 투여용 세포를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 당업자에 잘 인식되는 바와 같이, 용어, "숙주 양립성" 항원 제시 세포는 세포가 투여되는 개체 또는 "숙주"의 것과 동일한 일배체형(haplotype)인 항원 제시 세포를 의미한다. 바람직하게는 형질전환된 숙주 양립성 항원 제시 세포는 세포가 투여된 개체의 림프절로 이동하여, 이 부위에서, MHC 복합체를 발현할 수 있는 것들이다.

본 발명의 MHC 복합체 및 이 복합체를 코드하는 DNA 구조물은 다양한 치료상의 응용성을 가지고 있다. 예를 들면, MHC 클래스 II 융합 복합체를 투여하여 포유류의 면역 응답을 억압, 예컨대, 다발성 경화증, 인슐린 의존형 당뇨병, 류마티스성 관절염 등의 자가면역 질환으로 고통을 겪거나 이들에 감수성인 인간을 포함한 포유류를 치료할 수 있다. 또한 치료에 적합한 것들은 바람직하지 못한 면역 응답으로부터 고통을 받거나 또는 고통을 받을 것 같은 개체, 즉 심장, 신장, 피부 또는 기타 기관의 이식 등의 일부 형태의 이식 수술을 받는 환자들이다. 그러한 상황하에서, 치료 프로토컬은 외과적 절차에 앞서 적절히 개시할 수 있다.

본 발명에 따라, 다수의 독특한 접근법을 사용하여 포유류의 면역 응답을 억압하는데 사용할 수있다.

구체적으로, 상기 언급한 바와 같이, MHC 분자는, 예를 들면 항원 제시 세포로 부터 동시 자극 신호가 또한 전달될 경우, T-세포주 특이성인 클론 팽창만을 유도할 것이라는 것이 공개된 PCT 출원에서 밝혀졌다. 동시 자극 신호의 부재하에서 또는 적어도 T-세포 증식에 유효한 양의 그러한 T-세포 동시 자극 인자의 전달의 부재하에서, T-세포들은 무력증의 상태 또는 세포소멸로 유도되어 클론 결실을 초래할 것이다.

따라서, 면역 응답의 억압을 위한 한 치료 방법은 임의의 동시 자극 신호의 실질적인 부재하에서 MHC 융합 복합체 등의 본 발명의 하나 이상의 MHC 클래스 II 복합체의 충분량을 투여함으로써 특이성 T-세포의 무력증을 유발하고 바람직하지 못한 면역 응답을 효율적으로 억압하는 것을 제공한다. 예를 들면, "절단된" 가용성 MHC 복합체, 즉 막내외 부분을 갖지 않는 MHC 복합체를 투여할 수 있다. 투여되는 가용성 MHC 융합 복합체의 제공 펩티드는 그러한 T-세포에 대하여 무력증의 상태를 유발하는 바람직하지 못한 응답의 T-세포에 특이적인 것을 선택할 수 있다. 그러한 제공 펩티드들은 상기한 바의 시험관내 프로토컬에 의해 용이하게 동정하고 선별할 수 있다.

본 발명의 MHC 복합체는 주사, 예컨대 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 포유류에 적합하게 투여할 수 있다. 국소 투여, 예컨대 점안제, 및 비강 또는 폐 흡입을 통한 투여도 또한 가능하다. MHC 복합체, 적어도 치료학상의 적용에 사용되는 복합체는 포유류 세포에서 생산되어 사용하기 전에 정제할 수 있으므로 이는 임의의 세균 또는 발열원이 본질적으로 또는 완전히 없다. 주어진 치료학상의 적용을 위한 최적의 투여량은 통상의 수단에 의해 결정할 수 있다.

융합된 제공 펩티드를 포함하는 본 발명의 MHC 복합체는 융합 복합체를 포함하는 치료 또는 제약학적 조성물로 개체(특히 인간 등의 포유류 또는 소 등의 가축)에 적합하게 투여할 수 있다. 그러한 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 제조하여 사용한다. 예를 들면, 치료학상 유효량의 MHC 복합체를 함유하는 제형은 단위-투여량 또는 다중 투여량 컨테이너, 예컨대 밀봉 앰플 및 바이알로 제공할 수 있으며, 사용하기 바로 직전에 멸균 액상 담체, 예컨대 주사용 수의 첨가만을 요하는 동결건조 조건에서 저장할 수 있다. 리포좀 제형은 또한 많은 적용에 대하여 바람직할 수 있다. 비경구 투여용의 다른 조성물도 또한 적합할 것이며 의도한 수용자의 혈액과 함께 항산화제, 완충액, 항박테리아제 및 제형에 등장성을 부여하는 용질을 포함할 수 있는 수성 또는 비수성 멸균 주사액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다.

면역 질환의 억압을 위한 다른 치료 방법은 T4 상에 TCR-공수용체 CD4를 충분히 보충하는데 실패한 변형된 클래스 II-β2 도메인을 함유하는 본 발명의 MHC 복합체의 투여를 제공한다. T-세포 수용체를 펩티드-MHC 복합체로 채우는 한편 CD4로 결합을 차단하는 것은 부분적인 아고니스트 T-세포 신호화(signaling) 및 T-세포 무력화를 초래한다[참조: Madrenas, et al., J. Exper. Med., 185:219-229 (1997)]. 이 MHC 융합 복합체는 상기한 바와 같이 제공 펩티드로 부하하거나 또는 제공 펩티드에 공유적으로 연결시킬 수 있다. MHC 융합 복합체는 모두 또는 일부의 막내외 부분이 결핍된 절두형일 수 있으며, 상기한 바와 같이 가용성 단백질로서 투여될 수 있다. 별법으로, MHC 융합 복합체는 전체 길이일 수 있으며, 예컨대 막내외 부분을 포함할 수 있다. 이들 복합체로의 치료는 포유류에 변형된 클래스 II-β2 도메인을 함유하는 본 발명의 전체 길이의 MHC 융합 복합체를 코딩하는 DNA 벡터를 포함하는 충분량의 DNA 서열을 투여하는 것을 포함한다. 별법으로, 치료는 포유류에 변형된 클래스 II-β2 도메인을 함유하는 본 발명의 전체 길이의 MHC 융합 복합체를 이들의 표면에 발현하는 충분량의 세포를 투여하는 것을 포함한다.

면역 응답의 억압을 위한 다른 치료 방법은 MHC 복합체 및 T-세포 상의 관용-유발 수용체와 상호작용하는 하나 이상의 부가적인 결합 활성을 함유하는 본 발명의 다특이성 MHC 복합체의 투여를 제공한다. 예를 들면, 부가적인 결합 활성은 T-세포 표면 단백질, 예컨대 CTLA-4 또는 Fas와 특이적으로 상호작용을 하는 단일쇄 항체 또는 FasL 등의 단백질 또는 펩티드로 정의된다. CLTA-4 및 Fas의 사용은 T-세포 기능의 다운 조절(down-regulation) 또는 T-세포 세포사멸 중 하나를 초래한다. MHC 복합체는 상기한 바와 같이 제공 펩티드로 부하하거나 또는 제공 펩티드에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 다특이성 MHC 융합 복합체는 막내외 부분이 결핍된 절두형일 수 있으며, 상기한 바와 같이 가용성 단백질로서 투여될 수 있다.

면역 응답을 억압하기 위한 더욱 다른 치료법은 T-세포 수용체 길항질 또는 부분적 아고니스트인 공유적으로 연결된 제공 펩티드를 함유하는 본 발명의 MHC 복합체의 투여를 제공한다[참조: A. Sette et al., Annu. Rev. Immunol., 12:413-431 (1994)]. 이 MHC 융합 복합체는 절두형일 수 있으며, 상기한 바와 같이 가용성 단백질로서 투여될 수 있다. 별법으로, MHC 융합 복합체는 전체 길이일 수 있으며, 예컨대 막내외 부분을 포함할 수 있다. 이들 복합체로의 치료는 포유류에 본 발명의 전체 길이의 MHC 융합 복합체 및 TCR 길항질 또는 그의 부분적 아고니스트인 제공 펩티드를 코딩하는 DNA 벡터를 포함하는 충분량의 DNA 서열을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 논의 및 그러한 MHC 융합 복합체의 적합한 제조 수단 및 면역억제 요법에서 이의 사용을 나타낸 실시예 3, 11-13을 참조하기 바람. TCR 길항질 또는 부분적인 아고니스트인 제공 펩티드들은 상기한 바의 시험관내 프로토컬에 의해 용이하게 동정하고 선별할 수 있다. T-세포 수용체 길항질 또는 부분적인 아고니스트인 제공 펩티드를 함유하는 MHC 융합 복합체는 앨러지 및 다발성 경화증, 인슐린 의존형 당뇨병 및 류마티스성 관절염 등이 자가면역 질환의 치료에 특히 바람직하다.

또, 상기 및 PCT 출원 제 WO 96/04314에서 논의한 바와 같이, 본 발명의 MHC 복합체를 코딩하는 DNA를 도입시킨 숙주 양립성 항원 제시 세포를 개체에 투여하여 면역 응답을 억악할 수 있다. 투여시 세포들은 유효량의 T-세포 동시조절 신호의 부재하에 MHC 복합체를 발현하여, 예컨대 T-세포 무력증이 유도되고 및(또는) 투여된 세포는 길항질 또는 부분적인 아고니스트 활성을 갖는 연결된 제공 펩티드를 함유하는 MHC 융합 복합체를 발현한다.

본 발명의 상이한 면역억압 요법은 또한 항염제 등의 기타 공지된 면역억압제와 함께 혼합하여 사용하여 보다 효율적인 T-세포 매개 질환의 치료를 제공할 수 있다. 예를 들면, 면역억압성 MHC 융합 복합체는 자가면역 질환 및 앨러지의 치료용 코르티코스테로이드 및 비스테로이드성 약물 등의 항염제와 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 인간 등의 포유류를 감염성 동인 또는 암 등의 표적화된 질병, 특히 흑색종 또는 말라리아 등의 기타 질환에 대한 백신 접종을 포함하는 인간 등의 포유류에서 면역 응답을 자극하는 방법을 제공한다.

이들 방법들은 막내외 부분을 함유하는 본 발명의 MHC 복합체를 코드하는 DNA 벡터를 포함하는 유효량의 DNA 서열을 포유류에 투여하거나 및(또는) 막내외 부분을 함유하는 그러한 MHC 융합 복합체의 투여 및(또는) 그러한 MHC 복합체를 코드하는 그러한 DNA를 함유하는 숙주 양립성 항원 제시 세포의 투여를 포함한다. MHC 복합체의 발현 벡터의 제조는 전술하였으며 후술하는 실시예 1-3에 기재되어 있다. 플라스미드 DNA의 투여 방법, 투여된 개체의 세포에 의한 그 DNA의 수용 및 단백질의 발현은 보고되었다[참조: J. Ulmer et al., Science, 259:1745-1749 (1993)].

예시적인 방법에 있어서, MHC 복합체를 코드하는 DNA는 CD80 또는 CD86을 코딩하는 DNA 등의 적합한 T-세포 동시자극 인자를 코딩하는 DNA와 함께 포유류에 투여한다. 이 CD80 유전자 및 그의 발현은 문헌[D. Harlan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3137-3141 (1994)]에 기재되어 있다. 개체의 세포에 의한 그 DNA의 수용시, T-세포 동시 자극 인자는 발현되어 동시자극 신호를 제공함으로써 면역 응답의 개시를 돕는다. CD80 또는 CD86 유전자를 함유하는 발현 벡터의 제작에 관련된 개시에 대하여 상기 공개된 PCT 출원 및 계류 중인 미국 특허 출원을 참조하기 바람.

상기 논의한 바와 같은 인간 등의 포유류에 대한 MHC 복합체를 코딩하는 DNA의 투여는 개체에서 면역 응답을 일으키는 방법인 반면, MHC 복합체는 또한 다른 경로에 의해 적합하게 투여될 수 있다. 따라서, 상기한 바와 같이, MHC 복합체를 코딩하는 DNA가 도입된 숙주 적합성 항원 제시 세포를 개체에 투여하여 면역 응답을 유발할 수 있다. 투여시 세포는 CD80 또는 CD86 유전자 등의 유효량의 T-세포 동시 자극 신호의 존재하에서 MHC 복합체를 발현하여 면역 응답을 일으키거나 및(또는) 투여된 세포는 예컨대 후술하는 실시예에 구체적으로 설명한 절차에 의해 T-세포 증식에 있어서 증가에 의해 나타나는 바와 같이, 면역 응답을 일으킬 수 있는 전체 길이의 MHC 복합체를 발현한다.

별법으로, 면역 응답을 일으킬 수 있는 본 발명의 MHC 복합체, 예컨대 T-세포 증식을 자극하거나 유도할 수 있는 공유적으로 연결된 항원 제공 펩티드를 함유하는 MHC 복합체를 숙주에 직접적을 투여할 수 있다. 통상적으로, 이 MHC 복합체는, 빈 또는 부하된 복합체가 필요에 따라 일부의 적용을 위해 사용될 수도 있으나, 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드를 포함할 것이다.

면역 응답을 일으키는 다른 치료법은 MHC 복합체 및 T-세포 상의 T-세포 상의 동시자극 수용체와 상호작용하는 하나 이상의 부가적인 결합 활성을 함유하는 본 발명의 다특이성 MHC 복합체의 투여를 제공한다. 예를 들면, 부가적인 결합 활성은 CD28 등의 T-세포 표면 단백질과 특이적으로 상호작용하는 단일쇄 항체, CD80 또는 CD86 등의 단백질 또는 펩티드로 정의될 수 있다. CD28에 의해 제공되는 동시 자극 신호는, 이들이 예컨대 사이토카인 생산 및 세포용해 등의 T-세포 증식 및 효과기 세포 기능을 증대시키기 때문에, TcR 사용의 결과를 결정한다. MHC 복합체는 상기한 바와 같이 제공 펩티드로 부하하거나 또는 제공 펩티드에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 다특이성 MHC 융합 복합체는 막내외 부분이 결핍된 절두형일 수 있으며, 상기한 바와 같이 가용성 단백질로서 투여될 수 있다.

표적 질환에 대하여 개체를 백신접종하는 것을 포함하는 면역 응답을 유도하기 위한 본 발명의 방법은 면역 응답을 유도하기 위한 공지의 방법과 병용하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 sc-MHC 클래스 II 복합체 또는 그러한 MHC 복합체를 코딩하는 DNA 구조물을 백신 조성물의 투여와 공동으로 또는 혼합하여 개체에 투여하여 그러한 백신 조성물의 목적하는 효과를 촉진하거나 연장시킬 수 있다.

추가로 본 발명의 MHC 복합체, 그러한 복합체를 코드하는 DNA 벡터 및 그러한 DNA 벡터를 함유하는 숙주 적합성 항원 제시 세포 각각을 다양한 다른 경로에 의해 개체에 적절히 투여할 수 있다. 예를 들면, 면역 응답을 유도하기 위하여 항원성 MHC 융합 복합체를 단독으로 또는 동시 자극 인자를 코딩하는 DNA와 함께 당업자에게 공지된 절차에 의해 피내 경로로 개체에 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 투여는 피내 항원 제시 세포(예, 신경초 세포)의 형질전환 및 T-세포 증식을 초래할 것이다. HMC 융합 복합체 및 그러한 융합 복합체를 코딩하는 DNA 벡터는 또한 다른 경로, 예컨대 경구적으로 또는 경피적으로 개체에 투여할 수도 있다.

인간 질병의 치료 이외에, 융합된 제공 펩티드를 포함하는 복합체와 같은 본 발명의 MHC 복합체 및 그러한 복합체를 코드하는 DNA 구조물은 동물에의 적용, 예컨대 소, 양 등의 가축 및 개 및 고양이 등의 애완동물의 질환의 치료를 위해 중요한 용도를 갖는다.

본 명세서에 기재된 MHC 복합체 또는 그러한 복합체를 코딩하는 DNA 구조물은 개체에 단독으로 투여될 수 있는 반면, 이들은 또한 각각 제약 조성물의 일부로서 사용될 수 있다. 제약 조성물은 일반적으로 하나 이상의 본 발명의 MHC 복합체 또는 이들 복합체를 코딩하는 DNA 구조물과 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함한다. 담체는 제형의 다른 성분과 상용성의 의미에서 "허용 가능한" 것이어야 하고 그의 수여자에게 해롭지 않아야 한다. 예를 들면, 주사제에 의한 것과 같은 비경구 투여를 위하여, 멸균 용액 또는 물과의 현탁액 또는 기타 제약학상 허용되는 용액을 제조할 수 있다. 그러한 제약 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 적합하게 제조된다.

주어진 요법에 사용하기 위한 주어진 MHC 복합체 또는 이를 코딩하는 DNA 구조물의 실질적인 바람직한 양은 이용되는 특정 활성 화합물 또는 화합물들, 적용 모드, 투여의 특별한 부위, 환자의 체중, 일반적인 건강, 성 등, 치료되는 특정 적응증, 및 주치의 및 수의사를 포함한 당업자에 의해 인식되는 기타의 인자에 대하여 다양할 것이다. 주어진 투여 프로토컬에 대한 최적의 투여률은 예를 들면 상기의 가이드라인 및 본 명세서에 기재된 분석 방법 등에 관련하여 수행된 통상의 투여량 결정 시험을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 빈 MHC 복합체, 예컨대 빈 sc-MHC 클래스 II 복합체는 적합한 제공 펩티드와 혼합하여 본 발명의 부하된 sc-MHC 복합체를 형성할 수 있다. 그러한 부하된 복합체는 MHC 펩티드 융합 복합체의 투여가 상기한 바와 같이 표시된 일부의 경우에 적합하게 사용될 수 있다. MHC 펩티드 융합 복합체를 코딩하는 DNA 구조물이 사용되는 경우, 적절한 조건이 적합한 항원 제공 펩티드를 MHC 분자의 펩티드 결합 그루브 또는 클레프트에 비공유적으로 결합시키는 것을 제공한다면, 적합한 빈 단일쇄 MHC 복합체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 구조물을 사용할 수 있다. 적합한 제공 펩티드를 빈 단일쇄 MHC 복합체에 결합시키기 위한 조건의 예를 이하 자세히 설명한다. 본 발명의 부하된 MHC 복합체, 예컨대 부하된 MHC 클래스 II 펩티드 융합 복합체는 상기한 바와 같이 인간, 동물 및 애완동물의 치료에 있어서 용도를 갖는다.

본 발명의 MHC 복합체는 공개된 PCT 출원 제 WO 96/04314에 기재된 방법에 따라 트랜스제닉 마우스 계통을 만든는데 사용할 수 있다. 그러한 마우스 계통은, 예를 들면 T-세포와 같은 특정 면역 세포의 활성이 조정될 수 있는 모델 시스템으로서 유용할 것이다.

용어, "특이적 결합" 또는 유사한 용어는 다른 분자에 결합함으로써 특이적 결합쌍을 형성하지만, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅, ELISA, RIA, 겔 운동성 이동 분석, 효소 면역분석, 경쟁적 분석, 포화도 분석 또는 당업계에 알려진 기타 적합한 단백질 결합 분석에 의해 결정되는 바의 다른 분자를 인식하여 결합하지 않는 본 명세서에 기재된 분자를 의미한다. 일반적으로 단백질 사이의 특이적 결합을 검출하기 위한 적합한 통상의 방법들에 대한 문헌[Ausubel et al., 상기함; Sambrook et al., 상기함; 및 Harlow and Lane Antibdies: A Laboratory Manual, CSH Publication, N.Y. (1988)]을 참조하기 바람.

또한 용어, "프로모터"란 전사적 효소 복합체가 유전자의 전사를 개시하기에 앞서 결합되는 DNA의 세그먼트를 의미한다. 트랜스제닉 마우스의 제조를 위한 바람직한 프로모터는 IA^d프로모터, 및 문헌[Ohashi et al. in Cell 65, 305-317 (1991)]에 기재된 래트 인슐린 프로모터를 포함한다.

여기에서 언급된 모든 서류들은 이들의 전부를 본 명세서에서 참고로 인용한다.

다음의 비제한적인 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예 1 하나의 TM 도메인 (sc-IA^d/OVA)을 갖는 단일쇄 클래스 II MHC 복합체의 제작 및 세포 표면 발현

본 명세서에 기재된 방법에 따라, sc-IA^d/OVA 융합 분자(도 1 및 서열 번호: 24 및 25 참조)를 다음의 방법에 의해제조하였다.

역전사효소-폴리머라아제 사슬 반응(RT-PCR)을 수행하여 A20-1.11 세포[K. Kim et al., J. Immunol., 122:546(1979)]로부터 단리된 전체 RNA로부터 IA^dα 및 β 쇄 유전자 단편을 증폭시켰다. 적합한 제한 효소 부위들을 클로닝을 촉진하기 위하여 PCR에 의해 유전자 단편의 각 단부에 도입시켰다. 10 아미노산 펩티드 링커를 코딩하는 DNA 서열을 β1-β2 유전자 단편의 5' 말단에 도입시키고 코작(Kozak) 공통 서열을 PCR에 의해 β 신호 서열의 5' 말단에 도입시켰다. 24 아미노산 링커 및 OVA 항원성 펩티드를 코딩하는 영역을 어닐링된 올리고뉴클레오티드로부터 발생시켰다. pBlueScript-II 벡터(Stratagene) 중에 PCR 단편 및 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 어셈블리는 sc-IA^d융합 유전자를 발생시켰다(도 1 및 서열 번호 24 참조). 포유류 발현을 위해, pSCT1 벡터를 sc-IA^d/OVA(α쇄 TM 및 세포질 영역을 포함함)를 pEE13의 CMV 프로모터(Cell Tech)의 하류단에 서브클로닝함으로써 발생시켰다. 이 pEE13 벡터는 선별 가능한 글루타민 합성효소 유전자를 지닌다.

sc-IA^d/OVA 융합 분자를 다음의 방법에 의해 세포 표면 발현에 대하여 시험하였다: sc-IA^d/OVA 융합 유전자를 지닌 발현 벡터로 형질감염된 플라스마사이토마(Plasmacytoma) NS-0 세포들을 선별하고 클래스 II 분자의 표면 발현을 플루오 사이토메트리에 의해 검사하였다. 이 NS-0 세포들을 sc-IA^d/OVA 융합 유전자를 지닌 선형화된 pSCT1 DNA로 전기천공에 의해 형질감염시켰다. 세포들을 글루타민이 없는 배지에서 성장에 의해 선별하였다. 형질전환체(즉, T12 세포)는 14-21 일 후에 분명하게 나타났고, 클래스 II MHC 분자의 표면 발현에 대하여 분석하였다. 세포들을 FITC-공액된 앤티-IA^dmAb(AMS-32.1 PharMingen)으로 염색하고 형광을 플로우 사이토메트리에 의해 검사하였다. 동위원소를 부착시킨 FITC-공액된 앤티-IA^kmAb(10-3.6; PharMingen)을 음성 대조군으로 사용하였다.

도 2A는 기능성 단일쇄 융합 분자의 세포 표면 발현을 나타낸다. 적합한 형질감염체들을 IA^d및 앤티-IA^kmAb를 사용하여 플로우 사이토메트리에 의해 분석하였다. T12 형질감염체에 대해 나타낸 결과는 3 개의 다른 독립적인 형질감염체에 대해 스크리닝한 것과 유사하였다(m.f.i.=형광 강도). 이 결과는 sc-IA^d/OVA 발현 벡터로 형질감염된 세포의 표면에서 sc-IA^d/OVA 발현에서의 증가를 입증한다. 온전한 β TM 도메인은 클래스 II 분자의 세포 표면 발현에 필요하지 않다; β 및 α 쇄들을 연결하는 신축성 링커는 β TM 도메인의 기능을 대신할 수 있다. 마지막으로, 이 결과는 제공 펩티드를 단일쇄 MHC 클래스 II 분자에의 공유적인 연결이 MHC 분자의 안정된 어셈블리 및 표면 발현을 촉진하였음을 입증한다. 제공 펩티드를 β쇄에 연결하는 것도 또한 단일쇄 MHC 융합 분자의 안정된 어셈블리 및 세포 표면 발현을 허용할 것이다.

실시예 2 세포 표면 sc-IA^d/OVA 복합체는 시험관 내에서 T-세포 응답을 유도한다

OVA 펩티드가 sc-IA^d융합 복합체 내에 적절히 겹쳐지는 지를 확인하기 위하여, sc-IA^d/OVA 형질 감염된 세포들을 T- 세포를 자극하는 이들의 능력에 대하여 분석하였다. T-세포 수용체(TcR)을 발현하는 쥐의 T-세포 하이브리도마(DO11.10)을 사용하였다. 이 TCR은 sc-IA^d의 의미에서 OVA 323-339 펩티드를 인식한다. 이들 세포의 TcR을 APCs와 상호작용 시켰을 때(여기서, sc-IA^d/OVA 형질감염체) DO11.10는 인터류킨-2(IL-2)를 분비하였다. DO11.10 세포(2x10⁵/웰)을 T12 형질감염체(1x10⁵/웰)의 NS-0 세포의 존재하에서 24 시간 동안 배양시키고 배양 배지 내로 방출된 IL-2를 IL-2 특이성 ELISA(PharMingen)에 의해 결정하였다. 쥐 IA^d-운반 B 세포 임파종, A20-1.11 (1x10⁵/웰)을 항원 제시의 양성 대조군으로서 작용하는 20 mM OVA 323-339로 펄스처리하였다[참조: K. KIM et al., J. Immunol., 122:549(1979)]. T12 세포의 단독의 배양 배지에서 IL-2는 검출되지 않았다. 도 2B에 나타난 바와 같이, NS-0 세포(비형질감염됨)은 DO11.10 세포를 자극하는데 실패한 반면, sc-IA^d/OVA 융합 유전자로 형질감염된 세포들은 DO11.10 세포로부터 IL-2의 방출을 강력히 자극하였다. 결과들은 두 개의 다른 sc-IA^d/OVA 형질감염체에 대해서 관찰한 것들과 동일하였다. IL-2 분비의 정도는 OVA 펩티드로 펄스 처리된 IA^d-운반 APCs에 서 관찰된 것에 필적하였다. 이 결과는 OVA 펩티드가 IA^d융합 복합체 내에서 적절히 겹쳐져 있고, 이 겹쳐진 OVA 펩티드는 IA^d의 면에서 DO11.10 세포의 표면에서 TcR에 의해 인식됨을 입증한다.

실시예 3 단일쇄 클래스 II 및 단일쇄 클래스 II-IgG C_L융합 유전자의 제작

두 상이한 IA^d-제한 펩티드들을 사용하였다: 병아리 난알부민으로부터 OVA 323-329 (ISQAVHAAHAEINEAGR(서열 번호: 26))[참조: Buus, S. et al., Science 235:1353 (1987)] 및 HSV-1 당단백질 D로부터의 gD 246-261 (APYSTLLPPELSETP(서열번호: 27))[참조: Grammer, S.F., et al. J. Immunol. 145:249 (1990)]. 이들 펩티드들을 코딩하는 올리고뉴클레오티드들을 sc-IA^d유전자의 신호 펩티드 서열 및 펩티드 링커 사이에 삽입하였다(예컨대, 도 1 및 3A, B 참조). 제작된 결과의 융합 유전자는 펩티드가 없는 것(sc-IA^d/블랭크), OVA 323-339 펩티드(sc-IA^d/OVA), 또는 gD 246-261 펩티드(sc-IA^d/gD)를 가지는 sc-IA^d융합 단백질을 코드하였다.

본 실시예에서 기술한 벡터의 발생에 관한 자세한 반응도는 도 3A-3N에 나타나 있다. sc-클래스 II 유전자의 제작에 사용된 프라이머는 표 1에 나타냈다. 역전사효소-폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCRs)을 수행하여 A20-1.11 세포로부터 단리된 전체 RNA로부터의 IA^dα 및 β 쇄 유전자 단편을 증폭시켰다. 다음의 올리고뉴클레오티드 쌍들을 초기의 PCR 증폭에 사용하였다: IA^dβ 리더 유전자 단편-OPR 132(서열 번호: 2), OPR 133(서열 번호: 3), IA^dβ1-β2 유전자 단편-OPR 102(서열 번호: 4), OPR 104(서열 번호: 5), IA^dα1-α2 -OPR 100(서열 번호: 6), OPR 101(서열 번호: 7). 제한 부위들은 후속 PCR 증폭에서 단편 클로닝을 촉진시키기 위하여 유전자 단편의 말단에 도입시켰다. 10 아미노산 펩티드 링커를 코딩하는 서열을 β1-β2 유전자 단편의 5' 말단에 도입시키고, 코작 공통 서열(서열 번호: 1)을 PCR에 의해 β 신호 서열의 5' 말단에 도입시켰다. 24 아미노산 링커 및 항원성 펩티드를 코딩하는 영역을 어닐링된 올리고뉴클레오티드로부터 발생시켰다. pBlueScript-II 내의 PCR 단편 및 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 어셈블리는 도 3A 및 3B에 나타낸 sc-IA^d융합 유전자를 발생시켰다.

가용성 발현을 위해, sc-클래스 II 융합 유전자는 적합한 분비 및 프로세싱을 위한 신호 펩티드, 항원성 또는 자동-반응성 펩티를 위한 영역, 펩티드 링커 서열, 클래스 II β1-β2 도메인, 단일쇄 폴리펩티드 링커 서열 및 클래스 II α1-α2 도메인을 코드한다. 추가의 서열을, 정제를 촉진하고 sc-클래스 II 분자에 연결 단백질 및(또는) 효과기 분자에 결합하는 능력을 제공하기 위하여, 클래스 α1-α2 도메인 뒤에 삽입시킬 수 있다. 이들 서열들은 6 개의 히스티딘 잔기(6XHis 또는 6H) 및 항체 tag 서열(EE tag) 또는 IgG C^L도메인을 코딩하는 것들을 포함한다.

예를 들면, sc-IA^d/-IgG Cκ 융합 구조물의 발생은 다음과 같이 수행하였다: OVA-IA^dβ1-β2-sc 링커-IA^dα1-α2 주형(실시예 1 참조)을 올리고뉴클레오티드 프라이머, IADF100 (서열 번호: 8), IADB100 (서열 번호: 9)로 PCR 증폭시켰다. 이들 반응은 OVA 서열의 5'에 EcoRV 부위를 부가하고 카파 엑손/인트론 서열 및 BstBI 부위를 α2 서열의 3'에 첨가하였다. 이 sc-IA^d/OVA PCR 생성물을 pGEM-T 벡터로 클로닝시키고 서열을 확인하였다. 이어서 융합 유전자를 CMV 프로모터, 마우스 IgG 카파 리더 펩티드, 클로닝 영역, 마우스 카파 인트론 및 마우스 카파 불변 도메인 엑손 서열을 지닌 포유류 발현 벡터 pSUN6(후술함) 내에 서브클로닝시켰다. 생성된 벡터를 pIADK라고 한다.

1. 다발성 경화증-관련된 유전자의 클래스 II MHC 분자 내로의 삽입

다발성 경화증-관련 HLA-DR2 (1501) 유전자들을 sc-IA^d유전자의 것과 유사한 단일쇄 포맷으로 연결시켰다(도 4A 및 4B 참조). sc-DR2 유전자 생성물은 다발성 경화증-관련 펩티드, 예컨대 MBP(83-102)Y83:Y-D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P-P(서열 번호: 28) [Arimilli, S. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270:971)과 복합체를 이룰수 있다(공유적으로 또는 비공유적으로). 이 DRAI*0101α1α2 유전자 단편(1 내지 192 아미노산을 코딩함)을 먼저 이미 기술한 바와 같이 단리하였다(참조, 공개된 PCT 출원 WO 96/04314). 이 유전자 단편을 그의 5' 말단에 HindIII 및 XhoI 부위 및 그의 3' 말단에 BamHI 부위를 부가한 프라이머(OPR158, DR1A-B)로 PCR에 의해 재증폭시켰다. 이 HLA-DR2 α1-α2 유전자 단편을 서열 확인을 위해 클로닝 영역(HIndIII, BamHI 및 EcoRI 부위)을 지닌 셔틀 벡터 pJRS161.1 내로 서브클로닝시켰다(HindIII 및 BamHI를 사용하여). HLA-DR2 α1-α2 유전자 단편을 클로닝 영역(NcoI, Nhel 및 SpeI 부위), 14 아미노산 링커 서열(T-S-G-G-G-G-S-G-G-G-S-S-S, 서열 번호 29) 및 제2 클로닝 영역(XhoI, BamHI 및 EcoRI 부위)를 지닌 세균성 셔틀 벡터, SBIA 내로 서브클로닝시켰다(XhoI 및 EcoRI를 사용함). EE 항원 tag(E-E-E-E-Y-M-P-M-E-P-G-정지(서열 번호: 30)를 코딩하는 어닐링된 뉴클레오티드 (OPR2030000(서열 번호: 12), (OPR 203001)(서열 번호: 13)를 제2 클로닝 영역의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝시켰다. 생성된 벡터를 SBDE1으로 명명하였다. HLA-DR2 α1-α2 유전자 단편을 또한 클로닝 영역 (NcoI, Nhel 및 SpeI 부위), 24 아미노산 단일쇄 링커 서열(T-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-S-S(서열 번호: 31) 및 제2 클로닝 영역 (XhoI, Bam HI 및 EcoRI 부위)를 지닌 세균성 셔틀 벡터 내로 서브클로닝(XhoI 및 EcoRI를 사용함)시켰다. EE 항원 tag를 코딩하는 어닐링된 뉴클레오티드 (OPR 203000, OPR 203001)를 제2 클로닝 영역의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝시켰다. 생성된 벡터를 SBDE1으로 명명하였다. 생성된 벡터를 SEE3으로 명명하였다. HLA-DR2(1501) 유전자 서열의 개시에 대한 문헌[Kabat, E.A., 상기함]을 참조하기 바람.

HLA-DRB1*1501 유전자에 대하여, 전체 RNA를 인간 임파구 세포주, DO208915(ASH 보관 입수 번호 9008)로부터 단리하였다. HLA-DRB1*1501 β1-β2 유전자 단편(아미노산 1-188)의 cDNA의 발생 및 PCR 증폭을 올리고뉴클레오티드 프라이머 (DR2B-F)(서열 번호: 14), (DR2B-B2)(서열 번호: 15)를 사용하여 수행하였다. 이들 프라이머는 NheI 부위 및 8 아미노산 링커 서열의 β1 서열의 5' 말단에의 부가 및 SpeI 및 EcoRI 부위의 β2 서열의 3' 말단에의 부가를 허용한다. 이 DRB1*1501 PCR 생성물을 AfIII, NheI 및 EcoRI 제한 부위를 지닌 벡터 내로 클로닝시켰다(NheI/EcoRI). MBP(84-102)(D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-T-P-P(서열 번호: 32)를 코딩하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드 (MBPF, MBPR)을 DRB1*1501 벡터의 AfIII 및 NheI 부위에 서브클로닝시켰다. 24 아미노산 단일쇄 링커 서열(T-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-G-G-G-G-S-S-S(서열 번호: 31)을 코딩하는 DNA 단편을 DRB1*1501 벡터의 SpeI 및 EcoRI 부위에 서브클로닝시켰다. 마지막으로, 상기한 DRA1*0101 α1α2 유전자 단편(아미노산 1 내지 199를 코딩함)을 sc-링커 서열뒤에 삽입시켰다. 완성된 벡터는 MBP-DRB1*1501 β1β2-sc-링커-DRA1*0101 α1α2 유전자 단편을 가지며, 후속 조작을 위한 주형으로 작용하였다.

1. MHC 클래스 II β2 도메인에서의 결실은 가용성 발현을 증대시킨다.

증가된 가용성 발현을 시험하기 위하여, β2 도메인에서 결실을 포함하는 단일쇄 DR2 구조물을 발생시켰다(도 4B 참조). 일례에 있어서, 전체의 β2 도메인을 MBP-DRB1*1501 β1-β2 주형을 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머 [세균성발현을 위한-MB201816 (서열 번호: 16) 및 MB175959 (서열 번호: 17), 바큘로바이러스 발현을 위한-MB201817 (서열 번호: 18) 및 MB175959(서열 번호: 17)]를 사용하여 PCR 증폭시킴으로써 결실시켰다. 이들 반응은 MBP 서열을 다음: Y-D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-R-T-P-P(서열 번호: 28)으로 변화시켰다. 이 PCR 세균성 발현물은 그 기재 사항을 본 명세서에 참고로 인용하는 1997년 3월 7일자 출원된 미국 특허 출원 제 08/813,781호에 기재된 pKC 62로부터 유도된 세균성 발현 벡터 8BIA 내에 클로닝시켰다. 이 벡터는 클로닝된 유전자 단편의 유도 가능한 가용성 발현을 위한 phoA 프로모터 및 pelB 리더 서열을 지닌다. 세균성 발현을 위하여, MBP-DRB1*1501 β1 단편 (NcoI-SpeI)을 SBDE1 벡터 내에 서브클로닝시켜 SDRB2 발현 벡터를 얻었다. 바큘로바이러스성 발현을 위하여, pGEM-T 중의 MBP-DRB1*1501 β1 단편을 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 멜리틴 신호 펩티드를 코드하도록 변형된 pBlueBac4.5 버전 (Invitrogen) 내로 클로닝(NsiI-NcoI)시켰다. 14 아미노산 링커-DR2-α1-α2-EE-tag 융합 유전자 단편(SpeI-EcoRI)을 MBP-DRB1*1501 α1 단편을 지닌 pGEM-T 벡터 내에 서브클로닝시켰다. 단일쇄 DR2Δβ2/MBP 단편을 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 멜리틴 신호 펩티드를 코드하도록 변형된 pBlueBac4.5 버전 (Invitrogen) 내로 클로닝(NsiI-EcoRI)시켰다. 생성된 벡터를 pMB959로 명명하였다.

상기 pKC62 벡터(pSUN19)는 부다페스트 조약에 따라 미국 메릴랜드주 록빌 파크맨 드라이브 12301 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되어 있다. 이 DNA 벡터는 1997년 2월 26일자로 기탁되었으며, 기탁번호 97896을 받았다. pKC62 벡터는 pho A 프로모터, 변형된 pelB 서열, 유전자 10 리보솜 결합부위 및 박테리오파아지 유전자 VIII 프로모터를 포함한다. 이 DNA 벡터는 대장균 또는 기타 적합한 숙주에서 표준 방법에 따라 용이하게 증식시킬 수 있다.

β2 도메인을 더 변형시키기 위하여, pCI-neo/DR2 주형을 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머 [MB201807 (서열 번호: 18) 및 MB201810 (서열 번호: 21), MB201819 (서열 번호: 20) 및 MB201808 (서열 번호: 19)]를 사용하여 PCR 증폭시켜 아미노산 117에서의 Cys 코돈을 Ser 코돈으로 돌연변이시키고, 이어서 MB201807 (서열 번호: 18) 및 MB201808 (서열 번호: 19)을 사용하여 PCR을 중복하였다. 이들 반응은 MBP 서열을 다음: Y-D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N-I-V-T-P-R-R-T-P-P(서열 번호: 28)으로 변화시켰다.

이 PCR 생성물을 pGEM-T 벡터 내로 클로닝시키고 서열을 확인하였다. 베큘로바이러스성 발현을 위해, pGEM-T 중의 MBP-DRB1*1501 β1-modβ2 단편을 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 멜리틴 신호 펩티드를 코드하도록 변형된 pBlueBac4.5 버전 (Invitrogen) 내로 클로닝(NsiI-NcoI)시켰다. SDE3의 24 아미노산 링커-DR2-α1-α2-EE-tag 융합 유전자 단편(SpeI-EcoRI)을 MBP-DRB1*1501 β1-modβ2 단편을 지닌 pGEM-T 벡터 내에 서브클로닝시켰다. 단일쇄 DR2Δβ2/MBP 단편을 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 멜리틴 신호 펩티드를 코드하도록 변형된 pBlueBac4.5 버전 (Invitrogen) 내로 클로닝(NsiI-EcoRI)시켰다. 생성된 벡터를 pMB808로 명명하였다.

sc-DR2-IgG Cκ 융합 구조물의 발생을 위해, MBP-DRB1*1501 β1-β2-sc 링커-DRA*101 α1α2 주형을 올리고뉴클레오티드 프라이머, OPR215(서열 번호: 22), OPR216(서열 번호: 23)으로 PCR 증폭시켰다. 이들 반응은 BMP 서열의 5' 말단에서 AgeI 부위를 부가하였고, MBP 서열을 다음: Y-D-E-N-P-V-V-H-F-F-K-N- I-V-T-P-R-R-T-P-P(서열 번호: 28)으로 변화시켰으며, α2 서열의 3' 말단에 카파 엑손/인트론 서열 및 ClaI 부위를 부가하였다. 이 sc-DR2/MBP PCR 생성물을 pGEM-T 벡터 내로 클로닝시키고 서열을 확인하였다. 융합 유전자를 CMV 프로모터, 마우스 IgG 카파 리더 펩티드, 클로닝 영역, 마우스 카파 인트론 및 인간 카파 불변 영역 도메인 서열을 지닌 포유류 발현 벡터 pKCM 180(후술함) 내로 서브클로닝시켰다.

포유류 Ig-Cκ 발현 벡터, pSUN6 및 pKCM80은 다음과 같이 발생시켰다: 벡터의 골격은 클로닝된 유전자의 발현을 유도하기 위한 CMV 프로모터를 지닌 플라스미드 pCDN3 (Invitrogen)이었다.

이 플라스미드를 HindIII/XhoI로 절단하고 "경쇄 폴리링커" DNA 단편을 삽입하여 출발 pCDNA:LCPL 벡터를 만들었다. 이 링커는 제한 부위 HindIII, KpnI, ClaI, PmII, EcoRI, AgeI, BamHI 및 XhoI을 함유하여 후속 클로닝 단계를 촉진하였다. 경쇄 리더, 앤티-CKMB 카파 경쇄 게놈성 단편, 및 3'UTR을 포함하는 SmaI/BclI DNA 단편을 pCDNA:LCPL의 EcoRV/BamHI 부위 내에 클로닝시켰다. 이 단편 내의 마우스 인트론, 엑손 및 3'UTR은 문헌[Near, et al., (1990) Mol. Immunol. 27:901]에 기재된 pneo/20-10VL로부터 유도하였다. 이어서, 후속적인 돌연변이유발을 수행하여 적절한 제한 효소 부위를 도입시켜 pSUN6 벡터를 작제하였다.

이 벡터는 CMV 프로모터에 이어 경쇄 리더 서열 및 그의 가변성 영역 유전자가 EcoRV/BstB1 단편으로 존재하고 마우스 카파 불변 영역 도메인 유전자 서열이 EcoNI/XhoI 단편으로 존재하는 앤티 CKMMB 카파 경쇄 게놈 서열을 지닌다.

인간 Cκ 발현 벡터를 제조하기 위하여, pSUN6의 마우스 카파 불변 도메인 서열(EcoNI/XhoI)을 인간 카파 불변 도메인을 지닌 적절한 PCR 증폭시킨 단편으로 대체하였다. 생성된 벡터, pKCM180은 CMV 프로모터에 이은 경쇄 리더 서열, 앤티-CKMB 카파 경쇄 가변 도메인 엑손, 마우스 인트론, 인간 카파 경쇄 엑손 서열을 지닌다. 상기의 pDRHK 및 pIAdk 벡터는 부다페스트 조약에 따라 상기 주소의 ATCC에 기탁되었다. 이 DNA 벡터는 1997년 9월 17일자로 기탁되었으며, 기탁번호 209274(pD과) 및 209275(pIAdk)를 부여 받았다.

실시예 4 가용성 sc-MHC 클래스 II 분자의 세균 세포에서의 발현

MM294 대장균 균주(Sambrook et al, 상기함)을 표준 분자 클로닝 방법론에 의해 SDE3 플라스미드 (예, 가용성 sc-DR2Δβ2/MBP, 실시예 3 참조)로 형질전환시켰다. 이 벡터는 앰피실린에 대한 내성을 부여하는 유전자를 지닌다. 형질전환된 MM294 세포들을 고인산염 배지(규정된 배지-50㎍/ml 앰피실린, 0.4% 글루코오스, 0.15% 카사미노산, 0.0002% 티아민, 4 mM 트리신, 10 mM FeSO₄, 9.7 mM NH₄Cl, 0.29 mM K₂SO₄, 0.07 mM CaCl₂, 0.53 mM MgCl₂, 50 ml NaCl, 40 mM MOPS, pH 7.4 중의 10 mM KH₂PO₄) 중에서 30℃에서 밤새 성장시켰다. sc-DR2 유전자 생성물의 발현을 위해, 세포들을 낮은 인산염 배지(규정된 배지 중의 0.1 mM KH₂PO₄)로 이동시켜 30℃에서 8 시간 동안 유지시켰다. 세포들을 수확하고 PBS + 1% Triton-X100 중에 재현탁시켰다. 세포들을 초음파에 의해 파쇄시키고 가용성 물질들을 원심분리 후 얻었다. 발현된 sc-DR2 분자들은 포획 mAb로서 MAS-96p(Harlan Sera-lab) (0.1 ㎕/웰) 및 프로브 mAB로서 HRP-접합 L243 (0.1 ㎕/ml)(ATCC HB-55)을 사용한 형태 특이적 DR-특이성 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. 항체 결합은 아비딘 퍼옥시다아제(0.25 ㎍/웰)에 이어 ABTS 기질(Kirkegaard and Perry)로 인큐베이션 시킴으로써 검출하였다. 정제된 천연 DR2는 양성 표준으로 작용하였다. 이 분석의 결과를 표 2에 나타냈다.

표 2. 세균 세포로부터 sc-DR2의 생산
구조물SDE3(sc-DR2Δβ2/MBP	DR2 결핍됨1㎍/g 세포 펠릿

이들 결과는 β2 도메인이 결핍된 sc-DR2 분자는 천연 HLA-DR 배치의 적합한 겹침에 대해 특이적인 항체에 의해 인식되는 형태로 발현됨을 나타낸다. 이것은 클래스 II 분자의 β2 도메인은 α2 도메인과 상호작용하고, 복합체의 적절한 겹침에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 예기치 않은 결과이다[참조: Brown, J. H. et al. 1993. Nature 364:33]. 더욱이, 도메인의 제거는 세균 세포에서 sc-클래스 II 분자의 가용성 발현을 개선시키는 것으로 나타났다. 전체 β2 도메인을 지닌 sc-DR2 구조물이 대장균에서 불용성 형태로 발현되기 때문에 예측하지 못하였다.

1. 세균 세포에서 MHC 복합체의 대량 생산

가용성 sc-클래스 II 분자의 대량 생산은 세균 발현 계를 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들면, 80 리터의 규정된 성장 배지를 함유하는 발효기를 sc-DR2 융합 유전자를 지닌 형질전환된 MM294로 각각 접종시킬 수 있다. 이 세포는 표준 세균 발효 기술에 따라 유지시킬 수 있다. 일단 성장 배지 중이 인산염이 고갈되면, sv-DR2 유전자 생성물의 발현이 유도될 것이다. 세포들을 연속 플로우 원심분리에 의하거나 또는 밀리포어 펠리콘 접선 플로우 미공성 여과 단위에 의해 적합한 시간에 수집할 수 있다. 세포들을 가울린 프레스를 사용하여 파쇄하고 sc-MHC 클래스 II 분자를 지닌 가용성 물질들을 원심분리에 의해 얻을 수 있다. 각각의 발효는 가용성 MHC 클래스 II 분자를 약 0.01-0.1 그램의 양으로 생산할 것으로 예측된다.

실시예 5 가용성 sc-MHC 클래스 II 분자의 세균 세포에서의 발현

가용성 sd-IA^d및 sd-DR2 분자는 바큘로바이러스 발현계(InVitrogen)를 사용하여 SF9 곤충 세포로부터 얻었다. 펩티드가 없는 것(sc-IA^d/블랭크), OVA 323-339 펩티드(sc-IA^d/OVA), 또는 gD 246-261 펩티드(sc-IA^d/gD)를 가지는 sc-IA^d구조물을 제조원의 지시에 따라 pBluebac III의 바큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터의 하류에 개별적으로 서브클로닝시켰다. sc-DR2 구조물, pMB959 및 pMB808은 상기한 바와 같이 제조하였다. 융합 유전자들은 SF9 곤충 세포의 선형화된 wt AcMN-PV(야생형)와의 리포솜-매개 동시형질감염후 바큘로바이러스 내로 개별적으로 재조합시켰다. 제한 희석에 의한 클로닝후, 정제된 재조합 바이러스 스톡을 제조하였다.

더욱 구체적으로는, 가용성 sc-IA^d융합 유전자 산물의 생산은 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 Hink's TMN-로 곤충 배지에서 SF9 세포(1x10⁶세포/ml)을 감염시킴으로써 수행하였다. 감염의 배수(MOI)는 약 10이었다. 5일 후, 배양 상층액을 수집하고 이어서 친화 정제에 앞서 1M Tris로 pH 8.0으로 조정하였다.

발현된 sc-IA^d분자는 포획 mAb로서 M5/114[Bhattacharya, A., M. E. Dorf, T. A. Springer. 1981. J. Immunol. 127:2488] (0.1 ㎕/웰) 및 프로브 mAB로서 비오틴-접합 AMS32.1 [Wall, K. A., M. I. Lorbver, M. R. Loken, S. McClatchey, and F. W. Fitch (1983) J. Immunol. 131:1056] (0.1 ㎕/ml)(PharMingen)을 사용한 감수성 IA^d-특이적 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. 항체 결합은 아비딘 퍼옥시다아제(0.25 ㎍/웰)에 이어 ABTS 기질(Kirkegaard and Perry)로 인큐베이션시킴으로써 검출하였다.

다른 실시예에 있어서, β2 도메인에서 변형을 가진 가용성 sc-DR 융합 유전자 산물의 생산을 시험하였다. SF9 세포의 감염은 상기한 바와 같이 수행하였다. 발현된 sc-DR2 분자들은 포획 mAb로서 MAS-96p(Harlan Sera-lab) (0.1 ㎕/웰) 및 프로브 mAB로서 HRP-접합 L243 (0.1 ㎕/ml)(ATCC HB-55)을 사용한 형태 특이적 DR-특이성 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. 항체 결합은 아비딘 퍼옥시다아제(0.25 ㎍/웰)에 이어 ABTS 기질(Kirkegaard and Perry)로 인큐베이션 시킴으로써 검출하였다. 정제된 천연 DR2는 양성 표준으로 작용하였다. 이 분석의 결과를 표 3에 나타냈다.

표 3. 곤충 세포로부터 sc-DR2의 생산
구조물Pmb959(sc-DR2Δβ2/MBP	검출됨1.0 ㎍/ml
PMB808(sc-DR2modβ2/MBP	1.0 ㎍/ml

이전에 논의한 바와 같이, 이들 결과는 클래스 II 분자의 β2 도메인은 복합체의 적절한 겹침에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 예기치 않은 결과이다[참조: Brown, J. H. et al. 1993. Nature 364:33]. 이 도메인이 결핍되거나 또는 이 도메인에서 변형을 가진 sc-DR2 분자는 천연 HLA-DR 배치의 적절한 겹침에 대해 특이적인 항체에 의해 인식된다. 더욱이, 이 도메인의 제거 또는 변형은 곤충 세포에서 sc-클래스 II 분자의 가용성 발현을 개선시키는 것으로 나타났다. 이는 전체 β2 도메인을 지닌 sc-DR2 구조물이 이 시스템에서 불충분하게 발현되기 때문에 예측하지 못하였다.

1. 곤충 세포에서 MHC 복합체의 대량 생산

가용성 sc-클래스 II 분자의 대량 생산은 성취할 수 있다. 예를 들면, 20 리터의 성장 배지를 함유하는 3개이 스피너 플라스크를 약 2 x 10¹⁰의 SF9 곤충 세포로 각각 접종시킬 수 있다. 이 세포는 표준 세균 발효 기술에 따라 유지시키고 계속적으로 50% 산소:50% 질소를 공급할 수 있다. 이어서 각각의 스피너 플라스크를 재조합 바큘로바이러스 스톡 중 하나로 접종하고 SF9 배양 배지를 밀리포어 펠리콘 접선 플로우 미공성 여과 단위에 의해 적합한 시간에 수집할 수 있다.

실시예 6 가용성 sc- IA^d분자의 포유류 세포에서의 발현

포유류 세포주의 형질감염 및 선별은 다음과 같이 수행하였다: 1x10⁷NSO세포들을 빙냉 PBS 중에 2회 세척하고, 찬 PBS 760 ㎕ 중에 재현탁시키고, SalI 선형화된 플라스미드 SCE1 DNA(즉, 가용성 형태의 sc-IA^d/OVA 분자에 대한)와 혼합시켰다. 얼음 상에서 5 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포들을 Gene Pulser(Biorad)를 사용하여 전기천공시켜 250 볼트, 960 μFd의 1 펄스를 전달하였다. 펄스 처리된 세포들은 얼음 상에 2-5분 동안 위치시키고 비-선택적 배지(IMDM, 10% FBS, 2mM 글루타민, 5000 단위/ml 페니실린, 5000 ㎍/ml 스트렙토마이신) 30 ml에 첨가하였다. 세포들을 96-웰 평저 조직 배양 플레이트 내에 위치시키고 24 시간 후에 선택 배지(IMDM, 10% 투석된 FBS, 5000 단위/ml 페니실린, 5000 ㎍/ml 스트렙토마이신, 1x뉴클레오시드, 1x글루타메이트+아스파라긴) 150 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 일주일 토대로 사용된 배지 100 ㎕/웰을 제거하고 새로운 선택 배지 100 ㎕/웰을 첨가함으로써 선택 배지로 채우고, 세포들을 점차적으로 모든 잔류 글루타민의 배지를 고갈되게 하였다. SCE1 플라스미드 상에 운반되는 글루타민 합성효소는 무글루타민 배지에서 형질감염된 세포의 선택적인 성장을 허용하였다. 이 플라스미드로 형질감염된 세포의 콜로니는 14-21일 후에 명확하게 나타났다.

SCE1 벡터(즉, 가용성 형태의 sc-IA^d/OVA 분자)를 운반하는 형질감염체들을 팽창시키고 상기한 IA^d특이성 ELISA 분석에 의해 MHC 분자의 발현 및 분비를 스크리닝하였다. SCE1 벡터의 제작은 공개된 PCT 출원 WO 96/04314호에 기재되어 있다. 두 SCE1 형질감염된 세포주로부터의 배양 상층액의 그러한 분석 결과는 표 4에 나타냈다. 이들 결과는 형질감염된 세포가 IA^d/OVA 분자를 생산하여 분비하였음을 나타낸다.

〈표 4〉

SCE1 형질감염체 세포 배양 상층액에 관한 IA^dELISA 분석

배양 상층액(비희석)	흡광도
NSO(모세포 주)	0.444
E10 (SCE1 형질감염체)	0.781
E11 (SCE1 형질감염체)	0.960
곤충 세포 배양으로부터 sc-IAd/OVA(양성 대조군)	2.44

1. IgG Cκ 단편의 융합은 가용성 발현을 촉진한다

sc-클래스 II 분자의 발현 수준이 개선될 수 있는지를 시험하기 위해, sc-IA^d/OVA 단편 및 IgG Cκ 단편 사이의 유전자 융합체를 제조하였다(실시예 3 참조). 이 구조물은 다음과 같이 포유류 세포주에 형질감염시켰다:

1x10⁷NSO세포들을 빙냉 PBS 중에 2회 세척하고, 찬 PBS 790 ㎕ 중에 재현탁시키고, PvuI 선형화된 플라스미드 pIADK DNA 10 ㎍(㎍/㎕)와 혼합시켰다. 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션시킨 후, 세포들을 Gene Pulser(Biorad)를 사용하여 전기천공시켜 250 볼트, 960 μFd의 1 펄스를 전달하였다. 펄스 처리된 세포들은 얼음 상에 10분 동안 위치시키고 IMDM 배지(IMDM, 10% FBS, 2mM 글루타민, 5000 단위/ml 페니실린, 5000 ㎍/ml 스트렙토마이신) 10 ml에 첨가하였다. 세포들을 T25 조직 배양 플레이트 내에서 37℃, 5% CO₂에서 배양시키고, 24 시간 후에 네오마이신 선택 배지(IMDM, 1.5 mg/ml G418) 20 ml을 첨가하였다. 이에서 세포들을 200㎕/웰로 96웰 평저 조직 배양 플레이트로 옮기고, 37℃, 5% CO₂에서 배양시키고, 네오마이신 선별 배지를 매 3-7일 마다 공급하였다. pIADK 벡터는 안정되게 형질감염된 세포의 선택적 성장을 허용하는 네오마이신 내성 유전자를 가진다. 이 벡터로 형질감염된 세포의 콜로니는 14-21일 후에 명확하게 나타났다. pIADK 벡터를 운반하는 형질감염체를 이전에 기술한 바와 같이, 팽창시키고, IA^d-특이성 ELISA에 의해 가용성 sc-클래스 II-Cκ 분자의 발현에 대해 스크리닝하였다. 곤충 세포에 의해 생산된 정제된 sc-IA^d/OVA는 참고 표준으로 작용하였다. pIADK 형질감염된 세포주로부터의 배양 상층액의 분석결과는 표 5에 나타냈다.

〈표 5〉

포유류 세포에서 sc-IA^d/OVA-Cκ의 생산

세포주	생성된 가용성 IAd
NSOB7	81 ng/1x106세포/일
NSOE2	156 ng/1x106세포/일
NSOG4	116 ng/1x106세포/일
NSOD4	109 ng/1x106세포/일

이 결과는 가용성 sc-IA^d-Cκ 융합 분자가 두 배치-특이성 항체에 의해 인식되는 형태로 생성되었음을 나타낸다. 이러한 결과에 기초하면, NSEO2 형질전환체는 2 리터의 네오마이신 선택 배지에서 스피너 플라스크에서 팽창하고 성장하였다.

이 sc-IA^d-Cκ융합 분자들은 하기 실시예 7에 기재된 바와 같이 정제되었다.

또한, 인간 sc-클래스 II-Cκ융합체의 가용성 생산을 포유류 세포에서 시험하였다. CHO 세포들을 pDRHK 발현 벡터로 형질감염시키고 네오마이신 선택 배지 중에서 성장시켰다(상기 참조). 안정된 형질감염체들을 두가지 상이한 ELISA 포맷을 사용하여 가용성 sc-DR2/MBP-Cκ분자의 생산에 대하여 스크리닝하였다. 첫 번째 포맷에서, 항-인간 카파 항체를 포획 Ab로서 및 HRP-접합 L243 (ATCC HB-55)을 프로브 mAB로서 사용하였다. L243 mAb는 HLA-DR 분자 상의 형태학적 에피토프에 대해 특이적이다. 따라서, 이 분석 포맷은 적합하게 겹쳐진 DR2-Cκ 융합을 검출한다. 두 번째 포맷에서, 앤티-LHA-DR L227 mAb (ATCC HB-96)을 포획 mAb로서, HRP-접합 L243 (ATCC HB-55)을 프로브 mAB로서 사용하였다. L227 및 L243 mAb는 각각 HLA-DR분자 상의 선형 및 형태학적 에피토프에 대하여 특이적이다. 이 분석 포맷은 적합하게 겹쳐진 DR2 부분을 검출한다. 항체 결합은 아비딘 퍼옥시다아제에 이어 ABTS 기질(Kirkegaard and Perry)로 인큐베이션 시킴으로써 검출하였다. 정제된 천연 DR2는 양성 표준으로 작용하였다. 이 분석의 결과를 표 6에 나타냈다.

표 6- 포유류 세포에서 scDR2/MPB-Cκ의 생산
	ELISA 판독 (흡광도)
세포주	앤티-카파Ab:L243-HRP	L227 mAB:L224-HRB
CHOE 12	1.056	0.245
CHOA5	1.445	0.434
형질감염되지 않은 CHO (음성 대조군)	0.078	0.071

이 결과는 가용성 sc-DR2/MBP-Cκ융합 분자가 형질감염된 세포에 의해 생산되어 세포 배지로 방출됨을 나타낸다. 이 가용성 DR2/MBP-Cκ융합 분자는 형태학적으로 올바른 형태로 겹쳐진다.

2. MHC 복합체의 포유류 세포에서 대규모 발현

본 명세서에 기재된 NSO 및 CHO 세포 발현 시스템은 sc-MHC 클래스 II 분자(빈 또는 공유적으로 펩티드와 연결된 것)을 대량으로 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, sc-DR2/MBP-Cκ 분자를 발현하는 형질감염된 CHO 세포주 선별하여 3 개의 별도의 공동섬유 생물반응기 중에 융합에 이를 때까지 성장시킨다. 표준 생물반응기 기술에 따라, 약 1 x 10⁹CHO 세포들을 공동 섬유 생물 반응기 카트리지(Unisyn)의 모세관외 공간(EC)으로 접종시킬 수 있다. 새로이 산소를 공급한 배지를 형질감염된 CHO 세포의 성장 동안 공동 섬유를 통해 연속적으로 순환시킨다. 이어서 가용성 sc-MHC 클래스 II 분자를 EC 챔버로부터 (매일) 30-120일 동안 수확한다. 각 생물반응기는 각각의 가용성 MHC 클래스 II 분자를 약 0.1-1 그램의 양으로 생산할 것으로 예측된다.

실시예 7 가용성 sc-MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자의 정제

상기 실시예 5로부터의 곤충 세포 상층액을 단백질 A 세파로오스 칼럼 상에 통과시켰다. 이어서 미결합 물질을 MK-D6 mAb[참조: Kappler, J. W., B. Skidmore, J. White, P. Marrack 1981. J. Exp. Med. 153:1198] 단백질 A 세파로오스 칼럼에 가하였다. 칼럼을 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0로 세척하였다. sc-IA^d융합 단백질을 50 mM 글리신-HCl, pH 11.0으로 용출시킨 후 곧바로 pH 8.0으로 중성화시켰다. 융합 단백질을 농축시키고 센트리콘(Centricon) 30을 사용하여 20 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 완충액을 교환시켰다. 이들 방법은 sc-클래스 II 유전자를 지닌 포유류 세포에 의해 생성되는 배양 상층액으로부터 가용성 sc-클래스 II 분자를 대규모로 생산하는데에 용이하게 적용시킬 수 있다. 통상적으로, 이 정제 공정은 곤충 세포 배지 리터 당 200-1000㎍ sc- IA^d/펩티드 분자를 생성하였다.

제제의 순도는 친화 칼럼으로부터의 용출물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 평가하였다. 겔은 대략 50 kDa의 주된 밴드를 나타냈다(도 5A, 레인 1, 2 및 3). 예상했던 바와 같이, 이들 분자들은 글리코실화되었고 연결된 펩티드에 기인하여 질량에 있어서 약간의 차이를 보였다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 sc-IA^d/OVA 단백질 시료에서 OVA 323-339 펩티드의 존재가 확인되었다(도 5A, 레인 5). 다른 단백질 검출 분석에 있어서, 정제된 고정화된 sc-IA^d/OVA 및 sc-IA^d/블랭크 단백질들은 IA^d(예컨대, MK-D6, M5/114, ASM-32.1, 39-10-8 또는 34-5-3)에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체에 의해 독립적으로 결합되었다. MHC 복합체와 특이적으로 결합할 수 있는 기타의 단일 클론 항체는 몇가지 공급원, 예컨대 ATCC 및 상기 제공한 주소의 린스코트 디렉토리(Linscott's Directory)로부터 공공 입수 가능하다.

또다른 실시예에 있어서, MK-D6 mAb를 사용한 친화 클로마토그래피 방법을 사용하여 포유류 조직 배양 배지로부터 sc-IA^d/OVA-Cκ 융합 단백질을 정제하였다(실시예 6 참조).

MHC 클래스 II 분자의 면역친화 정제 방법은 이전에 기술되었다[참조: Gorga, J.C., V. Horejsi, D.R. Jhonson, R. Raghupathy, and J.L. Strominger. (1987) J. Biol. Chem. 262:16087]. 이들 방법들은 일반적으로 본 발명의 가용성 sc-MHC 클래스 I 또는 II 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, HLA-DR 또는 HLA-DQ 도메인을 지닌 sc-MHC 클래스 II 융합 단백질에 대하여, 단일클론 항체 L243 및 G2.5(각각 DR 및 DQ에 대하여 면역 특이성이고 ATCC로부터 입수 가능함)를 이들 도메인을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 분자를 면역정제하는데 사용할 수 있다. 일례에 있어서, 이들 분자들은 곤충 세포에서 생산된 sc-DR2Δβ/MBP를 정제하는데 사용하였다(실시예 5 참조). 그러한 분리의 결과는 도 5B에 나타나 있다.

이전에 언급한 바와 같이, 가용성 sc-클래스 II 분자는 태그를 포함하도록 설계할 수 있다. 그러한 "태그된" 분자는 표준 방법으로 편리하게 정제할 수 있다. 6xHis 태그를 함유하는 분자를 이전에 기술한 방법에따라 일반적으로 Ni-IDA 세파로오스 패스트 플로우 컬럼 상에서 친화 정제시킬 수 있다. 간단히 설명하자면, 칼럼을 PBS, 0.5 M NaCl, 0.2%(v/v) Tween 20, pH 8.0으로 평형화시킨다. 광범위한 세척후, sc-MHC 클래스 II 단백질을 상이한 부분의 완충액 A(20 mM Na₂HPO₄, pH 7.0, 0.2 M NaCl) 및 완충액 B(20 mM Na₂H₂PO₄, pH 3.0, 0.2 M NaCl)를 혼합시킴으로써 수행되는 바의 단계적으로 pH를 감소시키면서 용출할 수 있다. 다른 예로서, EE 태그를 함유하는 가용성 sc-MHC 클래스 II 분자를 앤티-EE 태그 mAb-단백질 A 세파로오스 칼럼을 사용하여 통상의 면역친화 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 이 sc-클래스 II/IgG 융합 분자는 단백질 A 세파로오스 칼럼을 사용하는 통상의 친화 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다[참조: Ausubel et al., 상기함; Sambrook et al., 상기함].

당업자에게는 상기 sc-MHC 클래스 II 정제 계획은 본 발명의 기타 MHC 분자의 대규모 제조 및 정제에 용이하게 채택될 수 있음은 자명할 것이다.

실시예 8 sc-MHC 클래스 II/펩티드 복합체의 형성

실시예 7에서 생성된 sc-IA^d/블랭크 융합 분자가 생산적으로 펩티드에 결합되는지를 시험하기 위하여, sc-IA^d/블랭크 분자들을 고정화시키고 이어서 시트르산염 완충액, pH 5.0 중의 50 배 몰과량의 OVA 323-339로 37℃에서 20 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이들 복합체들은 PBS로 세척하고 본 명세서에 기재된 분석법에 이해 T-세포 응답을 자극하는 이들의 능력에 대하여 시험하였다. 펩티드를 MHC 클래스 II 분자 내로 부하하기 위한 방법은 보고되었다[참조, 예컨대 Stern, L. J. et al. 상기함].

이들 방법들은 궁극적으로 임의의 제공 펩티드를 MHC 클래스 II 복합체에 부하하는데 용이하게 적용될 수 있다. 일반적으로, 이들 방법은 정제된 클래스 II 분자를 20-50배 몰과량의 펩티드와 37℃에서 20-60 시간 동안 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 이들 반응의 최적 pH는 사용되는 특정 MHC 클래스 II 분자 및 펩티드에 따라 다를 것이지만, 일반적으로 제공 펩티드를 부하하기 위한 최적 pH는 약 pH 4.5 내지 pH 7 사이일 것이다[참조: Sette, A., S. et al. (1992) J. Immunol. 148:844]. MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 HPLC 겔 여과, 막 여과, 면역 흡착 또는 스핀 한외여과에 의해 유리 펩티드로부터 분리할 수 있다.

본 발명자들은 실시예 7에서 생성된 고정화된 sc- IA^d/블랭크 분자은 생산적으로 펩티드에 결합할 수 있었다. 도 6C 참조.

실시예 9 가용성 sc-MHC 클래스 II/펩티드 복합체의 기능성

상기 실시예 4, 5 및 6에서 생성된 가용성 sc-IA^d클래스 II 분자들을 본 명세서에 기재된 방법에 따라 T-세포 하이브리도마 세포주로부터 IL-2 방출을 자극하는 이들의 능력에 대하여 시험하였다. 이 가용성 sc-IA^d/OVA 및 sc-IA^d/gD 분자(PBS, pH 7.0)을 사용하여 96-웰 이뮤론(Immulon) II 플레이트 (Dynatech) 중의 웰을 밤새 피복시켰다. 이어서, T-세포 하이브리도마 DO11.10 세포주를 sc-IA^d/OVA 분자로 피복된 웰에 첨가하고, GD12 하이브리도마 세포주를 sc- IA^d/gD 피복된 웰(1 x 10⁵세포/웰)에 첨가하였다. DO11.10 세포의 TcRs가 IA^d/OVA 복합체와 상호작용 할 경우, 세포는 인터류킨-2(IL-2) 및 IL-4를 분비한다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, 고정화된 sc-IA^d/OVA는 DO11.10 세포에 의한 투여량 의존형 IL-2 방출을 나타냈다. 이러한 결과는 DO11.10 세포의 TcR에 의한 실시예 5에서 생성된 sc-IA^d/펩티드 융합 분자의 인식을 확인해 준다. 예측한 대로, DO11.10 세포는 sc-IA^d/블랭크에 대해 반응하는데 실패했다. 유사한 결과가 IL-4에서 보여졌다.

항원 특이성의 또다른 증거는 GD12 T-세포 하이브리도마를 사용하여 얻었다. 도 6B에 나타낸 바와 같이, GD12 세포는 고정화된 sc- IA^d/gD와는 잘 반응하였으나 sc-IA^d/OVA 분자에 의해서는 자극되지 않은 반면, DO11.10 세포는 정반대의 응답 특이성을 나타냈다.

이전의 연구는 곤충 세포에서 생성된 클래스 II 헤테로이합체성성 분자는 외인성 첨가된 펩티드에 결합하지 않았음을 나타냈다[참조: Stern, L. J., and D. C. Wiley (1992) Cell 68:465, Scheirle, A., B. et al. (1992) J. Immunol. 149:1994, Kozono, H., 상기함]. 그러나, IA^dα 및 β 쇄는 해리하여 펩티드를 제시할 수 없는 것도 또한 밝혀졌다[참조: Kozono, H., 상기함]. 실시예 5에서 생성된 sc-IA^dMHC 클래스 II 분자가 안정되고 적합한 제공 펩티드를 부하할 수 있는지를 시험하기 위해, 본 명세서에 기재된 방법(예컨대, 실시예 8 참조)에 따라 정제된 sc-IA^d/블랭크 분자들을 OVA 323-339 펩티드와 인큐베이션시켰다. 세척하여 비결합 펩티드들을 제거한 후, 고정화된 복합체들은 DO11.10 세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다(도 6C). 이러한 결과는 단일쇄 포맷이 IA^d분자를 안정화시켜 정제 및 외부에서 첨가되거나 공유적으로 부착된 펩티드의 부하를 허용하는 것을 나타낸다.

다른 예에 있어서, DO11.10 사이토카인 방출 분석을 사용하여 실시예 6에서 생성된 sc-IA^d-Cκ 융합 단백질의 기능성을 시험하였다. 간략히 설명하자면, 정제된 sc-IA^d-Cκ 융합 단백질 (1.1 ㎍/웰)을 96웰 플레이트 상에 코팅시켰다. 곤충 세포 유도된 sc-IA^d분자 (1.1 ㎍/웰)은 대조군으로 작용하였다. 별법으로, 다클론 앤티-마우스 카파 항체(200 ng/웰) 을 첨가하고 앤티-카파 항체에 의해 포획시켰다. 플레이트들을 PBS로 세척하고 1x10⁵DO11.10 T-세포(200 ㎕)을 첨가하였다. 37℃에서 24 시간 후, 배양 상층액을 모으고 DO11.10 T-세포에 의해 배양 배지로 방출되는 IL-2의 양을 ELISA(PharMingen)에 의해 결정하였다. IL-2의 방출은 DO11.10 T-세포 수용체 및 IA^d/OVA 복합체 사이의 기능적 상호작용 후 T-세포 활성화의 정도의 척도이다. IL-2 ELISA의 결과는 표 7에 나타냈다.

표 7 - sc-IAd-Cκ 융합 단백질의 기능성
면역화된 단백질	방출된 DO11.10 IL-2 (pg/웰)
NSOE2 sc-IAd/OVA-Cκ	500
곤충 세포 sc-IAd/OVA(양성 대조군)	528
곤충 세포 sc-IAd/gD(음성 대조군)	0
앤티-카파 포획한 NSOE2 sc-IAd/OVA-Cκ	72

이 결과는 sc-IA^d/OVA-Cκ가 고정화되거나 또는 항-카파 항체에 의해 포획될 때는 기능적으로 활성임을 나타낸다. 이들 결과는 본 발명자들은 sc-IA^d및 IgG CH2-CH3 도메인 사이의 유사한 융합이 IA^d-특이성 ELISA 분석 또는 T-세포 자극 분석에 의해 인식되지 않는 분자를초래하였음을 발견하였기 때문에 예측하지 못하였다.

실시예 10 가용성 sc-IA^d/펩티드 융합 복합체는 세포소멸을 유발한다

DO11.10 세포를 사용하여 T-세포 세포소멸을 유도하는 가용성 sc- IA^d융합 분자의 능력에 대하여 시험하였다. 상기한 가용성 sc-IA^d/OVA 분자와 함께 밤새 배양한 후, DO11.10 세포는 핵 농축, 세포소멸 체의 출현 및 움의 올리고뉴클레오솜 밴드로의 분해를 포함한 세포 형태학에 있어서 현저한 변화를 나타냈다(도 7, 레인 4). 이들 변화는 세포소멸의 특징이다[참조: P. Walker et al., BioTechniques, 15:1032(1993)]. 유사한 효과가 앤티-TcR 및 앤티-CD3 mAb로 인큐베이션시킨 세포에서 관찰된 반면, 고정화된 sc-IA^d/블랭크로 인큐베이션 시킨 세포에서는 세포 형태학 또는 DNA 분해에 있어서 변화가 관찰되지 않았다(도 7의 레인 3 및 5를 비교 바람).

도 7은 다음과 같이 설명된다: DO11.10 세포를 미처리 웰 또는 100 ng/웰 앤티-TcR mAb(PharMingen) 또는 250 ng/웰 또는 sc-IA^d분자로 피복시킨 웰에서 인큐베이션시켰다. 24 시간 후, 세포들(1.2 x 10⁶/시료)을 수확하고 Triton X-100 가용성/DNA를 단리하였다[P. Walker et al., Biotechniques, 15:1032 (1993)]. 시료들을 2% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고 에티듐 브로마이드로 염색하여 염색체 DNA 래더링을 탐지하였다. 레인 2는 미처리 DO11.10 세포이다. 레인 1 및 6은 DNA 분자량 마커를 나타낸다.

실시예 11 가용성 sc- IA^dMHC 융합 분자를 포함한 벡터를 포함한 DNA 접종은 생체내 T-세포 팽창을 억압한다

T-세포의 활성화에는 T-세포의 증식에 있어서와 같이 적어도 2 개의 신호가 필요하다. TcR 및 MHC 클래스 II/펩티드 융합 복합체를 경유하여 T-세포에 전달되는 신호는 T-세포를 치사시키거나 또는 무력화시킬 것이다. 가용성 sc-IA^d/OVA 융합 분자는 부가된 동시 자극성 신호의 부재하에서 항원 특이성 T-세포를 선택적으로 치사시키는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는 단일쇄 MHC 분자, 특히 단일쇄 MHC 클래스 II 분자는 생체내에서 면역 시스템 기능을 억압하기에 아주 적합함을 나타낸다. 이 결과들은 또한 단일쇄 MHC 분자가 동시자극성 신호와 함께 동시 발현될 때 또는 별법으로 단일 쇄 MHC 분자가 적합한 동시 자극성 신호가 이 세포에 이미 존재하는 세포에서 발현될 때 면역 시스템 기능이 유도될 수 있음을 나타낸다.

생체내에서 T-세포의 클론 팽창을 억압하기 위하여 본 발명자들은 표준 방법에 의해 sc-IA^d/OVA 융합 유전자를 지니도록 변형시킬 수 있는 포유류 발현 벡터 pEE13을 사용하였다. sc-IA^d/OVA 유전자의 전사는 발현 벡터의 CMV 프로모터에 의해 유도되었다. BALB/c 마우스들을 플라스미드 DNA 100 ㎍으로 뒷다리에 근육내(IM) 주사하였다. 주사를 14일 및 28일 후에 2회더 반복하였다. 대조군은 0주에 식염수를 피하 주사하고, 2주 및 4주에 sc-IA^d/블랭크를 코딩하는 플라스미드 100 ㎍을 주사하였다.

이어서 두 집단을 최종 DNA 접종 후 23일 및 30일에 (완전 프로이트 H37Ra 보조액 중의 100 ㎍/마우스) OVA 323-339 펩티드로 꼬리의 기저부에 피하 주사하였다. 1 주후, 마우스들을 치사시키고 서혜부 및 대동맥주위 림프절을 모았다. 임프절 세포 현탁액을 제조하고 나일론 울 및 세파덱스 G-10 칼럼 상에 인큐베이션에 의해 항원 제시 세포들을 고갈시키고 결과의 정제된 T-세포 집단을 OVA 323-339 펩티드로 APCs 펄스 처리하였다. BALB/c 마우스로부터의 비장의 B 세포는 APCs로 작용하였다. 이들 세포들을 미토마이신 C(4x10⁶비장세포/ml의 현탁액 중의 50 내지 100 ㎍/ml)으로 고정시켜 B 세포의 증식을 억제하고, 활발하게 세척하고 OVA 323-339 펩티드 (0 내지 50 ㎍/웰)과 함께 T-세포 (2x10⁵세포/웰)에 첨가하였다. 세포들을 37℃, 5% CO₂에서 4일 동안 96웰 환저 마이클로타이터 플레이트 중에서 증식되게 하였다. 이때, 웰들을 배양의 종료에 앞서 4 내지 6 시간 동안 MTS(40㎕/웰)(Promega)로 펄스처리하였다. MTS의 혼입은 490에서 흡광도를 측정함으로서 결정하였고 T-세포 증식의 척도이다.

도 8A 및 도 8B는 주사된 및 대조군 마우스로부터의 세포를 사용한 T-세포 증식 분석의 결과를 나타낸다. 도 8A에서, T-세포들을 sc- IA^d/블랭크 플라스미드(및 식염수)의 IM 주사를 받은 마우스로부터 분리하였다. 도 8B에서, 마우스들은 sc-IA^d/OVA 플라스미드의 IM 주사를 맞았다. 마우스들을 OVA 펩티드로 2회 챌린지시키고 T-세포를 1 주후에 임프절로부터 단리하였다. OVA-특이성 T-세포 증식 분석은 상기한 바와 같이 수행하였다. sc-IA^d/OVA 플라스미드로 주사한 마우스들로부터 단리된 T-세포들은 sc-IA^d/블랭크 플라스미드로 주사한 대조군 집단으로부터 단리한 것들에 비하여 OVA-특이성 증식의 양에 있어서 상당한 감소를 보였다. 이들 결과는 가용성 sc- IA^d/OVA 분자의 발현은 생체내에서 항원 특이성 T-세포의 클론 팽창을 억압함을 나타낸다.

가용성 단일쇄 MHC 복합체(예컨대, 가용성 sc-MHC 클래스 II 펩티드 융합 복합체 또는 가용성 부하된 sc-MHC 클래스 II 복합체) 또는 이러한 분자들을 코딩하는 DNA 발현 벡터의 투여는 포유류, 특히 인간에 있어서 항원 특이성 T-세포의 바람직하지 못한 존재 또는 팽창을 수반하는 면역 질환을 경감시킬 것이다. 예를 들면, 가용성 단일쇄 MHC 복합체(예컨대, 가용성 sc-MHC 클래스 II 펩티드 융합 복합체) 또는 이들 복합체를 코딩하는 DNA 발현 벡터는 제약학상 허용되는 담체 물질, 예컨대 생리식염수와 혼합하여 항원 특이성 T-세포의 바람직하지 못한 존재 또는 팽창을 수반하는 면역 질환으로부터 고통을 겪거나 또는 고통을 겪을 것으로 보이는 포유류, 특히 인간에 투여한다. 기타 제약학상 허용되는 담체의 예는 잘 알려져 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Science, Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980]. 투여의 한 구체적인 형태는, 기타의 다른 형태를 사용할 수도 있으나(예, 경구, 비강, 정맥내, 비경구 또는 경피), 근육내이며, 이 모드는 치료되는 조건 및 동물의 일반적인 상태에 따라 다를 것이며, 당업자에게 자명할 것이다. 가용성 단일쇄 MHC 융합 분자의 투여량도 또한 면역 질환의 타입 및 심도 등의 인자에 따라 다양할 것이나 항원 특이성 T-세포 등의 면역 세포의 생체내 팽창을 억압하기에 충분한 투여량일 것이다. 통상의 투여량 범위는 가용성 MHC 클래스 II 분자의 체중 kg 당 1 ng 내지 10 mg일 것이다. 치료는 필요에 따라 예를 들면 매일 반복할 수 있다. 유사한 적합한 투여량은 본 명세서에 기재된 다특이성 MHC 복합체(부하된 또는 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드)의 투여에 사용될 수 있다.

또한 본 발명이 모든 또는 대부분의 MHC 분자는 T-세포를 억압하거나 또는 유도하기에 충분한 투여한 투여량으로 투여될 수 있음을 이해할 것이다.

기타의 가용성 부하된 단일쇄 MHC 분자는 생체내에서 항원 특이성 T-세포의 바람직하지 못한 존재 또는 팽창을 치료하는데 사용될 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들면, 약 6 내지 30 아미노산(포함함)의 제공 펩티드를 적합한 가용성 빈 단일쇄 MHC 분자와 적어도 동물량 비율로 혼합하여 대응하는 부하된 분자를 형성할 수 있다. 이 부하된 분자는 제약학상 허용되는 담체와 혼합하여 포유류, 예컨대 인간에 투여하여 상기한 바와 같은 면역계 질환을 치료한다.

실시예 12 펩티드-연결된 단일쇄 MHC 분자를 발현하는 벡터를 포함한 DNA 접종에 의한 면역억압 접근방법

DNA 접종 접근법(특히 근육내 또는 피내)의 효과를 시험하는 모델 시스템의 예는 다음과 같다. 3개의 그룹의 BALB/c 마우스를 두 뒷다리에 100㎍의 (1) SEC1, (2) SCT1 또는 (3) 식염수를 근육내(IM)에 주사하였다. 주사는 0, 2 및 4주에 주어질 것이다. 처음의 DNA 주사 후의 4 및 5 주에, OVA 펩티드 323-339 (완전 프로이트 H37Ra 보조액 중의 100㎍/마우스)를 꼬리의 기저부에 피하 주사하였다. 2 주후(8주), 혈액을 꼬리 출혈에 의해 각 마우스로부터 수집하고 혈청을 대략 14,000 G에서 3-5분 동안 원심분리하여 얻었다. OVA-특이성 IgG 및 IgM 항체의 역가는 상기한 바와 같이 결정한다. OVA-특이성 IgG 항체의 정도는 펩티드로 면역화후에 마우스에서 일어나는 T_H세포 의존성 면역글로빈 클래스 스위칭의 지표이다. 따라서, 펩티드-연결된 단일쇄 MHC 발현 벡터를 포함한 DNA 접종은 IgM 항체 농도에 영향을 미침이 없이 펩티드-특이성 IgM 항체의 농도에 있어서 감소를 유발할 수 있다.

별도의 분석법은 OVA-특이성 T_H세포 클론의 팽창 및 증식을 측정하는 것이다. 간단히 설명하자면, 세포 현탁액을 제2 OVA 면역화 후 7일에 서혜부 및 대동맥주위 림프절로부터 제조하였다. 현탁액에서 나일론 울 및 세파덱스 G-10 칼럼 상에 인큐베이션에 의해 항원 제시 세포들을 고갈시키고 결과의 정제된 T-세포 집단을 OVA 323-339 펩티드로 APCs 펄스 처리하여 인큐베이션시켰다. 비장의 B 세포는 항원 지시 세포로 작용하였다. 이들 세포들을 미토마이신 C(4x10⁶비장세포/ml의 현탁액 중의 50 내지 100 ㎍/ml)으로 고정시켜 B 세포의 증식을 억제하고, 활발하게 세척하고 다양한 농도의 OVA 323-339 펩티드와 함께 T-세포에 첨가하였다. OVA-특이성 T-세포 증식 분석은 상기한 바와 같이 수행하였다. 펩티드-반응성 t-세포 증식의 정도는 펩티드로 면역화 후 마우스에서 일러나는 TH 세포 반응(즉, 클론의 팽창)의 지표이다. 따라서, 펩티드-연결된 단일쇄 MHC 발현 벡터로의 DNA 접종은 펩티드 특이성 TH 세포 증식의 레벌에 있어서 감소를 유발할 수도 있다.

실시예 13 가용성 펩티드 연결된 단일쇄 MHC 클래스 II 분자를 사용한 면역억압

상기 실시예 4, 5 및 6에 따라 생산된 가용성 펩티드-연결된 sc-클래스 II 분자들은 T_H세포에서 무력증의 상태를 유발하기에 적합하다. 이를 시험하기 위해, T_H세포-의존성 면역글로빈 클래스 스위칭(예, IgM에서 IgG로) 및 펩티드-특이성 T-세포주의 팽창에 미치는 분자의 효과를 다음의 방법에 의해 검사할 수 있다.

a) IgG 클래스 스위칭

IgM의 IgG 클래스 스위칭을 검사하기 위하여, 두 시험그룹을 다음과 같이 설정하였다:

i) 10 마리의 BALB/c 마우스를 완전 프로이트 H37Ra 보조액 중의 OVA 323-339 펩티드 100 pg을 꼬리의 기저부에 피하 주사하고, 7일후 재차 면역시켜 OVA 323-339 펩티드에 대한 면역 응답을 유발시켰다. OVA를 사용한 각 면역 전 및 당일에, 5 마리의 마우스에 PBS 중의 가용성 sc-IA^d/OVA 10-100 ㎍을 IV 주사하엿다. 이 가용성 융합 단백질은 OVA 323-339 특이성 T_H세포 상에 나타난 T-세포 수용체 TcR에 결합할 수 있다.

동시자극성 신호의 부재에 기인하여, 이들 T_H세포는 무력증의 상태로 유발된다. 면역글로불린 클래스 스위칭은 T_H세포 의존성 공정이기 때문에 앤티-OVA 323-339 IgG 항체가 sc-IA^d/OVA 처리된 마우스에서 극적으로 감소되는 것이 예측된다. 나머지 5 마리의 마우스는 대조군으로서 작용하며 PBS를 수용시켰다. 이들 마우스는 방해받지 않은 T_H세포에 기인하여 앤티-OVA 323-339 IgG 항체를 축적시키는 것으로 예측된다.

제2 면역한지 10일 후, 혈액들을 고리 출혈에 의해 각 마우스로부터 수집하였다. 혈액을 대략 14,000 G에서 3-5분 동안 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 분석들은 Tris-HCl 코팅 완충액, pH 8.5를 사용하여 난알부민으로 1-50 ㎍/ml로 피복시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Maxisorp F8; Nunc, Inc)에서 수행된다.

이어서 플레이트들을 압력 민감성 필름(Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, CA)으로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서 플레이트들을 세척 용액(이미다졸/NaCl, 0.4% Tween-20)으로 세척하고 100㎕/웰의 3% BSA 용액을 첨가함으로써 차단시켰다. 플레이트 회전기에서 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트들을 세척 용액으로 5회 세척하였다. 이어서 마우스 혈청들을 시료/접합체 희석물(TBS 중의 2% 젤라틴 + 0.1% Tween-20) 중에 1:500으로 희석시키고, 이어서 플레이트 상에서 2배로 순차 희석시켰다. 두 개의 동일한 플레이트를 각각의 코팅 단백질에 대하여 준비하였는데, 하나는 IgM 역가 및 다른 것은 IgG의 역가를 측정하기 위한 것이다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트들을 세척 용액으로 5회 세척하였다. 양 앤티 마우스 IGM-HRP 및 양-앤티-마우스 IgG-HRP 공액체 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, 시료/공액 희석물 중의 1:100 희석)를 적절한 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트들을 세척 용액으로 5회 세척하고 이어서 실온에서 10 분 동안 ABTS 전개 기질(Kirkgaard ＆ Perry Laboratories, INc., Gaithersburg, MD) 100㎕/웰로 인큐베이션시켰다. 반응을 급냉 완충액 (Kirkgaard ＆ Perry Laboratories, INc., Gaithersburg, MD) 100㎕/웰로 정지시키고, 흡광도를 자동 마이크로리터 플레이트 ELISA 판독기(Ceres UV900HI, Bioteck, Winooski, Vermont)를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 역가는 흡광도 판독값 대 시료의 희석의 로그를 플롯팅하여 결정한다. 이어서, IgM 대 IgG에 대한 역가를 비교한다. 실시예 4, 5 및 6에서 생성된 가용성 펩티드-연결된 단일쇄 클래스 II 분자는 대응 펩티드-반응성 T_H세포에서 유발된 무력증에 기인하여 펩티드 특이성 방식으로 IgG 클래스 스위칭을 억제하는 것으로 예측된다.

b) 펩티드 특이적 T-세포주의 생체내에서 클론 팽창

실시예 10-11에서 생성된 가용성 펩티드-연결된 단일쇄 클래스 II 분자의 펩티드 특이성 T-세포주의 클론 팽창에 대한 효과는 다음과 같다. 처리군(군 당 4 마리의 마우스)은 상기한 바와 동일하다. 면역화 프로토컬은 다음과 같다: PBS 중의 가용성 sc-IA^d/OVA 융합 단백질 10-100㎍으로 IV 주사하고 24 시간 후 마우스를 완전 프로이트 H37Ra 보조액 중의 OVA 323-339 펩티드 50 ㎍을 꼬리의 기저부에 피하 주사하였다. 이들 두 주사를 6 및 7일 후에 반복하였다. 제2 세트의 주사 7일 후, 마우스들을 희생시켰다. 서혜부 및 대동맥주위 림프절을 제거하여 단일 세포 현탁액으로 제공하였다.

현탁액에서 나일론 울 및 세파덱스 G-10 칼럼 상에 인큐베이션에 의해 항원 제시 세포들을 고갈시키고 결과의 정제된 T-세포 집단을 OVA 323-339 펩티드로 APCs 펄스 처리하여 인큐베이션시켰다. 비장의 B 세포는 항원 지시 세포로 작용하였다. 이들 세포들을 미토마이신 C(4x10⁶비장세포/ml의 현탁액 중의 50 내지 100 ㎍/ml)으로 고정시켜 B 세포의 증식을 억제하고, 활발하게 세척하고 다양한 농도의 OVA 323-339 펩티드와 함께 T-세포에 첨가하였다. 증식 분석은 37℃, 5% CO₂에서 3-5일 동안 96웰 평저 마이클로타이터 플레이트 상에서 수행한다. 웰들을 배양 종료의 18시간 전에 1 마이크로큐리의 3H-티미딘으로 펄스처리하고 Skatron 세포 수확기를 사용하여 수확하였다. 펩티드-반응성 T-세포 증식의 정도는 펩티드로 면역화 후 마우스에서 일어나는 T_H세포 반응(즉, 클론의 팽창)의 지표이다.

실시예 4, 5 및 6에서 생산된 가용성 단일쇄 MHC 클래스 II 분자의 동시주입(OVA 면역화와 합하여)은 클론 팽창의 양 및 이에 이어 OVA-반응성 T-세포주의 시험관내 증식을 제한하는 것으로 예측된다.

실시예 14 다특이성 MHC 클래스 II 복합체의 제조

상기한 바와 같이, 본 발명의 완전히 용해성이고 기능적인 MHC 복합체는 다특이성 복합체를 포함한다. 이하, sc-MHC 클래스 II 분자 및 리간드 연결 분자를 포함하는 다특이성 MHC분자를 제조하는 예시적인 방법에 대하여 설명한다.

1. 이특이성 복합체

A. 면역글로빈 연결 분자

도 9A 및 9B는 각각 두 sc-MHC 클래스 II 펩티드 융합 분자 또는 하나의 sc-MHC 클래스 II 펩티드 융합 분자 및 하나의 단일쇄 항체를 포함하는 이특이성 복합체의 예를 나타낸다.

두 sc-MHC 클래스 II 펩티드 복합체(도 9A)를 포함하는 이특이성 복합체는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 한 접근법에 있어서, 공유적으로 연결된 순차적인 sc-MHC 분자(예, 클래스 II sc-MHC 분자), 연결 분자(예, Ig-C_L쇄) 및 임의의 효과기 분자를 포함하는 제1융합 분자를 제작하였다. 이 융합 분자는 공유적으로 연결된 순차적인 sc-MHC 클래스 II, 연결 분자(예, Ig-C_L쇄) 및 임의의 효과기 분자를 포함하는 제2 융합 분자와 결합시킬 수 있다. 제1 및 제2 융합 분자는 DNA 서열, 바람직하게는 두 분자들을 코딩하는 벡터에 의해 코드될 수 있다. 별법으로, 제1 및 제2 융합 분자는 별개의 DNA 서열, 바람직하게는 각 경우에 DNA 서열이 융합 분자의 하나를 코드하는 두 DNA 벡터를 포함한 서열에 의해 코드될 수 있다. 어느 경우에 있어서도, 제1 및 제2 융합 분자들은 뚜렷한 쇄들이며 시험관내 또는 적합한 포유류 세포에서 결합하여 비특이성 복합체를 형성한다. 이특이성 복합체는 필요에 따라 상기한 단리 및 정제방법에 따라 정제하여 실질적으로 순수한 복합체를 형성시킬 수 있다.

sc-MHC 클래스 II 펩티드 융합 분자 및 단일쇄 항체를 포함하는 도 9B에 나타낸 이특이성 복합체는 제2 융합 분자가 순서대로 공유적으로 연결된 sc-Fv 항체, 연결 분자(예컨대 IgGC_H ¹분자) 및 임의의 효과기 분자를 포함하는 것을 제외하고는 일반적으로 상기한 지침에 따라 제조할 수 있다.

B. 기타 연결 분자

상기 언급한 바와 같이, 다양한 폴리펩티드들은 특이적 결합 쌍을 형성하는 것으로 나타났다. 예를 들면, 코일된 코일(예, 류신 지퍼), 나선-회전-나선 모티브 및 관련된 구조들은 단일쇄 항체 Fv 단편, T-세포 수용체 분자의 α 및 β 쇄, MHC 클래스 II 분자의 α 및 β 쇄의 이합체성화(dimerization) 및 올리고화(oligomerization)을 촉진시키는 것으로 나타났다[참조: Pack et al., Biotechnology, 11:1271 (1993); Pack et al., J. Mol. Biol. (1995); Chaing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:11408(1994); Scott et al., J. Exp. Med., 183:2087(1996)].

코일된 코일 및 나선-회전-나선 구조를 제조하는 공지된 방법에 따라, 그러한 코일된 코일 또는 나선-회전-나선 연결 분자를 포함하는 이특이성 복합체를 제조하는 것은 본 발명의 목적이다.

이특이성 복합체는 다음의 단계들을 포함하는 몇 개의 분자들에 의해 제조할 수 있다. 먼저, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 DNA 프라이머를 각 프라이머가 다음의 코일된 코일 서열을 갖는 표준 합성 방법에 의해 제조할 수 있다:

1. NH2-SSADLVPRGSTTAPSAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ -COOH (서열 번호: 33)

2. NH2-SSADLVPRGSTTAPRAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKLAQ -COOH (서열 번호: 34)

문헌 [Scott et al., J. Exp. Med., 183:2087(1996)] 참조 바람.

별법으로, 각각의 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머는 코드된 서열의 쌍이 예컨대 문헌[Pack et al., 상기함, Chaing et al., 상기함 및 Scott et al., 상기함]에 의해 보고된 시험에 의해 결정되는 바의 특이적 결합 쌍을 형성할 수 있다면 서열번호: 33 및 서열번호: 34의 코일된 코일 서열의 적합한 부분을 코드할 수 있다.

다음에, 코일된 코일 연결 분자 또는 그의 적합한 단편을 포함하는 이특이성 MHC 복합체를 제작하기 위해, DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머 중 하나를 하나 이상의 목적하는 sc-MHC 분자, 예컨대 sc-MHC 클래스 II 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트의 3'에 공유적으로 연결시킨다. 이어서, 이와 같이 만들어진 DNA 구조물은 프라이머의 3'말단에서 목적하는 임의의 효과기 분자를 코딩하는 DNA 서열의 5'말단에 임의로 연결시킨다. 제2 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예컨대 목적하는 단일쇄 항체를 코딩하는 DNA 세그먼트 등의 목적하는 리간드 연결 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트의 3'에 공유적으로 연결시킨다. 이와 같이 제조된 DNA 구조물은 추가로 목적하는 임의의 효과기 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트의 5' 말단에 융합시킬 수 있다. 구체적인 예로서, DNA 세그먼트는 공유적으로 연결된 순서대로: sc-MHC 클래스 II/분자/코일된-코일 서열; sc-MHC 클래스 II/분자/코일된-코일 서열/효과기 분자; 단일쇄 항체/코일된 코일 서열; 단일쇄 항체/코일된-코일 서열/효과기 분자를 포함할 수 있다.

선택된 쌍의 DNA 세그먼트는 통상 이합체성화 할 수 있는 단백질을 코딩할 수 있는 것들일 것이다. 일반적으로, 선택된 쌍의 DNA 세그먼트는 목적하는 세포 형태에서 발현용으로 적합한 벡터쌍에 도입시킬 수 있다. 별법으로, DNA 세그먼트는 필요에 따라 단일 DNA 벡터 상에 삽입시킬 수 있다. 본 발명에 따른 이특이성 복합체는 별도의 전략에 의해 생성시킬 수 있다. 한 접근 방법에 있어서 복합체쇄 중 하나를 코딩하는 각각의 벡터를 세포내에 도입시키고, 이 세포를 제2 단백질을 생산하는 조건하에서 배양한다. 단백질을 각 세포 배양물로부터 별도로 단리하고 이어서 온도, 염, 단백질 및 이온 농도 등의 제어된 조건하에서 시험관내에서 혼합시킨다. 별법으로, 두 벡터를 동일한 적합한 세포 내에 도입시키고, 세포를 발현 목적하는 이특이성 MHC 복합체의 어셈블리에 유리한 조건 하에서 배양시킨다. 이특이성 MHC 복합체는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 필요에 따라 실질적으로 순수한 형태로 세포로부터 단리할 수 있다. 적합한 세포 및 벡터의 예들은 상기 언급하였다.

본 발명은 그의 바람직한 실시태양을 참고로 하여 설명되었다. 그러나, 당업자는 이 개시사항을 고려하여 본 발명의 정신 및 범위 내에서 변형 및 개선할 수 있음은 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION

(i) APPLICANT: Rhode, Peter R.

Acevedo, Jorge

Burkhardt, Martin

Jiao, Jin-an

Wong, Hing C.

(ii) TITLE OF THE INVENTION: SOLUBLE MHC COMPLEXES AND

METHODS OF USE THEREOF

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 38

(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: Dike, Bronstein, Roberts ＆ Cushman, LLP

(B) STREET: 130 Water Street

(C) CITY: Boston

(D) STATE: MA

(E) COUNTRY: usa

(F) ZIP: 02109

(v) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Diskette

(B) COMPUTER: IBM Compatible

(C) OPERATING SYSTEM: DOS

(D) SOFTWARE: FastSEQ for Windows Version 2.0

(vi) CURRENT APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 08/960,190

(B) FILING DATE: 29-OCT-1997

(C) CLASSIFICATION:

(vii) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER:

(B) FILING DATE:

(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:

(A) NAME: Corless, Peter F

(B) REGISTRATION NUMBER: 33,860

(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 48002

(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION:

(A) TELEPHONE: 617-523-3400

(B) TELEFAX: 617-523-6440

(C) TELEX:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 8 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:

CCACCATG 8

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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

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(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

CCCCCCAAGC TTCCGGGCCA CCATGGCTCT GCAGATCCCC AGC 43

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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 34 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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CCCCCCACTT AAGGTCCTTG GGCTGCTCAG CACC 34

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 37 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

GGGGGGGCCA TGGCCGGAAA CTCCGAAAGG CATTTCG 37

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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 32 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:

GCGGCGACTA GTCCACTCCA CAGTGATGGG GC 32

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 36 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GGGGGGGCCA TGGCCGAAGA CGACATTGAG GCCGAC 36

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 32 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

GCGCGACTAG TCCAGTGTTT CAGAACCGGC TC 32

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 31 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GGGGGGGATA TCTCTCAGGC TGTTCACGCT G 31

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 46 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GGGGGGTTCG AAAAGTGTAC TTACGGGGGG CTGGAATCTC AGGTTC 46

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 37 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GGGGGGCTCG AGTATCAAAG AAGAACATGT GATCATC 37

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 36 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GCGGCGGGAT CCGTTCTCTG TAGTCTCTGG GAGAGG 36

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 42 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GATAAGAGGA AGAAGAGTAC ATGCCGATGG AACCCGGGTG AG 42

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 43 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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AATTCTTCAC CCGGGTTCCA TCGGCATGTA CTCTTCTTCC TCG 43

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 75 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:

CCCCCCGCTA GCGGAGGGGG CGGAAGCGGC GGAGGGGGGG ACACCCGACC ACGTTTCCTG 60

TGGCAGCCTA AGAGG 75

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 48 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:

CCCCCCGAAT TCCCCACTAG TCCATTCCAC TGTGAGAGGG CTTGTCAC 48

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 35 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GGGGGGGCCA TGGCCTACGA CAGAACCCCG TGGTG 35

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 32 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GGGGGGACTA GTTCGCCGCT GCACTGTGAA GC 32

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 33 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:

GGGGGGTATG CATACGACGA GAACCCCGTG GTG 33

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 33 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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GGGGGGACTA GTCCACTTCG AGGAACTGTT TCC 33

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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CCTCCTGGTC TCCTCTGTGA GTGG 24

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:

CCACTCACAG AGGAGACCAG GAGG 24

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 30 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

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CCCCCCACCG GTTACGACAA GCCCGTGGTG 30

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 45 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23:

CCCCCCATCG ATAAGTGTAC TTACGTGGGA GAGGGCTTGG AGCAT 45

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1508 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: Coding Sequence

(B) LOCATION: 6...1505

(D) OTHER INFORMATION:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:

CCACC ATG GCT CTG CAG ATC CCC AGC CTC CTC CTC TCA GCT GCT GTG GTG 50

Met Ala Leu Gln Ile Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Val

1 5 10 15

GTG CTG ATG GTG CTG AGC AGC CCA AGG ACC TTA AGT ATC TCT CAG GCT 98

Val Leu Met Val Leu Ser Ser Pro Arg Thr Leu Ser Ile Ser Gln Ala

20 25 30

GTT CAC GCT GCT CAC GCT GAA ATC AAC GAA GCT GGT CGT GCT AGC GGA 146

Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Ala Ser Gly

35 40 45

GGG GGC GGA AGC GGC GGA GGG GGA AAC TCC GAA AGG CAT TTC GTG GTC 194

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asn Ser Glu Arg His Phe Val Val

50 55 60

CAG TTC AAG GGC GAG TGC TAC TAC ACC AAC GGG ACG CAG CGC ATA CGG 242

Gln Phe Lys Gly Glu Cys Tyr Tyr Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile Arg

65 70 75

CTC GTG ACC AGA TAC ATC TAC AAC CGG GAG GAG TAC GTG CGC TAC GAC 290

Leu Val Thr Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr Val Arg Tyr Asp

80 85 90 95

AGC GAC GTG GGC GAG TAC CGC GCG GTG ACC GAG CTG GGG CGG CCA GAC 338

Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp

100 105 110

GCC GAG TAC TGG AAC AGC CAG CCG GAG ATC CTG GAG CGA ACG CGG GCC 386

Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu Glu Arg Thr Arg Ala

115 120 125

GAG GTG GAC ACG GCG TGC AGA CAC AAC TAC GAG GGG CCG GAG ACC AGC 434

Glu Val Asp Thr Ala Cys Arg His Asn Tyr Glu Gly Pro Glu Thr Ser

130 135 140

ACC TCC CTG CGG CGG CTT GAA CAG CCC AAT GTC GCC ATC TCC CTG TCC 482

Thr Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro Asn Val Ala Ile Ser Leu Ser

145 150 155

AGG ACA GAG GCC CTC AAC CAC CAC AAC ACT CTG GTC TGT TCG GTG ACA 530

Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn Thr Leu Val Cys Ser Val Thr

160 165 170 175

GAT TTC TAC CCA GCC AAG ATC AAA GTG CGC TGG TTC AGG AAT GGC CAG 578

Asp Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln

180 185 190

GAG GAG ACA GTG GGG GTC TCA TCC ACA CAG CTT ATT AGG AAT GGG GAC 626

Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg Asn Gly Asp

195 200 205

TGG ACC TTC CAG GTC CTG GTC ATG CTG GAG ATG ACC CCT CAT CAG GGA 674

Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro His Gln Gly

210 215 220

GAG GTC TAC ACC TGC CAT GTG GAG CAT CCC AGC CTG AAG AGC CCC ATC 722

Glu Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys Ser Pro Ile

225 230 235

ACT GTG GAG TGG ACT AGT GGT GGC GGT GGC AGC GGC GGT GGT GGT TCC 770

Thr Val Glu Trp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

240 245 250 255

GGT GGC GGC GGT TCT GGC GGT GGC GGT TCC TCG AGT GAA GAC GAC ATT 818

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Asp Asp Ile

260 265 270

GAG GCC GAC CAC GTA GGC TTC TAT GGT ACA ACT GTT TAT CAG TCT CCT 866

Glu Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Gln Ser Pro

275 280 285

GGA GAC ATT GGC CAG TAC ACA CAT GAA TTT GAT GGT GAT GAG TTG TTC 914

Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly Asp Glu Leu Phe

290 295 300

TAT GTG GAC TTG GAT AAG AAG AAA ACT GTC TGG AGG CTT CCT GAG TTT 962

Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Lys Thr Val Trp Arg Leu Pro Glu Phe

305 310 315

GGC CAA TTG ATA CTC TTT GAG CCC CAA GGT GGA CTG CAA AAC ATA GCT 1010

Gly Gln Leu Ile Leu Phe Glu Pro Gln Gly Gly Leu Gln Asn Ile Ala

320 325 330 335

GCA GAA AAA CAC AAC TTG GGA ATC TTG ACT AAG AGG TCA AAT TTC ACC 1058

Ala Glu Lys His Asn Leu Gly Ile Leu Thr Lys Arg Ser Asn Phe Thr

340 345 350

CCA GCT ACC AAT GAG GCT CCT CAA GCG ACT GTG TTC CCC AAG TCC CCT 1106

Pro Ala Thr Asn Glu Ala Pro Gln Ala Thr Val Phe Pro Lys Ser Pro

355 360 365

GTG CTG CTG GGT CAG CCC AAC ACC CTT ATC TGC TTT GTG GAC AAC ATC 1154

Val Leu Leu Gly Gln Pro Asn Thr Leu Ile Cys Phe Val Asp Asn Ile

370 375 380

TTC CCA CCT GTG ATC AAC ATC ACA TGG CTC AGA AAT AGC AAG TCA GTC 1202

Phe Pro Pro Val Ile Asn Ile Thr Trp Leu Arg Asn Ser Lys Ser Val

385 390 395

ACA GAC GGC GTT TAT GAG ACC AGC TTC CTC GTC AAC CGT GAC CAT TCC 1250

Thr Asp Gly Val Tyr Glu Thr Ser Phe Leu Val Asn Arg Asp His Ser

400 405 410 415

TTC CAC AAG CTG TCT TAT CTC ACC TTC ATC CCT TCT GAT GAT GAC ATT 1298

Phe His Lys Leu Ser Tyr Leu Thr Phe Ile Pro Ser Asp Asp Asp Ile

420 425 430

TAT GAC TGC AAG GTG GAG CAC TGG GGC CTG GAG GAG CCG GTT CTG AAA 1346

Tyr Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Glu Glu Pro Val Leu Lys

435 440 445

CAC TGG GAA CCT GAG ATT CCA GCC CCC ATG TCA GAG CTG ACA GAA ACT 1394

His Trp Glu Pro Glu Ile Pro Ala Pro Met Ser Glu Leu Thr Glu Thr

450 455 460

GTG GTG TGT GCC CTG GGG TTG TCT GTG GGC CTT GTG GGC ATC GTG GTG 1442

Val Val Cys Ala Leu Gly Leu Ser Val Gly Leu Val Gly Ile Val Val

465 470 475

GGC ACC ATC TTC ATC ATT CAA GGC CTG CGA TCA GGT GGC ACC TCC AGA 1490

Gly Thr Ile Phe Ile Ile Gln Gly Leu Arg Ser Gly Gly Thr Ser Arg

480 485 490 495

CAC CCA GGG CCT TTA TGA 1508

His Pro Gly Pro Leu

500

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 500 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25:

Met Ala Leu Gln Ile Pro Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Val Val

1 5 10 15

Leu Met Val Leu Ser Ser Pro Arg Thr Leu Ser Ile Ser Gln Ala Val

20 25 30

His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asn Ser Glu Arg His Phe Val Val Gln

50 55 60

Phe Lys Gly Glu Cys Tyr Tyr Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile Arg Leu

65 70 75 80

Val Thr Arg Tyr Ile Tyr Asn Arg Glu Glu Tyr Val Arg Tyr Asp Ser

85 90 95

Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp Ala

100 105 110

Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Pro Glu Ile Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu

115 120 125

Val Asp Thr Ala Cys Arg His Asn Tyr Glu Gly Pro Glu Thr Ser Thr

130 135 140

Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro Asn Val Ala Ile Ser Leu Ser Arg

145 150 155 160

Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn Thr Leu Val Cys Ser Val Thr Asp

165 170 175

Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln Glu

180 185 190

Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg Asn Gly Asp Trp

195 200 205

Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro His Gln Gly Glu

210 215 220

Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys Ser Pro Ile Thr

225 230 235 240

Val Glu Trp Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

245 250 255

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu Asp Asp Ile Glu

260 265 270

Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Thr Thr Val Tyr Gln Ser Pro Gly

275 280 285

Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly Asp Glu Leu Phe Tyr

290 295 300

Val Asp Leu Asp Lys Lys Lys Thr Val Trp Arg Leu Pro Glu Phe Gly

305 310 315 320

Gln Leu Ile Leu Phe Glu Pro Gln Gly Gly Leu Gln Asn Ile Ala Ala

325 330 335

Glu Lys His Asn Leu Gly Ile Leu Thr Lys Arg Ser Asn Phe Thr Pro

340 345 350

Ala Thr Asn Glu Ala Pro Gln Ala Thr Val Phe Pro Lys Ser Pro Val

355 360 365

Leu Leu Gly Gln Pro Asn Thr Leu Ile Cys Phe Val Asp Asn Ile Phe

370 375 380

Pro Pro Val Ile Asn Ile Thr Trp Leu Arg Asn Ser Lys Ser Val Thr

385 390 395 400

Asp Gly Val Tyr Glu Thr Ser Phe Leu Val Asn Arg Asp His Ser Phe

405 410 415

His Lys Leu Ser Tyr Leu Thr Phe Ile Pro Ser Asp Asp Asp Ile Tyr

420 425 430

Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Glu Glu Pro Val Leu Lys His

435 440 445

Trp Glu Pro Glu Ile Pro Ala Pro Met Ser Glu Leu Thr Glu Thr Val

450 455 460

Val Cys Ala Leu Gly Leu Ser Val Gly Leu Val Gly Ile Val Val Gly

465 470 475 480

Thr Ile Phe Ile Ile Gln Gly Leu Arg Ser Gly Gly Thr Ser Arg His

485 490 495

Pro Gly Pro Leu

500

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 16 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 15 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27:

Ala Pro Tyr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro

1 5 10 15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28:

Tyr Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro

1 5 10 15

Arg Thr Pro Pro

20

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 14 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29:

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser

1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 11 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30:

Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu Pro Gly

1 5 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31:

TSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSSS 24

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32:

Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

Thr Pro Pro

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 45 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:

Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Thr Ala Pro Ser Ala

1 5 10 15

Gln Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Asn Ala Gln Leu

20 25 30

Glu Trp Glu Leu Gln Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Gln

35 40 45

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 44 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34:

Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Thr Ala Pro Arg Ala

1 5 10 15

Gln Leu Lys Lys Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu

20 25 30

Lys Trp Lys Leu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Ala Gln

35 40

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 10 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35:

ASSGGGSGGG 10

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36:

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala

20

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 94 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:

Gly Asp Thr Arg Pro Arg Phe Leu Trp Gln Pro Lys Arg Glu Cys His

1 5 10 15

Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Phe Tyr

20 25 30

Asn Gln Glu Glu Ser Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg

35 40 45

Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln

50 55 60

Lys Asp Ile Leu Glu Gln Ala Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg

65 70 75 80

His Asn Tyr Gly Val Val Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg

85 90

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 192 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38:

Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro

1 5 10 15

Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe

20 25 30

His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe

35 40 45

Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala

50 55 60

Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr

65 70 75 80

Pro Ile Thr Asn Val Pro Pro Glu Val Thr Val Leu Thr Asn Ser Pro

85 90 95

Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp Lys Phe

100 105 110

Thr Pro Pro Val Val Asn Val Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys Pro Val

115 120 125

Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu

130 135 140

Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val

145 150 155 160

Tyr Asp Cys Arg Val Glu His Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys

165 170 175

His Trp Glu Phe Asp Ala Pro Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu Asn

180 185 190

Claims (37)

1. 펩티드 결합 그루브, 및 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 클래스 II β2쇄를 포함하는 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
2. 제1항에 있어서, 추가로 면역글로빈 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
3. 펩티드 결합 그루브 및 공유적으로 연결된 면역글로빈 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
4. 제1항, 2항, 또는 3항의 빈 sc-MHC 클래스 II 분자룰 및 제공 펩티드와 제공 펩티드 및 빈 sc-MHC 분자 사이의 복합체를 형성하는 조건 하에서 접촉시킴으로써 생성되는 부하된 sc-MHC 분자.
5. 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드, 및 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 클래스 II β2 쇄를 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 단백질.
6. 제5항에 있어서, 추가로 면역글로빈 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 단백질.
7. 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드 및 공유적으로 연결된 면역글로빈 경쇄 불변 영역 또는 그의 단편을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 단백질.
8. 펩티드 결합 그루브를 포함하고, MHC 분자가 순서대로 공유적으로 연결된

   a) MHC 클래스 II β1 쇄 또는 이것의 제공 펩티드 결합 부분,

   b) 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 클래스 II β2 쇄,

   c) 펩티드 링커 서열, 및

   d) MHC 클래스 II α1α2 쇄 또는 그의 제공-펩티드 결합 부분을 포함하는 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
9. 제8항에 있어서, 클래스 II β2 아미노산 결실이 필수적으로 클래스 II β2 쇄의 전부인 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
10. 제9항에 있어서, 추가로 MHC 클래스 II α1α2 쇄 또는 그의 제공 펩티드 결합 부분에 공유적으로 연결된 면역글로빈 경쇄 불변 영역을 포함하는 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
11. 펩티드 결합 그루브를 포함하고, MHC 분자가 순서대로 공유적으로 연결된

    a) MHC 클래스 II β1β2 쇄 또는 이것의 제공 펩티드 결합 부분,

    b) 펩티드 링커 서열, 및

    c) MHC 클래스 II α1α2 쇄 또는 그의 제공-펩티드 결합 부분, 및

    d) 면역글로빈 경쇄 불변 영역 단편을 포함하는 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
12. 제11항에 있어서, 면역글로빈 경쇄 불변 영역 단편이 쥐 또는 인간 Cκ쇄인 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
13. 제11항에 있어서, 면역글로빈 경쇄 불변 영역 단편이 쥐 또는 인간 Cλ쇄인 빈 sc-MHC 클래스 II 분자.
14. 제8항 또는 11항의 빈 sc-MHC 클래스 II 분자를 제공 펩티드와 제공 펩티드 및 빈 sc-MHC 클래스 II 분자 사이의 복합체를 형성하는 조건 하에서 접촉시킴으로써 생성되는 부하된 sc-MHC 분자.
15. 펩티드 결합 그루브를 포함하고, sc-MHC 클래스 II 융합 분자가 순서대로 공유적으로 연결된

    a) 제공 펩티드,

    b) MHC 클래스 II β1 쇄 또는 이것의 제공 펩티드 결합 부분,

    c) 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 MHC 클래스 II β2 쇄, 및

    d) 펩티드 링커 서열; 및

    e) MHC 클래스 II α1α2 또는 그의 제공-펩티드 결합 부분

    을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
16. 제15항에 있어서, 상기 클래스 II β2 쇄 결실이 적어도 클래스 II β2쇄의 2, 5, 10, 25, 50, 60, 70, 80, 90 또는 그 이상의 아미노산의 결실을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
17. 제16항에 있어서, 클래스 II β2 쇄 아미노산 결실이 필수적으로 클래스 II β2 쇄의 전부인 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
18. 제15항에 있어서, 상기 치환된 클래스 II β2 쇄가 클래스 II β2 쇄의 2, 5, 10, 25, 50, 60, 70, 80, 90 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
19. 제18항에 있어서, 클래스 II β2 쇄 치환이 Cys¹¹⁷의 Ser¹¹⁷로의 치환을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
20. 제15항에 있어서, 추가로 MHC 클래스 II α1α2 쇄 또는 그의 제공-펩티드 결합 부분에 공유적으로 연결된 면역글로빈 경쇄 불변 영역 단편을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
21. 펩티드 결합 그루브를 포함하고, 융합 분자가 순서대로 공유적으로 연결된

    a) 제공 펩티드,

    b) MHC 클래스 II β1β2 쇄 또는 이것의 제공 펩티드 결합 부분,

    c) 펩티드 링커 서열,

    d) MHC 클래스 II α1α2 쇄 또는 이것의 제공 펩티드 결합 부분, 및

    e) 면역글로빈 경쇄 불변 영역 (Ig-C_L) 또는 단편을 포함하는

    sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
22. 제21항에 있어서, 면역글로빈 경쇄 불변 영역 단편이 쥐 또는 인간 Cκ쇄인 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
23. 제21항에 있어서, 면역글로빈 경쇄 불변 영역 단편이 쥐 또는 인간 Cλ쇄인 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
24. 제22항 또는 23항에 있어서, 면역글로빈 경쇄 불변 영역 (Ig-C_L) 단편이 약 80 내지 130, 90 내지 120 또는 100 내지 110 아미노산 길이인 것인 sc-MHC 클래스 II 융합 분자.
25. 하기 화학식의 sc-MHC 클래스를 포함하는 빈 다특이성 MHC 복합체.

    〈화학식〉

    식 중,

    a) A는 하나 이상의 빈 sc-MHC 클래스 II 분자이고,

    b) B₁, B₂는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 연결 분자이며,

    c) C₁, C₂는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 효과기 분자이거나 또는 -H이며,

    d) D는 하나 이상의 빈 sc-MHC 클래스 II 분자, 리간드 연결 분자 또는 -H이다.
26. 펩티드 결합 그루브를 포함하는 빈 sc-MHC 클래스 II 분자를 포함하고, 복합체가 식 A-B-C, B-A-C 또는 A-C-B(여기서, A는 하나 이상의 sc-MHC 클래스 II 분자이고, B는 연결 분자이며, C는 효과기 분자이거나 -H이되, 단 복합체가 A-C-B로 표시될 때, C는 -H가 아니다)으로 나타내어지는

    다특이성 MHC 복합체.
27. 제25항 또는 26항의 다특이성 MHC 복합체를 제공 펩티드와 제공 펩티드 및 하나 이상의 빈 sc-MHC 클래스 II 분자 사이의 특이적인 결합 복합체를 형성하는 조건 하에서 접촉시킴으로서 형성되는 부하된 다특이성 MHC 복합체.
28. sc-MHC 분자 및 펩티드 결합 그루브를 포함하고, 복합체가 다음의 식으로 표시되는 다특이성 MHC 복합체 융합 분자.

    〈화학식〉

    식 중,

    a) A는 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드를 포함하는 하나 이상의 sc-MHC 클래스 II 분자이고,

    b) B₁, B₂는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 연결 분자이며,

    c) C₁, C₂는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 효과기 분자이거나 -H이며,

    d) D는 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드를 포함하는 하나 이상의 sc-MHC 클래스 II 분자, 리간드 연결 분자 또는 -H를 나타낸다.
29. 펩티드 결합 그루브를 포함하는 sc-MHC 클래스 II 분자를 포함하고, 복합체가 식 A-B-C, B-A-C 또는 A-C-B(여기서, A는 재조합에 의해 융합된 제공 펩티드를 포함하는 하나 이상의 sc-MHC 클래스 II 분자이고, B는 연결 분자이며, C는 효과기 분자이거나 -H이되, 단 복합체가 A-C-B로 표시될 때, C는 -H가 아니다)으로 나타내어지는

    다특이성 MHC 융합 분자.
30. 제1항, 3항, 5항 또는 7항의 sc-MHC 클래스 II 분자를 코딩하는 DNA 세그먼트.
31. 제22항 및 26항의 다특이성 MHC 분자의 적어도 일부를 코딩하는 DNA 세그먼트.
32. 제27항의 DNA 세그먼트를 포함하는 DNA 벡터.
33. 제29항의 DNA 세그먼트를 포함하는 DNA 벡터.
34. a) DNA 벡터를 포함하는 세포를 제공하고, 여기서 DNA 벡터는 β2 클래스 II 쇄 변형을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 분자를 코딩하는 DNA 서열을 포함하며,

    b) 상기 세포를 sc-MHC 클래스 II 분자의 발현을 허용하는 조건하에서 배지중에서 배양하고,

    c) 상기 세포 또는 배지로부터 sc-MHC 클래스 II 분자를 정제하는 단계를 포함하는,

    β2 클래스 II 쇄 변형을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 분자의 제조 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 β2 클래스 II 쇄 변형을 포함하는 sc-MHC 클래스 II 분자가 제1항, 3항, 5항 또는 7항의 sc-MHC 클래스 II 분자인 방법.
36. a) 하나 이상의 DNA 벡터를 포함하는 세포를 제공하고, 여기서 벡터는 연결 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 다특이성 MHC 복합체 또는 그의 일부를 코딩하는 DNA 서열을 포함하며,

    b) 상기 세포를 다특이성 MHC 분자의 발현을 허용하는 조건하에서 배지 중에서 배양하고,

    c) 상기 세포 또는 배지로부터 다특이성 MHC 분자를 정제하는 단계를 포함하는,

    다특이성 MHC 클래스 II 복합체의 제조 방법.
37. 제4항, 5항, 7항, 17항 또는 28항의 sc-MHC 복합체 유효량을 포유류에 투여하는 것을 포함하는 포유류에서 면역 응답을 억제하는 방법.