JP2017529841A - キメラ抗原受容体 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、免疫グロブリン(Qg)由来の抗原結合ドメインと、T細胞受容体(TCR)由来の定常ドメインと、を有するキメラ抗原受容体(CAR)に関連する方法及び組成物を提供する。生殖細胞系にキメラ抗原受容体遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、CAR遺伝子座が、再構成されていない免疫グロブリン(Ig)可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、T細胞受容体定常領域を含む定常領域遺伝子座と、を含み、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメント由来の再構成されたIg可変領域遺伝子によりコードされるIg可変ドメインと、TCR定常領域遺伝子によりコードされるTCR定常ドメインと、を含むCARポリペプチドを発現するように、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントがTCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される、遺伝子改変非ヒト動物。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2015年5月28日に出願された米国仮特許出願第62/167,650号、2014年12月19日に出願された同第62/094,603号、2014年11月7日に出願されたた同第62/076,836号、2014年9月19日に出願された同第62/052,947号、及び2014年9月19日に出願された同第62/052,901号の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(配列表)
本出願は、2015年5月28日に出願された米国仮特許出願第62/167,650号、2014年12月19日に出願された同第62/094,603号、2014年11月7日に出願されたた同第62/076,836号、2014年9月19日に出願された同第62/052,947号、及び2014年9月19日に出願された同第62/052,901号の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(配列表)
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。2015年9月16日に作成された前記ASCIIのコピーは、RPB−010.25_SL.txtという名称であり、サイズは42,074バイトである。
遺伝子改変げっ歯類は、多くの抗原に対して特異的な治療用抗体の貴重な供給源であることが判明しているが、一部の抗原は標的にすることが困難であることが判明している。したがって、新型の治療用抗原結合タンパク質、並びにかかる抗原結合タンパク質の生成で有用な方法及び組成物に対する多大な必要性が存在する。
本明細書では、キメラ抗原受容体(CAR)に関連する方法及び組成物を提供する。例えば、本明細書では、CAR及びCARポリペプチド、CAR及びCARポリペプチドを発現する非ヒト動物、並びにCAR及びCARポリペプチドをコードする核酸、並びに、かかるCAR、CAR発現非ヒト動物、及びCARコード核酸の作製及び使用に有用な組成物及び方法を提供する。
本明細書に記載するように、CARは、免疫グロブリン(Ig)可変ドメイン由来の抗原結合ドメインと、T細胞受容体(TCR)由来の定常ドメインと、を有する抗原結合タンパク質である。概して、本明細書で提供するCARは2つのCARポリペプチド鎖を含み、その一方はTCRα定常ドメインを含み、もう一方はTCRβ定常ドメインを含む。各ポリペプチド鎖は、Ig可変ドメインを含み、一方のポリペプチド鎖は重鎖Ig可変ドメインを含み、他方の鎖はIg軽鎖(κ又はλ)可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するCARは、主要組織適合複合体(MHC)タンパク質(例えば、クラスI MHCタンパク質又はクラスII MHCタンパク質)によって提示される、ペプチドに対する結合特異性を有する。
特定の態様において、本明細書では、CARポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物(例えば、マウス又はラットなどげっ歯類)を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、その生殖細胞系に、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメント(例えば、再構成されていないV、D、及びJ重鎖遺伝子セグメント、再構成されていないV κ及びJ κ軽鎖遺伝子セグメント、又は再構成されていないV λ及びJ λ軽鎖遺伝子セグメント)を含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、TCR定常領域遺伝子(例えば、TCRα定常領域遺伝子又はTCRβ定常領域遺伝子)と、を含むCAR遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントは、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていない可変領域遺伝子セグメント由来の再構成されたIg可変領域遺伝子によりコードされるIg可変ドメインと、TCR定常領域遺伝子によりコードされるTCR定常ドメインと、を含むCARポリペプチドを発現するように、TCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントはヒトIg可変領域遺伝子セグメントである。いくつかの実施形態では、TCR定常領域遺伝子は、内在性種起源である。いくつかの実施形態では、TCR定常ドメインは、ヒト又はげっ歯類(例えば、マウス又はラット)である。いくつかの実施形態では、TCR定常領域遺伝子は、マウス又はラットのTCR定常領域である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ig可変領域遺伝子間配列(例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、Ig可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、TCR可変領域遺伝子間配列(例えば、TCRβ遺伝子間配列又はTCRα遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
いくつかの態様において、本明細書では、CARを発現する遺伝子改変非ヒト動物(例えば、マウス又はラットなどげっ歯類)を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、その生殖細胞系に第1のCAR遺伝子座及び第2のCAR遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、第1のCAR遺伝子座は、再構成されていないヒトIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源の(例えば、ラット又はマウス起源の)TCRβ定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントは、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていないIg VH、DH、JH遺伝子セグメント由来の再構成された重鎖可変領域遺伝子によりコードされるIg重鎖可変ドメインと、TCRβ定常領域遺伝子によりコードされるTCRβ定常ドメインと、を含む第1のCARポリペプチド鎖を発現するように、TCRβ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第1のCAR遺伝子座は、Ig重鎖可変領域遺伝子(ユニバーサル重鎖可変領域)を含む再構成された可変領域遺伝子座と、内在性種起源の(例えば、ラット又はマウス起源の)TCRβ定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、遺伝子改変非ヒト動物は、再構成された重鎖可変領域遺伝子によりコードされるIg重鎖可変ドメインと、TCRβ定常領域遺伝子によりコードされるTCRβ定常ドメインと、を含む第1のCARポリペプチド鎖を発現する。いくつかの実施形態では、第2のCAR遺伝子座は、再構成されていないヒトIg Vκ及びJκを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源の(例えば、ラット又はマウス起源の)TCRα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントは、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていないIg Vκ及びJκ遺伝子セグメント由来の再構成されたIg κ可変領域遺伝子によりコードされるIg κ可変ドメインと、TCRα定常領域遺伝子によりコードされるTCRα定常ドメインと、を含む第2のCARポリペプチド鎖を発現するように、TCRα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第2のCAR遺伝子座は、再構成されていないヒトIg Vλ及びJλを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源の(例えば、ラット又はマウス起源の)TCRα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトIg Vλ及びJλ遺伝子セグメントは、遺伝子改変非ヒト動物が、再構成されていないIg Vλ及びJλ遺伝子セグメント由来の再構成されたIg λ可変領域遺伝子によりコードされるIg λ可変ドメインと、TCRα定常領域遺伝子によりコードされるTCRα定常ドメインと、を含む第2のCARポリペプチド鎖を発現するように、TCRα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第2のCAR遺伝子座は、Ig軽鎖κ又はλ可変領域遺伝子(ユニバーサル軽鎖可変領域)を含む再構成された可変領域遺伝子座と、内在性種起源の(例えば、ラット又はマウス起源の)TCRα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、遺伝子改変非ヒト動物は、再構成された軽鎖可変領域遺伝子によりコードされるIg軽鎖可変ドメインと、TCRα定常領域遺伝子によりコードされるTCRα定常ドメインと、を含む第2のCARポリペプチド鎖を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、第1のCARポリペプチド鎖と、第2のCARポリペプチド鎖と、を含むCARを発現する。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座の一方又は両方は、Ig可変領域遺伝子間配列(例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、Ig可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座の一方又は両方は、TCR可変領域遺伝子間配列(例えば、TCRβ遺伝子間配列又はTCRα遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、CARを発現する。いくつかの実施形態では、CARは、非ヒト動物のT細胞(例えば、CD4及び/又はCD8 T細胞)で発現する。いくつかの実施形態では、CAR発現T細胞は、遺伝子改変非ヒト動物の胸腺においてポジティブ選択及び/又はネガティブ選択を受ける。いくつかの実施形態では、CARは、ペプチド/MHC複合体(すなわち、MHCタンパク質の溝内で提示されるペプチド)に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、CARは、クラスI MHCタンパク質によって提示されるペプチドに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、CARは、クラスII MHCタンパク質によって提示されるペプチドに対する結合特異性を有する。
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物のいくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、内在性TCR遺伝子座(例えば、内在性TCRα遺伝子座又は内在性TCRβ遺伝子座)に位置する。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座のTCR定常領域遺伝子は内在性TCR定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、内在性TCRα遺伝子座及び/又はTCRβ遺伝子座の可変領域の全て又は一部は、遺伝子座の可変領域の全て又は一部で置換されて、CAR遺伝子座を作製する。いくつかの実施形態では、TCR可変領域全体がIg可変領域で置換される。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子セグメントはIg可変領域遺伝子セグメントで置換される。例えば、いくつかの実施形態では、内在性TCRβ遺伝子座のV、D、及びJ遺伝子セグメントは、Ig重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、内在性TCRα遺伝子座のV及びJ遺伝子セグメントは、Ig軽鎖(例えば、κ又はλ)V及びJ遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、内在性TCR遺伝子座の外部に位置する。
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物のいくつかの実施形態では、CAR遺伝子座の可変領域遺伝子座内の内在性TCR可変領域遺伝子セグメントの全てがIg可変領域遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座の可変領域遺伝子座内の実質的に全てのTCR可変領域遺伝子セグメントは、Ig可変領域遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下、6個以下、7個以下、8個以下、9個以下、10個以下のTCR可変領域遺伝子セグメントが、CAR遺伝子座の可変領域遺伝子座内にある、及び/又はTCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、機能的TCR可変領域遺伝子セグメントは、CAR遺伝子座内のTCR定常領域遺伝子に操作可能に結合されない。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子セグメントは、CAR遺伝子座内のTCR定常領域遺伝子に操作可能に結合されない。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、又は80個のIg可変領域遺伝子セグメントを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は機能的αβ TCRを発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、機能的TCRα鎖及び/又は機能的TCRβ鎖を発現しない。いくつかの実施形態では、内在性TCRα可変領域遺伝子座及び/又はTCRβ可変領域遺伝子座は、遺伝子改変非ヒト動物内で不活性化されている。例えば、いくつかの実施形態では、内在性TCRα可変領域遺伝子座及び/又はTCRβ可変領域遺伝子座は、内在性遺伝子座の全て又は一部を削除することにより不活性化される。いくつかの実施形態では、TCRα可変領域遺伝子座及び/又はTCRβ可変領域遺伝子座は、TCR可変領域遺伝子座とTCR定常領域遺伝子座との操作可能な結合を分断することによって(例えば、非コード調節要素を削除することによって、TCR可変領域遺伝子座若しくはその一部を反転させることによって、及び/又は再構成されていないIg可変領域又はその一部をコードする核酸配列など核酸配列を、TCR可変領域遺伝子座の可変領域遺伝子セグメントとTCR定常領域遺伝子座TCR定常領域遺伝子との間に挿入することによって)不活性化される。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、TCRδ遺伝子座を含まない。TCRδは、TCRα遺伝子座の内側、つまりTCRα V遺伝子セグメントとTCRα J遺伝子セグメントとの間に位置する。したがって、いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、TCRα遺伝子座において、TCRα定常領域に操作可能に結合されたIg軽鎖V遺伝子セグメント及びJ遺伝子セグメントを含むIg軽鎖の可変領域を含み、TCRδ遺伝子座は、非ヒト動物が機能的δ/γ TCRを発現しないように削除されるか、改変されるかのいずれかである。いくつかの実施形態では、TCRδ遺伝子座は保存され、非ヒト動物機能的δ/γ TCRを発現しない。
本明細書で提供する遺伝子改変非ヒト動物のいくつかの実施形態では、CAR遺伝子座の再構成されていない可変領域は、1個又は2個以上のトリプシノーゲン(TRY)遺伝子(例えば、通常、TRY遺伝子及び/又はTCRβ可変領域遺伝子座内に存在する偽遺伝子)を含む。いくつかの実施形態では、TRY遺伝子は内在性種起源である。いくつかの実施形態では、TRY遺伝子はマウスTRY遺伝子である。いくつかの実施形態では、マウスTRY遺伝子は、Try1、Try2、Try3、Try4、Try5、Try6、Try7、Try8、Try9、Try10、Try11、Try12、Try13、Try14、Try15、Try16、Try17、Try18、Try19、及びTry20からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、1個又は2個以上のTRY遺伝子は、再構成されていない可変領域のVセグメントの上流に位置する。いくつかの実施形態では、1個又は2個以上のTRY遺伝子は、再構成されていない可変領域のVセグメントの下流(例えば、Vセグメントの下流並びにDセグメント及び/又はJセグメントの上流)に位置する。いくつかの実施形態では、Try1〜7は、再構成されていない可変領域のVセグメントの上流に位置し、Try 8〜20は、再構成されていない可変領域のVセグメントの下流(例えば、Vセグメントの下流並びにDセグメント及び/又はJセグメントの上流)に位置する。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、1種又は2種以上のヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメイン(ヒトα1、α2、及びα3ドメイン)と、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスIα鎖ポリペプチドは、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−g、HLA−K、又はHLA−Lである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−g、HLA−K、及び/又はHLA−Lポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化MHCクラスI α鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスI α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性MHCクラスI α鎖遺伝子座のうちの1個又は2個以上(例えば、全て)は、ヒト化MHCクラスI α鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のMHCクラスIα鎖ポリペプチドを発現しない。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化β−2−ミクログロブリン遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化β−2−ミクログロブリン遺伝子座は、内在性β−2−ミクログロブリン遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、内在性β−2−ミクログロブリン遺伝子座は、ヒト化β−2−ミクログロブリン遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のβ−2−ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、1種又は2種以上のヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスII α鎖ポリペプチドは、HLA−DMA、HLA−DOA、HLA−DPA、HLA−DQA、又はHLA−DRAである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化HLA−DMA、HLA−DOA、HLA−DPA、HLA−DQA、及び/又はHLA−DRAポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化MHCクラスII α鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスII α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性MHCクラスII α鎖遺伝子座のうちの1個又は2個以上(例えば、全て)は、ヒト化MHCクラスII α鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のMHCクラスII α鎖ポリペプチドを発現しない。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、1種又は2種以上のヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスII β鎖ポリペプチドは、HLA−DMB、HLA−DOB、HLA−DPB、HLA−DQB、又はHLA−DRBである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化HLA−DMB、HLA−DOB、HLA−DPB、HLA−DQB、及び/又はHLA−DRBポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化MHCクラスII β鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスII β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性MHCクラスII β鎖遺伝子座のうちの1個又は2個以上の(例えば、全て)は、ヒト化MHCクラスII β鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のMHCクラスII β鎖ポリペプチドを発現しない。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化CD8 α鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖遺伝子座は、内在性CD8 α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性CD8 α鎖遺伝子座は、ヒト化CD8 α鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のCD8 α鎖ポリペプチドを発現しない。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化CD8 β鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖遺伝子座は、内在性CD8 β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性CD8 β鎖遺伝子座は、ヒト化CD8 β鎖遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のCD8 β鎖ポリペプチドを発現しない。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト化CD4ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは、少なくとも1個のヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは、少なくともヒトD1免疫グロブリンドメイン、ヒトD2免疫グロブリンドメイン、及びヒトD3免疫グロブリンドメイン、並びに内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは、ヒトD1免疫グロブリンドメイン、ヒトD2免疫グロブリンドメイン、ヒトD3免疫グロブリンドメイン、内在性種起源のD4免疫グロブリンドメイン、及び内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒト化CD4ポリペプチドをコードする核酸配列を含むヒト化CD4遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4遺伝子座は、内在性CD4遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物の内在性CD4遺伝子座は、ヒト化CD4遺伝子座で置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、完全に内在性種起源のCD4ポリペプチドを発現しない。
特定の態様において、本明細書では、CARを発現するT細胞の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、CARは、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体及び/又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する抗原特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のMHC上で提示されるように、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド/MHC複合体に対して特異的なCARを発現するT細胞を、遺伝子改変非ヒト動物から得る工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び/又はそれから得ることができるT細胞を提供する。
特定の態様において、本明細書では、CARを発現するT細胞ハイブリドーマの作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、CARは、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体及び/又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する抗原特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のMHC上で提示されるように、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド/MHC複合体に対して特異的なCARを発現するT細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得る工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、T細胞からT細胞ハイブリドーマを作製する工程を含む。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び/又はそれから得ることができるT細胞ハイブリドーマを提供する。
特定の態様において、本明細書では、Ig可変ドメイン(例えば、Ig重鎖可変ドメイン、Ig κ可変ドメイン、及び/又はIg λ可変ドメイン)をコードする核酸の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ig可変ドメインは、単独で、又は別のIg可変ドメインと組み合わせたときのいずれかにおいて、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体及び/又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のMHC上で提示されるように、本明細書に記載の非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド/MHC複合体に対して特異的なCARを発現するT細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得る工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、CARのIg可変ドメインをコードする核酸をT細胞から単離することを含む。いくつかの実施形態では、CARの可変ドメインのそれぞれをコードする核酸は、T細胞から単離される。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び/又はそれ得ることができるIg可変ドメインをコードする核酸を提供する。
特定の態様において、本明細書では、抗体又は抗体フラグメントの作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体、及び/又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のMHC上で提示されるように、本明細書に記載の非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド/MHC複合体に対して特異的なCARを発現するT細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得ることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、CARの重鎖Ig可変ドメイン及び/又は軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸をT細胞から単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞が重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む抗体又は抗体フラグメントを発現するように、重鎖Ig可変ドメイン及び軽鎖Ig可変ドメインをコードする1個又は2個以上のベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞がIg重鎖可変ドメイン及びIg重鎖定常ドメインを含むIg重鎖ポリペプチドを発現するように、重鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、重鎖Ig定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞がIg軽鎖可変ドメイン及びIg重鎖定常ドメインを含むIg軽鎖ポリペプチドを発現するように、軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、軽鎖Ig定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞が、重鎖Ig可変ドメイン及び重鎖Ig定常ドメインを含む重鎖と、軽鎖Ig可変ドメイン及び軽鎖Ig定常ドメインを含む軽鎖と、を有する抗体を発現するように、重鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を重鎖Ig定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合し、軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を軽鎖Ig定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞が抗体又は抗体フラグメントを発現する条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、Ig軽鎖及び/又は重鎖定常ドメインは、ヒトIg定常ドメインである。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び/又はそれから得ることができる抗体又は抗体フラグメントを提供する。
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の抗体又は抗体フラグメント(例えば、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する抗体、及び/又は本明細書に記載の方法に従って生成された抗体)を被験者に投与することを含む、被験者の癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、任意の癌性又は前癌性腫瘍を治療してよい。本明細書に記載の方法及び組成物によって治療され得る癌としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎、肝、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からの癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、癌は、具体的に以下の組織型、つまり、腫瘍、悪性;癌;癌、未分化;巨細胞癌及び紡錘細胞癌;小細胞癌;乳頭癌;扁平上皮癌;リンパ上皮癌;基底細胞癌;毛母癌;移行上皮癌;乳頭状移行上皮癌;腺癌;ガストリン産生腫瘍、悪性;胆管癌;肝細胞癌;混合型肝細胞癌及び胆管癌;索状腺癌;腺様癌;腺腫様ポリープ内の腺癌;腺癌、家族性大腸ポリポーシス;充実癌;類癌、悪性;細気管支肺胞上皮(branchiolo-alveolar)腺癌;乳頭状腺癌;嫌色素性癌;好酸性癌;好酸性腺癌;好塩基性癌;明細胞腺癌;顆粒細胞癌;濾胞状腺癌;乳頭状及び濾胞状腺癌;非被包性硬化癌;副腎皮質癌;類内膜(endometroid)癌;皮膚付属器癌;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳垢腺癌;粘膜表皮癌;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液嚢胞腺癌;嚢胞腺癌;膠様腺癌;印環細胞癌;浸潤性乳管癌;髄様癌;小葉癌;炎症性癌;パジェット病、乳房;腺房細胞癌;腺扁平上皮癌;腺癌(扁平上皮化生を伴う);胸腺腫、悪性;卵巣間質腫、悪性;卵胞膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;及び神経芽細胞腫、悪性;セルトリ細胞腫;間質細胞腫、悪性;脂質細胞腫、悪性;傍神経節腫、悪性;乳房外傍神経節腫、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;メラニン欠乏性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑内の悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児型横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽腫細胞腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胎生期癌;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星状細胞腫;星状芽細胞腫;膠芽細胞腫;乏突起神経膠腫(oligodendroglioma);乏突起神経膠腫(oligodendroblastoma);未分化神経外胚葉性腫瘍;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽腫;網膜芽腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経線維鞘、悪性;果粒細胞腫、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキンリンパ腫;側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;他の特異的非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;肥胖細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;プラズマ細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥胖細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;並びに有毛状細胞性白血病であり得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の抗体又は抗体フラグメント(例えば、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する抗体、及び/又は本明細書に記載の方法に従って生成された抗体)を被験者に投与することを含む、ウイルス感染、細菌感染、蠕虫感染、又は原虫感染など感染症を患う被験者を治療する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書では、HPV、HBV、C型肝炎ウイルス(HCV)などウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルスHIV−1及びHIV−2)などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、HSV−1、及びHSV−2などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスの治療法を提供する。いくつかの実施形態では、治療される病原体は、マラリアなど寄生生物である。いくつかの実施形態において、本明細書では、アスペルギルス、Brugia、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌など細菌性疾患、真菌性疾患、及び他の病原性疾患の治療法を提供する。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、B群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス(Microplasma hominis)、軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌;又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど;又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
いくつかの態様において、本明細書では、CARを発現する細胞(例えば、ヒトT細胞などヒト細胞)の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体、及び/又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチドが非ヒト動物内のMHC上で提示されるように、本明細書に記載の非ヒト動物を、ペプチドを含む抗原に曝露する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、MHC上で提示されるペプチドに対して特異的なCARを発現するT細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得ることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、CARの重鎖Ig可変ドメイン及び/又は軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸をT細胞から単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞がIg重鎖可変ドメイン及びTCR定常ドメインを含むCARポリペプチドを発現するように、重鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、TCR定常ドメイン(例えば、TCRβ定常ドメイン又はTCRα定常ドメイン)をコードする核酸配列と細胞(例えば、ヒトT細胞などヒト細胞)内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞がIg軽鎖可変ドメイン及びTCR定常ドメインを含むCARポリペプチドを発現するように、軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、TCR定常ドメイン(例えば、TCRβ定常ドメイン又はTCRα定常ドメイン)をコードする核酸配列と細胞(例えば、ヒトT細胞などヒト細胞)内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞が重鎖Ig可変ドメイン及び第1のTCR定常ドメインを含む第1のCAR鎖ポリペプチドと、軽鎖Ig可変ドメイン及び第2のTCR定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を有するCARを発現するように、重鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、第1のTCR定常ドメイン(例えば、TCRβ定常ドメイン又はTCRα定常ドメイン)と細胞(例えば、ヒトT細胞などヒト細胞)内で操作可能に結合し、軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、第2のTCR定常ドメイン(例えば、TCRβ定常ドメイン(第1のTCR定常ドメインがTCRα定常ドメインである場合)又はTCRα定常ドメイン(第1のTCR定常ドメインがTCRβ定常ドメインである場合))をコードする核酸配列と細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、TCR定常ドメインはヒトTCR定常ドメインである。いくつかの実施形態では、細胞は、ex vivo細胞(例えば、ex vivoヒトT細胞などex vivoヒト細胞)である。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び/又はそれから得ることができるCARを発現する細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、ペプチドが非ヒト動物内のMHC上で提示されるように、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物をペプチドを含む抗原に曝露する任意の方法を使用できる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、非ヒト動物に抗原をコードする核酸配列を含むウイルス(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はレンチウイルス)を感染させることによって、抗原に曝露される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチドが非ヒト動物で発現するように、ペプチドをコードする核酸を動物に投与することによって、抗原に曝露される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、単鎖ペプチド/MHC複合体をコードする核酸を投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチド/MHC複合体を遺伝子改変非ヒト動物に投与することによって、抗原に曝露される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、単鎖ペプチド/MHC複合体(例えば、単鎖ecto−MHC/β−2−ミクログロブリン/ペプチドタンパク質複合体)を投与される。いくつかの実施形態では、ペプチド/MHC複合体は、多量体(例えば、四量体)として投与される。いくつかの実施形態では、ペプチド/MHC複合体は、細胞(例えば、マクロファージ細胞又は樹枝状細胞など抗原提示細胞)の表面に提示される。いくつかの実施形態では、B7.1、B7.2、又はICOS−Lは、細胞の表面に提示される。いくつかの実施形態では、細胞は、T細胞刺激性サイトカイン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−12、IL−13、IFN−γ、TNF−α、TGF−β、IFN−α及び/又はIFN−β)を発現する。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、任意の方法を使用して、Ig可変ドメインをコードする核酸を単離できる。いくつかの実施形態では、核酸を単離する工程は、T細胞からT細胞ハイブリドーマを作製し、T細胞ハイブリドーマから核酸を単離することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸増幅法(例えば、PCR)を使用して単離される。いくつかの実施形態では、核酸は、T細胞又はT細胞ハイブリドーマのCAR遺伝子座内で再構成されたIg可変領域遺伝子をシークエンシングし、再構成されたIg可変領域遺伝子を含む核酸配列を合成することにより単離される。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られた、又は得ることができるCARを発現するCARを提供する。いくつかの実施形態では、この細胞はT細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞はT細胞ハイブリドーマである。いくつかの実施形態では、CARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物又は細胞から得られた、又は得ることができる再構成されたIg可変領域遺伝子(例えば、重鎖Ig可変領域遺伝子又は軽鎖重鎖可変領域遺伝子)を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、TCR定常領域遺伝子(例えば、TCRα定常領域遺伝子又はTCRβ定常領域遺伝子)を更に含む。いくつかの実施形態では、核酸はCARポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、Ig可変領域遺伝子は、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有するIg可変ドメインをコードする。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物又は細胞から得られた、又は得ることができるCAR又はCARポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、CAR又はCARポリペプチドは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。
特定の態様において、本明細書では、ゲノム中にCAR遺伝子座を含む非ヒト胚性幹(ES)細胞(例えば、マウスES細胞又はラットES細胞などげっ歯類ES細胞)を提供する。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメント(例えば、再構成されていないV、D、及びJ重鎖遺伝子セグメント、再構成されていないV κ及びJ κ軽鎖遺伝子セグメント、又は再構成されていないV λ及びJ λ軽鎖遺伝子セグメント)を含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、TCR定常領域遺伝子(例えば、TCRα定常領域遺伝子又はTCRβ定常領域遺伝子)と、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントは、TCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントはヒトIg可変領域遺伝子セグメントである。いくつかの実施形態では、TCR定常領域遺伝子は、内在性種起源である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ig可変領域遺伝子間配列(例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、Ig可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、TCR可変領域遺伝子間配列(例えば、TCRβ遺伝子間配列又はTCRα遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
特定の態様において、本明細書では、ゲノム中に第1のCAR遺伝子座及び第2のCAR遺伝子座を含む、非ヒトES細胞(例えば、マウスES細胞又はラットES細胞などげっ歯類ES細胞)を提供する。いくつかの実施形態では、第1のCAR遺伝子座は、再構成されていないヒトIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源のTCRβ定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントは、TCRβ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第1のCAR遺伝子座は、Ig重鎖可変領域遺伝子(ユニバーサル重鎖可変領域)を含む再構成された可変領域遺伝子座と、内在性種起源のTCRβ定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含む。いくつかの実施形態では、第2のCAR遺伝子座は、再構成されていないヒトIg Vκ及びJκを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源のTCRα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントは、TCRα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第2のCAR遺伝子座は、再構成されていないヒトIg Vλ及びJλを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、内在性種起源のTCRα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、再構成されていないヒトIg Vλ及びJλ遺伝子セグメントは、TCRα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、第2のCAR遺伝子座は、Ig軽鎖κ又はλ可変領域遺伝子(ユニバーサル軽鎖可変領域)を含む再構成された可変領域遺伝子座と、内在性種起源のTCRα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座の一方又は両方は、Ig可変領域遺伝子間配列(例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、Ig可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座の一方又は両方は、TCR可変領域遺伝子間配列(例えば、TCRβ遺伝子間配列又はTCRα遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
本明細書に記載の非ヒト動物ES細胞のいくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、内在性TCR遺伝子座(例えば、内在性TCRα遺伝子座又は内在性TCRβ遺伝子座)に位置する。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座のTCR定常領域遺伝子は内在性TCR定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、内在性TCRα遺伝子座及び/又はTCRβ遺伝子座の可変領域の全て又は一部は、遺伝子座の可変領域の全て又は一部で置換されて、CAR遺伝子座を作製する。いくつかの実施形態では、TCR可変領域全体がIg可変領域で置換される。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子セグメントはIg可変領域遺伝子セグメントで置換される。例えば、いくつかの実施形態では、内在性TCRβ遺伝子座のV、D、及びJ遺伝子セグメントは、Ig重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメントで置換される。いくつかの実施形態では、内在性TCRα遺伝子座のV及びJ遺伝子セグメントは、Ig軽鎖(例えば、κ又はλ)V及びJ遺伝子セグメントで置換される。
いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的TCR遺伝子座を含まない。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的TCRα鎖遺伝子座及び/又は機能的TCRβ鎖遺伝子座を含まない。いくつかの実施形態では、内在性TCRα遺伝子座及び/又はTCRβ遺伝子座は、遺伝子改変非ヒトES細胞で(例えば、内在性遺伝子座の全て又は一部を削除することによって)不活性化される。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的TCRδ遺伝子座を含まない。
本明細書に記載の非ヒト動物ES細胞のいくつかの実施形態では、CAR遺伝子座の再構成されていない可変領域は、1個又は2個以上のトリプシノーゲン(TRY)遺伝子(例えば、TRY遺伝子及び/又はTCRβ可変領域遺伝子座内に通常存在する偽遺伝子)を含む。いくつかの実施形態では、TRY遺伝子は内在性種起源である。いくつかの実施形態では、TRY遺伝子はマウスTRY遺伝子である。いくつかの実施形態では、マウスTRY遺伝子は、Try1、Try2、Try3、Try4、Try5、Try6、Try7、Try8、Try9、Try10、Try11、Try12、Try13、Try14、Try15、Try16、Try17、Try18、Try19、及びTry20からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、1個又は2個以上のTRY遺伝子は、再構成されていない可変領域のVセグメントの上流に位置する。いくつかの実施形態では、1個又は2個以上のTRY遺伝子は、再構成されていない可変領域のVセグメントの下流(例えば、Vセグメントの下流並びにDセグメント及び/又はJセグメントの上流)に位置する。いくつかの実施形態では、Try1〜7は、再構成されていない可変領域のVセグメントの上流に位置し、Try8〜20は、再構成されていない可変領域のVセグメントの下流(例えば、Vセグメントの下流並びにDセグメント及び/又はJセグメントの上流)に位置する。
いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、そのゲノム中に、ヒト化MHCクラスIα鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスIα鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスIα鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメイン(ヒトα1、α2、及びα3ドメイン)と、内在性種起源細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスIα鎖ポリペプチドは、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−g、HLA−K、又はHLA−Lである。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ヒト化HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−g、HLA−K、及び/又はHLA−Lポリペプチドをコードする遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスI α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞の内在性MHCクラスI α鎖遺伝子座のうちの1個又は2個以上(例えば、全て)は、ヒト化MHCクラスI α鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的内在性MHCクラスI α鎖遺伝子座(例えば、完全に内在性種起源のMHCクラスI α鎖をコードする遺伝子座)を含まない。
いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、ヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化β−2−ミクログロブリン遺伝子座は、内在性β−2−ミクログロブリン遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、内在性β−2−ミクログロブリン遺伝子座は、ヒト化β−2−ミクログロブリン遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的内在性β−2−ミクログロブリン遺伝子座(例えば、完全に内在性種起源のβ−2−ミクログロブリンポリペプチドをコードする遺伝子座)をそのゲノム中に含まない。
いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスII α鎖ポリペプチドは、HLA−DMA、HLA−DOA、HLA−DPA、HLA−DQA、又はHLA−DRAである。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、ヒト化HLA−DMA、HLA−DOA、HLA−DPA、HLA−DQA及び/又はHLA−DRAポリペプチドをコードする遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスII α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞の内在性MHCクラスII α鎖遺伝子座のうちの1個又は2個以上(例えば、全て)は、ヒト化MHCクラスII α鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒトES細胞は、機能的内在性MHCクラスII α鎖遺伝子座(例えば、完全に内在性種起源のMHCクラスII α鎖をコードする遺伝子座)をそのゲノム中に含まない。
いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化クラスII β鎖ポリペプチドは、HLA−DMB、HLA−DOB、HLA−DPB、HLA−DQB、又はHLA−DRBである。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、ヒト化HLA−DMB、HLA−DOB、HLA−DPB、HLA−DQB、及び/又はHLA−DRBポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスII β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞の内在性MHCクラスII β鎖遺伝子座のうちの1個又は2個以上(例えば、全て)は、ヒト化MHCクラスII β鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的内在性MHCクラスII β鎖遺伝子座(例えば、完全に内在性種起源のMHCクラスII β鎖をコードする遺伝子座)をそのゲノム中に含まない。
いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖遺伝子座は、内在性CD8 α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞の内在性CD8 α鎖遺伝子座は、ヒト化CD8 α鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的内在性CD8 α鎖遺伝子座(例えば、完全に内在性種起源のCD8 α鎖をコードする遺伝子座)をそのゲノム中に含まない。
いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖遺伝子座は、内在性CD8 β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞の内在性CD8 β鎖遺伝子座は、ヒト化CD8 β鎖遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的内在性CD8 β鎖遺伝子座(例えば、完全に内在性種起源のCD8 β鎖をコードする遺伝子座)をそのゲノム中に含まない。
いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、ヒト化CD4ポリペプチドをコードする遺伝子座をそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは、少なくともヒトD1免疫グロブリンドメイン、ヒトD2免疫グロブリンドメイン、及びヒトD3免疫グロブリンドメイン、並びに内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは、ヒトD1免疫グロブリンドメイン、ヒトD2免疫グロブリンドメイン、ヒトD3免疫グロブリンドメイン、内在性種起源のD4免疫グロブリンドメイン、及び内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4遺伝子座は、内在性CD4遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞の内在性CD4遺伝子座は、ヒト化CD4遺伝子座で全体又は一部を置換される。いくつかの実施形態では、非ヒトES細胞は、機能的内在性CD4鎖遺伝子座(例えば、完全に内在性種起源のCD4鎖をコードする遺伝子座)をそのゲノム中に含まない。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載のES細胞を使用して生成された、又はそれから得ることができる遺伝子改変非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態では、この遺伝子改変非ヒト動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、この遺伝子改変非ヒト動物は、マウス又はラットである。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の非ヒトES細胞を含む非ヒト胚を提供する。
特定の態様において、本明細書では、CAR及び/又はCARポリペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物の作製方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、本明細書に記載の非ヒトES細胞を使用して非ヒト動物を生成することを含む。特定の実施形態では、非ヒトES細胞はマウス非ヒトES細胞である。いくつかの実施形態では、この方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,294,754号に記載されるように、VELOCIMOUSE(登録商標)法を使用することを含む。特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法を使用して生成された、又はそれらの方法から得ることができる遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
特定の態様において、本明細書では、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、げっ歯類TCR定常領域遺伝子(例えば、マウスTCR定常領域遺伝子又はラットTCR定常領域遺伝子)を含む定常領域遺伝子座と、を含むCAR遺伝子座を提供し、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントは、TCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントは、ヒトIg重鎖(IgH)可変領域遺伝子セグメントである。いくつかの実施形態では、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントは、ヒトIg軽鎖(IgL)可変領域遺伝子セグメント(例えば、Ig κ遺伝子セグメント又はIg λ遺伝子セグメント)である。いくつかの実施形態では、TCR定常領域遺伝子は、TCRα定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、内在性TCRα遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントは、内在性TCRα可変領域遺伝子セグメントを置換する。いくつかの実施形態では、TCRα定常領域遺伝子は、内在性TCRα定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、TCR定常領域遺伝子は、TCRβ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、内在性TCRβ遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントは、内在性TCRβ可変領域遺伝子セグメントを置換する。いくつかの実施形態では、TCRβ定常領域遺伝子は、内在性TCRβ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、1個又は2個以上のトリプシノーゲン遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ig可変領域遺伝子間配列(例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、Ig可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、TCR可変領域遺伝子間配列(例えば、TCRβ遺伝子間配列又はTCRα遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
特定の態様において、本明細書では、再構成されていないヒトIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、げっ歯類TCRβ定常領域遺伝子(例えば、ラットTCRβ定常領域遺伝子又はマウスTCRβ定常領域遺伝子)を含む定常領域遺伝子座と、を含むCAR遺伝子座を提供し、再構成されていないヒトIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントは、TCRβ定常領域遺伝子に操作可能に結合される。特定の実施形態では、CAR遺伝子座は、内在性TCRβ遺伝子座に位置する。特定の実施形態では、再構成されていないヒトIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントは、内在性TCRβ可変領域遺伝子セグメントを置換する。いくつかの実施形態では、TCRβ定常領域遺伝子は、内在性TCRβ定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、1個又は2個以上のトリプシノーゲン遺伝子を更に含む。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ig可変領域遺伝子間配列(例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、Ig可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、TCR可変領域遺伝子間配列(例えば、TCRβ遺伝子間配列又はTCRα遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
特定の態様において、本明細書では、再構成されていないヒトIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、げっ歯類TCRα定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含むCAR遺伝子座を提供し、再構成されていないヒトIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントは、TCRα定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、内在性TCRα遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントは、内在性TCRα可変領域遺伝子セグメントを置換する。いくつかの実施形態では、TCRα定常領域遺伝子は、内在性TCRα定常領域遺伝子である。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は機能的TCRδ遺伝子座を含まず、いくつかの実施形態では、TCRδ遺伝子座は削除される。
特定の態様において、本明細書では、生殖細胞系に本明細書に記載のCAR遺伝子座を含むげっ歯類(例えば、ラット又はマウス)を提供する。いくつかの態様において、本明細書では、生殖細胞系に本明細書に記載のCAR遺伝子座を含むげっ歯類細胞(例えば、ラット細胞又はマウス細胞)を提供する。いくつかの実施形態では、この細胞はES細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のCAR遺伝子座をコードする核酸(例えば、ベクター)を提供する。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、Ig可変領域遺伝子間配列(例えば、重鎖遺伝子間配列、κ遺伝子間配列、又はλ遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、Ig可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。いくつかの実施形態では、再構成されていない可変領域遺伝子座は、TCR可変領域遺伝子間配列(例えば、TCRβ遺伝子間配列又はTCRα遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、TCR可変領域遺伝子間配列は、ヒト配列、マウス配列、又はラット配列である。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載のCARを発現する非ヒト動物(例えば、マウス又はラット)の作製方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、本明細書に記載のCAR遺伝子座を生殖細胞系に含むように、非ヒト動物を遺伝子的に改変することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載のCAR遺伝子座を含むように、非ヒトES細胞(例えば、マウスES細胞又はラットES細胞)を遺伝子的に改変することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、TCRα定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないIg軽鎖遺伝子セグメント(軽鎖V及びJセグメント)を含むCAR遺伝子座を非ヒトES細胞に導入することと、TCRβ定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないIg重鎖遺伝子セグメント(重鎖V、D、及びJセグメント)を含むCAR遺伝子座を非ヒトES細胞に導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、TCRα定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないIg軽鎖遺伝子セグメント(軽鎖V及びJセグメント)を含むように、非ヒト動物ES細胞のTCRα遺伝子座を改変することと、TCRβ定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないIg重鎖遺伝子セグメント(重鎖V、D、及びJセグメント)を含むように、非ヒト動物ES細胞のTCRβ遺伝子座を改変することと、を含む。
特定の態様において、本明細書では、Ig重鎖可変ドメイン及びTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、Ig軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供し、このCARは、ペプチド/MHC複合体(例えば、図1を参照)に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスI MHC複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスII MHC複合体である。いくつかの実施形態では、このIg重鎖可変ドメイン及び/又はIg軽鎖可変ドメインは、ヒトIg可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン(例えば、ラット又はマウス定常ドメイン)である。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。
特定の態様において、本明細書では、Ig重鎖可変ドメイン及びTCRα定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、Ig軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びTCRβ定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むキメラ抗原受容体(CAR)を提供し、このCARは、ペプチド/MHC複合体(例えば、図2を参照)に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスI MHC複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスII MHC複合体である。いくつかの実施形態では、このIg重鎖可変ドメイン及び/又はIg軽鎖可変ドメインは、ヒトIg可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン(例えば、ラット又はマウス定常ドメイン)である。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載のCARを発現する細胞又は非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態では、この細胞はT細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞又は動物は、ヒト又はげっ歯類(例えば、ラット又はマウス)である。特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の細胞を含む非ヒト動物(例えば、ラット又はマウスなどげっ歯類)を提供する。
いくつかの態様において、本明細書では、被験者内のペプチド/MHC複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトIg重鎖可変ドメイン及びヒトTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、ヒトIg軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びヒトTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARを発現する細胞(例えば、CD4T細胞又はCD8T細胞などヒトT細胞)を被験者に投与することを含み、このCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスI MHC複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスII MHC複合体である。
いくつかの態様において、本明細書では、被験者(例えば、ヒト被験者)内のペプチド/MHC複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトIg重鎖可変ドメイン及びヒトTCRα定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、ヒトIg軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びヒトTCRβ定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARを発現する細胞(例えば、CD4T細胞又はCD8T細胞などヒトT細胞)を被験者に投与することを含み、このCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスI MHC複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスII MHC複合体である。
特定の態様において、本明細書では、被験者(例えば、ヒト被験者)内のペプチド/MHC複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者からT細胞(例えば、CD4 T細胞又はCD8 T細胞)を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトIg重鎖可変ドメイン及びヒトTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、ヒトIg軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びヒトTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARのT細胞によって発現を誘導することを含み、このCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者にT細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第1のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第1のベクター及び第2のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第2のベクターでT細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第1のCARポリペプチドをコードする核酸配列(nucleic sequence)を含む第1のベクター及び第2のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第2のベクターでT細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、内在性TCRα及び/又はTCRβのT細胞による発現を抑制する工程を含む。
特定の態様において、本明細書では、被験者(例えば、ヒト被験者)内のペプチド/MHC複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者からT細胞(例えば、CD4 T細胞又はCD8 T細胞)を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトIg重鎖可変ドメイン及びヒトTCRα定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、ヒトIg軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びヒトTCRβ定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARのT細胞によって発現を誘導することを含み、このCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者にT細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第1のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第1のベクター及び第2のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第2のベクターでT細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第1のCARポリペプチドをコードする核酸配列及び第2のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターでT細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、内在性TCRα及び/又はTCRβのT細胞による発現を抑制する工程を含む。
特定の態様において、本明細書では、Ig重鎖可変ドメイン及びTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、Ig軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドをコードする第2の核酸配列と、を含む核酸組成物を提供し、このCARは第1のCARポリペプチドを含み、第2のCARポリペプチドは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、このIg重鎖可変ドメイン及び/又はIg軽鎖可変ドメインは、ヒトIg可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン(例えば、ラット定常ドメイン又はマウス定常ドメイン)である。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、単一の核酸分子上にある。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、別個の核酸分子上にある。
特定の態様において、本明細書では、Ig重鎖可変ドメイン及びTCRα定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、Ig軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びTCRβ定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドをコードする第2の核酸配列と、を含む核酸組成物を提供し、このCARは第1のCARポリペプチドを含み、第2のCARポリペプチドは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、このIg重鎖可変ドメイン及び/又はIg軽鎖可変ドメインは、ヒトIg可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン(例えば、ラット定常ドメイン又はマウス定常ドメイン)である。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、単一の核酸分子上にある。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、別個の核酸分子上にある。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の核酸組成物で細胞をトランスフェクトすることを含む、CARを発現する細胞の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、この細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、げっ歯類細胞(例えば、ラット細胞又はマウス細胞)である。いくつかの実施形態では、この細胞はT細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、ex vivoT細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の方法に従って作製された、及び/又はそれから得ることができる細胞を提供する。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載のCARを発現するT細胞を被験者に投与することを含む、被験者の疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この疾患又は障害は癌であり、このCARは、癌抗原を提示したMHCに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この疾患又は障害は感染症であり、このCARは、病原体抗原(例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、又は寄生虫抗原)に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、この疾患又は障害は、自己免疫疾患、及び/又は炎症性疾患であり、このCARは自己免疫の自己抗原に特異的であり、調節性T細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、このT細胞は、CD4+ T細胞である。いくつかの実施形態では、このT細胞は、CD8+ T細胞である。
全般
本明細書では、免疫グロブリン(Ig)由来の抗原結合ドメインと、T細胞受容体(TCR)由来の定常ドメインと、を有するキメラ抗原受容体(CAR)に関連する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このCARは、主要組織適合複合体(MHC)タンパク質によって提示されるペプチドに対する結合特異性を有する。
本明細書では、免疫グロブリン(Ig)由来の抗原結合ドメインと、T細胞受容体(TCR)由来の定常ドメインと、を有するキメラ抗原受容体(CAR)に関連する方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このCARは、主要組織適合複合体(MHC)タンパク質によって提示されるペプチドに対する結合特異性を有する。
抗体は、高い親和性及び特異性で標的抗原に結合するその能力のために、有益な治療剤であることが判明している。既存の抗体治療技術の弱点の1つは、細胞膜全体への抗体の送達に伴う課題のために、細胞内抗原など特定の抗原を標的化することの困難さである。したがって、現在の抗体治療法は、概して、細胞表面タンパク質など細胞外抗原及びサイトカインなど可溶性因子を対象とする。一方、多くの腫瘍抗原及びウイルス抗原など細胞内標的は、標的化することが依然として困難である。
細胞膜全体に抗体を送達するという課題は、主要組織適合複合体(MHC)タンパク質上に提示されるペプチド抗原を認識できる抗体を使用することによって回避できる。全ての有核哺乳類細胞は、内在性細胞タンパク質を処理して、クラスIMHCタンパク質に積載され、細胞の表面で提示されるペプチドにする。同様に、樹枝状細胞又はマクロファージなどプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)は、外因性抗原を処理して、クラスII MHCタンパク質に積載され、APC細胞表面に提示されるペプチドにする。胸腺でのT細胞の発現中に、T細胞は、ポジティブ選択及びネガティブ選択を受ける。これによって、胸腺から出現するMHCに対して非常に弱いペプチド非依存の親和性を有するTCRを発現する、ごく少数のT細胞のみを確保し(ポジティブ選択)、一方では、自己ペプチド/MHCに対して中〜高度の親和性を有するTCRを発現するT細胞はアポトーシスに追いやられる(ネガティブ選択)。抗体は、TCRとは異なって、通常、MHCベースのポジティブ選択及びネガティブ選択を受けず、従来の抗体生成技術を使用したペプチド/MHC複合体に対して特異的な抗体を生成することが困難であることが判明している。
本明細書に記載するように、いくつかの実施形態では、ペプチド/MHC複合体に対して特異的な、抗体など可溶性抗原結合分子は、Ig可変ドメインと、TCR定常ドメインと、を有するCARを発現するT細胞を有するように操作される遺伝子改変非ヒト動物(例えば、マウス)を使用して生成され得る。かかる非ヒト動物は、TCRα及びTCRβ定常領域に操作可能に結合された、再構成されていないIg軽鎖及び重鎖可変(V(D)J)遺伝子セグメント由来のIg可変ドメインを有し、抗原(例えば、ペプチド/MHC)に遭遇すると、CAR遺伝子座においてV(D)J再構成を受けて、T細胞でのCAR発現をもたらす、再構成されたCAR分子を生成する。かかるT細胞はポジティブ及びネガティブ選択を受けるため、発現したCARは、ペプチド/MHCに対する抗原特異性を有する。したがって、かかるマウスは、ペプチド/MHC複合体を標的化できる抗原結合タンパク質を生成するために使用できる。例えば、これらのマウスは、抗原特異的なT細胞が生成されるように、ペプチド/MHC抗原で免疫され得る。抗原特異的なT細胞で発現したCARのIg可変ドメインをコードする核酸は、宿主細胞がペプチド/MHC特異抗体を発現するように、宿主細胞内でIg定常ドメインをコードする核酸に操作可能に結合され得る。
定義
冠詞「a」及び「an」は、冠詞の文法的目的語のうちの1つ又は2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために本明細書で使用される。例として、「an element(要素)」は、1つの要素又は2つ以上の要素を意味する。
冠詞「a」及び「an」は、冠詞の文法的目的語のうちの1つ又は2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために本明細書で使用される。例として、「an element(要素)」は、1つの要素又は2つ以上の要素を意味する。
用語「アミノ酸」は、天然であるか、合成であるかにかかわらず、アミノ官能基及び酸性官能基の両方を含み、天然に発生するアミノ酸のポリマーに含まれることができる、全ての分子を包含することを意図する。例示的なアミノ酸としては、天然に発生するアミノ酸;その類似物、誘導体、及び同族体;変形側鎖を有するアミノ酸類似物;並びに前述のいずれかの全ての立体異性体が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、インタクトな抗体及びそのフラグメントを結合する抗原の両方を指してよい。インタクトな抗体とは、ジスルフィド結合で相互に結合された、少なくとも2個の重(H)鎖及び2個の軽((L)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変ドメインと、重鎖定常ドメインと、を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインと、軽鎖定常ドメインと、を含む。重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、超可変性のいわゆる相補性決定領域(CDR)、より保存されている領域が組み入れられている、いわゆるフレームワーク領域(FR)のドメインへと更に細分化され得る。各重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された、3個のCDR及び4個のFRからなる。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
用語「抗原結合フラグメント」及び抗体の「抗原結合部分」は、本明細書で使用するとき、抗原に結合する能力を保持する抗体の1個又は2個以上のフラグメントを指す。用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、ジスルフィド結合Fv、Fd、単鎖抗体、単離CDRH3、及びインタクトな抗体の可変ドメインの少なくとも一部を保持する他の抗体フラグメントが挙げられる。これらの抗体フラグメントは、従来の組み換え及び/又は酵素技術を使用して得ることができ、インタクトな抗体と同様の方法で抗原結合をスクリーニングできる。
本明細書で使用するとき、「キメラ抗原受容体」又は「CAR」は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン(例えば、免疫グロブリン可変ドメイン)と、T細胞受容体(TCR)定常ドメインと、を含む抗原結合タンパク質を指す。本明細書で使用するとき、TCRポリペプチドの「定常ドメイン」は、膜近傍のTCR定常ドメインを含み、TCR膜貫通ドメイン及び/又はTCR細胞質尾部も含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、CARは、TCRβ定常ドメインに結合された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む第1のポリペプチドと、TCRα定常ドメインに結合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(例えば、κ又はλ可変ドメイン)を含む第2のポリペプチドと、を含む、二量体である。いくつかの実施形態では、CARは、TCRα定常ドメインに結合された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む第1のポリペプチドと、TCRβ定常ドメインに結合された免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(例えば、κ又はλ可変ドメイン)を含む第2のポリペプチドと、を含む、二量体である。
再構成されていない可変領域及び/又は再構成されていない可変領域遺伝子セグメント「由来の」再構成された可変領域遺伝子に関して使用するとき、語句「由来」は、再構成された可変領域遺伝子の配列を、可変ドメインを発現する遺伝子を形成するように再構成された、一連の再構成されていない可変領域遺伝子セグメントまで遡ることができることを指す(該当する場合、スプライスの相違点及び体細胞変異を説明する)。例えば、体細胞変異した、再構成された可変領域遺伝子は、それでもなお再構成されていない可変領域遺伝子セグメント由来である。内在性遺伝子座がユニバーサル軽鎖又は重鎖遺伝子座で置換されるいくつかの実施形態では、用語「由来」は、配列が体細胞変異したことがあっても配列の起源を前記再構成された遺伝子座まで遡ることができることを示す。
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子座」は、一連の関連遺伝子要素(例えば、遺伝子、遺伝子セグメント、調節要素)を含む染色体上の位置を指す。例えば、再構成されていない免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、1個又は2個以上の免疫グロブリン定常領域遺伝子、及びV(D)J組み換え及び免疫グロブリン発現を指示する関連調節要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、スイッチ要素など)を含んでよい。同様に、再構成されていないCAR遺伝子座は、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、TCR定常領域遺伝子、及びV(D)J組み換え及びCAR発現を指示する関連調節要素(例えば、プロモーター、エンハンサーなど)を含んでよい。遺伝子座は、内在性又は非内在性であり得る。用語「内在性遺伝子座」は、特定の遺伝子要素が自然に見つけられる、染色体上の位置を指す。例えば、内在性マウスTCRα遺伝子座は、野生型マウス内の、TCRα可変領域遺伝子セグメント及び定常領域遺伝子を含むマウス染色体14上の位置を指し、内在性マウスTCRβ遺伝子座は、野生型マウス内の、TCRβ可変領域遺伝子セグメント及び定常領域遺伝子を含むマウス染色体6上の位置を示す。
再構成されていない可変領域遺伝子セグメントは、再構成されていない可変領域遺伝子セグメントが、抗原結合タンパク質のポリペプチド鎖として定常領域遺伝子とともに発現される、再構成された可変領域遺伝子を形成するように再構成可能である場合、隣接する定常領域遺伝子に「操作可能に結合」される。例えば、再構成されていない免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、CAR遺伝子座内でTCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される。
用語「ポリヌクレチド」及び「核酸」は、同じ意味で使用する。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド、又はリボヌククレオチド、又はこれらの類似物のいずれであっても、任意の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。ポリヌクレチドは、任意の三次元構造を有してよく、任意の機能を実行してよい。ポリヌクレチドの非限定例としては、遺伝子又は遺伝子フラグメントのコード領域又は非コード領域、連鎖回析から定義された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボゾームRNA、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレチド、分岐ポリヌクレチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。ポリヌクレチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体など修飾ヌクレオチドを含んでよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組織化前後に付与されてよい。ポリヌクレチドは、標識成分との共役によって更に修飾されてよい。本明細書で提供する全ての核酸配列では、Uヌクレオチドは、Tヌクレオチドと代替できる。
本明細書で使用するとき、「特異的結合」及び「抗原特異性」は、抗原結合分子(例えば、抗体又はCAR)が所定のペプチド/MHC複合体など所定の標的に結合する能力を指す。通常、抗原結合分子は、その所定の標的に約10−7M以下のKDに相当する親和性で特異的に結合し、所定の標的に、非特異的な、無関係の標的(例えば、BSA、カゼイン)に結合するためのその親和性よりも少なくとも10倍小さい、少なくとも100倍小さい、又は少なくとも1000倍小さい、親和性(KDで示される)で結合する。
用語「再構成されていない」は、V遺伝子セグメント及びJ遺伝子セグメント(重又はTCRβ可変領域の場合、D遺伝子セグメントも同様)は、別個に維持されるものの、結合されてV(D)Jレパートリーの単独のV、(D)、Jを含む再構成されたV(D)J遺伝子(「可変領域遺伝子」)を形成することができる、免疫グロブリン、TCR若しくはCAR可変領域遺伝子座又は可変領域遺伝子セグメントの状態を含む。
キメラ抗原受容体遺伝子座
特定の態様において、本明細書では、キメラ抗原受容体(CAR)遺伝子座を提供する。かかるCAR遺伝子座は、概して、可変領域遺伝子座と、定常領域遺伝子座と、を含む。可変領域遺伝子座は再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントを含み、定常領域遺伝子座はTCR定常領域遺伝子を含み、Ig可変領域遺伝子セグメントは、定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、可変領域は再構成されていない可変領域であり、したがって、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、可変領域は再構成された可変領域であり、したがって、再構成された可変領域遺伝子を含む。特定の実施形態では、Ig可変領域遺伝子セグメントはヒト可変領域遺伝子セグメントであり、TCR定常領域遺伝子は非ヒト定常領域遺伝子である。例えば、いくつかの実施形態では、TCR定常領域遺伝子は、ラット定常領域遺伝子又はマウス定常領域遺伝子などげっ歯類定常領域遺伝子である。特定の実施形態では、Ig可変領域遺伝子セグメントはヒト可変領域遺伝子セグメントであり、TCR定常領域遺伝子はヒト定常領域遺伝子である。
特定の態様において、本明細書では、キメラ抗原受容体(CAR)遺伝子座を提供する。かかるCAR遺伝子座は、概して、可変領域遺伝子座と、定常領域遺伝子座と、を含む。可変領域遺伝子座は再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントを含み、定常領域遺伝子座はTCR定常領域遺伝子を含み、Ig可変領域遺伝子セグメントは、定常領域遺伝子に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、可変領域は再構成されていない可変領域であり、したがって、再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、可変領域は再構成された可変領域であり、したがって、再構成された可変領域遺伝子を含む。特定の実施形態では、Ig可変領域遺伝子セグメントはヒト可変領域遺伝子セグメントであり、TCR定常領域遺伝子は非ヒト定常領域遺伝子である。例えば、いくつかの実施形態では、TCR定常領域遺伝子は、ラット定常領域遺伝子又はマウス定常領域遺伝子などげっ歯類定常領域遺伝子である。特定の実施形態では、Ig可変領域遺伝子セグメントはヒト可変領域遺伝子セグメントであり、TCR定常領域遺伝子はヒト定常領域遺伝子である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCAR遺伝子座は、内在性TCR遺伝子座に位置する。例えば、いくつかの実施形態では、TCRα定常領域遺伝子を含むCAR遺伝子座は、内在性TCRα定常領域遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、かかる遺伝子座は、再構成されていないTCRα可変領域の一部又は全てを再構成されていないIg可変領域で置換することにより作製される。いくつかの実施形態では、TCRβ定常領域遺伝子を含むCAR遺伝子座は、内在性TCRβ定常領域遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、かかる遺伝子座は、再構成されていないTCRβ可変領域の一部又は全てを再構成されていないIg可変領域で置換することにより作製される。本明細書では、例示的なCAR遺伝子座の構築方法を実施例2で提供する。
特定の実施形態では、CAR可変領域遺伝子座は、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメント含む。ヒト可変領域遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域遺伝子座は、当該技術分野で説明されている。例えば、かかる遺伝子座は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,770,429号、同第5,814,318号、同第6,114,598号、同第6,998,514号、同第8,232,449号、同第8,502,018号、及び同第8,697,940号、並びにそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2008/0098490号、同第2012/0167237号、同第2013/0145484号、同第2013/0326647号、同第2014/013275号、及び同第2014/093908号に記載されている。
特定の実施形態では、CAR可変領域遺伝子座は、再構成されていないヒトIg重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントは、複数個のヒトVHセグメントと、1個又は2個以上のヒトDHセグメントと、1個又は2個以上のヒトJHセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントは、少なくとも3個のVH遺伝子セグメント、少なくとも18個のVH遺伝子セグメント、少なくとも20個のVH遺伝子セグメント、少なくとも30個のVH遺伝子セグメント、少なくとも40個のVH遺伝子セグメント、少なくとも50個のVH遺伝子セグメント、少なくとも60個のVH遺伝子セグメント、少なくとも70個のVH遺伝子セグメント、又は少なくとも80個のVH遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg遺伝子セグメントは、ヒトDH遺伝子セグメントの全てを含む。いくつかの実施形態では、CAR可変領域は、TCRβ可変領域遺伝子セグメント(例えば、V、D、及び/又はJ遺伝子セグメント)を更に含む。一実施形態では、CAR可変領域は、遠位TCR Vβ遺伝子セグメント、例えば、TCR Vβ31遺伝子セグメントを更に含む。別の実施形態では、遠位TCR Vβ遺伝子セグメント、例えば、TCR Vβ31遺伝子セグメントは、機能的に不活性であるか、削除されている。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg遺伝子セグメントは、全てのトJH遺伝子セグメントを含む。Ig重鎖遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Macdonald et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.111:5147〜52及び補足情報で提供される。
いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg重鎖可変領域遺伝子セグメントを含むCAR可変遺伝子座はまた、ヒトIg重鎖可変領域遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態では、CAR可変遺伝子座は、非ヒト(例えば、げっ歯類、ラット、マウス)Ig重鎖可変領域遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態では、CAR可変遺伝子座は、ヒト又は非ヒト(例えば、げっ歯類、ラット、マウス)TCRβ可変領域遺伝子間配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座の再構成されていない可変領域は、1個又は2個以上(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、又は20個)のトリプシノーゲン(TRY)遺伝子(例えば、TRY遺伝子及び/又は通常、TCRβ可変領域遺伝子座に存在する偽遺伝子)を含む。いくつかの実施形態では、TRY遺伝子はマウスTRY遺伝子である。いくつかの実施形態では、マウスTRY遺伝子は、Try1、Try2、Try3、Try4、Try5、Try6、Try7、Try8、Try9、Try10、Try11、Try12、Try13、Try14、Try15、Try16、Try17、Try18、Try19、及びTry20からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、1個又は2個以上のTRY遺伝子は、再構成されていない可変領域のVHセグメントの上流に位置する。いくつかの実施形態では、1個又は2個以上のTRY遺伝子は、再構成されていない可変領域のVHセグメントの下流かつDHセグメントの上流に位置する。いくつかの実施形態では、Try1〜7は、再構成されていない可変領域のVHセグメントの上流に位置し、Try8〜20は、再構成されていない可変領域のVHセグメントの下流かつDHセグメントの上流に位置する。ヒト及び/又はマウスTCRβ遺伝子座に位置するTRY遺伝子に関する追加情報は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Glusman et al.,Immunity 15:337〜349(2001)及びSkok et al.,Nature Immunology8:378〜387(2007)で提供される。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、非ヒト調節要素(例えば、非ヒトプロモーター及び/又はエンハンサー)を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト調節要素は、げっ歯類調節要素(例えば、ラット又はマウスプロモーター又はエンハンサー)である。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、IgMエンハンサー(Eμ)を含む。いくつかの実施形態では、IgMエンハンサーは、非ヒトEμ(例えば、マウス又はラットEμなどげっ歯類Eμ)である。
特定の実施形態では、CAR可変領域遺伝子座は、再構成されていないヒトIg κ可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、複数個のヒトVκセグメントと、1個又は2個以上のヒトJκセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、4個の機能的Vκセグメントと、全てのヒトJκセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、16個の機能的Vκセグメントと、全てのヒトJκセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、全てのヒトVκセグメントと、全てのヒトJκセグメントと、を含む。Ig κ遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Macdonald et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.111:5147〜52及び補足情報で提供される。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、全てのヒトJκセグメントを含む。いくつかの実施形態では、CAR可変領域は、TCRα可変領域遺伝子セグメント(例えば、V及び/又はJ遺伝子セグメント)を更に含む。
特定の実施形態では、CAR可変領域遺伝子座は、再構成されていないヒトIg λ可変領域遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、複数個のヒトVλセグメントと、1個又は2個以上のヒトJλセグメントと、を含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、全てのヒトVλセグメントを含む。いくつかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントは、全てのヒトJλセグメントを含む。いくつかの実施形態では、CAR可変領域は、TCRα可変領域遺伝子セグメント(例えば、V及び/又はJ遺伝子セグメント)を更に含む。Ig λ遺伝子セグメントを含む例示的な可変領域は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2012/0073004号及び同第2002/0088016号で提供される。
いくつかの実施形態では、再構成されていないヒトIg軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含むCAR可変遺伝子座はまた、ヒトIg軽鎖可変領域遺伝子間配列(例えば、κ可変領域遺伝子間配列及び/又はλ可変領域遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、CAR可変遺伝子座は、非ヒト(例えば、げっ歯類、ラット、マウス)Ig軽鎖可変領域遺伝子間配列(例えば、κ可変領域遺伝子間配列及び/又はλ可変領域遺伝子間配列)を含む。いくつかの実施形態では、CAR可変遺伝子座は、ヒト又は非ヒト(例えば、げっ歯類、ラット、マウス)TCRα可変領域遺伝子間配列を含む。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、非ヒト調節要素(例えば、非ヒトプロモーター及び/又はエンハンサー)を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト調節要素は、げっ歯類調節要素(例えば、ラット又はマウスプロモーター又はエンハンサー)である。
いくつかの実施形態では、CAR可変領域遺伝子座は、Ig重鎖可変領域遺伝子(ユニバーサル重鎖可変領域)を含む再構成された可変領域遺伝子座である。いくつかの実施形態では、再構成されたIg重鎖可変領域遺伝子は、再構成されたヒトIg重鎖可変領域遺伝子である。ユニバーサル重鎖可変領域を使用することにより、少なくとも1個の抗原結合ドメインがペプチド/MHC複合体に対する特異性を有する二重特異性抗体の生成が促進される。例示的な再構成されたIg重鎖可変領域は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0245468号で提供される。
いくつかの実施形態では、CAR可変領域遺伝子座は、Ig軽鎖可変領域遺伝子(ユニバーサル軽鎖可変領域)を含む再構成された可変領域遺伝子座である。いくつかの実施形態では、再構成されたIg軽鎖可変領域遺伝子は、再構成されたヒトIg軽鎖可変領域遺伝子である。ユニバーサル軽鎖可変領域を使用することにより、少なくとも1個の抗原結合ドメインがペプチド/MHC複合体に対する特異性を有する二重特異性抗体の生成が促進される。例示的な再構成されたIg重鎖可変領域は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2013/0185821号で提供される。
特定の実施形態では、CAR定常領域遺伝子座は、TCRα又はTCRβ定常領域遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、CAR定常領域遺伝子座は、免疫グロブリン調節配列(例えば、ヒト又は内在性種起源の調節配列)を更に含む。いくつかの実施形態では、CAR定常領域遺伝子座は、TCRβ C2の上流にマウス又はラットIgMエンハンサー(Eμ)を含む。いくつかの実施形態では、TCR定常領域遺伝子はまた、Ig定常領域配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、CAR定常領域遺伝子座は、Ig重鎖CH1ドメインをコードする核酸配列を含むTCRβ定常領域遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、CAR定常領域遺伝子座は、Ig λ又はIg κ定常領域又はその一部をコードする核酸配列を含むTCRα定常領域遺伝子を含む。
ヒト化MHC
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化MHCクラスIα鎖ポリペプチド(例えば、ヒト化HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−g、HLA−K、及び/又はHLA−L)をコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメイン(例えば、ヒトα1、α2、及びα3ドメイン)と、内在性種起源細胞質ドメインと、を含む。ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチド、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2013/0111617号、同第2013/0185819号、及び同第2014/0245467号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化MHCクラスIα鎖ポリペプチド(例えば、ヒト化HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−g、HLA−K、及び/又はHLA−L)をコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメイン(例えば、ヒトα1、α2、及びα3ドメイン)と、内在性種起源細胞質ドメインと、を含む。ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチド、ヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化MHCクラスI α鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2013/0111617号、同第2013/0185819号、及び同第2014/0245467号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。ヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチド、ヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化β−2−ミクログロブリンポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2013/0111617号及び同第2013/0185819号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチド(例えば、ヒト化HLA−DMA、HLA−DOA、HLA−DPA、HLA−DQA、及び/又はHLA−DRA)をコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチド、ヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化MHCクラスII α鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,847,005号及び同第9,043,996号、並びに米国特許出願公開第2014/0245467号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチド(例えば、ヒト化HLA−DMB、HLA−DOB、HLA−DPB、HLA−DQB、及び/又はHLA−DRB)をコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチド、ヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化MHCクラスII β鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,847,005号及び同第9,043,996号、並びに米国特許出願公開第2014/0245467号に記載されている。
CAR遺伝子座、並びにヒト化MHC I及び/又はMHC II(MHC II α/II β)遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物は、従来の方法を使用して繁殖させることによって生成され得る。あるいは、1個、又は2個以上の遺伝子操作されている遺伝子座(例えば、CAR遺伝子座)を既に含むES細胞内での相同的組み換え及び前記ES細胞からの非ヒト動物の生成によって、生成され得る。
ヒト化CD4及びCD8受容体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化CD8 α鎖ポリペプチド、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化CD8 α鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0245466号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化CD8 α鎖ポリペプチド、ヒト化CD8 α鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化CD8 α鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0245466号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドは、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。ヒト化CD8 β鎖ポリペプチド、ヒト化CD8 β鎖ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化CD8 β鎖ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0245466号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、ヒト化CD4ポリペプチドをコードする遺伝子座を発現する、及び/又はそのゲノム中に含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは、少なくとも1個のヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは、少なくともヒトD1免疫グロブリンドメイン、ヒトD2免疫グロブリンドメイン、及びヒトD3免疫グロブリンドメイン、並びに内在性種起源の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4ポリペプチドは、ヒトD1免疫グロブリンドメイン、ヒトD2免疫グロブリンドメイン、ヒトD3免疫グロブリンドメイン、内在性種起源のD4免疫グロブリンドメイン及び内在性種起源の細胞質ドメインを含む。ヒト化CD4ポリペプチド、ヒト化CD4ポリペプチドをコードする遺伝子座、及びヒト化CD4ポリペプチドを発現する非ヒト動物は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2014/0245466号に記載されている。
CAR遺伝子座、並びにヒト化CD4及び/又はCD8(CD8α/CD8β)遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物は、従来の方法を使用して繁殖させることによって生成され得る。あるいは、1個、又は2個以上の遺伝子操作されている遺伝子座(例えば、CAR遺伝子座)を既に含むES細胞内での相同的組み換え及び前記ES細胞からの非ヒト動物の生成によって、生成され得る。
遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞
特定の態様において、本明細書では、CAR及び/又はCARペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物、並びにかかる非ヒト動物の作製において有用な遺伝子改変非ヒト動物ES細胞を提供する。
特定の態様において、本明細書では、CAR及び/又はCARペプチドを発現する遺伝子改変非ヒト動物、並びにかかる非ヒト動物の作製において有用な遺伝子改変非ヒト動物ES細胞を提供する。
特定の態様において、本明細書では、生殖細胞系及び/又はゲノム中に本明細書に記載のCAR遺伝子座を含む、遺伝子改変非ヒト動物及び非ヒト動物ES細胞を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物又はES細胞は、その生殖細胞系及び/又はゲノム中に2個のCAR遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ある遺伝子座はTCRα定常領域遺伝子を含み、ある遺伝子座はTCRβ定常領域遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、CAR遺伝子座は、内在性TCR遺伝子座に位置する。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は任意の非ヒト動物であり得る。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は脊椎動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ(例えば、雌牛、雄牛、水牛)、シカ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類(例えば、マーモセット、赤毛猿)からなる群から選択されてよい。好適な遺伝子改変可能なES細胞を容易に入手できない非ヒト動物の場合、他の方法を用いて、本明細書に記載の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製できる。かかる方法としては、例えば、非ES細胞ゲノム(例えば、線維芽細胞又は誘導多能性細胞)を改変すること、及び核移植を用いて、卵母細胞など好適な細胞に改変ゲノムを移植し、好適な条件下で非ヒト動物内で改変細胞(例えば、改変卵母細胞)を成熟させて胚を形成することが挙げられる。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、例えば、トビネズミ科又はネズミ上科の小型哺乳動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はげっ歯類である。特定の実施形態では、げっ歯類は、マウス、ラット、又はハムスターである。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、ネズミ上科から選択される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、カンガルーハムスター科(例えば、マウス様ハムスター)、キヌゲネズミ科(例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ)、ネズミ科(例えば、真正マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ)、アシナガマウス科(例えば、キノボリマウス、イワマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス)、トゲヤマネ科(例えば、トゲヤマネ)、及びメクラネズミ科(例えば、デバネズミ(mole rates)、タケネズミ、及びモグラネズミ)から選択される科に属する。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、真正マウス又はラット(ネズミ科)、スナネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。いくつかの実施形態では、マウスはネズミ科に属する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、マウス及びラットから選択される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はマウスである。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物はC57BL系統のマウスである。いくつかの実施形態では、C57BL系統は、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、及びC57BL/Olaから選択される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は129系統のマウスである。いくつかの実施形態では、129系統は、129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例えば、129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2である系統からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変マウスは、129系統とC57BL系統との混合体である。いくつかの実施形態では、マウスは、129系統の混合体、及び/又はC57BL/6系統の混合体である。いくつかの実施形態では、129系統の混合体は、129S6(129/SvEvTac)系統である。いくつかの実施形態では、マウスはBALB系統(例えば、BALB/c)である。いくつかの実施形態では、マウスは、BALB系統と別の系統(例えば、C57BL系統及び/又は129系統)との混合体である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する非ヒト動物は、上記系統のいずれかの混合体に由来するマウスであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する非ヒト動物は、ラットである。いくつかの実施形態では、ラットは、ウィスターラツト、LEA系統、Sprague Dawley系統、Fischer系統、F344、F6、及びDark Agoutiから選択される。いくつかの実施形態では、ラット系統は、ウィスター、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6、及びDark Agoutiから選択される群から選択される、2つ又はそれ以上の系統の混合体である。
特定の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物又はES細胞は、そのゲノム中、及び/又は生殖細胞系CAR遺伝子座中に、ヒト化MHCクラスI α鎖遺伝子座、ヒト化β−2−ミクログロブリン遺伝子座、ヒト化MHCクラスII α鎖遺伝子座、ヒト化MHCクラスII β鎖遺伝子座、ヒト化CD8 α鎖遺伝子座、ヒト化CD8 β鎖遺伝子座、及び/又はヒト化CD4遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスI α鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスI α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化β−2−ミクログロブリン遺伝子座は、内在性β−2−ミクログロブリン遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII α鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスII α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化MHCクラスII β鎖遺伝子座は、内在性MHCクラスII β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 α鎖遺伝子座は、内在性CD8 α鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化CD8 β鎖遺伝子座は、内在性CD8 β鎖遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト化CD4遺伝子座は、内在性CD4遺伝子座に位置する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、内在性MHCクラスI α鎖ポリペプチド、内在性β−2−ミクログロブリンポリペプチド、内在性MHCクラスII α鎖ポリペプチド、内在性MHCクラスII β鎖ポリペプチド、内在性CD8 α鎖ポリペプチド、内在性CD8 β鎖ポリペプチド、及び/又は内在性CD4ポリペプチドを発現しない。かかる動物は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2013/0111617号、同第2013/0185819号、同第2014/0245466号、及び同第2014/0245467号、並びに米国特許第8,847,005号、及び同第9,043,996号に記載されている。
特定の態様では、遺伝子改変非ヒト動物は、本明細書に記載のCARポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、2個のCARポリペプチドを含むCARを発現する。特定の実施形態では、CARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、CARは、非ヒト動物内の非ヒト動物のT細胞(例えば、CD4T細胞又はCD8T細胞)で発現される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、αβ TCRを発現しない。いくつかの実施形態では、CAR発現T細胞は、T細胞の発現中にポジティブ選択を受ける。いくつかの実施形態では、CAR発現T細胞は、T細胞の発現中にネガティブ選択を受ける。
遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞は、当該技術分野において周知の任意の適切な方法を使用して生成できる。例えば、かかる遺伝子改変非ヒト動物ES細胞は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,586,251号、同第6,596,541号、同第7,105,348号、及びValenzuela et al.(2003)「High−throughput engineering of the mouse genome coupled with high−resolution expression analysis」Nat.Biotech.21(6):652〜659に記載されている、VELOCIGENE(登録商標)を使用して生成できる。改変はまた、CRISPR/Cas系、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)系、又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)系などゲノム標的ヌクレアーゼ系を使用して実行できる。いくつかの実施形態では、改変は、それぞれが参照により組み込まれる、米国特許出願第14/314,866号、同第14/515,503号、同第14/747,461号、及び同第14/731,914号に記載されているように、CRISPR/Cas系を使用して実行する。いくつかの実施形態では、可変領域遺伝子セグメントは、大型標的化ベクターが拡張するCAR遺伝子座に次々に連続して追加される一連の標的化イベントによって、CAR遺伝子座に連続的に追加される。いくつかの実施形態では、多数の大型標的化ベクター(例えば、2個又はそれ以上)は、単一の標的化イベント(例えば、2重標的化イベント)でCAR遺伝子座に同時に組み込まれる。本明細書では、かかる遺伝子改変非ヒト動物及びES細胞の例示的な作製方法を実施例2で提供する。
次いで、本明細書に記載のES細胞を使用して、当該技術分野において周知の方法によって非ヒト動物を生成できる。例えば、本明細書に記載のマウス非ヒト動物ES細胞を使用して、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,294,754号及びPoueymirou et al.,Nature Biotech25:91〜99(2007)に記載されているようにVELOCIMOUSE(登録商標)法によって遺伝子改変マウスを生成できる。得られたマウスは、ホモ接合性に繁殖させる(bread)ことができる。
遺伝子改変非ヒト動物の使用方法
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、CARを発現する動物が有用であり得る任意のプロセスで使用できる。例えば、かかる非ヒト動物は、CARの作製、CARを発現するT細胞の作製、CARを発現するT細胞ハイブリドーマの作製、再構成されたIg可変領域をコードする核酸の作製、及び抗体又は抗体フラグメントの作製に使用できる。
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、CARを発現する動物が有用であり得る任意のプロセスで使用できる。例えば、かかる非ヒト動物は、CARの作製、CARを発現するT細胞の作製、CARを発現するT細胞ハイブリドーマの作製、再構成されたIg可変領域をコードする核酸の作製、及び抗体又は抗体フラグメントの作製に使用できる。
本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、ペプチド/MHC複合体に対するT細胞免疫応答を誘発するために、トランスジェネリック非ヒト動物の免疫化を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチドが非ヒト動物内のMHC上に提示されるように、抗原に曝露される。
いくつかの実施形態では、ペプチドに対するT細胞応答が動物内で誘発されるように、ペプチドが非ヒト動物のMHC上に提示されるようにペプチドを含む抗原に本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を抗原に曝露する任意の方法を使用できる。
いくつかの実施形態では、ペプチドが提示されるMHCは、クラスI MHCである。いくつかの実施形態では、クラスI MHCは、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、又はHLA−Gである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、8〜10個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ペプチドが提示されるMHCは、クラスII MHCである。いくつかの実施形態では、クラスII MHCは、HLA−DM、HLA−DO、HLA−DP、HLA−DQ、又はHLA−DRである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、10〜25個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、13〜25個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、15〜18個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、癌関連抗原のエピトープを含む。癌関連抗原の例としては、adipophilin、AIM−2、ALDH1A1、Alpha−actin−4、α−フェトプロテイン(「AFP」)、ARTC1、B−RAF、BAGE−1、BCLX(L)、BCR−ABL融合タンパク質b3a2、β−カテニン、BING−4、CA−125、CALCA、癌胎児性抗原(「CEA」)、CASP−5、CASP−8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA−1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、サイクリンD1、サイクリン−A1、dek−can融合タンパク質、DKK1、EFTUD2、伸長因子2、ENAH(hMena)、Ep−CAM、EpCAM、EphA3,上皮性腫瘍抗原(「ETA」)、ETV6−AML1融合タンパク質、EZH2、FGF5、FLT3−ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE−1,2,8、GAGE−3,4,5,6,7、GAS7、グリピカン−3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、ヘプシン、HER−2/neu、HERV−K−MEL、HLA−A11lHLA−A2、HLA−DOB、hsp70−2、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、腸カルボキシルエステラーゼ、K−ras、カリクレイン4、KIF20A、KK−LC−1、KKLC1、KM−HN−1、KMHN1(別名CCDC110)、LAGE−1、LDLR−フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、Lengsin、M−CSF、MAGE−A1、MAGE−A10、MAGE−A12、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−C1、MAGE−C2、リンゴ酸酵素、mammaglobin−A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm−2、ME1、Melan−A/MART−1、Meloe、ミッドカイン、MMP−2、MMP−7、MUC1、MUC5AC、ムチン、MUM−1、MUM−2、MUM−3、ミオシン、ミオシンクラスI、N−raw、NA88−A、neo−PAP、NFYC、NY−BR−1、NY−ESO−1/LAGE−2、OA1、OGT、OS−9、Pポリペプチド、p53、PAP、PAX5、PBF、pml−RARalpha融合タンパク質、polymorphic epithelial mucin(「PEM」)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY−MEL−1、RAGE−1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、secernin1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX−2、SSX−4、STEAP1、サバイビン、SYT−SSX1又は−SSX2融合タンパク質、TAG−1、TAG−2、テロメラーゼ、TGF−betaRII、TPBG、TRAG−3、トリオースリン酸イソメラーゼ、TRP−1/gp75、TRP−2、TRP2−INT2、チロシナーゼ、チロシナーゼ(「TYR」)、VEGF、WT1、XAGE−1b/GAGED2aが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、感染性病原体によって発現した抗原のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫、又は原虫である。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、HPV、HBV、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1及びHIV−2)などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、HSV−1、及びHSV−2などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、寄生生物はマラリアである。いくつかの実施形態では、病原体は、アスペルギルス、Brugia、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌である。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、B群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌;又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど;又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、炎症性疾患、皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病(GVHD)、又は自己免疫疾患における自己反応性T細胞の標的である、タンパク質のエピトープを含む。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎(ulceous colitis)、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎(polymyosiis)、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症(achlorhydra autoimmune)、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Lambert−Eaton症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血(pernicious anema)、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群(polyglandular autosyndromes)、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症(又はクレスト症候群)、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythematosis)、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、B型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。自己反応性T細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、p205、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、TRP1、及びミエリンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチドをコードする核酸配列を含むウイルス(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、又はレンチウイルス)を非ヒト動物に投与することによって、ペプチドに曝露される。ウイルス予防接種方法は、例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,001,349号、同第8,663,622号、同第8,691,502号、同第8,377,688号、並びにPrecopio et al.,JEM 204:1405〜1416(2007)に提供されている。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、非ヒト動物が抗原を処理し、それをMHC上に提示するように、ウイルスが直接投与される。いくつかの実施形態では、細胞(例えば、樹枝状細胞など抗原提示細胞)は非ヒト動物に投与される、ウイルスにin vitro又はexvivoで感染する。いくつかの実施形態では、このウイルスは、ペプチド/MHC複合体(例えば、単鎖ペプチド/MHC複合体)をコードする。単鎖ペプチド/MHC系ワクチンの例は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Truscott et al.,J.Immunol.178:6280〜6289(2007)、EP1773383,Kim et al.,Vaccine 30:2178〜2186(2012)、Kim et al.,J.Immunol.184:4423〜4430(2010)に提供されている。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチドが非ヒト動物で発現するように、ペプチドをコードする核酸を動物に投与することによって、ペプチドに曝露される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、単鎖ペプチド/MHC複合体をコードする核酸を投与される。単鎖ペプチド/MHC系ワクチンの例は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Truscott et al.,J.Immunol.178:6280〜6289(2007)、EP1773383,Kim et al.,Vaccine 30:2178〜2186(2012)、Kim et al.,J.Immunol.184:4423〜4430(2010)に提供されている。特定の実施形態では、この核酸はDNAベクターである。核酸の送達は、ウイルス媒介遺伝子導入及びリポソーム媒介遺伝子導入など当該技術分野において周知の任意の技術によるものであり得る。対象のポリヌクレチドは、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,770,291号、同第7,001,614号、同第6,749,863号、同第5,512,295号、及び同第7,112,338号に記載されているように、遺伝子送達ビヒクルを形成するリポソームと関連している。いくつかの実施形態では、この核酸はmRNAベクターである。mRNAベクターを生成し、投与する例示的な方法は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,278,036号、並びに米国特許出願公開第2013/151736号及び同第2012/135805号に記載されている。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ペプチド/MHC複合体を遺伝子改変非ヒト動物に投与することによって、ペプチドに曝露される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、単鎖ペプチド/MHC複合体(例えば、単鎖ecto−MHC/β−2−ミクログロブリン/ペプチドタンパク質複合体)を投与される。いくつかの実施形態では、ペプチド/MHC複合体は、多量体(例えば、二量体、三量体、四量体)として投与される。いくつかの実施形態では、ペプチド/MHC複合体は、細胞の表面に提示される。ペプチド/MHC複合体を生成し、投与する例示的な方法は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,045,796号、同第5,869,270号、及び同第7,141,656号、並びにTruscott et al.,J.Immunol.178:6280〜6289(2007),EP1773383、Kim et al.,Vaccine30:2178〜2186(2012)、Kim et al.,J.Immunol.184:4423〜4430(2010)、及びLivingstone Methods:A Companion to methods in Enzymology 9:422〜429(1996)に提供されている。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド/MHC複合体に対して特異的なCARを発現するT細胞を遺伝子改変非ヒト動物から得る工程を含む。特定の実施形態では、当該技術分野において周知の任意の方法を使用して、かかるT細胞を得ることができる。例えば、かかるT細胞は、動物の脾臓、リンパ節、及び/又は末梢血から得ることができる。かかるT細胞は、当該技術分野において使用可能な方法を使用して、結合特異性をスクリーニングできる。例えば、カラム又はビーズ(例えば電磁ビーズ)など固体支持体上に積載されたペプチドMHC複合体を使用して、特定のペプチド/MHC複合体に対して特異的なCARを発現する細胞を精製できるか、標識ペプチド/MHCを使用して、かかるT細胞を染色でき、次いで、蛍光活性化細胞分類(FACS)及び/又は磁性活性化細胞分類(MACS)を使用してこれを精製できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、T細胞からT細胞ハイブリドーマを作製する工程を含む。T細胞ハイブリドーマの作製に有用な方法は当該技術分野において周知であり、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Hedrick et al.,Cell 30:141〜152(1982)、及びKruisbeek Curr.Protoc.Immunol.Chapter 3(2001)及びWhite et al.,Methods in Molecular Biology 134:185〜193(2000)に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、CARのIg可変ドメインをコードする核酸をT細胞から単離する工程を含む。本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、任意の方法を使用して、Ig可変ドメインをコードする核酸を単離できる。
いくつかの実施形態では、核酸を単離する工程は、T細胞からT細胞ハイブリドーマを作製し、T細胞ハイブリドーマから核酸を単離することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、核酸増幅法を使用して単離される。例えば、いくつかの実施形態では、核酸増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、転写介在増幅(TMA)、自家持続配列複製法(3SR)、Qβレプリカーゼ系増幅、核酸配列系増幅(NASBA)、修復連鎖反応(RCR)、ブーメランDNA増幅(BDA)、又はローリングサークル増幅(RCA)である。
いくつかの実施形態では、核酸は、T細胞又はT細胞ハイブリドーマのCAR遺伝子座内で再構成されたIg可変領域遺伝子をシークエンシングし、再構成されたIg可変領域遺伝子を含む核酸配列を合成することにより単離される。例示的な核酸シークエンシング法としては、連鎖停止シークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、合成によるシークエンシング、ピロシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、単分子リアルタイムシークエンシング、454シークエンシング、及び/又はDilute−‘N’−Goシークエンシングが挙げられるが、これらに限定されない。
重鎖及び軽鎖Ig可変領域セグメントをコードするDNAフラグメントを得ると、これらのDNAフラグメントは標準的な、DNA組み換え技術を使用して更に操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Fabフラグメント遺伝子、又はscFv遺伝子に変換できる。これらの操作では、可変ドメインをコードするDNAフラグメントは、抗体定常ドメイン又は可動性リンカーなど別のタンパク質をコードする別のDNAフラグメントに操作可能に結合される。この文脈で使用するとき、用語「操作可能に結合される」は、2個のDNAフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内にとどまるように、2個のDNAフラグメントが結合されることを意味することを意図する。
重鎖可変ドメインをコードする、単離されたDNAは、可変ドメインをコードするDNAを重鎖定常ドメイン(CH1、CH2、及びCH3)をコードする別のDNA分子に操作可能に結合することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において周知であり(例えば、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91〜3242を参照)、これらの領域を包含するDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常ドメインは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、又はIgD定常ドメインであり得るが、最も好ましくは、IgG1又はIgG4定常ドメインである。Fabフラグメント重鎖遺伝子の場合、VHをコードするDNAは、重鎖CH1定常ドメインのみをコードする別のDNA分子に操作可能に連結され得る。
軽鎖Ig可変ドメインをコードする、単離されたDNAは、可変ドメインをコードするDNAをκ又はλ定常ドメインなど軽鎖定常ドメインをコードする別のDNA分子に操作可能に結合することによって、完全長軽鎖遺伝子(並びにFab軽鎖遺伝子)に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において周知であり(例えば、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91〜3242を参照)、これらの領域を包含するDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、宿主細胞がIg重鎖可変ドメイン及びIg重鎖定常ドメインを含むIg重鎖ポリペプチドを発現するように、重鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、重鎖Ig定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞がIg軽鎖可変ドメイン及びIg重鎖定常ドメインを含むIg軽鎖ポリペプチドを発現するように、軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、軽鎖Ig定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、宿主細胞が、重鎖Ig可変ドメイン及び重鎖Ig定常ドメインを含む重鎖と、軽鎖Ig可変ドメイン及び軽鎖Ig定常ドメインを含む軽鎖と、を有する抗体を発現するように、重鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を重鎖Ig定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合し、軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を軽鎖Ig定常ドメインをコードする核酸配列と宿主細胞内で操作可能に結合する工程を含む。Ig可変領域は、当該技術分野において周知の標準的な分子生物学的技術を使用して、Ig定常領域と結合させることができる。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンポリペプチドを発現できる任意の宿主細胞を使用できる。いくつかの実施形態では、この細胞は、CHO細胞、HEK−293細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、又はVero細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、細胞がIg重鎖可変ドメイン及びTCR定常ドメインを含むCARポリペプチドを発現するように、重鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、TCR定常ドメイン(例えば、TCRβ定常ドメイン又はTCRα定常ドメイン)をコードする核酸配列と細胞(例えば、ヒトT細胞などヒト細胞)内で操作可能に結合する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞がIg軽鎖可変ドメイン及びTCR定常ドメインを含むCARポリペプチドを発現するように、軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列を、TCR定常ドメイン(例えば、TCRβ定常ドメイン又はTCRα定常ドメイン)をコードする核酸配列と細胞(例えば、ヒトT細胞などヒト細胞)内で操作可能に結合することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞が重鎖Ig可変ドメイン及び第1のTCR定常ドメインを含む第1のCAR鎖ポリペプチドと、軽鎖Ig可変ドメイン及び第2のTCR定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を有するCARを発現するように、重鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列及び第1のTCR定常ドメイン(例えば、TCRβ定常ドメイン又はTCRα定常ドメイン)を、細胞(例えば、ヒトT細胞などヒト細胞)内で操作可能に結合し、軽鎖Ig可変ドメインをコードする核酸配列及び第2のTCR定常ドメイン(例えば、TCRβ定常ドメイン(第1のTCR定常ドメインがTCRα定常ドメインである場合)又はTCRα定常ドメイン(第1のTCR定常ドメインがTCRβ定常ドメインである場合))をコードする核酸配列を、細胞内で操作可能に結合することを含む。いくつかの実施形態では、TCR定常ドメインはヒトTCR定常ドメインである。Ig可変領域は、当該技術分野において周知の標準的な分子生物学的技術を使用して、TCR定常領域と結合させることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、被験者から単離されたex vivo細胞(例えば、ex vivoヒトT細胞などex vivoヒト細胞)である。
抗体
特定の態様において、本明細書では、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する結合特異性を有する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、この抗体は完全ヒトである。いくつかの実施形態では、CARは、本明細書に記載の方法(例えば、本明細書に記載するように、CAR遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して)に従って得ることができる、及び/又は得られる。
特定の態様において、本明細書では、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する結合特異性を有する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、この抗体は完全ヒトである。いくつかの実施形態では、CARは、本明細書に記載の方法(例えば、本明細書に記載するように、CAR遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して)に従って得ることができる、及び/又は得られる。
特定の実施形態では、本明細書で提供する抗体及び抗体フラグメントは、10−6M以下、10−7M以下、10−8M以下、又は10−9M以下の解離定数でペプチド/MHC複合体を特異的に結合できる。いくつかの実施形態では、ペプチド/MHC複合体に対する抗体の結合親和性(KDで示す)は、無関係のペプチドを提示する同一のMHCタンパク質用ペプチドの抗体の親和性よりも少なくとも10倍小さい、少なくとも100倍小さい、又は少なくとも1000倍小さい。抗体の結合親和性を評価する標準的アッセイは、当該技術分野において周知であり、例えば、ELISA、ウエスタンプロット、及びRIAである。抗体の結合キネティクス(例えば、結合親和性)はまた、Biacore分析など当該技術分野において周知の標準的な分析によって評価できる。
いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチド/MHCクラスI複合体に対して特異的である。いくつかの実施形態では、MHCクラスIは、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、又はHLA−Gである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、8〜10個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、抗体は、ペプチド/MHCクラスI複合体に対して特異的である。いくつかの実施形態では、MHCクラスIIは、HLA−DM、HLA−DO、HLA−DP、HLA−DQ、又はHLA−DRである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、10〜25個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、13〜25個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、15〜18個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、癌関連抗原のエピトープを含む。癌関連抗原の例としては、adipophilin、AIM−2、ALDH1A1、Alpha−actin−4、α−フェトプロテイン(「AFP」)、ARTC1、B−RAF、BAGE−1、BCLX(L)、BCR−ABL融合タンパク質b3a2、β−カテニン、BING−4、CA−125、CALCA、癌胎児性抗原(「CEA」)、CASP−5、CASP−8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA−1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、サイクリンD1、サイクリン−A1、dek−can融合タンパク質、DKK1、EFTUD2、伸長因子2、ENAH(hMena)、Ep−CAM、EpCAM、EphA3,上皮性腫瘍抗原(「ETA」)、ETV6−AML1融合タンパク質、EZH2、FGF5、FLT3−ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE−1,2,8、GAGE−3,4,5,6,7、GAS7、グリピカン−3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、ヘプシン、HER−2/neu、HERV−K−MEL、HLA−A11lHLA−A2、HLA−DOB、hsp70−2、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、腸カルボキシルエステラーゼ、K−ras、カリクレイン4、KIF20A、KK−LC−1、KKLC1、KM−HN−1、KMHN1(別名CCDC110)、LAGE−1、LDLR−フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、Lengsin、M−CSF、MAGE−A1、MAGE−A10、MAGE−A12、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−C1、MAGE−C2、リンゴ酸酵素、mammaglobin−A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm−2、ME1、Melan−A/MART−1、Meloe、ミッドカイン、MMP−2、MMP−7、MUC1、MUC5AC、ムチン、MUM−1、MUM−2、MUM−3、ミオシン、ミオシンクラスI、N−raw、NA88−A、neo−PAP、NFYC、NY−BR−1、NY−ESO−1/LAGE−2、OA1、OGT、OS−9、Pポリペプチド、p53、PAP、PAX5、PBF、pml−RARalpha融合タンパク質、polymorphic epithelial mucin(「PEM」)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY−MEL−1、RAGE−1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、secernin1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX−2、SSX−4、STEAP1、サバイビン、SYT−SSX1又は−SSX2融合タンパク質、TAG−1、TAG−2、テロメラーゼ、TGF−betaRII、TPBG、TRAG−3、トリオースリン酸イソメラーゼ、TRP−1/gp75、TRP−2、TRP2−INT2、チロシナーゼ、チロシナーゼ(「TYR」)、VEGF、WT1、XAGE−1b/GAGED2aが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、感染性病原体によって発現した抗原のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫、又は原虫である。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、HPV、HBV、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1及びHIV−2)などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、HSV−1、及びHSV−2などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、寄生生物はマラリアである。いくつかの実施形態では、病原体は、アスペルギルス、Brugia、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌である。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、B群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌;又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど;又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、炎症性疾患、皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病(GVHD)、又は自己免疫疾患における自己反応性T細胞の標的である、タンパク質のエピトープを含む。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Lambert−Eaton症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症(又はクレスト症候群)、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、B型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。自己反応性T細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、p205、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、TRP1、及びミエリンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、ヒト重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、この抗体は、ヒト重鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、又はIgD定常ドメインを含む。ヒト重鎖定常ドメインの配列は当該技術分野において周知である(例えば、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91〜3242を参照)。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、重鎖定常ドメイン又はその一部を欠いている。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、改変Fcドメイン(例えば、FcとFc受容体との間の相互作用を変化させる突然変異)を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、(EU番号付与体系を使用して)235、236、237、239、265、267、268、269、270、298、326、327、330、332、350、351、366、392、394、405及び/又は407位置にある、それらのFcドメインに対する改変を含む。いくつかの実施形態では、この改変は、(EU番号付与体系を使用して)L235A、G236E、G237F、S239E、S239D、D265E、D265S、S267E、S267D、S267G、H268E、H268D、E269L、D270N、D270E、S298A、K326A、K326D、A327H、A327V、A327L、A330I、A330S、I332E、T350V、L351Y、T366L、K392M、K392L、T394W、F405A、及び/又はY407Vからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この抗体は、それらのFcドメインに対する多数の改変を含む。いくつかの実施形態では、多数の改変は、D270N/K326D、S239E/S298A/K326A/A327H、L235A/S239E/D265E/A327H、G236E/G237F/S239E、G237F/S239E/D265E、G327F/S239E/H268D、G236E/D270N/A327V/I332E、G237F/S239E/A327H、G237F/A327L/A330I、S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/D265S/H268D/I332E、S239E/D265S/I332E、S239E/S267E/H268D、S239E/A327L/A330I、D265E/S267D/A330S、S267G/H268E/D270E、H268D/E269L/S298A/K326A/A327H、H268D//K326A/A327Hからなる群から選択される。更なるFc改変及びFc改変の組み合わせは、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,624,821号、同第5,648,2601号、同第6,528,6241号、同第6,737,0561号、同第7,122,6371号、同第7,183,3871号、同第7,297,7751号、同第7,317,0911号、同第7,332,5811号、同第7,632,497,1号、同第7,662,9251号、同第7,695,9361号、同第8,093,3591号、同第8,216,8051号、同第8,218,8051号、同第8,388,9551号、及び同第8,937,1581号、並びに米国特許出願公開第2005/0054832号、同第2006/0222653号、同第2006/0275282号、同第2006/0275283号、同第2007/0190063号、同第2008/0154025号、同第2009/0042291号、同第2013/0108623号、及び同第2013/0089541号に提供されている。
いくつかの実施形態では、この抗体は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の2個の抗原結合ドメインは、異なる重鎖可変ドメインを有するが、同一の軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、この重鎖のFcドメインは、重鎖ヘテロダイマーの形成を促進する改変、及び/又は重鎖ヘテロダイマーの形成を抑制する改変を含む。かかる改変は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,731,168号、同第5,807,706号、同第5,821,333号、同第7,642,228号、及び同第8,679,785号、並びに米国特許出願公開第2013/0195849号に提供されている。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する抗体は、ヒト軽鎖可変ドメインを有する。いくつかの実施形態では、この軽鎖可変ドメインはλ軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、この軽鎖可変ドメインはκ軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、この抗体はヒト軽鎖定常ドメインを有する。いくつかの実施形態では、この軽鎖定常ドメインはλ軽鎖定常ドメインである。いくつかの実施形態では、この軽鎖定常ドメインはκ軽鎖定常ドメインである。ヒト軽鎖定常ドメインの配列は当該技術分野において周知である(例えば、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91〜3242を参照)。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体はインタクトな抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗原結合を保持する抗体フラグメントである。いくつかの実施形態では、この抗体フラグメントは、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、ジスルフィド結合Fv、Fd、単鎖抗体、単離されたCDRH3、又はインタクトな抗体の可変ドメインの少なくとも一部を保持する別の抗体フラグメントである。
キメラ抗原受容体
特定の態様において、本明細書では、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。いくつかの実施形態では、CARは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、CARは、本明細書に記載の方法(例えば、本明細書に記載するように、CAR遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して)に従って得ることができる、及び/又は得られる。
特定の態様において、本明細書では、ペプチド/MHC複合体(例えば、ペプチド/クラスI MHC複合体又はペプチド/クラスII MHC複合体)に対する結合特異性を有するキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。いくつかの実施形態では、CARは完全ヒトである。いくつかの実施形態では、CARは、本明細書に記載の方法(例えば、本明細書に記載するように、CAR遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して)に従って得ることができる、及び/又は得られる。
いくつかの実施形態では、CARは、10−7M未満、10−8M未満、又は10−9M未満のKDに相当する親和性でペプチド/MHC複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ペプチド/MHC複合体に対するCARの結合親和性(KDで示す)は、MHCによって提示されない場合のペプチドのCARの親和性よりも少なくとも10倍小さい、少なくとも100倍小さい、又は少なくとも1000倍小さい。いくつかの実施形態では、ペプチド/MHC複合体に対するCARの結合親和性(KDで示す)は、無関係のペプチドを提示する同一のMHCタンパク質用ペプチドのCARの親和性よりも少なくとも10倍小さい、少なくとも100倍小さい、又は少なくとも1000倍小さい。CARの結合親和性を評価する標準的なアッセイは当該技術分野において周知であり、例えば、ELISA、ウエスタンプロット、及びRIAである。CARの結合キネティクス(例えば、結合親和性)はまた、Biacore分析など当該技術分野において周知の標準的な分析によって評価できる。
いくつかの実施形態では、CARは、ペプチド/MHCクラスI複合体に対して特異的である。いくつかの実施形態では、MHCクラスIは、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、又はHLA−Gである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、8〜10個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、CARは、ペプチド/MHCクラスI複合体に対して特異的である。いくつかの実施形態では、MHCクラスIIは、HLA−DM、HLA−DO、HLA−DP、HLA−DQ、又はHLA−DRである。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、10〜25個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、13〜25個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドの長さは、15〜18個のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、癌関連抗原のエピトープを含む。癌関連抗原の例としては、adipophilin、AIM−2、ALDH1A1、Alpha−actin−4、α−フェトプロテイン(「AFP」)、ARTC1、B−RAF、BAGE−1、BCLX(L)、BCR−ABL融合タンパク質b3a2、β−カテニン、BING−4、CA−125、CALCA、癌胎児性抗原(「CEA」)、CASP−5、CASP−8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA−1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、サイクリンD1、サイクリン−A1、dek−can融合タンパク質、DKK1、EFTUD2、伸長因子2、ENAH(hMena)、Ep−CAM、EpCAM、EphA3,上皮性腫瘍抗原(「ETA」)、ETV6−AML1融合タンパク質、EZH2、FGF5、FLT3−ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE−1,2,8、GAGE−3,4,5,6,7、GAS7、グリピカン−3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、ヘプシン、HER−2/neu、HERV−K−MEL、HLA−A11lHLA−A2、HLA−DOB、hsp70−2、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、腸カルボキシルエステラーゼ、K−ras、カリクレイン4、KIF20A、KK−LC−1、KKLC1、KM−HN−1、KMHN1(別名CCDC110)、LAGE−1、LDLR−フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、Lengsin、M−CSF、MAGE−A1、MAGE−A10、MAGE−A12、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−C1、MAGE−C2、リンゴ酸酵素、mammaglobin−A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm−2、ME1、Melan−A/MART−1、Meloe、ミッドカイン、MMP−2、MMP−7、MUC1、MUC5AC、ムチン、MUM−1、MUM−2、MUM−3、ミオシン、ミオシンクラスI、N−raw、NA88−A、neo−PAP、NFYC、NY−BR−1、NY−ESO−1/LAGE−2、OA1、OGT、OS−9、Pポリペプチド、p53、PAP、PAX5、PBF、pml−RARalpha融合タンパク質、polymorphic epithelial mucin(「PEM」)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY−MEL−1、RAGE−1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、secernin1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX−2、SSX−4、STEAP1、サバイビン、SYT−SSX1又は−SSX2融合タンパク質、TAG−1、TAG−2、テロメラーゼ、TGF−betaRII、TPBG、TRAG−3、トリオースリン酸イソメラーゼ、TRP−1/gp75、TRP−2、TRP2−INT2、チロシナーゼ、チロシナーゼ(「TYR」)、VEGF、WT1、XAGE−1b/GAGED2aが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、感染性病原体によって発現した抗原のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、病原体は、ウイルス、細菌、真菌、蠕虫、又は原虫である。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、HPV、HBV、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1及びHIV−2)などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、HSV−1、及びHSV−2などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、寄生生物はマラリアである。いくつかの実施形態では、病原体は、アスペルギルス、Brugia、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌である。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、B群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌;又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど;又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、炎症性疾患、皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病(GVHD)、又は自己免疫疾患における自己反応性T細胞の標的である、タンパク質のエピトープを含む。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Lambert−Eaton症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症(又はクレスト症候群)、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、B型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。自己反応性T細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、p205、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、TRP1、及びミエリンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、かかるCARは、Ig重鎖可変ドメイン及びTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、Ig軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態では、このIg重鎖可変ドメイン及び/又はIg軽鎖可変ドメインは、ヒトIg可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、非ヒト定常ドメイン(例えば、ラット又はマウス定常ドメイン)である。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。CARのIg可変ドメインは、本明細書に記載の方法を使用して、又は当該技術分野において周知の任意の方法を使用して生成できる。例えば、抗ペプチド/MHC抗体は、当該技術分野において周知の方法を使用して(例えば、ファージディスプレイ法又はイーストディスプレイ法を使用して)生成でき、次いで、抗体の可変ドメインをコードする核酸配列をTCR定常ドメイン遺伝子に結合することができる。ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する抗体の例及びかかる抗体の産生方法は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,992,176号、同第7,718,777号、及び同第8,815,528号、並びにStewart−Jones et al.,Proc.Nat‘l.Acad.Sci.USA 106:5784〜88(2009)及びHulsmeyer et al.,J.Biol.Chem.280:2972〜80(2005)に提供されている。
医薬組成物
特定の実施形態では、本明細書では、薬学的に許容可能な担体と共に配合された、本明細書に記載の少なくとも1種の作用物質(例えば、本明細書に記載の抗体及び/又は本明細書に記載のCAR)を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
特定の実施形態では、本明細書では、薬学的に許容可能な担体と共に配合された、本明細書に記載の少なくとも1種の作用物質(例えば、本明細書に記載の抗体及び/又は本明細書に記載のCAR)を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
本明細書で提供する医薬組成物は、(1)経口投与、例えば、液剤(水性若しくは非水性溶液、又は懸濁液)、錠剤、例えば、バッカル錠、舌下錠、及び全身吸収を標的とするもの、巨丸剤、散剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト剤;又は、(2)非経口投与、例えば滅菌溶液若しくは懸濁液、又は徐放性製剤としての、例えば、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、又は硬膜外注射剤に適するものなど、固体又は液体形態で投与するために特別に配合されてよい。
非経口投与に好適な、本明細書で提供する医薬組成物は、1種若しくは2種以上の薬学的に許容可能な無菌等張水溶液若しくは非水溶液、分散液、懸濁液、又はエマルション、あるいは、使用直前に滅菌注射用溶液又は分散液に再溶解され得る、滅菌粉末(糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図する受容者の血液と等張にする溶質、又は懸濁化若しくは増粘剤を含んでよい)と組み合わせた、本明細書に記載の1種又は2種以上の作用物質を含む。
本明細書で提供する医薬組成物で用いてよい、好適な水性又は非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びこれらの好適な混合物、オリーブ油など植物油、オレイン酸エチルなど注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、レシチンなどコーティング材の使用によって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、また界面活性剤の使用によって維持できる。
特定の実施形態では、組成物は、所望の投与量に適したw/vをもたらす濃度で本明細書に記載の抗体及び/又はCARを含む。抗体及び/又はCARは、組成物中に、少なくとも1mg/mL、少なくとも5mg/mL、少なくとも10mg/mL、少なくとも15mg/mL、少なくとも20mg/mL、少なくとも25mg/mL、少なくとも30mg/mL、少なくとも35mg/mL、少なくとも40mg/mL、少なくとも45mg/mL、少なくとも50mg/mL、少なくとも55mg/mL、少なくとも60mg/mL、少なくとも65mg/mL、少なくとも70mg/mL、少なくとも75mg/mL、少なくとも80mg/mL、少なくとも85mg/mL、少なくとも90mg/mL、少なくとも95mg/mL、少なくとも100mg/mL、少なくとも105mg/mL、少なくとも110mg/mL、少なくとも115mg/mL、少なくとも120mg/mL、少なくとも125mg/mL、少なくとも130mg/mL、少なくとも135mg/mL、少なくとも140mg/mL、少なくとも150mg/mL、少なくとも200mg/mL、少なくとも250mg/mL、又は少なくとも300mg/mLの濃度で存在してよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、処置する特定の症状に必要な1種又は2種以上の活性化合物(通常、互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を有するもの)を含む。かかる追加活性化合物は、意図する目的に効果的な量で、ともに好適に存在する。
いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体及び/又はCARを、凍結乾燥組成物又は所望の最終濃度の水溶液の形態の、緩衝剤、糖類、塩類、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール、希釈剤、結合剤、塩類、親油性溶媒、アミノ酸、キレート剤、防腐剤などが挙げられるがこれらに限定されない、任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤と混合することによって調製される(Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,12th edition,L.Brunton,et al.及びRemington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.Ed.(1999))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、投与時に、用いる濃度で受容者に対して無害であり、ヒスチジン、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン、酢酸塩、及び他の有機酸など緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンなど酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウムなど;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベンなどアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残渣未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどタンパク質;ポリビニルピロリドンなど親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギンヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどアミノ酸;単糖類、二糖類、及びトレハロース、グルコース、マンノース、又はデキストリンなど他の炭水化物;EDTAなどキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなど糖類;ナトリウムなど塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質タンパク質複合体);並びに/又はTWEEN、ポリソルベート80、PLURONICS(登録商標)、又はポリエチレングリコール(PEG)など非イオン性界面活性剤を含む。
いくつかの実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩、グリシン、又は酢酸塩である。糖賦形剤は、トレハロース、スクロース、マンニトール、マルトース、又はラフィノースであってよい。界面活性剤は、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート80、又はPluronic F68であってよい。塩は、NaCl、KCl、MgCl2、又はCaCl2であってよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、緩衝剤又はpH調整剤を含んで、改善したpH調整をもたらしてよい。かかる組成物は、約3.0〜約9.0、約4.0〜約8.0、約5.0〜約8.0、約5.0〜約7.0、約5.0〜約6.5、約5.5〜約8.0、約5.5〜約7.0、又は約5.5〜約6.5のpHを有してよい。更なる実施形態では、かかる組成物は、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9、約6.0、約6.1、約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、又は約9.0のpHを有する。特定の実施形態では、組成物は約6.0のpHを有する。当業者は、概して、組成物のpHは、組成物中で用いる特定の抗体又はCARの等電位点と等しいべきではないことを理解するであろう。通常、緩衝剤は、有機又は無機の酸又は塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸塩、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸など有機酸塩類;トリス、塩酸トロメタミン、又はリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、アミノ酸成分はまた、緩衝能において作用できる。緩衝剤として組成物中で用いられ得る、代表的なアミノ酸成分としては、グリシン及びヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、緩衝剤は、ヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩、グリシン、及び酢酸塩から選択される。特定の実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。別の特定の実施形態では、緩衝剤はクエン酸塩である。更に別の特定の実施形態では、緩衝剤はグリシンである。緩衝剤の純度は、少なくとも98%、又は少なくとも99%、又は少なくとも99.5%であるべきである。本明細書で使用するとき、用語「純度」は、ヒスチジン及びグリシンに関する文脈において、例えば、The Merck Index,13th ed.,O’Neil et al.ed.(Merck & Co.,2001)に記載され、当該業界において理解されているように、ヒスチジン又はグリシンの化学的純度を指す。
特定の実施形態では、組成物は、緩衝剤としてヒスチジンを含む。特定の実施形態では、ヒスチジンは、少なくとも約1mM、少なくとも約5mM、少なくとも約10mM、少なくとも約20mM、少なくとも約30mM、少なくとも約40mM、少なくとも約50mM、少なくとも約75mM、少なくとも約100mM、少なくとも約150mM、又は少なくとも約200mMのヒスチジンの濃度で組成物中に存在する。別の実施形態では、組成物は、約1mM〜約200mM、約1mM〜約150mM、約1mM〜約100mM、約1mM〜約75mM、約10mM〜約200mM、約10mM〜約150mM、約10mM〜約100mM、約10mM〜約75mM、約10mM〜約50mM、約10mM〜約40mM、約10mM〜約30mM、約20mM〜約75mM、約20mM〜約50mM、約20mM〜約40mM、又は約20mM〜約30mMのヒスチジンを含む。更なる実施形態では、組成物は、約1mM、約5mM、約10mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、約150mM、又は約200mMのヒスチジンを含む。特定の実施形態では、組成物は、約10mM、約25mMのヒスチジンを含んでよい、又はヒスチジンを含まなくてよい。
いくつかの実施形態では、組成物は炭水化物賦形剤を含む。炭水化物賦形剤は、例えば、増粘剤、安定剤、充填剤、可溶化剤などとして作用できる。炭水化物賦形剤は、概ね約1%〜約99%の重量%又は体積%で、例えば、約0.1%〜約20%、約0.1%〜約15%、約0.1%〜約5%、約1%〜約20%、約5%〜約15%、約8%〜約10%、約10%〜約15%、約15%〜約20%、0.1%〜20%、5%〜15%、8%〜10%、10%〜15%、15%〜20%、約0.1%〜約5%、約5%〜約10%、又は約15%〜約20%で存在する。更に他の特定の実施形態では、炭水化物賦形剤は、1%、又は1.5%、又は2%、又は2.5%、又は3%、又は4%、又は5%、又は10%、又は15%、又は20%で存在する。
いくつかの実施形態では、組成物は炭水化物賦形剤を含む。組成物で用いるのに好適な炭水化物賦形剤としては、果糖、マルトース、ガラクトース、ブドウ糖、D−マンノース、ソルボースなど単糖類;ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど二糖類;ラフィノース、メレジトースマルトデキストリン、デキストラン、澱粉など多糖類;及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール(グルシトール)などアルジトールが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書で提供する組成物で用いる炭水化物賦形剤は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マンニトール、及びラフィノースから選択される。特定の実施形態では、炭水化物賦形剤はトレハロースである。別の特定の実施形態では、炭水化物賦形剤はマンニトールである。更に別の特定の実施形態では、炭水化物賦形剤はスクロースである。更に別の特定の実施形態では、炭水化物賦形剤はラフィノースである。炭水化物賦形剤の純度は、少なくとも98%、又は少なくとも99%、又は少なくとも99.5%であるべきである。
いくつかの実施形態では、組成物はトレハロースを含む。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約4%、少なくとも約8%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、又は少なくとも約40%のトレハロースを含む。別の実施形態では、組成物は、約1%〜約40%、約1%〜約30%、約1%〜約20%、約2%〜約40%、約2%〜約30%、約2%〜約20%、約4%〜約40%、約4%〜約30%、又は約4%〜約20%のトレハロースを含む。更なる実施形態では、組成物は、約1%、約2%、約4%、約6%、約8%、約15%、約20%、約30%、又は約40%のトレハロースを含む。特定の実施形態では、組成物は、約4%、約6%、又は約15%のトレハロースを含む。
特定の実施形態では、組成物は賦形剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、糖類、塩類、界面活性剤、アミノ酸、ポリオール、キレート剤、乳化剤、及び防腐剤から選択される、少なくとも1種の賦形剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、塩類、例えば、NaCl、KCl、CaCl2、及びMgCl2から選択される塩を含む。特定の実施形態では、組成物はNaClを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、アミノ酸、例えば、リシン、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、又はアミノ酸塩を含む。組成物は、少なくとも約1mM、少なくとも約10mM、少なくとも約25mM、少なくとも約50mM、少なくとも約100mM、少なくとも約150mM、少なくとも約200mM、少なくとも約250mM、少なくとも約300mM、少なくとも約350mM、又は少なくとも約400mMのアミノ酸を含んでよい。別の実施形態では、組成物は、約1mM〜約100mM、約10mM〜約150mM、約25mM〜約250mM、約25mM〜約300mM、約25mM〜約350mM、約25mM〜約400mM、約50mM〜約250mM、約50mM〜約300mM、約50mM〜約350mM、約50mM〜約400mM、約100mM〜約250mM、約100mM〜約300mM、約100mM〜約400mM、約150mM〜約250mM、約150mM〜約300mM、又は約150mM〜約400mMのアミノ酸を含んでよい。更なる実施形態では、組成物は、約1mM、1.6mM、25mM、約50mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM、約300mM、約350mM、又は約400mMのアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は界面活性剤を含む。本明細書で使用するとき、用語「界面活性剤」は、両親媒性構造を有する、すなわち、相対する溶解傾向の基、典型的に油溶性炭化水素鎖及び水溶性イオン基からなる有機物質を指す。界面活性剤は、界面活性分子の電荷に応じて、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤に分類できる。界面活性剤は、様々な医薬組成物及び生体物質の調製のために、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、及び分散剤として使用されることが多い。ポリソルベート(例えば、ポリソルベート20又は80);ポロキサマー(例えば、ポロキサマー188);Triton;オクチルグルコシドナトリウム;ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−スルホベタイン;ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、又はステアリル−ザルコシン;リノレイル−、ミリスチル−、又はセチル−ベタイン;ラウラミドプロピル(lauroamidopropyl)−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ベタイン(例えば、ラウラミドプロピル);ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、又はイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン;ココイルメチルナトリウム−、又はメチルオレイルジナトリウム−タウレート;並びにMONAQUA(登録商標)シリーズ(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレン及びプロピレングリコールのコポリマー(例えば、PLURONICS(登録商標)PF68など)など薬学的に許容可能な界面活性剤を、任意選択的に組成物に添加して、凝集を抑制することができる。特定の実施形態では、組成物は、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、又はポリソルベート80を含む。ポンプ又はプラスチック容器を使用して組成物を投与する場合、界面活性剤は特に有用である。薬学的に許容可能な界面活性剤の存在は、タンパク質の凝集傾向を緩和する。組成物は、約0.001%〜約1%、又は約0.001%〜約0.1%、又は約0.01%〜約0.1%の範囲の濃度であるポリソルベートを含んでよい。他の特定の実施形態では、組成物は、0.001%、又は0.002%、又は0.003%、又は0.004%、又は0.005%、又は0.006%、又は0.007%、又は0.008%、又は0.009%、又は0.01%、又は0.015%、又は0.02%の濃度であるポリソルペートを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、他の賦形剤及び/又は、希釈剤、結合剤、安定剤、親油性溶媒、防腐剤、補助剤などを含むが、これらに限定されない添加剤を含む。本明細書で提供する組成物では、薬学的に許容可能な賦形剤及び/又は添加剤が使用されてよい。薬学的に許容可能なキレート剤(例えば、EDTA、DTPA、又はEGTAが挙げられるが、これらに限定されない)など一般に使用される賦形剤/添加剤を任意選択的に組成物に添加して、凝集を低下させることができる。ポンプ又はプラスチック容器を使用して組成物を投与する場合、これらの添加剤は特に有用である。
いくつかの実施形態では、組成物は防腐剤を含む。フェノール、m−クレゾール、p−クレゾール、o−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀(phenylmercuric nitrite)、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム(例えば、6水和物であるが、これに限定されない)、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、及びチメロサール、又はこれらの混合物など防腐剤は、任意選択的に、約0.001%〜約5%、又はその範囲内の任意の範囲若しくは値など任意の好適な濃度で組成物に添加できる。組成物で使用する防腐剤の濃度は、微生物効果をもたらすために十分な濃度である。かかる濃度は、選択した防腐剤によって異なり、当業者によって容易に決定される。
いくつかの実施形態では、組成物はヒト血液と等張であり、組成物は、本質的にヒト血液と同一の浸透圧を有する。かかる等張性組成物は、概して、約250mOSm〜約350mOSmの浸透圧を有する。等張性は、例えば、蒸気圧型又は氷点降下型浸透圧計を使用して測定できる。組成物の張度は、張性調整剤を使用して調整する。「張性調整剤」は、組成物に添加して、組成物に等張性をもたらすことができる、薬学的に許容可能な不活性物質である。本明細書で提供する組成物に好適な張性調整剤としては、糖類、塩類、及びアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、組成物は、エンドトキシン及び/又は関連発熱物質を実質的に含まない、発熱物質を含まない組成物である。エンドトキシンは、微生物中に閉じ込められ、微生物が分解されたか、死んだときのみに放出される毒素を含む。発熱物質はまた、細菌及び他の微生物の外膜由来の発熱性、熱安定性物質を含む。これらの両物質は、ヒトに投与されると、熱、低血圧、及びショックを引き起こすことができる。潜在的な悪影響のため、エンドトキシンは、低量であっても、静脈内に投与される医薬品溶液から除去する必要がある。Food&Drug Administration(「FDA」)は、静脈内の医薬品適用について、1時間につき体重1キログラムあたり5エンドトキシン単位(EU)という上限を定めている(The United States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26(1):223(2000))。対象のタンパク質(例えば、抗体)の場合のように、治療タンパク質が体重1キログラムあたり数百又は数千ミリグラムの量で投与されるとき、微量であっても有害かつ危険なエンドトキシンは除去する必要がある。いくつかの実施形態では、組成物中のエンドトキシン及び発熱物質の濃度は、10EU/mg未満、又は5EU/mg未満、又は1EU/mg未満、又は0.1EU/mg未満、又は0.01EU/mg未満、又は0.001EU/mgである。
in vitro投与で使用するとき、本明細書に記載の組成物は無菌であるべきである。組成物は、無菌濾過、放射線など様々な滅菌法で滅菌されてよい。特定の実施形態では、組成物は、事前滅菌済みの0.22マイクロメートルフィルタを使用して、濾過滅菌されてよい。注入用滅菌組成物は、「Remington:The Science & Practice of Pharmacy」,21st ed.,Lippincott Williams & Wilkins,(2005)に記載されているように、従来の薬務に従って処方され得る。本明細書に開示されているものを含む対象のタンパク質(例えば、抗体又はCAR)は、通常、凍結乾燥形態で、又は溶液中で保管される。対象のタンパク質(例えば、抗体又はCAR)を含む無菌組成物は、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈注射用溶液バッグ、又は、皮下注射用針で突き刺し可能なストッパーなどの組成物の回収を可能にするアダプタを有するバイアルに入れられることが想到される。特定の実施形態では、組成物は、プレフィルドシリンジとして提供される。
特定の実施形態では、組成物は凍結乾燥製剤である。用語「凍結乾燥」又は「フリーズドライ」は、水分の少なくとも50%が除去されている、凍結乾燥など乾燥処置を受けている物質の状態を含む。
選択された投与の経路にかかわらず、好適な水和形態で使用されてよい本明細書で提供する薬剤、及び/又は本明細書で提供する医薬組成物は、当業者に周知の従来の方法によって、薬学的に許容可能な投薬形態に配合される。
治療法
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗体又はCAR(例えば、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する完全ヒト抗体、又はペプチド/MHCに対する結合特異性を有する完全ヒトCAR)を被験者に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体及び/又はCARは、本明細書に記載の方法を使用して(例えば、本明細書に記載するように、CAR遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して)得られる、又は得ることができる抗体及び/又はCARである。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗体又はCAR(例えば、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する完全ヒト抗体、又はペプチド/MHCに対する結合特異性を有する完全ヒトCAR)を被験者に投与することを含む、疾患又は障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗体及び/又はCARは、本明細書に記載の方法を使用して(例えば、本明細書に記載するように、CAR遺伝子座を含む非ヒト動物を使用して)得られる、又は得ることができる抗体及び/又はCARである。
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物(例えば、ペプチド/MHCに対する結合特異性を有する完全ヒト抗体など本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物)を被験者に投与することを含む、被験者の癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、癌性又は前癌性腫瘍の治療に使用できる。本明細書に記載の方法及び組成物によって治療され得る癌としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎、肝、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からの癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、癌は、具体的に以下の組織型、つまり、腫瘍、悪性;癌;癌、未分化;巨細胞癌及び紡錘細胞癌;小細胞癌;乳頭癌;扁平上皮癌;リンパ上皮癌;基底細胞癌;毛母癌;移行上皮癌;乳頭状移行上皮癌;腺癌;ガストリン産生腫瘍、悪性;胆管癌;肝細胞癌;混合型肝細胞癌及び胆管癌;索状腺癌;腺様癌;腺腫様ポリープ内の腺癌;腺癌、家族性大腸ポリポーシス;充実癌;類癌、悪性;細気管支肺胞上皮腺癌;乳頭状腺癌;嫌色素性癌;好酸性癌;好酸性腺癌;好塩基性癌;明細胞腺癌;顆粒細胞癌;濾胞状腺癌;乳頭状及び濾胞状腺癌;非被包性硬化癌;副腎皮質癌;類内膜癌;皮膚付属器癌;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳垢腺癌;粘膜表皮癌;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液嚢胞腺癌;嚢胞腺癌;膠様腺癌;印環細胞癌;浸潤性乳管癌;髄様癌;小葉癌;炎症性癌;パジェット病、乳房;腺房細胞癌;腺扁平上皮癌;腺癌(扁平上皮化生を伴う);胸腺腫、悪性;卵巣間質腫、悪性;卵胞膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;及び神経芽細胞腫、悪性;セルトリ細胞腫;間質細胞腫、悪性;脂質細胞腫、悪性;傍神経節腫、悪性;乳房外傍神経節腫、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;メラニン欠乏性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑内の悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児型横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽腫細胞腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胎生期癌;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星状細胞腫;星状芽細胞腫;膠芽細胞腫;乏突起神経膠腫(oligodendroglioma);乏突起神経膠腫(oligodendroblastoma);未分化神経外胚葉性腫瘍;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽腫;網膜芽腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経線維鞘、悪性;果粒細胞腫、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキンリンパ腫;側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;他の特異的非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;肥胖細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;プラズマ細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥胖細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;並びに有毛状細胞性白血病であり得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、被験者に投与される医薬組成物中の抗体及び/又はCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、癌関連抗原のエピトープ(例えば、治療する癌によって発現されるエピトープ)を含む。癌関連抗原の例としては、adipophilin、AIM−2、ALDH1A1、Alpha−actin−4、α−フェトプロテイン(「AFP」)、ARTC1、B−RAF、BAGE−1、BCLX(L)、BCR−ABL融合タンパク質b3a2、β−カテニン、BING−4、CA−125、CALCA、癌胎児性抗原(「CEA」)、CASP−5、CASP−8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA−1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、サイクリンD1、サイクリン−A1、dek−can融合タンパク質、DKK1、EFTUD2、伸長因子2、ENAH(hMena)、Ep−CAM、EpCAM、EphA3,上皮性腫瘍抗原(「ETA」)、ETV6−AML1融合タンパク質、EZH2、FGF5、FLT3−ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE−1,2,8、GAGE−3,4,5,6,7、GAS7、グリピカン−3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、ヘプシン、HER−2/neu、HERV−K−MEL、HLA−A11lHLA−A2、HLA−DOB、hsp70−2、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、腸カルボキシルエステラーゼ、K−ras、カリクレイン4、KIF20A、KK−LC−1、KKLC1、KM−HN−1、KMHN1(別名CCDC110)、LAGE−1、LDLR−フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、Lengsin、M−CSF、MAGE−A1、MAGE−A10、MAGE−A12、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−C1、MAGE−C2、リンゴ酸酵素、mammaglobin−A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm−2、ME1、Melan−A/MART−1、Meloe、ミッドカイン、MMP−2、MMP−7、MUC1、MUC5AC、ムチン、MUM−1、MUM−2、MUM−3、ミオシン、ミオシンクラスI、N−raw、NA88−A、neo−PAP、NFYC、NY−BR−1、NY−ESO−1/LAGE−2、OA1、OGT、OS−9、Pポリペプチド、p53、PAP、PAX5、PBF、pml−RARalpha融合タンパク質、polymorphic epithelial mucin(「PEM」)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY−MEL−1、RAGE−1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、secernin1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX−2、SSX−4、STEAP1、サバイビン、SYT−SSX1又は−SSX2融合タンパク質、TAG−1、TAG−2、テロメラーゼ、TGF−betaRII、TPBG、TRAG−3、トリオースリン酸イソメラーゼ、TRP−1/gp75、TRP−2、TRP2−INT2、チロシナーゼ、チロシナーゼ(「TYR」)、VEGF、WT1、XAGE−1b/GAGED2aが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物(例えば、ペプチド/MHCに対する結合特異性を有する完全ヒト抗体など本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物)を被験者に投与することを含む、ウイルス感染、細菌感染、蠕虫感染、又は原虫感染など感染症を患う被験者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、HPV、HBV、C型肝炎ウイルス(HCV)などウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1及びHIV−2)などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、HSV−1、及びHSV−2などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスの治療を含むいくつかの実施形態では、この方法は、マラリアなど寄生生物の治療を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、アスペルギルス、Brugia、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌など細菌性疾患、真菌性疾患、及び他の病原性疾患の治療法を含む。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、B群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌;又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど;又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
特定の実施形態では、被験者に投与される医薬組成物中の抗体及び/又はCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、感染性病原体によって発現される抗原のエピトープ(例えば、治療する感染性病原体によって発現されるエピトープ)を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の医薬組成物(例えば、ペプチド/MHCに対する結合特異性を有する完全ヒト抗体など本明細書に記載の抗体を含む医薬組成物)を被験者に投与することを含む、炎症性疾患、皮皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病(GVHD)、又は自己免疫疾患を治療する方法を提供する。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Lambert−Eaton症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症(又はクレスト症候群)、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、B型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
特定の実施形態では、被験者に投与される医薬組成物中の抗体及び/又はCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有し、ペプチドは、治療する疾患における自己反応性T細胞の標的であるタンパク質のエピトープ(例えば、自己免疫疾患における自己反応性T細胞によって標的化されるエピトープ)を含む。自己反応性T細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、p205、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、TRP1、及びミエリンが挙げられる。
本明細書に記載の医薬組成物は、経口的、経鼻的(例えば、スプレーによって)、経直腸的、膣内、非経口的、大槽内、及び局所的(例えば、粉末、軟膏、又は点滴薬によって、バッカル及び舌下を含む)などの任意の投与経路によって送達されてよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、全体的に(例えば、口腔投与、又は非経口投与によって)送達される。
本明細書に記載の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に害を及ぼすことなく、特定の患者、組成物、及び投与方法に対して望ましい治療反応を達成するのに有効である活性成分の量を得るように様々であってよい。
選択する投与レベルは、用いる特定の薬剤の活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄率又は代謝率、治療期間、用いる特定の化合物と併用する他の薬品、化合物、及び/又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、健康全般、病歴、並びに医療界で周知の要素など様々な要素に応じて異なるであろう。
当該技術分野において通常の技術を有する医師又は獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を直ちに判断し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物中で用いられる抗体及び/又はCARの投与量を処方及び/又は投与し、所望の効果を達成するまで投与量を徐々に増やすことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のCAR受容体は、T細胞ベースの治療に使用される。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載のCARを発現するT細胞は、被験者でT細胞ベースの免疫応答を誘発するために被験者に投与される。T細胞ベースの治療で有用な方法は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Schumacher Nat.Rev.Immunol.2:512〜519(2002)及びBitton et al.,Frontiers in Bioscience 4:d386〜393(1999)に記載されている。
いくつかの態様において、本明細書では、被験者内で免疫応答(例えば、T細胞ベースの免疫応答)を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトIg重鎖可変ドメイン及びヒトTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、ヒトIg軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びヒトTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARを発現する細胞(例えば、CD4T細胞又はCD8T細胞などヒトT細胞)を被験者に投与することを含み、このCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスI MHC複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスII MHC複合体である。
いくつかの実施形態では、被験者は、その必要のある被験者である。いくつかの実施形態では、被験者は、癌を患う被験者である。かかる実施形態では、CARによって認識されるペプチド/MHC複合体中のペプチドは、癌抗原のペプチドである。
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載のCARを発現するT細胞を被験者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、任意の癌性又は前癌性腫瘍を治療してよい。本明細書に記載の方法及び組成物によって治療され得る癌としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎、肝、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からの癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、癌は、具体的に以下の組織型、つまり、腫瘍、悪性;癌;癌、未分化;巨細胞癌及び紡錘細胞癌;小細胞癌;乳頭癌;扁平上皮癌;リンパ上皮癌;基底細胞癌;毛母癌;移行上皮癌;乳頭状移行上皮癌;腺癌;ガストリン産生腫瘍、悪性;胆管癌;肝細胞癌;混合型肝細胞癌及び胆管癌;索状腺癌;腺様癌;腺腫様ポリープ内の腺癌;腺癌、家族性大腸ポリポーシス;充実癌;類癌、悪性;細気管支肺胞上皮腺癌;乳頭状腺癌;嫌色素性癌;好酸性癌;好酸性腺癌;好塩基性癌;明細胞腺癌;顆粒細胞癌;濾胞状腺癌;乳頭状及び濾胞状腺癌;非被包性硬化癌;副腎皮質癌;類内膜癌;皮膚付属器癌;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳垢腺癌;粘膜表皮癌;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液嚢胞腺癌;嚢胞腺癌;膠様腺癌;印環細胞癌;浸潤性乳管癌;髄様癌;小葉癌;炎症性癌;パジェット病、乳房;腺房細胞癌;腺扁平上皮癌;腺癌(扁平上皮化生を伴う);胸腺腫、悪性;卵巣間質腫、悪性;卵胞膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;及び神経芽細胞腫、悪性;セルトリ細胞腫;間質細胞腫、悪性;脂質細胞腫、悪性;傍神経節腫、悪性;乳房外傍神経節腫、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;メラニン欠乏性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑内の悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児型横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽腫細胞腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胎生期癌;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星状細胞腫;星状芽細胞腫;膠芽細胞腫;乏突起神経膠腫(oligodendroglioma);乏突起神経膠腫(oligodendroblastoma);未分化神経外胚葉性腫瘍;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽腫;網膜芽腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経線維鞘、悪性;果粒細胞腫、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキンリンパ腫;側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;他の特異的非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;肥胖細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;プラズマ細胞白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥胖細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;並びに有毛状細胞性白血病であり得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、被験者に投与されたT細胞によって発現されるCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、癌関連抗原のエピトープ(例えば、治療する癌によって発現されるエピトープ)を含む。癌関連抗原の例としては、adipophilin、AIM−2、ALDH1A1、Alpha−actin−4、α−フェトプロテイン(「AFP」)、ARTC1、B−RAF、BAGE−1、BCLX(L)、BCR−ABL融合タンパク質b3a2、β−カテニン、BING−4、CA−125、CALCA、癌胎児性抗原(「CEA」)、CASP−5、CASP−8、CD274、CD45、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLPP、COA−1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、サイクリンD1、サイクリン−A1、dek−can融合タンパク質、DKK1、EFTUD2、伸長因子2、ENAH(hMena)、Ep−CAM、EpCAM、EphA3,上皮性腫瘍抗原(「ETA」)、ETV6−AML1融合タンパク質、EZH2、FGF5、FLT3−ITD、FN1、G250/MN/CAIX、GAGE−1,2,8、GAGE−3,4,5,6,7、GAS7、グリピカン−3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、HAUS3、ヘプシン、HER−2/neu、HERV−K−MEL、HLA−A11lHLA−A2、HLA−DOB、hsp70−2、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、腸カルボキシルエステラーゼ、K−ras、カリクレイン4、KIF20A、KK−LC−1、KKLC1、KM−HN−1、KMHN1(別名CCDC110)、LAGE−1、LDLR−フコシルトランスフェラーゼAS融合タンパク質、Lengsin、M−CSF、MAGE−A1、MAGE−A10、MAGE−A12、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−C1、MAGE−C2、リンゴ酸酵素、mammaglobin−A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm−2、ME1、Melan−A/MART−1、Meloe、ミッドカイン、MMP−2、MMP−7、MUC1、MUC5AC、ムチン、MUM−1、MUM−2、MUM−3、ミオシン、ミオシンクラスI、N−raw、NA88−A、neo−PAP、NFYC、NY−BR−1、NY−ESO−1/LAGE−2、OA1、OGT、OS−9、Pポリペプチド、p53、PAP、PAX5、PBF、pml−RARalpha融合タンパク質、polymorphic epithelial mucin(「PEM」)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY−MEL−1、RAGE−1、RBAF600、RGS5、RhoC、RNF43、RU2AS、SAGE、secernin1、SIRT2、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX−2、SSX−4、STEAP1、サバイビン、SYT−SSX1又は−SSX2融合タンパク質、TAG−1、TAG−2、テロメラーゼ、TGF−betaRII、TPBG、TRAG−3、トリオースリン酸イソメラーゼ、TRP−1/gp75、TRP−2、TRP2−INT2、チロシナーゼ、チロシナーゼ(「TYR」)、VEGF、WT1、XAGE−1b/GAGED2aが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原は新抗原である。
いくつかの実施形態では、被験者は、病原体に感染している被験者である。かかる実施形態では、CARによって認識されるペプチド/MHC複合体中のペプチドは、病原性抗原のペプチドである。
したがって、特定の実施形態において本明細書では、本明細書に記載のCARを発現するT細胞を被験者に投与することを含む、ウイルス感染、細菌感染、蠕虫感染、又は原虫感染など感染症を患う被験者を患う被験者を治療する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書では、HPV、HBV、C型肝炎ウイルス(HCV)などウイルス感染症、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1及びHIV−2)などレトロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、HSV−1、及びHSV−2などヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスの治療法を提供する。いくつかの実施形態では、治療される病原体は、マラリアなど寄生生物である。いくつかの実施形態において、本明細書では、アスペルギルス、Brugia、カンジダ、クラミジア、コクシジウム類、クリプトコッカス、犬糸状虫、りん菌、ヒストプラスマ、リーシュマニア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ゾウリムシ、百日咳、マラリア原虫、肺炎球菌、ニューモシスティス、リケッチア、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、ストレプ卜コッカス、トキソプラズマ、及びコレラ菌など細菌性疾患、真菌性疾患、及び他の病原性疾患の治療法を提供する。例示的な種としては、淋菌、結核菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、腟トリコモナス、ヘモフィルスワギナリス、B群レンサ球菌種、マイコプラズマホミニス、軟性下疳菌、鼠径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、梅毒トレポネーマ、ウシ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、イヌ流産菌、カンピロバクターフィタス、カンピロバクターフィタスインテスティナリス、レプトスピラポモナ、リステリア菌、ブルセラオビス、オウム病クラミジア、トリコモナスフィタス、トキソプラズマ原虫、大腸菌、アクチノバチルスエクーリ、ヒツジ流産菌、ウマ流産菌、緑膿菌、コリネバクテリウムエクイ、コリネバクテリウムピオゲネス、アクチノバチルスセミニス、マイコプラズマボビゲニタリウム、アスペルギルスフミガーツス、アブシヂアラモサ、トリパノソーマエクィペルズム、バベシア・カバリ、破傷風菌、ボツリヌス菌;又は、真菌、例えば、パラコクシジオイデスブラジリエンシスなど;又は他の病原体、例えば、熱帯熱マラリア原虫が挙げられる。
特定の実施形態では、被験者に投与されるT細胞によって発現されるCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、感染性病原体によって発現される抗原のエピトープ(例えば、治療する感染性病原体によって発現されるエピトープ)を含む。
特定の態様において、本明細書では、被験者(例えば、ヒト被験者)内のペプチド/MHC複合体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者からT細胞(例えば、CD4 T細胞又はCD8 T細胞)を単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有するCARのT細胞による発現を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者にT細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第1のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第1のベクター及び第2のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第2のベクターでT細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第1のCARポリペプチドをコードする核酸配列及び第2のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターでT細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、内在性TCRα及び/又はTCRβのT細胞による発現を抑制する工程を含む。
いくつかの実施形態では、被験者は、自己免疫疾患を患う被験者である。かかる実施形態では、T細胞は調節性T細胞(すなわち、抑制性T細胞)であり、CARによって認識されるペプチド/MHC複合体中のペプチドは、被験者が自己免疫応答を受ける自己抗原である。
いくつかの態様において、本明細書では、被験者内で免疫応答を抑制する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒトIg重鎖可変ドメイン及びヒトTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドと、ヒトIg軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びヒトTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARを発現する調節性T細胞(例えば、CD4+、CD−25+、及びFoxp3+調節性T細胞又はTreg17 T細胞)を被験者に投与することを含み、このCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスI MHC複合体である。いくつかの実施形態では、このペプチド/MHC複合体は、ペプチド/クラスII MHC複合体である。
特定の態様において、本明細書では、被験者(例えば、ヒト被験者)内のペプチド/MHC複合体に対する免疫応答を抑制する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、調節性T細胞(例えば、CD4+、CD−25+及びFoxp3+調節性T細胞又はTreg17T細胞)を被験者から単離することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有するCARのT細胞による発現を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、被験者にT細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第1のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第1のベクター及び第2のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含む第2のベクターでT細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第1のCARポリペプチドをコードする核酸配列及び第2のCARポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターでT細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、内在性TCRα及び/又はTCRβのT細胞による発現を抑制する工程を含む。
いくつかの実施形態では、被験者は、自己免疫疾患を患う被験者である。かかる実施形態では、T細胞は調節性T細胞(すなわち、抑制性T細胞)であり、CARによって認識されるペプチド/MHC複合体中のペプチドは、被験者が自己免疫応答を受ける自己抗原である。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、ぜんそく、炎症性疾患、皮膚又は臓器移植拒絶、移植片対宿主病(GVHD)、又は自己免疫疾患など有害免疫応答に関連する疾患又は障害を治療してよい。自己免疫疾患の例としては、例えば、糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性無酸症、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状ループス、エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、突発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存の糖尿病、Lambert−Eaton症候群、ルポイド肝炎、リンパ球減少症の一部、混合性結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症(又はクレスト症候群)、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺中毒症、B型インシュリン抵抗、潰瘍性結腸炎、及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
特定の実施形態では、被験者に投与されるT細胞によって発現されるCARは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有し、このペプチドは、治療する疾患における自己反応性T細胞の標的であるタンパク質のエピトープ(例えば、自己免疫疾患における自己反応性T細胞によって標的化されるエピトープ)を含む。自己反応性T細胞によって標的化される例示的なタンパク質としては、例えば、p205、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、チロシナーゼ、TRP1、及びミエリンが挙げられる。
核酸分子
本明細書では、本明細書に記載の抗体、CAR、並びに抗体及びCARの一部をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸は、本明細書に記載の抗体又はCARの可変ドメイン(例えば、重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン)をコードする。この核酸は、例えば、全細胞内に、細胞溶解物内に、又は部分的に純粋若しくは実質的に純粋な形態で存在してよい。
本明細書では、本明細書に記載の抗体、CAR、並びに抗体及びCARの一部をコードする核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、この核酸は、本明細書に記載の抗体又はCARの可変ドメイン(例えば、重鎖及び/又は軽鎖可変ドメイン)をコードする。この核酸は、例えば、全細胞内に、細胞溶解物内に、又は部分的に純粋若しくは実質的に純粋な形態で存在してよい。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗体及び/若しくはCARポリペプチド、又はこれらの一部をコードする核酸を提供する。この核酸は、例えば、全細胞内に、細胞溶解物内に、又は部分的に純粋若しくは実質的に純粋な形態で存在してよい。本明細書に記載の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して得ることができる。例えば、本明細書に記載の核酸分子は、標準的なPCR技術を使用してクローニングできる、又は化学的に合成できる。ハイブリドーマによって発現されたCAR又は抗体をコードする核酸の場合、ハイブリドーマによって作製された抗体又はCARの各鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅又はcDNAクローニング技術によって得ることができる。
特定の態様において、本明細書では、Ig重鎖可変ドメイン及びTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、Ig軽鎖可変ドメイン(例えば、Ig κ可変ドメイン又はIg λ可変ドメイン)及びTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドをコードする第2の核酸配列と、を含む核酸組成物を提供し、このCARは第1のCARポリペプチドを含み、第2のCARポリペプチドは、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、このIg重鎖可変ドメイン及び/又はIg軽鎖可変ドメインは、ヒトIg可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン(例えば、ラット定常ドメイン又はマウス定常ドメイン)である。いくつかの実施形態では、このTCRβ定常ドメイン及び/又はTCRα定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、単一の核酸分子上にある。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、別個の核酸分子上にある。
特定の態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗体の重鎖をコードする第1の核酸配列と、本明細書に記載の抗体の軽鎖(例えば、Ig κ軽鎖又はIg λ軽鎖)をコードする第2の核酸配列と、を含む核酸組成物を提供し、重鎖及び軽鎖を含む抗体は、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する。特定の実施形態では、このIg重鎖可変ドメイン及び/又はIg軽鎖可変ドメインは、ヒトIg可変ドメインである。いくつかの実施形態では、このIg重鎖定常ドメイン及び/又はIg重鎖定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン(例えば、ラット定常ドメイン又はマウス定常ドメイン)である。いくつかの実施形態では、このIg重鎖定常ドメイン及び/又はIg軽鎖定常ドメインは、ヒトIg定常ドメインである。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、単一の核酸分子上にある。いくつかの実施形態では、第1の核酸配列及び第2の核酸配列は、別個の核酸分子上にある。
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、結合されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターの1種は「プラスミド」であり、追加のDNAセグメントが連結され得る、環状2本鎖DNAループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントがウイルスゲノムに結合され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞(例えば、細菌起源の複製及びエピソーム哺乳類ベクターを有する細菌ベクター)で自己複製を実行できる。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、したがって、宿主ゲノムとともに複製されることができる。更に、特定のベクターは、遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と呼ぶ。
特定の実施形態において、本明細書では、本明細書に記載の核酸(例えば、本明細書に記載の抗体若しくはCAR、又はこれらの一部をコードする核酸)を含む細胞を提供する。この細胞は、例えば、原核、真核、哺乳類、鳥、ネズミ、及び/又はヒトであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、プロモーターなど転写調節要素に操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、この細胞は、本明細書に記載の核酸を転写し、したがって、抗体、その抗原結合フラグメント、又は本明細書に記載のポリペプチドを発現する。核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又は染色体外(extrachromasomal)であり得る。
本明細書で提供する核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を使用して得ることができる。例えば、本明細書に記載の核酸分子は、標準的なPCR技術を使用してクローニングできる、又は化学的に合成できる。
VH及びVLセグメントをコードするDNAフラグメントを得ると、標準的なDNA組み換え技術を使用してこれらのDNAフラグメントを更に操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Fabフラグメント遺伝子、又はscFv遺伝子に変換できる。これらの操作ではVL又はVHをコードするDNAフラグメントは、抗体定常領域又は可動性リンカーなど別のタンパク質をコードする別のDNAフラグメントに操作可能に結合される。この文脈で使用するとき、用語「操作可能に結合される」は、2個のDNAフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内にとどまるように、2個のDNAフラグメントが結合されることを意味することを意図する。
重鎖可変領域をコードする単離されたDNAは、重鎖定常領域(例えば、CH1、CH2、及びCH3)をコードする別のDNA分子に重鎖可変領域DNAを操作可能に結合することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において周知であり(例えば、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91〜3242を参照)、これらの領域を包含するDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、又はIgD定常領域であり得るが、最も好ましくは、IgG1又はIgG4定常領域である。Fabフラグメント重鎖遺伝子の場合、VHをコードするDNAは、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に操作可能に連結され得る。
軽鎖可変領域をコードする単離されたDNAは、DNAをコードする軽鎖可変領域を、軽鎖定常領域をコードする別のDNA分子に操作可能に結合することによって、完全長軽鎖遺伝子(並びにFab軽鎖遺伝子)に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において周知であり(例えば、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91〜3242を参照)、これらの領域を包含するDNAフラグメントは、標準的なPCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κ定常領域又はλ定常領域であり得るが、最も好ましくはκ定常領域である。
実施例1.キメラ抗原受容体を有するT細胞の活性化
ペプチド−MHC複合体(NY−ESO−1及びMAGE−1ペプチド、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Stewart−Joneset al.(2009)Rational development of high−affinity T−cell receptor−like antibodies,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 106:5784〜88及びHulsmeyer et al.(2005)A Major Histocompatibility Complex Peptide−restricted Antibody and T Cell Receptor Molecules Recognize Their Target by Distinct Binding Modes,J.Biol.Chem.280:2972〜80を参照)を認識する抗体のVH及びVLドメインをコードする配列を、合成的に産生した1.9kbヌクレオチド配列に組み込み、免疫グロブリンVκ及びVHドメイン配列を、それぞれTCRA C配列及びTCRB C配列の上流に配置した(図3)。Stewart−Jonesらは、HLA−A2と複合体化した、NY−ESO−1ペプチドを認識する抗体複合体(SLLMWITQVNY、配列番号1)について記載し、Hulsmeyerらは、HLA−A1と複合体化した、MAGE−1ペプチドを認識する抗体(EADPTGHSY、配列番号2)について記載している。
ペプチド−MHC複合体(NY−ESO−1及びMAGE−1ペプチド、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Stewart−Joneset al.(2009)Rational development of high−affinity T−cell receptor−like antibodies,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 106:5784〜88及びHulsmeyer et al.(2005)A Major Histocompatibility Complex Peptide−restricted Antibody and T Cell Receptor Molecules Recognize Their Target by Distinct Binding Modes,J.Biol.Chem.280:2972〜80を参照)を認識する抗体のVH及びVLドメインをコードする配列を、合成的に産生した1.9kbヌクレオチド配列に組み込み、免疫グロブリンVκ及びVHドメイン配列を、それぞれTCRA C配列及びTCRB C配列の上流に配置した(図3)。Stewart−Jonesらは、HLA−A2と複合体化した、NY−ESO−1ペプチドを認識する抗体複合体(SLLMWITQVNY、配列番号1)について記載し、Hulsmeyerらは、HLA−A1と複合体化した、MAGE−1ペプチドを認識する抗体(EADPTGHSY、配列番号2)について記載している。
抗NY−ESO−1/A2並びに抗MAGE−1/A1 VH及びVLを含む合成配列はまた、Vκ及びVHの両方の上流にRORリーダー部位(参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,534,604号)を含み、2シストロン発現のためにフューリン切断部位及び自己切断F2Aペプチドを有する(参照により本明細書に組み込まれる、Yang et al.(2008)Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high−level TCR gene expression and tumor cell recognition,Gene Ther.15:1411−1423)。合成DNAは、Blue Heronから得た。陰性対照として、生殖細胞系Vκ1−39Jκ5[ULC1−39]又はVκ3−20Jκ1[ULC3−20]及びVH3−23JH4[UHC]を、それぞれTCRA C及びTCRA Bの上流でレンチウイルスベクターに組み込んだ(いずれも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2011/0195454号(ULC1−39及びULC3−20)及び同第2014/0245468号(UHC)を参照)。
各合成1.9kbのDNA配列(すなわち、MAGE−1CAR、NY−ESO−1CAR、ULC1−39UHC、及びULC3−20UHC CARをコードする配列)は、pLVX EF1a IRES−PUROレンチウイルスベクター(Clontech)の多数のクローニング部位に連結させた。293T細胞の一過性トランスフェクションにより、構成体をδ 8.9及びPMDGとパッケージ化し、ウイルス上清を産生し、続いてこれを使用して、Jurkat T細胞由来であるが、TCRαβヘテロダイマーを産生する能力又は細胞膜でCD3を発現する能力に欠けるJ.RT3−T3.5(T3)細胞を形質導入した。Jurkat(CD4+CD8−T)細胞は、対照として使用した。形質導入後、FACSソーティングによって、T3細胞を細胞表面CD3を発現する能力をスクリーニングし、CARが形質導入された全てのT3細胞がCD3の発現を呈していたが、これは、CAR分子が細胞表面で発現したことを示していた。
NY−ESO−1のVL及びVH又はVL及びMAGE−1のVL及びVHのいずれかを含むCARで形質導入されたT3細胞のT細胞の活性化は、ヒトIL−2の分泌を検出するELISPOTアッセイによって判定した(参照により本明細書に組み込まれる、Czerkinsky et al.(1983)A solid−phase enzyme−linked immunospot(ELISPOT)assay for enumeration of specific antibody−secreting cells,J.Immunol.Methods 65:109〜121、及びMiyahira et al.(1995)Quantification of antigen specific CD8+ T cells using an ELISPOTassay.J.Immunol.Methods181:45〜54)。ヒトIL−2ELISPOTキットは、BD Biosciencesから得た(カタログ番号551282)。
具体的には、単独のT3細胞、又はMAGE−1CAR(A1MAGECAR)、NY−ESO−1CAR(A1NYESOCAR)、又はULC1−39UHCCARを発現するT3細胞のいずれかを、5×105細胞/ウェルの濃度でELISPOTプレートのウェルに加えた。単独の標的K562細胞(MHCを含まない細胞系)又はヒトHLA−A1(K562_A1)若しくはヒトHLA−A2(K562_A2)を発現する標的K562細胞を、1×105細胞/ウェル(5:1のエフェクター対標的細胞比)の濃度で加えた。適切なペプチド(MAGE−1、HLA−A1拘束性、又はNY−ESO−1、HLA−A2拘束性)を、10μg/mLの濃度でウェルに加え、プレートを37℃で16〜20時間インキュベートし、製造業者の指示に従って成長させた。
T細胞の活性化は、サイトカインの局在部位で形成される、暗藍色の沈殿物によって検出されたサイトカイン分泌性細胞の数に基づいて評価した。図4に示すように、活性化は、HLA−A1(K562_A1)を発現するエフェクター細胞の存在下で、MAGE−1 HLA−A1拘束性ペプチド(MAGE−A1)で処理したA1MAGECARを発現する細胞のみで生じ、HLA−A2(K562_A2)又は野生型K562細胞(K562WT)を発現するエフェクターでは生じなかった。更に、A1MAGECARを発現するT3細胞は、無関係のペプチドの存在下で、HLA−A1を発現するK562細胞によって活性化されなかった。同様に、IL−2分泌物によって明らかなように、HLA−A2(K562_A2)を発現するエフェクターの存在下で、NY−ESO−1 HLA−A2拘束性ペプチド(ESO−1)で処理したA2NYESOCARを発現するT3細胞のみが活性化した。ULC1−39UHC CAR(陰性対照)を発現するT3細胞は、いずれのペプチド−MHC複合体によっても活性化しなかった。
実施例2.キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変マウスの生成
実施例2.1.キメラヒトIgκ可変−マウスTCRA定常遺伝子座の構築
全てのヒトJκセグメント及び4個の機能的ヒトVκセグメントを含む、VELOCIMMUNE(登録商標)Igκ大型標的化ベクター(LTVEC)(「VI−1」、Macdonald et al.(2014)Precise and in situ genetic humanization of 6 mB of mouse immunoglobulin genes,Proc.Natl Acad.Sci USA111:5147〜52及び補足情報を参照)を細菌相同組み換え(BHR)によって改変して、5’マウスκアーム及びneo−tk−loxpカセットを、特異的なI−CeuI部位及びAsiSI部位を両側に配置したクロラムフェニコール(CM)耐性カセットで置換した(図5、工程1.)。工程2では、工程1で生成した構成体をBHRによって更に改変して、3’マウスκアーム及びSpecカセットを、特異的なNotI部位及びPI−SceI部位を領外に配置したloxp−neo−loxpカセットで置換した。続いて(工程3)、16kb遠位マウスTcraアーム及びFrt−Hyg−Frtカセットを含むI−CeuI−AsiSI核酸フラグメントを工程2の構成体に連結させて、CMカセットを置換した。最後に(工程4)、24kbの近位マウスTcraアーム及びSpecカセットを含むNotI−PI−SceI核酸フラグメントを、工程3の構成体のNotI部位及びPI−SceI部位に連結させてloxp−neo−loxpカセットを置換し、最終的なLTVEC(MAID 6548として示す)を作製した。
実施例2.1.キメラヒトIgκ可変−マウスTCRA定常遺伝子座の構築
全てのヒトJκセグメント及び4個の機能的ヒトVκセグメントを含む、VELOCIMMUNE(登録商標)Igκ大型標的化ベクター(LTVEC)(「VI−1」、Macdonald et al.(2014)Precise and in situ genetic humanization of 6 mB of mouse immunoglobulin genes,Proc.Natl Acad.Sci USA111:5147〜52及び補足情報を参照)を細菌相同組み換え(BHR)によって改変して、5’マウスκアーム及びneo−tk−loxpカセットを、特異的なI−CeuI部位及びAsiSI部位を両側に配置したクロラムフェニコール(CM)耐性カセットで置換した(図5、工程1.)。工程2では、工程1で生成した構成体をBHRによって更に改変して、3’マウスκアーム及びSpecカセットを、特異的なNotI部位及びPI−SceI部位を領外に配置したloxp−neo−loxpカセットで置換した。続いて(工程3)、16kb遠位マウスTcraアーム及びFrt−Hyg−Frtカセットを含むI−CeuI−AsiSI核酸フラグメントを工程2の構成体に連結させて、CMカセットを置換した。最後に(工程4)、24kbの近位マウスTcraアーム及びSpecカセットを含むNotI−PI−SceI核酸フラグメントを、工程3の構成体のNotI部位及びPI−SceI部位に連結させてloxp−neo−loxpカセットを置換し、最終的なLTVEC(MAID 6548として示す)を作製した。
最終的なLTVECは、5’から3’の方向に、(1)ES細胞内の相同組み換え用16kb 5’マウスTcraアーム(ゲノム位置14:52411629〜52427793、全ての座標はマウスアセンブリGRCm38に基づく)、(2)E.coli又はES細胞内の選択用Frt−Hyg−Frtカセット、(3)4個の最近位Vκセグメント及び全ての5個のJκセグメント(J1〜J5)を含む111kbヒトκ遺伝子座DNA、(4)ES細胞内の相同組み換え用24kb 3’マウスTCRAアーム(TCRA定常遺伝子(ゲノム位置14:54218920〜54243117)を含む)、及び(5)E.coli内の選択用Specカセットを含んだ。
LTVEC(MAID6548)は以下の接合配列を有する(マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Frt配列はイタリック体である(表1))。
MAID6548を使用して、MAID1540ヘテロES細胞にエレクトロポレーションし(参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第9,113,616号の図4Aを参照)、マウスTCRA V及びJセグメントの全てを削除し、Neoカセットで置換した(図6)。得られた遺伝子座の接合配列は、上記の表1と同一である。Hyg耐性ES細胞は、TAQMAN(登録商標)アッセイを使用してスクリーニングして、正しく標的化されたクローンを同定した(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Lie and Petropoulos,1998.Curr.Opin.Biotechnology 9:43〜48を参照)(表2;LOA=対立遺伝子の喪失;GOA=対立遺伝子の獲得、認識された領域は図6に示す)。
所望に応じて、初期挿入と重なるヒトIgκ配列に連結された、上記の同一の16kb 5’マウスTcra相同性アームを有するLTVECを使用して、更なるヒトVκセグメントをTCR可変領域遺伝子座に追加できる。
異なる戦略を使用して、かかるES細胞を生成できる。図7に要約した1つのアプローチは、二重標的化、つまり2つの異なる大型標的化ベクターのES細胞への共エレクトロポレーションを含む。このアプローチでは、第1の大型標的化ベクター(MAID 1710と表記、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2012/0096512A1号に記載されるように構築されたベクターの制限消化物由来)は、ヒトVκ1−5及びVκ1−6遺伝子セグメントの配列を含む3’30kb相同性アームと、ヒトVκ3−7〜Vκ3−15遺伝子セグメントを含む120kb配列と、ヒトVκ1−16遺伝子セグメントを含む5’20kb領域(「重複領域」)と、を含む。第2の大型標的化ベクター(MAID 6600と表記、これもまた、米国特許出願公開第2012/0096512A1号に記載のように構築されたベクターに由来)は、3’ 20kb重複領域(第1のベクターと同様に、ヒトVκ1−16遺伝子セグメントを含む領域)と、ヒトVκ1−17〜Vκ2−30遺伝子セグメントを含む140kb配列と、FRT−Ub−Neo−FRT選択カセットと、15.5kb 3’マウスTCR A相同性アームと、を含む。図6で生成されたES細胞(MAID 6548、全てのヒトJκセグメント及び4個の機能的ヒトVκ遺伝子セグメントのヘテロ接合)を、ヌクレオチド配列TGCGATCGCTGCGGCCGAtcttagCCAGACGAGCGGGTTCGG(小文字は切断部位;配列番号:24)におけるハイグロマイシン遺伝子を標的化する、改変亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードする核酸と共に、上記の2個の大型標的化ベクターでエレクトロポレーションし、Hyg配列における二重鎖切断を促進した。2個の共エレクトロポレーションした大型標的化ベクターは、相動性組み換えによってDNA配列に挿入され、Hyg選択カセットを含み、これを囲む領域を置換した。得られたES細胞は、内在性TCRα遺伝子座において、ヒトJκ1〜Jκ5及びVκ4−1〜Vκ2−30遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン可変領域を含んだ。2個の大型標的化ベクターの組み込みの成功は、上記のTAQMAN(登録商標)アッセイ(Lie and Petropoulos、上記)を使用して、図7及び以下の表3に示すプローブ及びプライマーを使用して確認した(GOA=対立遺伝子の獲得;LOA=対立遺伝子の喪失;コピー番号=配列のコピー番号を確認して、トランスジェニック取り込み対標的化取り込みを追跡;hArm1=第1の大型標的化ベクター(MAID 1710)の30kb 3’相同性アーム;hArm2=第1の大型標的化ベクター(MAID 1710)及び第2の大型標的化ベクター(MAID 6600)の20kb重複部、mArm=第2の標的化ベクター(MAID 6600)の15.5kb 5’相同性アーム、WTマウス対照−マウスTCRα遺伝子座に存在する配列)。
得られた、ES細胞内の標的遺伝子座は以下の接合配列を有する(マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Frt配列はイタリック体である(表4))。
免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントを更に含むTCRα遺伝子座を生成するための別の戦略は、可変遺伝子セグメントを更に含む大型標的化ベクターでの連続標的化を含む(例えば、図8を参照)。全てのヒトJκ遺伝子セグメント及び4個の機能的ヒトVκ遺伝子セグメントがヘテロ接合のES細胞(MAID 6548;図6を参照)を、5’から3’の方向に、15.5kb 5’マウス相同性アーム、Frt−Ub−Neo−Frt選択カセット、Vκ3−7〜Vκ3−15遺伝子セグメントを含む120kbフラグメント、並びにVκ1−5及びVκ1−6遺伝子セグメント(MAID 6548配列にも存在)を含む30kb 3’ヒト相同性アームを含む、大型標的化ベクターでエレクトロポレーションする。組み込みの成功は、上記のTaqmanアッセイを使用して、上記の表3に記載のプライマー及びプローブ、並びに図8に示すHyg、hIgK5、hIgK6、hIgK12、Neo、親1540m3、親1540m1を使用して確認する。組み込みの成功を確認するためにプライマー及びプローブの追加セット(hIgK10)も使用する:フォワードプライマー−CGATTATGACTGGTTAGGTAGAAAGGTG(配列番号:71);プローブ−GCCACTGGTTTCTCCAAATGTTTTCAATCCAT(配列番号:72);リバースプライマー−GGGAGTACTTGGAGATCCCTAAGC(配列番号:73)。
得られた、ES細胞内の標的遺伝子座は以下の接合配列を有する(マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Frt配列はイタリック体である(表5))。
図8に示す単標的化又は図7に示す二重標的化を完了すると、ES細胞は、追加Vκ遺伝子セグメントを含む大型標的化ベクターで連続して標的化されてよいが、これは、機能的ヒト免疫グロブリンVκ遺伝子セグメント、例えば、近位Vクラスター内の全ての機能的ヒトVκ遺伝子セグメントの完全レパートリーを組み込むためである。図8及び7に示す、二重標的化法又は連続的な単標的化法のいずれかの代わりに、三重標的化法を使用して、最大で機能的ヒト免疫グロブリンVκ遺伝子セグメント、例えば、近位Vクラスター中の全ての機能的ヒトVκ遺伝子セグメントの完全レパートリーを含むES細胞を生成できる。図9に示すこのアプローチでは、第1の大型標的化ベクター(MAID 1710、AscI及びNotI制限酵素で調整済み、上記を参照)は、ヒトVκ1−5及びVκ1−6遺伝子セグメント配列を含む3’ 30kb相同性アームと、ヒトVκ3−7〜Vκ3−15遺伝子セグメント配列を含む120kb配列と、ヒトVκ1−16遺伝子セグメントを含む5’ 20kb領域(「重複領域」)と、を含む。第2の大型標的化ベクター(MAID 6600、AscI及びNotI制限酵素で調整済み、上記を参照)は、3’ 20kb重複領域(第1のベクターと同様に、ヒトVκ1−16遺伝子セグメントを含む領域)と、ヒトVκ1−17〜Vκ2−24遺伝子セグメントを含む80kb配列と、ヒトVκ3−25〜Vκ2−30遺伝子セグメントを含む5’ 60kb領域(「重複領域」)と、を含む。最後に、第3の大型標的化ベクター(MAID 6647、これもまた、参照により組み込まれる、米国特許出願公開第2012/0096512A1号に記載のように構築されたベクターに由来)は、ヒトVκ3−25〜Vκ2−30を含む5’ 60kb重複領域と、Vκ3−31〜Vκ2−40を含む90kb配列と、FRT−Ub−Neo−FRT選択カセットと、15.5kb 3’マウスTCR A相同性アームと、を含む。図6で生成されたES細胞(MAID 6548、全てのヒトJκセグメント及び4個の機能的ヒトVκ遺伝子セグメントのヘテロ接合)を、ヌクレオチド配列TGCGATCGCTGCGGCCGAtcttagCCAGACGAGCGGGTTCGG(小文字は切断部位;配列番号:76)におけるハイグロマイシン遺伝子を標的化する、改変亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードする核酸と共に、上記の3個の大型標的化ベクターでエレクトロポレーションし、Hyg配列における二重鎖切断を促進した。3個の共エレクトロポレーションした大型標的化ベクターは、相動性組み換えによってDNA配列に挿入し、Hyg選択カセットを含み、これを囲む領域を置換した。得られたES細胞は、内在性TCRα遺伝子座において、ヒトJκ1〜Jκ5及びVκ4−1〜Vκ2−40遺伝子セグメント(すなわち、近位Vκクラスターの全ての機能的ヒトVκ遺伝子セグメント)を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインを含む。3個の大型標的化ベクターの組み込みの成功は、上記のTAQMAN(登録商標)アッセイ(Lie and Petropoulos、上記)を使用して、図9及び以下の表6に示すプローブ及びプライマーを使用して確認した(GOA=対立遺伝子の獲得;LOA=対立遺伝子の喪失;コピー番号=配列のコピー番号を確認して、トランスジェニック取り込み対標的化取り込みを追跡;hArm1=第1の大型標的化ベクター(MAID 1710)の30kb 3’相同性アーム;hArm2=第1の大型標的化ベクター(MAID 1710)及び第2の大型標的化ベクター(MAID 6600)の20kb重複部、mArm=第2の標的化ベクター(MAID 6600)の15.5kb 5’相同性アーム、hArm3=第2の標的化ベクター(MAID 6600)及び第3の標的化ベクター(MAID 6647)の60kb重複部、WTマウス対照−マウスTCRα遺伝子座に存在する配列)。
得られた、ES細胞内の標的遺伝子座は以下の接合配列を有する(マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Frt配列はイタリック体である(表7))。
更に他の別の戦略では、図6に示す、遺伝子座への連続的な追加ヒトIgVκ遺伝子セグメントの三重、二重、又は単標的化は、選択(例えば、ハイグロマイシン)カセットの、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ媒介又はCRISPR媒介破壊を含む、三重(3個の大型標的化ベクター)、二重(2個の大型標的化ベクター)、又は単(1個の大型標的化ベクター)標的化スキームを使用して達成されてよい。
上記の標的化ES細胞をドナーES細胞として使用し、VELOCIMOUSE(登録商標)法によって8細胞段階マウス胚に導入した(例えば、米国特許第7,294,754号及びPoueymirouet al.(2007)F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene−targeted ES cells allowing immediate phenotypic analysesNature Biotech.25(1):91〜99を参照)。キメラヒトIgκ V−マウスTcra C遺伝子を独立して有するVELOCIMICE(登録商標)(ドナーES細胞に完全に由来するF0マウス)は、特異的な遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの改変を使用した遺伝子型判定によって同定した。
実施例2.2.キメラヒトIgH可変−マウスTCRB定常遺伝子座の構築
キメラヒトIgH可変−マウスTCRB定常遺伝子座は、複数の異なる戦略のうちの1つによって構築する。
キメラヒトIgH可変−マウスTCRB定常遺伝子座は、複数の異なる戦略のうちの1つによって構築する。
戦略1を図11に示す。この戦略で使用する大型標的化ベクター(LTVEC A)を得るために、全てのヒト免疫グロブリン重鎖JH及びDHセグメント、並びに1個の近位VHセグメント(「VI−2」)を含むVELOCIMMUNE(登録商標)免疫グロブリン重鎖LTVECを、図10に示すように、複数のBHR及び制限消化/ライゲーション工程で改変して、全てのヒト免疫グロブリンJH及びDHセグメントを含む構成体(LTVEC B[MAID 6555])を生成した。LTVEC Bの5’マウスアームはトリプシノーゲン遺伝子(Try15〜Try20)を含み、一方、3’アームはマウスTCRB C2及びVβ31遺伝子を含んだ。LTVEC Bはまた、CAR遺伝子座における免疫グロブリン重鎖可変領域組み換えを増強するためのマウスIgMエンハンサー(Eμ)を含む。
次の工程では、BHR、制限消化/ライゲーション、及びCRISPR/Cas9媒介等温BACアセンブリ(参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第14/747,461号(2015年6月23日出願))の複数の工程によってLTVEC Bを更に改変して、5’から3’の方向に、(1)E.coli内の選択用Em7−Hygカセット;(2)トリプシノーゲン遺伝子(Try20、ゲノム位置6:41504907〜41525442)を含む、ES細胞内の相同組み換え用20kb 5’マウスアーム;(3)E.coli又はES細胞内の選択用Frt−Neo−loxP−Frtカセット;(4)3個の最近位のVHセグメント並びに全てのDH及びJHセグメントを含む145kbのヒトIgH遺伝子座;(5)IgMエンハンサー(Eμ)(ゲノム位置12:113427167〜113428462)(あるいは、この配列は除外される)を含む、1296bpのマウスIgH遺伝子座;並びに(6)Trbc2定常遺伝子(ゲノム位置6:41543957〜41584559)を含むES細胞内の相同組み換え用40kb 3’マウスアーム(図10を参照)を含む大型標的化ベクター(LTVEC A)を生成した。
LTVEC Aは以下の接合配列を有する(マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Frt配列はイタリック体である(表8))。
戦略1では、クローニング工程に従ってLTVEC Aを生成し、単一工程でキメラ遺伝子座をES細胞に導入した。図11に示すように、ヒトIgH V、D、及びJセグメントは、マウス3’トリプシノーゲン(TRY)遺伝子(マウスTRY遺伝子は正確な縮尺ではない;TCR B遺伝子座は多数のTRY遺伝子を含む)の下流、並びに、2個のトリプシノーゲン繰り返し体(MAID 1545、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第9,113,616号の図8Aを参照)の間の全てのマウスTCRB Vセグメントの削除を含むTCRB遺伝子座を有するES細胞内のマウスTCRB C2の上流に挿入する。したがって、マウスTCRB D1−J1−C1及びD2−J2は、ヒトV、D、及びJセグメントで置換し、マウスVセグメントの大部分を削除する。マウスIgMエンハンサー(Eμ)はまた、TCRB C2の5’に挿入されるが、例えば、エレクトロポレーションに使用される標的化ベクターにおいて、当該技術分野において周知の方法を使用して削除されてもよい。任意選択的に、マウスTCR Vβ31遺伝子も削除されてよい。
ヒトIgH VHセグメントを更に挿入するために、MAID 1545内のHyg遺伝子を不活性化する(これも図11を参照)。これは、(1)機能的Hygタンパク質をこれ以上生成できないように、CRISPR/Cas9又は亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFH)を使用して小さい挿入欠失変異をHygコーディング配列に導入すること(参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第14/731,914号(2015年6月5日出願));又は(2)相同組み換えによってLoxp−Neo−Loxpカセットで置換し、続いて、Creでこのカセットを削除すること、によって、標的化の前後いずれかに実行できる。
得られたCAR遺伝子座の接合配列は、上記の表8と同一である。Neo耐性ES細胞はTAQMAN(登録商標)アッセイによってスクリーニングし、標的化されたクローンを同定する。1545対立遺伝子は上流Hyg−Loxpカセットを含むため、LTVEC A内のLoxp部位によって、1545ヘテロES細胞内で標的化されたTCRB対立遺伝子を判定できる。したがって、2つのLoxp部位間の表域のCreを削除することを使用して、野生型Tcrb対立遺伝子に対立するものとして、1545対立遺伝子に対して標的化されたクローンを判定する。
戦略2では、Tcrb遺伝子座の基本構成(5’Try遺伝子クラスターと3’Try遺伝子クラスターとの間のVセグメント、並びに3’Try遺伝子クラスターとTcrb2定常との間のD及びJセグメント)を保存する。具体的には、14個のヒトTCRB Vセグメント並びに全てのヒトTCRB D及びJセグメントを含むES細胞(参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第9,113,616号の図7を参照)は5’から3’の方向に、(1)マウスTry遺伝子(マウスTry遺伝子は正確な縮尺ではない;TCRB遺伝子座は多数のTry遺伝子を含む)を含む5’相同性アーム、(2)HYG選択カセット、(3)全てのヒト免疫グロブリン重鎖D及びJセグメント、(4)マウスEμ遺伝子配列、並びに(5)マウスTCR B定常領域、マウスEβ遺伝子、及びマウスTCR Vβ31遺伝子セグメントを含む3’相同性アーム、を含む大型標的化ベクター(LTVEC B、図12を参照)を使用して、最初にヒトTCRB D及びJセグメントを免疫グロブリン重鎖D及びJセグメントを置換することにより改変した(図13の工程1)。
この改変及び選択カセットの削除に続いて、ES細胞は、5’から3’の方向に、(1)マウスTry遺伝子(Try7)を含む5’相同性アーム、(2)NEO選択カセット、(3)3個のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント、及び(4)マウスTry遺伝子(Try4)を含む3’相同性アームを含む、大型標的化ベクター(LTVEC D、図12を参照)によるエレクトロポレーションによって更に改変した(図13の工程3を参照)。
得られたES細胞は、ヒト免疫グロブリン重鎖V遺伝子セグメントVH1−3、VH1−2、及びVH6−1、全てのヒト免疫グロブリン重鎖D及びJ遺伝子セグメント、並びにマウス免疫グロブリンEμエンハンサー、マウスTCRB定常領域、マウスTCR Bエンハンサー、及び遠位3’マウスTCR Vβ31遺伝子セグメントを含む。この戦略の各工程において、特定のLTVECの導入の成功は、上記のTAQMAN(登録商標)アッセイを使用して確認した。
最終的なES細胞内のTCR B遺伝子座は以下の接合配列を有する(マウス配列は丸括弧で囲まれ、ヒト配列は通常フォントであり、マルチクローニング部位は太字であり、Frt配列はイタリック体である)。
上記の戦略2の代わりとして、LTVEC Bを導入するのではなく、マウスEμを含まないLTVEC C(図12を参照)を導入した。キメラTCR B CAR遺伝子座を生成する更なる戦略は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許仮出願第62/052,947号、同第62/076,836号、同第62/094,603号、同第62/167,650号に記載されている。最後に、図13に示すように、CRISPR/Cas9技術など様々な戦略を使用して、遠位3’TCR Vβ31を削除できる。
残っている任意の選択カセットは、Cre又はFlpo酵素を使用して削除してよい(例えば、図13を参照)。戦略1又は戦略2のいずれかについて所望に応じて、初期挿入と重なるヒトIgH配列に結合された、上記の5’マウスTcrb相同性アームを有するLTVECを使用して、更なるヒトVHセグメントをTCR可変領域遺伝子座に追加する。
上記の標的化されたES細胞をドナーES細胞として使用し、VELOCIMOUSE(登録商標)法によって8細胞段階マウス胚に導入した。キメラヒトIgH V−マウスTcrb C遺伝子を独立して有するVELOCIMICE(登録商標)(ドナーES細胞に完全に由来するF0マウス)は、特異的な遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの改変を使用した遺伝子型判定によって同定した。
実施例2.3.キメラ抗原受容体マウスの構築
キメラヒトIgκ V−マウスTcra C遺伝子及びキメラヒトIgH V−マウスTcrb C遺伝子を有するマウスを一緒に育てて、両方のキメラ遺伝子座を含むマウスを生成する。かかる遺伝子座の両方を含むマウスは、これらのT細胞表面で、T細胞受容体定常ドメイン及び免疫グロブリン可変ドメイン(マウスT細胞受容体定常ドメイン及びヒト免疫グロブリン可変ドメイン)を含むキメラ抗原受容体(CAR)を発現する。各キメラ遺伝子に関して同型接合体であるように子孫を育てる。
キメラヒトIgκ V−マウスTcra C遺伝子及びキメラヒトIgH V−マウスTcrb C遺伝子を有するマウスを一緒に育てて、両方のキメラ遺伝子座を含むマウスを生成する。かかる遺伝子座の両方を含むマウスは、これらのT細胞表面で、T細胞受容体定常ドメイン及び免疫グロブリン可変ドメイン(マウスT細胞受容体定常ドメイン及びヒト免疫グロブリン可変ドメイン)を含むキメラ抗原受容体(CAR)を発現する。各キメラ遺伝子に関して同型接合体であるように子孫を育てる。
あるいは、キメラヒトIgκ−マウスTcra C遺伝子又はキメラヒトIgH V−マウスTcrb C遺伝子のいずれかを含むES細胞を使用して、他のキメラ遺伝子(それぞれキメラヒトIgH V−マウスTcrb C遺伝子又はキメラヒトIgκ−マウスTcra C遺伝子)を含む標的化ベクターを導入し、上記のようにVELOCIMOUSE(登録商標)法によってこれらのES細胞から両方のキメラ遺伝子を有するマウスを生成した。
キメラヒトIgκ−マウスTcra C/キメラヒトIgH V−マウスTcrb C抗原受容体の発現は、細胞表面で検出する。ある検出方法では、(1)標準的な技術を使用してTCR定常領域発現(抗TCRα抗体F1(3A8)#TCR1145、Thermo−Pierce;抗TCRβ抗体F1(8A3)#TCR1151、Thermo−Pierce;抗TCRα−βヘテロダイマー抗体クローンT10B9.1A−31、BD−Pharmigen;抗TCRα−βヘテロダイマー抗体クローンIP26;eBioscience)を検出するFACS分析を、(2)同一の抗体を使用してキメラタンパク質のサイズを判定するウエスタンブロット法、及び(3)免疫グロブリン可変セグメント配列にアニールするフォワードプライマー混合物及びTCR定常領域配列にアニールするプライマーを使用して、キメラ転写物の発現を確認するRT−PCTと組み合わせる。加えて、抗CD3及び抗TCRα−β抗体の混合物を使用して、細胞表面でのTCR/CD3複合体の形成を確認できる。上記のように、次世代シークエンシングを使用してキメラ転写物の発現を確認できる。
実施例3.Igκ/TCRαキメラ抗原受容体遺伝子座を含むマウスのT細胞におけるヒトIgκ可変領域セグメントの使用
胸腺細胞及び脾細胞は、部分ヒトIgκ可変領域(図14及び15の4個の機能的Vκ及び5個の機能的Jκ(図6に示すように生成されたマウスを参照);図16及び17の16個の機能的Vκ及び5個の機能的Jκ(図7に示すように生成されたマウスを参照))でTCRα可変領域を置換した、CAR遺伝子座をゲノム中に含む3匹のマウスから採取した。T細胞は、抗CD90.2電磁ビーズ及びMACSMACS(登録商標)カラム(Miltenyi Biotech)を使用した電磁細胞ソートによって、全脾細胞からプラスに強化した。全RNAは、製造業者の指示に従ってRNeasy Plus RNA単離キット(Qiagen)を使用して、精製膵臓T細胞及び胸腺細胞から単離した。
胸腺細胞及び脾細胞は、部分ヒトIgκ可変領域(図14及び15の4個の機能的Vκ及び5個の機能的Jκ(図6に示すように生成されたマウスを参照);図16及び17の16個の機能的Vκ及び5個の機能的Jκ(図7に示すように生成されたマウスを参照))でTCRα可変領域を置換した、CAR遺伝子座をゲノム中に含む3匹のマウスから採取した。T細胞は、抗CD90.2電磁ビーズ及びMACSMACS(登録商標)カラム(Miltenyi Biotech)を使用した電磁細胞ソートによって、全脾細胞からプラスに強化した。全RNAは、製造業者の指示に従ってRNeasy Plus RNA単離キット(Qiagen)を使用して、精製膵臓T細胞及び胸腺細胞から単離した。
逆転写を実行して、SMARTer(商標)RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)及びTCRα特異的プライマー(5’−TCAAAGTCGGTGAACAGGCAGAG−3’;配列番号143)を使用して、TCRα定常領域配列を含むcDNAを生成した。このプロセス中、DNA配列(PIIA:5’−CCCATGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT−3’;配列番号144)を、新たに合成したcDNAの3’末端に結合させた。cDNAは、NUCLEOSPIN(登録商標)Gel and PCR Clean−Up Kit(Clontech)によって精製した。
次いで、精製cDNAは、PIIA特異的プライマー(5’−GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’;配列番号145)及びTCRα特異的プライマー(5’−ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACAGCAGGTTCTGGGTTCTGGATG−3’;配列番号146)を使用して、PCRによって増幅させた。PCR産物は、2%アガロースゲル上で分離し、長さ400〜700bpのフラグメントを単離し、ゲル注出キット(Qiagen)を使用して精製した。これらのフラグメントは、次のプライマー、つまり5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC−3’及び5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT−3’(それぞれ配列番号147及び配列番号148;「XXXXXX」は、シークエンシングの多重化サンプルを可能にする、6bp指標配列を示す)を使用したPCRによって更に増幅させた。シークエンシングのために、Miseqシーケンサー(Illumina)に積載する前に400bp〜600bpのPCR産物を単離し、精製し、KAPA Library Quantification Kit(KAPA Biosystems)を使用したqPCRによって計量した。
バイオインフォマティクス分析用に、サンプル指標の完全一致に基づいて得られたイルミナ配列をソートし、質を調整した。次いで、重複するメイトペアを集め、igblast(NCBI、v2.2.25+)のローカルインストールを使用して、再構成されたIgκ配列のヒト生殖細胞系V及びJセグメントデータベースへのアライメント及び再構成されたTCRα配列のマウス生殖細胞系V及びJセグメントデータベースへのアライメントに基づいて注釈を付けた。同一のスコアで複数のベストヒットが検出されると、配列は「曖昧」とマーク付けされ、分析から外される。結果を分析し、mysqlデータベースに保存するために、一連のperlスクリプトを開発した。
4個の機能的Vκ及び5個の機能的Jκを含むマウスでは、図14に示すように、配列分析によって、CAR遺伝子座中のIgκ可変ドメインは、CARトランスジェネリックマウスのT細胞及び胸腺細胞内でVJ組み換えを受け、測定値の〜80%は、脾臓及び胸腺の両方において、異なるJκ遺伝子セグメントで再構成された、最近位Vκ遺伝子セグメント(IGVK4−1)を含むことが明らかになった。図15に示すように、膵臓T細胞から増幅させた、再構成されたヒトIgκ VJ配列の大部分は、増殖性であった。
16個の機能的Vκ及び5個の機能的Jκを含むマウスでは、図16に示すように、配列分析によって、CAR遺伝子座中のIg κ可変ドメインは、CARトランスジェネリックマウスの膵臓T細胞及び胸腺細胞内でVJ組み換えを受けたことが明らかになった。これらの再構成は、全ての機能的ヒトVκ及びJκセグメントを含み、測定値の〜40%は、最近位Vκ遺伝子セグメント(IGVK4−1)を含んだ。図17に示すように、膵臓T細胞及び胸腺から増幅させた、再構成されたヒトIg κ VJ配列の〜2/3は、増殖性であった。
実施例4.IgH/TCRβキメラ抗原受容体遺伝子座を含むマウスのT細胞におけるヒトIgH可変領域セグメントの使用
部分ヒトIgH可変領域(3個の機能的ヒトVH及び全ての機能的ヒトD及びJH遺伝子セグメント、図13を参照)でTCRβ可変領域を置換した、CAR遺伝子座をゲノム中に含む4匹のマウスからの胸腺細胞、及び同一のCAR(IgH+TCRCβ)遺伝子座をゲノム中に含む3匹のマウスからの脾細胞を採取した。T細胞は、抗CD90.2電磁ビーズ及びMACSMACS(登録商標)カラム(Miltenyi Biotech)を使用した電磁細胞ソートによって、全脾細胞からプラスに強化した。全RNAは、製造業者の指示に従ってRNeasy Plus RNA単離キット(Qiagen)を使用して、精製膵臓T細胞及び胸腺細胞から単離した。
部分ヒトIgH可変領域(3個の機能的ヒトVH及び全ての機能的ヒトD及びJH遺伝子セグメント、図13を参照)でTCRβ可変領域を置換した、CAR遺伝子座をゲノム中に含む4匹のマウスからの胸腺細胞、及び同一のCAR(IgH+TCRCβ)遺伝子座をゲノム中に含む3匹のマウスからの脾細胞を採取した。T細胞は、抗CD90.2電磁ビーズ及びMACSMACS(登録商標)カラム(Miltenyi Biotech)を使用した電磁細胞ソートによって、全脾細胞からプラスに強化した。全RNAは、製造業者の指示に従ってRNeasy Plus RNA単離キット(Qiagen)を使用して、精製膵臓T細胞及び胸腺細胞から単離した。
逆転写を実行して、SMARTer(商標)RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)及びTCRβ特異的プライマー(5’−CGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGC−3’;配列番号149)を使用して、TCRβ定常領域配列を含むcDNAを生成した。このプロセス中、DNA配列(5’−CCCATGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTT−3’;配列番号150)を、新たに合成したcDNAの3’末端に結合させた。cDNAは、NUCLEOSPIN(登録商標)Gel and PCR Clean−Up Kit(Clontech)によって精製した。
次いで、精製cDNAは、プライマー5’−ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGACCTTGGGTGGAGTCACATTTCTC−3’及び5’−GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT−3’(配列番号:それぞれ151及び152)を使用して、PCRによって増幅させた。これらのフラグメントは、次のプライマー、つまり5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT−3’及び5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT−3’(「XXXXXX」は、6桁のヌクレオチドバーコード;(配列番号:それぞれ153及び154))を使用したPCRによって更に増幅させた。シークエンシングのために、Miseqシーケンサー(Illumina)に積載する前に490〜710塩基対を単離し、精製し、KAPA Library Quantification Kit(KAPA Biosystems)を使用したqPCRによって計量した。
バイオインフォマティクス分析用に、得られたイルミナ配列を多重化し、質を調整した。次いで、重複する一対の端部測定値を集め、igblast(NCBI、v2.2.25+)のローカルインストールを使用して、再構成されたIgH配列のヒト生殖細胞系V、D、及びJセグメントデータベースへのアライメントに基づいて注釈を付けた。同一のスコアで複数のベストヒットが検出されると、配列は「曖昧」とマーク付けされ、分析から外される。結果を分析し、mysqlデータベースに保存するために、一連のPERLスクリプトを開発した。
3個の機能的ヒトVH並びに全ての機能的ヒトD及びJHを含むマウスでは、図18に示すように、配列分析によって、CAR遺伝子座中のIgH可変領域は、CARトランスジェネリックマウスの膵臓及び胸腺においてVDJ組み換えを受けたことが明らかになった。VH及びJHセグメントの分析を示す。図19に示すように、膵臓又は胸腺から増幅させた、再構成されたヒトIgH VDJ配列の大部分は、増殖性であった。
実施例5:キメラ抗原受容体遺伝子座を含むマウスからの抗原結合タンパク質の生成
実施例2で上述したように遺伝子操作されたキメラ抗原受容体遺伝子座ヒトIgκ−マウスTcra C及びヒトIgH V−マウスTcrb Cを含むマウスを繁殖させた後、対象の抗原(例えば、ウイルスペプチド−MHC抗原;腫瘍ペプチド−MHC抗原;自己免疫ペプチド−MHC抗原などMHCで提示される抗原)で選択したマウスを免疫した。抗原投与後に、免疫原の標識化四量体化バージョンでソートすることによって、動物から抗原特異的なT細胞を回収した。ソートしたCAR T細胞のIgκ及びIgH可変領域の配列を決定し、ヒトTCRα及びTCRβ定常領域のそれぞれの上流の操作可能な結合でこれらの可変領域配列をクローニングする。レポーターT細胞系にキメラ核酸配列を導入する。免疫化に使用するペプチド−MHC複合体を発現する標的T細胞でレポーターT細胞系をスクリーニングし、対象の抗原に所望の特性、例えば、親和性、選択性、エピトープなどを有するCARを選択する。選択したCARのIgκ及びIgH可変領域の配列を決定し、標的化されたペプチド−MHC複合体に対して特異的なヒト抗体を生成するために、ヒトIgκ及びIgH定常領域のそれぞれの上流の操作可能な結合でこれらの可変領域配列をクローニングする。これらの抗体を使用して、破壊するために、対象のペプチド−MHCを発現する感染細胞又は腫瘍細胞を標的化できる。あるいは、ペプチド−MHC標的が誘導性自己免疫に含まれている場合、これらの抗体を使用して、自己免疫T−細胞の活性化を阻害して、病気の症状を緩和することができる。加えて、本明細書に記載のCARマウスの免疫化から得たキメラヒトCARクローンは、例えば、養子T細胞(adaptive T cell)移植用にヒト患者から得たT細胞の導入に使用できる。
実施例2で上述したように遺伝子操作されたキメラ抗原受容体遺伝子座ヒトIgκ−マウスTcra C及びヒトIgH V−マウスTcrb Cを含むマウスを繁殖させた後、対象の抗原(例えば、ウイルスペプチド−MHC抗原;腫瘍ペプチド−MHC抗原;自己免疫ペプチド−MHC抗原などMHCで提示される抗原)で選択したマウスを免疫した。抗原投与後に、免疫原の標識化四量体化バージョンでソートすることによって、動物から抗原特異的なT細胞を回収した。ソートしたCAR T細胞のIgκ及びIgH可変領域の配列を決定し、ヒトTCRα及びTCRβ定常領域のそれぞれの上流の操作可能な結合でこれらの可変領域配列をクローニングする。レポーターT細胞系にキメラ核酸配列を導入する。免疫化に使用するペプチド−MHC複合体を発現する標的T細胞でレポーターT細胞系をスクリーニングし、対象の抗原に所望の特性、例えば、親和性、選択性、エピトープなどを有するCARを選択する。選択したCARのIgκ及びIgH可変領域の配列を決定し、標的化されたペプチド−MHC複合体に対して特異的なヒト抗体を生成するために、ヒトIgκ及びIgH定常領域のそれぞれの上流の操作可能な結合でこれらの可変領域配列をクローニングする。これらの抗体を使用して、破壊するために、対象のペプチド−MHCを発現する感染細胞又は腫瘍細胞を標的化できる。あるいは、ペプチド−MHC標的が誘導性自己免疫に含まれている場合、これらの抗体を使用して、自己免疫T−細胞の活性化を阻害して、病気の症状を緩和することができる。加えて、本明細書に記載のCARマウスの免疫化から得たキメラヒトCARクローンは、例えば、養子T細胞(adaptive T cell)移植用にヒト患者から得たT細胞の導入に使用できる。
参照による組み込み
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が存在する場合、本明細書に記載の定義を含む本願が支配する。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が存在する場合、本明細書に記載の定義を含む本願が支配する。
等価物
当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載の発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、確認することが可能であろう。かかる等価物は、以下の「特許請求の範囲」によって包含されることが意図される。
当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載の発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、確認することが可能であろう。かかる等価物は、以下の「特許請求の範囲」によって包含されることが意図される。
Claims (133)
- 生殖細胞系にキメラ抗原受容体(CAR)遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、前記CAR遺伝子座が、
再構成されていない免疫グロブリン(Ig)可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、
T細胞受容体(TCR)定常領域を含む定常領域遺伝子座と、を含み、
前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメント由来の再構成されたIg可変領域遺伝子によりコードされるIg可変ドメインと、前記TCR定常領域遺伝子によりコードされるTCR定常ドメインと、を含むCARポリペプチドを発現するように、前記再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントが前記TCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される、遺伝子改変非ヒト動物。 - 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトである、請求項1に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCR定常領域遺伝子が内在性種起源である、請求項1又は請求項2に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCR定常領域遺伝子がマウスTCR定常領域遺伝子又はラットTCR定常領域遺伝子である、請求項1又は請求項2に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトIg重鎖(IgH)可変領域遺伝子セグメントである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトIg軽鎖(IgL)可変領域遺伝子セグメントである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記IgL可変領域遺伝子セグメントがヒトκ遺伝子セグメントである、請求項6に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記IgL可変領域遺伝子セグメントがλ遺伝子セグメントである、請求項6に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCR定常領域遺伝子がTCRα定常領域遺伝子である、請求項1〜8いずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物が機能的TCRα鎖を発現しない、請求項9に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記CAR遺伝子座が内在性TCRα遺伝子座に位置する、請求項9に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントが内在性TCRα可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項9に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCRα定常領域遺伝子が内在性TCRα定常領域遺伝子である、請求項11に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCR定常領域遺伝子がTCRβ定常領域遺伝子である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物が機能的TCRβ鎖を発現しない、請求項14に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記CAR遺伝子座が内在性TCRβ遺伝子座に位置する、請求項14に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントが内在性TCRβ可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項16に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCRβ定常領域遺伝子が内在性TCRβ定常領域遺伝子である、請求項16に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 生殖細胞系に第1のCAR遺伝子座と、第2のCAR遺伝子座と、を含む、遺伝子改変非ヒト動物であって、
前記第1のCAR遺伝子座が、再構成されていない免疫グロブリン(Ig)VH、DH、及びJH遺伝子セグメントを含む第1の再構成されていない可変領域遺伝子座と、T細胞受容体β(TCRβ)定常領域遺伝子を含む第1の定常領域遺伝子座と、を含み、前記再構成されていないIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントが、前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記再構成されていないIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメント由来の再構成された重鎖可変領域遺伝子によってコードされるIg重鎖可変ドメインと、前記TCRβ定常領域遺伝子によってコードされるTCRβ定常ドメインと、を含む第1のCARポリペプチド鎖を発現するように、前記TCRβ定常領域遺伝子に操作可能に結合され、
前記第2のCAR遺伝子座が、再構成されていないIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントを含む、第2の再構成されていない可変領域遺伝子座と、T細胞受容体α(TCRα)定常領域遺伝子を含む第2の定常領域遺伝子座と、を含み、前記再構成されていないIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントが、前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記再構成されていないIg Vκ及びJκ遺伝子セグメント由来の再構成されたIgκ可変領域遺伝子によってコードされるIg κ可変ドメインと、前記TCRα定常領域遺伝子によってコードされるTCRα定常ドメインと、を含む第2のCARポリペプチド鎖を発現するように、前記TCRα定常領域遺伝子に操作可能に結合され、
前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記第1のCARポリペプチド鎖と、前記第2のCARポリペプチド鎖と、を含むCARを発現する、遺伝子改変非ヒト動物。 - 前記Ig VH、DH、及びJH遺伝子セグメント、並びに/又は前記Ig Vκ及びJκ遺伝子セグメントがヒトである、請求項19に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCRβ定常領域遺伝子及び/又は前記TCRα定常領域遺伝子が内在性種起源である、請求項19又は20に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCRβ定常領域遺伝子及び/又は前記TCRα定常領域遺伝子がマウス遺伝子又はラット遺伝子である、請求項19又は20に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物が機能的TCRα鎖及び/又は機能的TCRβ鎖を発現しない、請求項19〜22のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記第2のCAR遺伝子座が内在性TCRα遺伝子座に位置する、請求項19〜23のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記再構成されていないIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントが内在性TCRα可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項24に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCRα定常領域遺伝子が内在性TCRα定常領域遺伝子である、請求項24又は25に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記第1のCAR遺伝子座が内在性TCRβ遺伝子座に位置する、請求項19〜26のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記再構成されていないIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントが内在性TCRβ可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項27のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記TCRβ定常領域遺伝子が内在性TCRβ定常領域遺伝子である、請求項27又は28に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物が、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む1種又は2種以上のキメラMHCクラスIα鎖ポリペプチドを発現する、請求項1〜29のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記1種又は2種以上のキメラクラスIα鎖ポリペプチドが、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−g、HLA−K、及びHLA−Lからなる群から選択される、請求項30に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物がヒトβ−2−ミクログロブリンポリペプチドを発現する、請求項1〜31のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物が、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む、1種若しくは2種以上のキメラMHCクラスII α鎖ポリペプチド、並びに/又はヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含む、1種若しくは2種以上のキメラMHCクラスII β鎖ポリペプチドを発現する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記1種又は2種以上のキメラMHCクラスII α鎖ポリペプチドが、HLA−DMA、HLA−DOA、HLA−DPA、HLA−DQA、及びHLA−DRAからなる群から選択され、並びに/又は前記1種又は2種以上のキメラMHCクラスII β鎖ポリペプチドが、HLA−DMB、HLA−DOB、HLA−DPB、HLA−DQB、及びHLA−DRBからなる群から選択される、請求項33に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物が、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラCD8 α鎖ポリペプチド、及び/又はヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラCD8 β鎖ポリペプチドを発現する、請求項1〜34のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物が、ヒトD1免疫グロブリンドメイン、ヒトD2免疫グロブリンドメイン、ヒトD3免疫グロブリンドメイン、D4免疫グロブリンドメイン、及び内在性種起源の細胞質ドメインを含むキメラCD4ポリペプチドを発現する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記CARが、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する、請求項1〜36のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記CARが、前記遺伝子改変非ヒト動物のT細胞で発現する、請求項1〜37のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記T細胞が、前記遺伝子改変非ヒト動物の胸腺内でポジティブ選択及びネガティブ選択を受ける、請求項38に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記遺伝子改変非ヒト動物がげっ歯類である、請求項1〜39のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記げっ歯類がマウスである.請求項40に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- MHC上に提示されるペプチドに対して特異的なCARを発現するT細胞を作製する方法であって、
(a)請求項1〜41のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のMHC上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
(b)前記MHC上に提示される前記ペプチドに対して特異的なCARを発現するT細胞を、(a)の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、を含む、方法。 - 請求項42に記載の方法に従って作製されたT細胞。
- MHC上に提示されるペプチドに対して特異的なCARを発現するT細胞ハイブリドーマを作製する方法であって、
(a)請求項1〜41のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のMHC上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
(b)前記MHC上に提示される前記ペプチドに対して特異的なCARを発現するT細胞を、(a)の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、
(c)工程(b)のT細胞からT細胞ハイブリドーマを作製することと、を含む、方法。 - 請求項44に記載の方法に従って作製されたT細胞ハイブリドーマ。
- MHC上に提示されるペプチドに対して特異的なIg可変ドメインをコードする核酸を作製する方法であって、
(a)請求項1〜41のいずれか一項に記載の非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のMHC上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
(b)前記MHC上に提示される前記ペプチドに対して特異的なCARを発現するT細胞を、(a)の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、
(c)前記CARのIg可変ドメインをコードする核酸を前記T細胞から単離することと、を含む、方法。 - 請求項46に記載の方法に従って作製されたMHC上に提示されるペプチドに対して特異的なIg可変ドメインをコードする核酸。
- MHC上に提示されるペプチドに対して特異的な抗体を作製する方法であって、
(a)請求項1〜41のいずれか一項に記載の非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のMHC上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
(b)前記MHC上に提示される前記ペプチドに対して特異的なCARを発現するT細胞を、(a)の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、
(c)前記CARのIg可変ドメインをコードする核酸を前記T細胞から単離することと、
(d)前記Ig可変ドメインをコードする前記核酸を、宿主細胞内のIg定常ドメインと操作可能に結合することと、
(e)前記宿主細胞が、前記Ig可変ドメイン及び前記Ig定常ドメインを含む抗体を発現する条件下で前記宿主細胞を培養することと、を含む、方法。 - 前記Ig定常ドメインがヒトIg定常ドメインである、請求項48に記載の方法。
- 請求項48又は49の方法に従って作製された、MHC上に提示されるペプチドに対して特異的な抗体。
- ヒトIg可変ドメイン及びヒトTCR定常ドメインを含むCARを発現するヒト細胞を作製する方法であって、
(a)請求項1〜41のいずれか一項に記載の非ヒト動物を、ペプチドが前記非ヒト動物内のMHC上に提示されるように、前記ペプチドを含む抗原又は前記ペプチドを含む抗原をコードする核酸に曝露することと、
(b)前記MHC上に提示される前記ペプチドに対して特異的なCARを発現する非ヒト動物T細胞を、(a)の遺伝子改変非ヒト動物から得ることと、
(c)前記CARのIg可変ドメインをコードする核酸を前記非ヒト動物T細胞から単離することと、
(d)前記ヒト細胞が前記Ig可変ドメイン及び前記ヒトTCR定常ドメインを含むCARを発現するように、前記Ig可変ドメインをコードする核酸を、ヒト細胞内のヒトTCR定常ドメインをコードする核酸と操作可能に結合することと、を含む、方法。 - 前記ヒト細胞がヒトT細胞である、請求項51に記載の方法。
- 前記ヒトT細胞がex−vivoで単離されたヒトT細胞である、請求項52に記載の方法。
- 請求項51〜53のいずれか一項に記載の方法に従って作製された、ヒトIg可変ドメイン及びヒトTCR定常ドメインを含むCARを発現するヒト細胞。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる、又は得ることができる、CARを発現する細胞。
- 前記細胞がT細胞である、請求項55に記載の細胞。
- 前記細胞がT細胞ハイブリドーマである、請求項55に記載の細胞。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる、又は得ることができる、再構成されたIg可変領域遺伝子を含む核酸。
- 前記核酸がCARをコードする、請求項58に記載の核酸。
- 請求項55〜57のいずれか一項に記載の細胞から得られる、又は得ることができる、再構成されたIg可変領域遺伝子を含む核酸。
- 前記核酸がCARをコードする、請求項60に記載の核酸。
- 前記再構成されたIg可変領域遺伝子が、MHC上に提示されるペプチドに対して特異的なIg可変ドメインをコードする、請求項60又は61のいずれか一項に記載の核酸。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト動物から得られる、又は得ることができる、MHC上に提示されるペプチドに対して特異的なCAR。
- 請求項55〜57のいずれか一項に記載の細胞から得られる、又は得ることができる、MHC上に提示されるペプチドに対して特異的なCAR。
- ゲノム中にキメラ抗原受容体(CAR)遺伝子座を含む非ヒト胚性幹(ES)細胞であって、前記CAR遺伝子座が、
再構成されていない免疫グロブリン(Ig)可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、
T細胞受容体(TCR)定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含み、
前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントが前記TCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される、非ヒトES細胞。 - 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトである、請求項65に記載の非ヒトES細胞。
- 前記TCR定常領域遺伝子が内在性種起源である、請求項65又は66に記載の非ヒトES細胞。
- 前記TCR定常領域遺伝子がマウス定常領域遺伝子又はラット定常領域遺伝子である、請求項65又は66に記載の非ヒトES細胞。
- 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトIg重鎖(IgH)可変領域遺伝子セグメントである、請求項65〜68のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトIg軽鎖(IgL)可変領域遺伝子セグメントである、請求項65〜68のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記IgL可変領域遺伝子セグメントがヒトκ遺伝子セグメントである、請求項70に記載の非ヒトES細胞。
- 前記IgL可変領域遺伝子セグメントがλ遺伝子セグメントである、請求項70に記載の非ヒトES細胞。
- 前記TCR定常領域遺伝子がTCRα定常領域遺伝子である、請求項65〜72のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記CAR遺伝子座が内在性TCRα遺伝子座に位置する、請求項73に記載の非ヒトES細胞。
- 前記再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントが内在性TCRα可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項74に記載の非ヒトES細胞。
- 前記TCRα定常領域遺伝子が内在性TCRα定常領域遺伝子である、請求項74又は75に記載の非ヒトES細胞。
- 前記TCR定常領域遺伝子がTCRβ定常領域遺伝子である、請求項68〜72のいずれか一項に記載非ヒトES細胞。
- 前記CAR遺伝子座が内在性TCRβ遺伝子座に位置する、請求項77に記載の非ヒトES細胞。
- 前記再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントが内在性TCRβ可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項78に記載の非ヒトES細胞。
- 前記TCRβ定常領域遺伝子が内在性TCRβ定常領域遺伝子である、請求項78又は79に記載の非ヒトES細胞。
- ゲノム中に第1のCAR遺伝子座と、第2のCAR遺伝子座と、を含む、非ヒトES細胞であって、
前記第1のCAR遺伝子座が、再構成されていない免疫グロブリン(Ig)VH、DH、及びJH遺伝子セグメントを含む第1の再構成されていない可変領域遺伝子座と、T細胞受容体β(TCRβ)定常領域遺伝子を含む第1の定常領域遺伝子座と、を含み、前記再構成されていないIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントが前記TCRβ定常領域遺伝子に操作可能に結合され、
前記第2のCAR遺伝子座が、再構成されていないIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントを含む第2の再構成されていない可変領域遺伝子座と、T細胞受容体α(TCRα)定常領域遺伝子を含む第2の定常領域遺伝子座と、を含み、前記再構成されていないIgVκ及びJκ遺伝子セグメントが、前記TCRα定常領域遺伝子に操作可能に結合される、非ヒトES細胞。 - 前記非ヒトES細胞が、そのゲノム中にヒト細胞外ドメイン及び内在性種起源の細胞質ドメインを含むキメラMHCクラスI α鎖ポリペプチドをコードする1個又は2個以上の核酸配列を含む、請求項65〜81のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記MHCクラスI α鎖ポリペプチドが、HLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−F、HLA−g、HLA−K、及びHLA−Lからなる群から選択される、請求項82に記載の非ヒトES細胞。
- 前記非ヒトES細胞が、そのゲノム中にヒトβ−2−ミクログロブリンポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項65〜83のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記非ヒトES細胞が、そのゲノム中に、ヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラMHCクラスII α鎖ポリペプチドをコードする1個若しくは2個以上の核酸配列、及び/又はヒト細胞外ドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラMHCクラスII β鎖ポリペプチドをコードする1個若しくは2個以上の核酸配列を含む、請求項65〜84のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記キメラMHCクラスII α鎖ポリペプチドが、HLA−DMA、HLA−DOA、HLA−DPA、HLA−DQA、及びHLA−DRAからなる群から選択され、並びに/又は前記MHCクラスII β鎖ポリペプチドが、HLA−DMB、HLA−DOB、HLA−DPB、HLA−DQB、及びHLA−DRBからなる群から選択される、請求項85に記載の非ヒトES細胞。
- 前記非ヒトES細胞が、そのゲノム中に、ヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラCD8 α鎖ポリペプチドをコードする核酸配列、及び/又はヒト細胞外免疫グロブリンドメインと、内在性種起源の細胞質ドメインと、を含むキメラCD8 β鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項65〜86のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記非ヒトES細胞が、そのゲノム中にヒトD1免疫グロブリンドメイン、ヒトD2免疫グロブリンドメイン、ヒトD3免疫グロブリンドメイン、D4免疫グロブリンドメイン、及び内在性種起源の細胞質ドメインを含むキメラCD4ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項65〜87のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記非ヒトES細胞がげっ歯類ES細胞である、請求項65〜88のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞。
- 前記げっ歯類ES細胞がマウスES細胞である、請求項89に記載の非ヒトES細胞。
- CARを発現する遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、請求項65〜90のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞を使用することを含む方法。
- 請求項91に記載の方法を使用して作製される、又はこの方法から得ることができる、遺伝子改変非ヒト動物。
- 請求項65〜90のいずれか一項に記載の非ヒトES細胞を含む非ヒト胚。
- キメラ抗原受容体(CAR)遺伝子座であって、
再構成されていない免疫グロブリン(Ig)可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、
T細胞受容体(TCR)定常領域を含む定常領域遺伝子座と、を含み、
前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントが前記TCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される、CAR遺伝子座。 - 前記Ig可変領域遺伝子セグメントがヒトである、請求項94に記載のCAR遺伝子座。
- 前記TCR定常領域遺伝子がげっ歯類TCR定常領域遺伝子である、請求項94又は請求項95に記載のCAR遺伝子座。
- 前記げっ歯類TCR定常領域がマウスTCR定常領域である、請求項96のいずれか一項に記載のCAR遺伝子座。
- 再構成されていない免疫グロブリン(Ig)VH、DH、及びJH遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、T細胞受容体β(TCRβ)定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含むCAR遺伝子座であって、前記再構成されていないIg VH、DH、及びJH遺伝子セグメントが前記TCRβ定常領域遺伝子に操作可能に結合される、CAR遺伝子座。
- 前記Ig VH、DH、及びJH遺伝子セグメントがヒトである、請求項98に記載のCAR遺伝子座。
- 前記TCRβ定常領域遺伝子がマウスTCRβ定常領域遺伝子である、請求項98又は99に記載のCAR遺伝子座。
- 再構成されていないIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、T細胞受容体α(TCRα)定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子座と、を含むCAR遺伝子座であって、前記再構成されていないヒトIg Vκ及びJκ遺伝子セグメントが前記TCRα定常領域遺伝子に操作可能に結合される、CAR遺伝子座。
- 前記Ig Vκ及びJκ遺伝子セグメントがヒトである、請求項101に記載のCAR遺伝子座。
- 前記TCRα定常領域遺伝子がマウスTCRα定常領域遺伝子である、請求項101又は102に記載のCAR遺伝子座。
- Ig重鎖可変ドメイン及びTCRβ定常ドメインを含む第1のキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドと、Ig軽鎖可変ドメイン及びTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARであって、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有するCAR。
- 前記Ig軽鎖可変ドメインがIg κ可変ドメインである、請求項104に記載のCAR。
- 前記Ig軽鎖可変ドメインがIg λ可変ドメインである、請求項104に記載のCAR。
- 前記Ig重鎖可変ドメイン及び前記Ig軽鎖可変ドメインがヒトIg可変ドメインである、請求項104〜105のいずれか一項に記載のCAR。
- Ig重鎖可変ドメイン及びTCRα定常ドメインを含む第1のキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドと、Ig軽鎖可変ドメイン及びTCRβ定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARであって、ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有するCAR。
- 前記Ig軽鎖可変ドメインがIg κ可変ドメインである、請求項108に記載のCAR。
- 前記Ig軽鎖可変ドメインがIg λ可変ドメインである、請求項108に記載のCAR。
- 前記Ig重鎖可変ドメイン及び前記Ig軽鎖可変ドメインがヒトIg可変ドメインである、請求項108〜110のいずれか一項に記載のCAR。
- 請求項103〜111のいずれか一項に記載のCARを発現する細胞。
- 前記細胞がT細胞である、請求項112に記載の細胞。
- 被験者においてペプチド/MHC複合体に対する免疫応答を誘発する方法であって、ヒトIg重鎖可変ドメイン及びヒトTCRβ定常ドメインを含む第1のキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドと、ヒトIg軽鎖可変ドメイン及びヒトTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドと、を含むCARを発現するヒトT細胞を前記被験者に投与することを含み、前記CARが前記ペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する、方法。
- Ig重鎖可変ドメイン及びTCRβ定常ドメインを含む第1のCARポリペプチドをコードする第1の核酸配列と、Ig軽鎖可変ドメイン及びTCRα定常ドメインを含む第2のCARポリペプチドをコードする第2の核酸配列と、を含む、核酸組成物であって、CARが前記第1のCARポリペプチドを含み、前記第2のCARポリペプチドがペプチド/MHC複合体に対する結合特異性を有する、核酸組成物。
- 遺伝子改変を含む、非ヒト動物を作製する方法であって、生殖細胞系にキメラ抗原受容体(CAR)遺伝子座を含むように前記非ヒト動物を遺伝子操作することを含み、前記CAR遺伝子座が、
再構成されていない免疫グロブリン(Ig)可変領域遺伝子セグメントを含む再構成されていない可変領域遺伝子座と、
T細胞受容体(TCR)定常領域を含む定常領域遺伝子座と、を含み、
前記再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントは、前記遺伝子改変非ヒト動物が、前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメント由来の再構成されたIg可変領域遺伝子によりコードされるIg可変ドメインと、前記TCR定常領域遺伝子によりコードされるTCR定常ドメインと、を含むCARポリペプチドを発現するように、前記TCR定常領域遺伝子に操作可能に結合される、方法。 - 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトである、請求項116に記載の方法。
- 前記TCR定常領域遺伝子が内在性種起源である、請求項116又は117に記載の方法。
- 前記TCR定常領域遺伝子がマウスTCR定常領域遺伝子又はラットTCR定常領域遺伝子である、請求項116又は請求項117に記載の方法。
- 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトIg重鎖(IgH)可変領域遺伝子セグメントである、請求項116〜119のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再構成されていないIg可変領域遺伝子セグメントがヒトIg軽鎖(IgL)可変領域遺伝子セグメントである、請求項116〜119のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IgL可変領域遺伝子セグメントがヒトκ遺伝子セグメントである、請求項121に記載の方法。
- 前記IgL可変領域遺伝子セグメントがλ遺伝子セグメントである、請求項121に記載の方法。
- 前記TCR定常領域遺伝子がTCRα定常領域遺伝子である、請求項116〜123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CAR遺伝子座が内在性TCRα遺伝子座に位置する、請求項124に記載の方法。
- 前記再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントが内在性TCRα可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項125に記載の方法。
- 前記TCRα定常領域遺伝子が内在性TCRα定常領域遺伝子である、請求項125に記載の方法。
- 前記TCR定常領域遺伝子がTCRβ定常領域遺伝子である、請求項116〜123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CAR遺伝子座が内在性TCRβ遺伝子座に位置する、請求項128に記載の方法。
- 前記再構成されていないヒトIg可変領域遺伝子セグメントが内在性TCRβ可変領域遺伝子セグメントを置換する、請求項129に記載の方法。
- 前記TCRβ定常領域遺伝子が内在性TCRβ定常領域遺伝子である、請求項129に記載の方法。
- 前記非ヒト動物がげっ歯類である、請求項116〜131のいずれか一項に記載の方法。
- 前記げっ歯類がマウスである、請求項132に記載の方法。
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