JP2021120405A - Ｃｄ２００阻害剤及びその使用方法 - Google Patents

Ｃｄ２００阻害剤及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＣＤ２００阻害剤及びその使用方法の提供。【解決手段】本発明は、ある特定の実施形態において、少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤を含む組成物、及び、細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から生じる疾患または障害を持つ患者における免疫抑制の反転または調節方法を提供し、本方法は、その方法を必要とする患者に、ＣＤ２００阻害剤組成物を投与することを含む。本発明は、少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、組成物は、さらに、癌ワクチンを含む。ある特定の実施形態において、癌ワクチンは、腫瘍ライセートである。ある特定の実施形態において、腫瘍ライセートは、ＣＤ２００が実質的に欠けている。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０１５年１１月３日に出願された米国仮出願第６２／２５０，３７６号の
優先権を主張する。
癌研究の進歩にも関わらず、多くの癌に未だに適切な治療法が存在しない。例えば、悪
性神経膠腫は、米国で年間１４，０００人を超える患者が新たに生じる深刻な疾患である
。神経膠腫細胞は、大型腫瘍腔から数センチメートル遊走する能力があるため、現在の標
準治療は、わずかな改善をもたらすにすぎず、５年生存率は３０％を下回る。神経膠芽腫
の患者は、全身性免疫抑制を示し、その結果、適応免疫応答不全になる。こうした不全状
態は、Ｔ細胞の増殖及び細胞傷害性機能を抑制する腫瘍が分泌する豊富な免疫抑制因子に
よるものである。免疫抑制は、神経膠芽腫の患者における腫瘍の増悪に重要な役割を果た
す。免疫抑制を反転させて免疫標的指向性を有効にすることができれば、神経膠腫の患者
は、腫瘍の増悪が低減し、予後が改善されると思われる。
したがって、癌治療の新たな組成物及び方法が必要である。詳細には、腫瘍により引き
起こされた微小環境免疫抑制を反転させる新規組成物が必要である。
本発明は、少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤を含む組成物を提供する。ある特定の実
施形態において、組成物は、さらに、癌ワクチンを含む。ある特定の実施形態において、
癌ワクチンは、腫瘍ライセートである。ある特定の実施形態において、腫瘍ライセートは
、ＣＤ２００が実質的に欠けている。本明細書中使用する場合、「実質的に欠ける」は、
ある物質（例えば、腫瘍ライセート）が、低下したレベルのＣＤ２００、例えば、未処理
の物質より１〜１００％少ないＣＤ２００を有することを意味する。ある特定の実施形態
において、ＣＤ２００は、標準方法を用いて吸収により除去される。ある特定の実施形態
において、ＣＤ２００阻害剤は、長さが５〜２０アミノ酸のペプチドである。ある特定の
実施形態において、ペプチドは、非天然起源ペプチドである。ある特定の実施形態におい
て、ペプチドは、ＣＤ２００ドメインに由来する天然起源ペプチドと比較した場合に、１
つまたは複数の変異（例えば、アラニン置換）を有する。ある特定の実施形態において、
ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号
８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号
１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のアミノ酸配列を有する。ある
特定の実施形態において、少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤は、ペプチド模倣物である
。ある特定の実施形態において、ペプチド模倣物は、１種または複数のＤ型アミノ酸を含
む。ある特定の実施形態において、ペプチド模倣物は、１種または複数の非天然アミノ酸
を含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤は、抗体であ
る。
本発明は、ある特定の実施形態において、薬学上許容されるキャリアまたは希釈剤、な
らびに活性成分として、上記のとおりの、少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤、及び任意
選択で癌ワクチン（例えば、腫瘍ライセート）を含む医薬組成物を提供する。ある特定の
実施形態において、医薬組成物は、経口投与または注射用に配合される。ある特定の実施
形態において、医薬組成物は、ヒトまたは動物の身体を治療するための処置方法に使用さ
れる。ある特定の実施形態において、組成物は、さらに、癌治療薬を含む。
本発明は、ある特定の実施形態において、細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から
生じる疾患または障害を治療するための、あるいは治療のための医薬の製造における、薬
学上許容されるキャリアまたは希釈剤、及び活性成分として、上記のとおりの、少なくと
も１種のＣＤ２００阻害剤、及び任意選択で癌ワクチン（例えば、腫瘍ライセート）を含
む医薬組成物の使用を提供する。ある特定の実施形態において、疾患または障害は、癌で
ある。ある特定の実施形態において、癌は、結腸、乳房、脳、肝臓、卵巣、胃、肺、及び
頭頸部の固形腫瘍から選択される。ある特定の実施形態において、癌は、神経膠芽腫、黒
色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、肝細胞癌、及び甲状腺癌
から選択される。ある特定の実施形態において、癌は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、
精巣、尿生殖器、食道、喉頭、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、胃、皮膚、角化棘細胞腫、肺
、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺
腫、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化癌、乳頭癌、精上皮腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌
、肝癌及び胆管、腎癌、骨髄障害、リンパ系障害、有毛細胞、頬側口腔及び咽頭（口腔）
、口唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリン
パ腫、ならびに白血病から選択される。
本発明は、ある特定の実施形態において、細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から
生じる疾患または障害を治療する方法を提供し、本方法は、その方法を必要とする患者に
、少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤及び癌ワクチン（例えば、腫瘍ライセート）を順次
投与することを含む治療レジメンを施行することを含む。ある特定の実施形態において、
治療レジメンは、少なくとも２回、施行される。ある特定の実施形態において、施行は、
治療レジメンを少なくとも３回施行することを含む。ある特定の実施形態において、施行
は、治療レジメンを少なくとも５回施行することを含む。ある特定の実施形態において、
施行は、治療レジメンを少なくとも１０回施行することを含む。ある特定の実施形態にお
いて、少なくとも２回の連続する治療レジメンの施行は、約１週間または約１ヶ月の間隔
で隔てられている。ある特定の実施形態において、本方法は、さらに、治療レジメンの施
行前、最中、または後に、アジュバントを投与することを含む。
ある特定の実施形態において、本発明は、細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から
生じる疾患または障害を持つ患者において免疫抑制を反転させるまたは調節する方法を提
供し、本方法は、その方法を必要とする患者に、上記の組成物または治療レジメンを投与
または施行することを含む。
ある特定の実施形態において、本発明は、細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から
生じる疾患または障害を持つ患者の腫瘍微小環境またはセンチネルリンパ節において免疫
抑制を反転させるまたは調節する方法を提供し、本方法は、その方法を必要とする患者に
、上記の組成物または治療レジメンを投与または施行することを含む。ある特定の実施形
態において、疾患または障害は、癌である。ある特定の実施形態において、癌は、神経膠
芽腫、黒色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸癌部、肝細胞癌、及び
甲状腺癌から選択される。
ある特定の実施形態において、癌は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、精巣、尿生殖器
、食道、喉頭、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、胃、皮膚、角化棘細胞腫、肺、類表皮癌、大
細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺腫、膵臓、腺癌
、甲状腺、濾胞癌、未分化癌、乳頭癌、精上皮腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌、肝癌及び胆管
、腎癌、骨髄障害、リンパ系障害、有毛細胞、頬側口腔及び咽頭（口腔）、口唇、舌、口
、咽頭、小腸、結腸直腸、大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリンパ腫、ならびに
白血病から選択される。
ある特定の実施形態において、本発明は、送達が、組成物を動物に静脈内投与すること
を含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、組成物が、動物に、全身用ポンプを用いて投
与される、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、さらに、化学療法剤を投与することを提供す
る。ある特定の実施形態において、化学療法剤は、スニチニブ、ｏｎｔａｋ、シクロホス
ファミド、ゲムシタビン、及び／またはレチノイン酸である。
ある特定の実施形態において、動物は、ヒトである。
ある特定の実施形態において、本発明は、上記組成物に、薬学上許容されるキャリアを
組み合わせることを含む、医薬組成物の製造プロセスを提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、癌の治療用キットを提供し、本キットは、（
ａ）上記組成物を含む第一の医薬組成物；及び（ｂ）使用説明書を含む。
ある特定の実施形態において、本発明は、ＣＤ２００阻害剤をコードする核酸分子を提
供し、ＣＤ２００阻害剤は、ペプチドである。
ある特定の実施形態において、本発明は、ＣＤ２００阻害剤をコードする核酸分子を含
む発現カセットを提供し、阻害剤は、ペプチドである。ある特定の実施形態において、発
現カセットは、さらに、プロモーターを含む。
ある特定の実施形態において、本発明は、上記発現カセットを含むウイルスベクターを
提供する。ある特定の実施形態において、ベクターは、Ａｄ５などのアデノウイルス（Ａ
ｄ）である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤を含む、組成物。
（項目２）
さらに、少なくとも１種の追加のＣＤ２００阻害剤を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
さらに、癌ワクチンを含む、項目１または２に記載の組成物。
（項目４）
前記癌ワクチンは、腫瘍ライセートである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記腫瘍ライセートは、ＣＤ２００が実質的に欠けている、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤は、長さが５〜２０アミノ酸のペプチドである
、項目１から５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７）
前記ペプチドは、非天然起源ペプチドである、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記ペプチドは、ＣＤ２００ドメインに由来する天然起源ペプチドと比較した場合に、
１つまたは複数の変異を有する、項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記変異は、アラニン置換である、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤は、ペプチド模倣物である、項目１から５のい
ずれか１項に記載の組成物。
（項目１１）
前記ペプチド模倣物は、１種または複数のＤ型アミノ酸を含む、項目１０に記載の組成
物。
（項目１２）
前記ペプチド模倣物は、１種または複数の非天然アミノ酸を含む、項目１０または１１
に記載の組成物。
（項目１３）
前記ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配
列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配
列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のアミノ酸配列を有する
、項目６に記載の組成物。
（項目１４）
前記少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤は、抗体である、項目１から５のいずれか１項
に記載の組成物。
（項目１５）
さらに、薬学上許容されるキャリアまたは希釈剤を含む、項目１から１４のいずれか１
項に記載の組成物。
（項目１６）
経口投与または注射用に配合される、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
ヒトまたは動物の身体を治療するための処置方法に使用される、項目１５または１６に
記載の組成物。
（項目１８）
さらに、アジュバントを含む、項目１から１７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１９）
さらに、癌治療薬を含む、項目１から１８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２０）
細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から生じる疾患または障害を治療するための医
薬の製造における、項目１から１９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目２１）
前記疾患または障害は、癌である、項目２０に記載の使用。
（項目２２）
前記癌は、結腸、乳房、脳、肝臓、卵巣、胃、肺、及び頭頸部の固形腫瘍から選択され
る、項目２１に記載の使用。
（項目２３）
前記癌は、神経膠芽腫、黒色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部
癌、肝細胞癌、及び甲状腺癌から選択される、項目２１に記載の使用。
（項目２４）
前記癌は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、精巣、尿生殖器、食道、喉頭、神経膠芽腫
、神経芽細胞腫、胃、皮膚、角化棘細胞腫、肺、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（Ｎ
ＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺腫、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化
癌、乳頭癌、精上皮腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌、肝癌及び胆管、腎癌、骨髄障害、リンパ
系障害、有毛細胞、頬側口腔及び咽頭（口腔）、口唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、
大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリンパ腫、ならびに白血病から選択される、項
目２１に記載の使用。
（項目２５）
細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から生じる疾患または障害の治療方法であって
、その方法を必要とする動物に、以下
（ａ）項目１から１９のいずれか１項に記載の組成物；または
（ｂ）癌ワクチン及びＣＤ２００阻害剤の順次投与
を含む治療レジメンを施行することを含む、前記方法。
（項目２６）
前記治療レジメンは、少なくとも２回施行される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記施行は、前記治療レジメンを少なくとも３回施行することを含む、項目２５に記載
の方法。
（項目２８）
前記施行は、前記治療レジメンを少なくとも５回施行することを含む、項目２５に記載
の方法。
（項目２９）
前記施行は、前記治療レジメンを少なくとも１０回施行することを含む、項目２５に記
載の方法。
（項目３０）
少なくとも２回の連続する前記施行は、約１週間の間隔で隔てられている、項目２６か
ら２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
少なくとも２回の連続する前記施行は、約１ヶ月の間隔で隔てられている、項目２６か
ら２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
さらに、前記治療レジメンの施行前、最中、または後に、アジュバントを投与すること
を含む、項目２５から３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から生じる疾患または障害を持つ患者における
免疫抑制の反転または調節方法であって、その方法を必要とする患者に、項目１から１９
のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目３４）
細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から生じる疾患または障害を持つ患者の腫瘍微
小環境またはセンチネルリンパ節における免疫抑制の反転または調節方法であって、その
方法を必要とする患者に、項目１から１９のいずれか１項に記載の組成物を投与すること
を含む、前記方法。
（項目３５）
細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から生じる疾患または障害を持つ患者における
癌ワクチンの有効性の向上方法であって、その方法を必要とする患者に、項目１から１９
のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目３６）
前記疾患または障害は、癌である、項目３３から３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記癌は、神経膠芽腫、黒色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部
癌、肝細胞癌、及び甲状腺癌から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記癌は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、精巣、尿生殖器、食道、喉頭、神経膠芽腫
、神経芽細胞腫、胃、皮膚、角化棘細胞腫、肺、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（Ｎ
ＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺腫、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化
癌、乳頭癌、精上皮腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌、肝癌及び胆管、腎癌、骨髄障害、リンパ
系障害、有毛細胞、頬側口腔及び咽頭（口腔）、口唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、
大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリンパ腫、ならびに白血病から選択される、項
目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記動物は、ヒトである、項目２５から３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
項目１から１９のいずれか１項に記載の組成物に、薬学上許容されるキャリアを組み合
わせることを含む、医薬組成物の製造プロセス。
（項目４１）
癌の治療用キットであって、以下：
（ａ）項目１から１９のいずれか１項に記載の組成物を含む第一の医薬組成物；及び
（ｂ）使用説明書、
を含む、前記キット。
（項目４２）
ＣＤ２００阻害剤をコードする核酸分子であって、前記阻害剤は、ペプチドである、前
記核酸分子。
（項目４３）
項目４２に記載の分子を含む、発現カセット。
（項目４４）
さらに、プロモーターを含む、項目４３に記載の発現カセット。
（項目４５）
項目４３または４４に記載の発現カセットを含む、ウイルスベクター。
（項目４６）
前記ベクターは、アデノウイルス（Ａｄ）である、項目４５に記載のウイルスベクター
。
（項目４７）
前記アデノウイルスは、Ａｄ５である、項目４６に記載のウイルスベクター。
（項目４８）
前記送達は、前記組成物を前記動物に静脈内投与することを含む、項目２５から３９の
いずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記組成物は、前記動物に、全身用ポンプを用いて投与される、項目２５から３９のい
ずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
さらに、化学療法剤を投与することを含む、項目２５から３９、４８、または４９のい
ずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記化学療法剤は、スニチニブ、ｏｎｔａｋ、シクロホスファミド、ゲムシタビン、及
び／またはレチノイン酸である、項目５０に記載の方法。
ＣＤ２００（ＯＸ−２）とＣＤ２００Ｒの相互作用の図。 ＣＤ２００阻害剤は、ＣＤ２００活性化受容体を標的とする。図２Ａ）のＣＤ２００活性化受容体は、マウス樹状細胞であり、図２Ｂ）のＣＤ２００活性化受容体は、ヒト単球（ＣＤ１４）及び単球細胞株（ＴＨＰ）である。図２Ｃ）精製ＣＤ１１ｂ細胞に、ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）をパルス添加（ｐｕｌｓｅｄ）した；ＲＮＡを、５７５の免疫関連遺伝子についてＮａｎｏＳｉｇｈｔで分析した。図２Ｄ）。ＣＤ２００阻害剤が抑制性ＣＤ２００タンパク質に指図しているかどうかを明らかにするため、ＣＤ２００阻害剤（白色縦棒）、ＣＤ２００タンパク質（赤色縦棒）、及びＣＤ２００タンパク質＋ＣＤ２００阻害剤（青色縦棒）で処置した３つの群の結果を比較した。各処置群は、無パルス添加対照に対して正規化した。 ＣＤ２００阻害剤は、ＣＤ２００活性化受容体を標的とする。図２Ａ）のＣＤ２００活性化受容体は、マウス樹状細胞であり、図２Ｂ）のＣＤ２００活性化受容体は、ヒト単球（ＣＤ１４）及び単球細胞株（ＴＨＰ）である。図２Ｃ）精製ＣＤ１１ｂ細胞に、ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）をパルス添加（ｐｕｌｓｅｄ）した；ＲＮＡを、５７５の免疫関連遺伝子についてＮａｎｏＳｉｇｈｔで分析した。図２Ｄ）。ＣＤ２００阻害剤が抑制性ＣＤ２００タンパク質に指図しているかどうかを明らかにするため、ＣＤ２００阻害剤（白色縦棒）、ＣＤ２００タンパク質（赤色縦棒）、及びＣＤ２００タンパク質＋ＣＤ２００阻害剤（青色縦棒）で処置した３つの群の結果を比較した。各処置群は、無パルス添加対照に対して正規化した。 図３Ａ）ワクチン接種スキーム。図３Ｂ）担癌または非担癌マウスに、２日目及び８日目は、アゴニスト（４０１２）またはＣＤ２００阻害剤（６０５９）のみでワクチン接種し、３〜６日目に、１０μgのＯＶＡ＋Ｐｏｌｙ：ＩＣＬＣ＋／−アゴニスト（４０１２）またはＣＤ２００阻害剤（６０５９）でワクチン接種した。Ｂ）１０日目にマウスを失血させ、全血を抗ＣＤ８及びＳＩＮＮＦＥＫＬ特異的ｄｅｔｒａｍｅｒで染色し、溶解させ、フローサイトメトリーにより分析した。この実験は、競合的阻害剤が、腫瘍微小環境の抑制効果を反転させることを実証した。 担癌または非担癌マウスに、２日目及び８日目は、アゴニストまたはＣＤ２００阻害剤のみでワクチン接種し、３〜６日目、及び１０日目に、ＯＶＡ＋Ｐｏｌｙ：ＩＣＬＣ＋／−ＣＤ２００阻害剤６０５９でワクチン接種した。１０日目、収穫を行い、ＯＶＡタンパク質で刺激して、サイトカイン放出を介してリコール反応を測定した。図４Ａ）担癌マウスのＴＮＦアルファ（ＰＧ／ＭＬ）レベル。図４Ｂ）担癌マウスのＩＦＮガンマ（ＰＧ／ＭＬ）レベル。この実験は、競合的阻害剤が、腫瘍微小環境の抑制効果を反転させることを実証した。 図５Ａ）ＧＬ２６１担癌マウスに、腫瘍ライセート（６５μｇ）＋／−ＣＤ２００阻害剤（５０μｇ）でワクチン接種する１日前に、５０μｇのＣＤ２００阻害剤６０５９を接種した。図５Ｂ）腫瘍増殖について、マウスを毎週撮像した。以下の群を調べた：生理食塩水（１）、腫瘍ライセート（２）、及び腫瘍ライセート＋ＣＤ２００阻害剤（６０５９）（３）。図５Ｃ）生理食塩水（１）、腫瘍ライセート（２）、及び腫瘍ライセート＋ＣＤ２００阻害剤（３）群の接種後の生存率。この実験は、本発明者らの競合的阻害剤の使用が、腫瘍増殖を遅くして、生存率を３０％向上させたことを実証した。 図６Ａ）ＧＬ２６１担癌マウスに、２日目に、１０μｇのＣＤ２００阻害剤を腫瘍部位にて接種し、次いで、腫瘍ライセート（６５μｇ）＋ＣＤ２００阻害剤（５０μｇ）でワクチン接種する１日前に、５０μｇのＣＤ２００阻害剤で接種した。図６Ｂ）腫瘍増殖について、マウスを毎週撮像した。以下の群を調べた：生理食塩水（１）、腫瘍ライセート＋ＣＤ２００阻害剤（２）、及びＣＮＳ＋腫瘍ライセート＋ＣＤ２００阻害剤（３）群。マウスのＣＮＳに接種することは、腫瘍増殖をさらに抑制し、このことは、ＣＮＳで腫瘍により誘導された抑制が反転することを実証する。 異なるＣＤ２００阻害剤は、代替免疫応答を誘導する。Ａ）ＧＬ２６１担癌マウスまたはＢ）ＥＭＴ６乳癌担持マウスに、異なるマウスＣＤ２００阻害剤を投与した。Ｃ）ヒト未熟樹状細胞に、異なるＣＤ２００阻害剤を投与した。阻害剤の数字は、社内での命名体系を表す。さらなる分析から、異なるＣＤ２００阻害剤は、異なるマウスＣＤ２０００活性化受容体に結合して異なる免疫応答を誘発することが判明した。 ＣＮＳからの可溶性ＣＤ２００の一貫した送達を示すスキームであり、この送達は、流入領域リンパ節におけるＣＤ２００介在型免疫抑制を向上させることになる。本発明者らのＣＤ２００阻害剤を添加すると、ＣＤ２００活性化受容体に結合して細胞を活性化させ、可溶性ＣＤ２００の抑制シグナルに打ち勝つ。 図９Ａ。担癌及び非担癌マウスのワクチン接種スキーム。マウスは、７日目に失血させた。図９Ｂ。全血を、抗ＣＤ８及びＳＩＮＮＦＥＫＬ特異的ｄｅｔｒａｍｅｒで染色し、溶解させ、フローサイトメトリーにより分析した。担癌または非担癌マウスでの結果。 Ｉｎ ｖｉｖｏ生存試験。４群を腫瘍増殖について調べた：（１）生理食塩水；（２）腫瘍ライセート；（３）腫瘍ライセート＋ＣＤ２００阻害剤６０５９；（４）腫瘍ライセート＋ＣＤ２００阻害剤６０５９でワクチン接種する２日前に、ＣＤ２００阻害剤６０５９のみで前処置したマウス。全てのワクチン接種は、担癌マウスの後頸部に投与された。 脾細胞に、ＯＶＡ＋阻害剤ペプチドをパルス添加し、２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗い、精製ＯＴ１をウェルに添加し、さらに４８時間インキュベートし、次いで図１１Ａ）ＴＮＦａ及びＩＬ−６産生；ならびに図１１Ｂ）ＩＬ−２及びＩＬ−１７産生について分析した。エラーバーは、＋／−ＳＥＭ（ｎ＝４／群；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１）を示す。 ＣＤ２００阻害剤は、腫瘍環境の抑制効果を反転させる。担癌及び非担癌マウスに、ＯＶＡ＋Ｐｏｌｙ：ＩＣＬＣ＋／−ＣＤ２００阻害剤６０５９でワクチン接種し、図１２Ａ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｋｂ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖について分析した。図１２Ｂ）リンパ球を収穫し、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで刺激した。上清を、ＴＮＦα及びＩＦＮγ分泌について分析した。図１２Ｃ）ＣＤ２００阻害剤６０５９を、ＯＶＡ＋エキソソームに添加した。エラーバーは、＋／−ＳＥＭ（ｎ＝４／群；＊Ｐ＜０．０５；ｔ検定による）を示す。 ヒトＣＤ１１ｂ細胞を単離した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を用いて、精製ＣＤ１１ｂ細胞を、未熟樹状細胞に分化させた。細胞に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４ ＣＤ２００阻害剤をパルス添加した（表２を参照）。上清を、図１３Ａ）サイトカインまたは図１３Ｂ）ケモカイン産生について分析した。 ヒトＣＤ１１ｂ細胞を単離した。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を用いて、精製ＣＤ１１ｂ細胞を、未熟樹状細胞に分化させた。細胞に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４ ＣＤ２００阻害剤をパルス添加した（表２を参照）。上清を、図１３Ａ）サイトカインまたは図１３Ｂ）ケモカイン産生について分析した。 図１４Ａ−１４Ｂ。ＣＦＳＥ標識化ヒトＰＢＭＣに、ＣｏｎＡ；ＣｏｎＡ＋ｈＣＤ２００；またはＣｏｎＡ＋ｈＣＤ２００＋ＣＤ２００阻害剤をパルス添加した。４８時間後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。 ＣＤ２００阻害剤は、抗原特異的反応を向上させる。ＣＭＶ陽性ヒトＣＤ１１ｂを、未熟樹状細胞（ｉＤＣ）まで成熟させ、ＣＭＶ抗原ｐｐ６５＋／−ｈＣＤ２００阻害剤をパルス添加した。未熟樹状細胞を、成熟ＤＣまで成熟させた。自己Ｔ細胞を細胞に添加し、上清を、ＩＦＮガンマ産生について分析した。 ヒトＣＤ１１ｂ細胞を単離し、精製したＣＤ１１ｂ細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を用いて、未熟樹状細胞へと分化させた。細胞に、ヒトＰ１ペプチド、またはアラニン置換を有するその変異型（Ｐ１ならびにアミノ酸の置換及び位置で表す；例えば、Ｐ１Ａ１、Ｐ１Ａ２、Ｐ１Ａ３、Ｐ１Ａ４、Ｐ１Ａ５、Ｐ１Ａ６など）（表２参照）をパルス添加した。上清を、サイトカイン産生について分析した。結果は、６番目のアミノ酸をアラニンで置換すると反応が有意に向上したことを示した。 イヌが診療所に来訪し、脳腫瘍と診断される。イヌの腫瘍を使用して、それらのワクチンを開発し、続いて個別化ワクチン＋イヌ特異的ＣＤ２００阻害剤（ＬＦＮＴＦＧＳＧＫＩＳＧ−アミド）で治療する。これまでに治療された神経膠腫担持イヌとは異なり、手術後残存していた腫瘍の退縮が観察される。特定のイヌのＭＲＩ画像をＡ−Ｄに示す。具体的には、神経膠腫で診療所に来訪したこのイヌから、神経膠腫の約６０％が摘除された（図１７Ａ、１７Ｃ）。腫瘍を用いて、腫瘍ライセートワクチンを作製した。イヌを、腫瘍ライセート＋イヌ用に設計されたＣＤ２００阻害剤で治療した。イヌを、手術から４ヶ月後、ワクチン接種から２４時間後（図１７Ｂ、１７Ｄ）に撮像し、生存について経過観察する（図１７Ｅ）。アスタリスクは、１０／２８／２０１６の時点で、試験で生存しているイヌを表す。 イヌが診療所に来訪し、脳腫瘍と診断される。イヌの腫瘍を使用して、それらのワクチンを開発し、続いて個別化ワクチン＋イヌ特異的ＣＤ２００阻害剤（ＬＦＮＴＦＧＳＧＫＩＳＧ−アミド）で治療する。これまでに治療された神経膠腫担持イヌとは異なり、手術後残存していた腫瘍の退縮が観察される。特定のイヌのＭＲＩ画像をＡ−Ｄに示す。具体的には、神経膠腫で診療所に来訪したこのイヌから、神経膠腫の約６０％が摘除された（図１７Ａ、１７Ｃ）。腫瘍を用いて、腫瘍ライセートワクチンを作製した。イヌを、腫瘍ライセート＋イヌ用に設計されたＣＤ２００阻害剤で治療した。イヌを、手術から４ヶ月後、ワクチン接種から２４時間後（図１７Ｂ、１７Ｄ）に撮像し、生存について経過観察する（図１７Ｅ）。アスタリスクは、１０／２８／２０１６の時点で、試験で生存しているイヌを表す。 イヌが診療所に来訪し、脳腫瘍と診断される。イヌの腫瘍を使用して、それらのワクチンを開発し、続いて個別化ワクチン＋イヌ特異的ＣＤ２００阻害剤（ＬＦＮＴＦＧＳＧＫＩＳＧ−アミド）で治療する。これまでに治療された神経膠腫担持イヌとは異なり、手術後残存していた腫瘍の退縮が観察される。特定のイヌのＭＲＩ画像をＡ−Ｄに示す。具体的には、神経膠腫で診療所に来訪したこのイヌから、神経膠腫の約６０％が摘除された（図１７Ａ、１７Ｃ）。腫瘍を用いて、腫瘍ライセートワクチンを作製した。イヌを、腫瘍ライセート＋イヌ用に設計されたＣＤ２００阻害剤で治療した。イヌを、手術から４ヶ月後、ワクチン接種から２４時間後（図１７Ｂ、１７Ｄ）に撮像し、生存について経過観察する（図１７Ｅ）。アスタリスクは、１０／２８／２０１６の時点で、試験で生存しているイヌを表す。 実験モデル。ＣＤ２００を、ＣＤ２００の受容体（ＣＤ２００Ｒ）で相互作用している腫瘍または内皮から可溶化させる。このＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ相互作用は、免疫応答に必要なＴＮＦアルファ及びＩＬ２産生を減少させるＭＹＣ経路を通じてＰＰＩＡの上方制御を誘導する（図１８Ａ）。その上、統合経路分析（図１８Ｂ）及び実験的実験は、ＣＤ２００が単球活性化を誘導し、その結果、骨髄系由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が増殖することを実証した（図１８Ｃ）。ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）を使用すると、ペプチドは単球上のＣＤ２００活性化受容体に結合し（図１８Ｄ）、ＰＰＩＡの産生を阻害し（図１８Ｅ）、ＮＦＡＴの脱リン酸化を可能にする。 実験モデル。ＣＤ２００を、ＣＤ２００の受容体（ＣＤ２００Ｒ）で相互作用している腫瘍または内皮から可溶化させる。このＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ相互作用は、免疫応答に必要なＴＮＦアルファ及びＩＬ２産生を減少させるＭＹＣ経路を通じてＰＰＩＡの上方制御を誘導する（図１８Ａ）。その上、統合経路分析（図１８Ｂ）及び実験的実験は、ＣＤ２００が単球活性化を誘導し、その結果、骨髄系由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が増殖することを実証した（図１８Ｃ）。ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）を使用すると、ペプチドは単球上のＣＤ２００活性化受容体に結合し（図１８Ｄ）、ＰＰＩＡの産生を阻害し（図１８Ｅ）、ＮＦＡＴの脱リン酸化を可能にする。 実験モデル。ＣＤ２００を、ＣＤ２００の受容体（ＣＤ２００Ｒ）で相互作用している腫瘍または内皮から可溶化させる。このＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ相互作用は、免疫応答に必要なＴＮＦアルファ及びＩＬ２産生を減少させるＭＹＣ経路を通じてＰＰＩＡの上方制御を誘導する（図１８Ａ）。その上、統合経路分析（図１８Ｂ）及び実験的実験は、ＣＤ２００が単球活性化を誘導し、その結果、骨髄系由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が増殖することを実証した（図１８Ｃ）。ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）を使用すると、ペプチドは単球上のＣＤ２００活性化受容体に結合し（図１８Ｄ）、ＰＰＩＡの産生を阻害し（図１８Ｅ）、ＮＦＡＴの脱リン酸化を可能にする。 実験モデル。ＣＤ２００を、ＣＤ２００の受容体（ＣＤ２００Ｒ）で相互作用している腫瘍または内皮から可溶化させる。このＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ相互作用は、免疫応答に必要なＴＮＦアルファ及びＩＬ２産生を減少させるＭＹＣ経路を通じてＰＰＩＡの上方制御を誘導する（図１８Ａ）。その上、統合経路分析（図１８Ｂ）及び実験的実験は、ＣＤ２００が単球活性化を誘導し、その結果、骨髄系由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が増殖することを実証した（図１８Ｃ）。ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）を使用すると、ペプチドは単球上のＣＤ２００活性化受容体に結合し（図１８Ｄ）、ＰＰＩＡの産生を阻害し（図１８Ｅ）、ＮＦＡＴの脱リン酸化を可能にする。 ＣＤ２００阻害剤は、走化性を向上させる。ワクチン接種スキーム。野生型及びＣＤ２００Ｒノックアウトマウスに、腫瘍ライセートまたはＣＤ２００阻害剤でワクチン接種した。２４時間後、マウスに、腫瘍ライセートまたはＣＤ２００阻害剤＋腫瘍ライセートで再度ワクチン接種した。８枚の切片（皮膚試料のレベル）を、２回目のワクチン接種から６時間後に、リンパ球浸潤について分析した； 腫瘍ライセート＋ＣｐＧの免疫組織化学的検査結果； 腫瘍ライセート＋ＣｐＧ＋アンタゴニスト（２４時間）の免疫組織化学的検査結果；ならびに 野生型及びＣＤ２００Ｒ ＫＯマウスのカウント数／切片。 ＣＤ２００阻害剤は、ＣＤ１１ｂ細胞を活性化する。野生型（白抜縦棒）またはＣＤ２００受容体ノックアウトマウス（黒塗縦棒）由来の精製単球に、ＯＶＡまたはＯＶＡ＋ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）をパルス添加した。混合Ｐ１Ａ１２阻害剤を、対照として用いた。図２０Ａ）野生型マウスから単離した細胞を、同時刺激分子及びＭＨＣ−ＩＩ発現レベルについて分析した。図２０Ｂ）細胞を、２４時間インキュベートし、３回洗い、精製ＯＴ−ＩＴ細胞とともにインキュベートした。上清を、ＩＦＮガンマ産生について分析した。 野生型マウス由来の精製単球に、腫瘍ライセート（ＴＬ）または腫瘍ライセート＋ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）をパルス添加した。細胞を、４８時間インキュベートし、サイトカイン及びケモカイン産生について分析した。 精製骨髄樹状細胞に、ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）をパルス添加した。細胞を、４８時間インキュベートし、サイトカイン及びケモカイン産生について分析した。 マウスに、腫瘍ライセート＋／−ＣＤ２００阻害剤をワクチン接種した。マウスを、ＭＤＳＣ集団について経時的に経過観察した。０．０１７というＰ値は、アンタゴニストを投与されたマウスにおいて１０日目と５０日目のＭＤＳＣパーセンテージの間に有意差があることを示す。 担癌または非担癌マウスに、ＯＶＡ＋及びアジュバントＰｏｌｙ：ＩＣＬＣ＋／−ＣＤ２００阻害剤Ｐ１Ａ１２をワクチン接種した。マウスを屠殺して、リンパ球をＯＶＡ特異的Ｔ細胞増殖について測定した（図２４Ａ）。リンパ球をＯＶＡで再刺激し、上清を、サイトカイン産生について測定した（図２４Ｂ）。 野生型及びＣＤ２００Ｒノックアウトマウスに、４〜７、１５、及び２２日目にワクチン接種した。流入領域リンパ節からリンパ球を収穫し、様々なエフェクター：標的細胞比で、ＧＬ２６１細胞とともにインキュベートし、細胞溶解反応について分析した。 ＣＤ２００受容体の上の、Ｐ１Ａ１２マウスアンタゴニストと同一のエピトープ部位に対して、ポリクローナル抗体（抗ＣＤ２００Ｒ）を作製した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。免疫抑制の誘導を回避するため、抗体は、Ｐ１Ａ１２アンタゴニストと同一のエピトープに対して特異的に設計された。図２６Ａ）ワクチン接種スケジュール、図２４６Ｂ）神経膠腫担持マウスに、腫瘍ライセート（ＴＬ）＋ＣＤ２００阻害剤ペプチド（Ｐ１Ａ１２）ｉｄ．＋／−ポリクローナル抗ＣＤ２００Ｒ阻害剤ｉｖをワクチン接種した。混合ＣＤ２００阻害剤を、対照として用いた。マウスを生存についてモニタリングした。
ＣＤ２００とＣＤ２００受容体（ＣＤ２００Ｒ）の相互作用は、免疫抑制性腫瘍微小環
境を創出することが見つかっている。溶解性ＣＤ２００が腫瘍微小環境で白血球の阻害を
向上させることも見つかっている。さらに、腫瘍細胞でのＣＤ２００発現の高さは、悪性
度と相関する。
本発明は、癌ワクチン及びＣＤ２００阻害剤を含む組成物を提供する。
癌ワクチン
本明細書中記載されるとおり、癌ワクチンは、腫瘍抗原ワクチンが可能である。腫瘍抗
原ワクチンとは、癌細胞（例えば、腫瘍ライセート）、癌細胞の一部、または純粋な腫瘍
抗原（腫瘍細胞から単離された物質）でできたワクチンである。腫瘍抗原ワクチンは、身
体の免疫系を刺激して、癌細胞を発見し殺傷することができる。例えば、癌ワクチンは、
神経膠腫癌細胞、乳癌細胞、もしくは他の固形腫瘍癌細胞、またはそれら細胞の一部、ま
たはそれら細胞に由来する抗原を含むことができる。ある特定の実施形態において、癌ワ
クチンは、ワクチン抗原を含み、培養腫瘍細胞由来ライセートが、抗原の源である。
ある特定の実施形態において、癌ワクチンは、ＧＬ２６１由来ワクチンが可能である。
ある特定の実施形態において、癌ワクチンは、ＯＶＡ由来ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープを
含有するペプチドを含む。ある特定の実施形態において、ペプチドは、
Figure 2021120405

である。
ＣＤ２００阻害剤
本明細書中使用される場合、ＣＤ２００の阻害剤は、ＣＤ２００の競合的阻害剤とも称
する。
ある特定の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤は、ＣＤ２００活性化受容体、すなわ
ちＣＤ２００の受容体に結合する。
ペプチド及びペプチド模倣物
ある特定の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤は、ペプチドが可能である。ある特定
の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤は、長さが５〜２０アミノ酸のペプチドである。
例えば、ある特定の実施形態において、ペプチドは、長さが５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。
ある特定の実施形態において、ペプチドは、ＣＤ２００の１つのドメインに相当するも
のが可能である。Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉらは、アンタゴニストとして作用するＣＤ２００
タンパク質の特定領域を記載した（Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ ２００８；１４５（１）
： ８７−９６）。すなわち、ある特定の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤は、Ｇｏ
ｒｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ ２００８；１４５（１）
： ８７−９６に記載のペプチドが可能である。ある特定の実施形態において、ＣＤ２０
０阻害剤は、以下のものが可能である：
Figure 2021120405
Figure 2021120405
Figure 2021120405
さらに、本発明の他の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤は、Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍ
ｅｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００８， ６９９−７０５
；Ｃｈｅｎ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １７（３），
２８９−２９６ （２００５）；Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｓｃｈｏｌａｒｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ， ＩＳＲＮ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ２０１２， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ６８２１６８；ｐａｇ
ｅｓ １−１８；米国特許公開第２００２／０１６８３６４号；米国特許第６，９５５，
８１１号；または米国特許第７，９０２，１５１号に記載されるものが可能である。
ある特定の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤は、自然の産物ではない非天然起源ペ
プチドである。ある特定の実施形態において、本明細書中記載されるＣＤ２００阻害剤は
、ＣＤ２００の１つのドメインに相当する天然起源ペプチドと比較した場合に、明らかに
異なる特徴（例えば、構造的、機能的、及び／または他の特性）を有する。
ある特定の実施形態において、ＣＤ２００ペプチド阻害剤は、非天然の変異（複数可）
を含むように操作されており、したがって、その天然起源のカウンターパートとは構造的
に異なる（表１〜３を参照）。ある特定の実施形態において、変異（複数可）は、天然起
源ペプチドと比べた場合に、向上したＣＤ２００抑制活性及び／または向上した免疫抑制
の反転または調節能力をもたらすものであり、結果的に、その自然状態にある天然起源の
カウンターパートとは、構造的及び機能的に異なる。したがって、本発明のある特定の実
施形態は、ＣＤ２００ドメインに由来する天然起源ペプチドの配列と比較した場合に、１
つまたは複数の変異を含むＣＤ２００ペプチド阻害剤を提供する。
本明細書中記載されるとおり、特定ＣＤ２００ペプチド阻害剤に変異を起こして特定の
アミノ酸位置でアラニン置換を誘導する（例えば、ペプチド阻害剤中、左から右に数えて
、６番目または１２番目のアミノ酸をアラニン残基で置換することができる）と、向上し
たＣＤ２００抑制活性及び／または向上した免疫抑制の反転または調節能力がもたらされ
ることが、期せずして判明した。例えば、Ｃｈｅｎ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １７（３）， ２８９−２９６ （２００５）に記載されるマウ
スＰ１ ＣＤ２００阻害剤の配列（ＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮ（配列番号８））は、１
２番目のアミノ酸をアラニンで置換することにより修飾して、その抑制活性を向上させる
ことができる（Ｐ１Ａ１２：
Figure 2021120405

（配列番号９））。同様に、ｈＰ１阻害剤（ＳＱＫＶＳＧＴＡＣＬＴＬＹ（配列番号５）
）は、６番目のアミノ酸をアラニンで置換することにより修飾して、その抑制活性を向上
させることができる（ｈＰ１Ａ６：
Figure 2021120405

、配列番号１３）（図１６を参照、この図は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−β産生の向上を示す
）。
したがって、ある特定の実施形態において、変異（複数可）は、アラニン置換（例えば
、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び／または
１５位アミノ酸での）である。ある特定の実施形態において、アラニン置換は、６位アミ
ノ酸（ペプチド内でアミノ酸を左から右に数えて）でのものである。ある特定の実施形態
において、アラニン置換は、１２位アミノ酸（ペプチド内でアミノ酸を左から右に数えて
）でのものである。
ある特定の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤は、ペプチド模倣物である。本明細書
中使用される場合、「ペプチド模倣物」とは、ペプチドを模倣するように化学的に設計さ
れた小タンパク質様鎖である。ある特定の実施形態において、ペプチド模倣物は、未修飾
ペプチドと比較した場合にある特定の調節された分子特性、例えば向上した安定性（例え
ば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期）または生物活性を保持するように設計される。例えば、ペプ
チド模倣物は、本明細書中記載されるペプチドを化学修飾することにより作製することが
できる。化学修飾として、Ｄ型アミノ酸、β３アザ−アミノ酸、改変骨格を含ませること
、及び／または非天然アミノ酸の組み込みが挙げられるが、これらに限定されない。例え
ば、これらの戦略は、天然（Ｌ−）アミノ酸を非天然（Ｄ−）アミノ酸またはβ３アザ−
アミノ酸で置き換えることに基づく。他の戦略として、アミド結合（−ＣＯＮＨ−）をチ
オアミドまたはＮ−メチル化アミドで置き換えることが挙げられる。他の方法として、Ｎ
及びＣ末端アミノ酸を、アミド、エステル、またはＤ−アミノ酸に変更することが挙げら
れる。
したがって、ある特定の実施形態において、ＣＤ２００ペプチド阻害剤は、１つまたは
複数のＤ型アミノ酸を含むように操作されている。ある特定の実施形態において、ＣＤ２
００ペプチド阻害剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、またはそれより多くのＤ型アミノ酸を含む。ある特定の実施形態において
、アミノ酸の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００
％は、Ｄ型アミノ酸である。
ある特定の実施形態において、ＣＤ２００ペプチド阻害剤は、１つまたは複数の非天然
アミノ酸（例えば、デヒドロアラニン、ホモセリン、ホスホセリン、ホスホトレオニン、
ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸；馬尿酸、オク
タヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキ
ノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニ
ン、ｐａｒａ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン
、サルコシン、及びｔｅｒｔ−ブチルグリシン）を含むように操作されている。ある特定
の実施形態において、ＣＤ２００ペプチド阻害剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くの非天然アミノ酸を含む
。ある特定の実施形態において、アミノ酸の約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７
０、８０、９０、または１００％は、非天然アミノ酸である。
抗体または抗体断片
ある特定の実施形態において、少なくとも１種のＣＤ２００阻害剤は、抗体（例えば、
活性化受容体ＣＤ２００Ｒ、すなわちＣＤ２００の受容体の特定エピトープに結合する抗
体）である。ＣＤ２００Ｒに結合する抗体は、当該分野で既知であり、市販されている。
本明細書中使用される場合、「抗体」という用語は、ｓｃＦｖ抗体、ヒト化抗体、全ヒ
トまたはキメラ抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、及び抗体のＦｃ領域を含まない抗原結
合断片（例えば、Ｆａｂ断片）を含む。ある特定の実施形態において、抗体は、ヒト抗体
またはヒト化抗体である。「ヒト化」抗体は、３つのＣＤＲ（相補性決定領域）のみを含
み、及び時として各ドナー抗体可変領域から注意深く選択された少数の「フレームワーク
」残基（可変領域の非ＣＤＲ部分）をヒト抗体配列の該当するフレームワーク及び定常領
域に組換え導入で連結させて含むこともある。「全ヒト化抗体」は、ヒト由来抗体遺伝子
のみを有するように遺伝子操作されたマウス由来のハイブリドーマで作製されるか、また
はヒト由来抗体遺伝子のファージディスプレイライブラリから選択することにより作製さ
れる。
本明細書中使用される場合、「抗体」という用語は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖまたは
「ナノボディ」）、ヒト化抗体、全ヒトまたはキメラ抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、
及び抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ断片）を含む。ｓｃＦｖは、リンカーペプチド
により接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タ
ンパク質である。リンカーは通常短く、長さが約１０〜２５アミノ酸である。柔軟性が重
要な場合、リンカーは、相当数のグリシンを含有することになる。溶解性が重要な場合、
セリンまたはテアニンがリンカーに使用されることになる。リンカーは、ＶＨのアミノ末
端とＶＬのカルボキシ末端を連結する場合もあるし、ＶＨのカルボキシ末端とＶＬのアミ
ノ末端を連結する場合もある。二価（Ｄｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）と
も称する）ｓｃＦｖは、２つのｓｃＦｖを連結することにより作製することができる。例
えば、二価ｓｃＦｖは、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を含有する１つのペプチドを
作製することにより作ることができる。あるいは、それぞれが１つのＶＨ及び１つのＶＬ
領域を含有する２つのペプチドを、二量体化することができる（「ダイアボディ」とも称
する）。Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ‘‘Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ： ｓｍａｌｌ
ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎ
ｔｓ，’’ ＰＮＡＳ， Ｊｕｌｙ １９９３， ９０：６４４４−６４４８。二価性は
、抗体が、多量体抗原に高結合活性で結合することを可能にし、二重特異性は、２つの抗
原の架橋を可能にする。
本明細書中使用される場合、「モノクローナル抗体］という用語は、実質的に均質な抗
体の群、すなわち、その群を構成する抗体が、少量で存在する自然発生変異体を除いて均
質である抗体の群から得られる抗体を示す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり
、単一抗原部位と相互作用する。そのうえさらに、各モノクローナル抗体は、多様な抗原
決定基に対する様々な抗体を典型的に含有する一般的なポリクローナル抗体調製物と比較
した場合に、抗原上の単一抗原決定基（エピトープ）を標的とする。モノクローナル抗体
は、その特性に加えて、他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養物から
産生されるという点で有利である。
「モノクローナル」という形容詞は、実質的に均質な抗体群から得られた抗体という特
質を示すのであって、特定の方法により作製された抗体を指定するものではない。例えば
、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ
ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５， １９７５）または組
換え法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製することができる。本発明で使用
されるモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる（Ｃ
ｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８， １９９１
；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７
， １９９１）。本発明のモノクローナル抗体は、特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリ
ン）を含み、抗体中、重（Ｈ）鎖及び／または軽（Ｌ）鎖の一部分は、特定種または特定
抗体のクラスもしくはサブクラスに由来し、鎖の残部は、別の種、または別の抗体のクラ
スもしくはサブクラスに由来に由来する。そのうえさらに、変異抗体及びその抗体断片も
、本発明に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ
．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−６８
５５， １９８４）。
本明細書中使用される場合、「変異抗体」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残
基が改変されてしまった変異アミノ酸配列を含む抗体を示す。例えば、抗体の可変領域は
、抗原結合などの生物学的特性を改善するように修飾することができる。そのような修飾
は、部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８２： ４８８（１９８５）を参照）、ＰＣＲを利用した変異誘発、カセ
ット変異誘発などにより達成することができる。そのような変異体は、抗体の重鎖または
軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一、より好ましくは少なくとも７５％
、さらにより好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも８５％、さら
になおより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ
酸配列を含む。本明細書中使用される場合、「配列同一性」という用語は、抗体の元来の
アミノ酸配列の残基と同一である残基のパーセンテージと定義され、配列を整列させてギ
ャップを適宜導入して配列同一性を最大化した後に決定される。
具体的には、１つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と別のものとの同一性は、Ｋ
ａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ， ９０： ５８７３−５８７７， １９９３）によるＢＬＡＳＴアルゴリズ
ムを用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸなどのプログラムは、
このアルゴリズムに基づいて開発された（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍ
ｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０， １９９０）。ＢＬＡＳＴに基づくＢ
ＬＡＳＴＮによりヌクレオチド配列を分析するため、パラメーターを、例えば、ｓｃｏｒ
ｅ＝１００及びｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２と設定する。他方で、ＢＬＡＳＴに基づくＢ
ＬＡＳＴＸによりアミノ酸配列を分析するのに使用されるパラメーターとして、例えば、
ｓｃｏｒｅ＝５０及びｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐ
ｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラムの初期設定パラメーターを使
用する。そのような分析に関する具体的技法は、当該分野で既知である（全米バイオテク
ノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇ
ｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）を参照；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、当業者に既知である方法により調製す
ることができる。
別の実施形態において、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４８：５５２−５５４ （１９９０））が報告した技法を用いることにより作製さ
れた抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔ
ｕｒｅ ３５２：６２４−６２８ （１９９１））及びＭａｒｋｓら（Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７ （１９９１））は、マウス抗体及びヒト抗体それ
ぞれについてファージライブラリーからの単離を報告した。チェーンシャッフリング法（
Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３
（１９９２））、ならびにコンビナトリアル感染法及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え方法に基づ
いた高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製を記載する報告もあり、これらの方法は大規模
ファージライブラリーを構築するための方法である（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ
．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：２２６５−２２６６ （１９９３
））。こうした技術を、モノクローナル抗体作製のための従来のハイブリドーマ技術の代
わりに使用して、モノクローナル抗体を単離することも可能である。
本発明で使用することになる抗体は、既知の方法、例えば、タンパク質Ａ−セファロー
ス法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、硫酸塩を用いた塩析法、イオン交換ク
ロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーなどから適切に選択された方
法により、またはそれらの併用により、精製することができる。
本発明は、遺伝子操作により作製された組換え抗体を使用することもできる。上記の方
法により得られる抗体をコードする遺伝子を、ハイブリドーマから単離する。遺伝子を適
切なベクターに挿入し、次いで宿主に導入する（例えば、Ｃａｒｌ， Ａ． Ｋ． Ｂｏ
ｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｊａｍｅｓ， Ｗ． Ｌａｒｒｉｃｋ， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ、１９９０により英国にて刊行）。本発明は、本発明の抗体をコー
ドする核酸、及びこれら核酸を含むベクターを提供する。具体的には、逆転写酵素を用い
て、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを、ハイブリドーマのｍＲＮＡから
合成する。関心対象の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを得た後、それらを、抗体の所
望の定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、得られるＤＮＡ構築物を、発現ベ
クターに挿入する。あるいは、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮ
Ａを含む発現ベクターに挿入することができる。これらは、遺伝子が、発現調節領域、例
えば、エンハンサー及びプロモーターの制御下で発現するように、発現ベクターに挿入さ
れる。次いで、宿主細胞を発現ベクターで形質転換して、抗体を発現させる。本発明は、
本発明の抗体を発現する細胞を提供する。本発明の抗体を発現する細胞として、そのよう
な抗体の遺伝子で形質転換した細胞及びハイブリドーマが挙げられる。
本発明の抗体には、相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはＣＤＲと機能的に等価な領域を
含む抗体も含まれる。「機能的に等価な」という用語は、実施例で単離されるモノクロー
ナル抗体のいずれかのＣＤＲのアミノ酸配列と類似したアミノ酸配列を含むことを示す。
「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変領域（「Ｖ領域」とも称する）中のある領域を示し、
抗原結合の特異性を決定するものである。Ｈ鎖及びＬ鎖は、それぞれ、３つのＣＤＲを有
し、これらは、Ｎ末端から、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と指定される。これらの
ＣＤＲと隣接して４つの領域が存在する：これらの領域を、「フレームワーク」と称し、
それらのアミノ酸配列は、高度に保存されている。ＣＤＲは、他の抗体に移植することが
でき、したがって、ＣＤＲを、所望の抗体のフレームワークと組み合わせることにより、
組換え抗体を調製することができる。その抗原と結合する能力を失うことなく、ＣＤＲの
１つまたは複数のアミノ酸を修飾することができる。例えば、ＣＤＲの１つまたは複数の
アミノ酸を、置換、削除、及び／または付加することができる。
ある特定の実施形態において、アミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されるよう
なものに変異させられる。アミノ酸側鎖の性質の例として、以下を含む：疎水性アミノ酸
（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、
Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の側鎖を含むアミノ酸：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、
Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；
カルボン酸及びアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；及び
芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。丸括弧内の文字は、一文字アミノ酸コードを示す。
各群内でのアミノ酸置換は、保存的置換と呼ばれる。１つまたは複数のアミノ酸残基が、
削除、付加、及び／または置換された修飾アミノ酸配列を含むポリペプチドは、元来の生
物活性を保持できることが周知である（Ｍａｒｋ Ｄ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１：５６６２−５６６６
（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒ Ｍ． Ｊ． ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ Ｍ．， Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ ｓＲｅｓ． １０： ６４８７−６５００ （１９８２）；Ｗａｎｇ Ａ
． ｅ ｔａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４： １４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉ
ｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７９： ６４０９−６４１３ （１９８２））。変異したア
ミノ酸の個数は制限されないが、一般に、その数は、各ＣＤＲのアミノ酸の４０％以内で
あり、好ましくは３５％以内、さらにより好ましくは３０％以内（例えば、２５％以内）
である。アミノ酸配列の同一性は、上記のとおり決定することができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低減するように人為的に修飾された組換え抗体
を使用することができる。例として、キメラ抗体及びヒト化抗体が挙げられる。これらの
修飾抗体は、既知の方法を用いて、作製することができる。キメラ抗体として、互いに異
なる種の可変領域及び定常領域を含む抗体、例えば、マウスなど非ヒト哺乳類の抗体重鎖
及び軽鎖の可変領域、ならびにヒトの抗体重鎖及び軽鎖の定常領域を含む抗体が挙げられ
る。そのような抗体は、（１）マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡと、ヒト抗体の
定常領域をコードするＤＮＡとを連結すること；（２）これを発現ベクターに組み込むこ
と；及び（３）ベクターを宿主に導入して、抗体を産生させることにより、得ることがで
きる。
ヒト化抗体は、再構成ヒト抗体とも呼ばれるが、これは、マウスなど非ヒト哺乳類のＨ
またはＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト抗体のＣＤＲと置き換えることにより、得
られる。そのような抗体を調製するための遺伝子組換え技法は、従来から知られている（
例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２−５２５ （１
９８６）；Ｒ ｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３−
３２９ （１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ
． ２： ５９３−５９６ （１９９２）を参照）。具体的には、マウス抗体のＣＤＲと
ヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）を連結するように設計されたＤＮＡ配列を、末端
に重複部分を含むように構築された複数のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより合
成する。ヒト化抗体は、（１）得られるＤＮＡと、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡ
とを連結すること；（２）これを発現ベクターに組み込むこと；及び（３）ベクターを宿
主に形質移入して抗体を産生させること、により得ることができる（欧州特許出願第ＥＰ
２３９，４００号、及び国際特許出願第ＷＯ９６／０２５７６号を参照）。ＣＤＲを介し
て連結されたヒト抗体ＦＲを、ＣＤＲが好適な抗原結合部位を形成するものについて選択
する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入されたＣＤＲにもフレームワーク配列にも
含まれていない追加アミノ酸残基（複数可）を含むことができる。そのようなアミノ酸残
基は、通常、抗原を認識しそれに結合するという抗体の能力をより正確に最適化するため
に導入される。例えば、必要に応じて、抗体可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を
、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、置き換えることがで
きる（Ｓａｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９９３）
５３， ８５１−８５６）。
本発明の抗体のアイソタイプは、限定されない。アイソタイプとして、例えば、ＩｇＧ
（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇ
Ａ２）、ＩｇＤ、及びＩｇＥが挙げられる。本発明の抗体は、抗原結合を担当する部分を
含む抗体断片、またはその修飾断片である場合もある。「抗体断片」という用語は、全長
抗体の一部分を示し、概して、抗原結合ドメインまたは可変領域を含む断片を示す。その
ような抗体断片として、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ
）（これは適切なリンカーで１つに結合された重鎖Ｆｖ及び軽鎖Ｆｖを含む）、ダイアボ
ディ（単数及び複数）、直鎖抗体、及び抗体断片から調製した多重特異性抗体が挙げられ
る。以前は、抗体断片は、天然抗体をプロテアーゼで消化することにより作製されていた
；現在は、遺伝子操作技法を用いてそれらを組換え抗体として発現させる方法も知られて
いる（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７ （１
９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１ （１９８
５）；Ｃｏ， Ｍ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９４，
１５２， ２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ， Ｍ． ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ａ．
Ｈ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９８９， １７８， ４７
６−４９６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，
Ａ． ＆ Ｓｋｅｒｒａ， Ａ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
１９８９， １７８， ４７６−４９６， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．
；Ｌａｍｏｙｉ， Ｅ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １９８９
， １２１， ６６３−６６９；Ｂｉｒｄ， Ｒ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＴＥ
ＣＨ， １９９１， ９， １３２−１３７を参照）。
「Ｆｖ」断片は、最小の抗体断片であり、完全抗原認識部位及び結合部位を含有する。
この領域は、二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）であり、その中で、重鎖及び軽鎖それぞれの可
変領域は、非共有結合により強力に接続されている。可変領域それぞれの３つのＣＤＲは
、互いに相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面で、抗原結合部位を形成する。言い換え
ると、重鎖及び軽鎖合計で６つのＣＤＲが、抗体の抗原結合部位として一緒に機能する。
しかしながら、可変領域（または３つの抗原特異的ＣＤＲのみを含有する半Ｆｖ）のみで
も、抗原を認識し、これに結合することができることが知られている。とはいえ、その親
和性は、全結合部位の親和性より低い。すなわち、本発明の好適な抗体断片は、Ｆｖ断片
であるが、これに限定されない。そのような抗体断片は、保存されており、かつその抗原
を認識してそれに結合することができる、重鎖または軽鎖ＣＤＲの抗体断片を含むポリペ
プチドである場合がある。
Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも称する）も、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域（ＣＨ１）を
含有する。例えば、抗体をパパイン消化すると、２種の断片が生成する：抗原結合断片、
これはＦａｂ断片と呼ばれ、重鎖及び軽鎖の可変領域を含有しており、これらの領域は単
一抗原結合ドメインとして機能する；及び残りの部分、これは容易に結晶化するため、「
Ｆｃ」と呼ばれる。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１領域のカルボキシル末端由来の残基も複
数有し、その中には抗体のヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステイン残基も含まれる
という点で、Ｆａｂ断片とは異なる。しかしながら、Ｆａｂ’断片もＦａｂも、重鎖及び
軽鎖の、単一抗原結合ドメインとして機能する可変領域を含有している抗原結合断片であ
るという点で、Ｆａｂ’断片はＦａｂと構造的に等価である。本明細書中、単一抗原結合
ドメインとして機能し、パパイン消化により得られるものと等価である、重鎖及び軽鎖の
可変領域を含む抗原結合断片は、たとえプロテアーゼ消化により生成する抗体断片と同一
でなかったとしても、「Ｆａｂ様抗体」と称する。Ｆａｂ’−ＳＨとは、その定常領域に
自由チオール基を有する１つまたは複数のシステイン残基を持つＦａｂ’である。Ｆ（ａ
ｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域中のシステイン残基間のジスルフィド結合を
切断することにより生成する。他の化学架橋した抗体断片も、当業者に既知である。抗体
をペプシン消化すると、２つの断片が得られる；一方は、２つの抗原結合ドメインを含み
、抗原と交差反応することができるＦ（ａｂ’）２断片であり、他方は、残りの断片であ
る（ｐＦｃ’と称する）。本明細書中、ペプシン消化により得られるものと等価な抗体断
片は、それが、２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応することができる場合に
、「Ｆ（ａｂ’）２様抗体」と称する。そのような抗体断片は、例えば、遺伝子操作によ
り作製することもできる。そのような抗体断片は、例えば、上記の抗体ファージライブラ
リーから単離することもできる。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ
などの宿主から直接回収し、次いで化学架橋によりＦ（ａｂ’）２断片を形成させること
ができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６
３−１６７ （１９９２））。代替方法において、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主の
培養物から直接単離することができる。
「ダイアボディ（Ｄｂ）」という用語は、遺伝子融合により構築された二価抗体断片を
示す（例えば、Ｐ． Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）， ＥＰ４０４
，０９７， ＷＯ ９３／１１１６１）。一般に、ダイアボディとは、２本のポリペプチ
ド鎖からなる二量体である。ポリペプチド鎖のそれぞれにおいて、同一鎖中の軽鎖可変領
域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）は、それらが互いに結合できないように、短いリン
カー、例えば、約５つの残基からなるリンカーを介して接続されている。二者間のリンカ
ーが短すぎるために、同一ポリペプチド鎖中のＶＬとＶＨは、一本鎖Ｖ領域断片を形成す
ることができず、その代わりに、二量体を形成する。すなわち、ダイアボディは、２つの
抗原結合ドメインを有する。２種類の抗原（ａ及びｂ）に対するＶＬ領域及びＶＨ領域を
組み合わせて、約５つの残基からなるリンカーを介してＶＬａ−ＶＨｂ及びＶＬｂ−ＶＨ
ａを形成し、次いでそれらを同時発現させた場合、それらは、二重特異性Ｄｂとして分泌
される。本発明の抗体は、そのようなＤｂである場合がある。
一本鎖抗体（「ｓｃＦｖ」とも称する）は、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域を連結する
ことにより調製することができる（ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ‘
‘Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ’’ Ｖｏｌ． １１３， ｅｄｓ． Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ，
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ． Ｙ．， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９
９４）を参照）。一本鎖抗体の調製方法は、当該分野で既知である（例えば、米国特許第
４，９４６，７７８号；同第５，２６０，２０３号；同第５，０９１，５１３号；及び同
第５，４５５，０３０号を参照）。そのようなｓｃＦｖでは、重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域は
、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して、互いに連結されている（Ｈｕｓｔｏ
ｎ， Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ， １９８８， ８５， ５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖの重鎖Ｖ領域及び
軽鎖Ｖ領域は、同一抗体に由来する場合も、異なる抗体に由来する場合もある。Ｖ領域を
連結するために使用されるペプチドリンカーは、１２〜１９の残基からなる任意の一本鎖
ペプチドが可能である。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、テンプレートとして、上記抗体
の重鎖または重鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ及び上記抗体の軽鎖または軽鎖のＶ領域を
コードするＤＮＡから選択された、全ＤＮＡまたは所望のアミノ酸配列をコードする部分
ＤＮＡいずれかを用いて；ならびに２つの末端を定義するプライマー対を用いて、ＰＣＲ
により増幅することができる。ペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、ならびに重鎖
及び軽鎖それぞれと連結されることになるＤＮＡの両末端を定義するプライマー対の組み
合わせを用いて、さらなる増幅を引き続き行うことができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮ
Ａを構築した後、従来方法を用いて、これらのＤＮＡを含む発現ベクターを得ることがで
き、そしてこれらの発現ベクターにより宿主を形質転換することができる。そのうえさら
に、ｓｃＦｖは、得られる宿主を用いて、従来方法にしたがって得ることができる。これ
らの抗体断片は、抗体断片をコードする遺伝子を得て、それらを上記に概説したとおりに
発現させることにより、宿主中で産生させることができる。ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）など種々の分子と結合させた抗体は、修飾抗体として使用することができる。抗体
を修飾する方法は、当該分野ですでに確立されている。「抗体」という用語は、本発明中
、上記の抗体も包含する。
得られる抗体は、精製して均一にすることができる。抗体は、タンパク質の単離及び精
製に常用される方法により、単離及び精製することができる。抗体は、例えば、カラムク
ロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、分取ポリアクリルアミドゲル電気泳動
、及び等電点電気泳動（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ， Ｄａｎｉｅｌ Ｒ． Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ
． ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ （１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ． Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８）から適切に選択される１つまた
は複数の方法を併用することにより、単離及び精製することができる。そのような方法は
、上記のものに限定されない。クロマトグラフィー法として、アフィニティークロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相
クロマトグラフィー、及び吸着クロマトグラフィーが挙げられる。これらのクロマトグラ
フィー法は、液相クロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣ及びＦＰＬＣなどを用いて行う
ことができる。アフィニティークロマトグラフィーで使用されることになるカラムとして
、タンパク質Ａカラム及びタンパク質Ｇカラムが挙げられる。例えば、タンパク質Ａカラ
ムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）が挙げられる。抗体は、抗原を固定してある担体を用いて抗原結合を利用し
て精製することもできる。
本発明の抗体は、標準方法に従って配合することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏ
ｎ， Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｕ．Ｓ．
Ａを参照）、薬学上許容されるキャリア及び／または添加剤を含むことができる。本発明
は、本発明の抗体、及び薬学上許容されるキャリア及び／または添加剤を含む組成物（試
薬及び医薬品を含む）に関する。キャリアの例として、界面活性剤（例えば、ＰＥＧ及び
Ｔｗｅｅｎ）、賦形剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、香味剤、保存剤
、安定剤、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸）、キレート化剤（例え
ば、ＥＤＴＡ）、懸濁化剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動性付与剤、矯味剤
が挙げられる。しかしながら、本発明で使用可能なキャリは、この列挙に限定されない。
事実、他の一般的に使用されるキャリアが、適切に採用される：軽質無水ケイ酸、ラクト
ース、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロー
スナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、
ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中
鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油６０、スクロース、カルボキ
シメチルセルロース、コーンデンプン、無機塩など。組成物は、他の低分子量ポリペプチ
ド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、及び免疫グロブリンなど、ならび
にアミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、及びリシンな
ども含むことができる。組成物が注射用水性液剤として調製される場合、組成物は、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖、及び他のアジュバントを含む等張液を含むことができ、アジ
ュバントとして、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、及び
塩化ナトリウムが挙げられ、組成物はまた、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（例え
ば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール及びＰＥＧ）、及び
非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０及びＨＣＯ−５０）も含有することができる
。
必要であれば、本発明の抗体は、マイクロカプセル（ヒドロキシセルロース、ゼラチン
、ポリメタクリル酸メチルなどでできたマイクロカプセル）に封入することができ、コロ
イド薬物送達系（リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、及
びナノカプセル）の構成要素にすることができる（例えば、‘‘Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ’’，
Ｏｓｌｏ Ｅｄ． （１９８０）を参照）。そのうえ、徐放性薬物の作製方法が知られて
おり、それらを本発明の抗体に適用することができる（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５： １６７−２７７ （１９８１
）；Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２： ９８−１０５ （１９８２）；
米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ
ａｌ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２： ５４７−５５６（１９８３） ；ＥＰ：
１３３，９８８）。
ＣＤ２００阻害剤の使用
本明細書中記載されるとおり、ＣＤ２００阻害剤またはＣＤ２００阻害剤を含む本明細
書中記載されるとおりの組成物は、免疫抑制を反転または調節するために使用することが
できる。ＣＤ２００は、ＣＤ２００Ｒを有する免疫細胞を負に調節する（例えば、抗原特
異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を抑制する）免疫抑制タンパク質である。本明細書中記載される
場合、「免疫抑制を反転または調節する」は、ＣＤ２００タンパク質及び／または腫瘍の
免疫抑制性質を改変、妨害、低減することを示す。ある特定の実施形態において、ＣＤ２
００タンパク質活性は、ＣＤ２００タンパク質不在下の腫瘍での活性と比べた場合に、哺
乳類において、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０
％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％低下する。例えば、癌患者において、骨
髄系由来抑制細胞及び調節性Ｔ細胞などの免疫抑制細胞は、活性の上昇を示すが、樹状細
胞（ＤＣ）は、腫瘍及びセンチネルリンパ節において障害されているようである。したが
って、ある特定の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤またはＣＤ２００阻害剤を含む本
明細書中記載されるとおりの組成物の投与は、骨髄系由来抑制細胞及び調節性Ｔ細胞など
の免疫抑制細胞の活性を低下させる可能性がある、及び／または腫瘍微小環境及び／また
はセンチネルリンパ節におけるＤＣの活性を向上させる可能性がある。ある特定の実施形
態において、反転または調節は、本明細書中記載されるとおりサイトカインプロファイル
を評価することにより確認することができる（例えば、サイトカインプロファイルを、Ｃ
Ｄ２００阻害剤の投与前後に測定して比較することができる；実施例も参照）。
本明細書中示される場合、「腫瘍微小環境」とは、腫瘍細胞を取り囲み、それらを養う
正常細胞、分子、及び血管である。腫瘍は、その微小環境を変更することができ、微小環
境は、腫瘍がどのように増殖及び拡散するかに影響を及ぼすことができる。
本明細書中記載されるとおり、ＣＤ２００阻害剤は、癌ワクチンの有効性を向上させる
ことができる（例えば、同時にまたは順次投与された場合）。例えば、ある特定の実施形
態において、ＣＤ２００阻害剤及び癌ワクチンは、合剤配合物（すなわち、本明細書中記
載される組成物）に含まれている場合もあるし、順次または同時投与用の別個の配合物に
含まれている場合もある。
本明細書中記載されるとおり、「向上の有効性」は、ＣＤ２００阻害剤及び癌ワクチン
の投与により、癌ワクチンのみの投与により生じる有益な免疫応答よりも強い有益な免疫
応答が生じることを意味する。ある特定の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤及び癌ワ
クチン（例えば、本明細書中記載される組成物）の投与は、哺乳類において、腫瘍の寸法
（体積）を、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％
、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％縮小させ、この縮小は、癌ワクチンのみの
投与による縮小より大きい。ある特定の実施形態において、ＣＤ２００阻害剤及び癌ワク
チンの投与（例えば、同時または順次投与）は、相乗効果をもたらす。
ＣＤ２００のアゴニスト
本明細書中使用される場合、ＣＤ２００のアゴニストは、ＣＤ２００と等価な生物学的
効果を有する。ある特定のＣＤ２００アゴニストが、例えば、Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ ｅ
ｔ ａｌ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ ２００８；１４５（１）： ８７−９６に以前
に報告されており、その中には、アゴニスト４００５（ＳＰＥＮＭＶＴＹＳＫＴ（配列番
号６））及びアゴニスト４０１２（ＴＹＳＫＴＨＧＶＶＴＱ（配列番号７））が含まれる
。
医薬組成物
本発明は、ある特定の実施形態において、薬学上許容されるキャリアまたは希釈剤、及
び活性成分として、本明細書中記載されるとおりの組成物を含む、医薬組成物も提供する
。ある特定の実施形態において、組成物は、経口投与または注射用に配合されている。
本発明は、ある特定の実施形態において、治療によるヒトまたは動物の身体の処置法で
使用するための、本明細書中記載されるとおりの組成物も提供する。
本発明は、ある特定の実施形態において、薬物療法に使用するための、本明細書中記載
されるとおりの組成物も提供する。
本発明は、ある特定の実施形態において、細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から
生じる疾患または障害の治療に使用するための、本明細書中記載されるとおりの組成物も
提供する。
本発明は、ある特定の実施形態において、細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から
生じる疾患または障害を治療するための医薬の製造における、本明細書中記載されるとお
りの組成物の使用も提供する。ある特定の実施形態において、疾患または障害は、癌であ
る。ある特定の実施形態において、癌は、結腸、乳房、脳、肝臓、卵巣、胃、肺、及び頭
頸部の固形腫瘍から選択される。ある特定の実施形態において、癌は、神経膠芽腫、黒色
腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、肝細胞癌、及び甲状腺癌か
ら選択される。ある特定の実施形態において、癌は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、精
巣、尿生殖器、食道、喉頭、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、胃、皮膚、角化棘細胞腫、肺、
類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、結腸、腺腫
、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化癌、乳頭癌、精上皮腫、黒色腫、肉腫、膀胱癌、
肝癌及び胆管、腎癌、骨髄障害、リンパ系障害、有毛細胞、頬側口腔及び咽頭（口腔）、
口唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジキンリンパ
腫、ならびに白血病から選択される。
本発明は、ある特定の実施形態において、細胞の異常な増殖、機能、もしくは挙動から
生じる疾患または障害を治療する方法も提供し、本方法は、そのような方法を必要とする
患者に、本明細書中記載されるとおりの組成物を投与することを含む。ある特定の実施形
態において、疾患または障害は、癌である。ある特定の実施形態において、癌は、神経膠
芽腫、黒色腫、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、肝細胞癌、及び
甲状腺癌から選択される。ある特定の実施形態において、癌は、乳房、卵巣、子宮頸部、
前立腺、精巣、尿生殖器、食道、喉頭、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、胃、皮膚、角化棘細
胞腫、肺、類表皮癌、大細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞癌、肺腺癌、骨、
結腸、腺腫、膵臓、腺癌、甲状腺、濾胞癌、未分化癌、乳頭癌、精上皮腫、黒色腫、肉腫
、膀胱癌、肝癌及び胆管、腎癌、骨髄障害、リンパ系障害、有毛細胞、頬側口腔及び咽頭
（口腔）、口唇、舌、口、咽頭、小腸、結腸直腸、大腸、直腸、脳及び中枢神経系、ホジ
キンリンパ腫、ならびに白血病から選択される。
本発明は、ある特定の実施形態において、医薬組成物の製造プロセスも提供し、本プロ
セスは、本明細書中記載されるとおりの組成物を、薬学上許容されるキャリアと組み合わ
せることを含む。
本発明は、ある特定の実施形態において、癌の治療用キットを提供し、本キットは、（
ａ）本明細書中記載されるとおりの組成物を含む第一の医薬組成物；及び（ｂ）使用説明
書を含む。
本発明は、さらに、上記のＣＤ２００阻害剤ペプチドをコードする核酸配列を提供する
。ＣＤ２００ペプチドをコードする核酸は、当該分野で周知の方法を用いて作製すること
ができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１を参照）。
したがって、本発明のある特定の実施形態は、本明細書中記載されるとおりのＣＤ２０
０阻害剤ペプチドをコードする核酸分子を提供する。
本発明のある特定の実施形態は、本明細書中記載される核酸分子を含む発現カセットを
提供する。ある特定の実施形態において、本明細書中記載される発現カセットは、さらに
、プロモーター、例えば調節可能なプロモーターまたは構成的プロモーターなどを含む。
適切なプロモーターの例として、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ｐｏｌ ＩＩ、またはｐｏｌ ＩＩＩ
プロモーターが挙げられる。発現カセットは、さらに、ポリアデニル化信号（合成最小ポ
リアデニル化信号など）及び／または標識遺伝子を含むことができる。
本発明のある特定の実施形態は、本明細書中記載される発現カセットを含むウイルスベ
クターを提供する。適切なベクターの例として、アデノウイルス、レンチウイルス、アデ
ノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶ、またはマウスモロニー系ウイルス
ベクターが挙げられる。ある特定の実施形態において、ベクターは、アデノウイルス（Ａ
ｄ）である。
ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、哺乳類の腫瘤に直接送達される。
ある特定の実施形態において、癌ワクチンは、ウイルスベクターの送達前、ウイルスベク
ター送達と同時、またはウイルスベクターの送達後に、哺乳類に投与される。
本発明は、上記の発現カセットまたはベクターを含有する細胞（哺乳類細胞など）を提
供する。本発明は、上記の発現カセットまたはベクターを含有する非ヒト哺乳類も提供す
る。
対象を免疫化するため、組成物は、非経口で、通常は、適切なビヒクルに入れられて筋
肉内または皮下注射により、投与される。しかしながら、他の投与様式、例えば、経口、
鼻腔内、または皮内送達も、許容される。
ワクチン配合物は、ビヒクル中に有効量の活性成分を含有することになり、有効量は、
当業者により容易に決定される。活性成分は、典型的には、組成物の約１％〜約９５％（
ｗ／ｗ）の範囲であるが、適切であれば、それより多いまたは少ない場合がある。投与さ
れることになる量は、ワクチン接種が検討される動物またはヒト対象の年齢、体重、及び
健康状態などの要因に依存する。この量はまた、動物の免疫系の抗体合成能力、及び所望
の保護度合いにも依存する。有効投薬量は、用量反応曲線を確立する常用試験を通じて、
当業者により容易に確立することができる。対象は、バイオフィルムペプチドまたはその
断片を、単回または複数回用量で投与されることにより、免疫化される。複数回用量は、
関心対象の細菌に対して免疫状態を維持するために必要とされるとおりに投与することが
できる。
鼻腔内配合物は、鼻腔粘膜に刺激をもたらすこともなく、繊毛機能を明らかに妨害する
こともないビヒクルを含むことができる。希釈剤、例えば、水、生理食塩水、または他の
既知の物質を、本発明の対象物とともに使用することができる。経鼻配合物は、保存剤も
含有することができ、そのような保存剤として、クロロブタノール及び塩化ベンザルコニ
ウムがあるが、これらに限定されない。界面活性剤は、鼻腔粘膜による対象タンパク質の
吸収を向上させるために存在することができる。
経口液状製剤は、例えば、水性もしくは油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、または
エリキシル剤の形状であることが可能であり、あるいは乾燥して錠剤形で、または使用前
に水もしくは他の適切なビヒクルで再構築する用の製品として存在することが可能である
。そのような液状製剤は、従来の添加剤、例えば、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（
食用油を含む場合がある）、または保存剤を含有することができる。
ワクチンを製造するため、精製組成物を、単離、凍結乾燥、及び安定化することができ
る。次いで、組成物を適切な濃度に調整し、任意選択で、適切なワクチンアジュバントと
組み合わせ、使用のためにパッケージ化することができる。
アジュバント
「アジュバント」とは、体液性及び／または細胞性免疫応答を非特異的に刺激する任意
の分子または化合物である。これらは、抗原の存在下でのみ免疫応答をもたらすので、非
特異的であると見なされる。アジュバントは、使用されることになる抗原の用量を非常に
少なくすることができ、可溶性抗原に対して強力な抗体反応を誘導するために不可欠であ
る。例えば、治療薬をアジュバントと併用して投与する場合、治療薬は、アジュバントの
前、後、及び／またはこれと同時に投与することができる。アジュバントは、当該分野で
既知であり、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、Ｐｏｌｙ：ＩＣＬＣ、及びイミキモドを挙げる
ことができるが、これらに限定されない。
腫瘍ライセートの作製方法
腫瘍ライセートは、治療しようとする腫瘍の試料を対象から取り出すことにより作製さ
れる。次いで、腫瘍細胞を溶解させる。有効な腫瘍ライセートの作製方法として、凍結融
解法、超音波処理、マイクロ波、煮沸、高温、界面活性剤または化学物質を利用した細胞
溶解、電気または電流を利用した溶解、及び他の物理的方法、例えば極度の力（ｅｘｔｒ
ｅｍｅ ｆｏｒｃｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
神経膠腫を治療しようとする場合などある特定の実施形態において、神経膠腫特異的受
容体であるＥＧＦ受容体ＶＩＩＩ変異体及びＩＬ−１３受容体アルファ−２（またはこれ
らのタンパク質をコードする発現ベクター）を、腫瘍ライセートに加えることができる。
配合物及び投与方法
本発明のワクチン及び組成物は、医薬組成物として配合することができ、選択された投
与経路、すなわち、経口経路、鼻腔内経路、皮内もしくは非経口経路、静脈内経路、筋肉
内経路、外用経路、または皮下経路に適合した様々な形状で、ヒト患者などの哺乳類宿主
に投与することができる。
すなわち、本化合物は、例えば、経口で、不活性希釈剤または吸収可能な食用キャリア
など薬学上許容されるビヒクルと併用して、全身投与することができる。これらは、硬ま
たは軟外皮ゼラチンカプセルに封入することができ、圧縮して錠剤にすることができ、ま
たは患者の食事の食物に直接組み込むことができる。治療目的の経口投与の場合、活性化
合物は、１種または複数の賦形剤と組み合わせることができ、体内取り込み可能な錠剤、
頬側錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハ剤など
の形状で使用することができる。そのような組成物及び製剤は、活性化合物を少なくとも
０．１％含有していなければならない。組成物及び製剤のパーセンテージは、当然ながら
、変わる可能性があり、都合のよいことに、所定の単位剤形の重量の約２〜約６０％が可
能である。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、有効な投薬レベルが得
られる様になっている。
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、以下も含有することができる：結合剤、
例えば、トラガカント・ゴム、アラビアゴム、コーンデンプン、またはゼラチンなど；賦
形剤、例えば、リン酸二カルシウムなど；崩壊剤、例えば、コーンデンプン、ジャガイモ
デンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなど；及び、甘
味剤、例えば、スクロース、フルクトース、ラクトース、またはアスパルテームなど、あ
るいは香味剤、例えば、ペパーミント、冬緑油、またはチェリー香味剤などを添加するこ
とができる。単位剤形がカプセル剤の場合、これは、上記の種類の材料の他に、液状キャ
リア、例えば植物油またはポリエチレングリコールなどを含有することができる。他にも
様々な材料が、被覆剤として、またはそれ以外で固形単位剤形の物理的形状を修飾するた
めに存在することができる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、ゼラチン、ロウ
、セラック、または糖などで被覆することができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、
活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存剤としてメチル及びプロ
ピルパラベン、色素、及び香味剤、例えば、チェリーまたはオレンジ香味剤を含有するこ
とができる。当然ながら、どの単位剤形でもその調製に使用される材料はどれでも、薬学
上許容され、かつ使用される量で実質的に無毒のものでなくてはならない。また、活性化
合物は、徐放性製剤及び装置に組み込むことができる。
活性化合物は、点滴または注射により、静脈内または腹腔内投与することもできる。活
性化合物またはその塩の液剤を水で調製し、任意選択で、無毒の界面活性剤と混合するこ
とができる。分散剤も、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、トリアセチン、及
びそれらの混合物に加えることで、または油類に加えることで、調製することができる。
貯蔵及び使用の通常条件下、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有す
る。
注射または点滴に適した医薬剤形として、滅菌水性液剤もしくは分散剤、あるいは滅菌
注射または点滴用液剤または分散剤の即時調製に適応した活性成分含有滅菌粉末剤を挙げ
ることができ、これらは任意選択でリポソームに封入されている。全ての場合において、
最終的な剤形は、滅菌されており、液状で、かつ製造及び貯蔵条件下で安定でなければな
らない。液状キャリアまたはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば
、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、植物油、
無毒グリセリルエステル、及びそれらの適切な混合物を含む、溶媒または液状分散媒体が
可能である。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散剤の場合は必要と
される粒子径の維持により、または界面活性剤の使用により維持することができる。微生
物の活動の防止は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール
、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合
、等張化剤、例えば、糖類、緩衝剤、または塩化ナトリウムなどを含むことが好ましいと
思われる。注射用組成物の長期吸収は、組成物に、吸収を遅らせる作用剤、例えば、モノ
ステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより、もたらすことができる。
滅菌注射用液剤は、適切な溶媒に、活性化合物を必要な量で、必要に合わせて上記に列
挙した様々な他の成分とともに組み込み、続いて滅菌濾過することにより、調製される。
滅菌注射用液剤を調製するための滅菌粉末剤の場合、好適な調製方法は、真空乾燥技法及
び凍結乾燥技法であり、これらの技法は、活性成分＋乾燥前の滅菌濾過溶液に存在した任
意の所望の追加成分の粉末をもたらす。外用投与の場合、本化合物は、純粋な形状で、す
なわち、それらが液体の場合、塗布することができる。しかしながら、本化合物を、皮膚
科学的に許容されるキャリアと組み合わせて、組成物または配合物として皮膚に投与する
ことが概して望ましく、キャリアは、固形の場合も液状の場合もある。
有用な固形キャリアとして、細かく粉砕された固体、例えば、タルク、粘土、微結晶性
セルロース、シリカ、アルミナなどが挙げられる。有用な液状キャリアとして、本化合物
が、任意選択で無毒界面活性剤の助けを借りて、有効レベルで溶解または分散することが
できる、水、アルコール、またはグリコール、あるいは水−アルコール／グリコールブレ
ンドが挙げられる。香料または抗菌剤などの追加成分は、所定用途のために性質を最適化
するのに加えることができる。得られる液状組成物は、吸収パッドから施す、絆創膏もし
くは他の包帯を含浸させるのに使用する、またはポンプ型もしくはエアロゾルスプレーで
幹部に噴射することができる。
増粘剤、例えば、合成重合体、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、改変
セルロース、または改変無機材料も、液状キャリアと一緒に用いて、使用者の皮膚に直接
塗布するための展着可能なペースト剤、ゲル剤、軟膏、石鹸などを形成することができる
。
本発明の化合物を皮膚に送達するのに使用可能な有用な皮膚科組成物の例は、当該分野
で既知である；例えば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒ
ｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５
７号）、及びＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照。
本発明の化合物の有用な投薬量は、それらの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、及び動物モデル
でのｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動
物での有効投薬量からヒトの有効投薬量を外挿する方法は、当該分野で既知である；例え
ば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照。
一般に、液状組成物、例えばローション剤中の本発明の化合物（単数または複数）の濃
度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％となる。半固形または固
形組成物、例えばゲル剤または粉末剤など中の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは
約０．５〜２．５重量％となる。
治療で使用するのに必要とされる化合物またはその活性な塩もしくは誘導体の量は、選
択された特定の塩によってだけでなく、投与経路、治療される症状の性質、ならびに患者
の年齢及び状態によっても変わることになり、最終的には、担当医師または臨床医の判断
によることになる。
しかしながら、一般に、適切な用量は、１日あたり体重１ｋｇあたりで、約０．５〜約
１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１０〜約７５ｍｇ／ｋｇ、例えば１日あたりレシピエント
の体重１キログラムあたりで、３〜約５０ｍｇの範囲、好ましくは６〜９０ｍｇ／ｋｇ／
日の範囲、特に好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲になる。
化合物は、単位剤形で都合よく投与される；例えば、単位剤形は、１単位あたり活性成
分を５〜１０００ｍｇ、都合よくは１０〜７５０ｍｇ、特に都合よくは、５０〜５００ｍ
ｇ含有する。
理想的には、活性成分は、活性化合物のピーク血漿濃度が約０．５〜約７５μＭ、好ま
しくは、約１〜５０μＭ、特に好ましくは、約２〜約３０μＭとなるように投与されるべ
きである。これは、例えば、活性成分の０．０５〜５％溶液を、任意選択で生理食塩水を
溶媒として静脈内注射することにより、または活性成分約１〜１００ｍｇを含有するボー
ラスとして経口投与することにより、達成することができる。活性成分（複数可）を、約
０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間で提供する連続点滴により、または約０．４〜１５ｍ
ｇ／ｋｇ含有する間欠的点滴により、望ましい血中レベルを維持することができる。
所望の用量は、都合よく、単回用量中に存在する場合も、適切な間隔で投与される複数
回用量として存在する場合もあり、複数回用量は、例えば、１日あたり、２回、３回、４
回、またはそれより多いサブ用量である。サブ用量自身、さらに分割することができ、例
えば、複数の別個のゆるく間を置いた投与に分けられる；例えば、吸入器からの複数回の
吸入、または目に複数回点眼することなどである。
ある特定の実施形態において、本発明のワクチンは、対象中の腫瘍の大きさを、少なく
とも約１０％〜１００％（腫瘍体積）縮小する。
本発明の核酸分子
「単離された及び／または精製された」という用語は、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ分子を、配列決定、複製、及び／または発現させることができるように、それらを、
その自然細胞環境から、及び核酸またはポリペプチドなど細胞の他の成分との関連から、
ｉｎ ｖｉｔｒｏで単離することを示す。例えば、「単離された核酸」は、転写されてペ
プチドに翻訳される１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、または２０未満の連
続ヌクレオチドを含有するＤＮＡ分子の場合がある。そのようなペプチドは、ＣＤ２００
に対する競合的阻害剤の場合があり、ＣＤ２００Ｒに結合する場合がある。すなわち、Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡは、そのＲＮＡまたはＤＮＡの天然源中でそれらが通常関連している少
なくとも１種の混入核酸を含まず、任意の他の哺乳類ＲＮＡまたはＤＮＡを好ましくは実
質的に含まないという点で、「単離されている」。「通常関連している少なくとも１種の
混入核酸を含まない」という語句は、核酸が、その核酸源または天然細胞中に再導入され
ているが、その染色体上の位置は異なっているか、そうでなければ、例えば、ベクターま
たはプラスミド中で、源細胞中では通常見つかることのない核酸配列と隣接している場合
を含む。
本明細書中使用される場合、「組換え核酸」、例えば、「組換えＤＮＡ配列またはセグ
メント」という用語は、任意の適切な細胞源に由来するまたは細胞源から単離された核酸
、例えば、ＤＮＡであって、その配列が天然起源ではない、または天然起源配列に相当す
るが、外来ＤＮＡで形質転換されたことのないゲノム中でその配列が位置すると思われる
とおりに位置していないように、単離後にｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に改変されている、
核酸、例えば、ＤＮＡを示す。ＤＮＡ源に「由来する」予め選択されたＤＮＡの例として
、所定の生体内で有用な断片として同定されるＤＮＡ配列が考えられ、この配列は、その
後、本質的に純粋な形で化学合成される。ＤＮＡ源から「単離された」そのようなＤＮＡ
の例として、本発明で使用するため、遺伝子工学の方法でさらに操作する、例えば、増幅
することができるように、化学的手段により、例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用に
よりその源から切り出されたまたは取り出された有用なＤＮＡ配列が考えられる。
すなわち、制限消化物から、所定のＤＮＡ断片を回収または単離するのに、消化物をポ
リアクリルアミドまたはアガロースゲル上で電気泳動により分離させること、フラグメン
トの移動度と分子量既知のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度を比較することにより関
心対象のフラグメントを同定すること、所望のフラグメントを含有するゲル切片を取り出
すこと、及びゲルとＤＮＡを分離すること、を採用することができる。したがって、「組
換えＤＮＡ」には、完全合成ＤＮＡ配列、半合成ＤＮＡ配列、生物学的源から単離された
ＤＮＡ配列、及びＲＮＡに由来するＤＮＡ配列、ならびにそれらの混合物が含まれる。
塩基置換を有する核酸分子（すなわち、変異体）は、当該分野で既知の様々な方法によ
り調製することができる。そうした方法として、天然源からの単離（天然起源配列変異体
の場合）、あるいは核酸分子の以前に調製された変異体または非変異型の、オリゴヌクレ
オチド介在型（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発が
挙げられるが、これらに限定されない。
オリゴヌクレオチド介在型変異誘発は、置換変異体を調製する方法である。この技法は
、Ａｄｅｌｍａｎら（１９８３）により記載されたとして、当該分野で知られている。簡
単に述べると、本明細書中記載されるペプチドをコードする核酸は、所望の変異をコード
するオリゴヌクレオチドをＤＮＡテンプレートとハイブリダイズさせることにより、改変
することができ、テンプレートは、非改変のすなわち天然遺伝子配列を含有する一本鎖型
プラスミドまたはバクテリオファージである。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて、テンプレートの第二の完全相補鎖を合成し、そうすると、合成された鎖
は、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込むことになり、ペプチドをコードする核酸に
おいて、選択された改変をコードするようになる。一般に、長さが少なくとも２５ヌクレ
オチドあるオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、変異をコー
ドするヌクレオチド（複数可）のいずれかの側においてテンプレートと完全相補性である
１２〜１５のヌクレオチドを有することになる。これにより、オリゴヌクレオチドが一本
鎖ＤＮＡテンプレート分子と適切にハイブリダイズすることを確実にする。オリゴヌクレ
オチドは、当該分野で既知の技法を用いて容易に合成される。
ＤＮＡテンプレートは、バクテリオファージＭ１３ベクターのいずれか（市販されてい
るＭ１３ｍｐ１８ベクター及びＭ１３ｍｐ１９ベクターが適切である）に由来するベクタ
ー、または一本鎖ファージ複製起点を含有するベクターにより作製することができる。す
なわち、変異させようとするＤＮＡを、これらのベクターの１種に挿入して、一本鎖テン
プレートを作製することができる。一本鎖テンプレートの作製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａ
ｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ２００１の第３章に記載されている。あるいは、一本鎖ＤＮＡ
テンプレートは、標準技法を用いて、二本鎖プラスミド（または他の）ＤＮＡを変性させ
ることにより、作製することができる。
天然ＤＮＡ配列を改変する場合（例えば、アミノ酸配列変異体を生成させるため）、オ
リゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、一本鎖テンプレートとハ
イブリダイズさせる。次いで、ＤＮＡ重合酵素、通常はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎ
ｏｗ断片を加えて、合成用プライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いて、テンプレート
の相補鎖を合成する。こうして、ＤＮＡの一方の鎖は、ＤＮＡの変異型をコードし、他方
の鎖（元来のテンプレート）は、ＤＮＡの天然、非改変配列をコードするように、ヘテロ
二本鎖分子を形成させる。次いで、このヘテロ二本鎖分子で、適切な宿主細胞、通常はＥ
．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１などの原核生物を形質転換する。細胞を成長させた後、それらを
アガロースプレートに播種し、３２−リン酸基で放射標識したオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いてスクリーニングして、変異ＤＮＡを含有する細菌コロニーを同定する。次い
で、変異した領域を取り出し、適切なベクター、通常は適切な宿主の形質転換に典型的に
採用される型の発現ベクターに入れる。
すぐ上で記載した方法は、ホモ二本鎖分子が作製されるように改変することができ、そ
の場合、プラスミドの鎖は両方とも、変異（複数可）を含有する。改変は、以下のとおり
である：一本鎖オリゴヌクレオチドを、アニールして、上記のとおりの一本鎖テンプレー
トにする。３種のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デ
オキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物を
、ｄＣＴＰ−（＊Ｓ）と称する改変チオデオキシリボシトシン（これは、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）と混合する。この混合物を、テンプレート−
オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物に加えると、変異
した塩基以外はテンプレートと同一であるＤＮＡ鎖が生成する。また、この新たなＤＮＡ
鎖は、ｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（＊Ｓ）を含有することになり、これは、ＤＮＡ鎖
を、制限エンドヌクレアーゼ消化から保護する働きをする。
二本鎖を形成したヘテロ二本鎖のテンプレート鎖に、適切な制限酵素で切れ目を入れた
後、テンプレート鎖は、ＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは別の適切なヌクレアーゼを用い
て、変異誘発しようとする部位（複数可）を含有する領域を通り越して、消化することが
できる。次いで、反応を停止させると、部分的に一本鎖となった分子だけが残る。次いで
、４種のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、ＡＴＰ、及びＤＮＡリガーゼ全て
の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、完全二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖を形成させる。
次いで、このホモ二本鎖分子で、適切な宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１など
を形質転換することができる。
本発明の発現カセット
発現カセットを調製するためには、組換えＤＮＡ配列またはセグメントは、環状または
直鎖の、二本鎖または一本鎖であることが可能である。一般に、ＤＮＡ配列またはセグメ
ントは、キメラＤＮＡ、例えば、プラスミドＤＮＡなど、または得られる形質転換細胞に
存在する組換えＤＮＡの発現を促進する調節配列と隣接する翻訳領域も含有することがで
きるベクターの形をしている。
「キメラ」ベクターまたは発現カセットは、本明細書中使用される場合、少なくとも２
種の異なる種由来の核酸配列を含む、あるいは、同一種由来の核酸配列を有するが、その
配列はその種の「天然」または野生型では生じない様式で連結または関連している、ベク
ターまたはカセットを意味する。
ＲＮＡ転写物用転写単位として働く組換えＤＮＡ配列、またはその一部分とは別に、組
換えＤＮＡのある一部分は、転写されず、調節または構造的機能を務める場合がある。例
えば、組換えＤＮＡは、哺乳類細胞で活性なプロモーターを有する場合がある。
宿主細胞で機能する他の配列要素、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル
化配列なども、組換えＤＮＡの一部である場合がある。そのような配列要素は、ＤＮＡの
機能に必要な場合もそうでない場合もあるが、転写、ＲＮＡ安定性などに影響を及ぼすこ
とにより、ＤＮＡの発現の改善をもたらす場合がある。そのような配列要素は、希望に応
じてＤＮＡに含ませることができ、それにより細胞で最適な発現をもたらす。
調節配列とは、特定宿主生体において機能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤ
ＮＡ配列である。原核細胞に適切な調節配列は、例えば、プロモーター、及び任意選択で
オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポ
リアデニル化信号、及びエンハンサーを利用することが知られている。
機能的に連結された核酸とは、別の核酸配列と機能的関連性がある核酸である。例えば
、プロモーターまたはエンハンサーは、それらがコード配列の転写に影響を及ぼすならば
、その配列と機能的に連結されている；あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を
促進するように配置されているならば、コード配列と機能的に連結されている。一般に、
機能的に連結されたＤＮＡ配列とは、途切れなく連結されたＤＮＡ配列である。しかしな
がら、エンハンサーは、途切れなく続いている必要はない。連結は、都合のよい制限部位
で連結することにより達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の慣例に従っ
て合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。
細胞に導入されることになる組換えＤＮＡは、ウイルスベクターを通じて形質移入また
は感染した細胞を探す際に細胞集団から発現細胞を同定及び選択しやすくするため、選択
可能な標識遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれか、あるいは両方を含有することがで
きる。他の実施形態において、選択可能な標識は、ＤＮＡの別個のピースに保持されてい
て、同時形質移入手順で使用される場合がある。選択可能な標識遺伝子及びレポーター遺
伝子のどちらも、適切な制御配列と隣接していて、宿主細胞での発現を可能にすることが
できる。有用な選択可能な標識は、当該分野で既知であり、例えば、ｎｅｏなどの抗生物
質耐性遺伝子などが挙げられる。
レポーター遺伝子は、形質移入された可能性のある細胞を同定するため、及び制御配列
の機能性を評価するために使用される。容易に評価可能なタンパク質をコードするレポー
ター遺伝子は、当該分野で周知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生体
または組織中に存在しないあるいはそれらにより発現せず、ある種の容易に検出可能な性
質、例えば、酵素活性により発現が顕在化するタンパク質をコードする遺伝子である。例
えば、レポーター遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）及びホタルの１種Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａ
ｌｉｓ由来のルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡが
レシピエント細胞に導入された後、適切な時点でアッセイされる。
標的細胞に形質移入する組換えＤＮＡを構築する一般方法は、当業者に周知であり、同
じ組成物及び構築方法を、本明細書中有用なＤＮＡの作製に利用することができる。例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（既出）は、適切な構築方法を提供する
。
組換えＤＮＡは、特定細胞への導入に有用な任意の手順により、例えば、物理的方法ま
たは生物学的方法により、ペプチド（例えば、ＣＤ２００阻害剤）をコードするＤＮＡで
構成された発現ベクターで形質移入することにより、宿主細胞、例えば、哺乳類細胞、細
菌細胞、酵母菌細胞、または昆虫細胞に容易に導入することができ、その結果、組換えＤ
ＮＡを有する細胞が得られ、この組換えＤＮＡは、本発明のＤＮＡ分子または配列が宿主
細胞により発現するように、細胞のゲノムに安定して組み込まれている、またはエピソー
ム配列要素として存在する。好ましくは、ＤＮＡは、ベクターを介して宿主細胞に導入さ
れる。宿主細胞は、好ましくは、真核生物起源のもの、例えば、植物、哺乳類、昆虫、酵
母菌、または真菌源のものであるが、非真核生物起源の宿主細胞も採用することができる
。
予め選択されたＤＮＡを宿主細胞に導入する物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿
法、リポフェクション法、微粒子銃、微量注入法、電気穿孔法などが挙げられる。関心対
象のＤＮＡを宿主細胞に導入する生物学的方法として、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスベクタ
ーの使用が挙げられる。哺乳類遺伝子治療の場合、本明細書中以下で記載するとおり、コ
ピー遺伝子を宿主ゲノムに導入する効率的手段を使用することが望ましい。ウイルスベク
ター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞に挿入
するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、ポックスウ
イルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス、などに
由来するものが可能である。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８
５，３６２号を参照。
上記で説明したとおり、「形質移入された」または「形質導入された」宿主細胞もしく
は細胞株とは、少なくとも１つの異種または組換え核酸配列の存在により改変されている
または増強されているゲノムを有するものである。本発明の宿主細胞は、典型的には、プ
ラスミド発現ベクター中またはウイルス発現ベクター中のＤＮＡ配列で、あるいは単離さ
れた直鎖のＤＮＡ配列で形質移入することにより作製される。形質移入されたＤＮＡは、
染色体に組み込まれた組換えＤＮＡ配列を有するようになることができ、組換えＤＮＡ配
列は、ペプチド（例えば、ＣＤ２００阻害剤）をコードする配列で構成されている。
宿主細胞に組換えＤＮＡ配列が存在することを確認するため、様々なアッセイを行うこ
とができる。そのようなアッセイとして、例えば、当業者に周知の「分子生物学」アッセ
イ、例えば、サザンブロット法及びノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＰＣＲ
など；「生化学」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット
法）による、または本発明の範囲内に含まれる作用剤を同定するための本明細書中記載さ
れるアッセイによる、例えば、特定ペプチドの有無の検出、が挙げられる。
導入された組換えＤＮＡセグメントから産生されたＲＮＡを検出及び定量するため、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲを利用することができる。この用途のＰＣＲでは、逆転写酵素などの酵素を用
いてＲＮＡからＤＮＡへと逆転写することが最初に必要であり、次いで従来のＰＣＲ技法
を用いてＤＮＡを増幅する。ほとんどの場合、ＰＣＲ技法は、有用とはいっても、ＲＮＡ
産物の完全性を示さない。ＲＮＡ産物の性質に関するさらなる情報は、ノーザンブロット
法により得ることができる。この技法は、ＲＮＡ種の存在を実証し、そのＲＮＡの完全性
について情報を与える。ＲＮＡ種の有無は、ドットまたはスロットブロットノーザンハイ
ブリダイゼーションを用いて判定することもできる。これらの技法は、ノーザンブロット
法の改変版であり、ＲＮＡ種の有無を示すのみである。
サザンブロット法及びＰＣＲを用いて問題の組換えＤＮＡセグメントを検出することが
できるものの、それらの方法は、予め選択されたＤＮＡセグメントが発現されているかど
うかについて情報を提供しない。発現の評価は、導入された組換えＤＮＡ配列のペプチド
産物を具体的に同定することにより、または宿主細胞での導入された組換えＤＮＡセグメ
ントの発現によりもたらされた表現型の変化を評価することにより、行うことができる。
本発明は、哺乳類レシピエントで外来核酸材料を発現させるための細胞発現系を提供す
る。発現系は、「遺伝子修飾細胞」とも称するが、細胞及び外来核酸材料を発現させるた
めの発現ベクターを含む。遺伝子修飾細胞は、哺乳類レシピエントに投与するのに適して
おり、遺伝子修飾細胞は、レシピエントの内在細胞と置き換わる。すなわち、好適な遺伝
子修飾細胞は、非不死化かつ非腫瘍原性である。
１つの実施形態に従って、細胞は、形質移入されるか、その他の方法でｅｘ ｖｉｖｏ
で遺伝子修飾される。細胞は、哺乳類（好ましくはヒト）から単離され、治療薬をコード
する異種（例えば、組換え）遺伝子の発現用ベクターが核酸に導入され（すなわち、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで形質導入または形質移入される）、次いで、ｉｎ ｓｉｔｕで治療薬を送
達するために哺乳類レシピエントに投与される。哺乳類レシピエントは、ヒトの場合があ
り、修飾される細胞は、自己細胞である、すなわち、細胞は、哺乳類レシピエントから単
離される。
別の実施形態に従って、細胞は、形質移入または形質導入されるか、あるいはその他の
方法でｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子修飾される。哺乳類レシピエントの細胞を、治療薬をコー
ドする異種（例えば、組換え）遺伝子の発現用の外来核酸材料含有ベクターを用いて、ｉ
ｎ ｖｉｖｏで形質導入または形質移入し、治療薬をｉｎ ｓｉｔｕで送達する。
本明細書中使用される場合、「外来核酸材料」は、天然または合成いずれかである核酸
またはオリゴヌクレオチドで、細胞中で自然には見つからないもの；あるいは、細胞中で
自然に見つかる場合には、その元来の形または天然形から改変されているものを示す。す
なわち、「外来核酸材料」として、例えば、「異種遺伝子」（すなわち、同型の天然起源
細胞中で発現しないまたは発現しても生物学的に不十分なレベルであるタンパク質をコー
ドする遺伝子）へと転写することが可能な非天然起源核酸が挙げられる。例示として、ヒ
トエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードする合成または天然遺伝子は、ヒト腹膜中皮細胞
に関しては「外来核酸材料」と見なされるだろう。なぜなら、この細胞は、自然にはＥＰ
Ｏを発現しないからである。「外来核酸材料」のさらに別の例は、組換え遺伝子を作製す
るために遺伝子の一部のみを導入すること、例えば、調節可能なプロモーターと外来コー
ド配列とを相同組換えを介して組み合わせることなどである。
本発明の発現カセットを細胞に導入する方法
遺伝子治療に適した条件は、予防的プロセス、すなわち、疾患または望ましくない病的
状態を予防するためのプロセスの場合がある。すなわち、本発明は、ＣＤ２００阻害剤な
ど、予防機能を持つペプチド（すなわち、予防的作用剤）を、哺乳類レシピエントに送達
するシステムを包含する。
核酸材料（例えば、ＣＤ２００阻害剤ペプチドをコードする発現カセット）は、遺伝子
導入方法、例えば形質移入または形質導入などにより、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉ
ｖｏで、細胞に導入することができ、その結果、遺伝子修飾された細胞を得ることができ
る。種々の発現ベクター（すなわち、外来核酸を標的細胞に送達しやすくするビヒクル）
が当業者に既知である。
本明細書中使用される場合、「細胞の形質移入」は、添加されたＤＮＡの組み込みによ
り、細胞が新たな核酸材料を獲得することを示す。すなわち、形質移入は、物理的または
化学的方法を用いて核酸を細胞に挿入することを示す。複数の形質移入技法が、当業者に
既知であり、そのような技法として、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ−デキス
トラン、電気穿孔法、カチオン性リポソーム介在型形質移入、タングステン粒子利用微粒
子銃、及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈法が挙げられる。
対照的に、「細胞の形質導入」は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを用いて細胞に核酸を
移植するプロセスを示す。細胞に核酸を移植するためのＲＮＡウイルス（すなわち、レト
ロウイルス）は、本明細書中、形質導入キメラレトロウイルスと称する。レトロウイルス
に含まれている外来核酸材料は、形質導入された細胞のゲノムに組み込まれる。キメラＤ
ＮＡウイルス（例えば、治療薬をコードするｃＤＮＡを保有するアデノウイルス）で形質
導入された細胞は、細胞のゲノムに組み込まれた外来核酸材料を有するようになるのでは
なく、細胞内で染色体外に保持されている外来核酸材料を発現することができるようにな
る。
外来核酸材料は、ペプチドをコードする核酸を、転写を制御するためのプロモーターと
一緒に含むことができる。プロモーターは、特徴として、転写を開始するのに必要な特定
ヌクレオチド配列を有する。外来核酸材料は、さらに、所望の遺伝子転写活性を得るため
に必要な追加配列（すなわち、エンハンサー）を含む場合がある。この説明の目的に関し
て、「エンハンサー」は、単に、コード配列（ｃｉｓにある）と協力してプロモーターが
決定づける基礎転写レベルを変更する任意の非翻訳ＤＮＡ配列である。外来核酸材料は、
コード配列の転写が許容されるようにプロモーターとコード配列が機能的に連結されてい
るように、プロモーターのすぐ下流にある細胞ゲノムに導入される場合がある。発現ベク
ターは、挿入された外来遺伝子の転写を制御するため外来プロモーター配列要素を含むこ
とができる。そのような外来プロモーターとして、構成的プロモーター及び調節可能なプ
ロモーターの両方が挙げられる。
天然起源の構成的プロモーターは、必須細胞機能の発現を制御する。結果として、構成
的プロモーターの制御下にある核酸配列は、細胞増殖の全ての条件下で発現する。構成的
プロモーターとして、ある特定の構成的または「ハウスキーピング」機能をコードする以
下の遺伝子用プロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、
ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムタ
ーゼ、ベータ−アクチンプロモーター、及び当業者に既知の他の構成的プロモーター。ま
た、多くのウイルスプロモーターが、真核生物細胞で構成的に機能する。そのようなもの
として、とりわけ以下が挙げられる：ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター；モロニー白
血病ウイルス及び他のレトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）；ならびに単純ヘルペス
ウイルスのチミジンキナーゼプロモーター。
調節可能なプロモーターの制御下にある核酸配列は、誘導剤または抑制剤の存在下での
み、あるいは存在下で度合いを上下させて、発現する（例えば、メタロチオネインプロモ
ーターの制御下にある転写は、ある特定の金属イオンの存在下で大幅に増加する）。調節
可能なプロモーターは、それらの誘導因子が結合した場合に転写を刺激する応答配列要素
（ＲＥ）を含む。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸、環状ＡＭＰ、
ならびにテトラサイクリン及びドキシサイクリンのＲＥが存在する。調節可能な反応を得
る目的で、特定ＲＥを含有するプロモーターを選択することができ、場合によっては、Ｒ
Ｅ自身を、異なるプロモーターに結合させて、それによりコードされる核酸配列に調節性
能を付与することができる。すなわち、適切なプロモーター（構成的対調節可能なもの；
強いもの対弱いもの）を選択することにより、遺伝子修飾された細胞中の核酸配列の発現
の存在及びレベル両方を制御することが可能である。核酸配列が調節可能なプロモーター
の制御下にある場合、ｉｎ ｓｉｔｕでの治療薬の送達は、遺伝子修飾された細胞をｉｎ
ｓｉｔｕで、核酸配列の転写を可能にする条件に曝すことにより、例えば、作用剤の転
写を制御する調節可能なプロモーターの特定誘導剤を腹腔内注射することにより、引き起
こされる。例えば、遺伝子修飾された細胞中のメタロチオネインプロモーターの制御下に
ある核酸配列のｉｎ ｓｉｔｕ発現は、遺伝子修飾された細胞を、ｉｎ ｓｉｔｕで、適
切な（すなわち、誘導性）金属イオンを含有する溶液と接触させることにより、向上する
。
したがって、ｉｎ ｓｉｔｕで生成するペプチド（例えば、ＣＤ２００阻害剤）の量は
、核酸配列の転写を指示するために使用されるプロモーターの性質（すなわち、プロモー
ターが構成的であるか調節可能であるか、強いか弱いかなど）、及び細胞中にあるペプチ
ドをコードする外来核酸配列のコピー数といった因子を制御することにより調節される。
本発明の１つの実施形態において、発現カセットは、ペプチド（例えば、ＣＤ２００阻
害剤）をコードする核酸配列と機能的に連結しているｐｏｌ ＩＩプロモーターを含有す
ることができる。すなわち、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼ
ＩＩ依存性プロモーターは、関心対象のペプチドをコードするＲＮＡの転写を開始させる
。別の実施形態において、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、調節可能である。
ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、そのまま全体が使用される場合も、プロモーター配列の
一部または断片が使用される場合もあり、その場合、その部分は、プロモーター活性を維
持する。本明細書中説明されるとおり、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、当業者に既知であ
り、任意のタンパク質コード遺伝子、例えば、内因的に調節される遺伝子または構成的に
発現する遺伝子などのプロモーターが含まれる。例えば、細胞の生理学的事象、例えば、
熱ショック、酸素レベル、及び／または一酸化炭素レベル（例えば、低酸素による）など
により調節される遺伝子のプロモーターを、本発明の発現カセットに使用することができ
る。また、薬理作用剤、例えば、テトラサイクリン及びその誘導体など、ならびに重金属
イオン及びホルモンの存在により調節される任意の遺伝子のプロモーターを、本発明の発
現カセットに採用することができる。本発明の実施形態において、ｐｏｌ ＩＩプロモー
ターは、ＣＭＶプロモーターまたはＲＳＶプロモーターが可能である。別の実施形態にお
いて、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
上記で説明されるとおり、本発明のｐｏｌ ＩＩプロモーターは、コードセグメント及
び／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得ることが
できる場合、内因的に調節される遺伝子または配列と生来関連しているものが可能である
。発現カセットのｐｏｌ ＩＩプロモーターは、例えば、標的となる関心対象の遺伝子の
発現を駆動するｐｏｌ ＩＩプロモーターと同一であることが可能である。あるいは、ペ
プチドをコードする核酸配列を、組換えまたは異種ｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下に
置くことができ、この核酸配列は、標的となる遺伝子の自然環境とは通常関連しないプロ
モーターを参照する。そのようなプロモーターとして、任意の真核生物細胞から単離され
たプロモーター、ならびに「天然起源」ではないプロモーター、すなわち、異なる転写調
節領域の異なる配列要素、及び／または発現を改変する変異を含有するプロモーターが挙
げられる。プロモーターの核酸配列は、合成で作製する他に、本明細書中開示される組成
物に関連して組換えクローン複製及び／またはＰＣＲ（商標）をはじめとする核酸増幅技
法を用いて、作製することができる（米国特許第４，６８３，２０２号、同第５，９２８
，９０６号を参照、これらはそれぞれ、本明細書中参照として援用される）。
１つの実施形態において、発現用に選択された細胞型、小器官、及び生体中でＲＮＡの
発現を効果的に指示するｐｏｌ ＩＩプロモーターが採用されることになる。分子生物学
の当業者なら、一般的に、タンパク質発現用プロモーターの使用について知っており、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）を参照、これは本明細書
中参照として援用される。採用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性、及
び／または導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するのに適切な条件下で有
用なもの、例えば組換えタンパク質及び／またはペプチドの大規模製造に有利なものなど
が可能である。組織特異的プロモーターの独自性、ならびにそれらの活性を特性決定する
ためのアッセイは、当業者に周知である。
少なくとも１つのプロモーター及びペプチドをコードする少なくとも１つの異種核酸配
列の他に、発現ベクターは、発現ベクターで形質移入されたまたは形質導入された細胞を
選択しやすくするため、選択遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含むことができ
る。
細胞は、２つ以上の発現ベクターで形質移入することも可能であり、少なくとも１つの
ベクターは、ペプチド（複数可）をコードする核酸配列（複数可）を含有し、他方のベク
ターは、選択遺伝子を含有する。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子、及び
／またはシグナル配列の選択は、必要以上の実験を行うことなく当業者の通常の技術の範
囲内にあると見なされる。
以下の説明は、本発明の様々な有用性に関する。例えば、本発明は、本明細書中記載さ
れるペプチドの発現に適した発現系として有用性を有する。
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳類レシピエントの細胞を遺伝子修飾する方法も提供す
る。１つの実施形態に従って、本方法は、本明細書中記載されるペプチドの発現用の発現
ベクターを、例えば、哺乳類レシピエントに注射することにより、ベクターをｉｎ ｓｉ
ｔｕで哺乳類レシピエントの細胞に導入することを含む。
本発明の発現カセット用送達ビヒクル
化合物の組織への送達及び血液脳関門の通過は、化合物の大きさ及び生化学的性質によ
り制限される可能性がある。現在、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞への化合物の効率的送達は、
分子が小さい（通常、６００ダルトン未満）の場合に限り、達成可能である。癌治療のた
めの遺伝子導入は、組換えアデノウイルスベクターを用いて達成されてきた。
細胞で特定ペプチド（例えば、ＣＤ２００阻害剤）を発現させるための特定発現ベクタ
ーの選択及び最適化は、ペプチドをコードする核酸配列を、できる限り１つまたは複数の
適切な制御領域（例えば、プロモーター、挿入配列）とともに、得ること；ペプチドをコ
ードする核酸配列が挿入されたベクターを含むベクター構築物を調製すること；ベクター
構築物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養細胞に形質移入または形質導入すること；及びペ
プチドが培養細胞中に存在するかどうかを判定すること、により達成できる。
細胞遺伝子治療用ベクターとして、複製欠損ウイルス（以下で詳細に説明される）など
のウイルスが挙げられる。代表的なウイルスベクターは、ハーベイ肉腫ウイルス、ＲＯＵ
Ｓ肉腫ウイルス、（ＭＰＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス、及びＤＮＡウイルス（
例えば、アデノウイルス）に由来する。
複製欠損レトロウイルスは、全てのビリオンタンパク質の合成を指示することができる
が、感染性粒子を作ることができない。したがって、これらの遺伝子改変レトロウイルス
発現ベクターは、培養細胞で核酸配列を高効率的に形質導入するのに汎用性を有し、本発
明の方法で使用するのに特に有用である。そのようなレトロウイルスは、さらに、ｉｎ
ｖｉｖｏで細胞に核酸配列を効率的に形質導入するのに有用性を有する。レトロウイルス
は、核酸材料を細胞に移植するために盛んに使用されてきた。複製欠損レトロウイルスの
作製プロトコル（外来核酸材料をプラスミドに組み込む工程、パッケージング細胞株にプ
ラスミドで形質移入する工程、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生
工程、組織培養培地からウイルス粒子を収集する工程、及びウイルス粒子で標的細胞を感
染させる工程を含む）は、当該分野で周知である。
遺伝子治療にレトロウイルスを使用する利点は、ウイルスが、宿主細胞ゲノムにペプチ
ドをコードする核酸配列を挿入し、それによりペプチドをコードする核酸配列が、細胞が
分裂したときにその後代に受け継がれることが可能になるという点である。ＬＴＲ領域の
プロモーター配列は、様々な細胞型で、挿入されたコード配列の発現を向上させることが
できる。レトロウイルス発現ベクターの使用の欠点として、（１）挿入変異、すなわち、
ペプチドをコードする核酸配列が標的細胞ゲノム中の望ましくない位置に挿入されること
、これは、例えば、未制御の細胞増殖を招く、及び（２）ベクターに保有されたペプチド
をコードする核酸配列が標的ゲノムに組み込まれるようにするため、標的細胞増殖を必要
とすること、がある。
細胞の形質転換用発現ベクターとして有用な他のウイルス候補は、アデノウイルス、す
なわち二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスは、例えば、筋肉細胞及び内皮細胞
をはじめとする広範囲の細胞型で感染性である。
アデノウイルス（Ａｄ）は、３６ｋｂのゲノムを持つ二本鎖の直鎖ＤＮＡウイルスであ
る。アデノウイルスの複数の特長が、このウイルスを、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達の促進
など治療用途の導入遺伝子送達ビヒクルとして有用なものにしている。組換えアデノウイ
ルスベクターは、肺、脳、膵臓、胆嚢、及び肝臓をはじめとする様々な臓器の実質細胞に
効率的にｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子導入できることが示されている。このことが、これらのベ
クターを、嚢胞性線維症など遺伝性の遺伝病の治療方法に使用可能なものにしてきており
、ベクターは、標的臓器に送達することができる。また、アデノウイルスベクターの持つ
、ｉｎ ｓｉｔｕで腫瘍形質導入を達成する能力は、非播種性疾患のための様々な抗癌遺
伝子治療法の開発を可能にしてきた。これらの方法において、ベクター封じ込めには、腫
瘍細胞特異的形質導入が好ましい。
レトロウイルスと同様に、アデノウイルスゲノムも、遺伝子治療用発現ベクターとして
の使用に適応可能である、すなわち、ウイルス自身の産生を制御する遺伝情報を除去する
ことにより適応可能である。アデノウイルスは、染色体外様式で機能するため、組換えア
デノウイルスは、挿入変異の問題を理論的に有さない。
組換えアデノウイルスを作製するのに、複数のアプローチが、従来使用されてきた。１
つのアプローチは、関心対象の核酸配列を含有する制限エンドヌクレアーゼ断片を、アデ
ノウイルスゲノムの一部分に直接連結することを含む。あるいは、相同組換えの結果とし
て、関心対象の核酸配列を、欠損アデノウイルスに挿入することができる。所望の組換え
体は、相補細胞の菌叢に生成する個別のプラークをスクリーニングすることにより同定さ
れる。
大部分のアデノウイルスベクターは、アデノウイルス５型（Ａｄ５）骨格に基づいてお
り、その中で、関心対象の核酸配列を含有する発現カセットは、初期領域１（Ｅ１）また
は初期領域３（Ｅ３）の代わりに導入されている。Ｅ１が削除されてしまったウイルスは
、複製欠損であり、失われた遺伝子Ｅ１及びｐＩＸをトランスで供給するヒト相補細胞（
例えば、２９３細胞または９１１細胞）中で増殖する。
本発明の１つの実施形態において、ＣＮＳ癌腫瘍（例えば、神経膠腫）中でペプチド（
例えば、ＣＤ２００阻害剤）を生成させることが望まれる。この用途に適切なベクターは
、ＦＩＶベクターまたはＡＡＶベクターである。例えば、ＡＡＶ５を使用することができ
る。ポリオウイルスまたはＨＳＶベクターを利用することもできる。
組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びネコ免疫不全ウイルス（
ＦＩＶ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を送達するのに使用すること
ができる。それぞれが、それぞれの長所及び短所を有する。アデノウイルスは、巨大なゲ
ノム（３６ｋｂ）を持つ二本鎖ＤＮＡウイルスであり、発現カセットを異なる領域に収容
するように操作されてきた。
アデノ随伴ウイルスは、Ａｄと同様に、カプシド形成したゲノムを有するが、大きさ及
びパッケージング容量は、それより小さい（約３０ｎｍ対約１００ｎｍ；パッケージング
限度は、約４．５ｋｂ）。ＡＡＶは、＋鎖または−鎖の一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。
８種の血清型のＡＡＶ（１〜８）が、詳しく研究されてきており、そのうち３種は、脳で
評価されてきている。本出願にとって重要な考慮事項は、ＡＡＶ５が、線条体及び皮質ニ
ューロンに形質導入し、どのような既知の病理とも関連しないことである。
ＦＩＶは、ヒトにおいて強力な安全特性を持つエンベロープ型ウイルスである；個人が
、ＦＩＶ感染猫に噛まれたまたは引っ掻かれたとしても、抗体陽転せず、これまでどのよ
うな疾患兆候も発生が記録されていない。ＡＡＶと同様に、ＦＩＶは、マウス及び非ヒト
霊長類ニューロンにおいて持続性トランス遺伝子発現を提供し、形質導入は、シュードタ
イピング、すなわちウイルスの天然エンベロープを別のウイルスのエンベロープに交換す
るプロセスにより、異なる細胞型に向かわせることができる。
すなわち、当業者には当然ながら、外来核酸材料を細胞に移植するために種々の適切な
ウイルス発現ベクターが利用可能である。遺伝子治療に適した特定症状用の治療薬を発現
させるのに適切な発現ベクターの選択、及び選択された発現ベクターを細胞に挿入するた
めの条件の最適化は、過剰な実験を必要とせず、当業者の通常の技術の範囲内にある。
別の実施形態において、発現ベクターは、プラスミドの形状をしており、これは、物理
的方法（例えば、微量注入、電気穿孔法、スクレープローディング法（ｓｃｒａｐｅ ｌ
ｏａｄｉｎｇ）、微粒子銃など）など様々な方法のうちの１つにより、あるいは化学複合
体としての細胞取り込み（例えば、カルシウムまたはストロンチウム共沈法、脂質との複
合体形成、リガンドとの複合体形成）により、標的細胞に移植される。Ｌｉｐｏｆｅｃｔ
ｉｎ（商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）及びＴｒａｎ
ｓｆｅｃｔａｍ（商標）（ＰｒｏＭｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）をはじめとする
複数の市販品が、カチオン性リポソーム複合体形成に利用可能である。しかしながら、こ
れらの方法による形質移入の効率は、標的細胞の性質に大きく左右され、従って、上記手
順を用いた細胞への核酸の最適な形質移入の条件を最適化しなければならない。そのよう
な最適化は、過剰な実験をせず、当業者の通常の技術の範囲内にある。
定義
「結合した」は、結合または付着を示し、この結合または付着は、例えば化学的なカッ
プリングによる共有結合の場合も、非共有結合、例えば、イオン性相互作用、疎水的相互
作用、水素結合などの場合もある。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエ
ステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素硫黄結合、炭素リン結合などが可能である。「
結合した」という用語は、「共役した」、「カップリングした」、「融合した」、及び「
付着した」などの用語よりも広義であり、これらを包含する。
本発明は、単離されたまたは実質的に精製されたタンパク質（またはペプチド）組成物
を包含する。本発明の文脈において、「単離された」または「精製された」ポリペプチド
とは、そのポリペプチドの生来環境から分離されて存在し、したがって、自然の産物では
ないポリペプチドである。ポリペプチドは、精製された形状で存在する場合もあるし、非
天然環境中、例えば、遺伝子導入宿主細胞中に存在する場合もある。例えば、「単離され
た」または「精製された」タンパク質、あるいはその生物学的に活性な一部分は、組換え
技法により産生された場合には他の細胞材料または培養培地を実質的に含まない、あるい
は化学合成された場合には前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まない。細胞材
料を実質的に含まないタンパク質として、混入タンパク質が約３０％、２０％、１０％、
５％、（乾燥重量基準）未満である、タンパク質またはポリペプチド調製物が挙げられる
。本発明のタンパク質、またはその生物学的に活性な一部分が、遺伝子組換えで産生され
る場合、好ましくは、培養培地は、前駆化学物質または目的タンパク質ではない化学物質
の割合が、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量基準）未満である。開示さ
れるタンパク質の断片及び変異体、またはそれらによりコードされる部分長タンパク質も
、本発明に包含される。「断片」または「一部分」は、ポリペプチドまたはタンパク質の
全長または全長未満のアミノ酸配列を意味する。
「天然起源の」は、自然中に見出すことができ、人為的に作製されたものと区別できる
対象物を記載するのに使用される。例えば、生体（ウイルスを含む）中に存在するタンパ
ク質またはヌクレオチド配列は、これが自然中の源から単離可能であり、かつ研究所で人
により意図的に改変されていないならば、天然起源のものである。
分子の「変異体」とは、天然分子の配列と実質的に類似した配列である。ヌクレオチド
配列の場合、変異体は、遺伝暗号の縮重故に、天然タンパク質のアミノ酸配列と同一のも
のをコードする配列を含む。こうしたものなど天然起源のアレル変異体は、周知の分子生
物学技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技法
を用いて同定することができる。変異型ヌクレオチド配列には、天然タンパク質をコード
するヌクレオチド配列を合成したもの、例えば、部位特異的変異誘発により作製したもの
など、ならびにアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものも含まれる。一般に
、本発明のヌクレオチド配列変異体は、少なくとも１つの実施形態において、天然（内因
性）ヌクレオチド配列と４０％、５０％、６０％、〜７０％、例えば、７１％、７２％、
７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、〜７９％、一般に少なくとも８０％
、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９
％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、〜９８％の、
配列同一性を有することになる。
「野生型」は、どのような既知の変異もない、自然中で見つかる正常な遺伝子、または
生体を示す。
「機能的に連結された」は、一方の機能が他方により影響されるような分子の関連性を
示す。例えば、機能的に連結された核酸は、一方の機能が他方により影響されるような、
例えば、機能的に連結されたと記載される要素がそれらの通常機能を実行するように編成
されている配列要素の並び方をした、１つの核酸断片上の核酸配列の関連性を示す。例え
ば、調節ＤＮＡ配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現に影響を
及ぼす（すなわち、コード配列または機能性ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）
ように、２つの配列が位置するならば、調節ＤＮＡ配列は、コードＤＮＡ配列と「機能的
に連結された」または「関連している」と言われる。コード配列は、センス方向またはア
ンチセンス方向で、制御配列と機能的に連結することができる。コード配列と機能的に連
結された調節配列要素は、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる。調節配列要素
は、コード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と途切れなく隣接して
いる必要はない。すなわち、例えば、非翻訳だけど転写される配列が、プロモーターとコ
ード配列の間に存在することが可能であり、それでもプロモーターは、コード配列と「機
能的に連結された」とみなすことができる。
「実質的同一性」という用語は、ペプチドの文脈において、ペプチドが、指定された比
較窓にわたり、参照配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％
、７６％、７７％、７８％、または７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、
８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、少なくとも９０％、９１％、９２％、
９３％、または９４％、または９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、配列同
一性を持つ配列を含むことを示す。最適配列比較は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕ
ｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）の相同性配列比
較アルゴリズムを用いて行われる。２つのペプチド配列が実質的に同一であることの指標
は、一方のペプチドが、他方のペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に反応性であ
るということである。すなわち、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異な
る場合に、１つのペプチドは、もう１つのペプチドと実質的に同一である。
配列比較の場合、典型的には、１つの配列が、参照配列として働き、それに対して、試
験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピ
ューターに入力し、必要であればサブシーケンス座標を指定し、そして配列アルゴリズム
プログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプ
ログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パ
ーセントを計算する。
「アミノ酸」という用語は、Ｄ型またはＬ型の天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ
、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶ
ａｌ）、ならびに非天然アミノ酸（例えば、デヒドロアラニン、ホモセリン、ホスホセリ
ン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグル
タミン酸；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，
４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリ
ン、α−メチル−アラニン、ｐａｒａ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン
、プロパルギルグリシン、サルコシン、及びｔｅｒｔ−ブチルグリシン）の残基を含む。
この用語は、従来のアミノ保護基（例えば、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル）
を有する天然及び非天然アミノ酸、ならびにカルボキシ末端が保護された（例えば、（Ｃ
１−Ｃ６）アルキル、フェニルもしくはベンジルエステル、またはアミドとして；あるい
はα−メチルベンジルアミドとして）天然及び非天然アミノ酸も含む。他の適切なアミノ
保護基及びカルボキシ保護基は、当業者に既知である（例えば、Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎ
ｅ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ；Ｗｉｌｅｙ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１、及びその中の引用を参照）。この用
語は、シクロプロピル側鎖またはエチル側鎖を有する天然及び非天然アミノ酸も含む。
本発明は、単離されたまたは実質的に精製されたタンパク質組成物を包含する。本発明
の文脈において、「単離された」または「精製された」ポリペプチドとは、そのポリペプ
チドの生来環境から分離されて存在するポリペプチドである。「ポリペプチド」及び「タ
ンパク質」という用語は、本明細書中同義で使用される。単離されたタンパク質分子は、
精製された形状で存在する場合もあるし、非天然環境中、例えば、遺伝子導入宿主細胞ま
たはバクテリオファージ中に存在する場合もある。例えば、「単離された」または「精製
された」タンパク質、あるいはその生物学的に活性な一部分は、組換え技法により産生さ
れた場合には他の細胞材料または培養培地を実質的に含まない、あるいは化学合成された
場合には前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まない場合がある。細胞材料を実
質的に含まないタンパク質として、混入タンパク質が約３０％、２０％、１０％、５％、
（乾燥重量基準）未満である、タンパク質またはポリペプチド調製物が挙げられる。ある
特定の実施形態において、「単離された」または「精製された」タンパク質は、細胞ライ
セートを含む場合がある。本発明のタンパク質、またはその生物学的に活性な一部分が、
遺伝子組換えで産生される場合、好ましくは、培養培地は、前駆化学物質または目的タン
パク質ではない化学物質の割合が、約３０％、２０％、１０％、または５％（重量基準）
未満である。開示されるタンパク質の断片及び変異体、またはそれらによりコードされる
部分長タンパク質も、本発明に包含される。「断片」または「一部分」は、タンパク質の
全長または全長未満のアミノ酸配列を意味する。
「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端に対して１つ
または複数のアミノ酸を削除（いわゆる切り詰め）または付加；天然タンパク質の１箇所
または複数箇所で１つまたは複数のアミノ酸を削除または付加；あるいは天然タンパク質
の１箇所または複数箇所で１つまたは複数のアミノ酸を置換することにより、天然タンパ
ク質から派生したポリペプチドを意図する。そのような変異体は、例えば、遺伝子多形か
ら、または人為的操作から生じる場合がある。そのような操作の方法は、一般に当該分野
で既知である。
すなわち、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、削除、切り詰め、及び挿入をはじ
めとする様々なやり方で改変することができる。そのような操作の方法は、一般に当該分
野で既知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡでの変異により
調製することができる。変異誘発及びヌクレオチド配列改変の方法は、当該分野で周知で
ある。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ
Ａ， ８２：４８８ （１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ．， １５４：３６７ （１９８７）；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗ
ａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉ
ｏｌ． （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． （１９８３）、及びそ
れらの中の引用を参照。関心対象のタンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置
換についてのガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｅｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｎａｔｌ． Ｂｉｏ
ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ． １９７８）のモデルに見つけることができる。生物
活性をほとんどまたはまったく変化させたくないことが望まれるならば、１つのアミノ酸
を類似の性質を持つ別のものと交換するなどの保存的置換が好ましい。
すなわち、本発明のポリペプチドは、天然起源タンパク質、ならびにその変異型及び修
飾型を包含する。そのような変異体は、所望の活性を保持し続けることになる。本明細書
中包含される、ポリペプチド配列の削除、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴に根本
的な変化をもたらすことは予想されない。しかしながら、置換、削除、または挿入を行う
に先立ってその影響を正確に予測することが難しい場合、当業者なら承知のことだろうが
、常用のスクリーニングアッセイによりそのような影響を見積もることになる。
コードされた配列中の１つのアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸（典型的
には５％未満、より典型的には１％未満）を改変、付加、または削除する個々の置換、削
除、または付加は、「保存的修飾された変異体」であり、この場合の改変は、あるアミノ
酸と化学的に類似したアミノ酸との置換をもたらす。機能的に類似したアミノ酸を提示す
る保存的置換表は、当該分野で周知である。以下の５つのグループは、それぞれ、互いに
保存的置換になるアミノ酸を含む：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（
Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシ
ン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有系：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；
塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（
Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。また、コードされ
た配列中の１つのアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を改変、付加、または
削除する個々の置換、削除、または付加は、「保存的修飾された変異体」でもある。
本明細書中使用される場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、糖、リ
ン酸基、及びプリンまたはピリミジンいずれかである塩基を含有する単量体（ヌクレオチ
ド）で構成された、一本鎖または二本鎖いずれかの形の、デオキシリボヌクレオチドまた
はリボヌクレオチド、及びそれらの重合体を示す。具体的に限定されない限り、この用語
は、参照核酸と同様な結合特性を有し、天然起源ヌクレオチドと同様な様式で代謝される
、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特に記載がない限り、特
定の核酸配列は、明示された配列だけでなく、暗黙のうちに、保存的修飾されたその変異
体（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は
、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３塩基が、混合塩基及び／ま
たはデオキシイノシン残基と置換されている配列を作製することにより、達成することが
できる。
「核酸断片」とは、所定の核酸分子の一部分である。大部分の生体において、デオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）は、遺伝材料であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡに含まれる情
報をタンパク質へと移すのに関与する。「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡまた
はＲＮＡの重合体を示し、この重合体は、一本鎖または二本鎖が可能であり、任意選択で
、ＤＮＡまたはＲＮＡ重合体に組み込むことができる合成、非天然、または改変ヌクレオ
チド塩基を含有する。
「核酸」、「核酸分子」、「核酸断片」、「核酸配列またはセグメント」、あるいは「
ポリヌクレオチド」という用語はまたは、遺伝子、ｃＤＮＡ、遺伝子がコードするＤＮＡ
及びＲＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ならびに合成ＤＮＡ配列さえもと同義で使用するこ
とができる。この用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列も
含む。
「遺伝子」という用語は、生物学的機能と関連した核酸の任意のセグメントを示すのに
広義で使用される。遺伝子は、コード配列及び／またはその発現に必要な制御配列を含む
。例えば、遺伝子は、ｍＲＮＡ、機能的ＲＮＡ、または特定タンパク質を発現する核酸断
片に、その制御配列も含めたものを示す。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列
を形成する、非発現ＤＮＡセグメントも含む。遺伝子は、関心対象の源からのクローニン
グ、または既知もしくは予想される配列情報からの合成をはじめとして、様々な源から得
ることができ、所望のパラメーターを持つように設計された配列を含むことができる。ま
た、「遺伝子」または「組換え遺伝子」は、オープンリーディングフレームを含み、かつ
少なくとも１つのエキソン及び（任意選択で）イントロン配列を含む核酸分子を示す。「
イントロン」という用語は、所定の遺伝子に存在し、タンパク質に翻訳されず、通常エキ
ソンの間で見つかるＤＮＡ配列を示す。
「ベクター」は、とりわけ、二本鎖または一本鎖の直鎖または環状の、任意のウイルス
ベクター、ならびに任意のプラスミド、コスミド、ファージ、またはバイナリーベクター
を含むと定義され、これらは、自己伝染性または可動性であってもなくてもよく、細胞ゲ
ノムに組み込まれるまたは染色体外に存在する（例えば、複製起点を持つ自己複製プラス
ミド）いずれかにより原核生物または真核生物宿主を形質転換することができる。
「形質転換」という用語は、核酸断片を宿主細胞のゲノムに移植することを示し、これ
は、遺伝子的に安定な遺伝をもたらす。「宿主細胞」とは、外来核酸分子により、形質転
換された細胞または形質転換を起こすことができる細胞である。形質転換された核酸断片
を含有する宿主細胞は、「遺伝子導入」細胞と称する。
「形質転換された」、「形質導入された」、「遺伝子導入の」、及び「組換えの」は、
異種核酸分子が導入された宿主細胞を示す。本明細書中で使用される場合、「形質移入」
という用語は、ＤＮＡを真核生物（例えば、哺乳類）細胞に送達することを示す。「形質
転換」という用語は、本明細書中、ＤＮＡを原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に送
達することを示すのに使用される。「形質導入」という用語は、本明細書中、細胞をウイ
ルス粒子で感染させることを示すのに使用される。核酸分子は、当該分野で一般的に知ら
れるとおり、ゲノムに安定的に組み込むことができる。既知のＰＣＲ方法として、対のプ
ライマー、入れ子状プライマー、単独の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異
的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを用いる方法
が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、「形質転換された」、「形質転換型」
、及び「遺伝子導入」細胞は、形質転換プロセスを経ており、細胞の染色体に組み込まれ
た外来遺伝子を含有する。「形質転換されていない」という用語は、形質転換プロセスを
経たことがない正常細胞を示す。
「遺伝子改変された細胞」は、組換えまたは異種核酸（例えば、１つまたは複数のＤＮ
Ａ構築物またはそれらのＲＮＡカウンターパート）の導入により修飾された細胞を示し、
さらに、そのような遺伝子修飾の一部または全部を保持するその細胞の後代を含む。
本明細書中使用される場合、ヌクレオチド分子に関しての「由来する」または「に向け
られた」という用語は、その分子が、関心対象の特定分子に対して相補配列同一性を有す
ることを意味する。
「発現カセット」は、本明細書中使用される場合、適切な宿主細胞で特定ヌクレオチド
配列の発現を指示することができる核酸配列を示し、発現カセットは、関心対象のヌクレ
オチド配列と機能的に連結したプロモーターを含む場合があり、関心対象のヌクレオチド
配列は、終止シグナルと機能的に連結している場合がある。翻訳領域は、通常、関心対象
の機能的ペプチド、例えば、ＣＤ２００阻害剤をコードする。関心対象のヌクレオチド配
列を含む発現カセットは、キメラの場合がある。発現カセットは、天然起源であるが、異
種発現に有用な組換え型で得られたものである場合もある。発現カセットのヌクレオチド
配列の発現は、構成的プロモーターの制御下にある場合も、宿主細胞がある特定の刺激に
曝された場合にのみ転写を開始する調節可能なプロモーターの制御下にある場合もある。
多細胞生物の場合、プロモーターは、特定組織または臓器あるいは発達段階に特異的であ
ることも可能である。
そのような発現カセットは、関心対象のヌクレオチド配列と連結した転写開始領域を含
むことができる。そのような発現カセットには、調節領域の転写制御下にあるように目的
の遺伝子を挿入するための、複数の制限部位が提供される。発現カセットは、さらに、選
択可能な標識遺伝子を含有することができる。
「ＲＮＡ転写物」または「転写物」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒され
たＤＮＡ配列の転写から生じる産物を示す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補性コ
ピーである場合、それは、一次転写物と称し、またはＲＮＡ転写物が一次転写物の転写後
プロセシングに由来するＲＮＡ配列の場合があり、その場合は成熟ＲＮＡと称する。「メ
ッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、イントロンを持たず、細胞によりタンパク質へと
翻訳することができるＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡと相補的でありｍＲＮＡ
に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡを示す。
「制御配列」とは、コード配列の上流（５’非翻訳配列）、配列内、または下流（３’
非翻訳配列）に位置するヌクレオチド配列であり、この配列は、随伴コード配列の、転写
、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響を及ぼす。制御配列として、エ
ンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化信号配
列が挙げられる。これらには、天然及び合成配列、ならびに合成及び天然配列の組み合わ
せの場合がある配列が含まれる。上記のとおり、「適切な制御配列」という用語は、プロ
モーターに限定されない。しかしながら、本発明で有用な適切な制御配列として、構成的
プロモーター、組織特異的プロモーター、発達特異的プロモーター、調節可能なプロモー
ター、及びウイルスプロモーターを挙げることになり、ただしこれらに限定されない。
「５’非翻訳配列」は、コード配列に対して５’（上流）に位置するヌクレオチド配列
を示す。この配列は、開始コドンの上流の完全にプロセシングされるｍＲＮＡに存在し、
一次転写物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性、または翻訳効率に影響を及
ぼす場合がある（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
「３’非翻訳配列」は、コード配列に対して３’（下流）に位置するヌクレオチド配列
を示し、ポリアデニル化信号配列、及びｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を
及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列を含む場合がある。ポリアデニル
化信号は、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸鎖（ｔｒａｃｔ）の付加
に影響を及ぼすことを特徴とする。
「プロモーター」は、それが関与するコード配列に対して通常５’（上流）のヌクレオ
チド配列を示し、この配列は、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要とされる他の因
子のための認識（部位）を提供することにより、コード配列の発現を指示及び／または制
御する。「プロモーター」は、ＴＡＴＡ−ボックスからなる短いＤＮＡ配列である最小プ
ロモーター、及び転写開始の部位を指定するように働く他の配列を含み、これらに対して
、調節配列要素が発現制御のために付加されている。「プロモーター」は、最小プロモー
ター＋コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができる調節配列要素を含む
ヌクレオチド配列も示す。この種のプロモーター配列は、近位の上流配列要素及びそれよ
り遠位の上流配列要素からなり、後者の配列要素は、エンハンサーと称することが多い。
したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列
であり、この配列は、プロモーターの生得配列要素の場合も、プロモーターのレベルまた
は組織特異性を向上させるために挿入された異種配列要素の場合もある。エンハンサーは
、両方向（正常または逆向き）で作動することができ、プロモーターより上流または下流
いずれかに移動した場合でさえも機能することができる。エンハンサー及び他の上流プロ
モーター配列要素の両方が、それらの効果を仲介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と
結合する。プロモーターは、そのまま全体が天然遺伝子から由来する場合も、自然界で見
つかる異なるプロモーターに由来する異なる配列要素で構成される場合も、さらには合成
ＤＮＡセグメントで構成される場合もある。プロモーターは、生理的または発達上の条件
に反応して転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列も含
有する場合がある。本発明で使用可能なプロモーターの例として、マウスＵ６ ＲＮＡプ
ロモーター、合成ヒトＨ１ＲＮＡプロモーター、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＲＮＡポリ
メラーゼＩＩ、及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
「恒常的発現」は、構成的プロモーターまたは調節されたプロモーターを用いる発現を
示す。「条件付き」または「調節された発現」は、調節されたプロモーターにより制御さ
れる発現を示す。
「発現」は、細胞での、内因性遺伝子、異種遺伝子または核酸セグメント、あるいは導
入遺伝子の、転写及び／または翻訳を示す。発現は、タンパク質の産生も示す場合がある
。
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列間の同一性
パーセントを示す。２つのＤＮＡ配列またはポリペプチド配列はそれらの配列が、配列の
定義された長さにわたって、少なくとも約７５％〜８５％（７５％、７６％、７７％、７
８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、及び８５％を含む）、少なく
とも約９０％、または少なくとも約９５％〜９９％（９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％を含む）連続配列同一性を示す場合に、互いに「相同」である。
２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列関連性を記述するために以下の用語を
用いる：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較窓」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列
同一性のパーセンテージ」、及び（ｅ）「実質的同一性」。
（ａ）本明細書中使用される場合、「参照配列」は、配列比較の基準として使用される
規定配列である。参照配列は、指定された配列のサブセットまたは全体の場合がある；例
えば、全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメント、あるいは完全ｃＤＮＡまたは遺伝子
配列である。
（ｂ）本明細書中使用される場合、「比較窓」は、ポリヌクレオチド配列の連続する指
定されたセグメントに言及しており、２つの配列の最適配列比較に関して、比較窓中のポ
リヌクレオチド配列は、参照配列（これは、付加も削除も含まない）に対して、付加また
は削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。一般に、比較窓は、長さが少なくと
も２０の連続ヌクレオチドであり、任意選択で、３０、４０、５０、１００、またはそれ
より長いことが可能である。当業者には当然ながら、ポリヌクレオチド配列にギャップを
含めることにより参照配列との類似性が高くなることを回避するため、ギャップペナルテ
ィが典型的には導入され、一致の数から差し引かれる。
比較のため配列を整列させる方法は、当該分野で周知である。すなわち、任意の２つの
配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。
こうした数学的アルゴリズムのコンピューターによる実行を、配列の比較に利用して、
配列同一性を求めることができる。そのような実行法として、以下が挙げられるが、それ
らに限定されない：ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）；ＡＬ
ＩＧＮプログラム（バージョン２．０）、ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬ
ＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ（ＧＣＧ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ、ＵＳＡから入手可能）。こうしたプログラムを使用した配列比較は、初期設定パ
ラメーターを用いて行うことができる。
ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて
公開されている（ワールドワイドウェブでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
このアルゴリズムは、最初に、クエリー配列中の長さＷの短いワードを特定することによ
りハイスコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含み、特定されるワードは、データベー
ス配列の同じ長さのワードと配列比較した場合に、一致する、またはある正の値の閾値ス
コアＴを満たすものである。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称する。ヒットしたこれらの
初期近隣ワードは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための
シードとして作用する。次いで、ヒットしたワードを、配列比較の累積スコアが上昇でき
る限り、各配列に沿って両方向に延ばしていく。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合
、パラメーターＭ（一致する残基の対に加算されるスコア；通常＞０）及びＮ（一致しな
い残基に対して減算されるスコア；通常＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列の場合、
累積スコアを計算するのにスコア行列を使用する。各方向でのヒットワードの延長は、配
列比較の累積スコアが、大きさＸでその最大達成値より減少した場合、１つまたは複数の
負の点数が付く残基配列比較の累積により累積スコアがゼロ以下になった場合、あるいは
いずれかの配列の末端に到達した場合に、停止される。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列同一性パーセントの計算だけでなく、２つの配列間の
類似性の統計分析も行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の１つの尺度は、最
小確率和（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致
が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列と参照核酸配列の比較で最小
確率和が約０．１未満、約０．０１未満、さらには約０．００１未満であるならば、試験
核酸配列は、参照配列と類似であると見なされる。
比較目的でギャップを入れた配列比較を行いたい場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ｂ
ＬＡＳＴ２．０に含まれる）を利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（
ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を使用して、分子間の遠い関連性を検出する繰り返し検索
を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使
用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、タン
パク質用のＢＬＡＳＴＸ）の初期設定パラメーターを使用することができる。ＢＬＡＳＴ
Ｎプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、ワード長さ（Ｗ）１１、期待
値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミ
ノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、ワード長さ（Ｗ）３、期
待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する。ワールドワイドウェブで
、ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。配列比較は、目視検査により手作業で行う
こともできる。
本発明の目的に関して、本明細書中開示される配列に対する配列同一性パーセントを求
めるためのヌクレオチド配列の比較は、好ましくは、ＢｌａｓｔＮプログラム（バージョ
ン１．４．７以降）に、その初期設定パラメーターを用いて、あるいは任意の等価なプロ
グラムを用いてなされる。「等価なプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、
ＢＬＡＳＴプログラムにより作製された該当する配列比較と比べた場合に同一のヌクレオ
チドまたはアミノ酸残基一致及び同一の配列同一性パーセントを有する配列比較を生成す
る任意の配列比較プログラムを意図する。
（ｃ）本明細書中使用される場合、「配列同一性」または「同一性」は、２つの核酸配
列の文脈において、配列比較アルゴリズムによりまたは目視検査により測定した場合に、
指定された比較窓にわたって最大一致となるように整列させた場合に同一である、２つの
配列中の残基の指定されたパーセンテージについて言及するものである。タンパク質に関
して配列同一性のパーセンテージが用いられる場合、広く認められていることであるが、
同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが多く、この場合、アミ
ノ酸残基は、同様な化学的性質（例えば、荷電または疎水性）を持つ他のアミノ酸残基に
置き換えられており、したがって、分子の機能的性質を変化させない。配列が保存的置換
で異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質に合わせて補正されるように
、正方向に調整することができる。そのような保存的置換で異なる配列は、「配列類似性
」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。
典型的には、この調整は、保存的置換を、完全不一致ではなく部分不一致として点数付け
し、それにより配列同一性パーセントを上昇させることを含む。すなわち、例えば、同一
アミノ酸には点数１が与えられ、非保存的置換には点数０が与えられる場合、保存的置換
には、０〜１の点数が与えられる。保存的置換の点数は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥ
ＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉａ）で実行されるとおりに、計算される。
（ｄ）本明細書中使用される場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、最適に整列さ
せた２つの配列を比較窓にわたり比較することにより求められる値を意味し、比較窓中の
ポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適配列比較に関し、参照配列（これは
、付加も削除も含まない）に対して、付加または削除（すなわち、ギャップ）を含むこと
ができる。パーセンテージは、両配列で同一核酸塩基が出現する位置の個数を一致した位
置数として求め、一致した位置数を比較窓中の位置の総数により割り、その結果に１００
をかけて配列同一性のパーセンテージとすることにより計算される。
（ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチ
ドが、記載される配列比較プログラムのうち１つを使用し、標準パラメーターを用いて参
照配列と比較した場合に、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％
、７６％、７７％、７８％、または７９％；少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％
、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％；少なくとも９０％、９１％
、９２％、９３％、または９４％；あるいはさらには少なくとも９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子が、ストリンジ
ェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである（以下を参照）。一般に、ス
トリンジェントな条件は、規定イオン強度及びｐＨで、特定配列に対して熱融解点（Ｔｍ
）より約５℃またはそれより低いように選択される。しかしながら、ストリンジェントな
条件は、本明細書中特に規定があれば適宜所望のストリンジェント度合いに合わせて、約
１℃〜約２０℃の範囲の温度を包含する。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダ
イズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然とし
て実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号により可能である最
大コドン縮重を用いて作製される場合に、生じる可能性がある。
（ｅ）（ｉｉ）配列比較のため、典型的には、１つの配列が参照配列の役割を果たし、
それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参
照配列をコンピューターに入力し、必要であればサブシーケンス座標を指定し、そして配
列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが
、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）
の配列同一性パーセントを計算する。
上記のとおり、２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子が
、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。「特異的にハイブ
リダイズする」という語句は、複雑な混合（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に特
定ヌクレオチド配列が存在する場合に、分子が、ストリンジェントな条件下で、その配列
に対してのみ結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを示す。「実質的に結合
する」は、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的ハイブリダイゼーションを示し、ハイブ
リダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下させることにより融通させて、標的核
酸配列の所望の検出を達成できる些細な不一致を包含する。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション洗浄条件」は、サザン及びノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸
ハイブリダイゼーション実験の文脈において、配列依存性であり、環境パラメーターごと
に異なるものである。配列が長いほど、特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。Ｔ
ｍは、標的配列の５０％が、完全一致する核酸とハイブリダイズする温度である（規定の
イオン強度及びｐＨ下で）。特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後洗浄の関
数であり、決定的因子は、イオン強度及び最終洗浄液の温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリッドの場合、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌの式で近似することができ：
Ｔｍ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ
）−５００／Ｌ
式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシン
ヌクレオチドのパーセンテージ、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルム
アミドのパーセンテージ、及びＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、不
一致が１％あるごとに約１℃低下する；すなわち、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び
／または洗浄条件は、所望の同一性の配列とハイブリダイズするように調整することがで
きる。例えば、＞９０％同一性を持つ配列を探す場合、Ｔｍは、１０℃低下させることが
できる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定イオン強度及びｐＨで、特定配列及び
その補体の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃またはそれより低いように選択される。しかしな
がら、高度にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より１、２、３、または４℃
低い温度で、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができ；中度にス
トリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より６、７、８、９、または１０℃低い温度
で、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができ；軽度にストリンジ
ェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）より１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低
い温度で、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができる。上記の式
、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、ならびに所望のＴを用いることで、当業者に
は当然ながら、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄液のストリンジェンシーの改変
形態が、本質的に記載されたことになる。所望の不一致度合いが、４５℃（水溶液）また
は３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴをもたらす場合、より高い温度が使用できるよう
に、ＳＳＣ濃度を上昇させることが好適である。一般に、高度にストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定イオン強度及びｐＨで、特定配列の熱融解点（
Ｔｍ）より約５℃またはそれより低いように選択される。
高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、０．１５ＭのＮａＣｌにより７２℃で約１
５分間というものである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２×ＳＳＣの洗浄を
６５℃で１５分間というものである。しばしば、高度にストリンジェントな洗浄に先行し
て、低いストリンジェンシーの洗浄が行われ、バックグラウンドプローブシグナルが除去
される。中度にストリンジェントな洗浄条件の例は、例えば、１００超のヌクレオチドの
二本鎖の場合、１×ＳＳＣにより４５℃で１５分間というものである。軽度のストリンジ
ェントな洗浄条件の例は、例えば、１００超のヌクレオチドの二本鎖の場合、４〜６×Ｓ
ＳＣにより４０℃で１５分間というものである。短いプローブの場合（例えば、約１０〜
５０ヌクレオチド）、ストリンジェントな条件は、典型的には、塩濃度が約１．５Ｍ未満
、より好ましくは約０．０１〜１．０Ｍ、ｐＨ７．０〜８．３のＮａイオン濃度（または
他の塩）、ならびに温度が典型的には少なくとも約３０℃及び長いプローブ（例えば、＞
５０ヌクレオチド）の場合は少なくとも約６０℃、を含む。ストリンジェントな条件は、
ホルムアミドなどの不安定化剤などを加えることによっても達成できる。一般に、特定ハ
イブリダイゼーションアッセイで無関係プローブについて観測されたものより２倍の（ま
たはそれより高い）信号対雑音比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。
非常にストリンジェントな条件は、特定プローブのＴｍに等しいように選択される。サ
ザンまたはノーザンブロットでフィルター上に１００超の相補的残基を有する相補的核酸
のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件の例は、５０％ホルムアミド
、例えば、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダ
イゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中６０〜６５℃での洗浄である。軽度にストリンジェ
ントな条件の例は、３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル
硫酸ナトリウム）の緩衝液を用いて、３７℃でのハイブリダイゼーション、１×〜２×の
ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中５０
〜５５℃での洗浄を含む。中度にストリンジェントな条件の例は、４０〜４５％ホルムア
ミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０
．５×〜１×のＳＳＣ中５５〜６０℃での洗浄を含む。
上記のとおり、「単離及び／または精製された」という用語は、核酸に関して、核酸、
例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を、配列決定、複製、及び／または発現させることがで
きるように、その天然細胞環境から、及び細胞の他の成分、例えば核酸またはポリペプチ
ドとの関連性から、ｉｎ ｖｉｔｒｏで単離することを示す。例えば、「単離された核酸
」は、ストリンジェントな条件下で、目的の遺伝子中の配列と相補的であるまたはこれに
ハイブリダイズし、安定に結合を維持するＤＮＡ分子の場合がある（当該分野で周知であ
る方法により定義した場合）。すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡは、それが、ＲＮＡまたは
ＤＮＡの天然源中では通常付随する少なくとも１種の混入核酸を含まず、本発明の１つの
実施形態では、どのような他の哺乳類ＲＮＡまたはＤＮＡも実質的に含まない点で、「単
離されている」。「通常付随する少なくとも１種の混入原料核酸を含まない」という語句
は、核酸が、原料細胞または自然細胞に再導入されているが、異なる染色体位置にある、
あるいは他のやり方で原料細胞中で通常見つからない核酸配列と隣接する、例えば、ベク
ターまたはプラスミド中にある場合を含む。
本明細書中使用される場合、「組換え核酸」という用語、例えば、「組換えＤＮＡ配列
またはセグメント」は、任意の適切な細胞源に由来するまたは細胞源から単離されており
、その配列が天然起源ではないように、または天然起源の配列に相当するが、外来ＤＮＡ
で形質転換されたことがないゲノム中で位置すると思われるとおりに位置していないよう
に、その後ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に改変することができる核酸、例えば、ＤＮＡを示
す。ある源に「由来する」予め選択されたＤＮＡの例として、所定の生体内で有用な断片
として同定され、その後本質的に純粋な形で化学合成されたＤＮＡ配列が考えられる。あ
る源から「単離された」そのようなＤＮＡの例として、本発明で使用するため、遺伝子工
学の方法により、さらに操作する、例えば、増幅することができるように、化学的手段に
より、例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用によりその源から切り出されたまたは取り
出された有用なＤＮＡ配列が考えられる。
すなわち、制限消化物から、所定のＤＮＡ断片を回収または単離するのに、消化物をポ
リアクリルアミドまたはアガロースゲル上で電気泳動により分離させること、関心対象の
フラグメントの移動度と分子量既知のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度を比較するこ
とによりフラグメントを同定すること、所望のフラグメントを含有するゲル切片を取り出
すこと、及びゲルとＤＮＡを分離すること、を採用することができる。したがって、「組
換えＤＮＡ」には、完全合成ＤＮＡ配列、半合成ＤＮＡ配列、生物学的源から単離された
ＤＮＡ配列、及びＲＮＡに由来するＤＮＡ配列、ならびにそれらの混合物が含まれる。
塩基置換を有する核酸分子（すなわち、変異体）は、当該分野で既知の様々な方法によ
り調製することができる。そうした方法として、天然源からの単離（天然起源の配列変異
体の場合）、あるいは核酸分子のこれまでに調製された変異体または非変異型の、オリゴ
ヌクレオチド介在型（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異
誘発が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中使用される場合、「治療薬」または「治療複合体」という用語は、哺乳類レ
シピエントに有益な効果を有する任意の作用剤または材料を示す。すなわち、「治療薬」
は、核酸またはタンパク質成分を有する治療用または予防用分子の両方を包含する。
「治療する」は、本明細書中使用される場合、所定の疾患または症状の少なくとも１つ
の症候を寛解させる、疾患または症状を治癒する、及び／または疾患または症状の発症を
防ぐことを示す。
「免疫応答」は、Ｂ及び／またはＴリンパ球及び／または抗原提示細胞の活性化または
増殖を招く、体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を示す。しかしながら、場合に
よっては、免疫応答は、強度が低く、本発明に従って少なくとも１種の物質を使用した場
合にのみ検出可能になる場合がある。「免疫原性」は、免疫系の１つまたは複数の機能が
上昇し、免疫原性作用剤に向けられるように、生きた生体の免疫系を刺激するのに使用さ
れる作用剤を示す。「免疫原性ポリペプチド」とは、単独であろうとキャリアと連結して
いようと、細胞性及び／または体液性免疫応答を誘発するポリペプチドである。好ましく
は、抗原提示細胞の活性化が可能である。
免疫応答を「向上させる」物質は、その物質の付加なしで測定した同一免疫応答と比較
した場合に、その物質の付加があることで、観測される免疫応答がより強くなる、または
強化される、またはいずれにしろ逸脱する物質を示す。例えば、細胞障害性Ｔ細胞の溶解
活性を、免疫化中に物質を使用して得られた試料及び使用せず得られた試料で、例えば、
５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定することができる。その物質なしでのＣＴＬ溶解活性
と比較した場合にＣＴＬ溶解活性が向上する物質の量は、抗原に対する動物の免疫応答を
向上させるのに十分な量であると言える。ある特定の実施形態において、免疫応答は、少
なくとも約２、例えば約３以上の係数で向上する。分泌されるサイトカインの量または種
類も、改変することができる。あるいは、誘導される抗体またはそのサブクラスの量が、
改変される場合がある。
「免疫化する」または「免疫化」という用語あるいは関連する用語は、標的抗原または
エピトープに対して実質的な免疫応答（抗体及び／または細胞性免疫、例えばエフェクタ
ーＣＴＬなどを含む）を開始する能力を付与することを示す。これらの用語は、完全な免
疫が作られることを要求するのではなく、実質的にベースラインより強い免疫応答が生じ
ることを要求する。例えば、哺乳類は、本発明の方法の適用後に、標的抗原に対する細胞
性及び／または体液性免疫応答が生じたならば、標的抗原に対して免疫化されたとみなす
ことができる。
「免疫治療薬」という用語は、疾患、障害、または症状の治療用組成物を示す。より詳
細には、この用語は、ワクチン接種により、または免疫分子の移植により有益な免疫応答
が生じる治療方法を示すのに使用される。「免疫学的有効量」は、個体に導入した場合に
その個体に免疫応答を誘導するのに十分な組成物の量を示す。能動免疫の文脈において、
この用語は、「免疫原性有効量」と同義語である。免疫学的に有効であるために必要な組
成物の量は、多くの要因に従って変化し、そのような要因として、組成物、組成物中の他
の成分の存在、抗原、免疫化の経路、個体、先行する免疫状態または生理状態などが挙げ
られる。
ここから、本発明のある特定の実施形態を、以下の限定ではない実施例により例示する
。
実施例１
センチネルリンパ節においてＣＤ２００誘導型免疫抑制を反転させる阻害剤をどのよう
にして選択するかの決定
腫瘍微小環境及びセンチネルリンパ節は、癌細胞を除去し再発を予防する免疫系の能力
を阻害する免疫抑制条件下に存在する。研究者は、癌または免疫細胞のいずれか、あるい
はその両方で免疫抑制カスケードを克服するためにシグナル伝達経路阻害剤を作製してみ
たものの、有効性はほとんどなかった。ＣＤ２００は、抑制性ＣＤ２００受容体（ＣＤ２
００Ｒ１）を有する免疫細胞を負に調節する免疫抑制タンパク質である（図１）。しかし
ながら、ＣＤ２００受容体ファミリーもまた、複数の独特なアイソフォームを有する（活
性化受容体ＣＤ２００Ｒ２、ＣＤ２００Ｒ３、ＣＤ２００Ｒ４、及びＣＤ２００Ｒ５）（
図２Ａ）。ＣＤ２００Ｒ５は、マウスのＣＤ−１株、及びヒトの活性化受容体１種に限定
される（図２Ｂ）。最近、ＣＤ２００が有するドメインについて、そのドメインが活性化
受容体に結合してタンパク質の抑制性質を調節／反転させると仮説が立てられ、報告され
た。
本明細書中記載されるとおり、活性化受容体を標的として受容体を活性化する（図２Ｄ
）これらＣＤ２００阻害剤の能力は、ＣＤ２００タンパク質の抑制性質を反転させる（図
２Ｃ）（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０１６；８（９）：
１０５９−１０７１）。ＣＤ２００阻害剤は、抗原提示細胞を活性化させる。マウスＣＤ
１１ｂ細胞に、ＣＤ２００阻害剤（Ｐ１Ａ１２）をパルス添加した。４８時間後、上清を
、サイトカイン及びケモカイン産生について分析した（図２２）。同じ結果が、ヒト樹状
細胞に、ヒトＣＤ２００阻害剤をパルス添加することにより見られた（図１３Ａ〜１３Ｂ
）。反応は、第６位アミノ酸をアラニンに置き換えることにより、向上した（図１６）。
本発明者らは、向上したケモカイン産生が、腫瘍部位への白血球浸潤を向上させたことも
明らかにした。非担癌マウスに、生理食塩水、腫瘍ライセート、またはＣＤ２００阻害剤
Ｐ１Ａ１２単独でワクチン接種した。２４時間後、マウスに、生理食塩水、腫瘍ライセー
ト＋アジュバントＣｐＧ、または腫瘍ライセート＋ＣｐＧ＋ＣＤ２００阻害剤で再ワクチ
ン接種した。６時間後、ワクチン接種部位を、白血球浸潤について分析した（図１９Ｄ）
。本明細書中記載されるのは、以下の目的で設計された試験である：ｉ）阻害剤を最適化
すること、ｉｉ）樹状細胞の抗原提示能力に対するＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ相互作用を
評価すること、ｉｉｉ）、及びＣＤ２００由来競合的抑制作用機構（複数可）を明らかに
すること。
病院で癌が検出された時、患者は、一般に、腫瘍関連微小環境における免疫抑制状態の
発生のため、免疫抑制されている。骨髄系由来抑制細胞及び調節性Ｔ細胞などの免疫抑制
細胞は、活性の上昇を示すが、樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍及びセンチネルリンパ節におい
て障害されているようである。抑制性ＣＤ２００受容体（ＣＤ２００Ｒ１）がＴ細胞で発
現するため（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１７１（
６）： ３０３４−４６；Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
２０００；１６５（９）： ４８５４−６０；Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１７２（１２）： ７７４４−９）、腫瘍微小環境か
ら分泌されるＣＤ２００と、ＣＤ２００Ｒ１との相互作用は、Ｔ細胞活性化に直接及び間
接的効果の両方を発揮することが提案される（図６）。
複数の移植片拒絶研究から、ＣＤ２００は免疫抑制性であることが判明しているものの
、Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉらは、ＣＤ２００タンパク質内に、ＣＤ２００Ｒに対するアゴニ
スト（同じ免疫抑制性効果を示す）活性を有する特定ペプチドドメイン、及びアンタゴニ
スト（ＣＤ２００に対して競合的阻害剤として作用する）活性を有する特定ペプチドドメ
インがあることを報告した（Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒ
ｅｓ ２００８；１４５（１）： ８７−９６）。これらのアンタゴニストは、可溶性Ｃ
Ｄ２００との相互作用に続いて、骨髄系由来抑制細胞としての分化を反転させることが報
告されており（図１８Ｃ）（Ｍｏｅｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ
ｒ Ｃａｎ；２（１）：４６）、ｉｎ ｖｉｖｏで反転させた（図２３）。ＣＤ２００タ
ンパク質阻害の機構は、免疫抑制性タンパク質ＰＰＩＡの上方制御を通じて明らかにされ
ており（図１８Ａ〜図１８Ｅ）、これはＣＤ２００阻害剤Ｐ１Ａ１２の使用と共存する。
Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉらは、ＣＤ２００由来のアゴニストペプチド及びアンタゴニスト
ペプチドを記載したが、ここではこれらをＸｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１６；Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ、１３（２） ２３３−２４２に従いＣＤ２００阻害剤と記載する。アゴニ
ストペプチドがインタクトＣＤ２００により誘発される免疫抑制を模倣するかどうかを判
定するため、選択したアゴニストを、ＯＶＡと混合して、野生型（非担癌）ＣＤ５７ＢＬ
／６マウスを、抗原刺激−追加免疫モデルで免疫化した（Ｏｈｌｆｅｓｔ ｅｔ ａｌ．
， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；１９０（２）： ６１３−２０）。これらのＣＤ２
００由来アゴニストは、非担癌マウスで、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖応答を、担癌マ
ウスで常態的に見られるものと等しいレベルまで抑制した（図３Ａ〜図３Ｂ）。これらの
データは、本明細書中記載されるとおりＣＤ２００が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を抑
制するという提唱を支持する。
Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉら（Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ ２００８；１４５（１）： ８７−
９６）が記載した異なるアンタゴニストが、腫瘍微小環境の抑制効果を調節するまたは反
転させることが可能かどうかも、調査した（Ｊ Ｉｍｍｕｎ Ｔｈｅｒ Ｃａｎ ２０１
４；２（１）４６。結果としては、マウス乳癌、神経膠腫、及びヒトモデルで示されたと
おり、異なるアンタゴニストは、異なるＣＤ２００Ｒアイソフォームを通じて作用する、
または同一受容体に対して異なる生物学的効果を有するいずれかであった（図７Ａ〜図７
Ｂ）。これらの結果は、神経膠腫腫瘍に最適な阻害剤は、乳癌で増加的生存延長効果を有
することを実証したが、対照的に、本発明者らの乳癌モデルで約８０％の生存率をもたら
した阻害剤は、本発明者らの神経膠腫モデルで目立った影響をもたらさなかった。差次的
免疫応答も、本発明者らが試験した２種のヒトＣＤ２００阻害剤ペプチド間で見られた。
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａプログラムは、３種の異なるマウスＣＤ２００阻害剤（Ｐ
１＝Ｐ１Ａ１２、Ｐ２＝４０１３、及びＰ３＝４００６、表１）が、異なる活性化受容体
に対してより高い結合特異性を有することを示す。Ｐ３阻害剤は、受容体Ｒ２に対してよ
り高い結合特異性を有し、Ｐ２は、受容体Ｒ３に対してより高い結合特異性を有し、Ｐ１
は、Ｒ４に対する受容体に対してより高い結合特異性を有する。本発明者らは、２種の異
なるヒトＣＤ２００阻害剤ペプチド（ペプチド１＝ｈＰ１＆ペプチド２＝ｈＰ２、表２）
が、まだ１つしか同定されていないものの樹状細胞の異なる活性化受容体にヒットすると
仮定している。このことは、本発明者らの阻害剤により指示される異なる免疫応答を解明
することの重要性を実証した。本発明者らは、患者にとって最も有益な免疫応答を生じさ
せたいと考えている。これらの結論は、脾細胞に、ＯＶＡ＋選択されたＣＤ２００阻害剤
（６０６１、６０６９、４００４、４００６、４０１３）を２４時間パルス添加した実験
により支持された。次いで、脾細胞を洗浄し、ＯＴ−１Ｔ細胞を添加して４８時間培養し
た。次いで、フローサイトメトリー用ビーズアレイを用いて、培養物をサイトカイン産生
について評価した。阻害剤４００４及び４００６は、他のものと比べて異なるサイトカイ
ンプロファイルを誘発したことが分かった（図１１Ａ〜図１１Ｂ）。腫瘍が子宮頸部リン
パ節で示す抑制効果を、ＣＤ２００阻害剤が、調節する／反転させることができるかどう
かを、引き続き調べた。結果として、阻害剤の添加は、腫瘍が誘導した抑制を反転させた
。この結果は、マウスに、抗原刺激追加免疫モデル（Ｏｈｌｆｅｓｔ ｅｔ． ａｌ．，
（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；１９０（２）： ６１３−２０）で、ＯＶＡ＋阻害
剤ペプチド６０５９を用いてワクチン接種することにより確認された（図１２Ａ）。担癌
マウスで常態的に見られる強力な抑制効果が実証された（図１２Ａ）。本発明者らの観察
を検証するため、阻害剤６０５９処置したマウスの子宮頸部リンパ節からリンパ球を収穫
し、ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬで再刺激した。４８時間後、培養上清をサイトカイ
ン産生について分析し、アンタゴニストの持つ、神経膠腫により誘導された抑制を調節す
る／反転させる能力を実証した（図４Ａ〜図４Ｂ）。興味深いことに、非担癌マウスにＯ
ＶＡ＋神経膠腫由来エキソソーム＋アンタゴニスト６０５９をワクチン接種すると、エキ
ソソームにより誘導される抑制が、部分的に反転した（図１２Ｃ）。これらの実験は、エ
キソソームがＣＤ２００タンパク質を発現し、それにより、神経膠腫担持マウスの流入領
域リンパ節におけるＴ細胞応答を抗原刺激する能力を阻害するという仮定を支持する。他
のＣＤ２００阻害剤も同様に評価した（図３Ａ〜図３Ｂ、図９Ａ〜図９Ｂ、及び図２４Ａ
〜図２４Ｂ）。
ＣＤ２００阻害剤を用いたワクチン接種が、担癌マウスの生存率を向上させられるかど
うかも調べた。結果として、阻害剤の添加は、ＧＬ２６１モデルで生存延長効果を向上さ
せた（図５Ａ）。ＧＬ２６１担癌マウスに、生理食塩水、腫瘍ライセート（ＴＬ）、また
は腫瘍ライセート＋阻害剤（６０５９）で毎週ワクチン接種した。これらの実験は、腫瘍
ライセート＋阻害剤（データは示さず）でワクチン接種されたマウスに比べて、生理食塩
水または腫瘍ライセートのみでワクチン接種されたマウスの方が速く腫瘍が成長し、ＧＬ
２６１モデルでは生存延長効果の上昇がもたらされ（図５Ａ）、その結果生存が延長した
（図５Ｂ）ことを示す。これらの結果を、乳癌（ＥＭＴ６）型（図７Ｂ）腫瘍モデルに変
換した。また、イヌ特異的ＣＤ２００阻害剤は、生存延長効果の向上を示した。ミネソタ
大学の獣医クリニックに来た個人飼育のペットで、グレードの高い神経膠腫と診断された
ものに、自己腫瘍ライセートまたは腫瘍ライセート＋イヌ特異的ＣＤ２００阻害剤を投与
した。４ヶ月のうちに、イヌによっては、腫瘍が残ってはいるものの、全体的な退縮を示
し（図１７Ａ〜図１７Ｄ）、その結果生存率が向上した（図１７Ｅ）。
ＣＤ２００ペプチド阻害剤は、抗原提示細胞を活性化するように設計されているものの
、活性化Ｔ細胞は、可溶性ＣＤ２００から保護する必要がある。特定エピトープ用に開発
された抗ＣＤ２００受容体を、腫瘍ライセート＋ＣＤ２００阻害剤Ｐ１Ａ１２を用いたワ
クチン接種後に全身性投与し、生存について経過観察した（図２６Ａ〜図２６Ｂ）。
競合的阻害剤の最適化
癌免疫治療の大きな困難の１つは、腫瘍微小環境及びセンチネルリンパ節の両方におけ
る免疫抑制を克服することである。本明細書中記載されるのは、センチネルリンパ節及び
腫瘍微小環境の両方における腫瘍誘導型免疫抑制を克服するためのＣＤ２００阻害剤ペプ
チドドメインの最適化である。
Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉら（Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ ２００８；１４５（１）： ８７−
９６）は、混合白血球反応を用いて、ＣＤ２００タンパク質の特定領域が、あるものはア
ゴニストとして作用し、あるものはアンタゴニスト（本明細書中、「ＣＤ２００阻害剤」
とも記載する）として作用することを報告した。マウスは、５種のアイソフォームのＣＤ
２００Ｒを発現し、これらは、組織限定発現及び機能の異種性を示す（Ｗｒｉｇｈｔ Ｇ
Ｊ， Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ Ｈ， Ｆｏｓｔｅｒ−Ｃｕｅｖａｓ Ｍ， ｅｔ ａｌ．
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２００ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅ
ｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＣＤ２００． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１７１（
６）： ３０３４−４６；Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ Ｒ， Ｂｏｕｄａｋｏｖ Ｉ， Ｋｈ
ａｔｒｉ Ｉ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ＣＤ２００ ｍｏｄｕｌａｔｅ ＬＰＳ−ｉ
ｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ
ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ ２００８；１４５（１）： ８７−９６；
Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ Ｒ， Ｃｈｅｎ Ｚ， Ｋａｉ Ｙ， Ｌｅｅ Ｌ， Ｗｏｎｇ
Ｓ， Ｍａｒｓｄｅｎ ＰＡ． ＣＤ２００ ｉｓ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ａｌ
ｌ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２００Ｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；１７２
（１２）： ７７４４−９；Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ ＲＭ， Ｃｈｅｎ Ｚ， Ｃｌａｒ
ｋ ＤＡ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈ
ｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ＣＤ２００Ｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｉｍｍ
ｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｆｅｔｏ−ｍａｔｅｒｎａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ． Ａｍ
Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００４；５２（２）： １４７−６３）。異なる
阻害剤は、異なる受容体を通じて働き、異なる生体反応をもたらす可能性がある。本明細
書中記載される実験は、異なる阻害剤が異なる経路を通じて作用するかどうかを明らかに
するもので、そうであれば、互いに相乗作用を及ぼして、それにより殺腫瘍性反応を誘導
する能力が向上する可能性がある複数の阻害剤の使用が可能になる。
方法：マウスでは、５種のＣＤ２００Ｒが同定されているので、ＣＤ２００由来ペプチ
ド阻害剤が、複数の受容体を通じて機能するのかどうかを明らかにする必要がある。した
がって、野生型脾細胞を、抗ＣＤ２００Ｒ１、抗ＣＤ２００Ｒ２、抗ＣＤ２００Ｒ３、ま
たは抗ＣＤ２００Ｒ１を用いてブロックすることになる（Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ Ｒ，
Ｌｅｅ Ｌ， Ｂｏｕｄａｋｏｖ Ｉ． Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏ
ｆ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ ｕｓｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ｔｏ ＣＤ２００Ｒ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２００５；７９：
１１８０−８３）。インキュベーション後、細胞に、組換えマウスＣＤ２００Ｆｃキメ
ラタンパク質（ｒｍＣＤ２００Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下または不在下で
、個別のペプチドを添加してまたはしないで、ＯＶＡ＋Ｐｏｌｙ：ＩＣＬＣをパルス添加
する。２４時間インキュベーション後、精製ＯＴ−Ｉ ＣＤ８Ｔ細胞を４８時間添加して
おき、次いで、上清を、フローサイトメトリー用ビーズアレイを用いてＴｈ１／Ｔｈ２サ
イトカインについて分析し、ＴＧＦβ産生についてＥＬＩＳＡにより分析する。増殖応答
の回復に対して阻害剤が有する効果を明らかにするため、野生型マウス由来の脾細胞に、
上記と同一の処置群でパルス添加する。２４時間インキュベーション後、精製ＣＦＳＥ標
識化ＯＴ−Ｉ ＣＤ８Ｔ細胞を、細胞に加える。４８時間インキュベーション後、細胞を
、増殖についてフローサイトメトリーにより分析する。適宜、ペプチドを組み合わせて混
合物にし、ＣＤ２００と複数の受容体との結合をブロックすることが免疫応答を向上させ
るかどうかを明らかにする。
まとめると、血液及び頸部リンパ節リンパ球を、ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｋｂ特異的ＣＤ８
＋Ｔ細胞について分析する。頸部リンパ節から単離したリンパ球を、コアＯＶＡ由来ＳＩ
ＩＮＦＥＫＬエピトープ
Figure 2021120405

を含有するペプチドで刺激する。上清を、フローサイトメトリー用ビーズアレイ（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカインのレベル
について分析する。市販のＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、
産生されたＴＧＦβのレベルを測定する。一定分量の細胞を別々に、ＣＤ８の表面発現及
びＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｋｂ結合及び細胞内発現ＩＦＮ−γ１について、分析する。
樹状細胞の抗原提示能力に対するＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ相互作用の評価。
樹状細胞（ＤＣ）は、最も強力な既知抗原提示細胞である。樹状細胞は、病原及び障害
の兆候がないか、身体の各組織を巡回している。注射されると、腫瘍細胞または細胞成分
は、皮膚のＤＣ及び二次リンパ器官により取り込まれて処理され、これがその後、自然免
疫と適応免疫とを橋渡しする。ＣＤ２００は、樹状細胞上のＣＤ２００Ｒ１に結合して、
その機能的応答を改変する（Ｌｉ Ｙ， Ｚｈａｏ ＬＤ， Ｔｏｎｇ ＬＳ， ｅｔ
ａｌ． Ａｂｅｒｒａｎｔ ＣＤ２００／ＣＤ２００Ｒ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎ
ｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓ
ｕｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ａｂｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎ
ｓｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ａｒ
ｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ２０１２；１４（３）： Ｒ１２３）。
精製骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）を、マウス試験に使用する。実験の評価項目は以下を含
む：ｉ）同時刺激マーカー発現、ｉｉ）ＯＶＡ交差提示、及びｉｉｉ）サイトカイン産生
。ヒトに移行させる可能性を調べるため、ｉＤＣに、ＣＭＶペプチドｐｐ６５＋ｈＣＤ２
００Ｆｃ＋／−阻害剤をパルス添加する。実験の評価項目は以下を含むｉ）同時刺激マー
カー発現、及びｉｉ）サイトカイン産生。
まとめると、ＢＭＤＣを、Ｉｎａｂａら（Ｏｈｌｆｅｓｔ ＪＲ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ
ＢＭ， Ｌｉｔｔｅｒｍａｎ ＡＪ， ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔ
ｉｏｎ ｓｉｔｅ ｍａｔｔｅｒｓ： ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉ
ｔａｔｉｖｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｉｍｅｄ ａｓ
ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｉｎ
ａ ｍｕｒｉｎｅ ｇｌｉｏｍａ ｍｏｄｅｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；１９
０（２）： ６１３−２０；Ｗｉｃｋ ＤＡ， Ｍａｒｔｉｎ ＳＤ， Ｎｅｌｓｏｎ
ＢＨ， Ｗｅｂｂ ＪＲ． Ｐｒｏｆｏｕｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｄａｉｌｙ ｉｍｍｕｎｉｚａ
ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｌｕｓ ｔｈｅ ＴＬＲ
３ ａｇｏｎｉｓｔ ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１１；２９（５）：
９８４−９３）のプロトコルを改変したものを用いて成熟させる。手短に述べると、Ｃ
５７ＢＬ／６マウスから大腿骨及び脛骨を取り出し、ＰＢＳでフラッシュ洗浄する。細胞
を洗浄し、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含有する完全ＲＰＭＩ １６４０に播種する
。浮遊細胞を除去し、３日ごとに培地を交換する。骨採取から６日後、軽く付着した細胞
を収穫し、洗浄し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００，０００細胞／２００μ
ｌで播種する。細胞に、ＯＶＡ＋ＣｐＧ、ＯＶＡ＋ＣｐＧ＋ｍＣＤ２００Ｆｃ、ＯＶＡ＋
ＣｐＧ＋阻害剤、またはＯＶＡ＋ＣｐＧ＋ＣＤ２００Ｆｃ＋阻害剤をパルス添加する。パ
ルス添加の３０分前に、ＣＤ２００Ｆｃを投与する。パルス添加しないウェルを対照とし
て用いる。２４時間インキュベーション後、樹状細胞を、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ８
０、及びＨＬＡ−ＩＩの抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析する。上清を、
ＩＬ−６及びＩＬ−１２産生について分析する。ＯＶＡ交差提示に対するＣＤ２００の効
果を試験するため、ＤＣを２５−Ｄ１．１６で染色して、抗原発現を測定する。２５−Ｄ
１．１６は、Ｈ−２Ｋｂにより提示された場合に限りＳＩＩＮＦＥＫＬと特異的に結合す
るモノクローナル抗体である。５×１０５のＣＤ１４＋末梢血単球由来ＨＬＡ−Ａ２＋未
熟ＤＣに、１０μｇのＣＭＶペプチドｐｐ６５４９５−５０３（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）＋
／−ｈＣＤ２００Ｆｃ＋／−阻害剤をパルス添加する。
ＣＤ２００由来競合的阻害剤の機構（複数可）を明らかにする。
阻害剤ペプチド６０５９が、担癌マウスで抑制効果を反転させることが、抗原刺激追加
免疫モデルを用いて実証されている。
以下の実験では、野生型マウスに、ＧＬ２６１細胞を接種し、ワクチン接種する。マウ
スは、ｉ）生理食塩水、ｉｉ）６５μｇのＧＬ２６１腫瘍ライセート腫瘍ライセート、ま
たはｉｉｉ）６５μｇのＧＬ２６１腫瘍ライセート腫瘍ライセート＋最適阻害剤でワクチ
ン接種することになる。実験は、上記の通り行う。本発明者らは、以下に対する本発明の
新規阻害剤の効果を調べることになる：ｉ）Ｔ細胞発現、ｉｉ）サイトカイン反応、及び
ｉｉｉ）頸部リンパ節で観察される細胞溶解反応、ｉｖ）リンパ球浸潤及びカスパーゼ３
／７活性、ｖ）免疫記憶の発達、及びｖｉ）生存延長効果。そのうえ、本研究は、Ｏｌｉ
ｎら（Ｏｌｉｎ ＭＲ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＢＭ， Ｌｉｔｔｅｒｍａｎ ＡＪ， ｅ
ｔ ａｌ． Ｏｘｙｇｅｎ ｉｓ ａ ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔ
ｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍ
ａ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１１；７１（２１）： ６５８３−９）
に記載されるとおり、ＣＭＶアッセイを用いて、本発明者らのヒトＴ細胞反応に移行され
る。
まとめると、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞発現を測定することによりＴ細胞に対する
効果を調べ、サイトカイン産生及びＣＴＬ反応の生成によりリコール反応を測定した。さ
らに、マウス（ｎ＝１０／処置群）に、記載のとおりにルシフェラーゼ発現ＧＬ２６１神
経膠腫細胞を接種し、３、１０、１７、２４、及び３１日目に、ｉ）生理食塩水、ｉｉ）
腫瘍ライセート、またはｉｉｉ）腫瘍ライセート＋最適阻害剤でワクチン接種する。別個
の実験で、マウスの１群（ｎ＝６）を７日目及び１４日目に屠殺する。脳を収穫して、Ｏ
ｌｉｎら（Ｏｌｉｎ ＭＲ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＢＭ， Ｚｅｌｌｍｅｒ ＤＭ， ｅ
ｔ ａｌ． Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖａ
ｃｃｉｎｅｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｏｘｙｇｅｎ． Ｃｌｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１０；１６（１９）： ４８００−８）に記載されるとお
りに、ＣＤ３浸潤及び活性カスパーゼの活性について免疫組織化学検査により分析する。
マウスの２つ目の群（ｎ＝５）では、脳浸潤性リンパ球を、以前に記載されたとおり（Ｏ
ｈｌｆｅｓｔ ＪＲ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ ＢＭ， Ｌｉｔｔｅｒｍａｎ ＡＪ， ｅｔ
ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｍａｔｔｅｒｓ： ｑｕａ
ｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ＣＤ８
Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｉｍｅｄ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｘｉｍｉ
ｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｇｌｉｏｍａ ｍｏｄｅｌ
． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；１９０（２）： ６１３−２０）に収穫して、ＣＤ
４またはＣＤ８集団について表現型を決定することになる。また、マウスを毎週撮像し、
生存をモニタリングする。生存させた後（接種から１００日後）、マウスの対側半球に、
ＧＬ２６１を再接種し、生存を経過観察する。新たに接種されたマウス（ワクチン接種な
し）を、対照として用いる。さらに、５×１０５のＣＤ１４＋末梢血単球由来ＨＬＡ−Ａ
２＋ＣＭＶ＋未熟ＤＣに、１０μｇのＣＭＶペプチドｐｐ６５４９５−５０３（ＮＬＶＰ
ＭＶＡＴＶ）＋／−ｈＣＤ２００ＦｃまたはＯＶＡ＋ＣＤ２００Ｆｃ＋ＣＤ２００阻害剤
をパルス添加する（図１５）。以前に記載されたとおり（Ｏｌｉｎ ＭＲ， Ａｎｄｅｒ
ｓｅｎ ＢＭ， Ｌｉｔｔｅｒｍａｎ ＡＪ， ｅｔ ａｌ． Ｏｘｙｇｅｎ ｉｓ ａ
ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ ２０１１；７１（２１）： ６５８３−９；Ｉｎａｂａ Ｋ， Ｉｎａｂａ Ｍ，
Ｒｏｍａｎｉ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍ
ｂｅｒｓ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｂｏｎｅ
ｍａｒｒｏｗ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌ
ｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔ
ｏｒ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９２；１７６（６）： １６９３−７０２）、細胞を
成熟させる。成熟後、５×１０５の同一ドナー由来ＰＢＭＣを加え、４８時間培養する。
サイトメトリー用ビーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、上清を、ＩＦ
Ｎγ及びグランザイムＢ産生について分析する（Ｏｌｉｎ ＭＲ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ
ＢＭ， Ｌｉｔｔｅｒｍａｎ ＡＪ， ｅｔ ａｌ． Ｏｘｙｇｅｎ ｉｓ ａ ｍａｓ
ｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐ
ｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０
１１；７１（２１）： ６５８３−９）。ＣＭＶ血清陰性ＰＢＭＣを、対照として使用す
る。全ての実験は、３つ組で行う。データのＡＮＯＶＡ分析は、パラメトリック変数の場
合は、ボンフェローニの多重比較検定（対照あり）、ならびにダネットの二元多重比較検
定（同じく対照あり）を用いて、ノンパラメトリック変数の場合は、クラスカル・ウォリ
スの多重比較ｚ値検定（ダン検定）を用いたクラスカル・ウォリスＡＮＯＶＡで行う。
実施例２
中枢神経系内の腫瘍微小環境の免疫抑制効果を克服する
阻害剤を使用してリンパ節のＴ細胞反応を刺激したとしても、活性化Ｔ細胞は、免疫抑
制性腫瘍微小環境に遭遇する。この困難を軽減するため、微小環境での腫瘍による効果の
抑制を探索する。
神経膠芽腫の患者は、全身性免疫抑制効果を示し、その結果、適応免疫応答不全になっ
ている。このような不全状態は、腫瘍により分発される豊富な免疫抑制因子がＴ細胞増殖
を抑制すること（図１４Ａ〜図１４Ｂ）及び細胞傷害性機能（図２５）による。免疫抑制
は、神経膠芽腫の患者における腫瘍増悪に重要な役割を果たす。免疫抑制を反転させて有
効な免疫標的指向性をもたらすことで、神経膠腫の患者は、腫瘍の増悪を低減させること
ができ、予後を改善できる。
阻害剤は、免疫抑制性腫瘍微小環境を反転させるまたは調節することができることが、
わかっている。担癌マウスの脳に、腫瘍を注射し、その２日後、同じ座標位置で、１０μ
ｇの阻害剤６０５９を接種した。この後、毎週、腫瘍ライセート＋阻害剤（図５Ａ〜図５
Ｂ）を注射した。６０５９阻害剤を投与されたマウスで、腫瘍成長が遅くなった。
本発明者らは、流入領域リンパ節の腫瘍の抑制効果を克服するため、ＣＤ２００競合的
阻害剤に注目してきた。しかしながら、殺腫瘍性反応が向上したとしても、腫瘍微小環境
の抑制性質が、細胞溶解反応を減少させる。
最適化されたＣＤ２００阻害剤ペプチドを、担癌マウスのＣＮＳで試験する。ルシフェ
ラーゼ発現ＧＬ２６１細胞１５，０００個を、上記のとおり接種する。アデノウイルスを
、神経膠腫接種の２日後、腫瘍と同じ座標位置で、接種する。４日目、マウスの後頸部に
、表３に概説するとおり、以下の組み合わせを皮下ワクチン接種する：ｉ）腫瘍ライセー
ト＋Ｐｏｌｙ：ＩＣＬＣ（腫瘍ライセート欄）、ｉｉ）阻害剤に腫瘍ライセート＋Ｐｏｌ
ｙ：ＩＣＬＣ（ワクチンあり欄）を追加、またはｉｉｉ）ＣＮＳ中のアデノウイルス（Ｃ
ＮＳ中欄）。
Figure 2021120405
腫瘍ライセートを投与されるマウスは全匹、アジュバントとしてＰｏｌｙ：ＩＣＬＣを
投与される。陽性対照として、マウスの１群に、Ａｌｚｅｔポンプを用いて、１μｇ／μ
Ｌの一定濃度で、０．５μＬ／ｈｒの速度で阻害剤を腫瘍環境に点滴することで、阻害剤
を投与する。実験は上記のとおり行い、以下に対して新規阻害剤の効果がどのようなもの
であるかを明らかにする：ｉ）リンパ球浸潤及びカスパーゼ３／７活性、ｉｉ）免疫記憶
の発達、ならびにｉｉｉ）生存率。
免疫系にとって好適な環境を維持する、新規阻害剤のＣＮＳへの一定送達系を開発する
。選択された阻害剤（複数可）をコードするアデノウイルスベクターを作製する。この試
験で使用されるベクターは、第一世代の複製欠損組換えアデノウイルス５型ベクター（Ａ
ｄ）であり、Ｅ１領域及びＥ３領域に欠損がある。導入遺伝子を含有する発現カセットを
、Ｅ１領域に挿入することになる（Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ Ｔ， Ｋｒｏｅｇｅｒ ＫＭ，
Ｌｉｕ Ｃ， Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ ＰＲ， Ｃａｓｔｒｏ ＭＧ． Ｇｅｎｅ ｔ
ｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｕｓｉｎｇ
ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃ
ｉ ２００８；Ｃｈａｐｔｅｒ ４： Ｕｎｉｔ ４ ２３）。腫瘍微小環境に分泌させ
ようとする最適化阻害剤をコードするＡｄベクターを構築し、規模拡大し、精製する。ト
ランス遺伝子発現は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にある（Ｃｕｒｔｉｎ ＪＦ，
Ｋｉｎｇ ＧＤ， Ｂａｒｃｉａ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｆｍｓ−ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓ
ｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｒｕｉｔｓ ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉ
ｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ ２００６；１７６（６）： ３５６６−７７；Ａｌｉ Ｓ， Ｋｉｎｇ ＧＤ， Ｃ
ｕｒｔｉｎ ＪＦ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔ
ｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａ
ｐｙ ｐｒｏｖｉｄｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ
ｇｌｉｏｍａ ｍｏｄｅｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５（１６）： ７
１９４−２０４）。全てのウイルス調製物は、以前に記載された方法を用いて、自己複製
能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）及びリポ多糖類（ＬＰＳ）混入がないことについて試
験する（Ｐｕｎｔｅｌ Ｍ， Ｋｒｏｅｇｅｒ ＫＭ， Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＮＳ，
Ｔｈｏｍａｓ ＣＥ， Ｃａｓｔｒｏ ＭＧ， Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ ＰＲ． Ｇｅｎ
ｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒ
ａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０１０；Ｃｈ
ａｐｔｅｒ ４： Ｕｎｉｔ ４ ２４；Ｋｉｎｇ ＧＤ， Ｍｕｈａｍｍａｄ ＡＫ，
Ｃｕｒｔｉｎ ＪＦ， ｅｔ ａｌ． Ｆｌｔ３Ｌ ａｎｄ ＴＫ ｇｅｎｅ ｔｈｅ
ｒａｐｙ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｇｌｉｏｍａ ｉｎ ａ ｓｙ
ｎｇｅｎｅｉｃ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｏｄｅｌ． Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ
２００８；１０（１）： １９−３１）。ラット及びマウスの脳内、同系ＧＢＭモデルに
おける腫瘍微小環境内で導入遺伝子を発現するＡｄの有効性が、鋭意試験され、検証され
てきた。本発明のデータは、Ａｄを腫瘤に直接送達して使用することにより、広範囲及び
安定した治療的トランス遺伝子発現を達成して、腫瘍退縮及び長期抗ＧＢＭ免疫記憶を誘
発することが可能であることを示す（Ｇｈｕｌａｍ Ｍｕｈａｍｍａｄ ＡＫ， Ｃａｎ
ｄｏｌｆｉ Ｍ， Ｋｉｎｇ ＧＤ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｇｌｉｏｍａ ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｏｎｄｉｔｉｏ
ｎａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ／ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｔｈ
ｅｒａｐｙ： ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｌｅａ
ｄ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２
００９；１５（１９）： ６１１３−２７；Ｃａｎｄｏｌｆｉ Ｍ， Ｙａｇｉｚ Ｋ，
ＦｏｕｌａｄＤ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＨＭＧＢ１ ｉｎ ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｇｌｉｏｍａ ｋｉｌｌｉｎｇ ｓｔｒ
ａｔｅｇｉｅｓ： ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｃｌｉ
ｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；１５（１３）： ４４０１−１４；ｃｕｒｔｉｎ
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ｅ１９８３）。
上記説明及び実施例は、本発明を十分に開示及び可能にするものの、それらは本発明の
範囲を制限することを意図せず、本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲
により定義される。
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、本明細書中参照として援用される。上記の説明
において、本発明はそのある特定の実施形態に関して記載されており、例示の目的で多く
の詳細が明記されてきたものの、当業者には明らかなことながら、本発明は、さらなる実
施形態を受け入れる余地があり、本明細書中記載される詳細の中には、本発明の基本原則
から逸脱することなく相当に変更可能なものがある。
「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語、ならびに同様な記述の使用は、本発明
を説明する文脈において、本明細書中特に記載がない限り、または文脈から明らかに矛盾
するのでない限り、単数及び複数両方を包含すると解釈されるものとする。「ｃｏｍｐｒ
ｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）、
及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」という用語は、特に記載がない限り、非制限
的用語（すなわち、「含むが、それらに限定されない」を意味する）と解釈されるものと
する。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中特に記載がない限り、その範囲に含ま
れる各別々の値を個別に示すことを簡略した方法となるにすぎず、各別々の値は、その値
が本明細書中個別に記述されたかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書中記載さ
れる全ての方法は、本明細書中特に記載がない限り、または文脈で明らかに否定されるの
でない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書中提示される、ありとあら
ゆる例示、または例示の言葉（例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ（例えば）」）の使用は、本発
明をよりわかりやすく例示することを意図するにすぎず、特許請求の範囲で記載されない
限り、本発明の範囲に制限をかけることはない。明細書中のどの言葉も、特許請求の範囲
に記載のない要素を本発明の実施に必須であると示すと解釈すべきではない。
本発明の実施形態は、本明細書中、本発明者らが本発明を実行するのに最適であること
を知っている様式を含めて記載される。これらの実施形態の改変形態は、上記の説明を読
むことで、当業者に明らかになる場合がある。本発明者らは、当業者がそのような改変形
態を適宜採用することを期待し、また本発明者らは、本発明が、本明細書中具体的に記載
された以外の形態で実施できることを意図する。したがって、本発明は、適用法で認めら
れるとおりに、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載される対象物の全ての修飾及び等
価物を含む。そのうえ、上記要素のどのような組み合わせも、本明細書中特に記載がない
限り、または文脈で明らかに否定されるのでない限り、それらの全ての可能な組み合わせ
方で本発明に包含される。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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