ES2921801T3 - Inmunorreceptores y epítopos de células T específicos de Claudina-18.2 - Google Patents

Inmunorreceptores y epítopos de células T específicos de Claudina-18.2 Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona inmunorreceptores específicos de Claudin-18.2 (receptores de células T y receptores de células T artificiales (receptores de antígenos quiméricos; CAR)) y epítopos de células T que son útiles para la inmunoterapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunorreceptores y epítopos de células T específicos de Claudina-18.2
Campo técnico
La presente enseñanza se refiere a la provisión de inmunorreceptores (receptores de células T y receptores de células T artificiales (receptores antigénicos quiméricos; CAR)) y epítopos de células T específicos de Claudina-18.2 que son útiles para inmunoterapia.
Antecedentes
La evolución del sistema inmunitario resultó en vertebrados en una red altamente efectiva basada en dos tipos de defensa: la inmunidad innata y la adaptativa.
Por el contrario, con el antiguo sistema inmunitario innato evolutivo que se basa en receptores invariantes que reconocen patrones moleculares comunes asociados con patógenos, la inmunidad adaptativa se basa en receptores de antígenos altamente específicos en células B (linfocitos B) y células T (linfocitos T) y en la selección clonal.
Mientras que las células B generan respuestas inmunitarias humorales mediante la secreción de anticuerpos, las células T median las respuestas inmunitarias celulares que conducen a la destrucción de células reconocidas.
Las células T juegan un papel central en la inmunidad mediada por células en humanos y animales. El reconocimiento y la unión de un antígeno particular está mediado por los receptores de células T (t Cr , por sus siglas en inglés) expresados en la superficie de las células T.
El receptor de célula T (TCR) de una célula T es capaz de interactuar con péptidos inmunogénicos (epítopos) unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y presentados en la superficie de las células diana. La unión específica del TCR desencadena una cascada de señales dentro de la célula T que conducen a la proliferación y diferenciación en una célula T efectora madura. Para poder dirigirse a una amplia variedad de antígenos, los receptores de células T deben tener una gran diversidad.
Esta diversidad se obtiene por reordenamiento genético de diferentes segmentos discontinuos de genes que codifican las diferentes regiones estructurales de los TCR. Los TCR se componen de una cadena a y una cadena p o de una cadena y y una cadena 8. Las cadenas a/p del TCR están compuestas por una región variable N-terminal altamente polimórfica involucrada en el reconocimiento del antígeno y una región constante invariante. En el nivel genético, estas cadenas se separan en varias regiones, una región variable (V), una región de diversidad (D) (solo cadenas p y 8), una región de unión (J) y una región constante (C). Los genes de la cadena p humana contienen más de 60 segmentos variables (V), 2 de diversidad (D), más de 10 segmentos de unión (J) y 2 segmentos de región constante (C). Los genes de la cadena a humana contienen más de 50 segmentos V y más de 60 segmentos J pero ningún segmento D, así como también como un segmento C. Los genes de la cadena p murina contienen más de 30 segmentos variables (V), 2 de diversidad (D), más de 10 segmentos de unión (J) y 2 segmentos de región constante (C). Los genes de la cadena a murina contienen casi 100 segmentos V, 60 segmentos J, ningún segmento D, pero un segmento C. Durante la diferenciación de las células T, se crean genes de receptores de células T específicos mediante reordenamiento de un gen de la región V, uno D (solo cadenas p y 8), uno J y uno C. La diversidad de los TCR se amplifica aún más mediante un reordenamiento impreciso V-(D)-J en donde se introducen y/o eliminan nucleótidos aleatorios en los sitios de recombinación. Dado que el reordenamiento de los loci del gen de TCR se produce en el genoma durante la maduración de las células T, cada célula T madura solo expresa un TCR a/p o TCR y/8 específico.
La unión del MHC y del antígeno está mediada por las regiones determinantes de complementariedad 1, 2 y 3 (CDR1, CDR2, CDR3) del TCR. La CDR3 de la cadena p, que es más crítica para el reconocimiento y la unión del antígeno, está codificada por la unión V-D-J del gen de la cadena p del TCR reordenado.
El TCR es parte de una compleja maquinaria de señalización, que incluye el complejo heterodimérico de las cadenas a y p del TCR, el correceptor CD4 o CD8 y el módulo de transducción de la señale CD3 (figura 1). Mientras que las cadenas CD3 transfieren la señal de activación dentro de la célula, el heterodímero a/p del TCR es el único responsable del reconocimiento del antígeno. Por tanto, la transferencia de las cadenas a/p del TCR ofrece la oportunidad de redirigir las células T hacia cualquier antígeno de interés.
Inmunoterapia
La inmunoterapia antígeno-específica tiene como objetivo mejorar o inducir respuestas inmunitarias específicas en pacientes para controlar enfermedades infecciosas o malignas. La identificación de un número creciente de antígenos asociados a patógenos y tumores (TAA, por sus siglas en inglés) condujo a una amplia colección de dianas adecuadas para la inmunoterapia. Las células que presentan péptidos inmunogénicos (epítopos) derivados de estos antígenos pueden ser dirigidas específicamente mediante estrategias de inmunización activa o pasiva.
La inmunización activa tiende a inducir y expandir las células T antígeno-específicas en el paciente, que son capaces de reconocer y destruir específicamente las células enfermas. Por el contrario, la inmunización pasiva se basa en la transferencia adoptiva de células T, que se expandieron y, opcionalmente, se modificaron genéticamente in vitro (terapia de células T adoptivas).
Vacunación:
Las vacunas tumorales tienen como objetivo inducir respuestas inmunitarias endógenas tumor-específicas mediante inmunización activa. Diferentes formatos de antígenos pueden usarse para la vacunación tumoral, incluidas células cancerosas completas, proteínas, péptidos o vectores inmunizantes tales como ARN, ADN o vectores virales que se pueden aplicar directamente in vivo o in vitro al pulsar las CD después de la transferencia al paciente.
El número de estudios clínicos donde se pueden identificar respuestas inmunitarias inducidas por terapia aumenta constantemente debido a las mejoras en las estrategias de inmunización y los métodos para la detección de respuestas inmunitarias antígeno-específicas (Connerotte, T. y otros (2008). Cancer Res. 68, 3931-3940; Schmitt, M. y otros (2008) Blood 111, 1357-1365; Speiser, D.E. y otros (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. E. U. A 105, 3849-3854; Adams, S. y otros (2008) J. Immunol. 181, 776-784).
Sin embargo, en la mayoría de los casos, las respuestas inmunitarias detectadas no pueden correlacionarse sistémicamente con los resultados clínicos (Curigliano, G. y otros (2006) Ann. Oncol. 17, 750-762; Rosenberg, S.A. y otros (2004) Nat. Med. 10, 909-915).
La definición exacta de epítopos peptídicos derivados de antígenos tumorales puede, por tanto, contribuir a mejorar la especificidad y la eficiencia de las estrategias de vacunación, así como también los métodos de inmunomonitoreo.
Transferencia adoptiva de células (ACT, por sus siglas en inglés)
La inmunoterapia basada en ACT puede definirse ampliamente como una forma de inmunización pasiva con células T previamente sensibilizadas que se transfieren a receptores no inmunes o al huésped autólogo después de la expansión ex vivo desde bajas frecuencias de precursores hasta números de células clínicamente relevantes. Los tipos de células que se han usado para los experimentos de ACT son las células asesinas activadas por linfocinas (LAK, por sus siglas en inglés) (Mule, J.J. y otros (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. y otros (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) (Rosenberg, S.A. y otros (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), linfocitos donantes después de un trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT, por sus siglas en inglés), así como también líneas o clones de células T tumor-específicas (Dudley, M.E. y otros (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. y otros (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. E. U. A 99, 16168-16173). Se demostró que la transferencia de células T adoptivas tiene actividad terapéutica contra infecciones virales humanas tal como el c Mv . Si bien la infección por CMV y la reactivación de virus latentes endógenos están controladas por el sistema inmunitario en individuos sanos, da como resultado una morbilidad y mortalidad significativas en individuos inmunocomprometidos, tales como receptores de trasplantes o pacientes con SIDA.
Riddell y colaboradores demostraron la reconstitución de la inmunidad viral mediante la terapia de células T adoptivas en pacientes inmunodeprimidos después de la transferencia de clones de células T CD8+ específicos para CMV derivados de donantes de trasplantes seropositivos para CMV compatibles con HLA (Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238-241).
Como un enfoque alternativo, se transfirieron poblaciones policlonales de células T específicas para CMV o EBV derivadas de donantes a receptores de trasplantes, lo que resulta en una mayor persistencia de células T transferidas (Rooney, C.M. y otros (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. y otros (2003) Lancet 362, 1375-1377).
Para la inmunoterapia adoptiva del melanoma, Rosenberg y sus colaboradores establecieron un enfoque de ACT que se basaba en la infusión de linfocitos infiltrantes de tumores autólogos expandidos (TIL) in vitro aislados de tumores extirpados en combinación con una quimioterapia linfodepletora no mieloablativa e IL2 a dosis altas. Un estudio clínico publicado recientemente dio como resultado una tasa de respuesta objetiva de ~50 % de los pacientes tratados que padecen melanoma metastásico (Dudley, M.E. y otros (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357).
Sin embargo, los pacientes deben cumplir con varias premisas para ser elegibles para la inmunoterapia de ACT. Deben tener tumores resecables. Los tumores deben generar TIL viables en condiciones de cultivo celular. Los TIL deben ser reactivos contra los antígenos tumorales y deben expandirse in vitro hasta números suficientes. Especialmente en otros cánceres distintos del melanoma, es difícil obtener tales TIL reactivos a tumores. Además, la estimulación in vitro repetida y la expansión clonal de linfocitos T humanos normales dan como resultado una disminución progresiva de la actividad de la telomerasa y el acortamiento de los telómeros, lo que da como resultado una senescencia replicativa y una disminución del potencial para la persistencia de las células T transferidas (Shen, X. y otros (2007) J. Immunother. 30: 123-129).
ACT mediante el uso de células T con genes modificados
Un enfoque que supera las limitaciones de ACT es la transferencia adoptiva de células T autólogas reprogramadas para expresar un inmunorreceptor reactivo al tumor de especificidad definida durante un cultivo ex vivo de corto tiempo seguido de reinfusión en el paciente (Kershaw M.H. y otros (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525-41). Esta estrategia hace que la ACT sea aplicable a una variedad de neoplasias malignas comunes, incluso si las células T reactivas al tumor están ausentes en el paciente. Dado que la especificidad antigénica de las células T se basa completamente en el complejo heterodimérico de las cadenas a y p del TCR, la transferencia de genes del TCR clonados en las células T ofrece el potencial de redirigirlas hacia cualquier antígeno de interés. Por lo tanto, la terapia génica con TCR proporciona una estrategia atractiva para desarrollar inmunoterapia antígeno-específica con linfocitos autólogos como opción de tratamiento. Las principales ventajas de la transferencia de genes del TCR son la creación de cantidades terapéuticas de células T antígeno-específicas dentro de unos pocos días y la posibilidad de introducir especificidades que no están presentes en el repertorio del TCR endógeno del paciente.
Varios grupos demostraron que la transferencia del gen TCR es una estrategia atractiva para redirigir la especificidad del antígeno de las células T primarias (Morgan, R.A. y otros (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. y otros (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. y otros (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. y otros (1986) Nature 320, 232-238).
Rosenberg y su grupo demostraron recientemente la viabilidad de la terapia génica con TCR en humanos en ensayos clínicos para el tratamiento del melanoma maligno. La transferencia adoptiva de linfocitos autólogos transducidos retroviralmente con TCR antígeno-específicas de melanoma/melanocito dio como resultado la regresión del cáncer en hasta el 30 % de los pacientes con melanoma tratados (Morgan, R.A. y otros (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. y otros (2009) Blood 114, 535-546).
Receptores antigénicos quiméricos
Los receptores antigénicos quiméricos (CAR) son receptores modificados genéticamente que combinan un fragmento variable cadena sencilla (scFv) de un anticuerpo monoclonal con una parte intracelular que consiste de uno o más dominios de señalización para la activación de las células T. Los CAR reconocen los antígenos nativos de una manera no restringida por MHC y, por lo tanto, pueden usarse en todos los individuos sin importar cuál sea su tipo de HLA y son funcionales en células T CD4+ así como también CD8+.
Se ha informado de una multitud de CAR durante la última década, dirigidas a un panel de diferentes antígenos tumorales de la superficie celular. Sus funciones biológicas se mejoraron drásticamente mediante la incorporación de un dominio coestimulador que dio como resultado receptores tripartitos (scFv, CD28, CD3Z), denominados CAR de 2da generación. Los CAR de la 3ra generación abarcan dominios adicionales de moléculas coestimuladoras tales como OX40 y 4-1BB para mejorar la capacidad proliferativa y la persistencia de las células T modificadas (figura 2).
Estructuras diana para inmunoterapia antígeno-específica
El descubrimiento de múltiples antígenos asociados a tumores (TAA) ha proporcionado las bases para los conceptos de inmunoterapia antígeno-específica (Novellino, L. y otros (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207). Los TAA son proteínas inusuales que se expresan en las células tumorales debido a su inestabilidad genética, que tienen una expresión nula o limitada en las células normales. Estos TAA pueden conducir al reconocimiento específico de células malignas por parte del sistema inmunitario.
La clonación molecular de TAA mediante la detección de bibliotecas de expresión de ADNc derivados de tumores mediante el uso de células T tumor-específicas autólogas (van der Bruggen, P. y otros (1991) Science 254, 1643­ 1647) o anticuerpos circulantes (Sahin, U. y otros (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A 92, 11810-11813), enfoques de inmunología inversa, métodos bioquímicos (Hunt, DF y otros (1992) Science 256, 1817-1820), análisis de expresión génica o estrategias de clonación in sílico (Helftenbein, G. y otros (2008) Gene 414, 76-84) condujeron a un número significativo de candidatos diana para estrategias inmunoterapéuticas. Los TAA se dividen en varias categorías, que incluyen antígenos de diferenciación, antígenos sobreexpresados, variantes de corte y empalme tumor-específicas, productos génicos mutados, antígenos virales y de cáncer de testículo (CTA, por sus siglas en inglés). La familia del cáncer de testículo es una categoría muy prometedora de TAA ya que su expresión está restringida al testículo y a una multitud de entidades tumorales diferentes (Scanlan, M.J. y otros (2002) Immunol. Rev. 188, 22-32). Hasta ahora se han descrito más de 50 genes CT (Scanlan, M.J. y otros (2004) Cancer Immun. 4, 1) y algunos de ellos se han direccionado en estudios clínicos (Adams, S. y otros (2008) J. Immunol. 181, 776-784; Atanackovic, D. y otros (2004) J. Immunol. 172, 3289-3296; Chen, Q. y otros (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. E. U. A 101, 9363-9368; Connerotte, T. y otros (2008). Cancer Res. 68, 3931-3940; Davis, I.D. y otros (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. E. U. A 101, 10697-10702; Jager, E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. E. U. A 97, 12198-12203; Marchand, M. y otros (1999) Int. J. Cancer 80, 219­ 230; Schuler-Thurner, B. y otros (2000) J. Immunol. 165, 3492-3496).
A pesar del creciente número de estructuras diana atractivas para enfoques inmunoterapéuticos, solo existen clones o líneas de células T específicas de restricción HLA definida para algunos de ellos (Chaux, P. y otros (1999) J.
Immunol. 163, 2928-2936; Zhang, Y. y otros (2002) Tissue Antigens 60, 365-371; Zhao, Y. y otros (2005) J. Immunol.
174, 4415-4423).
Las claudinas son proteínas integrales de membrana localizadas dentro de las uniones estrechas de los epitelios y endotelios. Se predice que las claudinas tienen cuatro segmentos transmembrana con dos lazos extracelulares, y N-y C-terminales localizados en el citoplasma. La familia claudina (CLDN) de proteínas transmembrana desempeña un papel crítico en el mantenimiento de las uniones estrechas epiteliales y endoteliales y pueden desempeñar también un papel en el mantenimiento del citoesqueleto y en la señalización celular. La CLDN18 pertenece a la familia de las claudinas, que son moléculas de la superficie celular con cuatro dominios que atraviesan la membrana involucrados en la formación de uniones estrechas (Tsukita S, Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2:285-93). El gen CLDN18 humano tiene dos primeros exones alternativos, que dan lugar a dos isoformas de proteínas (CLDN18.1 y CLDN18.2) que difieren en los 69 aminoácidos N-terminales (Niimi T, MolCellBiol 2001;21:7380-90), incluido el primer lazo extracelular (figura 4A). El perfil de transcripción de un conjunto restringido de tejidos ha demostrado que estas isoformas tienen compromisos de linaje diferentes, con CLDN18.1 que es predominantemente expresado en tejido pulmonar mientras que CLDN18.2 muestra especificidad de estómago. La expresión de CLDN18.2 se limita a los epitelios diferenciados de corta duración de la mucosa gástrica y está ausente de la zona de células madre gástricas y de cualquier otro tejido sano. La expresión de CLDN18.2 se ha asociado con cánceres gastroesofágicos, pancreáticos y de otro tipo (figura 4B, C; Sahin U y otros, Clin Cancer Res 2008;14:7624-34; Karanjawala ZE y otros, Am J Surg Pathol 2008;32:188-96;). Un mAb recombinante contra esta diana está actualmente en ensayos clínicos de Fase II, pero la evaluación de CLDN18.2 como diana para enfoques de terapia basada en células T aún no se ha direccionado.
La sobreexpresión frecuente de CLDN18.2 en tumores califica a esta molécula como una diana muy atractiva para el desarrollo de terapias dirigidas contra CLDN18.2 tales como vacunas terapéuticas y anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, hasta ahora no se han descrito epítopos de células T CLDN18.2 restringidos por HLA-A*2 y receptores de células T o CAR que se dirigen a CLDN18.2 y se desconoce si CLDN18.2 que expresan células cancerosas puede ser dirigido in vivo por inmunoterapias que involucran células T mediante el uso de enfoques de inmunización activa o pasiva.
Descripción
Resumen de la invención
La presente divulgación proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la divulgación de la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no es parte de la invención. En particular, los términos "realización" y "aspecto" no deben interpretarse como una referencia necesaria a la invención reivindicada, a menos que el asunto objeto en cuestión esté dentro del alcance de las reivindicaciones.
La presente enseñanza se refiere a receptores de células T y receptores de células T artificiales específicos para el antígeno asociado a tumores CLDN18.2, en particular cuando están presentes en la superficie de una célula tal como una célula enferma o se presentan en la superficie de una célula como una célula enferma o una célula presentadora de antígeno, así como también péptidos que comprenden epítopos reconocidos por estos receptores de células T, es decir, epítopos de células T CLDN18.2.
Mediante la transferencia adoptiva de células T modificadas genéticamente para expresar dicho receptor de células T o receptor de células T artificial CLDN18.2 que expresan las células cancerosas pueden dirigirse específicamente a las células cancerosas, lo que conduce de esta manera a la destrucción selectiva de las células cancerosas. Además, los epítopos de células T proporcionados de acuerdo con las enseñanzas son útiles para diseñar vacunas contra cánceres que expresan CLDN18.2.
En un aspecto, la enseñanza se refiere a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, el péptido es 100 o menos, 50 o menos, 20 o menos, o 10 o menos aminoácidos de longitud. En una realización, el péptido puede procesarse para producir un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
En una realización, el péptido es un péptido presentado por MHC de clase I o clase II, preferentemente un péptido presentado por MHC de clase I o, si está presente dentro de las células, puede procesarse para producir un producto de procesamiento del mismo que es péptido es un péptido presentado por MHC de clase I o clase II, preferentemente un péptido presentado por m Hc de clase I. Preferentemente, dicho péptido es un péptido presentado por MHC de clase I o clase II tiene una secuencia que se corresponde sustancialmente con la secuencia de aminoácidos dada, es decir, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. Preferentemente, un péptido de acuerdo con la enseñanza es capaz de estimular una respuesta celular contra una enfermedad que involucra células caracterizadas por la presentación de CLDN18.2 con el MHC de clase I.
En aspectos adicionales, la enseñanza se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la enseñanza y una célula que comprende el ácido nucleico. El ácido nucleico puede ser un ácido nucleico recombinante. El ácido nucleico puede estar presente en un plásmido o un vector de expresión y puede estar unido funcionalmente a un promotor. En una realización, el ácido nucleico es ARN. Preferentemente, la célula expresa el péptido. La célula puede ser una célula recombinante y puede secretar el péptido codificado o un producto de procesamiento del mismo, puede expresarlo en la superficie y preferentemente puede expresar adicionalmente una molécula de MHC que se une a dicho péptido o un producto de procesamiento del mismo y preferentemente presenta dicho péptido o un producto de procesamiento del mismo en la superficie celular. En una realización, la célula expresa endógenamente la molécula de MHC. En una realización adicional, la célula expresa la molécula de MHC y/o el péptido de manera recombinante. La célula es preferentemente no proliferativa. En una realización preferida, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a una célula que presenta el péptido de la enseñanza o un producto de procesamiento del mismo, en donde el producto de procesamiento es preferentemente un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos dada, es decir, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, dicha célula es una célula que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la enseñanza. Preferentemente, dicha célula expresa dicho ácido nucleico para producir dicho péptido. Opcionalmente, dicha célula procesa dicho péptido para producir un péptido que consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. La célula puede presentar el péptido o un producto de procesamiento del mismo mediante moléculas de MHC en su superficie. En una realización, la célula expresa endógenamente una molécula de MHC. En una realización adicional, la célula expresa de forma recombinante una molécula de MHC. En una realización, las moléculas de MHC de la célula se cargan (pulsan) con el péptido mediante la adición del péptido a la célula. La célula puede expresar de forma recombinante el péptido y presentar dicho péptido o un producto de procesamiento del mismo en la superficie celular. La célula es preferentemente no proliferativa. En una realización preferida, la célula es una célula presentadora de antígeno tal como una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a una célula inmunorreactiva que es reactiva con un péptido de la enseñanza, en particular cuando se presenta en la superficie de una célula tal como una célula enferma. La célula inmunorreactiva puede ser una célula que se ha sensibilizado in vitro para reconocer el péptido. La célula inmunorreactiva puede ser una célula T, preferentemente una célula T citotóxica. Preferentemente, la célula inmunorreactiva se une a una secuencia que se corresponde sustancialmente con la secuencia de aminoácidos dada, es decir, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos, en particular cuando se une a MHC tal como MHC en la superficie de una célula tal como una célula enferma.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un agente de unión que se une a un péptido de la enseñanza, opcionalmente en un complejo con una molécula de MHC.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un receptor de células T que se une a un péptido de la enseñanza, opcionalmente en un complejo con una molécula de MHC, y preferentemente es reactivo con dicho péptido, o una cadena polipeptídica de dicho receptor de células T. En una realización, la cadena polipeptídica de dicho receptor de células T es una cadena a del receptor de células T o una cadena p del receptor de células T.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a una cadena a del receptor de células T o un receptor de células T que comprende dicha cadena a del receptor de células T,
en donde dicha cadena a del receptor de células T se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una cadena a del receptor de células T que comprende al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una cadena a del receptor de células T seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16 y 18 o una variante de las mismas y
(ii) una cadena a del receptor de células T que comprende una secuencia de la cadena a del receptor de células T seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16 y 18 o un fragmento de las mismas o una variante de dicha secuencia o fragmento.
En una realización, dichas SEQ ID NO: se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 10, 14 y 18 y dicho receptor de células T es reactivo con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
En una realización, dichas SEQ ID NO: se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 12 y 14 y dicho receptor de células T es reactivo con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a una cadena p del receptor de células T o un receptor de células T que comprende dicha cadena p del receptor de células T,
en donde dicha cadena p del receptor de células T se selecciona del grupo que consiste en:
(i) una cadena p del receptor de células T que comprende al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una cadena p del receptor de células T seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 y 19 o una variante de las mismas
y
(ii) una cadena p del receptor de células T que comprende una secuencia de cadena p del receptor de células T seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 y 19 o un fragmento de las mismas o una variante de dicha secuencia o fragmento.
En una realización, dichas SEQ ID NO: se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 11, 15 y 19 y dicho receptor de células T es reactivo con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
En una realización, dichas SEQ ID NO: se seleccionan del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 13 y 15 y dicho receptor de células T es reactivo con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un receptor de células T seleccionado del grupo que consiste en: (I) un receptor de células T que comprende:
(i) una cadena a del receptor de células T que comprende al menos una, preferentemente, dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de la cadena a del receptor de células T de SEQ ID NO: x, o una variante de la misma, y (ii) una cadena p del receptor de células T que comprende al menos una, preferentemente dos, con mayor preferencia las tres secuencias de CDR de una cadena p del receptor de células T de SEQ ID NO: x+1 o una variante de la misma; en donde x se seleccionó del grupo que consiste en 8, 10, 12, 14, 16 y 18
y
(II) un receptor de células T que comprende:
(i) una cadena a del receptor de células T que comprende la secuencia de la cadena a del receptor de células T de SEQ ID NO: x o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento, y
(ii) una cadena p del receptor de células T que comprende la secuencia de la cadena p del receptor de células T de SEQ ID NO: x+1 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento;
en donde x se seleccionó del grupo que consiste en 8, 10, 12, 14, 16 y 18.
En una realización, dicha x se selecciona del grupo que consiste en 8, 10, 14 y 18 y dicho receptor de células T es reactivo con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
En una realización, dicha x se selecciona del grupo que consiste en 10, 12 y 14 y dicho receptor de células T es reactivo con un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
En una realización, la unión de dicho receptor de células T cuando se expresa por células T y/o se presenta en células T a epítopos de CLDN18.2-péptido como se describió anteriormente presentados en células tales como células cancerosas resulta en la proliferación y/o activación de dichas células T, en donde dichas células T activadas preferentemente liberan factores citotóxicos, por ejemplo, perforinas y granzimas, e inician la citólisis y/o apoptosis de las células cancerosas.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un receptor de células T artificial que se une a claudina-18.2 (CLDN18.2). En una realización, la unión es una unión específica.
En una realización, dicha CLDN18.2 se expresa en una célula cancerosa. En una realización, dicha CLDN18.2 se expresa en la superficie de una célula cancerosa. En una realización, dicho receptor de células T artificial se une a un dominio extracelular o a un epítopo en un dominio extracelular de CLDN18.2. En una realización dicho receptor de células T artificial se une a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes en la superficie de las células vivas. En una realización dicho receptor de células T artificial se une al primer lazo extracelular de CLDN18.2. En una realización, la unión de dicho receptor de células T artificial cuando se expresa por células T y/o se presenta en células T a la CLDN18.2 presente en células tales como células cancerosas resulta en la proliferación y/o activación de dichas células T, en donde dichas células T activadas preferentemente liberan factores citotóxicos, por ejemplo, perforinas y granzimas, e inician la citólisis y apoptosis de las células cancerosas.
En una realización, el receptor de células T artificial de la enseñanza comprende un dominio de unión para CLDN18.2. En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 está compuesto por un exodominio de dicho receptor de células T artificial. En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 comprende un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) de un anticuerpo a CLDN18.2. En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 comprende una región variable de una cadena pesada de una inmunoglobulina (VH) con una especificidad por CLDN18.2 (VH(CLDN18.2)) y una región variable de una cadena ligera de un inmunoglobulina (VL) con especificidad para CLDN18.2 (VL(CLDN18.2)). En una realización, dicha región variable de cadena pesada (VH) y la correspondiente región variable de cadena ligera (VL) están conectadas mediante un enlazador peptídico, preferentemente un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos (GGGGS)3. En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 comprende una VH(CLDN18.2) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 23 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento. En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 comprende una VL(CLDN18.2) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento. En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 comprende una VH(CLDN18.2) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 23 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento y una VL(CLDN18.2) comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento. En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 35 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento.
En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo como un dominio de unión para CLDN18.2 o un anticuerpo a CLDN18.2 que comprende un VH(CLDN18.2) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 23 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento y una VL(CLDN18.2) comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento y/o compite con dicho dominio de unión a CLDN18.2 o anticuerpo a CLDN18.2 por unirse a CLDN18.2. En una realización, el dominio de unión para CLDN18.2 reconoce el mismo o esencialmente el mismo epítopo que el dominio de unión para CLDN18.2 que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento y/o compite con dicho dominio de unión a CLDN18.2 por unirse a CLDN18.2. Un dominio de unión que compite con un segundo dominio de unión o un anticuerpo por unirse a una diana es preferentemente antagonista de dicho segundo dominio de unión o anticuerpo.
En una realización, el receptor de células T artificial de la enseñanza comprende un dominio transmembrana. En una realización, el dominio transmembrana es una alfa hélice hidrófoba que atraviesa la membrana. En una realización, el dominio transmembrana comprende el dominio transmembrana CD28 o un fragmento del mismo.
En una realización, el receptor de células T artificial de la enseñanza comprende un dominio de señalización de células T. En una realización, el dominio de señalización de células T se localiza intracelularmente. En una realización, el dominio de señalización de células T comprende CD3-zeta, preferentemente el endodominio de CD3-zeta, opcionalmente en combinación con CD28. En una realización, el dominio de señalización de células T comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 40 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento.
En una realización, el receptor de células T artificial de la enseñanza comprende un péptido señal que dirige la proteína naciente al retículo endoplásmico. En una realización, el péptido señal precede al dominio de unión para CLDN18.2. En una realización, el péptido señal comprende la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 37 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento.
En una realización, el receptor de células T artificial de la enseñanza comprende una región espaciadora que une el dominio de unión para CLDN18.2 al dominio transmembrana. En una realización, la región espaciadora permite que el dominio de unión para CLDN18.2 se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento de CLDN18.2. En una realización, la región espaciadora comprende la región bisagra de IgG1. En una realización, la región espaciadora comprende la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 38 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia o fragmento.
En una realización, el receptor de células T artificial de la enseñanza comprende la estructura:
NH2 - péptido señal - dominio de unión para CLDN18.2 - región espaciadora - dominio transmembrana - dominio de señalización de células T - COOH.
En una realización, el receptor de células T artificial de la enseñanza comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 41 o un fragmento de la misma, o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento.
Los receptores de células T y los receptores de células T artificiales anteriores son preferentemente específicos para el antígeno asociado a tumores CLDN18.2, en particular cuando están presentes en la superficie de una célula tal como una célula enferma o cuando se presentan en la superficie de una célula como una célula enferma o una célula presentadora de antígeno.
Los receptores de células T y los receptores de células T artificiales de la enseñanza pueden expresarse y/o estar presentes en la superficie de células tales como células T.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena del receptor de células T o el receptor de células T de la enseñanza o que codifica el receptor de células T artificial de la enseñanza. En una realización, el ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante. En una realización, el ácido nucleico tiene forma de un vector o la forma de ARN.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a una célula que comprende la cadena del receptor de células T o el receptor de células T de la enseñanza o el receptor de células T artificial de la enseñanza y/o que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena del receptor de células T o receptor de células T de la enseñanza o que codifica el receptor de células T artificial de la enseñanza. En una realización, dicho ácido nucleico es ARN, preferentemente ARN transcrito in vitro. La célula puede ser una célula que expresa la cadena del receptor de células T o el receptor de células T de la enseñanza o el receptor de células T artificial de la enseñanza y/o puede tener la cadena del receptor de células T o el receptor de células T de la enseñanza o el receptor de células T artificial de la enseñanza en su superficie celular. En una realización, dicha célula es una célula que es útil para la transferencia adoptiva de células. La célula puede ser un efector o una célula madre, preferentemente una célula inmunorreactiva. La célula inmunorreactiva puede ser una célula T, preferentemente una célula T citotóxica. En una realización, la célula inmunorreactiva es reactiva con el antígeno asociado a tumores CLDN18.2. En una realización, dicha CLDN18.2 está presente en la superficie de una célula tal como una célula enferma. En una realización, dicha CLDN18.2 se presenta en la superficie de una célula tal como una célula enferma o una célula presentadora de antígeno, y la célula inmunorreactiva es reactiva con un péptido de la enseñanza, en particular cuando se presenta en el contexto de MHC, y preferentemente se une a una secuencia que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos dada, es decir, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, dicha célula carece de expresión superficial de un TCR endógeno o es específica para un antígeno no relacionado con CLDN18.2.
En una realización, las células de la enseñanza antes de usar en la transferencia adoptiva de células se someten a una expansión y reexposición antígeno-específicas, en donde la expansión y reexposición específicas antígenoespecíficas se pueden efectuar al exponer las células a células presentadoras de antígeno preferentemente autólogos que presentan CLDN18.2 o un fragmento peptídico del mismo.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un método para producir una célula inmunorreactiva que comprende la etapa de transducir una célula T con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena del receptor de células T o el receptor de células T de la enseñanza o que codifica el receptor de células T artificial de la enseñanza.
Además, la presente enseñanza abarca generalmente el tratamiento de enfermedades al dirigirse a células enfermas tales como células cancerosas, en particular células cancerosas que expresan CLDN18.2. Los métodos prevén la erradicación selectiva de células que expresan en su superficie y/o presentan el antígeno asociado a tumores CLDN18.2, que minimiza de esta manera los efectos adversos en las células normales que no expresan y/o presentan CLDN18.2. Por tanto, las enfermedades preferidas para una terapia son aquellas en las que se expresa CLDN18.2 y se presenta opcionalmente, tales como enfermedades cancerosas, en particular las descritas en la presente descripción.
Cuando se administra un péptido de la enseñanza, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la enseñanza o una célula de la enseñanza que comprende dicho ácido nucleico, el tratamiento implica preferentemente una inmunización activa. Preferentemente, las células T específicas a CLDN18.2 se expanden en el paciente, que son capaces de reconocer y destruir las células enfermas. Cuando se administra una célula inmunorreactiva de la enseñanza, un receptor de células T de la enseñanza, un receptor de células T artificial de la enseñanza, un ácido nucleico de la enseñanza que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de células T de la enseñanza o que codifica un receptor de células T artificial de la enseñanza o una célula de la enseñanza que comprende un receptor de células T o un receptor de células T artificial de la enseñanza y/o que comprende un ácido nucleico de la enseñanza que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de células T de la enseñanza o que codifica un receptor de células T artificial de la enseñanza, el tratamiento implica preferentemente una inmunización pasiva. Preferentemente, las células T específicas a CLDN18.2 que son capaces de reconocer y destruir células enfermas y que opcionalmente se modificaron genéticamente y/o se expandieron in vitro se transfieren de forma adoptiva a un paciente.
En un aspecto, la enseñanza se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más de:
(i) el péptido de la enseñanza;
(ii) el ácido nucleico de la enseñanza;
(iii) la célula de la enseñanza;
(iv) la célula inmunorreactiva de la enseñanza;
(v) el agente aglutinante de la enseñanza;
(vi) el receptor de células T de la enseñanza; y
(vii) el receptor de células T artificial de la enseñanza.
Una composición farmacéutica de la enseñanza puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente, puede comprender uno o más adyuvantes, estabilizadores, etc. La composición farmacéutica puede estar en forma de vacuna terapéutica o profiláctica. En una realización, la composición farmacéutica es para usar en el tratamiento o prevención de una enfermedad cancerosa tal como aquellas descritas en la presente descripción.
La administración de una composición farmacéutica como se describió anteriormente puede proporcionar epítopos presentados en MHC de clase II que son capaces de provocar una respuesta de células T CD4+ cooperadoras y/o una respuesta de células T CD8+ contra CLDN18.2 (incluidas células que expresan CLDN18.2 en su superficie y/o presentan CLDN18.2 en el contexto de las moléculas de MHC). Alternativamente o adicionalmente, la administración de una composición farmacéutica como se describió anteriormente puede proporcionar epítopos presentados en MHC de clase I que son capaces de provocar una respuesta de células T CD8+ contra CLDN18.2.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un método para tratar o prevenir una enfermedad cancerosa que comprende administrar a un paciente la composición farmacéutica de la enseñanza.
En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere al péptido de la enseñanza, el ácido nucleico de la enseñanza, la célula de la enseñanza, la célula inmunorreactiva de la enseñanza, el agente de unión de la enseñanza, el receptor de células T de la enseñanza, o el receptor de células T artificial de la enseñanza para usar en terapia, en particular para usar en el tratamiento o prevención del cáncer.
Otro aspecto se refiere a un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica de la enseñanza.
Otro aspecto se refiere a un método para estimular, cebar y/o expandir células T, que comprende poner en contacto las células T con uno o más de: el péptido de la enseñanza, el ácido nucleico de la enseñanza que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la enseñanza, la célula de la enseñanza que comprende dicho ácido nucleico y/o la célula de la enseñanza que presenta el péptido de la enseñanza o un producto de procesamiento del mismo. En una realización, el péptido de la enseñanza se presenta en el contexto de moléculas de MHC tales como moléculas de MHC en la superficie de las células, por ejemplo, células presentadoras de antígenos.
En este aspecto, la enseñanza puede referirse a un método para preparar células T específicas a CLDN18.2. Las células T se pueden estimular, cebar y/o expandir in vitro o in vivo. Preferentemente, las células T están presentes en una muestra obtenida de un sujeto. Las células T estimuladas, cebadas y/o expandidas pueden administrarse a un sujeto y pueden ser autólogas, alogénicas, singénicas para el sujeto.
La enseñanza de los aspectos anteriores de un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto o de un método para estimular, cebar y/o expandir células T puede referirse aun método para tratar enfermedades cancerosas en un sujeto.
Otro aspecto se refiere a un método para destruir células cancerosas en un sujeto, que comprende la etapa de proporcionar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido de la enseñanza, el ácido nucleico de la enseñanza, la célula de la enseñanza, la célula inmunorreactiva de la enseñanza, el agente de unión de la enseñanza, el receptor de células T de la enseñanza o el receptor de células T artificial de la enseñanza.
Las composiciones y agentes descritos en la presente descripción son preferentemente capaces de inducir o promover una respuesta celular, preferentemente actividad de células T citotóxicas, contra una enfermedad caracterizada por la expresión de CLDN18.2 y/o presentación de CLDN18.2 con MHC de clase I, por ejemplo, una enfermedad cancerosa.
En un aspecto, la enseñanza proporciona los agentes y composiciones descritos en la presente descripción para usar en los métodos de tratamiento descritos en la presente descripción.
Los tratamientos de enfermedades cancerosas descritos en la presente descripción pueden combinarse con resección quirúrgica y/o radiación y/o quimioterapia tradicional.
En otro aspecto, la enseñanza se refiere a un método para determinar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende determinar la reactividad de células T con un péptido de la enseñanza o una célula de la enseñanza que presenta un péptido de la enseñanza o un producto de procesamiento del mismo en una muestra biológica aislada del sujeto. El método puede comprender las etapas de:
(a) incubar una muestra que comprende células T aisladas de un sujeto con uno o más de:
(i) el péptido de la enseñanza;
(ii) el ácido nucleico de la enseñanza que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de la enseñanza; y
(iii) la célula de la enseñanza que comprende dicho ácido nucleico o la célula de la enseñanza que presenta un péptido de la enseñanza o un producto de procesamiento del mismo; y
(b) detectar la activación específica de las células T, a partir de lo cual se determina la presencia o ausencia de una respuesta inmunitaria en dicho sujeto.
La enseñanza en los aspectos anteriores de un método para determinar una respuesta inmunitaria en un sujeto puede referirse a un método para diagnosticar enfermedades cancerosas en un sujeto.
En una realización de los métodos de diagnóstico, la muestra biológica es de un tejido u órgano en donde las células, cuando el tejido u órgano está libre de enfermedad, no expresan sustancialmente CLDN18.2.
Típicamente, el nivel de células T en una muestra biológica se compara con un nivel de referencia, en donde una desviación de dicho nivel de referencia es indicativo de la presencia y/o etapa de una enfermedad en un sujeto. El nivel de referencia puede ser un nivel determinado en una muestra de control (por ejemplo, de un tejido o sujeto sano) o un nivel mediano a partir de sujetos sanos. Una "desviación" de dicho nivel de referencia designa cualquier cambio significativo, tal como un aumento en al menos 10 %, 20 % o 30 %, preferentemente, en al menos 40 % o 50 %, o incluso más. Preferentemente, la presencia de células T en dicha muestra biológica o una cantidad de células T en la muestra biológica que se incrementa en comparación con un nivel de referencia indica la presencia de una enfermedad.
Las células T pueden aislarse de la sangre periférica del paciente, los ganglios linfáticos, las muestras de tejido tales como, derivadas de una biopsia y resección u otra fuente. Los ensayos de reactividad pueden realizarse en células T primarias u otros derivados apropiados. Por ejemplo, las células T pueden fusionarse para generar hibridomas. Los ensayos para medir la capacidad de respuesta de las células T son conocidos en la técnica e incluyen ensayos de proliferación y ensayos de liberación de citocinas.
Los ensayos e índices para detectar células T reactivas incluyen, pero no se limitan al uso de ELISPOT de IFNy y tinción de citocinas intracelulares de IFNy. Se conocen en la técnica otros métodos diversos para determinar si un clon de células T responderá a un péptido particular. Típicamente, el péptido se añade a una suspensión de células T durante un período de uno a tres días. La respuesta de las células T puede medirse mediante proliferación, por ejemplo, captación detimidina marcada, o mediante liberación de citocinas, por ejemplo, IL-2. Diversos ensayos están disponibles para detectar la presencia de citocinas liberadas. Pueden usarse ensayos citotóxicos de células T para detectar células T citotóxicas que tienen especificidad por antígenos. En una realización, las células T citotóxicas se prueban para su capacidad para destruir células diana que presentan un antígeno con moléculas de MHC de clase I. Las células diana que presentan un antígeno se pueden marcar y añadir a una suspensión de células T a partir de una muestra de paciente. La citotoxicidad puede medirse al cuantificar la liberación del marcador de las células lisadas. Controles para la liberación total y espontánea pueden incluirse en el ensayo.
En una realización de la enseñanza, un cáncer descrito en la presente descripción implica células cancerosas que expresan CLDN18.2 y/o presentan CLDN18.2 en el contexto de moléculas de MHC. En una realización de la enseñanza, las células enfermas son células cancerosas. En una realización, las células enfermas, tales como células cancerosas, son células que expresan CLDN18.2 y/o presentan CLDN18.2 en el contexto de moléculas de MHC. En una realización, la expresión de CLDN18.2 está en la superficie de una célula enferma.
En una realización de la enseñanza, un cáncer es un adenocarcinoma, en particular un adenocarcinoma avanzado. En una realización, un cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer de la vesícula biliar y la metástasis de los mismos, un tumor de Krukenberg, metástasis peritoneal y/o metástasis de ganglios linfáticos. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de esófago, en particular de esófago inferior, cáncer de la unión esofágica y cáncer gastroesofágico. En una realización, el paciente es un paciente negativo para HER2/neu o un paciente con estado positivo para HER2/neu pero no es elegible para la terapia con trastuzumab.
En una realización de la enseñanza, las células cancerosas son células cancerosas de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de la vesícula biliar y la metástasis del mismo, un tumor de Krukenberg, metástasis peritoneal y/o metástasis de ganglios linfáticos. En una realización, las células cancerosas son células cancerosas de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de esófago, en particular de esófago inferior, cáncer de la unión esofágica y cáncer gastroesofágico.
De acuerdo con la invención, CLDN18.2 preferentemente tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1.
Otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
Descripción detallada
Aunque la presente enseñanza se describe en detalle más abajo, debe entenderse que esta enseñanza no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente descripción, ya que pueden variar. Debe entenderse también, que la terminología usada en la presente descripción es para el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza la cual se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica.
A continuación, se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de diversas maneras y las realizaciones preferidas no deben interpretarse para limitar la presente enseñanza a solamente las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción sustenta y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier cantidad de elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquiera de las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse descritas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera.
Preferentemente, los términos que se usan en la presente descripción se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, y H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.
La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique de otra forma, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura del campo (consultar, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición, J. Sambrook y otros eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
A lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pero no la exclusión de ningún otro miembro, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas aunque en algunas realizaciones tal otro miembro entero, o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pueden excluirse, es decir, el tema consiste en la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas. Los términos "un" y "una" y "el/la" y referentes similares usados en el contexto para describir la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de cualquier otra manera en la presente descripción, o claramente se contradiga por el contexto. La enumeración de los intervalos de valores en la presente descripción pretende servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique de otra manera en la presente descripción, cada valor individual se incorpora en la descripción como si se enumerara individualmente en la presente descripción.
Todos los métodos que se describen en la presente descripción pueden llevarse a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra manera en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente de otra manera. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o de lenguaje ilustrativo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en la presente descripción, sólo tiene la intención de aclarar mejor la enseñanza y no plantea una limitación en el alcance de la enseñanza a menos que se declare de cualquier otra manera. De ninguna manera el lenguaje en la descripción debe interpretarse como indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la enseñanza.
El término "recombinante", en el contexto de la presente enseñanza, significa "producido mediante ingeniería genética". Preferentemente, un "objeto recombinante" tal como una célula recombinante en el contexto de la presente enseñanza, no es de origen natural.
El término "de origen natural", como se usa en la presente, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, es de origen natural un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (lo que incluye los virus) y que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio.
El término "respuesta inmunitaria" se refiere a una respuesta corporal integrada a un antígeno y preferentemente se refiere a una respuesta inmunitaria celular o una celular, así como también una respuesta inmunitaria humoral. La respuesta inmunitaria puede ser protectora/preventiva/profiláctica y/o terapéutica.
"Que induce una respuesta inmunitaria" puede significar que no hubo respuesta inmunitaria contra un antígeno particular antes de la inducción, pero puede significar, además, que hubo un cierto nivel de respuesta inmunitaria contra un antígeno particular antes de la inducción y después de la inducción se potencia dicha respuesta inmunitaria. Por tanto, "inducir una respuesta inmunitaria" también incluye "potenciar una respuesta inmunitaria". Preferentemente, después de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, dicho sujeto está protegido contra el desarrollo de una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa o la afección patológica se mejora mediante la inducción de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a tumores tal como CLDN18.2 puede inducirse en un paciente que tiene una enfermedad cancerosa o en un sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa. Inducir una respuesta inmunitaria en este caso puede significar que la afección patológica del sujeto mejora, que el sujeto no desarrolla metástasis o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa no desarrolla una enfermedad cancerosa.
Una "respuesta inmunitaria celular", una "respuesta celular", una "respuesta celular contra un antígeno" o un término similar pretenden incluir una respuesta celular dirigida a células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I o clase II. La respuesta celular se refiere a las células llamadas células T o linfocitos T que actúan como 'cooperadores' o 'asesinos'. Las células T cooperadoras (también denominadas células T CD4+) desempeñan un papel central mediante la regulación de la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) destruyen las células enfermas, tales como las células cancerosas, lo que evita la producción de más células enfermas.
El término "antígeno" se refiere a un agente que comprende un epítopo contra el cual se genera y/o se direcciona una respuesta inmunitaria. Preferentemente, un antígeno en el contexto de la presente enseñanza es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmunitaria, que preferentemente es específica para el antígeno o las células que expresan y/o presentan el antígeno. El término "antígeno" incluye en particular proteínas y péptidos. Un antígeno es preferentemente un producto que corresponde o se deriva de un antígeno de origen natural. Dichos antígenos de origen natural pueden incluir o pueden derivarse de antígenos asociados a tumores.
En particular, el antígeno o fragmentos peptídicos del mismo deberían ser reconocibles por un receptor de células T. Preferentemente, el antígeno o péptido, si es reconocido por un receptor de células T, es capaz de inducir en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, expansión clonal de la célula T que lleva el receptor de células T que reconocen el antígeno o péptido. En el contexto de las realizaciones de la presente enseñanza, el antígeno es preferentemente presentado por una célula, preferentemente por una célula presentadora de antígeno y/o una célula enferma, en el contexto de moléculas de MHC, lo que puede resultar en una reacción inmunitaria contra el antígeno (o célula que presenta el antígeno).
En una realización preferida, un antígeno es un antígeno asociado a tumores, es decir, un constituyente de células cancerosas que pueden derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferentemente en gran cantidad, intracelularmente o como antígenos de superficie en células cancerosas.
En el contexto de la presente enseñanza, los términos "antígeno asociado a tumores" o "antígeno tumoral" se refieren a proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas específicas del desarrollo, por ejemplo, el antígeno asociado a tumores puede expresarse en condiciones normales específicamente en tejido estomacal, preferentemente, en la mucosa gástrica, en órganos reproductores, por ejemplo, en testículos, en tejido trofoblástico, por ejemplo, en placenta, o en células de la línea germinal, y se expresan o se expresan de manera aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" significa, preferentemente, no más de 3, más preferentemente no más de 2. Los antígenos asociados a tumores en el contexto de la presente enseñanza incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferentemente, antígenos de diferenciación de tipo celular específico, es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en un cierto tipo de célula, en una cierta etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículos, es decir, proteínas que en condiciones normales se expresan específicamente en testículos y algunas veces en la placenta, y antígenos específicos de línea germinal. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno asociado a tumores se asocia preferentemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferentemente, no se expresa o solo se expresa rara vez en tejidos normales. Preferentemente, el antígeno asociado a tumores o la expresión aberrante del antígeno asociado a tumores identifica células cancerosas. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno asociado a tumores que se expresa por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece de una enfermedad cancerosa, preferentemente, es una proteína propia en dicho sujeto. En realizaciones preferidas, el antígeno asociado a tumores en el contexto de la presente enseñanza se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmunitario no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son, o son difícilmente asequibles, al sistema inmunitario. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno asociado a tumores es idéntica entre el antígeno asociado a tumores que se expresa en tejidos normales y el antígeno asociado a tumores que se expresa en tejidos cancerosos. Preferentemente, un antígeno asociado a tumores es presentado por una célula cancerosa en la que se expresa.
Diversos aspectos de la enseñanza implican el antígeno asociado a tumores CLDN18.2 y la presente enseñanza puede implicar la estimulación o provisión de una reacción de CTL antitumoral contra células cancerosas que expresan dicho antígeno asociado a tumores y preferentemente que presentan dicho antígeno asociado a tumores con MHC de clase I.
Las claudinas son una familia de proteínas que son los componentes más importantes de las uniones estrechas, donde establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas transmembranas que se extienden por la membrana 4 veces con el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, ambos localizados en el citoplasma. El primer lazo o dominio extracelular, denominado EC1 o ECL1, consiste en promedio de 53 aminoácidos, y el segundo lazo o dominio extracelular, denominado EC2 o ECL2, consiste en alrededor de 24 aminoácidos. Las proteínas de la superficie celular de la familia de claudina, tal como CLDN18.2, se expresan en tumores de diferentes orígenes, y son particularmente adecuados como estructuras diana en relación con la inmunoterapia del cáncer mediada por anticuerpos debido a su expresión selectiva (sin expresión en un tejido normal relevante de toxicidad) y localización en la membrana plasmática.
CLDN18.2 se expresa selectivamente en tejidos normales en células epiteliales diferenciadas de la mucosa gástrica. CLDN18.2 se expresa en cánceres de diferentes orígenes tales como carcinoma pancreático, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma bronquial, carcinoma de mama y tumores ENT. CLDN18.2 es una diana valiosa para la prevención y/o tratamiento de tumores primarios, tales como cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, y cánceres de la vesícula biliar, y sus metástasis, en particular, metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos.
El término "CLDN" como se usa en la presente descripción significa claudina e incluye CLDN18.2. Preferentemente, una claudina es una claudina humana.
El término "CLDN18" se refiere a la claudina 18 e incluye cualquiera de las variantes, que incluye la variante 1 de corte y empalme de claudina 18 (claudina 18.1 (CLDN18.1)) y la variante 2 de corte y empalme de claudina 18 (claudina 18.2 (CLDN18.2)).
El término "CLDN18.2" preferentemente se refiere a CLDN18.2 humana, y, en particular, a una proteína que comprende, preferentemente que consiste de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer lazo o dominio extracelular de CLDN18.2 comprende, preferentemente, los aminoácidos 27 al 81, con mayor preferencia los aminoácidos 29 al 78 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. El segundo lazo o dominio extracelular de CLD18.2 comprende, preferentemente, los aminoácidos 140 al 180 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Dichos primero y segundo lazos extracelulares o dominios forman preferentemente la porción o dominio extracelular de CLDN18.2.
El término "variante" de acuerdo con la enseñanza se refiere, en particular, a mutantes, variantes de corte y empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están presentes de manera natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya relevancia frecuentemente no está clara. La secuenciación génica completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen determinado. Un homólogo de especie es una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con una especie de origen diferente de una secuencia determinada de un ácido nucleico o aminoácido. El término "variante" abarcará cualquiera de las variantes modificadas postraduccionalmente y variantes conformacionales.
De acuerdo con los diversos aspectos de la enseñanza, el objetivo es preferentemente inducir o determinar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que expresan CLDN18.2 y que preferentemente se caracterizan por la presentación de CLDN18.2, y diagnosticar, tratar o prevenir una enfermedad cancerosa que involucre células que expresan CLDN18.2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria implica la estimulación de una respuesta CTL anti-CLDN18.2 contra células cancerosas que expresan CLDN18.2 y preferentemente que presentan CLDN18.2 con MHC de clase I.
De acuerdo con la enseñanza, el término "cáncer que expresa CLDN18.2" o "cáncer positivo a CLDN18.2" significa un cáncer que involucra células cancerosas que expresan CLDN18.2, preferentemente en la superficie de dichas células cancerosas. Alternativamente o adicionalmente, dichas células cancerosas que expresan CLDN18.2 presentan CLDN18.2 en el contexto de moléculas de MHC. Las células cancerosas que presentan CLDN18.2 en el contexto de moléculas de MHC pueden ser dirigidas por células inmunorreactivas que llevan receptores de células T, mientras que las células cancerosas que expresan CLDN18.2 en la superficie pueden ser dirigidas por células inmunorreactivas que llevan receptores de células T artificiales.
"Superficie celular" se usa de acuerdo con su significado normal en la técnica, y por lo tanto, incluye el exterior de la célula que es accesible a la unión por proteínas y otras moléculas.
La CLDN18.2 se expresa en la superficie de las células si se localiza en la superficie de dichas células y es accesible a la unión con los anticuerpos específicos de CLDN18.2 adicionados a las células.
El término "porción extracelular" o "exodominio" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una parte de una molécula tal como una proteína que está orientada al espacio extracelular de una célula y preferentemente es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, por moléculas de unión a antígeno tales como anticuerpos localizados en el exterior de la célula. Preferentemente, el término se refiere a uno o más lazos extracelulares o dominios o un fragmento de estos.
El término "porción" se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia de aminoácidos o proteína, el término "porción" de esta puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura. Preferentemente, una porción de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, preferentemente al menos 50 %, con mayor preferencia al menos 60 %, con mayor preferencia al menos 70 %, aún con mayor preferencia al menos 80 %, y con la máxima preferencia al menos 90 % de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Preferentemente, si la porción es una fracción discontinua, dicha fracción discontinua está compuesta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más partes de una estructura, al ser cada parte un elemento continuo de la estructura. Por ejemplo, una fracción discontinua de una secuencia de aminoácidos puede conformarse de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más, preferentemente, no más de 4 partes de dicha secuencia de aminoácidos, en donde cada parte comprende, preferentemente, al menos 5 aminoácidos continuos, al menos 10 aminoácidos continuos, preferentemente, al menos 20 aminoácidos continuos, preferentemente al menos 30 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos.
Los términos "parte" y "fragmento" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos o proteína se refiere a un elemento continuo de dicha estructura. Una porción, una parte o un fragmento de una estructura, preferentemente, comprende una o más propiedades funcionales de dicha estructura. Por ejemplo, una porción, una parte o un fragmento de un epítopo, péptido o proteína es, preferentemente, inmunológicamente equivalente al epítopo, péptido o proteína del que se deriva. En el contexto de la presente enseñanza, una "parte" de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos preferentemente comprende, preferentemente consiste en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 92 %, al menos 94 %, al menos 96 %, al menos 98 %, al menos 99 % de toda la estructura o secuencia de aminoácidos. Una parte o fragmento de una secuencia de proteína comprende, preferentemente, una secuencia de al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50 o al menos 100 aminoácidos consecutivos de la proteína. Las porciones, partes o fragmentos como se discutió anteriormente están abarcadas por el término "variante" usado en la presente descripción.
De acuerdo con la enseñanza, CLDN18.2 no se expresa esencialmente en una célula si el nivel de expresión es menor en comparación a la expresión en las células estomacales o tejido estomacal. Preferentemente, el nivel de expresión es inferior al 10 %, preferentemente inferior al 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,05 % de la expresión en las células estomacales o tejido estomacal o incluso inferior. Preferentemente, CLDN18.2 no se expresa esencialmente en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en el tejido no cancerígeno distinto al tejido estomacal en no más de 2 veces, preferentemente 1,5 veces, y preferentemente no excede el nivel de expresión en dicho tejido no cancerígeno. Preferentemente, CLDN18.2 no se expresa esencialmente en una célula si el nivel de expresión está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión es demasiado bajo para permitir la unión con los anticuerpos específicos a CLDN18.2 añadidos a las células.
De acuerdo con la enseñanza, CLDN18.2 se expresa en una célula si el nivel de expresión excede el nivel de expresión en el tejido no canceroso distinto del tejido estomacal, preferentemente en más de 2 veces, preferentemente 10 veces, 100 veces, 1000 veces o 10000 veces. Preferentemente, CLDN18.2 se expresa en una célula si el nivel de expresión está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión es suficientemente alto para permitir la unión con los anticuerpos específicos a CLDN18.2 añadidos a las células. Preferentemente, CLDN18.2 se expresa en una célula si se expresa o expone en la superficie de dicha célula.
"Célula diana" significará una célula que es una diana para una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria celular. Las células diana incluyen células que presentan un antígeno o un epítopo de antígeno, es decir, un fragmento peptídico derivado de un antígeno, e incluyen cualquier célula indeseable, tal como una célula cancerosa. En realizaciones preferidas, la célula diana es una célula que expresa CLDN18.2 que preferentemente está presente en la superficie celular y/o se presenta con MHC de clase I.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o fragmento de la molécula que es reconocida por el sistema inmunitario, por ejemplo, que es reconocida por una célula T, en particular cuando se presenta en el contexto de moléculas de MHC. Un epítopo de una proteína tal como un antígeno asociado a tumores comprende, preferentemente, una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene, preferentemente, entre 5 y 100, preferentemente entre 5 y 50, con mayor preferencia entre 8 y 30, con la máxima preferencia entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferentemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. Se prefiere particularmente que el epítopo en el contexto de la presente enseñanza no sea un epítopo de células T.
Términos tales como "epítopo", "fragmento de antígeno", "péptido antigénico" o "péptido inmunogénico" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren preferentemente a una representación incompleta de un antígeno que preferentemente es capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno o una célula de expresar o comprender y preferentemente presentar el antígeno. Preferentemente, los términos se refieren a una porción inmunogénica de un antígeno. Preferentemente, es una porción de un antígeno que es reconocido (es decir, unido específicamente) por un receptor de células T, en particular si se presenta en el contexto de moléculas de MHC. Ciertas porciones inmunogénicas preferidas se unen a una molécula de MHC de clase I o de clase II tal como en la superficie de una célula y, por tanto, son péptidos de unión a MHC. Como se usa en la presente descripción, se dice que un péptido se "une a" una molécula de MHC de clase I o clase II si tal unión es detectable mediante el uso de cualquier ensayo conocido en la técnica.
Preferentemente, los péptidos divulgados en la presente descripción que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 o una variante de dicha secuencia de aminoácidos son capaces de estimular una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta celular contra CLDN18.2 o células caracterizadas por expresión de CLDN18.2 y preferentemente caracterizadas por presentación de CLDN18.2. Preferentemente, tal péptido es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de CLDN18.2 con MHC de clase I y preferentemente es capaz de estimular CTL sensibles a CLDN18.2. Preferentemente, los péptidos de acuerdo con la enseñanza son péptidos presentados en MHC de clase I y/o clase II o pueden procesarse para producir péptidos presentados en m Hc de clase I y/o clase II. Preferentemente, la secuencia unida a la molécula de MHC se selecciona de las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7.
Si un péptido antigénico se va a presentar directamente, es decir, sin procesamiento, en particular sin escisión, tiene una longitud que es adecuada para unirse a una molécula de MHC, en particular una molécula de MHC de clase I, y preferentemente es de 7-20 aminoácidos de longitud, con mayor preferencia de 7-12 aminoácidos de longitud, con mayor preferencia de 8-11 aminoácidos de longitud, en particular de 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferentemente, la secuencia de un péptido antigénico que se va a presentar directamente corresponde sustancialmente y es preferentemente completamente idéntica a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7.
Si se va a presentar un péptido antigénico después del procesamiento, en particular después de la escisión, el péptido producido por procesamiento tiene una longitud que es adecuada para unirse a una molécula de MHC, en particular una molécula de MHC de clase I, y preferentemente es de 7-20 aminoácidos de longitud, con mayor preferencia de 7­ 12 aminoácidos de longitud, con mayor preferencia de 8-11 aminoácidos de longitud, en particular de 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferentemente, la secuencia del péptido que se presentará después del procesamiento corresponde sustancialmente y preferentemente es idéntica completamente a una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7. Por tanto, un péptido antigénico de acuerdo con la enseñanza en una realización comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7 y el siguiente procesamiento del péptido antigénico constituye una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7.
Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que corresponden sustancialmente a una secuencia de un péptido que se presenta mediante moléculas de MHC pueden diferir en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento por TCR del péptido como lo presenta el MHC, o para la unión del péptido a MHC. Preferentemente, dichos péptidos sustancialmente correspondientes también son capaces de estimular una respuesta celular antígenoespecífica, tal como CTL antígeno-específico. Los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren de un péptido presentado en residuos que no afectan el reconocimiento de TCR pero mejoran la estabilidad de unión al MHC pueden mejorar la inmunogenicidad del péptido antigénico y pueden denominarse en la presente descripción como "péptidos optimizados". Mediante el uso del conocimiento existente sobre cuál de estos residuos puede afectar más probablemente a la unión al MHC o al TCR, puede emplearse un enfoque racional para el diseño de péptidos sustancialmente correspondientes. Los péptidos resultantes que son funcionales se contemplan como péptidos antigénicos. Las secuencias como se discutieron anteriormente están abarcadas por el término "variante" usado en la presente descripción.
"Procesamiento del antígeno" se refiere a la degradación de un antígeno en productos de procesamiento, que son fragmentos de dicho antígeno (por ejemplo, la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas de MHC para presentación mediante células, preferentemente células presentadoras de antígenos a células T específicas.
Una célula presentadora de antígeno (APC) es una célula que muestra antígeno en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo mediante el uso de su receptor de células T (TCR). Las células presentadoras de antígenos procesan los antígenos y los presentan a las células T.
Las células presentadoras de antígenos profesionales son muy eficientes para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptor, y luego exhiben un fragmento del antígeno, unido a una molécula de MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de moléculas de MHC de clase II de antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, lo que lleva a la activación de la célula T. La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígenos profesionales. Las células presentadoras de antígenos incluyen células presentadoras de antígenos profesionales y células presentadoras de antígenos no profesionales.
Los principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales son las células dendríticas, que tienen la gama más amplia de presentación de antígenos, y son probablemente las células presentadoras de antígenos más importantes, los macrófagos, las células B, los monocitos y ciertas células epiteliales activadas.
Las células presentadoras de antígenos no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas del MHC de clase II requeridas para la interacción con las células T vírgenes; estos se expresan solo tras la estimulación de las células presentadoras de antígenos no profesionales por ciertas citocinas tales como el IFNy.
Las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de las vías de presentación de antígenos del MHC de clase II y I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunitarias y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad antitumoral.
Las células dendríticas y los progenitores pueden obtenerse de sangre periférica, médula ósea, células infiltrantes de tumores, células infiltrantes de tejidos peritumorales, ganglios linfáticos, bazo, piel, sangre del cordón umbilical o cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas pueden diferenciarse ex vivo mediante la adición de una combinación de citocinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNFa a cultivos de monocitos recolectados de sangre periférica. Alternativamente, las células CD34 positivas recolectadas de sangre periférica, sangre del cordón umbilical o médula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas al añadir al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNFa, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/u otros compuestos que inducen la diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas.
Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que pueden usarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debe interpretarse que esta nomenclatura excluye todas las posibles etapas intermedias de diferenciación.
Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como células presentadoras de antígenos con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor Fcy y del receptor manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una baja expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de superficie celular responsables de la activación de las células T tales como MHC de clase I y II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB).
La maduración de las células dendríticas se conoce como el estado de activación de las células dendríticas en el que dichas células dendríticas presentadoras de antígenos conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por las células dendríticas inmaduras resulta en tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligadura de CD40 en la superficie de la célula dendrítica por CD40L y sustancias liberadas de las células que sufren una muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden derivar al cultivar células de la médula ósea in vitro con citocinas, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.
Las células tales como las células presentadoras de antígenos o las células diana, pueden cargarse con péptidos presentados por MHC de clase I al exponer, es decir, pulsar, las células con el péptido o transducir las células con ácido nucleico, preferentemente ARN, que codifica un péptido o proteína que comprende el péptido a ser presentado, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica el antígeno.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de la enseñanza comprende una célula presentadora de antígeno cargada con péptido antigénico. A este respecto, los protocolos pueden basarse en cultivo in vitro/diferenciación de células dendríticas manipuladas de tal forma que presenten artificialmente el péptido antigénico. La producción de células dendríticas modificadas genéticamente puede implicar la introducción de ácidos nucleicos que codifican antígenos o péptidos antigénicos en células dendríticas. La transfección de células dendríticas con ARNm es una técnica prometedora de carga de antígenos para estimular una fuerte inmunidad antitumoral. Tal transfección puede tener lugar ex vivo, y una composición farmacéutica que comprende tales células transfectadas puede usarse luego con fines terapéuticos. Alternativamente, se puede administrar a un paciente un vehículo de suministro de genes que se dirige a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno, que resulta en la transfección in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas, por ejemplo, puede realizarse generalmente mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica, tal como los descritos en el documentoWO 97/24447, o el enfoque de pistola de genes descrito por Mahvi y otros, Immunology and cell Biology 75: 456-460,1997. La carga de antígeno de células dendríticas se puede lograr al incubar las células dendríticas o células progenitoras con antígeno, ADN (desnudo o dentro de un vector plasmídico) o ARN; o con bacterias o virus recombinantes que expresan antígenos (por ejemplo, vectores de vaccinia, viruela, adenovirus o lentivirus).
El término "inmunogenicidad" se refiere a la eficiencia relativa de un antígeno para inducir una reacción inmunitaria.
El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente enseñanza incluye cualquier función mediada por los componentes del sistema inmunitario que resulta, por ejemplo, en la destrucción de células tumorales o en la inhibición del crecimiento tumoral y/o inhibición del desarrollo tumoral, que incluye la inhibición de la diseminación tumoral y la metástasis. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias en el contexto de la presente enseñanza son funciones efectoras mediadas por células T. Tales funciones comprenden en el caso de una célula T colaboradora (célula T CD4+) el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas de MHC de clase II por receptores de células T, la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas de MHC de clase I por receptores de células T, la eliminación de las células presentes en el contexto de moléculas de MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citocinas tales como IFN-y y TNF-a, y destrucción citolítica específica de células diana que expresan antígenos.
El término "célula inmunorreactiva" o "célula efectora inmunitaria" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Una "célula inmunorreactiva" preferentemente es capaz de unirse a un antígeno tal como un antígeno expresado en la superficie de una célula o una célula caracterizada por la presentación de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno y que media una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, tales células secretan citocinas y/o quimiocinas, destruyen microbios, secretan anticuerpos, reconocen células infectadas o cancerosas, y opcionalmente eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T cooperadoras, células T infiltrantes de tumor), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferentemente, en el contexto de la presente enseñanza, "células inmunorreactivas" son células T, preferentemente células T CD4+ y/o CD8+.
Preferentemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas de MHC, tal como en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células cancerosas. Preferentemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un péptido antigénico derivado de dicho antígeno sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T colaboradora (célula T CD4+) que produce receptores que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas de MHC de clase II, tal capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas de MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforinas. De acuerdo con la enseñanza, la capacidad de respuesta de CTL puede incluir flujo de calcio sostenido, división celular, producción de citocinas tales como IFN-y y TNF-a, regulación positiva de marcadores de activación tales como CD44 y CD69, y destrucción citolítica específica de células diana que expresan antígenos. La capacidad de respuesta de CTL también puede determinarse mediante el uso de un indicador artificial que indica con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Dichos CTL que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno y son sensibles o reactivos también se denominan "CTL sensibles al antígeno" en la presente descripción. Si la célula es una célula B, dicha capacidad de respuesta puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.
De acuerdo con la enseñanza, el término "célula inmunorreactiva" también incluye una célula que puede madurar en una célula inmune (tal como célula T, en particular célula T colaboradora, o célula T citolítica) con una estimulación adecuada. Las células inmunorreactivas comprenden células madre hematopoyéticas CD34+, células T inmaduras y maduras y células B inmaduras y maduras. Si se desea la producción de células citolíticas o de T cooperadoras que reconozcan un antígeno, la célula inmunorreactiva se pone en contacto con una célula que expresa un antígeno o péptido antigénico bajo condiciones que favorecen la producción, diferenciación y/o selección de células T citolíticas y de células T cooperadoras. La diferenciación de los precursores de una célula T en una célula T citolítica, cuando se expone a un antígeno, es similar a la selección clonal del sistema inmunitario.
Una "célula linfoide" es una célula que, opcionalmente después de una modificación adecuada, por ejemplo, después de la transferencia de un receptor de células T, es capaz de producir una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria celular, o una célula precursora de dicha célula, e incluye linfocitos, preferentemente linfocitos T, linfoblastos y células plasmáticas. Una célula linfoide puede ser una célula inmunorreactiva como se describe en la presente descripción. Una célula linfoide preferida es una célula T que carece de expresión endógena de un receptor de células T y que puede modificarse para expresar dicho receptor de células T en la superficie celular.
Los términos "célula T" y "linfocito T" se usan de forma intercambiable en la presente descripción e incluyen células T cooperadoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+), que comprenden células T citolíticas.
Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, tales como las células B y las células asesinas naturales por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptores de células T (TCR). El timo es el principal órgano de células T responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.
Las células T cooperadoras ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, que incluyen la maduración de las células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T cooperadoras se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos mediante moléculas de MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Una vez activadas, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmunitaria activa.
Las células T citotóxicas destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+ ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.
La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real está compuesto por dos cadenas peptídicas separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta del receptor de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a- y p-TCR. Las células T y6 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. Sin embargo, en las células T y§, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 8. Este grupo de células T es mucho menos común (2 % del total de células T) que las células T ap.
La estructura del receptor de células T es muy similar a los fragmentos Fab de inmunoglobulinas, que son regiones definidas como la cadena ligera y pesada combinadas de un brazo del anticuerpo. Cada cadena del TCR es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y posee un dominio variable N-terminal (V), un dominio constante (C), una región que abarca la transmembrana/membrana celular y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal.
De acuerdo con la enseñanza, el término "región variable de un receptor de células T" se refiere a los dominios variables de las cadenas del TCR.
La región variable tanto de la cadena a como de la cadena p del TCR tiene tres regiones determinantes de complementariedad o hipervariables (CDR), mientras que la región variable de la cadena p tiene un área adicional de hipervariabilidad (HV4) que normalmente no contacta con el antígeno y por lo tanto, no se considera un CDR. La CDR3 es la principal CDR responsable de reconocer el antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDR1 de la cadena a interactúa con la parte N-terminal del péptido antigénico, mientras que la CDR1 de la cadena p interactúa con la parte C-terminal del péptido. Se cree que CDR2 reconoce el MHC. No se cree que la CDR4 de la cadena p participe en el reconocimiento del antígeno, pero se ha demostrado que interactúa con superantígenos.
De acuerdo con la enseñanza, el término "al menos una de las secuencias de CDR" significa, preferentemente, al menos la secuencia de CDR3. El término "secuencias de CDR de una cadena del receptor de células T" se refiere preferentemente a CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena a o cadena p de un receptor de células T.
El dominio constante del dominio TCR consiste en secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma enlaces disulfuro, que forman un enlace entre las dos cadenas.
Todas las células T se originan a partir de células madre hematopoyéticas en la médula ósea. Los progenitores hematopoyéticos derivados de células madre hematopoyéticas pueblan el timo y se expanden por división celular para generar una gran población de timocitos inmaduros. Los primeros timocitos no expresan ni CD4 ni CD8 y, por lo tanto, se clasifican como células dobles negativas (CD4-CD8-). A medida que avanzan en su desarrollo, se convierten en timocitos dobles positivos (CD4+CD8+) y finalmente maduran a timocitos simples positivos (CD4+CD8- o CD4-CD8+) que luego se liberan del timo a los tejidos periféricos.
La primera señal de activación de las células T se proporciona mediante la unión del receptor de células T a un péptido corto presentado por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en otra célula. Esto asegura que solo se active una célula T con un TCR específico para ese péptido. La célula pareja es generalmente una célula presentadora de antígeno (APC) profesional, generalmente una célula dendrítica en el caso de respuestas vírgenes, aunque las células B y los macrófagos pueden ser APC importantes. Los péptidos presentados a las células T CD8+ por moléculas de MHC de clase I tienen una longitud de 8-10 aminoácidos; los péptidos presentados a las células T CD4+ por moléculas de MHC de clase II son más largos, ya que los extremos de la hendidura de unión de la molécula de MHC de clase II están abiertos.
Las células T pueden prepararse generalmente in vitro o ex vivo, mediante el uso de procedimientos estándar. Por ejemplo, las células T pueden estar presentes dentro de (o aislarse de) la médula ósea, sangre periférica o una fracción de la médula ósea o sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, mediante el uso de un sistema de separación celular disponible comercialmente. Alternativamente, las células T pueden derivarse de seres humanos emparentados o no emparentados, mamíferos no humanos, líneas o cultivos celulares. Una "muestra que comprende células T" puede ser, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés).
Las células T pueden estimularse con antígeno, péptido, ácido nucleico y/o células presentadoras de antígenos (APC) que expresan un antígeno. Tal estimulación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que son específicas para un antígeno, un péptido y/o células que presentan un antígeno o un péptido.
La activación específica de las células T CD4+ o CD8+ puede detectarse de diversas formas. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen detectar la proliferación de células T, la producción de citocinas (por ejemplo, linfocinas) o la generación de actividad citolítica. Para las células T CD4+, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la proliferación de células T. Para las células T CD8+, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la generación de actividad citolítica.
Para generar líneas de células T CD8+, las células presentadoras de antígenos, preferentemente células presentadoras de antígenos autólogas, transfectadas con un ácido nucleico que produce el antígeno pueden usarse como células estimulantes.
Los ácidos nucleicos, tales como el ARN que codifica las cadenas del receptor de células T (TCR), pueden introducirse en células linfoides tales como las células T u otras células con potencial lítico. En una realización adecuada, las cadenas a y p del TCR se clonan a partir de una línea de células T antígeno-específicas y se usan para la terapia de células T adoptivas. A este respecto, la presente enseñanza proporciona receptores de células T específicos para CLDN18.2 o péptidos de CLDN18.2 divulgados en la presente descripción. En general, este aspecto de la enseñanza se refiere a receptores de células T que reconocen o se unen a péptidos de CLDN 18.2 presentados en el contexto de MHC. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas a y p de un receptor de células T, por ejemplo, un receptor de células T proporcionado de acuerdo con la presente enseñanza, pueden estar contenidos en moléculas de ácido nucleico separadas tales como vectores de expresión o, alternativamente, en una única molécula de ácido nucleico. En consecuencia, el término "un ácido nucleico que codifica un receptor de células T" o términos similares se refieren a moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas del receptor de células T en la misma o preferentemente en diferentes moléculas de ácido nucleico.
El término "célula inmunorreactiva reactiva con un péptido" se refiere a una célula inmunorreactiva que cuando reconoce el péptido, en particular si se presenta en el contexto de moléculas de MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células cancerosas, ejerce funciones efectoras de las células inmunorreactivas como se describió anteriormente.
El término "receptor de células T reactivo con un péptido" se refiere a un receptor de células T que cuando está presente en una célula inmunorreactiva reconoce el péptido, en particular si se presenta en el contexto de moléculas de MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células cancerosas, de manera que la célula inmunorreactiva ejerce funciones efectoras de las células inmunorreactivas como se describió anteriormente.
El término "célula T reactiva al antígeno" o términos similares se refieren a una célula T que reconoce un antígeno si se presenta en el contexto de moléculas de MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células cancerosas y ejerce funciones efectoras de las células T como se describió anteriormente.
El término "célula linfoide específica al antígeno" se refiere a una célula linfoide que, en particular cuando está provista de un receptor de células T antígeno-específicas, reconoce el antígeno si se presenta en el contexto de moléculas de MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células cancerosas y preferentemente ejerce funciones efectoras de las células T como se describió anteriormente. Se considera que las células T y otras células linfoides son consideradas específicas para el antígeno si las células destruyen las células diana que expresan un antígeno y/o presentan un péptido antigénico. La especificidad de las células T puede evaluarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas estándar, por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación. Alternativamente, se puede medir la síntesis de linfocinas (tales como el interferón-y)
El término "complejo mayor de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas de MHC de clase I y MHC de clase II y se refieren a un complejo de genes que se encuentra en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas de MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en donde las proteínas o moléculas de MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y presentan tanto antígenos propios (fragmento peptídicos de la propia célula) como antígenos ajenos (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T.
La región MHC se divide en tres subgrupos clase I, clase II y clase III. Las proteínas del MHC de clase I contienen una cadena ayuna p2-microglobulina (que no forma parte del MHC codificado por el cromosoma 15). Presentan fragmento de antígenos a las células T citotóxicas. En la mayoría de las células del sistema inmunitario, específicamente en las células presentadoras de antígenos, las proteínas del MHC de clase II contienen cadenas a y py presentan fragmentos de antígenos a las células T cooperadoras. La región del MHC de clase III codifica otros componentes inmunes, tales como los componentes del complemento y algunos que codifican citocinas.
En los seres humanos, los genes de la región MHC que codifican proteínas presentadoras de antígenos en la superficie celular se denominan genes de antígeno leucocitario humano (HLA). Sin embargo, la abreviatura MHC se usa a menudo para referirse a productos génicos de HLA. Los genes HLA incluyen los nueve genes llamados MHC clásicos: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA y HLA-DRB1.
En una realización preferida de todos los aspectos de la enseñanza, una molécula de MHC es una molécula de HLA.
Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno", "célula que presenta un antígeno", "antígeno presentado por una célula", "antígeno presentado" o expresiones similares se entiende una célula, tal como una célula enferma, tal como una célula cancerosa, o una célula presentadora de antígeno que presenta el antígeno que expresa o un fragmento derivado de dicho antígeno, por ejemplo, mediante procesamiento del antígeno, en el contexto de moléculas de MHC, en particular moléculas de MHC de clase I. De manera similar, los términos "enfermedad caracterizada por la presentación de un antígeno" denotan una enfermedad que involucra células caracterizadas por la presentación de un antígeno, en particular con MHC de clase I. La presentación de un antígeno por una célula puede efectuarse al transfectar la célula con un ácido nucleico tal como el ARN que codifica el antígeno.
Por "fragmento de un antígeno que se presenta" o expresiones similares se entiende que el fragmento puede ser presentado por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I, por ejemplo, cuando se añade directamente a células presentadoras de antígenos. En una realización, el fragmento es un fragmento que se presenta naturalmente por células que expresan un antígeno.
Algunos métodos terapéuticos se basan en una reacción del sistema inmunitario de un paciente, que resulta en una lisis de las células enfermas que presentan un antígeno con MHC de clase I. En relación con esto, por ejemplo, los linfocitos T citotóxicos autólogos específicos para un complejo de un péptido antigénico y una molécula de MHC, pueden administrarse a un paciente que presenta una enfermedad. La producción in vitro de dichos linfocitos T citotóxicos es conocida. Un ejemplo de un método de diferenciación de células T puede encontrarse en el documento WO-A-9633265. Generalmente, se toma una muestra que contiene células, tales como células sanguíneas, del paciente y las células se ponen en contacto con una célula que presenta el complejo y que puede provocar la propagación de linfocitos T citotóxicos (por ejemplo, células dendríticas). La célula diana puede ser una célula transfectada, tal como una célula COS. Estas células transfectadas presentan el complejo deseado en su superficie y, cuando contactan con los linfocitos T citotóxicos, estimulan su propagación. Después, los linfocitos T citotóxicos autólogos expandidos clonalmente se administran al paciente.
En otro método de selección de linfocitos T citotóxicos, se usan tetrámeros fluorogénicos de complejos de molécula de MHC de clase I/péptido para obtener clones específicos de linfocitos T citotóxicos (Altman y otros (1996), Science 274:94-96; Dunbar y otros (1998), Curr. Biol. 8:413-416, 1998).
Además, las células que presentan el complejo deseado (por ejemplo, células dendríticas) pueden combinarse con linfocitos T citotóxicos de individuos sanos o de otras especies (por ejemplo, ratones) que puede resultar en la propagación de linfocitos T citotóxicos específicos con una afinidad elevada. El receptor de células T de elevada afinidad de estos linfocitos T específicos propagados puede clonarse y opcionalmente humanizarse a un alcance diferente, y después los receptores de células T obtenidos de esta forma se transducen a través de un gen de transferencia, por ejemplo, mediante el uso de vectores retrovirales, en células T de pacientes. Después, puede llevarse a cabo la transferencia adoptiva mediante el uso de estos linfocitos T alterados genéticamente (Stanislawski y otros (2001), Nat Immunol. 2:962-70; Kessels y otros (2001), Nat Immunol. 2:957-61.
Los linfocitos T citotóxicos pueden generarse, además, in vivo en una manera conocida per se. Un método usa células no proliferativas que expresan un complejo MHC de clase I/péptido. Las células que se usan en este caso serán aquellas que normalmente expresan el complejo, tales como células de tumor irradiadas o células transfectadas con uno o más genes necesarios para la presentación del complejo (es decir, el péptido antigénico y la molécula presentadora del CMH). Otra forma preferida es la introducción de un antígeno en la forma de ARN recombinante que puede introducirse en las células mediante transferencia liposomal o mediante electroporación, por ejemplo. Las células resultantes presentan el complejo de interés y son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos autólogos que después se propagan.
Puede alcanzarse un efecto similar mediante la combinación de un antígeno o un péptido antigénico con un adyuvante para hacer posible la incorporación en las células presentadoras de antígenos in vivo. El antígeno o un péptido antigénico puede representarse como una proteína, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno puede procesarse para producir una pareja peptídica para la molécula de MHC, mientras un fragmento del mismo puede presentarse sin la necesidad de un procesamiento adicional. Este último es el caso en particular, si estos pueden unirse a las moléculas de MHC. Resultan preferidas las formas de administración en las que el antígeno completo se procesa in vivo por una célula dendrítica, ya que esto también puede producir respuestas de células T cooperadoras que son necesarias para una respuesta inmunitaria efectiva (Ossendorp y otros, Immunol Lett. (2000), 74:75-9; Ossendorp y otros (1998), J. Exp. Med. 187:693-702. En general, es posible administrar una cantidad efectiva del antígeno asociado a tumores a un paciente, por ejemplo, mediante inyección intradérmica. Sin embargo, la inyección también puede realizarse intranodalmente en un ganglio linfático (Maloy y otros (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303).
De acuerdo con la enseñanza el término "receptor de células T artificial" es sinónimo de los términos "receptor de células T quimérico" y "receptor antigénico quimérico (CAR)".
Estos términos se refieren a receptores modificados genéticamente, que confieren una especificidad arbitraria tal como la especificidad de un anticuerpo monoclonal en una célula inmunitaria efectoratal como una célula T. De esta forma, pueden generarse un gran número de células T específicas de cáncer para la transferencia adoptiva de células. Por lo tanto, un receptor de células T artificial puede estar presente en células T, por ejemplo, en lugar de o en adición al receptor propio de células T de las células T. Tales células T no requieren necesariamente el procesamiento y la presentación de un antígeno para el reconocimiento de la célula diana si no que pueden reconocer preferentemente con especificidad cualquier antígeno presente en una célula diana. Preferentemente, dicho receptor de células T artificial se expresa en la superficie de las células. Para el propósito de la presente enseñanza las células T que comprenden un receptor de células T artificial se encuentran comprendidas en el término "célula T" como se usa en la presente.
En una realización, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal se fusiona a CD3-zeta transmembranal y de endodominio. Tales moléculas resultan en la transmisión de una señal zeta en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana antigénica en una célula diana y la muerte de la célula diana que expresa el antígeno diana. Los dominios de reconocimiento de antígenos que también pueden usarse incluyen entre otros las cadenas sencillas alfa y beta del receptor de célula T (TCR). De hecho, casi cualquier cosa que se una a una diana determinada con alta afinidad puede usarse como un dominio de reconocimiento de antígenos.
Seguido del reconocimiento de los antígenos, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. A este respecto, un "dominio de señalización de células T" es un dominio, preferentemente un endodominio, que transmite una señal de activación a la célula T después de que se une el antígeno. El componente de endodominio más utilizado es CD3-zeta.
La terapia de transferencia adoptiva de células con células T modificadas genéticamente con CAR que expresan receptores de antígeno quiméricos es un terapéutico anticancerígeno prometedor debido a que las células T modificadas con CAR pueden modificarse genéticamente para dirigirlas prácticamente a cualquier antígeno tumoral. Por ejemplo, las células T de los pacientes pueden modificarse genéticamente para expresar CAR específicamente dirigidos hacia antígenos en las células tumorales de los pacientes, luego son regresadas al paciente.
De acuerdo con la enseñanza, un receptor de células T artificial puede reemplazar la función de un receptor de células T como se describió anteriormente y, en particular, puede conferir reactividad tal como actividad citolítica a una célula tal como una célula T como se describió anteriormente. Sin embargo, por el contrario, con la unión del receptor de células T a un complejo péptido antigénico-MHC como se describió anteriormente, un receptor de células T artificial puede unirse a un antígeno, en particular expresado en la superficie celular.
La cadena de la glicoproteína de la superficie de las células TCD3-zeta es una proteína que en los seres humanos está codificada por el gen CD247. La CD3-zeta junto con los heterodímeros alfa/beta y gamma/delta del receptor de células T y CD3-gamma, delta y épsilon, forman el complejo receptor de células T-CD3. La cadena zeta juega un papel importante en el acoplamiento del reconocimiento del antígeno a varias vías de transducción de señales intracelulares. El término "CD3-zeta" preferentemente se refiere a CD3-zeta humana, y, en particular, a una proteína que comprende, preferentemente, que consiste de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 40 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
CD28 (Conglomerado de Diferenciación 28) es una de las moléculas expresadas en las células T que proporcionan señales coestimuladoras, que son necesarias para la activación de las células T. CD28 es el receptor de CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2). La estimulación a través de CD28 además del receptor de células T (TCR) puede proporcionar una potente señal coestimuladora a las células T para la producción de diversas interleucinas (IL-6 en particular). El término "CD28" preferentemente se refiere a CD28 humana, y, en particular, a una proteína que comprende, preferentemente que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.
De acuerdo con la enseñanza, los CAR generalmente pueden comprender tres dominios.
El primer dominio es el dominio de unión que reconoce y se une a CLDN18.2.
El segundo dominio es el dominio de coestimulación. El dominio de coestimulación sirve para mejorar la proliferación y supervivencia de los linfocitos citotóxicos tras la unión del CAR a un resto diana. La identidad del dominio de coestimulación está limitada únicamente porque tiene la capacidad de potenciar la proliferación celular y la supervivencia tras la unión del resto diana por el CAR. Los dominios de coestimulación adecuados incluyen c D28, c D137 (4-1BB), un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF), CD134 (OX40), un miembro de la superfamilia de receptores TNFR y CD278 (ICOS), una molécula coestimuladora de la superfamilia de CD28 expresada en células T activadas. La persona experta entenderá que las variantes de secuencia de estos dominios de coestimulación señalados pueden usarse sin afectar negativamente a la enseñanza, donde las variantes tienen la misma o similar actividad que el dominio sobre el que se modelan. Tales variantes tendrán al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio del que se derivan. En algunas realizaciones de la enseñanza, los constructos de CAR comprenden dos dominios de coestimulación. Si bien las combinaciones particulares incluyen todas las variaciones posibles de los cuatro dominios indicados, los ejemplos específicos incluyen CD28+CD137 (4-1BB) y CD28+CD134 (OX40).
El tercer dominio es el dominio de señalización de activación (o dominio de señalización de células T). El dominio de señalización de activación sirve para activar los linfocitos citotóxicos tras la unión del CAR a CLDN18.2. La identidad del dominio de señalización de activación está limitada solo porque tiene la capacidad de inducir la activación del linfocito citotóxico seleccionado tras la unión del CLDN18.2 por el CAR. Los dominios de señalización de activación adecuados incluyen la cadena CD3[zeta] de células T y el receptor Fc [gamma]. El experto en la materia comprenderá que las variantes de secuencia de estos dominios de señalización de activación señalados pueden usarse sin afectar negativamente la enseñanza, donde las variantes tienen la misma o similar actividad que el dominio sobre el que se modelan. Tales variantes tendrán al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del dominio del que se derivan.
Los CAR de la presente enseñanza pueden comprender los tres dominios, juntos en forma de una proteína de fusión. Dichas proteínas de fusión comprenderán generalmente un dominio de unión, uno o más dominios de coestimulación y un dominio de señalización de activación, enlazados en una dirección N-terminal a C-terminal. Sin embargo, los CAR de la presente enseñanza no se limitan a este arreglo y otros arreglos son aceptables e incluyen un dominio de unión, un dominio de señalización de activación y uno o más dominios de coestimulación. Se debe entender que debido a que el dominio de unión debe estar libre para unirse a CLDN18.2, la colocación del dominio de unión en la proteína de fusión será generalmente de manera que se logre la visualización de la región en el exterior de la célula. De la misma manera, debido a que los dominios de señalización de activación y coestimulación sirven para inducir la actividad y proliferación de los linfocitos citotóxicos, la proteína de fusión generalmente mostrará estos dos dominios en el interior de la célula. Los CAR pueden incluir elementos adicionales, tales como un péptido señal para garantizar la exportación apropiada de la proteína de fusión a la superficie de las células, un dominio transmembrana para garantizar que la proteína de fusión se mantenga como una proteína integral de membrana y un dominio bisagra (o región espaciadora) que imparte flexibilidad al dominio de unión y permite una unión fuerte a CLDN18.2.
Las células usadas en relación con el sistema CAR de la presente enseñanza son preferentemente células T, en particular linfocitos citotóxicos, preferentemente seleccionados entre células T citotóxicas, células asesinas naturales (NK) y células asesinas activadas por linfocinas (LAK). Tras la activación, cada uno de estos linfocitos citotóxicos desencadena la destrucción de las células diana. Por ejemplo, las células T citotóxicas desencadenan la destrucción de las células diana por uno o ambos de los siguientes medios. Primero, tras la activación, las células T liberan citotoxinas tales como perforina, granzimas y granulisina. La perforina y la granulisina crean poros en la célula diana y las granzimas entran en la célula y desencadenan una cascada de caspasas en el citoplasma que induce a la apoptosis (muerte celular programada) de la célula. Segundo, la apoptosis puede inducirse mediante la interacción de Fas-ligando Fas entre las células T y las células tumorales diana. Los linfocitos citotóxicos serán preferentemente células autólogas, aunque pueden usarse células heterólogas o células alogénicas.
De acuerdo con la enseñanza, puede usarse una "referencia", tal como una muestra de referencia o un organismo de referencia para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los métodos de la enseñanza de una muestra de prueba u organismo de prueba. Típicamente, el organismo de referencia es un organismo sano, en particular un organismo que no padece de una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa. Un "valor de referencia" o "nivel de referencia" puede determinarse empíricamente a partir de una referencia mediante la medición de una cantidad suficientemente grande de referencias. Preferentemente, el valor de referencia se determina mediante la medición de al menos 2, preferentemente, al menos 3, preferentemente, al menos 5, preferentemente, al menos 8, preferentemente, al menos 12, preferentemente, al menos 20, preferentemente al menos 30, preferentemente, al menos 50, o preferentemente, al menos 100 referencias.
De acuerdo con la enseñanza, el término "agente de unión" incluye cualquier compuesto que tiene una capacidad de unión a una diana. Preferentemente, tal agente de unión comprende al menos un dominio de unión para la diana. El término incluye moléculas tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, receptores antigénicos quiméricos (CAR) y todas las moléculas de unión artificial (andamios) que tienen capacidad de unión a la diana, incluidas, pero no se limitan a nanocuerpos, aficuerpos, anticalinas, DARPins, monocuerpos, avímeros y microcuerpos. En una realización, dicha unión es una unión específica.
El término "inmunoglobulina" se refiere a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas, preferentemente a receptores de antígenos tales como anticuerpos o el receptor de células B (BCR). Las inmunoglobulinas se caracterizan por un dominio estructural, es decir, el dominio de inmunoglobulina, que tiene un pliegue de inmunoglobulina (Ig) característico. El término abarca las inmunoglobulinas unidas a membrana, así como también las inmunoglobulinas solubles. Las inmunoglobulinas unidas a membrana también se denominan inmunoglobulinas de superficie o inmunoglobulinas de membrana, que generalmente forman parte del BCR. Las inmunoglobulinas solubles generalmente se denominan anticuerpos. Las inmunoglobulinas generalmente comprenden varias cadenas, típicamente dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro. Estas cadenas se componen principalmente de dominios de inmunoglobulinas, tales como el dominio Vl (cadena ligera variable), dominio Cl (cadena ligera constante) y los dominios Ch (cadena pesada constante) Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4. Hay cinco tipos de cadenas pesadas de inmunoglobulinas de mamíferos, es decir, a, 8, £, y y M que explican las diferentes clases de anticuerpos, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. A diferencia de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas solubles, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de membrana o de superficie comprenden un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático corto en su extremo carboxi-terminal. En los mamíferos hay dos tipos de cadenas ligeras, es decir, lambda y kappa. Las cadenas de inmunoglobulinas comprenden una región variable y una región constante. La región constante se conserva esencialmente dentro de los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas, en donde la parte variable es muy diversa y explica el reconocimiento del antígeno.
El término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente descripción como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente descripción como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestos de amino terminal a carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y al primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal presenta una especificidad de unión y afinidad únicas. En una realización, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B que se obtiene de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que se fusiona a una célula inmortalizada.
El término "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente descripción, incluye todos los anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos que se aíslan de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma que se prepara a partir de estos, (b) anticuerpos que se aíslan de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos que se aíslan de una biblioteca recombinante, combinatoria, de anticuerpos y (d) anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el empalme de secuencias génicas de la inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.
El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo).
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde la estructura remanente de la inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o la secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender tanto dominios variables completos fusionados a dominios constantes como solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en las regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que se alteran con respecto al anticuerpo original.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras es homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase particular, mientras que el segmento remanente de la cadena es homólogo a secuencias correspondientes en otro. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada mimetiza las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas mediante el uso de células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos huéspedes no humanos en combinación con las regiones constantes que se derivan de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de ser fácil de preparar y que la fuente no afecta a la especificidad, la región constante que es humana, es menos probable que genere una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que si la región constante fuera de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.
Los anticuerpos pueden derivarse de diferentes especies, que incluyen, pero no se limitan a, ratón, rata, conejo, cobayo y humano.
Los anticuerpos que se describen en la presente descripción incluyen IgA tal como anticuerpos IgA1 o IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, e IgD. En varias realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un IgG1, isotipo kappa o IgG1 isotipo lambda (es decir, IgG1, k, A), un anticuerpo IgG2a (por ejemplo, IgG2a, k, A), un anticuerpo IgG2b (por ejemplo IgG2b, k, A), un anticuerpo IgG3 (por ejemplo IgG3, k, A) o un anticuerpo IgG4 (por ejemplo IgG4, k, A).
Los anticuerpos descritos en la presente descripción son, preferentemente, aislados. Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente descripción, pretende referirse a un anticuerpo que está esencialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CLDN18.2, está esencialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CLDN18.2). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de CLDN18.2 humana puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de CLDN18.2). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una realización de la enseñanza, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que tienen especificidades diferentes y que se combinan en una composición o mezcla bien definida.
Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de unión") o términos similares, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward y otros, (1989) Nature 341: 544­ 546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones aisladas determinantes de la complementariedad (CDR), y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, ellos pueden unirse, mediante el uso de métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite hacerlos como una proteína de cadena única en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242: 423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena única se abarquen dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional son las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona a un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región bisagra y (iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región constante CH2. El polipéptido del dominio de unión puede ser una región variable de la cadena pesada o una región variable de la cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen además en los documentos números. US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante el uso de técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica, y se seleccionan los fragmentos para la utilidad de la misma manera que a los anticuerpos intactos.
De acuerdo con la enseñanza, el término "dominio de unión para CLDN18.2" incluye y preferentemente se refiere a la porción de unión a antígeno de un anticuerpo a CLDN18.2, es decir, un anticuerpo que está dirigido contra CLDN18.2 y es preferentemente específico para CLDN18.2.
El término "dominio de unión" caracteriza, en relación con la presente enseñanza, una estructura por ejemplo de un anticuerpo, que se une a/interactúa con una estructura/antígeno/epítopo diana dado. Por lo tanto, el dominio de unión de acuerdo con la enseñanza designa un "sitio de interacción con el antígeno".
Todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos tales como fragmentos de anticuerpos como se describe en la presente descripción, para los fines de la enseñanza, se abarcan por el término "anticuerpo".
Los anticuerpos pueden producirse mediante una variedad de técnicas, que incluyen la metodología convencional del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de los linfocitos B o técnicas de presentación en fagos mediante bibliotecas de genes de anticuerpos.
El sistema animal que prefiere para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. También se conocen las parejas de fusión (por ejemplo, las células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión.
Otros sistemas de animales que se prefieren para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y el de conejo (por ejemplo, se describen en Spieker-Polet y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 92:9348 (1995), véase también Rossi y otros, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
Para generar los anticuerpos, los ratones pueden inmunizarse con portadores de péptidos conjugados derivados de la secuencia del antígeno, es decir, la secuencia contra la cual los anticuerpos deben dirigirse, una preparación enriquecida de antígeno expresado de manera recombinante o fragmentos de este y/o células que expresan el antígeno, como se describió. Alternativamente, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica el antígeno o fragmentos de este. En caso de que las inmunizaciones que usan una preparación purificada o enriquecida del antígeno no resulten en anticuerpos, los ratones pueden también inmunizarse con células que expresan el antígeno, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.
La respuesta inmunitaria puede monitorearse en el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen por la vena de la cola o sangrados retroorbitales. Los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina pueden usarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse de manera intraperitoneal o intravenosa con el antígeno que expresan las células 3 días antes del sacrificio y la eliminación del bazo para aumentar la tasa de hibridomas que secretan anticuerpos específicos.
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales, pueden aislarse los esplenocitos y las células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden luego tamizarse para la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Los pocillos individuales pueden luego tamizarse mediante ELISA para hibridomas que secretan anticuerpos. Por análisis de Inmunofluorescencia y FACS mediante el uso de las células que expresan el antígeno, pueden identificarse los anticuerpos con especificidad para el antígeno. Los hibridomas que secretan el anticuerpo pueden replaquearse, tamizarse de nuevo, y si todavía son positivos para los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse por dilución limitante. Los subclones estables pueden después cultivarse in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo tisular para la caracterización.
La capacidad de los anticuerpos y otros agentes de unión para unirse a un antígeno puede determinarse mediante el uso de ensayos de unión estándar (por ejemplo, ELISA, transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo).
Los anticuerpos y derivados de anticuerpos son útiles para proporcionar dominios de unión tales como fragmentos de anticuerpos, en particular para proporcionar regiones VL y VH.
Un dominio de unión para CLDN18.2 que puede estar presente dentro de un receptor de células T artificial tiene la capacidad de unirse a CLDN18.2, es decir la capacidad de unirse a un epítopo presente en CLDN18.2, preferentemente un epítopo localizado dentro de los dominios extracelulares de CLDN18.2, en particular el primer lazo extracelular, preferentemente las posiciones de los aminoácidos 29 al 78 de CLDN18.2. En realizaciones particulares, un dominio de unión para CLDN18.2 se une a un epítopo en CLDN18.2 que no está presente en CLDN18.1. Con la máxima preferencia, un dominio de unión para CLDN18.2 se une a un epítopo en CLDN18.2 que no está presente en una proteína CLDN distinta de CLDN18.2.
Un dominio de unión para CLDN18.2 preferentemente se une a CLDN18.2 pero no a CLDN18.1. Preferentemente, un dominio de unión para CLDN18.2 es específico para CLDN18.2. Preferentemente, un dominio de unión para CLDN18.2 se une a CLDN18.2 expresada en la superficie celular. En realizaciones particulares preferidas, un dominio de unión para CLDN18.2 se une a epítopos nativos de CLDN18.2 presentes en la superficie de las células vivas.
En una realización preferida, un dominio de unión para CLDN18.2 comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 y 25, o un fragmento de la misma o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento.
En una realización preferida, un dominio de unión para CLDN18.2 comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33 y 34, o un fragmento de la misma o una variante de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento.
En ciertas realizaciones preferidas, un dominio de unión para CLDN18.2 comprende una combinación de la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL) seleccionada de las siguientes posibilidades (i) a (ix):
(i) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 20 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 27 o un fragmento de la misma, (ii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 26 o un fragmento de la misma, (iii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 22 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 28 o un fragmento de la misma, (iv) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 24 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma, (v) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 23 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma, (vi) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 29 o un fragmento de la misma, (vii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 32 o un fragmento de la misma, (viii) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33 o un fragmento de la misma, (ix) la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 25 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 34 o un fragmento de la misma.
En una realización particularmente preferida, un dominio de unión para CLDN18.2 comprende la siguiente combinación de la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL): la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 23 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma.
En una realización particularmente preferida, un dominio de unión para CLDN18.2 comprende la siguiente combinación de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL): la VH comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 21 o un fragmento de la misma y la VL comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 26 o un fragmento de la misma.
En una realización preferida, un dominio de unión para CLDN18.2 comprende (i) una VH que comprende una CDR3 que comprende la siguiente secuencia: TRSWRGNSFDY y/o (ii) una VL que comprende una CDR3 que comprende la siguiente secuencia: QNDYSYPFT.
En una realización preferida, un dominio de unión para CLDN18.2 comprende
(i) una VH que comprende el siguiente conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3:
CDR1: GYTFTSYW, CDR2: IYPSDSYT, CDR3: TRSWRGNSFDY
y/o
(ii) una VL que comprende el siguiente conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3:
CDR1: QSLLNSGNQKNY, CDR2: WAS, CDR3: QNDYSYPFT.
En una realización preferida, un dominio de unión para CLDN18.2 comprende una combinación de VH y VL que comprende cada una el siguiente conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3: VH: CDR1: GYTFTSYW, CDR2: IYPSDSYT, CDR3: TRSWRGNSFDY, VL: CDR1: QSLLNSGNQKNY, CDR2: WAS, CDR3: QNDYSYPFT.
Preferentemente, una combinación de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) descrita en la presente descripción se dispone en un Fv de cadena sencilla (scFv).
El término "fragmento" se refiere a, en particular, una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), preferentemente al menos la región variable CDR3, de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL). En una realización dichas una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se seleccionan de un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3. En una realización particularmente preferida, el término "fragmento" se refiere a las regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada (VH) y/o de la región variable de cadena ligera (VL).
En una realización, un dominio de unión para CLDN18.2 que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una combinación de los conjuntos de CDR como se describe en la presente descripción comprende dichas CDR junto con sus regiones marco intermedias. Preferentemente, la porción además incluirá al menos aproximadamente 50 % de una o ambas de las regiones marco primera y cuarta, el 50 % que es el 50 % del C-terminal de la primera región marco y el 50 % del N-terminal de la cuarta región marco. La construcción de los agentes de unión hechos por técnicas de ADN recombinante puede resultar en la introducción de residuos N- o C-terminal a las regiones variables codificadas mediante los conectores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación, que incluyen la introducción de conectores para unir las regiones variables de la enseñanza a secuencias adicionales de proteínas que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulinas, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcas de proteínas.
En una realización un dominio de unión para CLDN18.2 que comprende una o más CDR, un conjunto de CDR o una combinación de los conjuntos de CDR como se describe en la presente descripción comprende dichas CDR en un marco de anticuerpo humano.
En una realización, un dominio de unión para CLDN18.2 de acuerdo con la enseñanza se refiere a un dominio de unión para CLDN18.2 que reconoce, es decir, se une al mismo o esencialmente el mismo epítopo que un dominio de unión para CLDN18.2 descrito en la presente descripción (tal como un anticuerpo que comprende una combinación de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) descrita en la presente descripción), y/o compite con dicho dominio de unión para CLDN18.2 por unirse a CLDN18.2.
El término "unión" de acuerdo con la enseñanza se refiere, preferentemente, a una unión específica.
De acuerdo con la presente enseñanza, un agente tal como un receptor de células T o un anticuerpo es capaz de unirse a una diana predeterminada si tiene una afinidad significativa por dicha diana predeterminada y se une a dicha diana predeterminada en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide por la constante de disociación en equilibrio (Kd). Preferentemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a un objetivo predeterminado con una constante de disociación (Kd) de 10'5 M o inferior, 10'6 M o inferior, 10'7 M o inferior, 10'8 M o inferior, 10'9M o inferior, 10'1° M o inferior, 10'11 M o inferior, o 10'12 M o inferior.
Un agente no es (esencialmente) capaz de unirse a una diana si no tiene una afinidad significativa por dicha diana y no se une significativamente, en particular no se une de manera detectable, a dicha diana en ensayos estándar. Preferentemente, el agente no se une de manera detectable a dicha diana si se presenta en una concentración de hasta 2, preferentemente 10, con mayor preferencia 20, en particular, 50 o 100 pg/mL o superior. Preferentemente, un agente no tiene afinidad significativa por una diana si se une a dicha diana con una Kd que es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces superior que la Kd de unión a la diana predeterminada a la que el agente es capaz de unirse. Por ejemplo, si la Kd para la unión de un agente a la diana, a la cual el agente es capaz de unirse es 10'7 M, la Kd para la unión a una diana por la cual el agente no tiene afinidad significativa será, al menos, 10'6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M o 10'1 M.
Un agente es específico para una diana predeterminada si es capaz de unirse a dicha diana predeterminada mientras que no es capaz de unirse (sustancialmente) a otras dianas, es decir, no tiene afinidad significativa por otras dianas y no se une significativamente a otras dianas en ensayos estándar. De acuerdo con la enseñanza, un agente es específico para CLDN18.2 si es capaz de unirse a CLDN18.2 pero no es (sustancialmente) capaz de unirse a otras dianas. Preferentemente, un agente es específico para CLDN18.2 si la afinidad por y la unión a tales otras dianas no excede significativamente la afinidad por o la unión a proteínas no relacionadas con CLDN18.2 tales como albúmina de suero bovina (BSA), caseína, albúmina de suero humana (HSA) o proteínas transmembrana que no son claudinas, tales como moléculas de MHC o receptor de transferrina o cualquier otro polipéptido especificado. Preferentemente, un agente es específico para una diana predeterminada si se une a dicha diana con una Kd que es al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces menor que la Kd de unión a una diana para el que no es específico. Por ejemplo, si la Kd de unión de un agente a la diana para el que es específico es 10'7M, la Kd de unión a una diana para el que no es específico pudiera ser de al menos 10'6 M, 10'5 M, 10'4 M, 10'3 M, 10'2 M, o 10'1 M.
La unión de un agente a una diana puede determinarse experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky y otros, "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company Nueva York, N Y (1992), y los métodos descritos en la presente descripción. Las afinidades pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, tales como la diálisis de equilibrio; mediante el uso del instrumento BIAcore 2000, mediante el uso de procedimientos generales delineados por el fabricante; por radioinmunoensayo mediante el uso del antígeno diana radiomarcado; o por otro método conocido por el experto en la materia. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, mediante el método de Scatchard y otros, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). La afinidad que se mide a una interacción particular antígeno anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo, Kd, IC50, se llevan a cabo preferentemente, con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.
Debe entenderse que los agentes peptídicos y proteicos descritos en la presente descripción pueden proporcionarse in vitro o in vivo en forma de un ácido nucleico tal como el ARN que codifica el agente y/o en forma de una célula huésped que comprende un ácido nucleico tal como ARN que codifica el agente. En particular, puede usarse una variedad de métodos para introducir constructos de CAR en células T, incluida la transfección de ADN no basada en virus, sistemas basados en transposones y sistemas basados en virus. La transfección de ADN no basada en virus tiene un riesgo bajo de mutagénesis de inserción. Los sistemas basados en transposones pueden integrar transgenes de manera más eficiente que los plásmidos que no contienen un elemento integrador. Los sistemas basados en virus incluyen el uso de Y-retrovirus y vectores lentivirales. Los Y-retrovirus son relativamente fáciles de producir, transducen de manera eficiente y permanente las células T, y se ha probado preliminarmente que son seguros desde el punto de vista de la integración en las células T primarias humanas. Los vectores lentivirales también transducen de manera eficiente y permanente las células T, pero su fabricación es más cara. También son potencialmente más seguros que los sistemas basados en retrovirus.
Los agentes peptídicos y proteicos descritos en la presente descripción pueden suministrarse a un paciente mediante la administración de un ácido nucleico tal como el ARN que codifica al agente y/o mediante la administración de una célula huésped que comprende un ácido nucleico tal como el ARN que codifica al agente. Un ácido nucleico cuando se administra a un paciente puede presentarse en la forma desnuda o en un vehículo de suministro adecuado tal como en la forma de liposomas o partículas virales, o dentro de una célula huésped. El ácido nucleico proporcionado puede producir el agente durante periodos de tiempo prolongados de forma sostenida, lo que mitiga la inestabilidad observada al menos parcialmente para las proteínas terapéuticas. Si un ácido nucleico se administra a un paciente sin estar presente dentro de una célula huésped, es captado, preferentemente, por las células del paciente para la expresión del agente codificado por el ácido nucleico. Si un ácido nucleico se administra a un paciente mientras está presente dentro de una célula huésped, se expresa, preferentemente, en la célula huésped dentro del paciente para producir el agente codificado por el ácido nucleico.
El término "ácido nucleico", como se usa en la presente descripción, pretende incluir ADN y ARN tal como moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm, producidas de manera recombinante y sintetizadas de manera química. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. El ARN incluye transcritos in vitro de ARN (IVT ARN) o ARN sintético. De acuerdo con la enseñanza, un ácido nucleico es preferentemente un ácido nucleico aislado.
Los ácidos nucleicos pueden comprenderse en un vector. EL término "vector" como se usa en la presente descripción incluye cualquiera de los vectores conocidos por la persona experta, que incluye vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de fagos tales como fago lambda, vectores virales tales como vectores de adenovirus o baculovirus, o vectores cromosómicos artificiales tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) o cromosomas artificiales PI (PAC). Dichos vectores incluyen vectores de expresión así como también de clonación. Los vectores de expresión comprenden los plásmidos así como también vectores virales y generalmente contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacteria, levadura, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se usan generalmente para modificar genéticamente y amplificar un cierto fragmento de ADN deseado y pueden carecer de las secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y preferentemente está compuesta totalmente o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosil. El término incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tales como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de manera recombinante, así como también ARN modificado que difiere del ARN presente de manera natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo, a uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN pueden comprender también nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos que no son de origen natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden referirse como análogos o análogos de ARN de origen natural.
De acuerdo con la presente enseñanza, el término "ARN" incluye y preferentemente se refiere a "ARNm" que significa "ARN mensajero" y se refiere a un "transcrito" que puede producirse mediante el uso de ADN como molde y codifica un péptido o proteína, el ARNm típicamente comprende una región no traducida 5' (5'-UTR), una región que codifica la proteína o péptido y una región no traducida 3' (3'-UTR). El ARNm tiene una vida media limitada en las células e in vitro. Preferentemente, el ARNm se produce por transcripción in vitro mediante el uso de un molde de ADN. En una realización de la enseñanza, el ARN se obtiene por transcripción in vitro o síntesis química. La metodología de la transcripción in vitro se conoce por la persona experta. Por ejemplo, existe una variedad de estuches de transcripción in vitro disponibles comercialmente.
En una realización de la presente enseñanza, el ARN es ARN autorreplicante, tal como ARN autorreplicante monocatenario. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN monocatenario de sentido positivo. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN viral o ARN derivado de ARN viral. En una realización, el ARN autorreplicante es un ARN genómico alfaviral o se deriva de un ARN genómico alfaviral. En una realización, el ARN autorreplicante es un vector de expresión de genes virales. En una realización, el virus es el virus del bosque Semliki. En una realización, el ARN autorreplicante contiene uno o más transgenes, al menos uno de dichos transgenes codifica los agentes descritos en la presente descripción. En una realización, si el ARN es ARN viral o derivado de ARN viral, los transgenes pueden reemplazar parcialmente o completamente las secuencias virales tal como las secuencias virales que codifican proteínas estructurales. En una realización, el ARN autorreplicante es ARN transcrito in vitro.
Para aumentar la expresión y/o la estabilidad del ARN usado de acuerdo con la presente enseñanza, este puede modificarse, preferentemente, sin alterar la secuencia del péptido o la proteína expresados.
El término "modificación", en el contexto del ARN, como se usa de acuerdo con la presente enseñanza, incluye cualquier modificación del ARN que no se presenta naturalmente en dicho ARN.
En una realización de la enseñanza, el ARN utilizado de acuerdo con la enseñanza no tiene 5'-trifosfatos sin caperuza. La eliminación de tales 5'-trifosfatos sin caperuza puede lograrse al tratar el ARN con una fosfatasa.
El ARN de acuerdo con la enseñanza puede tener ribonucleótidos modificados de origen natural o sintéticos para aumentar su estabilidad y/o disminuir su citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con la enseñanza se sustituye parcialmente o completamente, preferentemente, completamente, la 5-metilcitidina por citidina. Alternativa o adicionalmente, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con la enseñanza se sustituye parcialmente o completamente, preferentemente, completamente, la pseudouridina por uridina.
En una realización, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con una caperuza 5' o un análogo de la caperuza 5'. El término "5'-cap'" se refiere a una estructura de caperuza que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y consiste, generalmente, en un nucleótido de guanosina que se conecta al ARNm a través de un enlace inusual 5' a 5' trifosfato. En una realización, esta guanosina se metila en la posición 7. El término "5'-cap convencional" se refiere a una 5'-cap de ARN de origen natural, preferentemente, a la caperuza 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente enseñanza, el término "5'-cap" incluye un análogo de la 5'-cap que se asemeja a la estructura de la caperuza de ARN y se modifica para que posea la capacidad de estabilizar el ARN si se une a este, preferentemente, in vivo y/o en una célula.
Proporcionar un ARN con una 5'-cap o análogo de la 5'-cap puede lograrse por transcripción in vitro de un molde de ADN en presencia de dicha 5'-cap o análogo de la 5'-cap, en donde dicha 5'-cap se incorpora cotranscripcionalmente a la cadena de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, por transcripción in vitro, y la 5'-cap puede unirse al ARN de manera postranscripcional mediante el uso de enzimas que añaden la caperuza, por ejemplo, las enzimas que añaden la caperuza del virus vaccinia.
El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN usado en la presente enseñanza puede ser una extensión o acortamiento de la cola de poli(A) presente de manera natural o una alteración de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3' tal como la introducción de una UTR que no se relaciona con la región codificante de dicho ARN, por ejemplo, la inserción de una o más, preferentemente dos copias de una UTR 3' derivada de un gen de globina, tal como alfa2 globina, alfa1 globina, betaglobina, preferentemente betaglobina, con mayor preferencia betaglobina humana.
Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente enseñanza, puede modificarse para que esté presente junto con una secuencia poli A, que tiene preferentemente una longitud de 10 a 500, con mayor preferencia de 30 a 300, aún con mayor preferencia de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. En una realización especialmente preferida la secuencia de poli A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Además, la incorporación de dos o más regiones no traducidas (UTR) 3' en la región no traducida 3' de una molécula de ARN puede resultar en una potenciación de la eficiencia de la traducción. En una realización particular la UTR 3' se deriva del gen de la p-globina humana.
El término "estabilidad" del ARN se refiere a la "vida media" del ARN. "Vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad, o número de moléculas. En el contexto de la presente enseñanza, la vida media de un ARN es indicativo de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influenciar la "duración de la expresión" del ARN. Puede esperarse que el ARN que tiene una vida media larga se expresará por un período de tiempo prolongado.
En el contexto de la presente enseñanza, el término "transcripción" se refiere a un proceso, en donde el código genético en una secuencia de ADN se transcribe a ARN. Subsecuentemente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente enseñanza, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en donde el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso en donde el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferentemente, mediante el uso de extractos celulares apropiados. Preferentemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcriptos. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y son abarcados, de acuerdo con la presente enseñanza, por el término "vector".
El término "traducción", de acuerdo con la enseñanza, se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una cadena de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o proteína.
Los ácidos nucleicos pueden, de acuerdo con la enseñanza, presentarse solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En realizaciones preferidas, un ácido nucleico se une funcionalmente a secuencias de control de la expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. El término "homólogo" significa que los ácidos nucleicos también se unen funcionalmente de forma natural y el término "heterólogo" significa que los ácidos nucleicos no están unidos funcionalmente de forma natural.
Un ácido nucleico y una secuencia de control de la expresión se unen "funcionalmente" entre sí, si se enlazan covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o la transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de la expresión. Si el ácido nucleico debe traducirse en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de la expresión funcionalmente unida a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de la expresión resulta en la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un cambio de marco en la secuencia codificante o que dicha secuencia codificante no sea capaz de traducirse en la proteína o péptido deseado.
El término "secuencia de control de la expresión" o "elemento de control de la expresión" comprende, de acuerdo con la enseñanza, promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. En realizaciones particulares de la enseñanza, pueden regularse las secuencias de control de la expresión. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar en función de la especie o el tipo celular, pero generalmente comprende las secuencias 5'-sin transcribir y 5'- y 3'-sin traducir que están involucradas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como caja TATA, secuencia de caperuza, secuencia CAAT y similares. Más específicamente, las secuencias de control de expresión 5'-sin transcribir comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias de control de la expresión pueden comprender, además, las secuencias potenciadoras o secuencias activadoras corriente arriba.
El término "expresión" se usa, de acuerdo con la enseñanza, en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos o proteínas, por ejemplo, por transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. Comprende también la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable. De acuerdo con la enseñanza, el término expresión incluye, además, una "expresión aberrante" o "expresión anormal".
"Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa de acuerdo con la enseñanza que la expresión se altera, preferentemente, se aumenta, en comparación con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de una cierta proteína, por ejemplo, un antígeno tumoral. Un aumento de la expresión se refiere aun aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 % o al menos 100 %, o más. En una realización, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime.
El término "expresado específicamente" significa que una proteína se expresa esencialmente solo en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno tumoral expresado específicamente en la mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa primariamente en la mucosa gástrica, y no se expresa en otros tejidos o no se expresa en un grado significativo en otros tipos de tejidos u órganos. Por lo tanto, una proteína que se expresa exclusivamente en las células de la mucosa gástrica y en un grado significativamente menor en cualquier otro tejido, tal como el testículo, se expresa específicamente en las células de la mucosa gástrica. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral también puede expresarse específicamente bajo condiciones normales en más de un tipo de tejido u órgano, tal como en 2 o 3 tipos de tejidos u órganos, pero preferentemente en no más de 3 tipos diferentes de tejidos u órganos. En este caso, el antígeno tumoral se expresa entonces específicamente en estos órganos. Por ejemplo, si un antígeno tumoral se expresa bajo condiciones normales, preferentemente, en un grado aproximadamente igual en pulmón y estómago, dicho antígeno tumoral se expresa específicamente en pulmón y estómago.
De acuerdo con la enseñanza, el término "ácido nucleico codificante" significa que el ácido nucleico, si se presenta en el ambiente apropiado, preferentemente, dentro de una célula, puede expresarse para producir una proteína o péptido que codifica.
Algunos aspectos de la enseñanza se basan en la transferencia adoptiva de células huésped que se transfectan in vitro con un ácido nucleico tal como el ARN que codifica un agente descrito en la presente descripción y se transfiere a receptores tales como pacientes, preferentemente después de la expansión ex vivo de bajas frecuencias de precursores a números de células clínicamente relevantes. Las células huésped usadas para el tratamiento de acuerdo con la enseñanza pueden ser autólogas, alogénicas o singénicas para un receptor tratado.
El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "trasplante autólogo" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Tales procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que de cualquier otra manera resulta en el rechazo.
El término "alogénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.
El término "singénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos, es decir, gemelos idénticos o animales de la misma cepa endogámica, o sus tejidos.
El término "heterólogo" se usa para describir algo que consiste de múltiples elementos diferentes. Como ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a un individuo diferente constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta al sujeto.
El término "transfección" se refiere a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ARN, en una célula. Para los propósitos de la presente enseñanza, el término "transfección" también incluye la introducción de un ácido nucleico en una célula o la captación de un ácido nucleico portal célula, en donde la célula puede estar presente en un sujeto, por ejemplo, un paciente. Por lo tanto, de acuerdo con la presente enseñanza, una célula para la transfección de un ácido nucleico descrito en la presente descripción puede estar presente in vitro o in vivo, por ejemplo, la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo de un paciente. De acuerdo con la enseñanza, la transfección puede ser transitoria o estable. Para algunas aplicaciones de la transfección, es suficiente si el material genético transfectado se expresa solo transitoriamente. Como el ácido nucleico que se introduce en el proceso de transfección no se integra usualmente en el genoma nuclear, el ácido nucleico extraño se diluirá a través de la mitosis o se degradará. Las células que permiten la amplificación episomal de ácidos nucleicos reducen grandemente la tasa de la dilución. Si se desea que el ácido nucleico transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe ocurrir una transfección estable. El ARN puede transfectarse en las células para expresar transitoriamente su proteína codificada.
De acuerdo con la presente enseñanza, puede usarse cualquier técnica útil para introducir, es decir, transferir o transfectar, ácidos nucleicos en las células. Preferentemente, el ARN se transfecta en células mediante técnicas estándar. Estas técnicas incluyen electroporación, lipofección y microinyección. En una realización particularmente preferida de la presente enseñanza, el ARN se introduce en las células mediante electroporación.
La electroporación o electropermeabilización se refiere a un aumento significativo de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular provocada por un campo eléctrico aplicado externamente. Suele usarse en biología molecular como una forma de introducir alguna sustancia en una célula.
De acuerdo con la enseñanza, se prefiere que la introducción del ácido nucleico que codifica una proteína o péptido en las células resulte en la expresión de dicha proteína o péptido.
El término "péptido" de acuerdo con la enseñanza, comprende oligopéptidos y polipéptidos y se refiere a las sustancias que comprenden dos o más, preferentemente 3 o más, preferentemente 4 o más, preferentemente 6 o más, preferentemente 8 o más, preferentemente 9 o más, preferentemente 10 o más, preferentemente 13 o más, preferentemente 16 o más, preferentemente 21 o más y hasta preferentemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferentemente, a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptidos" y "proteínas" son sinónimos y se usan indistintamente en la presente descripción.
De acuerdo con la enseñanza, un péptido puede incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales. En una realización, un péptido simplemente incluye aminoácidos naturales.
De acuerdo con la enseñanza, el término "aminoácido no natural" se refiere a un aminoácido que tiene una estructura diferente de las de las 20 especies de aminoácidos naturales. Dado que los aminoácidos no naturales tienen estructuras similares a las de los aminoácidos naturales, los aminoácidos no naturales pueden clasificarse como derivados o análogos de determinados aminoácidos naturales.
Preferentemente, las proteínas y péptidos descritos de acuerdo con la enseñanza se han aislado. Los términos "proteína aislada" o "péptido aislado" significan que la proteína o el péptido se han separado de su ambiente natural. Una proteína o un péptido aislado pueden estar en un estado purificado esencialmente. El término "purificado esencialmente" significa que la proteína o péptido está libre esencialmente de otras sustancias con las que se asocia en la naturaleza o in vivo.
La enseñanza dada en la presente descripción con respecto a secuencias de aminoácidos específicas, por ejemplo, aquellas que se muestran en el listado de secuencias, se debe interpretar para que, además, se relacionen las variantes de dichas secuencias específicas que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que muestran propiedades idénticas o similares a aquellas de las secuencias de aminoácidos específicas. Una propiedad importante es retener la unión de un péptido a una molécula de MHC y/o un receptor de células T o de un receptor de células T a su diana o mantener las funciones efectoras de una célula T. Preferentemente, una secuencia se modificó con respecto a una secuencia específica, cuando reemplaza la secuencia específica en un receptor de células T, retiene la unión de dicho receptor de células T a la diana y preferentemente funciona de dicho receptor de células T o célula T que lleva el receptor de células T como se describe en la presente descripción.
Por ejemplo, las secuencias que se muestran en el listado de secuencias se pueden modificar para eliminar uno o más, preferentemente todos los residuos de cisteína libres, en particular al reemplazar los residuos de cisteína por aminoácidos distintos de cisteína, preferentemente serina, alanina, treonina, glicina, tirosina, leucina o metionina, con la máxima preferencia alanina o serina.
Los expertos en la técnica apreciarán que en particular las secuencias de las secuencias de CDR, regiones hipervariables y variables pueden modificarse sin perder la capacidad de unirse a una diana. Por ejemplo, las regiones CDR serán idénticas o altamente homólogas a las regiones de anticuerpos especificadas en la presente descripción. Por "altamente homóloga" se contempla que de 1 a 5, preferentemente, de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones pueden hacerse en las CDR. Además, las regiones hipervariables y variables pueden modificarse de manera que muestren homología sustancial con las regiones descritas específicamente en la presente descripción.
Una "variante" de péptido puede retener la inmunogenicidad de un péptido dado (por ejemplo, la capacidad de la variante para reaccionar con líneas de células T o clones no disminuye sustancialmente con relación al péptido dado). En otras palabras, la capacidad de una variante para reaccionar con líneas o clones de células T puede aumentar o no modificarse, con relación al péptido dado, o puede disminuir en menos del 50 %, y preferentemente menos del 20 %, con relación al péptido dado.
Se puede identificar una variante al evaluar su capacidad para unirse a una molécula de MHC. En una realización preferida, un péptido variante tiene una modificación de manera que la capacidad del péptido variante para unirse a una molécula de MHC aumenta con relación al péptido dado. La capacidad del péptido variante para unirse a una molécula de MHC puede aumentarse al menos 2 veces, preferentemente al menos 3 veces, 4 veces o 5 veces con relación a la de un péptido dado. En consecuencia, dentro de ciertas realizaciones preferidas, un péptido comprende una variante en la que de 1 a 3 aminoácidos que residen dentro de una porción inmunogénica se sustituyen de manera que la capacidad de reaccionar con líneas de células T o clones es estadísticamente mayor que la del péptido no modificado. Preferentemente, tales sustituciones se localizan dentro de un sitio de unión al MHC del péptido. Las sustituciones preferidas permiten un aumento de la unión a moléculas de MHC de clase I o clase II. Ciertas variantes contienen sustituciones conservadoras.
El término "variante" de acuerdo con la enseñanza incluye, además, mutantes, variantes de corte y empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están presentes de forma natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya relevancia frecuentemente no está clara. La secuenciación génica completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen determinado. Un homólogo de especie es una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con una especie de origen diferente de una secuencia determinada de un ácido nucleico o aminoácido. El término "variante" abarcará cualquiera de las variantes modificadas postraduccionalmente y variantes conformacionales.
Para los propósitos de la presente enseñanza, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de deleción de aminoácidos que comprenden la deleción en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína se denominan también variantes de truncamiento N-terminal y/o C-terminal.
Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de secuencias de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque es posible también una inserción aleatoria con el tamizaje apropiado del producto resultante.
Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones aminoterminales y/o carboxiterminales de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos.
Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tales como por la eliminación de 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos. Las deleciones pueden estar en cualquier posición de la proteína.
Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo en la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. La preferencia está dada a las modificaciones que están en las posiciones de la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre las proteínas o péptidos homólogos y/o al reemplazo de aminoácidos con otros que tienen propiedades similares. Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteína son cambios conservadores de aminoácidos, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio conservador de aminoácidos involucra la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). En ocasiones la fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.
Preferentemente, el grado de similitud, preferentemente de identidad entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de la secuencia de aminoácidos dada será de al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. El grado de similitud o de identidad está dado, preferentemente para una región del aminoácido que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente 100 % de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consiste en 200 aminoácidos, el grado de similitud o de identidad se da, preferentemente, para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180, o aproximadamente 200 aminoácidos, preferentemente, aminoácidos continuos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad está dado por la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia. El alineamiento para determinar la similitud de secuencia, preferentemente, la identidad de secuencia, puede realizarse con herramientas conocidas en la técnica, preferentemente, mediante el uso del mejor alineamiento de secuencia, por ejemplo, mediante el uso de Align, mediante el uso de configuraciones estándar, preferentemente, EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. "Identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.
El término "porcentaje de identidad" pretende indicar un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias a comparar, se obtiene después del mejor alineamiento, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen en forma aleatoria y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente mediante la comparación de estas secuencias después de haberlas alineado de forma óptima, dicha comparación se lleva a cabo por segmento o por "ventana de comparación" con el fin de identificar y comparar las regiones locales con similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede producirse, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 85, 2444, o por medio de programas de ordenador que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TfAs TA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
El porcentaje de identidad se calcula mediante la determinación del número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, se divide este número entre el número de posiciones comparadas, y se multiplica el resultado obtenido por 100 de forma que se obtiene el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Las secuencias de aminoácidos homólogas exhiben, de acuerdo con la enseñanza, al menos un 40 %, en particular al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % y, preferentemente al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de los residuos de aminoácidos.
Las variantes de secuencias de aminoácidos descritas en la presente descripción pueden prepararse fácilmente por el experto, por ejemplo, mediante manipulación del ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para la preparación de proteínas y péptidos que tienen sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones, se describe en detalle en Sambrook y otros (1989), por ejemplo. Además, las variantes de aminoácidos y péptidos descritas en la presente descripción pueden prepararse fácilmente con la ayuda de técnicas conocidas de síntesis de péptidos tales como, por ejemplo, mediante la síntesis en fase sólida y métodos similares.
La enseñanza incluye derivados de los péptidos o proteínas descritos en la presente descripción que están comprendidos por los términos "péptido" y "proteína". De acuerdo con la enseñanza, los "derivados" de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones, simples o múltiples, de cualquiera de las moléculas asociadas con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. En una realización, los "derivados" de proteínas o péptidos incluyen aquellos análogos modificados que resultan de la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivatización, introducción de grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica o unión a un anticuerpo u otro ligando celular. El término "derivado" se extiende, además, a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferentemente, un péptido modificado tiene estabilidad aumentada y/o inmunogenicidad aumentada.
También se incluyen miméticos de péptidos. Dichos miméticos pueden comprender aminoácidos unidos a uno o más miméticos de aminoácidos (es decir, uno o más aminoácidos dentro del péptido pueden ser reemplazados por un mimético de aminoácidos) o pueden ser completamente miméticos no peptídicos. Un mimético de aminoácido es un compuesto que es conformacionalmente similar a un aminoácido, por ejemplo, de manera que puede ser sustituido por un aminoácido sin disminuir sustancialmente la capacidad de reaccionar con líneas o clones de células T. Un mimético no peptídico es un compuesto que no contiene aminoácidos y que tiene una conformación general que es similar a un péptido, por ejemplo, de manera que la capacidad del mimético para reaccionar con líneas o clones de células T no disminuye sustancialmente con relación a la capacidad de un péptido dado.
De acuerdo con la enseñanza, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína tiene preferentemente una propiedad funcional de la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado, es decir, es funcionalmente equivalente. En una realización, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado. En una realización, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica.
Una propiedad particular es la capacidad de formar un complejo con moléculas de MHC y, donde sea apropiado, generar una respuesta inmunitaria, preferentemente, mediante la estimulación de células citotóxicas o células T cooperadoras. El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico tal como la inducción de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, la fortaleza y/o la duración de la reacción inmunitaria inducida, o la especificidad de la reacción inmunitaria inducida. En el contexto de la presente enseñanza, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferentemente con respecto a los efectos o propiedades inmunológicas de un péptido o variante de péptido usado para la inmunización. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos, cuando se expone al sistema inmunitario de un sujeto, induce una reacción inmunitaria que tiene una especificidad de reacción con la secuencia de aminoácidos de referencia.
El término "derivado" significa de acuerdo con la enseñanza que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del que se deriva, en particular un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencia particulares, "derivado" significa en particular que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.
El término "célula" o "célula huésped" se refiere, preferentemente, a una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no libera sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, organelos, o material genético. Una célula intacta, preferentemente, es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferentemente, dicho término se refiere, de acuerdo con la enseñanza, a cualquier célula que puede transfectarse con un ácido nucleico exógeno. Preferentemente, la célula cuando se transfecta con un ácido nucleico exógeno y se transfiere a un receptor puede expresar el ácido nucleico en el receptor. El término "célula" incluye células bacterianas; otras células útiles son células de levadura, células de hongos o células de mamíferos. Las células bacterianas adecuadas incluyen células de cepas bacterianas gramnegativas tales como cepas de Escherichia coli, Proteus y Pseudomonas, y cepas bacterianas grampositivas tales como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus y Lactococcus. Las células fúngicas adecuadas incluyen células de especies de Trichoderma, Neurospora y Aspergillus. Las células de levadura adecuadas incluyen células de especies de Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por ejemplo, Schizo saccharomyces pombe), Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris y Pichia methanolicd) y Hansenula. Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células HeLa, células COS, 293 HEK y similares. Sin embargo, también pueden usarse células de anfibios, células de insectos, células vegetales y cualquier otra célula usada en la técnica para la expresión de proteínas heterólogas como tal. Se prefieren particularmente células de mamífero para la transferencia adoptiva, tales como células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivar de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares tales como células del sistema inmunitario, en particular células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas y células T, células madre tales como células madre hematopoyéticas y células madre mesenquimales y otros tipos de células. Una célula presentadora de antígeno es una célula que muestra antígeno en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo mediante el uso de su receptor de células T (TCR).
Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico expresa preferentemente el péptido o proteína codificada por el ácido nucleico.
La célula puede ser una célula recombinante y puede secretar el péptido o proteína codificada, puede expresarlo en la superficie y preferentemente puede expresar adicionalmente una molécula de MHC que se une a dicho péptido o proteína o un producto de procesamiento del mismo. En una realización, la célula expresa endógenamente la molécula de MHC. En una realización adicional, la célula expresa la molécula de MHC y/o el péptido o proteína o el producto de procesamiento de los mismos de una manera recombinante. La célula es preferentemente no proliferativa. En una realización preferida, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.
El término "expansión clonal" se refiere a un proceso en donde se multiplica una entidad específica. En el contexto de la presente enseñanza, el término se usa preferentemente en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferentemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.
Se puede detectar una enfermedad asociada con la expresión de antígenos en base a la presencia de células T que reaccionan específicamente con un péptido en una muestra biológica. Dentro de ciertos métodos, una muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente se incuba con un péptido de la enseñanza, un ácido nucleico que codifica dicho péptido y/o una célula presentadora de antígeno que expresa y/o presenta al menos se detecta una porción inmunogénica de tal péptido y la presencia o ausencia de activación específica de las células T. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células T aisladas. Por ejemplo, las células T pueden aislarse de un paciente mediante técnicas de rutina (tales como centrifugación en gradiente de densidad Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica). Para las células T CD4+, la activación se detecta preferentemente al evaluar la proliferación de las células T. Para las células T CD8+, la activación se detecta preferentemente mediante la evaluación de la actividad citolítica. Un nivel de proliferación que es al menos dos veces mayor y/o un nivel de actividad citolítica que es al menos un 20 % mayor que en sujetos libres de enfermedad indica la presencia de una enfermedad asociada con la expresión de antígeno en el sujeto.
Como se usa en la presente descripción "reducir" o "inhibir" significan la capacidad de causar una disminución global, preferentemente de 5 % o mayor, 10 % o mayor, 20 % o mayor, con mayor preferencia de 50 % o mayor, y con la máxima preferencia de 75 % o mayor en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.
Los términos tales como "aumentar" o "potenciar", preferentemente se refieren a un aumento o potenciación de aproximadamente al menos 10 %, preferentemente al menos 20 %, preferentemente al menos 30 %, con mayor preferencia al menos 40 %, con mayor preferencia al menos 50 %, aún con mayor preferencia al menos 80 %, y con la máxima preferencia al menos 100 %.
Los agentes, composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células enfermas que expresan CLDN18.2 y preferentemente presentan CLDN18.2 en el contexto de moléculas de MHC. Los ejemplos de enfermedades que se pueden tratar y/o prevenir abarcan todas las enfermedades que expresan CLDN18.2. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades cancerosas.
Los agentes, composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse, además, para la inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en la presente descripción.
Los términos "tejido normal" o "condiciones normales" se refieren a tejido sano o las condiciones en un sujeto sano, es decir, condiciones no patológicas, en donde "sano" significa, preferentemente no canceroso.
El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una condición médica asociada con signos y síntomas específicos. Una enfermedad puede causarse por factores originalmente de una fuente externa, tal como enfermedad infecciosa, o puede causarse por disfunciones internas, tales como enfermedades autoinmunes. En humanos, "enfermedad" se usa a menudo más ampliamente para referirse a cualquier condición que causa dolor, disfunción, sufrimiento, problemas sociales, o la muerte al individuo afectado, o problemas similares para aquellos en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, algunas veces incluye heridas, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, comportamientos anormales, y variaciones atípicas de la estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros propósitos estas pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades usualmente afectan a los individuos no solo físicamente, si no también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de uno de la vida y la personalidad de uno. De acuerdo con la enseñanza, el término "enfermedad" incluye cáncer, en particular aquellas formas de cáncer descritas en la presente descripción. Cualquier referencia en la presente descripción a cáncer o formas particulares de cáncer también incluye la metástasis del cáncer de estas. En una realización preferida, una enfermedad a tratar de acuerdo con la presente solicitud involucra células que expresan CLDN18.2 y opcionalmente presentan CLDN18.2 en el contexto de moléculas de MHC.
"Enfermedades que involucran células que expresan CLDN18.2" o expresiones similares significa de acuerdo con la enseñanza que CLDN18.2 se expresa en las células de un tejido u órgano enfermo. En una realización, la expresión de CLDN18.2 en células de un tejido u órgano enfermo aumenta en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, al menos 10000 % o aún más. En una realización, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime. De acuerdo con la enseñanza, las enfermedades que involucran células que expresan CLDN18.2 incluye enfermedades cancerosas. Además, de acuerdo con la enseñanza, preferentemente las enfermedades cancerosas son aquellas en donde las células cancerosas expresan CLDN18.2.
Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren a o describen el estado fisiológico en un individuo que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de tales cánceres incluyen cáncer óseo, cáncer sanguíneo, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer uterino, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, Enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la vejiga, cáncer de los riñones, carcinoma celular renal, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (CNS), cáncer neuroectodérmico, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma pituitario. El término "cáncer" de acuerdo con la presente enseñanza comprende, además, las metástasis del cáncer. Preferentemente, una "enfermedad cancerosa" se caracteriza por las células que expresan CLDN18.2 y una célula cancerosa expresa CLDN18.2.
Una célula enferma preferentemente es una célula que expresa CLDN18.2, dicho CLDN18.2 está presente preferentemente en la superficie de dicha célula como proteína transmembrana y/o se presenta por dicha célula en el contexto de MHC tal como MHC I. Una célula que expresa CLDN18.2 es preferentemente una célula cancerosa, preferentemente de los cánceres descritos en la presente descripción.
En una realización, una enfermedad cancerosa es una enfermedad maligna que se caracteriza por las propiedades de anaplasia, invasividad y metástasis. Un tumor maligno puede contrastarse con un tumor benigno no canceroso en que una malignidad no es autolimitada en su crecimiento, es capaz de invadir los tejidos adyacentes y puede ser capaz de diseminarse a tejidos distantes (metastatizar), mientras que un tumor benigno no tiene ninguna de esas propiedades.
En una realización, un cáncer de acuerdo con la enseñanza implica células cancerosas que expresan CLDN18.2. En una realización, el cáncer es CLDN18.2 positivo. En una realización, la expresión de CLDN18.2 está en la superficie de las células. En una realización, al menos el 50 %, preferentemente el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 % de las células cancerosas son positivas para CLDN18.2 y/o al menos el 40 %, preferentemente al menos el 50 % de las células cancerosas son positivas para la expresión superficial de CLDN18.2. En una realización, al menos el 95 % o al menos el 98 % de las células cancerosas son positivas para CLDN18.2. En una realización, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de las células cancerosas son positivas para la expresión superficial de CLDN18.2.
En una realización, un cáncer que expresa CLDN18.2, un cáncer que involucra células cancerosas que expresan CLDN18.2 o un cáncer positivo a CLDN18.2 se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer de la vesícula biliar, y metástasis de los mismos, en particular metástasis de cáncer gástrico tales como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos. En una realización, el cáncer es un adenocarcinoma, en particular un adenocarcinoma avanzado. Las enfermedades cancerosas particularmente preferidas son los adenocarcinomas del estómago, el esófago, el conducto pancreático, los conductos biliares, el pulmón y el ovario. En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de estómago, cáncer de esófago, en particular de esófago inferior, cáncer de la unión esofágica y cáncer gastroesofágico. En una realización particularmente preferida, el cáncer es cáncer gastroesofágico tal como cáncer gastroesofágico avanzado metastásico, refractario o recurrente.
De acuerdo con la enseñanza, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a una hinchazón o lesión que se forma por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales). Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida y descontrolada y continúa su crecimiento después de que cesa el estímulo que inició el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una pérdida parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser ya sea benigna, premaligna o maligna.
De acuerdo con la enseñanza, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, incluidas las formas comunes de cáncer de mama, próstata, pulmón y colon.
"Adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido es parte, además, de una categoría de tejido más grande conocido como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y los órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente a partir de ectodermo, endodermo y mesodermo. Para clasificarse como adenocarcinoma, las células no necesitan necesariamente formar parte de una glándula, siempre que tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, que incluye los seres humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que se derivan, mientras que los pobremente diferenciados pueden no serlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Mientras que cada glándula puede no secretar la misma sustancia, siempre que exista una función exocrina para la célula, se considera glandular y su forma maligna se denomina, por lo tanto, adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, frecuentemente, con tiempo suficiente hacen metástasis. El adenocarcinoma de ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma endometrial.
El linfoma y la leucemia son neoplasias derivadas de células hematopoyéticas (formadoras de sangre).
El tumor blástico o blastoma es un tumor (generalmente maligno) que se asemeja a un tejido inmaduro o embrionario. Muchos de estos tumores son más comunes en los niños.
Por "metástasis" se entiende la propagación de las células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de las células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales del endotelio para entrar en la cavidad y en los vasos del cuerpo, y después, tras haberse transportado por la sangre, la infiltración en los órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el sitio diana depende de la angiogénesis. A menudo la metástasis del tumor ocurre incluso después de la remoción del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se refiere a "metástasis distante" que se relaciona con una metástasis que está remoto del tumor primario y del sistema de nódulos linfáticos regional. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se refiere a la metástasis en ganglios linfáticos.
Las células de un tumor secundario o metastásico son como las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que si el cáncer de ovario hace metástasis en el hígado, el tumor secundario se forma por células ováricas anormales, no por células hepáticas anormales. El tumor en el hígado entonces se denomina cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.
Una recaída o recurrencia se produce cuando una persona se ve afectada nuevamente por una afección que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y desarrolla nuevamente dicha enfermedad, dicha enfermedad recientemente desarrollada puede considerarse una recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la enseñanza, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede, pero no necesariamente, producirse en el sitio de la enfermedad tumoral original. Así, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor incluye, además, situaciones en donde un tumor se produce en un sitio diferente al sitio del tumor original, así como también en el sitio del tumor original. Preferentemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.
El término "tratamiento" o "tratamiento terapéutico" se refiere a cualquier tratamiento que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la esperanza de vida de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o enlentecer el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o enlentecer el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un individuo, y/o disminuir la recurrencia en un individuo quien actualmente tiene o quien previamente tuvo una enfermedad.
Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refieren a cualquier tratamiento que pretende prevenir la aparición de una enfermedad en un individuo. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se usan en la presente descripción indistintamente.
Los términos "individuo" y "sujeto" se usan indistintamente en la presente descripción. Se refieren a seres humanos, primates no humanos u otros mamíferos (por ejemplo ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, porcino, oveja, caballo o primate) que pueden afectarse con o son susceptibles a una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) pero pueden o no pueden tener la enfermedad o el trastorno. En muchas realizaciones, el individuo es un ser humano. A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos "individuo" y "sujeto" no indican una edad particular, y por tanto abarcan adultos, ancianos, niños, y recién nacidos. En realizaciones preferidas de la presente enseñanza, el "individuo" o "sujeto" es un "paciente". El término "paciente" significa de acuerdo con la enseñanza un sujeto para el tratamiento, en particular un sujeto enfermo.
Por "que está en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica que tiene una posibilidad mayor de la normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que tal sujeto puede continuar el desarrollo de una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen o han tenido un cáncertienen, además, un riesgo aumentado de metástasis de cáncer.
El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que involucra una reacción inmunitaria específica.
En el contexto de la presente enseñanza, términos tales como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención o al tratamiento, o ambos, de la aparición y/o propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, para minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o para retardar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, una persona en riesgo de un tumor, como se describió anteriormente, sería un candidato para la terapia para prevenir un tumor.
Una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración profiláctica de un agente o composición de la enseñanza, preferentemente, protege al receptor del desarrollo de una enfermedad. Una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración terapéutica de un agente o composición de la enseñanza, puede conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de la enfermedad. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento de la enfermedad, en particular una interrupción de la progresión de la enfermedad, que conduce, preferentemente, a la eliminación de la enfermedad.
La inmunoterapia se puede realizar mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas, en las que los agentes proporcionados en la presente descripción funcionan preferentemente para eliminar las células que expresan CLDN18.2 de un paciente. Tal eliminación puede tener lugar como resultado de potenciar o inducir una respuesta inmunitaria en un paciente específico para CLDN18.2 o una célula que expresa CLDN18.2 y/o presenta CLDN18.2 en el contexto de moléculas de MHC.
Dentro de ciertas realizaciones, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmunitario endógeno del huésped para reaccionar contra células enfermas con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (tales como péptidos y ácidos nucleicos como se proporciona en la presente descripción).
Dentro de otras realizaciones, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica el suministro de agentes con reactividad inmune tumoral establecida (tales como las células efectoras) que pueden mediar directa o indirectamente los efectos antitumorales y no depende necesariamente de un sistema inmunitario intacto del huésped. Los ejemplos de células efectoras incluyen linfocitos T (tales como linfocitos T citotóxicos CD8+ y linfocitos T CD4+ cooperadores) y células presentadoras de antígenos (tales como células dendríticas y macrófagos). Los receptores de células T específicos para los péptidos CLDN18.2 enumerados en la presente descripción y los receptores de células T artificiales específicos para CLDN18.2 pueden transferirse a células efectoras para inmunoterapia adoptiva.
Como indicó anteriormente, los péptidos inmunorreactivos como se proporcionan en la presente descripción pueden usarse para expandir rápidamente cultivos de células T antígeno-específicas con el fin de generar un número suficiente de células para inmunoterapia. En particular, las células presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas, macrófagos, monocitos, fibroblastos y/o células B, pueden pulsarse con péptidos inmunorreactivos o transfectarse con uno o más ácidos nucleicos mediante el uso de técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Las células efectoras cultivadas para usar en terapia deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente y sobrevivir a largo plazo in vivo. Los estudios han demostrado que se puede inducir el crecimiento de las células efectoras cultivadas in vivo y sobrevivir a largo plazo en cantidades sustanciales mediante estimulación repetida con antígeno suplementado con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheevery otros (1997), Immunological Reviews 157, 177.
Alternativamente, un ácido nucleico que expresa un péptido enumerado en la presente descripción puede introducirse en células presentadoras de antígenos tomadas de un paciente y propagarse clonalmente ex vivo para trasplantar de nuevo al mismo paciente.
Las células transfectadas pueden reintroducirse en el paciente mediante el uso de cualquier medio conocido en la técnica, preferentemente en forma estéril mediante administración intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.
Los métodos divulgados en la presente descripción pueden implicar la administración de células T autólogas que se han activado en respuesta a un péptido o célula presentadora de antígeno que expresa péptido. Tales células T pueden ser CD4+ y/o CD8+, y pueden proliferar como se describió anteriormente. Las células T pueden administrarse al sujeto en una cantidad efectiva para inhibir el desarrollo de una enfermedad.
El término "inmunización" o "vacunación" describe el proceso para tratar a un sujeto con el propósito de inducir una respuesta inmunitaria por razones terapéuticas o profilácticas.
El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.
De acuerdo con la enseñanza, una "muestra" puede ser cualquier muestra útil de acuerdo con la presente enseñanza, en particular una muestra biológica tal como una muestra de tejido, incluidos fluidos corporales, y/o una muestra celular y puede obtenerse de manera convencional tal como mediante biopsia de tejido, incluida biopsia por perforación, y al tomar sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces fecales u otros fluidos corporales. De acuerdo con la enseñanza, el término "muestra" incluye, además, muestras procesadas tales como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo, aislados de ácidos nucleicos y péptidos/proteínas.
Los compuestos y agentes descritos en la presente descripción pueden administrarse en la forma de cualquier composición farmacéutica adecuada.
Las composiciones farmacéuticas de la enseñanza son, preferentemente, estériles y contienen una cantidad efectiva de los agentes descritos en la presente descripción y opcionalmente de agentes adicionales como se analiza en la presente descripción para generar la reacción deseada o el efecto deseado.
Las composiciones farmacéuticas se proporcionan usualmente en una forma de dosificación uniforme y pueden prepararse en una forma conocida per se. Una composición farmacéutica puede estar por ejemplo en la forma de una solución o una suspensión.
Una composición farmacéutica puede comprender sales, sustancias tamponantes, conservantes, portadores, diluyentes y/o excipientes todos los cuales son preferentemente farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.
Las sales que no son farmacéuticamente aceptable pueden usarse para preparar sales farmacéuticamente aceptables y se incluyen en la enseñanza. Las sales farmacéuticamente aceptables de este tipo comprenden de manera no limitante, aquellas preparadas a partir de los ácidos siguientes: ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden prepararse también como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.
Las sustancias tampón adecuadas para usar en una composición farmacéutica incluyen ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.
Los conservantes adecuados para usar en una composición farmacéutica incluyen cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.
Una formulación inyectable puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como lactato de Ringer.
El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de una naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina con el fin de facilitar, potenciar o habilitar la aplicación. De acuerdo con la enseñanza, el término "portador" incluye, además, uno o más agentes de relleno sólidos o líquidos, diluyentes o sustancias de encapsulación, que son adecuadas para la administración a un paciente. Las sustancias portadoras posibles para la administración parenteral son por ejemplo agua estéril, Ringer, lactato de Ringer, solución de cloruro de sodio estéril, polialquilenglicoles, naftalenos hidrogenados y, en particular, polímeros biocompatibles de lactida, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno.
El término "excipiente" cuando se usa en la presente descripción pretende indicar todas las sustancias que pueden estar presentes en una composición farmacéutica y que no son ingredientes activos tales como, por ejemplo, portadores, aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes activos de superficie, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.
Los agentes y composiciones descritas en la presente descripción pueden administrarse por cualquier vía convencional, tal como por administración parenteral que incluye por inyección o infusión. La administración es preferentemente parenteral, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica o intramuscular.
Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden usualmente una preparación acuosa o no acuosa estéril del componente activo, que es, preferentemente, isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de portadores y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, se usan aceites fijados, usualmente estériles, como solución o medio de suspensión.
Los agentes y composiciones descritas en la presente descripción se administran en cantidades efectivas. Una "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada se relaciona, preferentemente, con la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección puede ser también un retraso en la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o de dicha afección.
Una cantidad efectiva de un agente o composición descrito en la presente descripción dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, que incluyen la edad, la condición fisiológica, la talla y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia de acompañamiento (si se presenta), la vía específica de administración y factores similares. En consecuencia, las dosis administradas de los agentes descritos en la presente descripción pueden depender de varios de tales parámetros. En el caso que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial pueden usarse dosis más altas (o dosis efectivamente más altas alcanzadas por una vía de administración diferente, más localizada).
Los agentes y composiciones descritas en la presente descripción pueden administrarse a los pacientes, por ejemplo, in vivo, para tratar o prevenir una variedad de trastornos tales como aquellos descritos en la presente descripción. Los pacientes que se prefieren incluyen pacientes humanos que tienen trastornos que pueden corregirse o mejorarse mediante la administración de los agentes y composiciones descritas en la presente descripción. Esto incluye trastornos que involucran las células caracterizadas por la expresión de CLDN18.2.
Por ejemplo, en una realización, los agentes descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar un paciente con una enfermedad cancerosa, por ejemplo, una enfermedad cancerosa tal como se describe en la presente descripción caracterizada por la presencia de células cancerosas que expresan CLDN18.2.
Las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento descritos de acuerdo con la enseñanza pueden usarse también para la inmunización o la vacunación para prevenir una enfermedad descrita en la presente descripción.
La composición farmacéutica de la enseñanza puede administrarsejunto con sustancias suplementarias que potencian la inmunidad tales como uno o más adyuvantes y pueden comprender uno o más sustancias que potencian la inmunidad para aumentar además su efectividad, preferentemente para lograr un efecto sinérgico de inmunoestimulación. El término "adyuvante" se refiere a los compuestos que prolongan o potencian o aceleran una respuesta inmunitaria. Con respecto a esto, son posibles diversos mecanismos, en dependencia de los diversos tipos de adyuvantes. Por ejemplo, los compuestos que permiten la maduración del DC, por ejemplo lipopolisacáridos o ligando CD40, forman una primera clase de adyuvantes adecuados. Generalmente, cualquier agente que influya en el sistema inmunitario del tipo de una "señal de peligro" (LPS, GP96, ARNdc, etc.) o citocinas, tales como GM-CSF, pueden usarse como un adyuvante que activa una respuesta inmunitaria para intensificarla y/o influenciarla de una manera controlada. Los oligodesoxinucleótidos CpG pueden además usarse opcionalmente en este contexto, aunque deben considerarse sus efectos secundarios que se presentan bajo ciertas circunstancias, como se explicó antes. Los adyuvantes particularmente preferidos son citocinas, tales como monocinas, linfocinas, interleucinas o quimiocinas, por ejemplo IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNa, IFNy, GM-CSF, LT-a o factores de crecimiento, por ejemplo hGH. Otros adyuvantes conocidos son hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund o aceite tal como Montanide®, de mayor preferencia Montanide™ ISA51. Los lipopéptidos, tal como Pam3Cys, también son adecuados para usar como adyuvantes en la composición farmacéutica de la presente enseñanza.
La composición farmacéutica puede administrarse localmente o sistémicamente, preferentemente sistémicamente.
El término "administración sistémica" se refiere a la administración de un agente de manera que el agente se distribuya ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolle un efecto deseado. Por ejemplo, el agente puede desarrollar su efecto deseado en la sangre y/o alcanza su sitio de acción deseado a través del sistema vascular. Las rutas de administración sistémicas típicas incluyen la administración mediante la introducción del agente directamente en el sistema vascular o la administración oral, pulmonar, o intramuscular en donde el agente se adsorbe, entra al sistema vascular, y se transporta a uno o más sitio(s) de acción deseado(s) a través de la sangre.
De acuerdo con la presente enseñanza, se prefiere que la administración sistémica sea mediante la administración parenteral. El término "administración parenteral" se refiere a la administración de un agente de manera que el agente no pase por el intestino. El término "administración parenteral" incluye la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intradérmica o la administración intraarterial, pero no se limita a estas.
La administración también puede llevarse a cabo, por ejemplo, oralmente, intraperitonealmente o intramuscularmente.
Los agentes y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).
La presente enseñanza se describe en detalle mediante las figuras y los ejemplos más abajo, que se usan solamente para propósitos ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Debido a la descripción y los ejemplos, las realizaciones adicionales que se incluyen igualmente en la enseñanza son asequibles para el trabajador experto.
Figuras
Figura 1: Representación del complejo TCR-CD3. Los motivos de activación basados en tirosina del inmunorreceptor CD3 intracitoplasmático (ITAM) se indican como cilindros (adaptado de "The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).
Figura 2: El diseño de generaciones sucesivas de CAR. Representación esquemática de las diferentes generaciones de CAR (1G, primera generación, 2G, segunda generación, 3G, tercera generación). La primera generación contiene scFv extracelulares y la citotoxicidad mediada por la cadena CD3Z citoplasmática/ZAp70, la segunda generación adicionalmente CD28/PI3K promueve la proliferación y la tercera generación además 4-1BB o OX40/TRAF sustenta la supervivencia celular (Casucci, M. y otros (2011) 2: 378-382).
Figura 3: Representación esquemática de los diferentes formatos de receptores para la redirección de células T frente a CLDN18.2. Izquierda: un CAR de segunda generación que consiste de un fragmento scFv específico a CLDN18.2, un dominio espaciador derivado de IgG1, un coestimulador de CD28 y un dominio de señalización de CD3Z (CAR-28Z); centro: un nuevo formato de CAR basado en el enlace del scFv con el dominio constante de la cadena TCRp murina y la coexpresión del dominio constante de la cadena TCRa murina (CAR/Ca); derecha: un TCR murino compuesto por cadenas a/p del TCR (mu, TCR murino);
Figura 4: Perfilado de los transcriptos de CLDN18.1 y CLDN18.2 en un panel de tejidos humanos. A, estructura genómica del locus CLDN18 (arriba). Cajas sombreadas, exones únicos para CLDN18.1 (E 1.1) o CLDN18.2 (E 1.2), respectivamente; abajo, composición del exón de las variantes de CLDN18; arcos, los dos dominios extracelulares; flechas, los cebadores usados para RT-PCR. B, análisis comparativo de las isoformas de CLDN18 en tejidos humanos normales (N), espécimen de tumor primario y líneas de células tumorales mediante RT-PCR de punto final. C, cuantificación en tejidos humanos normales (N), espécimen de tumor primario y líneas de células tumorales mediante PCR en tiempo real (Sahin U y otros, Clin Cancer Res 2008;14:7624-34).
Figura 5: Reactividad ex vivo de las células del bazo de ratones transgénicos a HLA-A*02 inmunizados contra péptidos derivados de CLDN18.2 analizados mediante ensayo IFNy-ELISPOT. Se predijeron péptidos de unión específicos a HLA-A*02 CLDN18.2 para los primeros 80 aminoácidos de CLDN18.2 al aplicar un algoritmo específico (Rammensee H. y otros (1999) Immunogenetics 50, 213-9). Las células del bazo de ratones transgénicos a HLA-A*02 inmunizados con CLDN18.2 se analizaron para la reactividad contra la mezcla de péptidos de CLDN18.2 o los péptidos derivados de CLDN18.2 de unión a HlA-A*02, CLDN18.2-A2-1-6. Control positivo: Células de bazo tratadas con PMA; control negativo: una mezcla de péptidos irrelevantes (HlV-gag), péptido nonámero irrelevante (PLAC1-31-39).
Figura 6: Clasificación por citometría de flujo de células T CD8+ murinas específicas a CLDN18.2 a partir de ratones transgénicos a HLA-A*02 después de la reestimulación in vitro. Se aislaron células T CD8+/CD137+ individuales después de la reestimulación de las células del bazo con la mezcla de péptidos solapantes de CLDN18.2. Control: células del bazo reestimuladas con mezcla de péptidos irrelevantes (VIH-gag).
Figura 7: Ensayo de especificidad de TCR aislados de células T CD8+ de ratones inmunizados con CLDN18.2. Se transfectaron células T CD8+ de un donante sano positivo a HLA-A*02 con ARN de cadenas a/p de TCR y se probaron para el reconocimiento de células K562-A2 pulsadas con péptidos de 15 mer de CLDN18.2 solapados (= mezcla de CLDN18.2) o péptidos de unión a HLA-A*02 derivados de CLDN18.2 (CLDN18.2-A2-4, CLDN218.2-A2-5, CLDN18.2-A2-6) mediante IFNy-ELISPOT. Controles negativos: mezcla de péptidos irrelevantes (HlV-gag), péptido de 9 mer irrelevantes (PLAC1-31-39); control positivo: SEB;
Figura 8: Expresión superficial de CAR específicos de CLDN18.2 y CLDN6 en células T CD8+ humanas preactivadas. Se preactivaron células T CD8+ con OKT3 y se transfectaron con 20 |jg de CAR-ARN. Después de 20 h de electroporación, las células se tiñeron con un anticuerpo anti-CD8 conjugado con PE y anticuerpos conjugados con fluorocromo específicos de idiotipo, específicos para CLDN18.2-CAR y CLDN6-CAR, respectivamente. Las células se activaron en linfocitos T CD8+ individuales.
Figura 9: Lisis específicas de células diana que expresan CLDN18.2 mediadas por CLDN18.2-CAR. Se transfectaron células T CD8+ preactivadas con 20 |jg de CAR-ARN y se cocultivaron 20 h más tarde junto con iDC autólogas transfectadas con ARN que codifica CLDN18.2-CAR mediante el uso de relaciones E:T tituladas (30:1, 10:1, 3:1). Controles negativos: Células T transfectadas con un CAR específico a CLND6 o sin CAR-ARN (= simulacro), iDC transfectadas con CLDN6-ARN. La lisis específica se analizó mediante ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa después de 4 h de cocultivo.
Figura 10: Inhibición específica de la lisis mediada por CLDN18.2-CAR de células diana que expresan CLDN18.2 mediante la adición de un anticuerpo específico de idiotipo. Se transfectaron células T CD8+ preactivadas con 20 jg de CAR-ARN y se cocultivaron 20 h más tarde junto con iDC autólogas transfectadas con CLDN18.2- o con CLDN6-ARN mediante el uso de una relación E:T de 30:1. Se preincubaron células T efectoras con o sin 2 pg/mL de un anticuerpo específico de idiotipo durante 1 h antes de que se añadieran las células diana. La lisis específica se analizó mediante ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa después de 4 h de cocultivo.
Figura 11: Proliferación antígeno-específica in vitro de células T CLDN18.2-CAR. Las células T CD8+ se electroporaron con ARN que codifica CLDN18.2-CAR o sin ARN (simulacro) y se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). Las células T CAR se cocultivaron con iDC transfectadas con 5 pg de IVT-ARN que codifica CLDN18.2 o los antígenos de control CLDN9 o CLDN6. Después de 96 h de cocultivo, se recolectaron las células y se analizó la fluorescencia de CFSE mediante citometría de flujo. Las células se activaron en linfocitos CD8+ vivos individuales.
Figura 12: Activación antígeno-específica in vivo de la célula T CLDN18.2-CAR en ratones después de la vacunación. Los ratones BALB/c se injertaron i.v. con 5x106 de células T transducidas con CLDN18-2-CAR-effLuc-GFP. Después de 24 h de ACT, se vacunaron los ratones i.v. con ARN(F12-Lip) que comprende 25 pg de ARN CLDN18.2 o ARN Ctrl. (A) La eficiencia de transducción de las células T se midió mediante citometría de flujo mediante el uso de anticuerpos acoplados a fluorocromo (B) Las intensidades de luminiscencia in vivo en ratones se midieron 48 h después de la vacunación. Las imágenes descoloridas representan la intensidad de la luz (negro, menos intenso; blanco hasta gris oscuro, más intenso) que se superpuso sobre la foto de referencia en escala de grises.
Ejemplos
Las técnicas y métodos usados en la presente descripción se llevan a cabo de la forma conocida per se y como se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Todos los métodos, incluido el uso de estuches y reactivos, se llevan a cabo de acuerdo con la información del fabricante a menos que se indique específicamente.
Ejemplo 1: Materiales y métodos
Líneas celulares y reactivos
La línea celular de leucemia mieloide crónica humana K562 (Lozzio, C.B. & Lozzio, B.B (1975), Blood 45, 321-334) transfectada de forma estable con HLA-A*0201 (Britten, CM y otros (2002), J. Immunol. Methods 259, 95-110) (denominada, por ejemplo, como K562-A2) y usada para ensayos de validación de TCR, se cultivó bajo condiciones estándar. Se cultivó la línea celular primaria de fibroblastos de prepucio humano recién nacido CCD-1079Sk (ATCC No. CRL-2097) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Células mononucleares de sangre periférica (PBMC), monocitos y células dendríticas (DC)
Las PBMC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) a partir de capas leucocitarias. Los alelotipos de HLA se determinaron mediante métodos estándar de PCR. Los monocitos se enriquecieron con microperlas anti-CD14 (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Alemania). Las CD inmaduras (iDC) se obtuvieron al diferenciar monocitos durante 5 días en medio de cultivo suplementado con citocinas como se describió en Kreiter y otros (2007), Cancer Immunol. Immunother., CII, 56, 1577-87.
Péptidos y pulsos de péptidos de células estimulantes
Mezclas de péptidos de 15 mer N- y C-terminales libres con 11 aminoácidos solapados que corresponden a secuencias de Claudina-18.2 o HlV-gag (denominado como mezcla de péptidos antigénicos) se sintetizaron mediante química de fase sólida estándar (JPT GmbH, Berlín, Alemania) y se disolvieron en DMSO hasta una concentración final de 0,5 mg/mL. Los péptidos nonámeros se reconstituyeron en PBS con DMSO al 10 %. Para el estimulador pulsátil, las células se incubaron durante 1 h a 37 °C en medio de cultivo mediante el uso de diferentes concentraciones de péptidos.
Vectores para la transcripción in vitro (IVT) de ARN
Todos los constructos son variantes del plásmido pST1-sec-insert-2pgUTR-A(120)-Sap1 previamente descrito (Holtkamp, S. y otros (2006), Blood 108, 4009-4017). Para la generación de plásmidos que codifican cadenas de TCR murino, los ADNc que codifican las regiones constantes de TCR-a, -p1 y -p2 murinos se solicitaron a un proveedor comercial y se clonaron de forma análoga (números de acceso a GenBank M14506, M64239 y X67127, respectivamente). Se introdujeron productos de PCR V(D)J específicos en dichos casetes para rendir cadenas de TCR de longitud completa (denominadas como pST1-TCRap-2pgUTR-A murino(120)).
Se clonaron los antígenos CLDN18.2 de longitud completa, CLDN18.2 aa 1-80 y CLDN6, unidos a la señal de tráfico de MHC de clase I (MITD) en los plásmidos pST1 descritos anteriormente (Kreiter, S. y otros (2008), J. Immunol. 180, 309-318).
Generación de ARN transcrito in vitro (IVT) y transferencia a las células
La generación de ARN IVT se realizó como se describió anteriormente (Holtkamp, S. y otros (2006), Blood 108, 4009­ 4017) y se añadió a las células suspendidas en medio X-VIVO 15 (Lonza, Basilea, Suiza) en una cubeta de electroporación estéril con un espacio de 4 mm preenfriado (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemania). La electroporación se realizó con un aparato Gene-Pulser-II (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Alemania) (células T: 450 V/250 |jF; K562-A2: 200 V/300 j F).
Cebado de células Tin vivo mediante inmunización intraganglionar de ratones HLA A2.1/DR1 con ARN IVT
Las células T de ratones A2/DR1 (Pajot A. y otros (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) se cebaron in vivo contra el antígeno de interés por inmunización intraganglionar repetitiva mediante el uso de ARN IVT que codifica el antígeno (Kreiter S. y otros (2010), Cancer Research 70, 9031-40). Para las inmunizaciones intraganglionares, los ratones se anestesiaron con xilacina/ketamina. Se expuso quirúrgicamente el ganglio linfático inguinal, se inyectaron lentamente 10 j L de ARN (20 jg ) diluidos en solución de Ringery agua libre de RNAsa mediante el uso de una jeringa de 0,3 mL de un solo uso con una aguja ultrafina (31G, BD Biosciences), y la herida se cerró. Después de seis ciclos de inmunización, se sacrificaron los ratones y se aislaron las células del bazo.
Recolecta de células del bazo
Después de su disección bajo condiciones estériles, los bazos se transfirieron a tubos Falcon que contenían PBS. Los bazos se rompieron mecánicamente con fórceps y las suspensiones celulares se obtuvieron con un filtro de células (40 jm ). Los esplenocitos se lavaron con PBS, se centrifugaron y se resuspendieron en un tampón hipotónico para la lisis de los eritrocitos. Después de 5 min de incubación a TA, la reacción se detuvo al añadir 20-30 mL de medio o PBS. Las células del bazo se centrifugaron y se lavaron dos veces con PBS.
Clasificación celular individual de células T CD8+ antígeno-específicas después de la tinción con CD137
Para la reestimulación antígeno-específica, se sembraron 2,5x10A6/pocillo de células de bazo a partir de ratones A2/DR1 inmunizados en una placa de 24 pocillos y se pulsaron con una mezcla de péptidos solapados que codifican el antígeno de interés o un antígeno de control. Después de 24 h de incubación, se recolectaron las células, se tiñeron con un anticuerpo anti-CD3 conjugado con FITC, un anticuerpo anti-CD4 conjugado con PE, un anticuerpo anti-CD8 conjugado con PerCP-Cy5.5 y un anticuerpo anti-CD137 conjugado con Dylight-649. La clasificación se realizó en un citómetro de flujo BD FACS Aria (BD Biosciences). Se clasificaron las células positivas para CD137, CD3 y CD8, se recolectó una célula por pocillo en una placa de fondo en V de 96 pocillos (Greiner Bio-One) que contenía células CCD-1079Sk humanas como células alimentadoras, se centrifugó a 4 °C y se almacenó inmediatamente a -80 °C.
Extracción de ARN, síntesis de ADNc basada en SMART y amplificación inespecífica a partir de las células clasificadas
El ARN de las células T clasificadas se extrajo con el RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se usó un protocolo de cambio de molde para la síntesis de ADNc: La transcriptasa inversa de menta (Evrogen JSC) se combinó con oligo(dT)-T-cebador largo para cebar la reacción de síntesis de la primera hebra y TS-corto (Eurofins Genomic) al introducir una secuencia de oligo(riboG) para permitir la creación de un molde extendido por la actividad transferasa terminal de la transcriptasa inversa y para el cambio de molde (Matz, M. y otros (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1558-1560). La primera hebra de ADNc sintetizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante se sometió a 21 ciclos de amplificación con ADN polimerasa de alta fidelidad 5 U PfuUltra Hotstart (Agilent Technologies) y cebador 0,48 j M TS-PCR cebador en presencia de dNTP 200 j M (condiciones de ciclo: 2 min a 95 °C durante, 30 s a 94 °C, 30 s a 65 °C, 1 min a 72 °C para la extensión final de 6 min a 72 °C). La amplificación satisfactoria de los genes de TCR se controló con cebadores específicos de la región constante de TCR-p murino y solo se realizaron Va-/Vp-PCR murinas específicas de clonotipo consecutivas si se detectaban bandas fuertes.
Diseño de cebadores de PCR para la amplificación del TCR
Para el diseño de cebadores consenso del TCR murino, todos los genes TCR-Vp y -Va funcionales murinos enumerados en la base de datos ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org) junto con sus correspondientes secuencias líder se alinearon con BioEdit Sequence Alignment Editor (por ejemplo, http://www.bio-soft.net). Se diseñaron cebadores directos de 24 a 27 pb de longitud con un máximo de 3 bases degeneradas, un contenido de GC entre 40-60 % y una G o C en el extremo 3' para hibridarse a tantas secuencias líder como fuera posible y se equiparon con una extensión 5' de 15 pb que presenta un sitio de enzima de restricción raro y una secuencia de Kozak. Los cebadores inversos se diseñaron para hibridarse a los primeros exones de los genes de la región constante, con el cebador mTRACex1_as que se une a secuencias correspondientes a los aminoácidos 24 a 31 de Ca y mTRBCex1_as a los aminoácidos (aa) 8 a 15 en Cp1 y Cp2. Ambos oligonucleótidos se sintetizaron con un fosfato 5'. Los cebadores se agruparon en mezclas de 2-6 oligos directos con idéntica temperatura de hibridación.
Amplificación por PCR y clonación de secuencias V(D)J
Se sometieron 6 pL de ADNc preamplificado a partir de células T aisladas a 40 ciclos de PCR en presencia de la mezcla de oligos específicos a mVa-/mVp 0,6 pM, mCa- o mCp-oligo 0,6 pM, dNTP 200 pM y ADN polimerasa 5 U PfuUltra II Fusion h S (Agilent; condiciones de ciclo: 1 min a 95 °C, 30 s a 94 °C, 30 s a temperatura de hibridación, 30 s a 72 °C, tiempo de extensión final de 3 min a 72 °C). Los productos de PCR se analizaron mediante el uso del sistema de electroforesis capilar de Qiagen. Las muestras con bandas a 470-550 pb se fraccionaron por tamaño en geles de agarosa, las bandas se escindieron y se purificaron mediante el uso de un estuche de extracción en gel (Qiagen, Hilden, Alemania). Se realizó un análisis de secuencia para revelar la secuencia del dominio V(D)J y de la región constante p, como del cebador mTRBCex1_as y mTRBCex1_as, respectivamente, coinciden con los genes Cp1 y Cp2 de la región constante del TCR en el ratón. El ADN se digirió y se clonó en los vectores IVT que contenían el esqueleto apropiado para una cadena TCR-a/p murina completa.
Análisis de citometría de flujo
La expresión en la superficie celular de los genes del TCR transfectados se analizó por citometría de flujo mediante el uso de un anticuerpo anti-TCR conjugado con fluorocromo contra la familia de la región variable apropiada o la región constante de la cadena p del TCR (Beckman Coulter Inc., Fullerton, EE.UU) en combinación con anticuerpos dirigidos contra CD3, CD8 o CD4 (BD Biosciences). La expresión en la superficie celular de los CAR transfectados se analizó mediante el uso de anticuerpos específicos de idiotipo conjugados con fluorocromo (Ganymed Pharmaceuticals) que reconocen los fragmentos scFv contenidos en el constructo CAR respectivo. El análisis de citometría de flujo se realizó en un citómetro de flujo FACS CANTO II mediante el uso del software FACS Diva (BD Biosciences).
Ensayo de citotoxicidad de luciferasa
Para la evaluación de la citotoxicidad mediada por células, se usó un ensayo basado en bioluminiscencia como alternativa y optimización para la liberación del 51Cr. En contraste con el ensayo estándar de liberación de cromo, este ensayo mide la actividad lítica de las células efectoras al calcular el número de células diana que expresan luciferasa viable después de la coincubación. Las células diana se transfectaron de forma estable o transitoria con el gen de luciferasa que codifica la luciferasa de luciérnaga a partir de la luciérnaga Photinus pyralis (EC 1.13.12.7). La luciferasa es una enzima que cataliza la oxidación de la luciferina. La reacción depende de ATp y tiene lugar en dos etapas:
luciferina ATP ^ adenilato de luciferilo Pp
adenilato de luciferilo O2 ^ oxiluciferina AMP luz
Las células diana se sembraron en placas a una concentración de 104 células por pocillo en placas blancas de 96 pocillos (Nunc, Wiesbaden, Alemania) y se cocultivaron con números variables de células T transfectadas con TCR en un volumen final de 100 pL. 3 h más tarde, 50 pL de una mezcla de reacción que contiene D-Luciferina (BD Biosciences) (Luciferina (1 pg/pL), tampón HEPES (50 mM, pH), adenosina 5'-trifosfatasa (ATPasa, 0,4 mU/pL, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) se añadieron a las células. Mediante la adición de ATPasa a la mezcla de reacción se disminuyó la luminiscencia resultante de la luciferasa liberada de las células muertas.
Después de un tiempo total de incubación de 4 h, se midió la bioluminiscencia emitida por las células viables mediante el uso del lector Tecan Infinite 200 (Tecan, Crailsheim, Alemania). La actividad destructora de células se calculó con respecto a los valores de luminiscencia obtenidos después de la lisis celular completa inducida por la adición de Triton-X 100 al 2 % y en relación con la luminiscencia emitida por las células diana solas. La salida de datos se expresó en recuentos por segundo (CPS, por sus siglas en inglés) y el porcentaje de lisis específica se calculó de la siguiente manera:
(l-(CPScxp~CPSffli„)/(CPSnm-C P S n™))) * 100.
Se evaluó la luminiscencia máxima (recuentos máximos por segundo, CPSmáx) después de incubar las células diana sin efectores y se evaluó la luminiscencia mínima (CPSmín) después del tratamiento de las dianas con detergente Triton-X-100 para una lisis completa.
ELISPOT (Ensayo ImmunoSPOT ligado a enzimas)
Las placas de microtitulación (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) se recubrieron durante la noche a temperatura ambiente con un anticuerpo anti-IFNY humano 1-Dlk (Mabtech, Estocolmo, Suecia) o durante la noche a 4 °C con un anticuerpo anti-IFNY murino AN18 (Mabtech) y se bloquearon con albúmina humana al 2 % (CSL Behring, Marburg, Alemania) o con medio de cultivo murino. En el escenario murino 5x105 de células del bazo se distribuyeron por pocillo, mientras que en el escenario humano 2-5x104/pocillo de células estimuladoras presentadoras de antígeno se sembraron por triplicado junto con 0,3-3x105/células efectoras CD4+ o CD8+ transfectadas con TCR 24 h después de la electroporación. Las placas se incubaron durante la noche (37 °C, CO2 al 5 %), se lavaron con PBS Tween 20 al 0,05 % y se incubaron durante 2 horas con el mAB biotinilado anti-IFNY humano 7-B6-1 (Mabtech) o el mAb biotinilado anti-IFNY murino R4-6A2 (Mabtech) a una concentración final de 1 pg/mL a 37 °C. Se añadió peroxidasa de rábano picante H unida a avidina (Vectastain Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, EE.UU.) a los pocilios, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y se desarrolló con 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma, Deisenhofen, Alemania).
Ensayo de proliferación de CFSE (éster succinimidílico de carboxifluoresceína)
Se transfectaron células T CD8+ con CAR-ARN y aproximadamente 20 h después se marcaron con CFSE 0,8 pM. Las células T marcadas se lavaron y se cocultivaron con iDC autólogas transfectadas con ARN (relación E:T = l0:1). Después de 4 días de cocultivo, las células se recolectaron y la proliferación se analizó mediante citometría de flujo basada en la reducción progresiva a la mitad de la fluorescencia de CFSE dentro de las células hijas después de las divisiones celulares.
Animales
Se adquirieron ratones BALB/c de Javier Labs. Se usaron animales emparejados por edad (8 semanas) y sexo (hembra) a lo largo de los experimentos. Se criaron ratones congénicos BALB/c-Thy1.1 en las instalaciones para animales de BioNTech AG, Alemania
Manipulación de genes retrovirales y preparación de células T CAR para la transferencia de células T adoptivas
Se aislaron esplenocitos de ratones BALB/c-Thy1.1 y se preactivaron con 2 pg/mL de anti-CD3 soluble (eBioscience) y 1 pg/mL de anti-CD28 soluble (Novus Biologicals) en presencia de 5 ng/mL de rh IL-7 y 10 ng/mL de rh IL-15 (ambos Miltenyi). 24 h y 48 h después de la preactivación, las células T se transdujeron retroviralmente (MLV-E) con un vector tricistrónico que codifica CLDN18.2-CAR-effLuc-GFP mediante el uso de la técnica de RetroNectin (Takara). Las células T transducidas se expandieron luego durante 3 días en presencia de 5 ng/mL de rh IL-7 y 10 ng/mL de rh IL-15 y se limpiaron con ficoll subsecuentemente con Ficoll-Paque PREMIUM (1.084) antes de la transferencia adoptiva a ratones.
Experimentos con ratones
5x106 células T BALB/c-Thy1.1+transducidas con CAR CLDN18.2 se transfirieron por vía intravenosa (i.v.) a ratones BALB/c. Subsecuentemente, los ratones se vacunaron i.v. con una relación F12:ARN de 1,3:2 de ARN(Lip) 24 horas después de la transferencia de células T adoptivas (ACT). Se realizaron imágenes de bioluminiscencia de cuerpo entero.
Imágenes de bioluminiscencia in vivo (BLI, por sus siglas en inglés)
La expansión de las células T transducidas CLDN18.2-CAR-effLuc-GFP se evaluó mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo mediante el uso del sistema de obtención de imágenes IVIS Lumina (Caliper Life Sciences). Brevemente, 5 min después de la inyección de una solución acuosa de D-luciferina (80 mg/kg de peso corporal; Perkin Elmer), se cuantificaron los fotones emitidos (tiempo de integración de 1 min). La intensidad de la luz transmitida que se origina a partir de las células que expresan luciferasa dentro del animal se representó como una imagen en escala de grises, donde el negro es el menos intenso y el blanco a gris oscuro la señal de bioluminiscencia más intensa. Se obtuvieron imágenes de referencia en escala de grises de ratones bajo iluminación LED con poca luz. Las imágenes se superpusieron mediante el uso del software Living Image 4.0.
Ejemplo 2: Aislamiento de TCR murinos de alta afinidad restringidos a HLA-A*02 específicos para Claudina-18.2
Validamos el potencial inmunogénico de CLDN18.2 en ratones A2/DR1 mediante inmunización intraganglionar repetitiva con IVT-ARN que codifica aa 1-80 de CLDN18.2. El gen CLDN18 humano tiene dos primeros exones alternativos, que da lugar a dos isoformas de proteínas (CLDN18.1 y CLDN18.2) que difieren en los 69 aminoácidos N-terminales (figura 4A). Como CLDN18.1 también se expresa en tejidos normales, especialmente en el pulmón, solo usamos la parte N-terminal de CLDN18.2 para inducir exclusivamente reactividades de células T específicas a CLDN18.2. Usamos células del bazo de estos ratones para el aislamiento de células T específicas a CLDN18.2 y la subsecuente clonación de los genes TCR correspondientes. Se analizaron las células del bazo de los ratones inmunizados para la inducción exitosa de células T específicas a CLDN18.2 y su reactividad contra los péptidos de CLDN18.2 de unión a HLA-A*02 predichos ex vivo por el ensayo IFNy-ELISp Ot (figura 5).
Se pudieron inducir frecuencias significativas de células T específicas a CLDN 18.2 en los tres ratones mediante inmunización con ARN, mientras que la reactividad de células T se centró en dos péptidos CLDN18.2 que predichos para unirse a HLA-A*0201(CLDN18.2-A2-5 y -CLDN18.2-A2-6).
Para el aislamiento de células T específicas a CLDN18.2, se reestimularon células del bazo de ratones inmunizados in vitro y se aislaron células individuales mediante citometría de flujo basada en la regulación positiva inducida por la activación de CD137 (figura 6).
Se pudieron recuperar células T CD8+ específicas a CLDN18.2 a partir de los tres ratones A2/DR1 inmunizados y se clonaron un total de 6 TCR específicos a CLDN18.2 a partir de células T murinas clasificadas de forma individual.
Los TCR se sometieron a ensayos de validación inmunológica, que revelaron que los seis CLDN18.2-TCR reconocieron uno o ambos de los dos epítopos restringidos a HLA-A*0201 CLDN18.2 aa 7-15 (CLDN18.2-A2-5) y CLDN18.2 aa 8-16 (CLDN18.2-A2-6), que fueron previamente identificados por análisis de ELIs Po T ex vivo (figura 7).
Ejemplo 3: Generación y validación in vitro de un CAR específico a Claudina-18.2
Generamos un CAR de segunda generación dirigido a CLDN18.2 que contiene los restos de señalización y coestimuladores de CD3Z y CD28, respectivamente. Una deleción del resto de unión a lck en el endodominio CD28 anula la secreción de IL2 tras el acoplamiento de CAR para prevenir la inducción de células T reguladoras (Kofler D.M. y otros, (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760-767). Una modificación del dominio 'espaciador' Fc de la IgG1 en el resto extracelular del CAR evita la activación 'fuera de diana' y el inicio no intencionado de una respuesta inmunitaria innata (Hombach A. y otros, (2010) Gene Therapy 17, 1206-1213).
Para analizar la lisis específica de células diana que expresan CLDN18.2 por células T CLDN18.2-CAR se realizó un ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa. Las células T CD8+ se preactivaron y transfectaron con IVT-ARN que codifica el CLDN18.2-CAR o el CAR específico de CLDN6 como control. La expresión superficial de CAR se confirmó después de la tinción con anticuerpos conjugados con fluorocromo mediante citometría de flujo (figura 8). Ambos CAR se expresaron bien en la superficie de las células T CD8+. Se cultivaron células T transfectadas con CAR con iDC autólogas transfectadas con CLDN18.2- o CLDN6-ARN mediante el uso de diferentes relaciones de efector a diana y se calculó la lisis específica después de 4 h de cocultivo (figura 9). Ambos, CLDN18.2-CAR y CLDN6-CAR, mediaron la lisis específica de iDC que expresan CLDN18.2 y CLDN6, respectivamente. No se pudo observar lisis cuando las iDC expresaron el antígeno de control respectivo.
Para analizar, si la lisis mediada por CLDN18.2-CAR de células diana que expresan CLDN18.2 puede inhibirse mediante la adición de un anticuerpo específico de idiotipo, las células T CAR se preincubaron con o sin el anticuerpo que se une específicamente al fragmento scFv contenido en CLDN18.2-CAR antes de que se iniciara el cocultivo con las células diana y se analizó la lisis mediante el uso de un ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa (figura 10).
La lisis mediada por CLDN18.2-CAR de células diana que expresan CLDN18.2 podría inhibirse eficientemente incluso con una alta relación E:T de 30:1 al bloquear la unión de CLDN18.2-CAR a su antígeno diana. No se pudo observar inhibición de la lisis mediada por CLDN6-CAR que confirme la unión selectiva del anticuerpo al CLDN18.2-CAR. Este experimento confirmó, por un lado, que la lisis mediada por CLDN18.2-CAR depende exclusivamente de la especificidad de CLDN18.2 del CAR y, por otro lado, que el anticuerpo específico de idiotipo que se usa para la detección de CLDN18.2-CAR en principio, también podría aplicarse para la inhibición de las células T CLDN18.2-CAR in vivo en caso de un evento adverso grave.
Un requisito previo esencial para la eficacia antitumoral de las células T modificadas genéticamente con CAR es su capacidad para proliferar y persistir en el paciente. Para analizar, si las células T CLDN18.2-CAR proliferan eficientemente en respuesta a CLDN18.2 expresado ectópicamente en iDC, se realizó un ensayo de cocultivo in vitro basado en éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). Las células T CD8+ transfectadas con IVT-ARN que codifica CLDN18.2-CAR se marcaron con CFSE y se cocultivaron con iDC autólogas transfectadas con IVT-ARN que codifica CLDN18.2 o los antígenos de control CLDN9 o CLDN6. La expresión superficial de CAR se analizó por citometría de flujo mediante el uso de un anticuerpo específico anti-idiotipo acoplado a fluorocromo (figura 11A). Después de cuatro días de cocultivo, la proliferación antígeno-específica de las células T CD8+ transfectadas con CAR marcado con CFSE se analizó mediante citometría de flujo. La proliferación mediada por CLDN18.2-CAR de aproximadamente el 86 % de células T CD8+ en respuesta a CLDN18.2, mientras que solo pudo observarse la proliferación de fondo de células T CAR en respuesta a iDC transfectadas con antígeno de control (CLDN9, CLDN6) (figura 11B). Estos datos confirman que la activación antígeno-específica eficiente y la expansión de las células T CLDN18.2-CAR se pueden lograr mediante la expresión ectópica de CLDN18.2 en iDC humanas.
La potencia del CLDN18.2-CAR para mediar la activación antígeno-específica y la expansión de células T portadoras de CAR in vivo se examinó en un modelo de ratón singénico. Para seguir el destino de las células T-CAR transferidas adoptivamente in vivo, se usó un vector retroviral tricistrónico que codifica los genes reporteros de luciferasa (effLuc) y eGFP aguas abajo de CLDN18.2-CAR separados por secuencias de T2A viral.
Se injertaron ratones BALB/c vírgenes con células T murinas transducidas con CLDN18.2-CAR. En el día de la transferencia, se evaluó la expresión de CLDN18.2-CAR en células T transducidas por citometría de flujo mediante el uso de un anticuerpo específico anti-idiotipo acoplado a fluorocromo en combinación con la expresión del reportero eGFP. El CLDN18.2-CAR se expresó altamente en aproximadamente el 36 % de las células T CD8+ y en aproximadamente el 45 % de las CD4+ (figura 12A). Los ratones injertados se trataron luego con IVT-ARN que codifica CLDN18.2 o un antígeno control (Ctrl). Se pudo observar un fuerte aumento de la emisión de luz en los ratones tratados con ARN CLDN18.2 en comparación con ARN control dos días después de la vacunación con ARNm, lo que indica una activación y proliferación significativas de las células T CLDN18.2-CAR en respuesta al antígeno afín (figura 12B). Estos datos mostraron claramente la funcionalidad y la especificidad antigénica del CAR CLDN18.2 en las células T in vivo.
Epítopos de células T específicas de CLDN18.2
A2-1 (aa 68-76)
TLLGLPAML
A2-2 (aa 71-79)
GLPAMLQAV
A2-3 (14-22)
SLIGIAGII
A2-4 (17-25)
GIAGIIAAT
A2-5 (7-15)
QGLGFVVSL
A2-6 (8-16)
GLGFVVSLI
Receptores de células T específicos de CLDN18.2
mTCRcD8-CL18#2
>Alfa V12D.1 J33 C (MNcarece N-terminal; V ^ G und S ^C ) MRPGTCSVLVLLLMLRRSNGDSVTQTEGLVTVTEGLPVKLNCTYQTTYLT1AFFWYVQ YLNEAPQVLLKSSTDNKRTEHQGFHATLHKSSSSFHLQKSSAQLSDSALYYCALMDSNY QL1WGSGTKL11KPD1QNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTF1TDK TVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNL NFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
>Beta V13.3 D1 J1.4*02 C1 MGSRLFFVVLILLCAKHMEAAVTQSPRSKVAVTGGKVTLSCHQTNNHDYMYWYRQDT GHGLRLIHYSYVADSTEKGDIPDGYKASRPSQENFSLILELASLSQTAVYFCASSINERLF FGHGTKLSVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNG KE VHS G VSTDPQA YKESN YS YCLS S RLRVS ATFWHNPRNHFRCQ VQFHGLSEEDKWPE GSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYETLLGKATLYAVLVSTLVVMA MVKRKNS*
mTC CD8- CL18#4
>Alfa V6D.7 *04 J26 C (S ^F ) MNSFPGFMTVMLLIFTRAHGDSVTQTEGQVALSEEDFLT1HCNYSASGYPALFWYVQYP GEGPQFLFRASRDKEKGSSRGFEATYDKGTTSFHLRKASVQESDSAVYYCALGDYAQG LTFGLGTRVSVFPY1QNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTF1TDKT VLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNL NFQNLS VMGLRILLLK V AGFNLLMTLRLWS S *
>Beta V2 D2 J2.7 C2 (CASSQEWGGYEQYF)
MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKILICEQYLGHNAMYWYRQSAK KPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASSQEWGG YEQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSW W VNGKEVFISG VSTDPQ AYKESN Y S YCLSSRLR VÍS ATFWFTNPRNFIFRCQ VQFHGLS EED KWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSAT1LYE1LLGKATLYAVLVSGL VLMAMVKKKNS*
mTCRcns-CL18#5
>Alfa V6D.7*04 J47 C (N ^D y S ^F )
MDSFPGFMTVMLLIFTRAHGDSVTQTEGQVALSEEDFLTIHCNYSASGYPTLFWYVQYP GEGPQLLFRASRDKEKGSSRGFEATYDKGTTSFHLRKASVQESDSAVYYCALSVDYAN KMIFGLGTILRVRPHIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDK
TVLDMKAMDSKSNGA1AWSNQTSFTCQD1FKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNL NFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
>Beta V1 D2 J2.7 C2
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mTCRCns-CL18#8
>Alfa V8D.2*02 o V8N.2 J31 C
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>Beta V23 D2 J2.7 C2
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mTCRms-CL18#9
>Alfa V9N.3 J21 C (P ^S )
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>Beta V2 D2 J2.7 C2 (CASSQDQGGQGQYF)

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión para claudina-18.2 (CLDN18.2), un dominio transmembrana, un dominio de coestimulación y un dominio de señalización,
en el que el dominio de unión para CLDN18.2 comprende
(a) una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 23 o una VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de dicha VH, en donde dichas CDR1, CDR2 y CDR3 consisten en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 42, 43 y 44; y
(b) una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 30 o una VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de dicha VL, en donde dichas CDR1, CDR2 y CDR3 consisten en una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 45, 46 y 47.
2. El receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 1, en donde el dominio de coestimulación es un dominio de coestimulación seleccionado del grupo que consiste en CD28, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS).
3. El receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 2, en donde el dominio de coestimulación es el de (i) CD28 y CD137 (4-1BB) o (ii) CD28 y CD134 (OX40).
4. El receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el dominio de señalización es el de CD3-zeta o del receptor Fc gamma, preferiblemente un dominio de señalización que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 40.
5. El receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 39 o un fragmento de la misma.
6. El receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas VH y VL están dispuestas en un FV de cadena sencilla y en donde el receptor de antígeno quimérico comprende la transmembrana CD3-zeta y el endodominio.
7. El receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende un péptido señal, preferiblemente que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 37.
8. El receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 7, en donde el dominio transmembrana es el de CD28.
9. El receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la VH y VL están conectadas a través de un enlazador peptídico, preferiblemente un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos (GGGGS)3.
10. El receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende una región espaciadora que enlaza el dominio de unión para CLDN18.2 al dominio transmembrana.
11. El receptor de antígeno quimérico de la reivindicación 1 o 2, que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 41.
12. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el ácido nucleico es ARN o ADN, preferiblemente ARNm o ARN autorreplicante.
13. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12.
14. El vector de la reivindicación 13, que es un vector viral o un vector basado en virus, preferiblemente un vector yretroviral, un vector lentiviral o un vector adenoviral.
15. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12 o que expresa el receptor de antígeno quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
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