JP2023039980A - クローディン－１８．２－特異的免疫受容体およびｔ細胞エピトープ - Google Patents

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Abstract

【課題】免疫療法に有用な、クローディン－１８．２－特異的免疫受容体（Ｔ細胞受容体および人工Ｔ細胞受容体（キメラ抗原受容体；ＣＡＲ））およびＴ細胞エピトープを提供する。【解決手段】クローディン－１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に結合し、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡであって、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが、特定のアミノ酸配列を含むＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）および特定のアミノ酸配列を含むＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む、ＤＮＡを提供する。【選択図】なし

Description

発明の技術分野
本発明は、免疫療法に有用な、クローディン－１８．２－特異的免疫受容体（Ｔ細胞受容体および人工Ｔ細胞受容体（キメラ抗原受容体；ＣＡＲ））およびＴ細胞エピトープの提供に関する。
発明の背景
免疫系の進化は、脊椎動物に、自然免疫および適応免疫の２種類の防御に基づく極めて効果的なネットワークをもたらした。
病原体に関連する共通の分子パターンを認識する不変（インバリアント）受容体に依存する進化論的に古い自然免疫系とは対照的に、適応免疫は、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）およびＴ細胞（Ｔリンパ球）上の高度に特異的な抗原受容体ならびにクローン選択に基づく。
Ｂ細胞は抗体の分泌によって体液性免疫応答を生じるのに対して、Ｔ細胞は認識された細胞の破壊をもたらす細胞性免疫応答に介在する。
Ｔ細胞は、ヒトおよび動物における細胞性免疫において中心的役割を果たす。特定の抗原の認識および結合には、Ｔ細胞表面上に発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在する。
Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、標的細胞の表面上に提示される、免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用することができる。ＴＣＲの特異的結合は、Ｔ細胞内のシグナルカスケードを誘発し、増殖および成熟したエフェクターＴ細胞への分化をもたらす。多種の抗原を標的にすることを可能にするためには、Ｔ細胞受容体は多様性に富む必要がある。
この多様性は、ＴＣＲの異なる構造領域をコードする遺伝子の異なる不連続なセグメントの遺伝子再編成によって得られる。ＴＣＲは、１つのα鎖および１つのβ鎖または１つのγ鎖および１つのδ鎖から構成される。ＴＣＲα／β鎖は、抗原認識に関与するＮ末端の高度に多型な可変領域と、不変定常領域とから構成される。遺伝子レベルでは、これらの鎖は、可変（Ｖ）領域、多様性（Ｄ）領域（β鎖およびδ鎖のみ）、連結（Ｊ）領域および定常（Ｃ）領域の、いくつかの領域に分けられる。ヒトβ鎖遺伝子は、６０を超える可変（Ｖ）セグメント、２つの多様性（Ｄ）セグメント、１０を超える連結（Ｊ）セグメント、および２つの定常領域セグメント（Ｃ）を含む。ヒトα鎖遺伝子は、５０を超えるＶセグメント、および６０を超えるＪセグメントを含むが、Ｄセグメントを含まず、１つのＣセグメントを含む。マウスβ鎖遺伝子は、３０を超える可変（Ｖ）セグメント、２つの多様性（Ｄ）セグメント、１０を超える連結（Ｊ）セグメント、および２つの定常領域セグメント（Ｃ）を含む。マウスα鎖遺伝子は、ほぼ１００個のＶセグメント、６０個のＪセグメントを含み、Ｄセグメントを含まず、１つのＣセグメントを含む。Ｔ細胞の分化中に、１つのＶ領域遺伝子、１つのＤ（β鎖およびδ鎖のみ）領域遺伝子、１つのＪ領域遺伝子および１つのＣ領域遺伝子を再編成することにより、特定のＴ細胞受容体遺伝子が作製される。ＴＣＲの多様性は、組換え部位においてランダムなヌクレオチドの導入および／または欠失が起こる不正確なＶ－（Ｄ）－Ｊ再編成によって、さらに増幅される。ＴＣＲ遺伝子座の再編成はＴ細胞の成熟中にゲノムにおいて起こるので、各成熟Ｔ細胞は1つの特異的α／β ＴＣＲまたはγ／δ ＴＣＲしか発現しない。
ＭＨＣおよび抗原結合は、ＴＣＲの相補性決定領域１、２および３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）によって介在される。抗原認識および結合にとって最も重要なβ鎖のＣＤＲ３は、再編成されたＴＣＲβ鎖遺伝子のＶ－Ｄ－Ｊ接合部によってコードされている。
ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のヘテロ二量体型複合体、補助刺激受容体（co－receptor）ＣＤ４またはＣＤ８ならびにＣＤ３シグナル伝達モジュールを含む、複雑なシグナル伝達機構の一部である（図１）。ＣＤ３鎖が細胞内部に活性化シグナルを伝達するのに対し、ＴＣＲα／βヘテロ二量体はもっぱら抗原認識を担っている。従って、ＴＣＲα／β鎖の移入は、Ｔ細胞を任意の目的抗原にリダイレクト(redirect)する機会を提供する。
免疫療法
抗原特異的免疫療法は、感染性疾患または悪性疾患を制御するために、患者における特異的免疫応答を増強または誘導することを目指している。病原体関連抗原および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が次々と同定されることで、免疫療法に適した標的が幅広く収集されることになった。これらの抗原に由来する免疫原性ペプチド（エピトープ）を提示する細胞は、能動免疫戦略または受動免疫戦略のいずれかによって特異的に標的化することができる。
能動免疫は、患者において、罹患細胞を特異的に認識して死滅させることができる抗原特異的Ｔ細胞を誘導し、増殖を活性化する傾向がある。対照的に、受動免疫は、インビトロで増殖され、場合によっては遺伝子改変されたＴ細胞の養子移入に依存する（養子Ｔ細胞療法）。
ワクチン接種
腫瘍ワクチンは能動免疫によって内在性腫瘍特異的免疫応答を誘導することを目指している。癌細胞全体、タンパク質、ペプチドまたは免疫化ベクター、例えばＲＮＡ、ＤＮＡもしくはウイルスベクターなどを含む、異なる抗原フォーマットを、腫瘍ワクチン接種に用いることができ、それらはインビボで直接適用するか、または患者への移入に続いて、ＤＣのパルス処理により、インビトロで適用することができる。
治療が誘導する免疫応答を同定することのできる臨床治験の数は、免疫戦略の改善と抗原特異的免疫応答を検出するための方法の改善とにより、着実に増加している(Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res. 68, 3931－3940; Schmitt, M. et al. (2008) Blood 111, 1357－1365; Speiser, D.E. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 3849－3854; Adams, S. et al. (2008) J. Immunol. 181, 776－784)。
しかしながら、ほとんどの場合、検出される免疫応答を臨床転帰と体系的に関連付けることはできない(Curigliano, G. et al. (2006) Ann. Oncol. 17, 750－762; Rosenberg, S.A. et al. (2004) Nat. Med. 10, 909－915)。
それゆえに、腫瘍抗原由来のペプチドエピトープの厳密な定義は、ワクチン接種戦略の特異性および効率の改善だけでなく、さらに免疫モニタリングの方法にも貢献し得る。
養子細胞移入（ＡＣＴ）
ＡＣＴに基づく免疫療法は、非免疫レシピエントに移入されるか、または低い前駆体頻度から臨床的に妥当な細胞数までエクスビボで増加させた後に自己宿主に移入される、予め感作されたＴ細胞による受動免疫の一形態であると広く定義することができる。ＡＣＴ実験に使用されている細胞タイプは、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞(Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487－1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485－1492)、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）(Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159－1166)、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後のドナーリンパ球、ならびに腫瘍特異的Ｔ細胞株またはＴ細胞クローン(Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363－373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168－16173)である。
養子Ｔ細胞移入は、ＣＭＶなどのヒトウイルス感染症に対して治療活性を有することが示されている。ＣＭＶ感染と内在性潜在ウイルスの再活性化が健常個体では免疫系によって制御されるのに対し、移植レシピエントまたはＡＩＤＳ患者などの免疫機能が低下した個体では、これが有意に高い罹病率および死亡率をもたらす。
Riddellとその共同研究者らは、養子Ｔ細胞療法によるウイルス免疫の再構成を、ＨＬＡ適合ＣＭＶ血清陽性移植ドナー由来のＣＤ８＋ ＣＭＶ特異的Ｔ細胞クローンを移入した後の免疫抑制患者において実証した(Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238－241)。
別のアプローチとして、ポリクローナルドナー由来ＣＭＶまたはＥＢＶ特異的Ｔ細胞集団を移植レシピエントに移入して、移入されたＴ細胞の持続性を高めた(Rooney, C.M. et al. (1998) Blood 92, 1549－1555; Peggs, K.S. et al. (2003) Lancet 362, 1375－1377)。
メラノーマの養子免疫療法に関して、Rosenbergとその共同研究者らは、切除した腫瘍から単離され、インビトロで増加させた自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の注入と骨髄非破壊的リンパ球枯渇(lymphodepleting)化学療法および高用量ＩＬ２との併用に依る、ＡＣＴアプローチを確立した。最近公表された臨床試験は、処置を受けた転移性メラノーマ罹患患者に約５０％の奏功率をもたらした(Dudley, M.E. et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346－2357)。
しかしながら、ＡＣＴ免疫療法の対象となるには、患者がいくつかの前提を満たさなければならない。患者の腫瘍は切除可能でなければならない。腫瘍は、細胞培養条件下で、生存可能なＴＩＬを生成しなければならない。ＴＩＬは腫瘍抗原に対して反応性でなければならず、インビトロで十分な数まで増加しなければならない。とりわけメラノーマ以外の癌では、そのような腫瘍反応性ＴＩＬを得ることは困難である。さらに、正常ヒトＴリンパ球のインビトロ刺激およびクローン増殖を繰り返すことにより、テロメラーゼ活性が徐々に低下し、テロメアが短縮して、複製老化および移入されたＴ細胞の持続可能性の低下が起こる(Shen, X. et al. (2007) J. Immunother. 30: 123－129)。
遺伝子改変されたＴ細胞を用いるＡＣＴ
ＡＣＴの限界を克服する一つのアプローチは、短期間のエクスビボ培養中に、所定の特異性を有する腫瘍反応性免疫受容体を発現するように再プログラムされた自己Ｔ細胞を、該患者に再注入する、自己Ｔ細胞の養子移入である(Kershaw M.H. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525－41)。この戦略により、腫瘍反応性Ｔ細胞が患者に存在しない場合であっても、ＡＣＴを種々の一般的悪性病変に適用することが可能になる。Ｔ細胞の抗原特異性はもっぱらＴＣＲα鎖およびβ鎖のヘテロ二量体型複合体に基づいているので、Ｔ細胞へのクローン化ＴＣＲ遺伝子の移入により、それらを任意の目的抗原に対してリダイレクトすることを可能にする。それゆえに、ＴＣＲ遺伝子治療は、処置選択肢として自己リンパ球による抗原特異的免疫療法を開発するための魅力的な戦略を提供する。ＴＣＲ遺伝子移入の主な利点は、数日以内に治療量の抗原特異的Ｔ細胞が生成する点、および患者の内在性ＴＣＲレパートリーには存在しない特異性を導入することが可能になる点である。
ＴＣＲ遺伝子移入が初代T細胞の抗原特異性をリダイレクトするための魅力的な戦略であることは、いくつかのグループが実証している(Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol. 171, 3287－3295; Cooper, L.J. et al. (2000) J. Virol. 74, 8207－8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528－532; Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957－961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232－238)。
ヒトにおけるＴＣＲ遺伝子治療の実施可能性は、最近、Rosenbergおよび彼のグループにより、悪性黒色腫の処置に関する臨床治験において実証された。メラノーマ／メラノサイト抗原特異的ＴＣＲをレトロウイルスを用いて形質導入した自己リンパ球の養子移入は、処置を受けたメラノーマ患者の最大３０％に癌退縮をもたらした(Morgan, R.A. et al. (2006) Science 314, 126－129; Johnson, L.A. et al. (2009) Blood 114, 535－546)。
キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、モノクローナル抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）とＴ細胞活性化のための１以上のシグナル伝達ドメインからなる細胞内部分を結合させて作製された受容体である。ＣＡＲは、非ＭＨＣ拘束性様式で天然抗原を認識し、それゆえに、そのＨＬＡタイプが何であっても全ての個体に使用可能であり、それらはＣＤ４＋Ｔ細胞ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞において機能する。
過去１０年間に、種々の細胞表面腫瘍抗原のパネルを標的にして、多数のＣＡＲが報告されている。それらの生物学的機能は、第２世代のＣＡＲと呼ばれる、三者間（tripartite）受容体（ｓｃＦｖ、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ）をもたらす共刺激ドメインの組み込みによって劇的に改善された。第３世代のＣＡＲは、修飾されたＴ細胞の増殖能力および持続性を増強するために、ＯＸ４０および４－１ＢＢなどの共刺激分子のさらなるドメインを包含する（図２）。
抗原特異的免疫療法の標的構造
複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発見が、抗原特異的免疫療法の概念の基礎になっている(Novellino, L. et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 187－207)。ＴＡＡは、その遺伝的不安定性のために腫瘍細胞上に発現される異常なタンパク質であり、正常細胞では発現されないか、または発現が限定されている。これらのＴＡＡは、免疫系による悪性細胞の特異的認識につながり得る。
自己腫瘍特異的Ｔ細胞（van der Bruggen, P. et al. (1991) Science 254, 1643－1647）または循環抗体（Sahin, U. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 92, 11810－11813）を用いる腫瘍由来ｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニング、ＴＡＡの分子クローニング、逆免疫学的アプローチ、生化学的方法（Hunt, D.F. et al. (1992) Science 256, 1817－1820）、遺伝子発現解析、またはインシリコ・クローニング戦略（Helftenbein, G. et al. (2008) Gene 414, 76－84）によるＴＡＡの分子クローニングにより、免疫療法的戦略のための標的候補が、かなりの数、もたらされている。ＴＡＡは、分化抗原、過剰発現抗原、腫瘍特異的スプライス変異体、変異型（mutated）遺伝子産物、ウイルス抗原、および癌精巣抗原（ＣＴＡ）を含む、いくつかのカテゴリーに分類される。癌精巣ファミリーは、その発現が精巣および多数の異なる腫瘍体(entities)に制限されているので、極めて有望なＴＡＡのカテゴリーである（Scanlan, M.J. et al. (2002) Immunol. Rev. 188, 22－32）。現在までに、５０個を超えるＣＴ遺伝子が報告されており（Scanlan, M.J. et al. (2004) Cancer Immun. 4, 1）、そのうちのいくつかは臨床治験において試験されている(Adams, S. et al. (2008) J. Immunol. 181, 776－784; Atanackovic, D. et al. (2004) J. Immunol. 172, 3289－3296; Chen, Q. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 9363－9368; Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res. 68, 3931－3940; Davis, I.D. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 10697－10702; Jager, E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 12198－12203; Marchand, M. et al. (1999) Int. J. Cancer 80, 219－230; Schuler－Thurner, B. et al. (2000) J. Immunol. 165, 3492－3496)。
免疫療法的アプローチのための魅力的な標的構造の数はますます増えているにもかかわらず、所定のＨＬＡ拘束性を有する特異的Ｔ細胞クローンまたはＴ細胞株は、そのうちのわずかなものについてしか存在しない（Chaux, P. et al. (1999) J. Immunol. 163, 2928－2936；Zhang, Y. et al. (2002) Tissue Antigens 60, 365－371；Zhao, Y. et al. (2005)J. Immunol. 174, 4415－4423）。
クローディンは、上皮と内皮との密着結合部に位置する内在性膜タンパク質である。クローディンは、２つの細胞外ループを有する４つの膜貫通領域、ならびに細胞質中に位置するＮ末端およびＣ末端を有すると予測されている。膜貫通タンパク質のクローディン（ＣＬＤＮ）ファミリーは、上皮および内皮の密着結合部の維持において重要な役割を果たしており、細胞骨格の維持および細胞シグナル伝達にも関与している可能性がある。
ＣＬＤＮ１８は、クローディンファミリーに属し、密着結合部の形成に関与する４つの膜貫通ドメインを有する細胞表面分子である(Tsukita S, Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2:285－93)。ヒトＣＬＤＮ１８遺伝子は、Ｎ末端の６９アミノ酸が異なり(Niimi T, MolCellBiol 2001;21:7380－90)、第１の細胞外ループを含む、２つのタンパク質アイソフォーム（ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２）を生じる、２つの代替的な第１エクソンを有する（図４Ａ）。制限された組織セットの転写プロファイリングにより、これらのアイソフォームは、ＣＬＤＮ１８．１が肺組織で主に発現され、一方、ＣＬＤＮ１８．２が胃特異性を示す、異なる分化系列決定を有することが示されている。ＣＬＤＮ１８．２発現は、胃粘膜の短寿命分化上皮細胞に限られ、胃幹細胞ゾーンおよび他の健康な組織には存在しない。ＣＬＤＮ１８．２発現は、胃食道、膵臓および他の癌に関連している（図４Ｂ、Ｃ； Sahin U et al., Clin Cancer Res 2008;14:7624－34; Karanjawala ZE et al., Am J Surg Pathol 2008;32:188－96;)。この標的に対する組換えｍＡｂは、現在、第ＩＩ相臨床治験中であるが、Ｔ細胞ベースの治療アプローチの標的としてのＣＬＤＮ１８．２の評価は、未だに明確でない。
腫瘍におけるＣＬＤＮ１８．２の高頻度過剰発現は、この分子を、ワクチン療法剤および治療抗体などのＣＬＤＮ１８．２に指向した治療剤の開発のための極めて魅力的な標的とみなす。しかしながら、今まで、ＨＬＡ－Ａ＊２拘束性ＣＬＤＮ１８．２ Ｔ細胞エピトープおよびＴ細胞受容体またはＣＬＤＮ１８．２を標的とするＣＡＲは記載されておらず、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞が、能動的または受動的免疫化アプローチを用いてＴ細胞を含む免疫療法によってインビボで標的化され得るかどうかは分かっていない。
本発明の説明
発明の概要
本発明は、特に、罹患細胞などの細胞の表面上に存在するか、または罹患細胞もしくは抗原提示細胞などの表面上に提示されるとき、腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ１８．２に特異的なＴ細胞受容体および人工Ｔ細胞受容体、ならびにこれらのＴ細胞受容体により認識されるエピトープ、すなわち、ＣＬＤＮ１８．２－Ｔ細胞エピトープを含むペプチドに関する。
そのようなＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するよう操作されたＴ細胞の養子移入により、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞を特異的に標的化することができ、それにより、癌細胞の選択的破壊をもたらし得る。さらに、本発明により提供されるＴ細胞エピトープは、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌に対するワクチンの設計に有用である。
一側面において、本発明は、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含むペプチドに関する。一態様において、該ペプチドは、１００以下、５０以下、２０以下または１０以下のアミノ酸長である。一態様において、ペプチドは、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体からなるペプチドを産生するように処理することができる。一態様において、ペプチドは、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体からなる。
一態様において、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチドであり、好ましくはＭＨＣクラスＩ提示ペプチドであるか、または、細胞内に存在するとき、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチド、好ましくはＭＨＣクラスＩ提示ペプチドである、そのプロセシング産物を作製するように処理され得る。好ましくは、該ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ提示ペプチドは、所定のアミノ酸配列、すなわち、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体に実質的に対応する配列を有する。好ましくは、本発明のペプチドは、クラスＩ ＭＨＣと共にＣＬＤＮ１８．２の提示を特徴とする細胞に関する疾患に対する細胞応答を刺激することができる。
さらなる側面において、本発明は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸および該核酸を含む細胞に関する。核酸は、組換え核酸であり得る。核酸は、プラスミドまたは発現ベクター中に存在してよく、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。一態様において、核酸はＲＮＡである。好ましくは、細胞は、該ペプチドを発現する。細胞は、組換え細胞であってよく、コードされたペプチドまたはそのプロセシング産物を分泌可能であり、表面上にそれを発現可能であり、そして好ましくは、該ペプチドまたはそのプロセシング産物に結合し、好ましくは、該ペプチドまたはそのプロセシング産物を細胞表面上に提示する、ＭＨＣ分子をさらに発現することができ、ことができる。一態様において、細胞は、ＭＨＣ分子を内因的に発現する。さらなる態様において、細胞は、組換え法でＭＨＣ分子および／またはペプチドを発現する。細胞は、好ましくは、非増殖性である。好ましい態様において、細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
さらなる側面において、本発明は、本発明のペプチドまたはそのプロセシング産物を提示する細胞に関し、ここで、該プロセシング産物は、好ましくは、所定のアミノ酸配列、すなわち、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を有するペプチドである。一態様において、該細胞は、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む細胞である。好ましくは、該細胞は、該ペプチドを産生するように該核酸を発現する。必要に応じで、該細胞は、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体からなるペプチドを産生するように該ペプチドをプロセシングする。細胞は、その表面上にＭＨＣ分子によりペプチドまたはそのプロセシング産物を提示することができる。一態様において、細胞は、ＭＨＣ分子を内因的に発現する。さらなる態様において、細胞は、ＭＨＣ分子を組換え的に発現する。一態様において、細胞にペプチドを添加することにより、細胞のＭＨＣ分子にペプチドを負荷（パルスして）させる。細胞は、ペプチドを組換え的に発現し、該ペプチドまたはそのプロセシング産物を細胞表面上に提示し得る。細胞は、好ましくは非増殖性である。好ましい態様において、細胞は、樹状細胞、単球またはマクロファージなどの抗原提示細胞である。
さらなる側面において、本発明は、特に、罹患細胞のような細胞の表面上に提示されるとき、本発明のペプチドと反応性である免疫反応性細胞に関する。免疫反応性細胞は、ペプチドを認識するためにインビトロで感作された細胞であってもよい。免疫反応性細胞は、Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞であってもよい。好ましくは、免疫反応性細胞は、特に罹患細胞のような細胞の表面上のＭＨＣのようなＭＨＣに結合したとき、所定のアミノ酸配列に実質的に対応する配列、すなわち、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体に結合する。
さらなる側面において、本発明は、ＭＨＣ分子と複合体を形成していてよい本発明のペプチドに結合する結合剤に関する。
さらなる側面において、本発明は、ＭＨＣ分子と複合体を形成していてよい本発明のペプチドに結合し、好ましくは該ペプチドと反応性のＴ細胞受容体、または該Ｔ細胞受容体のポリペプチド鎖である。一態様において、該Ｔ細胞受容体のポリペプチド鎖は、Ｔ細胞受容体α鎖またはＴ細胞受容体β鎖である。
さらなる側面において、本発明は、Ｔ細胞受容体α鎖または該Ｔ細胞受容体α鎖を含むＴ細胞受容体に関し、ここで、該Ｔ細胞受容体α鎖は、
（ｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択されるＴ細胞受容体α鎖またはその変異体の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列を含む、Ｔ細胞受容体α鎖、ならびに
（ｉｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択されるＴ細胞受容体α鎖配列もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体を含むＴ細胞受容体α鎖
からなる群より選択される。
一態様において、該配列番号は、配列番号８、１０、１４および１８からなる群より選択され、該Ｔ細胞受容体は、配列番号６のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含むペプチドと反応性である。
一態様において、該配列番号は、配列番号１０、１２および１４からなる群より選択され、該Ｔ細胞受容体は、配列番号７のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含むペプチドと反応性である。
さらなる側面において、本発明は、Ｔ細胞受容体β鎖または該Ｔ細胞受容体β鎖を含むＴ細胞受容体に関し、ここで、該Ｔ細胞受容体β鎖は、
（ｉ）配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択されるＴ細胞受容体β鎖またはその変異体の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列を含む、Ｔ細胞受容体β鎖、ならびに
（ｉｉ）配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択されるＴ細胞受容体β鎖もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体を含むＴ細胞受容体β鎖
からなる群より選択される。
一態様において、該配列番号は、配列番号９、１１、１５および１９からなる群より選択され、該Ｔ細胞受容体は、配列番号６のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含むペプチドと反応性である。
一態様において、該配列番号は、配列番号１１、１３および１５からなる群より選択され、該Ｔ細胞受容体は、配列番号７のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含むペプチドと反応性である。
さらなる側面において、本発明は、
（Ｉ）（ｉ）配列番号ｘのＴ細胞受容体α鎖またはその変異体の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列を含むＴ細胞受容体α鎖、および
（ｉｉ）配列番号ｘ＋１のＴ細胞受容体β鎖またはその変異体の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列を含むＴ細胞受容体β鎖（ここで、ｘは、８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択される）
を含むＴ細胞受容体、および
（ＩＩ）（ｉ）配列番号ｘのＴ細胞受容体α鎖配列もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体を含むＴ細胞受容体α鎖、および
（ｉｉ）配列番号ｘ＋１のＴ細胞受容体β鎖配列もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体を含むＴ細胞受容体β鎖（ここで、ｘは、８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択される）
を含むＴ細胞受容体
からなる群より選択されるＴ細胞受容体に関する。
一態様において、該ｘは、８、１０、１４および１８からなる群より選択され、該Ｔ細胞受容体は、配列番号６のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含むペプチドと反応性である。
一態様において、該ｘは、１０、１２および１４からなる群より選択され、該Ｔ細胞受容体は、配列番号７のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含むペプチドと反応性である。
一態様において、Ｔ細胞により発現され、および／またはＴ細胞上に存在するとき、該Ｔ細胞受容体の、癌細胞などの細胞上に提示される上記のＣＬＤＮ１８．２－ペプチドエピトープへの結合は、該Ｔ細胞の増殖および／または活性化をもたらし、ここで、該活性化されたＴ細胞は、好ましくは、細胞毒性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出し、癌細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスを開始する。
さらなる側面において、本発明は、クローディン－１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に結合する人工Ｔ細胞受容体に関する。一態様において、結合は特異的結合である。
一態様において、該ＣＬＤＮ１８．２は、癌細胞に発現される。一態様において、該ＣＬＤＮ１８．２は、癌細胞上の表面に発現される。一態様において、該人工Ｔ細胞受容体は、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメインに結合するか、またはその細胞外ドメインのエピトープに結合する。一態様において、該人工Ｔ細胞受容体は、生細胞の表面上に存在するＣＬＤＮ１８．２の天然エピトープに結合する。一態様において、該人工Ｔ細胞受容体は、ＣＬＤＮ１８．２の第一の細胞外ループに結合する。一態様において、Ｔ細胞によって発現される、および／またはＴ細胞上に存在するとき、該人工Ｔ細胞受容体の、癌細胞などの細胞上に存在するＣＬＤＮ１８．２への結合は、該Ｔ細胞の増殖および／または活性化をもたらし、ここで、該活性化されたＴ細胞は、好ましくは細胞毒性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出し、癌細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスを開始する。
一態様において、本発明の人工Ｔ細胞受容体は、ＣＬＤＮ１８．２に対する結合ドメインを含む。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、該人工Ｔ細胞受容体の細胞外ドメインに包含される。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．２抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．２に特異性を有する免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２））およびＣＬＤＮ１８．２に特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２））を含む。一態様において、該重鎖可変領域（ＶＨ）および対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ペプチドリンカー、好ましくはアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３を含むペプチドリンカーを介して連結する。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、ならびに配列番号３０のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含む。
一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）および配列番号３０に示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含むＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインあるいはＣＬＤＮ１８．２に対する抗体と同じかまたは実質的に同じエピトープを認識し、ならびに／あるいは該ＣＬＤＮ１８．２－結合ドメインと競合するか、またはＣＬＤＮ１８．２への結合についてＣＬＤＮ１８．２－抗体と競合する。一態様において、該ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインと同じかまたは実質的に同じエピトープを認識し、ならびに／あるいはＣＬＤＮ１８．２への結合について該ＣＬＤＮ１８．２－結合ドメインと競合する。第２の結合ドメインと競合するか、または標的への結合について抗体と競合する結合ドメインは、好ましくは、該第２の結合ドメインまたは抗体に対して拮抗的である。
一態様において、本発明の人工Ｔ細胞受容体は、膜貫通ドメインを含む。一態様において、膜貫通ドメインは、膜を貫通する疎水性αへリックスである。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはそのフラグメントを含む。
一態様において、本発明の人工Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。一態様において、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、細胞内に位置している。一態様において、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ζを含み、好ましくはＣＤ３－ζの細胞内ドメインを含み、場合により、ＣＤ２８と複合体を形成していてよい。一態様において、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体を含む。
一態様において、本発明の人工Ｔ細胞受容体は、新生タンパク質の小胞体への輸送を指示するシグナルペプチドを含む。一態様において、シグナルペプチドは、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインに先行する。一態様において、シグナルペプチドは、配列番号３７に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体を含む。
一態様において、本発明の人工Ｔ細胞受容体は、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域を含む。一態様において、スペーサー領域は、ＣＬＤＮ１８．２の認識を容易にするために、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが異なる方向に配向するのを可能にする。一態様において、スペーサー領域は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域を含む。一態様において、スペーサー領域は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体を含む。
一態様において、本発明の人工Ｔ細胞受容体は、以下の構造を含む：
ＮＨ２－シグナルペプチド－ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメイン－スペーサー領域－膜貫通ドメイン－Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン－ＣＯＯＨ。
一態様において、本発明の人工Ｔ細胞受容体は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含む。
上記のＴ細胞受容体および人工Ｔ細胞受容体は、好ましくは、特に、罹患細胞などの細胞の表面上に存在するか、または罹患細胞もしくは抗原提示細胞などの細胞の表面上に提示されるとき、腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ１８．２に特異的である。
本発明のＴ細胞受容体および人工Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞などの細胞により発現され、および／またはその表面上に存在し得る。
さらなる側面において、本発明は、本発明のＴ細胞受容体鎖もしくはＴ細胞受容体または本発明の人工Ｔ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。一態様において、核酸は組換え核酸である。一態様において、核酸は、ベクターの形態またはＲＮＡの形態である。
さらなる側面において、本発明は、本発明のＴ細胞受容体鎖もしくはＴ細胞受容体または本発明の人工Ｔ細胞受容体を含む、および／または本発明のＴ細胞受容体鎖もしくはＴ細胞受容体または本発明の人工Ｔ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む細胞に関する。一態様において、該核酸はＲＮＡであり、好ましくはインビトロで転写されたＲＮＡである。細胞は、本発明のＴ細胞受容体鎖もしくはＴ細胞受容体または本発明の人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞であってよく、および／または本発明のＴ細胞受容体鎖もしくはＴ細胞受容体または本発明の人工Ｔ細胞受容体をその表面上に有していてよい。一態様において、該細胞は、養子細胞移動に有用な細胞である。細胞は、エフェクターまたは幹細胞であってよく、好ましくは免疫反応性細胞であり得る。免疫反応性細胞は、Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。一態様において、免疫反応性細胞は、腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ１８．２と反応性である。一態様において、該ＣＬＤＮ１８．２は、罹患細胞などの細胞の表面上に存在する。一態様において、該ＣＬＤＮ１８．２は、罹患細胞または抗原提示細胞などの細胞の表面上に提示され、該免疫反応性細胞は、特にＭＨＣとの関連で提示されるとき、本発明のペプチドと反応性であり、好ましくは所定のアミノ酸配列に実質的に対応する配列、すなわち、配列番号６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体に結合する。一態様において、該細胞は、内在性ＴＣＲの表面発現を欠くか、またはＣＬＤＮ１８．２非関連抗原に特異的である。
一態様において、本発明の細胞は、養子細胞移入に用いる前に、抗原特異的増殖および再暴露が行われ、ここで、抗原特異的増殖および再暴露は、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２またはそのペプチドフラグメントを提示する自己抗原提示細胞に該細胞を暴露することにより行われ得る。
さらなる側面において、本発明は、本発明のＴ細胞受容体鎖もしくはＴ細胞受容体または本発明の人工Ｔ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でＴ細胞を形質導入する工程を含む、免疫反応性細胞の作製方法に関する。
さらに、本発明は、一般的に、癌細胞、特にＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞などの罹患細胞を標的とすることによる疾患の処置法を含む。本方法は、その表面上に腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ１８．２を発現する、および／または腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ１８．２を提示する細胞の選択的な排除を提供し、それにより、ＣＬＤＮ１８．２を発現しない、および／または提示しない正常細胞への有害作用を最小限にする。従って、治療のための好ましい疾患は、ＣＬＤＮ１８．２が発現され、場合によっては提示される疾患、例えば癌疾患、特に本明細書に記載の疾患などである。
本発明のペプチド、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸または該核酸を含む本発明の細胞が投与されるとき、該処置は、好ましくは、能動免疫化を伴う。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２－特異的Ｔ細胞は、患者において増殖され、罹患細胞を認識して死滅させることが可能となる。本発明の免疫反応性細胞、本発明のＴ細胞受容体、本発明の人工Ｔ細胞受容体、本発明のＴ細胞受容体もしくは本発明の人工Ｔ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸、または本発明のＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体を含む、および／または本発明のＴ細胞受容体もしくは本発明の人工Ｔ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸を含む本発明の細胞が投与されるとき、処置は、好ましくは、受動免疫化を伴う。好ましくは、罹患細胞を認識して死滅させることができ、場合によっては、遺伝子工学的に改変され、および／またはインビトロで増殖された、ＣＬＤＮ１８．２－特異的Ｔ細胞は、患者に養子移植される。
一側面において、本発明は、以下の１以上を含む医薬組成物に関する：
（ｉ）本発明のペプチド；
（ｉｉ）本発明の核酸；
（ｉｉｉ）本発明の細胞；
（ｉｖ）本発明の免疫反応性細胞；
（ｖ）本発明の結合剤；
（ｖｉ）本発明のＴ細胞受容体；および
（ｖｉｉ）本発明の人工Ｔ細胞受容体。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてよく、場合により、安定化剤などの１以上のアジュバントを含んでいてよい。医薬組成物は、治療用または予防用ワクチンの形態であってよい。一態様において、医薬組成物は、本明細書に記載の疾患などの癌疾患の処置または予防に使用するためのものである。
上記の医薬組成物の投与は、ＣＬＤＮ１８．２に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答（その表面上にＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞および／またはＭＨＣ分子に関してＣＬＤＮ１８．２を提示する細胞を含む）を誘発することができるＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープを提供し得る。あるいは、またはさらに、上記の医薬組成物の投与は、ＣＬＤＮ１８．２に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができるＭＨＣクラスＩ提示エピトープを提供することができる。
さらなる側面において、本発明は、本発明の医薬組成物を患者に投与することを含む、癌疾患を処置または予防する方法に関する。
さらなる側面において、本発明は、治療に使用するための、特に癌の処置または予防に使用するための、本発明のペプチド、本発明の核酸、本発明の細胞、本発明の免疫反応性細胞、本発明の結合剤、本発明のＴ細胞受容体、または本発明の人工Ｔ細胞受容体に関する。
別の側面は、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘導するための方法に関する。
別の側面は、Ｔ細胞を、本発明のペプチド、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸、該核酸を含む本発明の細胞、および／または本発明のペプチドもしくはそのプロセシング産物を提示する本発明の細胞の１以上と接触させることを含む、Ｔ細胞を刺激、プライミングおよび／または増殖させるための方法に関する。一態様において、本発明のペプチドは、細胞、例えば抗原提示細胞の表面上に、ＭＨＣ分子などの分子として提示される。
この側面において、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２特異的Ｔ細胞を調製するための方法に関し得る。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで、刺激、プライミングおよび／または増殖され得る。好ましくは、Ｔ細胞は、対象から得られたサンプル中に存在する。刺激、プライミングおよび／または増殖させたＴ細胞は、対象に投与され得て、対象にとって自己、同種異系、同系であり得る。
本発明は、対象における免疫応答を誘導するための方法の上記の側面において、またははＴ細胞を刺激、プライミングおよび／または増殖させるための方法の上記の側面において、対象における癌疾患を処置するための方法に関する。
別の側面は、対象において癌細胞を死滅させる方法であって、治療的有効量の本発明のペプチド、本発明の核酸、本発明の細胞、本発明の免疫反応性細胞、本発明の結合剤、本発明のＴ細胞受容体、または本発明の人工Ｔ細胞受容体を対象に提供する工程を含む方法に関する。
本明細書に記載の組成物および作用物質（agent）は、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の発現および／またはクラスＩ ＭＨＣと共にＣＬＤＮ１８．２の提示により特徴付けられる疾患、例えば癌疾患に対する細胞性応答、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞活性を誘導または促進することができる。
一側面において、本発明は、本明細書に記載の処置法における使用のための本明細書に記載の作用物質および組成物を提供する。
本明細書に記載の癌疾患の処置は、外科的切除および／または放射線療法および／または従来の化学療法と組み合わせることができる。
別の側面において、本発明は、対象における免疫応答を決定するための方法であって、対象から単離された生物学的サンプル中の、本発明のペプチド、または本発明のペプチドもしくはそのプロセシング産物を提示する細胞と反応するＴ細胞を決定することを含む方法に関する。本方法は、以下の工程を含み得る：
（ａ）対象から単離されたＴ細胞を含むサンプルを、
（ｉ）本発明のペプチド；
（ｉｉ）本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸；および
（ｉｉｉ）該核酸を含む本発明の細胞または本発明のペプチドもしくはそのプロセシング産物を提示する本発明の細胞
の１以上と共にインキュベートすること；および
（ｂ）Ｔ細胞の特異的活性化を検出し、そこから該対象における免疫応答の有無を決定すること
を含み得る。
本発明は、対象における免疫応答を決定するための方法の上記側面において、対象において癌疾患を診断するための方法に関連し得る。
診断方法の一態様において、生物学的サンプルは、組織または臓器が無疾患であるとき、ＣＬＤＮ１８．２を細胞が実質的に発現しないような組織または臓器に由来する。
一般的に、生物学的サンプル中のＴ細胞のレベルを対照レベルと比較し、ここでは、該対照レベルからの逸脱が、対象における疾患の存在および／またはステージを示す。対照レベルは、対照サンプル（例えば健常組織または健常対象からのサンプル）において決定されるレベルであるか、または健常対象からの中央値レベルであり得る。該対照レベルからの“逸脱”は、少なくとも１０％、２０％、または３０％、好ましくは少なくとも４０％もしくは５０％、またはそれ以上の増加などの任意の有意な変化を示す。好ましくは、該生物学的サンプル中のＴ細胞の存在、または対照レベルと比較して増加している生物学的サンプル中のＴ細胞の量が、疾患の存在を示す。
Ｔ細胞は、患者の末梢血、リンパ節、組織サンプル、例えば生検および切除術によって得られるもの、または他の供給源から単離され得る。反応性アッセイは、初代Ｔ細胞または他の適当な誘導体で行うことができる。例えばＴ細胞を融合させてハイブリドーマを作製することができる。Ｔ細胞応答性を測定するためのアッセイは、当技術分野において知られており、これには、増殖アッセイおよびサイトカイン放出アッセイが含まれる。
反応性Ｔ細胞を検出するためのアッセイおよび指標には、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴの使用およびＩＦＮγ 細胞内サイトカイン染色が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞クローンが特定のペプチドに応答するかどうかを決定するための方法は、当技術分野では、他にも種々知られている。一般的には、ペプチドを、１～３日間に亘って、Ｔ細胞の懸濁液に添加する。Ｔ細胞の応答は、増殖、例えば標識チミジンの取り込みによって、またはサイトカイン、例えばＩＬ－２の放出によって、測定することができる。放出されたサイトカインの存在の検出には種々のアッセイを利用することができる。Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイは、抗原に対する特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を検出するために使用することができる。一態様において、細胞傷害性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩ分子を使って抗原を提示している標的Ｔ細胞を殺す能力について試験する。抗原を提示している標的Ｔ細胞を標識し、患者サンプルからのＴ細胞の懸濁液に添加することができる。細胞傷害性は、溶解された細胞からのラベルの放出を定量することによって測定することができる。自発的放出および総放出量に関する対照をアッセイに含めることができる。
本発明の一態様において、本明細書に記載の癌は、ＭＨＣ分子に関して、ＣＬＤＮ１８．２を発現する、および／またはＣＬＤＮ１８．２を提示する、癌細胞を含む。本発明の一態様において、罹患細胞は癌細胞である。一態様において、癌細胞などの罹患細胞は、ＭＨＣ分子に関して、ＣＬＤＮ１８．２を発現する、および／またはＣＬＤＮ１８．２を提示する細胞である。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の発現は、罹患細胞の表面上である。
本発明の一態様において、癌は、腺癌、特に進行した腺癌である。一態様において、癌は、胃癌、食道癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、胆嚢癌およびそれらの転移癌、クルーケンベルグ腫瘍、腹膜播種性転移および／またはリンパ節転移からなる群より選択される。一態様において、癌は、胃癌、食道癌、特に下部食道、食道胃接合部（eso－gastric junction）の癌および胃食道癌からなる群より選択される。一態様において、患者は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性患者またはＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性状態であるが、トラスツズマブ治療に適格ではない患者である。
本発明の一態様において、癌細胞は、胃癌、食道癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、胆嚢癌およびそれらの転移癌、クルーケンベルグ腫瘍、腹膜播種性転移および／またはリンパ節転移からなる群より選択される癌の癌細胞である。一態様において、癌細胞は、胃癌、食道癌、特に下部食道、食道胃接合部の癌および胃食道癌からなる群より選択される癌の癌細胞である。
本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明を下記で詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコールおよび反応剤（reagent）に限定されるものではなく、変更も可能である。また、本明細書で用いる用語は、特定の態様を説明するためのみ用いられるものであって、本発明の範囲を限定しようとするものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ規定される。他の定義がない限り、本明細書で用いる技術用語および科学用語は、当業者が一般的に理解している意味と同様の意味を有する。
下記に、本発明の構成要素を説明する。これらの要素は特定の態様と共に記載されているが、これらを任意の方法でおよび任意の数で組み合わせてさらなる態様を構成することも可能であることを理解されたい。各種実施例、および好ましい態様は、本発明を明示的に記載された態様に限定するものとして解釈されるべきではない。本説明は、明示的に記載された態様を、任意の数の開示要素および／または好ましい要素と組み合わせた態様を支持し、包含するものであると理解されるべきである。さらに、本願に記載されているすべての要素の変更および組み合わせは、文脈中に別段の記載がない限り、本願の記載により開示されると考えられるべきである。
好ましくは、本明細書で用いる用語は、“バイオテクノロジー用語の多言語用語集：（IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH－4010 Basel, Switzerlandに記載の通りに定義される。
本発明の実施には、特記しない限り、当該分野の文献に説明されている、生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術における常套法を採用するものとする（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照のこと）。
本明細書および特許請求の範囲を通じて、別途の記載がない限り、用語“～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”およびその変形表現（“～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”、“～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”）は、記載された要素（member）、整数、工程、または要素、整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他の要素、整数、工程、または要素、整数もしくは工程の群を排除するものではないことを意味すると理解されるが、ある態様において、他の要素、整数、工程、または要素、整数もしくは工程の群が排除されてもよく、すなわち、ある主題は、記載された要素、整数、工程、または要素、整数もしくは工程の群を包含してなる。本発明を説明する文脈中（とりわけ、特許請求の範囲の文脈において）用いられる用語“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”および類似の表現は、本明細書中他に特記されることなく、または明らかに文脈に矛盾するものでない限り、単数および複数の両方を網羅するものとして解釈する。本明細書中、数値範囲の列挙は、単に、その範囲内の個々の値を個別に参照する簡単な方法として役立つことを意図するものである。本明細書中、他に特記しない限り、個々の値は、本明細書中に個別に引用されるかのように本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書中他に特記しない限り、または明らかに文脈に矛盾するものでない限り、任意の相応の手順で実施することができる。本明細書に記載されている任意のおよびすべての例または例示表現（例えば、“～のような”）は、単に本発明をよりよく例示するにするためのものであって、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる文言も、本発明の実施に必須不可欠な特許請求の範囲に記載されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書には幾つかの文献を引用している。引用文献（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様、指示書などを含む）はそれぞれ、上記や下記を問わず、引用により本明細書にその内容全体を包含させる。本明細書中のいかなる文献も、本発明が先行発明の開示前になされていないことを容認するものと解釈されるべきではない。
本発明の文脈中、用語“組換え”は、“遺伝子工学によって作られた”ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈中、組換え細胞などの“組換え体”は、天然には存在しない。
本明細書で用いる用語“天然に存在する”は、対象物が天然にみられるという事実を意味する。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、天然の供給源から単離でき、実験室でヒトにより意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在するものである。
用語“免疫応答”は、抗原に対する統合された身体応答を意味し、好ましくは、細胞性免疫応答または細胞性ならびに体液性免疫応答を意味する。免疫応答は、保護／防御／予防および／または治療的であり得る。
“免疫応答を誘発する”とは、特定の抗原に対する免疫応答が誘導前には存在しなかったことを意味し得るが、ある特定の抗原に対する免疫応答が誘導前に一定レベルは存在し、誘導後は該免疫応答が強化されることも意味し得る。従って、“免疫応答を誘導する”には、“免疫応答を強化する”も包含される。好ましくは、対象における免疫応答を誘導した後は、該対象が、癌疾患などの疾患の発症から防御されるか、または免疫応答を誘導することによって該疾患状態が改善される。例えば、ウイルス性疾患を有する患者、またはウイルス性疾患を発症する危険がある対象において、hCMV－pp65などのウイルス抗原に対する免疫応答を誘導することができる。例えば、癌疾患を有する患者、または癌疾患を発症するリスクがある対象において、ＣＬＤＮ１８．２などの腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導することができる。この場合、免疫応答を誘導するとは、対象の疾患状態が改善されること、対象が転移を発症しないこと、または癌疾患を発症するリスクがある対象が癌疾患を発症しないことを意味し得る。
“細胞性免疫応答”、“細胞性応答”、“抗原に対する細胞性応答”または類似の用語は、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に向けられた細胞性応答を包含することを意味する。細胞性応答は、‘ヘルパー’または‘キラー’として作用するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関係する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞とも呼ばれる）は免疫応答を調節することによって中心的役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＴＬとも呼ばれる）は、癌細胞などの罹患細胞を死滅させ、さらなる罹患細胞の産生を防止する。
用語“抗原”は、免疫応答が産生されるべき、および／または指向されるエピトープを含む作用物質に関する。好ましくは、本発明との関連において抗原とは、場合によってはプロセシング後に、免疫反応（好ましくはその抗原、または該抗原を発現および／もしくは提示する細胞に特異的なもの）を誘導する分子である。抗原は、好ましくは、天然に存在する抗原に対応するか、またはそれに由来する生成物である。そのような天然に存在する抗原は、腫瘍関連抗原を含むか、または腫瘍関連抗原に由来し得る。
特に、抗原またはそのペプチドフラグメントは、Ｔ細胞受容体により認識可能であるべきである。好ましくは、抗原またはペプチドは、それがＴ細胞受容体によって認識されるとき、適当な共刺激シグナルの存在下で、その抗原またはペプチドを認識するＴ細胞受容体を保有するＴ細胞のクローン拡大を誘導することができる。本発明の態様に関連して、抗原は、好ましくは細胞によって、好ましくは抗原提示細胞および／または罹患細胞によって、ＭＨＣ分子との関連において提示され、それが、その抗原に対する免疫反応（または抗原を提示する細胞）をもたらし得る。
好ましい態様において、抗原は腫瘍関連抗原、すなわち、細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の構成要素、特に、細胞内で、好ましくは大量に産生されるか、または癌細胞上の表面抗原として産生される抗原である。
本発明の文脈中、用語“腫瘍関連抗原”または“腫瘍抗原”は、正常な状態では、限られた数の組織および／または臓器において、または特定の発生段階において、特異的に発現するタンパク質に関し、例えば腫瘍関連抗原は、正常な状態では、胃組織、好ましくは胃粘膜において、生殖器官、例えば精巣において、栄養芽層組織、例えば胎盤において、または生殖系列細胞において特異的に発現する場合があり、１以上の腫瘍組織または癌組織において、発現または異常発現される。この文脈において“限られた数”とは、好ましくは、３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明との関連において、腫瘍関連抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞タイプ特異的分化抗原、すなわち正常な状態では一定の分化段階にある一定の細胞タイプにおいて特異的に発現するタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常な状態では精巣および時には胎盤において特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原が含まれる。本発明との関連において、腫瘍関連抗原は、好ましくは、癌細胞の細胞表面に付随しており、好ましくは、正常組織では発現しないか、まれにしか発現しない。好ましくは、腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原の異常発現によって、癌細胞が同定される。本発明との関連において、対象、例えば癌に罹患している患者において癌細胞により発現される腫瘍関連抗原は、好ましくは、該対象における自己タンパク質である。好ましい態様において、本発明との関連において、腫瘍関連抗原は、正常な状態では、必須でない組織または臓器、すなわち免疫系による損傷を受けても、対象の死につながらない組織もしくは臓器において、または免疫系が到達できないかほとんど到達できない臓器もしくは身体構造において、特異的に発現する。好ましくは、腫瘍関連抗原のアミノ酸配列は、正常組織において発現する腫瘍関連抗原と癌組織において発現する腫瘍関連抗原との間で同一である。好ましくは、腫瘍関連抗原は、それを発現する癌細胞によって提示される。
本発明の種々の側面は、腫瘍関連抗原ＣＬＤＮ１８．２を伴い、本発明は、該腫瘍関連抗原を発現し、該腫瘍関連抗原をクラスＩ ＭＨＣと共に提示する、癌細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ反応の刺激または提供を含み得る。
クローディンは、密着結合部の最も重要な構成要素であるタンパク質ファミリーであり、そこで上皮の細胞間の細胞間空間における分子の流れを制御する傍細胞バリアを形成する。クローディンは、Ｎ末端およびＣ末端の両方が細胞質中に位置する、４回膜を貫通する膜貫通タンパク質である。ＥＣ１またはＥＣＬ１と呼ばれる第１の細胞外ループまたはドメインは、平均５３アミノ酸からなり、ＥＣ２またはＥＣＬ２と呼ばれる第２の細胞外ループまたはドメインは、約２４アミノ酸からなる。ＣＬＤＮ１８．２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質は、種々の起源の腫瘍において発現され、特に、その選択的発現（毒性関連正常組織で発現しない）および細胞膜への局在のために、抗体介在癌免疫療法に関連する標的構造として相応しい。
ＣＬＤＮ１８．２は、胃粘膜の分化上皮細胞における正常組織で選択的に発現する。ＣＬＤＮ１８．２は、膵臓癌、食道癌、胃癌、気管支癌、乳癌、およびＥＮＴ腫瘍などの種々の起源の癌で発現される。ＣＬＤＮ１８．２は、原発腫瘍、例えば胃癌、食道癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頸部癌および胆嚢癌、ならびにこれらの転移、その中でも特にクルーケンベルグ腫瘍、腹膜転移およびリンパ節転移などの胃癌転移に対する予防および／または処置のための重要なターゲットである。
本明細書で用いる用語“ＣＬＤＮ”は、クローディンを意味し、ＣＬＤＮ１８．２を含む。好ましくは、クローディンはヒトクローディンである。
用語“ＣＬＤＮ１８”は、クローディン１８に関連し、クローディン１８スプライス変異体１（クローディン１８．１（ＣＬＤＮ１８．１））およびクローディン１８スプライス変異体２（クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２））を含む任意の変異体を含む。
用語“ＣＬＤＮ１８．２”は、好ましくは、ヒトＣＬＤＮ１８．２に関連し、特に、配列表の配列番号１のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるタンパク質に関連する。ＣＬＤＮ１８．２の第１の細胞外ループまたはドメインは、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸２７～８１を含み、より好ましくは、アミノ酸２９～７８を含む。ＣＬＤＮ１８．２の第２の細胞外ループまたはドメインは、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１４０～１８０を含む。該第１および第２の細胞外ループまたはドメインは、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外部分またはドメインを形成する。
本発明による“変異体”という用語は、ミュータント（mutant）、スプライス変異体、立体配座（conformation）、アイソフォーム、アレル変異体、種変異体および種ホモログを意味し、特に天然に存在するものを意味する。アレル変異体は、遺伝子の正常配列の変形に関し、その意義は不明であることが多い。完全な遺伝子配列決定を行うと、所与の遺伝子について、しばしば、数多くのアレル変異体が同定される。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列の起源とは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。用語“変異体”は、翻訳後修飾された変異体および立体配座変異体を包含する。
本発明の種々の側面により、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２を発現し、好ましくはＣＬＤＮ１８．２の提示によって特徴付けられる癌細胞に対する免疫応答を誘導または決定すること、およびＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を伴う癌疾患を診断、処置または予防することが目的である。好ましくは、免疫応答は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する、好ましくはクラスＩ ＭＨＣと共にＣＬＤＮ１８．２を提示する、癌細胞に対する抗ＣＬＤＮ１８．２ ＣＴＬ応答の刺激を伴う。
本発明により、用語“ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌”または“ＣＬＤＮ１８．２陽性癌”は、好ましくは該癌細胞の表面上にＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞を含む癌を意味する。あるいは、またはさらに、該ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞は、ＭＨＣ分子に関連してＣＬＤＮ１８．２を提示する。ＭＨＣ分子に関連してＣＬＤＮ１８．２を提示する癌細胞は、Ｔ細胞受容体を担持する免疫反応性細胞によって標的化され得るが、一方、表面上にＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞は、人工Ｔ細胞受容体を担持する免疫反応性細胞によって標的化され得る。
“細胞表面”は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、従って、タンパク質および他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。
ＣＬＤＮ１８．２は、それが、細胞の表面に位置し、細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合にアクセス可能であれば、該細胞の表面上に発現される。
本発明の文脈中、用語“細胞外部分”または“細胞外ドメイン”は、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは該細胞の外部から、例えば該細胞の外部に位置する抗体などの抗原結合分子によりアクセス可能である、タンパク質などの分子の一部を意味する。好ましくは、この用語は、１以上の細胞外ループまたはドメインもしくはそのフラグメントを意味する。
用語“部分”は、断片（fraction）を意味する。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造に関して、その“部分”という用語は、該構造の連続的または不連続的断片を示し得る。好ましくは、アミノ酸配列の部分は、該アミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を含む。好ましくは、部分が不連続断片である場合、該不連続断片は、構造の２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上のパーツから構成され、各パーツはその構造の連続的要素である。例えば、アミノ酸配列の不連続断片は、該アミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８個またはそれ以上の、好ましくは４個以下のパーツから構成されることができ、ここで、各パーツは、好ましくは、該アミノ酸配列の少なくとも５個の連続アミノ酸、少なくとも１０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも２０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも３０個の連続アミノ酸を含む。
用語“パーツ（part）”および“フラグメント”は、本明細書では互換的に使用され、連続的要素を意味する。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造のパーツとは、該構造の連続的要素を意味する。ある構造の部分、パーツまたはフラグメントは、好ましくは、該構造の１以上の機能的特性を含む。例えば、エピトープ、ペプチドまたはタンパク質の部分、パーツまたはフラグメントは、好ましくは、それが由来するエピトープ、ペプチドまたはタンパク質と免疫学的に等価である。本発明との関連において、アミノ酸配列などの構造の“パーツ”は、好ましくは、その全体構造またはアミノ酸配列の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９4％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を含み、好ましくはそれらからなる。タンパク質配列のパーツまたはフラグメントは、好ましくは、少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、小なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続したアミノ酸の配列を含む。上記の部分、パーツまたはフラグメントは、本明細書において使用する“変異体”という用語に包含される。
本発明によれば、発現レベルが胃細胞または胃組織における発現と比較して低い場合、ＣＬＤＮ１８．２は、該細胞において実質的に発現されていない。好ましくは、発現レベルは、胃細胞または胃組織における発現の１０％未満、好ましくは５％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満または０．０５％未満、あるいはさらにそれ以下である。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが、胃以外の非癌組織における発現レベルを最大２倍、好ましくは１．５倍超え、好ましくは該非癌組織における発現レベルを超えない場合、細胞内で実質的に発現されていない。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが検出限界未満である場合、および／または発現レベルが細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合を可能にするには低すぎる場合、細胞において実質的に発現されていない。
本発明によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが胃以外の非癌組織における発現レベルが、好ましくは２倍以上、好ましくは１０倍以上、１００倍以上、１０００倍以上、または１００００倍以上である場合、該細胞において発現されている。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２は、発現レベルが検出限界を上回る場合、および／または発現レベルが細胞に添加されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体による結合を可能にするのに十分高い場合、細胞内で発現されている。好ましくは、細胞内で発現されるＣＬＤＮ１８．２は、該細胞の表面上に発現または露出されている。
“標的細胞”とは、細胞性免疫応答のような免疫応答のための標的の細胞を意味する。標的細胞には、抗原または抗原エピトープを提示する細胞、すなわち抗原に由来するペプチドフラグメントが含まれ、癌細胞のような、任意の望ましくない細胞が含まれる。好ましい態様においては、標的細胞は、好ましくは細胞表面に存在し、および／またはクラスＩ ＭＨＣ共に提示されるＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞である。
用語“エピトープ”は、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち、特にＭＨＣ分子との関連で提示されるとき、免疫系、例えば、特にＴ細胞によって認識される分子の一部またはフラグメントを意味する。腫瘍関連抗原などのタンパク質のエピトープは、好ましくは、該タンパク質の連続または不連続部分を含み、好ましくは５～１００、好ましくは５～５０、より好ましくは８～３０、最も好ましくは１０～２５のアミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。特に、本発明の文脈において、エピトープはＴ細胞エピトープであることが好ましい。
“エピトープ”、“抗原フラグメント”、“抗原ペプチド”または“免疫原性ペプチド”などの用語は、本明細書中、互換的に用いられ、好ましくは、抗原の不完全な表現であって、好ましくはその抗原またはその抗原を発現する細胞もしくはその抗原を含む細胞および好ましくはその抗原を提示する細胞に対する免疫応答を誘発し得るものに関する。好ましくは、これらの用語は、抗原の免疫原性部分に関する。好ましくは、これは抗原のうち、特にＭＨＣ分子との関連において提示された場合に、Ｔ細胞受容体によって認識される（すなわち特異的に結合される）部分である。一定の好ましい免疫原性部分は、細胞の表面上などのＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合し、従って、ＭＨＣ結合ペプチドである。本明細書で用いるペプチドは、そのような結合が当技術分野において知られている任意のアッセイを使って検出可能であるならば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子“に結合する”と言われる。
好ましくは、配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む本明細書に記載のペプチドは、免疫応答、好ましくはＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ１８．２の発現を特徴とする細胞（好ましくはＣＬＤＮ１８．２の提示を特徴とする細胞）に対する細胞応答を刺激する能力を有する。好ましくは、かかるペプチドは、クラスＩ ＭＨＣと共にＣＬＤＮ１８．２の提示を特徴とする細胞に対する細胞性応答を刺激する能力を有し、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２応答性ＣＴＬを刺激する能力を有する。好ましくは、本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、またはプロセシングを受けてＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドを生成することができる。好ましくは、ＭＨＣ分子に結合する配列は、配列番号２、３、４、５、６および７から選択される。
抗原ペプチドを直接的に、すなわちプロセシングを受けずに、特に切断されずに、提示させる場合、それは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ ＭＨＣ分子への結合に適した長さを有し、好ましくは７～２０アミノ酸長、より好ましくは７～１２アミノ酸長、より好ましくは８～１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、直接提示させる抗原ペプチドの配列は、配列番号２、３、４、５、６および７から選択される配列に実質的に対応し、好ましくはその配列と完全に同一である。
抗原ペプチドを、プロセシング後に、特に切断後に提示させる場合、プロセシングによって生成するペプチドは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ ＭＨＣ分子への結合に適した長さを有し、好ましくは７～２０アミノ酸長、より好ましくは７～１２アミノ酸長、より好ましくは８～１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、プロセシング後に提示させるペプチドの配列は、配列番号２、３、４、５、６および７から選択される配列に実質的に対応し、好ましくはその配列と完全に同一である。したがって、本発明の抗原ペプチドは、一態様において、配列番号２、３、４、５、６および７から選択される配列を含み、抗原ペプチドのプロセシング後に、配列番号２、３、４、５、６および７から選択される配列を構成する。
ＭＨＣ分子によって提示されるペプチドの配列に実質的に対応するアミノ酸配列を有するペプチドは、ＭＨＣによって提示されるペプチドのＴＣＲ認識にとって、またはＭＨＣへのペプチド結合にとって必須ではない１以上の残基が異なっていてもよい。そのような実質的に対応するペプチドは、好ましくは、抗原特異的ＣＴＬなどの抗原特異的細胞性応答を刺激する能力も有する。提示されるペプチドとのアミノ酸配列の相違が、ＴＣＲ認識には影響を及ぼさないがＭＨＣへの結合の安定性を改善する残基にあるペプチドは、抗原ペプチドの免疫原性を改善する場合があり、本明細書ではこれらを“最適化されたペプチド”と称する。これらの残基のうちどれがＭＨＣまたはＴＣＲへの結合に影響を及ぼす可能性が高いかに関する既存の知識を用いることで、実質的に対応するペプチドを設計するために、合理的なアプローチを使用することができる。結果として得られた機能的なペプチドは、抗原ペプチドであると考えられる。上で議論した配列は、本明細書において用いる用語“変異体”に包含される。
“抗原プロセシング”とは、細胞、好ましくは抗原提示細胞によって特異的Ｔ細胞に提示するための、抗原の、該抗原のフラグメントであるプロセシング産物への分解（例えばタンパク質の、ペプチドへの分解）およびこれらのフラグメントの１以上の（例えば、結合による）ＭＨＣ分子との結合を意味する。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、抗原を主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との関連においてその表面上に提示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、この複合体を認識し得る。抗原提示細胞は、抗原をプロセシングし、それらをＴ細胞に提示する。
プロフェッショナル抗原提示細胞は、極めて効率よく、貪食によって、または受容体介在性エンドサイトーシスによって、抗原を細胞内に取り込み、次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原のフラグメントを、その膜上に提示する。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原－ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を認識し、それと相互作用する。次に、追加の共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生産され、それがＴ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞の決定的特徴である。抗原提示細胞には、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞が含まれる。
プロフェッショナル抗原提示細胞の主なタイプは、抗原提示の範囲が最も広く、おそらく最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および特定の活性化上皮細胞である。
非プロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要なＭＨＣクラスＩＩタンパク質を構成的には発現せず、これらは、ＩＦＮγなどの特定のサイトカインによって非プロフェッショナル抗原提示細胞が刺激された時にのみ発現する。
樹状細胞（ＤＣ）は、末梢組織において捕捉された抗原をＭＨＣクラスＩＩ抗原提示経路およびＭＨＣクラスＩ抗原提示経路の両方によってＴ細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞が免疫応答の強力な誘導因子（inducer）であり、これらの細胞の活性化が、抗腫瘍免疫の誘導にとって重要なステップであることは、よく知られている。
樹状細胞およびその前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血または何らかの他の適切な組織もしくは体液から得ることができる。例えば、樹状細胞は、末梢血から収穫された単球の培養物にＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１３および／またはＴＮＦａなどのサイトカインの組合せを添加することによって、エクスビボで分化させることができる。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収穫されたＣＤ３４陽性細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンド、ならびに／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘導する他の化合物（複数可）の組合せを培養培地に添加することによって、樹状細胞に分化させてもよい。
樹状細胞は、便宜上、“未成熟”細胞と“成熟”細胞とに分類され、これを、２つの詳しく特徴づけられた表現型を見分ける簡便な方法として用いることができる。しかしながら、この命名を、可能性のある全ての分化の中間段階を排除するものであると解釈してはならない。
未成熟樹状細胞は、高い抗原取り込みおよびプロセシング能力（これはＦｃγ受容体およびマンノース受容体の高発現と相関する）を有する抗原提示細胞と特徴づけられる。成熟表現型は、一般的には、これらのマーカーの低発現と、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）および共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４－１ ＢＢ）などといったＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高発現とにより特徴付けられる。
樹状細胞成熟とは、その抗原提示樹状細胞がＴ細胞プライミングにつながるような樹状細胞活性化の状態を意味し、一方、未成熟樹状細胞による提示は免疫寛容をもたらす。樹状細胞成熟は、主として、自然免疫系受容体によって検出される微生物特徴を有する生体分子（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、エンドトキシンなど）、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面上のＣＤ４０のライゲーション、およびストレス性細胞死を起こしている細胞が放出する物質によって引き起こされる。樹状細胞は、骨髄細胞をインビトロで、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子アルファなどのサイトカイン類と共に培養することによって誘導することができる。
抗原提示細胞または標的細胞などの細胞には、細胞にペプチドを曝露、すなわちパルスすることによって、または提示されるべきペプチドもしくは提示されるべきペプチドを含むタンパク質をコードする核酸、好ましくはＲＮＡ、例えば抗原をコードする核酸を、細胞に形質導入することによって、ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを負荷することができる。
ある態様において、本発明の医薬組成物は、抗原ペプチドを負荷された抗原提示細胞を含む。この点において、プロトコールは、抗原ペプチドを人工的に提示するような形で操作された樹状細胞のインビトロでの培養／分化に依るものであり得る。遺伝子改変された樹状細胞の生産は、抗原または抗原ペプチドをコードする核酸の、樹状細胞への導入を伴いうる。ｍＲＮＡによる樹状細胞のトランスフェクションは、強い抗腫瘍免疫を刺激する有望な抗原負荷技術である。そのようなトランスフェクションはエクスビボで行うことができ、その場合は、そのようなトランスフェクト細胞を含む医薬組成物を治療目的に用いることができる。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビークルを患者に投与して、インビボでトランスフェクションを起こさせてもよい。樹状細胞のインビボおよびエクスビボでのトランスフェクションは、例えば、一般的に、当技術分野において知られている方法、例えばＷＯ９７／２４４４７に記載の方法、またはMahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456－460, 1997に記載されている遺伝子銃アプローチなどを使って行うことができる。樹状細胞の抗原負荷は、樹状細胞または前駆細胞を、抗原、ＤＮＡ（裸のＤＮＡまたはプラスミドベクター内のＤＮＡ）またはＲＮＡと共に、または抗原を発現する組換え細菌もしくはウイルス（例えばワクシニア、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター）と共にインキュベートすることによって達成することができる。
用語“免疫原性”は、免疫反応を誘導する抗原の相対的効率に関する。
本発明との関連において、用語“免疫エフェクター機能”は、免疫系の構成成分によって介在される機能であって、例えば腫瘍細胞の死滅をもたらすもの、または腫瘍の播種および転移の阻害を含む腫瘍成長の阻害および／または腫瘍発生の阻害をもたらすものが含まれる。好ましくは、本発明との関連において、免疫エフェクター機能は、Ｔ細胞が介在するエフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）の場合であれば、ＭＨＣクラスＩＩ分子との関連における抗原または抗原に由来する抗原ペプチドのＴ細胞受容体による認識、サイトカインの放出、ならびに／またはＣＤ８＋ リンパ球（ＣＴＬ）および／またはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合であれば、ＭＨＣクラスＩ分子との関連における抗原または抗原に由来する抗原ペプチドのＴ細胞受容体による認識、ＭＨＣクラスＩ分子との関連において提示された細胞の、すなわちクラスＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞の、例えばアポトーシスもしくはパーフォリン介在性細胞溶解による排除、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの生産、および抗原を提示する標的細胞の特異的な細胞溶解的死滅を含む。
本発明との関連において、用語“免疫反応性細胞”は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。“免疫反応性細胞”は、好ましくは、細胞の表面上に発現される抗原または抗原もしくは抗原に由来する抗原ペプチドの提示を特徴とする細胞に結合して、免疫応答に介在する能力を有する。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を殺し、抗体を分泌し、感染細胞またはがん性細胞を認識し、場合によってはそのような細胞を排除する。例えば免疫反応性細胞には、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。好ましくは、本発明との関連において、“免疫反応性細胞”は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
好ましくは、“免疫反応性細胞”は、抗原または抗原に由来する抗原ペプチドを、特にそれが抗原提示細胞または癌細胞などの罹患細胞の表面上などにＭＨＣ分子との関連において提示されている場合には、ある程度の特異性を持って認識する。好ましくは、該認識は、抗原または該抗原に由来する抗原ペプチドを認識する細胞が、応答性または反応性であることを可能にする。細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子との関連において抗原または抗原に由来する抗原ペプチドを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）である場合、かかる応答性または反応性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋ リンパ球（ＣＴＬ）および／またはＢ細胞の活性化を伴い得る。細胞がＣＴＬである場合、かかる応答性または反応性は、ＭＨＣクラスＩ分子との関連において提示された細胞、すなわちクラスＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞の、例えばアポトーシスまたはパーフォリン介在性細胞溶解などによる排除を伴い得る。本発明によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的カルシウム流束、細胞分裂、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの生産、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方制御、ならびに抗原発現標的細胞の特異的な細胞溶解的死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工的レポーターを用いて決定することもできる。抗原または抗原に由来する抗原ペプチドを認識し、応答性または反応性であるそのようなＣＴＬを、本明細書中、“抗原応答性ＣＴＬ”とも言う。細胞がＢ細胞である場合、かかる応答性は、免疫グロブリンの放出を伴い得る。
本発明によれば、用語“免疫反応性細胞”は、適当な刺激によって免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞、または細胞溶解性Ｔ細胞）へと成熟することができる細胞も包含する。免疫反応性細胞には、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未熟および成熟Ｔ細胞ならびに未熟および成熟Ｂ細胞が含まれる。抗原を認識する細胞溶解性細胞またはＴヘルパー細胞の生産が望まれるとき、免疫反応性細胞を、抗原または抗原ペプチドを提示している細胞と、細胞溶解性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞の生産、分化および／または選択に有利な条件下で接触させる。抗原に曝露された時のＴ細胞前駆体の、細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、免疫系のクローン選択と同様である。
“リンパ球様細胞”は、場合によっては好適な修飾後に、例えばＴ細胞受容体の移入後に、細胞性免疫応答などの免疫応答を生じる能力を有する細胞、またはそのような細胞の前駆細胞であり、これには、リンパ球、好ましくはＴリンパ球、リンパ芽球、および形質細胞が含まれる。リンパ球様細胞は、本明細書に記載の免疫反応性細胞であり得る。好ましいリンパ球様細胞は、Ｔ細胞受容体の内在性発現を欠き、細胞表面にそのようなＴ細胞受容体を発現するように修飾され得るＴ細胞である。
用語“Ｔ細胞”および“Ｔリンパ球”は、本明細書中、互換的に用いられ、これには、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）が含まれる。
Ｔ細胞は、リンパ球として知られている白血球細胞群に属し、細胞介在性免疫において中心的な役割を果たしている。これらは、その細胞表面上にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる特別な受容体が存在することで、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球タイプとは区別され得る。胸腺は、Ｔ細胞のＴ細胞成熟を担う主要臓器である。Ｔ細胞にはいくつかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが独特な機能を有している。
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程において、他の白血球細胞を支援する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋ Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されたＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されると、活性型になる。ひとたび活性化されると、それらは迅速に分裂し、能動免疫応答を調節または支援するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶とも関連付けられている。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋ Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、身体のほぼ全ての細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩと会合した抗原に結合することによって、その標的を認識する。
ほとんどのＴ細胞は、数個のタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、２つの別個のペプチド鎖から構成され、これらのペプチド鎖は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から生産され、α－ＴＣＲ鎖およびβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる。γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をその表面上に担持するＴ細胞の小さなサブセットを表す。ただし、γδＴ細胞では、ＴＣＲが１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成されている。このグループのＴ細胞は、αβＴ細胞よりも、はるかに少ない（全Ｔ細胞の２％）。
Ｔ細胞受容体の構造は、組み合わされた抗体アームの軽鎖および重鎖と定義される領域である、免疫グロブリンＦａｂフラグメントによく似ている。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、１つのＮ－末端可変（Ｖ）ドメイン、１つの定常（Ｃ）ドメイン、膜貫通／細胞膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質テールを有する。
本発明によれば、用語“Ｔ細胞受容体の可変領域”は、ＴＣＲ鎖の可変ドメインに関する。
ＴＣＲα鎖およびβ鎖の両方の可変ドメインは、どちらも３つの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するのに対し、β鎖の可変領域は、通常は抗原と接触せず、それゆえにＣＤＲとはみなされない、さらにもう１つの超可変性領域（ＨＶ４）を有している。ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識を担う主なＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１も、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、他方、β鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣを認識すると考えられている。β鎖のＣＤＲ４は、抗原認識に参加するとは考えられていないが、スーパー抗原と相互作用することが示されている。
本発明によれば、“ＣＤＲ配列の少なくとも１つ”という用語は、好ましくは、少なくともＣＤＲ３配列を意味する。“Ｔ細胞受容体鎖のＣＤＲ配列”という用語は、好ましくは、Ｔ細胞受容体のα鎖またはβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関する。
ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成している短い連結（connecting）配列からなり、２本の鎖の間の結合を形成している。
全てのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞から派生する。造血幹細胞に由来する造血前駆細胞は、胸腺に集合し、細胞分裂によって増殖して、未成熟胸腺細胞の大きな集団を作製する。最初期の胸腺細胞は、ＣＤ４もＣＤ８も発現せず、それゆえに二重陰性（ＣＤ４－ＣＤ８－）細胞と分類される。これらは、その発生が進むにつれて二重陽性胸腺細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）になり、最終的には単一陽性（ＣＤ４＋ＣＤ８－またはＣＤ４－ＣＤ８＋）胸腺細胞に成熟して、次いで、胸腺から末梢組織へと放出される。
Ｔ細胞の活性化における最初のシグナルは、別の細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示された短いペプチドへのＴ細胞受容体の結合によって与えられる。これが、そのペプチドに特異的なＴＣＲを有するＴ細胞だけが活性化されることを、保証する。パートナー細胞は、通常はプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ナイーブ応答の場合は、通常は樹状細胞であるが、Ｂ細胞およびマクロファージも重要なＡＰＣである。ＭＨＣクラスＩ分子によってＣＤ８＋ Ｔ細胞に提示されるペプチドは８～１０アミノ酸長であり；ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝（binding cleft）の末端は開いているので、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４＋ Ｔ細胞に提示されるペプチドはそれより長い。
Ｔ細胞は、一般的に、標準的な方法を用いて、インビトロまたはエクスビボで調製することができる。例えばＴ細胞は、市販の細胞分離システムを用いることで、患者などの哺乳動物の骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分内に存在し得る（またはそこから単離され得る）。あるいは、Ｔ細胞は、血縁関係にあるヒトもしくは血縁関係のないヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物に由来してもよい。“Ｔ細胞を含むサンプル”は、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。
Ｔ細胞は、抗原、ペプチド、核酸および／または抗原を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって刺激され得る。そのような刺激は、抗原、ペプチドおよび／または抗原もしくはペプチドを提示する細胞に特異的なＴ細胞を産生させるのに十分な条件下および十分な時間で、行われる。
ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の特異的活性化は、さまざまな方法で検出することができる。特異的Ｔ細胞活性化を検出するための方法には、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えば、リンフォカイン）の産生、または細胞溶解活性の生成を検出することが含まれる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の場合、特異的Ｔ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の場合、特異的Ｔ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、細胞溶解活性の生成の検出である。
ＣＤ８＋ Ｔ細胞株を産生させるために、抗原を産生する核酸をトランスフェクトした抗原提示細胞、好ましくは自己抗原提示細胞を、刺激細胞として使用することができる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖をコードするＲＮＡなどの核酸を、Ｔ細胞または溶解能を有する他の細胞などのリンパ球様細胞に導入することができる。好適な態様において、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を抗原特異的Ｔ細胞株からクローニングし、それらを養子Ｔ細胞療法に用いる。この点において、本発明は、本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ１８．２ペプチドに特異的なＴ細胞受容体を提供する。一般に、本発明のこの側面は、ＭＨＣとの関連において提示されたＣＬＤＮ１８．２ペプチドを認識するか、またはＣＬＤＮ１８．２ペプチドに結合するＴ細胞受容体に関する。Ｔ細胞受容体、例えば本発明により提供されるＴ細胞受容体のα鎖およびβ鎖をコードする核酸は、発現ベクターなどの別個の核酸分子上に含まれていてもよいし、あるいは単一の核酸分子であってもよい。したがって、用語“Ｔ細胞受容体をコードする核酸”とは、同じ核酸分子上の、または好ましくは異なる核酸分子上の、Ｔ細胞受容体鎖をコードする核酸分子に関する。
用語“ペプチドと反応する免疫反応性細胞”とは、それがペプチドを認識したとき、特にそのペプチドが、抗原提示細胞または癌細胞などの罹患細胞の表面上などに、ＭＨＣ分子との関連において提示されている場合、上記のような免疫反応性細胞のエフェクター機能を発揮する免疫反応性細胞に関する。
用語“ペプチドと反応するＴ細胞受容体”とは、免疫反応性細胞上に存在するとき、ペプチドを、特にそのペプチドが抗原提示細胞または癌細胞などの罹患細胞の表面上などに、ＭＨＣ分子との関連において提示されている場合、免疫反応性細胞が上記のような免疫反応性細胞のエフェクター機能を発揮するような形で認識する、Ｔ細胞受容体に関する。
用語“抗原反応性Ｔ細胞”または類似語は、抗原がＭＨＣ分子との関連において、例えば抗原提示細胞または癌細胞などの罹患細胞の表面上に提示されている場合、その抗原を認識し、上記のようなＴ細胞のエフェクター機能を発揮する、Ｔ細胞に関する。
用語“抗原特異的リンパ球様細胞”は、特に、抗原特異的Ｔ細胞受容体と共に供されたとき、その抗原を、ＭＨＣ分子との関連において、例えば抗原提示細胞または癌細胞などの罹患細胞の表面上に提示される場合、認識し、好ましくは上記のようなＴ細胞のエフェクター機能を発揮する、リンパ球様細胞に関する。Ｔ細胞および他のリンパ球様細胞は、その細胞が、抗原を発現するか、および／または抗原ペプチドを提示する標的細胞を殺す場合、その抗原に対して特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、さまざまな標準的技術のいずれかを用いて、例えばクロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、評価することができる。あるいは、リンフォカイン（インターフェロン－γなど）の合成を測定することもできる。
用語“主要組織適合遺伝子複合体”およびその略語“ＭＨＣ”には、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子が包含され、これは、全ての脊椎動物に見いだされる遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または罹患細胞との間のシグナル伝達にとって重要であり、ここでは、ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ分子がペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のために、それらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原（細胞自身に由来するペプチドフラグメント）と非自己抗原（例えば、侵入した微生物のフラグメント）をどちらも、Ｔ細胞に提示する。
ＭＨＣ領域は、３つのサブクラス、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分類される。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖およびβ２－ミクログロブリン（ＭＨＣの一部ではなく、１５番染色体によってコードされている）を含んでいる。これらは抗原フラグメントを細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。ほとんどの免疫系細胞において、特に抗原提示細胞において、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はα鎖およびβ鎖を含んでおり、これらは、抗原フラグメントをＴヘルパー細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、補体成分およびサイトカインをコードするものなど、他の免疫構成要素をコードしている。
ヒトでは、細胞表面上の抗原提示タンパク質をコードするＭＨＣ領域中の遺伝子が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれている。しかしながら、ＭＨＣという略語がＨＬＡ遺伝子産物を意味するために用いられることが多い。ＨＬＡ遺伝子には、９つのいわゆる古典的ＭＨＣ遺伝子が含まれる：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＡおよびＨＬＡ－ＤＲＢ１。
本発明の全ての側面の好ましい態様では、ＭＨＣ分子がＨＬＡ分子である。
“抗原の提示を特徴とする細胞”、“抗原を提示する細胞”、“細胞によって提示された抗原”、“提示された抗原”または類似の表現は、それが発現する抗原または該抗原に由来するフラグメントを、例えば抗原のプロセシングによるなどして、ＭＨＣ分子との関連において、特にＭＨＣクラスＩ分子との関連において、提示している癌細胞などの罹患細胞または抗原提示細胞などの細胞を意味する。同様に、用語“抗原の提示を特徴とする疾患”は、抗原の提示、特にクラスＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞が関与する疾患を表す。細胞による抗原の提示は、抗原をコードするＲＮＡなどの核酸を、その細胞にトランスフェクトすることによって達成することができる。
“提示される抗原のフラグメント”または類似の表現は、そのフラグメントが、例えば抗原提示細胞に直接添加されたとき、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示され得ることを意味する。一態様において、フラグメントは、抗原を発現する細胞によって自然に提示されるフラグメントである。
いくつかの治療法は、クラスＩ ＭＨＣと共に抗原を提示する罹患細胞の溶解をもたらす、患者の免疫系の反応に基づいている。これに関連して、例えば抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体に特異的な自己細胞傷害性Ｔリンパ球を、疾患を有する患者に投与することができる。インビトロでのそのような細胞傷害性Ｔリンパ球の生産は知られている。Ｔ細胞を分化させる方法の一例は、ＷＯ－Ａ－９６３３２６５に見いだすことができる。一般的には、血球などの細胞を含むサンプルを患者から採取し、それらの細胞を、前記複合体を提示し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を引き起こし得る細胞（例えば、樹状細胞）と接触させる。標的細胞はＣＯＳ細胞などのトランスフェクト細胞であり得る。これらのトランスフェクト細胞は、その表面上に所望の複合体を提示し、細胞傷害性Ｔリンパ球と接触させたとき、その増殖を刺激する。次に、クローン増殖された自己細胞傷害性Ｔリンパ球を患者に投与する。
細胞傷害性Ｔリンパ球を選択するための別の方法では、細胞傷害性Ｔリンパ球の特異的クローンを得るために、ＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド複合体の蛍光性テトラマーを使用する（Altman et al.(1996), Science 274:94－96; Dunbar et al. (1998), Curr. Biol. 8:413－416, 1998）。
さらにまた、所望の複合体を提示する細胞（例えば、樹状細胞）を、高い親和性を有する特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖をもたらし得る健常個体または他の種（例えば、マウス）の細胞傷害性Ｔリンパ球と組み合わせることもできる。これら増殖された特異的Ｔリンパ球の高親和性Ｔ細胞受容体をクローニングして、場合によってはさまざまな程度にヒト化し、そうして得られたＴ細胞受容体を、次に、遺伝子移入によって、例えばレトロウイルスベクターを用いて、患者のＴ細胞に形質導入する。次に、これらの遺伝子改変Ｔリンパ球を用いて、養子移入を行うことができる（Stanislawski et al.(2001), Nat Immunol. 2:962－70; Kessels et al. (2001), Nat Immunol. 2:957－61）。
細胞傷害性Ｔリンパ球は、それ自体公知の方法により、インビボで作製可能である。一つの方法では、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を発現する非増殖性細胞を用いる。本発明で用いる細胞は、通常複合体を発現するもの、例えば照射された腫瘍細胞であるか、または複合体（すなわち、抗原性ペプチドおよび提示ＭＨＣ分子）の提示に必要な遺伝子の一方もしくは両方がトランスフェクトされた細胞であり得る。別の好ましい形態は、例えばリポソーム移入またはエレクトロポレーションなどによって細胞中に導入することができる組換えＲＮＡの形態の抗原の導入である。その結果得られる細胞は、目的の複合体を提示し、自己細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され、次いでその自己細胞傷害性Ｔリンパ球が増殖する。
同様の効果は、抗原または抗原ペプチドを、インビボでの抗原提示細胞への組込みを可能にするために、アジュバントと組み合わせることによって達成することができる。抗原または抗原ペプチドは、タンパク質、ＤＮＡ（例えばベクター内にあるもの）、またはＲＮＡとして表すことができる。抗原はプロセシングされることでＭＨＣ分子のペプチドパートナーを産生し得るが、そのフラグメントは、さらなるプロセシングを受ける必要なく、提示され得る。後者は、これらがＭＨＣ分子に結合することができる場合には、特にそうである。完全な抗原が樹状細胞によってインビボでプロセシングされるような投与形態は、これが、効果的な免疫応答に必要なＴヘルパー細胞応答も生じ得るために、好ましい（Ossendorp et al., Immunol Lett. (2000), 74:75－9; Ossendorp et al. (1998), J. Exp. Med. 187:693－702）。一般的には、有効量の腫瘍関連抗原を、例えば皮内注射によって患者に投与することができる。しかし、注射をリンパ節に節内的に行うこともできる（Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299－303）。
本発明によれば、用語“人工Ｔ細胞受容体”は、用語“キメラＴ細胞受容体”および“キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）”と同義である。
これらの用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞へのモノクローナル抗体の特異性のような任意の特異性を与える、操作された受容体に関する。このようにして、養子細胞移入のために多数の癌特異的Ｔ細胞を産生することができる。従って、人工Ｔ細胞受容体は、例えばＴ細胞の自身のＴ細胞受容体の代わりに、またはそれに加えて、Ｔ細胞上に存在してよい。そのようなＴ細胞は、標的細胞の認識のための抗原のプロセシングおよび提示を必ずしも必要とせず、好ましくは標的細胞上に存在する任意の抗原を特異的に認識することができる。好ましくは、該人工Ｔ細胞受容体は、細胞の表面上に発現される。本発明の目的のために、人工Ｔ細胞受容体を含むＴ細胞は、本明細書で用いる用語“Ｔ細胞”に包含される。
一態様において、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、ＣＤ３－ζ膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合させる。そのような分子は、標的細胞上のその抗原標的のｓｃＦｖによる認識に応答してゼータシグナルの伝達をもたらし、標的抗原を発現する標的細胞の死滅をもたらす。用いられ得る抗原認識ドメインには、とりわけ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよびβ単鎖が含まれる。実際に、高親和性で所与の標的に結合するほとんどのものは、抗原認識ドメインとして使用することができる。
抗原認識に続いて、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。この点において、“Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン”は、抗原が結合された後にＴ細胞へ活性化シグナルを伝達するドメイン、好ましくは細胞内ドメインである。最も一般的に使用される細胞内ドメイン成分は、ＣＤ３－ζである。
キメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ－操作されたＴ細胞を用いる養子細胞移植療法は、ＣＡＲ修飾されたＴ細胞が事実上あらゆる腫瘍抗原を標的とするように操作され得ることから、有望な抗腫瘍治療薬である。例えば、患者のＴ細胞は、患者の腫瘍細胞上の抗原に対して特異的に指向されたＣＡＲを発現するように遺伝子操作され、次いで、患者に注入され得る。
本発明によれば、人工Ｔ細胞受容体は、上記のようなＴ細胞受容体の機能を置き換えることができ、特に、細胞溶解活性のような反応性を上記のようにＴ細胞などの細胞に与えることができる。しかしながら、上記のようなＴ細胞受容体の抗原ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合とは対照的に、人工Ｔ細胞受容体は、抗原、特に細胞表面上に発現される抗原に結合し得る。
Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３－ζ鎖は、ヒトにおいて、ＣＤ２４７遺伝子によってコードされているタンパク質である。ＣＤ３－ζと、Ｔ細胞受容体α／βおよびγ／δヘテロ二量体ならびにＣＤ３－γ、－δおよび－εは共に、Ｔ細胞受容体－ＣＤ３複合体を形成する。ζ鎖は、抗原認識をいくつかの細胞内シグナル伝達経路と組み合わせるのに重要な役割を果たす。用語“ＣＤ３－ζ”は、好ましくは、ヒトＣＤ３－ζに関し、特に、配列表の配列番号４０のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるタンパク質に関する。
ＣＤ２８（分化に関するクラスター群（Cluster of Differentiation）２８）は、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを提供するＴ細胞上に発現される分子の１つである。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の受容体である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８による刺激は、種々のインターロイキン（特に、ＩＬ－６）の産生のためにＴ細胞への強力な共刺激シグナルを提供することができる。用語“ＣＤ２８”は、好ましくは、ヒトＣＤ２８に関し、特に、配列表の配列番号３９のアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるタンパク質に関する。
本発明によれば、ＣＡＲは、一般的に、３つのドメインを含み得る。
第１のドメインは、ＣＬＤＮ１８．２を認識し、結合する結合ドメインである。
第２のドメインは、共刺激ドメインである。共刺激ドメインは、標的部分へのＣＡＲの結合の際に細胞傷害性リンパ球の増殖および生存を増強するために働く。共刺激ドメインの同一性は、それがＣＡＲによる標的部分の結合の際に細胞増殖および生存を増強する能力を有する点でのみ制限される。好適な共刺激ドメインには、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバー、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＴＮＦＲ－受容体のスーパーファミリーのメンバー、およびＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、活性化Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８－スーパーファミリー共刺激分子が含まれる。当業者は、本発明に悪影響を及ぼすことなく、これらの特記された共刺激ドメインの配列変異体を用いることができ、ここで、該変異体は、それらがモデル化されるドメインと同じか、または同様の活性を有することを理解し得る。このような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有し得る。本発明のいくつかの態様において、ＣＡＲ構築物は、２つの共刺激ドメインを含む。特定の組み合わせは、４つの記載されたドメインの全ての可能性のある変形を含むが、特定の例には、ＣＤ２８＋ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）およびＣＤ２８＋ＣＤ１３４（ＯＸ４０）が含まれる。
第３のドメインは、活性化シグナル伝達ドメイン（または、Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン）である。活性化シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲのＣＬＤＮ１８．２への結合の際に細胞傷害性リンパ球を活性化する働きをする。活性化シグナル伝達ドメインの同一性は、それがＣＡＲによるＣＬＤＮ１８．２の結合の際に、選択された細胞傷害性リンパ球の活性化を誘導する能力を有する点でのみ制限される。好適な活性化シグナル伝達ドメインには、Ｔ細胞ＣＤ３［ζ］鎖およびＦｃ受容体［γ］が含まれる。当業者は、本発明に悪影響を及ぼすことなく、これらの記載された活性化シグナル伝達ドメインの配列変異体を用いることができ、ここで、該変異体が、それらがモデル化されるドメインと同じか、または同様の活性を有することを理解し得る。このような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有し得る。
本発明のＣＡＲは、３つのドメインを、融合タンパク質の形態で含み得る。かかる融合タンパク質は、一般的に、Ｎ末端からＣ末端方向に連結された、結合ドメイン、１以上の共刺激ドメイン、および活性化シグナル伝達ドメインを含み得る。しかしながら、本発明のＣＡＲは、この配置に限定されず、他の配置も許容可能であり、結合ドメイン、活性化シグナル伝達ドメイン、および１以上の共刺激ドメインを含む。結合ドメインがＣＬＤＮ１８．２に結合するために自由でなければならないため、融合タンパク質における結合ドメインの配置は、一般的に、細胞の外部上の領域のディスプレイが達成されるようなものであり得ることが理解され得る。同様に、共刺激および活性化シグナル伝達ドメインは、細胞傷害性リンパ球の活性および増殖を誘導するのに働くため、融合タンパク質は、一般的に、細胞の内部にこれら２つのドメインをディスプレイする。ＣＡＲは、融合タンパク質の細胞表面への適切な輸送を確実にするシグナルペプチド、融合タンパク質タンパク質が完全な膜タンパク質として維持されることを確実にする膜貫通ドメイン、および結合ドメイン柔軟性を与え、かつＣＬＤＮ１８．２への強力な結合を可能にするヒンジドメイン（またはスペーサー領域）などの、さらなるエレメントを含んでいてよい。
本発明のＣＡＲシステムに関連して用いられる細胞は、好ましくはＴ細胞、特に好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される、細胞傷害性リンパ球である。活性化すると、これらの細胞傷害性リンパ球の各々が標的細胞の破壊を誘発する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、以下の手段のいずれかまたは両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。第１に、活性化すると、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンなどの細胞毒素を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは、標的細胞に孔を形成し、グランザイムは細胞に入り、そして細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する細胞質におけるカスパーゼカスケードを誘導する。第２に、Ｔ細胞と標的腫瘍細胞との間のＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介してアポトーシスを誘導することができる。細胞傷害性リンパ球は、好ましくは自己細胞であるが、異種細胞または同種細胞を用いることもできる。
本発明によれば、対照サンプルまたは対照生物などの“対照”は、ある試験サンプルまたは試験生物から、本発明の方法において得られた結果を相関させ、比較するために用いることができる。一般的には、対照生物は健常生物、特に癌疾患などの疾患を罹患していない生物である。“対照値”または“対照レベル”は、十分に多数の対照を測定することにより、対照から実験的に決定することができる。好ましくは、対照値は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、好ましくは少なくとも５０、または好ましくは少なくとも１００個の対照を測定することによって決定される。
本発明によれば、用語“結合剤”には、標的に対する結合能力を有する全ての化合物が包含される。好ましくは、そのような結合剤は、標的に対する少なくとも１つの結合ドメインを含む。この用語には、ナノボディ、アフィボディー、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、ノボディー、アビマー、および微生物を含むが、これらに限定されない標的に対する結合能力を有する、抗体および抗体フラグメント、二重特異性または多重特異性分子、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ならびに全ての人工結合分子（足場）などの分子が含まれる。一態様において、該結合は特異的結合である。
用語“免疫グロブリン”は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗体またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）などの抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインを特徴とする。この用語は、膜結合型免疫グロブリン、ならびに可溶性免疫グロブリンを包含する。膜結合型免疫グロブリンは、表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンとも呼ばれ、一般的にはＢＣＲの一部である。可溶性免疫グロブリンは、一般的に抗体と呼ばれる。免疫グロブリンは一般的に、数本の鎖、一般的には、ジスルフィド結合によって連結された２本の同一な重鎖と２本の同一な軽鎖とを含む。これらの鎖は、主として、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン、ＣＬ（定常軽鎖）ドメイン、ならびにＣＨ（定常重鎖）ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４などの免疫グロブリンドメインから構成される。哺乳動物免疫グロブリン重鎖には５つのタイプ、すなわちα、δ、ε、γ、およびμがあり、これらは、異なる抗体クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを構成する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜または表面免疫グロブリンの重鎖は、膜貫通ドメインと、そのカルボキシ末端にある短い細胞質ドメインとを含む。哺乳動物では、２タイプの軽鎖、すなわちラムダおよびカッパがある。免疫グロブリン鎖は可変領域と定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ（ここでは、可変部分が高度に多様であり、抗原認識を構成する）内で、本質的に保存されている。
用語“抗体”は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を意味する。用語“抗体”には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中、ＶＨと略す）と重鎖定常領域とから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中、ＶＬと略す）と軽鎖定常領域とから構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域と、それらの間に挿入された、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域とに、さらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序で配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。
本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”は、単一分子組成の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体は、単一の結合特異性および親和性を示す。一態様において、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、例えばマウスのような非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
本明細書で用いる用語“組換え抗体”には、以下のような、組換え手段によって調製、発現、生成もしくは単離されたすべての抗体が含まれる：（ａ）免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマに対してトランスジェニックまたはトランス染色体の、動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）当該抗体を発現するように、例えばトランスフェクトーマから形質転換された、宿主細胞から単離された抗体、（ｃ）組換え抗体ライブラリー、コンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う他の手段によって調製、発現、生成、単離された抗体。
本明細書で用いる用語“ヒト抗体”は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものを意図する。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムに、もしくは部位特異的に導入された変異、またはインビボでの体細胞変異により同導入された変異）を含んでもよい。
用語“ヒト化抗体”は、実質的に非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子を意味し、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメイン、または、可変ドメイン内の好適なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれであってもよい。抗原結合部位は、野生型であるか、または１以上のアミノ酸置換によって修飾されていてもよく、例えば、よりヒト免疫グロブリンに類似するように修飾されていてよい。ヒト化抗体のいくつかの形態は、すべてのＣＤＲ配列を保持する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲをすべて含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の抗体に対して変更された１以上のＣＤＲを有している。
用語“キメラ抗体”は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が、特定の種に由来するか、または特定のクラスに属する抗体の対応する配列に相同であるが、一方、前記鎖の残りのセグメントは、別の対応する配列に相同である、それらの抗体を意味する。一般的に、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、１つの哺乳動物種に由来する抗体の可変領域と類似しており、一方、定常部分は別の種に由来する抗体の配列と相同である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、可変領域が、非ヒト宿主生物から容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いて、例えばヒト細胞調製物等に由来する定常領域と組み合わせて容易に現在公知の供給源に由来することができることである。一方、可変領域は調製の容易さという利点を有し、特異性は供給源によって影響されないが、ヒトの定常領域である場合、非ヒト供給源からの定常領域であるときより、抗体が注入されるときに、ヒト対象から免疫反応を誘導されにくい。しかし、定義はこの特定の例に限定されない。
抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトなどの異なる種に由来してもよいが、これらに限定されない。
本明細書に記載の抗体には、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤ抗体が含まれる。種々の態様において、抗体はＩｇＧ１抗体であり、より具体的には、ＩｇＧ１、κまたはＩｇＧ１、λアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えば、ＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えば、ＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えば、ＩｇＧ３、κ、λ）、またはＩｇＧ４抗体（例えば、ＩｇＧ４、κ、λ）である。
本明細書に記載の抗体は、好ましくは単離されている。本明細書で用いる“単離抗体”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図する（例えば、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離抗体は、ＣＬＤＮ１８．２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＬＤＮ１８．２のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離抗体は、例えば、他の種（例えば、ＣＬＤＮ１８．２種の相同体）由来の他の関連抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まなくてよい。本発明の一態様において、“単離された”モノクローナル抗体の組合せは、異なる特異性を有し、明確に定義された組成物または混合物中に組み合わされる抗体に関する。
用語、抗体の“抗原結合部分”（もしくは、単に“結合部分”）または抗体の“抗原結合フラグメント”（もしくは、単に“結合フラグメント”）または類似の用語は、抗原に特異的に結合する能力を有する１以上の抗体のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより行われることができることが示されてきた。抗体の“抗原結合部分”という用語内に、結合フラグメントを含む例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341: 544－546)；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）必要に応じて合成リンカーにより連結されてもよい２つ以上の単離したＣＤＲの組み合わせ、を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、ＶＬおよびＶＨ領域が組み合わさって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することができる合成リンカーにより、組換え法を用いて連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423－426; および、 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879－5883を参照のこと）。このような一本鎖抗体も、抗体の“抗原結合フラグメント”という用語に含まれるものとする。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合される結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）前記ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であってもよい。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、更に、ＵＳ２００３／０１１８５９２およびＵＳ２００３／０１３３９３９に開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、フラグメントは無傷抗体と同一の方法により有用性についてスクリーニングされる。
本発明によれば、用語“ＣＬＤＮ１８．２に対する結合ドメイン”には、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２抗体、すなわち、ＣＬＤＮ１８．２対して向けられた抗体、好ましくはＣＬＤＮ１８．２に特異的である抗体の、抗原結合部分が含まれ、好ましくはそれに関する。
用語“結合ドメイン”は、本発明に関連して、所与の標的構造／抗原／エピトープに結合／相互作用する抗体の構造を特徴づける。したがって、本発明による結合ドメインは、“抗原－相互作用部位”を示す。
本発明の目的のための本明細書に記載の抗体および抗体フラグメントなどの抗体の誘導体は、用語“抗体”に包含される。
抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、種々の技術によって産生することができる。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えば、Ｂ－リンパ球のウイルス性または発癌性形質転換あるいは抗体遺伝子のライブラリーを用いたファージディスプレイ技術を用いることができる。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された方法である。融合用の免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコールおよび技術は、当該分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた知られている。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための他の好ましい動物はラットおよびウサギ系である（例えば、Spieker－Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), see also Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)に記載)。
抗体を産生するために、マウスを、記載の通りに、担体に結合した抗原配列に由来するペプチド、すなわち、抗体が指向される配列、組換え的に発現した抗原またはそのフラグメントの濃縮調製物、および／または、抗原を発現する細胞で免疫化することができる。あるいは、マウスを、抗原またはそのフラグメントをコードするＤＮＡで免疫化することができる。抗原の精製もしくは濃縮調製物を用いた免疫化によっても抗体が生じない場合、マウスは、免疫応答を促進するために、抗原を発現する細胞、例えば細胞株で免疫化することもできる。
免疫反応を、尾静脈または後眼窩採血によって得られる血漿および血清サンプルについて、免疫化プロトコールの過程に亘って観察することができる。免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合のために用いることができる。特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を高めるため、マウスに対し、屠殺し、脾臓を摘出する３日前に、抗原発現細胞を腹腔内または静脈内にブーストさせることができる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを産生するために、免疫化したマウスから得られた脾臓細胞およびリンパ節細胞を、単離し、マウス骨髄腫細胞株のような適当な不死化細胞株と融合することができる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生のためにスクリーニングすることができる。次いで、個々のウェルを抗体分泌ハイブリドーマ用のＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。抗原発現細胞を用いた免疫蛍光法およびＦＡＣＳ分析によって、抗原に対する特異性を有する抗体を同定することができる。抗体分泌ハイブリドーマを、再配置して、再スクリーニングすることができ、仮に、モノクローナル抗体に対してまだ陽性である場合、限界希釈によってサブクローニングすることができる。そして、安定なサブクローンを、特徴付け用の組織培養培地中でインビトロで培養し、抗体を産生することができる。
抗体および他の結合剤の抗原を結合する能力を、標準結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫蛍光およびフローサイトメトリー分析）を用いて決定することができる。
抗体および抗体の誘導体は、抗体フラグメントなどの結合ドメインを提供するために、特にＶＬおよびＶＨ領域を提供するために、有用である。
人工Ｔ細胞受容体内に存在し得るＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有し、すなわち、ＣＬＤＮ１８．２中に存在するエピトープ、好ましくはＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメイン内に位置するエピトープ、特に第１の細胞外ループ、好ましくはＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸位置２９～７８に位置するエピトープに結合する能力を有する。特定の態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．１条に存在しない、ＣＬＤＮ１８．２上のエピトープに結合する。最も好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．２以外のＣＬＤＮタンパク質上に存在しない、ＣＬＤＮ１８．２上のエピトープに結合する。
ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、好ましくはＣＬＤＮ１８．２に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１には結合しない。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、ＣＬＤＮ１８．２に特異的である。好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１８．２に結合する。特に好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、生細胞の表面上に存在するＣＬＤＮ１８．２の天然エピトープに結合する。
好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群より選択されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
特定の好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、以下の可能性のある（ｉ）～（ｉｘ）より選択される重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の組合せを含む：
（ｉ）ＶＨが、配列番号２０のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号２７のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む、
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号２１のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号２６のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む、
（ｉｉｉ）ＶＨが、配列番号２２のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号２８のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む、
（ｉｖ）ＶＨが、配列番号２４のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号３１のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む、
（ｖ）ＶＨが、配列番号２３のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号３０のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む、
（ｖｉ）ＶＨが、配列番号２５のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号２９のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉ）ＶＨが、配列番号２５のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号３２のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む、
（ｖｉｉｉ）ＶＨが、配列番号２５のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号３３のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む、
（ｉｘ）ＶＨが、配列番号２５のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号３４のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む。
特に好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の以下の組合せを含む：
ＶＨが、配列番号２３のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号３０もしくはそのフラグメントを含む。
さらに特に好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の以下の組合せを含む：
ＶＨが配列番号２１のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含み、ＶＬが、配列番号２６のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む。
好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、（ｉ）以下の配列：ＴＲＳＷＲＧＮＳＦＤＹ、を含むＣＤＲ３を含むＶＨ、および／または（ｉｉ）以下の配列：ＱＮＤＹＳＹＰＦＴ、を含むＣＤＲ３を含むＶＬ、を含む。
好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、
（ｉ）以下の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のセットを含むＶＨ：
ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＷ、ＣＤＲ２：ＩＹＰＳＤＳＹＴ、ＣＤＲ３：ＴＲＳＷＲＧＮＳＦＤＹ
および／または
（ｉｉ）以下の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のセットを含むＶＬ：
ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹ、ＣＤＲ２：ＷＡＳ、ＣＤＲ３：ＱＮＤＹＳＹＰＦＴ
を含む。
好ましい態様において、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、以下の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のセットをそれぞれ含むＶＨおよびＶＬの組合せを含む：
ＶＨ：ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＷ、ＣＤＲ２：ＩＹＰＳＤＳＹＴ、ＣＤＲ３：ＴＲＳＷＲＧＮＳＦＤＹ、ＶＬ：ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹ、ＣＤＲ２：ＷＡＳ、ＣＤＲ３：ＱＮＤＹＳＹＰＦＴ。
好ましくは、本明細書に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の組合せは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）に配置される。
用語“フラグメント”は、特に、１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を意味し、好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）の少なくともＣＤＲ３可変領域および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の少なくともＣＤＲ３可変領域である。一態様において、該１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のセットから選択される。特に好ましい態様において、用語“フラグメント”は、重鎖可変領域（ＶＨ）の、および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）の、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を意味する。
一態様において、本明細書に記載の１以上のＣＤＲ、ＣＤＲのセットまたはＣＤＲのセットの組み合わせを含むＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、それらの間のフレームワーク領域と共に該ＣＤＲを含む。好ましくは、その部分はまた、第１および第４のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み、該５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端の５０％および第４のフレームワーク領域のＮ末端の５０％である。組換えＤＮＡ技術によって作製された結合剤の構築は、本発明の可変領域を、免疫グロブリン重鎖、他の可変ドメイン（例えば、二重特異性抗体の産生において）またはタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に結合するためのリンカーの導入を含む、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されたリンカーによってコードされる可変領域へのＮ末端またはＣ末端残基の導入をもたらし得る。
一態様において、本明細書に記載の１以上のＣＤＲ、ＣＤＲのセットまたはＣＤＲのセットの組合せを含むＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、ヒト抗体フレームワーク中に該ＣＤＲを含む。
一態様において、本発明のＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインは、明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２の結合ドメイン（本明細書に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の組合せを含む抗体など）と同じか、または実質的に同じエピトープを認識する、すなわちそれに結合する、および／またはＣＬＤＮ１８．２との結合について該ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインと競合する、ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインに関する。
本発明による用語“結合”は、好ましくは、特異的結合に関する。
本発明によると、Ｔ細胞受容体または抗体などの作用物質は、所定の標的に対する有意な親和性を有し、標準アッセイにより該所定の標的に結合する場合、当該所定の標的に結合することができる。多くの場合、“親和性”または“結合親和性”は、平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される。好ましくは、“有意な親和性”という用語は、１０－５Ｍ以下、１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、１０－１１Ｍ以下、または１０－１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で所定の標的に結合することを意味する。
作用物質は、標的に対して有意な親和性を有しておらず、有意に結合しておらず、特に、標準アッセイで該標的を検出可能に結合しない場合、（実質的に）標的に結合しない。好ましくは、作用物質は、濃度が２μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２０μｇ／ｍｌ以上、特に５０μｇ／ｍｌ以上または１００μｇ／ｍｌ以上で存在する場合、該標的に検出可能に結合しない。好ましくは、作用物質は、それが結合できる所定の標的に対して結合するためのＫＤより少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、または１０６倍大きいＫＤで当該標的に結合する場合は、標的に対する有意な親和性を有さない。例えば、作用物質が結合できる標的に結合するためのＫＤが、１０－７Ｍであれば、有意な親和性を有さない抗体を標的に結合するためのＫＤは、少なくとも１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍ、１０－３Ｍ、１０－２Ｍ、または１０－１Ｍであり得る。
作用物質は、それが他の標的に（実質的に）結合することができなくても、すなわち、それが他の標的に対する有意な親和性を有しておらず、標準アッセイにより有意に他の標的に結合しなくても、それが該所定の標的に結合することが可能である場合、所定の標的に対して特異的である。本発明によると、作用物質は、それがＣＬＤＮ１８．２に結合することは可能であるが、他の標的に（実質的に）結合することは可能でない場合、ＣＬＤＮ１８．２に対して特異的である。好ましくは、作用物質は、他の標的に対する親和性および結合性が、ＣＬＤＮ１８．２に無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＭＨＣ分子もしくはトランスフェリン受容体もしくは他の任意の特定のポリペプチドなどの非クローディン膜貫通タンパク質に対する親和性または結合性を有意に超えない場合は、ＣＬＤＮ１８．２に対して特異的である。好ましくは、作用物質は、それが標的に非特異的標的に結合するためのＫＤより少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、または１０６倍低いＫＤで当該標的に結合する場合、所定の標的に対して特異的である。例えば、特異的標的への抗体の結合のためのＫＤが１０－７Ｍである場合、非特異的標的に結合するためのＫＤは、少なくとも１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍ、１０－３Ｍ、１０－２Ｍ、または１０－１Ｍである。
標的に対する作用物質の結合は、好適な方法により実験的に決定することができる：例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの、基本免疫学における“抗体－抗原相互作用”、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．編、Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)、および本明細書に記載の方法を参照のこと。親和性は、例えば、平衡透析法によるか、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置を用いて製造者により概説された一般手順を用いることによるか、放射性標識された標的抗原を用いた放射免疫測定法によるか、または当業者に知られている別の方法により、従来の技術を用いて容易に決定することができる。親和性データは、例えば、Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949）の方法によって分析することができる。測定された特定の抗体－抗原相互作用の親和性は、異なる条件下、例えば、塩濃度、ｐＨなどで測定した場合は変化し得る。従って、親和性および他の抗原結合パラメーター、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０の測定は、好ましくは、抗体および抗原の標準化溶液、および標準化された緩衝液を用いて行われる。
本明細書に記載のペプチドおよびタンパク質作用物質は、インビトロまたはインビボで、該作用物質をコードするＲＮＡなどの核酸の形態および／または該作用物質をコードするＲＮＡなどの核酸を含む宿主細胞の形態で提供される得ることが理解されるべきである。特に、非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクション、トランスポゾンベースのシステムおよびウイルスベースのシステムを含む種々の方法が、ＣＡＲ構築物をＴ細胞に導入するために用いられ得る。非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクションは、挿入突然変異誘発のリスクが低い。トランスポゾンベースのシステムは、組み込み要素を含まないプラスミドよりも効率的に導入遺伝子を組み込むことができる。ウイルスベースのシステムには、γ－レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの使用が包含される。γ－レトロウイルスは比較的生産し易く、効率的かつ永久的にＴ細胞に形質導入し、初代ヒトＴ細胞における組込みの観点から安全であることが予備的に証明されている。レンチウイルスベクターもまた、Ｔ細胞に効率的かつ永久的に形質導入するが、製造コストがより高い。また、レトロウィルスベースのシステムより潜在的に安全である。
本明細書に記載のペプチドおよびタンパク質作用物質は、該作用物質をコードするＲＮＡなどの核酸を投与すること、および／または該作用物質をコードするＲＮＡなどの核酸を含む宿主細胞を投与することにより、患者に送達され得る。患者に投与されたとき、核酸は、裸の形態でか、またはリポソームもしくはウイルス粒子の形態のような適切な送達ビヒクル中に、または宿主細胞内に存在し得る。提供された核酸は、持続的な様式で長時間にわたって作用物質を産生して、治療用タンパク質について少なくとも部分的に観察される不安定性を緩和することができる。核酸が宿主細胞内に存在することなく患者に投与される場合、それは、好ましくは、患者の細胞に取り込まれて、該核酸によってコードされる作用物質を発現する。核酸が宿主細胞内に存在している間に患者に投与される場合、それは、好ましくは、患者内の宿主細胞によって発現されて、該核酸によってコードされる作用物質を産生する。
本明細書で用いる用語“核酸”は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え産生体および化学合成分子などのＤＮＡおよびＲＮＡを含むことを意図する。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡには、インビトロで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡが含まれる。本発明により、核酸は、好ましくは、単離された核酸である。
核酸は、ベクター中に含まれ得る。本明細書で用いる用語“ベクター”には、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、アデノウイルスベクターもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体を含む、当業者に知られているベクターが含まれる。該ベクターには、発現ベクターならびにクローニングベクターが含まれる。発現ベクターは、プラスミドならびにウイルスベクターを含み、一般的に、所望のコード配列と、作動可能に連結されたコード配列の特定宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物）またはインビトロ発現系における発現に必要な適当なＤＮＡ配列とを含む。クローニングベクターは、一般に、任意の所望のＤＮＡフラグメントを操作し増幅するために使用され、該所望のＤＮＡフラグメントの発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
本発明の文脈中、用語“ＲＮＡ”は、リボヌクレオチド残基を含む分子に関し、好ましくは、全体的にまたは実質的にリボヌクレオチド残基からなる。“リボヌクレオチド”は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに天然に存在するＲＮＡとは１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって異なっている改変ＲＮＡを包含する。そのような改変には、例えばＲＮＡの末端への、または内部への、例えばＲＮＡの１以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準的ヌクレオチド、例えば非天然ヌクレオチドもしくは化学合成ヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドもまた含むことができる。これらの改変ＲＮＡは、類縁体または天然ＲＮＡの類縁体と呼ぶことができる。
本発明によれば、用語“ＲＮＡ”には、“メッセンジャーＲＮＡ”を意味する“ｍＲＮＡ”が含まれ、好ましくはこれに関し、また、ＤＮＡを鋳型として生産され得る、ペプチドまたはタンパク質をコードする“転写物”に関する。ｍＲＮＡは通常、５'－非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、タンパク質またはペプチドコード領域、および３'－非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡは、細胞内およびインビトロで限られた半減期を有する。好ましくは、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を用いて、インビトロ転写によって生産される。本発明の一態様において、ＲＮＡは、インビトロ転写によって得られるか、または化学合成される。インビトロ転写法は、当御者に知られている。例えば、市販の種々のインビトロ転写キットがある。
本発明の一態様において、ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡ、例えば一本鎖自己複製ＲＮＡである。一態様において、自己複製ＲＮＡは、センス鎖（positive sense）の一本鎖ＲＮＡである。一態様において、自己複製ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ由来のＲＮＡである。一態様において、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスゲノムＲＮＡであるか、またはアルファウイルスゲノムＲＮＡ由来である。一態様において、自己複製ＲＮＡは、ウイルス遺伝子発現ベクターである。一態様において、ウイルスは、セムリキ森林ウイルスである。一態様において、自己複製ＲＮＡは、本明細書に記載の作用物質をコードする１以上のトランスジーン、少なくとも１つのトランスジーンを含む。一態様において、ＲＮＡがウイルスＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ由来である場合、トランスジーンは、構造タンパク質をコードするウイルス配列のようなウイルス配列を部分的または完全に置換し得る。一態様において、自己複製ＲＮＡは、インビトロで転写されたＲＮＡである。
本発明で用いるＲＮＡの発現および／または安定性を増加させるために、発現されたペプチドまたはタンパク質の配列を修飾する、好ましくは改変することなく修飾することができる。
本明細書で用いるＲＮＡに関して、用語“修飾”には、ＲＮＡに天然に存在しないＲＮＡの修飾が含まれる。
本発明の一態様において、本発明で用いるＲＮＡは、キャップされていない５’－三リン酸を有さない。かかるキャップされていない５’－三リン酸の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成することができる。
本発明のＲＮＡは、その安定性を増加させ、および／または細胞傷害性を低下させるために、改変された天然または合成リボヌクレオチドを有し得る。例えば、一態様において、本発明で用いるＲＮＡにおいて、５－メチルシチジンは、シチジンについて、部分的にまたは完全に、好ましくは完全に置換される。あるいは、またはさらに、一態様において、本発明で用いるＲＮＡにおいて、シュードウリジンは、ウリジンについて、部分的にまたは完全に、好ましくは完全に置換される。
一態様において、用語“修飾”は、５’－ｃａｐまたは５’－ｃａｐアナログを有するＲＮＡを提供することに関する。用語“５’－ｃａｐ”は、ＲＮＡ分子の５’末端に見出されるキャップ構造を意味し、一般的に、異常な５’から５’－三リン酸結合を介してｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一態様において、このグアノシンは、７位でメチル化される。用語“従来の５’－ｃａｐ”は、天然に存在するＲＮＡ ５’－ｃａｐ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を意味する。本発明の文脈において、用語“５’－ｃａｐ”には、ＲＮＡキャップ構造に似ており、好ましくはインビボおよび／または細胞中で、ＲＮＡに結合したとき、それを安定化する能力を有するように修飾された、５’－ｃａｐアナログが含まれる。
５’－ｃａｐまたは５’－ｃａｐアナログを有するＲＮＡを提供することは、該５’－ｃａｐまたは５’－ｃａｐアナログの存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により達成することができ、ここで、該５’－ｃａｐは、作製されたＲＮＡ鎖に転写と共に組み込まれるか、または例えば、インビトロ転写によってＲＮＡが作製され、５’－ｃａｐは、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて転写後にＲＮＡに結合され得る。
ＲＮＡは、さらなる修飾を含み得る。例えば、本発明で用いるＲＮＡのさらなる修飾は、天然に存在するポリ（Ａ）テールの伸長もしくは切断、または該ＲＮＡのコード領域に関連しないＵＴＲの導入、例えば、α２－グロビン、α１－グロビン、β－グロビン、好ましくはβ－グロビン、より好ましくはヒトβ－グロビンなどのグロビン遺伝子に由来する１以上、好ましくは２つのコピーの３’－ＵＴＲの挿入などの、５’－もしくは３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変であり得る。
従って、本発明で用いるＲＮＡの安定性および／または発現を増加させるために、それは、好ましくは１０～５００長、より好ましくは３０～３００、さらにより好ましくは６５～２００長、とりわけ１００～１５０長のアデノシン残基の、ポリ－Ａ配列と共に存在するように修飾されていてよい。とりわけ好ましい態様において、ポリ－Ａ配列は、約１２０個のアデノシン残基を有する。加えて、２以上の３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）のＲＮＡ分子の３’－非翻訳領域への組み込みにより、翻訳効率の向上をもたらし得る。１つの特定の態様において、３’－ＵＴＲは、ヒトβ－グロビン遺伝子に由来する。
用語、ＲＮＡの“安定性”は、ＲＮＡの“半減期”に関連する。“半減期”は、分子の活性、量または数の半分を除去するのに必要な時間に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡの半減期は、該ＲＮＡの安定性を示す。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの“発現の持続時間”に影響し得る。長い半減期を有するＲＮＡが長時間発現され得ることが期待され得る。
本発明の文脈において、用語“転写”は、ＤＮＡ配列内の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。次いで、ＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、用語“転写”は“インビトロ転写”を含み、ここで、用語“インビトロ転写”は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、無細胞系において、好ましくは適当な細胞抽出物を用いて、インビトロで合成される過程に関する。好ましくは、転写産物の生成には、クローニングベクターが適用される。これらのクローニングベクターは、一般に、転写ベクターとして設計され、本発明によれば、用語“ベクター”に包含される。
本発明によれば、用語“翻訳”は、メッセンジャーＲＮＡの鎖がアミノ酸の配列のアセンブリを指示してペプチドまたはタンパク質を作製することによる、細胞のリボソームにおける過程に関する。
核酸は、本発明によれば、単独で、または相同（homologous）であっても非相同（heterologous）であってもいよい他の核酸と組み合わされて存在してよい。好ましい態様において、核酸は、該核酸に関して相同であっても非相同であってもよい発現制御配列に、機能的に連結される。用語“相同”は、その核酸が天然で機能的に連結されていることを意味し、用語“非相同”は、その核酸が天然では機能的に連結されていないことを意味する。
核酸および発現制御配列は、それらが、該核酸の発現または転写が該発現制御配列の制御下または影響下にあるような形で互いに共有結合によって互いに連結されているならば、それらは互いに“機能的に”連結している。核酸が機能的タンパク質に翻訳されるものである場合は、発現制御配列がコード配列に機能的に連結されていることにより、該発現制御配列の誘導により、コード配列のフレームシフトを引き起こすことなく、または該コード核酸が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳されなくなることもなく、該核酸の転写をもたらす。
用語“発現制御配列”または“発現制御エレメント”は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、および遺伝子の転写またはｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメント（要素）を含む。本発明の特定の態様では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞タイプに応じて異なりうるが、一般的には、例えばＴＡＴＡ簿ックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などといった、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’－非転写配列ならびに５’－および３’－非翻訳配列を含む。より具体的には、５’－非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列または上流のアクティベーター配列もまた含み得る。
本明細書で用いる用語“発現”は、最も広義として用いられ、ＲＮＡおよび／またはペプチドもしくはタンパク質の、例えば転写および／または翻訳による産生を含む。ＲＮＡに関して、用語“発現”または“翻訳”は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。また、核酸の部分発現も含まれる。さらに、発現は、一時的であっても、安定的であってもよい。本発明によれば、用語、発現はまた、“正常ではない発現”または“異常な発現”を含む。
“正常ではない発現”または“異常な発現”とは、本発明によれば、発現が、任意のタンパク質、例えば腫瘍抗原の正常ではないまたは異常な発現に関連する疾患を有さない対象における状態を、対照と比較して、変化する、好ましくは増加することを意味する。発現の増加は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％、またはそれ以上の増加を意味する。一態様において、発現は、罹患組織においてのみ見いだされ、健康な組織における発現は抑制される。
用語“特異的に発現”は、本質的に、特異組織または臓器でのみタンパク質が発現されることを意味する。例えば、胃粘膜で特異的に発現される腫瘍抗原は、該タンパク質が胃粘膜で優先的に発現され、他の組織では発現されないか、または他の組織もしくは臓器タイプでは有意な程度には発現されないことを意味する。よって、胃粘膜の細胞でのみ特に発現され、精巣などの他の組織では非常に少ない量が発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞で特異的に発現される。ある態様においては、腫瘍抗原が特異的に２以上の組織タイプまたは臓器、例えば、２つまたは３つの組織タイプまたは臓器で、しかし好ましくは３つを超えない互いに異なる組織または臓器タイプにおいて、正常条件下に特異的に発現されることもある。このような場合、該腫瘍抗原はこれらの臓器で特異的に発現される。例えば、腫瘍抗原が正常条件下で、好ましくは肺および胃においてほぼ等しい程度で発現されるとき、該腫瘍抗原は、肺および胃で特異的に発現される。
本発明により、用語“～をコードする核酸”は、核酸が適当な環境、好ましくは細胞内に存在するとき、発現され得て、それがコードするタンパク質またはペプチドを生産することを意味する。
本発明のある側面は、本明細書に記載の作用物質をコードするＲＮＡなどの核酸でインビトロでトランスフェクトされ、そして好ましくは低い前駆体頻度から臨床的に意味のある細胞数までエクスビボで増殖後に、患者などのレシピエントに移入された、宿主細胞の養子移入に関する。本発明の処置に用いる宿主細胞は、処置されるレシピエントに対いて自己、同種異系または同系であり得る。
用語“自己”は、同じ対象に由来するものを記載するために用いられる。例えば、“自己移植”とは、同じ対象に由来する組織または臓器の移植を意味する。そのような手法は、そうでなければ拒絶をもたらす免疫学的障壁を克服するため、有利である。
用語“同種異系”は、同じ種の異なる個体に由来するものを記載するために用いられる。１つまたは複数の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は、互いに同種異系であると言われる。
用語“同系”は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち同一の双子もしくは同一の近交系の動物、またはそれらの組織に由来するものを記載するために用いられる。
用語“異種”は、複数の異なる要素からなるものを記載するために用いられる。一例として、ある個体の骨髄を異なる個体に移すことは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
用語“トランスフェクション”は、核酸、特にＲＮＡの、細胞への導入に関する。本発明の目的のために、用語“トランスフェクション”はまた、細胞への核酸の導入またはかかる細胞による核酸の取り込みを含み、ここで、該細胞は、対象、例えば患者に存在し得る。従って、本発明により、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在し得て、例えば細胞は、患者の臓器、組織および／または生体の一部を形成し得る。本発明により、トランスフェクションは、一時的であっても、安定的であってもよい。トランスフェクションの幾つかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一時的にしか発現されない場合も十分である。トランスフェクション過程で導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないため、外来核酸は、有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大きく低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残っていることが望ましい場合、安定なトランスフェクションが行われなければならない。ＲＮＡは、それがコードするタンパク質を一時的に発現するように細胞にトランスフェクトされ得る。
本発明により、核酸を細胞に導入、すなわち移入またはトランスフェクションするのに有用な技術を用いることができる。好ましくは、ＲＮＡは、標準的な技術によって細胞にトランスフェクトされる。そのような技術には、エレクトロポレーション、リポフェクションおよびマイクロインジェクションが含まれる。本発明の１つの特に好ましい態様において、ＲＮＡは、エレクトロポレーションにより細胞に導入される。
エレクトロポレーションまたは電気透過処理（electropermeabilization）は、外部から印加された電場によって引き起こされる細胞原形質膜の電気伝導度および透過性の有意な増加に関する。これは、分子生物学では、通常、細胞中に何らかの物質を導入する方法として使用される。
本発明により、本発明によれば、タンパク質またはペプチドをコードする核酸の細胞への導入により、該タンパク質またはペプチドの発現がもたらされることが好ましい。
本発明の用語“ペプチド”は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合的に連結された２以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは９以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２１以上、および最大で好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０の、特に１００個のアミノ酸を含む物質を意味する。“タンパク質”という用語は、大きなペプチドを意味し、好ましくは、１００を上回るアミノ酸残基を有するペプチドを意味するが、一般的には、用語“ペプチド”および“タンパク質”は同義であり、本明細書においては互換的に用いられる。
本発明により、ペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。一態様において、ペプチドは、単に、天然アミノ酸を含む。
本発明により、用語“非天然アミノ酸”とは、２０種の天然アミノ酸とは異なる構造を有するアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸は天然アミノ酸と類似の構造を有するため、非天然アミノ酸は、所定の天然アミノ酸の誘導体または類縁体として分類され得る。
好ましくは、本明細書に記載のタンパク質およびペプチドは、単離されている。用語“単離されたタンパク質”または“単離されたペプチド”は、タンパク質またはペプチドが天然環境から分離されていることを意味する。単離されたタンパク質またはペプチドは、本質的に精製された状態であり得る。用語“本質的に精製された”とは、該タンパク質またはペプチドが、天然でまたはインビボで会合している他の物質を本質的に含まないことを意味する。
特定のアミノ酸配列に関して本明細書に記載の教示は、例えば配列表に示されているものは、該特定の配列と機能的に等価な配列、例えば特定のアミノ酸配列の性質と同一のまたは類似する性質を示すアミノ酸配列をもたらす、該特定の配列の改変体にも関するように解釈すべきである。重要な性質の一つは、ペプチドのＭＨＣ分子および／もしくはＴ細胞受容体への結合を保つこと、またはＴ細胞受容体のその標的への結合を保つこと、またはＴ細胞のエフェクター機能を持続させることである。好ましくは、ある特定の配列に関して改変された配列は、それがＴ細胞受容体中の特定の配列を置換するとき、標的への該Ｔ細胞受容体の結合を保持し、好ましくは本明細書に記載のＴ細胞受容体の機能またはＴ細胞受容体を保有するＴ細胞の機能を保つ。
例えば、配列表に示す配列を、１以上、好ましくは全ての遊離システイン残基を除くように、特に、システイン残基を、システイン以外のアミノ酸、好ましくはセリン、アラニン、スレオニン、グリシン、チロシン、ロイシンまたはメチオニン、最も好ましくはアラニンまたはセリンで置換することによって除去するように、修飾することができる。
特に、標的に結合する能力を失わずにＣＤＲ配列、超可変領域および可変領域の配列を修飾することができることは、当業者には理解され得る。例えば、ＣＤＲ配列は、本明細書に明記する抗体の該領域と同一であるか、または高度に相同である。“高度に相同”とは、１～５、好ましくは１～４、例えば１～３または１もしくは２個の置換がＣＤＲにおいてなされることが企図される。加えて、超可変領域および可変領域は、本明細書に具体的に開示される領域と実質的な相同性を示すように改変され得る。
ペプチド“変異体”は、所定のペプチドの免疫原性を保持し得る（例えば、Ｔ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する変異体の能力が、所定のペプチドに対して実質的に減少しない）。言い換えると、Ｔ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する変異体の能力は、所定のペプチドに対して増強されても、または変化しなくてもよく、または所与のペプチドに対して５０％未満、好ましくは２０％未満減少してもよい。
変異体は、ＭＨＣ分子に結合するその能力を評価することによって同定され得る。１つの好ましい態様では、変異体ペプチドが、ＭＨＣ分子に結合する変異体ペプチドの能力が所与のペプチドと比較して増加するような修飾を有する。ＭＨＣ分子に結合する変異体ペプチドの能力は、所与のペプチドの能力と比較して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、４倍、または５倍増加し得る。従って、任意の好ましい態様において、ペプチドは、Ｔ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力が無修飾ペプチドの能力よりも統計的に大きくなるように免疫原性部分内の１～３アミノ酸残基が置換されている変異体を含む。そのような置換は、好ましくは、ペプチドのＭＨＣ結合部位内に位置する。好ましい置換は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子への結合を増加させる。任意の変異体は、保存的置換を含む。
本発明による用語“変異体”にはまた、ミュータント、スプライス変異体、コンフォメーション、アイソフォーム、アレル変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものも包含される。アレル変異体は、遺伝子の正常配列における変化に関し、その意義は不明であることが多い。完全な遺伝子配列決定を行うと、所与の遺伝子について、しばしば、数多くのアレル変異体が同定される。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列の起源とは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。用語“変異体”は、翻訳後修飾された変異体およびコンフォメーション変異体を包含する。
本発明の目的に関して、アミノ酸配列の“変異体”は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体が含まれる。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に、１つまたは２つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１以上のアミノ酸残基が、アミノ酸配列中の特定の部位に挿入されるが、ランダム挿入とその結果生じる産物の適当なスクリーニングも可能である。
アミノ酸付加変異体は、１以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上のアミノ酸の、アミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質のどの位置にあってもよい。
アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されていることを特徴とする。修飾が、相同タンパク質またはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列中の位置にあること、かつ／またはアミノ酸が、類似する性質を有する別のアミノ酸で置換されることが、好ましい。好ましくは、タンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち同じように荷電しているアミノ酸または同じように非荷電であるアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖同士が関連しているアミノ酸のファミリーの１つの置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は、一般に、次の４つのファミリーに分類される：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、無極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、まとめて芳香族アミノ酸と分類される場合もある。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と該所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。類似性および同一性の程度は、好ましくは、対照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、対象アミノ酸配列が２００アミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続アミノ酸配列について与えられる。好ましい態様において、類似性または同一性の程度は、対照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野において知られているツールで、好ましくは最適配列アラインメントを用いて、例えばＡｌｉｇｎを用いて、標準的設定で、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使って、行うことができる。
“配列類似性”は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換に相当するアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列の間の“配列同一性”は、それらの配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
用語“同一性パーセンテージ”は、最適アラインメント後に得られる、比較しようとする２つの配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを表するものとし、このパーセンテージは純粋に統計的であって、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布する。２つのアミノ酸配列の間の配列比較は、従来どおり、それらを最適にアラインメントした後にこれらの配列を比較することによって実施され、該比較は、配列類似性を有する局所領域を同定し、比較するために、セグメントで、または“比較ウインドウ”で、実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手作業で行われる他、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピュータプログラムによって（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group、575 Science Drive, Madison, Wis）におけるGAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST NおよびTFASTA）によって作成することもできる。
同一性パーセンテージは、比較される２つの配列間で同一な位置の数を決定し、その数を比較した位置の数で割り、これら２つの配列間の同一性パーセンテージが得られるように、得られた結果に１００を掛けることによって算出される。
相同なアミノ酸配列は、本発明によれば、少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸残基の同一性を示す。
本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、当業者により、例えば組換えＤＮＡ操作によって、容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するタンパク質およびペプチドを調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばSambrook et al. (1989)に、詳述されている。さらに、本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸変異体は、既知のペプチド合成技術を利用して、例えば固相合成法および類似の方法によって、容易に調製することができる。
本発明は、本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質の誘導体を包含し、それらは用語“ペプチド”および“タンパク質”に含まれる。本発明によれば、タンパク質およびペプチドの“誘導体”は、タンパク質およびペプチドの修飾型である。そのような修飾には化学的修飾が含まれ、そのような修飾は、炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチドなどの、タンパク質またはペプチドに関連する任意の分子の、１つまたは複数の置換、欠失、および／または付加を含む。一態様において、タンパク質またはペプチドの“誘導体”には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質加水分解的切断または抗体への結合もしくは他の細胞性リガンドへの結合によってもたらされる、修飾された類縁体が含まれる。用語“誘導体”はまた、該タンパク質およびペプチドの全ての機能的化学等価物にも及ぶ。好ましくは、修飾ペプチドは、増加した安定性および／または増加した免疫原性を有する。
ペプチドの模倣物も含まれる。そのような模倣物は、１以上のアミノ酸模倣物に連結されたアミノ酸を含んでもよいし（すなわち、ペプチド内の１以上のアミノ酸が、アミノ酸模倣物で置き換えられていてもよいし）、もっぱら非ペプチド模倣物であってもよい。アミノ酸模倣物は、コンフォメーションがアミノ酸に似ていて、それゆえに、例えばＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力を実質的に減少させることなく、アミノ酸の代わりに用いることができるような化合物である。非ペプチド模倣物は、アミノ酸を含有せず、ペプチドに似た全体的コンフォメーションを有していて、それゆえに、例えばＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力が所与のペプチドの能力と比較して実質的に減少しないような化合物である。
本発明により、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の変異体、誘導体、修飾型、フラグメント、パーツまたは部分は、好ましくは、それぞれ、それが由来するアミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の機能的性質を有する。すなわち、それは機能的に等価である。一態様において、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の変異体、誘導体、修飾型、フラグメント、パーツまたは部分が、それぞれ、それが由来するアミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質と免疫学的に等価である。一態様において、機能的特性が免疫学的特性である。
ある特定の性質は、ＭＨＣ分子との複合体を形成し、それが好適な場合には、好ましくは細胞傷害性細胞またはＴヘルパー細胞を刺激することによって、免疫応答を生じさせる能力である。
用語“免疫学的に等価”とは、免疫学的に等価な分子、例えば免疫学的に等価なアミノ酸配列が、例えば体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の誘導、誘導される免疫反応の強さおよび／または持続時間、あるいは誘導される免疫反応の特異性などの免疫学的効果のタイプに関して、同じかまたは本質的に同じ免疫学的性質を示し、かつ／または同じかまたは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明との関連において、用語“免疫学的に等価”は、好ましくは、免疫処置に使用されるペプチドもしくはペプチド変異体の免疫学的効果または性質に関して使用される。例えばアミノ酸配列は、対象の免疫系に曝露された時に、該アミノ酸配列が、対照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導するのであれば、該対照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。
用語“由来する”は、本発明によれば、特定のエンティティ、特に特定の配列が、それが由来する物体、特に生物または分子中に存在することを意味する。アミノ酸配列の場合、とりわけ特定の配列領域の場合、“由来する”は、特に、関連するアミノ酸配列が、それが存在しているアミノ酸配列に由来することを意味する。
用語“細胞”または“宿主細胞”は、好ましくは、無傷の細胞、すなわち、酵素、細胞小器官（オルガネラ）、または遺伝物質などのその正常な細胞内構成要素を放出していない、無傷の膜を有する細胞である。無傷の細胞は、好ましくは、生細胞、すなわちその正常な代謝機能を果たす能力を有する生きている細胞である。好ましくは、該用語は、本発明によれば、外因性の核酸によるトランスフェクションを受けることができる細胞に関する。好ましくは、外因性の核酸でトランスフェクションされ、レシピエントに移入された細胞は、レシピエント中で該核酸を発現できる。用語“細胞”は、本発明によれば、細菌細胞を包含し；他の有用な細胞は、酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。好適な細菌細胞には、大腸菌、プロテウス属およびシュードモナス属の菌株などのグラム陽性菌株、ならびにバチルス属、ストレプトミセス属、ブドウ球菌およびラクトコッカス属の菌株などのグラム陰性細菌株由来の細胞が含まれる。好適な真菌細胞には、トリコデルマ（Trichoderma）、ニューロスポラ（Neurospora）、およびアスペルギルス（Aspergillus）種由来の細胞が含まれる。好適な酵母細胞には、サッカロミケス属（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）、シゾサッカロミケス（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ）、ピキア（例えば、ピキア・パストリスおよびピキア・メタノリカ）およびハンゼヌラの種の細胞が含まれる。好適な哺乳動物細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３ ＨＥＫなどが挙げられる。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および異種タンパク質の発現のために当該分野で使用される他の細胞も同様に使用することができる。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギおよび霊長動物由来の細胞などの哺乳動物細胞は、養子移入のために特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来し、初代細胞および免疫系の細胞などの細胞株、特に樹状細胞およびＴ細胞などの抗原提示細胞、造血幹細胞などの幹細胞および間葉系細胞幹細胞および他の細胞型が挙げられる。抗原提示細胞は、その表面上に主要組織適合複合体との関連で抗原を提示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこの複合体を認識し得る。
核酸分子を含む細胞は、好ましくは、その核酸がコードするペプチドまたはタンパク質を発現する。
細胞は、組換え細胞であってもよく、コードされているペプチドまたはタンパク質を分泌してもよく、それを表面上に発現してもよく、好ましくはさらに、該ペプチドもしくはタンパク質またはそのプロセシング産物に結合するＭＨＣ分子を発現してもよい。一態様において、細胞はＭＨＣ分子を内在性に発現する。さらなる態様において、細胞は、ＭＨＣ分子および／またはペプチドもしくはタンパク質またはそのプロセシング産物を、組換え的に発現する。細胞は、好ましくは、非増殖性である。好ましい態様において、細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
用語“クローン拡大（clonal expansion）”は、特異的なエンティティが増倍される過程を意味する。本発明との関連において、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、該抗原を認識する特異的リンパ球が増幅される、免疫学的応答との関連において使用される。好ましくは、クローン拡大は、リンパ球の分化につながる。
抗原発現に関連する疾患は、生物学的サンプル中のペプチドと特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出することができる。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む生物学的サンプルを、本発明のペプチド、そのようなペプチドをコードする核酸、および／またはそのようなペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現し、かつ／または提示する抗原提示細胞と共にインキュベートし、該Ｔ細胞の特異的活性化の有無を検出する。好適な生物学的サンプルには、単離されたＴ細胞が含まれるが、これに限定されない。例えばＴ細胞は、患者から、常套的な技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離などによって）単離することができる。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の場合、活性化は、好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の場合、活性化は、好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。無疾患対象と比較して少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、その対象における抗原発現に関連する疾患の存在を示す。
本明細書で用いる“低減する”または“阻害する”は、レベルの全体的低下、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的低下を引き起こす能力を意味する。用語“阻害する”または類似の表現は、完全な阻害または本質的に完全な阻害、すなわちゼロへの低減または本質的にゼロへの低減が含まれる。
“増加する”または“強化する”などの用語は、好ましくは、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％程度の増加または強化に関する。
本明細書に記載の作用物質、組成物および方法は、疾患、例えばＣＬＤＮ１８．２を発現し、好ましくはＭＨＣ分子と関連してＣＬＤＮ１８．２を提示する、罹患細胞の存在により特徴付けられる疾患を有する対象を処置するために用いることができる。処置し、かつ／または予防することができる疾患の例には、ＣＬＤＮ１８．２を発現する全ての疾患が包含される。特に好ましい疾患は癌疾患である。
本明細書に記載の作用物質、組成物および方法は、本明細書に記載の疾患を予防するための予防接種またはワクチン接種にも使用することができる。
用語“正常組織”または“正常状態”は、健常組織、または健常対象における状態、すなわち非病理学的状態を意味し、ここで“健常”とは、好ましくは、非癌性を意味する。
用語“疾患”は、個体の身体に影響を与える異常な状態を意味する。疾患は、しばしば特定の症状および兆候に関連する病状として解釈される。疾患は、元来、感染性疾患などの外部原因に起因する要因、または自己免疫疾患などの内的機能障害によって引き起こされ得る。ヒトでは、“疾患”はしばしば、疼痛、機能不全、苦痛、社会的問題、または罹患している個人の死亡、または該個人と接触している人にとっての同様の問題を引き起こす、あらゆる状態を意味するために、より広範に用いられる。この広い意味では、傷害、身体障害（disability）、障害、症候群、感染症、単発症状、逸脱行動、ならびに構造および機能上の異型変異型を含むことがあるが、他の状況および目的ではこれらは区別可能なカテゴリーと考えられる。疾患は通常、物理的にだけでなく、感情的にも個人に影響を与え、多くの疾患に罹患しながら生活することは、人生観や人格を変える可能性ある。本発明によれば、用語“疾患”には、癌、特に本明細書に記載の癌の形態が含まれる。癌または特定の形態の癌に対する本明細書中のいずれの言及も、その癌の転移を含む。好ましい態様において、本発明により処置される疾患は、ＭＨＣ分子に関してＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞および場合によってはＣＬＤＮ１８．２を提示する細胞を含む。
“ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関する疾患”または類似の表現は、本発明により、ＣＬＤＮ１８．２が、罹患組織または臓器の細胞で発現されることを意味する。一態様において、罹患組織または臓器の細胞におけるＣＬＤＮ１８．２の発現は、健康な組織または臓器における状態と比較して増加する。増加は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはさらにそれ以上を意味する。一態様において、発現は、罹患組織においてのみ見いだされ、健康な組織における発現は抑制される。本発明により、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関する疾患には、癌疾患が含まれる。さらに、本発明によれば、癌疾患は、好ましくは、癌細胞がＣＬＤＮ１８．２を発現するものである。
用語“癌疾患”または“癌”は、一般的に、無制御の細胞増殖により特徴付けられる個体における生理学的状態を意味するか、または説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、かかる癌の例には、骨腫瘍、血液の癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、軟部肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれる。本発明による用語“癌”はまた、癌転移を含む。好ましくは、“癌疾患”は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞により特徴付けられ、かつ癌細胞はＣＬＤＮ１８．２を発現する。
罹患細胞は、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞であり、ここで、該ＣＬＤＮ１８．２は、好ましくは、膜貫通タンパク質として該細胞の表面上に存在し、および／またはＭＨＣ ＩなどのＭＨＣと関連して該細胞により提示される。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞は、好ましくは、癌細胞であり、好ましくは本明細書に記載の癌の細胞である。
一態様において、癌疾患は、退形成、侵襲性、および転移という性質を特徴とする悪性疾患である。悪性腫瘍とは、悪性病変が、その増殖において自己限定的でなく、隣接組織に侵入する能力を有し、遠隔組織に伝播する（転移する）能力も有し得るのに対し、良性腫瘍はこれらの性質をいずれも有さないという点で、非がん性良性腫瘍と対比させることができる。
一態様において、本発明の癌は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞に関する。一態様において、癌はＣＬＤＮ１８．２陽性である。一態様において、ＣＬＤＮ１８．２の発現は、細胞の表面で起こる。一態様において、癌細胞の少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％または９０％は、ＣＬＤＮ１８．２陽性であり、および／または癌細胞の少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％は、ＣＬＤＮ１８．２の細胞表面発現について陽性である。一態様において、癌細胞の少なくとも９５％または少なくとも９８％は、ＣＬＤＮ１８．２陽性である。一態様において、癌細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ＣＬＤＮ１８．２の細胞表面発現について陽性である。
一態様において、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞を含む癌またはＣＬＤＮ１８．２陽性の癌は、胃癌、食道癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、および胆嚢癌ならびにそれらの転移、特に胃癌転移癌、例えばクルーケンベルグ腫瘍、腹膜播種性転移およびリンパ節転移からなる群より選択される。一態様において、癌は、腺癌、特に進行した腺癌である。特に好ましい癌疾患は、胃、食道、膵管、胆管、肺および卵巣の腺癌である。一態様において、癌は、胃癌、食道癌、特に下部食道、食道胃接合部の癌および胃食道癌からなる群より選択される。特に好ましい態様において、癌は、転移性、難治性または再発性の進行胃食道癌などの胃食道癌である。
本発明によれば、用語“腫瘍”または“腫瘍疾患”は、細胞（新生物細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常増殖によって形成された腫脹または病変を意味する。“腫瘍細胞”は、急激でかつ無制御な細胞増殖によって増殖する異常細胞であり、新しい増殖停止を開始する刺激後に増殖し続ける。腫瘍は、構造的組織、および、正常組織との機能的な共同作用の部分的または完全な欠如を示し、通常は、良性、前癌状態または悪性のいずれかの異質な組織塊を形成する。
本発明により、“癌腫”は、上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。この群は、乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌の一般的な形態を含む最も一般的な癌を表す。
“腺癌”は、腺組織に起源を有するがんである。この組織は、上皮組織として知られる、さらに大きな組織カテゴリーの一部でもある。上皮組織には、皮膚、腺、ならびに身体の腔および臓器を裏打ちする他の種々の組織が含まれる。上皮は、発生学的には、外胚葉、内胚葉および中胚葉に由来する。腺癌と分類されるためには、細胞が分泌性を有する限り、該細胞が腺の一部である必要は必ずしもない。この形態の癌腫はヒトを含む高等哺乳動物において発生し得る。高分化型腺癌はそれらが由来する腺組織に似る傾向があるが、低分化型はそうではない。病理学者は、生検からの細胞を染色することによって、その腫瘍が腺癌であるか、または他のタイプの癌であるかを決定することができる。腺癌は、体内での腺の遍在性ゆえに、身体の多くの組織に生じ得る。各腺は同じ物質を分泌するわけではないが、細胞に外分泌機能がある限り、それは腺性であるとみなされ、その悪性形態は、それゆえに腺癌と呼ばれる。悪性腺癌は他の組織に侵入し、転移するのに十分な時間が与えられれば、しばしば転移する。卵巣腺癌は最も一般的なタイプの卵巣癌腫である。これには、漿液性および粘液性腺癌、明細胞腺癌ならびに類内膜腺癌が含まれる。
リンパ腫および白血病は、造血（血液形成）細胞に由来する悪性疾患である。
芽細胞性腫瘍または芽細胞腫は、未熟組織または胚性組織に似た腫瘍（通常は悪性）である。これらの腫瘍の多くは、小児に最もよく見られる。
“転移”とは、その元の部位から身体の別の部分への癌細胞の伝播を意味する。転移の形成は、とても複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の脱離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および脈管に入るための内皮基底膜の貫入、および血液によって輸送された後の、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍の成長は、血管形成に依存する。腫瘍の転移はしばしば原発性腫瘍の除去後にも起こるが、これは、腫瘍細胞または腫瘍構成要素が残存していて、転移能を発生させ得るからである。一態様において、用語“転移”は、本発明によれば、“遠隔転移”に関し、これは、原発性腫瘍および所属リンパ節系から遠く離れた転移に関する。一態様において、用語“転移”は、本発明によれば、リンパ節転移に関する。
続発性腫瘍または転移性腫瘍の細胞は、元の腫瘍における細胞に似ている。これは、例えば、卵巣癌が肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は異常な肝細胞ではなく異常な卵巣細胞で構成されることを意味する。肝臓における腫瘍は、その場合、肝臓がんではなく転移性卵巣癌と呼ばれる。
再燃（relapse）または再発（recurrence）は、ある人が、過去に罹患した状態に再び罹患したときに起こる。例えば、ある患者が腫瘍疾患を患い、該疾患の処置を成功裏に終了し、そして再び該疾患を発症した場合、該新たに発症した疾患は、再燃または再発とみなされ得る。しかしながら、本発明によれば、腫瘍疾患の再燃または再発は、もとの腫瘍疾患の部位でも起こりうるものの、必ずしも、もとの腫瘍疾患の部位で起こるとは限らない。従って、例えば、ある患者が卵巣腫瘍を患い、処置を受けて成功を収めたことがある場合、再燃または再発は卵巣腫瘍の発生である場合も、卵巣とは異なる部位での腫瘍の発生である場合もあり得る。腫瘍の再燃または再発には、腫瘍がもとの腫瘍の部位に発生する状況だけでなく、もとの腫瘍の部位とは異なる部位に発生する状況も含まれる。好ましくは、患者が処置を受けたもとの腫瘍は原発性腫瘍であり、もとの腫瘍の部位とは異なる部位にある腫瘍は、続発性または転移性腫瘍である。
用語“処置”または“治療的処置”は、健康状態を改善する、および／または個体の寿命を延長する（増加させる）、あらゆる処置に関する。該処置は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の発症を停止または遅延させ、個体における疾患の発症を阻害または遅延させ、個体における症状の頻度または重症度を低下させ、および／または現在罹患しているか、もしくは以前に罹患していた個体における再発を低下させ得る。
用語“予防的処置”または“予防処置”は、個体において疾患が生じるのを予防することを意図した処置に関する。用語“予防的処置”または“予防処置”は、本明細書中、互換的に用いられる。
用語“個体”および“対象”は、本明細書中、互換的に用いられる。それらは、疾患または障害（例えば、癌）に罹患し得るか、または罹患しやすいが、疾患または障害を有していても有していなくてもよい、ヒト、非ヒト哺乳動物または他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは哺乳動物）を意味する。多くの態様において、個体はヒトである。特記しない限り、用語“個体”および“対象”は、特定の年齢を示すものではなく、従って、成人、高齢者、子供および新生児を包含する。本発明の好ましい態様において、“個体”または“対象”は“患者”である。用語“患者”は、本発明によれば、処置の対象、特に罹患対象を意味する。
“リスクを有する”とは、一般的な集団と比較して、疾患、特に癌の発生の可能性が通常よりも高いことが確認されている対象、すなわち患者を意味する。加えて、疾患、特に癌に罹患していたか、または現在罹患している対象は、対象が疾患の再発を繰り返すように、疾患の発症のリスクが高い対象である。癌に罹患していたか、または現在罹患している対象もまた、高い癌転移のリスクを有する。
用語“免疫療法”は、特定の免疫反応に関与する治療に関連する。
本発明の文脈では、“保護する”、“予防する”、“予防的”、“予防の”または“保護の”のような用語は、対象の疾患の発生および／または伝播の、予防もしくは処置またはその両方に関連し、特に対象が疾患を発症する可能性を最小化するか、または疾患の発生を遅延することに関連する。例えば、上記のように、腫瘍のリスクを有する個人は、腫瘍の予防のための療法の候補者となりうる。
免疫療法の予防的施行、例えば本発明の作用物質または組成物の予防的投与は、好ましくは、疾患の発生からレシピエントを保護する。免疫療法の治療的施行、例えば本発明の作用物質または組成物の治療的投与は、疾患の進行／成長の阻害につながり得る。これは、疾患の進行／成長の減速、特に、好ましくは疾患の排除につながる、疾患の進行の中断を含む。
免疫療法は、本明細書に記載の作用物質が、好ましくはＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を患者から除去するように機能する種々の技法を何れでも用いて行うことができる。そのような除去は、ＣＬＤＮ１８．２またはＣＬＤＮ１８．２を発現するか、もしくはＭＨＣ分子に関連してＣＬＤＮ１８．２を提示する細胞に特異的な患者の免疫応答を強化または誘導した結果として起こり得る。
ある態様において、免疫療法は、能動免疫療法であってよく、この場合、処置は、免疫応答修飾作用物質（本明細書に記載のペプチドおよび核酸など）を投与して、罹患細胞に対して反応するように内在性宿主免疫系をインビボで刺激することに依る。
他の態様において、免疫療法は、受動免疫療法であってよく、この場合、処置は、直接的または間接的に抗腫瘍効果に介在することができ、かつ必ずしも無傷な宿主免疫系に依存しない、確立された腫瘍免疫反応性を有する作用物質（例えば、エフェクター細胞）の送達を伴う。エフェクター細胞の例には、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋ 細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋ Ｔヘルパーリンパ球）、および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が含まれる。養子免疫療法のために、本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２ペプチドに特異的なＴ細胞受容体およびＣＬＤＮ１８．２に特異的な人工Ｔ細胞受容体を、エフェクター細胞に移入することができる。
上述のように、免疫療法用に十分な数の細胞を作製するために、本明細書に記載するような免疫反応性ペプチドを使って、抗原特異的Ｔ細胞培養を迅速に拡大することができる。特に、抗原提示細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞および／またはＢ細胞に、免疫反応性ペプチドをパルスするか、当技術分野においてよく知られている標準技術を用いて１以上の核酸をトランスフェクトすることができる。治療に使用するための培養エフェクター細胞は、増殖可能であり、広く分布していること、およびインビボで長期間生存可能でなければならない。ＩＬ－２を補足した抗原で繰り返し刺激することにより、培養エフェクター細胞を、インビボで増殖させ、かなりの数を長期間生き残らせることが可能であることは、研究によって示されている（例えば、Cheever et al. (1997), Immunological Reviews 157, 177を参照のこと）。
あるいは、本明細書に記載のペプチドを発現する核酸を、患者から採取した抗原提示細胞に導入し、同じ患者に移植し戻すためにエクスビボでクローン増殖させてもよい。
トランスフェクト細胞は、当技術分野において知られる手段を用いて、好ましくは静脈内、腔内、腹腔内または腫瘍内投与により滅菌された形態で、患者に再導入することができる。
本明細書に記載の方法は、ペプチドまたはペプチドを発現する抗原提示細胞胞に応答して活性化された自己Ｔ細胞の投与を伴い得る。そのようなＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またＣＤ８＋であってよく、上記の通りに増殖させることができる。Ｔ細胞は、疾患の発生を阻害するのに有効な量で対象に投与され得る。
用語“免疫化（immunization）”または“ワクチン接種”は、治療的または予防的理由で免疫応答を誘導するという目的をもって、対象を処置する過程を意味する。
用語“インビボ”は、対象内の状況に関する。
本発明によれば、“サンプル”は、本発明に従って有用である任意のサンプル、特に体液を含む組織サンプルおよび／または細胞サンプルなどの生物学的サンプルであってよく、パンチ生検を含む組織生検や、血液、気管支吸引液、喀痰、尿、糞便または他の体液の採取などの、従来の方法で得ることができる。本発明によれば、用語“サンプル”にはまた、加工されたサンプル、例えば生物学的サンプルの画分もしくは単離物、例えば核酸およびペプチド／タンパク質単離物なども含まれる。
本明細書に記載の化合物および作用物質は、任意の好適な医薬組成物の形態で投与され得る。
本発明の医薬組成物は、好ましくは、滅菌されており、有効量の本明細書に記載の作用物質を含み、本明細書に記載の通り、要すれば、所望の反応または所望の効果が生じるように、さらに作用物質を含んでもよい。
医薬組成物は通常、均一な剤形で提供され、それ自体公知の方法で調製することができる。医薬組成物は、例えば、溶液または懸濁液の形態であってもよい。
医薬組成物は、好ましくは薬学的に許容される、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤および／または添加物を含み得る。用語“薬学的に許容される”は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を意味する。
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用することができ、本発明に包含される。この種の薬学的に許容される塩には、以下の酸から調製されるものが含まれるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。薬学的に許容される塩はまた、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩としても調製することができる。
医薬組成物に用いるのに適する緩衝物質には、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩およびリン酸塩が含まれる。
医薬組成物に用いるのに適する防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
注射用製剤には、リンガー乳酸塩のような薬学的に許容される添加物が含まれ得る。
用語“担体”は、適用を容易にする、増強する、または可能にするために活性成分がそこに組み合わされる、天然のまたは合成の有機または無機成分を意味する。本発明によれば、用語“担体”にはまた、患者への投与に適する１以上の適合性の固形または液状の充填剤、希釈剤または封入物質が含まれる。
非経腸投与用の可能性のある担体物質は、例えば、滅菌水、リンゲル溶液、リンゲル乳酸塩、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシ－プロピレンコポリマーである。
本明細書で用いる用語“添加物”は、医薬組成物中に存在し得て、例えば担体、結合剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤などの活性成分ではない、全ての物質を示すことを意図する。
本明細書に記載の作用物質および組成物は、従来の経路、例えば、注射または点滴を含む非経腸投与によって投与することができる。投与は、好ましくは、非経腸的、例えば静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内にできる。
非経腸投与用に適する組成物は、通常、好ましくはレシピエントの血液と等張である、活性化合物の滅菌水性または非水性調製物を含む。適合性担体および適合性溶媒の例は、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌された固定油が、溶液または懸濁媒体として使用される。
本明細書に記載の作用物質および組成物は、有効量で投与される。“有効量”とは、単独で、またはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を意味する。特定の疾患または特定の状態を処置する場合、所望の反応とは、好ましくは、その疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅延させること、特に疾患の進行を中断することまたは逆転させることを含む。疾患または病状の処置における所望の反応は、該疾患または該病状の発症の遅延または予防でもあり得る。
本明細書に記載の有効量の作用物質または組成物は、治療される状態、疾患の重症度、患者の年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメーター、治療期間、併用療法（存在する場合）のタイプ、特定の投与経路および同様の要因に依存し得る。従って、本明細書に記載の作用物質の投与量は、さまざまな上記パラメーターに依存し得る。患者における反応が初回用量では不十分な場合は、より高い用量（または、異なる、より局所的な投与経路によって効果的に達成される、より高い用量）を用いることができる。
本明細書に記載の作用物質および組成物は、患者に、例えばインビボで投与されて、本明細書に記載の障害などの種々の障害を処置または予防し得る。好ましい患者には、本明細書に記載の作用物質および組成物を投与することによって治療または改善され得る障害を有するヒト患者が含まれる。これには、ＣＬＤＮ１８．２の発現を特徴とする細胞に関連する障害が含まれる。
例えば、一態様において、本明細書に記載の作用物質は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞の存在を特徴とする癌疾患、例えば本明細書に記載のような癌疾患を有する患者を治療するために使用することができる。
本明細書に記載の医薬組成物および処置法は、本明細書に記載の疾患を予防するための免疫化またはワクチン接種のために使用することもできる。
本発明の医薬組成物は、１以上のアジュバントのような補充免疫増強物質（supplementing immunity－enhancing substance）と共に投与することができ、その有効性をさらに高めるため、好ましくは免疫刺激の相乗効果を達成するために、１以上の免疫増強物質を含み得る。用語“アジュバント”は、免疫応答を延長または強化または加速する化合物に関する。この点で、様々な種類のアジュバントに応じて、種々のメカニズムが可能である。例えば、ＤＣの成熟を可能にする化合物、例えばリポ多糖またはＣＤ４０リガンドは、第１のクラスの適切なアジュバントを形成する。一般的に、“危険シグナル”（ＬＰＳ、ＧＰ９６、ｄｓＲＮＡなど）またはＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインのタイプの免疫系に影響を及ぼす作用物質は、免疫応答を、制御された方法で強化することおよび／または影響を受けることを可能にするアジュバントとして使用することができる。本明細書中、要すればＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを使用することもできるが、上記で説明した特定の状況下で生じるそれらの副作用を考慮する必要がある。特に好ましいアジュバントは、モノカイン、リンホカイン、インターロイキンまたはケモカインなどのサイトカイン類、例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－α、または増殖因子、例えばｈＧＨである。さらに公知のアジュバント類は、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバントまたはMontanide（登録商標）などの油であり、最も好ましくは、Montanide（登録商標）ＩＳＡ５１である。Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドもまた、本発明の医薬組成物におけるアジュバントとしての使用に適している。
医薬組成物は、局所的または全身的に、好ましくは全身的に投与することができる。
用語“全身投与”は、薬剤(作用物質)が有意な量で個体の体内に広く分配され、所望の効果を発揮するような薬剤の投与を意味する。例えば、作用物質は、血液中で所望の効果を発揮し得て、および／または血管系に介在して作用の所望の部位に到達し得る。一般的な全身投与経路には、作用物質を血管系に直接導入する投与、または作用物質が吸着され、血管系に入り、血液に介在して１以上の所望の作用部位に運ばれる、経口、肺、または筋肉内投与が含まれる。
本発明によれば、全身投与は非経腸投与によるものであることが好ましい。用語“非経腸投与”は、作用物質が腸を通過しないような該作用物質の投与を意味する。用語“非経腸投与”には、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または動脈内投与が含まれるが、これに限定されるものではない。
投与はまた、例えば経口的、腹腔内または筋肉内に行うことができる。
本明細書に記載の作用物質および組成物は、単独で使用するか、または外科手術、放射線照射、化学療法および／または骨髄移植（自己、同系、同種異系または無関係）などの従来の治療レジメンと組み合わせて使用することができる。
本発明を図面および以下の実施例によって詳しく説明するが、これらは例示を目的として使用されているに過ぎず、限定を意図していない。これらの説明と実施例とにより、当業者は、本発明に同様に包含されるさらなる態様に到達することができる。
図１：ＴＣＲ－ＣＤ３複合体の図。細胞質内ＣＤ３免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を、円柱で示す（出典元：“The T cell receptor facts book”, MP Lefranc, G Lefranc, 2001）。 図２：ＣＡＲの連続世代の設計。異なる世代のＣＡＲ（１Ｇ、第１世代、２Ｇ、第２世代、３Ｇ、第３世代）の概略図。第１世代は細胞外ｓｃＦｖおよび細胞質ＣＤ３ζ鎖／ＺＡＰ７０介在細胞毒性を含み、第２世代はさらにＣＤ２８／ＰＩ３Ｋによる増殖を促進し、第３世代はさらに４－１ＢＢまたはＯＸ４０／ＴＲＡＦにより細胞生存を維持する（Casucci, M. et al. (2011) 2: 378－382）。 図３：ＣＬＤＮ１８．２に対するＴ細胞のリダイレクションのための異なる受容体フォーマットの模式図。左：ＣＬＤＮ１８．２特異的ｓｃＦｖフラグメント、ＩｇＧ１由来スペーサードメイン、ＣＤ２８共刺激部位およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる第２世代のＣＡＲ（ＣＡＲ－２８ζ）；中：ｓｃＦｖとマウスＴＣＲβ鎖の定常ドメインとの結合およびマウスＴＣＲα鎖の定常ドメインの共発現に基づく新規ＣＡＲフォーマット（ＣＡＲ／Ｃα）；右：ＴＣＲα／β鎖からなるマウスＴＣＲ（ｍｕ、マウスＴＣＲ）。 図４：ヒト組織のパネルにおけるＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２転写物のプロファイリング。Ａ、ＣＬＤＮ１８遺伝子座のゲノム構造（上）。四角で囲って示すエクソンは、ＣＬＤＮ１８．１（Ｅ１．１）またはＣＬＤＮ１８．２（Ｅ１．２）それぞれに固有のものである；下、ＣＬＤＮ１８変異体のエクソン組成；アーチ、２つの細胞外ドメイン；矢印、ＲＴ－ＰＣＲに用いたプライマー。Ｂ、エンドポイントＲＴ－ＰＣＲによる、正常ヒト組織（Ｎ）、原発腫瘍試料、および腫瘍細胞株における、ＣＬＤＮ１８アイソフォームの比較分析。Ｃ、リアルタイムＰＣＲによる、正常ヒト組織（Ｎ）、原発腫瘍試料、および腫瘍細胞株における定量化（Sahin U et al., Clin Cancer Res 2008;14:7624－34）。 図５：ＩＦＮｙ－ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した、ＣＬＤＮ１８．２由来ペプチドに対する免疫化したＨＬＡ－Ａ＊０２－トランスジェニックマウス由来の脾臓細胞のエキソビボ反応性。特定のアルゴリズムを適用してＣＬＤＮ１８．２の最初の８０アミノ酸について、ＨＬＡ－Ａ＊０２ ＣＬＤＮ１８．２特異的結合ペプチドを予測した（Rammensee H. et al. (1999) Immunogenetics 50, 213－9）。ＣＬＤＮ１８．２－免疫化ＨＬＡ－Ａ＊０２－トランスジェニックマウスの脾臓細胞を、ＣＬＤＮ１８．２ペプチドプールまたは予測されたＨＬＡ－Ａ＊０２－結合ＣＬＤＮ１８．２－由来ペプチドＣＬＤＮ１８．２－Ａ２－１－６に対する反応性について分析した。陽性対照：ＰＭＡ－処理した脾臓細胞；陰性対照：無関係なペプチドプール（ＨＩＶ－ｇａｇ）、無関係な９マー（nonamer）のペプチド（ＰＬＡＣ１－３１－３９）。 図６：インビトロ再刺激後のＨＬＡ－Ａ＊０２－トランスジェニックマウスからのＣＬＤＮ１８．２－特異的マウスＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリーソーティング。単一のＣＤ８＋／ＣＤ１３７＋Ｔ細胞を、ＣＬＤＮ１８．２重複ペプチドプールを有する脾臓細胞の再刺激後に単離した。対照：無関係のペプチドプールで再刺激した脾臓細胞（ＨＩＶ－ｇａｇ）。 図７：ＣＬＤＮ１８．２－免疫マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞から単離したＴＣＲの特異性試験。ＨＬＡ－Ａ＊０２－陽性健常ドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＴＣＲ－α／β鎖ＲＮＡを用いてトランスフェクトし、ＣＬＤＮ１８．２オーバーラップ１５マーペプチド（＝ＣＬＤＮ１８．２プール）またはＣＬＤＮ１８．２－由来ＨＬＡ－Ａ＊０２結合ペプチド（ＣＬＤＮ１８．２－Ａ２－４、ＣＬＤＮ２１８．２－Ａ２－５、ＣＬＤＮ１８．２－Ａ２－６）でパルスしたＫ５６２－Ａ２細胞の認識についてＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴにより試験した。陰性対照：無関係なペプチドプール（ＨＩＶ－ｇａｇ）、無関係な９マーのペプチド（ＰＬＡＣ１－３１－３９）；陽性対照：ＳＥＢ。 図８：ヒト前活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＬＤＮ１８．２－およびＣＬＤＮ６－特異的ＣＡＲの細胞表面発現。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＫＴ３で予め活性化し、２０μｇのＣＡＲ－ＲＮＡをトランスフェクトした。エレクトロポレーションの２０時間後、細胞を、それぞれＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲおよびＣＬＤＮ６－ＣＡＲに特異的な、ＰＥ－コンジュゲート抗ＣＤ８抗体およびイディオタイプ特異的フロロクロムコンジュゲート抗体で染色した。細胞を単一のＣＤ８＋Ｔリンパ球でゲーティング（gate）した。 図９：ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲによって介在されるＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞の特異的溶解。予め活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞に２０μｇのＣＡＲ ＲＮＡをトランスフェクトし、漸増Ｅ：Ｔ比（３０：１、１０：１、３：１）を用いてＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲのいずれかをコードするＲＮＡを用いてトランスフェクトした自己未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）と共に２０時間共培養した。陰性対照：ＣＬＮＤ６－特異的ＣＡＲでトランスフェクトした、またはＣＡＲ ＲＮＡなし（＝モック）でトランスフェクトしたＴ細胞、ＣＬＤＮ６－ＲＮＡでトランスフェクトしたｉＤＣ。特異的溶解を、４時間共培養後のルシフェラーゼベースの細胞毒性アッセイによって分析した。 図１０：イディオタイプ特異的抗体の添加によるＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞のＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ介在溶解の特異的阻害。予め活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞に２０μｇのＣＡＲ ＲＮＡをトランスフェクトし、３０：１のＥ：Ｔ比を用いてＣＬＤＮ１８．２－またはＣＬＤＮ６－ＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした自己ｉＤＣと共に２０時間共培養した。標的細胞を添加する前に１時間、エフェクターＴ細胞を、２μｇ／ｍｌのイディオタイプ特異的抗体で、またはそれなしで、予めインキュベートした。特異的溶解を、４時間共培養後のルシフェラーゼベースの細胞毒性アッセイによって分析した。 図１１：ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロでの抗原特異的増殖。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲのいずれかをコードするＲＮＡまたはＲＮＡなし（モック）でエレクトロポレーションし、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＬＤＮ１８．２のいずれかをコードするＩＶＴ－ＲＮＡ ５μｇまたは対照抗原ＣＬＤＮ９もしくはＣＬＤＮ６でトランスフェクトしたｉＤＣと共培養した。９６時間共培養後、細胞を採取し、ＣＦＳＥ蛍光をフローサイトメトリーで分析した。細胞をＣＤ８＋生存単一リンパ球でゲーティング（gate）した。 図１２：ワクチン接種後のマウスにおけるＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボでの抗原特異的活性化。ＢＡＬＢ／ｃ－マウスに、５ｘ１０６ ＣＬＤＮ１８－２－ＣＡＲ－ｅｆｆＬｕｃ－ＧＦＰ形質導入Ｔ細胞を移植した。ＡＣＴの２４時間後に、マウスを、２５μｇのＣＬＤＮ１８．２ ＲＮＡまたはＣｔｒｌ ＲＮＡを含むＲＮＡ（Ｆ１２－Ｌｉｐ）を静脈内注射によりワクチン接種した。（Ａ）蛍光色素結合抗体を用いたフローサイトメトリーによるＴ細胞の形質導入効率の測定。（Ｂ）マウスにおけるインビボでの発光強度を、ワクチン接種の４８時間後に測定した。色のついていない画像は、グレースケールの比較用写真(reference photo)に重ね合わされた光の強さ（黒、最低強度；白から濃い灰色、最も強い強度）を表す。
実施例
本明細書で用いる技術および方法は本明細書に記載されているか、またはそれ自体公知の方法で実施され、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記載のような方法で実施される。キットおよび反応剤の使用を含むすべての方法は、特に指示がない限り、製造者の情報に従って行われる。
実施例１：材料および方法
細胞株および反応剤
ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（Britten, C.M. et al. (2002), J. Immunol. Methods 259, 95－110）を安定にトランスフェクトされたヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（Lozzio, C.B. ＆ Lozzio, B.B (1975), Blood 45, 321－334）（例えば、Ｋ５６２－Ａ２と呼ばれる）を、ＴＣＲ検証アッセイのために、標準条件下で培養した。初代ヒト新生児包皮線維芽細胞株ＣＣＤ－１０７９Ｓｋ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ－２０９７）を、製造者の指示に従って培養した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球および樹状細胞（ＤＣ）
ＰＢＭＣを、バフィーコートからＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）密度勾配遠心分離により単離した。ＨＬＡアレル型をＰＣＲ標準法により決定した。単球を、抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotech, Bergisch－Gladbach, Germany）を用いて濃縮した。未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を、Kreiter et al. (2007), Cancer Immunol. Immunother., CII, 56, 1577－87に記載の通り、サイトカイン添加培養培地中で５日間、単球を分化させることにより得た。
ペプチドおよび刺激細胞へのペプチドのパルス刺激
クローディン－１８．２またはＨＩＶ－ｇａｇの配列に対応する１１個のアミノ酸重複を有するＮ末端およびＣ末端の遊離１５マーのペプチドのプール（抗原ペプチドプールと呼ばれる）を、標準固相化学（JPT GmbH, Berlin, Germany）により合成し、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯで希釈した。９マーのペプチドを、ＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯ中で再構成した。パルス刺激のために、刺激細胞を、異なるペプチド濃度を用いて培養培地中で３７℃にて１時間インキュベートした。
ＲＮＡのインビトロでの転写（ＩＶＴ）のためのベクター
全ての構築物は、既述のｐＳＴ１－ｓｅｃ－ｉｎｓｅｒｔ－２βｇＵＴＲ－Ａ（１２０）－Ｓａｐ１プラスミド（Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009－4017）の変異体である。マウスＴＣＲ鎖をコードするプラスミドの作製のために、マウスＴＣＲ－α、－β１および－β２定常領域をコードするｃＤＮＡを、商業的プロバイダから注文し、類似性に基づいてクローニングした（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１４５０６、Ｍ６４２３９およびＸ６７１２７）。特定のＶ（Ｄ）Ｊ ＰＣＲ産物を、かかるカセットに導入して、完全長ＴＣＲ鎖を産生した（ｐＳＴ１－マウスＴＣＲαβ－２βｇＵＴＲ－Ａ（１２０）と称する）。
完全長ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ１８．２ ａａ１－８０およびＣＬＤＮ６抗原を、既報の通り、ｐＳＴ１プラスミド中のＭＨＣクラスＩ輸送シグナル（ＭＩＴＤ）に連結させてクローニングした（Kreiter, S. et al. (2008), J. Immunol. 180, 309－318）。
インビトロで転写された（ＩＶＴ）ＲＮＡの作製および細胞への導入
ＩＶＴ ＲＮＡの作製を既報の通り実施し（Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009－4017）、予冷した４－ｍｍ ｇａｐ滅菌エレクトロポレーションキュベット（Bio－Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany）中、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（Lonza, Basel, Switzerland）中に懸濁した細胞に添加した。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ－Ｐｕｌｓｅｒ－ＩＩ装置（Bio－Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany）を用いて実施した（Ｔ細胞：４５０Ｖ／２５０μＦ；Ｋ５６２－Ａ２：２００Ｖ／３００μＦ）。
ＩＶＴ ＲＮＡを用いたＨＬＡ Ａ２．１／ＤＲ１マウスの結節内免疫化によるＴ細胞のインビボプライミング
Ａ２／ＤＲ１マウス（Pajot A. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060－69）のＴ細胞を、抗原をコードするＩＶＴ ＲＮＡを用いた反復的節内免疫化により、目的の抗原に対してインビボでプライミングした（Kreiter S. et al. (2010), Cancer Research 70, 9031－40）。節内免疫化のために、マウスをキシラジン／ケタミンで麻酔した。鼠径部リンパ節を外科的に露出させ、極細針（31G、BD Biosciences）を付けた使い捨て０．３ ｍｌ注射器を用いて、リンゲル液およびＲｎａｓｅフリー水に希釈した１０μＬ ＲＮＡ（２０μg）をゆっくり注射し、創部を閉じた。６回の免疫化サイクル後にマウスを屠殺し、脾臓細胞を単離した。
脾臓細胞の取得
脾臓を滅菌条件下で切離した後、それらをＰＢＳ含有ファルコンチューブに移した。脾臓を鉗子で機械的に破壊し、セルストレーナー（４０μｍ）で細胞懸濁液を得た。脾細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、赤血球溶解用の低張緩衝液に再懸濁した。室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした後、２０～３０ｍｌの培地またはＰＢＳを添加することによって反応を停止させた。脾臓細胞を遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄した。
ＣＤ１３７染色後の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の単一細胞選別
抗原特異的再刺激のために、免疫化Ａ２／ＤＲ１マウスからの脾臓細胞２．５ｘ１０６個／ウェルを２４ウェルプレートに播種し、目的の抗原または対照抗原をコードする重複ペプチドのプールをパルス処理した。２４時間のインキュベーション後に、細胞を収穫し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３抗体、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ４抗体、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ＣＤ８抗体およびＤｙｌｉｇｈｔ－６４９コンジュゲート抗ＣＤ１３７抗体で染色した。選別はＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーター（BD Biosciences）で行った。ＣＤ１３７、ＣＤ３およびＣＤ８に関して陽性な細胞を選別し、フィーダー細胞としてヒトＣＣＤ－１０７９Ｓｋ細胞を含む９６ウェルＶ底プレート（Greiner Bio－One）に、１ウェル当たり１細胞を取得し、４℃で遠心分離し、直ちに－８０℃で保存した。
選別された細胞からのＲＮＡ抽出、ＳＭＡＲＴ法に基づくｃＤＮＡ合成および非特異的増幅
選別されたＴ細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて、供給者の指示に従って、ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成のために鋳型スイッチプロトコールを用いた：ミント逆転写酵素（Evrogen JSC）を、第１鎖合成反応のプライミングのためのオリゴ（ｄＴ）－Ｔ－ｐｒｉｍｅｒ ｌｏｎｇおよびオリゴ（riboG）配列を導入するＴＳ－ｓｈｏｒｔ（Eurofins Genomic）と組み合わせて、逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性および鋳型スイッチによる伸長型鋳型の作製を可能にした（Matz, M. et al. (1999)Nucleic Acids Res. 27, 1558－1560）。製造者の指示に従って合成された第１鎖ｃＤＮＡを、２００μＭ ｄＮＴＰの存在下での、５Ｕ ＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Agilent Technologies）および０．４８μＭプライマーＴＳ－ＰＣＲプライマーによる２１サイクルの増幅に供した（サイクル条件：９５℃で２分、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒、７２℃で１分、７２℃で６分間の最終伸長）。ＴＣＲ遺伝子の増幅の成功を、マウスＴＣＲ－β定常領域特異的プライマーでコントロールし、強いバンドが検出された場合にのみ、引き続きクローン型特異的マウスＶα－／Ｖβ－ＰＣＲを行った。
ＴＣＲ増幅用のＰＣＲプライマーの設計
マウスＴＣＲコンセンサスプライマーを設計するために、ImMunoGeneTics（IMGT）データベース（http://www.imgt.org）に列挙されている全てのマウスＴＣＲ－Ｖβおよび－Ｖα遺伝子を、それぞれの対応するリーダー配列と共に、BioEdit Sequence Alignment Editor（例えば、http://www.bio－soft.net）でアラインメントした。最大３つの縮重塩基、４０－６０％のＧＣ含量、および３’末端にＧまたはＣを有する２４～２７ｂｐ長のフォワードプライマーを、可能な限り多くのリーダー配列にアニールするように設計し、稀な制限酵素部位およびコザック配列を特徴とする１５ｂｐの５’伸長部を設けた。リバースプライマーは、定常領域遺伝子の第１エクソンにアニールするように設計され、プライマーｍＴＲＡＣｅｘ１＿ａｓはＣαのアミノ酸２４～３１に対応する配列に結合し、ｍＴＲＢＣｅｘ１＿ａｓはＣβ１およびＣβ２中のアミノ酸（ａａ）８～１５に結合する。どちらのオリゴヌクレオチドも５’リン酸基を有するように合成した。プライマーを、同一のアニーリング温度を有する２～６個のフォワードオリゴのプールにまとめた。
Ｖ（Ｄ）Ｊ配列のＰＣＲ増幅およびクローニング
単離されたＴ細胞に由来する予め増幅したｃＤＮＡ６μｌを、０．６μＭ ｍＶα－／ｍＶβ－特異的オリゴプール、０．６μＭ ｍＣα－またはｍＣβ－オリゴ、２００μＭ ｄＮＴＰおよび５Ｕ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、４０サイクルのＰＣＲに供した（Ａｇｉｌｅｎｔ；サイクル条件：９５℃で１分、９４℃で３０秒、アニーリング温度で３０秒、７２℃で３０秒、７２℃で３分間の最終伸長）。Ｑｉａｇｅｎのキャピラリー電気泳動システムを用いてＰＣＲ産物を分析した。４７０－５５０ｂｐにバンドを有するサンプルを、アガロースゲルでサイズ分画し、バンドを切り出し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて精製した。ｍＴＲＢＣｅｘ１＿ａｓおよびｍＴＲＢＣｅｘ１＿ａｓプレイマーがそれぞれ、マウスにおけるＴＣＲ定常領域遺伝子Ｃβ１およびＣβ２の両方に合致するので、配列解析を行い、Ｖ（Ｄ）Ｊドメインおよびβ定常領域の両方の配列を明らかにした。ＤＮＡを消化し、完全なマウスＴＣＲ－α／β鎖のための適当なバックボーンを含むＩＶＴベクター中にクローニングした。
フローサイトメトリー分析
トランスフェクトされたＴＣＲ遺伝子の細胞表面発現を、ＴＣＲ β鎖の適当な可変領域ファミリーまたは定常領域に対する蛍光色素－コンジュゲート抗ＴＣＲ抗体（Beckman Coulter Inc., Fullerton, USA）をＣＤ３、ＣＤ８またはＣＤ４に対する抗体（BD Biosciences）と組み合わせて用いて、フローサイトメトリーで分析した。トランスフェクションされたＣＡＲの細胞表面発現を、それぞれのＣＡＲ構築物に含まれるｓｃＦｖフラグメントを認識する蛍光色素－結合イディオタイプ特異的抗体（Ganymed Pharmaceuticals）を用いて分析した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ ＩＩフローサイトメーターでＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（BD Biosciences）を用いて行った。
ルシフェラーゼ細胞傷害性アッセイ
細胞介在性細胞傷害を評価するために、５１Ｃｒ放出法の代替法および最適化法として、バイオルミネセンスに基づくアッセイを用いた。標準的なクロム放出アッセイとは対照的に、このアッセイでは、共インキュベーション後の生存可能なルシフェラーゼ発現標的細胞の数を計算することによって、エフェクター細胞の溶解活性を測定する。標的細胞に、ホタルPhotinus pyralisのホタル・ルシフェラーゼ（EC 1.13.12.7）をコードするルシフェラーゼ遺伝子を安定にまたは一過性にトランスフェクトした。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化を触媒する酵素である。この反応はＡＴＰ依存的であり、２段階で起こる：
ルシフェリン＋ＡＴＰ→ルシフェリルアデニレート＋ＰＰ ｉ
ルシフェリルアデニレート＋Ｏ ２ →オキシルシフェリン＋ＡＭＰ＋光。
標的細胞を、白色９６ウェルプレート（Nunc, Wiesbaden, Germany）に、１ウェルあたり１０４細胞の濃度で播種し、１００μlの最終容量で、種々の細胞数のＴＣＲトランスフェクトＴ細胞と共培養した。３時間後に、５０μlのＤ－ルシフェリン（BD Biosciences）含有反応ミックス（ルシフェリン（１μｇ／μｌ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ）、アデノシン５’－トリホスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ、０．４ｍＵ／μｌ、Sigma－Aldrich, St. Louis, USA）を細胞に添加した。反応ミックスへのＡＴＰａｓｅの添加により、死細胞から放出されたルシフェラーゼから生じる発光が減少した。
４時間の総インキュベーション時間後に、生細胞によって放射される生物発光を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００リーダー（Tecan, Crailsheim, Germany）を用いて測定した。２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００の添加によって誘導される完全な細胞溶解後に得られる発光値に対して、標的細胞のみによって放出された発光との関係で、殺細胞活性を計算した。データ出力の単位はカウント毎秒（ＣＰＳ）とし、特異的溶解パーセントは以下のように計算した：
（１－（ＣＰＳｅｘｐ－ＣＰＳｍｉｎ）／（ＣＰＳｍａｘ－ＣＰＳｍｉｎ）））＊１００。
最大発光（最大カウント毎秒、CPSmax）を、エフェクターなしで標的細胞をインキュベートした後に評価し、最小発光（CPSmin）を、完全な溶解のために界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で標的を処理した後に評価した。
ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポットアッセイ）
マイクロタイタープレート（Millipore, Bedford, MA, USA）に、抗ヒトＩＦＮγ抗体１－Ｄ１ｋ（Mabtech, Stockholm, Sweden）を室温で一晩、または抗マウスＩＦＮｙ抗体ＡＮ１８（Mabtech）を４℃で一晩、コーティングし、２％ヒトアルブミン（CSL Behring, Marburg, Germany）またはマウス培養培地でブロッキングした。エレクトロポレーションの２４時間後に、マウス設定では１ウェル当たり５ｘ１０５の脾細胞、ヒト設定においては２～５×１０４／ウェルの抗原提示刺激細胞を、０．３－３ｘ１０５／ウェルのＴＣＲ－トランスフェクトＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞と共に、トリプリケートで播種した。プレートを、一晩（３７℃、５％ＣＯ２）インキュベートし、ＰＢＳ中０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、最終濃度１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＦＮγビオチン化ｍＡＢ ７－Ｂ６－１（Mabtech）または抗マウスＩＦＮγビオチニル化ｍＡｂ Ｒ４－６Ａ２（Mabtech）と共に、３７℃で２時間インキュベートした。アビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼＨ（Vectastain Elite Kit；Vector Laboratories、Burlingame、USA）をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（Sigma, Deisenhofen, Germany）で発色させた。
ＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）増殖アッセイ
ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＡＲ ＲＮＡでトランスフェクトし、約２０時間後に、０．８μＭのＣＦＳＥで標識した。標識したＴ細胞を洗浄し、ＲＮＡ－トランスフェクトした自己由来ｉＤＣ（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）と共に培養した。共培養の４日後、細胞を収集し、細胞分裂後の娘細胞内のＣＦＳＥ蛍光の漸進的な半減に基づいてフローサイトメトリーにより増殖を分析した。
動物
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｖｉｅｒ Ｌａｂから購入した。月齢（８週齢）および性別（メス）適合動物を、実験を通して使用した。コンジェニック系統ＢＡＬＢ／ｃ－Ｔｈｙ１．１マウスを、BioNTech AG（Germany）の動物施設で飼育した。
レトロウイルス遺伝子操作および養子Ｔ細胞移植のためのＣＡＲ Ｔ細胞の調製
ＢＡＬＢ／ｃ－Ｔｈｙ１．１マウスの脾細胞を単離し、５ｎｇ／ｍＬのｒｈ ＩＬ－７および１０ｎｇ／ｍＬのｒｈ ＩＬ－１５（both Miltenyi）の存在下で、２μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ３（eBioscience）および１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８（Novus Biosciences）によって予め活性化させた。予活性化の２４時間後および４８時間後に、Ｔ細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ法（Takara）を用いてＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ－ｅｆｆＬｕｃ－ＧＦＰをコードするトリシストロン性ベクターでレトロウイルス的（ＭＬＶ－Ｅ）に形質導入した。その後、形質導入したＴ細胞を、５ｎｇ／ｍＬ ｒｈ ＩＬ－７および１０ｎｇ／ｍＬ ｒｈ ＩＬ－１５の存在下で３日間増殖させ、次いで、マウスに養子移植する前に、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（１．０８４）を用いてフィコール分離した。
マウス実験
５ｘ１０６ ＣＬＤＮ１８．２ ＣＡＲ形質導入ＢＡＬＢ／ｃ－Ｔｈｙ１．１＋ Ｔ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。次いで、マウスを、養子Ｔ細胞移植（ＡＣＴ）の２４時間後に、Ｆ１２：ＲＮＡ比が１．３：２のＲＮＡ（Ｌｉｐ）でワクチン接種した。全身生物発光撮像を行った。
インビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）
ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ－ｅｆｆＬｕｃ－ＧＦＰで形質導入されたＴ細胞の増殖を、ＩＶＩＳ発光イメージングシステム（Caliper Life Sciences）を用いるインビボ生物発光イメージングによって評価した。簡潔には、Ｄ－ルシフェリン（８０ｍｇ／ｋｇ体重； Perkin Elmer）の水溶液の注射の５分後に、放出された光子を定量した（１分間の積分時間）。動物内のルシフェラーゼ発現細胞にからの透過光の強度を、グレースケール画像として表し、黒は最も弱い強度であり、白色から暗灰色が最も強い生物発光シグナルである。マウスのグレースケール対照画像を、ＬＥＤ低照度照明下で得た。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．０ソフトウェアを用いて画像を重ね合わせた。
実施例２：クローディン－１８．２に特異的な高親和性ＨＬＡ－Ａ＊０２－制限マウスＴＣＲの単離
本発明者らは、ＣＬＤＮ１８．２のａａ １－８０をコードするＩＶＴ－ＲＮＡを用いる反復結節内免疫化によるＡ２／ＤＲ１マウスにおけるＣＬＤＮ１８．２の免疫原性の可能性を確認した。ヒトＣＬＤＮ１８遺伝子は、Ｎ末端の６９アミノ酸が異なる２つのタンパク質アイソフォーム（ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２）を生じる、２つの代替第１エクソンを有する（図４Ａ）。ＣＬＤＮ１８．１は正常組織でも、とりわけ肺で発現されるため、本発明者らは、ＣＬＤＮ１８．２特異的Ｔ細胞反応性を排他的に誘導するために、ＣＬＤＮ１８．２のＮ末端部分のみを用いた。本発明者らは、これらのマウスの脾細胞を、ＣＬＤＮ１８．２特異的Ｔ細胞の単離およびその後の対応するＴＣＲ遺伝子のクローニングに使用した。免疫化したマウスからの脾細胞を、ＣＬＤＮ１８．２特異的Ｔ細胞の誘導の成功について分析し、ＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりエキソビボでの予測されたＨＬＡ－Ａ＊０２結合ＣＬＤＮ１８．２ペプチドに対するそれらの反応性を分析した（図５）。
３匹すべてのマウスにおいて、ＲＮＡ免疫化によって有意な頻度のＣＬＤＮ１８．２特異的Ｔ細胞を誘導することができたが、Ｔ細胞反応性は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１に結合すると予測された２つのＣＬＤＮ１８．２ペプチド（ＣＬＤＮ１８．２－Ａ２－５および－ＣＬＤＮ１８．２－Ａ２－６）に注目した。
ＣＬＤＮ１８．２特異的Ｔ細胞の単離のために、免疫化したマウスの脾細胞をインビトロで再刺激し、ＣＤ１３７の活性化誘導上昇制御に基づいてフローサイトメトリーにより単一細胞を単離した（図６）。
３つ全ての免疫化Ａ２／ＤＲ１マウスからＣＬＤＮ１８．２－特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を回収することができ、合計６つのＣＬＤＮ１８．２－特異的ＴＣＲを単一ソーティングしたマウスＴ細胞からクローニングした。
ＴＣＲを免疫学的検証アッセイに供したところ、６つ全てのＣＬＤＮ１８．２－ＴＣＲが、以前にエキソビボでのＥＬＩＳＰＯＴ分析により同定された、２つのＨＬＡ－Ａ＊０２０１－拘束性エピトープ ＣＬＤＮ１８．２ ａａ７－１５（ＣＬＤＮ１８．２－Ａ２－５）およびＣＬＤＮ１８．２ ａａ８－１６（ＣＬＤＮ１８．２－Ａ２－６）の一方または両方を認識したことが明らかとなった（図７）。
実施例３：クローディン－１８．２－特異的ＣＡＲの作製およびインビトロでの検証
本発明者らは、ＣＤ３ζおよびＣＤ２８のそれぞれのシグナル伝達および共刺激部分を含むＣＬＤＮ１８．２を標的とする第２世代のＣＡＲを作製した。ＣＤ２８細胞内ドメインにおけるｌｃｋ結合部分の欠失は、ＣＡＲ連結に際してＩＬ２分泌を抑制し、調節性Ｔ細胞の誘導を防止する（Kofler D.M. et al., (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760－767）。ＣＡＲの細胞外部分におけるＩｇＧ１ Ｆｃ‘スペーサー’ドメインの改変は、 ‘オフターゲット’の活性化および自然免疫応答の意図しない開始を回避する（Hombach A. et al., (2010) Gene Therapy 17, 1206－1213）。
ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ Ｔ細胞によるＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞の特異的溶解を分析するために、ルシフェラーゼベースの細胞毒性アッセイを実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を予め活性化させ、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲまたは対照としてのＣＬＤＮ６－特異的ＣＡＲのいずれかをコードするＩＶＴ－ＲＮＡでトランスフェクトした。ＣＡＲの表面発現を、フローサイトメトリーによる蛍光色素結合抗体による染色後に確認した（図８）。両方のＣＡＲは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上でよく発現されていた。ＣＡＲをトランスフェクトしたＴ細胞を、異なるエフェクター対標的比を用いてＣＬＤＮ１８．２－またはＣＬＤＮ６－ＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした自己ｉＤＣと共に培養し、特異的溶解を共培養の４時間後に計算した（図９）。ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲおよびＣＬＤＮ６－ＣＡＲの両方は、それぞれＣＬＤＮ１８．２およびＣＬＤＮ６を発現するｉＤＣの特異的溶解に介在した。ｉＤＣがそれぞれの対照抗原を発現するとき、溶解は観察されなかった。
分析するために、ＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞のＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ－介在性溶解が、イディオタイプ特異的抗体の添加によって阻害され得る場合、ＣＡＲ Ｔ細胞を、標的細胞との共培養が開始される前に、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲに含まれるｓｃＦｖフラグメントに特異的に結合する抗体と共に、またはそれなしで、予めインキュベートして、ルシフェラーゼベースの細胞傷害アッセイを用いて溶解を分析した（図１０）。
ＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞のＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ－介在溶解は、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲのその標的抗原への結合を阻止することにより、３０：１の高Ｅ：Ｔ比でさえも効率的に阻害することができた。ＣＬＤＮ６－ＣＡＲ介在溶解の阻害は観察されず、抗体のＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲへの選択的結合を確認することはできなかった。この実験は、一方では、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲにより介在される溶解が専らＣＡＲのＣＬＤＮ１８．２特異性に依存し、他方では、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ検出に用いられるイディオタイプ特異的抗体が、原則として、重篤な有害事象の場合にはインビボでＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ Ｔ細胞の阻害に適用可能であることを確認した。
ＣＡＲ操作されたＴ細胞の抗腫瘍効果のための本質的な前提条件は、患者において増殖し続けるそれらの能力である。分析するために、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ Ｔ細胞が、ｉＤＣにおいて異所的に発現されるＣＬＤＮ１８．２に応答して効率的に増殖する場合、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ベースのインビトロ共培養アッセイを実施した。ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲをコードするＩＶＴ－ＲＮＡでトランスフェクトしたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥで標識し、ＣＬＤＮ１８．２または対照抗原ＣＬＤＮ９もしくはＣＬＤＮ６のいずれかをコードするＩＶＴ－ＲＮＡでトランスフェクトした自己ｉＤＣと共培養した。ＣＡＲの表面発現を、蛍光色素結合抗イディオタイプ特異的抗体を用いるフローサイトメトリーによって分析した（図１１Ａ）。共培養の４日後、ＣＦＳＥ－標識したＣＡＲ－トランスフェクトＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原特異的増殖をフローサイトメトリーにより分析した。ＣＬＤＮ１８．２に応答して約８６％のＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ介在性増殖が観察されたが、対照抗原をトランスフェクトされたｉＤＣ（ＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ６）に応答するＣＡＲ Ｔ細胞のバックグラウンド増殖のみが観察された（図１１Ｂ）。これらのデータは、ヒトｉＤＣにおける異所的ＣＬＤＮ１８．２発現により、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ Ｔ細胞の効率的な抗原特異的活性化および増殖が達成され得ることを確認する。
ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲがインビボでＣＡＲを有するＴ細胞の抗原特異的活性化および増殖に介在する能力を、同系マウスモデルで調べた。インビボで養子移入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の運命を追うために、ウイルスＴ２Ａ配列によって分離されたＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲの下流のルシフェラーゼ（effLuc）およびｅＧＦＰレポーター遺伝子をコードするトリシストロンレトロウイルスベクターを用いた。
ナイーブ型ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ形質導入マウスＴ細胞を移植した。移植の日に、形質導入されたＴ細胞上のＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ発現を、ｅＧＦＰレポーター発現と組み合わせた蛍光色素結合抗イディオタイプ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲは、約３６％のＣＤ８＋および約４５％のＣＤ４＋Ｔ細胞で高度に発現されていた（図１２Ａ）。対いで、移植したマウスを、ＣＬＤＮ１８．２または対照（Ｃｔｒｌ）抗原のいずれかをコードするＩＶＴ－ＲＮＡで処理した。ｍＲＮＡワクチン接種の２日後に対照ＲＮＡで処理したマウスと比較して、ＣＬＤＮ１８．２ ＲＮＡにおいて強い発光増加が観察され、同族抗原に応答してＣＬＤＮ１８．２－ＣＡＲ Ｔ細胞の有意な活性化および増殖が示された（図１２Ｂ）。これらのデータは、Ｔ細胞におけるＣＬＤＮ１８．２ ＣＡＲの機能および抗原特異性をインビボで明らかに示した。
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Figure 2023039980000002
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Claims (43)

  1. 配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体を含む、ペプチド。
  2. １００以下、５０以下、２０以下または１０以下のアミノ酸長である、請求項１に記載のペプチド。
  3. 配列番号２、３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列の変異体からなる、請求項１または２に記載のペプチド。
  4. 請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  5. 組換え核酸である、請求項４に記載の核酸。
  6. 請求項４または５に記載の核酸を含む細胞。
  7. 請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドまたはそのプロセシング産物を提示する細胞。
  8. 請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドと反応する、免疫反応性細胞。
  9. ＭＨＣ分子と複合体を形成していてよい、請求項１に記載のペプチドに結合する結合剤。
  10. ＭＨＣ分子と複合体を形成していてよい、請求項１に記載のペプチドに結合し、好ましくは該ペプチドと反応性であるＴ細胞受容体、または該Ｔ細胞受容体のポリペプチド鎖。
  11. Ｔ細胞受容体α鎖または該Ｔ細胞受容体α鎖を含むＴ細胞受容体であって、
    該Ｔ細胞受容体α鎖が、
    （ｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択されるＴ細胞受容体α鎖またはその変異体の、少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列を含むＴ細胞受容体α鎖、および
    （ｉｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択されるＴ細胞受容体α鎖配列またはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体、を含むＴ細胞受容体α鎖
    からなる群より選択される、Ｔ細胞受容体α鎖または該Ｔ細胞受容体α鎖を含むＴ細胞受容体。
  12. Ｔ細胞受容体β鎖または該Ｔ細胞受容体β鎖を含むＴ細胞受容体であって、
    該Ｔ細胞受容体β鎖が、（ｉ）配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択されるＴ細胞受容体β鎖またはその変異体の、少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列を含むＴ細胞受容体β鎖、および
    （ｉｉ）配列番号９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択されるＴ細胞受容体β鎖配列またはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体、を含むＴ細胞受容体β鎖、
    からなる群より選択される、Ｔ細胞受容体β鎖または該Ｔ細胞受容体β鎖を含むＴ細胞受容体。
  13. （Ｉ）（ｉ）配列番号ｘのＴ細胞受容体α鎖またはその変異体の、少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列を含むＴ細胞受容体α鎖、および
    （ｉｉ）配列番号ｘ＋１のＴ細胞受容体β鎖またはその変異体の、少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てのＣＤＲ配列を含むＴ細胞受容体β鎖（ここで、ｘは、８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択される）
    を含む、Ｔ細胞受容体、および
    （ＩＩ）（ｉ）配列番号ｘのＴ細胞受容体α鎖配列もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体、を含むＴ細胞受容体α鎖、および
    （ｉｉ）配列番号ｘ＋１のＴ細胞受容体β鎖配列もしくはそのフラグメント、または該配列もしくはフラグメントの変異体、を含むＴ細胞受容体β鎖（ここで、ｘは、８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択される）
    を含む、Ｔ細胞受容体
    からなる群より選択される、Ｔ細胞受容体。
  14. クローディン－１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に結合する人工Ｔ細胞受容体。
  15. ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメインに結合する、請求項１４に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  16. 該結合が特異的結合である、請求項１４または１５に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  17. ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインを含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  18. ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが、該人工Ｔ細胞受容体の細胞外ドメインに包含される、請求項１７に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  19. ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが、ＣＬＤＮ１８．２抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１７または１８に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  20. ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが、ＣＬＤＮ１８．２に特異性を有する免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）（ＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２））およびＣＬＤＮ１８．２に特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）（ＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２））を含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  21. 該重鎖可変領域（ＶＨ）および対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）が、ペプチドリンカー、好ましくはアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３を含むペプチドリンカーにより連結している、請求項２０に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  22. ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列またはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  23. ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列またはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  24. ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが、配列番号２３のアミノ酸配列またはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＨ（ＣＬＤＮ１８．２）、および配列番号３０のアミノ酸配列またはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含むＶＬ（ＣＬＤＮ１８．２）を含む、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  25. ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列またはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含む、請求項１７から２４のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  26. 膜貫通ドメインを含む、請求項１４から２５のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  27. Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項１４から２６のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  28. Ｔ細胞シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８と結合してよい、ＣＤ３－ｚｅｔａ、好ましくはＣＤ３－ｚｅｔａの細胞内ドメインを含む、請求項２７の人工Ｔ細胞受容体。
  29. 新生タンパク質の小胞体への輸送を指示するシグナルペプチドを含む、請求項１４から２８のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  30. 膜貫通ドメインにＣＬＤＮ１８．２の結合ドメインを連結させるスペーサー領域を含む、請求項１４から２９のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  31. ＮＨ２－シグナルペプチド－ＣＬＤＮ１８．２の結合ドメイン－スペーサー領域－膜貫通ドメイン－Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン－ＣＯＯＨなる構造を含む、請求項１４から３０のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  32. 配列番号４１のアミノ酸配列またはそのフラグメント、または該アミノ酸配列もしくはフラグメントの変異体を含む、請求項１４から３１のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  33. 請求項１０から１３のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体鎖またはＴ細胞受容体をコードするか、または請求項１４から３２のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  34. 請求項１０から１３のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体鎖またはＴ細胞受容体、または請求項１４から３２のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体を含み、および／または該Ｔ細胞受容体鎖またはＴ細胞受容体をコードするか、または該人工Ｔ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、細胞。
  35. 請求項３３に記載の核酸を用いてＴ細胞を形質転換する工程を含む、免疫反応性細胞の製造方法。
  36. （ｉ）請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド；
    （ｉｉ）請求項４、５および３３のいずれか一項に記載の核酸；
    （ｉｉｉ）請求項６、７および３４のいずれか一項に記載の細胞；
    （ｉｖ）請求項８に記載の免疫反応性細胞；
    （ｖ）請求項９に記載の結合剤；
    （ｖｉ）請求項１０から１３のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体；および
    （ｖｉｉ）請求項１４から３２のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体
    のいずれか１つを含む、医薬組成物。
  37. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 請求項３６または３７に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、癌の処置または予防方法。
  39. 治療に使用するための、特に癌の処置または予防に使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４、５および３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項６、７および３４のいずれか一項に記載の細胞、請求項８に記載の免疫反応性細胞、請求項９に記載の結合剤、請求項１０から１３のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体、または請求項１４から３２のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体。
  40. 請求項３６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、該対象において免疫応答を誘導する方法。
  41. Ｔ細胞を、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４または５に記載の核酸、および／または請求項６または７に記載の細胞、の１以上と接触させることを含む、Ｔ細胞を刺激する、プライミングする、および／または増殖させる方法。
  42. 請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４、５および３３のいずれか一項に記載の核酸、請求項６、７および３４のいずれか一項に記載の細胞、請求項８に記載の免疫反応性細胞、請求項９に記載の結合剤、請求項１０から１３のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体、または請求項１４から３２のいずれか一項に記載の人工Ｔ細胞受容体の治療的有効量を対象に提供する工程を含む、該対象における癌細胞を死滅させる方法。
  43. 対象から単離された生物学的サンプル中の、Ｔ細胞と請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドの反応性を決定することを含む、該対象における免疫応答を決定する方法。
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