CN115109141A - 闭合蛋白-18.2特异性免疫受体和t细胞表位 - Google Patents

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卡罗利娜·安娜·姆罗兹
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Abstract

本发明提供了用于免疫治疗的闭合蛋白‑18.2特异性免疫受体(T细胞受体和人工T细胞受体(嵌合抗原受体；CAR))和T细胞表位。

Description

闭合蛋白-18.2特异性免疫受体和T细胞表位
发明技术领域
本发明涉及提供对免疫治疗有用的闭合蛋白-18.2(Claudin-18.2)特异性免疫受体(T细胞受体和人工T细胞受体(嵌合抗原受体；CAR))和T细胞表位。
发明背景
免疫系统的进化导致脊椎动物在基于两种类型防御：先天性和过继性免疫的高效网络中。
与依赖于识别与病原体相关的常见分子模式的不变受体的进化的古老先天性免疫系统相比，过继性免疫是基于B细胞(B淋巴细胞)和T细胞(T淋巴细胞)上的高度特异性抗原受体和克隆选择。
然而，B细胞通过分泌抗体提高体液免疫反应，T细胞介导导致被识别细胞的破坏的细胞免疫反应。
在人类和动物中，T细胞在细胞介导的免疫中发挥核心作用。特定抗原的识别和结合是由T细胞表面表达的T细胞受体(TCR)介导的。
T细胞的T细胞受体(TCR)能够与结合到主要组织相容性复合体(MHC)分子并且呈现在靶细胞表面的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合引发T细胞内部的信号级联，导致增殖和分化为成熟的效应T细胞。为了能够靶向各种各样的抗原，T细胞受体需要具有极大的多样性。
这种多样性是通过对为TCR的不同结构区指定遗传密码的基因的不同不连续片段进行基因重排获得的。TCR是由一条α链和一条β链，或由一条γ链和一条δ链组成。TCR的α/β链是由涉及抗原识别的N末端高度多态性可变区和不变的恒定区组成。在基因水平，这些链被分成几个区：可变(V)区、多样性(D)区(只有β和δ链)、连接(J)区和和恒定(C)区。人β链基因包含超过60个可变(V)片段、2个多样性(D)片段、超过10个连接片段和2个恒定(C)区片段。人α链基因包含超过50个V片段和超过60个J片段，但是没有D片段，和一个C片段。鼠β链基因包含超过30个可变(V)片段、2个多样性(D)片段、超过10个连接片段和2个恒定(C)区片段。鼠α链基因包含差不多100个V片段，60个J片段，没有D片段，但有一个C片段。在T细胞分化期间，特异性T细胞受体基因通过对一个V、一个D(只有β和δ链)、一个J和一个C区基因进行重排来产生。TCR的多样性是通过不精确的V-(D)-J重排进一步扩大的，其中在重组位点引入和/或删除随机核苷酸。由于在T细胞成熟期间TCR基因座的重排发生在基因组中，每个成熟T细胞只表达一种特异性α/βTCR或γ/δTCR。
MHC和抗原结合是由TCR的互补决定区1、2和3(CDRl、CDR2、CDR3)介导的。对抗原识别和结合最关键的β链的CDR3，是由重排的TCRβ链基因的V-D-J连接来编码的。TCR是复杂的信号转导机构的一部分，该机构包括TCRα链和β链的异二聚体复合体，共受体CD4或CD8和CD3信号转导模块(图1)。虽然CD3链传递细胞内部的激活信号，但TCRα/β异二聚体仅负责抗原识别。因此，TCRα/β链的转移为重定向T细胞指向任何所关注的抗原提供了机会。
免疫治疗
抗原特异性免疫治疗旨在增强或诱导患者的特异性免疫反应，以控制传染性或恶性的疾病。越来越多的病原体和肿瘤相关抗原(TAA)的鉴定，导致用于免疫治疗的合适靶标的广泛收集。可以通过主动或被动免疫策略来特异性地靶向呈现来源于这些抗原的免疫原性肽(表位)的细胞。
主动免疫趋向于诱导和扩增患者内的抗原特异性T细胞，其能够特异性识别和杀伤病变细胞。相反，被动免疫依赖于T细胞的过继性转移，其在体外扩增并任选地进行基因工程化(过继性T细胞治疗)。
疫苗接种
肿瘤疫苗旨在通过主动免疫诱导内源性肿瘤特异性免疫反应。不同的抗原形式可以用于肿瘤疫苗接种，包括全部癌细胞、蛋白质、肽或诸如RNA、DNA的免疫载体或病毒载体，它们可以通过脉冲刺激DC直接在体内或在体外应用，接着转移到患者内。
由于免疫策略和检测抗原特异性免疫反应的方法的改进，可以鉴定治疗诱导的免疫反应的临床研究数稳定增加(Connerotte,T.等人(2008).Cancer Res.68.393 1-3940；Schmitt,M.等人(2008)Blood 1 1 1,1357-1365；Speiser.D.E.等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105,3849-3854；Adams,S.等人(2008)J.Immunol.181,776-784)。
然而，在大部分情况下，检测到的免疫反应不能系统地与临床结果相关联(Curigliano,G.等人(2006)Ann.Oncol.17.750-762；Rosenberg.S.A.等人(2004)Nat.Med.10,909-915)。
因此，源于肿瘤抗原的肽表位的准确确定可有助于改善疫苗接种策略的特异性和效率以及用于免疫监测的方法。
过继性细胞转移(ACT)
基于ACT的免疫治疗可以概括地定义为用预先敏化的T细胞进行被动免疫的形式，所述T细胞经从低前体频率到临床相关细胞数量的体外扩增之后被转移到非免疫受体或到自体宿主中。已经用于ACT实验的细胞类型是淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞(Mule,J.J.等人(1984)Science 225,1487-1489；Rosenberg,S.A.等人(1985)N.Engl.J.Med.3 13,1485-1492)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)(Rosenberg,S.A.等人(1994)J.Natl.Cancer Inst.86,1159-1166)、造血干细胞移植(HSCT)后的供体淋巴细胞和肿瘤特异性T细胞系或克隆(Dudley,M.E.等人(2001)J.Immunother.24,363-373；Yee,C,等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A99,16168-16173)。过继性T细胞转移已显示出针对诸如CMV的人类病毒感染具有治疗活性。然而在健康个体中，CMV感染和内源性潜伏病毒的再激活是由免疫系统控制的，这导致在诸如移植受体或AIDS患者的免疫受损个体中显著的发病率和死亡率。
Riddell和同事证明，转移源自HLA匹配的CMV血清反应阳性的移植供体的CD8+CMV特异性T细胞克隆后，通过过继性T细胞治疗来重建免疫抑制患者的病毒免疫性(Riddell,S.R.(1992)Science 257,238-241)。
作为可供选择的方法，将源自多克隆供体的CMV或EBV特异性T细胞群转移到移植受体中，导致了转移的T细胞增加的持久性(Rooney,CM.等人(1998)Blood 92,1549-1555；Peggs,K.S.等人(2003)Lancet 362,1375-1377)。
对于黑色素瘤的过继性免疫治疗，Rosenberg和同事建立了依赖于输注体外扩增的分离自切除的肿瘤的自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)与非清髓性淋巴排除化疗和高剂量IL2联合的ACT方法。最近公布的临床研究导致受治疗的转移性黑色素瘤患者～50％的客观反应率(Dudley,M.E.等人(2005)J.Clin.Oncol.23:2346-2357)。
然而，患者必须满足几个前提以有资格进行ACT免疫治疗。他们必须具有可切除的肿瘤。在细胞培养条件下肿瘤必须形成有生存力的TIL。TIL针对肿瘤抗原必须是反应性的，而且必须在体外扩增到足够的数量。尤其是在除黑色素瘤外的其它癌症中，获得此类肿瘤反应性的TIL很困难。此外，对正常人T淋巴细胞进行反复体外刺激和克隆扩增，导致端粒酶活性逐渐降低和端粒缩短，从而导致转移的T细胞的复制性衰老和降低的潜在持久性(Shen,X.等人(2007)J.Immunother.30:123-129)。
使用基因工程化的T细胞的ACT
克服ACT局限性的方法是自体T细胞的过继性转移，所述T细胞在短期体外培养期间被重新编程以表达具有确定的特异性的肿瘤反应性免疫受体，随后被再输注至患者体内(Kershaw M.H.等人(2013)Nature Reviews Cancer 13(8):525-41)。这一策略使得ACT适用于各种各样常见的恶性肿瘤，即使肿瘤反应性T细胞在患者中不存在。由于T细胞的抗原特异性完全依赖于TCRα-和β-链的异二聚体复合体，因此将克隆的TCR基因转移至T细胞提供了将它们重新定向至任何所关注的抗原的可能性。因此，TCR基因治疗为用自体淋巴细胞发展抗原特异性免疫治疗作为治疗方案提供了有吸引力的策略。TCR基因转移的主要优势是，在几天内产生治疗量的抗原特异性T细胞，以及引入在患者的内源性TCR所有组成成分中不存在的特异性的可能性。
几个团队证明，TCR基因转移是重新定向原始T细胞抗原特异性的有吸引力的策略(Morgan,R.A.等人(2003)J.Immunol.171,3287-3295；Cooper,L.J.等人(2000)J.Virol.74,8207-8212；Fujio.K.等人(2000)J.Immunol.165,528-532:Kessels,H.W.等人(2001)Nat.Immunol.2,957-961；Dembic,Z.等人(1986)Nature 320,232-238)。
最近由Rosenberg和他的团队在恶性黑色素瘤治疗的临床试验中证明，在人类中进行TCR基因治疗的可行性。用黑色素瘤/黑色素细胞抗原特异性TCR逆转录病毒转导的自体淋巴细胞进行过继性转移，导致多达30％的经治疗的黑色素瘤患者的癌症退化(Morgan,R.A.等人(2006)Science 314,126-129；Johnson,L.A.等人(2009)Blood 1 14,535-546)。
嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(CAR)是工程化受体，其将单克隆抗体的单链可变片段(scFv)与包含用于T细胞激活的一种或多种信号转导结构域的细胞内部分联合。CAR以非MHC限制性的方式识别天然抗原，并且可以因此用于所有的个体中，无论他们的HLA类型是什么，并且它们在CD4+T细胞和CD8+T细胞中是功能化的。
在过去的十年里已经报道了大量的CAR，它们靶向一组不同的细胞表面肿瘤抗原。通过并入共刺激结构域，它们的生物功能显著地改善，而产生了三重受体(scFv、CD28、CD3ζ)，被称为第二代CAR。第三代CAR包含诸如OX40和4-1BB的共刺激分子的另外的结构域，以增强修饰的T细胞的增殖能力和持久性(图2)。
用于抗原特异性免疫治疗的靶结构
多种肿瘤相关抗原(TAA)的发现，已经为抗原特异性免疫治疗的概念提供了基础(Novellino,L.等人(2005)Cancer Immunol.Immunother.54,187-207)。由于它们的遗传不稳定性，TAA是在肿瘤细胞上表达的不寻常蛋白质，其在正常细胞中不表达或有限表达。这些TAA可以通过免疫系统引起对恶性细胞的特异性识别。
通过使用自体肿瘤特异性T细胞(van der Bruggen,P.等人(1991)Science 254,1643-1647)、或循环抗体(Sahin,U.等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92,11810-11813)、反向免疫学方法、生物化学方法(Hunt,D.F.等人(1992)Science 256,1817-1820)，基因表达分析或电子克隆策略(Helftenbein,G.等人(2008)Gene 414,76-84)，进行肿瘤来源的cDNA表达库筛选，TAA的分子克隆产生了用于免疫治疗策略的相当数量的目标候选物。TAA分为几类，包括分化抗原、过表达抗原、肿瘤特异性剪接变异体、突变基因产物、病毒和癌睾丸抗原(CTA)。癌睾丸家族是TAA非常有希望的类别，因为它们的表达受限于睾丸和大量不同的肿瘤实体(Scanlan,M.J.等人(2002)Immunol.Rev.188,22-32)。迄今为止，已经描述了超过50种CT基因(Scanlan,M.J.等人(2004)Cancer Immun.4,1)，并且它们中的一些已经处在临床研究中(Adams,S.等人(2008)J.Immunol.181,776-784；Atanackovic,D.等人(2004)J.Immunol.172,3289-3296；Chen,Q.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101,9363-9368；Connerotte,T.等人(2008).Cancer Res.68,3931-3940；Davis,I.D.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101,10697-10702；Jager,E.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97,12198-12203；Marchand,M.等人(1999)Int.J.Cancer 80,219-230；Schuler-Thurner,B.等人(2000)J.Immunol.165,3492-3496)。
尽管用于免疫治疗方法的有吸引力的靶结构数目越来越多，确定的HLA限制的特异性T细胞克隆或系只针对它们中的几个存在(Chaux,P.等人(1999)J.Immunol.163,2928-2936；Zhang,Y.等人(2002)Tissue Antigens 60,365-371；Zhao,Y.等人(2005)J.Immunol.174,4415-4423)。
闭合蛋白(claudin)是位于上皮细胞和内皮的紧密连接内的整合膜蛋白。闭合蛋白预计具有含有两个胞外环的四个跨膜片段，而且N和C末端位于细胞质内。跨膜蛋白的闭合蛋白(CLDN)家族，在维持上皮和内皮紧密连接中发挥着核心作用，而且也可能在维持细胞骨架和信号传导中发挥作用。
CLDN18属于闭合蛋白家族，其是涉及形成紧密连接的具有4个跨膜结构域的细胞表面分子(Tsukita S,Nat Rev Mol Cell Biol 2001；2:285-93)。人类CLDN18基因具有2个可替代的第一外显子，产生在N-末端69个氨基酸不同的2种蛋白同种型(CLDN18.1和CLDN18.2)(Niimi T,Mol Cell Biol 2001；21:7380-90)，包括第一细胞外环(图4A)。一组限制性组织的转录谱示出了这些同种型具有不同的谱系定向，CLDN18.1主要在肺组织中表达，而CLDN18.2显示出胃特异性。CLDN18.2表达限于胃粘膜的短寿命分化上皮细胞，且不存在于胃干细胞区域和任何其它健康组织中。CLDN18.2表达与胃食道癌、胰腺癌和其它癌症有关(图4B、C；Sahin U等人,Clin Cancer Res 2008；14:7624–34；Karanjawala ZE等人,AmJ Surg Pathol 2008；32:188–96；)。针对该靶标的重组mAb目前正在进行临床II期试验，但CLDN18.2作为用于基于T细胞的治疗方法的靶标的评估尚未得以解决。
CLDN18.2在肿瘤上的频繁过表达使该分子有资格成为用于开发针对CLDN18.2的治疗剂(如疫苗治疗剂和治疗性抗体)的非常有吸引力的靶标。然而，迄今为止，尚未描述靶向于CLDN18.2的HLA-A*2限制性CLDN18.2 T细胞表位和T细胞受体或CAR，并且并未获知使用主动或被动免疫方法通过涉及T细胞的免疫治疗在体内是否可以靶向到表达CLDN18.2的癌细胞。
发明描述
发明概述
本发明涉及以下T细胞受体和人工T细胞受体，其特异于肿瘤相关抗原CLDN18.2，尤其是存在于细胞(如病变细胞)的表面上或呈递在细胞(如病变细胞或抗原呈递细胞)的表面上的肿瘤相关抗原CLDN18.2，以及包含由这些T细胞受体识别的表位(即CLDN18.2-T细胞表位)的肽。
通过过继转移工程化的表达此类T细胞受体或人工T细胞受体的T细胞，表达CLDN18.2的癌细胞可以被特异性靶向，从而导致癌细胞的选择性破坏。此外，本发明提供的T细胞表位可用于设计针对表达CLDN18.2的癌症的疫苗。
一方面，本发明涉及包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的肽。在一个实施方案中，肽的长度为100个或更少、50个或更少、20个或更少或者10个或更少的氨基酸。在一个实施方案中，可以处理肽以产生由选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体组成的肽。在一个实施方案中，肽由选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体组成。
在一个实施方案中，肽是MHC I类或II类呈递的肽，优选MHC I类呈递的肽，或者如果存在于细胞内，所述肽则可以被加工以产生是MHC I类或II类呈递的肽(优选是MHC I类呈递的肽)的加工产物。优选地，所述MHC I类或II类呈递的肽具有基本上对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体)的序列。优选地，本发明的肽能够刺激针对涉及以呈递CLDN18.2与MHC I类为特征的细胞的疾病的细胞应答。
在另一方面，本发明涉及包含编码本发明的肽的核苷酸序列的核酸和包含所述核酸的细胞。核酸可以是重组的核酸。核酸可存在于质粒或表达载体中，并且可以与启动子功能性连接。在一个实施方案中，核酸是RNA。优选地，细胞表达所述肽。细胞可以是重组细胞并且可以分泌编码的肽或其加工产物，可以在表面上表达它，并优选可以另外表达与所述肽或其加工产物结合的MHC分子，并且优选在细胞表面上呈递所述肽或其加工产物。在一个实施方案中，细胞内源性表达MHC分子。在另一个实施方案中，细胞以重组方式表达MHC分子和/或肽。细胞优选是非增殖的。在优选的实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞。
另一方面，本发明涉及呈递本发明的肽或其加工产物的细胞，其中加工产物优选是具有给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体)的肽。在一个实施方案中，所述细胞是包含含有编码本发明的肽的核苷酸序列的核酸的细胞。优选地，所述细胞表达所述核酸以产生所述肽。任选地，所述细胞加工所述肽，以产生由选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体组成的肽。细胞可以通过其表面上的MHC分子呈递肽或其加工产物。在一个实施方案中，细胞内源性表达MHC分子。在另一个实施方案中，细胞重组表达MHC分子。在一个实施方案中，通过向细胞中加入肽，将细胞的MHC分子负载(脉冲)有肽。细胞可以重组表达肽并且在细胞表面上呈递所述肽或其加工产物。细胞优选是非增殖的。在优选的实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，例如树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞。
另一方面，本发明涉及与本发明的肽反应的免疫反应性细胞，尤其是当呈递于诸如病变细胞的细胞表面时。免疫反应性细胞可以是已经在体外致敏以识别肽的细胞。免疫反应性细胞可以是T细胞，优选是细胞毒性T细胞。优选地，免疫反应性细胞结合基本上对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸的变体)的序列，尤其是当结合MHC(诸如病变细胞的细胞的表面上的MHC)时。
在另一方面，本发明涉及结合本发明的肽的结合剂，任选地，所述肽在具有MHC分子的复合体中。
另一方面，本发明涉及与本发明的肽结合的T细胞受体或所述T细胞受体的多肽链，任选地所述肽在具有MHC分子的复合体中，并且优选地所述T细胞与所述肽反应。在一个实施方案中，所述T细胞受体的多肽链是T细胞受体α链或T细胞受体β链。
另一方面，本发明涉及T细胞受体α链或包含所述T细胞受体α链的T细胞受体，
其中所述T细胞受体α链选自：
(i)T细胞受体α链，其包含选自SEQ ID NO：8、10、12、14、16和18的T细胞受体α链或其变体中的至少一个，优选两个，更优选全部三个CDR序列；以及
(ii)T细胞受体α链，其包含选自SEQ ID NO：8、10、12、14、16和18的T细胞受体α链序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。
在一个实施方案中，所述SEQ ID NO：选自SEQ ID NO：8、10、14和18，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的肽反应。
在一个实施方案中，所述SEQ ID NO：选自SEQ ID NO：10、12和14，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的肽反应。
另一方面，本发明涉及T细胞受体β链或包含所述T细胞受体β链的T细胞受体，
其中所述T细胞受体β链选自：
(i)T细胞受体β链，其包含选自SEQ ID NO：9、11、13、15、17和19的T细胞受体β链或其变体中的至少一个，优选两个，更优选全部三个CDR序列；以及
(ii)T细胞受体β链，其包含选自SEQ ID NO：9、11、13、15、17和19的T细胞受体β链序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。
在一个实施方案中，所述SEQ ID NO：选自SEQ ID NO：9、11、15和19，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的肽反应。
在一个实施方案中，所述SEQ ID NO：选自SEQ ID NO：11、13和15，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的肽反应。
另一方面，本发明涉及选自以下的T细胞受体：
(I)T细胞受体，其包含：
(i)T细胞受体α链，其包含SEQ ID NO：x的T细胞受体α链或其变体中的至少一个，优选两个，更优选全部三个CDR序列，以及
(ii)T细胞受体β链，其包含SEQ ID NO：x+1的T细胞受体β链或其变体中的至少一个，优选两个，更优选全部三个CDR序列；
其中x选自8、10、12、14、16和18；
以及
(II)T细胞受体，其包含：
(i)T细胞受体α链，其包含SEQ ID NO：x的T细胞受体α链序列或其片段，或者所述序列或片段的变体，以及
(ii)T细胞受体β链，其包含SEQ ID NO：x+1的T细胞受体β链序列或其片段，或者所述序列或片段的变体；
其中x选自8、10、12、14、16和18。
在一个实施方案中，所述x选自8、10、14和18，并且所述T细胞受体与包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的肽反应。
在一个实施方案中，所述x选自10、12和14，并且所述T细胞受体与包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的肽反应。
在一个实施方案中，当由T细胞表达和/或呈递在T细胞上的所述T细胞受体与如上所述呈递在细胞(如癌细胞)上的CLDN18.2-肽表位结合导致所述T细胞的增殖和/或活化，其中所述活化的T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶，并引发癌细胞的细胞溶解和/或细胞凋亡。
在另一方面，本发明涉及结合闭合蛋白-18.2(CLDN18.2)的人工T细胞受体。在一个实施方案中，结合是特异性结合。
在一个实施方案中，所述CLDN18.2在癌细胞中表达。在一个实施方案中，所述CLDN18.2在癌细胞的表面上表达。在一个实施方案中，所述人工T细胞受体结合CLDN18.2的细胞外结构域或细胞外结构域中的表位。在一个实施方案中，所述人工T细胞受体结合存在于活细胞表面上的CLDN18.2的天然表位。在一个实施方案中，所述人工T细胞受体结合CLDN18.2的第一细胞外环。在一个实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上的所述人工T细胞受体与存在于细胞(如癌细胞)上的CLDN18.2结合，导致所述T细胞的增殖和/或活化，其中所述活化的T细胞优选释放细胞毒性因子，如穿孔素和颗粒酶，并引发癌细胞的细胞溶解和/或细胞凋亡。
在一个实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含CLDN18.2的结合结构域。在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域被包括在所述人工T细胞受体的胞外结构域(exodomain)中。在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含CLDN18.2抗体的单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的重链可变区(VH)(VH(CLDN18.2))和对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白的轻链可变区(VL)(VL(CLDN18.2))。在一个实施方案中，所述重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)经由肽接头连接，优选包含氨基酸序列(GGGGS)3的肽接头。在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含VH(CLDN18.2)，所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含VL(CLDN18.2)，所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含VH(CLDN18.2)和VL(CLDN18.2)，所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域识别与CLDN18.2的结合结构域或CLDN18.2的抗体相同或基本上相同的表位，其中所述CLDN18.2的结合结构域或CLDN18.2的抗体包含VH(CLDN18.2)和VL(CLDN18.2)，所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体，和/或CLDN18.2的结合结构域与所述CLDN18.2-结合结构域或CLDN18.2-抗体竞争结合CLDN18.2。在一个实施方案中，CLDN18.2的结合结构域识别与包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体的CLDN18.2的结合结构域相同或基本上相同的表位，和/或与所述CLDN18.2-结合结构域竞争结合CLDN18.2。与第二结合结构域或抗体竞争结合靶标的结合结构域优选是与所述第二结合结构域或抗体拮抗。
在一个实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域是跨膜的疏水性α螺旋。在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域或其片段。
在一个实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含T细胞信号传导结构域。在一个实施方案中，T细胞信号传导结构域位于细胞内。在一个实施方案中，T细胞信号传导结构域包括CD3-ζ，优选包括CD3-ζ的胞内结构域(endodomain)，任选地与CD28组合。在一个实施方案中，T细胞信号传导结构域包含SEQ ID NO：40的序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。
在一个实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含指导新生蛋白进入内质网的信号肽。在一个实施方案中，信号肽在CLDN18.2的结合结构域之前。在一个实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO：37的序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。
在一个实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含将CLDN18.2的结合结构域连接到跨膜结构域的间隔子区。在一个实施方案中，间隔子区允许CLDN18.2的结合结构域在不同方向上定向以促进CLDN18.2的识别。在一个实施方案中，间隔子区包含来自IgG1的铰链区。在一个实施方案中，间隔子区包含SEQ ID NO：38的序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。
在一个实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含以下结构：
NH2-信号肽-CLDN18.2的结合结构域-间隔子区-跨膜结构域-T细胞信号传导结构域-COOH。
在一个实施方案中，本发明的人工T细胞受体包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
上述T细胞受体和人工T细胞受体优选特异于肿瘤相关抗原CLDN18.2，尤其是当存在于细胞(例如病变细胞)表面上时，或者当被呈递于细胞(例如病变细胞或抗原呈递细胞)表面上时。
本发明的T细胞受体和人工T细胞受体可以由细胞(如T细胞)表达和/或存在于细胞(如T细胞)表面上。
另一方面，本发明涉及包含编码本发明的T细胞受体链或T细胞受体或编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，核酸是重组核酸。在一个实施方案中，核酸是载体形式或RNA形式。
另一方面，本发明涉及以下细胞，其包含本发明的T细胞受体链或T细胞受体，或者本发明的人工T细胞受体和/或包含含有编码本发明的T细胞受体链或T细胞受体或者编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，所述核酸是RNA，优选是体外转录的RNA。细胞可以是表达本发明的T细胞受体链或T细胞受体或本发明的人工T细胞受体的细胞，和/或可以在细胞表面上具有本发明的T细胞受体链或T细胞受体，或者本发明的人工T细胞受体。在一个实施方案中，所述细胞是可用于过继细胞转移的细胞。细胞可以是效应物或干细胞，优选是免疫反应性细胞。免疫反应性细胞可以是T细胞，优选是细胞毒性T细胞。在一个实施方案中，免疫反应性细胞与肿瘤相关抗原CLDN18.2反应。在一个实施方案中，所述CLDN18.2存在于细胞(例如病变细胞)的表面上。在一个实施方案中，所述CLDN18.2被呈递于细胞(如病变细胞或抗原呈递细胞)的表面上，并且所述免疫反应性细胞与本发明的肽反应，尤其是当在MHC的背景下被呈递时，并且优选结合基本上对应于给定氨基酸序列(即选自SEQ ID NO：6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体)的序列。在一个实施方案中，所述细胞缺少内源性TCR的表面表达或对CLDN18.2无关抗原是特异性的。
在一个实施方案中，本发明的细胞在用于过继细胞转移之前，经受抗原特异性扩增和再激发，其中所述抗原特异性扩增和再激发可以通过将细胞暴露于优选呈递CLDN18.2或其肽片段的自体抗原呈递细胞来实现。
另一方面，本发明涉及产生免疫反应性细胞的方法，其包括用包含编码本发明的T细胞受体链或T细胞受体，或者编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸序列的核酸转导T细胞的步骤。
此外，本发明通常包括通过靶向病变细胞(如癌细胞，尤其是表达CLDN18.2的癌细胞)来治疗疾病。所述方法提供了选择性根除在表面上表达和/或呈递肿瘤相关抗原CLDN18.2的细胞，从而使对不表达和/或呈递CLDN18.2的正常细胞的不利影响最小化。因此，优选用于治疗的疾病是其中表达并任选地呈递CLDN18.2的疾病，如癌症疾病，尤其是本文所述的疾病。
当施用本发明的肽、包含编码本发明的肽的核苷酸序列的核酸或包含所述核酸的本发明的细胞时，治疗优选涉及主动免疫。优选地，CLDN18.2-特异性T细胞在患者中扩增，其能够识别和杀伤病变细胞。当施用本发明的免疫反应性细胞、本发明的T细胞受体、本发明的人工T细胞受体、包含编码本发明的T细胞受体或编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸序列的本发明的核酸、或者包含本发明的T细胞受体或人工T细胞受体和/或包含含有编码本发明的T细胞受体或编码本发明的人工T细胞受体的核苷酸序列的本发明的核酸的本发明的细胞时，治疗优选涉及被动免疫。优选地，能够识别和杀伤病变细胞并且任选地在体外经基因工程化和/或扩增的CLDN18.2-特异性T细胞被过继转移到患者体内。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含以下中的一种或多种：
(i)本发明的肽；
(ii)本发明的核酸；
(iii)本发明的细胞；
(iv)本发明的免疫反应性细胞；
(v)本发明的结合剂；
(vi)本发明的T细胞受体；和
(vi)本发明的人工T细胞受体。
本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体，并且可以任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。药物组合物可以是治疗性或预防性疫苗的形式。在一个实施方案中，药物组合物用于治疗或预防癌症疾病，例如本文所述的那些癌症疾病。
施用如上所述的药物组合物可以提供MHC II类呈递的表位，其能够引起对CLDN18.2的CD4+辅助T细胞应答和/或CD8+T细胞应答(包括在细胞表面上表达CLDN18.2和/或在MHC分子背景下呈递CLDN18.2的细胞)。或者或此外，施用如上所述的药物组合物可以提供MHC I类呈递的表位，其能够引起对CLDN18.2的CD8+T细胞应答。
另一方面，本发明涉及治疗或预防癌症疾病的方法，其包括向患者施用本发明的药物组合物。
另一方面，本发明涉及本发明的肽、本发明的核酸、本发明的细胞、本发明的免疫反应性细胞、本发明的结合剂、本发明的T细胞受体或本发明的人工T细胞受体，其用于治疗，尤其是用于治疗或预防癌症。
另一方面涉及诱导对象中的免疫应答的方法，其包括向对象施用本发明的药物组合物。
另一方面涉及用于刺激、引发和/或扩增T细胞的方法，包括使T细胞与以下中的一种或多种接触：本发明的肽、包含编码本发明的肽的核苷酸序列的本发明的核酸、包含所述核酸的本发明的细胞和/或呈递本发明的肽或其加工产物的本发明的细胞。在一个实施方案中，在MHC分子如细胞(例如抗原呈递细胞)表面上的MHC分子的背景下呈递本发明的肽。
在此方面，本发明可涉及制备CLDN18.2特异性T细胞的方法。可以在体外或体内刺激、引发和/或扩增T细胞。优选地，T细胞存在于获自对象的样品中。可以将刺激的、引发的和/或扩增的T细胞施用于对象，并且其对对象可以是自体的、同种异体的、同基因的。
在用于诱导对象的免疫应答的方法或用于刺激、引发和/或扩增T细胞的方法的上述方面中的本发明，可以涉及用于治疗对象中的癌症疾病的方法。
另一方面涉及杀伤对象的癌细胞的方法，其包括向对象提供治疗有效量的本发明的肽、本发明的核酸、本发明的细胞、本发明的免疫反应性细胞、本发明的结合剂、本发明的T细胞受体或本发明的人工T细胞受体。
本文所述的组合物和试剂优选能够诱导或促进针对以CLDN18.2表达和/或用MHCI类呈递CLDN18.2为特征的疾病，例如癌症疾病的细胞反应，优选细胞毒性T细胞活性。
一方面，本发明提供了本文所述的试剂和组合物，其用于本文所述的治疗方法。
本文所述的癌症疾病的治疗可以与手术切除和/或放射和/或传统化学疗法组合。
另一方面，本发明涉及用于确定对象中的免疫应答的方法，其包括在分离自对象的生物样品中确定与本发明的肽或呈递本发明的肽或其加工产物的本发明的细胞反应的T细胞。所述方法可以包括以下步骤：
(a)将包含分离自对象的T细胞的样品与以下中的一种或多种孵育：
(i)本发明的肽；
(ii)本发明的核酸，其包含编码本发明的肽的核苷酸序列；和
(iii)包含所述核酸的本发明的细胞或呈递本发明的肽或其加工产物的本发明的细胞；
以及
(b)检测T细胞的特异性活化，从而确定所述对象中是否存在免疫应答。
用于确定对象中的免疫应答的方法的上述方面中的本发明，可以涉及用于诊断对象中的癌症疾病的方法。
在诊断方法的一个实施方案中，生物样品源自组织或器官，其中组织或器官无疾病时的细胞基本上不表达CLDN18.2。
通常，将生物样品中的T细胞水平与参考水平进行比较，其中与所述参考水平的偏差指示了对象中疾病的存在和/或阶段。参考水平可以是在对照样品(例如，源自健康组织或对象)中确定的水平或源自健康对象的中值水平。与所述参考水平的“偏差”指定任何显著的变化，例如增加至少10％、20％或30％，优选至少40％或50％，甚至更高。优选地，所述生物样品中的T细胞的存在或与参考水平相比生物样品中增加的T细胞数量表明了疾病的存在。
T细胞可以分离自患者的外周血、淋巴结、组织样品(如来源于活检和切除术或者其它来源)。可以在原代T细胞或其它合适的衍生物上进行反应性测定。例如，可以融合T细胞以产生杂交瘤。用于测量T细胞应答性的测定是本领域已知的，并且包括增殖测定和细胞因子释放测定。
用于检测反应性T细胞的测定和指标包括但不限于使用IFNγELISPOT和IFNγ细胞内细胞因子染色。用于确定T细胞克隆是否将对特定肽作出应答的其它各种方法是本领域已知的。通常将肽加入到T细胞的悬浮液中，保持1至3天。可以通过增殖(如标记的胸苷的摄取)或细胞因子(如IL-2)的释放来测量T细胞的应答。各种测定可用于检测释放的细胞因子的存在。T细胞毒性测定可用于检测对抗原具有特异性的细胞毒性T细胞。在一个实施方案中，测试细胞毒性T细胞杀伤用MHC I类分子呈递抗原的靶细胞的能力。可以标记呈递抗原的靶细胞并将其加入到源自患者样品的T细胞悬浮液中。细胞毒性可以通过定量溶解细胞的标志物的释放来进行测量。测定中可以包括自发和总释放的对照。
在本发明的一个实施方案中，本文描述的癌症涉及表达CLDN18.2和/或在MHC分子的背景下呈递CLDN18.2的癌细胞。在本发明的一个实施方案中，病变细胞是癌细胞。在一个实施方案中，病变细胞(如癌细胞)是表达CLDN18.2和/或在MHC分子的背景下呈递CLDN18.2的细胞。在一个实施方案中，CLDN18.2的表达位于病变细胞的表面。
在本发明的一个实施方案中，癌症是腺癌，尤其是晚期腺癌。在一个实施方案中，癌症选自胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及上述癌症的转移、库肯勃氏瘤(Krukenberg tumor)、腹膜转移和/或淋巴结转移。在一个实施方案中，癌症选自胃癌、食道癌(尤其是下食道癌)、食道-胃结合部癌和胃食道癌。在一个实施方案中，患者是HER2/neu阴性患者或具有HER2/neu阳性状态但不符合曲妥珠单抗治疗的患者。
在本发明的一个实施方案中，癌细胞是选自以下的癌细胞:胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌如非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及上述癌症的转移、库肯勃氏瘤、腹膜转移和/或淋巴结转移。在一个实施方案中，癌细胞是选自以下的癌细胞:胃癌、食道癌(尤其是下食道癌)、食道-胃结合部癌和胃食道癌。
根据本发明，CLDN18.2优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
从以下详细描述和权利要求中，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
本发明的详细描述
尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，这是因为它们是可以变化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量进行组合以产生其它实施方案。各种描述的实施例和优选的实施方案不应被解释为将本发明仅限于所明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并包括将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素相组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，本申请中所有描述的要素的任意排列和组合应被视为通过本申请的描述而被公开。
优选地，本文使用的术语定义为如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger、B.Nagel和H.
Figure BDA0003709256050000191
编(1995)Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland中所述。
除非另有说明，本发明的实施将使用在本领域的文献中所解释的生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法(参见，例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，J.Sambrook等人编,Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor 1989)。
除非上下文中另有要求，本说明书和所附的权利要求书中，词语“包括”及变体如“包含”和“含有”将被理解为意味着包括所述的成员、整数或步骤或者成员，整数或步骤的组，但不排除任何其它的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，此类其它的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组可以被排除，即主题在于包括所指定的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本发明(尤其是权利要求的背景中)时所使用的术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”以及“该(the)”以及类似参考应被解释为包括单数和复数。本文对数值范围的叙述仅意图用作落入所述范围的单独提及的每个分开的值的速记法。除非另有说明，将各个单独的值并入本说明书中，如同在本文中对其进行单独叙述一样。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，本文所述的所有方法可以按任何合适的顺序实施。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并且不对所要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为表示对本发明的实施至关重要的任何非要求保护的要素。
在本说明书的整个文本中引用了数个文件。本文引用的各个文件(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、说明等)，无论是上文还是下文，都通过引用将其整体并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权因为是在先发明而先于此类公开。
在本发明的上下文中，术语“重组”是指“通过基因工程产生的”。优选地，在本发明的上下文中，“重组物”如重组细胞不是天然存在的。
本文使用的术语“天然存在”是指在自然界中可以发现此物的事实。例如，存在于有机体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离并且未被人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
术语“免疫应答”是指对抗原的综合性身体反应，优选是指细胞免疫应答或者细胞以及体液免疫应答。免疫应答可以是保护性/预防性(preventive)/预防性(prophylactic)和/或治疗性的。
“诱导免疫应答”可意味着在诱导前没有对特定抗原的免疫应答，但也可意味着在诱导前对特定抗原存在一定水平的免疫应答，并且在诱导后，所述免疫应答增强。因此，“诱导免疫应答”还包括“增强免疫应答”。优选地，在对象中诱导免疫应答后，保护所述对象免于发展疾病(如癌症疾病)或通过诱导免疫应答来改善疾病状况。例如，可以在具有癌症疾病的患者或具有发展为癌症疾病的风险的对象中诱导针对肿瘤相关抗原(如CLDN18.2)的免疫应答。在这种情况下，诱导免疫应答可意味着对象的疾病状况得到改善，对象不会发展转移瘤，或具有发展为癌症疾病的风险的对象不会发展癌症疾病。
“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“针对抗原的细胞应答”或类似术语旨在包括涉及以用I类或II类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答涉及被称为T细胞或T淋巴细胞的细胞，其作为“辅助者”或“杀伤者”。辅助T细胞(也被称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答起关键作用，和杀伤细胞(也被称为细胞毒性T细胞、细胞溶解性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤病变细胞如癌细胞，防止产生更多的病变细胞。
术语“抗原”涉及包含将产生和/或指导免疫应答的表位的试剂。优选地，本发明上下文中的抗原是(任选地，在加工之后)诱导免疫反应的分子，其优选对表达和/或呈递抗原的抗原或细胞是特异性的。术语“抗原”尤其包括蛋白和肽。抗原优选是对应于或源自天然存在的抗原的产物。此类天然存在的抗原可以包括或可以源自肿瘤相关抗原。
特别地，抗原或其肽片段应被T细胞受体识别。优选地，如果被T细胞受体识别，抗原或肽能够在适当的共刺激信号的存在下诱导携带识别抗原或肽的T细胞受体的T细胞克隆扩增。在本发明的实施方案的上下文中，抗原优选由细胞，优选由抗原呈递细胞和/或病变细胞，在MHC分子的背景下，呈递，这可导致对抗原(或呈递抗原的细胞)的免疫反应。
在优选的实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原，即可源自细胞质、细胞表面和细胞核的癌细胞的成分，尤其是那些细胞内产生(优选大量产生)的抗原或作为癌细胞上的表面抗原。
在本发明的上下文中，术语“肿瘤相关抗原”或“肿瘤抗原”涉及在正常条件下在有限数量的组织和/或器官或特定发育阶段特异性表达的蛋白，例如，肿瘤相关抗原可以在正常条件下在胃组织(优选胃粘膜)、生殖器官(如睾丸)、滋养层组织(如胎盘或生殖细胞系细胞)中特异性表达，并在一个或多个肿瘤或癌组织中表达或异常表达。在该背景下，“有限数量”优选是指不多于3，更优选不多于2。在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原包括例如分化抗原，优选细胞型特异性分化抗原，即在正常条件下在一定分化阶段中于某些细胞类型中特异性表达的蛋白；癌/睾丸抗原，即在正常条件下在睾丸中且有时在胎盘中特异性表达的蛋白；以及生殖细胞系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原优选与癌细胞的细胞表面相关，并且优选在正常组织中不表达或仅少量表达。优选地，肿瘤相关抗原或肿瘤相关抗原的异常表达鉴定癌细胞。在本发明的上下文中，由对象(例如患有癌症疾病的患者)中的癌细胞表达的肿瘤相关抗原优选为所述对象的自身蛋白。在优选的实施方案中，本发明的上下文中的肿瘤相关抗原在正常条件下表达，特别是在非必要的组织或器官(即当被免疫系统破坏时不会导致对象死亡的组织或器官)中表达，或在免疫系统不能或仅很难进入的身体器官或结构中表达。优选地，肿瘤相关抗原的氨基酸序列在正常组织中表达的肿瘤相关抗原与癌组织中表达的肿瘤相关抗原之间是相同的。优选地，肿瘤相关抗原由表达其的癌细胞呈递。
本发明的各个方面涉及肿瘤相关抗原CLDN18.2，并且本发明可涉及刺激或提供针对表达所述肿瘤相关抗原并且优选地用I类MHC呈递所述肿瘤相关抗原的癌细胞的抗肿瘤CTL反应。
闭合蛋白是一个蛋白家族，其是紧密连接的最重要组分，在那它们建立了控制上皮细胞间的细胞间隙中分子流动的细胞旁屏障。闭合蛋白是跨膜4次的跨膜蛋白，其N-末端和C末端都位于细胞质中。被称为EC1或ECL1的第一细胞外环或结构域由平均53个氨基酸组成，并且被称为EC2或ECL2的第二细胞外环或结构域由约24个氨基酸组成。闭合蛋白家族的细胞表面蛋白如CLDN18.2在不同来源的肿瘤中表达，由于它们选择性表达(在毒性相关的正常组织中不表达)且定位到质膜，尤其适合作为与抗体介导的癌症免疫治疗相关的靶结构。
CLDN18.2在正常组织的胃粘膜的分化上皮细胞中选择性表达。CLDN18.2在不同来源的癌症中表达，所述癌症如胰腺癌、食道癌、胃癌、支气管癌、乳腺癌和ENT肿瘤。CLDN18.2是用于预防和/或治疗原发性肿瘤的有价值的靶标，所述原发性肿瘤是例如胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌如非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌以及上述癌症的转移，尤其是胃癌转移，如库肯勃氏瘤、腹膜转移和淋巴结转移。
本文使用的术语“CLDN”是指闭合蛋白，并包括CLDN18.2。优选地，闭合蛋白是人类闭合蛋白。
术语“CLDN18”涉及闭合蛋白18并包括任何变体，这包括闭合蛋白18剪接变体1(闭合蛋白18.1(CLDN18.1))和闭合蛋白18剪接变体2(闭合蛋白18.2(CLDN18.2))。
术语“CLDN18.2”优选涉及人类CLDN18.2，尤其是涉及包含序列表的SEQ ID NO：1的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的蛋白，优选涉及由序列表的SEQ ID NO：1的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体组成的蛋白。CLDN18.2的第一细胞外环或结构域优选包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基酸27至81，更优选氨基酸29至78。CLDN18.2的第二细胞外环或结构域优选包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基酸140至180。所述第一和第二细胞外环或结构域优选形成CLDN18.2的细胞外部分或结构域。
本发明的术语“变体”尤其涉及突变体、剪接变体、构象、同种型、等位变体、物种变体和物种同系物，尤其是天然存在的变体。等位变体涉及基因正常序列的改变，其意义通常不清楚。完整的基因测序通常鉴定出给定基因的多个等位变体。物种同系物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同种的来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应包括任何翻译后修饰的变体和构象变体。
根据本发明的不同方面，目的是优选诱导或确定针对表达CLDN18.2且优选地以通过呈递CLDN18.2为特征的癌细胞的免疫应答，并诊断、治疗或预防涉及表达CLDN18.2的细胞的癌症疾病。优选地，免疫应答涉及针对表达CLDN18.2且优选地用I类MHC呈递CLDN18.2的癌细胞的抗CLDN18.2 CTL应答的刺激。
根据本发明，术语“表达CLDN18.2的癌症”或“CLDN18.2阳性癌症”是指涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症，优选在所述癌细胞的表面上表达CLDN18.2的癌细胞的癌症。或者或此外，所述表达CLDN18.2的癌细胞在MHC分子的背景下呈递CLDN18.2。在MHC分子的背景下呈递CLDN18.2的癌细胞可以被携带T细胞受体的免疫反应性细胞靶向，而在表面表达CLDN18.2的癌细胞可以被携带人工T细胞受体的免疫反应性细胞靶向。
“细胞表面”的使用是根据其在本领域的正常含义，因此包括可通过与蛋白和其它分子结合而接近的细胞外部。
如果CLDN18.2位于细胞表面，则CLDN18.2在细胞表面表达，并且可通过加入细胞的CLDN18.2特异性抗体进行结合而接近。
在本发明的上下文中，术语“细胞外部分”或“胞外结构域”是指诸如面向细胞的细胞外间隙的蛋白质的分子的一部分，且优选地例如通过抗原结合分子如位于细胞外的抗体可从所述细胞外部接近。优选地，该术语是指一个或多个细胞外环或结构域或其片段。
术语“部分(portion)”是指片段(fraction)。对于特定结构如氨基酸序列或蛋白，术语其“部分”可以表示所述结构的连续或不连续片段。优选地，氨基酸序列的一部分包含至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、优选至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、最优选至少90％的所述氨基酸序列的氨基酸。优选地，如果该部分是不连续片段，则所述不连续片段包含结构的2、3、4、5、6、7、8个或更多个部分，各个部分是结构的连续元件。例如，氨基酸序列的不连续片段可以包括所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8个或更多个，优选不超过4个部分，其中各个部分优选包含氨基酸序列的至少5个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、优选至少20个连续氨基酸、优选至少30个连续氨基酸。
术语“部分(part)”和“片段(fragment)”在本文中可互换使用，并且是指连续元件。例如，结构(如氨基酸序列或蛋白)的一部分是指所述结构的连续元件。结构的部分(portion)、部分(part)或片段优选包含所述结构的一个或多个功能性质。例如，表位、肽或蛋白的部分(portion)、部分(part)或片段优选免疫学等同于其来源的表位、肽或蛋白。在本发明的上下文中，结构(如氨基酸序列)的“部分”优选包含整个结构或氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％，优选由上述组成。蛋白序列的部分或片段优选包含蛋白序列的至少6个、尤其是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个、或至少100个连续氨基酸的序列。在本文中使用的术语“变体”包括如上所述的部分(portion)、部分(part)或片段。
根据本发明，如果表达水平低于胃细胞或胃组织中的表达水平时，CLDN18.2在细胞中基本不表达。优选地，表达水平小于胃细胞或胃组织中的表达水平的10％、优选小于5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％，或甚至更低。优选地，如果表达水平超过除胃以外的非癌组织中的表达水平不多于2倍、优选1.5倍，且优选不超过所述非癌组织中的表达水平，则CLDN18.2基本上不在细胞中表达。优选地，如果表达水平低于检测限和/或如果表达水平太低而不能通过加入细胞的CLDN18.2特异性抗体进行结合，则CLDN18.2基本上不在细胞中表达。
根据本发明，如果表达水平超过胃以外的非癌组织中的表达水平优选多于2倍，优选10倍、100倍、1000倍或10000倍，则CLDN18.2在细胞中表达。优选地，如果表达水平高于检测限和/或如果表达水平足够高以允许加入细胞的CLDN18.2特异性抗体进行结合，则CLDN18.2在细胞中表达。优选地，在细胞中表达的CLDN18.2是表达或暴露于所述细胞的表面上。
“靶细胞”是指作为免疫应答(如细胞免疫应答)的靶标的细胞。靶细胞包括呈递抗原或抗原表位(即源自抗原的肽片段)的细胞，并且包括任何不期望的细胞，如癌细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是表达CLDN18.2的细胞，其优选存在于细胞表面和/或用I类MHC呈递。
术语“表位”是指分子(如抗原)中的抗原决定簇，即被免疫系统识别(例如被T细胞识别)的分子的部分或片段，尤其是当在MHC分子的背景下呈递时。蛋白如肿瘤相关抗原的表位优选包含所述蛋白的连续或不连续部分，且优选为5至100，优选5至50，更优选8至30，最优选10至25个氨基酸长度，例如，表位可以优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸长度。尤其优选的是本发明的上下文中的表位是T细胞表位。
术语如“表位”、“抗原片段”、“抗原肽”或“免疫原性肽”在本文中可互换使用，优选涉及抗原的不完整表示，其优选能够引发针对抗原或者表达或包含并优选呈递抗原的细胞的免疫应答。优选地，这些术语涉及抗原的免疫原性部分。优选地，由T细胞受体识别(即特异性结合)抗原的部分，尤其是如果其在MHC分子的背景下呈递。某些优选的免疫原性部分结合例如在细胞表面上的MHC I类或II类分子，，因此是MHC结合肽。如本文所用，如果使用本领域已知的任何测定可检测到此类结合，则称肽“结合”MHC I类或II类分子。
优选地，本文公开的包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体，能够刺激免疫应答，优选为针对CLDN18.2或以表达CLDN18.2为特征并优选以呈递CLDN18.2为特征的细胞的细胞应答。优选地，此类肽能够刺激针对以用I类MHC呈递CLDN18.2为特征的细胞的细胞应答，并且优选能够刺激CLDN18.2反应性CTL。优选地，本发明的肽是MHC I类和/或II类呈递的肽，或可以被加工以产生MHC I类和/或II类呈递的肽。优选地，与MHC分子结合的序列选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7。
如果抗原肽是直接呈递的，即没有加工，尤其是没有切割，则其具有适合于结合MHC分子(尤其是I类MHC分子)的长度，长度优选为7-20个氨基酸，更优选为7-12个氨基酸，更优选为8-11个氨基酸，尤其为9或10个氨基酸。优选地，直接呈递的抗原肽的序列基本上对应于选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的序列且优选与以上的序列完全相同。
如果抗原肽是在加工之后尤其是在切割之后呈递的，则通过加工产生的肽具有适合于结合MHC分子(尤其是I类MHC分子)的长度，长度优选为7-20个氨基酸，更优选为7-12个氨基酸，更优选为8-11个氨基酸，尤其为9或10个氨基酸。优选地，加工后呈递的肽的序列基本上对应于选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的序列且优选与选自以上的序列完全相同。因此，在一个实施方案中，本发明的抗原肽包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的序列，且在抗原肽加工后产生选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的序列。
具有基本上对应于由MHC分子呈递的肽的序列的氨基酸序列的肽可以在一个或多个残基处不同，所述残基对于MHC所呈递的肽的TCR识别或对于肽结合MHC是不必要的。此类基本上对应的肽优选也能够刺激抗原特异性细胞应答，如抗原特异性CTL。在不影响TCR识别但提高与MHC结合的稳定性的残基处具有不同于呈递的肽的氨基酸序列的肽，可以提高抗原肽的免疫原性，并且在本文中可以被称为“优化的肽”。利用这些残基中哪些可更可能影响与MHC或TCR的结合的现有知识，可以采用推理研究法设计基本相应的肽。所获得的具有功能的肽被认为是抗原肽。在本文中使用的术语“变体”包括如上所述的序列。
“抗原加工”是指将抗原降解成加工产物，其为所述抗原的片段(例如，将蛋白降解为肽)，并将这些片段中的一个或多个与MHC分子缔合(例如，经结合)，用于由细胞(优选抗原呈递细胞)呈递给特异性T细胞。
抗原呈递细胞(APC)是在主要组织相容性复合体(MHC)的背景下将抗原展示在细胞表面的细胞。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别该复合体。抗原呈递细胞加工抗原并将其呈递给T细胞。
通过吞噬作用或受体介导的内吞作用，专职抗原呈递细胞非常有效地内化抗原，然后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段。T细胞识别并与抗原呈递细胞膜上的抗原II类MHC分子复合体相互作用。然后由抗原呈递细胞产生另外的共刺激信号，导致T细胞激活。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的定义特征。抗原呈递细胞包括专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
专职抗原呈递细胞的主要类型是树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和某些活化的上皮细胞，树突状细胞具有最广泛的抗原呈递范围，并且可能是最重要的抗原呈递细胞。
非专职抗原呈递细胞不组成型表达与初始T细胞相互作用所需的MHC II类蛋白；这些蛋白仅在通过某些细胞因子如IFNγ刺激非专职抗原呈递细胞时才表达。
树突状细胞(DC)是通过MHC II类和I类抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递给T细胞的白细胞群。众所周知，树突状细胞是免疫应答的有效诱导物，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。
树突状细胞和祖细胞可以获自外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、瘤周组织浸润细胞、淋巴结、脾脏、皮肤、脐带血或任何其它合适的组织或液体。例如，树突状细胞可以通过将细胞因子如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的组合加入到自外周血收获的单核细胞的培养物中来进行体外分化。或者，自外周血、脐带血或骨髓收获的CD34阳性细胞可以通过向培养基中加入GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或其它诱导树突状细胞的分化、成熟和增殖的化合物来分化成树突状细胞。
树突状细胞方便地被分类为“未成熟”细胞和“成熟”细胞，其可以用作区分两种良好表征的表型的简单方法。然而，这个命名不应被解释为排除所有可能的中间分化阶段。
未成熟的树突状细胞被表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的特征通常是这些标志物的较低表达，但负责T细胞活化的细胞表面分子，如I类和II类MHC、粘附分子(例如CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)高表达。
树突状细胞的成熟被称为树突状细胞活化的状态，其中此类抗原呈递树突状细胞导致T细胞的引发，而未成熟树突状细胞的呈递导致耐受性。树突状细胞成熟主要由具有由先天受体(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎性细胞因子(TNF、IL-1、IFN)、在树突状细胞表面通过CD40L连接CD40和从经历应激细胞死亡的细胞释放的物质所检测到的微生物特征的生物分子引起。可以通过用细胞因子(如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子α)体外培养骨髓细胞来获得树突状细胞。
细胞(如抗原呈递细胞或靶细胞)可以通过用肽暴露，即脉冲细胞或用编码包括待呈递肽的肽或蛋白的核酸(优选RNA)(如编码抗原的核酸)转导细胞负载有MHC I类呈递的肽。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含负载有抗原肽的抗原呈递细胞。在这方面，方案可依赖于以使得树突状细胞人工呈递抗原肽的方式操作的所述树突状细胞的体外培养/分化。基因工程改造的树突状细胞的产生可包括将编码抗原或抗原肽的核酸引入树突状细胞。用mRNA转染树突状细胞是刺激强的抗肿瘤免疫的有希望的抗原负载技术。此类转染可以在体外进行，并且包含此类转染细胞的药物组合物于是可用于治疗目的。或者，可以向患者施用靶向树突状细胞或其它抗原呈递细胞的基因递送载体，导致在体内发生转染。例如，通常可使用本领域已知的任何方法进行树突状细胞的体内和离体转染，所述方法例如WO97/24447中所述的方法或由Mahvi等人，Immunology and cell Biology 75:456-460,1997中所述的基因枪法。通过将树突状细胞或祖细胞与抗原、DNA(裸露或在质粒载体中)或RNA；或者与表达抗原的重组细菌或病毒(例如牛痘、禽痘(fowipox)、腺病毒或慢病毒载体)一起孵育，可以实现树突状细胞的抗原负载。
术语“免疫原性”涉及抗原诱导免疫反应的相对效率。
在本发明的上下文中，术语“免疫效应子功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，所述组分导致例如杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展(包括抑制肿瘤播散和转移)。优选地，在本发明的上下文中的免疫效应子功能是T细胞介导的效应子功能。此类功能包括，在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下，由T细胞受体识别在MHC II类分子的背景下的抗原或源自抗原的抗原肽、细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的激活，以及在CTL的情况下，由T细胞受体识别在MHC I类分子的背景下的抗原或源自抗原的抗原肽、消除在MHC I类分子的背景下呈递的细胞，即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞，例如通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解、产生细胞因子如IFN-γ和TNF-α以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞溶解性杀伤。
在本发明的上下文中，术语“免疫反应性细胞”或“免疫效应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应子功能的细胞。“免疫反应性细胞”优选能够结合抗原，例如在细胞表面表达的抗原或以呈递抗原或源自抗原的抗原肽为特征的细胞，并介导免疫应答。例如，此类细胞分泌细胞因子和/或趋化因子、杀伤微生物、分泌抗体、识别被感染的或癌细胞以及任选地消除这些细胞。例如，免疫反应性细胞包含T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫反应性细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+T细胞。
优选地，“免疫反应性细胞”以某种程度的特异性识别抗原或源自抗原的抗原肽，尤其是如果在MHC分子的背景下呈递，例如在抗原呈递细胞或病变细胞(如癌细胞)的表面。优选地，所述识别能使识别抗原或源自所述抗原的抗原肽的细胞具有应答性或反应性。如果细胞是携带识别在MHC II类分子的背景下的抗原或源自抗原的抗原肽的受体的辅助T细胞(CD4+T细胞)，，则此类应答性或反应性可涉及细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的激活。如果细胞是CTL，则此类应答性或反应性可涉及消除在MHC I类分子的背景下呈递的细胞，即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞，例如通过细胞凋亡或穿孔素介导的细胞溶解。根据本发明，CTL应答性可包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生、活化标志物如CD44和CD69的上调以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞溶解性杀伤。CTL应答性也可以使用精确指示CTL应答性的人工报告物来确定。此类识别抗原或源自抗原的抗原肽并且具有应答性或反应性的CTL在本文中也称为“抗原应答性CTL”。如果细胞是B细胞，则此类应答性可涉及免疫球蛋白的释放。
根据本发明，术语“免疫反应性细胞”还包括通过适当刺激能成熟为免疫细胞(例如T细胞，尤其是T辅助细胞或细胞溶解性T细胞)的细胞。免疫反应性细胞包含CD34+造血干细胞、未成熟和成熟的T细胞以及未成熟和成熟的B细胞。如果需要产生识别抗原的细胞溶解性或T辅助细胞，则在有利于细胞溶解性T细胞和T辅助细胞的产生、分化和/或选择的条件下，使免疫反应性细胞与呈递抗原或抗原肽的细胞接触。当暴露于抗原时，T细胞前体分化成细胞溶解性T细胞，类似于免疫系统的克隆选择。
“淋巴样细胞”是任选地在适当修饰后(例如，在T细胞受体转移后)，能够产生免疫应答如细胞免疫应答的细胞或此类细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞(优选T淋巴细胞)、淋巴母细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是本文所述的免疫反应性细胞。优选的淋巴样细胞是缺乏T细胞受体的内源性表达的T细胞，其可被修饰以在细胞表面上表达此类T细胞受体。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包含细胞溶解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)。
T细胞属于被称为淋巴细胞的白细胞组，在细胞介导的免疫中起着核心作用。通过在其细胞表面上存在被称为T细胞受体(TCR)的特异性受体，它们可以与其它淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)相区别。胸腺是负责T细胞的T细胞成熟的主要器官。已经发现了数种不同的T细胞亚群，每种具有不同的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其它白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞、激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞等功能。这些细胞也称为CD4+T细胞，这是因为它们在其表面表达CD4蛋白。当辅助T细胞面对由在抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子呈递的肽抗原时，所述辅助T细胞被激活。一旦被激活，它们迅速分裂并分泌被称为细胞因子的小蛋白，所述细胞因子在主动免疫应答中进行调节或辅助。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。这些细胞也称为CD8+T细胞，这是因为它们在其表面表达CD8糖蛋白。这些细胞通过与存在于身体的几乎每个细胞表面上的MHC I类相关的抗原结合来识别其靶标。
大多数T细胞具有作为数种蛋白的复合体存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两个单独的肽链组成，所述肽链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称为α-和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T cell)代表在其表面上具有不同的T细胞受体(TCR)的小的T细胞亚群。然而，在γδT细胞中，TCR由一个γ链和一个δ链组成。这组T细胞远不及αβT细胞常见(总T细胞的2％)。
T细胞受体的结构非常类似于免疫球蛋白Fab片段，其是定义为抗体臂的组合的轻链和重链的区域。TCR的每个链是免疫球蛋白超家族的成员，并且具有一个N末端可变(V)结构域，一个恒定(C)结构域，跨膜/细胞跨膜区和C末端的短的细胞质尾。
根据本发明，术语“T细胞受体的可变区”涉及TCR链的可变结构域。
TCRα链和β链的可变区具有三个高变区或互补决定区(CDR)，而β链的可变区具有通常不接触抗原的另外的高变区(HV4)，因此不被认为是CDR。CDR3是负责识别加工抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示与抗原肽的N末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。认为CDR2识别MHC。不认为β链的CDR4参与抗原识别，但已显示与超抗原相互作用。
根据本发明，术语“至少一个CDR序列”优选是指至少CDR3序列。术语“T细胞受体链的CDR序列”优选涉及T细胞受体的α链或β链的CDR1、CDR2和CDR3。
TCR结构域的恒定结构域由短的连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成在两条链之间形成连接的二硫键。
所有T细胞源自骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞居住于胸腺并通过细胞分裂扩增以产生大量未成熟的胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，因此被分类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们通过其发育而发展，它们成为双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，最后成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放到外周组织。
通过将T细胞受体与在另一细胞上的主要组织相容性复合体(MHC)呈递的短肽结合，提供T细胞活化中的第一信号。这确保仅具有该肽特异性TCR的T细胞被激活。伴侣细胞通常是一种专职抗原呈递细胞(APC)，尽管B细胞和巨噬细胞可以是重要的APC，但在初始应答的情况下通常是树状细胞。通过MHC I类分子呈递给CD8+T细胞的肽的长度为8-10个氨基酸；随着MHC II类分子的结合槽的末端打开，由MHC II类分子呈递给CD4+T细胞的肽更长。
通常可以使用标准方法在体外或离体制备T细胞。例如，使用商购的细胞分离系统，T细胞可存在于(或分离自)哺乳动物(例如患者)的骨髓、外周血或者骨髓或外周血的一部分中。或者，T细胞可以源自相关或不相关的人类、非人类动物、细胞系或培养物。“包含T细胞的样品”可以是例如外周血单核细胞(PBMC)。
可以用抗原、肽、核酸和/或表达抗原的抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞。在足以允许产生对抗原、肽和/或呈递抗原或肽的细胞具有特异性的T细胞的条件和时间下进行此类刺激。
可以以各种方式检测CD4+或CD8+T细胞的特异性活化。用于检测特异性T细胞活化的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子(例如淋巴因子)的产生或细胞溶解活性的产生。对于CD4+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测T细胞的增殖。对于CD8+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测细胞溶解活性的产生。
为了产生CD8+T细胞系，用产生抗原的核酸转染的抗原呈递细胞(优选自体抗原呈递细胞)可以用作刺激细胞。
可以将核酸(例如编码T细胞受体(TCR)链的RNA)引入淋巴样细胞如T细胞或具有溶解潜能的其它细胞。在合适的实施方案中，从抗原特异性T细胞系中克隆出TCRα和β链，并用于过继性T细胞治疗。在这方面，本发明提供了对本文公开的CLDN18.2或CLDN18.2肽特异的T细胞受体。通常，本发明的该方面涉及识别或结合在MHC的背景下呈递的CLDN18.2肽的T细胞受体。可以在分别的核酸分子，如表达载体或单个核酸分子上包含编码T细胞受体(例如，根据本发明提供的T细胞受体)的α-和β-链的核酸。因此，术语“编码T细胞受体的核酸”或类似术语涉及在相同或优选不同的核酸分子上编码T细胞受体链的核酸分子。
术语“与肽反应的免疫反应性细胞”涉及以下免疫反应性细胞，当其识别肽时，尤其是如果在MHC分子的背景下例如在抗原呈递细胞或病变细胞(如癌细胞)的表面上呈递的肽，，发挥如上所述的免疫反应性细胞的效应子功能。
术语“与肽反应的T细胞受体”涉及以下T细胞受体，当存在于免疫反应性细胞上时，T细胞受体识别肽，尤其是如果在MHC分子的背景下，例如在抗原呈递细胞或病变细胞(如癌细胞)的表面上呈递的肽，使得免疫反应性细胞发挥如上所述的免疫反应性细胞的效应子功能。
术语“抗原反应性T细胞”或类似术语涉及以下T细胞，其识别如果在MHC分子的背景下，例如在抗原呈递细胞或病变细胞如癌细胞的表面上呈递的抗原，并且发挥如上所述的T细胞的效应子功能。
术语“抗原特异性淋巴样细胞”涉及以下淋巴样细胞，尤其是当提供抗原特异性T细胞受体时，淋巴样细胞识别如果是在MHC分子的背景下呈递的抗原，例如在抗原呈递细胞或病变细胞如癌细胞的表面上的抗原，并且优选发挥如上所述的T细胞的效应子功能。如果细胞杀伤表达抗原和/或呈递抗原肽的靶细胞，则T细胞和其它淋巴样细胞被认为对抗原是特异性的。T细胞特异性可以使用各种标准技术中的任一种进行评估，例如铬释放测定或增殖测定。或者，可以测量淋巴因子(例如干扰素-γ)的合成。
术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子并涉及在所有脊椎动物中出现的基因复合体。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞和抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽并将其呈递给T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白在细胞表面表达，并将自身抗原(源自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如入侵微生物的片段)展示给T细胞。
MHC区被分为3个亚组，I类、II类和III类。MHC I类蛋白含有α链和β2-微球蛋白(不是由15号染色体编码的MHC的部分)。它们将抗原片段呈递给细胞毒性T细胞。在大多数免疫系统细胞上，尤其是抗原呈递细胞，MHC II类蛋白含有α-和β-链并且它们将抗原片段呈递给T辅助细胞。MHC III类区编码其它的免疫组分，如补体组分和一些编码细胞因子。
在人类中，在细胞表面编码抗原呈递蛋白的MHC区中的基因被称为人白细胞抗原(HLA)基因。然而，缩写MHC通常用于指HLA基因产物。HLA基因包括9种所谓的经典MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。
在本发明的所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子是HLA分子。
“以呈递抗原为特征的细胞”、“呈递抗原的细胞”、“由细胞呈递的抗原”、“呈递的抗原”或类似的表达是指诸如病变细胞(如癌细胞)的细胞或抗原呈递细胞，其在MHC分子，尤其是MHC I类分子的背景下呈递其表达的抗原或源自所述抗原的片段(如通过加工抗原)。类似地，术语“以呈递抗原为特征的疾病”表示涉及以呈递抗原(尤其是用I类MHC)为特征的细胞的疾病。通过细胞呈递抗原可以通过用核酸如编码抗原的RNA转染细胞来实现。
“所呈递的抗原的片段”或类似的表达意味着该片段可以由MHC I类或II类(优选MHC I类)呈递，例如当直接加入抗原呈递细胞时。在一个实施方案中，片段是由表达抗原的细胞天然呈递的片段。
一些治疗方法是基于患者的免疫系统的反应，其导致用I类MHC呈递抗原的病变细胞溶解。在这方面，例如可以向患有疾病的患者施用对抗原肽和MHC分子的复合体具有特异性的自体细胞毒性T淋巴细胞。此类细胞毒性T淋巴细胞的体外生产是已知的。分化T细胞的方法的实例可以在WO-A-9633265中找到。通常，从患者中取出含有细胞(如血细胞)的样品，并使细胞与呈递复合体并可引起细胞毒性T淋巴细胞(如树突状细胞)繁殖的细胞接触。靶细胞可以是转染的细胞，如COS细胞。这些转染的细胞在其表面上呈递期望的复合体，并且当与细胞毒性T淋巴细胞接触时刺激后者的繁殖。然后向患者施用克隆扩增的自体细胞毒性T淋巴细胞。
在选择细胞毒性T淋巴细胞的另一种方法中，使用MHC I类分子/肽复合体的荧光四聚体来获得细胞毒性T淋巴细胞的特异性克隆(Altman等人(1996),Science 274:94-96；Dunbar等人(1998),Curr.Biol.8:413-416,1998)。
此外，呈递期望的复合体的细胞(如树突状细胞)可与健康个体或另一物种(如小鼠)的细胞毒性T淋巴细胞组合，这样可以导致具有高亲和力的特异性细胞毒性T淋巴细胞的繁殖。这些繁殖的特异性T淋巴细胞的高亲和力T细胞受体可以被克隆并任选地被人源化到不同程度，然后通过基因转移(例如使用逆转录病毒载体)将如此获得的T细胞受体转导到患者的T细胞中。然后可以使用这些基因改变的T淋巴细胞进行过继转移(Stanislawski等人(2001),Nat Immunol.2:962-70；Kessels等人(2001),Nat Immunol.2:957-61)。
细胞毒性T淋巴细胞也可以以本身已知的方式在体内产生。一种方法使用了表达MHC I类/肽复合体的非增殖性细胞。这里使用的细胞是通常表达复合体的细胞，例如被辐射的肿瘤细胞或转染有对于复合体(即抗原肽和呈递的MHC分子)的呈递所必需的一种或两种基因的细胞。另一种优选形式是引入重组RNA形式的抗原，例如，其可以通过脂质体转移或通过电穿孔被引入到细胞中。所得的细胞呈递所关注的复合体并被自体细胞毒性T淋巴细胞识别，然后所述T淋巴细胞进行繁殖。
通过将抗原或抗原肽与佐剂结合可以实现类似的效果，以使体内并入抗原呈递细胞成为可能。抗原或抗原肽可以表示为蛋白、DNA(例如，在载体中)或RNA。可以加工抗原以产生MHC分子的肽伴侣，而其片段可以不需要进一步加工而被呈递。后者尤其是，如果这些可以结合MHC分子的情况。优选的施用形式是完整抗原在体内由树突状细胞加工，因为这也可产生有效免疫应答所需的T辅助细胞应答(Ossendorp等人,Immunol Lett.(2000),74:75-9；Ossendorp等人(1998),J.Exp.Med.187:693-702)。通常，可以通过例如皮内注射向患者施用有效量的肿瘤相关抗原。然而，注射也可以经结内进入淋巴结来进行(Maloy等人(2001),Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303)。
根据本发明，术语“人工T细胞受体”与术语“嵌合T细胞受体”和“嵌合抗原受体(CAR)”同义。
这些术语涉及工程化的受体，其赋予了免疫效应细胞如T细胞任意的特异性，例如单克隆抗体的特异性。以这种方式，可以产生大量癌症特异性T细胞用于过继细胞转移。因此，人工T细胞受体可以存在于T细胞上，例如代替T细胞自身的T细胞受体或作为除T细胞自身的T细胞受体之外的受体。此类T细胞不一定需要加工和呈递用于识别靶细胞的抗原而是可以优选特异性识别呈递于靶细胞上的任何抗原。优选地，所述人工T细胞受体在细胞表面上表达。为了本发明的目的，本文使用的术语“T细胞”包括含有人工T细胞受体的T细胞。
在一个实施方案中，源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜和胞内结构域融合。此类分子响应于靶细胞上的其抗原靶标的被scFv的识别和表达靶抗原的靶细胞的杀伤而导致ζ信号的传递。也可以使用的抗原识别结构域尤其包括T细胞受体(TCR)α和β单链。事实上，几乎任何以高亲和力结合给定靶标的物质都可以用作抗原识别结构域。
抗原识别后，受体聚集和信号传递给细胞。在这方面，“T细胞信号传导结构域”是抗原结合后将激活信号传递给T细胞的结构域(优选胞内结构域)。最常用的胞内结构域组成是CD3-ζ。
用表达嵌合抗原受体的CAR工程化T细胞进行的过继细胞转移治疗是一种有希望的抗癌治疗，这是因为CAR-修饰的T细胞可被工程化以几乎靶向任何肿瘤抗原。例如，患者的T细胞可以被基因工程改造以表达特异性针对患者肿瘤细胞上的抗原的CAR，然后灌输回患者体内。
根据本发明，如上所述，人工T细胞受体可以代替T细胞受体的功能，尤其可赋予细胞，如上所述的T细胞反应性(如细胞溶解活性)。然而，相比于如上所述的T细胞受体与抗原肽-MHC复合体的结合，人工T细胞受体可以结合抗原，尤其是表达于细胞表面的抗原。
T细胞表面糖蛋白CD3-ζ链是在人类中由CD247基因编码的蛋白。CD3-ζ与T细胞受体α/β和γ/δ异二聚体和CD3-γ、-δ和-ε一起，形成T细胞受体-CD3复合体。ζ链在将抗原识别偶联到数种细胞内信号转导途径中起重要作用。术语“CD3-ζ”优选涉及人类CD3-ζ，尤其是涉及包含序列表的SEQ ID NO：40的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的蛋白，优选涉及由序列表的SEQ ID NO：40的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体组成的蛋白。
CD28(分化群28)是提供对于T细胞活化所需的共刺激信号的T细胞上表达的分子之一。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的受体。通过除T细胞受体(TCR)之外的CD28的刺激可以为T细胞提供有效的共刺激信号，用于产生各种白细胞介素(尤其是IL-6)。术语“CD28”优选涉及人类CD28，尤其是涉及包含序列表的SEQ ID NO：39的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体的蛋白，优选涉及由序列表的SEQ ID NO：39的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体组成的蛋白。
根据本发明，CAR通常可以包含三个结构域。
第一结构域是识别和结合CLDN18.2的结合结构域。
第二结构域是共刺激结构域。共刺激结构域用于在CAR与靶向部分结合时，增强细胞毒性淋巴细胞的增殖和存活。共刺激结构域的身份仅受限于其在通过CAR结合靶向部分时具有增强细胞增殖和存活的能力。合适的共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)(肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员)、CD134(OX40)(受体TNFR-超家族的成员)和CD278(ICOS)(在活化的T细胞上表达的CD28-超家族共刺激分子)。本领域技术人员将理解，可以使用这些所述共刺激结构域的序列变体而不会不利地影响本发明，其中变体具有与被模仿的结构域相同或相似的活性。此类变体与其来源的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，CAR构建体包含2个共刺激结构域。尽管特定组合包括四个所述结构域的所有可能的变体，但具体实例包括CD28+CD137(4-1BB)和CD28+CD134(OX40)。
第三结构域是激活信号传导域(或T细胞信号传导结构域)。激活信号传导结构域用于在CAR与CLDN18.2结合时激活细胞毒性淋巴细胞。激活信号传导结构域的身份仅受限于其在通过CAR结合CLDN18.2时具有诱导所选择的细胞毒性淋巴细胞活化的能力。合适的激活信号传导结构域包括T细胞CD3[ζ]链和Fc受体[γ]。本领域技术人员将理解，可以使用这些所述激活信号传导结构域的序列变体而不会不利地影响本发明，其中变体具有与被模仿的结构域相同或相似的活性。此类变体与其来源的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。
本发明的CAR可以包含以融合蛋白形式在一起的3个结构域。此类融合蛋白通常包含从N-末端至C-末端方向连接的结合结构域、一个或多个共刺激结构域和激活信号传导结构域。然而，本发明的CAR不限于这种排列，其它排列是可接受的，并且包括结合结构域、激活信号结构域和一个或多个共刺激结构域。应当理解，因为结合结构域必须自由结合CLDN18.2，所以融合蛋白中结合结构域的布置通常将使得能够实现在细胞外展示该区域。同样，由于共刺激和激活信号传导结构域用于诱导细胞毒性淋巴细胞的活性和增殖，融合蛋白通常在细胞内部展示这两个结构域。CAR可以包括另外的元件，如信号肽，以确保融合蛋白适当地输出到细胞表面；跨膜结构域，以确保融合蛋白被保持为完整的膜蛋白；铰链结构域(或间隔子区)，其赋予结合结构域柔性，并允许与CLDN18.2牢固结合。
与本发明的CAR系统结合使用的细胞优选为T细胞，尤其是细胞毒性淋巴细胞，优选选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。激活后，这些细胞毒性淋巴细胞中的每一种均引发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过下列方法之一或两者引发靶细胞的破坏。首先，激活后，T细胞释放细胞毒素如穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，并且颗粒酶进入细胞并在细胞质中引发半胱天冬酶级联反应，其引起细胞的细胞凋亡(程序性细胞死亡)。其次，可以通过T细胞和靶肿瘤细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导细胞凋亡。尽管可以使用异源细胞或同种异体细胞，但细胞毒性淋巴细胞优选是自体细胞。
根据本发明，可以使用“参考”(如参考样品或参考有机体)来关联和比较在本发明的方法中从测试样品或测试有机体获得的结果。通常，参考有机体是健康的有机体，尤其是不患有疾病如癌症疾病的有机体。可以通过测量足够大数量的参考从参考经经验来确定“参考值”或“参考水平”。优选参考值是通过测量至少2个、优选至少3个、优选至少5个、优选至少8个、优选至少12个、优选至少20个、优选至少30个、优选至少50或优选至少100个参考来确定。
根据本发明，术语“结合剂”包括对靶标具有结合能力的任何化合物。优选地，此类结合剂包含至少一种针对靶标的结合结构域。该术语包括分子(如抗体和抗体片段)、双特异性或多特异性分子、嵌合抗原受体(CAR)和具有与靶标结合能力的所有人工结合分子(支架)，其包括但不限于纳米体(nanobodies)、亲和体(affibodies)、anticalins、DARPins、单体(monobodies)、avimers和微体(microbodies)。在一个实施方案中，所述结合是特异性结合。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白，优选涉及抗原受体如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白的特征在于具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构域，即免疫球蛋白结构域。该术语包括膜结合免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也被称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其通常是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白通常被称为抗体。免疫球蛋白通常包含数条链，通常是通过二硫键连接的2条相同的重链和2条相同的轻链。这些链主要由免疫球蛋白结构域组成，例如VL(可变轻链)结构域、CL(恒定轻链)结构域和CH(恒定重链)结构域CH1、CH2、CH3和CH4。有5种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即α、δ、ε、γ和μ，它们负责不同类别的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链包含跨膜结构域和在其羧基末端的短的胞质结构域。在哺乳动物中存在2种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型中为基本保守的，其中可变部分是高度变化的，并负责抗原识别。
术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少2条重(H)链和2条轻(L)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体和嵌合抗体。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL区域可以进一步细分为高变区域，称为互补决定区(CDR)，散布的更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
本文使用的术语“单克隆抗体”是指单分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体显示出单一的结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从非人类动物(如小鼠)获得的融合到永生化细胞的B细胞。
本文使用的术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从相对于免疫球蛋白基因而言是转基因或转染色体的动物(如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组的组合抗体文库分离的抗体，以及(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式来制备、表达、产生或分离的抗体。
本文使用的术语“人类抗体”旨在包括具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人类抗体可以包括不被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。
术语“人源化抗体”是指具有基本上源自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中该分子的保留免疫球蛋白结构是基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整的可变结构域，或仅包含移植到可变结构域中的适当的框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或通过一个或多个氨基酸取代修饰的，例如，被修饰以更类似人类免疫球蛋白。一些人源化抗体形式保留了所有的CDR序列(例如，人源化小鼠抗体，其包含来自小鼠抗体的所有6个CDR)。其它形式具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR。
术语“嵌合抗体”是指以下抗体，其中重链和轻链的各个氨基酸序列的一部分与源自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的其余部分与另一个中的相应序列同源。通常，轻链和重链的可变区模拟了源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与源自另一种的抗体序列同源。这种嵌合形式的一个明显优点是，使用容易获得的来自非人类宿主有机体的B细胞或杂交瘤与源自例如人类细胞制备物的恒定区组合，可变区可以方便地源自目前已知的来源。尽管可变区具有易于制备的优点，并且特异性不受来源影响，但是当注射抗体时，源自人类的恒定区比来自非人类来源的恒定区更少可能地引起人类对象的免疫应答。然而，该定义不限于此特定示例。
抗体可以源自不同的物种，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人类。
本文所述的抗体包括IgA(例如IgA1或IgA2)、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM和IgD抗体。在各种实施方案中，抗体是IgG1抗体，尤其是IgG1，κ或IgG1，λ同种型(即IgG1，κ，λ)，IgG2a抗体(例如IgG2a，κ，λ)、IgG2b抗体(例如IgG2b，κ，λ)、IgG3抗体(例如IgG3，κ，λ)或IgG4抗体(例如IgG4，κ，λ)。
本文所述的抗体优选是分离的。本文使用的“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合CLDN18.2的分离的抗体基本上不含特异性结合除CLDN18.2以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人类CLDN18.2的表位、同种型或变体的分离的抗体可能与其它相关抗原(例如源自其它物种(例如，CLDN18.2物种同系物))具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，“分离的”单克隆抗体的组合涉及具有不同特异性并在明确定义的组合物或混合物中组合的抗体。
术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“结合部分”)或抗体的“抗原结合片段”(或简称“结合片段”)或类似术语是指抗体的一个或多个片段，其保留了特异性结合抗原的能力。已显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。包含在术语抗体的“抗原结合部分”的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)以及(vii)两种或更多种分离的CDR的组合，所述CDR可任选地由合成接头连接。此外，尽管Fv片段(VL和VH)的2个结构域由单独的基因编码，但是它们可以通过合成接头使用重组方法连接，使得它们能够被制成单个蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。术语抗体的“抗原结合片段”中也包括此类单链抗体。另一实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步公开在US 2003/0118592和US 2003/0133939中。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段加以利用。
根据本发明，术语“CLDN18.2的结合结构域”包括并优选涉及CLDN18.2抗体的抗原结合部分，即针对CLDN18.2的抗体，并且优选对CLDN18.2是特异性的。
术语“结合结构域”结合本发明表征了例如抗体的结构，其与给定的靶结构/抗原/表位相结合/相互作用。因此，根据本发明的结合结构域表示“抗原相互作用位点”。
为了本发明的目的，术语“抗体”包括了所有抗体和抗体的衍生物如本文所述的抗体片段。
抗体可以通过各种技术生产，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术，Nature 256：495(1975)。尽管体细胞杂交程序是优选的，但原则上，可以使用生产单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒转化或致癌转化，或使用抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的优选动物系统是鼠类系统。小鼠中的杂交瘤生产是非常好的已建立的程序。用于分离用于融合的免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
用于制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的其它优选的动物系统是大鼠和兔系统(例如，如Spieker-Polet等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:9348(1995)中所述，也参见Rossi等人,Am.J.Clin.Pathol.124:295(2005))。
为了产生抗体，可以用源自抗原序列(即抗体所针对的序列)的载体缀合的肽、重组表达的抗原或其片段的富集制备物和/或表达抗原的细胞来免疫小鼠，如所描述的。或者，可以用编码抗原或其片段的DNA来免疫小鼠。在使用纯化或富集的抗原制备物的免疫接种不会导致抗体的情况下，也可以用表达抗原的细胞(例如细胞系)来免疫小鼠以促进免疫应答。
在免疫方案的过程中可以监测免疫应答，通过尾静脉或眶后取血获得血浆和血清样品。具有足够免疫球蛋白滴度的小鼠可用于融合。在处死前3天可以用表达抗原的细胞腹膜内或静脉内加强小鼠，并除去脾脏以提高分泌特异性抗体的杂交瘤的速率。
为了产生生产单克隆抗体的杂交瘤，可以分离源自免疫小鼠的脾细胞和淋巴结细胞，并将其与适当的永生化细胞系(如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。然后可以筛选所得到的杂交瘤，以用于产生抗原特异性抗体。然后，针对分泌抗体的杂交瘤可以通过ELISA筛选单个孔。通过使用表达抗原的细胞的免疫荧光和FACS分析，可以鉴定具有抗原特异性的抗体。可以重新接种分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，并且如果单克隆抗体仍然是阳性的，可以通过有限稀释进行亚克隆。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生用于表征的抗体。
抗体和其它结合剂结合抗原的能力可以使用标准结合测定法(例如，ELISA、蛋白印迹、免疫荧光和流式细胞分析)来测定。
抗体和抗体的衍生物可用于提供结合结构域，例如抗体片段，尤其是用于提供VL和VH区。
可存在于人工T细胞受体内的CLDN18.2的结合结构域具有与CLDN18.2结合的能力，即与CLDN18.2中存在的表位结合的能力，优选地位于CLDN18.2的细胞外结构域的表位，尤其是第一细胞外环，优选CLDN18.2的氨基酸29位至78位。在具体实施方案中，CLDN18.2的结合结构域结合CLDN18.2上的表位，其不存在于CLDN18.1上。最优选地，CLDN18.2的结合结构域结合CLDN18.2上的表位，其不存在于除CLDN18.2以外的CLDN蛋白上。
CLDN18.2的结合结构域优选结合CLDN18.2，但不结合CLDN18.1。优选地，CLDN18.2的结合结构域对于CLDN18.2是特异性的。优选地，CLDN18.2的结合结构域结合在细胞表面上表达的CLDN18.2。在特别优选的实施方案中，CLDN18.2的结合结构域结合存在于活细胞表面上的CLDN18.2的天然表位。
在一个优选的实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO：20、21、22、23、24和25的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
在一个优选的实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33和34的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
在某些优选的实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合，其选自以下(i)至(ix)的可能：
(i)VH包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列或其片段，
(ii)VH包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列或其片段，
(iii)VH包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或其片段，
(iv)VH包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列或其片段，
(v)VH包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或其片段，
(vi)VH包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列或其片段，
(vii)VH包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列或其片段，
(viii)VH包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列或其片段，
(ix)VH包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列或其片段。
在特别优选的实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的以下组合：VH包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ IDNO：30所示的氨基酸序列或其片段。
在另一个特别优选的实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的以下组合：VH包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列或其片段，和VL包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列或其片段。
在优选实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含(i)VH，其包含含有以下序列的CDR3：TRSWRGNSFDY，和/或(ii)VL，其包含含有以下序列的CDR3：QNDYSYPFT。
在优选的实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含：
(i)VH，其包含以下一组互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
CDR1：GYTFTSYW，CDR2：IYPSDSYT，CDR3：TRSWRGNSFDY
和/或
(ii)VL，其包含以下一组互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
CDR1：QSLLNSGNQKNY，CDR2：WAS，CDR3：QNDYSYPFT。
在一个优选的实施方案中，CLDN18.2的结合结构域包含VH和VL的组合，其各自包含以下一组互补决定区CDR1、CDR2和CDR3：
VH：CDR1：GYTFTSYW，CDR2：IYPSDSYT，CDR3：TRSWRGNSFDY，
VL：CDR1：QSLLNSGNQKNY，CDR2：WAS，CDR3：QNDYSYPFT。
优选地，本文所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合被布置在单链Fv(scFv)中。
术语“片段”尤其是指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)中的一个或多个互补决定区(CDR)，优选至少CDR3可变区。在一个实施方案中，所述一个或多个互补决定区(CDR)选自一组互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。在特别优选的实施方案中，术语“片段”是指重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。
在一个实施方案中，包含如本文所述的一个或多个CDR、一组CDR或CDR组的组合的CLDN18.2的结合结构域包含所述CDR及其介于中间的框架区。优选地，该部分还包括第一和第四框架区中的一个或两个的至少约50％，50％是第一框架区的C末端50％和第四框架区的N末端50％。通过重组DNA技术进行的结合剂的构建可导致将残基N-或C-末端引入到由引入的接头编码的可变区，以促进克隆或其它操作步骤，包括引入接头以将本发明的可变区连接到其它蛋白序列，包括免疫球蛋白重链、其它可变区(例如在双抗体的生产中)或蛋白标记。
在一个实施方案中，包含如本文所述的一个或多个CDR、一组CDR或CDR组的组合的CLDN18.2的结合结构域包含在人类抗体框架中的所述CDR。
在一个实施方案中，根据本发明的CLDN18.2的结合结构域涉及以下一种CLDN18.2的结合结构域，其识别(即结合)与本文所述的CLDN18.2的结合结构域相同或基本相同的表位(例如，包含本文所述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合的抗体)和/或与所述CLDN18.2的结合结构域竞争结合CLDN18.2。
本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。
根据本发明，如果试剂(如T细胞受体或抗体)对于预定靶标具有显著的亲和力并且在标准测定中与所述预定靶标结合，则试剂能够结合所述预定靶标。“亲和力”或“结合亲和力”通常通过平衡解离常数(KD)来测量。优选地，术语“显著的亲和力”是指与预定靶标的结合具有10-5M或更低、10-6M或更低、10-7M或更低、10-8M或更低、10-9M或更低、10-10M或更低、10-11M或更低、或10-12M或更低的解离常数(KD)。
如果试剂对于靶标没有显著的亲和力，并且在标准测定中不能显著地结合，尤其是不能可检测地结合所述靶标，则试剂不能(基本上不能)结合靶标。优选地，如果以高达2、优选10、更优选20、尤其是50或100μg/ml或更高的浓度存在时，试剂不能可检测地结合所述靶标。优选地，如果试剂结合靶标的KD比试剂与该试剂能够结合的预定靶标结合的KD高至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍，则该试剂对靶标没有显著的亲和力。例如，如果试剂与试剂能够结合的靶标结合的KD为10-7M，则与该试剂没有显著亲和力的靶标结合的KD将为至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、或10-1M。
如果试剂能够结合预定靶标而不能(基本上不能)结合其它靶标，即对其它靶标没有显著的亲和力并且在标准测定中不能显著地结合其它靶标，则试剂对于所述预定靶标是特异的。根据本发明，如果试剂能够结合CLDN18.2但不能(基本上不能)结合其它靶标，则该试剂对CLDN18.2是特异的。优选地，如果与此类其它靶标的亲和力和结合不能显著超过与CLDN18.2不相关的蛋白(如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(HSA)或非闭合蛋白的跨膜蛋白如MHC分子或转铁蛋白受体或任何其它特定多肽)的亲和力或结合，则试剂对CLDN18.2是特异的。优选地，如果试剂结合预定靶标的KD比该试剂结合非特异性靶标的KD低至少10倍、100倍、103倍、104倍、105倍或106倍，则该试剂对于所述预定靶标是特异的。例如，如果试剂与特异性靶标结合时的KD为10-7M，则该试剂与非特异性靶标结合时的KD将为至少10-6M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、或10-1M。
可以用任何合适的方法来经实验确定试剂与靶标的结合；参见，例如Berzofsky等人,"Antibody-Antigen Interactions"In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press New York,N Y(1984)，Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and CompanyNew York,N Y(1992)和本文所述的方法。可以使用常规技术，例如通过平衡透析；通过使用制造商概述的通用程序，使用BIAcore 2000仪器；通过使用放射性标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过本领域技术人员已知的其它方法容易地确定亲和力。例如可以通过Scatchard等人,Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)的方法分析亲和力数据。如果在不同条件，例如盐浓度、pH下测量，则所测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可以是变化的。因此，亲和力和其它抗原结合参数(例如，KD、IC50)的测量优选用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
应当理解，可以在体外或体内提供本文所述的肽和蛋白试剂，其可以是核酸(如编码试剂的RNA)的形式和/或包含核酸(如编码试剂的RNA)的宿主细胞的形式。特别地，可以使用多种方法将CAR构建体引入T细胞，所述方法包括基于非病毒的DNA转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的DNA转染具有低的插入诱变风险。基于转座子的系统可以比不含整合元件的质粒更有效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易产生，能有效地和永久地转导T细胞，并且在原代人类T细胞中从整合观点看已被初步证明为安全的。慢病毒载体也能有效地和永久地转导T细胞，但制备成本更高。它们也可能比基于逆转录病毒的系统更安全。
本文所述的肽和蛋白试剂可以通过施用核酸(如编码试剂的RNA)和/或通过施用包含核酸(如编码试剂的RNA)的宿主细胞来递送给患者。当向患者施用时，核酸可以以裸露形式或在合适的递送载体(例如以脂质体或病毒颗粒的形式)或在宿主细胞内存在。所提供的核酸可以在延长的时间段以持续的方式产生药剂，以减轻至少部分观察到的治疗性蛋白的不稳定性。如果将核酸以不存在于宿主细胞内的方式施用给患者时，则优选其被患者的细胞吸收以表达由核酸编码的试剂。如果将核酸以存在于宿主细胞内的方式施用给患者时，则优选其在患者内由宿主细胞表达，以便产生由核酸编码的试剂。
本文使用的术语“核酸”旨在包括DNA和RNA，例如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根据本发明，核酸优选是分离的核酸。
核酸可以包含在载体中。本文使用的术语“载体”包括本领域技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体如λ噬菌体、病毒载体如腺病毒或杆状病毒载体、或人工染色体载体如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体并且通常含有期望的编码序列和合适的DNA序列，所述DNA序列是在特定宿主有机体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的。克隆载体通常用于工程化和扩增某些期望的DNA片段，并且可能缺少表达期望的DNA片段所需的功能性序列。
在本发明的上下文中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基并优选完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基团的2'-位处具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及修饰的RNA，其通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA。此类改变可以包括加入非核苷酸材料，例如到RNA的末端或例如在RNA的一个或多个核苷酸的内部。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可被称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并且优选涉及“mRNA”，其意指“信使RNA”，并涉及可以使用DNA作为模板并编码肽或蛋白所产生的“转录物”。mRNA通常包含5'非翻译区(5'-UTR)、蛋白或肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。mRNA在细胞内和体外的半衰期有限。优选地，通过使用DNA模板的体外转录来产生mRNA。在本发明的一个实施方案中，通过体外转录或化学合成获得RNA。体外转录的方法是本领域技术人员已知的。例如，存在多种商购的体外转录试剂盒。
在本发明的一个实施方案中，RNA是自我复制的RNA，例如单链自我复制的RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是正义单链RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是病毒RNA或源自病毒RNA的RNA。在一个实施方案中，自我复制RNA是甲病毒基因组RNA或源自甲病毒基因组RNA。在一个实施方案中，自我复制的RNA是病毒基因表达载体。在一个实施方案中，病毒是塞姆利基森林(Semliki forest)病毒。在一个实施方案中，自我复制的RNA包含一种或多种转基因，其中所述转基因中的至少一种编码本文所述的试剂。在一个实施方案中，如果RNA是病毒RNA或源自病毒RNA，则转基因可部分或完全替代病毒序列，例如编码结构蛋白的病毒序列。在一个实施方案中，自我复制的RNA是体外转录的RNA。
为了增加本发明所使用的RNA的表达和/或稳定性，其可被修饰，优选不改变所表达的肽或蛋白的序列。
在本发明所使用的RNA的上下文中，术语“修饰”包括RNA的任何修饰，其非天然存在于所述RNA中。
在本发明的一个实施方案中，本发明所使用的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。通过用磷酸酶处理RNA可以实现此类未加帽的5'-三磷酸的去除。
根据本发明的RNA可以具有修饰的天然存在或合成的核糖核苷酸，以增加其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在本发明所使用的RNA中，5-甲基胞苷部分或完全，优选完全取代胞苷。或者或此外，在一个实施方案中，在本发明所使用的RNA中，假尿苷部分或完全，优选完全取代尿苷。
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA。术语“5'-帽”是指在mRNA分子的5'-末端上发现的帽结构，通常由通过不寻常的5'至5'三磷酸键连接到mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位是甲基化的。术语“常规的5'-帽”是指天然存在的RNA 5'帽，优选7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5'-帽”包括类似于RNA帽结构的5'-帽类似物，并被修饰以具有稳定RNA(如果其上附有)的能力，优选在体内和/或细胞内。
提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA可以通过在所述5'-帽或5'-帽类似物的存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5'-帽被共转录并入所产生的RNA链中，或者可以例如通过体外转录产生RNA，并且可以在转录后使用加帽酶(例如，牛痘病毒的加帽酶)将5'-帽连接到RNA。
RNA可以包含进一步的修饰。例如，本发明中使用的RNA的进一步修饰可以是天然存在的聚(A)(poly(A))尾的延伸或截短，或5'或3'非翻译区(UTR)的改变，例如引入与所述RNA的编码区无关的UTR，例如插入一个或多个(优选两个)拷贝的源自球蛋白(例如α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白，优选β-球蛋白，更优选人类β-球蛋白)基因的3'-UTR。
因此，为了提高本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可以将其进行修饰，以与聚-A序列相连的形式存在，聚-A序列优选长度为10至500个，更优选30至300个，甚至更优选65至200个，尤其为100至150个腺苷残基。在特别优选的实施方案中，聚-A序列具有大约120个腺苷残基的长度。此外，将2个或更多个3'-非翻译区(UTR)并入RNA分子的3'-非翻译区可导致翻译效率的提高。在一个具体实施方案中，3'-UTR源自人类β-球蛋白基因。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”。“半衰期”涉及清除分子的活性、数量或数目的一半所需的时间。在本发明的上下文中，RNA的半衰期表示所述RNA的稳定性。RNA的半衰期可影响RNA的“表达持续时间”。可以预期，具有长半衰期的RNA将在延长的时间内表达。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可以翻译成蛋白。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及RNA(尤其是mRNA)在无细胞系统中体外合成的过程，优选使用适当的细胞提取物。优选地，将克隆载体用于转录物的产生。这些克隆载体通常被称为转录载体，并且根据本发明包括于术语“载体”中。
本发明的术语“翻译”涉及在细胞的核糖体中信使RNA链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白的过程。
根据本发明，核酸可以单独存在或与可以是同源的或异源的其它核酸组合存在。在优选的实施方案中，核酸与表达控制序列功能性连接，所述表达控制序列可以是与所述核酸同源或异源的。术语“同源的”是指核酸也是天然功能性连接的，术语“异源的”是指核酸不是天然功能性连接的。
如果核酸和表达控制序列以使得所述核酸的表达或转录受所述表达控制序列的控制或影响的方式彼此共价连接，则该核酸和表达控制序列是彼此“功能性”连接的。如果核酸将被翻译成功能性蛋白，则随着表达控制序列与编码序列功能性连接，所述表达控制序列的诱导导致所述核酸的转录，而不引起编码序列中的读框移位或所述编码序列不能被翻译成期望的蛋白或肽。
术语“表达控制序列”或“表达控制元件”包括根据本发明的启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其它控制元件。在本发明的具体实施方案中，可以调节表达控制序列。表达控制序列的精确结构可以作为物种或细胞类型的函数而变化，但通常包含分别涉及启动转录和翻译的5'-非转录以及5'-和3'-非翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5'-非转录的表达控制序列包含启动子区，其包括用于功能性连接的核酸的转录控制的启动子序列。表达控制序列还可以包含增强子序列或上游激活子序列。
根据本发明，术语“表达”以其最普遍的含义使用，并且包括例如通过转录和/或翻译产生RNA和/或肽或蛋白。关于RNA，术语“表达”或“翻译”尤其涉及肽或蛋白的产生。术语“表达”还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明，术语“表达”还包括“反常(aberrant)表达”或“异常(abnormal)表达”。
根据本发明，“反常表达”或“异常表达”是指与参考，(例如，不具有与某些蛋白如肿瘤抗原的反常表达或异常表达相关的疾病的对象的一种状态)相比，表达被改变，优选表达增加。表达的增加是指增加至少10％、尤其是至少20％、至少50％或至少100％或更多。在一个实施方案中，表达仅在病变的组织中发现，而在健康组织中的表达被抑制。
术语“特异性表达”是指蛋白基本上仅在特定组织或器官中表达。例如，在胃粘膜中特异性表达的肿瘤抗原意味着所述蛋白主要在胃粘膜中表达，并且在其它组织中不表达，或者在其它组织或器官类型中不以显著程度表达。因此，仅在胃粘膜的细胞中表达并且在任何其它组织如睾丸中以显著较低程度表达的蛋白是在胃粘膜的细胞中特异性表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原还可以在正常条件下在多于1种组织类型或器官中，例如在2或3种组织类型或器官中，但优选不超过3种不同的组织或器官类型中特异性表达。在这种情况下，肿瘤抗原于是在这些器官中特异性表达。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下表达，优选在肺和胃中以大致相等的程度表达，则所述肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。
根据本发明，术语“核酸编码的”是指核酸如果存在于适当的环境中，优选在细胞内，则可以被表达以产生其编码的蛋白或肽。
本发明的一些方面依赖于宿主细胞的过继转移，用核酸(如本文所述的编码试剂的RNA)体外转染所述宿主细胞，并优选在体外从低前体频率扩增到临床相关的细胞数量之后，将其转移至接受者如患者。根据本发明，用于治疗的宿主细胞对治疗的接受者可以是自体的、同种异体的或同基因的。
术语“自体的”用于描述源自同一对象的任何事物。例如，“自体移植”是指源自同一对象的组织或器官的移植。此类方法是有利的，这是因为其克服了否则会导致排斥的免疫屏障。
术语“同种异体的”用于描述源自同一物种的不同个体的任何事物。当一个或多个基因座的基因不是完全相同时，两个或多个个体被认为是彼此同种异体的。
术语“同基因的”用于描述源自具有完全相同基因型的个体或组织的任何事物，即完全相同的双胞胎或相同近交系动物或其组织。
术语“异源的”用于描述由多种不同元件组成的物。例如，将一个体的骨髓转移到不同的个体中，这构成异源移植。异源基因是源自除了对象以外的来源的基因。
术语“转染”涉及将核酸(尤其是RNA)引入细胞中。为了本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞或由此类细胞摄取核酸，其中细胞可存在于对象如患者体内。因此，根据本发明，本文所述的用于转染核酸的细胞可以存在于体外或体内，例如，细胞可以形成患者的器官、组织和/或有机体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，转染的遗传物质仅被瞬时表达就足够了。由于在转染过程中引入的核酸通常不被整合到细胞核基因组中，因此，外来核酸将通过有丝分裂或降解而被稀释。允许核酸附加型扩增的细胞极大地降低稀释速率。如果期望转染的核酸实际保留于细胞及其子细胞的基因组中，则必须进行稳定转染。RNA可以转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白。
根据本发明，可以使用任何用于将核酸引入，即转移或转染到细胞中的技术。优选地，将RNA通过标准技术转染到细胞中。这些技术包括电穿孔、脂质转染和显微注射。在本发明的一个特别优选的实施方案中，通过电穿孔将RNA引入细胞。
电穿孔或电渗透涉及由外部施加的电场引起的细胞质膜的电导率和渗透性显著增加。它通常用于分子生物学，作为将一些物质引入细胞的一种方式。
根据本发明，优选的是，将编码蛋白或肽的核酸引入细胞导致所述蛋白或肽的表达。
根据本发明，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键共价连接的2个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选9个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选21个或更多个和多达优选8、10、20、30、40或50，尤其为100个氨基酸的物质。术语“蛋白”是指大的肽，优选具有多于100个氨基酸残基的肽，但通常术语“肽”和“蛋白”是同义词并且在本文中可互换使用。
根据本发明，肽可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸。在一个实施方案中，肽仅包括天然氨基酸。
根据本发明，术语“非天然氨基酸”是指具有与20种天然氨基酸不同的结构的氨基酸。由于非天然氨基酸具有与天然氨基酸类似的结构，所以非天然氨基酸可以分类为给定天然氨基酸的衍生物或类似物。
优选地，本发明的蛋白和肽是被分离的。术语“分离的蛋白”或“分离的肽”意指蛋白或肽已经从其天然环境分离。分离的蛋白或肽可以处于基本上纯化的状态。术语“基本上纯化的”意指蛋白或肽基本上不含与其在自然界或体内缔合的其它物质。
本文给出的关于特定氨基酸序列(例如序列表中所示的那些)的教导应被解释为也涉及所述特定序列的变体，其导致功能上等同于所述特定序列的序列，例如，显示出与特定氨基酸序列相同或相似性质的氨基酸序列。一个重要的性质是保留了肽与MHC分子和/或T细胞受体的结合或T细胞受体与其靶标的结合，或维持T细胞的效应子功能。优选地，相对于特定序列修饰的序列，当其替代T细胞受体中的特定序列时，保留所述T细胞受体与靶标的结合，以及优选地保留所述T细胞受体或携带本文所述的T细胞受体的T细胞的功能。
例如，可以修饰序列表所示的序列以去除一个或多个(优选全部)游离的半胱氨酸残基，尤其是通过用除半胱氨酸以外的氨基酸替代半胱氨酸残基，优选丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，最优选丙氨酸或丝氨酸。
本领域技术人员会理解，特别地，可以修饰CDR序列、高变区和可变区的序列，而不丧失与靶标结合的能力。例如，CDR区将与本文指定的抗体区完全相同或高度同源。通过“高度同源的”，预期，在CDR中可以进行1至5个，优选1至4个，例如1至3个或1个或2个取代。此外，可以修饰高变区和可变区，使得它们与本文具体公开的区域显示出大量的同源性。
肽“变体”可以保留给定肽的免疫原性(例如，相对于给定的肽，变体与T细胞系或克隆进行反应的能力基本上未减弱)。换言之，相对于给定的肽，变体与T细胞系或克隆进行反应的能力可以增强或不变，或相对于给定的肽可减弱小于50％，优选小于20％。
可以通过评价变体与MHC分子结合的能力来鉴定变体。在一个优选的实施方案中，变体肽具有修饰，使得相对于给定的肽，变体肽结合MHC分子的能力增加。相对于给定的肽，变体肽结合MHC分子的能力可增加至少2倍，优选至少3倍、4倍或5倍。因此，在某些优选实施方案中，肽包含以下变体，其中在免疫原性部分内的1至3个氨基酸残基被取代，使得与T细胞系或克隆进行反应的能力在统计学上大于未修饰肽的能力。此类取代优选位于肽的MHC结合位点内。优选的取代允许增加与MHC I类或II类分子的结合。某些变体含有保守取代。
本发明的术语“变体”还包括突变体、剪接变体、构象、同种型、等位变体、物种变体和物种同系物，尤其是天然存在的变体。等位变体涉及基因正常序列的改变，其意义通常不清楚。完整的基因测序通常鉴定出给定基因的多个等位变体。物种同系物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同种的来源的核酸或氨基酸序列。术语“变体”应包括任何翻译后修饰的变体和构象变体。
为了本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。在蛋白的N末端和/或C末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N-末端和/或C-末端截短变体。
氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或多个氨基酸残基插入到氨基酸序列的特定位点，尽管也可能对所得产物的随机插入进行适当筛选。
氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)的氨基和/或羧基末端融合。
氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或多个氨基酸，例如通过去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。该缺失可以在蛋白的任何位置。
氨基酸取代变体的特征在于去除序列中的至少一个残基，并将另一残基插入其中。优选考虑在同源蛋白或肽之间非保守的氨基酸序列中的位置进行修饰，和/或用具有相似性质的其它氨基酸替换氨基酸。优选地，蛋白变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即由类似的带电荷或不带电荷的氨基酸取代。保守的氨基酸变化涉及其侧链相关的氨基酸家族中的一个的取代。天然存在的氨基酸通常分为4个家族：酸性的(天冬氨酸、谷氨酸)，碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，非极性的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性的(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同归类为芳香族氨基酸。
优选地，给定氨基酸序列和作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性程度(优选同一性程度)为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，给出以下氨基酸区域的相似性或同一性的程度：所述氨基酸区域为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选给出至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸，优选连续的氨基酸的相似性或同一性的程度。在优选的实施方案中，对参考氨基酸序列的全长给出相似性或同一性的程度。用于确定序列相似性(优选序列同一性)的比对可以用本领域已知的工具进行，优选使用最佳序列比对，例如使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS::needle，Matrix：Blosum62，Gap Open10.0，Gap Extend 0.5。
“序列相似性”表示完全相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间完全相同的氨基酸的百分比。
术语“同一性百分比”旨在表示在最佳比对后获得的待比较的两个序列之间完全相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，两个序列之间的差异是随机分布的且遍及其全长。通常通过在将2个氨基酸序列最佳比对后比较这些氨基酸序列来进行它们之间的序列比较，所述比较是通过片段或通过“比较窗口”进行的，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。除手动外，可以通过如下方法产生用于比较的序列的最佳比对：Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法；Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法；Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA85,2444的相似性搜索方法或使用算法(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA于Wisconsin Genetics Software Package中,Genetics Computer Group,575ScienceDrive,Madison,Wis.)的计算机程序。
通过以下计算同一性百分比：确定被比较的两个序列之间的完全相同位置的数量，将此数除以所比较的位置数，并将获得的结果乘以100，以获得这两个序列之间的同一性百分比。
根据本发明，同源氨基酸序列显示出至少40％，尤其是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、优选至少95％、至少98或至少99％的氨基酸残基的同一性。
本文所述的氨基酸序列变体可以由本领域技术人员容易地制备，例如通过重组DNA操作。Sambrook等人(1989)详细描述了用于制备具有取代、添加、插入或缺失的蛋白和肽的DNA序列操作。此外，本文所述的肽和氨基酸变体可以借助于已知的肽合成技术如通过固相合成和类似方法容易地制备。
本发明包括包含术语“肽”和“蛋白”的如本文所述的肽或蛋白的衍生物。根据本发明，蛋白和肽的“衍生物”是蛋白和肽的修饰形式。此类修饰包括任何的化学修饰，并且包括与蛋白或肽相关的任何分子(例如碳水化合物、脂质和/或蛋白或肽)的单个或多个取代、缺失和/或添加。在一个实施方案中，蛋白或肽的“衍生物”包括由以下产生的修饰的类似物：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、保护性/封闭基团的引入、蛋白水解切割或者与抗体或另外细胞配体的结合。术语“衍生物”还延伸到所述蛋白和肽的所有功能性化学等同物。优选地，修饰的肽具有增加的稳定性和/或增加的免疫原性。
还包括肽的模拟物。此类模拟物可以包含与一个或多个氨基酸模拟物连接的氨基酸(即，肽内的一个或多个氨基酸可以被氨基酸模拟物取代)或者可以全部是非肽模拟物。氨基酸模拟物是与氨基酸构象相似的化合物，例如使得其可以取代氨基酸而基本上不降低与T细胞系或克隆进行反应的能力。非肽模拟物是不含氨基酸，并且具有类似于肽的总体构象的化合物，例如使得相对于给定肽，模拟物与T细胞系或克隆进行反应的能力不会大幅降低。
根据本发明，氨基酸序列、肽或蛋白的变体、衍生物、修饰形式、片段、部分(part)或部分(partion)优选分别具有其源自的氨基酸序列、肽或蛋白的功能性质，即它在功能上是等价的。在一个实施方案中，氨基酸序列、肽或蛋白的变体、衍生物、修饰形式、片段、部分或部分分别与其源自的氨基酸序列、肽或蛋白为免疫学等价的。在一个实施方案中，功能性质是免疫学性质。
特定性质是与MHC分子形成复合体的能力，并且在适当的情况下，优选通过刺激细胞毒性或T辅助细胞产生免疫应答。
术语“免疫学等价的”意指免疫学等价的分子，例如免疫学等价的氨基酸序列显示出相同或基本上相同的免疫学性质和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用，例如关于免疫学作用的类型如诱导体液和/或细胞免疫应答、诱导的免疫反应的强度和/或持续时间、或诱导的免疫反应的特异性。在本发明的上下文中，对于用于免疫的肽或肽变体的免疫学作用或性质，优选使用术语“免疫学等价的”。例如，当暴露于对象的免疫系统时，如果氨基酸序列诱导的免疫反应具有与参考氨基酸序列反应时的特异性，则所述氨基酸序列在免疫学上等价于参考氨基酸序列。
根据本发明，术语“源自”意指特定实体，尤其是特定序列存在于其源自的对象中，尤其是有机体或分子。在氨基酸序列尤其是特定序列区域的情况下，“源自”尤其意指相关氨基酸序列源自其所存在的氨基酸序列。
术语“细胞”或“宿主细胞”优选涉及完整的细胞，即具有完整的膜的细胞，其未释放其正常细胞内组分如酶、细胞器或遗传物质。完整的细胞优选是活细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞。优选地，根据本发明，所述术语涉及可以用外源核酸转染的任何细胞。优选地，当用外源核酸转染并转移到接受者时，细胞可以在接受者中表达核酸。术语“细胞”包括细菌细胞；其它有用的细胞是酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。合适的细菌细胞包括来自革兰氏阴性细菌菌株，如大肠杆菌、变形杆菌和假单胞菌的菌株的细胞，，以及革兰氏阳性细菌菌株，如芽孢杆菌属、链霉菌属、葡萄球菌属和乳球菌属的菌株的细胞。合适的真菌细胞包括来自木霉、脉孢菌和曲霉的细胞。合适的酵母细胞包括源自酵母属(例如酿酒酵母)、裂殖酵母(例如栗酒裂殖酵母(Schizo saccharomyces pombe))、毕赤酵母(例如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolicd))和汉逊酵母(Hansenula)的种类细胞。合适的哺乳动物细胞包括例如CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、293HEK等。然而，也可以使用本领域中用于表达异源蛋白的两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和任何其它细胞。哺乳动物细胞特别优选用于过继转移，所述哺乳动物细胞例如源自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类动物的细胞。细胞可以源自大量的组织类型，并且包括原代细胞和细胞系，例如免疫系统的细胞，尤其是抗原呈递细胞如树突状细胞和T细胞、干细胞如造血干细胞和间充质干细胞以及其它细胞类型。抗原呈递细胞是在主要组织相容性复合体的背景下在细胞表面上展示抗原的细胞。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别此复合体。
包含核酸分子的细胞优选表达由所述核酸编码的肽或蛋白。
细胞可以是重组细胞并且可以分泌编码的肽或蛋白，可以在表面上表达肽或蛋白并且优选可以另外表达与所述肽或蛋白或其加工产物结合的MHC分子。在一个实施方案中，细胞内源性表达MHC分子。在另一个实施方案中，细胞以重组方式表达MHC分子和/或肽或蛋白或其加工产物。细胞优选是非增殖的。在优选的实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞、单核细胞或巨噬细胞。
术语“克隆扩增”是指其中将特定实体倍增的过程。在本发明的上下文中，该术语优选在免疫反应的背景下使用，其中淋巴细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞被扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞的分化。
可以基于在生物样品中与肽特异性反应的T细胞的存在来检测与抗原表达相关的疾病。在某些方法中，将自患者分离的包含CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与本发明的肽、编码此类肽的核酸和/或表达和/或呈递此类肽的至少免疫原性部分的抗原呈递细胞一起孵育，并检测是否存在T细胞的特异性活化。合适的生物样品包括但不限于分离的T细胞。例如，可以通过常规技术(例如通过外周血淋巴细胞的Ficoll/Hypaque密度梯度离心)从患者中分离T细胞。对于CD4+T细胞，优选通过评价T细胞的增殖来检测活化。对于CD8+T细胞，优选通过评价细胞溶解活性来检测活化。相比在无病的对象中，增殖水平高至少2倍和/或细胞溶解活性水平高至少20％，则表明在对象中存在与抗原表达相关的疾病。
本文使用的“减少”或“抑制”意指引起水平总体降低的能力，优选降低5％或更多、10％或更多、20％或更多、更优选50％或更多、最优选75％或更多。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全的抑制，即减少到零或基本上为零。
例如“增加”或“增强”的术语优选地涉及增加或增强约至少10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，最优选至少100％。
本文描述的试剂、组合物和方法可用于治疗患有疾病的对象，例如，所述疾病是以表达CLDN18.2并且优选在MHC分子的背景下呈递CLDN18.2的病变细胞的存在为特征。可以治疗和/或预防的疾病的实例包括所有表达CLDN18.2的疾病。特别优选的疾病是癌症疾病。
本文所述的试剂、组合物和方法也可用于免疫接种或疫苗接种以预防本文所述的疾病。
术语“正常组织”或“正常状况”是指健康对象的健康组织或状况，即非病理状况，其中“健康”优选意指非癌的。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病况。疾病可能是由最初源自外部来源的因素所引起的，例如传染性疾病，或其可能是由内部功能障碍所引起的，如自身免疫性疾病。在人类中，“疾病”通常更广泛地用于指引起折磨个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡的任何病况，或与个体接触的人的类似问题。在更广泛的意义上，疾病有时包括受伤、残疾、失调、综合症、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在其它情况下，为了其它目的，这些可被认为是可区分的类别。疾病通常不仅身体上而且也在情绪上影响个体，，这是因为个体感染和患有许多疾病可能会改变人们对生活的看法和个性。根据本发明，术语“疾病”包括癌症，尤其是本文所述的癌症形式。本文中对癌症或癌症的特定形式的任何提及也包括其癌症转移。在优选的实施方案中，根据本申请，待治疗的疾病涉及表达CLDN18.2以及任选地在MHC分子的背景下呈递CLDN18.2的细胞。
根据本发明，“涉及表达CLDN18.2的细胞的疾病”或类似表达意指CLDN18.2在病变组织或器官的细胞中表达。在一个实施方案中，与健康组织或器官中的状态相比，CLDN18.2在病变组织或器官的细胞中的表达增加。增加是指增加至少10％，尤其是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或更多。在一个实施方案中，表达仅在病变组织中发现，而在健康组织中的表达被抑制。根据本发明，涉及表达CLDN18.2的细胞的疾病包括癌症疾病。此外，根据本发明，癌症疾病优选是其中癌细胞表达CLDN18.2的癌症疾病。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中的生理状况，其通常以不受调节的细胞生长为特征。癌症的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地，此类癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区的癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官与生殖器官的癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、神经外胚层癌症、脊柱轴肿瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明，术语“癌症”也包括癌症转移。优选地，“癌症疾病”是以表达CLDN18.2的细胞为特征的，和癌细胞表达CLDN18.2。
病变细胞优选是表达CLDN18.2的细胞，所述CLDN18.2优选作为跨膜蛋白存在于所述细胞的表面上和/或在MHC(如MHC I)的背景下由所述细胞呈递。表达CLDN18.2的细胞优选是癌细胞，优选是本文所述的癌症的癌细胞。
在一个实施方案中，癌症疾病是特征在于间变、侵袭性和转移的恶性疾病。恶性肿瘤可以与非癌良性肿瘤形成对照，因为恶性肿瘤在其生长中不是自我限制的，能够侵入到相邻组织中，并且能够扩散到远处的组织(转移)，而良性肿瘤没有这些性质。
在一个实施方案中，本发明的癌症涉及表达CLDN18.2的癌细胞。在一个实施方案中，癌症是CLDN18.2阳性的。在一个实施方案中，CLDN18.2的表达位于细胞表面。在一个实施方案中，至少50％，优选60％、70％、80％或90％的癌细胞是CLDN18.2阳性的，和/或至少40％，优选至少50％的癌细胞对于CLDN18.2的表面表达是阳性的。在一个实施方案中，至少95％或至少98％的癌细胞是CLDN18.2阳性的。在一个实施方案中，至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的癌细胞对于CLDN18.2的表面表达是阳性的。
在一个实施方案中，表达CLDN18.2的癌症、涉及表达CLDN18.2的癌细胞的癌症或者CLDN18.2阳性癌症选自胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌如非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌、胆囊癌及其转移，尤其是胃癌转移如库肯勃氏瘤、腹膜转移和淋巴结转移。在一个实施方案中，癌症是腺癌，尤其是晚期腺癌。特别优选的癌症疾病是胃、食道、胰管、胆管、肺和卵巢的腺癌。在一个实施方案中，癌症选自胃癌、食道癌(尤其是下食道癌)、食道-胃结合部癌和胃食道癌。在特别优选的实施方案中，癌症是胃食道癌，例如转移性、难治性或复发性的晚期胃食道癌。
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指由细胞(被称为瘤细胞(neoplasticcell)或肿瘤细胞(tumor cell))异常生长所形成的肿胀或病变。“肿瘤细胞”是指通过快速、不受控制的细胞增殖而生长，并且在启动新生长的刺激停止后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出部分或完全缺乏与正常组织的结构组织和功能协调，并且通常形成明显的组织团块，其可以是良性的、恶变前的或恶性的。
根据本发明，“癌(carcinoma)”是源自上皮细胞的恶性肿瘤。此组代表了最常见的癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌的常见形式。
“腺癌”是起源于腺体组织的癌症。该组织也是被称为上皮组织的较大组织类别中的一部分。上皮组织包括皮肤、腺体和多种使身体的腔和器官排列成行的其它组织。上皮细胞在胚胎学上源于外胚层、内胚层和中胚层。要被分类为腺癌，细胞不一定需要是腺体的一部分，只要它们具有分泌性质即可。这种形式的癌可以发生在一些高等哺乳动物，包括人类中。分化良好的腺癌倾向于类似于其源自的腺体组织，而分化较差的可以不是。通过对来自活检的细胞进行染色，病理学家将确定肿瘤是否是腺癌或一些其它类型的癌症。由于体内腺体无处不在，腺癌可在身体的许多组织中出现。虽然每个腺体可能不分泌相同的物质，但只要细胞具有外分泌功能，就被认为是腺体，因此其恶性形式被称为腺癌。恶性腺癌侵袭其它组织，且经常有足够时间进行转移。卵巢腺癌是最常见的卵巢癌类型。其包括浆液性和粘液性的腺癌、透明细胞腺癌和子宫内膜样腺癌。
淋巴瘤和白血病是源自造血(血液形成)细胞的恶性肿瘤。
胚细胞瘤(blastic tumor)或母细胞瘤是类似于未成熟或胚胎组织的肿瘤(通常是恶性的)。这些肿瘤中的许多肿瘤在儿童中最常见。
“转移”是指癌细胞从其原始位点扩散到身体的另一部分。转移的形成是一个非常复杂的过程，并取决于恶性细胞从原发性肿瘤的脱离、细胞外基质的侵入、内皮基底膜渗透进入体腔和血管，以及然后在被血液运输后，浸润靶器官。最后，在靶位点的新肿瘤的生长取决于血管生成。肿瘤转移经常发生，甚至在去除原发性肿瘤后仍发生，这是由于肿瘤细胞或组分可保留并发展了转移潜能。在一个实施方案中，根据本发明，术语“转移”涉及“远处转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域性淋巴结系统的转移。在一个实施方案中，本发明的术语“转移”涉及淋巴结转移。
继发性或转移性肿瘤的细胞与原始肿瘤中的细胞类似。这意味着，例如，如果卵巢癌转移到肝脏，继发性肿瘤是由异常的卵巢细胞组成，而不是由异常的肝细胞组成。肝脏中的肿瘤于是被称为转移性卵巢癌，而不是肝癌。
当人再次受到过去影响他们的状况的影响时，就会发生复发(relapse)或再发(recurrence)。例如，如果患者患有肿瘤疾病，已经接受了所述疾病的成功治疗，并且再次发展所述疾病，则所述新发展的疾病可被认为是复发或再发。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或再发可能但不一定发生在原始肿瘤疾病的位点。因此，例如，如果患者患有卵巢肿瘤并且已经接受了成功治疗，则复发或再发可以是卵巢肿瘤的发生或在不同于卵巢的位点的肿瘤的发生。肿瘤的复发或再发还包括以下情况，其中肿瘤发生于与原始肿瘤位点不同的位点以及原始肿瘤位点。优选地，患者接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，以及在与原始肿瘤位点不同的位点的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。
术语“治疗”或“治疗性处理”涉及改善个体的健康状态和/或延长(增加)个体的寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体中的疾病、阻止或减缓个体疾病的发展、抑制或减缓个体疾病的发展、降低个体中症状的频率或严重性，和/或减少目前患有或以前患有疾病的个体的再发。
术语“预防性治疗(prophylactic treatment)”或“预防性治疗(preventivetreatment)”涉及旨在防止个体发生疾病的任何治疗。术语“预防性治疗(prophylactictreatment)”或“预防性治疗(preventive treatment)”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可能受到疾病或病症(如癌症)的折磨或易患疾病或病症(如癌症)但可能有或可能没有该疾病或病症的人类、非人类灵长类动物或其它哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类动物)。在许多实施方案中，个人是人类。除非另有说明，术语“个人”和“对象”不表示特定年龄，并且因此包括成年人、老年人、儿童和新生儿。在本发明的优选实施方案中，“个人”或“对象”是“患者”。根据本发明，术语“患者”意指用于治疗的对象，尤其是患病对象。
“具有风险”是指与一般群体相比，对象，即患者被认定为具有高于正常的发展疾病(尤其是癌症)的可能性。此外，已经患有或目前患有疾病(尤其是癌症)的对象是具有增加的发展疾病的风险的对象，因为此类对象可继续发展疾病。目前患有或已经患有癌症的对象也具有增加的癌症转移的风险。
术语“免疫治疗”是指涉及特异性免疫反应的治疗。
在本发明的上下文中，术语如“保护”、“预防”、“预防性(prophylactic)”、“预防性(preventive)”或“保护性”涉及对象中疾病的发生和/或传播的预防或治疗或者预防和治疗，尤其是将对象发展疾病的可能性最小化或延缓疾病发展。例如，如上所述，具有患肿瘤风险的人将是用于预防肿瘤的治疗的候选者。
免疫治疗的预防性施用，例如本发明的试剂或组合物的预防性施用优选保护接受者免于疾病的发展。免疫治疗的治疗性施用，例如本发明的试剂或组合物的治疗性施用可导致抑制疾病的进展/生长。这包括疾病的进展/生长的减缓，尤其是疾病的进展的破坏，其优选导致疾病的消除。
可以使用多种技术中的任一种进行免疫治疗，其中本文提供的试剂优选用于从患者中去除表达CLDN18.2的细胞。由于增强或诱导患者中对CLDN18.2或表达CLDN18.2的细胞和/或在MHC分子的背景下呈递CLDN18.2特异性的免疫应答，可以发生此类去除。
在某些实施方案中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗依赖于施用免疫应答-修饰剂(如本文提供的肽和核酸)以体内刺激内源性宿主免疫系统，从而针对病变细胞反应。
在其它实施方案中，免疫治疗可以是被动免疫治疗，其中治疗涉及具有确定的肿瘤-免疫反应性的试剂(例如效应细胞)的递送，其可以直接或间接介导抗肿瘤作用，并且不一定依赖于完整的宿主免疫系统。效应细胞的实例包括T淋巴细胞(例如CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+T辅助淋巴细胞)和抗原呈递细胞(如树突状细胞和巨噬细胞)。对本文所述的CLDN18.2肽特异的T细胞受体和对CLDN18.2特异的人工T细胞受体可以被转移到效应细胞中，用于过继免疫治疗。
如上所述，本文提供的免疫反应性肽可用于快速扩增抗原特异性T细胞培养物，以产生足够数量的用于免疫治疗的细胞。特别地，抗原呈递细胞如树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和/或B细胞可使用本领域熟知的标准技术用免疫反应肽进行脉冲或用一种或多种核酸进行转染。用于治疗的所培养的效应细胞必须能够生长和广泛分布，并在体内长期存活。研究表明，通过用补充有IL-2的抗原反复刺激，可以诱导所培养的效应细胞在体内生长并以大量数量长期存活(参见，例如Cheever等人(1997),ImmunologicalReviews 157,177。
或者，可以将表达本文所述的肽的核酸引入取自患者的抗原呈递细胞中，并在体外克隆繁殖以移植回同一患者体内。
可以使用本领域已知的任何方法，优选以无菌形式，通过静脉内、腔内、腹膜内或瘤内施用将转染的细胞再引入患者体内。
本文公开的方法可涉及施用响应于肽或表达肽的抗原呈递细胞而被激活的自体T细胞。此类T细胞可以是CD4+和/或CD8+，并且可以如上所述进行增殖。T细胞可以以抑制疾病发展的有效量施用于对象。
术语“免疫”或“接种疫苗”描述了治疗对象的过程，其目的是为治疗或预防的原因诱导免疫应答。
术语“体内”涉及在对象中的情况。
根据本发明，“样品”可以是根据本发明的任何有用的样品，尤其是生物样品，例如组织样品，这包括体液和/或细胞样品，并且可以以常规方式获得，例如通过组织活检(包括钻取活检)和通过取血、支气管抽吸物、痰液、尿液、排泄物或其它体液。根据本发明，术语“样品”还包括处理的样品，例如生物样品的部分或分离物，如核酸和肽/蛋白分离物。
本文所述的化合物和试剂可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
本发明的药物组合物优选是无菌的，并含有有效量的本文所述的试剂和任选的本文所论述的另外的试剂以产生期望的反应或期望的效果。
药物组合物通常以统一的剂型提供，并且可以以本身已知的方式进行制备。药物组合物可以是例如溶液或悬浮液的形式。
药物组合物可以包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，所有这些都优选是药学上可接受的。术语“药学上可接受的”是指不与药物组合物的活性成分的功能相互作用的无毒材料。
药学上不可接受的盐可以用于制备药学上可接受的盐并且其包括在本发明中。这种药学上可接受的盐以非限制性方式包括由如下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学上可接受的盐也可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，如钠盐、钾盐或钙盐。
用于药物组合物中的合适的缓冲物质包括乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐。
用于药物组合物中的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
可注射的制剂可以包含药学上可接受的赋形剂，如乳酸林格氏液(RingerLactate)。
术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其中组合活性组分以促进、增强或能够施用。根据本发明，术语“载体”还包括适合于向患者施用的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。
用于肠胃外施用的可能的载体物质是例如无菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘，和尤其是生物相容性的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。
当在本文中使用时，术语“赋形剂”旨在表示可存在于药物组合物中并且不是活性成分的所有物质，例如载体、粘合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲液、调味剂或着色剂。
可以通过任何常规途径，例如通过肠胃外施用(包括通过注射或输注)来施用本文所述的试剂和组合物。优选肠胃外施用，例如静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。
适于肠胃外施用的组合物通常包含活性化合物的无菌水性或非水性制剂，其优选与接受者的血液等渗。相容性载体和溶剂的实例是林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常使用无菌的固定油作为溶液或悬浮介质。
本文所述的试剂和组合物以有效量进行施用。“有效量”是指单独或与其它剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病或特定病况的情况下，所期望的反应优选涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，尤其是中断或逆转疾病的进展。在治疗疾病或病况中所期望的反应也可能是延迟所述疾病或所述病况的发作或者预防所述疾病或所述病况的发作。
本文所述的试剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病况、疾病的严重度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、尺寸和体重)、治疗持续时间、伴随治疗(如果存在的话)的类型、具体施用途径和类似因素。因此，本文所述的试剂的施用剂量可取决于不同的此类参数。在用初始剂量使患者中的反应不足时，可以使用更高剂量(或通过不同的、更局部的施用途径所实现的有效的更高剂量)。
本文所述的试剂和组合物可以例如在体内施用给患者，以治疗或预防各种病症(如本文所述的那些病症)。优选的患者包括患有可通过施用本文所述的试剂和组合物而被矫正或改善的病症的人类患者。这包括涉及以CLDN18.2的表达为特征的细胞的病症。
例如，在一个实施方案中，本文所述的试剂可用于治疗患有癌症疾病的患者，所述癌症疾病例如本文所述的癌症疾病，其特征在于存在表达CLDN18.2的癌细胞。
本发明所述的药物组合物和治疗方法也可用于免疫接种或疫苗接种以预防本文所述的疾病。
本发明的药物组合物可以与补充性免疫增强物质(如一种或多种佐剂)一起施用，并且可以包含一种或多种免疫增强物质以进一步增加其有效性，优选实现免疫刺激的协同效应。术语“佐剂”涉及延长或增强或加速免疫应答的化合物。依赖于佐剂的各种类型，在此方面各种机制都有可能。例如，允许DC成熟的化合物(如脂多糖或CD40配体)形成第一类合适的佐剂。通常，影响免疫系统的“危险信号”类型的任何试剂(LPS、GP96、dsRNA等)或影响免疫系统的细胞因子类型的任何试剂(如GM-CSF)都可以用作能够增强免疫应答和/或以受控方式影响免疫应答的佐剂。任选地CpG寡脱氧核苷酸也可以用于本文，尽管如上所述，要考虑在某些情况下会出现它们的副作用。特别优选的佐剂是细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-α或生长因子如hGH。其它已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油如
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最优选为
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ISA51。脂肽如Pam3Cys也适用于作为本发明的药物组合物中的佐剂。
药物组合物可以局部或全身施用，优选全身施用。
术语“全身施用”是指施用试剂，使得试剂以有效量广泛分布在个体的体内并产生所期望的效果。例如，试剂可以在血液中产生其期望的效果和/或通过血管系统达到其期望的作用位点。典型的全身施用途径包括通过将试剂直接引入血管系统或口服、肺或肌内施用进行施用，其中所述试剂被吸收，进入血管系统，并通过血液运送至一个或多个期望的作用位点。
根据本发明，优选通过肠胃外施用进行全身施用。术语“肠胃外施用”是指施用试剂，使得试剂不通过肠道。术语“肠胃外施用”包括静脉内施用、皮下施用、皮内施用或动脉内施用，但不限于这些。
也可以例如口服、腹膜内或肌内施用。
本文提供的试剂和组合物可以单独使用或与常规治疗方案，例如手术、辐射、化疗和/或骨髓移植(自体的、同基因的、同种异体的或不相关的)组合使用。
通过如下附图和实施例对本发明进行详细描述，其仅用于说明的目的，而不是限制性的。由于描述和实施例，同样包括于本发明中的其它实施方案对于本领域技术人员而言是可获取的。
附图说明
图1：TCR-CD3复合体的代表。胞质内CD3免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)表示为圆柱体(改编自“The T cell receptor factbook”，MP Lefranc,G Lefranc,2001)。
图2：连续几代CAR的设计。不同代的CAR的示意图(1G，第一代，2G，第二代，3G，第三代)。第一代包含细胞外scFv和介导细胞毒性的细胞质CD3ζ链/ZAP70，第二代另外有促进增殖的CD28/PI3K，第三代还有维持细胞存活的4-1BB或OX40/TRAF(Casucci,M.等人(2011)2:378-382)。
图3：用于针对CLDN18.2的T细胞重定向的不同受体形式的示意图。左：由CLDN18.2特异性scFv片段、IgG1衍生的间隔子区结构域、CD28共刺激和CD3ζ信号传导结构域(CAR-28ζ)组成的第二代CAR；中间：基于scFv与鼠TCRβ链的恒定结构域的连接以及鼠TCRα链的恒定结构域的共表达的新型CAR形式(CAR/Cα)；右：包含TCRα/β链的鼠TCR(mu，鼠TCR)；
图4：在一组人类组织中分析CLDN18.1和CLDN18.2转录物。A，CLDN18基因座的基因组结构(上)。有阴影线的框，分别为CLDN18.1(E1.1)或CLDN18.2(E 1.2)所独有的外显子；底部，CLDN18变体的外显子组成；拱形，2个细胞外结构域；箭头，用于RT-PCR的引物。B，通过终点RT-PCR对正常人类组织(N)、原发性肿瘤样本和肿瘤细胞系的CLDN18同种型的比较分析。C，通过实时PCR在正常人类组织(N)、原发性肿瘤样本和肿瘤细胞系中的定量(Sahin U等人,Clin Cancer Res 2008；14:7624–34)。
图5：通过IFNy-ELISPOT测定分析来自免疫的HLA-A*02-转基因小鼠的脾细胞对CLDN18.2衍生肽的离体反应性。应用特定算法预测CLDN18.2的前80个氨基酸的HLA-A*02CLDN18.2特异性结合肽(Rammensee H.等人(1999)Immunogenetics 50,213-9)。分析CLDN18.2免疫的HLA-A*02转基因小鼠的脾细胞对CLDN18.2肽池或预测的HLA-A*02结合CLDN18.2衍生肽CLDN18.2-A2-1-6的反应性。阳性对照：PMA处理的脾细胞；阴性对照：不相关的肽池(HIV-gag)、不相关的九聚物肽(PLAC1-31-39)。
图6：体外再刺激后，来自HLA-A*02-转基因小鼠的CLDN18.2特异性鼠CD8+T细胞的流式细胞术分选。在用CLDN18.2重叠肽池对脾细胞进行再刺激后，分离单一的CD8+/CD137+T细胞。对照：用不相关的肽池(HIV-gag)再刺激脾细胞。
图7：分离自CLDN18.2免疫小鼠的CD8+T细胞的TCR的特异性测试。用TCR-α/β链RNA转染HLA-A*02阳性健康供体的CD8+T细胞并通过IFNγ-ELISPOT测试对用CLDN18.2重叠的15mer肽(＝CLDN18.2池)或CLDN18.2衍生的HLA-A*02结合肽(CLDN18.2-A2-4、CLDN218.2-A2-5、CLDN18.2-A2-6)脉冲的K562-A2细胞的识别。阴性对照：不相关的肽池(HIV-gag)、不相关的9mer肽(PLAC1-31-39)；阳性对照：SEB；
图8：人类预活化的CD8+T细胞上的CLDN18.2和CLDN6特异性CAR的表面表达。用OKT3预活化CD8+T细胞并用20μg的CAR-RNA转染。电穿孔后20h，将细胞分别用对CLDN18.2-CAR和CLDN6-CAR特异的PE缀合的抗CD8抗体和独特型特异性(idiotype-specific)荧光染料-缀合的抗体进行染色。将细胞以单一CD8+T淋巴细胞设门。
图9：由CLDN18.2-CAR介导的表达CLDN18.2的靶细胞的特异性溶解。用20μgCARRNA转染预活化的CD8+T细胞，随后与用编码CLDN18.2-CAR的RNA转染的自体iDC在使用滴定的E：T比(30:1、10:1、3:1)下一起共培养20小时。阴性对照：用CLND6特异性CAR或不含CARRNA(＝模拟)转染的T细胞、用CLDN6-RNA转染的iDC。4h共培养后，通过基于荧光素酶的细胞毒性测定来分析特异性溶解。
图10：通过加入独特型特异性抗体对表达CLDN18.2的靶细胞的CLDN18.2-CAR介导的溶解的特异性抑制。用20μgCAR RNA转染预活化的CD8+T细胞，随后与用CLDN18.2-或CLDN6-RNA转染的自体iDC一起共培养20小时，使用的E：T比为30:1。在加入靶细胞之前，将效应T细胞与或不与2μg/ml独特型特异性抗体预孵育1小时。在4h共培养后，通过基于荧光素酶的细胞毒性测定来分析特异性溶解。
图11：CLDN18.2-CAR T细胞的体外抗原特异性增殖。将CD8+T细胞用编码CLDN18.2-CAR的RNA或不用RNA(模拟)进行电穿孔，并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。将CAR T细胞与用5μg的编码CLDN18.2或对照抗原CLDN9或CLDN6的IVT-RNA转染的iDC共培养。96小时后收获共培养细胞，通过流式细胞术分析CFSE荧光。将细胞以活的单一CD8+淋巴细胞设门。
图12：疫苗接种后小鼠的CLDN18.2-CAR T细胞的体内抗原特异性活化。用5×106个CLDN18-2-CAR-effLuc-GFP转导的T细胞经静脉内(i.v.)植入BALB/c-小鼠中。ACT后24小时，用包含25μg CLDN18.2RNA的RNA(F12-Lip)或对照RNA经静脉内接种小鼠。(A)通过流式细胞术使用荧光染料-偶联的抗体来测量T细胞的转导效率。(B)在接种后48小时，测量小鼠的体内发光强度。变色图像表示在灰度参考照片上叠加的光强度(黑色，最不强烈；白色至深灰色，最强烈)。
实施例
本文使用的技术和方法以自身已知的方式在本文描述或实施，其描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版(1989)，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y。除非明确指出，包括试剂盒和试剂使用的全部方法均根据制造商的信息实施。
实施例1：材料和方法
细胞系和试剂
在标准条件下培养用HLA-A*0201稳定转染的并用于TCR验证测定的人类慢性髓性白血病细胞系K562(Lozzio,C.B.&Lozzio,B.B(1975),Blood 45,321-334)(Britten,C.M.等人(2002),J.Immunol.Methods 259,95-110)(被称为例如K562-A2)。根据制造商的说明，培养原代人类新生儿包皮成纤维细胞系CCD-1079Sk(ATCC No.CRL-2097)。
外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞和树突状细胞(DC)
通过Ficoll-Hypaque(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)密度梯度离心，从血沉棕黄层分离PBMC。通过PCR标准方法确定HLA等位型。用抗-CD14微珠(MiltenyiBiotech.Bergisch-Gladbach,Germany)富集单核细胞。如Kreiter等人(2007),CancerImmunol.Immunother.,CII,56,1577-87中所述，通过在补充有细胞因子的培养基中分化单核细胞5天获得未成熟的DC(iDC)。
肽以及刺激细胞的肽脉冲
通过标准固相化学(JPT GmbH,Berlin,Germany)，合成对应于闭合蛋白-18.2或HIV-gag的序列的具有11个氨基酸重叠的N-和C-末端游离的15-mer肽池(称为抗原肽池)，并且溶解在DMSO中至0.5mg/ml的终浓度。在PBS 10％DMSO中重新组成九聚物肽。在培养基中使用不同肽浓度于37℃培养刺激细胞1h，用于进行脉冲。
用于RNA体外转录(IVT)的载体
所有构建体是之前描述的pST1-sec-插入物-2βgUTR-A(120)-Sap1质粒(Holtkamp,S.等人(2006),Blood 108,4009-4017)的变体。为了产生编码鼠TCR链的质粒，从商业提供者定购编码鼠TCR-α、-β1和-β2恒定区的cDNA，并类似地克隆(GenBank登录号分别是M14506、M64239和X67127)。将特异性V(D)J PCR产物引入此类盒中以产生全长TCR链(称为pST1-鼠TCRαβ-2βgUTR-A(120))。
克隆全长CLDN18.2、CLDN18.2 aa 1-80和CLDN6抗原，连接到之前描述的pST1质粒中的MHC I类运输信号(MITD)中(Kreiter,S.等人(2008),J.Immunol.180,309-318)。
体内转录的(IVT)RNA的产生和转移进细胞
按照之前描述的(Holtkamp,S.等人(2006).Blood 108,4009-4017)进行IVT RNA的产生，并且加入到在预冷的4mm间隙无菌电穿孔小池(Bio-Rad Laboratories GmbH,Munich,Germany)中的X-VIVO 15培养基(Lonza,Basel,Switzerland)中悬浮的细胞。用Gene-Pulser-II装置(Bio-Rad Laboratories GmbH,Munich,Germany)(T细胞:450V/250μF；K562-A2:200V/300μF)进行电穿孔。
通过用IVT RNA对HLA A2.1/DR1小鼠进行节内免疫在体内引发T细胞
通过使用编码抗原的IVT RNA进行重复的节内免疫，在体内引发针对所关注的抗原的A2/DR1小鼠的T细胞(Pajot A.等人.(2004),Eur.J.Immunol.34,3060-69)(KreiterS.等人.(2010),Cancer Research 70,9031-40)。为了节内免疫，用甲苯噻嗪/氯胺酮麻醉小鼠。经外科手术使腹股沟淋巴结暴露，使用具有超细针(31G,BD Biosciences)的一次性0.3-ml注射器，缓慢注射在林格氏液中稀释的10μLRNA(20μg)以及无核糖核酸酶的水，并且将伤口闭合。在6次免疫循环之后，将小鼠处死并且分离脾细胞。
脾细胞的收获
在解剖之后，在无菌条件下将脾脏转移到含有PBS的离心管中。用镊子机械地破坏脾脏，并且用细胞过滤器(40μm)获得细胞悬浮液。用PBS洗涤脾细胞，离心并且在低渗的缓冲液中重悬以用于溶解红细胞。在室温孵育5min后，通过加入20-30ml培养基或PBS停止反应。将脾细胞离心，并且用PBS洗涤两次。
在CD137染色后，抗原特异性CD8+T细胞的单细胞分选
为了抗原特异性重刺激，将来自免疫的A2/DR1小鼠的2.5x10^6/孔的脾细胞接种到24孔板中，并且用编码所关注的抗原或对照抗原的重叠肽池进行脉冲。在24h孵育之后，收获细胞，用FITC-缀合的抗-CD3抗体、PE-缀合的抗CD4抗体、PerCP-Cy5.5-缀合的抗-CD8抗体和Dylight-649-缀合的抗-CD137抗体进行染色。在BD FACS Aria流式细胞仪(BDBiosciences)上进行分选。分选CD137、CD3和CD8阳性的细胞，在含有人CCD-1079Sk细胞作为饲养细胞的96孔V-底板中收获每孔一个细胞，在4℃离心，并且立即在-80℃储存。
来自分选的细胞的RNA提取物、基于SMART的cDNA合成和非特异性扩增
根据供应商的说明，用RNeasy Micro Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提取来自分选的T细胞的RNA。使用模板-转换方案进行cDNA合成：将Mint逆转录酶(Evrogen JSC)与用于引发第一链合成反应的寡(dT)-T-引物长以及与用于引入寡(riboG)序列的TS-短(Eurofins Genomic)进行组合，以允许通过逆转录酶的末端转移酶活性产生延长的模板并用于模板转换(Matz,M.等人.(1999)Nucleic Acids Res.27,1558-1560)。使根据制造商的说明合成的第一链cDNA在200μΜdNTP存在时，经历采用5U PfuUltra Hotstart High-Fidelity DNA聚合酶(Agilent Technologies)和0.48μΜ引物TS-PCR引物的21个循环的扩增(循环条件：在95℃2min，在94℃30s，在65℃30s，在72℃1min，在72℃最后延伸6min)。用鼠TCR-β恒定区特异性引物控制TCR基因的成功扩增，并且如果检测到强的带，则仅执行了连续的克隆型特异性鼠Vα-/Vβ-PCR。
设计用于TCR扩增的PCR引物
为了设计鼠TCR共有引物，将如ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http:// www.imgt.org)中列出的所有功能性鼠TCR-Vβ和TCR-Vα基因以及它们的相应前导序列，用BioEdit序列比对编辑器(例如http://www.bio-soft.net)比对。设计有最多3个简并碱基、GC含量在40-60％之间和在3'末端是G或C的24-27bp长度的正向引物，以与尽可能多的前导序列退火，并且配备有15bp的以稀有的限制性酶位点和Kozak序列为特征的5'延伸。设计反向引物，以与恒定区基因的第一外显子退火，引物mTRACex1_as结合到对应于Cα的氨基酸24至31的序列，以及mTRBCex1_as结合到对应于Cβ1和Cβ2的氨基酸(aa)8至15的序列。2种寡核苷酸都是用5'磷酸合成的。将引物合并在有相同退火温度的2-6个正向寡核苷酸的池中。
V(D)J序列的PCR扩增和克隆
在0.6μΜ mVα-/mVβ特异性寡核苷酸池、0.6μΜmCα-或mCβ-寡核苷酸、200μΜdNTP和5U PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶存在时，使6μl来自分离的T细胞的预扩增cDNA进行40个PCR循环(Agilent；循环条件：在95℃1min，在94℃30s，退火温度30s，在72℃30s，最后72℃3min延伸时间)。使用Qiagen毛细管电泳系统分析PCR产物。将在470-550bp有带的样品在琼脂糖凝胶上按大小分块，用凝胶回收试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)切除并纯化条带。进行序列分析以显示V(D)J结构域和β恒定区两者的序列，因为mTRBCex1_as和mTRBCex1_as引物分别匹配小鼠中的TCR恒定区基因Cβ1和Cβ2。将DNA消化并且克隆到包含完整鼠TCR-α/β链的适当骨架的IVT载体中。
流式细胞术分析
使用针对TCRβ链的适当可变区家族或恒定区的荧光染料-缀合的抗-TCR抗体(Beckman Coulter Inc.,Fullerton.USA)与针对CD3、CD8或CD4的抗体(BD Biosciences)的组合，通过流式细胞术，分析转染的TCR基因的细胞表面表达。使用识别包含在分别的CAR构建体中的scFv片段的荧光染料-缀合的独特型特异性抗体(Ganymed Pharmaceuticals)，分析转染的CAR的细胞表面表达。在FACSCANTO II流式细胞仪上，使用FACS Diva软件(BDBiosciences)进行流式细胞术分析。
荧光素酶细胞毒性测定
为了评估细胞介导的细胞毒性，将基于生物体发光的测定用作针对51Cr释放的替代选择和最优选择。相对于标准的铬释放测定，这一测定通过计算共孵育之后活的表达荧光素酶的靶细胞数，测量效应细胞的细胞溶解活性。用编码来自萤火虫(Photinuspyralis)(EC 1.13.12.7)的萤火虫荧光素酶的荧光素酶基因稳定或瞬时地转染靶细胞。荧光素酶是催化荧光素氧化的酶。该反应是ATP依赖的，并且发生在以下两个步骤：
荧光素+ATP→荧光素化腺苷酸+PPi
荧光素化腺苷酸+O2 →氧化荧光素+AMP+光
以每孔104个细胞的浓度将靶细胞铺在白色96孔板中(Nunc,Wiesbaden,Germany)，并且与不同数量的TCR-转染的T细胞共培养，终体积是100μl。3h后，向细胞中加入50μl包含反应混合物(荧光素(1μg/μl)、HEPES缓冲液(50mM,pH)、腺苷酸5'-三磷酸酶(ATP酶，0.4mU/μl,Sigma-Aldrich,St.Louis,USA))的D-荧光素(BD Biosciences)。通过将ATP酶加入到反应混合物中，减弱了从死细胞释放的因荧光素酶而产生的荧光。
在总计4h的孵育时间之后，使用Tecan Infinite 200阅读器(Tecan,Crailsheim,Germany)测量由活细胞发射的生物发光。细胞杀伤活性是针对通过加入2％Triton-X 100诱导完整细胞溶解之后获得的荧光值进行计算，并且与由单独的靶细胞发射的荧光相关联。数据输出是每秒钟计数的(CPS)，并且如下计算特异性溶解的百分比：
(l-(CPSexp-CPSmin)/(CPSmax–CPSmin)))*100。
在没有效应物时孵育靶细胞之后，评估最大荧光(最大每秒钟计数，CPSmax)，以及在用清洁剂Triton-X-100处理靶标以完全溶解之后，评估最小荧光(CPSmin)。
ELISPOT(酶联免疫斑点测定)
在室温用抗-人类IFNγ抗体1-Dl k(Mabtech,Stockholm,Sweden)过夜或在4℃用抗-鼠IFNy抗体AN18(Mabtech)过夜包被微量滴定板(Millipore,Bedford,MA,USA)，并且用2％人类血清白蛋白(CSL Behring,Marburg,Germany)或用鼠培养基进行封闭。在鼠背景中，每孔分配5×105个脾细胞，而在人类背景中，为2-5×104个/孔，将抗原呈递刺激细胞与电穿孔后24h的每孔0.3-3×105个TCR转染的CD4+或CD8+效应细胞一起以一式三份进行接种。将板孵育过夜(37℃,5％CO2)，用PBS 0.05％Tween 20洗涤，并且与1μg/ml终浓度的抗-人类IFNγ生物素化的mAB 7-B6-1(Mabtech)或抗-鼠IFNγ生物素化的mAb R4-6A2(Mabtech)在37℃孵育2小时。将亲和素结合的辣根过氧化物酶H(Vectastain Elite Kit；Vector Laboratories,Burlingame,USA)加入到孔中，在室温孵育1小时，并且用3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma,Deisenhofen,Germany)显影。
CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)增殖测定
用CAR RNA转染CD8+T细胞，约20h后用0.8μM CFSE标记。将标记的T细胞洗涤并与RNA转染的自体iDC共培养(E：T的比＝10:1)。共培养4天后，收获细胞，并且基于在细胞分裂后子代细胞中的CFSE荧光的进行性二等分，用流式细胞术分析增殖。
动物
BALB/c小鼠购自Javier Labs。在整个实验中，使用年龄(8周龄)和性别(雌性)匹配的动物。将同类系BALB/c-Thy1.1小鼠饲养在BioNTech AG,Germany的动物设施中。
逆转录病毒基因操作和制备CAR T细胞用于过继性T细胞转移
分离BALB/c-Thy1.1小鼠的脾细胞，并在5ng/mL rh IL-7和10ng/mL rh IL-15(均来自Miltenyi)存在时，通过2μg/mL可溶性的抗-CD3(eBioscience)和1μg/mL可溶性的抗-CD28(Novus Biologicals)进行预活化。在预活化后24小时和48小时，使用RetroNectin技术(Takara)，用编码CLDN18.2-CAR-effLuc-GFP的三顺反子载体转导(逆转录病毒(MLV-E))T细胞。然后在5ng/mL rh IL-7和10ng/mL rh IL-15存在时，将转导的T细胞扩增3天，随后用Ficoll-Paque PREMIUM(1.084)进行ficoll清洗，然后过继转移到小鼠中。
小鼠实验
将5x106个CLDN18.2 CAR转导的BALB/c-Thy1.1+T细胞静脉内(i.v.)转移到BALB/c小鼠中。随后，在过继性T细胞转移(ACT)后24小时，用RNA(Lip)的F12：RNA为1.3:2的比率对小鼠进行静脉内(i.v.)接种。进行全身生物发光成像。
体内生物发光成像(BLI)
使用IVIS Lumina成像系统(Caliper Life Sciences)通过体内生物发光成像评价CLDN18.2-CAR-effLuc-GFP转导的T细胞的扩增。简言之，在注射D-荧光素的水溶液(80mg/kg体重；Perkin Elmer)后5分钟，定量发射的光子(1min的积分时间)。动物中源自表达荧光素酶的细胞的透射光的强度被表示为灰度图像，其中黑色是最不强烈的生物发光信号且白色至深灰色是最强烈的生物发光信号。在LED低光照下获得小鼠的灰度参考图像。使用Living Image 4.0软件叠加图像。
实施例2：对闭合蛋白18.2特异的高亲和力HLA-A*02限制性鼠TCR的分离
我们通过使用编码CLDN18.2的氨基酸1-80的IVT-RNA进行重复节内免疫来验证A2/DR1小鼠中的CLDN18.2的免疫原性潜能。人类CLDN18基因具有2个可替代的第一外显子，产生在N末端69个氨基酸不同的2种蛋白同种型(CLDN18.1和CLDN18.2)(图4A)。由于CLDN18.1也在正常组织，尤其是肺中表达，我们仅使用CLDN18.2的N末端部分，以便专一诱导CLDN18.2特异性T细胞反应性。我们使用这些小鼠的脾细胞用于分离CLDN18.2特异性T细胞并随后克隆相应的TCR基因。对成功诱导CLDN18.2特异性T细胞的免疫小鼠的脾细胞进行分析，并通过IFNγ-ELISPOT测定离体分析其对预测的HLA-A*02结合CLDN18.2肽的反应性(图5)。
通过RNA免疫，可以在所有3只小鼠中诱导CLDN18.2特异性T细胞的显著频率，而T细胞反应性集中在预测与HLA-A*0201结合的2种CLDN18.2肽上(CLDN18.2-A2-5和CLDN18.2-A2-6)。
为了分离CLDN18.2特异性T细胞，在体外再刺激免疫小鼠的脾细胞，并且基于激活诱导的CD137上调，通过流式细胞术分离单个细胞(图6)。
可以从所有3只免疫的A2/DR1小鼠中取回CLDN18.2特异性CD8+T细胞，并从单分选的鼠T细胞克隆总共6种CLDN18.2特异性TCR。
对TCR进行免疫学验证测定，其显示所有6种CLDN18.2-TCR识别2种HLA-A*0201限制性表位CLDN18.2 aa 7-15(CLDN18.2-A2-5)和CLDN18.2 aa 8-16(CLDN18.2-A2-6)中的一种或两种，所述表位是之前通过离体ELISPOT分析鉴定的(图7)。
实施例3：闭合蛋白-18.2特异性CAR的产生和体外验证
我们生产了靶向CLDN18.2的第二代CAR，其分别包含CD3ζ和CD28的信号传导部分和共刺激部分。一旦CAR接合，CD28胞内结构中的lck结合部分的缺失取消了IL2分泌，以防止调节T细胞的诱导(Kofler D.M.等人,(2011)Molecular Therapy 19(4),760–767)。在CAR的细胞外部分中的IgG1 Fc“间隔子区”结构域的修饰，避免了“脱靶”激活和非计划中启动固有免疫应答(Hombach A.等人,(2010)Gene Therapy 17,1206–1213)。
为了通过CLDN18.2-CAR T细胞分析表达CLDN18.2的靶细胞的特异性溶解，进行基于荧光素酶的细胞毒性测定。预活化CD8+T细胞并用编码CLDN18.2-CAR或CLDN6特异性CAR(作为对照)的IVT-RNA转染CD8+T细胞。用荧光染料-缀合的抗体染色后，通过流式细胞术证实CAR的表面表达(图8)。2种CAR在CD8+T细胞表面表达良好。将CAR转染的T细胞与用CLDN18.2-或CLDN6-RNA转染的自体iDC通过使用不同的效应子-靶标比例进行培养，并且在共培养4小时后计算特异性溶解(图9)。CLDN18.2-CAR和CLDN6-CAR两者分别介导了表达CLDN18.2和CLDN6的iDC的特异性溶解。当iDC表达各自的对照抗原时，观察不到溶解。
为了分析，如果表达CLDN18.2的靶细胞的CLDN18.2-CAR介导的溶解可通过加入独特型特异性抗体来抑制，则在开始与靶细胞共培养之前，可以将CAR T细胞与或不与特异性结合包含在CLDN18.2-CAR中的scFv片段的抗体预孵育，并使用基于荧光素酶的细胞毒性测定来分析溶解(图10)。
表达CLDN18.2的靶细胞的CLDN18.2-CAR介导的溶解可以通过阻断CLDN18.2-CAR与其靶抗原的结合而被高效抑制，即使是30:1的高E：T比率亦如此。没有观察到CLDN6-CAR介导的溶解的抑制，证实了抗体与CLDN18.2-CAR的选择性结合。该实验一方面证实了CLDN18.2-CAR介导的溶解完全依赖于CAR的CLDN18.2特异性，另一方面证明了用于CLDN18.2-CAR检测的独特型特异性抗体原则上也可以在严重不良事件时应用于体内CLDN18.2-CAR T细胞的抑制。
CAR工程化的T细胞的抗肿瘤功效的基本先决条件是它们能够增殖并持续存在于患者体内。为了分析，如果CLDN18.2-CAR T细胞响应于在iDC中异位表达的CLDN18.2而有效增殖，则进行基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)的体外共培养测定。用CFSE标记用编码CLDN18.2-CAR的IVT-RNA转染的CD8+T细胞，并与用编码CLDN18.2或对照抗原CLDN9或CLDN6的IVT-RNA转染的自体iDC共培养。使用荧光染料-偶联的抗-独特型特异性抗体，通过流式细胞术分析CAR的表面表达(图11A)。共培养4天后，通过流式细胞术分析CFSE标记的CAR转染的CD8+T细胞的抗原特异性增殖。在响应于CLDN18.2中，观察到约86％的CD8+T细胞的CLDN18.2-CAR介导的增殖，而在响应于对照抗原转染的iDC(CLDN9、CLDN6)中，仅可观察到CAR T细胞的背景增殖(图11B)。这些数据证实CLDN18.2-CAR T细胞的有效抗原特异性激活和扩增可以通过人类iDC中的异位CLDN18.2表达来实现。
在同源小鼠模型中体内检测CLDN18.2-CAR介导携带CAR的T细胞的抗原特异性激活和扩增的效力。为了跟踪过继转移的CAR-T细胞在体内的命运，使用三顺反子逆转录病毒载体，其编码由病毒T2A序列分隔的CLDN18.2-CAR下游的荧光素酶(effLuc)和eGFP报告基因。
将CLDN18.2-CAR转导的鼠T细胞移植到初始的BALB/c小鼠。转移当天，使用荧光染料-偶联的抗-独特型特异性抗体与eGFP报告基因表达相组合，通过流式细胞术评估转导的T细胞上的CLDN18.2-CAR表达。CLDN18.2-CAR在约36％的CD8+和约45％的CD4+T细胞中高度表达(图12A)。然后用编码CLDN18.2或对照(Ctrl)抗原的IVT-RNA处理移植的小鼠。在mRNA接种后2天，与对照RNA处理的小鼠相比，在CLDN18.2 RNA中可以观察到发光的强烈增加，这表明CLDN18.2-CAR T细胞响应于同源抗原而显著激活和增殖(图12B)。这些数据清楚地显示了体内T细胞中的CLDN18.2 CAR的功能和抗原特异性。
CLDN18.2-特异性T细胞表位
A2-1(aa 68-76)
TLLGLPAML
A2-2(aa 71-79)
GLPAMLQAV
A2-3(14-22)
SLIGIAGII
A2-4(17-25)
GIAGIIAAT
A2-5(7-15)
QGLGFVVSL
A2-6(8-16)
GLGFVVSLI
CLDN18.2-特异性T细胞受体
mTCRCD8-CL18#2
>αV12D.1J33 C(MN缺少N-末端；V→G und S→C)
Figure BDA0003709256050000831
Figure BDA0003709256050000841
>βV13.3 D1 J1.4*02 C1
Figure BDA0003709256050000842
mTCRCD8-CL18#4
>αV6D.7*04 J26 C(S→F)
Figure BDA0003709256050000843
>βV2 D2 J2.7 C2(CASSQEWGGYEQYF)
Figure BDA0003709256050000844
Figure BDA0003709256050000851
mTCRCD8-CL18#5
>αV6D.7*04J47 C(N→D und S→F)
Figure BDA0003709256050000852
>βV1 D2 J2.7 C2
Figure BDA0003709256050000853
mTCRCD8-CL18#8
>αV8D.2*02或V8N.2J31 C
Figure BDA0003709256050000854
>βV23 D2 J2.7 C2
Figure BDA0003709256050000861
mTCRCD8-CL18#9
>αV9N.3 J21 C(P→S)
Figure BDA0003709256050000862
>βV2 D2 J2.7 C2(CASSQDQGGQGQYF)
Figure BDA0003709256050000863
mTCRCD8-CL18#12
>αa V6.3*02或V6D.3J26 C(N→T)
Figure BDA0003709256050000871
>βV2 D2 J2.7 C2(CASSPDWGAEYEQYF)
Figure BDA0003709256050000872
序列表
<110> 拜恩科技细胞&基因治疗有限公司等(BioNTech Cell & Gene Therapies GmbHet al.)
<120> 闭合蛋白-18.2特异性免疫受体和T细胞表位
<130> 674-152 PCT
<150> PCT/EP2015/060357
<151> 2015-05-11
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr
20 25 30
Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
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Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val
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<212> PRT
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<220>
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Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> T细胞表位
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Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile
1 5
<210> 8
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Met Arg Pro Gly Thr Cys Ser Val Leu Val Leu Leu Leu Met Leu Arg
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Arg Ser Asn Gly Asp Ser Val Thr Gln Thr Glu Gly Leu Val Thr Val
20 25 30
Thr Glu Gly Leu Pro Val Lys Leu Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Thr Tyr
35 40 45
Leu Thr Ile Ala Phe Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Leu Asn Glu Ala Pro
50 55 60
Gln Val Leu Leu Lys Ser Ser Thr Asp Asn Lys Arg Thr Glu His Gln
65 70 75 80
Gly Phe His Ala Thr Leu His Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Leu Gln
85 90 95
Lys Ser Ser Ala Gln Leu Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Leu
100 105 110
Met Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ser Gly Thr Lys Leu Ile
115 120 125
Ile Lys Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys
130 135 140
Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
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Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr
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Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly
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Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe
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Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln
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Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
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Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Met Gly Ser Arg Leu Phe Phe Val Val Leu Ile Leu Leu Cys Ala Lys
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His Met Glu Ala Ala Val Thr Gln Ser Pro Arg Ser Lys Val Ala Val
20 25 30
Thr Gly Gly Lys Val Thr Leu Ser Cys His Gln Thr Asn Asn His Asp
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Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Thr Gly His Gly Leu Arg Leu Ile
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His Tyr Ser Tyr Val Ala Asp Ser Thr Glu Lys Gly Asp Ile Pro Asp
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Gly Tyr Lys Ala Ser Arg Pro Ser Gln Glu Asn Phe Ser Leu Ile Leu
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Glu Leu Ala Ser Leu Ser Gln Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser
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Ile Asn Glu Arg Leu Phe Phe Gly His Gly Thr Lys Leu Ser Val Leu
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Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
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Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
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Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
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Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
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Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
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Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
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His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
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Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
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Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
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Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
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Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
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Arg Ala His Gly Asp Ser Val Thr Gln Thr Glu Gly Gln Val Ala Leu
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Pro Val Asp Pro Lys Ile Ile Gln Lys Pro Lys Tyr Leu Val Ala
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Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly
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<213> 智人(Homo sapiens)
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85 90 95
Ala Ser Val Gln Glu Ser Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser
100 105 110
Val Asp Tyr Ala Asn Lys Met Ile Phe Gly Leu Gly Thr Ile Leu Arg
115 120 125
Val Arg Pro His Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys
130 135 140
Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
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Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly
180 185 190
Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe
195 200 205
Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala
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Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
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Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Met Trp Gln Phe Cys Ile Leu Cys Leu Cys Val Leu Met Ala Ser Val
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Ala Thr Asp Pro Thr Val Thr Leu Leu Glu Gln Asn Pro Arg Trp Arg
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Leu Val Pro Arg Gly Gln Ala Val Asn Leu Arg Cys Ile Leu Lys Asn
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Leu Gln Trp Leu Phe Thr Leu Arg Ser Pro Gly Asp Lys Glu Val Lys
65 70 75 80
Ser Leu Pro Gly Ala Asp Tyr Leu Ala Thr Arg Val Thr Asp Thr Glu
85 90 95
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100 105 110
Thr Cys Ser Pro Leu Thr Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
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130 135 140
Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
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Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
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195 200 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe
210 215 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro
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Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp
245 250 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val
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Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<211> 305
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
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Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
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Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
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Ser
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
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Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Met Gly Ser Ile Phe Leu Ser Cys Leu Ala Val Cys Leu Leu Val Ala
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Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
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Asn Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 抗体片段
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 抗体片段
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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Lys
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<211> 113
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体片段
<400> 30
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Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体片段
<400> 31
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体片段
<400> 32
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln
85 90 95
Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体片段
<400> 33
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗体片段
<400> 34
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 35
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 小鼠IgG Vh-Vl (κ)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
180 185 190
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala
245 250
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 信号肽
<400> 37
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 38
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgG1 Fc片段
<400> 38
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 39
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人CD28 (TM + ic)
<400> 39
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Ala Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 40
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人CD3-ζ (ic)
<400> 40
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 41
<211> 686
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工T细胞受体
<400> 41
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
145 150 155 160
Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys
165 170 175
Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp
195 200 205
Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp
225 230 235 240
Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe
245 250 255
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Glu Pro
260 265 270
Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro
275 280 285
Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
290 295 300
Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
305 310 315 320
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
325 330 335
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
340 345 350
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
355 360 365
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
370 375 380
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
385 390 395 400
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
405 410 415
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
420 425 430
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
435 440 445
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
450 455 460
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
465 470 475 480
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
485 490 495
Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val
500 505 510
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
515 520 525
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
530 535 540
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
545 550 555 560
Ala Tyr Ala Ala Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Arg Val
565 570 575
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
580 585 590
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
595 600 605
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
610 615 620
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
625 630 635 640
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
645 650 655
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
660 665 670
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675 680 685
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR序列
<400> 42
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR序列
<400> 43
Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR序列
<400> 44
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR序列
<400> 45
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR序列
<400> 46
Trp Ala Ser
1
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDR序列
<400> 47
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5

Claims (43)

1.肽，其包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体。
2.如权利要求1所述的肽，其长度为100个或更少、50个或更少、20个或更少、或10个或更少的氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的肽，其由选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6和7的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体组成。
4.核酸，其包含编码权利要求1至3中任一项所述的肽的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸，其是重组核酸。
6.细胞，其包含权利要求4或5所述的核酸。
7.细胞，其呈递权利要求1至3中任一项所述的肽或其加工产物。
8.免疫反应性细胞，其与权利要求1至3中任一项所述的肽反应。
9.结合剂，其结合权利要求1所述的肽，所述肽任选地在具有MHC分子的复合体中。
10.T细胞受体或所述T细胞受体的多肽链，所述T细胞受体结合权利要求1所述的肽，任选地所述肽在具有MHC分子的复合体中，以及优选地所述T细胞受体与所述肽反应。
11.T细胞受体α链或包含所述T细胞受体α链的T细胞受体，
其中所述T细胞受体α链选自：
(i)T细胞受体α链，其包含选自SEQ ID NO：8、10、12、14、16和18的T细胞受体α链或其变体中的至少一个，优选两个，更优选全部三个CDR序列；以及
(ii)T细胞受体α链，其包含选自SEQ ID NO：8、10、12、14、16和18的T细胞受体α链序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。
12.T细胞受体β链或包含所述T细胞受体β链的T细胞受体，
其中所述T细胞受体β链选自：
(i)T细胞受体β链，其包含选自SEQ ID NO：9、11、13、15、17和19的T细胞受体β链或其变体中的至少一个，优选两个，更优选全部三个CDR序列；
以及
(ii)T细胞受体β链，其包含选自SEQ ID NO：9、11、13、15、17和19的T细胞受体β链序列或其片段，或者所述序列或片段的变体。
13.T细胞受体，其选自：
(I)T细胞受体，其包含：
(i)T细胞受体α链，其包含SEQ ID NO：x的T细胞受体α链或其变体中的至少一个，优选两个，更优选全部三个CDR序列，以及
(ii)T细胞受体β链，其包含SEQ ID NO：x+1的T细胞受体β链或其变体中的至少一个，优选两个，更优选全部三个CDR序列；
其中x选自8、10、12、14、16和18；
以及
(II)T细胞受体，其包含：
(i)T细胞受体α链，其包含SEQ ID NO：x的T细胞受体α链序列或其片段，或者所述序列或片段的变体，以及
(ii)T细胞受体β链，其包含SEQ ID NO：x+1的T细胞受体β链序列或其片段，或者所述序列或片段的变体；
其中x选自8、10、12、14、16和18。
14.人工T细胞受体，其结合闭合蛋白-18.2(CLDN18.2)。
15.如权利要求14所述的人工T细胞受体，其结合CLDN18.2的细胞外结构域。
16.如权利要求14或15所述的人工T细胞受体，其中所述结合是特异性结合。
17.如权利要求14至16中任一项所述的人工T细胞受体，其包含CLDN18.2的结合结构域。
18.如权利要求17所述的人工T细胞受体，其中所述CLDN18.2的结合结构域被包括在所述人工T细胞受体的胞外结构域中。
19.如权利要求17或18所述的人工T细胞受体，其中所述CLDN18.2的结合结构域包含CLDN18.2抗体的单链可变片段(scFv)。
20.如权利要求17至19中任一项所述的人工T细胞受体，其中所述CLDN18.2的结合结构域包含对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白重链可变区(VH)(VH(CLDN18.2))和对CLDN18.2具有特异性的免疫球蛋白轻链可变区(VL)(VL(CLDN18.2))。
21.如权利要求20所述的人工T细胞受体，其中所述重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)经由肽接头连接，优选包含氨基酸序列(GGGGS)3的肽接头。
22.如权利要求17至21中任一项所述的人工T细胞受体，其中所述CLDN18.2的结合结构域包含VH(CLDN18.2)，所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
23.如权利要求17至22中任一项所述的人工T细胞受体，其中所述CLDN18.2的结合结构域包含VL(CLDN18.2)，所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
24.如权利要求17至23中任一项所述的人工T细胞受体，其中所述CLDN18.2的结合结构域包含VH(CLDN18.2)和VL(CLDN18.2)，所述VH(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体，所述VL(CLDN18.2)包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
25.如权利要求17至24中任一项所述的人工T细胞受体，其中所述CLDN18.2的结合结构域包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
26.如权利要求14至25中任一项所述的人工T细胞受体，其包含跨膜结构域。
27.如权利要求14至26中任一项所述的人工T细胞受体，其包含T细胞信号传导结构域。
28.如权利要求27所述的人工T细胞受体，其中所述T细胞信号传导结构域包含CD3-ζ，优选CD3-ζ的胞内结构域，其任选地与CD28组合。
29.如权利要求14至28中任一项所述的人工T细胞受体，其包含指导新生蛋白进入内质网的信号肽。
30.如权利要求14至29中任一项所述的人工T细胞受体，其包含将所述CLDN18.2的结合结构域连接到所述跨膜结构域的间隔子区。
31.如权利要求14至30中任一项所述的人工T细胞受体，其包含以下结构：
NH2-信号肽-CLDN18.2的结合结构域-间隔子区-跨膜结构域-T细胞信号传导结构域-COOH。
32.如权利要求14至31中任一项所述的人工T细胞受体，其包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列或其片段，或者所述氨基酸序列或片段的变体。
33.核酸，其包含编码权利要求10至13中任一项所述的T细胞受体链或T细胞受体或编码权利要求14至32中任一项所述的人工T细胞受体的核苷酸序列。
34.细胞，其包含权利要求10至13中任一项所述的T细胞受体链或T细胞受体或者权利要求14至32中任一项所述的人工T细胞受体，和/或包含含有编码所述T细胞受体链或T细胞受体或者编码所述人工T细胞受体的核苷酸序列的核酸。
35.产生免疫反应性细胞的方法，其包括用权利要求33所述的核酸转导T细胞的步骤。
36.药物组合物，其包含以下的一种或多种：
(i)权利要求1至3中任一项所述的肽；
(ii)权利要求4、5和33中任一项所述的核酸；
(iii)权利要求6、7和34中任一项所述的细胞；
(iv)权利要求8所述的免疫反应性细胞；
(v)权利要求9所述的结合剂；
(vi)权利要求10至13中任一项所述的T细胞受体；和
(vi)权利要求14至32中任一项所述的人工T细胞受体。
37.如权利要求36所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。
38.治疗或预防癌症疾病的方法，其包括向患者施用权利要求36或37所述的药物组合物。
39.如权利要求1至3中任一项所述的肽、权利要求4、5和33中任一项所述的核酸、权利要求6、7和34中任一项所述的细胞、权利要求8所述的免疫反应性细胞、权利要求9所述的结合剂、权利要求10至13中任一项所述的T细胞受体或权利要求14至32中任一项所述的人工T细胞受体，其用于治疗，尤其是用于治疗或预防癌症。
40.诱导对象中的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用权利要求36所述的药物组合物。
41.用于刺激、引发和/或扩增T细胞的方法，其包括使T细胞与以下中的一种或多种接触：权利要求1至3中任一项所述的肽、权利要求4或5所述的核酸和/或权利要求6或7所述的细胞。
42.杀伤对象中的癌细胞的方法，其包括以下步骤：向所述对象提供治疗有效量的权利要求1至3中任一项所述的肽、权利要求4、5和33中任一项所述的核酸、权利要求6、7和34中任一项所述的细胞、权利要求8所述的免疫反应性细胞、权利要求9所述的结合剂、权利要求10至13中任一项所述的T细胞受体或权利要求14至32中任一项所述的人工T细胞受体。
43.用于确定对象中的免疫应答的方法，其包括在分离自所述对象的生物样品中确定与权利要求1至3中任一项所述的肽反应的T细胞。
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