TW202029971A - 針對突變ras之hla-a3–限制性t細胞受體 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種經分離或經純化T細胞受體(T cell receptor；TCR)，其中該TCR對藉由HLA-A3分子呈現之突變RAS胺基酸序列具有抗原特異性。亦提供相關之多肽及蛋白質，以及相關之核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群及醫藥組合物。亦揭示偵測哺乳動物中癌症之存在之方法及治療或預防哺乳動物中之癌症之方法。
Description
一些癌症可具有非常有限之治療選擇，尤其在癌症變成轉移性及不可切除時。儘管在諸如(例如)手術、化學療法及放射療法之治療中取得進展，但諸如(例如)胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌及前列腺癌之許多癌症的預後可為不佳的。因此，對癌症之額外治療存在未滿足之需求。
本發明之一實施例提供一種經分離或經純化T細胞受體(T-cell receptor；TCR)，其中該TCR對藉由人類白血球抗原(human leukocyte antigen；HLA)-A3分子呈現之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性，且其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)或突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列。
本發明之其他實施例提供與本發明TCR相關之多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群及醫藥組合物。
藉由本發明之實施例進一步提供偵測哺乳動物中癌症之存在之方法及治療或預防哺乳動物中之癌症之方法。
相關申請案之交叉參考
本專利申請案主張2018年10月24日申請之美國臨時專利申請案第62/749,750號的權益，該專利申請案以引用之方式併入。
以引用之方式併入以電子方式提交之材料
與本申請案同時提交且如下標識之電腦可讀核苷酸/胺基酸序清單以全文引用之方式併入本文中：一個76,774位元組ASCII (文本)檔案，其命名為「744885_ST25.txt」，創建於2019年10月17日。
關於聯邦政府獎助研究及研發之說明
本發明係在政府支援之情況下，藉由國立衛生研究院(National Institutes of Health)、國立癌症研究院(National Cancer Institute)以項目編號BC011651-03進行。在本發明中政府具有某些權利。
RAS家族蛋白質屬於小GTP酶之大家族。不受特定理論或機制束縛，咸信當突變時，RAS蛋白質可參與許多人類癌症之瘤形成早期的信號轉導。單一胺基酸取代可活化蛋白質。突變RAS蛋白質產物可經組成性活化。突變RAS蛋白質可在多種人類癌症中之任一者中表現，該等癌症諸如(例如)胰臟癌(例如，胰臟癌瘤)、結腸直腸癌、肺癌(例如，肺腺癌)、子宮內膜癌、卵巢癌(例如，上皮卵巢癌)及前列腺癌。人類RAS家族蛋白質包括KRAS、HRAS及NRAS。
KRAS亦稱為GTP酶KRas、V-Ki-Ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因或KRAS2。存在KRAS之兩種轉錄變體：KRAS變體A及KRAS變體B。野生型(Wild-type；WT) KRAS變體A具有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。野生型(WT) KRAS變體B具有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。在下文中，除非另外規定，否則提及「KRAS」(突變或未突變(WT))係指變體A及變體B兩者。在活化時，突變KRAS與鳥苷-5'-三磷酸(GTP)結合且將GTP轉化為鳥苷5'-二磷酸(GDP)。
HRAS為RAS蛋白質家族之另一成員。HRAS亦稱為Harvey大鼠肉瘤病毒癌蛋白、V-Ha-Ras Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物或Ras家族小GTP結合蛋白H-Ras。WT HRAS具有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。
NRAS為RAS蛋白質家族之又另一成員。NRAS亦稱為GTP酶NRas、V-Ras神經母細胞瘤RAS病毒致癌基因同系物或NRAS1。WT NRAS具有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
本發明之一實施例提供一種經分離或經純化TCR，其中TCR對藉由HLA-A3分子呈現之突變人類RAS胺基酸序列(下文，「突變RAS」)具有抗原特異性，且其中突變人類RAS胺基酸序列為突變人類KRAS、突變人類HRAS或突變人類NRAS胺基酸序列。在下文中，除非另外規定，否則提及「TCR」亦係指TCR之功能部分及功能變體。
本發明TCR可對如本文所描述之任何突變人類RAS蛋白質、多肽或肽胺基酸序列具有抗原特異性。在本發明之一實施例中，突變人類RAS胺基酸序列為突變人類KRAS胺基酸序列、突變人類HRAS胺基酸序列或突變人類NRAS胺基酸序列。WT人類KRAS、NRAS及HRAS蛋白質之胺基酸序列各自具有188-189個胺基酸殘基之長度且具有彼此相同之高度。舉例而言，WT人類NRAS蛋白質之胺基酸序列與WT人類KRAS蛋白質之胺基酸序列為86.8%相同。WT人類NRAS蛋白質及WT人類KRAS蛋白質之胺基酸殘基1-86為100%相同。WT人類HRAS蛋白質之胺基酸序列與WT人類KRAS蛋白質之胺基酸序列為86.3%相同。WT人類HRAS蛋白質及WT人類KRAS蛋白質之胺基酸殘基1-94為100%相同。在下文中，除非另外規定，否則提及「RAS」(突變或未突變(WT))共同係指KRAS、HRAS及NRAS。
在本發明之一實施例中，突變人類RAS胺基酸序列包含在位置12處具有甘胺酸取代之WT人類KRAS、WT人類HRAS或WT人類NRAS胺基酸序列，其中位置12分別參考WT人類KRAS、WT人類HRAS或WT人類NRAS蛋白質來定義。WT RAS蛋白質可為WT KRAS蛋白質(SEQ ID NO: 9或10)、WT HRAS蛋白質(SEQ ID NO: 11)或WT NRAS蛋白質(SEQ ID NO: 12)中之任一者，因為如上文所解釋，WT人類NRAS蛋白質及WT人類KRAS蛋白質之胺基酸殘基1-86為100%相同，且WT人類HRAS蛋白質及WT人類KRAS蛋白質之胺基酸殘基1-94為100%相同。因此，WT KRAS、WT HRAS及WT NRAS蛋白質中之每一者之位置12處的胺基酸殘基為相同的，即甘胺酸。
WT RAS胺基酸序列之位置12處的甘胺酸可經除甘胺酸以外之任何胺基酸殘基取代。在本發明之一實施例中，取代為甘胺酸在WT RAS胺基酸序列之位置12處經纈胺酸取代。就此而言，本發明之實施例提供對具有G12V突變之任何WT RAS蛋白質、多肽或肽胺基酸序列具有抗原特異性之TCR。
RAS之突變及取代在本文中參考WT RAS蛋白質之胺基酸序列來定義。因此，RAS之突變及取代在本文中通過參考存在於WT RAS蛋白質中之特定位置處的胺基酸殘基，隨後為位置編號，隨後為所論述之特定突變或取代中該殘基經置換的胺基酸殘基來描述。RAS胺基酸序列(例如，RAS肽)可包含少於全長WT RAS蛋白質之所有胺基酸殘基。因此，位置12在本文中通過參考WT全長RAS蛋白質(即，SEQ ID NO: 9-12中之任一者)來定義，同時理解RAS胺基酸序列之特定實例中對應殘基之實際位置可能不同。當位置藉由SEQ ID NO: 9-12中之任一者定義時，術語「G12」係指通常存在於SEQ ID NO: 9-12中之任一者之位置12處的甘胺酸且「G12V」指示通常存在於SEQ ID NO: 9-12中之任一者之位置12處的甘胺酸經纈胺酸置換。舉例而言，當RAS胺基酸序列之特定實例為例如VVVGAG
GVGK (SEQ ID NO: 36) (對應於SEQ ID NO: 9之連續胺基酸殘基7至16的一例示性WT KRAS肽)時，「G12V」係指SEQ ID NO: 36中帶下劃線的甘胺酸經纈胺酸取代，即使SEQ ID NO: 36中帶下劃線的甘胺酸之實際位置為6。
具有G12V突變之全長RAS蛋白質之實例闡述於下表1中。
表1
| 突變全長RAS 蛋白 質 | SEQ ID NO: |
| G12V KRAS變體A | 13 |
| G12V KRAS變體B | 14 |
| G12V HRAS | 15 |
| G12V NRAS | 16 |
在本發明之一實施例中，TCR對上文描述之具有G12V突變之RAS肽具有抗原特異性，其中突變RAS肽具有適用於與本文所描述之HLA-A3分子中之任一者結合的任何長度。舉例而言，TCR可對具有G12V突變之RAS肽具有抗原特異性，RAS肽具有約9至約11個胺基酸殘基之長度。TCR可對包含突變RAS蛋白質之連續胺基酸殘基的突變RAS肽具有抗原特異性，該突變RAS蛋白質包括G12V突變。在本發明之一實施例中，TCR可對具有G12V突變之RAS肽具有抗原特異性，突變RAS肽具有約9個胺基酸殘基、約10個胺基酸殘基或約11個胺基酸殘基之長度。可藉由本發明G12V TCR識別的具有G12V突變之特異性肽之一實例為10-聚體肽VVVGAV
GVGK (SEQ ID NO: 26)。
在本發明之一實施例中，本發明TCR能夠識別藉由HLA-A3分子呈現之突變RAS。就此而言，在HLA-A3分子之背景下，當與突變RAS結合時，TCR可引發免疫反應。除突變RAS之外，本發明TCR可與HLA-A3分子結合。HLA-A3分子為α鏈及β2微球蛋白之雜二聚體。HLA-A3 α鏈可由HLA-A3基因編碼。β2微球蛋白與α鏈之α1、α2及α3域非共價結合，以構建HLA-A3複合物。HLA-A3分子可為任何HLA-A3分子。HLA-A3分子之實例可包括(但不限於) HLA-A*3:01、HLA-A*3:02或HLA-A*3:05。
本發明之TCR可提供多種優點中之任何一或多者，包括當由用於過繼細胞轉移之細胞表現時。突變RAS由癌細胞表現且不由正常的非癌性細胞表現。不受特定理論或機制束縛，咸信本發明TCR有利地靶向癌細胞之破壞，同時最小化或消除正常的非癌細胞之破壞，由此例如藉由最小化或消除毒性來降低。此外，本發明TCR可有利地成功治療或預防不對諸如(例如)化學療法、手術或輻射之其他類型治療作出反應的突變RAS陽性癌症。RASG12
突變在許多癌症類型中發現的最常見之熱點突變中。舉例而言，KRAS G12V突變分別在約27%及約9%之患有胰臟癌及結腸直腸癌之患者中表現。約30%之具有KRAS突變之患者(約21%之所有胰臟腫瘤患者)具有KRAS G12V突變。此外，RAS家族成員在不同癌症類型(例如，黑素瘤中之NRAS)中共用G12熱點突變。另外，本發明TCR可提供突變RAS之高度親合識別，其可提供識別未經操控之腫瘤細胞(例如，尚未用干擾素(IFN)-γ治療之腫瘤細胞、用編碼突變RAS及HLA-A3中之一或兩者的載體轉染之腫瘤細胞、用具有G12V突變之RAS肽脈衝之腫瘤細胞或其組合)的能力。此外，HLA-A3對偶基因在美國由約20%至約30%之高加索人(Caucasian)群體表現。因此，本發明TCR可增加符合免疫療法資格的癌症患者之數目以包括表現HLA-A3之彼等患者，該等患者可對使用識別藉由其他MHC分子呈現之突變RAS之TCR的免疫療法沒有資格。
如本文所使用，片語「抗原特異性」意謂TCR可以高親合力特異性結合且免疫識別突變RAS。舉例而言，若表現TCR之約1×104
至約1×105
個T細胞在與(a)用低濃度之突變RAS肽(例如，約0.05 ng/mL至約10 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、8 ng/mL、10 ng/mL或由前述值中之任何兩個定義之範圍)脈衝之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞或(b)編碼突變RAS之核苷酸序列已引入至其中以使得目標細胞表現突變RAS之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞共培養時分泌至少約200 pg/mL或更高(例如，200 pg/mL或更高、300 pg/mL或更高、400 pg/mL或更高、500 pg/mL或更高、600 pg/mL或更高、700 pg/mL或更高、1000 pg/mL或更高、5,000 pg/mL或更高、7,000 pg/mL或更高、10,000 pg/mL或更高、20,000 pg/mL或更高或由前述值中之任何兩個定義之範圍)之IFN-γ，則可將TCR視為對突變RAS具有「抗原特異性」。表現本發明TCR之細胞亦可在與用較高濃度之突變RAS肽脈衝之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞共培養時分泌IFN-γ。
替代地或另外，與由陰性對照表現的IFN-γ之量相比，若表現TCR之T細胞在與(a)用低濃度之突變RAS肽脈衝之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞或(b)編碼突變RAS之核苷酸序列已引入至其中以使得目標細胞表現突變RAS之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞共培養時分泌至少兩倍IFN-γ，則可將TCR視為對突變RAS具有「抗原特異性」。陰性對照可為例如：(i)表現TCR之T細胞，其與(a)用相同濃度之不相關肽(例如，與突變RAS肽具有不同序列的一些其他肽)脈衝之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞或(b)編碼不相關肽之核苷酸序列已引入至其中以使得目標細胞表現不相關肽之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞共培養；或(ii)未轉導之T細胞(例如，衍生自PBMC，其不表現TCR)，其與(a)用相同濃度之突變RAS肽脈衝之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞或(b)編碼突變RAS之核苷酸序列已引入至其中以使得目標細胞表現突變RAS之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞共培養。由陰性對照之目標細胞表現的HLA-A3分子將為由與所測試的T細胞共培養之目標細胞表現的相同HLA-A3分子。IFN-γ分泌可藉由此項技術中已知之方法來量測，諸如(例如)酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)。
替代地或另外，與分泌IFN-γ的陰性對照T細胞之數目相比，若至少兩倍數目的表現TCR之T細胞在與(a)用低濃度之突變RAS肽脈衝之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞或(b)編碼突變RAS之核苷酸序列已引入至其中以使得目標細胞表現突變RAS之抗原陰性、HLA-A3分子陽性目標細胞共培養時分泌IFN-γ，則可將TCR視為對突變RAS具有「抗原特異性」。分泌IFN-γ的細胞之數目可藉由此項技術中已知之方法來量測，諸如(例如) ELISPOT。
替代地或另外，若如在用表現突變RAS之目標細胞刺激後藉由例如流式細胞量測術所量測，表現TCR之T細胞上調一或多種T細胞活化標記物之表現，則可將TCR經視為對突變RAS具有「抗原特異性」。T細胞活化標記物之實例包括4-1BB、OX40、CD107a、CD69及在抗原刺激時上調之細胞介素(例如，腫瘤壞死因子(TNF)、介白素(IL)-2等)。
本發明之一實施例提供一種TCR，其包含兩種多肽(亦即，多肽鏈)，諸如TCR之α (alpha)鏈、TCR之β (beta)鏈、TCR之γ (gamma)鏈、TCR之δ (delta)鏈或其組合。本發明TCR之多肽可包含任何胺基酸序列，其限制條件為TCR對突變RAS具有抗原特異性。
在本發明之一實施例中，TCR包含兩條多肽鏈，其中之每一者包含可變區，該可變區包含TCR之互補決定區(complementarity determining region；CDR) 1、CDR2及CDR3。在本發明之一實施例中，TCR包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，該第一多肽鏈包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列(α鏈之CDR1)；CDR2，其包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列(α鏈之CDR2)；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列(α鏈之CDR3)，該第二多肽鏈包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列(β鏈之CDR1)；CDR2，其包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列 (β鏈之CDR2)；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列 (β鏈之CDR3)。就此而言，本發明TCR可包含選自由SEQ ID NO: 1-6組成之群的胺基酸序列中之任何一或多者。在本發明之一實施例中，TCR包含以下之胺基酸序列：(a)所有SEQ ID NO: 1-3；(b)所有SEQ ID NO: 4-6；或(c)所有SEQ ID NO: 1-6。在一尤佳實施例中，TCR包含所有SEQ ID NO: 1-6之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，TCR包含TCR之可變區之胺基酸序列，該TCR包含上文所闡述之CDR。TCR可包含可變區，例如，α鏈可變區及β鏈可變區。就此而言，TCR可包含以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 7 (α鏈之可變區)；SEQ ID NO: 8 (β鏈之可變區)；或SEQ ID NO: 7及8兩者。較佳地，TCR包含SEQ ID NO: 7及8兩者之胺基酸序列。
本發明TCR可進一步包含α鏈恆定區及β鏈恆定區。恆定區可來源於諸如(例如)人類或小鼠之任何適合物種。在本發明之一實施例中，TCR進一步包含鼠類α鏈及β鏈恆定區或人類α鏈及β鏈恆定區。如本文所使用，當提及TCR或本文所描述之TCR之任何組分(例如，CDR、可變區、恆定區、α鏈及/或β鏈)時，術語「鼠類」或「人類」意謂分別來源於小鼠或人類之TCR (或其組分)，亦即，分別來源於小鼠T細胞或人類T細胞或曾經由小鼠T細胞或人類T細胞表現之TCR (或其組分)。
本發明之一實施例提供一種鼠類TCR，其包含鼠類可變區及鼠類恆定區，其中TCR對藉由HLA-A3分子呈現之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性。鼠類恆定區可提供任何一或多個優點。舉例而言，當宿主細胞不為鼠類宿主細胞(例如，人類宿主細胞)時，鼠類恆定區可減少本發明TCR與本發明TCR已引入至其中的宿主細胞之內因性TCR之誤配。替代地或另外，與具有人類恆定區之相同TCR相比，鼠類恆定區可增加本發明TCR之表現。TCR可包含SEQ ID NO: 19 (野生型(WT)鼠類α鏈恆定區)、SEQ ID NO: 20 (WT鼠類β鏈恆定區)或SEQ ID NO: 19及20兩者之胺基酸序列。較佳地，本發明TCR包含SEQ ID NO: 19及20兩者之胺基酸序列。TCR可包含本文所描述的鼠類恆定區中之任一者以及如本文關於本發明之其他態樣所描述的CDR區中之任一者。就此而言，TCR可包含以下之胺基酸序列：(a)所有SEQ ID NO: 1-3及19；(b)所有SEQ ID NO: 4-6及20；或(c)所有SEQ ID NO: 1-6及19-20。在本發明之另一實施例中，TCR可包含本文所描述的鼠類恆定區中之任一者以及本文關於本發明之其他態樣所描述的可變區中之任一者。就此而言，TCR可包含以下之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 7及19兩者；(ii) SEQ ID NO: 8及20兩者；或(iii)所有SEQ ID NO: 7-8及19-20。
在本發明之另一個實施例中，鼠類TCR包含以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 23 (具有WT鼠類恆定區之鼠類TCR α鏈)、SEQ ID NO: 24 (具有WT鼠類恆定區之鼠類TCR β鏈)，或SEQ ID NO: 23-24兩者。
在本發明之一實施例中，TCR包含經取代之恆定區。就此而言，TCR可包含在α鏈及β鏈中之一或兩者之恆定區中具有一個、二個、三個或四個胺基酸取代的本文所描述之TCR中之任一者之胺基酸序列。在一實施例中，TCR包含在α鏈及β鏈中之一或兩者之鼠類恆定區中具有一個、二個、三個或四個胺基酸取代的鼠類恆定區。TCR可包含在α鏈之鼠類恆定區中具有一個、二個、三個或四個胺基酸取代且在β鏈之鼠類恆定區中具有一個胺基酸取代的鼠類恆定區。一般而言，TCR α鏈及β鏈之鼠類恆定區之經取代胺基酸序列(SEQ ID NO: 17及18)分別對應於未經取代之鼠類恆定區胺基酸序列SEQ ID NO: 19及20之全部或部分，分別地，其中當相較於SEQ ID NO: 19時，SEQ ID NO: 17具有一個、二個、三個或四個胺基酸取代，當相較於SEQ ID NO: 20時，SEQ ID NO: 18具有一個胺基酸取代。就此而言，本發明之一實施例提供一種包含以下之胺基酸序列的TCR：(a) SEQ ID NO: 17 (α鏈之恆定區)，其中(i)位置48處之X為Thr或Cys；(ii)位置112處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)位置114處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及(iv)位置115處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b) SEQ ID NO: 18 (β鏈之恆定區)，其中位置57處之X為Ser或Cys；或(c) SEQ ID NO: 17及18兩者。在本發明之一實施例中，包含SEQ ID NO: 17之TCR不包含SEQ ID NO: 19 (α鏈之未經取代之鼠類恆定區)。在本發明之一實施例中，包含SEQ ID NO: 18之TCR不包含SEQ ID NO: 20 (β鏈之未經取代之鼠類恆定區)。
在本發明之一實施例中，TCR包含：α鏈，其包含可變區及恆定區；及β鏈，其包含可變區及恆定區。就此而言，TCR可包含(a) α鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 21之位置182處之X為Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 21之位置246處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 21之位置248處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及(iv) SEQ ID NO: 21之位置249處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b) β鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 22之位置191處之X為Ser或Cys；或(c) (a)及(b)兩者。在本發明之一實施例中，包含SEQ ID NO: 21之TCR不包含SEQ ID NO: 23 (未經取代之α鏈)。在本發明之一實施例中，包含SEQ ID NO: 22之TCR不包含SEQ ID NO: 24 (未經取代之β鏈)。
在本發明之一實施例中，經取代之恆定區包括α鏈及β鏈中之一或兩者之恆定區中的半胱胺酸取代，以提供經半胱胺酸取代之TCR。α鏈及β鏈中相對之半胱胺酸提供二硫鍵，該二硫鍵將經取代TCR之α鏈及β鏈之恆定區彼此連接且其不存在於包含未經取代之鼠類恆定區之TCR中。就此而言，TCR可為經半胱胺酸取代之TCR，其中SEQ ID NO: 19之位置48處之天然Thr (Thr48)及SEQ ID NO: 20之位置57處之天然Ser (Ser57)中之一或兩者可經Cys取代。較佳地，SEQ ID NO: 19之天然Thr48及SEQ ID NO: 20之天然Ser57兩者經Cys取代。經半胱胺酸取代之TCR恆定區序列之實例闡述於表2中。在本發明之一實施例中，經半胱胺酸取代之TCR包含(i) SEQ ID NO: 17，(ii) SEQ ID NO: 18，或(iii) SEQ ID NO: 17及18兩者，其中SEQ ID NO: 17及18兩者如表2中所定義。除本文所描述之CDR或可變區中之任一者之外，本發明之經半胱胺酸取代之TCR可包括經取代之恆定區。
在本發明之一實施例中，經半胱胺酸取代之TCR包含全長α鏈及全長β鏈。經半胱胺酸取代之TCR α鏈及β鏈序列之實例闡述於表2中。在本發明之一實施例中，TCR包含(i) SEQ ID NO: 21，(ii) SEQ ID NO: 22，或(iii) SEQ ID NO: 21及22兩者，其中SEQ ID NO: 21-22如表2中所定義。
表2
| SEQ ID NO: | 「X 」 之定義 |
| SEQ ID NO: 17 (恆定區α鏈) | 位置48處之X為Cys， 位置112處之X為Ser， 位置114處之X為Met，及 位置115處之X為Gly。 |
| SEQ ID NO: 18 (恆定區β鏈) | 位置57處之X為Cys |
| SEQ ID NO: 21 (α鏈) | 位置182處之X為Cys， 位置246處之X為Ser， 位置248處之X為Met，及 位置249處之X為Gly。 |
| SEQ ID NO: 22 (β鏈) | 位置191處之X為Cys |
在本發明之一實施例中，經取代之胺基酸序列包括α鏈及β鏈中之一或兩者之恆定區之跨膜(TM)域中的一個、兩個或三個胺基酸經疏水性胺基酸取代以提供經疏水性胺基酸取代之TCR (在本文中亦稱為「經LVL修飾之TCR」)。與TM域中缺少疏水性胺基酸取代之TCR相比，TCR之TM域中之疏水性胺基酸取代可增加TCR之TM域之疏水性。就此而言，TCR為經LVL修飾之TCR，其中SEQ ID NO: 19之一個、兩個或三個天然Ser112、Met114及Gly115可獨立地經Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp取代，較佳地經Leu、Ile或Val取代。較佳地，SEQ ID NO: 19之全部三個天然Ser112、Met114及Gly115可獨立地經Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp取代，較佳地經Leu、Ile或Val取代。在本發明之一實施例中，經LVL修飾之TCR包含(i) SEQ ID NO: 17，(ii) SEQ ID NO: 18，或(iii) SEQ ID NO: 17及18兩者，其中SEQ ID NO: 17及18兩者如表3中所定義。除本文所描述之CDR或可變區中之任一者之外，本發明之經LVL修飾之TCR可包括經取代之恆定區。
在本發明之一實施例中，經LVL修飾之TCR包含全長α鏈及全長β鏈。經LVL修飾之TCR α鏈及β鏈序列之實例闡述於表3中。在本發明之一實施例中，經LVL修飾之TCR包含(i) SEQ ID NO: 21，(ii) SEQ ID NO: 22，或(iii) SEQ ID NO: 21及22兩者，其中SEQ ID NO: 21-22如表3中所定義。
表3
| SEQ ID NO: | 「X 」 之定義 |
| SEQ ID NO: 17(恆定區α鏈) | 位置48處之X為Thr； 位置112處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置112處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置112處之X為Leu； 位置114處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置114處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置114處之X為Ile；及 位置115處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置115處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置115處之X為Val； 其中SEQ ID NO: 17不包含SEQ ID NO: 19 (α鏈之未經取代恆定區) |
| SEQ ID NO: 18(恆定區β鏈) | 位置57處之X為Ser |
| SEQ ID NO: 21 (α鏈) | 位置182處之X為Thr； 位置246處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置246處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置246處之X為Leu； 位置248處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置248處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置248處之X為Ile；及 位置249處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置249處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置249處之X為Val， 其中SEQ ID NO: 21不包含SEQ ID NO: 23 (未經取代之α鏈) |
| SEQ ID NO: 22 (β鏈) | 位置191處之X為Ser |
在本發明之一實施例中，經取代之胺基酸序列包括α鏈及β鏈中之一或兩者之恆定區中的半胱胺酸取代，以及α鏈及β鏈中之一或兩者之恆定區之跨膜(TM)域中的一個、兩個或三個胺基酸經疏水性胺基酸取代(在本文中亦稱為「經半胱胺酸取代的經LVL修飾之TCR」)。就此而言，TCR為經半胱胺酸取代的經LVL修飾之TCR，其中SEQ ID NO: 19之天然Thr48經Cys取代；SEQ ID NO: 19之一個、兩個或三個天然Ser112、Met114及Gly115獨立地經Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp取代，較佳地經Leu、Ile或Val取代；及SEQ ID NO: 20之天然Ser57經Cys取代。較佳地，SEQ ID NO: 19之全部三個天然Ser112、Met114及Gly115可獨立地經Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp取代，較佳地經Leu、Ile或Val取代。在本發明之一實施例中，經半胱胺酸取代的經LVL修飾之TCR包含(i) SEQ ID NO: 17，(ii) SEQ ID NO: 18，或(iii) SEQ ID NO: 17及18兩者，其中SEQ ID NO: 17及18兩者如表4中所定義。除本文所描述之CDR或可變區中之任一者之外，本發明之經半胱胺酸取代的經LVL修飾之TCR可包括經取代之恆定區。
在一實施例中，經半胱胺酸取代的經LVL修飾之TCR包含全長α鏈及全長β鏈。在本發明之一實施例中，經半胱胺酸取代的經LVL修飾之TCR包含(i) SEQ ID NO: 21，(ii) SEQ ID NO: 22，或(iii) SEQ ID NO: 21及22兩者，其中SEQ ID NO: 21-22如表4中所定義。
表4
| SEQ ID NO: | 「X 」 之定義 |
| SEQ ID NO: 17(恆定區α鏈) | 位置48處之X為Cys； 位置112處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置112處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置112處之X為Leu； 位置114處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置114處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置114處之X為Ile；及 位置115處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置115處之X為Leu、Ile或Val；及 尤佳地，其中位置115處之X為Val， 其中SEQ ID NO: 17不同時包含位置112處之Ser、位置114處之Met及位置115處之Gly中之全部。 |
| SEQ ID NO: 18 (恆定區β鏈) | 位置57處之X為Cys |
| SEQ ID NO: 21 (α鏈) | 位置182處之X為Cys； 位置246處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置246處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置246處之X為Leu； 位置248處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置248處之X為Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置248處之X為Ile；及 位置249處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置249處之X為Leu、Ile或Val；及 尤佳地，其中位置249處之X為Val， 其中SEQ ID NO: 21不同時包含位置246處之Ser、位置248處之Met及位置249處之Gly中之全部。 |
| SEQ ID NO: 22 (β鏈) | 位置191處之X為Cys |
亦藉由本發明之一實施例提供一種多肽，其包含本文所描述之TCR中之任一者之功能部分。如本文所使用，術語「多肽」包括寡肽且係指由一或多個肽鍵連接之胺基酸之單鏈。
關於本發明多肽，功能部分可為包含其作為部分的TCR之連續胺基酸的任何部分，其限制條件為功能部分特異性結合於突變RAS。當在提及TCR時使用時，術語「功能部分」係指本發明TCR之任何部分或片段，該部分或片段保留其作為部分的TCR (親本TCR)之生物活性。功能部分涵蓋例如TCR之彼等部分，其保留以與親本TCR類似的程度、相同的程度或更高的程度特異性結合於突變RAS (例如，在HLA-A3分子之情形中)或偵測、治療或預防癌症的能力。關於親本TCR，功能部分可包含例如約10%、約25%、約30%、約50%、約70%、約80%、約90%、約95%或更高之親本TCR。
功能部分可在部分之胺基或羧基端或在兩個端處包含額外胺基酸，該等額外胺基酸在親本TCR之胺基酸序列中未發現。理想地，額外胺基酸不干擾功能部分之生物功能，例如特異性結合於突變RAS；及/或具有偵測癌症、治療或預防癌症等之能力。更理想地，與親本TCR之生物活性相比，額外胺基酸增強生物活性。
多肽可包含本發明TCR之α鏈及β鏈中之任一者或兩者之功能部分，諸如包含本發明TCR之α鏈及/或β鏈之可變區之CDR1、CDR2及CDR3中之一或多者的功能部分。在本發明之一實施例中，多肽可包含以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 1 (α鏈之CDR1)、SEQ ID NO: 2 (α鏈之CDR2)、SEQ ID NO: 3 (α鏈之CDR3)、SEQ ID NO: 4 (β鏈之CDR1)、SEQ ID NO: 5 (β鏈之CDR2)、SEQ ID NO: 6 (β鏈之CDR3)或其組合。
就此而言，本發明多肽可包含選自由SEQ ID NO: 1-6組成之群的胺基酸序列中之任何一或多者。在本發明之一實施例中，TCR包含以下之胺基酸序列：(a)所有SEQ ID NO: 1-3；(b)所有SEQ ID NO: 4-6；或(c)所有SEQ ID NO: 1-6。在一較佳實施例中，多肽包含所有SEQ ID NO: 1-6之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，本發明多肽可包含例如本發明TCR之可變區，該可變區包含上文闡述之CDR區之組合。就此而言，多肽可包含以下之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 7 (α鏈之可變區)；(ii) SEQ ID NO: 8 (β鏈之可變區)，或(iii) SEQ ID NO: 7及8兩者。較佳地，多肽包含SEQ ID NO: 7及8兩者之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，本發明多肽可進一步包含上文闡述之本發明TCR之恆定區。就此而言，多肽可進一步包含以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 19 (α鏈之WT鼠類恆定區)、SEQ ID NO: 20 (β鏈之WT鼠類恆定區)、SEQ ID NO: 17，(α鏈之經取代鼠類恆定區)、SEQ ID NO: 18 (β鏈之經取代鼠類恆定區)、SEQ ID NO: 19及20兩者，或SEQ ID NO: 17及18兩者。較佳地，多肽進一步包含SEQ ID NO: 19及20兩者或SEQ ID NO: 17及18兩者之胺基酸序列以及本文關於本發明之其他態樣所描述的CDR區或可變區中之任一者。
在本發明之一實施例中，多肽包含：(a) SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 17之位置48處之X為Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 17之位置112處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 17之位置114處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及(iv) SEQ ID NO: 17之位置115處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b) SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 18之位置57處之X為Ser或Cys；或(c) (a)及(b)兩者。在本發明之一實施例中，多肽之SEQ ID NO: 17及18中之一或兩者如表2-4中之任一者中所定義。
在本發明之一實施例中，本發明多肽可包含本文所描述之TCR之α或β鏈之整個長度。就此而言，本發明多肽可包含以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 21及22兩者或SEQ ID NO: 23及24兩者。較佳地，多肽包含SEQ ID NO: 21及22兩者或SEQ ID NO: 23及24兩者之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，多肽包含：(a) SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 21之位置182處之X為Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 21之位置246處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 21之位置248處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及(iv) SEQ ID NO: 21之位置249處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b) SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 22之位置191處之X為Ser或Cys；或(c) (a)及(b)兩者。在本發明之一實施例中，多肽之SEQ ID NO: 21-22中之任一或多者如表2-4中之任一者中所定義。
本發明之一實施例進一步提供一種蛋白質，其包含本文所描述之至少一個多肽。「蛋白質」意謂包含一或多條多肽鏈之分子。
在一實施例中，本發明之蛋白質可包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 1-3之胺基酸序列；及第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 4-6之胺基酸序列。
在本發明之另一個實施例中，蛋白質可包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列；及第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
本發明蛋白質可進一步包含本文關於本發明之其他態樣所描述的恆定區中之任一者。就此而言，在本發明之一實施例中，第一多肽鏈可進一步包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列且第二多肽鏈可進一步包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。在本發明之一實施例中，第一多肽鏈可進一步包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列且第二多肽鏈可進一步包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中：(a)第一多肽鏈進一步包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 17之位置48處之X為Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 17之位置112處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 17之位置114處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及(iv) SEQ ID NO: 17之位置115處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b)第二多肽鏈進一步包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 18之位置57處之X為Ser或Cys；或(c) (a)及(b)兩者。在本發明之一實施例中，蛋白質之SEQ ID NO: 17及18中之一或兩者如表2-4中之任一者中所定義。
替代地或另外，本發明之一實施例之蛋白質可包含(a)包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的第一多肽鏈，其中：(i) SEQ ID NO: 21之位置182處之X為Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 21之位置246處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 21之位置248處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及(iv) SEQ ID NO: 21之位置249處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b)包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列的第二多肽鏈，其中SEQ ID NO: 22之位置191處之X為Ser或Cys；或(c) (a)及(b)兩者。在本發明之一實施例中，蛋白質可包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列；及第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。在本發明之一實施例中，SEQ ID NO: 21-22中之一或兩者如表2-4中之任一者中所定義。
本發明之蛋白質可為TCR。替代地，若例如蛋白質包含單一多肽鏈，該單一多肽鏈包含SEQ ID NO: 21及22兩者、SEQ ID NO: 23及24兩者之胺基酸序列，或若蛋白質之第一及/或第二多肽鏈進一步包含其他胺基酸序列(例如，編碼免疫球蛋白或其部分的胺基酸序列)，則本發明蛋白質可為融合蛋白。就此而言，本發明之一實施例亦提供一種融合蛋白，其包含至少一種本文所描述之本發明多肽以及至少一種其他多肽。其他多肽可作為融合蛋白之單獨多肽存在，或可作為多肽存在，其與本文所描述之本發明多肽中之一者在框內(以串聯方式)表現。其他多肽可編碼任何肽或蛋白質分子或其部分，包括(但不限於)免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子(例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等)。
融合蛋白可包含本發明多肽之一或多個複本及/或其他多肽之一或多個複本。舉例而言，融合蛋白可包含本發明多肽及/或其他多肽之1、2、3、4、5或更多個複本。製備融合蛋白之適合方法為此項技術中已知的，且包括例如重組方法。
在本發明之一些實施例中，本發明之TCR、多肽及蛋白質可表現為包含連接α鏈及β鏈之連接子肽的單一蛋白質。就此而言，本發明之TCR、多肽及蛋白質可進一步包含連接子肽。連接子肽可有利地促進重組TCR、多肽及/或蛋白質在宿主細胞中之表現。連接子肽可包含任何適合的胺基酸序列。舉例而言，連接子肽可為包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列的P2A連接子。當藉由宿主細胞表現包括連接子肽之構築體時，連接子肽可經裂解，從而產生經分離α鏈及β鏈。因此，連接子肽可為可裂解連接子肽。在本發明之一實施例中，TCR、多肽或蛋白質可包含胺基酸序列，該胺基酸序列包含全長α鏈、全長β鏈及位於α鏈與β鏈之間的連接子肽。舉例而言，TCR、多肽或蛋白質可包含SEQ ID NO: 34或SEQ ID NO: 35之胺基酸序列。
本發明之蛋白質可為重組抗體或其抗原結合部分，其包含至少一種本文所描述之本發明多肽。如本文所使用，「重組抗體」係指包含至少一種本發明之多肽及抗體或其抗原結合部分之多肽鏈的重組(例如，經基因工程改造)蛋白質。抗體或其抗原結合部分之多肽可為重鏈、輕鏈、重鏈或輕鏈之可變或恆定區、單鏈可變片段(scFv)，或抗體之Fc、Fab或F(ab)2
'片段等。抗體或其抗原結合部分之多肽鏈可作為重組抗體之單獨多肽存在。替代地，抗體或其抗原結合部分之多肽鏈可作為多肽存在，其與本發明之多肽在框內(以串聯方式)表現。抗體或其抗原結合部分之多肽可為包括本文所描述之抗體及抗體片段中之任一者的任何抗體或任何抗體片段之多肽。
包括於本發明之範疇中的係本文所描述之本發明TCR、多肽或蛋白質之功能變體。如本文所使用，術語「功能變體」係指與親本TCR、多肽或蛋白質具有實質或顯著序列一致性或類似性的TCR、多肽或蛋白質，該功能變體保留其作為變體的TCR、多肽或蛋白質之生物活性。功能變體涵蓋例如本文所描述之TCR、多肽或蛋白質(親本TCR、多肽或蛋白質)之彼等變體，其保留以與親本TCR、多肽或蛋白質類似的程度、相同的程度或更高的程度特異性結合於突變RAS的能力，親本TCR對該突變RAS具有抗原特異性或親本多肽或蛋白質特異性結合於該突變RAS。關於親本TCR、多肽或蛋白質，功能變體可例如在胺基酸序列中分別與親本TCR、多肽或蛋白質至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同。
功能變體可例如包含具有至少一個保守胺基酸取代的親本TCR、多肽或蛋白質之胺基酸序列。保守胺基酸取代為此項技術中已知的且包括其中具有某些物理及/或化學特性之一個胺基酸與具有相同化學或物理特性之另一個胺基酸交換的胺基酸取代。舉例而言，保守胺基酸取代可為取代另一酸性胺基酸的酸性胺基酸(例如，Asp或Glu)、取代具有非極性側鏈之另一胺基酸的具有非極性側鏈之胺基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、取代另一鹼性胺基酸的鹼性胺基酸(Lys、Arg等)、取代具有極性側鏈之另一胺基酸的具有極性側鏈之胺基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。
替代地或另外，功能變體可包含具有至少一個非保守胺基酸取代的親本TCR、多肽或蛋白質之胺基酸序列。在此情況下，較佳的為非保守胺基酸取代不干擾或抑制功能變體之生物活性。較佳地，非保守胺基酸取代增強功能變體之生物活性，使得與親本TCR、多肽或蛋白質相比，功能變體之生物活性增加。
TCR、多肽或蛋白質可基本上由本文所描述之一或多個指定胺基酸序列組成，使得TCR、多肽或蛋白質之其他組分(例如，其他胺基酸)不實質上改變TCR、多肽或蛋白質之生物活性。就此而言，本發明TCR、多肽或蛋白質可例如基本上由以下之胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 21-22兩者，或SEQ ID NO: 23-24兩者。此外，舉例而言，本發明TCR、多肽或蛋白質可基本上由以下之胺基酸序列組成：(i) SEQ ID NO: 7、(ii) SEQ ID NO: 8，或(iii) SEQ ID NO: 7及8兩者。此外，本發明TCR、多肽或蛋白質可基本上由以下之胺基酸序列組成：(a) SEQ ID NO: 1-6中之任一或多者；(b)所有SEQ ID NO: 1-3；(c)所有SEQ ID NO: 4-6；或(d)所有SEQ ID NO: 1-6。
本發明之TCR、多肽及蛋白質可具有任何長度(亦即，可包含任何數目之胺基酸)，其限制條件為TCR、多肽或蛋白質保留其生物活性，例如，特異性結合於突變RAS、偵測哺乳動物中之癌症或治療或預防哺乳動物中之癌症等的能力。舉例而言，多肽可在約50至約5000個胺基酸長之範圍內，諸如長度為約50、約70、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000個或更多個胺基酸。就此而言，本發明之多肽亦包括寡肽。
本發明之TCR、多肽及蛋白質可包含代替一或多種天然存在之胺基酸的合成胺基酸。此等合成胺基酸為此項技術中已知的且包括例如胺基環己烷甲酸、正白胺酸、α-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯胺基甲基半胱胺酸、反式-3-羥脯胺酸及反式-4-羥脯胺酸、4-胺基苯丙胺酸、4-硝基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、4-羧基苯丙胺酸、β-苯基絲胺酸β-羥基苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N'-苯甲基-N'-甲基-離胺酸、N',N'-二苯甲基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷甲酸、α-胺基環己烷甲酸、α-胺基環庚烷甲酸、α-(2-胺基-2-降冰片烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯丙胺酸及α-第三丁基甘胺酸。
本發明之TCR、多肽及蛋白質可經糖基化、醯胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-醯基化、經由例如二硫橋鍵環化或轉化成酸加成鹽及/或視情況二聚或聚合，或共軛。
本發明之TCR、多肽及/或蛋白質可藉由此項技術中已知之方法獲得，諸如(例如)重新合成。此外，多肽及蛋白質可使用本文所描述之核酸使用標準重組方法以重組方式產生。參見例如Green及Sambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual
，第4版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY (2012)。替代地，本文所描述之TCR、多肽及/或蛋白質可藉由諸如Synpep (Dublin，CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg，MD)及Multiple Peptide Systems (San Diego，CA)之公司來商業地合成。在此態樣中，本發明TCR、多肽及蛋白質可為合成的、重組的、分離的及/或純化的。
包括於本發明之範疇中的係共軛物(例如，生物共軛物)，包含以下中之任一者：本發明TCR、多肽或蛋白質(包括其功能部分或變體中之任一者)、核酸、重組表現載體、宿主細胞或宿主細胞群體。共軛物以及合成共軛物之方法一般而言為此項技術中已知的。
本發明之一實施例提供一種核酸，其包含編碼本文所描述之TCR、多肽或蛋白質中之任一者的核苷酸序列。如本文所使用，「核酸」包括「聚核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸分子」，且通常意謂可為單股或雙股的DNA或RNA之聚合物，其可含有天然、非天然或經更改之核苷酸，且其可含有天然、非天然或經更改之核苷酸間鍵，諸如磷醯胺酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵，而非在未經修飾之寡核苷酸之核苷酸之間發現的磷酸二酯。在一實施例中，核酸包含互補DNA (cDNA)。通常較佳的為，核酸不包含任何插入、缺失、倒位及/或取代。然而，在一些情況下，如本文所論述，適合之核酸可包含一或多個插入、缺失、倒置及/或取代。
較佳地，本發明之核酸為重組的。如本文所使用，術語「重組」係指(i)藉由將天然或合成核酸片段接合至可在活細胞中複製之核酸分子而在活細胞外部構築的分子，或(ii)由上文(i)中描述之彼等之複製產生的分子。出於本文之目的，複製可為活體外複製或活體內複製。
核酸可使用此項技術中已知之程序基於化學合成及/或酶促連接反應來構築。參見例如前述Green及Sambrook等人。舉例而言，核酸可使用天然存在之核苷酸或各種經修飾之核苷酸化學上合成，該等核苷酸經設計以增加分子之生物穩定性或增加雜交時形成的雙螺旋之物理穩定性(例如，硫代磷酸酯衍生物及吖啶取代之核苷酸)。可用於產生核酸的經修飾核苷酸之實例包括(但不限於) 5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖苷基Q核苷、肌苷、N6
-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6
-取代之腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖苷基Q核苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6
-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。替代地，本發明之核酸中之一或多者可購自諸如Macromolecular Resources (Fort Collins，CO)及Synthegen (Houston，TX)之公司。
核酸可包含編碼本文所描述之TCR、多肽或蛋白質中之任一者的任何核苷酸序列。在本發明之一實施例中，核酸可包含SEQ ID NO: 27-28中之任一者之WT核苷酸序列。在本發明之一實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 27-28兩者之核苷酸序列。
在本發明之一實施例中，核酸包含一種密碼子優化核苷酸序列，其編碼本文所描述之TCR、多肽或蛋白質中之任一者。不受任何特定理論或機制束縛，咸信核苷酸序列之密碼子優化增加mRNA轉錄物之轉譯效率。核苷酸序列之密碼子優化可涉及用另一密碼子取代初始密碼子，該另一密碼子編碼相同胺基酸但可藉由更容易地在細胞內可用的tRNA轉譯，因此增加轉譯效率。核苷酸序列之優化亦可減少會干擾轉譯之二級mRNA結構，因此增加轉譯效率。在本發明之一實施例中，核酸可包含SEQ ID NO: 29-30 (構築體1)及SEQ ID NO: 59-60 (構築體2)中之任一者之密碼子優化核苷酸序列。在本發明之一實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 29-30兩者或SEQ ID NO: 59-60兩者之核苷酸序列。
本發明亦提供一種核酸，其包含與本文所描述之核酸中之任一者之核苷酸序列互補的核苷酸序列或在嚴格條件下與本文所描述之核酸中之任一者之核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
在嚴格條件下雜交的核苷酸序列較佳地在高嚴格度條件下雜交。「高嚴格度條件」意謂以比非特異性雜交更強的可偵測量使核苷酸序列與目標序列(本文所描述之核酸中之任一者之核苷酸序列)特異性雜交。高嚴格度條件包括將具有準確互補序列之聚核苷酸或僅含有少量分散錯配之聚核苷酸與碰巧具有匹配核苷酸序列之少量小區域(例如，3-10個鹼基)之隨機序列進行區分的條件。具有互補性此等小區域比具有14-17個或更多個鹼基之全長互補序列更易於解鏈，且高嚴格度雜交使其容易區分。相對高嚴格度條件將包括例如低鹽及/或高溫條件，諸如在約50-70℃之溫度下由約0.02-0.1 M NaCl或等效物提供。此等高嚴格度條件容許核苷酸序列與模板或目標股之間的少量(若存在)錯配，且尤其適用於偵測本發明TCR中之任一者之表現。通常理解，藉由添加逐漸增加量之甲醯胺，可更加嚴格呈現條件。
本發明之一實施例亦提供一種核酸，其包含與本文所描述之核酸中之任一者至少約70%，例如至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同的核苷酸序列。就此而言，核酸可基本上由本文所描述之核苷酸序列中之任一者組成。
本發明之核酸可併入至重組表現載體中。就此而言，本發明之一實施例提供包含本發明之核酸中之任一者的重組表現載體。在本發明之一實施例中，重組表現載體包含編碼α鏈、β鏈及連接子肽的核苷酸序列。
出於本文之目的，術語「重組表現載體」意謂當構築體包含編碼mRNA、蛋白質、多肽或肽之核苷酸序列且使載體在足以使mRNA、蛋白質、多肽或肽在細胞內表現之條件下與細胞接觸時，准許藉由宿主細胞表現mRNA、蛋白質、多肽或肽的經基因修飾之寡核苷酸或聚核苷酸構築體。本發明之載體整體上不為天然存在的。然而，部分載體可為天然存在的。本發明重組表現載體可包含任何類型之核苷酸，包括(但不限於)可為單股或雙股、合成的或部分獲自天然來源且可含有天然、非天然或經更改核苷酸的DNA及RNA。重組表現載體可包含天然存在之核苷酸間鍵、非天然存在之核苷酸間鍵或兩種類型的鍵。較佳地，非天然存在或經更改核苷酸或核苷酸間鍵不妨礙載體之轉錄或複製。
本發明之重組表現載體可為任何適合的重組表現載體且可用於轉化或轉染任何適合的宿主細胞。適合載體包括設計用於增殖及擴增或用於表現或用於二者的彼等載體，諸如質體及病毒。載體可選自由以下組成之群：pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, CA)、pET系列(Novagen, Madison, WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)及pEX系列(Clontech, Palo Alto, CA)。亦可使用噬菌體載體，諸如λGT10、λGT11、λZapII (Stratagene)、λEMBL4及λNM1149。植物表現載體之實例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及pBIN19 (Clontech)。動物表現載體之實例包括pEUK-Cl、pMAM及pMAMneo (Clontech)。較佳地，重組表現載體為病毒載體，例如反轉錄病毒載體。在一尤佳實施例中，重組表現載體為MSGV1反轉錄病毒載體。
可使用描述於例如前述Green及Sambrook等人中之標準重組DNA技術來製備本發明之重組表現載體。環狀或線性的表現載體之構築體可經製備以含有在原核或真核宿主細胞中起作用之複製系統。複製系統可衍生自例如ColEl、2 μ質體、λ、SV40、牛乳突狀瘤病毒及類似者。
理想地，重組表現載體包含諸如轉錄及轉譯起始及終止密碼子之調節序列，其對載體待引入至其中之宿主細胞的類型(例如，細菌、真菌、植物或動物)具特異性，按需要且考量載體是否為基於DNA或基於RNA。
重組表現載體可包括允許選擇經轉化或經轉染宿主細胞之一或多個標記物基因。標記物基因包括殺生物劑耐性(例如，對抗生素、重金屬等具有耐性)，營養缺陷型宿主細胞中之互補以提供原營養及類似者。用於本發明表現載體的適合標記物基因包括例如耐新黴素/G418基因、耐潮黴素基因、耐組胺醇基因、耐四環素基因及耐安比西林(ampicillin)基因。
重組表現載體可包含可操作地連接至編碼TCR、多肽或蛋白質之核苷酸序列或連接至與編碼TCR、多肽或蛋白質之核苷酸序列互補或雜交之核苷酸序列的天然或非天然啟動子。啟動子之選擇(例如，強、弱、誘導性、組織特異性及發育特異性)在技術人員之普通技能內。類似地，核苷酸序列與啟動子之組合亦在技術人員之技能內。啟動子可為非病毒啟動子或病毒啟動子，諸如巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子及發現於鼠類幹細胞病毒之長末端重複序列中之啟動子。
本發明重組表現載體可經設計用於短暫表現、用於穩定表現或用於兩者。此外，重組表現載體可適宜用於組成性表現或用於誘導性表現。
此外，重組表現載體可經製成以包括自殺基因。如本文所使用，術語「自殺基因」係指使表現自殺基因之細胞死亡的基因。自殺基因可為向表現基因之細胞賦予對藥劑(例如，藥物)之敏感性且當細胞與藥劑接觸或暴露於藥劑時使細胞死亡的基因。自殺基因為此項技術中已知的且包括例如單純疱疹病毒(Herpes Simplex Virus；HSV)胸苷激酶(thymidine kinase；TK)基因、胞嘧啶脫胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基還原酶及誘導性卡斯蛋白酶9基因系統。
在本發明之一實施例中，重組表現載體包含編碼α鏈CDR1、α鏈CDR2、α鏈CDR3、β鏈CDR1、β鏈CDR2及β鏈CDR3之核苷酸序列，且編碼β鏈CDR1、β鏈CDR2及β鏈CDR3之核苷酸序列位於編碼α鏈CDR1、α鏈CDR2及α鏈CDR3之核苷酸序列之5'。此等重組表現載體之實例為包含SEQ ID NO: 33之核苷酸序列的重組表現載體。
在本發明之一實施例中，重組表現載體包含編碼α鏈CDR1、α鏈CDR2、α鏈CDR3、β鏈CDR1、β鏈CDR2及β鏈CDR3之核苷酸序列，且編碼β鏈CDR1、β鏈CDR2及β鏈CDR3之核苷酸序列位於編碼α鏈CDR1、α鏈CDR2及α鏈CDR3之核苷酸序列之3'。此等重組表現載體之實例為包含SEQ ID NO: 32之核苷酸序列的重組表現載體。
本發明之另一實施例進一步提供一種宿主細胞，其包含本文所描述之重組表現載體中之任一者。如本文所使用，術語「宿主細胞」係指可含有本發明重組表現載體的任何類型之細胞。宿主細胞可為真核細胞(例如，植物、動物、真菌或藻類)或可為原核細胞(例如，細菌或原蟲)。宿主細胞可為經培養細胞或原代細胞，亦即直接地自生物體(例如，人類)分離。宿主細胞可為黏附細胞或懸浮細胞，亦即在懸浮液中生長之細胞。適合宿主細胞為此項技術中已知且包括例如DH5α大腸桿菌(E. coli
)細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴VERO細胞、COS細胞、HEK293細胞及其類似者。出於擴增或複製重組表現載體之目的，宿主細胞較佳為原核細胞，例如DH5α細胞。出於製備重組TCR、多肽或蛋白質之目的，宿主細胞較佳為哺乳動物細胞。最佳地，宿主細胞為人類細胞。雖然宿主細胞可為任何細胞類型，可來源於任何類型之組織，且可為任何發育階段，但宿主細胞較佳為周邊血液淋巴球(peripheral blood lymphocyte；PBL)或周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell；PBMC)。
更佳地，宿主細胞為T細胞。出於本文之目的，T細胞可為任何T細胞，諸如經培養T細胞(例如，原代T細胞)，或來自經培養T細胞株之T細胞(例如，Jurkat，SupT1等)，或獲自哺乳動物之T細胞。若獲自哺乳動物，則T細胞可獲自眾多來源，包括(但不限於)血液、骨髓、淋巴結、胸腺或其他組織或體液。T細胞亦可經富集或純化。較佳地，T細胞為人類T細胞。T細胞可為任何類型之T細胞且可為任何發育階段，包括(但不限於) CD4+
/CD8+
雙陽性T細胞、CD4+
輔助T細胞(例如，Th1
及Th2
細胞)、CD4+
T細胞、CD8+
T細胞(例如，細胞毒性T細胞)、腫瘤浸潤性淋巴球(tumor infiltrating lymphocytes；TIL)、記憶體T細胞(例如，中樞記憶T細胞及效應記憶T細胞)、原生T細胞及類似者。
亦藉由本發明提供一種細胞群，其包含至少一種本文所描述之宿主細胞。細胞群可為包含宿主細胞之異質群體，該宿主細胞包含所描述之重組表現載體中之任一者，以及至少一種其他細胞，例如宿主細胞(例如，T細胞)，該至少一種其他細胞不包含重組表現載體中之任一者或除T細胞以外之細胞，例如B細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、紅血球、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞、大腦細胞等。替代地，細胞群可為實質上均質的群體，其中群體包含主要包含重組表現載體之宿主細胞(例如，基本上由其組成)。群體亦可為純系細胞群，其中群體之所有細胞為包含重組表現載體的單一宿主細胞之純系，使得群體之所有細胞包含重組表現載體。在本發明之一個實施例中，細胞群為包含宿主細胞之純系群體，該宿主細胞包含如本文所描述之重組表現載體。
在本發明之一實施例中，群體中細胞之數目可快速擴增。可藉由此項技術中已知之許多方法中之任一者來實現T細胞之數目之擴增，如例如美國專利8,034,334；美國專利8,383,099；美國專利申請公開案第2012/0244133號；Dudley等人，J. Immunother
., 26:332-42 (2003)；及Riddell等人，J. Immunol. Methods
, 128:189-201 (1990)中所描述。在一實施例中，藉由用OKT3抗體、IL-2及飼養PBMC (例如，經輻射之同種異體PBMC)培養T細胞來進行T細胞之數目之擴增。
本發明TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體及宿主細胞(包括其群體)可經分離及/或經純化。如本文所使用，術語「經分離」意謂已自其天然環境移出。如本文所使用，術語「經純化」意謂純度已增加，其中「純度」為相對術語且不必理解為絕對純度。舉例而言，純度可為至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或可為約100%。
可將本發明TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體及宿主細胞(包括其群體) (其皆在下文中統稱為「本發明TCR材料」)調配成組合物，諸如醫藥組合物。就此而言，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之TCR、多肽、蛋白質、核酸、表現載體及宿主細胞(包括其群體)中之任一者及醫藥學上可接受之載劑。含有本發明TCR材料中之任一者的本發明醫藥組合物可包含超過一種本發明TCR材料，例如多肽及核酸，或兩種或多於兩種不同之TCR。替代地，醫藥組合物可包含本發明TCR材料以及另一種醫藥活性劑或藥物，諸如化學治療劑，例如天冬醯胺酶、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、甲胺喋呤、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)等。
較佳地，載劑為醫藥學上可接受之載劑。關於醫藥組合物，載劑可為習知用於考慮中之特定本發明TCR材料的彼等載劑中之任一者。用於製備可投與組合物之方法對熟習此項技術者為已知的或顯而易見的且在例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy
, 第22版，Pharmaceutical Press (2012)中更詳細地描述。較佳的為，醫藥學上可接受之載劑為在使用條件下不具有有害副作用或毒性的載劑。
將部分的藉由特定本發明TCR材料以及藉由用於投與本發明TCR材料之特定方法來決定載劑之選擇。因此，存在本發明之醫藥組合物之多種適合調配物。適合調配物可包括用於非經腸、皮下、靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、瘤內或腹膜內投與的彼等調配物中之任一者。可使用超過一種途徑來投與本發明TCR材料，且在某些情況下，特定途徑可提供比另一種途徑更直接且更有效的反應。
較佳地，本發明TCR材料藉由注射(例如，經靜脈內)投與。當本發明TCR材料為表現本發明TCR之宿主細胞(或其群體)時，用於注射的細胞之醫藥學上可接受之載劑可包括任何等張性載劑，諸如(例如)標準生理鹽水(約0.90% w/v之NaCl於水中、約300 mOsm/L NaCl於水中或每公升水約9.0 g NaCl)、NORMOSOL R電解質溶液(Abbott，Chicago，IL)、PLASMA-LYTE A (Baxter，Deerfield，IL)、含約5%右旋糖之水或林格氏乳酸鹽(Ringer's lactate)。在一實施例中，醫藥學上可接受之載劑補充有人類血清蛋白。
出於本發明之目的，投與之本發明TCR材料的量或劑量(例如，當本發明TCR材料為一或多種細胞時的細胞之數目)應足以在合理的時間範圍內在個體或哺乳動物中實現例如治療性或防治性反應。舉例而言，本發明TCR材料之劑量應足以結合於癌症抗原(例如，突變RAS)，或在距投與時間約2小時或更長(例如，12至24或更多小時)之時段中偵測、治療或預防癌症。在某些實施例中，時段可甚至為較長的。將藉由特定本發明TCR材料之功效及哺乳動物(例如，人類)之病況以及待治療之哺乳動物(例如，人類)之體重來決定劑量。
用於確定投與劑量之諸多分析為此項技術中已知的。出於本發明之目的，分析可用於確定待投與至哺乳動物之起始劑量，該分析包含在向各自給與不同劑量之T細胞的一組哺乳動物中之哺乳動物投與給定劑量之此等T細胞時目標細胞裂解或IFN-γ由表現本發明TCR、多肽或蛋白質之T細胞分泌的程度進行比較。可藉由此項技術中已知之方法來測定在投與某一劑量時目標細胞裂解或IFN-γ分泌的程度。
亦將藉由可能伴隨投與特定本發明TCR材料的任何不良副作用之存在、性質及程度來確定本發明TCR材料之劑量。通常，主治醫師將考慮各種因素，諸如年齡、體重、一般健康、飲食、性別、待投與之本發明TCR材料、投與途徑及所治療癌症之嚴重性，來決定用以治療各個體患者的本發明TCR材料之劑量。在本發明TCR材料為細胞群之一實施例中，每次輸注投與的細胞數目可例如自約1 × 106
至約1 × 1012
個細胞或更多個細胞變化。在某些實施例中，可投與少於約1 × 106
個細胞。
一般熟習此項技術者將容易理解，本發明之本發明TCR材料可以許多方式進行修飾，使得經由修飾來提高本發明TCR材料之治療性或預防功效。舉例而言，本發明TCR材料可直接地或間接地經由橋接與化學治療劑共軛。將化合物與化學治療劑共軛之實踐為此項技術中已知。一般熟習此項技術者認識到，對於本發明TCR材料之功能不為必需的本發明TCR材料上之位點為用於連接橋接及/或化學治療劑的適合位點，其限制條件為，一旦連接至本發明TCR材料，橋接及/或化學治療劑不干擾本發明TCR材料之功能，亦即結合至突變RAS或偵測、治療或預防癌症之能力。
設想本發明醫藥組合物、TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體、宿主細胞及細胞群可用於治療或預防癌症之方法中。不受特定理論或機制束縛，咸信本發明TCR特異性結合於突變RAS，使得TCR (或相關之本發明多肽或蛋白質)在由細胞表現時能夠介導針對表現突變RAS之目標細胞的免疫反應。就此而言，本發明提供一種治療或預防哺乳動物中之癌症之方法，其包含以治療或預防哺乳動物中之癌症的有效量向哺乳動物投與本文所描述之醫藥組合物、TCR、多肽或蛋白質中之任一者、包含編碼本文所描述之TCR、多肽、蛋白質中之任一者之核苷酸序列的任何核酸或重組表現載體，或包含編碼本文所描述之任TCR、多肽或蛋白質中之任一者之重組載體的任何宿主細胞或細胞群。
本發明之一實施例提供用於本文所描述之醫藥組合物、TCR、多肽或蛋白質以下中之任一者、包含編碼本文所描述之TCR、多肽、蛋白質中之任一者之核苷酸序列的任何核酸或重組表現載體，或包含編碼本文所描述之TCR、多肽或蛋白質中之任一者之重組載體的任何宿主細胞或細胞群，其用於治療或預防哺乳動物中之癌症。
如本文所使用，術語「治療」及「預防」以及自其衍生之字組不必暗示100%或完全治療或預防。相反地，存在一般熟習此項技術者識別為具有可能的益處或治療效果的治療或預防之變化程度。就此而言，本發明方法可在哺乳動物中提供任何量之任何水準之癌症治療或預防。此外，由本發明方法提供之治療或預防可包括治療或預防所治療或預防之癌症之一或多種病況或症狀。舉例而言，治療或預防可包括促進腫瘤之消退。此外，出於本文之目的，「預防」可涵蓋延緩癌症或其症狀或病況之發作。替代地或另外，「預防」可涵蓋預防或延緩癌症或其症狀或病況之復發。
亦提供一種偵測哺乳動物中之癌症之存在之方法。方法包含(i)使包含來自哺乳動物之一或多種細胞的樣品與本文所描述之本發明TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群或醫藥組合物中之任一者接觸，由此形成複合物，及(ii)偵測複合物，其中複合物之偵測指示哺乳動物中之癌症之存在。
關於偵測哺乳動物中之癌症之本發明方法，細胞之樣品可為包含全細胞、其溶胞物或全細胞溶胞物之部分(例如，核或細胞質部分、全蛋白部分或核酸部分)的樣品。
出於偵測癌症之本發明方法之目的，接觸可關於哺乳動物在活體外或活體內進行。較佳地，接觸為活體外。
此外，複合物之偵測可經由此項技術中已知之許多方式進行。舉例而言，本文所描述之本發明TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體、宿主細胞或細胞群可標記有可偵測標記，諸如(例如)放射性同位素、螢光團(例如，異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅素(PE))、酶(例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶)及元素粒(例如，金粒)。
出於本發明方法之目的，其中投與宿主細胞或細胞群，細胞可為對哺乳動物為同種異體或自體的細胞。較佳地，細胞對哺乳動物為自體的。
關於本發明方法，癌症可為任何癌症，其包括(但不限於)以下中之任一者：急性淋巴球性癌症、急性骨髓性白血病、肺泡橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳癌、肛門癌、肛管癌或肛腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、子宮宮頸癌、腸胃類癌瘤、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、喉咽癌、腎臟癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰臟癌、腹膜癌、腸網膜癌及腸系膜癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、尿管癌及膀胱癌。較佳的癌症為胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌或前列腺癌。較佳地，肺癌為肺腺癌，卵巢癌為上皮卵巢癌且胰臟癌為胰臟腺癌。在一實施例中，癌症為微隨體穩定的結腸直腸癌。在本發明之一實施例中，癌症表現突變人類RAS胺基酸序列，其中突變人類RAS胺基酸序列為突變人類KRAS、突變人類HRAS或突變人類NRAS胺基酸序列。由癌症表現之突變人類KRAS、突變人類HRAS及突變人類NRAS可如本文關於本發明之其他態樣所描述。
本發明方法中所提及之哺乳動物可為任何哺乳動物。如本文所使用，術語「哺乳動物」係指任何哺乳動物，包括(但不限於)嚙齒目之哺乳動物(諸如小鼠及倉鼠)及兔形目之哺乳動物(諸如兔)。較佳的為，哺乳動物來自食肉目，包括貓科動物(貓)及犬科動物(狗)。更佳的為，哺乳動物來自偶蹄目，包括牛科動物(母牛)及豬科動物(豬)，或奇蹄目，包括馬科動物(馬)。最佳的為，哺乳動物為靈長目、四足猴目或猴目(猴)或類人猿目(人類及猿)。尤佳的哺乳動物為人類。
以下實例進一步說明本發明，但當然不應解釋為以任何方式限制其範疇。
實例1
此實例表明，小鼠T細胞純系B1及C6識別表現HLA-A3/H2-Kb及具有G12V突變之人類KRAS的細胞株。
EL4為小鼠淋巴瘤細胞株。EL4/A3Kb細胞為用包括人類HLA-A3 α1域、人類HLA-A3 α2域及小鼠H2-Kb α3域之HLA-A3/H2-Kb嵌合分子轉導的EL4細胞。EL4/A3Kb細胞用1 µM之9-聚體肽VVGAV
GVGK (SEQ ID NO: 25)或1 µM之10-聚體肽VVVGAV
GVGK (SEQ ID NO: 26)脈衝。
SK-PC3為表現KRAS G12V突變之人類胰臟癌細胞株。SK-PC3/A3細胞為用全人類HLA-A3轉導之SK-PC3細胞。SK-PC3/A3Kb細胞為用HLA-A3/H2-Kb嵌合分子轉導之SK-PC3細胞。
小鼠T細胞純系(B1或C6)與共培養：(i)用9-聚體肽VVGAV
GVGK (SEQ ID NO: 25)脈衝之EL4/A3Kb細胞，(ii)用10-聚體肽VVVGAV
GVGK (SEQ ID NO: 26)脈衝之EL4/A3Kb細胞，(iii)僅SK-PC3/A3細胞，(iv)僅SK-PC3/A3Kb細胞，(v)僅SK-PC3細胞，(vi)僅EL4/A3Kb細胞，(vii)用KRAS G12D袖珍基因轉導之EL4/A3Kb細胞，或(viii)用KRAS G12V袖珍基因轉導之EL4/A3Kb細胞。單獨培養之T細胞純系充當對照。量測IFN-γ。
結果展示於圖1中。如圖1中所展示，B1及C6兩者對KRAS G12V 10-聚體具反應性但對KRAS G12V 9-聚體不具反應性。
B1及C6識別SK-PC3/A3Kb而非SK-PC3/A3 (圖1)。小鼠CD8不能與全人類HLA-A3之α3域相互作用但可與人類-小鼠嵌合分子A3/Kb之α3域相互作用。因此，KRAS G12V之識別視CD8與MHC之相互作用而定。
實例2
此實例表明，自實例1之小鼠T細胞純系B1及C6分離對藉由HLA-A3呈現之KRAS G12V具有抗原特異性的TCR。
TCR基因自實例1之小鼠T細胞純系B1及C6分離且發現彼此相同。自純系B1及C6分離之全長TCR α鏈及β鏈之WT核苷酸及胺基酸序列闡述於表5A中。自純系B1及C6分離之TCR α鏈及β鏈之CDR之WT核苷酸序列闡述於表5B中。
表5A
表5B
實例3
| TCR α 鏈 | TCR β 鏈 | |
| TRAV12-3*03 | TRBV1*01 | |
| 核苷酸序列( 野生型) | SEQ ID NO: 27 | SEQ ID NO: 28 |
| 胺基酸序列( 野生型) | SEQ ID NO: 23 | SEQ ID NO: 24 |
| 區域 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO: |
| CDR1α | ACTATTTACTCAAATGCTTTC | 47 |
| CDR2α | AGCTCCACAGACAACAAGAGG | 48 |
| CDR3α | TGTGCTCTGAGTGAGGGAGGAAACTACAAATACGTCTTT | 49 |
| CDR1β | AATTCCCAGTATCCCTGG | 50 |
| CDR2β | CTGCGGAGTCCTGGGGAC | 51 |
| CDR3β | ACCTGCAGTGCACGACACAGTGCAGAAACGCTGTAT | 52 |
此實例表明，編碼實例2之TCR的反轉錄病毒載體之製備。
編碼表5A之TCR α鏈及β鏈之核苷酸序列經密碼子優化。編碼全長TCR α鏈及β鏈之密碼子優化核苷酸序列闡述於表6A中。編碼TCR α鏈及β鏈之CDR之密碼子優化核苷酸序列闡述於表6B中。
表6A
表6B
| TCR α 鏈 | TCR β 鏈 | |
| 核苷酸序列( 密碼子優化) ( 構築體1) | SEQ ID NO: 29 | SEQ ID NO: 30 |
| 核苷酸序列( 密碼子優化) ( 構築體2) | SEQ ID NO: 59 | SEQ ID NO: 60 |
| 區域 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO: |
| CDR1α( 構築體1) | ACAATCTATTCCAATGCCTTC | 53 |
| CDR2α( 構築體1) | AGCTCCACAGATAATAAGAGG | 54 |
| CDR3α( 構築體1) | TGCGCCCTGAGCGAGGGCGGCAACTACAAGTACGTGTTC | 55 |
| CDR1β( 構築體1) | AATAGCCAGTACCCCTGG | 56 |
| CDR2β( 構築體1) | CTGCGGTCTCCCGGCGAC | 57 |
| CDR3β( 構築體1) | ACCTGTAGCGCCAGACACTCCGCCGAGACACTGTAT | 58 |
| CDR1α( 構築體2) | ACAATCTATTCTAATGCCTTC | 61 |
| CDR2α( 構築體2) | TCTAGCACAGATAATAAGAGG | 62 |
| CDR3α( 構築體2) | GCCCTGTCCGAGGGCGGCAACTACAAGTACGTG | 63 |
| CDR1β( 構築體2) | AACAGCCAGTACCCCTGG | 64 |
| CDR2β( 構築體2) | CTGAGGTCTCCCGGCGAC | 65 |
| CDR3β( 構築體2) | ACCTGTTCCGCCAGACACTCTGCCGAGACACTGTAT | 66 |
將表6A之密碼子優化TCR α鏈及β鏈序列選殖至MSGV1反轉錄病毒載體中，其中P2A連接子(SEQ ID NO: 31)位於α鏈與β鏈之間。反轉錄病毒載體以兩種不同構形，即「構築體1」及「構築體2」中之每一者製成。構築體1之構形如下：5'-α鏈-P2A-β鏈-3'。構築體2之構形如下：5'-β鏈-P2A-α鏈-3'。構築體1及構築體2之反轉錄病毒載體之核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 33。構築體1編碼具有以下構形之胺基酸序列：胺基端(N)-α鏈-P2A-β鏈-羧基端(C) (SEQ ID NO: 34)。構築體2編碼具有以下構形之胺基酸序列：N-β鏈-P2A-α鏈-C (SEQ ID NO: 35)。
實例4
此實例表明，用實例3之反轉錄病毒載體中之任一者轉導的人類T細胞識別表現HLA-A3及KRAS G12V二者的腫瘤細胞株。
用實例3之反轉錄病毒載體構築體1或構築體2轉導人類T細胞。用綠色螢光蛋白(green fluorescent protein；GFP)轉導之人類T細胞用作對照。經轉導細胞與以下目標細胞中之一者共培養：SW620、SW480、FA6-2、用HLA-A3轉導之SW620 (SW620/A3)、用HLA-A3轉導之SW480 (SW480/A3)、用HLA-A3轉導之FA6-2 (FA6-2/A3)、用HLA-A3轉導之COS (COS/A3)、用HLA-A3及KRAS G12V轉導之COS (COS/A3 G12V 30)，或用HLA-A3及KRAS G12V轉導之COS (COS/A3 G12V D1D2)。「G12V D1D2」(域1及域2)指示突變RAS蛋白質之胺基酸殘基1-165包括於突變RAS蛋白質中。「G12V 30」指示突變RAS蛋白質之胺基酸殘基1-30包括於突變RAS蛋白質中。藉由各目標細胞株表現之HLA-A3及KRAS G12V展示於圖2中。單獨培養之T細胞充當對照。量測IFN-γ。結果展示於圖2中。G12V D1D2及G12V 30兩者藉由經轉導T細胞識別，但具有稍微不同的效率。
如圖2中所展示，用實例3之反轉錄病毒載體構築體1或構築體2轉導的人類T細胞識別表現HLA-A3及KRAS G12V二者之腫瘤細胞株。
實例5
此實例表明，用實例3之構築體1轉導的人類T細胞識別KRAS G12V 10-聚體肽，但不與正常肽交叉反應。
使用NCBI蛋白質鹼基局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST)工具，正常人類蛋白質之資料庫檢索序列與KRAS G12V 10-聚體抗原決定基類似的肽。測試所選擇之肽(表7)以測定其中之任一者是否由實例3之載體編碼的TCR識別。COS/A3目標細胞用表7之肽中之每一者以圖3中指示之各種濃度中之每一者獨立地脈衝。用實例3之構築體1轉導的人類T細胞與經脈衝目標細胞共培養。量測IFN-γ。結果展示於圖3中。如圖3中所展示，未觀測到與正常肽之交叉反應。
表7
實例6
| 肽編號 | 基因名稱 | 序列 | SEQ ID NO: |
| 1 | KRAS WT | VVVGAGGVGK | 36 |
| 2 | KRAS G12V | VVVGAVGVGK | 26 |
| 3 | MRP3 | AVVGPVGCGK | 37 |
| 4 | MOAT-E | AVVGPVGAGK | 38 |
| 5 | TIGD6 | KVVGAVDSGK | 39 |
| 6 | TANC1 | VVVGNVGFGK | 40 |
| 7 | MDR1 | AVVGQVGCGK | 41 |
| 8 | CFTR | AVVGQVGSGK | 42 |
| 9 | SEMA6B | FVVGAVVSGF | 43 |
| 10 | DNAH2 | LLVGPVGTGK | 44 |
| 11 | IFI44L | LLVGPVGSGK | 45 |
| 12 | MRGX2 | ALVGLVGNGF | 46 |
此實例表明，實例2之TCR之修飾在α鏈及β鏈恆定區中具有半胱胺酸取代且在α鏈恆定區之跨膜區中具有疏水性突變。此實例亦表明，經修飾TCR識別表現HLA-A3及KRAS G12V二者之腫瘤細胞株。
除α鏈及β鏈恆定區經半胱胺酸修飾且疏水性突變引入至α鏈恆定區之跨膜區中以外，製備分別與實例3之構築體1及構築體2相同的其他反轉錄病毒載體構築體(構築體3及構築體4)。構築體3之構形如下：5'-α鏈-P2A-β鏈-3'。構築體4之構形如下：5'-β鏈-P2A-α鏈-3'。構築體3及構築體4各自包含SEQ ID NO: 17之α鏈恆定區胺基酸序列，其中位置48處之X為Cys；位置112處之X為Leu；位置114處之X為Val；且位置115處之X為Leu，及SEQ ID NO: 18之β鏈恆定區胺基酸序列，其中位置57處之X為Cys。
用反轉錄病毒載體構築體1、構築體2、構築體3或構築體4轉導人類T細胞。用綠色螢光蛋白(GFP)轉導之人類T細胞用作對照。經轉導細胞與以下目標細胞中之一者共培養：SW620、用HLA-A3轉導之SW620 (SW620/A3)、用HLA-A3轉導之COS (COS/A3)或用HLA-A3及KRAS G12V轉導之COS (COS/A3 G12V 30)。「G12V 30」指示突變RAS蛋白質之胺基酸殘基1-30包括於突變RAS蛋白質中。單獨培養之T細胞(培養基)充當對照。量測IFN-γ。結果展示於圖4及表8中。
表8
| 共培養後量測的IFN-γ 之濃度 (pg/mL) | |||||
| A-P2A-B ( 構築體1) | B-P2A_A ( 構築體2) | A-P2A-B ，LVL-C ( 構築體3) | B-P2A-A ，LVL-C ( 構築體4) | GFP | |
| 培養基 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| COS/A3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| COS/A3G12V 30 | 12200 | 8315.2 | 8698.1 | 3005.5 | 0 |
| SW620 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| SW620/A3 | 2381.8 | 1593.6 | 1131.9 | 526.6 | 0 |
如圖4及表8中所展示，用反轉錄病毒載體構築體3或構築體4轉導的人類T細胞識別表現HLA-A3及KRAS G12V二者之腫瘤細胞株。
本文中所引用之所有參考文獻(包括公開案、專利申請案及專利)均以引用之方式併入本文中，該引用程度如同各參考文獻個別地且特定地指示以引用之方式併入且全文闡述於本文中。
除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)使用術語「一(a/an)」及「該」及「至少一個」及類似參照物應解釋為涵蓋單數及複數兩者。除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則應將後接一或多個項目之清單(例如，「A及B中之至少一者」)的術語「至少一個」之使用理解為意謂選自所列項目之一個項目(A或B)或所列項目中之兩者或多於兩者之任何組合(A及B)。除非另外提及，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應理解為開端式術語(亦即，意謂「包括(但不限於)」)。除非另外指示，否則本文中值範圍之列舉僅意欲充當單獨提及屬於該範圍內之各獨立值的簡寫方法，且各獨立值併入至本說明書中，如同在本文中單獨列舉一般。除非本文另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則本文所描述之所有方法均可以任何適合次序進行。除非另外主張，否則使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)僅意欲較好地闡明本發明且不對本發明之範疇造成限制。本說明書中之語言不應理解為指示實踐本發明所必需之任何未主張要素。
本發明之較佳實施例描述於本文中，包括本發明人已知用於實施本發明之最佳模式。在閱讀前文描述之後，彼等較佳實施例之變化對於一般熟習此項技術者可變得顯而易見。本發明人期望熟習此項技術者適當時採用此等變化，且本發明人意欲以不同於本文中特定描述之其他方式來實施本發明。因此，本發明包括適用法律所允許之隨附申請專利範圍中所陳述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任何組合。
圖1為展示將小鼠T細胞純系B1 (無陰影條)或C6 (陰影條)與(i)用9-聚體KRAS G12V肽脈衝之EL4/A3Kb細胞；(ii)用10-聚體KRAS G12V肽脈衝之EL4/A3Kb細胞、(iii) SK-PC3/A3細胞、(iv) SK-PC3/A3Kb細胞、(v) SK-PC3細胞、(vi) EL4/A3Kb細胞、(vii)用KRAS G12D袖珍基因轉導之EL4/A3Kb細胞或(viii)用G12V袖珍基因轉導之EL4/A3Kb細胞共培養後所分泌的IFN-γ之濃度(pg/ml)的圖示。單獨培養之T細胞純系(培養基)充當對照。
圖2為展示將用TCR反轉錄病毒載體構築體1 (對角條紋條)或構築體2 (水平條紋條)或GFP (無陰影條)轉導之T細胞與以下目標細胞中之一者共培養後所分泌的IFN-γ之濃度(pg/ml)的圖示：SW620、SW480、FA6-2、用HLA-A3轉導之SW620 (SW620/A3)、用HLA-A3轉導之SW480 (SW480/A3)、用HLA-A3轉導之FA6-2 (FA6-2/A3)、用HLA-A3轉導之COS (COS/A3)、用HLA-A3及KRAS G12V轉導之COS (COS/A3 G12V 30)或用HLA-A3及KRAS G12V轉導之COS (COS/A3 G12V D1D2)。單獨培養之T細胞(培養基)充當對照。在圖示下方之表中展示各目標細胞株的HLA-A3及KRAS G12V表現之缺失(-)或存在(+)。KRAS G12V表現之低、中等及高水準分別由(+)、(++)及(+++)指示。
圖3為展示將用TCR反轉錄病毒載體構築體1轉導之T細胞與目標細胞共培養後所分泌的IFN-γ之濃度(pg/ml)的圖示，該等目標細胞以所指示肽濃度(nM)中之每一者用表7肽中之每一者獨立地脈衝。圖3之圖例藉由表7中闡述之肽編號來鑑別各肽。
圖4為展示將用TCR反轉錄病毒載體構築體1 (A-P2A-B)、構築體2 (B-P2A-A)、構築體3 (A-P2A-B、LVL-C)、構築體4 (B-P2A-A、LVL-C)或GFP轉導之T細胞與以下目標細胞中之一者共培養後所分泌的IFN-γ之濃度(pg/ml)的圖示：SW620、用HLA-A3轉導之SW620 (SW620/A3)、用HLA-A3轉導之COS (COS/A3)或用HLA-A3及KRAS G12V轉導之COS (COS/A3 G12V 30)。單獨培養之T細胞(培養基)充當對照。
Claims (39)
- 一種經分離或經純化T細胞受體(T-cell receptor；TCR)，其中該TCR對藉由人類白血球抗原(human leukocyte antigen；HLA)-A3分子呈現之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性，及 其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)或突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列。
- 如請求項1之TCR，其中該突變人類RAS胺基酸序列包含在位置12處具有甘胺酸取代之野生型人類KRAS、野生型人類HRAS或野生型人類NRAS胺基酸序列，其中位置12分別參考該野生型人類KRAS、該野生型人類HRAS或該野生型人類NRAS蛋白質來定義。
- 如請求項2之TCR，其中該取代為在位置12處的甘胺酸經纈胺酸取代。
- 如請求項1至3中任一項之TCR，其包含以下之胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 1-3；(ii) SEQ ID NO: 4-6；或(iii) SEQ ID NO: 1-6。
- 如請求項1至3中任一項之TCR，其包含以下之胺基酸序列： (i) SEQ ID NO: 7， (ii) SEQ ID NO: 8，或 (iii) SEQ ID NO: 7-8兩者。
- 如請求項1至3中任一項之TCR，其包含： (a) α鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 17之位置48處之X為Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 17之位置112處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 17之位置114處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及 (iv) SEQ ID NO: 17之位置115處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b) β鏈恆定區，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 18之位置57處之X為Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)兩者。
- 如請求項1至3中任一項之經分離或經純化TCR，其包含： (a) α鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 21之位置182處之X為Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 21之位置246處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 21之位置248處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及 (iv) SEQ ID NO: 21之位置249處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b) β鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 22之位置191處之X為Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)兩者。
- 一種經分離或經純化多肽，其包含如請求項1至7中任一項之TCR之功能部分，其中該功能部分包含以下之胺基酸序列： (a)所有SEQ ID NO: 1-3， (b)所有SEQ ID NO: 4-6，或 (c)所有SEQ ID NO: 1-6。
- 如請求項8之經分離或經純化多肽，其中該功能部分包含以下之胺基酸序列： (i) SEQ ID NO: 7， (ii) SEQ ID NO: 8，或 (iii) SEQ ID NO: 7-8兩者。
- 如請求項8或9之經分離或經純化多肽，其進一步包含： (a) SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 17之位置48處之X為Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 17之位置112處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 17之位置114處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及 (iv) SEQ ID NO: 17之位置115處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b) SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 18之位置57處之X為Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)兩者。
- 如請求項8或9之經分離或經純化多肽，其包含： (a) SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 21之位置182處之X為Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 21之位置246處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 21之位置248處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及 (iv) SEQ ID NO: 21之位置249處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b) SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 22之位置191處之X為Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)兩者。
- 一種經分離或經純化蛋白質，其包含如請求項8至11中任一項之多肽中之至少一者。
- 如請求項12之經分離或經純化蛋白質，其包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 1-3之胺基酸序列；及第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 4-6之胺基酸序列。
- 如請求項12或13之經分離或經純化蛋白質，其包含：第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列；及第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
- 如請求項12或13之經分離或經純化蛋白質，其進一步包含： (a)第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 17之位置48處之X為Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 17之位置112處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 17之位置114處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及 (iv) SEQ ID NO: 17之位置115處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b)第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 18之位置57處之X為Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)兩者。
- 如請求項12或13之經分離或經純化蛋白質，其包含： (a)第一多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 21之位置182處之X為Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 21之位置246處之X為Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 21之位置248處之X為Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；及 (iv) SEQ ID NO: 21之位置249處之X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b)第二多肽鏈，其包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 22之位置191處之X為Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)兩者。
- 一種經分離或經純化核酸，其包含編碼如請求項1至7中任一項之TCR、如請求項8至11中任一項之多肽或如請求項12至16中任一項之蛋白質的核苷酸序列。
- 一種重組表現載體，其包含如請求項17之核酸。
- 如請求項18之重組表現載體，其中該核苷酸序列編碼α鏈CDR1、α鏈CDR2、α鏈CDR3、β鏈CDR1、β鏈CDR2及β鏈CDR3，且編碼該β鏈CDR1、該β鏈CDR2及該β鏈CDR3之該核苷酸序列位於編碼該α鏈CDR1、該α鏈CDR2及該α鏈CDR3之該核苷酸序列之5'。
- 如請求項18之重組表現載體，其中該核苷酸序列編碼α鏈CDR1、α鏈CDR2、α鏈CDR3、β鏈CDR1、β鏈CDR2及β鏈CDR3，且編碼該β鏈CDR1、該β鏈CDR2及該β鏈CDR3之該核苷酸序列位於編碼該α鏈CDR1、該α鏈CDR2及該α鏈CDR3之該核苷酸序列之3'。
- 一種經分離或經純化宿主細胞，其包含如請求項18至20中任一項之重組表現載體。
- 一種經分離或經純化細胞群，其包含如請求項21之宿主細胞。
- 一種醫藥組合物，其包含：(a)如請求項1至7中任一項之TCR、如請求項8至11中任一項之多肽、如請求項12至16中任一項之蛋白質、如請求項17之核酸、如請求項18至20中任一項之重組表現載體、如請求項21之宿主細胞或如請求項22之細胞群；及(b)醫藥學上可接受之載劑。
- 一種偵測哺乳動物中癌症之存在之方法，該方法包含： (a)使包含該癌症之細胞的樣品與如請求項1至7中任一項之TCR、如請求項8至11中任一項之多肽、如請求項12至16中任一項之蛋白質、如請求項17之核酸、如請求項18至20中任一項之重組表現載體、如請求項21之宿主細胞、如請求項22之細胞群或如請求項23之醫藥組合物接觸，由此形成複合物；及 (b)偵測該複合物， 其中偵測該複合物指示該哺乳動物中癌症之存在。
- 如請求項24之方法，其中該癌症表現突變人類RAS胺基酸序列，其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類KRAS、突變人類HRAS或突變人類NRAS胺基酸序列。
- 如請求項25之方法，其中該突變人類RAS胺基酸序列包含在位置12處具有甘胺酸取代之野生型人類KRAS、野生型人類HRAS或野生型人類NRAS胺基酸序列，其中位置12分別參考該野生型人類KRAS、該野生型人類HRAS或該野生型人類NRAS胺基酸序列來定義。
- 如請求項26之方法，其中該取代為在位置12處的甘胺酸經纈胺酸取代。
- 如請求項25至27中任一項之方法，其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)胺基酸序列。
- 如請求項25至27中任一項之方法，其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列。
- 如請求項25至27中任一項之方法，其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)胺基酸序列。
- 如請求項24至27中任一項之方法，其中該癌症為胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌或前列腺癌。
- 一種如請求項1至7中任一項之TCR、如請求項8至11中任一項之多肽、如請求項12至16中任一項之蛋白質、如請求項17之核酸、如請求項18至20中任一項之重組表現載體、如請求項21之宿主細胞、如請求項22之細胞群或如請求項23之醫藥組合物的用途，其用於製造供用於治療或預防哺乳動物中之癌症之藥物。
- 如請求項32之用途，其中該癌症表現突變人類RAS胺基酸序列，其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類KRAS、突變人類HRAS或突變人類NRAS胺基酸序列。
- 如請求項33之用途，其中該突變人類RAS胺基酸序列包含在位置12處具有甘胺酸取代之野生型人類KRAS、野生型人類HRAS或野生型人類NRAS胺基酸序列，其中位置12分別參考該野生型人類KRAS、該野生型人類HRAS或該野生型人類NRAS胺基酸序列來定義。
- 如請求項34之用途，其中該取代為在位置12處的甘胺酸經纈胺酸取代。
- 如請求項33至35中任一項之用途，其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)胺基酸序列。
- 如請求項33至35中任一項之用途，其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列。
- 如請求項33至35中任一項之用途，其中該突變人類RAS胺基酸序列為突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)胺基酸序列。
- 如請求項32至35中任一項之用途，其中該癌症為胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌或前列腺癌。
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