JP7237287B2 - 単一ドメイン抗体に基づくｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用 - Google Patents
単一ドメイン抗体に基づくｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、免疫細胞療法の分野、特に単一ドメイン抗体に基づくＢＣＭＡキメラ抗原受容体及びその使用に属する。
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄において生じ、クローン性形質細胞の蓄積によって特徴づけられる血液系腫瘍である。治療レジメンは、主として形質細胞のアポトーシス及び／または破骨細胞活性の低減（例えば化学療法、サリドマイド、レナリドミド、二リン酸塩、及び／またはプロテアソーム阻害物質（ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））またはカルフィルゾミブ等））に集中している。現在のところ、多発性骨髄腫は依然として難病である。患者の約４５％のみが診断後５年を超えて生きることができる。多くの患者が治療停止後に疾患の再発を経験し、再発後の患者の５年生存率は２０％未満である。
近年、キメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（ＣＡＲＴ）は最も有望な腫瘍免疫療法の１つとなっている。キメラ抗原受容体は、１つの腫瘍関連抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び細胞内シグナリングドメインからなる。ＣＡＲＴ細胞療法は、概して、遺伝子形質導入技術によって、腫瘍関連抗原の認識のための最小抗体の結合断片（単一鎖断片可変、またはｓｃＦｖ）及びＴ細胞活性化配列の融合タンパク質をＴ細胞の表面上で発現する。ＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、抗原依存性であるがＭＨＣに制限されない様式で腫瘍抗原へ結合して、腫瘍細胞を特異的に殺傷する。
ＣＡＲＴ細胞療法の有効性は、腫瘍関連抗原を認識する抗体の特異性、抗原結合の親和性等の特性に依存する。現在のところ、ＣＡＲＴ細胞の細胞内シグナリングドメインの設計は成熟してきており、抗原結合ドメインの設計が、新規のＣＡＲＴ技術の開発の焦点及び鍵になっている。アルパカ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）中の抗原へ完全に結合することが可能な最小且つ単一の機能的ドメイン抗体断片（すなわち軽鎖の無い重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨとしても公知である））は、単純な構造を有し、一般の抗体の分子量の約１／１０の分子量である。それは、インビトロ発現系（例えばＥ．ｃｏｌｉ、酵母、真核生物細胞、及び植物）中で有効に発現及び精製され得る。それは、高特異性、高親和性、低免疫原性、良好な浸透を有し、相対的に隠された標的（それは腫瘍治療に際して従来の抗体が恐らく接触しない）と接触する可能性を有する。これらの利点に基づいて、これは、ＣＡＲの抗原結合領域として単一ドメイン抗体を使用してＣＡＲを修飾する、ＣＡＲＴ細胞療法の開発傾向のうちの１つである。
Ｂ細胞系譜の悪性腫瘍については、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）は非常に重要なＢ細胞バイオマーカーである。そのＲＮＡは、多発性骨髄腫細胞においてほとんど常に見出され、タンパク質も、多発性骨髄腫に罹患した患者中の悪性形質細胞の表面上で見出される。ＢＣＭＡは１８５のアミノ酸残基からなるＩＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属し、そのリガンドは、ＴＮＦスーパーファミリー（分裂増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）Ｂリンパ球刺激因子（ＢＡＦＦ）等）に属する。ＢＣＭＡは、そのリガンドへ結合することによって、Ｂ細胞の分裂増殖及び生存を活性化することができる。ＢＣＭＡは、形質細胞及び多発性骨髄腫細胞の表面上で高度に発現されるが、造血幹細胞または他の通常の組織細胞において発現されない。したがって、ＢＣＭＡは、ＭＭの標的化療法のための理想的な標的として使用され得る。
本出願は、遺伝子操作の手段によるＣＡＲ修飾及びＣＡＲＴ細胞療法における使用のためのＣＡＲの抗原結合領域として、特異的な単一ドメイン抗体を設計し、標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナリングドメインを含む、単一ドメイン抗体に基づく特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、細胞外ドメインが、ヒトＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）へ結合することができる抗原結合の断片である、単一ドメイン抗体に基づく特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提案する。
一態様において、本出願は、ＢＣＭＡ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＢＣＭＡ結合ドメインが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号：１において記載され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号：２において記載され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号：３において記載される、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、単一ドメイン抗体である。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、配列番号：４において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ａ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質に由来するポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインへ連結される。
いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号：６において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の共刺激ドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０及びＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する。
いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、配列番号：７において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζのシグナリングドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、配列番号：８において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲはリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、配列番号：９において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号：１０～１１において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
別の態様において、本出願は、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子を提供する。
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号：１２～１３において記載される核酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
別の態様において、本出願は、核酸分子を含むベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターから選択される。
いくつかの実施形態において、ベクターはＥＦ１プロモーターをさらに含み、ＥＦ１プロモーターは配列番号：１４において記載される配列を含む。
別の態様において、本出願は、ＣＡＲ、核酸分子、またはベクターを含む、免疫エフェクター細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される。
別の態様において、本出願は、ベクターを免疫エフェクター細胞の中へ導入することを含む、免疫エフェクター細胞を調製する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本方法では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される。
別の態様において、本出願は、免疫エフェクター細胞を含む組成物を提供する。
別の態様において、本出願は、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害の治療のための薬物の製造における、ＣＡＲ、核酸分子、ベクター、または免疫エフェクター細胞の使用を提供する。
別の態様において、本出願は、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害の治療のためのＣＡＲ、核酸分子、ベクター、または免疫エフェクター細胞を提供する。
別の態様において、本出願は、ＣＡＲ、核酸分子、ベクター、または免疫エフェクター細胞を対象へ投与するステップを含む、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害は、癌または悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、ならびにＰＯＥＭＳ症候群からなる群から選択される。
本出願の革新性及び有益な効果。
本出願人は、遺伝子操作の手段によって特異的アミノ酸配列を含む単一ドメイン抗体を設計し、結合ドメイン（ＢＣＭＡ結合ドメイン）として単一ドメイン抗体を使用することによって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を構築した。キメラ抗原受容体を含む免疫細胞（例えばＣＡＲＴ細胞）が関連する腫瘍への強い殺傷能力及び特異性を有することが、研究を介して見出された。特に、ＣＡＲは健康なヒトＴリンパ球にインビトロで効率的に形質導入され、ＢＣＭＡ陽性標的細胞に対する強い殺傷効果を生じ、インビボの実験においても、以下の強い殺傷効果を示す。ルシフェラーゼによりトランスフェクションされたＭＭ．１Ｓ細胞の使用による検出のために、原発性骨髄腫を持つマウスモデルが確立され、投与３日の後に大部分の蛍光は消滅し、ＣＡＲＴ細胞が優れた治療効果をインビボで有することを指摘する。
本出願人は、遺伝子操作の手段によって特異的アミノ酸配列を含む単一ドメイン抗体を設計し、結合ドメイン（ＢＣＭＡ結合ドメイン）として単一ドメイン抗体を使用することによって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を構築した。キメラ抗原受容体を含む免疫細胞（例えばＣＡＲＴ細胞）が関連する腫瘍への強い殺傷能力及び特異性を有することが、研究を介して見出された。特に、ＣＡＲは健康なヒトＴリンパ球にインビトロで効率的に形質導入され、ＢＣＭＡ陽性標的細胞に対する強い殺傷効果を生じ、インビボの実験においても、以下の強い殺傷効果を示す。ルシフェラーゼによりトランスフェクションされたＭＭ．１Ｓ細胞の使用による検出のために、原発性骨髄腫を持つマウスモデルが確立され、投与３日の後に大部分の蛍光は消滅し、ＣＡＲＴ細胞が優れた治療効果をインビボで有することを指摘する。
さらに、本出願のキメラ抗原受容体を含む免疫細胞は、インビトロで優れた標的化を示す。それらは、ＢＣＭＡを陽性に発現する細胞に対して非常に強い殺傷能力を有し、ＢＣＭＡを発現しない細胞に対する殺傷効果は実質的に無い。加えて、それらはインビボの実験においても優れた腫瘍標的化を示す。
本出願人は、遺伝子操作の手段によるＣＡＲ修飾及びＣＡＲＴ細胞療法のためのＣＡＲの抗原結合領域として、特異的な単一ドメイン抗体をデザインし、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、そこで、細胞外ドメインが、アルパカ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノ抗体）から選択されるヒトＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）へ結合することができる抗原結合断片である、単一ドメイン抗体に基づく特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提案した。
本出願において、「ＣＤＲ」という用語は、概して、抗原エピトープへの結合の主な原因である、相補性決定領域を指す。重鎖のＣＤＲは、概して、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と呼ばれ、それはＮ末端から連続的に番号付けされる。本出願において、ＣＤＲは、従来の手段によって、例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｗｕ，ＴＴ，ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１－５０，（１９７０）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．，ａｎｄ Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０－２４４３（１９８７））中で開示される方法、またはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１－９１７（１９８７））中で開示される方法に従って、定義または同定され得る。
本出願において、「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」という用語は、概して、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）から構成される抗体断片を指し（Ｈｏｌｔ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４－４９０））、それはナノボディとしても公知である。単一ドメイン抗体は、わずか約１２～１５ｋＤａである。「ＶＨＨセグメント」として公知の最初の単一ドメイン抗体は、アルパカの重鎖抗体から人工的操作によって調製された。本出願において、単一ドメイン抗体はアルパカの単一ドメイン抗体であり得る。例えば、ＶＨＨセグメントは、重鎖抗体の公知の最小の抗原結合単位を指し得る（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１：３４９０－３４９８（２００７））。
本出願において、「膜貫通ドメイン」という用語は、「膜貫通領域（短縮してＴＭ）」と互換的に使用され得、細胞外結合部分を細胞内シグナリングドメインへ融合させ、免疫エフェクター細胞の原形質膜へＣＡＲをアンカーする、ＣＡＲの一部分を指す。膜貫通領域は天然に存在するタンパク質に由来するか、または合成、半合成、もしくは組換えによって得られるかのいずれかであり得る。ＴＭドメインは、少なくとも以下のタンパク質：Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１の膜貫通ドメインを含み得る。本出願において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ａ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４から選択されるタンパク質に由来するポリペプチドを含み得る。
本出願において、「細胞内シグナリングドメイン」という用語は、概して、エフェクター細胞の機能（例えば活性化、サイトカインの産生、分裂増殖、及び細胞傷害性活性であり、ＣＡＲ結合標的細胞への細胞毒性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへ結合する抗原によって誘導される他の細胞応答を包含する）を引き起こすように、ヒトＢＣＭＡポリペプチドへの有効な抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ結合の情報を免疫エフェクター細胞の内部へ伝達することに関与する、ＣＡＲの一部分である。本出願において、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζのシグナリングドメインを含み得る。
本出願において、「ＢＣＭＡ」という用語は、概して、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーに属する細胞成熟抗原を指す（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９２（１）：１２９－１３５，２０００を参照）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び分裂増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）へ結合し得る（Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０４：４３－５４，２００５を参照）。非悪性細胞では、ＢＣＭＡは主として形質細胞のサブセット及び成熟Ｂ細胞において発現されることが報告されている（Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，７７（１）：３８９７－３９０４，１９９２；Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（７）：１１４７－１１５４，１９９４；Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９（１）：９１－９７，２００４；及びＮｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７３（２）：８０７－８１７，２００４を参照）。ＢＣＭＡ ＲＮＡは、多発性骨髄腫細胞及び他のリンパ腫において通常検出され、何人かの研究者は、多発性骨髄腫に罹患した患者からの形質細胞の表面上でＢＣＭＡタンパク質を検出した（Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３（２）：６８９－６９４，２００４；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３（１９）：５９０３－５９０９，２００７；Ｂｅｌｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５（１０）：３９４５－３９５０，２００５；及びＭｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７０３（８）：３１４８－３１５７，２００４を参照）。したがって、ＢＣＭＡは、悪性腫瘍（例えば多発性骨髄腫）の可能な治療標的として使用され得る。
本出願において、「ＢＣＭＡ結合ドメイン」という用語は、概して、Ｂ細胞上で発現されるＢＣＭＡポリペプチドへ特異的に結合することができる、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体、またはその抗原結合断片を包含するものを指す。本出願において、結合ドメインは、天然に存在する源、合成源、半合成源、または組換え源に由来し得る。本出願において、細胞外結合ドメインは、ＢＣＭＡに対する抗体、またはその抗原結合断片を含み得る。それらのうちで、「抗体」は、少なくとも抗原（例えばＢＣＭＡ）のエピトープ（抗原決定基含有ペプチド、脂質、多糖類、または核酸（例えば免疫細胞によって認識されるもの）等）を特異的に認識し、それへ結合する軽鎖または重鎖の免疫グロブリン可変部領域を含むポリペプチドであり得る。
本出願において、「共刺激ドメイン」という用語は、概して、共刺激分子の細胞内シグナリングドメインを指す。例えば、共刺激分子は、Ｔリンパ球の有効な活性化及び機能によって要求される第２のシグナルを提供することができる、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子であり得る。例えば、共刺激ドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択され得る。
本出願において、「ヒンジ領域」という用語は、概して、細胞／細胞接着、抗原結合、及び活性化において適切な役割を果たすように、結合ドメインをエフェクター細胞の表面から遠ざけて所在させる、キメラ抗原受容体中のドメインを指す。本出願において、ヒンジ領域は結合ドメイン及び膜貫通ドメインとの間に所在し得る。ヒンジ領域は、天然に存在する源、合成源、半合成源、または組換え源に由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または人工的に修飾された（欠失、置換、または挿入を包含する）免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
本出願において、「リーダー配列」という用語は、概して、転写され得るが翻訳され得ない、構造遺伝子のコード領域の前に所在する配列を指す。本出願において、リーダー配列は、５’端部から、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子の第１のコーダーまでに開始し得る。本出願において、リーダー配列は、配列番号：９において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。
本出願において、「機能的なバリアント」という用語は、概して、実質的にそれと同じ機能を有し（例えばキメラ抗原受容体の特性を有し）、少なくとも８５％（例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）の、それとの配列同一性を有する、アミノ酸配列を指す。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列のバリアントは、実質的にそれと同じ機能を有し（例えばキメラ抗原受容体の特性を有し）、１つまたは複数（例えば１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、またはそれ以上）のアミノ酸の置換、欠失、または添加をアミノ酸配列上に含む、アミノ酸配列である。
本出願において、「レンチウイルスベクター」という用語は、概して、ウイルスに基づいて開発された遺伝子療法ベクターを指す。本出願において、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡ）、またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）であり得る。レンチウイルスベクターは、有糸分裂細胞及び非有糸分裂細胞の両方に感染する能力を有し、ニューロン、肝細胞、心筋細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、幹細胞、及び同種のものを包含する哺乳動物細胞のほとんどすべてに有効に感染することができ、高い感染効率を有する。
本出願において、「ＥＦ１プロモーター」という用語は、概して、特定のレベルで調節される標的遺伝子の転写レベルを一定して維持することができるプロモーターを指す。本出願において、ＥＦ１プロモーターは、配列番号：１４において記載される配列を含み得る。本出願において、ＥＦ１プロモーターによって調節されるキメラ抗原受容体の発現レベルは、多くとも５％、多くとも４％、多くとも３％、多くとも２％、多くとも１％、多くとも０．５％、多くとも０．１％、多くとも０．０１％、またはそれ以下までアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ得る。本出願において、ＥＦ１プロモーターは、キメラ抗原受容体をコードする核酸の上流に所在し得る。
本出願において、「Ｔリンパ球」という用語は、概して、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を包含するものを指す。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞（ヘルパーＴ１（Ｔｈ１）細胞、またはヘルパーＴ２（Ｔｈ２）細胞等）であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞であり得る。代替的に、Ｔリンパ球は、天然のＴ細胞及びメモリーＴ細胞を包含し得る。
本出願において、「ナチュラルキラー細胞」という用語は、概して、先天性免疫系の構成成分である、白血球のサブタイプを指す。ＮＫ細胞は、腫瘍及びウイルス感染細胞の宿主拒絶において重要な役割を果たす。ＮＫ細胞は、細胞傷害性を有し、アポトーシスを誘導する。ＮＫ細胞を使用して、ウイルス感染を阻害し、適応的免疫応答によって抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を産生し、それによって感染を取り除くことができる。
本出願において、「腫瘍」という用語は、概して、様々な発癌因子の作用下で、遺伝子レベルで正常な増殖調節を失った局所組織中のある特定の細胞のクローン性の異常な分裂増殖によって形成される、新たな増殖を指す。かかる新たな増殖が、たいていは占拠性の大規模な隆起を提示するので新生物とも呼ばれる。本出願において、癌としては、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮細胞癌を包含する）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）または胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を包含する）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓、または腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、頭頸部癌、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性ＮＨＬを包含する）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中間的／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、進行性免疫芽球性ＮＨＬ、進行性リンパ球のＮＨＬ、進行性小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病及び慢性骨髄芽球症、ならびに移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）が挙げられ得る。本出願において、癌は、ＢＣＭＡの発現と関連する癌または悪性腫瘍を含み得る。例えば、癌は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、ならびにＰＯＥＭＳ症候群からなる群から選択され得る。
本出願は、ＢＣＭＡ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナリングドメインを含み；そこで、ＢＣＭＡ結合ドメインが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号：１において記載され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号：２において記載され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号：３において記載される、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
本出願において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、約１０５Ｍ－１以上（例えば約１０５Ｍ－１以上、約１０６Ｍ－１以上、約１０７Ｍ－１以上、約１０８Ｍ－１以上、約１０９Ｍ－１以上、約１０１０Ｍ－１以上、約１０１１Ｍ－１以上、約１０１２Ｍ－１以上、約１０１３Ｍ－１以上、またはそれ以上）のＫａ（すなわち１／Ｍでの結合相互作用の平衡会合定数）により、または約１０－５Ｍ以下（例えば約１０－５Ｍ以下、約１０－６Ｍ以下、約１０－７Ｍ以下、約１０－８Ｍ以下、約１０－９Ｍ以下、約１０－１０Ｍ以下、約１０－１１Ｍ以下、約１０－１２Ｍ以下、約１０－１３Ｍ以下、またはそれ以下）の解離平衡定数Ｋｄにより、ＢＣＭＡへ結合またそれと会合し得る。
本出願において、ＢＣＭＡ結合ドメインとＢＣＭＡとの間の親和性は、当技術分野における従来の技法によって（例えば競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって、または結合会合によって、または置換アッセイによって、標識リガンドの使用、または表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００等、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから得ることができる）もしくは光バイオセンサー技術の使用によって）決定され得る。
本出願において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、単一ドメイン抗体であり得る。本出願のキメラ抗原受容体の構築に好適なＢＣＭＡ結合ドメインとしては、配列番号：４において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントが挙げられるがこれらに限定されない。それらのうちで、機能的なバリアントは、ＢＣＭＡ結合ドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸を置換、欠失、添加することによって形成されるタンパク質またはポリペプチド；及び９０％以上（例えば少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の、ＢＣＭＡ結合ドメインとの配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。
本出願において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質に由来するポリペプチドを含む。本出願において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αの膜貫通ドメインに由来し得る。本出願において、膜貫通ドメインは、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含み得る。それらのうちで、機能的なバリアントは、膜貫通ドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸を置換、欠失、添加することによって形成されるタンパク質またはポリペプチド；及び９０％以上（例えば少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の、膜貫通ドメインとの配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。
本出願において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインへ連結され得る。本出願において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域の１つまたは複数を含み得る。ヒンジ領域は、いくつかの突然変異、またはアミノ酸の置換（例えばプロリン残基が、別のアミノ酸残基（例えばセリン残基）へ突然変異されるかまたはそれにより置換されるもの）を含み得る。本出願において、ヒンジ領域は、配列番号：６において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含み得る。それらのうちで、機能的なバリアントは、ヒンジ領域の１つまたは複数のアミノ酸を置換、欠失、添加することによって形成されるタンパク質またはポリペプチド；及び９０％以上（例えば少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の、ヒンジ領域との配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。
本出願において、共刺激ドメインは、第２のシグナルまたは共刺激シグナルを提供するような、抗原非依存性（例えばＢＣＭＡ非依存性）の様式で機能し得る。本出願において、ＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。複数の共刺激ドメインが、ＣＡＲを発現する免疫細胞（例えばＴ細胞及びＮＫ細胞）の性能及び増殖能力を促進し得る。例えば、共刺激ドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端へ連結され得る。本出願において、共刺激ドメインのうちの１つまたは複数は、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０から選択される共刺激分子に由来し得る。本出願において、共刺激ドメインは、ＣＤ１３７に由来し得る。本出願において、共刺激ドメインは、配列番号：７において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含み得る。それらのうちで、機能的なバリアントは、共刺激ドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸を置換、欠失、添加することによって形成されるタンパク質またはポリペプチド；及び９０％以上（例えば少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の、共刺激ドメインとの配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。
本出願において、細胞内シグナリングドメインは、主として抗原依存性の様式でＴＣＲ（例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって活性化され得る。本出願において、細胞内シグナリングドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来し得る。本出願において、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζのシグナリングドメインを含み得る。例えば、細胞内シグナリングドメインは、配列番号：８において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。それらのうちで、機能的なバリアントは、細胞内シグナリングドメイン中の１つまたは複数のアミノ酸を置換、欠失、添加することによって形成されるタンパク質またはポリペプチド；及び９０％以上（例えば少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の、細胞内シグナリングドメインとの配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。
本出願において、ＣＡＲは、リーダー配列をさらに含み得る。例えば、リーダー配列は、配列番号：９において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含み得る。それらのうちで、機能的なバリアントは、リーダー配列中の１つまたは複数のアミノ酸を置換、欠失、添加することによって形成されるタンパク質またはポリペプチド；及び９０％以上（例えば少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の、リーダー配列との配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。
本出願において、ＣＡＲは、それぞれのドメインの間にリンカーを含み得る。例えば、リンカーは、それぞれのドメインの間に適切な間隔及び立体配置の達成のために組込まれる。例えば、リンカーは、細胞内シグナリングドメインへ膜貫通ドメインを連結し得る。本出願において、リンカーは、以下のアミノ酸配列：ＧＧＧ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及びＧＧＲＲＧＧＧＳを含み得る。
本出願のＣＡＲにおいて、膜貫通ドメインはＣＤ８αに由来し、共刺激ドメインはＣＤ１３７に由来し、細胞内シグナリングドメインはＣＤ３ζに由来し得る。
本出願において、ＣＡＲは、配列番号：１において記載されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号：２において記載されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、及び配列番号：３において記載されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含むＢＣＭＡ結合ドメイン、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列を有する膜貫通ドメイン、配列番号：６において記載されるアミノ酸配列を有するヒンジ領域、配列番号：７において記載されるアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン、配列番号：８において記載されるアミノ酸配列を有する細胞内シグナリングドメイン、ならびに配列番号：９において記載されるアミノ酸配列を有するリーダー配列を含み得る。
本出願において、ＣＡＲは、配列番号：４において記載されるアミノ酸配列を含むＢＣＭＡ結合ドメイン、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン、配列番号：６において記載されるアミノ酸配列を含むヒンジ領域、配列番号：７において記載されるアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン、配列番号：８において示されるアミノ酸配列を含む細胞内シグナリングドメイン、ならびに配列番号：９において記載されるアミノ酸配列を含むリーダー配列を含み得る。
本出願において、ＣＡＲは、配列番号：１０～１１において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む。それらのうちで、機能的なバリアントは、ＣＡＲ中の１つまたは複数のアミノ酸を置換、欠失、添加することによって形成されるタンパク質またはポリペプチド；及び９０％以上（例えば少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の、ＣＡＲとの配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドからなる群から選択される。
本出願は、ＣＡＲをコードし得る単離核酸分子を提供する。
本出願において、核酸分子は、配列番号：１２～１３において記載される核酸配列、またはその機能的なバリアントを含み得る。例えば、機能的なバリアントは、それがまだＣＡＲをコードすることができる限り、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の、配列番号：１２～１３の配列との配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはバリアントを含み得る。
本出願は、核酸分子を含み得るベクターを提供する。
本出願において、ベクターは、複製起点、選択ボックス、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガルノ配列またはコザック配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’の非翻訳領域のうちの１つまたは複数を含み得る。例えば、ベクターはＥＦ１プロモーターを含み、ＥＦ１プロモーターは配列番号：１４において記載される配列を含み得る。本出願において、ベクターは、プラスミド、ファージ、人工染色体（例えば酵母人工染色体、ＹＡＣ）、及び動物ウイルスから選択され得る。例えば、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターから選択され得る。
本出願は、ＣＡＲ、核酸分子、またはベクターを含み得る免疫エフェクター細胞を提供する。
本出願において、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択され得る。
本出願において、
本出願は、免疫エフェクター細胞の中へベクターを導入することを含む、免疫エフェクター細胞を調製する方法を提供する。例えば、ＣＡＲは免疫細胞の中へ導入され、ＣＡＲを標的抗原（例えばＢＣＭＡ）へ特異的に再標的化するように免疫細胞において発現される。本出願において、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択され得る。本出願において、方法は、対象から免疫エフェクター細胞を得るステップを含み得る。例えば、Ｔリンパ球は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍から得られ得る。さらに、方法は、免疫エフェクター細胞からの特異的な細胞サブセットを選択するステップをさらに含み得る。例えば、特異的なＴ細胞サブセットは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ４５ＲＯの特異的な発現に従って選択され得る。
本出願は、免疫エフェクター細胞を含み得る組成物を提供する。
本出願において、組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体は、賦形剤、流動化物質、甘味物質、希釈物質、防腐物質、色素／着色物質、香味促進物質、界面活性物質、湿潤剤、分散媒、懸濁剤、安定化物質、等張剤、溶媒、界面活性物質、及び乳化物質からなる群から選択され得る。
本出願において、組成物は、追加の活性成分（サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小さな分子化学的活性成分、プロドラッグ、及び抗体等のうちの１つまたは複数）をさらに含み得る。
本出願において、組成物中の免疫エフェクター細胞の量は、有効量であり得る。有効量は、有益な効果、または所望される予防的な効果、または治療的な効果を達成し得る最少量であり得る。例えば、有効量は、疾患の重症度、年齢、体重、性別、または対象の他の因子によって影響を受け得る。
本出願は、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害の治療のための薬物の製造における、ＣＡＲ、核酸分子、ベクター、または免疫エフェクター細胞の使用を提供する。
本出願は、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害の治療のための、ＣＡＲ、核酸分子、ベクター、または免疫エフェクター細胞を提供する。
本出願は、ＣＡＲ、核酸分子、ベクター、または免疫エフェクター細胞を対象へ投与するステップを含む、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害を治療する方法を提供する。
本出願において、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害は、癌または悪性腫瘍である。本出願において、ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、ならびにＰＯＥＭＳ症候群からなる群から選択される。
本出願において、薬物の投与モードとしては、エアロゾル吸入、注射、摂取、点滴、埋込み、または移植が挙げられ得る。例えば、注射としては、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、及び胸骨内の注射、または腫瘍もしくはリンパ節の中への直接注射が挙げられ得る。
以下に、本出願は、詳細な実施例によってさらに例証される。以下の実施例は単に本出願を例証するためにあり、本発明の内容を限定しないことが理解されよう。
実施例１ ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体のＶＨＨ遺伝子の獲得
１）ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体ライブラリーの構築
健康な成体のアルパカを、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ Ｌｔｄ．から購入したＢＣＭＡ抗原により、複数の皮下注射によって首及び背中で免疫した。免疫に際して、等体積の抗原及びフロイントアジュバントを、４～６の免疫のために加えた。注射部位での質量の吸収をトラッキング及び観察して、正確な免疫を確認した。免疫間の間隔は７～１５日であった。第４の免疫後に、血液サンプルを収集して、抗原の免疫力価を決定した。力価が１００００倍（ＥＬＩＳＡ法）を超えた場合に、血液サンプル（約１００ｍｌ）を収集してリンパ球を単離し、ＲＮＡを抽出し、それをｃＤＮＡへ逆転写した。アルパカ重鎖抗体の可変領域断片ＶＨＨを２回のＰＣＲによって増幅した。ＶＨＨ断片をファージディスプレイライブラリーへと構築し、単一ドメイン抗体を保有する遺伝子断片の生成物を、コンピテントセルの中へ形質転換して、単一ドメイン抗体免疫ライブラリーを得た。
１）ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体ライブラリーの構築
健康な成体のアルパカを、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ Ｌｔｄ．から購入したＢＣＭＡ抗原により、複数の皮下注射によって首及び背中で免疫した。免疫に際して、等体積の抗原及びフロイントアジュバントを、４～６の免疫のために加えた。注射部位での質量の吸収をトラッキング及び観察して、正確な免疫を確認した。免疫間の間隔は７～１５日であった。第４の免疫後に、血液サンプルを収集して、抗原の免疫力価を決定した。力価が１００００倍（ＥＬＩＳＡ法）を超えた場合に、血液サンプル（約１００ｍｌ）を収集してリンパ球を単離し、ＲＮＡを抽出し、それをｃＤＮＡへ逆転写した。アルパカ重鎖抗体の可変領域断片ＶＨＨを２回のＰＣＲによって増幅した。ＶＨＨ断片をファージディスプレイライブラリーへと構築し、単一ドメイン抗体を保有する遺伝子断片の生成物を、コンピテントセルの中へ形質転換して、単一ドメイン抗体免疫ライブラリーを得た。
２）ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体のスクリーニング
単一ドメイン抗体分子をファージディスプレイ技術によってファージの表面上に提示させ、次いでスクリーニングして抗原特異的単一ドメイン抗体を得た。ファージ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、抗原を１００μｇ／ｍＬの最終的な濃度へ１００ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．０）により希釈し、１００μＬを９６ウェルプレートの中へコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳにより洗浄し、１％のスキムミルクによりシーリングした後に、ファージを添加して、１～２時間インキュベーションした。次いで、抗原特異的ファージを溶出し、アンピシリンを含有するＬＢ培養プレート上にコーティング及び培養したＴＧ１細胞を感染させた。複数ラウンドのスクリーニングによって、濃縮を徐々に達成した。多数の陽性クローンをＥＬＩＳＡ検出のために選択し、陽性クローンをシーケンスした。配列アライメントに従って、ユニークなクローンを同定し、フレーム領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）へと分割した。
単一ドメイン抗体分子をファージディスプレイ技術によってファージの表面上に提示させ、次いでスクリーニングして抗原特異的単一ドメイン抗体を得た。ファージ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、抗原を１００μｇ／ｍＬの最終的な濃度へ１００ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．０）により希釈し、１００μＬを９６ウェルプレートの中へコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳにより洗浄し、１％のスキムミルクによりシーリングした後に、ファージを添加して、１～２時間インキュベーションした。次いで、抗原特異的ファージを溶出し、アンピシリンを含有するＬＢ培養プレート上にコーティング及び培養したＴＧ１細胞を感染させた。複数ラウンドのスクリーニングによって、濃縮を徐々に達成した。多数の陽性クローンをＥＬＩＳＡ検出のために選択し、陽性クローンをシーケンスした。配列アライメントに従って、ユニークなクローンを同定し、フレーム領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）へと分割した。
正確なシーケンシングを備えたクローンをアンピシリンを含有する５ｍＬのＬＢ培地中に接種し、振盪機中で３７℃で一晩培養した。１ｍＬの細菌溶液を３００ｍＬのＬＢ培地の中へ接種し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．６～０．９まで振盪機中で３７℃で培養した。１ＭのＩＰＴＧを添加し、振盪機中で２８℃で一晩培養した。細菌を遠心分離によって収集した。抗体の粗抽出物を、浸透法の使用によって得た。単一ドメイン抗体をプロテインＬによって標識し、親和性クロマトグラフィーによって精製し、１０ｍｇ／Ｌを超える収率であった。高特異性を備えた単一ドメイン抗体をさらにスクリーニングするために、抗体親和性をＳＰＲ技術によって検出した。上記の実施形態によって、合計で６つのＢＣＭＡ単一ドメイン抗体は得て、より高い親和性を備えた単一ドメイン抗体を選択した。
それらのうちで、１つのＢＣＭＡ単一ドメイン抗体を、ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ Ｉと命名する。シーケンシングによって、ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ ＩのＨＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、連続して配列番号：１～３において記載されることが見出された。
実施例２ キメラ抗原受容体遺伝子ベクターの構築
２つの遺伝子セグメントをＴａｉｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成した。１つは、実施例１において調製したＢＣＭＡ ｓｄＡｂ Ｉ中に含有される配列番号：１５のヌクレオチド配列であり；他のものは、デザインされた第２世代ＣＡＲ構造遺伝子である（ＣＤ８ａヒンジ領域、膜貫通ドメイン＋４－１ＢＢ共刺激ドメイン＋ＣＤ３ζ細胞内シグナリングドメインであり、これらのドメインを含有する第２世代ＣＡＲ構造遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１６において記載される）。合成遺伝子を得た後に、分子クローニングを遂行して、ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築した。配列番号：１５及び配列番号：１６のＰＣＲ産物をＰＣＲによって得た。オーバーラップＰＣＲを使用して、２つの断片の連結によって形成されるＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子を得た（そのヌクレオチド配列は配列番号：１２において記載される）。レンチウイルスプレベクター及びＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子を酵素によって消化し、接続し、形質転換した。クローンをピックアップし、プラスミドを抽出した。シーケンシングを遂行して、レンチウイルスベクタープレ－レンチ－ＥＦ１－ＢＣＭＡの正確な配列を得た。
２つの遺伝子セグメントをＴａｉｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成した。１つは、実施例１において調製したＢＣＭＡ ｓｄＡｂ Ｉ中に含有される配列番号：１５のヌクレオチド配列であり；他のものは、デザインされた第２世代ＣＡＲ構造遺伝子である（ＣＤ８ａヒンジ領域、膜貫通ドメイン＋４－１ＢＢ共刺激ドメイン＋ＣＤ３ζ細胞内シグナリングドメインであり、これらのドメインを含有する第２世代ＣＡＲ構造遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１６において記載される）。合成遺伝子を得た後に、分子クローニングを遂行して、ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築した。配列番号：１５及び配列番号：１６のＰＣＲ産物をＰＣＲによって得た。オーバーラップＰＣＲを使用して、２つの断片の連結によって形成されるＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子を得た（そのヌクレオチド配列は配列番号：１２において記載される）。レンチウイルスプレベクター及びＢＣＭＡ ＣＡＲ遺伝子を酵素によって消化し、接続し、形質転換した。クローンをピックアップし、プラスミドを抽出した。シーケンシングを遂行して、レンチウイルスベクタープレ－レンチ－ＥＦ１－ＢＣＭＡの正確な配列を得た。
実施例３ ＢＣＭＡキメラ抗原受容体のレンチウイルスの調製
ウイルスパッケージングの前日に、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣから購入した）を、トリプシンによって消化し、１×１０７細胞／ディッシュで１０ｃｍのディッシュの中へ播種した。細胞のトランスフェクションに際して、実施例２において調製したプレ－レンチ－ＥＦ１－ＢＣＭＡプラスミドに加えて、各々のプラスミドは、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．０Ｇと共にコトランスフェクションされることが必要とされる。それらのうちで、５μｇのプレ－レンチ－ＥＦ１－ＢＣＭＡ、３．７５μｇのｐｓＰＡＸ２プラスミド、及び１．２５μｇのｐＭＤ２．０Ｇプラスミドを使用した。トランスフェクションに際して、上記の３つのプラスミドの混合物を５００μｌのＭＥＭ培地の中へ添加した。分離したマイクロ遠心分離チューブ中に、２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポソーム）２０００試薬を５００μｌのＭＥＭの培地の中へ添加した。次いで、希釈したトランスフェクション試薬を、上記の希釈したプラスミドに滴加し、良く混合し、遠心分離し、２０分間の室温で放置した。最終的に、プラスミド及びトランスフェクション試薬の混合物を１０ｃｍの培養用ディッシュの中へ添加し、１０回穏やかに振盪し、良く混合し、インキュベーターの中へ置いた。トランスフェクションの３日後に、ウイルスを収穫した。１０ｍｌのウイルス含有培養液上清を５０ｍｌの遠心分離チューブの中へ移し、１２５０ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離して、死んだ２９３Ｔ細胞を除去した。次いで、ウイルス含有上清を濾過し、濃縮し、サブパッケージングし、使用のために－８０℃で保存した。
ウイルスパッケージングの前日に、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣから購入した）を、トリプシンによって消化し、１×１０７細胞／ディッシュで１０ｃｍのディッシュの中へ播種した。細胞のトランスフェクションに際して、実施例２において調製したプレ－レンチ－ＥＦ１－ＢＣＭＡプラスミドに加えて、各々のプラスミドは、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．０Ｇと共にコトランスフェクションされることが必要とされる。それらのうちで、５μｇのプレ－レンチ－ＥＦ１－ＢＣＭＡ、３．７５μｇのｐｓＰＡＸ２プラスミド、及び１．２５μｇのｐＭＤ２．０Ｇプラスミドを使用した。トランスフェクションに際して、上記の３つのプラスミドの混合物を５００μｌのＭＥＭ培地の中へ添加した。分離したマイクロ遠心分離チューブ中に、２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポソーム）２０００試薬を５００μｌのＭＥＭの培地の中へ添加した。次いで、希釈したトランスフェクション試薬を、上記の希釈したプラスミドに滴加し、良く混合し、遠心分離し、２０分間の室温で放置した。最終的に、プラスミド及びトランスフェクション試薬の混合物を１０ｃｍの培養用ディッシュの中へ添加し、１０回穏やかに振盪し、良く混合し、インキュベーターの中へ置いた。トランスフェクションの３日後に、ウイルスを収穫した。１０ｍｌのウイルス含有培養液上清を５０ｍｌの遠心分離チューブの中へ移し、１２５０ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離して、死んだ２９３Ｔ細胞を除去した。次いで、ウイルス含有上清を濾過し、濃縮し、サブパッケージングし、使用のために－８０℃で保存した。
実施例４ ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体によって修飾したＴ細胞の調製
１）Ｔリンパ球の調製
滅菌環境において、１０ｍｌの静脈血をボランティアから採血した。５０ｍｌの遠心分離チューブへ、１０ｍｌのヒトリンパ球単離試薬（Ｄａｋｅｗｅｉ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を添加した。血液を、電動ピペットガンにより遠心分離チューブの中へ壁に沿ってゆっくり添加した。遠心分離チューブを遠心分離チューブの中へ置き、７００ｇで２２℃で２５分間遠心分離した。遠心分離の完了後に、ＰＢＭＣは、上部の血漿層と分離した溶液との間の白色膜層で濃縮していた。白色膜層を、パスツールピペットにより別の遠心分離チューブの中へ可能な限り吸引した（３０ｍｌの１６４０培地を添加する）。分離した溶液を吸引しないように注意した。２５０ｇ、２２℃、１０分間。上部の液体を廃棄した。細胞を３ｍｌの１６４０培地中で再懸濁し、Ｔ細胞精製のためにカウントした。
１）Ｔリンパ球の調製
滅菌環境において、１０ｍｌの静脈血をボランティアから採血した。５０ｍｌの遠心分離チューブへ、１０ｍｌのヒトリンパ球単離試薬（Ｄａｋｅｗｅｉ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を添加した。血液を、電動ピペットガンにより遠心分離チューブの中へ壁に沿ってゆっくり添加した。遠心分離チューブを遠心分離チューブの中へ置き、７００ｇで２２℃で２５分間遠心分離した。遠心分離の完了後に、ＰＢＭＣは、上部の血漿層と分離した溶液との間の白色膜層で濃縮していた。白色膜層を、パスツールピペットにより別の遠心分離チューブの中へ可能な限り吸引した（３０ｍｌの１６４０培地を添加する）。分離した溶液を吸引しないように注意した。２５０ｇ、２２℃、１０分間。上部の液体を廃棄した。細胞を３ｍｌの１６４０培地中で再懸濁し、Ｔ細胞精製のためにカウントした。
１×１０７細胞をマイクロ遠心分離チューブ中に置き、２５０ｇで２２℃で１０分間遠心分離した。上部液体を廃棄し、細胞沈殿物を８０μＬの磁気ビーズ分離緩衝液中で再懸濁し、２０μｌのＣＤ３ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｅｉｔｉａｎｎｉ）を添加した。混合物を冷蔵庫中で４℃で１時間置いて、十分な結合を保証した。１時間後に、１ｍＬの磁気ビーズ分離緩衝液をマイクロ遠心分離チューブの中へ添加し、２５０ｇで４℃で１０分間遠心分離した。この期間の間に、フィルターカラムを調製し、磁石上に置き、５００μｌの緩衝液によりリンスした（緩衝液を重力により下に流した）。遠心分離後に、上清を廃棄し、細胞を５００μｌの緩衝液中に再懸濁した。カラムに添加し、緩衝液を重力により下に流した。細胞懸濁物が流れ出た後に、カラムを、５００μｌの緩衝液により４回洗浄した。カラムを磁石から除去し、Ｔ細胞を、１．５ｍｌのマイクロ遠心分離チューブの中へ、１ｍＬの緩衝液によりフラッシングした。細胞を２５０ｇで４℃で１０分間遠心分離した。細胞をＩＬ２含有Ｘ－ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中に再懸濁し、カウント後に２×１０６Ｔ細胞／ウェル（６ウェル位置に）で播種した。
２）レンチウイルスによるＴ細胞の感染
一晩の培養後に、実施例３においてＭＯＩ＝２で調製したプレ－レンチ－ＥＦ１－ＢＣＭＡウイルス溶液を、感染のために一晩添加した。２日目に、１ｍｌの新鮮培地を補足した。３日目に、Ｔ細胞は十分に活性化し、迅速に分裂増殖した。その時に、Ｔ細胞を２５ｃｍ２培養フラスコの中へ移動させた。感染の５日後に、Ｔ細胞の表面上でのＢＣＭＡ ＣＡＲ分子の発現効率を、生体標識ＢＣＭＡ Ｆｃタンパク質により決定して、特異的なＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞を産生する。細胞膜の表面上でのＣＡＲの発現をフローサイトメトリーによって検出した。ＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞の表面上でのＢＣＭＡ ＣＡＲ分子の発現のフローサイトメトリー検出結果を、図１中に示す。図１中の結果は、実施例４において調製したＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞におけるＣＡＲ発現効率が５０％を超えることを示す。
一晩の培養後に、実施例３においてＭＯＩ＝２で調製したプレ－レンチ－ＥＦ１－ＢＣＭＡウイルス溶液を、感染のために一晩添加した。２日目に、１ｍｌの新鮮培地を補足した。３日目に、Ｔ細胞は十分に活性化し、迅速に分裂増殖した。その時に、Ｔ細胞を２５ｃｍ２培養フラスコの中へ移動させた。感染の５日後に、Ｔ細胞の表面上でのＢＣＭＡ ＣＡＲ分子の発現効率を、生体標識ＢＣＭＡ Ｆｃタンパク質により決定して、特異的なＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞を産生する。細胞膜の表面上でのＣＡＲの発現をフローサイトメトリーによって検出した。ＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞の表面上でのＢＣＭＡ ＣＡＲ分子の発現のフローサイトメトリー検出結果を、図１中に示す。図１中の結果は、実施例４において調製したＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞におけるＣＡＲ発現効率が５０％を超えることを示す。
実施例５ ＢＣＭＡキメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞の機能評価
１）インビトロ機能の評価
多発性骨髄腫ＭＭ．１Ｓ細胞及び骨髄性白血病Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣから購入した）に、フローサイトメトリーを行った。結果を図２中に示す。図２の結果は、ＢＣＭＡ分子がＭＭ．１Ｓ細胞において有効に発現されるが、Ｋ５６２細胞において発現されないことを指摘する。
１）インビトロ機能の評価
多発性骨髄腫ＭＭ．１Ｓ細胞及び骨髄性白血病Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣから購入した）に、フローサイトメトリーを行った。結果を図２中に示す。図２の結果は、ＢＣＭＡ分子がＭＭ．１Ｓ細胞において有効に発現されるが、Ｋ５６２細胞において発現されないことを指摘する。
インビトロ細胞殺傷実験を、検出のためのＬＤＨ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって遂行した。実施例４において調製したＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞、及び標的細胞（ＭＭ．１Ｓ細胞またはＫ５６２細胞等）を、４つの勾配の数比（すなわち感染多重度）、すなわち０．５：１及び１：１及び２：１及び４：１に従って設定した。それらのうちで、標的細胞は３×１０４細胞／ウェルであり、すべての残りのウェル中の系にＸ－ＶＩＶＯ培地／１６４０培地を２００μＬまで補足した。９６ウェルプレートを、インキュベーター中で３７℃で５％のＣＯ２でインキュベーションした。１７時間後に、２０μＬの溶解液を、最大放出のためにウェルの中へ添加した。細胞を、ウェルを混合することによって完全に破裂させた。９６ウェルプレートを、インキュベーター中でＣＯ２中で２時間インキュベーションした。２時間後に、最大放出のウェルを観察した。標的細胞がすべて溶解された後に、５０μＬの上清を各々のウェルから収集し、９６ウェルの平底プレートの中へ移し、次いで５０μＬの基質溶液を各々のウェルの中へ添加し、暗所で３０分間顕色させた。３０分後に、ウェルの色変化について観察し、そこで、ＭＭ．１Ｓが最大放出のウェルであり、ＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞を含有するウェルは、比較的暗い色を示した。４９０ｎｍの波長での酵素リーダーにより、測定を行った。殺傷能力の検出結果を、ＬＤＨ試験キットの使用によって得た。
結果を図３中に示し、Ｋ５６２細胞に対する殺傷効果を図３Ａ中に示し；ＭＭ．１Ｓ細胞に対する殺傷効果を図３Ｂ中に示す。図３中の結果は、実施例４において調製したＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞が、高い殺傷活性（４０％を超える等）によりＢＣＭＡ陽性細胞を特異的に殺傷することができることを示す。同時に、これらのＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞は、ＢＣＭＡ陰性細胞に対する殺傷効果を生じない。
実施例４において調製したＭＭ．１Ｓ腫瘍細胞及びＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞を、共インキュベーションし、上清中のＩＦＮ－γ及びＴＮＦαの含有量についてＥＬＩＳＡ法によって検出した。結果を図４中に示し、ＩＦＮ－γの含有量を図４Ａ中に示し、ＴＮＦαの含有量を図４Ｂ中に示す。図４の結果は、様々な感染多重度が腫瘍殺傷効果を有するサイトカインＩＦＮ－γ及びＴＮＦαの発現レベルをアップレギュレートできることを示す。このことは、別の見地からのＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞の特異的な殺傷効果を証明する。
２）動物実験
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＭＭ．１Ｓをルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するように形質導入して、ＭＭ．１Ｓ－ｌｕｃを得た。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する１６４０を、インキュベーター中で５％のＣＯ２中で従来通りに３７℃でインキュベーションした。ＭＭ．１Ｓ－ｌｕｃ細胞株を、尾静脈（５０匹のマウス、オス半数及びメス半数）経由で、１．５×１０６細胞／２００μｌのＰＢＳで、１７日間注射した。次いで、すべての動物を画像化した。均一な担腫瘍マウスを実験群の中へ登録し、５つの群（オス半数及びメス半数、各々の群中に８匹のマウス）、すなわち細胞外液群、モックＴ群、そして、ＢＣＭＡ ＣＡＲＴの低用量群、中用量群、及び高用量群へとランダムに割り当てた。それらのうちで、細胞外液群に尾静脈経由で細胞外液を注射し、モックＴ群に尾静脈経由でモックＴ細胞を注射し、ＢＣＭＡ ＣＡＲＴの低用量群、中用量群、及び高用量群に、尾静脈経由で実施例４において調製したＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞を注射した。
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＭＭ．１Ｓをルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するように形質導入して、ＭＭ．１Ｓ－ｌｕｃを得た。１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する１６４０を、インキュベーター中で５％のＣＯ２中で従来通りに３７℃でインキュベーションした。ＭＭ．１Ｓ－ｌｕｃ細胞株を、尾静脈（５０匹のマウス、オス半数及びメス半数）経由で、１．５×１０６細胞／２００μｌのＰＢＳで、１７日間注射した。次いで、すべての動物を画像化した。均一な担腫瘍マウスを実験群の中へ登録し、５つの群（オス半数及びメス半数、各々の群中に８匹のマウス）、すなわち細胞外液群、モックＴ群、そして、ＢＣＭＡ ＣＡＲＴの低用量群、中用量群、及び高用量群へとランダムに割り当てた。それらのうちで、細胞外液群に尾静脈経由で細胞外液を注射し、モックＴ群に尾静脈経由でモックＴ細胞を注射し、ＢＣＭＡ ＣＡＲＴの低用量群、中用量群、及び高用量群に、尾静脈経由で実施例４において調製したＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞を注射した。
３日後に、マウスに麻酔をかけ、ルシフェラーゼ基質を腹腔内に注射した。対照群（細胞外液群及びモックＴ群）及びＢＣＭＡ ＣＡＲＴ治療群の腫瘍量を、小動物インビボ画像化システムによって観察した。治療３日及び７日後の結果を、それぞれ図５及び図６中に示す。
図５中の結果は、ＢＣＭＡ ＣＡＲＴの高用量及び中用量の治療群において腫瘍細胞画像がほとんど無い一方で、対照群において腫瘍量は大量であることを示し、ＢＣＭＡ ＣＡＲＴは、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞を有効に取り除くことができることを指摘する。ＢＣＭＡ ＣＡＲＴ細胞を静脈の中へ点滴した後に、３日目のマウスにおける蛍光シグナル強度は、細胞外液群及びモックＴ群と比較して減少し始め、腫瘍量が減少していたことを指摘する。７日目のマウスにおける蛍光シグナル強度が実質的に検出不可能だったことは、図６から理解できる。ＢＣＭＡ ＣＡＲＴが動物のインビボの実験においても、ＢＣＭＡ発現と関連する疾患に対して強い治療有効性を示すことが観察できる。
これまでのところ、当業者は、複数の本出願の例示的な実施形態が本明細書において詳細に示され、記載されることを認識するべきであるが、しかしながら、本出願の原理に従う他の多くの変動または修飾は、本出願の趣旨または範囲から逸脱せずに、本出願の本開示から直接決定され得るかまたはそれらに由来し得る。したがって、本出願の範囲は、他の変動または修飾をすべて網羅すると理解及び判断されるべきである。
Claims (25)
- ＢＣＭＡ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナリングドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
前記ＢＣＭＡ結合ドメインが、重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号：１において記載され、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号：２において記載され、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号：３において記載され、
前記ＢＣＭＡ結合ドメインが単一ドメイン抗体である、ＣＡＲ。 - 前記ＢＣＭＡ結合ドメインが、配列番号：４において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
- 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ａ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４から選択されるタンパク質に由来するポリペプチドを含む、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
- 前記膜貫通ドメインが、配列番号：５において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
- 前記ＢＣＭＡ結合ドメインが、ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインへ連結される、請求項１～４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
- 前記ヒンジ領域が、配列番号：６において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む、請求項５に記載のＣＡＲ。
- 前記１つまたは複数の共刺激ドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０から選択される共刺激分子に由来する、請求項１～６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
- 前記共刺激ドメインが、配列番号：７において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
- 前記細胞内シグナリングドメインがＣＤ３ζのシグナリングドメインを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
- 前記細胞内シグナリングドメインが、配列番号：８において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
- リーダー配列をさらに含み、前記リーダー配列が配列番号：９において記載されるアミノ酸配列、またはその機能的なバリアントを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
- 配列番号：１０において記載されるアミノ酸配列、配列番号：１１において記載されるアミノ酸配列、またはそれらの機能的なバリアントを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
- 請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記ＣＡＲをコードする、単離核酸分子。
- 配列番号：１２において記載される核酸配列、または配列番号：１３において記載される核酸配列を含む、ＣＡＲをコードする単離核酸分子。
- 請求項１３または１４に記載の前記核酸分子を含む、ベクター。
- ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターから選択される、請求項１５に記載のベクター。
- ＥＦ１プロモーターをさらに含み、前記ＥＦ１プロモーターが配列番号：１４において記載される配列を含む、請求項１５または１６に記載のベクター。
- 請求項１～１２のいずれか１項に記載の前記ＣＡＲ、請求項１３または１４に記載の前記核酸分子、または請求項１５～１７のいずれか１項に記載の前記ベクターを含む、免疫エフェクター細胞。
- Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される、請求項１８に記載の免疫エフェクター細胞。
- 請求項１５～１７のいずれか１項に記載の前記ベクターを免疫エフェクター細胞の中へ導入することを含む、免疫エフェクター細胞を調製する方法。
- 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択される、請求項２０に記載の方法。
- 請求項１～１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１３または１４に記載の核酸分子、請求項１５～１７のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１８または１９に記載の免疫エフェクター細胞を含む、医薬組成物。
- ＢＣＭＡの発現と関連する疾患または障害の治療のための、請求項２２に記載の医薬組成物。
- ＢＣＭＡの発現と関連する前記疾患または障害が、癌または悪性腫瘍である、請求項２３に記載の医薬組成物。
- ＢＣＭＡの発現と関連する前記疾患または障害が、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性病態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、骨髄腫、ＭＧＵＳ、形質細胞腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、ならびにＰＯＥＭＳ症候群からなる群から選択される、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
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