CN117069856B - 双特异性抗体及应用、组合物、激活和扩增t细胞的方法 - Google Patents

双特异性抗体及应用、组合物、激活和扩增t细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及免疫技术领域，尤其涉及一种双特异性抗体及应用、组合物、激活和扩增T细胞的方法，其中该双特异性抗体，包括用于与T细胞表面的CD28受体特异性结合的第一抗原结合域，和用于与T细胞表面的CD27受体特异性结合的第二抗原结合域；第一抗原结合域为CD80，第二抗原结合域为CD70。可以作为共刺激分子应用于激活和扩增T细胞。该组合物包括CD3抗体和双特异性抗体。该激活和扩增T细胞的方法，包括以下步骤：将待激活T细胞群、CD3抗体和双特异性抗体添加至培养基中进行培养，以激活和扩增T细胞群中的T细胞。本申请能够为T细胞提供有效的协同刺激信号完成T细胞的激活，并且能够加快T细胞的增殖速度。

Description

双特异性抗体及应用、组合物、激活和扩增T细胞的方法
技术领域
本申请涉及免疫技术领域，尤其涉及一种双特异性抗体及应用、组合物、激活和扩增T细胞的方法。
背景技术
在肿瘤免疫应答方面，T细胞所介导的细胞免疫起主要作用。因此T细胞的激活与扩增对细胞免疫有着非常重要的影响。其中的细胞过继疗法，例如TCR-T就涉及到T细胞的体外激活与扩增。
T细胞的激活与扩增需要两个信号，第一个信号是T细胞受体TCR和多肽-MHC分子的结合形成的特异性抗原刺激信号，也叫TCR信号。但是这条信号不足以激活静止状态的T细胞。如果仅通过TCR信号对T细胞进行刺激，T细胞不会被激活，也不会发生扩增与免疫应答。T细胞的激活与扩增除了TCR信号之外，还需要协同刺激分子和T细胞的相应受体相互作用后产生非特异性协同刺激信号。只有在TCR信号和协同刺激信号的共同作用下，T细胞激活相关的RNA及蛋白质才会被合成，关键细胞因子IL-2才会被分泌，细胞也会从G0期进入到G1期。
综上所述，协同刺激是激活和扩增T细胞的必不可少的关键环节之一，而如何加强对T细胞的协同刺激，快速高效地激活和扩增T细胞，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
为了加强对T细胞的协同刺激，从而高效快速地激活和扩增T细胞，本申请提供一种双特异性抗体及应用、组合物、激活和扩增T细胞的方法。
根据本申请的一方面提供一种双特异性抗体，适用于作为共刺激分子参与激活T细胞，所述双特异性抗体包括用于与T细胞表面的CD28受体特异性结合的第一抗原结合域，和用于与T细胞表面的CD27受体特异性结合的第二抗原结合域；
所述第一抗原结合域为CD80，所述第二抗原结合域为CD70。
根据本申请的另一方面提供一种双特异性抗体的应用，所述双特异性抗体作为共刺激分子用于激活和扩增T细胞。
根据本申请的另一方面提供一种组合物，适用于激活和扩增T细胞，包括：
CD3抗体和所述双特异性抗体；
所述CD3抗体适用于与待激活T细胞表面的CD3受体特异性结合产生TCR信号，所述双特异性抗体适用于向T细胞提供协同刺激信号。
根据本申请的另一方面提供一种激活和扩增T细胞的方法，包括以下步骤：将待激活T细胞群、CD3抗体和所述双特异性抗体添加至培养基中进行培养，以激活和扩增所述T细胞群中的T细胞。
本申请通过设置双特异性抗体，模拟抗原递呈细胞功能，适用于与待激活T细胞群接触进行刺激培养，双特异性抗体的第一抗原结合域CD80与T细胞表面CD28受体特异性结合，双特异性抗体的第二抗原结合域CD70与T细胞表面CD27受体特异性结合，为T细胞提供协同刺激信号，完成T细胞的激活与扩增。相比较CD3抗体单独刺激T细胞，仅依靠PBMC细胞本身的免疫细胞提供协同刺激信号，本申请所提供的双特异性抗体能够为T细胞提供有效的协同刺激信号完成T细胞的激活，并且能够加快T细胞的增殖速度。
附图说明
图1示出本申请实施例的纯化得到双特异性抗体（CD80-Fc-CD70）的SDS-PAGE电泳凝胶银染图；
图2示出本申请对比例1、实施例1至4的CD3抗体和双特异性抗体（CD80-Fc-CD70）刺激后的T细胞增殖曲线；
图3示出本申请实施例的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养8天的细胞流式图；
图4示出本申请实施例的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养8天的细胞流式图；
图5示出本申请实施例的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养8天的细胞流式图；
图6示出本申请实施例的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养8天的细胞流式图；
图7示出本申请实施例的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养8天的细胞流式图；
图8示出本申请实施例的PBMC经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养16天的细胞流式图；
图9示出本申请实施例的PBMC经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养16天的细胞流式图。
图10示出本申请实施例的PBMC经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养16天的细胞流式图。
图11示出本申请实施例的PBMC经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养16天的细胞流式图。
图12示出本申请实施例的PBMC经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养16天的细胞流式图。
具体实施方式
为了更好的说明本申请，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本申请同样可以实施。在一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法手段未作详细描述，以便于凸显本申请的主旨。
图1示出根据本申请一实施例的纯化得到双特异性抗体（CD80-Fc-CD70）的SDS-PAGE电泳凝胶银染图；
图2示出本申请对比例1、实施例1至4的CD3抗体和双特异性抗体（CD80-Fc-CD70）刺激后的T细胞增殖曲线；其中不同形状标记的折线代表了刺激T细胞增殖的CD80-Fc-CD70包被孔板时的不同浓度（实施例1至4终浓度依次分别为0 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL、800 ng/mL），而同时添加的CD3抗体的终浓度都是200 ng/mL；
图3示出本申请实施例的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养8天的细胞流式图。图中可见在刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD28+的各个细胞群体所占的比例，需要说明的是，CD3+是指CD3阳性，CD4+是指CD4阳性，CD8+是指CD8阳性，CD28+是指CD28阳性；
图4为图3的局部放大图，示出了本申请对比例1的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养8天的细胞流式图；
图5为图3的局部放大图，示出了本申请实施例1的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子刺激后培养8天的细胞流式图；
图6为图3的局部放大图，示出了本申请实施例2的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子刺激后培养8天的细胞流式图；
图7为图3的局部放大图，示出了本申请实施例4的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子刺激后培养8天的细胞流式图；
图8示出本申请实施例的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养16天的细胞流式图。图中可见在刺激培养16天后的T细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD28+的各个细胞群体所占的比例；
图9至图12均为图8的局部放大图，依次示出了本申请对比例1、实施例1、实施例2、实施例4的PBMC细胞经CD3抗体和双特异性分子（CD80-Fc-CD70）刺激后培养16天的细胞流式图。
根据本申请的一方面提供一种双特异性抗体，适用于作为共刺激分子参与激活T细胞，双特异性抗体设有第一抗原结合域和第二抗原结合域；第一抗原结合域为CD80，第一抗原结合域适用于与T细胞表面的CD28受体特异性结合；第二抗原结合域为CD70，第二抗原结合域适用于与T细胞表面的CD27受体特异性结合。
CD28是T细胞表面重要的共刺激受体，在没有CD28共刺激存在时，初始T细胞不会被活化，也不会发生免疫应答。而CD80是CD28受体的配体，能够与CD80特异性结合产生共刺激信号，完成T细胞的激活，促进T细胞的活化与扩增。
CD70是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，是B淋巴细胞、T淋巴细胞和抗原呈递细胞上表达的受严格调控的跨膜糖蛋白CD27的唯一配体，具有调控T细胞和B细胞活化、增殖及分化的能力。CD70能够与T细胞表面的CD27受体特异性结合产生共刺激信号，促进T细胞的激活与扩增。此外，CD27的共刺激还能促进活化T细胞的存活，是T细胞启动和记忆分化的关键。
本申请通过设置双特异性抗体，适用于与待激活T细胞群接触进行刺激培养，提供协同刺激信号，辅助抗原肽-MHC结合体完成T细胞的激活与扩增。相比较CD3抗体单独刺激T细胞，仅依靠PBMC细胞本身的免疫细胞提供协同刺激信号，本申请所提供的双特异性抗体能够为T细胞提供有效的协同刺激信号完成T细胞的激活，并且能够加快T细胞的增殖速度，如图2所示。
另外，一些T细胞会在其表面表达PD-1受体，PD-1受体是一种免疫抑制分子，可以与PD-L1配体结合产生共抑制信号，共抑制信号会诱导T细胞的衰竭，减弱其细胞因子的分泌，降低T细胞的杀瘤效果。PD-1在活化的B细胞、T细胞、巨噬细胞、DC、NK细胞等广泛表达。许多肿瘤细胞表面通过PD-L1的表达用以抑制免疫细胞的杀伤，逃避宿主免疫系统的攻击。而本发明提供的双特异性抗体，可以通过CD80与DC细胞上的PD-L1配体，发生顺式相互作用，从而阻断T细胞上PD-1与DC细胞上PD-L1的相互作用，达到促进T细胞扩增，优化T细胞群的免疫反应的效果。
在一种可能的实现方式中，双特异性抗体为lgG4型抗体，双特异性抗体包括Fc结构域和两个Fab结构域，其中一个Fab结构域为第一抗原结合域，另一个Fab结构域为第二抗原结合域，即双特异性抗体为CD80-FC-CD70。
另外，本申请还提供了一种双特异性抗体的制备方法，适用于制备前述双特异性抗体，包括以下步骤：合成前述的双特异性抗体的序列，重组构建前述的双特异性抗体的表达载体；将表达载体导入受体细胞；培养受体细胞；对受体细胞进行裂解得到裂解液，在裂解液中纯化分离得到前述的双特异性抗体。
在一种可能的实现方式中，受体细胞为293T细胞。
在一种可能的实现方式中，在将表达载体导入受体细胞之前，还包括将收益细胞提前传代直至汇合度达到80%的步骤。
在一种可能的实现方式中，在将表达载体导入受体细胞的具体操作步骤为：用聚乙烯亚胺做转染试剂，将表达载体转染到受体细胞：293T细胞中，48小时后收集受体细胞以进行裂解处理。
在一种可能的实现方式中，前述的双特异性抗体为CD80-FC-CD70，双特异性抗体CD80-FC-CD70的制备方法包括以下步骤：合成CD80-Fc-CD70的序列，用EcoR I和XbaI双酶切克隆到慢病毒载体中，构建CD80-Fc-CD70表达载体，并提取质粒；293T细胞提前15小时传代于培养皿中，汇合度达到80%，用聚乙烯亚胺做转染试剂，将CD80-Fc-CD70质粒转染到293T细胞中，48小时后收集293T细胞；293T细胞经裂解液完全裂解后，用protein G琼脂糖珠富集CD80-Fc-CD70蛋白。对用protein G琼脂糖珠纯化得到的CD80-Fc-CD70蛋白纯度在90%以上，对其进行SDS-PAGE凝胶银染分析，得到蛋白条带如图1所示。
其中，CD80-FC-CD70序列如序列表所示，其中，CD80由SEQ ID No：1的第13-第738位DNA序列编码，FC结合域由SEQ ID No：1的第745-第1431位DNA序列编码，CD70由SEQ IDNo：1的第1447-第1914位DNA序列编码。
其中，SEQ ID No：1的第1-第6位DNA序列、第739-第744位DNA序列和第1915-第1920位DNA序列依次分别为EcoR1、BamH1和Xba1酶切位点，可以根据需要进行选择设计。SEQID No：1的第7-第12位DNA序列为Kozak序列，用于增加基因的翻译效率。SEQ ID No：1的第1432-第1446位DNA序列编码GGGGS柔性接头。
根据本申请的另一方面提供一种双特异性抗体的应用，前述双特异性抗体作为共刺激分子用于激活和扩增T细胞。
根据本申请的另一方面提供一种组合物，适用于激活和扩增T细胞。该组合物包括CD3抗体和双特异性抗体；CD3抗体适用于与待激活T细胞表面的CD3受体特异性结合产生TCR信号，双特异性抗体适用于向T细胞提供协同刺激信号。
进一步地，该组合物中，CD3抗体和双特异性抗体的质量比为1:(1~4)。
另外，本申请还提供该组合物的一种应用，将该组合物直接添加至T细胞群培养基中，或者先将该组合物预先固定于固体表面，再将待激活T细胞群和该固体在培养基中刺激培养。在一种可能的实现方式中，该组合物呈溶液状，CD3抗体在组合物溶液中的浓度为200ng/mL，双特异性抗体在组合物溶液中的浓度为200ng/mL~800ng/mL。
根据本申请的另一方面提供一种激活T细胞的方法，适用于激活和扩增T细胞，包括以下步骤：将待激活T细胞群、CD3抗体和前述的双特异性抗体添加至培养基中进行培养，以激活和扩增T细胞群中的T细胞。
CD3抗体含有T细胞表面CD3的特异性识别位点，能够与TCR-CD3复合物特异性结合，产生并向胞内传送TCR信号；而双特异性抗体的两个抗原结合域能够分别与共刺激受体CD28和CD27特异性结合，产生非特异性协同刺激信号。两种信号共同作用，完成T细胞的激活，而活化的T细胞分泌增殖相关细胞因子，由G0期进入到G1期，进行大量增殖分化。与现有的激活T细胞的方法相比，本申请能够为T细胞提供协同刺激信号，从而高效快速地激活和扩增T细胞。
现有的研究中联合使用CD3抗体和CD28抗体，利用CD3抗体和CD28抗体的藕联磁珠模拟T细胞活化的两种信号以刺激扩增T细胞，而本发明联合使用CD3抗体与双特异性抗体，双特异性抗体的第一抗原结合域CD80就可以与CD28受体特异性结合，产生由CD28受体所介导的协同刺激信号，在此之外，本发明所提供的双特异性抗体的第二抗原结合域CD70还可以与T细胞表面的CD27受体特异性结合，产生由CD27受体所介导的协同刺激信号。因此，与现有的联合使用CD3抗体和CD28抗体刺激扩增T细胞的方法相比，本发明能够加强对T细胞的协同刺激，从而快速高效地激活和扩增T细胞。
在一种可能的实现方式中，在将T细胞群、CD3抗体和双特异性抗体添加至培养基之前，还包括将CD3抗体和双特异性抗体固定于固体表面的步骤，随后将T细胞群和固定有CD3抗体和双特异性抗体的固体添加至培养基中接触并进行培养。
也就是说，激活和扩增T细胞的方法包括以下步骤：将前述的双特异性抗体和CD3抗体固定于固体表面；将待激活T细胞群与固体在培养基中接触并进行培养，以激活和扩增T细胞群中的T细胞。
本申请通过将双特异性抗体和CD3抗体固定于固体表面，便于运输保存，保存抗体活性，提高激活与扩增效率。
在一种可能的实现方式中，固体为磁珠。
在一种可能的实现方式中，固体为微孔板，将CD3抗体和双特异性抗体固定于固体具体包括以下步骤：将CD3抗体、前述的双特异性抗体和稀释剂添加至微孔板，37℃静置进行过夜包被，将前述的双特异性抗体和CD3抗体固定于微孔板表面，添加洗涤液进行清洗，然后将T细胞群和培养基添加至微孔板的孔中并进行培养，实现T细胞群和固体在培养基中的接触，以激活和扩增T细胞群中的T细胞。
进一步地，微孔板为六孔板，稀释剂为PBS溶液，用PBS稀释CD3抗体和前述的双特异性抗体，稀释后的终溶液中CD3抗体浓度为200ng/mL，稀释后的终溶液中双特异性抗体浓度为200ng/mL~800ng/mL，向微孔板的孔中添加1mL终溶液进行固定。洗涤剂为PBS溶液。
在一种可能的实现方式中，T细胞群为PBMC细胞，需要说明的是，本申请所指待激活T细胞群，并不是指该细胞群仅含T细胞，而是指该细胞群中富含大量的未激活T细胞，能够提供用于激活和扩增的T细胞基础即可，并不需要对T细胞群的纯度做过多要求。而PBMC细胞中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3+T细胞又占了淋巴细胞中的绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始状态，即已经成熟了但没有受到TCR刺激，可以作为T细胞群用于T细胞的激活和扩增。
在一种可能的实现方式中，将PBMC细胞添加至培养基之前还包括PBMC细胞的复苏步骤。
在一种可能的实现方式中，将PBMC细胞与固体在培养基中接触并进行培养前，PBMC细胞在培养基中的接种浓度为1.88×106细胞/mL。
在一种可能的实现方式中，培养基为含有1%~5%的血清替代物的无血清培养基，进一步地，无血清培养基为X-VIVO培养基，无血清培养基含有2.5%的血清替代物。
在一种可能的实现方式中，将PMBC细胞和固体在培养基中接触，在37℃，CO2培养箱内，培养6天~11天。
在一种可能的实现方式中，CD3抗体和双特异性抗体的质量比为1:(1~4)，在将前述的双特异性抗体和CD3抗体固定于固体表面前，按照质量比添加双特异性抗体和CD3抗体。
在一种可能的实现方式中，在PBMC细胞与固体的接触培养过程中，向培养基中添加IL-2，然后继续进行培养。
进一步地，向培养基中添加50~1000U/mL的IL-2，IL-2的浓度优选为100U/mL。通常激活后活化的T细胞才会开始自分泌能够促进细胞增殖的可溶性细胞因子IL-2并大量增殖，本申请通过外加IL-2来促进T细胞的扩增，并且IL-2能够保证刺激活化后的T细胞在体外培养中长期存活和增殖。
另外，IL-2能够诱导和增强细胞毒活性，辅助细胞毒性T细胞分化，而细胞毒性T细胞能够生成参与细胞溶解的分子，如颗粒酶B和穿孔素，对提高T细胞的杀伤力，改善T细胞群的免疫能力有着积极作用。
在一种可能的实现方式中，将PBMC细胞与固体在培养基中接触并进行培养24小时后，向培养基中添加IL-2，然后继续进行培养。培养过程中，随着细胞的生长，消耗培养液，细胞密度增加，需要根据细胞的生长情况，补充添加含有50~1000U/mL的IL-2培养基，为细胞生长持续提供营养，并通过添加IL-2持续刺激T细胞的增殖。
对比例1：
首先进行双特异性抗体的制备：
载体构建：合成CD80-Fc-CD70的序列如序列表所示，用EcoR I和XbaI双酶切克隆到慢病毒载体中，构建CD80-Fc-CD70表达载体，并提取质粒；
细胞转染：293T细胞提前15小时传代于培养皿中，汇合度达到80%，用聚乙烯亚胺做转染试剂，将CD80-Fc-CD70质粒转染到293T细胞中，48小时后收集细胞；
蛋白纯化：细胞经裂解液完全裂解后，用protein G琼脂糖珠富集CD80-Fc-CD70蛋白。
采集富集到的CD80-Fc-CD70蛋白样品，并用SDS-PAGE凝胶银染检测样品的纯度如图1所示。
随后利用protein G琼脂糖珠富集得到的CD80-Fc-CD70蛋白进行T细胞的激活与扩增，具体操作步骤如下：
CD3抗体和CD80-Fc-CD70包被培养皿：在六孔板中用PBS溶液稀释CD3抗体（至终浓度为200 ng/mL）和CD80-Fc-CD70蛋白（终浓度为0 ng/mL），放置于37℃细胞培养箱中过夜包被，将CD3抗体和CD80-Fc-CD70蛋白固定于六孔板的孔表面，在种植PBMC前吸弃孔中的孵育液，并用PBS溶液清洗一次。
PBMC的种植：PBMC复苏后细胞计数，6孔板每孔种植1.88×106细胞，培养基为1mL的添加2.5% 血清替代物的X-VIVO培养基。
T细胞的扩增：PBMC刺激24小时后添加终浓度100U/mL的IL-2，根据细胞的生长情况和细胞密度进行补加添加2.5%血清替代物的X-VIVO培养基（添加终浓度100U/mL的IL-2）。
每隔3天细胞计数记录细胞增殖情况，并用CD3、CD4、CD8、CD28的抗体进行流式检测和细胞亚群分析，如图3、图8所示。
实施例1：
双特异性抗体的制备方法与对比例1保持一致。
T细胞的激活与扩增方法方面，实施例2与对比例1的区别在于，实施例1的CD3抗体和CD80-Fc-CD70包被培养皿的操作步骤中，在六孔板中用PBS溶液稀释CD3抗体（至终浓度为200ng/mL）和CD80-Fc-CD70蛋白（终浓度为200ng/mL），其他步骤保持一致。
实施例2：
双特异性抗体的制备方法与对比例1保持一致。
T细胞的激活与扩增方法方面，实施例3与对比例1的区别在于，实施例1的CD3抗体和CD80-Fc-CD70包被培养皿的操作步骤中，在六孔板中用PBS溶液稀释CD3抗体（至终浓度为200ng/mL）和CD80-Fc-CD70蛋白（终浓度为400ng/mL），其他步骤保持一致。
实施例3：
双特异性抗体的制备方法与对比例1保持一致。
T细胞的激活与扩增方法方面，实施例4与对比例1的区别在于，实施例1的CD3抗体和CD80-Fc-CD70包被培养皿的操作步骤中，在六孔板中用PBS溶液稀释CD3抗体（至终浓度为200ng/mL）和CD80-Fc-CD70蛋白（终浓度为600ng/mL），其他步骤保持一致。
实施例4：
双特异性抗体的制备方法与对比例1保持一致。
T细胞的激活与扩增方法方面，实施例5与对比例1的区别在于，实施例1的CD3抗体和CD80-Fc-CD70包被培养皿的操作步骤中，在六孔板中用PBS溶液稀释CD3抗体（至终浓度为200ng/mL）和CD80-Fc-CD70蛋白（终浓度为800ng/mL），其他步骤保持一致。
如图2所示，实施例1至4均在刺激后的第6天有显著的增殖，因此PBMC细胞和固体在培养基中的培养时间优选为6天以上。
对比例1的PBMC细胞只用200ng/mL的CD3抗体去激活的T细胞，其增殖曲线是不外加协同刺激分子激活T细胞的前提下，PBMC细胞中本身的免疫细胞相互作用下，T细胞在该培养条件下的正常生长曲线。
由图2可以看出，CD3抗体和双特异性抗体CD80-Fc-CD70蛋白能够刺激和激活PBMC中的T细胞，促进T细胞的增殖。并且，CD3抗体与CD80-FC-CD70的浓度比优选为1:（1~4）。
另外，由图2可以看出，实施例1的T细胞增殖速度显著提升，且增殖速度稳定，约为对比例1的1.5倍；实施例2的细胞增殖速度提升更加显著，且增殖速度稳定，约为对比例1的1.9倍；实施例3和实施例4的T细胞增殖前期更快，但刺激培养至第11天时，实施例4的增殖速度最快，得到的T细胞数量也最多。
如图3、图8所示，对比例1至4的CD3+T淋巴细胞占比都在90%以上，表明PBMC细胞中，T细胞在大量增殖。
如图3所示，对比例1中，刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD4+占58.5%，CD3+CD8+占38.6%；实施例1中，刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD4+占58.6%，CD3+CD8+占43.6%；实施例2中，刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD4+占43.2%，CD3+CD8+占57.5%；实施例4中，刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD4+占42.6%，CD3+CD8+占57.5%。
如图8所示，实施例4中，刺激培养16天后的T细胞中CD3+CD8+更是占到了62%，而对比例1刺激培养16天后的的T细胞中CD3+CD8+仅占到了25.8%。
因此，在200 ng/mL的CD3抗体基础上添加400 ng/mL的CD80-Fc-CD70就能显著增加扩增的T细胞中CD3+CD8+细胞比例，降低了CD3+CD4+的T细胞比例，添加800 ng/mL的CD80-Fc-CD70能进一步提高CD3+CD8+细胞比例。
T细胞的CD8+是指CD8阳性，T细胞表面有CD8受体，CD8+T细胞也叫细胞毒性T细胞TCL，具有杀灭肿瘤细胞，在防止一些淋巴系统的肿瘤及杀伤某些抗原调变的肿瘤细胞变异株具有一定的免疫学功能。并且CD8受体可以参与并稳定TCR受体与CD3抗体的结合，有助于激活信号传递。而上述数据充分说明，外加CD80-Fc-CD70蛋白能够促进CD3+CD8+T细胞亚群的扩增。增加CD80-Fc-CD70蛋白的含量，能够对T细胞中CD3+CD8+细胞比例提升，CD3+CD8+T细胞亚群扩增起到积极作用。
如图3所示，对比例1中，刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD28+占41%；实施例1中，刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD28+占42%；实施例2中，刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD28+占55.1%；实施例4中，刺激培养8天后的T细胞中CD3+CD28+占59.2%。
如图8所示，对比例1中，刺激培养16天T细胞中CD3+CD28+占58.2%；实施例1中，刺激培养16天后的T细胞中CD3+CD28+占56.8%；实施例2中，刺激培养16天后的T细胞中CD3+CD28+占65.9%；实施例4中，刺激培养16天后的T细胞中CD3+CD28+占77.6%。
因此，在200 ng/mL的CD3抗体基础上添加400 ng/mL的CD80-Fc-CD70就能显著增加扩增的T细胞中CD3+CD28+细胞比例。
T细胞只有TCR受体在与抗原提呈细胞表面的MHC-抗原肽结合物特异性结合，经由CD3向胞内传送TCR信号后才会在其细胞膜表面表达CD28受体，CD28+受体可以与CD80-Fc-CD70蛋白的CD80特异性结合接收协同刺激信号，图3、图8中各实施例T细胞中CD3+CD28+的比例上升，充分说明了T细胞已经完成TCR受体的特异性结合，做好接收协同刺激信号的准备，CD3+CD28+的比例上升意味着CD80-Fc-CD70能够作为协同刺激分子参与完成T细胞的激活与扩增。
而上述数据充分说明，外加CD80-Fc-CD70蛋白能够促进CD3+CD28+T细胞亚群的扩增。增加CD80-Fc-CD70蛋白的含量，能够对T细胞中CD3+CD28+细胞比例提升、CD3+CD28+T细胞亚群的扩增起到积极作用。并且随着培养时间延长，CD3+CD28+细胞比例明显提升，说明利用CD3抗体和双特异性抗体激活、扩增、诱导得到的T细胞群处于年轻化的状态，并且能够维持在免疫活性较高的年轻化状态。
另外，有研究表明，CD28受体在CD28+T细胞中表达与功能有一定的关系，CD8+CD28+T细胞能够表现出MHC限制的细胞毒性功能；CD8+CD28+T细胞的抑制抗体产生以及同种异体抗原所诱导的细胞增殖效应等功能，也为T细胞产品开发提供了更多可能性。
以上已经描述了本申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (8)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，适用于作为共刺激分子参与激活T细胞，所述双特异性抗体包括用于与T细胞表面的CD28受体特异性结合的第一抗原结合域，和用于与T细胞表面的CD27受体特异性结合的第二抗原结合域；
所述第一抗原结合域为CD80，所述第二抗原结合域为CD70；
所述双特异性抗体的DNA编码序列如SEQ ID No：1所示。
2.一种组合物，其特征在于，适用于激活和扩增T细胞，包括：
CD3抗体和权利要求1所述的双特异性抗体；
所述CD3抗体适用于与待激活T细胞表面的CD3受体特异性结合产生TCR信号，所述双特异性抗体适用于向T细胞提供协同刺激信号。
3.一种激活和扩增T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待激活T细胞群、CD3抗体和权利要求1所述的双特异性抗体添加至培养基中进行培养，以激活和扩增所述T细胞群中的T细胞。
4.根据权利要求3所述的激活和扩增T细胞的方法，其特征在于，在将所述T细胞群、所述CD3抗体和所述双特异性抗体添加至培养基之前，还包括将所述CD3抗体和所述双特异性抗体固定于固体表面的步骤，随后将所述T细胞群和固定有所述CD3抗体和所述双特异性抗体的所述固体添加至所述培养基中接触并进行培养。
5.根据权利要求3所述的激活和扩增T细胞的方法，其特征在于，所述T细胞群为PBMC细胞。
6.根据权利要求3所述的激活和扩增T细胞的方法，其特征在于，所述CD3抗体和所述双特异性抗体的质量比为1:(1～4)。
7.根据权利要求3所述的激活和扩增T细胞的方法，其特征在于，将所述T细胞群、所述CD3与所述双特异性抗体添加至所述培养基中进行培养后，向所述培养基中添加IL-2，继续进行培养。
8.根据权利要求7所述的激活和扩增T细胞的方法，其特征在于，向所述培养基中添加50～1000U/mL的IL-2。
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