CN106929523A - 酵母表达重组hCD80-GPI融合蛋白的制备及其在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酵母表达重组hCD80‑GPI融合蛋白的制备及其在抗肿瘤中的应用。具体地，本发明提供一种优化的适合毕赤酵母表达的hCD80‑GPI融合蛋白的编码序列，以及高效生产所述融合蛋白的方法。优化后的hCD80‑GPI融合蛋白基因非常适合酵母表达，具有高表达、高稳定的特点。本发明可高效、简便、低成本地获得hCD80‑GPI融合蛋白。本发明还提供了含所述hCD80‑GPI融合蛋白的药物组合物。

Description

酵母表达重组hCD80-GPI融合蛋白的制备及其在抗肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及了基因工程和医药领域。具体地，本发明涉及酵母表达重组hCD80-GPI融合蛋白的制备及其在抗肿瘤中的应用。更具体地，本发明涉及优化的适合酵母表达的hCD80-GPI融合蛋白的编码序列，以及高效生产hCD80-GPI融合蛋白的方法。本发明还涉及含有hCD80-GPI融合蛋白的药物组合物。

背景技术

肿瘤是严重危害人类健康的疾病，正在超过心脑血管疾病而成为第一死亡的原因，因此探寻肿瘤的发生发展机制、寻找新的抗肿瘤方法是当代医学药学研究的重要工作。上世纪80年代以后，有关肿瘤生物治疗的各种研究呈阶梯状上升趋势，肿瘤的生物治疗手段在现代肿瘤治疗中作为肿瘤术后化疗、放疗的一种重要的辅助治疗手段越来越受到人们的关注，特别是2013年肿瘤的生物治疗被Science杂志列为当年度十大科技进展之一，更是掀起了新一轮肿瘤生物治疗研究的热潮。

肿瘤之所以能够在机体中存在，是因为肿瘤能够逃脱机体的免疫监视。在机体与肿瘤相互作用及肿瘤如何逃脱机体免疫监视机能而侵袭转移的研究中，人们通常认为是由于肿瘤细胞的免疫原性低下，并且具有抗原调变能力。如:肿瘤细胞本身的遗传高度不稳定性、肿瘤细胞下调或缺乏MHC等位基因表达、不表达共刺激分子和勃附分子等，使T细胞无法被识别。

目前有研究证明，缺乏CD80共刺激信号是肿瘤细胞逃避免疫监视的重要原因之一。已知大多数肿瘤细胞表面表达MHC-I类抗原，而MHC-II类抗原表达降低或缺失，而机体针对肿瘤的免疫应答主要是细胞免疫应答。在此过程中，肿瘤细胞表面的肿瘤抗原与MHC-I分子结合成为MHC-I类分子肿瘤抗原肤复合物后，才被CD8^十CTL识别。CD8^十CTL(细胞毒性T淋巴细胞，cytotoxic lymphocyte，CTLs)被激活后增生分化为具有杀伤肿瘤活性的CTL。或者当MHC-I类分子肿瘤抗原肽复合物被抗原提呈细胞(APC)摄取加工后与MHC-II类分子结合后，可以被CD4⁺T识别，从而激活抗肿瘤免疫应答。在MHC-I类分子和MHC-II类分子提呈肿瘤抗原、激活肿瘤免疫应答的过程都需要共刺激分子CD80分子协同刺激，传递T细胞活化的第二信号。

有学者采用CD80基因转染，进行抗肿瘤免疫治疗取得了成功。Hayakawa等用携带鼠CD80基因的载体转染鼠骨肉瘤细胞系MSK-SG，使肿瘤细胞表达共刺激信号，结果表明机体能排斥CD80基因转染的肿瘤细胞，显著降低转移灶的形成数量，并且有效激发免疫系统，排斥CD80^-的骨肉瘤细胞。Yang等将CD80基因转染人黑色素瘤细胞，诱导产生了针对黑色素瘤细胞的特异性CTL。诸多理论与实验研究均证明：转染了CD80基因的肿瘤细胞表达CD80后，变成了具有免疫原性的肿瘤细胞，可有效的刺激抗肿瘤免疫，杀灭肿瘤细胞。

由于将CD80基因直接导入目的肿瘤细胞内表达CD80的传统的基因转导法存在许多的限制：1.需要外源性载体，而病毒等载体进入患者体内，其活动范围，活动过程都无法控制，很可能带来不良反应；2.患者体内进行基因转染，因受体内生理微环境条件的限制，其转染效率往往较低；3.基因表达的过程复杂且耗时；4.外源性基因整合到宿主细胞核染色体后，往往容易降解，或其表达不稳定。所以目前很难运用于临床实践。

目前国内外针对hCD80锚定修饰瘤苗已经进行了一些研究，部分研究涉及将超抗原hCD80序列与一些锚定序列进行融合。然而，目前开发的构建hCD80锚定蛋白的真核表达体系，存在明显的缺点，例如制备纯化hCD80融合蛋白的周期长、得率低，成本大，操作程序复杂，不利于工程化开发和临床应用推广。

此外，也有研究涉及通过原核表达体系制备hCD80锚定蛋白，例如使用原核载体在大肠杆菌中表达了hCD80锚定蛋白，但是原核载体表达hCD80锚定蛋白的效率低下。此外，采用原核载体构建hCD80锚定蛋白的技术体系，因为原核表达体系的固有缺陷，导致蛋白表达产物生物活性低，且产生的融合蛋白难以正确地进行蛋白折叠修饰。

综上所述，当前利用hCD80构建hCD80锚定蛋白修饰的瘤苗细胞可提高机体抗肿瘤效应已经得到了诸多科学实验的验证，但因为表达体系和工艺等的限制，如何克服原核载体表达能力与产物活性差、真核载体制备困难的缺陷，设计构建具有良好生物学效应、产量高、制备更高效、易于开发应用的hCD80相关融合蛋白成为研究者面临的难题。

因此，本领域迫切需要开发新的高效、简便、低成本地制备高活性hCD80锚定蛋白的方法以及相关的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效表达和生产hCD80-GPI融合蛋白的方法。

本发明的另一目的是提供相应的编码序列、载体、宿主细胞以及表达和纯化的工艺。

在本发明的第一方面，提供了一种编码hCD80-GPI融合蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码hCD80-GPI融合蛋白的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或式I所示结构的hCD80-GPI融合蛋白，而且所述核苷酸序列的hCD80-GPI融合蛋白编码区与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有≥95％相同性。

在另一优选例中，所述核苷酸序列的hCD80-GPI融合蛋白编码区与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有≥98％相同性。

在另一优选例中，所述核苷酸序列的hCD80-GPI融合蛋白编码区与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有≥99％相同性。

在另一优选例中，所述核苷酸序列的hCD80-GPI融合蛋白编码区与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有100％相同性。

在另一优选例中，该编码hCD80-GPI融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的第二方面，提供了含有一种表达载体，它含有本发明第一方面中所述的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第二方面中所述的表达载体或者基因组中整合有本发明第一方面中所述的hCD80-GPI融合蛋白的编码序列。

在另一优选例中，所述宿主细胞是通过转入本发明第二方面中所述的表达载体或第一方面中所述的核苷酸序列并经同源重组而形成的，从而在基因组或染色体中整合有hCD80-GPI融合蛋白的编码序列。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)GS115菌株。

在本发明的第四方面，提供了一种生产hCD80-GPI融合蛋白的方法，它包括以下步骤：

(a)在适合表达条件下，培养本发明第三方面中所述的宿主细胞，从而表达hCD80-GPI融合蛋白，其中所述的宿主细胞是毕赤酵母；

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的hCD80-GPI融合蛋白。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的hCD80-GPI融合蛋白的编码序列。

在本发明的第五方面，提供了一种hCD80-GPI融合蛋白，所述的hCD80-GPI融合蛋白具有式I结构：

A-B-C (I)

式中，

A为hCD80元件，其序列如SEQ ID NO.:2中第1-208位；

B为无或连接肽；

C为GPI元件，其序列如SEQ ID NO.:2中第209-251位；

各“-”为肽键；

并且，所述hCD80-GPI融合蛋白是酵母表达的重组蛋白。

在另一优选例中，所述的hCD80-GPI融合蛋白的糖基化的蛋白。

在另一优选例中，所述的hCD80-GPI融合蛋白是糖基化的分子量为约63kD的蛋白。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有本发明第五方面中所述的hCD80-GPI融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物是疫苗组合物或瘤苗组合物。

在本发明的第七方面，提供了本发明第五方面所述的hCD80-GPI融合蛋白的用途，它被用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物或瘤苗组合物。

在本发明的第八方面，提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用本发明第五方面中所述的hCD80-GPI融合蛋白，或含所述hCD80-GPI融合蛋白的药物组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明中优化的hCD80-GPI融合基因的核苷酸序列，其中第1-624位为hCD80序列(去除了hCD80其自身信号肽序列)；下划线部分(第625-753位)为GPI序列(来自人胎盘碱性磷酸酶的锚定序列，共129碱基)。该优化的融合基因序列共753碱基。

图2显示了原始的hCD80基因序列，其中下划线部分为hCD80信号肽序列的编码序列(第1-102位)。

图3显示了对应于hCD80-GPI融合蛋白的原始的GPI锚定肽基因序列。

图4显示了优化的酵母表达的hCD80-GPI融合基因序列与原始融合基因序列比对，其中下划线为被改变的碱基。

图5显示了优化的酵母表达的hCD80-GPI融合基因表达蛋白序列与原始融合基因表达蛋白序列比对。结果表明，优化的融合基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)与未优化的原始基因序列所编码的蛋白序列无差异，是完全相同。

图6显示了hCD80-GPI融合基因酵母表达载体的构建图。

图7显示了hCD80-GPI融合基因的GS115酵母高表达菌株筛选。各泳道如下：1:分子量标准品(从下至上分别为：25、30、40、55、70、100、130和170kD)；2：菌株1；3：菌株2；4：菌株3；5：菌株4；6：菌株57：菌株6；8：对照上清。

图8显示了Westernblot方法鉴定GS115/6菌株上清中高表达的hCD80-GPI融合蛋白。各泳道如下：1.GPI；；2.对照；3.hCD80-GPI；4.hCD80；5.对照；6.hCD80-GPI。

图9显示了hCD80-GPI融合蛋白的纯化。各泳道如下：1:分子量标准品(从下至上分别为：25、30、40、55、70、100、130和170kD)；2：发酵上清:3：浓缩上清；4：硫酸铵沉淀蛋白；5：CM柱纯化峰；6：Q柱纯化峰；7：分子筛纯化峰。

图10显示了Western blot方法鉴定制备的hCD80-GPI融合蛋白，其中用抗hCD80抗体和抗GPI抗体分别检测蛋白。

图11显示了HPLC分析制备的hCD80-GPI融合蛋白纯度。

图12显示了本发明hCD80-GPI融合蛋白的锚定CT26细胞能力的检测结果。

图13显示了hCD80-GPI/CT26瘤苗刺激小鼠T细胞增殖。其中，曲线包括：1.PBS；2.CT26；3.hCD80-GPI(G)/CT26；4.hCD80-GPI(E)-GPI；5.LPS。

图14显示了hCD80-GPI/CT26瘤苗刺激小鼠T细胞分泌细胞因子增多。

图15显示了hCD80-GPI/CT26锚定修饰瘤苗接种的荷瘤小鼠的生存曲线。

图16显示了hCD80-GPI/CT26锚定修饰瘤苗的荷瘤小鼠的荷瘤体积。

图17显示了hCD80-GPI锚定CT26瘤苗的荷瘤小鼠的NK活性。

图18显示了hCD80-GPI锚定CT26瘤苗的荷瘤小鼠的CTL活性。

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，发现hCD80锚定蛋白用常规技术无法有效地在酵母中表达，其主要原因之一是天然基因序列未经合理的优化。本发明人对基因编码序列进行了针对性优化设计，将优化后的hCD80-GPI融合蛋白的编码序列(SEQ IDNO:1)转入合适的宿主毕赤酵母(P.pastoris)，从而实现了hCD80-GPI融合蛋白的高水平分泌表达，在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人设计并经筛选获得了优化的hCD80-GPI融合基因，将其导入酵母表达载体pPIC9k，筛选高表达GS115酵母菌株，建立酵母高效发酵表达体系，大量纯化制备hCD80-GPI融合蛋白，并且检定其抗肿瘤学效应。

在本发明的生产工艺中，因为hCD80-GPI融合蛋白的表达水平高，可大幅度提高产品得率，从而获得表达量高、提纯方便、得率高、正确折叠且活性高的hCD80-GPI融合蛋白，因而大幅降低了生产hCD80锚定蛋白的生产成本，非常适合大规模生产。

hCD80

hCD80基因的全长序列为726bp，其中的1-102位碱基为信号肽序列，共编码242个氨基酸(如SEQ ID NO.:3和4所示)。

CD80是表达于活化的B细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞和NK细胞等有抗原提呈作用的细胞膜上的糖蛋白，与配体CD28结合，在T细胞活化中起重要的协同刺激作用。研究表明，不表达CD80分子的肿瘤细胞即使有免疫原性，也不能有效地诱导T细胞活化，甚至产生特异的肿瘤抗原无反应性。导入CD80基因的癌细胞不但失去其成瘤性，而且能诱导全身特异性的肿瘤免疫反应。其作用机制为：肿瘤细胞表达CD80分子后具有免疫原性(MHC-I⁺)，被CD8⁺T前体CTL细胞识别时，肿瘤抗原-MHC-I类分子复合物提供第一信号，而CD80分子通过与T细胞表面的CD28结合提供第二信号(协同刺激信号)，CD80⁺T细胞识别这一共刺激信号后即活化、自分泌IL-2、IL-1等细胞因子，并增殖分化形成效应CTL，发挥细胞毒功能，从而杀灭肿瘤细胞。至于一些能自行退化的肿瘤，发生机制也是因为肿瘤细胞表面表达了CD80，与配体CD28相互作用诱导了机体的抗肿瘤免疫。但绝大多数肿瘤细胞不表达或仅仅是弱表达CD80分子(黑色素瘤、成纤维肉瘤、T淋巴细胞瘤以及肥大细胞瘤等细胞表面均不表达CD80分子)，无法被机体的免疫系统识别，导致肿瘤逃避免疫监视而在体内无限制生长。

本发明的研究表明，将CD80以hCD80-GPI融合蛋白方式作用于肿瘤细胞制备肿瘤疫苗，可增强肿瘤细胞抗原性以及抗体对肿瘤抗原的识别和加工提呈能力，可以显著增强机体抗肿瘤免疫能力。

GPI

GPI锚定蛋白是指一类通过其羧基端的GPI结构锚定于细胞膜表面的一类蛋白。

在本发明中，优选的GPI元件来自人胎盘滋养层细胞膜表面的人胎盘碱性磷酸酶1(humanplacental alkaline phosphatase 1，hPLAP-1)和人红细胞膜表面的补体衰变加速因子(decay-accelerating factor，DAF)。GPI锚定蛋白包括多肽部分、GPI部分，多肤的C末端氨基酸连接于GPI上，C末端氨基酸的α羧基与GPI胆胺氨基相结合，胆胺连接于甘露糖和葡萄糖胺上，葡萄糖胺连于磷脂酞肌醇(phosphatidylinositol，PI)上，PI通过其磷酸基团连于细胞膜脂质外层。GPI的核心结构属于高度保守序列，主要由线性排列的Glycan组成：(蛋白)-胆胺(EthN)-甘露糖(Man)-甘露糖-甘露糖-葡萄糖胺(GlcN)-磷脂酰肌醇(Pl)-(细胞膜)。GPI锚定蛋白可以与多种新生蛋白羧基末端序列连接。

在本发明中，将目的蛋白hCD80的优化编码序列和GPI锚定信号肽编码序列融合重组，构建高表达的融合基因并纯化表达产物。

在本发明中，未优化的GPI元件的序列如SEQ ID NO.:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

hCD80-GPI融合蛋白

如本文所用，术语“hCD80-GPI融合蛋白”指hCD80元件与GPI元件构成的融合蛋白。在hCD80-GPI融合蛋白中，hCD80元件与GPI元件之间可以含有或不含有连接肽或柔性接头。此外，所述融合蛋白可以含有或不含有起始的Met；可以含有或不含有信号肽。

在本发明中，通过基因工程重组技术将糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinosi-tol，GPI)与目的蛋白hCD80融合表达，制备的目的蛋白能够凭借GPI锚定到多种细胞膜上。

本发明的hCD80-GPI融合蛋白，在适宜的温度与电解质环境下与靶细胞共同孵育时，hCD80-GPI融合蛋白可锚着与细胞表面并显示其抗肿瘤的生物学活性。

序列优化

在本发明中，提供了优化的、特别适合在酵母细胞中表达的hCD80-GPI融合蛋白的编码序列。

hCD80的天然核苷酸序列是已知的(如SEQ ID NO:3所示)，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

GPI的天然核苷酸序列是已知的(如SEQ ID NO:5所示)，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明人先根据毕赤酵母密码子偏爱性，在不改变其氨基酸序列的前提下对hCD80和GPI的DNA序列进行了优化。然而，本发明人发现，仅依据密码子偏爱性而获得的优化序列并不适合在毕赤酵母中表达。

因此，本发明人还根据其他因素进行了针对性的二次优化，其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变基因中A+T组成、改变G+C含量、改变mRNA 5'及3'非翻译区(UTR)、和/或改变mRNA的二级结构及翻译起始密码子的AUG旁侧序列等。

经过测试和筛选，在众多修饰序列中获得了一个特别优化的hCD80-GPI融合蛋白编码序列。此优化的hCD80-GPI融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，与未优化的基于hCD80和GPI原始序列的编码序列的同源性较低，仅约38％(见图3)。无论是本发明优化的hCD80-GPI编码序列，还是未优化的编码序列，或是仅依据密码子偏爱性进行部分优化的编码序列，它们编码的氨基酸序列是相同，即SEQ ID NO.:2所示的hCD80-GPI融合蛋白。

本发明的优化的hCD80-GPI融合蛋白的编码序列可用常规方法获得，例如通过全基因合成。

工程菌的制备和发酵生产

本发明的发明点主要在于改构的hCD80-GPI融合蛋白的优化基因。至于将改构的hCD80-GPI融合蛋白优化基因插入质粒、转化毕赤酵母、工程菌的筛选、工程菌的发酵、以及产物的分离等技术基本上按本领域已知的常规方法进行(例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件)。

通常，可在优化基因的5'端与3'端分别引进特异性酶切位点，用分子克隆的常规方法，将优化基因克隆入表达载体(如pPIC9、pPIC9K等)。然后，转化、整合入P.pastoris宿主细胞染色体。利用常规方法(如G418抗性或Southern印迹法)选出高拷贝转化株，摇瓶表达选出高表达工程细胞。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut⁺)或慢速利用甲醇型(Mut^s)。

整合入毕赤酵母染色体(或基因组)中的hCD80-GPI融合蛋白编码序列的拷贝数没有特别限制，可以为1-50个或更高，通常为2-30个。

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于毕赤酵母生长、表达的培养基都可用于本发明。例如，合适的培养基包括(但并不限于)以下培养基：

YPD平板	酵母提取物	1％
				蛋白胨	2％
	葡萄糖	2％
				琼脂	1％
BMGY培养液	酵母提取物	1％
				蛋白胨	2％
	磷酸钾缓冲液，pH 6.0	100mM
				YNB	1.34％
	生物素	(4×10-5)％
				甘油	1％
BMMY培养液	酵母提取物	1％
				蛋白胨	2％
	磷酸钾缓冲液，pH 6.0	100mM
				YNB	1.34％
	生物素	(4×10-5)％
				甲醇	0.5％

此外，对于大规模生产hCD80-GPI融合蛋白，可选择无机盐培养基，也可在无机盐培养基基础上进行一定更改，但所含离子成份宜与无机盐培养基相似。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，hCD80-GPI融合蛋白的发酵及诱导温度保持在28-30℃。

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在20-90％。溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决。

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料。

(e)就诱导期甲醇浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常甲醇浓度控制在0.5-5％。

(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为12-160小时，较佳地为24-120小时。

如果表达的hCD80-GPI融合蛋白存在于培液上清，则发酵样品先以离心、过滤等方式去除细胞，获得含目的蛋白质hCD80-GPI融合蛋白的发酵清液。如果表达的hCD80-GPI融合蛋白存在于细胞内，则发酵样品先经破壁、离心、过滤等方式去除细胞碎片，获得含目的蛋白质的滤液。

含目的蛋白质的发酵清液或滤液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

经过上述纯化可得到hCD80-GPI融合蛋白纯品，纯化得率通常为20％以上，纯度95％以上，纯品得率约2-5mg/L培液，远高于未优化的编码序列(提高至少10倍)和部分优化的编码序列(提高至少2-5倍)。

此外，对于本发明毕赤酵母高水平表达的hCD80-GPI融合蛋白，由于其折叠正确，因此不需复性。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的重组的hCD80-GPI融合蛋白或由其自组装的hCD80-GPI融合蛋白，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是仅含有hCD80-GPI融合蛋白，也可以含有其他抗肿瘤的刺激免疫的蛋白，如hCD80-GPI融合蛋白。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(i)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明hCD80-GPI融合蛋白。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的hCD80-GPI融合蛋白。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如多肽或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's PharmaceuticalSciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明重组的hCD80-GPI融合蛋白)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。

更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

(iii)给药途径和剂量

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的hCD80-GPI融合蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

应以“有效量”给予hCD80-GPI融合蛋白，即hCD80-GPI融合蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主产生针对肿瘤的免疫应答。

在各疫苗剂份中所选用的hCD80-GPI融合蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg hCD80-GPI融合蛋白。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

本发明的主要优点在于：

(1)优化后的hCD80-GPI融合蛋白基因非常适合毕赤酵母表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。

(2)含有优化的hCD80-GPI融合蛋白基因的毕赤酵母具有高密度生长的特性，非常适于大规模高密度的发酵生产。由于表达水平高，因此得率大幅度提高，成本低。

(3)与原核表达相比，毕赤酵母的表达的hCD80-GPI融合蛋白具有更高的活性。

(4)外源基因被整合在毕赤酵母的染色体上，不易丢失。

(5)本发明的hCD80-GPI融合蛋白不依赖于细胞自身生长增殖等性状和可转染性，可以用于各种类型和组织器官来源的靶细胞；

(6)本发明的hCD80-GPI融合蛋白允许多种蛋白有序地锚定在细胞表面，适合于多重免疫分子膜表面修饰瘤苗的制备；

(7)本发明的hCD80-GPI融合蛋白可以方便地锚定在肿瘤细胞上，便捷地制备地制备经免疫分子表面修饰的自体肿瘤细胞的瘤苗，具有较大的临床应用潜力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)；或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.hCD80-GPI融合蛋白毕赤酵母表达系统的构建

1.目的基因的获得

优化序列：根据天然hCD80和GPI的氨基酸序列，本发明人先根据毕赤酵母密码子偏爱性，在不改变其氨基酸序列的前提下对hCD80和GPI的DNA序列进行了优化。然而，本发明人发现，仅依据密码子偏爱性而获得的优化序列并不适合在毕赤酵母中表达。

为此，本发明人根据其他因素进行了针对性的二次优化，其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变基因中A+T组成、改变G+C含量、改变mRNA 5'及3'非翻译区(UTR)、和/或改变mRNA的二级结构。

一种最优化的目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因编码hCD80-GPI融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。人工全合成该优化基因(SEQID NO:1)，并在其5'端与3'端分别引入酶切位点。SEQ ID NO.:1与对照序列的相似性仅为约38％。

对照序列1：基于野生型的hCD80基因(SEQ ID NO:3)和野生型GPI基因(SEQ IDNO.:5)得出的核苷酸序列(SEQ ID NO.:7中第103-855位)，其编码相同的hCD80-GPI融合蛋白。

对照序列2：仅根据毕赤酵母密码子偏爱性原则进行优化所产生的核苷酸序列(SEQ ID NO:8中第103-855位)，编码相同的hCD80-GPI融合蛋白。对照序列2与对照序列1的相似性为约75％。

全合成对照序列，并在两端引入酶切位点。

2.表达质粒的构建及高表达工程细胞的获得

用全合成方法获得优化的hCD80-GPI融合蛋白基因，按照该优化合成的序列，设计并合成PCR引物(见表1)。均在上游引物引入EcoRI酶切位点，下游引物引入NotI位点。

以全合成的优化或未优化型的hCD80-GPI融合蛋白基因为模板，通过PCR扩增融合蛋白的编码序列，用EcoR I和Not I双酶切后扩增产物后，插入相同酶酶切后的pPIC9K质粒(可购自Invitrogen公司)，取酶切鉴定以及测序正确的构建质粒，获得质粒pPIC9K-hCD80-GPI(optimal)。用类似方法，获得质粒pPIC9K-hCD80-GPI-1(control1)、pPIC9K-hCD80-GPI-2(control2)。

按照Invitrogen公司操作手册，质粒经酚/氯仿抽提后浓缩至10ul.将80ul毕赤酵母感受态细胞和10ul浓缩后的质粒混匀后加到预冷的电击杯中。电击杯放置冰上5min，设置参数1500V/5ms电击，结束后加入1ml 1M山梨醇溶液至电击杯中。混匀后涂布至MD筛选平板上，置于28度培养箱培养3-5天。

待酵母单克隆长出后，挑取一定数量的单克隆按照顺序转接到另一块MD筛选培养基上，置于28度培养箱培养3天。

从MD平板上挑取单克隆，按照下列方法诱导，并用空质粒转化毕赤酵母KM71(可购自Invitrogen公司)作为胞内表达的背景对照。

1挑取单克隆，接种至50ml BMGY中，(250ml尖底离心管)，28度，250-300rpm，摇至OD600＝2-6(对数生长，大约16-18小时)。

2室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至用1/5-1/10原培养基体积的BMMY重悬细胞。

3在25ml摇瓶中加入上述培养物10ml，加盖四层灭菌纱布，放入摇床继续生长。

4每24小时，加甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。

5诱导72小时后，离心收集酵母细胞。储存于-80度，直至开始检测。

6用Westernblot方法来分析酵母细胞胞内目的蛋白表达情况。

诱导结束后，采用Westernblot检测目的蛋白的表达。

不同优化序列和天然序列的诱导筛选结果表明，SEQ ID NO:1序列的表达量最高。

实施例2 hCD80-GPI融合蛋白的发酵表达

挑选实施例1中的不同毕赤酵母克隆，按Invitrogen的毕赤酵母发酵手册进行20升发酵罐的发酵。

结果表明：在毕赤酵母中采用未优化对照序列1(SEQ ID NO:7)时，hCD80-GPI融合蛋白表达量极低(为约0.03g/L发酵液)；采用对照序列2时(SEQ ID NO:8)时，表达量很低(为约0.06g/L发酵液)。与之相反，采用SEQ ID NO:1所示的优化序列时，表达的hCD80-GPI融合蛋白表达量最高(为约0.60g/L发酵液)。

实施例3 hCD80-GPI融合蛋白的生产和鉴定

1.酵母高表达菌株筛选表达

将测序正确的酵母表达载体pPIC9K-hCD80-GPI(optimal)导入毕赤酵母GS115菌株，经MD板营养筛选，和4mg/mLG418⁺抗性筛选得到含hCD80-GPI融合基因的高拷贝的酵母菌株筛选高表达菌株。

如图7的蛋白电泳所示：1为蛋白标志，2-7为筛选的表达hCD80-GPI融合蛋白的GS115菌株上清，8为对照GS115菌株上清，可见2-7中6种GS115菌株与对照相比，在63kD处均有目的蛋白表达，其中的菌株6表达效果最佳，提示为hCD80-GPI融合蛋白的高表达菌株。

2.Western印迹法鉴定

使用常规的Western印迹法检定蛋白电泳筛选的筛选高表达菌株中的融合蛋白。

结果如图8所示。首先选择用抗GPI的多抗检定经筛选的GS115菌株6上清中表达的融合蛋白，发现在GS115/6菌株上清中在约63kD处有GPI成分。在GS115/6菌株上清中在63kD处有GPI成分；采用抗hCD80的多抗检定经筛选的GS115菌株6上清中表达的融合蛋白，发现在GS115/6菌株上清中在63kD处有hCD80成分，提示GS115菌株6表达上清中表达hCD80-GPI融合蛋白。

构建的pPIC9k-hCD80-GPI酵母表达载体表达的hCD80-GPI产物分子量为63kD，原始的hCD80-GPI融合蛋白的分子量为31kD，说明经酵母表达载体表达的hCD80--GPI融合蛋白经过了糖基化修饰，较之原核表达的融合蛋白可能具有更好的生物学活性，更接近于体内蛋白的生物学状态。

实施例4 hCD80-GPI融合蛋白的发酵与纯化

4.1 GS115/hCD80-GPI菌株的大规模发酵工艺

选择经筛选得到的高表达hCD80-GPI融合蛋白菌株进行大规模诱导发酵，选择经过筛选的GS115/hCD80-GPI，经BBROUN 30L发酵罐高密度发酵，主要采用50％甘油作为补料，维持pH值在5.5，发酵72h后，OD₆₀₀值达到800以上，此时停止甘油补料，改以含有PTM1的1％甲醇诱导表达72h，OD₆₀₀值均达到1400以上，停止发酵，连续流离心机6000rpm×60min离心收集，发酵菌株的湿重均可以达到8000g以上，发酵上清可以收集到15L。

4.2 GS115/hCD80-GPI融合蛋白的纯化制备

对经离心机收集的发酵上清予以超滤浓缩至1L，(体积尽可能少，以不出现沉淀为限)，采用50％浓度硫酸铵沉淀上清中的蛋白质，200mL PBS溶解蛋白沉淀后，先后以CM柱、Q柱层析和分子筛纯化获得合hCD80-GPI融合蛋白。

结果如图9所示。采用Lowery法测定纯化产品的蛋白浓度，hCD80-GPI浓度达到0.45mg/ml，体积150ml。3种融合蛋白内毒素含量均<0.03pg/μg蛋白。

4.3.hCD80-GPI的检定

采用Western印迹法验证制备的融合蛋白的性质，证实了融合蛋白制备正确。结果见图10所示。图10是hCD80-GPI融合蛋白的Western印迹法检定(分别采用抗GPI抗体和抗hCD80抗体检测融合蛋白)。

然后，采用C-18柱，行反相层析测定制备hCD80-GPI融合蛋白的纯度，结果如图11所示。可见hCD80-GPI融合蛋白的纯度在99％以上。

上述结果表明，本发明制备了符合进行生物学功能检测和体内实验的hCD80-GPI融合蛋白。建立的酵母表达制备hCD80-GPI融合蛋白体系能够应用于大规模生产，远远优于原核表达等其他方式。

实施例5 hCD80-GPI融合蛋白锚定肿瘤细胞的能力

在本实施例中，使用hCD80-GPI锚定CT26瘤苗细胞，选择1×10⁶个CT26细胞/ml，选择制备的hCD80-GPI融合蛋白与CT26细胞共同孵育0h、4h、8h，行流式细胞仪检测。

结果如图12所示。hCD80-GPI迅速锚定CT26细胞，锚定率达到99％；4h后检测发现hCD80-GPI锚定CT26细胞率达到91.8％；经过8h后，hCD80-GPI仍然能够锚定86.1％的CT26细胞(见图12)。这表明，本发明的hCD80-GPI融合蛋白具有优良的锚定能力。

实施例6 hCD80-GPI融合蛋白体外抗肿瘤效应

在本实施例中，以丝裂霉素灭活(终浓度为100ug/ml，37℃，5％CO₂孵育1h)CT26/hCD80-GPI制备减毒灭活的肿瘤瘤苗。行CT26/hCD80-GPI瘤苗的体外效应检定：选择瘤苗细胞为刺激细胞，增殖细胞为小鼠脾脏淋巴细胞，2种细胞按1∶4、1∶20、1∶100比例培养，对照组不加刺激细胞。置24孔板中常规培养3后，[³H]摄入法检测反应强度，ELISA检测上清液中IL-2、TNF-α和IFN-γ的含量。

结果如图13所示，酵母表达的hCD80-GPI修饰的CT26瘤苗细胞能够有效激发小鼠脾细胞具有很好的活化作用。hCD80-GPI锚定修饰后的CT26瘤苗细胞能够有效激发小鼠脾脏T细胞的大量增殖，而且酵母表达的hCD80-GPI(hCD80-GPI(G))的效能与真核载体表达的hCD80-GPI(E)相同。

此外，如图14所示，能分泌大量的hCD80-GPI双重修饰瘤苗能刺激小鼠脾细胞分泌细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ因子等。

实施例7.hCD80-GPI融合蛋白体内抗肿瘤效应

选择hCD80-GPI(20ug/ml)锚定小鼠CT26细胞经丝裂霉素灭活制备CT26/hCD80-GPI瘤苗，1×10⁶个瘤苗细胞/100ul，注射入C57小鼠右后肢背部皮下，观察荷瘤小鼠生存率，分析荷瘤小鼠肿瘤生长情况。

结果如图15和图16所示，研究发现经hCD80-GPI锚定修饰的荷瘤小鼠体积最小，肿瘤生长受到显著抑制，荷瘤小鼠生存期最长；且酵母表达的hCD80-GPI融合蛋白的抑瘤效果与真核表达的hCD80-GPI融合蛋白的抑瘤效果相同无差异。

实施例8.hCD80-GPI融合蛋白体内抗肿瘤机制研究

荷瘤小鼠脾细胞的CTL活性检测：荷瘤25天，取各实验组(未处理组、PBS对照组、CT26/hCD80-TM瘤苗组、CT26/hCD80-GPI(G)瘤苗组、CT26/hCD80-GPI(E)瘤苗组)3只小鼠，制备脾细胞，与CT26细胞共孵育7d，诱导CTL产生，LDH法测定其CTL活性。

荷瘤小鼠NK细胞的活性检测：采用LDH法测定，靶细胞为YAC细胞，取各实验组(未处理组、PBS对照组、CT26/hCD80-TM瘤苗组、CT26/hCD80-GPI(G)瘤苗组、CT26/hCD80-GPI(E)瘤苗组)3只小鼠，制备脾细胞，与靶细胞共孵育，测定其NK活性。

结果如图17和图18所示，hCD80-GPI修饰的CT26瘤苗能够能高效激发荷瘤小鼠体内NK、CTL活性，且酵母表达的hCD80-GPI融合蛋白的抑瘤效果与真核表达的融合蛋白的效果相同。

讨论

酵母表达系统结合了原核和真核蛋白表达系统的优点，既是真核蛋白质表达和分析的有力工具，拥有转录后加工修饰功能；又是大规模生产重组真核蛋白的最佳模式，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质。与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比，酵母表达系统操作简单，成本低廉，可大规模进行发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。较之原核表达体系，酵母表达系统表达能力强，具有蛋白质折叠、和糖链修饰功能，可以有效保证目的蛋白的生物学活性；而且能分泌目的基因产物导培养液中，有利于纯化等。

在本发明中，构建了特别适合酵母表达的优化的hCD80-GPI融合基因和相应表达载体，得到了高表达hCD80-GPI融合蛋白的GS115菌株，并且建立了大规模酵母发酵纯化制备体系，制备了大量的适合生物学功能应用的hCD80-GPI融合蛋白。试验结果表明，检定hCD80-GPI融合蛋白可以有效锚定在在肿瘤细胞上，体内外效应和机制研究证明hCD80-GPI融合蛋白修饰的CT26瘤苗具有优良的抗肿瘤效应。

本发明的酵母表达的hCD80-GPI融合蛋白具有优良的生物学活性，其活性显著高于原核表达的hCD80-TM融合蛋白。本发明开发的优化的酵母体系的大规模制备工艺，有助于融合蛋白的临床应用，具有开发和大规模应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种编码hCD80-GPI融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码hCD80-GPI融合蛋白的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的hCD80-GPI融合蛋白编码区与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列有≥95％相同性。

2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，该编码hCD80-GPI融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体或者基因组中整合有权利要求1所述的hCD80-GPI融合蛋白的编码序列。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，它是毕赤酵母(Pichia Pastoris)。

6.一种生产hCD80-GPI融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在适合表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达hCD80-GPI融合蛋白，其中所述的宿主细胞是毕赤酵母；

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的hCD80-GPI融合蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的hCD80-GPI融合蛋白的编码序列。

8.一种hCD80-GPI融合蛋白，其特征在于，所述的hCD80-GPI融合蛋白具有式I结构：

A-B-C (I)

式中，

A为hCD80元件，其序列如SEQ ID NO.:2中第1-208位；

B为无或连接肽；

C为GPI元件，其序列如SEQ ID NO.:2中第209-251位；

各“-”为肽键；

并且，所述hCD80-GPI融合蛋白是酵母表达的重组蛋白。

9.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求8所述的hCD80-GPI融合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。

10.如权利要求8所述的hCD80-GPI融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物组合物。