KR102664453B1 - Hla-dr car-t 조성물 및 그를 제조하고 사용하는 방법 - Google Patents

Hla-dr car-t 조성물 및 그를 제조하고 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

HLA-DR에 관한 CAR-T 조성물이 제공된다. 특정의 제공된 HLA-DR CAR 조성물은 대상체의 HLA-DR의 다형성 영역에 대해 낮은 친화도를 나타낸다. HLA-DR CAR-T와 관련된 다양한 시험관내 및 생체내 방법 및 시약이 또한 제공된다. 본원에 기재된 방법은, 예를 들어, HLA-DR 결합의 특징화, T-세포의 증식 뿐만 아니라 본원에 제공된 HLA-DR CAR-T 조성물을 사용한 암의 예방 및/또는 치유적 치료를 포함할 수 있다.

Description

HLA-DR CAR-T 조성물 및 그를 제조하고 사용하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 2월 21일에 출원된 미국 특허 출원 번호 62/461,632를 우선권 주장하며, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
암은 여전히 전 세계에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 최근 통계에 따르면 세계 인구의 13%가 암으로 사망하는 것으로 보고되어 있다. 국제 암 연구소 (IARC)의 추정에 따르면, 2012년에 전 세계적으로 1410만 건의 새로운 암 사례와 820만 건의 암 사망이 발생하였다. 2030년까지, 인구 증가와 노령화 및 위험 요소, 예컨대 흡연에 대한 노출, 건강에 해로운 식이 및 신체 활동 부족으로 인해 전 세계적으로 새로운 암 사례가 2170만 건으로 늘어나고 1300만 건의 암 사망이 발생할 것으로 예상된다. 추가로, 암 치료를 위한 통증 및 의료 비용은 암 환자와 그의 가족 둘 다에게 삶의 질을 저하시킨다.
키메라 항원 수용체로 조작된 T 세포 (CAR-T)는 암과 같은 질환을 치료하기 위한 큰 치료적 잠재력을 갖고 있다. CAR-T 치료제는 T 세포에 강력한 표적 친화도 및 시그널링 기능을 부여한다. 그러나, CAR-T 요법의 인상적인 효능은 종종 심각한 부작용, 예컨대 시토카인 방출 증후군 (CRS)을 동반한다. 따라서 감소된 부작용을 갖는 CAR-T 치료제 및 전략을 개발할 필요성이 여전히 충족되지 않고 있다.
본 개시내용은 특히, HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 조작된 T 세포를 제공한다. 본 개시내용은 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR (HLA-DR CAR)이, 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 결합 도메인의 결합 특징에 근거하여 선택, 조작 및/또는 최적화될 수 있다는 통찰력을 제공한다. 일부 실시양태에서, HLA-DR 결합 도메인은 HLA-DR의 다형성 에피토프에 특이적이다. 본 개시내용은 대상체로부터의 세포 (예를 들어, T 세포)와 낮은 친화도로 결합하는 HLA-DR CAR이 특정 질환 및/또는 장애를 치료하는데 유효한 요법을 제공할 수 있다는 인식을 포괄한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 T 세포를 제공하며, 여기서 CAR은 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 T 세포는 대상체에 대해 자가이고, 여기서 HLA-DR 항원 결합 도메인은 대상체로부터의 T 세포와 낮은 친화도로 결합한다. 일부 실시양태에서, HLA-DR 항원 결합 도메인은 MVR-scFv 또는 그의 변이체이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 본 개시내용의 HLA-DR CAR T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) HLA-DR 항원 결합 도메인을 수득하며, 여기서 HLA-DR 항원 결합 도메인은 대상체로부터의 HLA-DR과 낮은 친화도로 결합하는 것인 단계; 및 (b) HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 대상체로부터 수득된 T 세포에서 발현하고, 그에 의해 자가 조작된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 자가 조작된 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계; 및 결합도가 역치 미만인 경우에, HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 대상체로부터의 T 세포를 조작하는 단계를 포함하는, 자가 조작된 T 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 자가 조작된 T 세포는 적절한 자극 하의 12일의 배양 동안 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 또는 그 초과로 확장된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포와 역치 미만의 결합도로 결합하는 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 자가 조작된 T 세포는 적절한 자극 하의 12일의 배양 동안 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 또는 그 초과로 확장된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포와 역치 미만의 결합도로 결합하는 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 자가 조작된 T 세포는 적절한 자극 하의 12일의 배양 동안 적어도 20배 확장된다.
일부 실시양태에서, 적절한 자극은 T 세포를 CD3-특이적 항체 및/또는 HLA-DR-발현 세포에 노출시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도의 분석은 결합 친화도 (예를 들어, KD)의 직접적인 측정이다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도의 분석은 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 기능적 결합력의 척도이다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력은 T-세포 반응을 촉발시키는데 필요한 항원 용량과 반비례한다. 일부 실시양태에서, T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 기능적 결합력의 척도는 T 세포 기능, 예컨대, 예를 들어, IFN-γ 생산, 세포독성 활성 (표적 세포를 용해시킬 수 있는 능력), 또는 증식의 생체외 정량화를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 기능적 결합력의 척도는 T 세포의 최대 절반 반응 (EC50)을 유도시키는데 필요한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 농도를 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 방법은 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 HLA-DR CAR을 발현하는 자가 조작된 T 세포의 제조 및/또는 생산을 포함한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR 항원 결합 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 2-4 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR 서열을 포함하는 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 6-8 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR 서열을 포함하는 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR 항원 결합 도메인은 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR1; 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR2; 및 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR1; 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR2; 및 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR 항원 결합 도메인은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 i) 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR1; 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR2; 및 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR1; 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR2; 및 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 HLA-DR 항원 결합 도메인; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 HLA-DR 항원 결합 도메인과 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 i) 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 HLA-DR 항원 결합 도메인; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 HLA-DR 항원 결합 도메인과 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 T 세포 수용체-ζ (TCR-ζ)의 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체-ζ (TCR-ζ)는 CD3 도메인 (예를 들어, CD3제타 도메인)이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 CD8α 막횡단 도메인 및/또는 4-1BB 시그널링 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 B 세포에 대한 사멸 효율이 EBV LCL에 대한 T 세포의 사멸 효율보다 2배 또는 3배 더 낮다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 HLA-DR CAR T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) HLA-DR 항원 결합 도메인을 수득하며, 여기서 HLA-DR 항원 결합 도메인은 대상체로부터의 HLA-DR과 낮은 친화도로 결합하는 것인 단계, 및 (b) HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 대상체로부터 수득된 T 세포에서 발현하고, 그에 의해 자가 조작된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하고, 자가 조작된 T 세포를 시험관내에서 적어도 8일, 9일, 10일, 11일, 또는 12일 동안 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 자가 조작된 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계; 및 결합도가 역치 미만인 경우에, HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 대상체로부터의 T 세포를 조작하는 단계를 포함하고, 자가 조작된 T 세포를 시험관내에서 적어도 8일, 9일, 10일, 11일, 또는 12일 동안 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 자가 조작된 T 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 자가 조작된 T 세포는 적절한 자극 하의 12일의 배양 동안 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 또는 그 초과로 확장된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포와 역치 미만의 결합도로 결합하는 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 자가 조작된 T 세포는 적절한 자극 하의 12일의 배양 동안 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 또는 그 초과로 확장된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포와 역치 미만의 결합도로 결합하는 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 자가 조작된 T 세포는 적절한 자극 하의 12일의 배양 동안 적어도 20배 확장된다. 일부 실시양태에서, 적절한 자극은 T 세포를 CD3-특이적 항체 및/또는 HLA-DR-발현 세포에 노출시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제공된 방법에서의 배양하는 단계는 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 CAR의 감소된 표면 발현을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산한다.
일부 실시양태에서, 상기 제공된 방법에서의 배양하는 단계는 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 정상 B 세포에 대한 감소된 독성을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산한다.
일부 실시양태에서, 상기 제공된 방법에서의 배양하는 단계는 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 비-악성 세포보다 악성 세포에 대한 증강된 선택성을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 맥락에서 자가 조작된 T 세포는 대상체로부터 정상 B 세포로의 상기 조작된 T 세포의 과립 전달보다 적어도 2배 더 큰 EBV LCL로의 과립 전달을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 의해 제조된 자가 조작된 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 HLA-DR 항원을 발현한다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 대상체로부터의 비-암 세포에 대비하여 HLA-DR 항원의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 대상체로부터의 비-암 세포에 대비하여 HLA-DR 항원의 발현이 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 6배 더 높다. 일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법으로 치료하는데 적합한 암은 대상체로부터의 동일한 유형의 정상 세포에 대비하여 HLA-DR 항원의 발현이 적어도 2배 더 높다.
일부 실시양태에서, 상기 제공된 방법은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭암, 위장암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 타액선암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 및 전립선암으로부터 선택된 암을 치료하거나 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 혈액암은 B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포-여포성 림프종, 거대 세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제공된 치료 방법은 대상체가 이온화 방사선, 화학요법제, 항체 작용제, 및 세포-기반 요법으로부터 선택된 하나 이상의 부가적인 항암 요법을 투여받은 적이 있거나 또는 투여받을 예정이어서, 대상체가 둘 다를 이용한 치료를 받는 것들을 포함할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 T 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 T 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체의 HLA-DR 항원에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 T 세포의 결합력의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계, 및 결합력이 역치 미만인 경우에, 상기 조작된 T 세포를 포함하는 치료 제제를 생산하는 단계를 포함하는, 치료 제제를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 HLA-DR 항원에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 T 세포의 결합력의 분석은 기능적 결합력의 분석이다. 일부 실시양태에서, T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 기능적 결합력의 척도는 T 세포 기능, 예컨대, 예를 들어, IFN-γ 생산, 세포독성 활성 (표적 세포를 용해시킬 수 있는 능력), 또는 증식의 생체외 정량화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료 제제를 생산하는 방법은 대상체의 HLA-DR 항원에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 T 세포의 기능적 결합력의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계, 및 기능적 결합력이 역치 미만인 경우에, 상기 조작된 T 세포를 포함하는 치료 제제를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력의 척도는 적절한 자극 하에 적어도 8일, 10일, 12일 또는 14일 동안 배양될 때 조작된 T 세포의 증식이다. 일부 실시양태에서, 적절한 자극은 T 세포를 CD3-특이적 항체 및/또는 HLA-DR-발현 세포에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력의 역치는 적어도 15배, 20배, 25배 증식이다.
일부 실시양태에서, 치료 제제를 생산하는 방법은 대상체의 HLA-DR 항원에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 T 세포의 기능적 결합력의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계, 및 기능적 결합력이 역치 미만인 경우에, 상기 조작된 T 세포를 포함하는 치료 제제를 생산하는 단계를 포함하며, 여기서 역치는 CD3-특이적 항체 및/또는 HLA-DR-발현 세포와 함께 적어도 12일 동안 배양될 때 조작된 T 세포의 적어도 15배, 20배, 25배 증식이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암이 발생하였거나 또는 암이 발생할 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암이 발생하였거나 또는 암이 발생할 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 증강을 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 증강을 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암이 발생하였거나 또는 암이 발생할 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에서 치료하는데 적합한 암은, 예를 들어, 혈액암을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈액암은 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 암은 B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포-여포성 림프종, 거대 세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 중 하나 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 부가적인 항암 요법을 투여받은 적이 있거나 또는 투여받을 예정인 대상체에게 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이온화 방사선, 화학요법제, 항체 작용제, 및 세포-기반 요법 중 하나 이상을 받은 적이 있거나 또는 투여받을 예정인 대상체에게 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하여, 대상체가 둘 다를 이용한 치료를 받는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 부가적인 항암 요법을 투여받은 적이 있거나 또는 투여받을 예정인 대상체에게 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이온화 방사선, 화학요법제, 항체 작용제, 및 세포-기반 요법 중 하나 이상을 투여받은 적이 있거나 또는 투여받을 예정인 대상체에게 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하여, 대상체가 둘 다를 이용한 치료를 받는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포의 치료상 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 적어도 106개, 적어도 107개, 적어도 108개, 적어도 109개, 적어도 1010개, 또는 1010개 초과하여 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포의 치료상 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포를 적어도 106개, 적어도 107개, 적어도 108개, 적어도 109개, 적어도 1010개, 또는 1010개 초과하여 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포이다.
또한 특히, 본원에 기재된 바와 같은 HLA-DR CAR 및/또는 그를 포함하는 조성물을 특징화하기 위한 기술이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 T 세포에 대한 HLA-DR CAR의 결합도를 특징화하기 위한 방법이 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 T 세포 및/또는 그를 포함하는 조성물에 대한 HLA-DR CAR의 결합도를 특징화하기 위한 방법이 제공되며, 이는, 예를 들어, ELISA, 유동 세포계수법 (예를 들어, FAC), 면역 조직 화학, 및/또는 비아코어(Biacore) 결합 검정을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포 및/또는 그를 함유하는 조성물을 제조 또는 제작하는 것과 관련된 다양한 기술을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포 및/또는 그를 함유하는 조성물을 제조 또는 제작하는 것과 관련된 다양한 기술을 제공한다.
본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "약" 및 "대략"은 등가인 것으로서 사용된다. 본원의 간행물, 특허 또는 특허 출원에 대한 임의의 인용은 그 전문이 참조로 포함된다. 본 출원에서 약/대략의 유무에 관계없이 사용되는 임의의 숫자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지되는 임의의 정상적인 변동을 포함하도록 의도된다.
본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 본 발명의 실시양태를 나타내는 상세한 설명은 제한적인 것이 아니라 단지 예시적인 방식으로 제공된다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.
하기 도면으로 구성된 본원에 포함된 도면은 단지 예시를 위한 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본 개시내용의 상기 및 다른 목적, 측면, 특색 및 이점은 첨부 도면과 연계해서 기재된 하기 설명을 참조함으로써 보다 명백해지고 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 (a) scFv 항원 결합 도메인을 갖는 예시적인 일반적 CAR 구축물 및 (b) 자가 CAR T 세포 요법에 수반되는 대단히 중요한 단계를 갖는 일반화된 방법의 개략도를 도시한다.
도 2a는 HLA-DR의 다형성 영역의 서열 정렬을 도시하고, 예시적인 HLA-DR 항체 작용제인 MVR에 대한 에피토프를 나타낸다.
도 2b는 상이한 대상체로부터의 PBMC 세포에 대한 예시적인 MVR 항체 작용제에 대한 결합 패턴을 도시하며, 이는 FLAG:APC 항체 및 유동 세포계수법을 이용하여 CD19:PE 또는 HLA-DR:PE-Cy5 항체 및 MVR-scFv로 공동 염색함으로써 결정된 바와 같이, 강력한 결합 친화도 (DRstr), 중간 정도의 결합 친화도 (DRint) 및 약한 결합 친화도 (DRweak)를 갖는 것으로서 분류되었다.
도 3a는 항-CD19 또는 예시적인 HLA-DR 항체 작용제인 MVR을 사용하여 설계된 차세대 CAR 구축을 도시한다.
도 3b는 CAR 단백질을 측정하기 위한 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가된 바와 같이, 3가지 세포 세트: 비-형질도입된 (NT) T, CD19 CAR T, 및 DRweakMVR CAR T 세포에서의 단백질 발현을 도시한다. 상부 밴드는 CAR 단백질이고 하부 밴드는 β-액틴이다. 패널 a (상단)는 웨스턴 블롯의 잘린 버전이며, 참조를 위해 바로 아래 (패널 b)에 전체 블롯이 제시된다.
도 4a는 DR str , DR int , 또는 DR weak PBMC의 활성화 후 NT T, CD19 CAR T, 및 HLA-DR CAR T 세포의 성장 (좌측 패널) 및 생육력 (우측 패널)을 도시한다. 비-형질도입된 (NT) T, CD19 CAR T, 및 MVR CAR T 세포의 세포 카운트에 있어서의 배수 증가 (제0일 계수치 대비) 및 생육력을 표시된 시점에 측정하였다. CD19 CAR T 세포와 MVR CAR T 세포 둘 다는 제2일에 형질도입되었다.
도 4b는 DR str , DR int , 및 DR weak PBMC로부터 생성된 NT T, CD19 CAR T, 및 MVR CAR T 세포 상에서의 CAR의 발현을 도시한다. 형질도입 후 13일에 세포를 CD8 및 CAR 발현에 관하여 분석하였다.
도 5a는 제15일에 CAR 및 고갈 마커 발현 수준의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. 도 5b는 도 5a에서 측정된 다수의 고갈 마커 (즉, LAG-3, Tim-3, CTLA-4, 및 PD-1) 발현을 수반한 T 세포의 빈도의 예시적인 파이 차트 데이터를 도시한다. 각각의 CAR T 세포는 CAR-양성 세포 상에서 게이팅함으로써 분석되었다. 각각의 색상의 우측 숫자는 고갈 마커의 다중도를 표시한다.
도 6은 (a) DRweak-EBV-LCL 또는 DRstr-EBV-LCL에 의한 활성화 후 측정된 각각의 CAR T 세포의 증식 능력을 도시한다. CFSE-표지된 T 세포를 3:1의 E:T 비 하에 5일 동안 각각의 EBV-LCL과 함께 공동 인큐베이션하고 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. (b) 다수의 마커 (즉, IFN-γ, TNF, IL-2, MIP-1β, 및 CD107a)를 수반한 T 세포의 빈도의 파이 차트 데이터. 각각의 색상의 우측 숫자는 마커의 다중도를 표시한다. (c) EBV-LCL에 대항한 각각의 CAR T 세포의 사멸 효능. DRweak-EBV-LCL 또는 DRstr-EBV-LCL 중 하나를 표시된 E:T 비 하에 4시간 동안 각각의 T 세포와 함께 공동 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 유도된 세포독성을 측정하여 사멸 효능을 계산하였다. 각각의 점과 오류 막대는 평균 및 SD를 표시한다. 기술적 이중으로 수행되었다. 2가지 독립적인 실험을 나타낸다. (d) 시험관내 표적-맞춤 검정에 의한 각각의 CAR T 세포의 표적 특이적 사멸의 평가. DRweak 또는 DRstr 공여자 중 하나로부터의 EBV-LCL 및 PBMC를 6:1:1의 T 세포:EBV-LCL:PBMC 비 하에 4시간 동안 각각의 CAR T 세포와 함께 공동 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 잔여 생육성 세포의 수를 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 각각의 점과 오류 막대는 평균 및 SD를 표시한다. 기술적 삼중으로 수행되었다. 2가지 독립적인 실험을 나타낸다.
도 7a는 CD19 CAR T 세포와 MVR CAR T 세포 간의 표면 CAR 발현에 있어서의 차이를 도시한다. DR weak MVR CAR T 세포에 의해 발현된 CAR의 평균 형광 강도 (MFI)를 CD19 CAR T 세포의 것으로 나누었다. CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 별도로 분석하였다. 별도로 생성된 CAR T 세포 제제로부터의 유동 세포계수 데이터를 사용하였다 (n = 8). 수평선은 평균을 표시한다. 8가지 독립적인 실험을 요약한다.
도 7b는 표면 CAR의 발현에 있어서의 렌티바이러스 역가 의존적 변화를 도시한다. 293T 세포 및 DR weak T 세포를 다양한 감염 다중도 하에 각각의 CAR 벡터로 형질도입하고, 유동 세포계수법에 의해 CAR의 MFI에 관하여 분석하였다. 293T 세포주 및 DR weak T 세포를 형질도입 후 5일 및 13일에 각각 분석하였다.
도 7c는 CD19 CAR 또는 MVR CAR 벡터로 형질도입된 DR weak T 세포를 형질도입 후 표시된 시점에서 CAR 발현에 관하여 분석한다는 것을 도시한다. 세포를 CD8 및 CAR 발현에 관하여 분석하였다.
도 7d는 qPCR 및 웨스턴 블롯팅 각각에 의해 mRNA (좌측) 및 단백질 (우측) 수준 하에 분석된 CAR 발현을 도시한다. 비-형질도입된 (NT) T, CD19 CAR T, 및 DR weak MVR CAR T 세포를 대상으로 CD4-음성 분류를 수행하여, CD4 마이크로비드 (130-045-101, 밀테니 바이오텍, 인크.(Miltenyi Biotec, Inc.))를 사용하여 CD8+ T 세포를 강화시키고, 이를 분석에 사용하였다. n = 3 생물학적 복제물. 평균 ± s.e.m. 비-대응표본 양측 t-검정: ns, 유의하지 않음; ***, p < 0.001.
도 8은 NT T, CD19 CAR T, 및 DR weak MVR CAR T 세포의 면역형광 염색을 도시한다.
도 9a는 형질도입 후 제2일 또는 제12일 (각각 D2 또는 D12)에 DR weak MVR CAR T 세포의 표적 특이적 사멸을 도시한다. DR weak EBV LCL을 D2 또는 D12 MVR CAR T 세포와 함께 공동 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 생육성 세포의 수를 결정하고 사멸 효능을 계산하였다.
도 9b는 시험관내 표적-맞춤 사멸 검정으로 평가된 각각의 CAR T 세포 유형에 의한 표적 특이적 사멸을 도시한다. DR weak 또는 DR str HLA-DRB1 대립유전자 중 하나를 수반하는 EBV LCL 및 말초 혈액 단핵 세포를 NT T, CD19 CAR T, 또는 DR weak MVR CAR T 세포와 함께 공동 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 생육성 세포의 수를 결정하고 사멸 효능을 계산하였다.
도 9c는 DRweak EBV LCL 또는 DRstr EBV LCL에 의한 활성화 후 측정된 T 세포의 증식 능력을 도시한다.
도 9d는 LPS-처리된 B 세포에서의 HLA-DR 발현을 도시한다.
도 9e는 형질도입 후 제2일 또는 제12일에 DR weak MVR CAR T 세포 (비조율된 MVR CAR T 또는 MVR CAR T로서 각각 지칭됨)의 표적 특이적 사멸을 도시한다. DR weak B 세포, DR str B 세포, 및 3일 동안 리포폴리사카라이드로 처리된 DR weak B 세포를 비조율된 MVR CAR T 또는 MVR CAR T 세포와 함께 공동 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 생육성 세포의 수를 결정하고 사멸 효능을 계산하였다.
도 9f는 T 세포와의 접촉 후 전달된 과립을 함유하는 B 세포 및 EBV LCL의 분율을 도시한다. NT, 비-형질도입됨.
도 9g는 T 세포와의 접촉 후 아폽토시스성 EBV LCL의 시간 경과 분석을 도시한다. 아폽토시스 (적색)를 진행하는 EBV LCL (청색)은 마젠타 색상을 검출함으로써 확인되었다 (스케일 바는 250 μm를 표시함).
도 9h는 표시된 시점에서의 아폽토시스성 EBV LCL의 분율을 도시한다. 각각의 샘플의 3가지 상이한 영역을 분석하였다.
도 9i는 B 세포 및 EBV-LCL 표면 상에서 CD19 및 HLA-DR의 정량적 분자 분석을 도시한다. EBV-형질전환 전 및 후 CD19 및 HLA-DR 카운트 상의 변화를 퀀텀 심플리 세포성 마이크로스피어 (뱅스 래보러토리즈, 인크.(Bangs Laboratories, Inc.))에 의해 측정하였다. 연결된 선에 의해 쌍을 이루는 도트는 동일한 공여자를 표시한다 (n = 6). 적색 및 청색 도트는 각각, 본 연구에 사용된 DRlow 및 DRhigh 공여자를 표시한다.
도 9j, 도 9k 및 도 9l은 예시된 과립 전달 검정의 세부사항을 도시한다.
도 10은 (a) 본원에 예시된 CAR T 세포의 다기능성을 평가하기 위한 게이팅 전략을 도시한다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 카르복시-플루오레세인 숙신이미딜에스테르 (CFSE)-음성/CD4-양성 세포 및 CFSE-음성/CD4-음성 세포 상에서 각각 게이팅함으로써 분석하였다. 이소형 대조군 항체로 염색된 T 세포의 발현에 대비하여 각각의 시토카인의 발현을 결정하였다. (b) 상세한 다기능성 분석. 시토카인-발현 세포의 조합물을 불린(Boolean) 게이팅에 의해 분석하였다.
도 11은 본 개시내용에 예시된 특정 HLA-DR CAR T 세포 및 표적 세포의 예시적인 도식적 요약을 도시한다.
도 12a는 생체내에서 EBV LCL 억제를 평가하기 위한 절차의 개략도를 도시한다.
도 12b는 비-형질도입된 (NT) T, CD19 CAR T, 또는 DR weak MVR CAR T 세포를 주입한 후 DR weak EBV LCL 억제의 효능을 평가하기 위한 예시적인 루시페라제 활성 검정로부터의 마우스의 영상을 도시한다. 루시페라제-표지된 DR weak EBV LCL로 이식된 마우스에서의 루시페라제 활성을 T 세포 주입 후 0, 7, 14, 21, 및 28일에 측정하였다.
도 12c는 생체내 표적-맞춤 사멸 검정을 위한 절차의 개략도를 도시한다. DR weak B 세포/DR weak EBV LCL을 이종 이식한 다음, NT T, CD19 CAR T, 또는 DR weak MVR CAR T 세포를 주입하고, 연속해서 효능 분석을 수행하였다.
도 12d는 14일 동안 관찰된 각각의 T 세포를 주입한 후 EBV LCL 억제의 효능을 도시한다. DR weak B 세포 및 루시페라제-표지된 DR weak EBV LCL로 이식된 마우스에서의 루시페라제 활성을 T 세포 주입 후 -1, 7, 및 14일에 측정하였다.
도 12e는 T 세포 주입 후 -1, 2, 및 7일에 T 세포-주입된 마우스에서의 B 세포 지속성 (상단 패널)을 도시한다. 각각의 마우스의 말초 혈액을 항체의 패널로 염색하고 분석하며, T 세포 주입 후 -1, 2, 및 7일에 NT T, CD19 CAR T, 또는 DR weak MVR CAR T 세포가 주입된 마우스에서 혈장 IFN-γ 수준 (바닥 패널)을 측정하였다.
도 12f는 (a, b) 생체내 표적-맞춤 검정에서 B 세포의 분석을 위한 게이팅 전략을 도시한다. T 세포 주입 전날의 분석 결과가 패널 a에 제시되고, 주입 후 2일의 분석 결과가 패널 b에 제시된다. 전혈 세포를 CD3, CD20, CD45, 및 HLA-DR 발현에 관하여 분석하였다. B-세포 집단을 CD45-양성/CD3-음성/HLA-DR-양성/CD20-양성 세포 상에서 게이팅함으로써 결정하였다. DR weak B 세포 단독 (b 세포 단독) 또는 DR weak EBV LCL 단독 (종양 단독)으로 이식된 마우스를 또한 대조군으로서 평가하였다. (c)는 비-형질도입된 (NT) T, CD19 CAR T, 및 DR weak MVR CAR T 세포가 주입된 마우스에서 DR weak B 세포 상의 HLA-DR의 발현 수준을 도시한다. B 세포 상에서의 HLA-DR의 평균 형광 강도가 비교용으로 사용된다.
도 13은 널리 공지된 악성 B 세포주의 표면 상에서의 HLA-DR의 발현을 도시한다. 세포를 HLA-DR 발현에 관하여 분석하였고, 항체 결합 능력 (ABC)은 표적 분자 존재비의 지수이다. 상부 및 하부 점선은 EBV LCL 및 B 세포 각각의 평균 HLA-DR 수준을 표시한다.
도 14는 MVR CAR T 세포의 EBV LCL-특이적 사멸의 메카니즘의 개략도를 도시한다. MVR CAR로 형질도입된 T 세포는 그의 표면 상에 CAR을 발현하고, MVR CAR은 HLA-DR과 HLA-DR CAR (예를 들어, MVR CAR)의 상호작용에 의해 하향조절된다. 자동조율된 HLA-DR CAR (예를 들어, MVR CAR) T 세포는 HLA-DR에 탈감작되고 정상 B 세포에 대항하여 감소된 세포독성을 나타낸다. EBV-형질전환된 B 세포는 그의 표면 상의 HLA-DR을 상향조절하고, MVR CAR T 세포에 의해 사멸되기 쉽다.
도 15는 본 개시내용의 HLA-DR CAR T 세포의 특정 특성의 벤(Venn) 다이어그램을 도시한다.
특정 정의
하기 설명에서, 생화학, 분자 생물학 및 면역학에 사용되는 많은 용어가 광범위하게 활용된다. 이러한 용어가 제공하는 범주를 포함하여 본 명세서 및 청구범위에 대한 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다.
약 : 용어 "약"은 본원에서 특정 값과 관련하여 사용될 때, 언급된 값과 관련하여 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 문맥에 익숙한 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그 문맥에서 "약"에 의해 포함되는 관련 정도의 편차를 인지할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용어 "약"은 언급된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 이내의 값의 범위를 포괄할 수 있다.
투여 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여"는 전형적으로, 조성물이거나 또는 조성물에 포함된 작용제의 전달을 달성하기 위해 조성물을 대상체 또는 시스템에 투여하는 것을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 상황에서, 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 활용될 수 있는 각종 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 투여는 안구, 경구, 비경구, 국소 등일 수 있다. 일부 특정한 실시양태에서, 투여는 기관지 (예를 들어, 기관지 주입에 의함), 협측, 피부 (예를 들어, 진피에 대한 국소, 피내, 피부 사이, 경피 등 중 하나 이상일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있음), 장내, 동맥내, 피내, 위내, 수질내, 근육내, 비내, 복강내, 척추강내, 정맥내, 심실내, 특이적 기관 내 (예를 들어, 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관 (예를 들어, 기관내 주입), 질, 유리질 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 단지 단일 용량만을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 고정된 수의 용량의 적용을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 간헐적인 (예를 들어, 늦지 않게 시간 간격을 둔 복수개의 용량) 투약 및/또는 주기적 (예를 들어, 공통의 시간 간격을 둔 개별 용량) 투약을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투약 (예를 들어, 관류)을 수반할 수 있다.
친화도 : 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, "친화도"는 특정한 리간드가 그의 파트너와 결합하는 견고성의 척도이다. 친화도는 상이한 방식으로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화도는 정량적 검정에 의해 측정된다. 이러한 일부 실시양태에서, 결합 파트너 농도는 생리학적 조건을 모방하기 위해 리간드 농도를 초과하도록 고정될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시양태에서, 결합 파트너 농도 및/또는 리간드 농도는 다양할 수 있다. 이러한 일부 실시양태에서, 친화도는 비교가능한 조건 (예를 들어, 농도) 하에서 참조와 비교될 수 있다.
동물 : 본원에 사용된 바와 같이, 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 하나의 성별 및 임의의 발달 단계 하의 인간을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 임의의 발달 단계 하의 비-인간 동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유 동물 (예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 실시양태에서, 동물은 포유 동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전적으로 조작된 동물, 및/또는 클론일 수 있다.
항체 작용제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 작용제"는 특정한 항원과 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 이뮤노글로불린 구조적 요소를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포괄한다. 예시적인 항체 작용제는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 그의 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 관련 기술분야에 공지되는 바와 같이, 인간화되거나, 영장류화되거나, 키메라 등인 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 실시양태에서, 용어 "항체 작용제"는 대안적 제시에서 항체 구조적 및 기능적 특색을 활용하기 위한 관련 기술분야에 공지되거나 또는 개발된 구축물 또는 포맷 중 하나 이상을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 실시양태에서, 본 발명에 따라서 활용되는 항체 작용제는 무손상 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중특이적 또는 다중특이적 항체 (예를 들어, 자이바디스(Zybodies)® 등); 항체 단편, 예컨대 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 그의 단리된 CDR 또는 세트; 단일 쇄 Fv; 폴리펩티드-Fc 융합물; 단일 도메인 항체 (예를 들어, 샤크 단일 도메인 항체, 예컨대 IgNAR 또는 그의 단편); 카멜로이드 항체; 마스크된 항체 (예를 들어, 프로바디스(Probodies)®); 소형 모듈 면역 약제 ("SMIP™"); 단일 쇄 또는 탠덤 디아바디 (TandAb®); VHH; 안티칼린스(Anticalins)®; 나노바디(Nanobodies)® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®; 아비머스(Avimers)®; DART; TCR-유사 항체; 애드넥틴스(Adnectins)®; 애필린스(Affilins)®; 트랜스-바디스(Trans-bodies)®; 애피바디스(Affibodies)®; 트리머X(TrimerX)®; 마이크로단백질; 피노머스(Fynomers)®, 센티린스(Centyrins)®; 및 칼비토르(KALBITOR)®로부터 선택되나 이에 제한되지는 않는 포맷으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 자연적으로 생산된다면 가질 수 있는 공유 변형 (예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 공유 변형 (예를 들어, 글리칸, 페이로드 (예를 들어, 검출가능한 모이어티, 치료용 모이어티, 촉매 모이어티 등), 또는 다른 펜던트 기 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등)의 부착)을 함유할 수 있다. 많은 실시양태에서, 항체 작용제는 그의 아미노산 서열이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 상보성 결정 영역 (CDR)으로서 인식된 하나 이상의 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함하고; 일부 실시양태에서 항체 작용제는 그의 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견된 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR (예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 서열에 있어서 동일하거나 또는 참조 CDR과의 비교 시 1-5개의 아미노산 치환을 함유한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 참조 CDR과의 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은 참조 CDR과의 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은, 이와 같이 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과의 비교시 결실, 부가 또는 치환되지만, 상기 포함된 CDR이 달리 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은, 이와 같이 포함된 CDR 내의 1-5개의 아미노산이 참조 CDR과의 비교 시 결실, 부가 또는 치환되지만, 상기 포함된 CDR이 달리 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은, 이와 같이 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과의 비교 시 치환되지만, 상기 포함된 CDR이 달리 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 포함된 CDR은, 이와 같이 포함된 CDR 내의 1-5개의 아미노산이 참조 CDR과의 비교 시 결실, 부가 또는 치환되지만, 상기 포함된 CDR이 달리 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 그의 아미노산 서열이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이뮤노글로불린 가변 도메인으로서 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 이뮤노글로불린-결합 도메인과 상동이거나 또는 대체로 상동인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 단백질이다. 일부 실시양태에서, 항체 작용제는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 적어도 특정 부분이거나 또는 그를 포함한다.
항원 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 작용제와 결합하는 인자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원은 항체 작용제와 결합하고, 유기체에서 특정한 생리학적 반응을 유도할 수 있거나 또는 유도하지 않을 수 있다. 일반적으로, 항원은 임의의 화학적 실체, 예컨대, 예를 들어, 작은 분자, 핵산, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 중합체 (생물제제 중합체 [예를 들어, 핵산 및/또는 아미노산 중합체] 및 생물제제 중합체 이외의 중합체 [예를 들어, 핵산 또는 아미노산 중합체 이외의 중합체) 포함] 등일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리펩티드이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 글리칸이거나 또는 그를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일반적으로, 항원이 단리되거나 또는 순수한 형태로 제공될 수 있거나, 또는 대안적으로 조질 형태로 (예를 들어, 다른 물질과 함께, 예를 들어, 추출물, 예컨대 세포성 추출물로 또는 항원 함유 공급원의 다른 비교적 조질의 제제로) 제공될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일부 특정 실시양태에서, 항원은 세포성 환경에 존재한다 (예를 들어, 항원은 세포의 표면 상에 발현되거나 또는 세포 내에서 발현됨). 일부 실시양태에서, 항원은 재조합 항원이다.
항원 결합 도메인 : 본원에 사용된 바와 같이, 표적 모이어티 또는 실체와 특이적으로 결합하는 항체 작용제 또는 그의 부분을 지칭한다. 전형적으로, 항원 결합 도메인과 그의 표적 간의 상호작용은 비-공유적이다. 일부 실시양태에서, 표적 모이어티 또는 실체는, 예를 들어, 탄수화물, 지질, 핵산, 금속, 폴리펩티드, 또는 작은 분자를 포함한 임의의 화학적 부류의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 폴리펩티드 (또는 그의 복합체)일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 융합 폴리펩티드의 일부이다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 키메라 항원 수용체 (CAR)의 일부이다.
연관된 : 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것의 그것과 상관되는 경우에, 두 이벤트 또는 실체는 용어가 본원에 사용되는 바와 같이 서로 "연관"된다. 예를 들어, 특정한 실체 (예를 들어, 폴리펩티드, 유전적 시그니처, 대사 산물, 미생물 등)는 그의 존재, 수준 및/또는 형태가 특정한 질환, 장애 또는 병태 (예를 들어, 관련 집단에 전반에 걸친)의 발병률 및/또는 그에 대한 감수성과 상관이 있는 경우에, 이러한 질환, 장애 또는 병태와 연관되는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 실체는 그들이 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 경우에 서로 물리적으로 "연관"되어, 서로 물리적으로 근접해 있고/거나 물리적 근접을 유지하고 있다. 일부 실시양태에서, 서로 물리적으로 연관되는 2개 이상의 실체는 서로 공유적으로 연결되고; 일부 실시양태에서, 서로 물리적으로 연관되는 2개 이상의 실체는 서로 공유적으로 연결되지 않지만, 예를 들어 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자기성, 및 그의 조합을 통해 비-공유적으로 연관된다.
결합 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합"은 전형적으로, 2개 이상의 실체 간의 또는 2개 이상의 실체 중에서 비-공유적 연관을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. "직접적인" 결합은 실체 또는 모이어티 간의 물리적 접촉을 수반하고; 간접적인 결합은 하나 이상의 중간 실체와의 물리적 접촉을 통한 물리적 상호작용을 수반한다. 2개 이상의 실체 간의 결합은 전형적으로, 상호작용 실체 또는 모이어티가 단리되어 연구되거나 또는 보다 복잡한 시스템의 상황에서 (예를 들어, 담체 실체와 공유적으로 또는 다른 방식으로 연관되어 있는 동안 및/또는 생물학적 시스템 또는 세포에서) 연구되는 경우를 포함하여, 다양한 상황 중 임의의 것에서 평가될 수 있다.
암 : 용어 "암", "악성 종양", "신생물", "종양" 및 "암종"은 비교적 비정상적이고, 제어되지 않고/거나 자율적 성장을 나타내므로, 세포 증식의 유의한 제어 상실을 특징으로 하는 비정상적 성장 표현형을 나타내는 세포를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 일부 실시양태에서, 종양은 전암성 (예를 들어, 양성), 악성, 전 전이성, 전이성, 및/또는 비-전이성인 세포일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 구체적으로, 그의 교시가 특별하게 관련될 수 있는 특정 암을 확인한다. 일부 실시양태에서, 관련 암은 고형 종양을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관련 암은 혈액학적 종양을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 관련 기술분야에 공지된 상이한 유형의 암의 예는, 예를 들어, 백혈병, 림프종 (호지킨 및 비-호지킨), 골수종 및 골수 증식성 장애를 포함한 조혈암; 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종; 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종; 간암; 비뇨 생식기 암, 예컨대 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 자궁암, 및 자궁내막암; 및 신세포 암종, 골암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 내분비계의 암, 갑상선암, 부갑상선암, 두경부암, 유방암, 위장암 및 신경계 암, 양성 병변, 예컨대 유두종 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 혈액암은, 예를 들어, B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 급성 백혈병; 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 만성 백혈병; B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 거대 세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성증 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수성 혈액 세포의 무효한 생산 (또는 이형성증)에 의해 연합된 다양한 혈액학적 병태의 집합인 "전백혈병"을 포함하나 이에 제한되지는 않는 부가적인 혈액암 또는 혈액학적 병태; 및 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성 종양 및 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함할 수 있다.
CDR : 본원에 사용된 바와 같이, 항체 작용제의 가변 영역 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에는 3개의 CDR이 있으며, 이는 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지명된다. "CDR의 세트" 또는 "CDR 세트"는 항원과 결합할 수 있는 단일 가변 영역 또는 항원과 결합할 수 있는 동족 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR에서 발생하는 3개 또는 6개의 CDR 군을 지칭한다. CDR 경계를 규정하기 위한 특정 시스템 (예를 들어, 카바트(Kabat), 코티아(Chothia) 등)이 관련 기술분야에 확립되었으며; 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이들 시스템 간의 차이를 인식하고 청구된 발명을 이해하고 실시하는데 필요한 정도로 CDR 경계를 이해할 수 있다.
화학요법제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화학요법제"는 하나 이상의 아폽토시스유발성, 세포증식억제성 및/또는 세포독성 작용제, 예를 들어, 바람직하지 않은 세포 증식과 연관된 하나 이상의 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위해 활용되고/거나 권장되는 작용제를 구체적으로 포함하는 것을 지칭하는 관련 기술분야에서 이해된 의미를 갖는다. 많은 실시양태에서, 화학요법제는 암의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 하나 이상의 알킬화제, 하나 이상의 안트라시클린, 하나 이상의 세포골격 파괴제 (예를 들어 미세소관 표적화제, 예컨대 탁산, 메이탄신 및 그의 유사체), 하나 이상의 에포틸론, 하나 이상의 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDAC), 하나 이상의 토포이소머라제 억제제 (예를 들어, 토포이소머라제 I 및/또는 토포이소머라제 II의 억제제), 하나 이상의 키나제 억제제, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 전구체 유사체, 하나 이상의 펩티드 항생제, 하나 이상의 백금-기반 작용제, 하나 이상의 레티노이드, 하나 이상의 빈카 알카로이드, 및/또는 하기 (즉, 관련 항증식 활성을 공유하는 것) 중 하나 이상의 하나 이상의 유사체일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 특정한 실시양태에서, 화학요법제는 액티노마이신, 올-트랜스 레티노산, 아우리스타틴, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 쿠르쿠민, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메이탄신 및/또는 그의 유사체 (예를 들어 DM1), 메클로르에타민, 메르캅토푸린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 마이탄시노이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 테니포시드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 그의 조합 중 하나 이상일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 항체-약물 접합체의 맥락에서 활용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 hLL1-독소루비신, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-독소루비신, 겜투주맙 오조가미신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가미신, 글렘바투모맙 베도틴, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, 항-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, 보르세투주맙 마포도틴, 및 로르보투주맙 메르탄신으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체-약물 접합체에서 발견된 것이다.
조합 요법 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조합 요법"은 대상체가 2가지 이상의 치료 레지멘 (예를 들어, 2가지 이상의 치료제)에 동시에 노출되는 상황을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 2가지 이상의 치료 레지멘은 동시에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2가지 이상의 치료 레지멘은 순차적으로 투여될 수 있다 (예를 들어, 제1 레지멘은 임의의 용량의 제2 레지멘의 투여 전에 투여됨). 일부 실시양태에서, 2가지 이상의 치료 레지멘은 중복되는 투약 레지멘으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조합 요법의 투여는 하나 이상의 치료제 또는 양식을 다른 작용제(들) 또는 양식을 받는 대상체에게 투여하는 것을 수반할 수 있다.
조작된 : 일반적으로, 용어 "조작된"은 사람의 손에 의해 조작된 측면을 지칭한다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드 서열이 사람의 손에 의해 조작될 때, 이러한 폴리펩티드는 "조작된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 사람의 손에 의해 참조 폴리펩티드 서열 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 사람의 손에 의해 하나 이상의 부가적인 폴리펩티드와 융합 (즉, 공유적으로 연결)되어 생체내에서 자연적으로 발생하지 않는 융합 폴리펩티드를 형성하는 폴리펩티드를 포함한다. 유사하게, 세포 또는 유기체가 그의 유전적 정보가 변경되도록 조작된 경우에 (예를 들어, 이전에 존재하지 않은 새로운 유전적 물질이, 예를 들어 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입, 또는 다른 메카니즘에 의해 도입되었거나, 또는 이전에 존재하는 유전적 물질이, 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이에 의해 또는 교배 프로토콜에 의해 변경되거나 또는 제거됨), 이러한 세포 또는 유기체는 "조작된" 것으로 간주된다. 통상적인 관행이며 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리펩티드 또는 세포의 유도체 및/또는 자손은 전형적으로, 실제 조작이 이전 실체 상에서 수행되는 경우라도 여전히 "조작된" 것으로서 지칭된다.
에피토프 : 본원에 사용된 바와 같이, 이뮤노글로불린 (예를 들어, 항체 작용제 또는 수용체) 결합 성분에 의해 특이적으로 인식되는 임의의 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 항원 상의 복수개의 화학적 원자 또는 기로 구성된다. 일부 실시양태에서, 이러한 화학적 원자 또는 기는 항원이 관련 3차원 입체형태를 채택하는 경우에 표면 노출된다. 일부 실시양태에서, 이러한 화학적 원자 또는 기는 항원이 상기 입체형태를 채택하는 경우에 공간에서 서로 물리적으로 가깝다. 일부 실시양태에서, 항원이 대안적 입체형태를 채택하는 경우에 (예를 들어, 선형화되는 경우)에 이러한 화학적 원자 또는 기 중 적어도 일부는 서로 물리적으로 분리된다.
생체외 : 본원에 사용된 바와 같이, 다세포 유기체의 맥락 밖에서 발생하는 생물학적 이벤트를 지칭한다. 예를 들어, 세포-기반 시스템과 관련하여, 상기 용어는 인공 환경에서 세포 집단 중에서 발생하는 이벤트 (예를 들어, 세포 증식, 시토카인 분비 등)를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
프레임워크 또는 프레임워크 영역 : 본원에 사용된 바와 같이, 가변 영역의 서열에서 CDR을 뺀 것을 지칭한다. CDR 서열은 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 마찬가지로 프레임워크 서열은 상응하는 상이한 해석의 대상이 된다. 6개의 CDR은 중쇄 및 경쇄 상의 프레임워크 영역을 각각의 쇄 상의 4개의 하위-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누고, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치하고, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정한 하위-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 지정하지 않고, 다른 것으로 언급되는 바와 같은 프레임워크 영역은 단일의 자연적으로 발생하는 이뮤노글로불린 쇄의 가변 영역 내에서 조합된 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 FR은 4개의 하위-영역 중 하나를 나타내고, FR1은, 예를 들어, 가변 영역의 아미노 말단 끝에 가장 가까운 제1 프레임워크 영역을 나타내고 CDR1에 대해 5'를 나타내며, FR은 프레임워크 영역을 구성하는 하위-영역 중 2개 이상을 나타낸다.
시험관내 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시험관내"는 다세포 유기체 내에서가 아닌 인공 환경, 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양물 등에서 발생하는 이벤트를 지칭한다.
생체내 : 본원에 사용된 바와 같이, 인간 및 비-인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 이벤트를 지칭한다. 세포-기반 시스템과 관련하여, 상기 용어는 (예를 들어, 시험관내 시스템과는 대조적으로) 살아있는 세포 내에서 발생하는 이벤트를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
단리된 : 본원에 사용된 바와 같이, (1) 초기에 생산되었을 때 (자연에서든 및/또는 실험적 환경에서든지) 그와 연관된 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되었고/거나 (2) 사람의 손에 의해 설계, 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 실체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 실체는, 이들과 초기에 연관된 다른 성분들 중 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과하여 순수하다. 본원에 사용된 바와 같이, 특정 물질에 다른 성분이 실질적으로 없는 경우에, 이러한 물질은 "순수"하다. 일부 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 물질은 특정의 다른 성분, 예컨대, 예를 들어, 하나 이상의 담체 또는 부형제 (예를 들어, 완충제, 용매, 물 등)와 조합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있으며; 이러한 실시양태에서, 상기 물질의 퍼센트 단리 또는 순도는 이러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 하나의 예를 제공하기 위해, 일부 실시양태에서, 자연에서 발생하는 생물학적 중합체, 예컨대 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 a) 그의 기원 또는 유도화 공급원에 의해, 자연에서 그의 천연 상태로 동반되는 성분들 중 일부 또는 전부와 연관되지 않는 경우에; b) 자연에서 그것을 생산하는 종으로부터 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로 없는 경우에; c) 자연에서 그것을 생산하는 종이 아닌 세포 또는 다른 발현 시스템으로부터의 성분에 의해 발현되거나 또는 그렇지 않으면 그러한 성분과 연관되는 경우에, "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화학적으로 합성되거나 또는 자연에서 그것을 생산하는 것과 상이한 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드가 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일부 실시양태에서, 하나 이상의 정제 기술을 거친 폴리펩티드가, a) 자연에서 그것과 연관되는 다른 성분; 및/또는 b) 초기에 생산될 때 그것과 연관된 다른 성분으로부터 분리된 정도까지 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주될 수 있다.
K D : 본원에 사용된 바와 같이, 그의 파트너 (예를 들어, 항체 작용제 또는 그의 결합 성분과 결합하는 에피토프)와의 복합체로부터의 결합제 (예를 들어, 항체 작용제 또는 그의 결합 성분)의 해리 상수를 지칭한다.
작동가능하게 연결된 : 본원에 사용된 바와 같이, 기재된 성분이 그의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병렬배치를 지칭한다. 기능적 요소에 "작동가능하게 연결된" 제어 요소는, 이러한 기능적 요소의 발현 및/또는 활성이 상기 제어 요소와 화합성인 조건 하에서 달성되는 방식으로 연관된다. 일부 실시양태에서, "작동가능하게 연결된" 제어 요소는 관심 코딩 요소와 인접하고 (예를 들어, 공유적으로 연결되고); 일부 실시양태에서, 제어 요소는 관심 기능적 요소와 트랜스로 작용하거나 또는 기능적 요소로부터 달리 작용한다.
제약 조성물 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제약 조성물"은 활성제가 하나 이상의 제약상 허용되는 담체와 함께 제형화되는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시양태에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 미리 결정된 치료 효과를 달성할 수 있는 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 레지멘으로 투여하기에 적절한 단위 용량으로 존재한다.
폴리펩티드 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로, 관련 기술분야에서 인식된 적어도 3개의 아미노산의 중합체를 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용어 "폴리펩티드"가 본원에 나열된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드 뿐만 아니라 이러한 완전한 폴리펩티드의 기능적 단편 (즉, 적어도 하나의 활성을 보유하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드를 포괄하는 것으로 충분히 일반적이라는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단백질 서열이 일반적으로 활성을 파괴하지 않으면서 일부 치환을 허용한다는 것을 이해한다. 따라서, 활성을 유지하고, 전체 서열 동일성을 적어도 약 30-40%, 종종 약 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과하여 공유하며, 통상적으로 하나 이상의 고도로 보존된 영역에 훨씬 더 높은 동일성, 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 적어도 하나의 영역을 추가로 포함하고, 통상적으로 동일한 부류의 또 다른 폴리펩티드와 함께 적어도 3-4개, 종종 최대 20개 또는 그 초과의 아미노산을 포괄하는 임의의 폴리펩티드가 본원에 사용된 바와 같은 관련 용어 "폴리펩티드" 내에 포괄된다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 다를 함유할 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 각종 아미노산 변형 또는 유사체 중 임의의 것을 함유할 수 있다. 유용한 변형은, 예를 들어, 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 자연 아미노산, 비-자연 아미노산, 합성 아미노산, 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 일반적으로, 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 또는 10개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체 작용제, 항체 단편, 그의 생물학적 활성 부분, 및/또는 그의 특징적인 부분이다.
예방하다 또는 예방 : 본원에 사용된 바와 같이, 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 발생과 연계해서 사용되는 경우에, 상기 질환, 장애 및/또는 병태의 발생 위험을 감소시키고/거나 상기 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 특징 또는 증상의 발병 및/또는 중증도를 지연시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 특정한 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생, 빈도 및/또는 강도에 있어서의 통계적으로 유의한 감소가 이러한 질환, 장애 또는 병태에 취약한 집단에서 관찰되는 경우에, 특정 작용제가 상기 질환, 장애 또는 병태를 "예방"하는 것으로 간주되도록 집단에 기초하여 예방이 평가된다.
재조합 : 본원에 사용된 바와 같이, 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 제조, 발현, 창출, 제작 및/또는 단리되는 폴리펩티드, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드; 재조합의 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드; 폴리펩티드 또는 그의 하나 이상의 성분(들), 부분(들), 요소(들), 또는 도메인(들)을 코딩하고/거나 그들의 발현을 지시하는 유전자(들), 또는 유전자 성분에 대해 트랜스제닉이거나 또는 이들 유전자(들) 또는 유전자 성분을 발현하도록 달리 조작시킨 동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 양, 어류 등)로부터 단리된 폴리펩티드; 및/또는 선택된 핵산 서열 요소를 서로 스플라이싱 또는 라이게이션하고/거나, 선택된 서열 요소를 화학적으로 합성하고/거나, 폴리펩티드 또는 그의 하나 이상의 성분(들), 부분(들), 요소(들), 또는 도메인(들)을 코딩하고/거나 그들의 발현을 지시하는 핵산을 달리 생성시키는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 단리된 폴리펩티드를 지칭하고자 한다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상이 자연에서 발견된다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상이 인 실리코 설계된다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상이, 예를 들어, 자연 또는 합성 공급원으로부터, 예컨대, 예를 들어, 관심 공급원 유기체 (예를 들어, 인간, 마우스 등)의 생식세포 계열에서 공지된 서열 요소의 돌연변이 유발 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내)로부터 비롯된다.
특이적 결합 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 결합이 일어날 환경에서 가능한 결합 파트너를 구별할 수 있는 능력을 지칭한다. 다른 잠재적 인 표적이 존재할 때 하나의 특정한 표적과 상호작용하는 결합제는, 그것과 상호작용하는 표적과 "특이적으로 결합"한다고 한다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 결합제와 그의 파트너 간의 연합 정도를 검출하거나 또는 결정함으로써 평가되며; 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리 정도를 검출하거나 또는 결정함으로써 평가되고; 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 그의 파트너와 또 다른 실체 간의 대안적 상호작용을 놓고 경쟁할 수 있는 결합제의 능력을 검출하거나 또는 결정함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 일정 범위의 농도에 걸쳐 이러한 검출 또는 결정을 수행함으로써 평가된다.
대상체 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유 동물 (예를 들어, 일부 실시양태에서 태아 인간 형태를 포함한 인간)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 특정 질환, 장애, 또는 병태에 취약하다. 일부 실시양태에서, 대상체는 특정 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체는 특정 질환, 장애, 또는 병태의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 특정 질환, 장애, 또는 병태에 대한 취약성 또는 위험 중 하나 이상의 특징적인 특색을 지닌 사람이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 그에 대한 진단 및/또는 요법을 투여받고/거나 투여받은 적이 있는 개체이다.
치료제 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료제"는 일반적으로, 유기체에게 투여될 때 목적하는 약리학적 효과를 유도하는 임의의 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 특정 작용제가 적절한 집단 전반에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 명확하게 보여주는 경우에, 이러한 작용제는 치료제인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 모델 유기체 집단일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 다양한 기준, 예컨대 특정 연령 군, 성별, 유전적 배경, 기존의 임상 병태 등에 의해 규정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 특정 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특색을 경감, 완화, 구제, 억제, 예방하고/거나, 상기 증상 또는 특색의 발병을 지연시키고/거나, 그의 중증도를 감소시키고/거나, 그의 발생률을 감소시키기 위해 사용될 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 시장에 내놓기 전에 정부 기관에 의해 승인을 받았거나 또는 승인을 받아야 하는 작용제이다. 일부 실시양태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 의학적 처방이 필요한 작용제이다.
치료상 유효량 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료상 유효량"은 치료 투약 레지멘에 따라서 특정 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있거나 또는 이에 취약한 집단에 투여될 때, 이러한 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하는데 충분한 양을 의미한다. 일부 실시양태에서, 치료상 유효량은 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생률 및/또는 중증도를 감소시키고/거나, 그의 하나 이상의 특징을 안정화시키고/거나, 그의 발병을 지연시키는 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용어 "치료상 유효량"이 실제로 특정한 개체에서 성공적인 치료가 달성될 것을 요구하지는 않는다는 것을 인지할 것이다. 오히려, 치료상 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 유의한 수의 대상체에서 특정한 목적하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용어 "치료상 유효량"은 본 발명의 요법의 맥락에서 치료를 필요로 하는 개체에게 투여될 때, 이러한 개체에서 발생하는 암 지지 프로세스를 차단, 안정화, 약화 또는 역전시키거나, 또는 상기 개체에서의 암 억제 프로세스를 증강 또는 증가시킬 것인 양을 지칭한다. 암 치료의 맥락에서, "치료상 유효량"은 암이 있는 것으로 진단된 개체에게 투여될 때, 이러한 개체에서 암의 추가 발생을 예방, 안정화, 억제 또는 감소시킬 양이다. 본원에 기재된 조성물의 특히 바람직한 "치료상 유효량"은 악성 종양, 예컨대 췌장 암종의 발생을 역전시키거나 (치유적 치료에서) 또는 악성 종양의 완화를 달성하거나 또는 이를 연장시키는 것을 도와준다. 개체에서 암을 치료하기 위해 그 개체에게 투여되는 치료상 유효량은 완화를 촉진하거나 또는 전이를 억제하기 위해 투여되는 치료상 유효량과 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 대부분의 암 요법에서와 같이, 본원에 기재된 치료 방법은 암에 대한 "치유"로 해석되거나, 제한되거나, 또는 달리 제한되지 않으며; 오히려, 그 치료 방법은 암을 "치료"하기 위해, 즉 암을 갖는 개체의 건강에 바람직하거나 또는 유리한 변화를 초래하기 위해 본원에 기재된 조성물을 사용하는 것에 관한 것이다. 이러한 혜택은 종양학 분야의 숙련된 의료 제공자에 의해 인식되며, 환자 상태의 안정화, 종양 크기의 감소 (종양 퇴행), 극히 중요한 기능의 개선 (예를 들어, 암성 조직 또는 기관의 개선된 기능), 추가 전이의 감소 또는 억제, 기회주의적 감염의 감소, 증가된 생존성, 통증의 감소, 운동 기능의 개선, 인지 기능의 개선, 에너지의 느낌 개선 (활력, 감소된 불쾌감), 웰빙 느낌 개선, 정상적인 식욕의 회복, 건강한 체중 증가의 회복 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 개체에서 특정한 종양의 퇴행 (예를 들어, 본원에 기재된 치료의 결과로서)은 또한, 췌장 선암종과 같은 종양 부위로부터 암 세포 샘플을 채취하고 (예를 들어, 치료 과정에 걸쳐 수행됨); 암 세포의 상태를 모니터링하기 위해 암 세포의 대사 수준 및 시그널링 마커에 관하여 암 세포를 시험하여 분자 수준에서 암 세포가 덜 악성 표현형으로 퇴행하는 것을 검증함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 이용함으로써 유도된 종양 퇴행은 상기 논의된 혈관형성을 촉진시키는 마커 중 임의의 것의 감소, 본원에 기재된 항-혈관형성 마커의 증가; 암으로 진단된 개체에서 비정상적인 활성을 나타내는 대사 경로, 세포간 시그널링 경로, 또는 세포내 시그널링 경로의 정규화 (즉, 암을 앓고 있지 않는 정상적인 개체에서 발견된 상태로의 변경)을 발견함으로써 표시될 수 있을 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일부 실시양태에서, 치료상 유효량이 단일 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일부 실시양태에서, 치료상 유효량은 복수개의 용량으로, 예를 들어, 투약 레지멘의 일부로서 제형화 및/또는 투여될 수 있다.
변이체 : 분자, 예를 들어, 핵산, 단백질, 또는 작은 분자와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 참조 분자와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만, 예를 들어, 참조 실체와의 비교 시 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 부재 또는 수준에 있어서 참조 분자와 구조적으로 상이한 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 또한, 그의 참조 분자와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정한 분자가 참조 분자의 "변이체"인 것으로 적절하게 간주되는지의 여부는 참조 분자와의 구조적 동일성 정도에 근거한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 수 있는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 분자는 특정의 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 정의에 따르면, 변이체는 하나 이상의 이러한 특징적인 구조적 요소를 공유하지만 참조 분자와는 적어도 하나의 측면에서 상이한 별개의 분자이다. 몇 가지 예를 들자면, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/거나 특정한 구조적 모티프 및/또는 생물학적 기능에 기여하는 복수개의 아미노산으로 구성된 특징적 서열 요소를 가질 수 있고; 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수개의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특징적 서열 요소를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 있어서의 하나 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%인, 참조 폴리펩티드 또는 핵산과의 전체 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 하나의 특징적 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다.
벡터 : 본원에 사용된 바와 같이, 그와 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 부가적인 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 부가적인 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)에서 자율 복제할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 그에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그와 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환을 위한 표준 기술이 사용될 수 있다 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션). 효소 반응 및 정제 기술은 제조업체의 사양에 따라 또는 관련 기술분야에서 통상적으로 달성되거나 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조할 수 있으며, 이는 임의의 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
예시적인 실시양태의 상세한 설명
본 개시내용은 특히, HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 조작된 T 세포 뿐만 아니라 그를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체로 조작된 T 세포 (CAR T 세포)는 암 치료를 위한 큰 치료적 잠재력을 갖고 있다. 예를 들어, 혈액학적 악성 종양에 대항한 CD19-표적화된 CAR-형질도입된 T 세포 (CD19-CAR T 세포)의 최근 임상 시험은 CAR T 기술의 강력한 효과를 보여주었다 (Kochenderfer, J. N. et al. (2010) Blood 116: 4099-4102; Porter, D. L., et al. (2011) N. Engl. J. Med. 365: 725-733; Grupp, S. A. et al. (2013) N. Engl. J. Med. 368: 1509-1518; Kochenderfer, J. N. et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33: 540-549; Brown, C. E. et al. (2016) N. Engl. J. Med. 375: 2561-2569). CAR T의 임상적 성공은 CAR의 융합 구조에 적어도 부분적으로 기인하며, 이는 높은 친화도 항원-결합 도메인을 다수의 시그널링 도메인과 인위적으로 조합함으로써 이루어진다 (Maus, M. V. et al. (2014) Blood 123: 2625-2635; van der Stegen, S. J. et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14: 499-509).
그러나, CAR T 요법의 인상적인 성과는 심각한 부작용, 예컨대 CD19-CAR T 세포-처리된 환자에서 시토카인 방출 증후군 (CRS) 및 B 세포 무형성증을 종종 동반한 바 있다 (Kalos, M., et al. (2011) Sci. Transl. Med. 3: 95ra73; Davila, M.L., et al. (2014) Sci. Transl. Med. 6: 224ra225). 따라서, 상기 연관된 부작용을 감소시키고/거나 완화시키는 새로운 CAR T 전략을 개발할 필요성이 충족되지 않았다.
CAR은 종종, 악성 세포 상에서 독점적으로 발현되지 않지만 정상 세포 상에서 발현되는 항원을 표적으로 하고, 일부 경우에는 T 세포 자체 상에서의 항원을 표적으로 한다. 이러한 CAR의 특성은, 전형적으로 낮은 친화도를 나타내고 정상 세포 상에서는 거의 발현되지 않는 항원을 인식하는, T 세포에 대한 자연 항원 수용체인 T 세포 수용체 (TCR)와 상이하다. 이러한 차이에도 불구하고, CAR의 일부 특성은 TCR과 공유된다.
CAR과 TCR 둘 다의 공유된 하나의 특성은 양쪽 유형의 수용체가 수용체 하향조절될 수 있다는 것이다. 예를 들어, TCR은 시그널 무결성을 유지하기 위해 과도한 시그널링을 제한하기 위해 항원 인식 후에 신속하게 하향조절된다 (Viola, A. & Lanzavecchia, A. (1996) Science 273: 104-106; Baniyash, M. (2004) Nat. Rev. Immunol. 4: 675-687). 유사하게, CAR에 의한 항원 인식에 이어 종종 즉시 CAR 하향조절이 뒤따르며, 이는 후속 항원 인식 및 기능에 영향을 미친다 (Caruso, H. G. et al. (2015) Cancer Res. 75: 3505-3518; Eyquem, J. et al. (2017) Nature 543: 113-117). 이러한 수용체 하향조절 이벤트는 수 시간 내에 발생할 수 있으며 회복은 수일 정도 걸릴 수 있다. 단기간 하향조절과 대조적으로, TCR의 장기간 하향조절은 문헌 [Gallegos et al. (2016) Nat. Immunol. 17: 379-386]에 보고되었다. 이러한 연구는 특정의 연속적인 TCR-표적 상호작용이 장기간 TCR 하향조절을 유도할 수 있었으며, 이는 50일 이상 지속될 수 있었다는 것을 명확하게 보여주었다. 이러한 연구에서 하향조절의 정도는 TCR-표적 친화도와 상관이 있었고, 중요하게도, 전체 면역 활성화 역치에 있어서의 궁극적인 증가를 가져왔다. 이러한 현상은 T 세포가 항원 감수성을 조정하고 매크로 수준에서 면역 반응의 정도를 관리할 수 있는 메카니즘을 나타낸다.
CAR T 세포의 경우에, 카루소(Caruso) 등 및 리우(Liu) 등은 낮은 친화도의 특정 CAR이 T 세포를 감작시켜 높은 항원 밀도의 특정 표적 세포를 낮은 항원 밀도의 세포와 구별할 수 있다는 것을 입증한 바 있다 (Caruso, H.G., et al. (2015) Cancer Res. 75: 3505-3518; Liu, X., et al. (2015) Cancer Res. 75: 3596-3607). 이들 연구는 악성 세포에서 특이적으로 상향조절되는 종양 항원을 표적으로 하는 CAR 설계 전략을 제안하였다. 그러나, 연속적인 표적 인식에 의해 유도된 장기간 CAR 하향조절 및 후속 기능적 변화는 광범위하게 연구된 바 없다.
CAR과 TCR 둘 다에서 수용체 하향조절이 관찰되긴 하지만, CAR의 특이적 결합 특징은 "프래트리사이드(fratricide)"로서 공지된 독특한 기능적 결과를 초래할 수 있으며, 이는 T 세포 상에 발현된 항원의 표적화로 인해 이웃한 CAR T 세포에 의해 유도된 T 세포 사멸이다. 흥미롭게도, 프래트리사이드의 정도는 모든 CAR 구축물에 대해 동일하지 않다. 예를 들어, 프래트리사이드는 CD5-표적화된 CAR T 세포에서 일시적이며, 이는 이들 세포가 수주 동안 정상적으로 확장되기 때문이다 (Mamonkin, M., et al. (2015) Blood 126: 983-992). 반대로, 프래트리사이드는 CD7-표적화된 CAR T 세포를 심각하게 손상시켜 생육불능을 초래한다 (Gomes-Silva, D. et al. (2017) Blood 130: 285-296). 그러나, 프래트리사이드의 정도를 허용가능한 수준으로 가능하게 하는 조건은 널리 규정되어 있지 않다.
본 개시내용은 HLA-DR-표적화된 CAR T 세포가 이웃하는 CAR T 세포 상의 HLA-DR을 연속적으로 인식하고, 프래트리사이드 및 CAR 하향조절을 유도할 수 있다는 통찰력을 제공한다. 본 개시내용은 HLA-DR의 다형성 영역을 인식하는 HLA-DR-표적화된 CAR이 다양한 친화도를 갖는 상이한 HLA-DRB1 대립유전자를 수반한 T 세포를 인식할 수 있다는 인식을 포괄한다. 더욱이, 본 개시내용은 또한, 프래트리사이드의 정도 (예를 들어, 심각하거나 또는 가벼운 정도의 프래트리사이드를 나타내는 T 세포) 및/또는 CAR 하향조절이 HLA-DR 항원 (예를 들어, T 세포와 관련하여)과 HLA-DR CAR (예를 들어, MVR CAR) 간의 결합 강도에 좌우된다는 인식을 포괄한다. 본 개시내용은 HLA-DR CAR 항원 친화도가 낮을 때 프래트리사이드가 허용가능한 수준으로 감소된다는 것을 명확하게 보여준다. 더욱이, 본 개시내용은 항원 수준 및/또는 친화도에 근거하여 표적 세포 선택성을 HLA-DR CAR T 세포 (예를 들어, MVR CAR T 세포)에 부여하는 지속된 CAR 하향조절을 특징으로 하는 감수성 조정 메카니즘을 기재한다.
따라서, 본 개시내용은 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR (HLA-DR CAR)이 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 결합 도메인의 결합 특징에 근거하여 선택, 조작 및/또는 최적화될 수 있다는 통찰력을 제공한다. 본 개시내용은 대상체로부터 세포 (예를 들어, T 세포)와 낮은 친화도로 결합하는 HLA-DR CAR이 특정 질환 및/또는 장애 (예를 들어, 암)를 치료하기 위한 유효한 요법을 제공할 수 있다는 인식을 포괄한다. 따라서, 본 개시내용은 특정한 HLA-DR CAR 폴리펩티드 및/또는 그를 코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포를 제공하고, 더욱이 이들 T 세포가 시험관내 및 생체내에서 놀랍게도 유리한 활성을 갖는다는 것을 입증해 준다.
HLA-DR
HLA-DR (Human Leukocyte Antigen - antigen D Related: 인간 백혈구 항원 - 항원 D 관련된)은 고전적인 주요 조직 적합성 복합체 II 분자이다 (Shackelford, D. A. et al., (1982) Immunol. Rev. 66: 133-187). HLA-DR, 및 9개 아미노산 길이 또는 그 초과의 펩티드인 그의 리간드는 TCR에 대한 리간드를 구성한다. HLA-DR 분자는 시그널링에 반응하여 상향조절된다. 감염의 경우에, 펩티드 (예컨대 스타필로코쿠스 장독소 I 펩티드)는 DR 분자와 결합되어 T-헬퍼 세포에서 발견되는 아주 많은 T-세포 수용체 중 몇 개에 제시된다. 이어서, 이러한 세포는 B 세포 증식을 자극하는 B 세포의 표면 상의 항원과 결합한다.
HLA-DR의 1차 기능은 동일한 펩티드 항원에 대항하여 궁극적으로 항체의 생산을 유도하는 T-(헬퍼) 세포 반응을 유도하거나 또는 억제하기 위해 면역 체계에, 기원에 있어 잠재적으로 외래인 펩티드 항원을 제시하는 것이다. HLA-DR은 αβ 이종이량체, 세포 표면 수용체이며, 이들의 각각의 서브유닛은 2개의 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리를 함유한다. α와 β 쇄 둘 다는 막에 고정되어 있다. 성숙한 단백질의 N-말단 도메인은 결합 홈의 노출된 부분을 구성하는 알파-나선을 형성하고, C-말단 세포질 영역은 다른 쇄와 상호작용하여 세포막 전역에 걸친 결합 홈 아래에 베타-시트를 형성한다. 펩티드 접촉 위치의 대부분은 각각의 쇄의 처음 80개 잔기에 있다.
HLA-DR은 항원 제시 세포, 예를 들어 DC, 대식 세포, 단핵구 및 B 세포 상에서의 발현이 제한되어 있다. 세포 표면 상에서의 DR '항원'의 증가된 존재비는 종종 자극에 반응하므로, DR은 또한 면역 자극에 대한 마커이다. B 세포 악성 종양에서 HLA-DR의 높은 발현 수준 및 정상 세포 상에서의 제한된 발현 스펙트럼으로 인해, HLA-DR에 대항한 항체가 개발되어 전임상 및 임상 연구에서 B 세포 악성 종양에 대해 시험된 바 있다 (Nagy, Z.A., et al. (2002) Nat. Med. 8: 801-807; DeNardo, G.L., et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11: 7075s-7079s; Ivanov, A., et al. (2009) J. Clin. Invest. 119: 2143-2159; Lin, T.S., et al. (2009) Leuk. Lymphoma 50: 1958-1963). 제I/II 상 시험에서는 독성이 심각하지 않았지만, 제한된 효능으로 인해 추가 연구가 중단되었다 (Lin, T.S., et al. (2009) Leuk. Lymphoma 50: 1958-1963). 본 개시내용은 항원 특이성을 대규모 T 세포 반응에 통합시킴으로써 CAR T 세포가 모노클로날 항체의 치료 효능을 증대시킬 수 있는 가능성을 고려해 볼 때, HLA-DR-재유도된 CAR T 세포는 B 세포 악성 종양에 유용한 치료제일 수 있다는 인식을 포괄한다.
HLA-DR CAR
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, HLA-DR CAR 폴리펩티드를 제공한다. 본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 자연에 존재하지 않는 수용체를 지칭하고, 특정한 항원에 대한 특이성을 갖는 면역 이펙터 세포를 제공할 수 있다. 정상적으로, CAR은 모노클로날 항체 작용제의 특이성을 T 세포에 전달하는데 사용되는 수용체를 지칭한다. 일반적으로, CAR은 세포외 도메인 (엑토도메인), 막횡단 도메인, 및 세포내 도메인 (엔도도메인)을 포함한다. 본 개시내용에 따르는 예시적인 CAR 구축물의 개략도가 도 1a에 도시되어 있다. 일부 실시양태에서, CAR의 세포외 도메인은 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 항체 작용제이거나 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 HLA-DR과 특이적으로 결합하는 항체 작용제이거나 또는 그를 포함한다.
최근에, 본 발명자들은 HLA-DR의 다형성 영역을 인식하는 항체 작용제 MVR을 개발하였다 (미국 특허 출원 공개 번호 US 2016-0257762에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 HLA-DR 항체 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 MVR 항체 작용제를 포함한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR 항체 작용제는 MVR 항체 작용제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 i) 서열식별번호: 2-4 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한 항체 작용제; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 항체 작용제와 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한, 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR 항체 작용제는 MVR 항체 작용제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 i) 서열식별번호: 6-8 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한 항체 작용제; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 항체 작용제와 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한, 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR 항체 작용제는 MVR 항체 작용제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 i) 서열식별번호: 2-4 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 6-8 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한 항체 작용제; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 항체 작용제와 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한, 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR 항체 작용제는 MVR 항체 작용제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 i) 서열식별번호: 2-4 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 1개, 2개 또는 3개의 중쇄 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 6-8 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 1개, 2개 또는 3개의 경쇄 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한 항체 작용제; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 항체 작용제와 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한, 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, HLA-DR 항체 작용제는 MVR 항체 작용제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 i) 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR1; 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR2; 및 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR1; 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR2; 및 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 작용제; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 항체 작용제와 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한, 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다.
Figure 112019094024711-pct00001
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 i) 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한 항체 작용제; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 항체 작용제와 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한, 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 i) 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한 항체 작용제; ii) 막횡단 도메인; 및 iii) 항원이 상기 항체 작용제와 결합할 때 T 세포 활성화를 초래하는 세포내 시그널링 도메인을 포함한, 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다.
서열식별번호: 1 - MVR 중쇄 가변 영역
Figure 112019094024711-pct00002
38-2
서열식별번호: 5 - MVR 경쇄 가변 영역
Figure 112019094024711-pct00003
일부 실시양태에서, CAR은 세포외 도메인과 연결되는 (예를 들어, 융합되고, 공유적으로 연결되는) CAR의 막횡단 도메인을 포함한다. CAR의 막횡단 도메인은 자연 또는 합성 막횡단 도메인으로부터 유래될 수 있다. 그것이 자연적으로 존재하는 것으로부터 유래될 때, 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래된 것일 수 있고, 다양한 단백질, 예컨대 CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD 154, 및 CD8의 막횡단 영역, T 세포 수용체의 α, β 또는 ξ 쇄로부터 유래된 것일 수 있다. 막횡단 도메인의 서열은 막횡단 단백질의 막횡단 도메인을 개시하는 관련 기술분야에 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
부가적으로, 막횡단 도메인이 합성 도메인인 경우에, 이는 주로 소수성 아미노산 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 이는 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중자가 합성되는 막횡단 도메인에 존재할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 막횡단 도메인에 대한 서열 정보는 관련 기술분야에 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 예시적인 실시양태에서, CD8-힌지 영역이 막횡단 도메인으로서 사용되었다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CAR 내의 세포내 도메인은 CAR 도메인의 일부분이고, 막횡단 도메인과 연결된 형태이다. 본 개시내용의 세포내 도메인은 세포내 시그널링 도메인을 포함할 수 있으며, 이는 항원이 CAR의 항원 결합 영역과 결합할 때 T 세포 활성화, 및 바람직하게 T 세포 증식을 초래하는 것을 특징으로 한다.
세포내 시그널링 도메인은 항원이 세포외로 존재하는 항원-결합 영역과 결합할 때 T 세포 활성화를 초래할 수 있는 시그널링 부분인 한은, 그의 유형에 있어 특별히 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 세포내 시그널링 도메인은, 예를 들어, 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하며, 여기서 ITAM은 CD3 제타 (ξ), FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d 또는 FcεRIγ로부터 유래된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
부가적으로, 본 개시내용의 CAR의 세포내 도메인은 바람직하게, 세포내 시그널링 도메인과 함께 공동 자극 도메인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
공동 자극 도메인은 본 발명의 CAR에 포함되는 세포내 시그널링 도메인에 의한 시그널에 더하여, T 세포에 시그널을 전달하는데 있어서 적어도 부분적으로 일정 역할을 하며, 공동 자극 분자의 세포내 도메인을 포함하여 CAR의 세포내 부분을 지칭한다.
세포 표면 분자인 공동 자극 분자는 항원에 대한 림프구의 충분한 반응에 필요한 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 공동 자극 분자는, 예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 또는 B7-H3일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 공동 자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, 또는 B7-H3 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 세포내 부분일 수 있다.
부가적으로, 일부 실시양태에서, 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 세포내 도메인과 막횡단 도메인을 연결할 수 있고, 링커는 항원이 세포외 위치에 존재하는 항원 결합 도메인와 결합할 때, 세포내 도메인을 통한 T 세포 활성화를 유도시킬 수 있는 링커, 예를 들어 (GLY4SER)3으로 불리는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 10)인 한은 그의 길이와 관련하여 특별히 제한되지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-MVR 항체 작용제의 VH 부분과 VL 부분은 (GLY4SER)3 링커에 의해 연결되어 MVR scFv를 구축할 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR은 MVR scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVR CAR은 막횡단 도메인으로서 CD8-힌지를 포함한다. 일부 실시양태에서, MVR CAR은 4-1BB 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, MVR CAR은 CD3ξ 쇄의 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, MVR CAR은 MVR scFv, CD8-힌지, 4-1BB 세포내 도메인, 및 CD3ξ 쇄의 세포내 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 단백질을 제공한다.
서열식별번호: 9 - 예시적인 HLA-DR (MVR) CAR
Figure 112019094024711-pct00004
하기 실시예에 기재되는 바와 같이, 예시적인 HLA-DR 항체 작용제인 MVR은 HLA-DR의 가변 에피토프를 인식한다. 적어도 부분적으로는 대상체들 간의 에피토프 가변성으로 인해, 상이한 대상체 (즉, 공여자)로부터의 B 세포는 상이한 결합 친화도를 나타낸다. 예를 들어, 별개의 HLA-DRB1 대립유전자를 수반하는 일부 대상체 (즉, 공여자)는 예시적인 MVR-scFv에 의해 극도로 낮은 결합도를 나타내었다. MVR 낮은 결합자 (즉, DRweak)로서 특징지워진 대상체로부터 단리된 PBMC를 사용하여, 허용가능한 프래트리사이드를 나타내는 MVR-조작된 CAR T 세포 (MVR-CAR T 세포)를 성공적으로 생성시켰다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR T 세포는 낮은 결합자 (즉, HLA-DR CAR과 낮은 친화도 및/또는 결합력으로 결합하는 HLA-DR 변이체를 발현함)로서 특징지워진 대상체로부터 조작된다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도 및/또는 결합력을 갖도록 조작된다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 대상체로부터의 HLA-DR에 대한 낮은 친화도 및/또는 결합력을 갖도록 조작된다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR은 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 친화도 및/또는 결합력이 역치 미만인 경우에는 T 세포에서의 발현을 위해 선택된다.
일부 실시양태에서, 이러한 HLA-DR CAR T 세포는 악성 세포에 대항한 세포독성을 특이적으로 유도할 수 있다. 하기에 입증되는 바와 같이, 이러한 HLA-DR CAR T 세포는 정상 B 세포는 보존하면서 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스-유도된 림프모구양 세포주 (EBV-LCL)에 대항하여 세포독성을 특이적으로 유도할 수 있다. EBV-LCL에서의 HLA-DR 상향-조절 및 이에 따른 과립 전달 속도의 증가가 이러한 메카니즘에 수반되었다. 하기 실시예는 B 세포 림프종에서 HLA-DR-재유도된 MVR-CAR T 세포의 악성 종양 특이적 사멸의 개념 증명을 입증하고, 본 개시내용의 방법을 통해 생산된 HLA-DR CAR T 세포의 치료적 혜택을 강조한다.
핵산
본 개시내용은 본 개시내용의 HLA-DR CAR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 HLA-DR CAR은 관련 기술분야에 공지된 분자 생물학적 방법을 사용하여 핵산 분자로부터 생산될 수 있다. 본 개시내용의 핵산은, 예를 들어, DNA 및/또는 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 HLA-DR CAR을 코딩하는 영역을 포함한다. HLA-DR CAR은 목적하는 결합 및/또는 기능적 특성에 대하여 확인 및/또는 선택될 수 있고, 상기 항체 작용제의 가변 영역이 단리, 증폭, 클로닝 및/또는 시퀀싱되었다. 아미노산을 코딩하고/거나 제한 부위를 수반하는 뉴클레오티드 서열의 부가, 및/또는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 치환을 포함한, 가변 영역 뉴클레오티드 서열에 대한 변형이 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 인트론 서열을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
본 개시내용의 핵산 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 발현 벡터 또는 바이러스 벡터 내로 삽입될 수 있고, 핵산 분자는 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 전술한 핵산 분자, 또는 그의 단편 중 임의의 것을 포함하는 벡터가 본 개시내용에 의해 추가로 제공된다. 상기 핵산 분자, 또는 그의 단편 중 임의의 것은 임의의 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 이들을 구축하기 위한 벡터 및 방법의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 공지되어 있고, 일반적인 기술적 참고문헌에 기재되어 있다 (일반적으로, 문헌 ["Recombinant DNA Part D," Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)] 참조).
일부 실시양태에서, 통상적으로 사용되는 기술, 예컨대, 예를 들어, 전기영동, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 리포펙션 등은 외래 핵산 (DNA 또는 RNA)을 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 벡터는 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있으며, 이는 적절하게 및 벡터가 DNA 또는 RNA인지 여부를 고려하여 벡터가 도입될 숙주의 유형 (예를 들어, 박테리움, 진균, 식물 또는 동물)에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 숙주의 속에 특이적인 조절 서열을 포함한다. 바람직하게, 벡터는 숙주의 종에 특이적인 조절 서열을 포함한다.
복제 시스템 및 삽입된 핵산 외에도, 핵산 구축물은 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주의 선택을 허용하는 하나 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생물제 내성, 예를 들어, 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 프로토트로피를 제공하는 영양 요구성 숙주에서의 상보성 등을 포함한다.
적합한 벡터는 증식 및 확장을 위해 또는 발현을 위해 또는 둘 다를 위해 설계된 것들을 포함한다. 예를 들어, 클로닝 벡터는 pUC 시리즈, pBluescript 시리즈 (스트라타젠(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라호야), pET 시리즈 (노바젠(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨), pGEX 시리즈 (파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech), 스웨덴 웁살라), 및 pEX 시리즈 (클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 박테리오파지 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII (스트라타젠), λEMBL4, 및 λNM1149를 사용할 수도 있다. 식물 발현 벡터의 예는 pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (클론테크)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 예는 pEUK-C1, pMAM 및 pMAMneo (클론테크)를 포함한다. TOPO 클로닝 시스템 (인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드)이 제조업체의 권장사항에 따라서 사용될 수도 있다.
발현 벡터는 상기 기재된 바와 같이 단리되거나 또는 정제된 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 천연 또는 비-천연 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 강력한, 약한, 유도가능한, 조직-특이적 및 발달 특이적인 프로모터의 선택은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. 유사하게, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 그의 단편을 프로모터와 조합하는 것 또한 관련 기술분야의 기술 내에 있다.
적합한 바이러스 벡터는, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 파르보바이러스-기반 벡터, 예를 들어, 아데노-연관 바이러스 (AAV)-기반 벡터, AAV-아데노바이러스 키메라 벡터, 및 아데노바이러스-기반 벡터, 및 렌티바이러스 벡터, 예컨대 단순 포진 (HSV)-기반 벡터를 포함한다. 이들 바이러스 벡터는, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)]에 기재된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 유래된다. 레트로바이러스는 광범위한 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 RNA 바이러스이다. 감염되면, 레트로바이러스 게놈은 그의 숙주 세포의 게놈으로 통합되고, 숙주 세포 DNA와 함께 복제되어, 바이러스 RNA 및 레트로바이러스 게놈 내로 혼입된 임의의 핵산 서열을 지속적으로 생산한다. 이와 같이, 레트로바이러스를 사용할 때 치료 인자(들)의 장기간 발현이 달성될 수 있다. 유전자 요법에 사용하기 위해 고려되는 레트로바이러스는 병원성 레트로바이러스가 존재하더라도 비교적 비-병원성이다. 병원성 레트로바이러스, 예를 들어, 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV) 또는 인간 T-세포 림프친화 바이러스 (HTLV)를 이용하는 경우에, 숙주에 대한 독성을 제거하기 위해 바이러스 게놈을 변경하는데 주의를 기울여야만 한다. 레트로바이러스 벡터는 부가적으로, 바이러스 복제 결핍성이 되도록 조작될 수 있다. 이와 같이, 레트로바이러스 벡터는 생체내에서 안정적인 유전자 전달에 특히 유용한 것으로 간주된다. 렌티바이러스 벡터, 예컨대 HIV-기반 벡터는 유전자 전달에 사용되는 레트로바이러스 벡터의 예이다. 다른 레트로바이러스와는 달리, HIV-기반 벡터는 그의 패신저 유전자를 비-분할 세포 내로 혼입시키는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 지속적인 형태의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
클로닝 및/또는 발현에서의 그의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 도와주거나, 또는 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되는 것을 개선시키기 위해 부가적인 서열을 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가할 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Ausubel]; 또는 상기 문헌 [Sambrook] 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 및 벡터는 단리되고/거나 정제될 수 있다. 본 개시내용은 또한, 임의로 벡터 형태의 상기 기재된 단리되거나 또는 정제된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 단리된 핵산 및 벡터는, 예를 들어, 알칼리/SDS 처리, CsCl 결합, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 기술을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 조성물은 본원에 추가로 기재된 바와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 적절한 세포 내로 도입될 때 HLA-DR CAR을 발현할 수 있는 벡터 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다.
DNA 단편을 벡터 내로 삽입하는 것에 관하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법(들)을 사용하여, 전사/번역 제어 시그널의 제어 하에 본 개시내용의 HLA-DR CAR을 코딩하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기술 및 생체내 재조합을 포함할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Ausubel]; 또는 상기 문헌 [Sambrook] 참조).
HLA-DR CAR-T 세포의 생산
본 발명의 또한 또 다른 목적은 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 일부 실시양태에서, CAR이 그 안에 도입되는 본 발명의 T 세포는 CD4+ T 세포 (헬퍼 T 세포, TH 세포), CD8+ T 세포 (세포독성 T 세포, CTL), 기억 T 세포, 조절 T 세포 (Treg 세포), 아폽토시스성 T 세포이지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, CAR이 그 안에 도입되는 본 발명의 T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, CAR이 그 안에 도입되는 본 발명의 T 세포는 CD4+ T 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) HLA-DR 항원 결합 도메인을 수득하며, 여기서 HLA-DR 항원 결합 도메인은 대상체로부터의 HLA-DR과 낮은 친화도로 결합하는 것인 단계; 및 (b) HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 대상체로부터 수득된 T 세포에서 발현하고, 그에 의해 자가 조작된 T 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 자가 조작된 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 자가 조작된 T 세포를 생산하는 방법은 자가 조작된 T 세포를 시험관내에서 적어도 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계; 및 결합도가 역치 미만인 경우에, HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 대상체로부터의 T 세포를 조작하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 자가 조작된 T 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 자가 조작된 T 세포를 생산하는 방법은 자가 조작된 T 세포를 시험관내에서 적어도 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제공된 방법에서의 배양하는 단계는 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 CAR의 감소된 표면 발현을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산한다.
일부 실시양태에서, 상기 제공된 방법에서의 배양하는 단계는 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 정상 B 세포에 대한 감소된 독성을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산한다.
일부 실시양태에서, 상기 제공된 방법에서의 배양하는 단계는 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 비-악성 세포보다 악성 세포에 대한 증강된 선택성을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 맥락에서 자가 조작된 T 세포는 대상체로부터 정상 B 세포로의 상기 조작된 T 세포의 과립 전달보다 적어도 2배 더 큰 EBV LCL로의 과립 전달을 나타낸다.
관련 기술분야에 공지된 T 세포 또는 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 분석하기 위한 임의의 적절한 방법이 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도의 분석은 T 세포 결합력의 평가일 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포의 결합력은 수용체의 발현 수준 및 수용체-항원 친화도를 통합하는 규모로 평가될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Vigano, S. et al. (2012) Clin. Dev. Immunol. 2012: 153863] 참조). 일부 실시양태에서, T 세포 결합력은 TCR-항원 복합체가 클러스터를 형성하여 궁극적으로 T 세포 활성화를 초래하는 최소 항원 수준의 척도일 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도의 분석은 결합 친화도 (예를 들어, KD)의 직접적인 측정이다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도의 분석은 T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 기능적 결합력의 척도이다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력은 T-세포 반응을 촉발시키는데 필요한 항원 용량과 반비례한다. 일부 실시양태에서, T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 기능적 결합력의 척도는 T 세포 기능, 예컨대, 예를 들어, IFN-γ 생산, 세포독성 활성 (표적 세포를 용해시킬 수 있는 능력), 또는 증식의 생체외 정량화를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 기능적 결합력의 척도는 T 세포의 최대 절반 반응 (EC50)을 유도시키는데 필요한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 농도를 결정하는 것을 포함한다.
T 세포에서 CAR을 발현하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법이 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 발현을 위한 다양한 핵산 벡터, 예컨대, 예를 들어, 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물이 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 바이러스 벡터 등이 있지만, 본 개시내용은 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, T 세포에서 CAR의 발현을 위한 벡터는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스 또는 그의 유도체일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터인 렌티바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대, 예를 들어 리포솜이다.
일부 실시양태에서, 림프구 (예를 들어, T 세포)는 적어도 약 25℃, 바람직하게 적어도 약 30℃, 보다 바람직하게 약 37℃의 온도에서 배양된다.
본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 HLA-DR CAR T 세포가 (예를 들어, 암의 치료를 위하여) 치료상 유용할 수 있다는 인식을 포괄한다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR T 세포는 치료를 필요로 하는 환자의 HLA-DR 변이체에 가장 적합하도록 조작된다.
치료적 적용
본 개시내용은 HLA-DR CAR T 세포 요법을 위한 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR T 세포 요법은 자가 CAR T 세포 요법이다. 자가 CAR T 세포 요법에 수반되는 대단히 중요한 단계를 예시하는 일반적인 개략도가 도 1b에 도시되어 있다. 이들 단계는 CAR T 세포 요법을 필요로 하는 대상체로부터 T 세포의 단리 및 벌크 자극, CAR T 세포의 형질도입 및 확장, 및 CAR T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물의 주입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체의 HLA-DR 항원에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 T 세포의 결합력의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계, 및 결합력이 역치 미만인 경우에, 상기 조작된 T 세포를 포함하는 치료 제제를 생산하는 단계를 포함하는, 치료 제제를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체의 HLA-DR 항원에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 T 세포의 결합력의 분석은 기능적 결합력의 분석이다. 일부 실시양태에서, T 세포에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인의 기능적 결합력의 척도는 T 세포 기능, 예컨대, 예를 들어, IFN-γ 생산, 세포독성 활성 (표적 세포를 용해시킬 수 있는 능력), 또는 증식의 생체외 정량화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료 제제를 생산하는 방법은 대상체의 HLA-DR 항원에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 T 세포의 기능적 결합력의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계, 및 기능적 결합력이 역치 미만인 경우에, 상기 조작된 T 세포를 포함하는 치료 제제를 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력의 척도는 적절한 자극 하에 적어도 8일, 10일, 12일 또는 14일 동안 배양될 때 조작된 T 세포의 증식이다. 일부 실시양태에서, 적절한 자극은 T 세포를 CD3-특이적 항체 및/또는 HLA-DR-발현 세포에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력의 역치는 적어도 15배, 20배, 25배 증식이다.
일부 실시양태에서, 치료 제제를 생산하는 방법은 대상체의 HLA-DR 항원에 대한 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 포함하는 조작된 T 세포의 기능적 결합력의 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계, 및 기능적 결합력이 역치 미만인 경우에, 상기 조작된 T 세포를 포함하는 치료 제제를 생산하는 단계를 포함하며, 여기서 역치는 CD3-특이적 항체 및/또는 HLA-DR-발현 세포와 함께 적어도 12일 동안 배양될 때 조작된 T 세포의 적어도 15배, 20배, 25배 증식이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암이 발생하였거나 또는 암이 발생할 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암이 발생하였거나 또는 암이 발생할 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 증강을 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 증강을 필요로 하는 대상체에게 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암이 발생하였거나 또는 암이 발생할 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법으로 치료하는데 적합한 질환은 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성 종양 또는 전암성 병태로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 질환은 HLA-DR의 발현과 연관된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법으로 치료하는데 적합한 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 HLA-DR 항원을 발현한다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 대상체로부터의 비-암 세포에 대비하여 HLA-DR 항원의 증가된 발현을 갖는다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 대상체로부터의 비-암 세포에 대비하여 HLA-DR 항원의 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 6배 더 높은 발현을 나타낸다. 일부 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법으로 치료하는데 적합한 암은 대상체로부터의 동일한 유형의 정상 세포에 대비하여 HLA-DR 항원의 적어도 2배 더 높은 발현을 나타낸다.
본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭암, 위장암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 타액선암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 및 전립선암을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의한 치료를 위한 암은 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 편평 세포 암종, 복막암, 간세포 암종, 위암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 혈액암은 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 암은 B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 급성 백혈병; 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 만성 백혈병; B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 거대 세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성증 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수성 혈액 세포의 무효한 생산 (또는 이형성증)에 의해 연합된 다양한 혈액학적 병태의 집합인 "전백혈병"을 포함하나 이에 제한되지는 않는 부가적인 혈액암 또는 혈액학적 병태; 및 HLA-DR을 발현하는 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성 종양 및 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는, HLA-DR 발현과 연관된 질환; 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의한 치료를 위한 암은 B 세포 림프종 (즉, B 세포 기원의 악성 림프종)이다. B 세포 림프종은 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 점막-연관 림프 조직 림프종 (MALT), 만성 림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종 (MCL), 버킷 림프종, 종격동 거대 B 세포 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 결절성 변연부 B 세포 림프종 (NMZL), 비장 변연부 림프종 (SMZL), 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 림프종양 육아종증, 및 AIDS-관련 림프종을 포함하나, B 세포 기원의 림프종인 한은 이에 특별히 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물을 포함한 조성물은 암 세포 또는 그의 전이를 치료하거나, 또는 암의 성장을 억제하는데 제약상 유효한 양으로 투여될 수 있다. 치료 방법에 사용하기 위하여, 본 개시내용의 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 용량화, 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 요소는 치료되는 특정한 장애, 치료되는 특정한 포유 동물, 개별 환자의 임상 상태, 환자의 연령, 환자의 체중, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 요인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 T 세포는 자가이다 (공여자와 수용자가 동일함). 일부 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 T 세포는 동계이다 (공여자와 수용자는 상이하지만 동일한 트윈임). 일부 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 T 세포는 수용자 대상체와 동종이계 (동일한 종으로부터 유래되지만, 상이한 공여자)이다.
일부 실시양태에서, 조성물 내의 세포의 치료 유효량은 이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 적어도 106개, 적어도 107개, 적어도 108개, 적어도 109개, 적어도 1010개, 또는 1010개 초과하여 포함한다. 세포의 수는 조성물에 포함된 세포의 유형과 같이 조성물이 의도한 최종 용도에 좌우될 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포의 집단은 이러한 세포를 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과 또는 35% 초과 함유할 것이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포의 집단은 이러한 T 세포를 10% 내지 50%, 15% 내지 45%, 20% 내지 40%, 25% 내지 35%, 또는 20% 내지 30% 함유할 것이다. 본원에 제공된 용도의 경우에, 투여를 위한 T 세포의 집단은 일반적으로 1 리터 이하의 용적이다. 일부 실시양태에서, 투여를 위한 T 세포는 500 ml 미만, 250 ml 미만, 또는 100 ml 이하의 용적이다. 일부 실시양태에서, 목적하는 T 세포의 밀도는 전형적으로, 106개 초과의 세포/ml이고, 일반적으로 107개 초과의 세포/ml, 일반적으로 108개 이상의 세포/ml이다. 임상적으로 관련된 면역 세포의 수는 다수의 주입으로 할당될 수 있으며, 이는 누적해서 107개의 세포, 108개의 세포, 109개의 세포, 1010개의 세포, 1011개의 세포, 또는 1012개의 세포와 동일하거나 또는 그를 초과한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 환자에게 비경구로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물은 하나 또는 다수의 투여로 환자에게 비경구로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하는 조성물은 매일 1회, 2 내지 7일마다 1회, 매주, 2주마다 1회, 매월 1회, 3개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 환자에게 비경구로 투여될 수 있다.
조성물
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 T 세포는 자가 T 세포이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR의 HLA-DR 결합 도메인은 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HLA-DR CAR을 포함하는 조작된 T 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조작된 T 세포는 제약 조성물이 투여되는 대상체로부터의 T 세포에 대한 낮은 기능적 결합력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력은 역치 수준 아래이다. 일부 실시양태에서, 대상체의 T 세포에 대한 조작된 T 세포의 기능적 결합력은 T 세포 기능, 예컨대, 예를 들어, IFN-γ 생산, 세포독성 활성 (표적 세포를 용해시킬 수 있는 능력), 또는 증식의 생체외 정량화를 사용하여 평가된다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력의 척도는 적절한 자극 하에 적어도 8일, 10일, 12일 또는 14일 동안 배양될 때 조작된 T 세포의 증식이다. 일부 실시양태에서, 적절한 자극은 T 세포를 CD3-특이적 항체 및/또는 HLA-DR-발현 세포에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기능적 결합력의 역치는 적어도 15배, 20배, 25배 증식이다.
본 개시내용의 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 완충제, 희석제, 부형제, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 목적하는 경우에 또한, 하나 이상의 부가적인 치료상 활성 물질을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포는 포유 동물 (예를 들어, 인간)에게 투여하는데 적합하다. 본원에 제공된 제약 조성물의 설명이 주로 인간에게 윤리적으로 투여하기에 적합한 제약 조성물에 관한 것이지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 조성물이 일반적으로, 모든 종류의 동물에게 투여하기에 적합한 것으로 이해할 것이다. 다양한 동물에게 투여하기에 적합한 조성물을 제공하기 위해 인간에게 투여하기에 적합한 제약 조성물의 변형은 널리 이해되고 있고, 통상의 수의학 약리학자는 단지 평범한 실험이 있다면 이를 이용하여 상기 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 T 세포는 먼저, 이들의 배양 배지로부터 세포를 수거한 후, 투여에 적합한 배지 및 용기 시스템 ("제약상 허용되는" 담체)에서 치료 유효량으로 세포를 세척 및 농축시킴으로써 제형화된다. 적합한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제형일 수 있으며, 전형적으로 생리 식염수, 노르모솔(Normosol) R (애보트(Abbott)) 또는 플라스마-라이트 A (백스터(Baxter))일 수 있지만, 또한 수중 5% 덱스트로스 또는 링거의 락테이트가 활용될 수 있다. 주입 매질에 인간 혈청 알부민이 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다. 예를 들어, 본원에 제공된 제약 조성물은 멸균 주사 형태 (예를 들어, 피하 주사 또는 정맥내 주입에 적합한 형태)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사에 적합한 액체 투여 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 임의로 진공 하에서 분말 (예를 들어, 동결 건조되고/거나 멸균됨)로서 제공되며, 이는 주사 전에 수성 희석제 (예를 들어, 물, 완충제, 염 용액 등)로 재구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 물, 염화나트륨 용액, 아세트산 나트륨 용액, 벤질 알콜 용액, 인산염 완충 식염수 등에 희석되고/거나 재구성된다. 일부 실시양태에서, 분말은 수성 희석제와 함께 부드럽게 혼합되어야 한다 (예를 들어, 진탕시키지 않아야 함).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포는 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 제형화된다. 이러한 비히클의 예는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 1-10% 인간 혈청 알부민이다. 리포솜 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정 오일이 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결 건조된 분말은 등장성을 유지시키는 첨가제 (예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지시키는 첨가제 (예를 들어, 완충제 및 보존제)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제형은 공지되거나 또는 적합한 기술에 의해 멸균된다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제형은 약리학 분야에서 공지되거나 또는 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 희석제 또는 또 다른 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 연합시킨 다음, 필요한 경우에 및/또는 바람직한 경우에, 산물을 목적하는 단일 용량 단위 또는 다수 용량 단위로 패키징하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포를 포함한 제약 조성물은 저장 또는 투여를 위한 용기, 예를 들어, 바이알, 시린지 (예를 들어, IV 시린지), 또는 백 (예를 들어, IV 백)에 포함될 수 있다. 본 개시내용에 따르는 제약 조성물은 단일 단위 용량으로서, 및/또는 복수개의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조, 패키징 및/또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로, 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 및/또는 이러한 복용량의 편리한 분율, 예컨대, 예를 들어, 이러한 복용량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 개시내용에 따르는 제약 조성물 중에서 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포, 제약상 허용되는 부형제(들), 및/또는 임의의 부가적인 성분의 상대적 양은 치료되는 대상체의 실체, 크기, 및/또는 상태에 따라서, 및 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라서 다양할 것이다. 한 예로서, 조성물은 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 적어도 106개, 적어도 107개, 적어도 108개, 적어도 109개, 적어도 1010개, 또는 1010개 초과하여 포함하는, HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포의 집단을 포함할 수 있다. 세포의 수는 조성물에 포함된 세포의 유형과 같이 조성물이 의도한 최종 용도에 좌우될 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포의 집단은 이러한 세포를 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과 또는 35% 초과 함유할 것이다. 일부 실시양태에서, HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포의 집단은 이러한 T 세포를 10% 내지 50%, 15% 내지 45%, 20% 내지 40%, 25% 내지 35%, 또는 20% 내지 30% 함유할 것이다. 본원에 제공된 용도의 경우에, 투여를 위한 T 세포의 집단은 일반적으로 1 리터 이하의 용적이다. 일부 실시양태에서, 투여를 위한 T 세포는 500 ml 미만, 250 ml 미만, 또는 100 ml 이하의 용적이다. 일부 실시양태에서, 목적하는 T 세포의 밀도는 전형적으로, 106개 초과의 세포/ml이고, 일반적으로 107개 초과의 세포/ml, 일반적으로 108개 이상의 세포/ml이다. 임상적으로 관련된 면역 세포의 수는 다수의 주입으로 할당될 수 있으며, 이는 누적해서 107개의 세포, 108개의 세포, 109개의 세포, 1010개의 세포, 1011개의 세포, 또는 1012개의 세포와 동일하거나 또는 그를 초과한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하한 및 상한에 의해 한정된 범위 내의 양으로 HLA-DR CAR을 포함하는 T 세포를 포함하거나 또는 전달하며, 상한은 하한보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 하한은 약 106개의 세포, 107개의 세포, 108개의 세포, 109개의 세포, 1010개의 세포, 1011개의 세포, 또는 1012개의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상한은 약 107개의 세포, 108개의 세포, 109개의 세포, 1010개의 세포, 1011개의 세포, 1012개의 세포, 1013개의 세포 또는 1014개의 세포일 수 있다.
제약 조성물은 부가적으로, 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있으며, 이는 본원에 사용된 바와 같이, 목적하는 특정한 투여 형태에 적합한 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고형 결합제, 윤활제 등을 포함한다. 문헌 [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)]에는 제약 조성물을 제형화하는데 사용되는 다양한 부형제 및 그의 제조를 위한 공지된 기술이 개시된다. 임의의 통상적인 부형제 매질이 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 초래하거나 또는 다른 방식으로 제약 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용하는 것과 같은, 물질 또는 그의 유도체와 비-화합성인 경우를 제외하고는, 그의 사용이 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 순수하다. 일부 실시양태에서, 부형제는 인간 및 수의학용으로 승인된다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 식품 의약국에 의해 승인된다. 일부 실시양태에서, 부형제는 제약 등급이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 약전 (USP), 유럽 약전 (EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 표준을 충족시킨다.
제약 조성물의 제조에 사용된 제약상 허용되는 부형제는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제, 및/또는 오일을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 부형제는 임의로 제약 제형에 포함될 수 있다. 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제, 및/또는 방향제가 조제자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제 (예를 들어, 보존제, 불활성 희석제, 분산제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 완충제 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포의 집단을 포함한 조성물은 안정적으로 제형화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 T 세포의 집단의 안정적인 제형은 식염수 또는 선택된 염을 수반한 인산염 완충제 뿐만 아니라 보존제를 함유하는 보존된 용액 및 제형을 포함할 수 있고, 또한 제약 또는 수의학 용도에 적합한 다용도 보존 제형을 포함할 수 있다. 보존된 제형은 적어도 하나의 공지된 보존제를 함유하거나 또는 수성 희석제 중의 적어도 하나의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 아질산페닐제2수은, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘 (예를 들어, 6수화물), 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로살 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 보존제를 함유한다. 임의의 적합한 농축물 또는 혼합물은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 예컨대 0.001-5%, 또는 그 안에서의 임의의 범위 또는 값, 예컨대, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 안에서의 임의의 범위 또는 값이지만 이에 제한되지 않는 것으로 사용될 수 있다. 비-제한적 예는 보존제를 포함하지 않거나, 0.1-2% m-크레졸 (예를 들어, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% 벤질 알콜 (예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% 티메로살 (예를 들어, 0.005, 0.01), 0.001-2.0% 페놀 (예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0% 알킬파라벤(들) (예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉장 및/또는 동결될 수 있는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉장 및/또는 동결될 수 없는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 재구성된 용액 및/또는 액체 투여 형태는 재구성 후 특정 기간 동안 (예를 들어, 2시간, 12시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일, 2주, 1개월, 2개월, 또는 그 초과 동안) 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 명시된 시간보다 더 장시간 항체 작용제를 포함한 조성물을 저장하면, 항체 작용제의 분해가 초래된다.
액체 투여 형태 및/또는 재구성된 용액은 투여 전에 미립자 물질 및/또는 변색을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변색되거나 또는 혼탁한 경우에 및/또는 여과 후에 미립자 물질이 남아 있는 경우에는 용액을 사용해서는 안된다.
의약품의 제형화 및/또는 제조에 대한 일반적인 고려 사항은, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005]에서 찾을 수 있다.
키트
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트를 추가로 제공한다. 키트는, 예를 들어, 치료 방법, 진단 방법, 세포 증식 및/또는 단리 방법 등을 포함한 임의의 적용가능한 방법으로 사용될 수 있다. 임의로, 이러한 용기(들)와 연관된 것은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지서일 수 있으며, 이러한 통지서는 (a) 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 관한 기관의 승인을 반영하거나, (b) 사용 지침을 반영하거나, 또는 둘 다를 반영한다.
일부 실시양태에서, 키트는, 예를 들어, HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산을 검출가능한 형태 (예를 들어, 검출가능한 모이어티 또는 실체와 공유적으로 연합됨)로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 하나 이상의 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산은 대상체의 치료를 위해 사용되는 키트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 HLA-DR CAR 및/또는 HLA-DR CAR을 코딩하는 핵산은 HLA-DR CAR을 발현하는 자가 T 세포를 제조하기 위해 사용되는 키트에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 HLA-DR 항체 작용제를 제공할 수 있으며, 각각은 CAR 구축물로 클로닝하는데 적합하다. 일부 실시양태에서, 키트는 대상체로부터 확인되거나 또는 단리된 T 세포 또는 HLA-DR에 대한 HLA-DR 항체 작용제 (예를 들어, MVR 항체 작용제) 및/또는 HLA-DR CAR (예를 들어, MVR CAR) 및/또는 HLA-DR CAR T 세포의 결합 친화도를 검정하기 위한 다른 시약을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 대상체의 T 세포에 대한 HLA-DR 항체 작용제 (예를 들어, MVR 항체 작용제) 및/또는 HLA-DR CAR (예를 들어, MVR CAR) 및/또는 HLA-DR CAR T 세포의 기능적 결합력을 검정하기 위한 다른 시약을 제공할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 인용 참고문헌 (문헌 참조, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 특색은 예시적인 실시양태의 하기 설명 과정에서 명백해질 것이다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주가 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, HL-DR CAR을 발현하는 신규 조작된 T 세포 및 이와 관련된 방법을 제공한다. HLA-DR CAR-T 조성물의 생성 및 특징화, 및 생산 및 사용 방법은 하기 실시예에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
예시적인 방법
하기 실시예와 관련하여 하기 예시적인 방법이 사용되었지만, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 방법은 그에 제한되지 않는다.
플라스미드 설계
MVR 항체 작용제 (미국 특허 출원 공개 번호 US 2016-0257762에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 형태를 코딩하는 DNA 구축물은 하기 표 1에 제공된 표준 DNA 클로닝 기술을 사용하여 VL 및 VH 영역을 GS 링커와 연결함으로써 생성되었다. CD8α 리더 서열을 MVR-scFv 서열의 5'-말단에 삽입하여 단백질이 분비될 수 있게 하였다 (표 1). 보다 용이한 정제 및 검출을 위해, His-태그 및 FLAG-태그 서열을 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열을 사용하여 MVR-scFv 서열의 5'-말단 및 3'-말단에 각각 부착시켰다:
표 1 - 예시적인 구축물의 제조에 사용하기에 적합한 서열
Figure 112019094024711-pct00005
이어서, MVR-scFv를 pcDNA3.1(+) 발현 벡터 (V790-20, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 내로 클로닝하여 pcDNA3.1-MVR-scFv를 생성하였다. MVR CAR 구축물을 창출하기 위해, MVR-scFv 서열을, 표준 DNA 클로닝 기술을 사용하여 차세대 CD19 CAR 구축물을 코딩하는 앞서 보고된 렌티바이러스 벡터 pELPS-19BBz (문헌 [Milone, M. C. et al., (2009) Mol. Ther. 17: 1453-1464; June, C. et al., (2012) 국제 특허 공개 번호: WO/2012/07900]) 내로 이식하였다. FLAG-태그 서열을 CD8α 리더와 CD19 CAR 및 MVR CAR의 scFv 서열 사이에 삽입하여 pELPS-FLAG19BBz 및 pELPS-FLAGMVRBBz를 각각 생성하여 (도 3), 각각의 구축물의 발현이 항-FLAG 항체로 편견 없는 방식으로 검출될 수 있도록 하였다. pLCv2-DRB1을 생성하기 위해, HLA-DRB1-표적화 sgRNA/Cas9 발현 벡터인 HLA-DRB1 엑손3-표적화 스페이서 서열을, 표준 DNA 클로닝 기술을 사용하여 렌티CRISPRv2 (52961, 애드진(Addgene), 미국 매사추세츠주 캠브리지) 내로 삽입하였다 (표 1).
세포 및 배지
PBMC는 국립 암 센터 기관 검토 위원회 승인 프로토콜을 사용하여 국립 암 센터 연구소의 건강한 자원 공여자로부터 사전 동의를 얻어 수득하였다. PBMC를 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하고 즉시 사용하거나 또는 액체 질소에 저장하였다. EBV로의 형질전환에 의해 PBMC로부터 EBV LCL이 생성되었다. 상세하게, 기하 급수적으로 성장하는 B95-8 세포를 37℃ 하에 3일 동안 인큐베이션하였다. 상등액을 0.45-μm 필터를 통해 여과하고 형질전환에 사용하였다. EBV-형질전환을 위해, 2.5 mL 배지 중 107개의 PBMC를 2.5 mL의 EBV 함유 상등액과 혼합하고 37℃ 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합된 세포를 T75 플라스크로 옮기고, 1 μg/mL 시클로스포린 A를 함유하는 5 mL의 배지를 부가하였다. 인큐베이션 3주 후, 과다 성장하는 불멸화 B 세포를 CD19 및 HLA-DR 발현에 관하여 검사하고 하기 실시예에서 사용하였다. pGL4.51 벡터 (E132A, 프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨)의 존재 하에서 DR weak EBV LCL의 전기 천공 후 EBV LCL-lucH 세포주를 단일 세포 클로닝에 의해 생성하였다. 결함있는 HLA-DR 분자를 갖는 ΔDR-EBV LCL은 pLCv2-DRB1을 전기천공에 의해 DR weak EBV LCL 내로 도입함으로써 생성되었다. 전기천공을 위해, 세포 및 플라스미드를 4-mm 큐벳에 놓아두고, 지수 붕괴 프로그램을 사용하여 진 펄서 X셀 전기천공 시스템 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크. (Bio-Rad Laboratories, Inc.), 미국 캘리포니아주 헤라클레스)으로 250 V, 975 μF에서 펄싱하였다. 전기천공 후, HLA-DR-음성 DR weak EBV LCL을 FACSAria 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크)로 분류하였다. 1A2 (CRL-8119, ATCC, 미국 버지니아주 마나사스), BC-1 (CRL-2230, ATCC), JVM-2 (CRL-3002, ATCC), Daudi (CCL-213, ATCC), Raji (CCL-86, ATCC), Ramos (CRL-1596, ATCC), NALM6 (CRL-3273, ATCC), B95-8 (CRL-1612, ATCC), EBV LCL, EBV LCL-lucH, 및 ΔDR-EBV LCL을, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (15140-122, 깁코(Gibco), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (FBS-BBT-5XM, 로키 마운틴 바이오로지칼스, 인크.(Rocky Mountain Biologicals, Inc.), 미국 몬타나주 미줄러)으로 보충된 RPMI 1640 (LM011-01, 웰젠, 인크.(Welgene, Inc.), 대한민국 대전)에서 배양하였다. 확장된 T 세포 및 PBMC를 1% 페니실린/스트렙토마이신 (15140-122, 깁코) 및 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (FBS-BBT-5XM, 로키 마운틴 바이오로지칼스, 인크.)으로 보충된 RPMI 1640 (LM011-77, 웰젠, 인크.)에서 배양하였다. 렌티-X 293T (632180, 클론테크 래보러토리즈, 인크. (Clontech Laboratories, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰) 및 293T 세포주를 1% 페니실린/스트렙토마이신 (15140-122, 깁코) 및 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (FBS-BBT-5XM, 로키 마운틴 바이오로지칼스, 인크.)로 보충된 DMEM (LM001-05, 웰젠, 인크.)에서 배양하였다. 하기 실시예에서 사용된 모든 세포주는 지난 1년 동안 젤쉴드(ZellShield) (13-0050, 미네르바 바이오랩스(Minerva Biolabs), 미국 뉴저지주 해켄잭)의 존재 하에서 배양되었고, 이-미코 발리드 미코플라스마(e-Myco VALiD Mycoplasma) PCR 검출 키트 (S25239, iNtRON 바이오테크놀로지, 인크.(iNtRON Biotechnology, Inc.), 대한민국 서울)를 사용하여 미코플라스마가 없는 것으로 검증되었다. 세포주 인증이 시행되지 않았다.
MVR-scFv 생산
정제된 MVR-scFv 단백질을 생산하기 위하여, pcDNA3.1-MVR-scFv를 293T 세포 내로 형질감염시켰다. 상등액 내로 분비된 MVR-scFv 단백질을 형질감염 후 48시간에 수집하고, 제조업체의 프로토콜에 따라서 Ni-NTA 정제 시스템 (R901-10; 써모 피셔 사이언티픽, 인크.(Thermo Fisher Scientific, Inc.), 미국 매사추세츠주 월섬)으로 정제하였다.
유동 세포계수 방법 및 항체
표면 마커의 발현을 분석하기 위해, 1 x 106개의 세포를 4℃ 하에 30분 동안 특이적 항체로 염색하였다. 표면 수용체에 대한 MVR-scFv의 결합을 평가하기 위해, 1 x 106개의 세포를 4℃ 하에 30분 동안 1 μg의 정제된 MVR-scFv로 염색하고, 1회 세척하고, PE- 또는 APC-접합된 항-FLAG 항체로 4℃ 하에 30분 동안 염색하였다. 상기 세포를 2회 세척하고 분석 전에 1% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 세포내 항원을 분석하기 위해, 세포를 시토픽스/시토펌 고정/투과화 키트 (554714, 비디 바이오사이언시스)를 사용하여 세포내 항원-특이적 항체로 염색하였다. 표적 항원 접촉 후 증식을 평가하기 위해, T 세포를 셀트레이스(CellTrace) 바이올렛 세포 증식 키트 (C34557, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)로 표지하고, EBV LCL을 감마 셀 3000 137Cs 조사기 (베스트 테라트로닉스, 리미티드(Best Theratronics, Ltd.), 캐나다 온타리오)를 사용하여 30 Gy의 선량으로 γ-조사하였다. 이어서, 총 1.2 x 106개의 세포를 3:1의 T 세포:EBV LCL 비로 혼합하고, 200 IU/mL의 인간 재조합 IL-2의 존재하에 5일 동안 배양하였다. 제5일에, 이와 같이 배양된 세포를 2회 세척하고 분석 전에 1% 파라포름알데히드로 고정시켰다. CD107a, IFN-γ, IL-2, MIP-1β 및 TNF의 수준을 측정함으로써 다기능성을 평가하였다. EBV LCL을 셀트레이스 카르복시 플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 세포 증식 키트 (C34554, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)로 표지하고, T 세포를 활성화시키는데 사용하였다. 총 1.2 x 106개의 세포를 단백질 수송 억제제 칵테일 (00-4980, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.) 및 CD107a-특이적 항체의 존재하에 48-웰 플레이트에서 6시간 동안 3:1의 T 세포:EBV LCL 비로 공동 인큐베이션하였다. 세포를 항-CD4 항체로 염색하고, 2회 세척하고, IFN-γ-, IL-2-, MIP-1β- 및 TNF-특이적 항체로 세포내로 염색하였다. 모든 유동 세포계수 분석은 FACSCalibur 또는 FACSVerse 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)로 수행되었다. 하기 실시예에서 사용된 항체에 관한 추가 정보는 하기 표 2에 제시된다.
표 2 - 예시적인 방법에 사용하기에 적합한 예시적인 항체
Figure 112019094024711-pct00006
Figure 112019094024711-pct00007
렌티바이러스 제제
렌티바이러스 벡터는 렌티-X 293 T 패키징 세포주 및 패키징 플라스미드 벡터를 사용하여 생성되었다. 형질감염 전날, 렌티-X 293T 세포를 150-mm 배양 접시에 105개의 세포/cm2의 밀도로 시딩하였다. 그 다음날인 제0일에, CAR-코딩 렌티바이러스 벡터 구축물 (pELPS-FLAG19BBz 및 pELPS-FLAGMVRBBz)을, 리포펙타민(Lipofectamine) 3000 (L3000075, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)을 사용하여 16:7:7:1의 비 하에 패키징 플라스미드 벡터인 pMDLg/pRRE, pRSV-rev 및 pMD.G로 렌티-X 293T 세포 내에 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 및 48시간에 수거된 상등액을 틱월 폴리알로머(Thickwall Polyallomer) 튜브 (355642, 베크만 쿨터, 인크.(Beckman Coulter, Inc.), 미국 캘리포니아주 브레아)에서 4℃ 하에 16,500 xg로 90분 동안 초원심분리함으로써 농축시켰다. 초원심분리 후, 상등액을 버리고 1 mL의 신선한 T 세포 배지를 각각의 튜브에 부가하였다. 4℃ 하에 밤새 인큐베이션된 밀봉된 튜브를 0.45-μm 필터를 통해 여과하고, 등분하며 사용할 때까지 -70℃ 하에 저장하였다. 렌티바이러스 역가는 형질도입 단위를 계산함으로써 결정되었다. 인간 PBMC는 제0일에 인간 T 세포 활성화/확장 키트 (130-091-441, 밀테니 바이오텍, 인크., 독일 베르기쉬 글라트바흐)를 사용하여 활성화되었다. 제2일에, T 세포를 50 μL T 세포 배지의 존재하에 96-웰 평평한 바닥 플레이트에서 105개의 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 형질도입을 위해, 10 μg/mL의 폴리브렌을 함유하는 100 μL의 3배 연속 희석된 렌티바이러스 벡터를 T 세포 시딩된 웰에 부가하고, 25℃ 하에 1,200 xg로 2시간 동안 회전접종하였다. 회전접종 후, 플레이트를 37℃ 하에 2일 동안 인큐베이션하고, 형질도입된 T 세포를 항-FLAG 항체로 염색하고, FACSVerse 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)에 의해 CAR 발현을 분석하였다. 0.05 내지 0.1의 형질도입률을 초래한 희석률을 결정함으로써, 렌티바이러스의 형질도입 U/mL를 하기 방정식을 사용하여 계산하였다 : (형질도입률 x 105 x 10)/희석률.
CAR T 세포 생산
CAR T 세포는 CAR-코딩 렌티바이러스를 이용한 활성화된 T 세포의 회전접종에 의해 생성되었다. 상세하게, 범 T 세포 단리 키트 (130-096-535, 밀테니 바이오텍, 인크.)를 사용하여 단리된 인간 PBMC 또는 T 세포는 인간 T 세포 활성화/확장 키트 (130-091-441, 밀테니 바이오텍, 인크.)를 사용하여 제0일에 활성화시켰다. 제2일에, 10 μg/mL의 폴리브렌을 함유하는 배지에서 25℃ 하에 2시간 동안 1,200 xg 회전접종에 의해 3-5의 감염 다중도 하에 렌티바이러스로 T 세포를 형질도입하였다. 회전접종 후, 이와 같이 형질도입된 T 세포를 세척하고, 200 IU/mL의 인간 재조합 IL-2가 보충된 배지에서 2주 동안 배양하였다. 제14일에, CAR-발현 T 세포를 즉시 사용하거나 또는 사용 전에 항-FLAG-비오틴 (130-101-566, 밀테니 바이오텍, 인크.) 및 항-비오틴 마이크로비드 (130-091-441, 밀테니 바이오텍, 인크.)를 사용하여 강화시켰다.
정량적 PCR
CAR mRNA 발현은 정량적 PCR에 의해 결정되었다. 1 x 106개의 T 세포로부터의 총 RNA를 RNeasy 플러스 미니 키트 (74136, 퀴아젠(QIAGEN), 독일 힐덴)를 사용하여 추출하고, 슈퍼스크립트(SuperScript) III 제1 가닥 합성 시스템 (18080-051, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)을 사용하여 역전사시켰다. 이어서, 역전사된 단일 가닥 DNA를 패스트스타트(FastStart) 필수 DNA 그린 마스터 키트 및 라이트사이클러 96 시스템 (06924204001, 로슈 몰레쿨라 시스템즈, 인크.(Roche Molecular Systems, Inc.), 스위스 바젤)을 사용하여 정량적 PCR에 적용하였다. CD8TM-BB_Fwd (4-1BB 시그널링 도메인과 CD8α 막횡단의 연접부에 특이적임) 및 BB-CD3z_Rev (CD3ζ 시그널링 도메인과 4-1BB의 연접부에 특이적임)를 사용하여 CAR mRNA를 정량화하였다 (표 1). GAPDH_Fwd 및 GAPDH_Rev (GAPDH mRNA에 특이적임)를 사용하여 참조 유전자 발현을 검출하였다 (표 1). GAPDH mRNA 수준 대비 CAR mRNA 수준을 계산하고, 이를 CAR T 세포 샘플들 간의 CAR 발현을 비교하는데 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석
CAR 단백질 수준을 비교하기 위해, CD247-특이적 항체 (비접합됨; 51-6527GR, 비디 바이오사이언시스; 표 2)를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 시행하였다. 상세하게, 1 x 107개의 T 세포를 빙냉 PBS로 3회 세척하고 프로테아제 억제제 칵테일 (P3100-001, 젠데포, 인크.(GenDEPOT, Inc.), 미국 텍사스주 바커)을 함유하는 RIPA 용해 완충제로 용해시켰다. 용해물을 4℃ 하에 최대 속도로 10분 동안 원심분리하고 상등액을 샘플 완충제 (5X)와 혼합하고 5분 동안 비등시켰다. 동일한 양의 단백질을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 이를 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겼다. 이러한 막을 5% 무-지방 우유를 사용하여 25℃ 하에 1시간 동안 차단하고 항-CD247 항체의 존재하에 4℃ 하에 밤새 부드럽게 흔들면서 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 막을 TBS-T 완충제로 3회 세척하고 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항-마우스 IgG 항체 (315-035-045, 잭슨 이뮤노리서치, 인크.(Jackson ImmunoResearch, Inc.), 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브) 및 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 β-액틴-특이적 항체 (sc-130656, 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 미국 텍사스주 달라스)와 함께 25℃ 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 TBS-T 완충제로 3회 세척하였다. 시그널 전개를 위해, 막을 화학발광 기판 (NCI4080KR, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)으로 전개하고 X-선 필름에 노출시켰다. β-액틴 대비 CAR의 단백질 수준을 ImageJ v1.50i 소프트웨어 (NIH, 미국 메릴랜드주 베데스다)로 정량화하였다.
면역형광 영상화
CAR 단백질 국재화는 면역형광 영상화에 의해 평가되었다. T 세포를 25℃ 하에 10분 동안 PBS (pH 7.4) 중 4% (w/v) 파라포름알데히드에 고정시켰다. 고정된 세포를 25℃ 하에 20분 동안 펌-워시 완충제 (0.1% 사포닌 및 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS, pH 7.4)로 세척 및 투과시키고, 25℃ 하에 20분 동안 인간 Fc 블록 (564219, 비디 바이오사이언시스)으로 차단하였다. 펌-워시 완충제로 세척한 후, 세포를 펌-워시 완충제 중 알렉사(Alexa)488-접합된 항-FLAG-태그 항체 (5407, 셀 시그널링 테크놀로지, 인크.(Cell Signaling Technology, Inc.), 미국 매사추세츠주 댄버스; 표 2)로 25℃ 하에 30분 동안 염색하였다. 상기 세포를 펌-워시 완충제로 세척하고 DAPI를 함유하는 벡타쉴드(Vectashield) 장착 배지 (H-1200, 벡터 래보러토리즈, 인크.(Vector Laboratories, Inc.), 미국 캘리포니아주 벌링게임)를 사용하여 유리 슬라이드에 고정시키고 자이스(Zeiss) LSM 780 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (칼 자이스 에스에이에스(Carl Zeiss SAS), 독일 오베르코헨)을 사용하여 영상을 획득하였다.
세포독성의 평가
T 세포에 의한 EBV LCL의 세포독성 사멸은 시토톡스-글로(CytoTox-Glo) 세포독성 검정 키트 (G9291, 프로메가; 미국 위스콘신주 매디슨)를 사용하여 정량화되었다. 상세하게, 5 x 104개의 EBV LCL을 투명한 평평한 바닥이 있는 96-웰 블랙 플레이트 (3904, 코닝, 인크.(Corning, Inc.), 미국 뉴욕주 코닝)에 시딩하였다. 이어서, T 세포를 1:27, 1:9, 1:3, 1:1, 또는 3:1의 T 세포:EBV LCL 비로 상기 웰에 부가하고 37℃ 하에 4시간 동안 인큐베이션하였다. EBV LCL을 단독으로 함유하는 대조군 웰을 동일한 조건 하에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 발광성 AAF-글로 기질을 각각의 웰에 부가하고, TECAN 인피니트 PRO 200 (테칸 그룹, 리미티드(Tecan Group, Ltd.), 스위스 만네도르프)을 사용하여 발광을 측정하였다. EBV LCL 단독 또는 디기토닌-처리된 EBV LCL을 함유하는 웰을 배경 및 최대 세포독성 시그널 각각을 검출하기 위한 대조군으로서 사용하였다. 세포독성-유도 사멸 효능은 하기 방정식을 사용하여 결정되었다: (샘플 웰에서의 세포독성 시그널 - 배경 세포독성 시그널)/최대 세포독성 시그널.
시험관내 표적-맞춤 사멸의 평가
CAR T 세포의 표적-특이적 사멸 효능을 평가하기 위해, 유동 세포계수법-기반 사멸 검정을 설계하였다. 상세하게, PBMC 및 EBV LCL을 셀트레이스 바이올렛 세포 증식 키트 (C34557, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.) 및 셀트레이스 카르복시 플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 세포 증식 키트 (C34554, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)로 각각 표지시켰다. 표지된 PBMC 및 EBV LCL을 4시간 동안 6:1:1의 T 세포:EBV LCL:PBMC 비로 T 세포와 함께 공동 배양하였다. 공동 배양을 위해, 1.2 x 106개의 세포를 1 mL의 배지에서 48-웰 플레이트의 웰에서 인큐베이션하였다. 대조군 웰은 T 세포의 부재 하에 표적 세포에 있어서의 감소를 측정하기 위해 표지된 EBV LCL 및 PBMC만을 함유하였다. 인큐베이션 후, 정량적 유동 세포계수 분석을 위해 20 μL의 플로우-카운트 플루오로스피어 (7547053, 베크만 쿨터, 인크.)를 각각의 웰에 부가하였다. 이어서, 세포-비드 혼합물을 12 x 75-mm 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 고정가능한 생육력 염료 이플루오르(eFluor) 780 (65-0865, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.), 및 HLA-DR, CD14 및 CD20에 특이적인 항체로 염색하였다. 이어서, 샘플을 1% 파라포름알데히드로 고정시키고 FACSVerse 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)로 분석하였다. 정량적 집단 분석을 위해, 고정된 수의 정량적 비드가 모든 샘플로부터 획득되었다. 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르-표지된 EBV LCL 및 바이올렛-표지된 CD20-양성 B 세포에 대항한 T 세포의 사멸 효능을 하기 방정식을 사용하여 계산하였다: EBV LCL-사멸 효능 = (대조군 웰에서 살아있는 EBV LCL - 샘플 웰에서 살아있는 EBV LCL)/대조군 웰에서 살아있는 EBV LCL; B 세포 사멸 효능 = (대조군 웰에서 살아있는 B 세포 - 샘플 웰에서 살아있는 B 세포)/대조군 웰에서 살아있는 B 세포.
세포독성 억제의 평가
세포독성 억제 검정은 일부 변형을 수반한 시험관내 표적-맞춤 사멸 검정에서와 같이 수행되었다. 간략하게 언급하면, 셀트레이스 바이올렛 세포 증식 키트 (C34557, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)를 사용하여 EBV LCL을 표지시키고, 항-CD178 (FasL) 항체 (FasL 차단제; 비접합됨; 10 μg/mL; 556371, 비디 바이오사이언시스; 표 2), 항-CD253 (TRAIL) 항체 (TRAIL 차단제; 비접합됨; 10 μg/mL; 550912, 비디 바이오사이언시스; 표 2), 콘카나마이신 A (CMA; 퍼포린-1 차단제; 1 μg/mL; C9705-25UG, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스), 또는 재조합 인간 Bcl-2 단백질 (그랜자임 B 차단제; 1 μg/mL; 827-BC, 알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스)의 존재하에 4시간 동안 5:1의 T 세포:EBV LCL 비로 각각의 유형의 T 세포와 공동 배양하였다. 1.2 x 106개의 세포의 샘플을 0.5 mL 배지와 함께 48-웰 플레이트에서 공동 배양하였다. 10 μg/mL의 이소형 마우스 IgG 및 1 μg/mL의 디메틸 술폭시드를 함유하는 T 세포-EBV LCL 혼합물을 비-억제된 대조군으로서 사용하였다. 표지된 EBV LCL 단독을 배경 대조군으로서 사용하였다. 인큐베이션 후, 정량적 유동 세포계수 분석을 위해 20 μL의 플로우-카운트 플루오로스피어 (7547053, 베크만 쿨터, 인크.)를 각각의 웰에 직접 부가하였다. 이어서, 세포-비드 혼합물을 12 x 75-mm 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 고정가능한 생육력 염료 이플루오르 780 (65-0865, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)으로 염색한 다음, 1% 파라포름알데히드로 고정시키고 FACSVerse 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 분석하였다. 정량적 분석을 위해, 고정된 수의 정량적 비드가 모든 샘플로부터 획득되었다. 억제된 EBV LCL 사멸의 효율은 하기 방정식을 사용하여 결정하였다: (시약 함유 샘플에서의 EBV LCL - 비-억제된 대조군에서의 EBV LCL)/(배경 대조군에서의 EBV LCL - 비-억제된 대조군에서의 EBV LCL).
표면 분자의 정량화
표면 분자는 퀀텀 심플리 세포성 항-마우스 IgG 키트 (814, 뱅스 래보러토리즈, 인크.; 미국 인디애나주 피셔스)를 사용하여 정량화하였다. APC-접합된 FLAG-특이적 항체, PE-접합된 CD19-특이적 항체, 및 PE-Cy5-접합된 HLA-DR-특이적 항체를 사용하여 CAR, CD19, 및 HLA-DR을 각각 정량화하였다. 유동 세포계수 분석은 FACSVerse 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 수행되었다.
과립 전달 속도의 측정
T 세포와 B 세포 (또는 EBV LCL) 간의 접촉 후 과립 전달 속도를 유동 세포계수법에 의해 측정하였다. 먼저, T 세포를 셀트레이스 바이올렛 세포 증식 키트 (C34557, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)로 표지하였다. B 세포 단리 키트 II (130-091-151, 밀테니 바이오텍, 인크.)를 사용하여 단리된 건강한 공여자의 PBMC로부터의 EBV LCL 또는 B 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 2:1의 T 세포:표적 세포 비에서 4.5 x 105개의 T 세포 및 표적 세포의 샘플을 96-웰 평평한 바닥 플레이트에서 10, 30 또는 90분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 시토픽스/시토펌 고정/투과화 키트 (554714, 비디 바이오사이언시스)로 고정 및 투과시키고, 전달된 과립을 항-그랜자임 A 및 항-그랜자임 B 항체로 염색하고 FACSVerse 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)에 의해 분석하였다. 바이올렛-음성 세포 상에서 게이팅함으로써 표적 세포를 확인하였다. 과립-전달 속도는 총 표적 세포 중 그랜자임 A 및/또는 그랜자임 B-양성 세포의 백분율로부터 계산되었다.
아폽토시스성 세포의 라이브 영상화
EBV LCL 아폽토시스의 동역학은 율리(JuLI) 스테이지 실시간 세포 이력 기록 장치 (나노엔텍, 인크.(NanoEnTek, Inc.), 대한민국 경기도)로 측정되었다. 표적 EBV LCL을 셀트레이스 바이올렛 세포 증식 키트 (C34557, 써모 피셔 사이언티픽, 인크.)로 표지하였다. 1:1의 T 세포:EBV LCL 비 하의 1 x 105개의 T 세포 및 EBV LCL의 샘플을 인큐사이트(IncuCyte) 카스파제-3/7 시약의 존재하에 96-웰 평평한 바닥 플레이트에서 인큐베이션하여 아폽토시스를 유도하였다 (4440, 에센 바이오사이언스(Essen BioScience), 미국 미시간주 앤 아버). DAPI- 및 RFP-여과된 영상을 90분 동안 5분마다 촬영하였다. 각각의 웰의 3개 영역을 분석하였다. 바이올렛-표지된 EBV LCL의 청색 형광으로 인해, 합병된 영상에서 마젠타 색상의 세포를 관찰함으로써 아폽토시스성 EBV LCL을 확인할 수 있다 (바이올렛 표지의 청색 형광과 아폽토시스성 세포의 적색 형광이 조합되었음). 아폽토시스성 EBV LCL의 백분율을 결정하고, 이를 ImageJ v1.50i 소프트웨어 및 율리 STAT (나노엔텍, 인크.)를 사용하여 수치로 전환하였다. 아폽토시스성 EBV LCL의 분율은 하기 방정식으로부터 계산되었다: % 아폽토시스성 EBV LCL = 아폽토시스성 EBV LCL (마젠타 색상)/총 EBV LCL (청색 또는 마젠타 색상).
동물 모델
하기 실시예에 기재된 동물 실험을 위해, 특이적 병원체가 없는 조건하에 유지된 면역 결핍성 7-10주령 C;129S4-Rag2 tm1.1Flv Il2rg tm1.1Flv /J 암컷 마우스를 사용하였다. 종양 용적이 2,000 mm3을 초과하거나 또는 루시페린-처리된 대상체의 총 발광이 1 x 1011 광자/초를 초과할 때 마우스를 이산화탄소 노출에 의해 희생시켰다.
생체내 효능의 평가
생체내 CAR T 세포 효능을, 이종 이식편 모델을 사용하여 평가하였다. T 세포 주입 5일 전에, 마우스에게 3 x 106개의 (100 μL) 루시페라제-발현 EBV LCL-lucH 세포를 복강내로 이종 이식하였다. 5일 후 (제0일), 마우스 당 5 x 106개의 T 세포 (300 μL)를 정맥내로 주사하였다. 4마리 마우스에게 NT T 세포를 주사하고, 5마리 마우스에게 CD19 CAR T 및 MVR CAR T 세포를 각각 주사하였다. 이종 이식된 마우스의 종양 부담은 IVIS 루미나 생체내 영상화 시스템 (펄킨 엘머, 인크.(PerkinElmer, Inc.), 미국 매사추세츠주 월섬)으로 루시페라제 활성을 측정함으로써 제0일, 제7일, 제14일, 제21일 및 제28일에 결정되었다..
생체내 표적-맞춤 사멸의 평가
일시적 이종 이식편 모델을 사용하여 생체내 표적-맞춤 사멸을 검정하였다. 상세하게, T 세포를 주입하기 5일 전에 1 mg의 클로드로네이트 리포솜 (클로드립 베파우(ClodLip BV), 네덜란드 암스테르담)을 마우스 내로 정맥내 주사하였다. 그 다음날, 마우스에게 X-RAD 320 (프리시젼 X-레이, 인크.(Precision X-Ray, Inc.), 미국 코네티컷주 노스 브랜퍼드)을 사용하여 2 Gy의 선량으로 X-선 조사하고, B 세포 단리 키트 II (130-091-151, 밀테니 바이오텍, 인크.)로 수득된 DR weak PBMC로부터의 3 x 105개 (300 μL)의 DR weak B 세포로 정맥내 이식하였다. T 세포 주입 3일 전에, 6.5 x 105개 (200 μL)의 루시페라제-발현 EBV LCL-lucH 세포를 마우스에게 복강내로 주사하였다. 3일 후 (제0일), 마우스 당 1 x 107개의 T 세포 (500 μL)를 정맥내로 주사하였다. 4마리 마우스에게 NT T 및 MVR CAR T 세포를 각각 주사하였고, 5마리 마우스에게 CD19 CAR T 세포를 주사하였다. IVIS 루미나 생체내 영상화 시스템으로 루시페라제 활성을 측정함으로써 모든 이종 이식된 마우스를 제-1일, 제7일, 및 제14일에 종양 부담에 관하여 분석하였다. 제-1일, 제2일 및 제7일에 눈뒤 출혈에 의해 수집된 혈액 샘플에서 B 세포 및 혈액 IFN-γ 수준의 지속성을 측정하였다. 혈액 샘플에 남아있는 B 세포를 정량화하기 위해, CD3-, CD20-, CD45-, 및 HLA-DR-특이적 항체를 75 μL의 EDTA-처리된 말초 혈액에 직접 부가하였다. 염색 후, 적혈구 용해 완충제를 부가하고, 샘플을 12 x 75 mm 폴리스티렌 튜브로 옮겼다. 플로우-카운트 플루오로스피어 (7547053, 베크만 쿨터, 인크.)를 정량적 유동 세포계수 분석을 위해 각각의 웰에 부가하였다. 이어서, 세포-비드 혼합물을 2회 세척하고 1% 파라포름알데히드로 고정시키고, FACSVerse 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 정량적 집단 분석을 위해, 고정된 수의 정량적 비드가 모든 샘플로부터 획득되었다. 원심분리된 혈액 샘플로부터 수집된 혈장에서의 IFN-γ 수준을 BD 세포계수 비드 어레이 인간 Th1/Th2/Th17 시토카인 키트 (560484, 비디 바이오사이언시스)로 정량화하였다.
통계적 분석
본 분야의 유사한 연구를 근거로 한 데이터에 적절한 통계적 시험을 사용하였다. 달리 명시되지 않는 한, 비-대응표본 양측 t-검정을 사용하여 차이를 평가하였다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었고 유의성은 별표로 지정된다 (ns, 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001). 프리즘 v5.01 (그래프패드 소프트웨어, 인크.(GraphPad Software, Inc.), 미국 캘리포니아주 라호야)을 사용하여 모든 그래프 및 모든 통계적 분석을 생성하였다.
실시예 1 - 낮은 CAR 친화도는 예시적인 HLA-DR CAR T 세포의 프래트리사이드를 감소시킨다
본 실시예는 상이한 대상체로부터의 HLA-DR 항원에 대해 다양한 친화도를 갖는 HLA-DR CAR T 세포를 기재한다. 더욱이, 본 실시예는 대상체로부터의 T 세포에 대해 낮은 친화도를 갖는 HLA-DR CAR로 조작된 HLA-DR CAR T 세포가 특정의 유리한 특성을 갖는다는 것을 입증한다.
최근에, 본 발명자들은 마우스를 B 세포 림프종 세포주 L3055로 면역시킴으로써 HLA-DR-특이적 항체 작용제인 MVR을 개발하였다. 이러한 예시적인 HLA-DR 항체 작용제는 HLA-DR의 다형성 영역을 인식한다 (미국 특허 출원 공개 번호 US 2016-0257762에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 흥미롭게도, MVR 항체 작용제는 HLA-DR의 다형성 영역을 인식하기 때문에, 상이한 HLA-DRB1 배경의 개체로부터의 PBMC는 광범위한 스펙트럼의 MVR-scFv 결합 친화도를 나타낼 수있다 (공개되지 않음). 도 2a에는 MVR 에피토프 영역이 표시된, HLA-DR의 다형성 영역의 서열 정렬이 제공된다. 3명의 공여자로부터의 예시적인 CD19+ B 세포는 높은 (강력한), 중간 (중간 정도) 또는 낮은 (약한) 친화도를 갖는 (각각 DR str , DR int , 또는 DR weak 로서 명명됨) 예시적인 HLA-DR-scFv, MVR-scFv와 결합하는 것으로 밝혀졌고, 이들 공여자로부터의 세포를 추가 실험에 사용하였다 (도 2b). 강력한/중간 정도 및 약한 결합제에 대한 HLA-DR 다형성 영역의 예시적인 서열 변이는 또한, 도 2a의 서열 정렬에 도시되어 있다.
최근에, 본 발명자들은 T 세포 상에서 발현되는 CD5에 대항하여 재유도된 CAR T 세포의 프래트리사이드를 보고하였다 (Mamonkin, M., et al., (2015) Blood 126: 983-992). 본 연구에서, 프래트리사이드는 시험관내 배양의 초기 단계 (형질도입 후 ~2주)에서 CD19-CAR T 세포보다 2일 내지 3일 지연된 확장을 초래하였고, 배양의 추가 단계 (형질도입 후 2~4주)에서 회복이 관찰되었으며, 이는 증가된 수의 CD5low T 세포와 연관이 있었다.
MVR-scFv의 표적 항원인 HLA-DR은 주로 항원 제시 세포 (APC)에서 발현된다. 그러나, T 세포 활성화는 이들 세포에서 HLA-DR의 상향-조절을 유도한다. 활성화된 T 세포는 그들의 표면 상에서 HLA-DR을 발현하기 때문에, MVR CAR과 같은 HLA-DR CAR로 형질도입된 T 세포는 HLA-DR을 지속적으로 인식하고 프래트리사이드 및 CAR 하향조절을 유도하는 것으로 가정되었다.
HLA-DR-표적화된 CAR T 세포는 상이한 HLA-DRB1 변이체를 갖는 T 세포 (예를 들어, HLA-DR 항체 작용제 또는 HLA-DR CAR에 대한 강력한, 중간 정도, 및/또는 약한 결합을 갖는 것으로서 특징지워진 대상체로부터의 T 세포)로부터 조작되었다. DR str , DR int , 및 DR weak T 세포를 차세대 MVR CAR 구축물로 형질도입시켰다 (도 3a). DR str , DR int , 및 DR weak PBMC로서 특징지워진 HLA-DRB1 변이체를 갖는 차세대 MVR-CAR 형질도입된 T 세포의 프래트리사이드성 정도는 CAR-항원 친화도의 함수로서 프래트리사이드 및 CAR 하향조절의 정도에 관하여 평가되었다. CD19-표적화된 CAR T (CD19 CAR T) 세포 및 비-형질도입된 T (NT T) 세포를 대조군으로서 생성하였다. DR str 및 DR int MVR CAR T 세포의 성장률 및 생육력을 평가하였다. DR str - 및 DR int -CAR T 세포 성장률과 생육력 둘 다가 형질도입 당일부터 감소되었다 (도 4a). 대조적으로, DR weak MVR CAR T 세포는 모 NT T 세포와 유사한 방식으로 계속 성장하였다 (도 4a). 더욱이, MVR CAR-양성 세포의 빈도는 DR str 및 DR int MVR CAR T 세포에서 현저하게 감소되어, MVR-CAR과 HLA-DR 간의 상호작용이 프래트리사이드성 세포 사멸에 수반된다는 것을 암시한다 (도 4b).
TCR-매개된 고갈과 유사하게, 연속적인 CAR 시그널링은 T 세포 고갈 및 관련 T 세포 기능 장애를 일으킨다 (Long, A. H. et al. (2015) Nat. Med. 21: 581-590; Frigault, M. J. et al. (2015) Cancer Immunol. Res. 3: 356-367). DR weak -CAR T 세포가 최소한의 프래트리사이드를 나타낸 경우일지라도, 시험관내 확장 동안 MVR-CAR과 DR weak -HLA-DR 간의 상호작용이 여전히 T 세포 고갈 및/또는 다른 관련 T 세포 기능 장애를 야기하는지의 여부는 명확하지 않았다. 이들 세포에서의 고갈 정도를 평가하기 위해, 대표적인 고갈 마커인 LAG-3, TIM-3, CTLA-4 및 PD-1 (문헌 [Wherry, E. J. & Kurachi, M. (2015) Nat. Rev. Immunol. 15: 486-499; Blackburn, S. D. et al., (2009) Nat. Immunol. 10: 29-37; Speiser, D. E., et al., (2016) Nat. Rev. Immunol. 16: 599-611)]의 발현을 DR int 및 DR weak MVR CAR T 세포에서 검사하였다. DR weak MVR CAR T 세포는 강력한 고갈을 나타내지 않았고, 다수의 고갈 마커를 동시에 발현하는 일은 거의 없었다 (도 5a 및 도 5b). 대조적으로, 대부분의 DR int MVR CAR T 세포 (예를 들어, 절반 초과)는 2개 이상의 대표적인 고갈 마커를 발현하였다 (도 5a 및 도 5b).
DR int -CAR T 세포의 높은 분율은 2개 이상의 고갈 마커를 발현하는 반면, DR int -PBMC로부터의 CD19-CAR T 세포는 그렇지 않았다 (MVR-CAR = 65.8%, CD19-CAR = 7.7%; 도 5b). 흥미롭게도, DR weak -CAR T 세포는 DR weak -PBMC로부터의 CD19-CAR T 세포보다 Tim-3의 약간의 증가만을 나타냈지만 (MVR-CAR = 60.7%, CD19-CAR = 36.6%), 2개 이상의 고말 마커를 수반한 CAR T 세포의 빈도는 유사하였다 (MVR-CAR = 9.2%, CD19-CAR = 9.4%). 이들 데이터는 MVR-CAR과 HLA-DR의 상호작용에 의해 야기되는 프래트리사이드 및 고갈이 DR weak -CAR T 세포에서 최소이고 허용가능한 반면, 프래트리사이드 및 고갈은 DR str - 및 DR int -CAR T 세포에서 심각하고 본질적으로 회복 불가능하다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 MVR CAR과 HLA-DR의 상호작용에 의해 야기되는 프래트리사이드 및 고갈이 DR weak MVR CAR T 세포에서 최소인 반면, 이들은 DR str 및 DR int MVR CAR T 세포에서 심각하다는 것을 표시한다.
본 실시예는 T 세포의 감수성 선택이 프래트리사이드에 의해 모방되었다는 것을 입증한다. 더욱이, 이들 결과는 DR str MVR CAR T 세포와 대조적으로, DR weak MVR CAR T 세포는 가벼운 프래트리사이드 및 고갈을 나타내었으며, 이는 MVR CAR과 DR weak HLA-DR 간의 낮은 친화도 상호작용이 제한된 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 표시한다. 실제로, DR weak MVR CAR T 세포는 DR weak B 세포에 대한 세포독성이 없었지만, DR str B 세포를 사멸시켰다. 이러한 결과는 프래트리사이드성 선택이, 잠재적으로 유해한 CAR T 세포가 검출되고 제거되는 CAR T 세포 개발에 유용한 전략일 수 있다는 것을 시사한다.
하기 실시예 섹션에서 사용된 MVR CAR T 세포는 달리 명시되지 않는 한 DR weak MVR CAR T 세포이다.
실시예 2 - CAR-HLA-DR 상호작용은 표면 MVR CAR을 하향조절한다
본 실시예는 T 세포에서의 HLA-DR CAR의 표면 발현을 기재한다. DR str 및 DR int MVR CAR T 세포는 CAR의 심한 하향조절을 나타내었지만 (도 4b), DR weak MVR CAR T 세포는 CD19 CAR T 세포보다 대략 2배 더 낮은 표면 CAR 발현을 나타냈다 (도 4b, 도 7a). 이러한 차이는 293T 세포주 및 MVR CAR 또는 CD19 CAR 렌티바이러스 벡터의 다양한 감염 다중도로 형질도입된 1차 DR weak T 세포에서 확증되었다 (도 7b). MVR CAR의 표면 발현은 293T 세포주에서 감염 다중도에 따라 증가되었지만 (좌측 패널), 1차 DR weak T 세포에서의 발현은 본질적으로 일정하게 유지되었다 (우측 패널) (도 7b).
CAR 발현의 종방향 분석 결과, 최고 수준의 표면 MVR CAR을 발현하는 DR weak T 세포가 형질도입 후 2일 (활성화 후 4일)에 존재하였고, MVR CAR이 T 세포 활성화 주기의 14일에 걸쳐 점차적으로 하향조절되었다는 것이 밝혀졌다 (도 7c). DR weak MVR CAR T 세포에서의 CAR mRNA 및 단백질 수준은 CD19 CAR T 세포에서와 유사하거나 그보다 더 높았으며, 이는 표면 CAR이 번역 후에 하향조절된다는 것을 표시한다 (도 7d, 도 3b).
MVR CAR의 하향조절이 MVR CAR과 HLA-DR의 상호작용에 의해 유도되었는지를 결정하기 위해, CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 HLA-DR-결핍성 MVR CAR T 세포를 생성하려는 시도가 반복되었다. 그러나, 이러한 시도는 아마도 T 세포에서 HLA-DR의 공지되지 않은 생존 이점으로 인해 반복적으로 실패하였다. 악성 B 세포 상에서의 더 높은 HLA-DR 발현 프로파일로 인해, 본 발명자들은 DR weak -CAR T 세포 자체에 의한 허용가능한 면역 활성화에도 불구하고, 악성 세포 모델인 EBV-LCL이 적절한 면역 활성화를 유도할 수 있다고 추정하였다. 따라서, 본 발명자들은 HLA-DR에 결함있는 엡스타인-바르 바이러스-유도된 림프모구양 세포주 (ΔDR-EBV LCL)를 생성하었고, 이들 세포를 MVR CAR 렌티바이러스로 형질도입하였다. ΔDR-EBV LCL은 DR weak EBV LCL보다 더 높은 수준의 MVR CAR을 발현하였고, DR weak EBV LCL과의 접촉 후 발현이 감소하였으며, 이는 MVR CAR-HLA-DR 상호작용이 MVR CAR 하향조절에 책임이 있다는 것을 시사한다 (도시되지 않음). 추가의 면역형광 실험은 CAR이 DR weak MVR CAR T 세포 및 CD19 CAR T 세포 내의 막 상에 위치하였다는 것을 나타내었다 (도 8). 이러한 데이터는 표면 MVR CAR의 지속적인 하향조절이 HLA-DR과의 상호작용으로 인해 DR weak MVR CAR T 세포의 시험관내 확장 동안 발생한다는 것을 시사한다.
따라서, 본 실시예는 TCR로 관찰되는 것과 유사한 감수성 선택이 프래트리사이드에 의해 CAR T 세포에서 모방될 수 있다는 것을 입증하였다. MVR CAR과 HLA-DR 간의 친화도가 강력한 면역 활성화를 유도하기에 충분히 높기 때문에, DR str 및 DR int MVR CAR T 세포는 실질적인 프래트리사이드에 수반되었다. 강렬한 면역 활성화는 DR int MVR CAR T 세포의 상승된 고갈 수준으로부터 추론되었다 (도 5a 및 도 5b). 대조적으로, DR weak MVR CAR T 세포는 가벼운 프래트리사이드 및 고갈을 나타냈으며, 이는 MVR CAR과 DR weak HLA-DR 간의 친화도가 면역 반응을 제한하기에 충분히 낮다는 것을 표시한다. 실제로, DR weak MVR CAR T 세포는 DR weak B 세포에 대한 세포독성이 없었지만, DR str B 세포를 사멸시켰다. 따라서, DR weak MVR CAR T 세포는 프래트리사이드성 선택에서 살아남을 수 있고 그의 표면 상의 CAR을 하향조절할 수 있다. 본 개시내용은 프래트리사이드성 선택이, 잠재적으로 유해한 CAR T 세포가 검출되고 제거되는 CAR T 세포 개발에 유용한 전략일 수 있다는 인식을 포괄한다.
실시예 3 - HLA-DR CAR T 세포는 정상 B 세포는 보존하면서 악성 세포를 사멸시킨다
본 실시예는 CD19 CAR T 세포와 DR weak MVR CAR T 세포의 면역 활성화 능력을 비교함으로써 프래트리사이드성 선택 및 CAR 하향조절의 기능적 결과의 분석을 기재한다. CD19 및 HLA-DR을 지속적으로 발현하는 EBV LCL을 활성화에 사용하였다. DR weak MVR CAR T 세포 및 표적 세포의 HLA-DRB1 대립유전자를 매칭시키기 위해, DR weak B 세포의 EBV 형질전환에 의해 EBV LCL을 생성하였다. 따라서, CD19 CAR T 세포와 DR weak MVR CAR T 세포의 기능적 활성을 DR weak EBV LCL에 대항하여 비교하였다 (도 11). 그의 HLA-DR이 MVR CAR과 강력하게 결합하여 강력한 면역 활성화를 유도하는 DR str EBV LCL이 양성 대조군으로서 제공되었다.
증식은 T 세포 활성화의 대표적인 특색 중 하나이다. 활성화시 접촉 후 MVR-CAR T 세포의 증식가능성을 평가하기 위해, HLA-DR CAR T 세포를 예시적인 악성 세포주와 공동 배양하였다. 구체적으로, MVR-CAR T 세포를 상이한 결합 친화도의 HLA-DR 변이체를 수반한 엡스타인-바르 바이러스-유도된 림프모구양 세포주 (EBV-LCL) 세포인 EBV-LCL DR weak - 또는 DR str -EBV-LCL과 공동 배양하였다. 흥미롭게도, MVR-CAR T 세포는 DR weak -EBV-LCL 접촉 후 CD19-CAR T 세포와 유사한 증식을 나타내었다 (도 6, a 및 도 9c). 그리고 증식은 MVR-CAR T 세포와 DR str -EBV-LCL 간에서와 같은 강력한 CAR-표적 상호작용으로 추가로 현저하였다.
표적 항원 인식 후, T 세포는 용해성 과립, 시토카인 및/또는 케모카인을 분비하여 표적 세포를 직접 사멸시키고 면역 체계를 활성화시킨다. T 세포가 병원체 및 종양을 효율적으로 억제할 수 있다는 점에서 T 세포는 이러한 모든 특색을 동시에 나타내는 다기능성으로서 간주된다 (Yuan, J., et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci USA 105: 20410-20415; Ding, Z.C., et al. (2012) Blood 120: 2229-2239; Chiu, Y.L., et al. (2014) J. Clin. Invest. 124: 198-208; Franzese, O., et al. (2016) Oncoimmunology 5: e1114203). MVR-CAR과 DR weak -HLA-DR 간의 약한 상호작용을 고려하면, EBV-LCL 상에서 DR weak -HLA-DR의 인식 후 MVR-CAR T 세포가 적절하게 증식되는 경우일지라도, 상기 MVR-CAR T 세포가 T 세포 기능에 충분한지의 여부는 명확하지 않았다.
다기능성 (즉, 동시 탈과립화 및 시토카인 및/또는 케모카인 분비)을 평가하기 위해, EBV-LCL과의 6시간의 공동 배양 후, 5개의 상이한 마커, 즉 IFN-γ, TNF, IL-2, MIP-1β 및 CD107a의 동시 발현에 관하여 MVR-CAR T 세포를 평가하였다 (도 10). DRstr-EBV-LCL과 공동 배양한 경우에, 2개 이상의 다기능성 마커를 갖는 MVR-CAR T 세포의 분율은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 CD19-CAR T 세포의 것과 유사하였다 (2개 이상의 마커의 빈도; CD4+ MVR-CAR T = 71.3%, CD4+ CD19-CAR T = 63.6%, CD8+ MVR-CAR T = 29.4%, CD8+ CD19-CAR T = 24.6%; 도 6, b 및 도 10). 흥미롭게도, DRweak-EBV-LCL과의 공동 배양은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 MVR-CAR T 세포의 다기능성 반응을 유도하였다. 특히, CD4+ MVR-CAR T 세포의 다기능성 능력은 CD19-CAR T 세포의 것보다 더 낮았지만, CD8+ 집단은 그렇지 않았다 (2개 이상의 마커의 빈도; CD4+ MVR-CAR T = 31.6%, CD4+ CD19-CAR T = 65.1%, CD8+ MVR-CAR T = 26.3%, CD8+ CD19-CAR T = 25.4%). 요약하면, 이들 데이터는 DRweak-EBV-LCL이 MVR-CAR T 세포의 면역 활성화의 역치를 교차하기에 충분한 시그널을 제공할 수 있었다는 것을 뒷받침해준다.
CAR T 세포의 중요한 기능은 표적 세포의 세포 사멸을 유도하는 것이다. 본 발명자들은 EBV LCL에 대항한 DR weak MVR CAR T 세포의 세포독성 사멸 효능을 평가하였다. DR weak MVR CAR T 세포는 CD19 CAR T 세포에 의한 사멸과 유사한 DR weak EBV LCL의 용량-의존적 사멸을 나타낸 반면, CD19 CAR T 세포보다 더 효율적으로 DR str EBV LCL을 사멸시켰다 (도 6, c). DR weak MVR CAR T 세포의 초기 확장 동안 관찰된 제한된 분열에 프래트리사이드에 근거하여 (도 4a), 이들 결과는 DR weak HLA-DR과 MVR CAR 간의 낮은 친화도가, EBV LCL을 활성화된 T 세포와 구별하는데 사용될 수 있다는 것을 표시하지만, 둘 다는 DR weak HLA-DR을 발현한다.
CD19 CAR T 세포는 CD19 CAR T 세포-주입된 환자에서 표적-맞춤 종양 제거 독성, 예컨대 B 세포 무형성증을 유발한다. DR weak MVR CAR T 세포의 표적-맞춤 종양 제거 사멸 효능을 평가하기 위해, 본 발명자들은 B 세포 및 EBV LCL에 대항한 세포독성을 동시에 평가하기 위한 시험관내 표적-맞춤 사멸 검정을 설계하였다. 그들의 사멸 효능과 일치하여, CD19 CAR T 및 DR weak MVR CAR T 세포는 DR str 및 DR weak EBV LCL에 대항한 세포독성 활성을 나타냈다 (도 9b). 두드러지게, DR weak B 세포는 DR weak MVR CAR T 세포의 영향을 받지 않은 반면, DR str B 세포는 사멸되었다. 프래트리사이드성 선택 및 CAR 하향조절이 DR weak MVR CAR T 세포의 사멸 선택성에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 형질도입 후 제2일 및 제12일에 DR weak MVR CAR T 세포를 대상으로 (각각 도 7c에서 D2 및 D12 MVR CAR T) 시험관내 표적-맞춤 사멸 검정을 수행하였다. D2 MVR CAR T 세포는 DR weak B 세포와 DR weak EBV LCL 둘 다에 대항하여 D12보다 유의하게 더 높은 사멸 활성을 나타냈으며 (비-대응표본 양측 t-검정; LCL, p = 0.0050; B 세포, p = 0.0285; 도 9a), 이는 프래트리사이드성 선택 및 CAR 하향조절이 세포독성 역치를 조정하였다는 것을 표시한다. 취합해 보면, 이들 관찰 내용은 DR weak MVR CAR T 세포가 DR weak EBV LCL에 의해 활성화되고 DR weak EBV LCL을 독점적으로 사멸한다는 것을 시사하며; 이러한 사멸은 MVR CAR의 하향조절에 의해 추가로 개선된다. 표면 CAR의 하향조절이 프래트리사이드성 선택 동안 자율적으로 발생하고 결국 감수성 조정을 초래한다. 일부 경우에, 본 발명자들은 이러한 프로세스를 '자동조율'으로서 지칭한다. 따라서, 프래트리사이드성 선택 및 CAR 하향조절을 겪은 HLA-DR CAR T 세포는 악성 세포를 특이적으로 표적화하고 사멸시킬 수 있다.
실시예 4 - 특이적 표적화는 항원 및 CAR 수준에 좌우된다
본 실시예는 본 개시내용의 예시적인 HLA-DR CAR T 세포에 의해 나타나는 악성 세포에 대한 특이적 표적화 특성의 특징화를 기재한다. DR weak B 세포는 12일 동안 배양된 HLA-DR CAR T 세포 (D12, '자동조율됨')보다 2일 동안 배양된 HLA-DR CAR T 세포 (D2, '비조율된')와 공동 배양될 때 세포 사멸에 더 취약하였다 (도 7c 및 도 9a). 그러나, 세포 사멸의 정도는 여전히 DR weak EBV LCL의 것보다 더 낮았다. 이는 DR weak EBV LCL이 DR weak MVR CAR T 세포에 의해 유도된 세포독성에 더 취약하게 하는 또 다른 요인이 있다는 것을 표시한다. 하나의 가능한 요인은 EBV LCL이 Fas 및 TRAIL-R2를 발현하므로, FasL 및 TRAIL과의 결합 후 세포 사멸을 유도시키는 사멸 수용체의 존재이다 (Xiang, Z. et al. (2014) Cancer Cell 26: 565-576). 이러한 효과를 분석하기 위해, 차단제를 사용하여 세포독성 사멸의 4가지 주요 경로 (FasL, TRAIL, 퍼포린-1 및 그랜자임 B)를 차단하였고 (문헌 [Martinez-Lostao, L., et al., (2015) Clin. Cancer. Res. 21: 5047-5056]), CAR T 세포의 사멸 효능을 평가하였다. 차단제에 의한 사멸의 억제는 DR weak MVR CAR T 세포와 CD19 CAR T 세포 간에 상이하지 않았다. FasL 및 TRAIL의 차단은 사멸 효능에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 반면, 퍼포린-1 또는 그랜자임 B의 억제는 사멸 효능을 15-20%만큼 감소시켰다 (도시되지 않음). 이는 DR weak EBV LCL의 세포 사멸이 주로 세포 용해성 과립-매개된 경로를 수반하지만, 사멸 수용체-매개된 경로는 포함하지 않는다는 것을 시사한다.
DR weak EBV LCL을 세포독성 사멸에 보다 취약하게 만드는 또 다른 가능한 요인은 HLA-DR의 상향조절인데 (문헌 [Zhang, Q. et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 1467-1470]), 이는 증가된 수준의 표적 항원이 CAR T 세포에 의한 보다 효율적인 사멸을 초래하기 때문이다 (Caruso, H. G. et al. (2015) Cancer Res. 75: 3505-3518; Liu, X. et al.(2015) Cancer Res. 75: 3596-3607). 따라서, 본 발명자들은 B 세포 및 EBV LCL의 표면 상에서의 CD19 및 HLA-DR의 발현에 있어서의 변화를 조사하였다. HLA-DR은 EBV로의 형질전환 후 시험된 모든 공여자에서 상향조절된 반면 (B 세포 = 42,590 ± 2,458, EBV LCL = 78,513 ± 8,963, 평균 ± s.e.m., n = 6), CD19는 4명의 공여자에서 하향조절되었고 2명의 공여자에서만 상향조절되었다 (도 9i). DR weak MVR CAR T 세포의 DR weak EBV LCL-특이적 사멸에 대한 DR weak HLA-DR 상향조절의 기여를 검사하기 위해, 본 발명자들은 DR weak HLA-DR-상향조절된 B 세포의 사멸에 대한 취약성을 평가하였다. 리포폴리사카라이드-자극된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 존재하는 B 세포는 자극되지 않은 PBMC에서의 것들보다 더 높은 수준의 HLA-DR을 발현하였다 (도 9d). B 세포 상에서의 HLA-DR 발현은 자극 후 2-3일에 정점에 이르렀고, 피크 수준은 EBV LCL 상에서의 것과 유사하였다 (제2일 리포폴리사카라이드-자극된 B 세포 = 86,383 ± 7,217, 제3일 = 82,945 ± 6,395, 평균 ± s.e.m., n = 6). 본 발명자들은 사멸 검정에서 표적 세포로서 3일 동안 리포폴리사카라이드로 자극된 DR weak PBMC를 사용하였고, 뿐만 아니라 이펙터 세포로서 자동조율된 및 비조율된 MVR CAR T 세포 (CAR 발현에 있어서 5.6배 차이를 나타냄)를 사용하였다 (도 9e; 자동조율된 = 124,854 ± 2,531, 비조율된 = 698,123 ± 7,458, 평균 ± s.e.m., n = 4). 리포폴리사카라이드-자극된 DR weak B 세포는 자극되지 않은 DR weak B 세포보다 DR weak MVR CAR T 세포-유도된 사멸에 더 취약하였다 (도 9e). 더욱이, 비조율된 DR weak MVR CAR T 세포는 자동조율된 세포보다 사멸에서 더 효율적이었다. 이들 관찰 내용은 자동조율과 HLA-DR 상향조절 둘 다가 증가된 세포독성 사멸에 기여한다는 것을 표시한다.
적어도 8일 (예를 들어, 12일) 동안의 HLA-DR CAR T 세포 배양물은 MVR-CAR T 세포의 증강된 정상/악성 종양 선택성을 나타내었고 (도 9a), 자동-조율에만 선택성을 부여하는 것이 완전히 설득력이 있는 것은 아니다. 따라서, 본 발명자들은 표적 세포 표면 상에서의 HLA-DR의 정량적 변화를 조사하고자 하였다. 6명의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 EBV-LCL을 생성하고, EBV 형질전환 동안 CD19 및 HLA-DR 표면 발현의 변화를 평가하였다. EBV-LCL은 ~2배 더 높은 수준을 나타내는 2명을 제외하고는 정상 B 세포와 유사하거나 또는 심지어 정상 B 세포보다 더 낮은 수준의 CD19를 표시하였다 (도 9i). 흥미롭게도, HLA-DR 양은 EBV 형질전환 후 6명의 공여자 모두에서 상향-조절되었고, 특히 DRweak-B 세포보다 DRweak-EBV-LCL에서 ~2배 더 높았다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 MVR-CAR의 약한 친화도에서, 그 결합 량은 면역학적 시냅스의 강도 및 그에 따른 기공 형성 및 과립 전달 속도를 지시한다고 가정하였다. 이러한 가설을 검증하기 위해, CAR T 세포가 정상 B 세포 및 EBV-LCL과 접촉한 후에 전달된 과립을 측정하였다 (도 9j). 흥미롭게도, MVR-CAR은 정상 DRweak-B 세포에서 과립을 전달하지 않은 반면, 강력한 과립 전달 속도는 DRstr-B 세포에서 관찰되었다 (도 9f 및 도 9k). 반대로, DRweak-EBV-LCL은 MVR-CAR T 세포와의 접촉 후에 증가된 과립 전달 속도를 표시하였고, DRstr-EBV-LCL은 2 내지 3배 더 높은 과립 전달 속도를 나타냈으며 (도 9f 및 도 9l), 이는 이전의 사멸 효능 데이터와 일치하였다 (도 6, c 및 도 6, d).
강력한 TCR 시그널은 T 세포에서 표적 세포로의 활성 과립 전달을 유도한다30,31. 따라서, MVR CAR에 의한 과립의 전달 정도는 MVR CAR-HLA-DR 상호작용의 강도에 의존할 수 있다. 본 발명자들은 CAR T 세포와 B 세포 또는 EBV LCL 간의 접촉 후 시간이 지남에 따라 전달되는 과립의 양을 측정하였다. B 세포 또는 EBV-LCL 및 각각의 바이올렛-표지된 T 세포를 2:1의 E:T 비 하에 지시된 시간 동안 공동 인큐베이션한 후, 도 9j에서와 같은 척도인 전달된 과립을 정량화하기 위한 세포내 염색 및 유동 세포계수법 분석을 수행하였다. DR weak MVR CAR T 세포와 접촉한 후 90분 동안 DR weak B 세포 내로의 측정가능한 과립 유입은 없는 반면, DR weak EBV LCL 내로의 과립 유입은 시간이 지남에 따라 용이하게 검출되고 증가되었다. 대조적으로, DR str B 세포 및 DR str EBV LCL 내로의 과립 유입은 DR weak MVR CAR T 세포와의 접촉 후 신속하였고, CD19 CAR T 세포보다 2배 내지 4배 더 컸다 (도 9f).
T 세포로부터 전달된 용해성 과립은 표적 세포의 아폽토시스를 적극적으로 유도한다32. CAR T 세포와 접촉하는 카스파제 3/7-활성화된 EBV LCL의 시간 경과 영상화는 CD19 CAR T 및 DR weak MVR CAR T 세포가 아폽토시스성 DR str 및 DR weak EBV LCL의 분율을 점진적으로 증가시켰다는 것을 보여주었다 (도 9g 및 도 9h). 상호작용의 동역학은 그랜자임 유입의 것들과 유사하였으며, 이는 과립 전달이 DR weak MVR CAR T 세포-유도된 세포독성의 주요 원인이었다는 것을 시사한다. 집합적으로, 이들 데이터는 자동조율된 DR weak MVR CAR T 세포가 DR weak HLA-DR의 수준을 감지하고 용해성 과립 전달에 의해 표적 세포의 사멸을 유도한다는 것을 시사한다.
실시예 5 - MVR CAR T 세포는 생체내에서 증강된 HLA-DR 수준을 감지한다
본 실시예는 동물 모델에서 본 개시내용의 예시적인 HLA-DR CAR T 세포의 생체내 활성을 기재한다. DR weak MVR CAR T 세포를 DR weak EBV LCL-이종 이식편 C;129S4-Rag2 tm1.1Flv Il2rg tm1.1Flv /J 마우스 내로 전달하면, EBV LCL-유도된 종양이 억제되었다 (도 12a 및 도 12b). 비록 그 차이는 유의하지 않지만 (이원 ANOVA; p = 0.5175), DR weak MVR CAR T 세포에 대한 효능보다 CD19 CAR T 세포에 대한 효능이 더 높은 것으로 나타났다. 생리적 조건 하에서 DR weak MVR CAR T 세포의 항원-수량-기반 표적-세포 선택성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 생체내 표적-맞춤 사멸 검정을 설계하였다. 이러한 검정에서, 본 발명자들은 DR weak B 세포 및 DR weak EBV LCL로 이식된 마우스를 사용하였다. 이는 CAR T 세포-주입된 마우스에서 2개의 세포 집단의 박멸 속도의 관찰을 가능하게 하였다 (도 12c). 예상한 바와 같이, DR weak MVR CAR T 세포 또는 CD19 CAR T 세포가 주입된 마우스에서는 종양 퇴행이 관찰되었지만, NT T 세포가 주입된 마우스에서는 종양 퇴행이 관찰되지 않았다 (도 12d). 특히, 말초 혈액 DR weak B 세포는 DR weak MVR CAR T 세포-주입된 마우스에서 지속되는 반면, 대부분의 DR weak B 세포는 CD19 CAR T 세포-주입된 마우스에서 2일 이내에 제거되었다 (도 12e 및 도 12f, a 및 도 12f, b). 본 발명자들은 종양 억제가 활성일 때, T 세포 주입 후 7일까지 DR weak MVR CAR T 세포가 주입된 마우스와 CD19 CAR T 세포가 주입된 마우스 간의 DR weak B 세포 카운트 상의 차이를 관찰하였다. 흥미롭게도, DR weak MVR CAR T 세포-주입된 마우스로부터의 잔류 DR weak B 세포에 의한 HLA-DR의 발현은 NT T 세포-주입된 마우스에 의한 것보다 더 낮았으며 (도 12f, c), 이는 시험관내에서 관찰된 바와 같이 (도 9d 및 도 9e), 이종-반응에 의해 활성화된 HLA-DR-상향조절된 DR weak B 세포가 생체내에서 DR weak MVR CAR T 세포-유도된 세포독성에 대한 증가된 취약성을 가졌다는 것을 시사한다. 또한, DR weak MVR CAR T 세포-주입된 마우스의 혈장 IFN-γ 수준은 시험관내 결과와 일치하여 (도 6, b 및 도 10, b), CD19 CAR T 세포-주입된 마우스의 것보다 더 낮았다 (도 12e). 취합해 보면, 이들 데이터는 DR weak MVR CAR T 세포가 생리학적 조건 하에서 DR weak HLA-DR 수준을 감지한다는 것을 보여주는 시험관내 결과를 확인시켜 준다.
이상, 본 발명은 실시예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명은 첨부된 청구 범위에 기재되어 있는 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 다양한 형태로 변화 및 변형될 수 있는 것으로 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 수 있다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을, 일상의 실험만을 사용하여 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 설명에 제한되는 것이 아니라, 청구범위에 제시된 바와 같다.
SEQUENCE LISTING <110> Eutilex Co., Ltd. <120> HLA-DR CAR-T Compositions and Methods of Making and Using the Same <130> 47683-0025WO1 <140> PCT/IB2018/000227 <141> 2018-02-21 <150> 62/461,632 <151> 2017-02-21 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 2 Arg Tyr Ser Val His 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 3 Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 4 Cys Ala Arg Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 15 Trp <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 6 Lys Ala 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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 130 135 140 Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ile Thr Ser Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser 165 170 175 Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 180 185 190 Met Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 195 200 205 Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys 210 215 220 Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 225 230 235 240 Asn Glu Gly Asp Thr Thr Ala Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 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<211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 24 Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Phe Leu Asp Arg Tyr Phe His 1 5 10 15 Asn Gln Glu Glu Asn Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 25 Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Tyr Leu Asp Arg Tyr Phe His 1 5 10 15 Asn Gln Glu Glu Asn Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 26 Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Leu Glu Arg His Phe His 1 5 10 15 Asn Gln Glu Glu Leu Leu Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 27 Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Gln Phe Leu Glu Arg Leu Phe Tyr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Glu Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 28 Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Phe Leu Glu Arg Tyr Phe His 1 5 10 15 Asn Gln Glu Glu Asn Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 29 Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Leu Glu Arg Cys Ile Tyr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Glu Ser Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu 20 25 30 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 30 Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Tyr Leu His Arg Gly Ile Tyr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Glu Asn Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic polypeptide <400> 31 Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Leu Leu Glu Arg Arg Val His 1 5 10 15 Asn Gln Glu Glu Tyr Ala Arg Tyr Asp Ser Asp Val Gly Glu 20 25 30

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  12. 하기 단계를 포함하는, 자가 조작된 T 세포를 제조하는 방법:
    대상체로부터의 T 세포에 대한 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HLA-DR 분자; 또는 10번 위치의 Phe, 11번 위치의 Leu, 12번 위치의 Asp, 13번 위치의 Arg, 14번 위치의 Tyr, 15번 위치의 Phe 및 16번 위치의 Tyr로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는 서열식별번호: 19의 서열을 포함하는 HLA-DR 분자; 에 결합하는 HLA-DR 항원 결합 도메인의 결합도 분석을 제공하거나 또는 수득하는 단계; 및
    결합도가 서열식별번호: 19의 서열을 포함하는 HLA-DR 분자에 대한 친화도 대비 낮은 경우에, 상기 HLA-DR 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 대상체로부터의 T 세포를 조작하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, HLA-DR 항원 결합 도메인이 MVR-scFv 또는 그의 변이체인 방법.
  14. 제12항에 있어서, CAR이 T 세포 수용체-ζ (TCR-ζ)의 세포내 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, CAR이 CD8α 막횡단 도메인 및 4-1BB 시그널링 도메인 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 자가 조작된 T 세포를 시험관내에서 적어도 12일 동안 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 배양하는 단계가, 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 CAR의 감소된 표면 발현을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 배양하는 단계가, 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 정상 B 세포에 대한 감소된 독성을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 배양하는 단계가, 시험관내에서 2일 동안 배양시킨 자가 조작된 T 세포 집단에 대비하여 비-악성 세포보다 악성 세포에 대한 증강된 선택성을 갖는 자가 조작된 T 세포 집단을 생산하는 것인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 자가 조작된 T 세포가 대상체로부터 정상 B 세포로의 과립 전달보다 적어도 2배 더 많은 수준으로 EBV LCL로의 과립 전달을 유도하는 것인 방법.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
EP3273994B1 (en) 2015-03-27 2021-12-01 University of Southern California Car t-cell therapy directed to lhr for the treatment of solid tumors
CA2987992A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 University Of Southern California Lym-1 and lym-2 targeted car cell immunotherapy
CA3080109A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Sorrento Therapeutics, Inc. Cd38-directed chimeric antigen receptor constructs
EP3835320A4 (en) 2018-08-10 2022-06-01 Eutilex Co., Ltd. BINDING OF CHEMERA ANTIGEN RECEPTOR TO HLA-DR, AND CAR-T CELL
CN113710703A (zh) 2019-02-15 2021-11-26 南加利福尼亚大学 Lym-1和lym-2抗体组合物及改进的car构建体
KR20220030248A (ko) * 2019-06-27 2022-03-10 주식회사 유틸렉스 4-1bb 공동자극 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101605421B1 (ko) * 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
US20170335281A1 (en) * 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
EP3001021B1 (en) * 2014-09-25 2020-06-24 United Technologies Corporation Hail screen in the inlet of a conduit to a heat exhanger of an aircraft engine
CA2969456A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for adoptive cell therapy
CA2987992A1 (en) * 2015-06-04 2016-12-08 University Of Southern California Lym-1 and lym-2 targeted car cell immunotherapy
AU2016277121C1 (en) * 2015-06-12 2022-07-14 Lentigen Technology, Inc. Method to treat cancer with engineered T-cells
EP3307282A4 (en) * 2015-06-12 2019-05-01 Immunomedics, Inc. TREATMENT OF DISEASES WITH CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CAR) AND T-CELL (T-CAR) OR NK (CAR-NK) CELL EXPRESSION CONSTRUCTIONS CAR CONSTRUCTIONS
MA42895A (fr) * 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
MA43380A (fr) * 2015-12-03 2018-10-10 Juno Therapeutics Inc Récepteurs chimériques modifiés et compositions et procédés associés
WO2018005559A1 (en) * 2016-06-27 2018-01-04 Juno Therapeutics, Inc. Method of identifying peptide epitopes, molecules that bind such epitopes and related uses
JP2020501512A (ja) * 2016-09-23 2020-01-23 ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア キメラ抗原受容体およびその組成物ならびにそれらの使用の方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Res. 2006, 66(3):1799-808.
Human Immunology. 1983, 8:249-254.

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JP2020508080A (ja) 2020-03-19
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