KR101820582B1 - 항체 제제 및 이의 용도 - Google Patents

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트라콘 파마수티칼즈, 인코포레이티드
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Abstract

본원은 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제제, 및 이의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양태는 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제제의 예비충전된 주사기에 관한 것이다. 또 다른 양태는 혈관신생 관련 장애, 예컨대, 암 및 안과적 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소시키기 위한 상기 제제의 용도에 관한 것이다.

Description

항체 제제 및 이의 용도{ANTIBODY FORMULATIONS AND USES THEREOF}
교차참조
본원은 2012년 9월 5일자로 출원된 미국 가출원 제61/697,111호(이 출원은 온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)의 이익을 주장한다.
본원은 하기 동시계류 특허출원들에 관한 것이다: 미국 특허 공보 제2010-0098692 A1호[대리인 사건 번호 35882-706.201]; 미국 특허 제8,221,753호[대리인 사건 번호 35882-706.202]; 미국 특허출원 제13/485,702호[대리인 사건 번호 35882-706.301]; 및 미국 특허출원 제13/390,896호[대리인 사건 번호 35882-712.201](이들은 그 전문이 본원에 참고로 도입됨).
서열목록
본원은 EFS-웹을 통해 ASCII 형식으로 제출되었고 온전히 그대로 본원에 참고로 도입되는 서열목록을 함유한다. 2013년 9월 4일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 35882-714.601_SL.txt로 명명되고 그의 크기는 22,121 바이트이다.
암은 관상 질환 다음으로 인간 사망의 두 번째 주요 원인이다. 전세계적으로, 해마다 수백만 명의 사람들이 암으로 인해 사망한다. 미국에서만, 암은 해마다 오십만 명 초과의 사람들의 사망을 야기하고, 해마다 약 140만 건의 새로운 사례가 진단된다. 심장 질환으로 인한 사망은 유의하게 감소하고 있지만, 암으로 인한 사망은 일반적으로 증가하고 있다. 많은 국가들에서, 암은 이미 사망의 주요 원인이다.
더욱이, 그들의 일차 암으로부터 초기에 생존한 암 환자들의 경우조차도 공통된 경험은 그들의 삶이 급격히 변경된다는 것을 보여주었다. 많은 암 환자들이 재발 또는 치료 실패에 대한 가능성의 자각에 의해 유발된 강한 불안을 경험한다. 많은 암 환자들은 치료 후 상당한 신체적 쇠약을 경험한다.
일반적으로 말하자면, 치명적인 암의 관리에 있어서 근본적인 문제점은 효과적인 무독성 전신 치료의 결여이다. 암은 비-조절된 세포 생장을 초래하는 유전적 돌연변이를 특징으로 하는 복잡한 질환이다. 암성 세포는 모든 유기체들에 존재하고, 정상 환경 하에서 그들의 과도한 생장은 다양한 생리학적 인자들에 의해 철저히 조절된다.
혈관신생은 새로운 혈관이 기존 혈관으로부터 발생하는 생리학적 과정이다. 혈관신생은 정상 과정 및 병리학적 과정 둘다에서 일정한 역할을 수행하는 것으로 암시되어 있다. 예를 들면, 혈관신생 과정은 동물 장기 및 조직의 혈관 시스템의 발생에 관여한다.
특정 병리학적 상태에서, 혈관신생은 적절한 혈액 및 영양분 공급을 영향받은 조직 내의 세포에게 제공하기 위한 수단으로서 자극된다. 대다수의 이들 병리학적 상태들은 비정상적인 세포 증식 및/또는 조절을 수반한다. 고형 암 및 삼출성 황반 변성은 계속된 생장 및 전이를 위한 새로운 혈액 공급의 동원에 의존한다.
본원은 항-CD105 항체의 신규 제제, 이 제제를 함유하는 예비충전된 주사기, 및 혈관신생 관련 장애를 치료하기 위한 이러한 제제의 용도를 제공한다. 본원은 예를 들면, CD105와 관련된 암 및 안과적 병태(질병)(ophthalmologic condition)의 치료를 위한 정맥내 또는 안내 투여를 위해 사용될 수 있는 제제를 제공한다.
한 양태에서, 본원은 약 1 mg/㎖ 내지 약 150 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 100 mM 이하의 완충제 및 약 1 M 이하의 폴리올을 포함하고 약 4.0 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제제를 제공한다.
한 양태에서, 상기 제제는 제조 후 안정하고, 이것은 통상적인 수단에 따라 시험될 수 있다. 시간에 따른 상기 제제의 안정성에 대하여, 95% 이상의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정될 때 약 12개월 이상 동안 약 2℃ 내지 8℃에서 저장된 후 단량체로서 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 제제의 완충제는 히스티딘 또는 포스페이트 완충 식염수이다. 시간에 따른 상기 제제의 안정성에 대하여, 90% 이상의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정될 때 약 6개월 이상 동안 약 25℃에서 저장된 후 단량체로서 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 제제의 완충제는 아세테이트이다.
추가로, 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 12개월 이상 동안 약 2℃ 내지 8℃에서 저장된 후 CD105 ELISA 결합 분석에 의해 약 50% 내지 약 150%의 결합을 나타낼 수 있다.
항-CD105 항체의 평균 등전점(pI)은 예를 들면, 모세관 전기영동-등전 포커싱에 의해 측정될 때 약 12개월 이상 동안 2℃ 내지 8℃에서 저장된 후 약 8.7 내지 약 9.2일 수 있다.
당업자는 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약 12개월 이상, 약 18개월 이상, 약 24개월 이상, 약 30개월 이상, 약 36개월 이상 또는 이보다 오랜 기간 동안 안정할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
제제는 제제의 동결 및 해동 주기 후 SEC에 의해 측정될 때 단량체로서 존재하는 95% 이상의 항-CD105 항체를 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제제는 교반 스트레스를 받은 경우 SEC에 의해 측정될 때 단량체로서 존재하는 95% 이상의 항-CD105 항체를 함유할 수 있다.
항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD105에 결합할 수 있는 CDR들의 임의의 서열을 포함할 수 있다. 한 비-한정적 실시양태에서, 항-CD105 항체는 서열 번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 서열 번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역(CL); 서열 번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 불변 영역(Fc)을 포함한다(예를 들면, 도 1 참조).
또 다른 비-한정적 실시양태에서, 항-CD105 항체는 서열 번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열 번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 서열 번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 번호 10으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함한다.
단리된 인간화된-탈면역화된 항-CD105 항체는 서열 번호 11로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 인간화된-탈면역화된 중쇄의 다른 비-한정적 예로는 서열 번호 13, 14, 15 및 16이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 인간화된-탈면역화된 경쇄의 다른 비-한정적 예로는 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 서열들은 하기 실시예 17에 제공되어 있다.
제제는 약 1 mg/㎖ 내지 약 150 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 약 2 mg/㎖, 약 5 mg/㎖, 약 7.5 mg/㎖, 약 10 mg/㎖, 20 mg/㎖, 약 25 mg/㎖, 약 30 mg/㎖, 약 35 mg/㎖, 약 40 mg/㎖, 약 45 mg/㎖, 약 50 mg/㎖, 약 55 mg/㎖, 약 60 mg/㎖, 약 65 mg/㎖, 약 70 mg/㎖, 약 75 mg/㎖, 약 80 mg/㎖, 약 85 mg/㎖, 약 90 mg/㎖, 약 95 mg/㎖, 약 100 mg/㎖, 약 105 mg/㎖, 약 110 mg/㎖, 약 115 mg/㎖, 약 120 mg/㎖, 약 125 mg/㎖, 약 130 mg/㎖, 약 135 mg/㎖, 약 140 mg/㎖, 약 145 mg/㎖, 약 150 mg/㎖ 또는 이보다 높은 값을 포함하나 이들로 한정되지 않는 상기 범위 내의 임의의 값의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유할 수 있다.
한 실시양태에서, 제제는 약 25 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제제는 약 50 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제제는 약 100 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 기재된 제제는 완충제, 예를 들면, 히스티딘, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 약 5 mM, 약 7.5 mM, 약 10 mM, 약 12.5 mM, 약 15 mM, 약 17.5 mM, 20 mM, 약 22.5 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM 또는 약 100 mM의 히스티딘, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 포함한다.
제제는 유리체내(intravitreal) 투여 및 정맥내 투여를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 항체에 대해 공지되어 있는 임의의 유형의 투여를 위해 제조될 수 있다.
본원에서 제공된 제제는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제이고 환자에게의 투여에 대해 허용가능한 임의의 담체 또는 부형제를 포함하는 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 등장성을 나타낸다. "등장성을 나타내는"은 관심있는 제제가 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는다는 것을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 밀리오스몰(mOsm)의 삼투압을 가질 것이다. 등장성은 예를 들면, 증기압 또는 얼음-동결 유형 삼투압계를 이용함으로써 측정될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 고장성을 나타낸다. "등장성" 제제는 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 제제이다. 상응하게, 용어 "고장성을 나타내는"은 인간 혈액의 삼투압보다 더 높은 삼투압을 갖는 제제를 기술하는 데에 사용된다.
본원에서 제공된 제제는 1 M 미만의 양으로 폴리올을 함유할 수 있다. 예를 들면, 폴리올은 약 50 mM, 약 75 mM, 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 225 mM, 약 240 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 600 mM, 약 650 mM, 약 700 mM, 약 750 mM, 약 800 mM, 약 850 mM, 약 900 mM, 약 950 mM, 약 1 M, 또는 이들 내의 임의의 정수의 양으로 제제에 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 약 100 mM 내지 약 175 mM 농도의 염을 이용하여 등장성으로 제조된다. 예를 들면, 300 mM 미만의 양으로 폴리올을 함유하는 제제는 약 130 mM 농도의 염을 이용하여 등장성으로 제조된다.
한 양태에서, 본원에서 제공된 제제에서 사용될 폴리올은 당, 예를 들면, 비-환원 당일 수 있다. 비-환원 당의 대표적인 예로는 트레할로스 및 수크로스가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 제제는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 트레할로스 또는 수크로스를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 약 240 mM의 트레할로스 또는 수크로스를 포함할 수 있다.
대안적으로, 당은 약 200 mM 내지 약 300 mM의 양(농도)의 소르비톨일 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 약 240 mM의 소르비톨을 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 제제의 추가 비-한정적 예는 표 1의 제제 1 내지 39 중 어느 한 제제이다.
본원에서 제공된 제제는 약 4.0 내지 약 7.5의 pH를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5 또는 약 7.0의 pH를 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 계면활성제를 함유하지 않는다. 임의적으로, 일부 경우, 계면활성제는 상기 제제에 포함될 수 있다. 계면활성제의 비-한정적 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 및 플루로닉(Pluronic)® F68이 있다.
본원은 본원에 기재된 제제를 포함하는, 정맥내 또는 유리체내 투여에 적합한 예비충전된 주사기도 제공한다. 이러한 예비충전된 주사기는 포장될 수 있고 혈관신생 관련 질병, 예컨대, 본원에 기재된 질병들 중 임의의 질병의 치료를 위한 사용에 대해 표지될 수 있다. 포장물은 저장 및 투여에 대한 설명서도 포함할 수 있다. 본원은 본원에 기재된 제제를 포함하는, 정맥내 또는 유리체내 투여에 적합한 하나 이상의 예비충전된 주사기를 함유하는 포장물을 제공한다.
본원의 한 실시양태는 본원에 기재된 장애의 치료용 약제를 제제화하기 위한 본원에 기재된 조성물들 중 임의의 조성물의 용도를 고려한다. 약제는 치료를 필요로 하는 환자/대상체의 신체적 특징을 기초로 제제화될 수 있고, 단일 또는 다중 제제로 제제화될 수 있다. 약제는 병원 및 진료소에의 배포에 적절한 표지를 갖는 적합한 포장물로 포장될 수 있고, 이때 상기 표지는 대상체에서 본원에 기재된 장애를 치료한다는 것을 표시하기 위한 것이다. 약제는 단일 또는 다중 유닛으로서 포장될 수 있다. 본원에 기재된 조성물의 용량 및 투여에 대한 설명서는 포장물과 함께 포함될 수 있다.
본원은 혈관신생 관련 질환의 치료를 필요로 하는 환자(대상체)에서 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 제제는 유리체내로 또는 정맥내로 환자에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 혈관신생 관련 질환은 예를 들면, 암 또는 전이일 수 있다. 한 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 치료될 암은 예를 들면, 상피계(epithelial based) 종양을 포함한다. 이러한 제제로 치료될 암의 비-한정적 예로는 폐암, 부인과 악성 종양, 흑색종, 유방암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 대장(colorectal)암, 전립선암, 신장암, 두부암, 췌장암, 간암(간세포암), 자궁암, 경부암, 신장암(신세포암), 육종, 골수종 및 림프종이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 암 또는 전이의 치료를 위한 제제는 환자에게 정맥내로 투여될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 혈관신생 관련 질환은 예를 들면, 안과적 병태일 수 있다. 안과적 병태는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종 및/또는 맥락막 신생혈관형성을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 연령 관련 황반 변성(AMD)은 습성 AMD 또는 건성 AMD일 수 있다. 안과적 병태의 치료를 위한 제제는 환자에게 유리체내로 투여될 수 있다.
이러한 방법에서, 제제는 환자에게 1회 이상 투여될 수 있다. 예를 들면, 제제는 매일 1회, 매주 1회, 매월 1회, 격월로 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 치료 일정은 치료에 대한 환자의 반응에 따라 필요한 경우 증가될 수 있거나 감소될 수 있다.
한 양태에서, 제제는 혈관신생 관련 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상이 감소될 때까지 투여된다.
안과적 병태와 관련하여, 상기 하나 이상의 징후 또는 증상은 혈관의 수축, 안 질환과 관련된 내피세포 증식의 억제, 출혈의 징후 또는 증상의 제거, 뿌옇게 보이는 증상(cloudy vision)의 치료, 시력 손실의 정체 제공, 시각의 개선, 시력의 개선, 황반 부종의 감소 및/또는 혈관 누출의 예방을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
암 또는 전이에 대하여, 치료는 환자의 상태를 개선할 수 있고, 치료는 하기 인자들 중 하나 이상의 인자가 발생하였는지를 확인함으로써 평가될 수 있다: 감소된 세포 증식, 감소된 세포 수, 증가된 아폽토시스, 또는 세포 증식성 장애를 포함하는 세포의 적어도 일부의 감소된 생존.
치료는 종양 또는 전이를 부분적으로 또는 전체적으로 제거할 수 있고/있거나 환자의 생존을 연장시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 징후 또는 증상은 하나 이상의 용량의 제제를 환자에게 투여한 후 중증도 또는 지속시간에 있어 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 감소된다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 징후 또는 증상은 하나 이상의 용량의 제제를 환자에게 투여한 후 중증도 또는 지속시간에 있어 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 90배, 약 95배, 약 100배 또는 그 이상 감소된다.
본원은 안과적 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 안과적 병태를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 안과적 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상이 상기 치료에 의해 호전된다. 제제의 투여는 유리체내 투여일 수 있다.
본원은 암 또는 전이의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 또는 전이를 예방하거나 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공하고, 이때 상기 암 또는 전이의 하나 이상의 징후 또는 증상이 호전된다. 제제의 투여는 정맥내 투여일 수 있다.
본원에서 제공된 방법에서, 치료될 대상체는 인간 또는 비-인간 대상체일 수 있다. 본원에서 제공된 제제는 환자의 건강, 질환 또는 병태의 진행 및 치료의 효능에 따라 1회 또는 다회 투여될 수 있다. 치료 과정 전체에서 치료법 및 치료(예를 들면, 조성물에서 항체의 용량)를 조절할 수 있다.
본원은 본원에서 제공된 방법들 중 하나 이상의 임의의 방법의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 가용성 CD105의 수준은 암 환자에서 생존과 상호관련되어 있고 치료 전 및 치료 동안 모니터링될 수 있다. 따라서, 가용성 CD105의 수준은 치료 요법이 환자의 치료에 효과적이라는 것을 표시할 수 있다. 본원에 기재된 치료는 하나 이상의 추가 치료를 포함할 수 있다.
참고도입
본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.
실시양태의 신규 특징은 첨부된 특허청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 실시양태의 특징 및 장점의 보다 우수한 이해는 실시양태의 원리가 이용되는, 예시적인 실시양태를 기술하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 수득될 수 있다:
도 1A 내지 1J는 본원에 기재된 항-CD105 항체(TRC105)의 예시적인 아미노산 서열을 제공한다. 도 1A는 항-CD105 항체의 대표적인 가변 경쇄(VL)(서열 번호 1)이고; 도 1B는 항-CD105 항체의 대표적인 불변 경쇄(CL)(서열 번호 2)이고; 도 1C는 항-CD105 항체의 대표적인 가변 중쇄(VH)(서열 번호 3)이고; 도 1D는 항-CD105 항체의 대표적인 불변 감마-1 중쇄(서열 번호 4)이다. 도 1E 내지 1G는 각각 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 나타낸다. 도 1H 내지 1J는 각각 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 나타낸다.
도 2는 TGF-β/ALK5 신호전달 경로의 도표를 제공한다. TGF-β/ALK5 경로(A)는 세포 증식의 억제를 유발한다. TGF-β/ALK1 경로(B)는 내피세포 증식을 유도하고 ALK1 신호전달을 위해 CD105(엔도글린)를 필요로 한다. 점선은 불활성 또는 차단된 경로를 표시한다. 굵은 화살표는 신호전달 경로의 자극을 표시한다.
본원에서 사용된 용어는 구체적인 실시양태만을 기술하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니라는 것을 이해해야 한다. 추가로, 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사한 또는 동등한 다수의 방법 및 재료가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다는 것이 이해된다.
본원에 따라, 당분야에서 전체적으로 설명된 바와 같이 통상적인 세포생물학, 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법이 사용될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재되어 있고/있거나 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 자명하게 될 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다.
항-CD105 항체는 다양한 형태의 혈관신생 관련 장애를 치료하거나 예방하는 데에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 제제를 투여함으로써 다양한 형태의 암, 고형 종양 및 전이 등을 치료하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
항체 용어
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 천연적으로 생성되었거나 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생성된 면역글로불린(Ig)을 지칭한다. 상기 용어는 항원 결합 도메인이거나 항원 결합 도메인에 대한 상동성을 나타내는 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질도 커버한다. 상기 용어는 "항원 결합 단편" 및 유사한 결합 단편에 대한 다른 상호교환가능한 용어, 예컨대, 후술된 용어도 포함한다.
천연 항체 및 천연 면역글로불린은 통상적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각각의 경쇄는 전형적으로 1개의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 동종형들의 중쇄들 사이에 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 이황화 가교도 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에서 가변 도메인("VH" 또는 "VH")에 이어서 다수의 불변 도메인("CH" 또는 "CH")을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에서 가변 도메인("VL" 또는 "VL")을 갖고 그의 다른 말단에서 불변 도메인("CL" 또는 "CL")을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 구체적인 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "합성 폴리뉴클레오티드", "합성 유전자" 또는 "합성 폴리펩티드"는 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 부분, 또는 아미노산 서열 또는 이의 부분이 동등한 천연 발생 서열에 비해 디자인된, 새로(de novo) 합성된 또는 변경된 서열로부터 유래된다는 것을 의미한다. 합성 폴리뉴클레오티드(항체 또는 항원 결합 단편) 또는 합성 유전자는 핵산 또는 아미노산 서열의 화학적 합성을 포함하나 이것으로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 합성 유전자는 전형적으로 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 수준(또는 이들 둘다)에서 천연 발생 유전자와 상이하고, 전형적으로 합성 발현 조절 서열의 환경 내에 위치한다. 합성 유전자 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 유전자와 비교될 때 반드시 상이한 아미노산을 갖는 단백질을 코딩하지 않을 수 있는데; 예를 들면, 상기 서열은 상이한 코돈을 포함하되 동일한 아미노산을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열(즉, 뉴클레오티드 변화는 아미노산 수준에서 침묵 돌연변이를 나타냄)도 포괄할 수 있다.
항체에 대하여, 용어 "가변 도메인"은 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는 항체의 가변 도메인을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 오히려, 가변성은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 둘다에서 초가변 영역(CDR로서도 공지되어 있음)으로서 지칭되는 3개의 절편들에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 "골격 영역" 또는 "FR"로서 지칭된다. 비-변경된 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하는 루프 및 일부 경우 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR들이 산재되어 있는 β-시트 입체구조를 주로 채택하는 4개의 FR들(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 각각 함유한다. 각각의 쇄에서 CDR들은 FR들에 의해 가깝게 인접하여 함께 모여있고 다른 쇄로부터의 CDR들과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669) 참조).
본원에서 사용될 때 용어 "초가변 영역" 및 "CDR"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. CDR은 항원에 상보적인 방식으로 결합하는 3개의 서열 영역들로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, VH 및 VL 쇄들 각각에 대한 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 공지되어 있다. 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에 따를 때, 경쇄 가변 도메인에서 CDR들은 전형적으로 대략 잔기 24-34(CDRL1), 50-56(CDRL2) 및 89-97(CDRL3)에 상응하고, 중쇄 가변 도메인에서 CDR들은 전형적으로 대략 잔기 31-35(CDRH1), 50-65(CDRH2) 및 95-102(CDRH3)에 상응한다. 상이한 항체의 CDR들은 삽입을 함유할 수 있으므로 아미노산 넘버링이 상이할 수 있다는 것이 이해된다. 카바트(Kabat) 넘버링 시스템은 상이한 항체들 사이의 넘버링에서 임의의 삽입을 반영하도록 특정 잔기에 부착된 문자(예를 들면, 경쇄에서 CDRL1의 27A, 27B, 27C, 27D, 27E 및 27F)를 사용하는 넘버링 체계로 이러한 삽입을 설명한다. 대안적으로, 문헌(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987))에 따를 때, 경쇄 가변 도메인에서 CDR들은 전형적으로 대략 잔기 26-32(CDRL1), 50-52(CDRL2) 및 91-96(CDRL3)에 상응하고, 중쇄 가변 도메인에서 CDR들은 전형적으로 대략 잔기 26-32(CDRH1), 53-55(CDRH2) 및 96-101(CDRH3)에 상응한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "골격 영역" 또는 "FR"은 항원 결합 포켓 또는 홈의 일부를 형성하는 골격 아미노산 잔기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 골격 잔기는 항원 결합 포켓 또는 홈의 일부인 루프를 형성하고, 루프의 아미노산 잔기는 항원과 접촉할 수 있거나 접촉하지 않을 수 있다. 골격 영역은 일반적으로 CDR들 사이의 영역을 포함한다. 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에 따를 때, 경쇄 가변 도메인에서 FR들은 전형적으로 대략 잔기 0-23(FRL1), 35-49(FRL2), 57-88(FRL3) 및 98-109에 상응하고, 중쇄 가변 도메인에서 FR들은 전형적으로 대략 잔기 0-30(FRH1), 36-49(FRH2), 66-94(FRH3) 및 103-133에 상응한다. 경쇄에 대한 카바트 넘버링으로 상기 논의된 바와 같이, 중쇄도 유사한 방식으로 삽입(예를 들면, 중쇄에서 CDRH1의 35A 또는 35B)을 설명한다. 대안적으로, 문헌(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987))에 따를 때, 경쇄 가변 도메인에서 FR들은 전형적으로 대략 잔기 0-25(FRL1), 33-49(FRL2) 53-90(FRL3) 및 97-109(FRL4)에 상응하고, 중쇄 가변 도메인에서 FR들은 전형적으로 대략 잔기 0-25(FRH1), 33-52(FRH2), 56-95(FRH3) 및 102-113(FRH4)에 상응한다.
항체의 불변 도메인(Fc)은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않고, 오히려 다양한 이펙터 기능을 나타내는데, 예컨대, 항체가 예를 들면, Fc 수용체(FcR)와의 상호작용을 통해 항체 의존적 세포 독성에 참여하게 한다. Fc 도메인은 환자에게의 투여 후 순환계에서의 항체의 생체이용률도 증가시킬 수 있다. 인간 Fc 도메인에 의한 뮤린 Fc 도메인의 치환은 HAMA 부반응도 감소시킬 수 있다.
면역글로불린들은 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스들로 배정될 수 있다. 5개의 주요 면역글로불린 클래스들, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 일부는 서브클래스(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인(Fc)은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로서 지칭된다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체구조는 잘 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄들"은 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 카파 또는 ("κ") 및 람다 또는 ("λ")로서 지칭되는 2개의 명확히 구별되는 유형들 중 하나로 배정될 수 있다.
용어 "항체의 항원 결합 부분", "항원 결합 단편", "항원 결합 도메인", "항체 단편" 또는 "항체의 기능성 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어들에 포함된 항체 단편의 비-한정적 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 함유하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인들을 함유하는 Fv 단편; (v) VH 도메인을 함유하는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544 546); 및 (vi) 단리된 CDR이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 "절반" 항체도 이 정의에 포함된다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대, 디아바디도 본원에 포함된다.
"F(ab')2" 및 "Fab'" 모이어티는 Ig를 단백질분해효소, 예컨대, 펩신 및 파파인으로 처리함으로써 생성될 수 있고, 2개의 중쇄들 각각에서 힌지 영역들 사이에 존재하는 이황화 결합 근처에서 면역글로불린을 분해함으로써 발생된 항체 단편을 포함한다. 예를 들면, 파파인은 2개의 중쇄들 각각에서 힌지 영역들 사이에 존재하는 이황화 결합의 상류에서 IgG를 절단하여, VL 및 CL(경쇄 불변 영역)으로 구성된 경쇄와 VH 및 CHγ1(중쇄의 불변 영역 내의 γ1 영역)로 구성된 중쇄 단편이 그들의 C 말단 영역에서 이황화 결합을 통해 연결되어 있는 2개의 상동성 항체 단편들을 발생시킨다. 이들 2개의 상동성 항체 단편들 각각은 Fab'로서 지칭된다. 펩신도 2개의 중쇄들 각각에서 힌지 영역들 사이에 존재하는 이황화 결합의 하류에서 IgG를 절단하여, 2개의 상기 언급된 Fab'가 힌지 영역에서 연결되어 있는 단편보다 약간 더 큰 항체 단편을 발생시킨다. 이 항체 단편은 F(ab')2로서 지칭된다.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)도 함유한다. Fab' 단편은 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에서 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 소수의 잔기가 첨가됨으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 본원의 표기이다. 처음에 F(ab')2 항체 단편들은 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 이 영역은 단단한 비-공유 또는 공유 연결로 연결되어 있는 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인으로 구성된 이량체로 구성된다(이황화 연결된 Fv는 문헌(Reiter et al. (1996) Nature Biotechnology 14:1239-1245)에 기재되어 있음). 이 구성에서 각각의 가변 도메인의 3개 CDR들은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에서 항원 결합 부위를 정의한다. 종합하건대, VH 및 VL 쇄 각각으로부터의 CDR들 중 하나 이상의 CDR들의 조합은 항원 결합 특이성을 항체에게 부여한다. 예를 들면, CDRH3 및 CDRL3이 수용자 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VH 및 VL 쇄에 전달될 때 항원 결합 특이성을 항체에게 부여하기에 충분할 수 있고 CDR들의 이 조합이 본원에 기재된 기법들 중 임의의 기법의 이용을 통해 결합, 친화성 등에 대해 시험될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR들만을 포함하는 Fv의 절반)조차도 항원을 인식하고 (아마도 제2 가변 도메인과 조합될 때보다 더 낮은 친화성으로) 항원에 결합하는 능력을 갖는다. 나아가, Fv 단편의 2개 도메인들(VL 및 VH)이 별개의 유전자들에 의해 코딩될지라도, 이들은 그들 자신이 단일 단백질 쇄(이때, VL 및 VH 영역들이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성함)로서 만들어질 수 있게 하는 합성 연결제에 의해 재조합 방법을 이용함으로써 연결될 수 있다(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지되어 있음; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778). 이러한 scFv도 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함된다. 특정 scFv의 임의의 VH 및 VL 서열들은 완전한 Ig(예를 들면, IgG) 분자 또는 다른 동종형을 코딩하는 발현 벡터를 발생시키기 위해 Fc 영역 cDNA 또는 게놈 서열과 연결될 수 있다. VH 및 VL은 단백질 화학 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 Ig의 Fab, Fv 또는 다른 단편을 발생시키는 데에 사용될 수도 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인들을 포함하고, 이때 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 폴리펩티드 연결제를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에서 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg) 및 문헌(Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994))을 참조한다.
용어 "아비머(AVIMER)™"는 항체 및 항체 단편과 무관하고 A-도메인(클래스 A 모듈, 보체 유형 반복부 또는 LDL-수용체 클래스 A 도메인으로서도 지칭됨)으로서 지칭되는 여러 모듈식 및 재사용가능한 결합 도메인들로 구성된 인간 유래의 치료 단백질의 한 클래스를 지칭한다. 이들은 시험관내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인으로부터 발생되었다(Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-1494; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220). 발생된 단백질은 단일 에피토프 결합 단백질에 비해 개선된 친화성(일부 경우 나노몰 미만의 친화성) 및 특이성을 나타낼 수 있는 다수의 독립적인 결합 도메인들을 함유할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허출원 공보 제2005/0221384호, 제2005/0164301호, 제2005/0053973호, 제2005/0089932호, 제2005/0048512호 및 제2004/0175756호(이들 각각은 온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)를 참조한다.
각각의 공지된 217 인간 A-도메인은 약 35개의 아미노산(약 4 kDa)을 포함하고, 이들 도메인들은 길이에 있어서 평균 5개의 아미노산을 갖는 연결제에 의해 분리된다. 천연 A-도메인은 주로 칼슘 결합 및 이황화 형성에 의해 매개된 균일한 안정한 구조로 신속히 효율적으로 접혀진다. 12개의 아미노산만으로 구성된 보존된 스카폴드 모티프가 이 공통된 구조를 위해 요구된다. 최종 결과는 별도의 기능을 각각 나타내는 다수의 도메인들을 함유하는 단일 단백질 쇄이다. 단백질의 각각의 도메인은 독립적으로 결합하고, 각각의 도메인의 에너지 기여는 부가적이다. 이들 도메인은 결합활성(avidity) 다량체로부터의 "아비머™"로서 지칭되었다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편으로서, 동일한 폴리펩티드 쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 단편을 지칭한다. 동일한 쇄 상의 2개 도메인들 사이에 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 연결제를 사용함으로써 상기 도메인들이 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 한다. 디아바디는 예를 들면, 유럽 특허 제404,097호; 국제 특허출원 공보 제WO 93/11161호; 및 문헌(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993))에 더 전체적으로 기재되어 있다.
항원 결합 폴리펩티드는 중쇄 이량체, 예를 들면, 낙타 및 상어로부터의 항체도 포함한다. 낙타 항체 및 상어 항체는 V 유사 도메인 및 C 유사 도메인의 2개 쇄들로 구성된 동종이량체 쌍을 포함한다(상기 항체들 중 어느 것도 경쇄를 갖지 않는다). 낙타에서 중쇄 이량체 IgG의 VH 영역이 경쇄와 소수성 상호작용을 달성할 필요가 없기 때문에, 통상적으로 경쇄와 접촉하는 중쇄의 영역은 낙타에서 친수성 아미노산 잔기로 교체된다. 중쇄 이량체 IgG의 VH 도메인은 VHH 도메인으로서 지칭된다. 상어 Ig-NAR은 1개의 가변 도메인(V-NAR 도메인으로서 지칭됨) 및 5개의 C 유사 불변 도메인(C-NAR 도메인)으로 구성된 동종이량체를 포함한다. 낙타에서, 항체 레파토리의 다양성은 VH 또는 VHH 영역 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 의해 결정된다. 낙타 VHH 영역 내의 CDR3은 평균 16개의 아미노산에 이르는 그의 상대적으로 긴 길이를 특징으로 한다(Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9): 1129). 이것은 많은 다른 종들의 항체의 CDR3 영역과 대조된다. 예를 들면, 마우스 VH의 CDR3은 평균 9개의 아미노산을 갖는다. 낙타의 가변 영역의 생체내 다양성을 유지하는, 낙타 유래의 항체 가변 영역의 라이브러리는 예를 들면, 미국 특허출원 공보 제20050037421호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.
"키메라" 형태의 비-인간(예를 들면, 뮤린) 항체는 비-인간 Ig로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체를 포함한다. 대부분의 경우, 키메라 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부가 뮤린 Fc 대신에 삽입되어 있는 뮤린 항체이다. 상세한 내용에 대해서는 문헌(Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)); 및 문헌(Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992))을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 즉, 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원성 부위에 대해 유도된다. 나아가, 상이한 결정인자들(에피토프들)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함할 수 있는 통상적인 (다중클론) 항체 제제와 대조적으로 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 수식어 "단일클론"은 항체의 특징을 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 것으로서 표시하고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 단일클론 항체는 문헌(Kohler et al., Nature 256:495 (1975))에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법(예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일클론 항체는 예를 들면, 문헌(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)) 및 문헌(Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))에 기재된 기법을 이용함으로써 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
항체는 포화된 황산암모늄 침전, 유글로불린(euglobulin) 침전 방법, 카프로산 방법, 카프릴산 방법, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52), 또는 더 상세히 후술된 바와 같이 항-Ig 컬럼 또는 단백질 A, G 또는 L 컬럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 언급된 배양 상청액 또는 복수로부터 단리되고 정제될 수 있다.
면역글로불린 분자를 구축할 때, 가변 영역 또는 이의 부분은 하나 이상의 불변 영역 또는 이의 부분에 융합되거나, 결합되거나 다른 방식으로 연결되어 본원에 기재된 항체들 중 임의의 항체를 생성할 수 있다. 이것은 분자 클로닝 기법 또는 분자를 코딩하는 핵산의 직접적인 합성을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "면역반응성"은 아미노산 잔기의 서열("결합 부위" 또는 "에피토프")에 대한 특이성을 나타내지만 다른 펩티드/단백질에 대한 교차반응성을 나타내는 경우 인간 사용을 위해 투여되도록 제제화되는 수준에서 독성을 나타내지 않는 결합제, 항체 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "결합"은 생리학적 조건 하에서 예를 들면, 공유, 정전기, 소수성, 및 이온성 및/또는 수소 결합 상호작용으로 인한 2개의 분자들 사이의 직접적인 회합을 지칭하고 상호작용, 예컨대, 염 가교 및 물 가교 및 임의의 다른 통상적인 결합 수단을 포함한다. 용어 "우선적으로 결합한다"는 결합제가 무관한 아미노산 서열에 결합할 때보다 더 높은 친화성으로 결합 부위에 결합한다는 것을 의미한다. 친화성은 무관한 아미노산 서열에 대한 결합제의 친화성보다 1배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상 또는 1000배 이상 더 클 수 있다. 용어 "면역반응성" 및 "우선적으로 결합한다"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 2개의 물질들의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하고 Kd로서 표현된다. 리간드에 대한 결합 단백질의 친화성, 예컨대, 에피토프에 대한 항체의 친화성은 예를 들면, 약 100 나노몰(nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰(pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 페토몰(fM)일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합활성"은 희석 후 해리에 대한 2개 이상의 물질들의 복합체의 저항성을 지칭한다. 겉보기 친화성은 방법, 예컨대, 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 임의의 다른 기법에 의해 측정될 수 있다. 결합활성은 방법, 예컨대, 스캐차드(Scatchard) 분석 또는 당업자에게 익숙한 임의의 다른 기법에 의해 측정될 수 있다.
"에피토프"는 항체의 가변 영역 결합 포켓과 결합 상호작용을 형성할 수 있는 항원 또는 다른 거대분자의 부분을 지칭한다. 이러한 결합 상호작용은 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로서 나타날 수 있다. 항원 결합은 예를 들면, CDR3 또는 CDR3 쌍, 또는 일부 경우 VH 및 VL 쇄의 최대 모든 6개 CDR들의 상호작용을 수반할 수 있다. 에피토프는 선형 펩티드 서열일 수 있거나(즉, "연속적") 비-인접 아미노산 서열로 구성될 수 있다(즉, "입체구조적" 또는 "불연속적"). 항체는 하나 이상의 아미노산 서열을 인식할 수 있으므로, 에피토프는 하나 초과의 상이한 아미노산 서열을 정의할 수 있다. 항체에 의해 인식되는 에피토프는 당업자에게 잘 공지되어 있는 펩티드 맵핑 및 서열 분석 기법에 의해 확인될 수 있다. 결합 상호작용은 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자간 접촉으로서 나타난다. TRC105는 미국 특허 제5,928,641호, 제6,200,566호, 제6,190,660호 및 제7,097,836호에서 Y4-2F1 또는 SN6j로서 기재된 뮤린 항체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 뮤린 항체이다. Y4-2F1 또는 SN6j에 의해 인식되므로 TRC105에 의해 인식되는 에피토프는 이전에 확인되었다.
용어 "특이적"은 항체가 이 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 항원 이외의 분자와의 임의의 유의한 결합을 보이지 않을 상황을 지칭한다. 상기 용어는 예를 들면, 항원 결합 도메인이 다수의 항원들에 의해 보유되는 특정 에피토프에 대한 특이성을 나타내는 경우에도 적용될 수 있고, 이 경우 항체는 상기 에피토프를 보유하는 다양한 항원들에 결합할 수 있을 것이다. 용어 "우선적으로 결합한다" 또는 "특이적으로 결합한다"는 항체가 무관한 아미노산 서열에 결합할 때보다 더 높은 친화성으로 에피토프에 결합하고 에피토프를 함유하는 다른 폴리펩티드에 대한 교차반응성을 나타내는 경우 상기 항체가 인간 사용을 위해 투여되도록 제제화되는 수준에서 독성을 나타내지 않는다는 것을 의미한다. 한 양태에서, 이러한 친화성은 무관한 아미노산 서열에 대한 항체의 친화성보다 1배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상 또는 1000배 이상 더 크다. 용어 "면역반응성", "결합한다", "우선적으로 결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "결합"은 생리학적 조건 하에서 예를 들면, 공유, 정전기, 소수성, 및 이온성 및/또는 수소 결합 상호작용으로 인한 2개의 분자들 사이의 직접적인 회합을 지칭하고 상호작용, 예컨대, 염 가교 및 물 가교뿐만 아니라 임의의 다른 통상적인 결합 수단도 포함한다.
폴리펩티드에 적용될 때, "단리된"("실질적으로 순수한"과 상호교환적으로 사용됨)은 그의 기원 또는 조작에 의해 (i) 발현 벡터의 부분의 발현 생성물로서 숙주 세포에 존재하거나; (ii) 천연 상태에서 연결되어 있는 단백질 또는 다른 화학적 모이어티 이외의 단백질 또는 다른 화학적 모이어티에 연결되어 있거나; (iii) 천연 상태에서 발생되지 않는 폴리펩티드 또는 이의 부분, 예를 들면, 단백질이 천연 상태에서 발견되지 않는 형태로 존재하도록 하나 이상의 소수성 모이어티를 단백질에 덧붙이거나 추가함으로써 화학적으로 조작된 단백질을 의미한다. "단리된"은 (i) 화학적으로 합성된 단백질, 또는 (ii) 숙주 세포에서 발현되었고 회합된 오염 단백질로부터 정제된 단백질도 의미한다. 상기 용어는 일반적으로 폴리펩티드와 함께 천연적으로 존재하는 다른 단백질 및 핵산으로부터 분리되어 있는 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 그를 정제하는 데에 사용된 물질, 예컨대, 항체 또는 겔 매트릭스(폴리아크릴아미드)로부터도 분리된다.
혈관신생 용어
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관신생 억제성", "혈관신생 억제" 또는 "항-혈관신생"은 혈관형성의 억제를 포함하고, 신생혈관형성의 정도, 양 또는 속도의 감소에 영향을 미친다는 것을 의미하기 위한 것이다. 조직에서 내피세포 증식 또는 이동의 정도, 양 또는 속도의 감소에 영향을 미치는 것은 혈관신생 억제의 구체적인 예이다.
용어 "혈관신생 억제성 조성물"은 혈관신생에 의해 매개되는 과정, 예컨대, 내피세포 이동, 증식 및 튜브 형성을 억제한 후, 기존 혈관으로부터의 새로운 혈관의 발생의 억제를 유발하고 결과적으로 혈관신생 의존적 상태에 영향을 미치는 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관신생 의존적 상태"는 혈관신생 또는 혈관형성의 과정이 병리학적 상태를 유지하거나 증강시키거나 정상 생리학적 과정에 유리하게 영향을 미치는 상태를 의미하기 위한 것이다. 따라서, 혈관신생이 병리학적 상태를 유지하는 혈관신생 의존적 상태의 치료는 질환을 경감시킬 수 있지만, 혈관신생이 정상 생리학적 과정에 유리하게 영향을 미치는 혈관신생 의존적 상태의 치료는 예를 들면, 정상 과정을 향상시킬 수 있다.
혈관신생은 기존 모세혈관 또는 후-모세혈관 세정맥으로부터의 새로운 혈관의 형성이다. 혈관형성은 내피세포 전구체인 혈관모세포로부터 발생하는 새로운 혈관의 형성으로부터 비롯된다. 상기 과정들 둘다가 새로운 혈관 형성을 초래하고 용어 혈관신생 의존적 상태의 의미에 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혈관신생"은 혈관의 새로운 형성, 예컨대, 혈관형성으로부터 발생되는 혈관의 형성뿐만 아니라 기존 혈관, 모세혈관 및 세정맥의 분지 및 발아로부터 발생되는 혈관의 형성도 포함하기 위한 것이다. 혈관신생은 ALK1 신호전달 및 관련된 Smad 1/5/8 인산화 및/또는 신호전달의 유도를 포함할 수도 있다. CD105도 ALK1 신호전달 경로에 관여하는 것으로 공지되어 있으므로 혈관신생의 의미 내에 포함된다.
종양 개시 CD105+ 세포 집단은 인간 신장 암종에서 발견되었다. CD105+ 세포는 다른 유형의 종양에 존재하는 암 줄기 세포에 대해 이미 기재된 종양 줄기 세포의 특징을 제시하였다. 관찰된 CD105+ 세포는 클론발생성을 나타내었고 줄기 세포 마커를 발현하였고 분화 마커를 결여하였고, 시험관내에서 상피세포 유형 및 내피세포 유형으로 분화될 수 있었고 생체내에서 연속적으로 이식가능한 종양을 발생시킬 수 있었다. 중간엽 마커를 발현하는 클론으로부터 유래되었음에도 불구하고 상기 종양은 기원 종양으로서 상피 암종이고, CD105+ 종양유발성 집단의 유지 및 비-종양유발성 분화된 CD105- 집단의 존재를 특징으로 한다.
"숙주 면역 반응의 유도"는 환자가 질병의 징후 또는 증상의 완화 또는 감소를 경험한다는 것을 의미하고, 구체적으로 생존의 연장을 포함하나 이것으로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증식성 장애" 및 "증식성 병태"는 비정상적 또는 바람직하지 않은 증식을 특징으로 하는 임의의 병리학적인 또는 비-병리학적인 생리학적 상태를 의미한다. 용어 "세포 증식성 장애" 및 "세포 증식성 병태"는 비정상적 또는 바람직하지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 임의의 병리학적인 또는 비-병리학적인 생리학적 상태를 의미할 뿐만 아니라, (예를 들면, 아폽토시스 결여로 인한) 바람직하지 않은 또는 원치 않는 세포 증식 또는 세포 생존을 특징으로 하는 상태, 결여된 또는 비정상적인 아폽토시스를 특징으로 하는 상태, 및 비정상적인, 바람직하지 않은 또는 원치 않는 세포 생존을 특징으로 하는 상태도 포함한다. 용어 "분화성 장애"는 비정상적인 또는 결여된 분화를 특징으로 하는 임의의 병리학적인 또는 비-병리학적인 생리학적 상태를 의미한다.
치료될 수 있는 증식성 또는 분화성 장애는 비정상적인 또는 바람직하지 않은 세포 수, 세포 생장 또는 세포 생존을 특징으로 하는 양성 및 신생물성 질환 상태를 포함한다. 따라서, 이러한 장애 또는 병태는 질환 상태를 구성할 수 있고, 모든 유형의 암성 생장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 형질전환된 세포, 조직 또는 장기를 포함한다.
증식성 또는 분화성 장애를 구성하는 세포는 세포 덩어리로 응집되어 있을 수 있거나 분산되어 있을 수 있다. "비-고형 종양"은 조혈 시스템의 신생물, 예컨대, 림프종, 골수종 및 백혈병, 또는 전형적으로 고체 덩어리를 형성하지 않기 때문에 천연 상태에서 확산되는 신생물을 지칭한다. 백혈병의 구체적인 예로는 급성 및 만성 림프모구성 골수종, 골수모구성 골수종 및 다발성 골수종이 있다.
용어 "고형 종양"은 전형적으로 함께 응집하여 덩어리를 형성하는 신생물 또는 전이를 지칭한다. 이러한 장애는 사실상 임의의 유형의 세포 또는 조직에 영향을 미칠 수 있는 신생물 또는 암, 예를 들면, 암종, 육종, 흑색종, 전이성 장애 또는 조혈 신생물성 장애를 포함한다. 전이성 종양은 유방, 폐, 갑상선, 두경부, 뇌, 림프, 위장(입, 식도, 위, 소장, 결장, 직장), 비뇨생식관(자궁, 난소, 자궁경부, 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 뼈, 근육, 피부 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 유형의 일차 종양으로부터 발생될 수 있다.
암종(carcinoma)은 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양을 지칭하고, 호흡 시스템 암종, 위장 시스템 암종, 비뇨생식 시스템 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비 시스템 암종 및 흑색종을 포함한다. 예시적인 암종은 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장, 간 및 난소로부터 형성되는 암종을 포함한다. 상기 용어는 예를 들면, 암성 조직 및 육종성 조직으로 구성된 악성 종양을 포함하는 암육종도 포함한다. 선암종은 샘 조직의 암종, 또는 종양이 샘 유사 구조를 형성하는 암종을 포함한다.
치료될 암성 조직은 예를 들면, 비정상적인 수준의 CD105를 발현하는 내피 조직 또는 형질전환된 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환된 세포"는 구속되지 않은 생장 상태로 자발적으로 전환된 세포를 지칭한다. 즉, 상기 세포는 배양에서 무한한 수의 분열을 통해 생장하는 능력을 획득하였다. 형질전환된 세포는 그의 생장 조절 상실 면에서 신생물성, 역형성 및/또는 과다형성과 같은 용어로 특징지어질 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "악성 포유동물 세포의 형질전환된 표현형" 및 "형질전환된 표현형"은 포유동물 세포의 세포 형질전환과 관련된 하기 표현형적 특성들 중 임의의 특성을 포괄하기 위한 것이나 이들로 한정되지 않는다: 세포 배양에서의 연장된 생장, 반고체 배지에서의 생장, 또는 면역불능 또는 유전적 동계 동물에서의 종양유발성 생장에 의해 검출될 때 불멸화, 형태적 또는 생장 형질전환, 및 종양유발성.
용어 "종양 세포 항원"은 무관한 종양 세포, 정상 세포 또는 정상 체액에 존재하는 양보다 더 높은 양으로 종양 세포 또는 체액에 존재하는 항원으로서 본원에서 정의된다. 항원 존재는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 수의 분석에 의해 시험될 수 있고, 항체를 사용한 음성 및/또는 양성 선별, 예컨대, ELISA 분석, 방사면역분석 또는 웨스턴 블롯을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "아폽토시스" 또는 "프로그래밍된 세포 사멸"은 원치 않는 또는 쓸모없는 세포가 발생 및 다른 정상 생물학적 과정 동안 제거되는 생리학적 과정을 지칭한다. 아폽토시스는 정상 생리학적 과정 하에서 일어나는 세포 사멸의 방식이고, 세포는 그 자신의 사멸에서 능동적 참여자이다("세포 자살"). 이것은 정상 세포 교체 및 조직 항상성, 배아발생, 면역 내성의 유도 및 유지, 신경 시스템의 발생 및 내분비 의존적 조직 위축 동안 가장 자주 발견된다. 아폽토시스를 겪는 세포는 특징적인 형태적 및 생화학적 특징들을 보여준다. 이들 특징들은 염색질 응집, 핵 및 세포질 응축, 리보좀을 함유하는 막 결합된 소포(아폽토시스체)로의 세포질 및 핵의 분할, 형태적으로 온전한 미토콘드리아 및 핵 물질을 포함한다. 생체내에서 이들 아폽토시스체들은 대식세포, 수지상세포 또는 인접 상피세포에 의해 신속히 인식되고 식세포작용에 의해 삼켜진다. 생체내에서 아폽토시스 세포의 제거를 위한 이 효율적인 기작으로 인해 염증 반응이 유발되지 않는다. 시험관내에서 아폽토시스체뿐만 아니라 남은 세포 단편도 궁극적으로 팽윤되고 최종적으로 용해된다. 시험관내 세포 사멸의 이 말기 단계는 "이차 괴사"로서 지칭되었다. 아폽토시스는 당업자에게 공지되어 있는 방법, 예컨대, DNA 단편화, 아넥신 V의 노출, 캐스파제(caspase)의 활성화, 사이토크롬 c의 방출 등에 의해 측정될 수 있다. 사멸하도록 유도된 세포는 본원에서 "아폽토시스 세포"로서 지칭된다.
"아폽토시스 유도제"는 본원에서 아폽토시스/프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 것으로 정의되고, 예를 들면, 항-CD105 항체, 항-VEGF 항체, 방사선조사, 화학치료제 또는 수용체 라이게이션 물질을 포함하고, 이때 세포, 예를 들면, 종양 세포 또는 내피세포는 프로그래밍된 세포 사멸을 겪도록 유도된다. 예시적인 아폽토시스 유도제는 더 상세히 후술되어 있다.
아폽토시스는 표준 아넥신 V 아폽토시스 분석을 이용함으로써 시험될 수 있다: NIH:OVCAR-3 세포를 6웰 플레이트(NUNC)에서 생장시키고 4시간 내지 48시간 동안 방사선으로 조사하거나 길항제(또는 또 다른 항암 약물과 함께 길항제)로 처리하고, 세척하고 1시간 동안 아넥신 V-FITC(비디-파밍겐(BD-Pharmingen))로 염색한다. 세포를 유동 세포측정(벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson), 셀퀘스트(CellQuest))으로 분석하고 요오드화프로피듐으로 대조염색하고 유동 세포측정기에서 다시 분석한다.
항체의 제조 및 발현 방법
키메라 면역글로불린은 유전공학에 의해 구축되었다. 이전에 기재된 대다수의 키메라 면역글로불린은 마우스 단일클론 항체로부터의 VH 및 VL, 및 인간 항체의 CL 및 Fc로 구성되었다. Fc 영역은 본원에 기재된 동종형들 중 임의의 동종형으로부터 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 키메라는 항체의 친화성을 증가시키기 위해 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역의 골격에서 한정된 수의 아미노산을 변경시키는 데에 사용되는 기준도 포함할 수 있다.
키메라 항체는 일반적으로 인간 치료에 사용되는 경우 마우스 항체에 비해 여러 잠재적인 장점을 갖는다. 항체의 이펙터 부분이 인간으로부터 유래되었기 때문에, 상기 이펙터 부분은 인간 면역 시스템의 다른 부분과 더 잘 상호작용하는(예를 들면, 보체 의존적 세포독성(CDC) 또는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)으로 표적 세포를 보다 효율적으로 파괴하는) 것으로 생각된다. 추가로, 인간 면역 시스템은 키메라 항체의 불변 영역을 외래 물질로서 인식해서는 안 되므로, 이러한 주입된 항체에 대한 항체 반응은 전형적으로 완전한 외래 마우스 항체에 대한 항체 반응보다 더 적어야 한다. 마지막으로, 마우스 항체는 인간 순환계에서 인간 항체의 반감기보다 훨씬 더 짧은 반감기를 갖는 것으로 공지되어 있다. 추정컨대, 키메라 항체는 천연 발생 인간 항체와 더 유사한 반감기를 가짐으로써 보다 더 작고 보다 덜 빈번한 용량이 제공되게 할 수 있다.
항체의 증가된 친화성을 원하는 경우, 항체의 CDR들 내의 잔기가 다른 아미노산으로 더 치환될 수 있다. 10개만큼 많은 잔기가 변화될 수 있는 중쇄 CDR2를 제외하고, 전형적으로 CDR에서 4개 이하의 아미노산 잔기가 변화되고, 가장 전형적으로 CDR에서 2개 이하의 잔기가 변화될 것이다. 친화성의 변화는 통상적인 방법, 예컨대, 본원에 기재된 방법(예를 들면, 비아코어(Biacore))에 의해 측정될 수 있다.
항체는 당분야에서 공지되어 있는 통상적인 기법을 이용함으로써 구축되고 제조될 수 있다. 추가로, 재조합적으로 제조된 항체는 특히 고수준 발현 벡터를 사용할 때 종종 대량으로 제조될 수 있다.
수의학 용도의 경우, 항체는 비-인간 Fc를 사용함으로써 비-인간(예를 들면, 영장류, 소, 말, 돼지 등)에게 투여되도록 합성될 수 있다.
당분야에서 인정된 기법, 예컨대, 본원에서 제공되고 도입된 기법은 제한 핵산내부분해효소(endonuclease) 부위에서 재조합 기법을 이용하여 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 변경시키는 데에 사용될 수 있다.
발현의 경우, 발현 시스템은 글루타민 합성효소 유전자를 선별 마커로서 사용하는 GS 시스템(론자(Lonza))을 이용하는 발현 시스템이다. 요약하건대, 글루타민 합성효소 유전자를 선별 마커로서 사용하는 GS 시스템(론자)을 사용하여 전기천공(250 V)으로 CHO 세포에서 형질감염을 수행한다. 2 mM 글루타민과 함께 10% 희석된 태아 소 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM(시그마(Sigma))에서 야생형 CHO 세포를 생장시킨다. 6 x 107개의 CHO 세포를 전기천공으로 300 ㎍의 선형화된 DNA로 형질감염시킨다. 전기천공 후, 글루타민을 함유하는 DMEM에 세포를 재현탁시키고 36 x 96웰 플레이트 내로 플레이팅하고(50 ㎕/웰) 5% CO2 하에서 37℃에서 항온처리한다. 다음날, 150 ㎕/웰의 선별 배지(글루타민을 갖지 않는 DMEM)를 첨가한다. 대략 3주 후, 무관한 항체를 음성 대조군으로서 사용하여 콜로니를 ELISA(하기 참조)로 스크리닝한다. 20 ㎍/㎖ 초과의 생성 수준을 나타내는 모든 콜로니들을 24웰 플레이트 내로 증폭한 후 이중 T25 플라스크 내로 증폭한다.
고수준 생성을 위해, 널리 사용되는 포유동물 발현 시스템은 데하이드로폴레이트 환원효소 결핍("dhfr-") 중국 햄스터 난소 세포에 의해 제공된 유전자 증폭 절차를 이용하는 포유동물 발현 시스템이다. 상기 시스템은 데하이드로폴레이트를 테트라하이드로폴레이트로 전환시키는 것을 촉매작용하는 DHFR 효소를 코딩하는 데하이드로폴레이트 환원효소 "dhfr" 유전자를 기초로 한다. 높은 생성을 달성하기 위해, 원하는 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 기능성 DHFR 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 dhfr- CHO 세포를 형질감염시킨다. 이 경우, 원하는 단백질은 재조합 항체 중쇄 및/또는 경쇄이다.
경쟁 DHFR 억제제 메토트렉세이트(MTX)의 양을 증가시킴으로써, 재조합 세포는 dhfr 유전자를 증폭하여 내성을 발생시킨다. 표준 경우, 사용된 증폭 유닛은 dhfr 유전자의 크기보다 훨씬 더 크고, 그 결과 항체 중쇄가 함께 증폭된다.
단백질, 예컨대, 항체 쇄의 대규모 생성을 원하는 경우, 사용되는 세포의 발현 수준 및 안정성 둘다를 고려한다. 장기간 배양에서 재조합 CHO 세포 집단은 단일 모 클론으로부터 유래되었을지라도 증폭 동안 그들의 특이적 항체 생산성 면에서 균질성을 상실한다.
본원은 본원에 기재된 항체 또는 이의 부분을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(핵산), 이러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 폴리펩티드로 전사하고 번역하기 위한 숙주 세포 및 발현 시스템을 제공한다.
본원은 하나 이상의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구축물도 제공한다.
본원은 하나 이상의 상기 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포도 제공한다. 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 핵산은 항체를 코딩 핵산으로부터 발현시키는 단계를 포함하는 항체의 제조 방법과 마찬가지로 본원의 한 양태를 형성한다. 발현은 상기 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생성 후, 임의의 적합한 기법을 이용하여 항체 또는 이의 부분을 단리하고/하거나 정제한 후 적절하게 사용할 수 있다.
특이적 항체(또는 이의 부분) 코딩 핵산 분자 및 본원에 기재된 핵산 분자를 함유하는 벡터는 예를 들면, 그들의 천연 환경으로부터 실질적으로 순수한 또는 균질한 형태로 단리되고/되거나 정제된 상태로 제공될 수 있다. 핵산의 경우, 핵산은 요구된 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 기원 핵산 또는 유전자를 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는다. 핵산 서열은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고 전체적으로 또는 부분적으로 합성 핵산 서열일 수 있다. 정제 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다.
다양한 상이한 숙주 세포들에서 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시키기 위한 시스템은 잘 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 포유동물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당분야에서 사용가능한 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 골수종 세포 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
매우 다양한 단세포성 숙주 세포들도 DNA 서열의 발현에 유용하다. 이들 숙주들은 잘 공지되어 있는 진핵 숙주 및 원핵 숙주, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli) 균주, 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 진균, 예컨대, 효모, 및 동물 세포, 예컨대, CHO, YB/20, NS0, SP2/0, R1.1, B-W 및 L-M 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(예를 들면, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 및 BMT10), 곤충 세포(예를 들면, Sf9), 및 조직 배양물 중의 인간 세포 및 식물 세포를 포함한다.
원핵 세포, 예컨대, 이. 콜라이에서의 항체 또는 이의 부분의 발현은 당분야에서 잘 확립되어 있다. 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌(Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991))을 참조한다.
배양물 중의 진핵 세포에서의 발현도 본원에 기재된 항체의 제조 방법으로서 당업자에게 이용될 수 있다(최근 평론에 대해서는 예를 들면, 문헌(Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576) 및 문헌(Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560)(이들 각각은 온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨) 참조).
프로모터 서열을 포함하는 적절한 조절 서열, 종결요소 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 경우 다른 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택할 수 있거나 구축할 수 있다. 벡터는 적절한 경우 플라스미드, 바이러스, 예를 들면, 파지 또는 파지미드일 수 있다. 추가 상세한 설명에 대해서는 예를 들면, 문헌(Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 참조한다. 예를 들면, 핵산 구축물의 제조, 돌연변이유발, 서열결정, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에 있어서 핵산의 조작을 위한 많은 공지된 기법들 및 프로토콜들은 문헌(Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992)에 상세히 기재되어 있다. 문헌(Sambrook et al.) 및 문헌(Ausubel et al.)의 방법 개시내용은 온전히 그대로 본원에 참고로 도입되고 당분야에서 잘 공지되어 있다.
따라서, 추가 양태는 본원에 개시된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 추가 양태는 이러한 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 도입은 임의의 이용가능한 기법을 이용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기법은 예를 들면, 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE 덱스트란, 전기천공, 리포좀 매개 형질감염, 및 레트로바이러스(retrovirus) 또는 다른 바이러스, 예를 들면, 백시니아(vaccinia) 또는 바큘로바이러스(baculovirus)(곤충 세포의 경우)를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 기법은 예를 들면, 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
도입 후, 예를 들면, 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 야기할 수 있거나 허용할 수 있다.
한 실시양태에서, 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들면, 염색체) 내로 삽입된다. 삽입은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다. Ig 인핸서는 발현을 최대화하기 위해 필요에 따라 초기화될 수 있다.
본원은 상기 항체(또는 이의 부분)를 발현하기 위해 발현 시스템에서 전술된 구축물을 사용하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
또한, 본원은 CD105에 결합하는 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 예컨대, 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자, 또는 이의 축퇴 변이체, 돌연변이체, 유사체 또는 단편에 관한 것이다.
추가 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 부분의 재조합 DNA 분자 또는 클로닝된 유전자의 전체 DNA 서열은 적절한 숙주 내로 도입될 수 있는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 본원은 항체의 VH, VL, CL 및/또는 Fc를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 클로닝된 유전자 또는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 단세포성 숙주까지 확장된다.
또 다른 특징은 본원에 개시된 DNA 서열의 발현이다. 당분야에서 잘 공지되어 있는 바와 같이, DNA 서열은 이 서열을 적절한 발현 벡터 내의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결하고 상기 발현 벡터를 사용하여 적절한 단세포성 숙주를 형질전환시킴으로써 발현될 수 있다.
물론, DNA 서열과 발현 조절 서열의 이러한 작동가능한 연결은 이미 상기 DNA 서열의 일부가 아닌 경우 개시 코돈 ATG를 상기 DNA 서열의 상류에서 정확한 판독 프레임으로 제공하는 것을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및 벡터는 단리되고/되거나 정제된 형태(예를 들면, 요구된 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 이외의 기원 폴리뉴클레오티드를 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는 형태)로 제공될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한" 및 "실질적으로 갖지 않는"은 예를 들면, 약 20% 이하의 외래 물질, 약 10% 이하의 외래 물질, 약 5% 이하의 외래 물질, 약 4% 이하의 외래 물질, 약 3% 이하의 외래 물질, 약 2% 이하의 외래 물질 또는 약 1% 이하의 외래 물질을 함유하는 용액 또는 현탁액을 지칭한다.
매우 다양한 숙주/발현 벡터 조합물들이 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는 데에 사용될 수 있다. 유용한 발현 벡터는 예를 들면, 염색체 DNA 서열, 비-염색체 DNA 서열 및 합성 DNA 서열의 절편으로 구성될 수 있다. 적합한 벡터는 SV40의 유도체 및 공지된 세균 플라스미드, 예를 들면, 이. 콜라이 플라스미드 col E1, Pcr1, Pbr322, Pmb9 및 이들의 유도체, RP4와 같은 플라스미드; 파지 DNA, 예를 들면, 파지 λ의 수많은 유도체, 예를 들면, NM989, 및 다른 파지 DNA, 예를 들면, M13 및 사상 단일 가닥 파지 DNA; 효모 플라스미드, 예컨대, 2u 플라스미드 또는 이의 유도체; 진핵 세포에 유용한 벡터, 예컨대, 곤충 또는 포유동물 세포에 유용한 벡터; 플라스미드와 파지 DNA의 조합물로부터 유도된 벡터, 예컨대, 파지 DNA 또는 다른 발현 조절 서열을 사용하기 위해 변경된 플라스미드 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포도 제공한다. 본원에서 제공된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터의 발현을 포함하는 항체의 제조 방법과 마찬가지로 본원의 한 양태를 형성한다. 발현은 예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양함으로써 달성될 수 있다. 그 후, 항체는 임의의 적합한 기법을 이용함으로써 단리될 수 있고/있거나 정제될 수 있고 적절하게 사용될 수 있다.
매우 다양한 발현 조절 서열들(그 자신에 작동가능하게 연결된 DNA 서열의 발현을 조절하는 서열들) 중 임의의 발현 조절 서열이 DNA 서열을 발현하기 위해 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열은 예를 들면, SV40, CMV, 백시니아, 폴리오마(polyoma) 또는 아데노바이러스(adenovirus)의 초기 또는 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 시스템, TRC 시스템, LTR 시스템, 파지 λ의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코트 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제(kinase) 또는 다른 당용해 효소에 대한 프로모터, 산 포스파타제(phosphatase)(예를 들면, Pho5)의 프로모터, 효모 알파-교배 인자의 프로모터, 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지되어 있는 다른 서열, 및 이들의 다양한 조합물을 포함한다.
모든 벡터들, 발현 조절 서열들 및 숙주들이 DNA 서열을 발현하기 위해 동등하게 잘 작용하지는 않을 것이라는 것이 이해될 것이다. 모든 숙주들도 동일한 발현 시스템으로 동등하게 잘 작용하지는 않을 것이다. 그러나, 당업자는 본원의 범위를 벗어나지 않으면서 원하는 발현을 달성하기 위해 과도한 실험 없이 적절한 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면, 벡터의 선택에 있어서, 벡터가 숙주 내에서 작용해야 하기 때문에 숙주가 고려되어야 한다. 벡터의 카피 수, 그 카피 수를 조절하는 능력 및 벡터에 의해 코딩된 임의의 다른 단백질, 예컨대, 항생제 마커의 발현도 고려될 것이다. 당업자는 본원의 범위를 벗어나지 않으면서 원하는 발현을 달성하기 위해 적당한 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주를 선택할 수 있다. 예를 들면, 벡터의 선택에 있어서, 벡터가 숙주 내에서 작용하기 때문에 숙주가 고려된다. 벡터의 카피 수, 그 카피 수를 조절하는 능력 및 벡터에 의해 코딩된 임의의 다른 단백질, 예컨대, 항생제 마커의 발현도 고려될 수 있다.
본원은 하나 이상의 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 본원의 임의의 부분에 기재된 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구축물도 제공한다. 프로모터 서열을 포함하는 적절한 조절 서열, 종결요소 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 선별 마커 및 적절한 경우 다른 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택할 수 있거나 구축할 수 있다. 벡터는 적절한 경우 플라스미드, 바이러스, 예를 들면, 파지, 파지미드 등일 수 있다. 추가 상세한 설명에 대해서는 예를 들면, 문헌(Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 참조한다. 예를 들면, 핵산 구축물의 제조, 돌연변이유발, 서열결정, 세포 내로의 DNA의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에 있어서 핵산의 조절을 위한 많은 공지된 기법들 및 프로토콜들은 문헌(Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992)에 상세히 기재되어 있다. 문헌(Sambrook et al.) 및 문헌(Ausubel et al.)의 방법 및 개시내용은 본원에 참고로 도입된다.
발현 조절 서열의 선택에 있어서, 다양한 인자들이 통상적으로 고려될 것이다. 이들은 예를 들면, 시스템의 상대적인 강도, 그의 조절능, 및 특히 잠재적인 이차 구조 면에서 발현될 특정 DNA 서열 또는 유전자와 그의 상용성을 포함한다. 적합한 단세포성 숙주는 예를 들면, 선택된 벡터와 그의 상용성, 그의 분비 특징, 정확하게 단백질을 폴딩하는 그의 능력 및 그의 발효 요건뿐만 아니라, 발현될 DNA 서열에 의해 코딩된 생성물의 숙주에 대한 독성, 및 발현 생성물의 정제 용이성의 고려에 의해 선택될 것이다.
추가 양태는 본원에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 추가 양태는 임의의 이용가능한 기법으로 이러한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기법은 예를 들면, 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란, 전기천공, 리포좀 매개 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스(예를 들면, 백시니아) 또는 바큘로바이러스(곤충 세포의 경우)를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 기법은 예를 들면, 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
도입 후, 예를 들면, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하기 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로부터의 발현을 야기할 수 있거나 허용할 수 있다. 유도성 시스템이 사용될 수 있고 발현은 활성화제의 첨가에 의해 유도될 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈(예를 들면, 염색체) 내로 삽입될 수 있다. 삽입은 표준 기법에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 숙주 세포에서 에피좀 벡터 상에서 유지된다.
본원은 특정 폴리펩티드를 발현하기 위해 발현 시스템에서 전술된 구축물을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
이들 인자들 및 다른 인자들을 고려할 때, 당업자는 발효 시 또는 대규모 동물 배양에서 DNA 서열을 발현할 다양한 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합물들을 구축할 수 있을 것이다.
항체 또는 이의 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 클로닝될 수 있다는 것 이외에, 또는 클로닝될 수 있다기보다는 오히려 재조합적으로/합성적으로 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 적절한 코돈을 갖도록 디자인될 수 있다. 일반적으로, 당업자는 서열이 발현을 위해 사용될 경우 의도된 숙주를 위한 바람직한 코돈을 선택할 것이다. 완전한 폴리뉴클레오티드는 표준 방법에 의해 제조된 중첩 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있고 완전한 코딩 서열로 조립될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Edge, Nature, 292:756 (1981)); 문헌(Nambair et al., Science, 223:1299 (1984)) 및 문헌(Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984))을 참조한다.
항체(또는 이의 부분) 코딩 핵산의 동시적인 도입 및 선택된 아미노산 위치 변화는 예를 들면, 재조합 및 화학적 합성을 포함하는, 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다.
항-CD105 항체
엔도글린(CD105)은 180 kDa의 동종이량체성 경막 단백질로서 세포 표면 상에서 발현된다. 외부 도메인은 높은 친화성(50 nM)으로 TGF-β1 및 TGF-β3 동종형들에 결합하고, CD105의 경막 도메인 및 세포내 도메인은 베타글리칸과 71% 서열 유사성을 공유한다. 인간 CD105 유전자는 염색체 9q34 상에 위치하고, 형광 제자리 혼성화의 이용을 통해 확인되고, 코딩 영역은 14개의 엑손들을 함유하고, TGF-β에 결합하는 능력을 갖는 CD105의 2개 상이한 동종형들(L 및 S)이 특징규명되었다. L-CD105는 14개 아미노산 세포질 꼬리와 함께 600개 아미노산 잔기로 구성된 S-CD105와 대조적으로 세포질 꼬리에서의 47개 아미노산 잔기와 함께 633개 아미노산 잔기로 구성된다. 그러나, L-CD105는 우성 형태이다. CD105는 내피세포에서 주로 세린 및 쓰레오닌 잔기 상에서 항시적으로 인산화되고, 이 인산화는 세포 내의 항시적 활성 TGF-β RII에 기인한다. TGF-β와 CD105의 결합은 단백질 키나제 C 억제제의 사용 시 관찰된 효과와 유사한, 인산화의 하향조절을 초래한다. 인간 CD105 아미노산 서열은 세포외 도메인의 노출된 영역에 위치하는 트리펩티드 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)을 함유한다. RGD 펩티드는 ECM 단백질, 예컨대, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 본 빌레브란트 인자(vWF), I형 콜라겐 및 피브리노겐 상에서 발견된 핵심 인식 구조물이고, 세포 표면 인테그린에 의해 인식된다. 인테그린 부착은 내피가 중추적인 역할을 수행하는 항상성, 혈전증, 혈관신생 및 염증 과정에 연루되어 있다(Duff et al., FASEB J., 17:984-992 (2003)).
CD105는 증식 내피세포에 의해 발현되는 TGF-β 수용체 패밀리의 구성원이다. 정상 수준의 CD105는 내피세포 증식을 위해 필요하다. CD105 발현은 저산소증-유도성 인자-1-α(HIF-1-α)의 생성을 통한 세포 저산소증에 의해 증가되고 저산소증 세포를 아폽토시스로부터 보호한다. CD105의 여러 기능은 TGF-β 신호전달과 관련되어 있다. TGF-β는 세린 키나제 수용체 I(RI) 및 수용체 II(RII)로 구성된 이종이량체 수용체를 통해 신호를 전달한다. TGF-β와 상기 수용체의 외부 도메인의 결합은 TGF-β RI을 인산화시키는 세포질 RII 키나제 활성을 드러내고, 그 후 상기 TGF-β RI은 하류 신호전달제, 예컨대, Smad 단백질과 상호작용할 수 있다. CD105는 TGF-β 수용체 복합체의 일부를 형성하지만 세포 표면 상에서 독립적으로 존재할 수 있다. 시험관내 많은 세포들에서, CD105는 TGF-β 신호전달을 억제한다.
CD105는 다른 성장 인자, 예컨대, 액티빈 A 및 뼈 형태형성 단백질(BMP)-10, BMP-9, BMP-7 및 BMP-2에도 결합한다. TGF-β 또는 다른 성장 인자 리간드와 CD105의 결합은 적어도 수용체 RII의 존재를 요구하고, CD105는 그 자체로 리간드에 결합할 수 없다. CD105와 수용체의 회합은 리간드 자체에 대한 그들의 친화성을 변경시키지 않는다. 회합 시, CD105의 세포질 도메인이 TGF-β RI 및 TGF-β RII에 의해 인산화된 후, TGF-β RI 키나제가 수용체 복합체로부터 해리되지만 TGF-β RII 키나제는 해리되지 않는다.
CD105 발현은 TGF-β RII의 인산화 수준을 억제하지만 TGF-β RI의 인산화 수준을 증가시켜, Smad 2의 인산화를 증가시키지만 Smad 3의 인산화를 증가시키지는 않는다. Smad 2가 다양한 전사 인자, 보조활성화제 및 억제제와 상호작용할 수 있기 때문에, 인산화된 Smad 2는 유전자 전사를 조절하기 위한 다수의 신호들의 통합자로서 작용할 수 있다. 따라서, CD105는 TGF-β RI 및 TGF-β RII와의 상호작용을 통해 TGF-β 기능을 조절하고 하류 Smad 단백질의 인산화를 변경시킨다.
CD105는 TGF-β 수용체(TGF-βR), 액티빈 수용체 유사 키나제(ALK) 및 액티빈 수용체를 포함하는 TGF-β 수퍼패밀리의 다수의 키나제 수용체 복합체들의 신호전달을 조절하도록 작용한다. CD105의 부재 하에서, TGF-β 수용체의 활성화는 내피세포 생장을 억제하는 SMAD 단백질(SMAD 2 및 3)의 인산화를 초래한다. 그러나, TGF-β에 의한 CD105의 활성화는 SMAD 단백질 인산화(SMAD 1, 5 및 8의 인산화를 포함함)를 조절한다. 최종 결과는 내피세포에 대한 TGF-β 수용체 활성화의 생장 억제 효과의 방출이다(도 2 참조). 당연히, 항-CD105 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 CD105 활성화의 방해는 내피세포 생장을 억제하는 데에 있어서 TGF-β와 상승작용적으로 작용한다.
CD105 프로모터는 그의 길이가 2.6 kb이지만 TATA 또는 CAAT 전사 개시 박스를 함유하지 않는다. 그러나, 상기 프로모터는 2개의 GC-풍부 영역, Sp1, ets, GATA, AP-2, NGF-β 및 Mad에 대한 컨센서스 모티프, 및 TGF-β 반응 요소를 갖는다. 그럼에도 불구하고, CD105는 상대적으로 제한된 세포 분포를 갖는다. 기초 수준의 전사는 위치 -68의 ets 부위 및 Sp1 부위를 요구하는 듯하지만, 예를 들면, 내피세포로의 발현의 상대적 제한은 다수의 조절 영역, 특히 -1294 내지 -932에서 1개의 조절 영역 및 전사 개시 부위에 매우 가까운 위치에서 또 다른 조절 영역을 수반하는 듯하다. CD105는 TGF-β에 의해 상향조절되고, 이것은 -37 내지 -29에서 Sp1 부위를 요구하고 (TGF-β 신호전달에 의해 활성화되는) Smad 3 및/또는 Smad 4에 결합하는 하나 이상의 병치된 상류 SBE 부위도 수반하는 것으로 밝혀졌다. 저산소증은 허혈성 조직 및 종양의 공통된 특징이고, 혈관 내피세포(EC)에서 CD105 유전자 발현을 위한 강력한 자극제이다. 이러한 효과는 TGF-β1과의 조합 시 강화된다. 상향조절된 CD105는 저산소증 스트레스 하에서 EC에서 자가 보호 역할을 발휘할 수 있다.
혈관 EC는 CD105의 주요 공급원이다. 혈관 평활근 세포, 섬유모세포, 대식세포, 전구-B 및 골수단핵세포 유래의 백혈병 세포, 및 적혈구 전구체를 비롯한 다른 유형의 세포들은 CD105를 보다 적은 정도로 발현한다.
CD105는 혈관신생에 관여한다. 안티센스 실험은 HUVEC에서의 CD105 발현의 억제가 TGF-β1과의 조합 시 시험관내 혈관신생을 현저하게 억제한다는 것을 입증하였는데, 이것은 CD105가 내피세포에서 전구혈관신생 성분이라는 것을 시사한다. 혈관신생에 있어서 CD105의 중요한 역할의 추가 증거는 CD105 넉아웃 마우스로부터 나온다. CD105 널(null) 마우스는 초기 배아 단계에서 사멸을 초래하는 다수의 혈관 및 심장 결함을 나타낸다. CD105 널 마우스에서 관찰된 중증 혈관 손상은 CD105가 배아외 혈관구조에서 성숙 혈관의 형성을 위해 요구된다는 것을 시사하는데, 이것도 혈관신생에 있어서 CD105의 직접적인 역할을 확인시켜준다.
특히, 엔도글린 또는 edg-1로서도 공지되어 있는 CD105는 증식 혈관 내피세포에서 고수준으로 발현되는 I형 동종이량체 막 당단백질이다. 따라서, CD105는 일차적으로 활성 혈관신생을 겪는 내피세포에 대한 증식 관련 마커이다. 그러나, 정상 조직의 혈관 내피에 의한 CD105의 한정된 발현이 있을 수 있다. 인간 CD105는 형질전환 성장 인자-β(TGF-β)에 특이적으로 결합하는 것으로 공지되어 있고, CD105의 유추된 아미노산 서열은 TGF-β 수용체의 한 유형인 β-글리칸에 대한 강한 상동성을 갖는다.
CD105는 내피세포 및 백혈병 세포 상의 증식 관련 항원이기 때문에 종양 혈관구조를 감소시키는 항체-기초 방법에서 표적화되었다. 그의 발현은 종양 관련 혈관 내피에서 상향조절되고, CD105는 혈관신생을 위해 필수적이다. 혈관신생은 신생혈관형성을 초래하는 새로운 모세혈관의 형성뿐만 아니라 기존 혈관구조의 유지도 포함한다. 혈관신생은 혈관 기저막 및 간질 매트릭스의 내피세포 매개 분해, 내피세포의 이동, 내피세포의 증식 및 내피세포에 의한 모세혈관 루프의 형성을 포함하는 일련의 순차적인 단계들을 포함하는 복잡한 과정이다.
CD105는 기존 혈관구조를 포함하고 지탱하는 세포뿐만 아니라 새로운 혈관구조의 생장을 촉진하고 새로운 혈관구조의 일부가 되는 세포 상에서도 발견될 수 있다. 이들 항체들은 CD105에 결합하여 혈관신생을 억제할 수 있고/있거나, 기존 혈관구조 또는 기존 혈관구조의 유지를 억제할 수 있고/있거나, 소혈관 확장을 억제할 수 있다. 이들 항체들은 CD105의 정제를 위한 그들의 용도 이외에 정제, 검출 및 진단 목적뿐만 아니라 치료 목적에도 유용하다. 본원에서 제공된 항체는 다양한 질병들 및 질환들의 치료를 위한 약제의 제제화, 상기 질병들 및 질환들의 치료 방법 및 검출 또는 진단 방법에서 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 혈관신생은 새로운 혈관의 성장 및/또는 발생(신규혈관형성으로서도 지칭됨), 소혈관의 확장, 과도한 또는 연장된 혈관 성장, 및 기존 혈관구조의 유지를 포함한다. 혈관신생 질병 및 질환은 혈관신생과 관련되어 있거나, 혈관신생에 의해 야기되거나 혈관신생과 연관되어 있는 질환 및 질병을 지칭한다. 이러한 질환의 비-한정적 예로는 다양한 형태의 암(일차 종양 및 전이)이 있다. CD105 활성을 조절하여 혈관신생을 억제하고/하거나 소혈관의 혈관확장을 억제하는, CD105에 대한 뮤린 단일클론 항체들(mAb들)이 발생되었다. 이들 뮤린 항체들은 미국 특허 제5,928,641호, 제6,200,566호, 제6,190,660호 및 제7,097,836호(이들 각각은 온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 추가로, 다수의 이들 항체들의 생체외 및 생체내 효능이 입증되었고; CD105에 결합하는 단일클론 항체는 CD105 조절 화합물로서 관심을 끈다. 그러나, 뮤린 항체의 투여가 예를 들면, 인간 항-마우스 항체(HAMA)의 형태에서의 면역원성을 비롯한 다수의 한계를 갖기 때문에 뮤린 항체의 치료적 사용은 실행될 수 없다.
여러 항-CD105 항체, 특히 항-CD105 단일클론 항체("mAb")가 기재되어 있다. MAb SN6은 인간 백혈병 세포의 세포막의 당단백질 혼합물을 사용한 마우스의 면역화로부터 발생된 항체이다(Haruta and Seon, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:7898-7902). SN6은 인간 CD105를 인식하는 뮤린 mAb이다. MAb 44G4는 인간 전구-B 백혈병 세포의 전체 세포 현탁액을 사용한 마우스의 면역화로부터 발생된 항체이다(Gougos and Letarte, 1988, J. Immunol. 141:1925-1933; 1990, J. Biol. Chem. 265:8361-8364). 44G4도 인간 CD105를 인식하는 뮤린 mAb이다. MAb MJ7/18은 염증이 생긴 마우스 피부를 사용한 래트의 면역화로부터 발생된 항체이다(상기 문헌(Ge and Butcher, 1994)). MJ7/18도 뮤린 CD105를 인식하는 mAb이다. mAb Tec-11은 인간 탯줄 정맥 내피세포를 사용한 마우스의 면역화로부터 발생된 항체이다(Burrows et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1623-1634). Tec-11은 인간 CD105로 제한된 반응성을 갖는 뮤린 mAb이다. 그의 특이성을 유지하고/하거나 개선하면서 감소된 면역원성을 나타내는, CD105에 결합하는 키메라 항체가 본원에 기재되어 있다. 추가로, 뮤린 항체와 관련된 문제점을 해결하기 위해, 그의 특이성을 유지하고/하거나 개선하면서 감소된 면역원성을 나타내는, CD105에 결합하고 혈관신생을 감소시키고/시키거나 억제하는 키메라 항체가 본원에 기재되어 있다. 이들 항-CD105 항체들은 다양한 질병들 및 질환들의 진단 및 치료뿐만 아니라 CD105의 정제 및 검출에도 유용하다. CD105에 대한 항체는 혈관신생을 수반하거나, 혈관신생에 의해 영향을 받거나 혈관신생에 의해 발생된 다양한 질환 및 병태의 치료를 위한 치료법의 개발을 위한 중요한 영역을 대표한다.
본원은 CD105에 결합하는 항체를 제공한다. CD105에 결합하고 혈관신생/신생혈관형성 또는 소혈관의 확장을 (부분적으로 또는 전체적으로) 억제하거나 (부분적으로 또는 전체적으로) 관리/치료하거나, 세포 증식을 억제하거나 종양 성장을 억제하는 항체(또는 이의 항원 결합 단편)도 제공한다. 유사하게, CD105 기능(예를 들면, 신호전달, 결합, 활성화 등)의 억제도 CD105를 억제하거나 CD105에 결합한다는 의미 내에 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 CD105에 결합함으로써 혈관신생을 억제한다. 본원은 항체의 생성에 사용될 수 있는 세포주, 상기 세포주의 제조 방법, 항체의 발현 방법 및 항체의 정제 방법도 제공한다.
당업자는 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 발생된, CD105에 특이적으로 결합하는 항체가 ELISA를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 통상적인 방법을 이용함으로써 CD105에 결합하는 능력에 대해 본원에서 제공된 분석 또는 당분야에서 공지되어 있는 분석으로 시험될 수 있다는 것을 인식할 수 있다. 본원에 기재된 항체의 친화성은 비아코어 또는 표면 플라스몬 공명을 포함하나 이들로 한정되지 않는 통상적인 방법을 이용함으로써 측정될 수도 있다.
본원은 CD105에 결합하는 항체를 제공한다. 본원은 CD105에 결합하고 혈관신생을 억제하는 항체도 제공한다.
본원은 서열 번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 서열 번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역, 서열 번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 감마 1(γ1) 불변 영역(Fc)을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 비-한정적 실시양태에서, 항-CD105 항체는 서열 번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열 번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 서열 번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 번호 10으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함한다.
또 다른 비-한정적 실시양태에서, 단리된 인간화된-탈면역화된 항-CD105 항체는 서열 번호 11로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 인간화된-탈면역화된 중쇄의 다른 비-한정적 예로는 서열 번호 13, 14, 15 및 16이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 인간화된-탈면역화된 경쇄의 다른 비-한정적 예로는 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 서열들은 하기 실시예 17에서 제공되어 있다.
또 다른 양태에서, 본원은 상기 항체의 VH 및 VL 서열들을 갖는 항체의 5% 이상이 ELISA 분석에서 이러한 항체와의 경쟁에 의해 CD105와의 결합으로부터 차단되는 조건 하에서 본원에 기재된 항-CD105 항체와 경쟁할 수 있는 항체를 제공한다.
본원은 CD105에 결합하고 CD105의 활성을 조절하는 중화 항체를 제공한다. 상기 중화 항체는 예를 들면, CD105에 결합함으로써 혈관신생을 억제할 수 있다.
본원에 기재된 항체는 더 상세히 후술되어 있는 바와 같이 검출 또는 진단 적용에 유용하다. 본원에 기재된 항체는 CD105에 결합하는 데에 유용하므로, 본원에 기재된 바와 같이 혈관신생을 억제할 수 있다.
본원에 기재된 항체는 치료 적용에 사용되기 위해 치료 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항체는 면역접합체로서 사용될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본 명세서 및 특허청구범위의 목적을 위해, 면역접합체는 본 발명에 따른 항-CD105 항체 또는 이의 단편 및 하나 이상의 치료 표지로 구성된 접합체를 지칭한다. 치료 표지는 항종양제 및 혈관신생 억제제를 포함한다. 이러한 항종양제는 당분야에서 공지되어 있고, 독소, 약물, 효소, 사이토킨, 방사성핵종, 광역학적 물질 및 혈관신생 억제제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 독소는 리신 A 쇄, 돌연변이체 슈도모나스 외독소, 디프테리아 변성독소, 스트렙토니그린(streptonigrin), 보아마이신(boamycin), 사포린(saporin), 겔로닌(gelonin) 및 미국자리공 항바이러스 단백질을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 약물은 다우노루비신, 메토트렉세이트 및 칼리케아미신을 포함한다. 방사성핵종은 방사성금속을 포함한다. 사이토킨은 형질전환 성장 인자(TGF)-β, 인터류킨, 인터페론 및 종양 괴사 인자를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 광역학적 물질은 포피린(porphyrin) 및 이의 유도체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가 치료 표지는 당분야에서 공지되어 있고 본원에서도 고려된다. 항-CD105 mAb 또는 이의 단편과 하나 이상의 항종양제로 복합체를 형성하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(즉, 문헌(Ghetie et al., 1994, Pharmacol. Ther. 63:209-34)에 의해 검토된 항체 접합체). 이러한 방법은 분자들을 커플링시키거나 연결하는 데에 사용되는 여러 입수가능한 이종이작용성 시약들 중 하나를 사용할 수 있다. 추가 방사성핵종도 분자들, 예컨대, 치료 및 진단 표지들을 연결하는 추가 방법과 함께 본원에 기재되어 있다.
항체는 다양한 목적으로 당분야에서 공지되어 있는 기법, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 추가를 이용함으로써 변경될 수 있다. PEG 변경(PEG화)은 개선된 순환 시간, 개선된 가용성, 단백질분해에 대한 개선된 내성, 감소된 항원성 및 면역원성, 개선된 생체이용가능성, 감소된 독성, 개선된 안정성, 및 보다 용이한 제제화 중 하나 이상을 유발할 수 있다(검토를 위해서는 문헌(Francis et al., International Journal of Hematology 68:1-18, 1998) 참조).
항체의 Fc 부분은 환자에게 투여될 때 혈액에서 순환 반감기를 증가시키도록 변경될 수 있다. 변경은 당분야의 통상적인 수단, 예를 들면, 미국 특허 제7,217,798호(온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 수단을 이용함으로써 확인될 수 있다.
순환계에서의 항체-기제 융합 단백질의 반감기를 개선하는 다른 방법도 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제7,091,321호 및 제6,737,056호(이들 각각은 참고로 본원에 도입됨)에 기재되어 있다). 추가로, 항체는 이 항체가 그의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당쇄 상에서 푸코스를 함유하지 않도록 생성될 수 있거나 발현될 수 있다. 복합체 N-글리코사이드-연결된 당쇄로부터의 푸코스의 제거는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존적 세포독성(CDC)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 항체 및 항원 결합 단편의 이펙터 기능을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, CD105에 결합할 수 있는 항체는 그의 C-말단에서 임의의 항체 동종형, 예를 들면, IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM, 및 임의의 동종형 서브클래스, 특히 IgG1, IgG2b, IgG2a, IgG3 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부에 부착될 수 있다.
추가로, 본원에 기재된 항체는 혈액-뇌 장벽을 횡단할 수 있도록 변경될 수도 있다. 본원에 기재된 항체의 이러한 변경은 뇌 질환, 예컨대, 다형성 아교모세포종(GBM)의 치료를 가능하게 한다. 단백질, 예컨대, 항체가 혈액-뇌 장벽을 횡단할 수 있게 하는 예시적인 변경은 미국 특허 공보 제20070082380호(온전히 그대로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다.
면역글로불린의 글리코실화는 그의 이펙터 기능, 구조적 안정성 및 항체 생성 세포로부터의 분비 속도에 유의한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985)). 이들 성질들을 책임지는 탄수화물 기는 일반적으로 항체의 불변(C) 영역에 부착된다. 예를 들면, CH2 도메인 내의 아스파라긴 297에서의 IgG의 글리코실화는 보체 의존적 세포용해의 고전적인 경로를 활성화시키는 IgG의 완전한 능력을 위해 요구된다(Tao and Morrison, J. Immunol. 143:2595 (1989)). CH3 도메인 내의 아스파라긴 402에서의 IgM의 글리코실화는 항체의 적절한 조립 및 세포용해 활성에 필수적이다(Muraoka and Shulman, J. Immunol. 142:695 (1989)). IgA 항체의 CH1 및 CH3 도메인 내의 위치 162 및 419에서의 글리코실화 부위의 제거는 세포내 분해 및 90% 이상의 분비 억제를 유발하였다(Taylor and Wall, Mol. Cell. Biol. 8:4197 (1988)). 추가로, 항체는 그의 복합체 N-글리코사이드-연결된 당쇄 상에서 푸코스를 함유하지 않도록 생성될 수 있거나 발현될 수 있다. 상기 복합체 N-글리코사이드-연결된 당쇄로부터의 푸코스의 제거는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 및 보체 의존적 세포독성(CDC)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 항체 및 항원 결합 단편의 이펙터 기능을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 이들 "탈푸코실화된" 항체는 푸코스가 복합체 N-글리코사이드-연결된 당쇄 내에 포함되는 데에 필요한 효소 및 생화학적 경로를 더 이상 함유하지 않도록 유전적으로 조작된 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 세포주(푸코실트랜스퍼라제 넉-아웃 동물, 식물 또는 세포로서도 공지되어 있음)를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 분자 클로닝 기법을 이용하는 다양한 시스템을 통해 생성될 수 있다. 푸코실트랜스퍼라제 넉-아웃 세포가 되도록 조작될 수 있는 세포의 비-한정적 예로는 CHO 세포, SP2/0 세포, NS0 세포 및 YB2/0 세포가 있다.
가변(V) 영역에서의 면역글로불린의 글리코실화도 관찰되었다. 속스(Sox) 및 후드(Hood)는 약 20%의 인간 항체가 V 영역에서 글리코실화된다고 보고하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:975 (1970)). V 도메인의 글리코실화는 V 영역 서열에서의 N-연결된 글리코실화 신호 Asn-Xaa-Ser/Thr의 우연한 발생으로부터 비롯되는 것으로 생각되고, 면역글로불린 기능에서 일정한 역할을 수행하는 것으로서 당분야에서 인식되어 있지 않다.
가변 도메인 골격 잔기에서의 글리코실화는 항체와 항원의 결합 상호작용을 변경시킬 수 있다. 본 발명은 항체의 친화성을 증가시키기 위해 면역글로불린 쇄의 골격 또는 CDR에서 한정된 수의 아미노산이 (예를 들면, 잔기의 치환, 결실 또는 추가에 의해) 돌연변이되도록 선택되는 데에 사용되는 기준을 포함한다.
항원과의 결합에 대한 친화성은 일반적으로 하나 이상의 돌연변이를 V 영역 골격, 전형적으로 하나 이상의 CDR에 인접한 영역 및/또는 하나 이상의 골격 영역 내로 도입함으로써 조절될 수 있다. 전형적으로, 이러한 돌연변이는 글리코실화 부위 서열을 파괴하거나 생성하되 폴리펩티드의 하이드로패틱(hydropathic) 구조적 성질에 실질적으로 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환의 도입을 포함한다. 전형적으로, 프롤린 잔기를 도입하는 돌연변이는 회피된다. 항체의 글리코실화는 미국 특허 제6,350,861호(글리코실화에 대하여 본원에 참고로 도입됨)에 더 기재되어 있다.
항체는 단기간 전달 또는 연장된(장기간) 전달을 위해 제제화될 수 있다.
CD105에 결합하는 항체는 더 상세히 후술되어 있는 바와 같이 CD105와 관련된 질환 또는 장애를 검출하거나 진단하기 위해 샘플 또는 환자에서 CD105를 정제하고/하거나 CD105 수준을 검출하는 데에 사용될 수도 있다.
이러한 방법을 이용함으로써 발생된, CD105에 결합하는 항체는 그의 결합 친화성, 결합활성 및 중화 능력 중 하나 이상에 대해 시험될 수 있다. 유용한 항체는 혈관신생과 관련된 병태, 질환 또는 장애를 예방하거나, 억제하거나, 관리하거나 치료하기 위해 환자에게 투여되는 데에 사용될 수 있다.
항체는 결합 친화성, 결합 속도, 해리 속도 및 결합활성 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다. 한 양태에서, 항체는 CD105 또는 VEGF의 활성을 중화하는 그의 능력에 대해 평가될 수 있다. 결합 친화성, 결합 속도, 해리 속도 및 결합활성의 측정은 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA), 스캐차드 분석, 비아코어 분석(표면 플라스몬 공명) 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 인정된 분석뿐만 아니라, 당업자에 의해 통상적으로 이용되고 당업자에게 공지되어 있는 다른 분석을 이용함으로써 달성될 수 있다.
항체와 CD105의 결합, 및/또는 예를 들면, 혈관신생을 억제하는 항체의 능력의 측정은 예를 들면, 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA), 경쟁 결합 분석, ELISPOT 분석, 또는 당분야에서 공지되어 있는 임의의 다른 유용한 분석을 이용함으로써 달성될 수 있다. 이들 분석들은 당업자에 의해 통상적으로 이용되고 당업자에게 잘 공지되어 있다.
한 비-한정적 실시양태에서, ELISA 분석은 CD105에 결합하는 특이적 항체의 결합 능력을 측정하는 데에 이용될 수 있다.
분석, 예컨대, ELISA는 다른 항체에 비해 CD105에 대한 증가된 특이성을 나타내는 항체를 확인하는 데에도 이용될 수 있다. 분석, 예컨대, ELISA는 하나 이상의 폴리펩티드에 걸쳐 존재하고 CD105 또는 VEGF의 하나 이상의 종에 걸쳐 존재하는 에피토프에 결합하는 항체를 확인하는 데에도 이용될 수 있다. 특이성 분석은 CD105에 결합하는 항체를 확인하기 위해 CD105 에피토프를 함유하는 폴리펩티드의 상이한 종들 상의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 능력에 대해 시험 항체를 별개의 분석 챔버에서 동시에 스크리닝하는 병렬 ELISA를 실시함으로써 수행될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 또 다른 겉보기 결합 친화성 측정 기법은 표면 플라스몬 공명 기법(비아코어 2000 시스템 상에서 분석됨)이다(Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329). 표준 측정 및 전통적인 결합 분석은 문헌(Heeley, R. P., Endocr. Res. 2002, 28:217-229)에 기재되어 있다.
CD105에 특이적으로 결합하는 항체는 다양한 형태의 암(예를 들면, 일차 종양, 재발 종양 및 전이)과 관련하여 혈관신생과 관련된 다양한 질환 및 병태를 치료하는 그의 능력에 대해 분석될 수도 있다. 당업자에게 공지되어 있는 임의의 적합한 분석은 이러한 효과를 모니터링하는 데에 이용될 수 있다. 여러 이러한 기법들이 본원에 기재되어 있다. 한 예에서, 본원에 기재된 항체는 CD105에 결합하는 그의 능력에 대해 분석된다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 항체에 대한 결합 상수는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정된다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 항체는 혈관신생의 억제에 대한 그의 효과에 대해 분석된다.
제제
본원에서 제공된 제제는 활성 성분(항-CD105 항체 또는 이의 항체 단편) 이외에 당업자에게 잘 공지되어 있는 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제, 계면활성제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 독성을 나타내지 않아야 하고 활성 성분(들)의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 의존할 것이다.
본원은 항-CD105 항체의 신규 제제, 이 제제를 함유하는 예비충전된 주사기, 및 혈관신생 관련 장애를 치료하는 데에 유용한 이러한 제제의 용도를 제공한다. 본원은 예를 들면, CD105와 관련된 암 및 안과적 병태의 치료를 위한 정맥내 또는 안내 투여를 위해 사용될 수 있는 제제를 제공한다. 본원에 기재된 CD105에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합, 친화성, 결합활성 및 활성은 이전 설명 및 하기 실시예에 기재되어 있는 분석들을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 인정된 방법을 이용함으로써 평가될 수 있다.
한 양태에서, 본원은 약 1 mg/㎖ 내지 약 150 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 약 100 mM 이하의 완충제 및 약 1 M 이하의 폴리올을 포함하고 약 4.0 내지 약 7.5의 pH를 갖는 제제를 제공한다.
한 양태에서, 제제는 제조 후 안정하고, 이것은 통상적인 수단에 따라 시험될 수 있다. 단백질을 포함하는 제제의 안전한 취급 및 투여는 약학 조제자에게 상당한 도전과제에 해당한다. 단백질은 안정성 문제를 제공하는 독특한 화학적 성질 및 물리적 성질을 보유한다: 화학적 불안정성 및 물리적 불안정성 둘다를 내포하는, 단백질에 대한 다양한 분해 경로들이 존재한다. 화학적 불안정성은 탈아민화, 응집, 펩티드 골격의 절단, 및 메티오닌 잔기의 산화를 포함한다. 물리적 불안정성은 예를 들면, 응집을 포함하는 많은 현상들을 포괄한다.
"안정성" 제제는 그 내부의 단백질이 저장 시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 보유하는 제제이다. 단백질 안정성을 측정하는 다양한 분석 기법들이 당분야에서 이용가능하고 예를 들면, 문헌(Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)) 및 문헌(Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993))에서 검토되어 있다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 제제는 1개월 이상 동안 실온(약 30℃) 또는 40℃에서 안정하고/하거나, 1년 이상 또는 2년 이상 동안 약 2℃ 내지 8℃에서 안정하다. 나아가, 제제는 제제의 (예를 들면, -80℃까지) 동결 및 해동 후 안정할 수 있다.
단백질은 색채 및/또는 투명성의 시각적 검사 시, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 측정 시 응집, 침전 및/또는 변성의 징후를 보이지 않는 경우 약학 제제에서 "그의 물리적 안정성을 보유한다". 이러한 측정치를 결정하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고 더 상세히 후술되어 있다.
단백질은 단백질이 하기 정의된 바와 같이 그의 생물학적 활성을 여전히 보유하는 것으로 간주될 정도로 주어진 시간에서 화학적 안정성이 존재하는 경우 제제에서 "그의 화학적 안정성을 보유한다". 화학적 안정성은 화학적으로 변경된 형태의 단백질을 검출하고 정량함으로써 평가될 수 있다. 화학적 변경은 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화/비행시간 질량 분광측정(MALDI/TOF MS)을 이용함으로써 평가될 수 있는 크기 변경(예를 들면, 절단)을 포함할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변경은 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 또는 모세관 전기영동-등전 포커싱(cIEF)에 의해 평가될 수 있는 (예를 들면, 탈아미드화의 결과로서 일어나는) 전하 변경을 포함한다.
항체는 예를 들면, 항원 결합 분석에서 측정될 때 주어진 시간에서의 항체의 생물학적 활성이 제제를 제조한 시간에서 나타난 생물학적 활성의 (분석의 오차 내에 있는) 약 50% 내지 150% 내에 있는 경우 제제에서 "그의 생물학적 활성을 보유한다". 항체에 대한 다른 "생물학적 활성" 분석은 이하에 더 상세히 기재되어 있다.
시간에 따른 제제의 안정성에 대하여, 95% 이상의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정될 때 약 12개월 이상 동안 약 2℃ 내지 8℃에서 저장된 후 단량체로서 존재할 수 있다. 실시예에 기재된 방법들을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 인정된 추가 안정성 평가 방법도 본원에서 고려된다.
또한, 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약 12개월 이상 동안 약 2℃ 내지 8℃에서 저장된 후 CD105 ELISA 결합 분석에 의해 약 50% 내지 150% 결합을 나타낼 수 있다.
항-CD105 항체의 평균 등전점(pI)은 예를 들면, 모세관 전기영동-등전 포커싱에 의해 측정될 때 약 12개월 이상 동안 2℃ 내지 8℃에서 저장된 후 약 8.8 내지 약 9.2일 수 있다.
당업자는 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약 12개월 이상, 약 18개월 이상, 약 24개월 이상, 약 30개월 이상 또는 약 36개월 이상 동안 안정할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
제제는 제제의 동결 및 해동 주기 후 SEC에 의해 측정될 때 단량체로서 존재하는 항-CD105 항체의 95% 이상을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제제는 교반 스트레스를 받는 경우 SEC에 의해 측정될 때 단량체로서 존재하는 항-CD105 항체의 95% 이상을 함유할 수 있다.
항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD105에 결합할 수 있는 CDR들의 임의의 서열을 포함할 수 있다. 한 비-한정적 실시양태에서, 항-CD105 항체는 서열 번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 서열 번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역(CL); 서열 번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 불변 영역(Fc)을 포함하는 TRC105이다.
또 다른 비-한정적 실시양태에서, 항-CD105 항체는 서열 번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열 번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 서열 번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 번호 10으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함한다.
제제는 약 1 mg/㎖ 내지 약 150 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 약 2 mg/㎖, 약 5 mg/㎖, 약 7.5 mg/㎖, 약 10 mg/㎖, 20 mg/㎖, 약 25 mg/㎖, 약 30 mg/㎖, 약 35 mg/㎖, 약 40 mg/㎖, 약 45 mg/㎖, 약 50 mg/㎖, 약 55 mg/㎖, 약 60 mg/㎖, 약 65 mg/㎖, 약 70 mg/㎖, 약 75 mg/㎖, 약 80 mg/㎖, 약 85 mg/㎖, 약 90 mg/㎖, 약 95 mg/㎖, 약 100 mg/㎖, 약 105 mg/㎖, 약 110 mg/㎖, 약 115 mg/㎖, 약 120 mg/㎖, 약 125 mg/㎖, 약 130 mg/㎖, 약 135 mg/㎖, 약 140 mg/㎖, 약 145 mg/㎖, 약 150 mg/㎖ 또는 그 이상, 또는 이들 사이의 임의의 정수를 포함하나 이들로 한정되지 않는 상기 범위 내의 임의의 값의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체 농도를 지칭할 때, 용어 "약"은 표시된 값의 ± 2%를 의미한다.
한 실시양태에서, 제제는 약 25 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 50 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 약 100 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에 기재된 제제는 완충제, 예를 들면, 히스티딘, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 완충제는 약 5 mM 내지 약 100 mM의 양으로 포함될 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 약 5 mM, 약 7.5 mM, 약 10 mM, 약 12.5 mM, 약 15 mM, 약 17.5 mM, 20 mM, 약 22.5 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 약 100 mM, 또는 이들 사이의 임의의 정수의 양으로 히스티딘, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 완충제 농도를 지칭할 때, 용어 "약"은 표시된 값의 ± 2%를 의미한다.
제제는 유리체내 및 정맥내 투여를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 항체에 대해 공지되어 있는 임의의 유형의 투여를 위해 제조될 수 있다.
본원에서 제공된 제제는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제이고 환자에게의 투여에 대해 허용가능한 임의의 담체 또는 부형제를 포함하는 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 등장성을 나타낸다. 대표적인 등장성 제제는 약 250 내지 약 350 밀리오스몰의 제제들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 고장성을 나타낸다. 대표적인 고장성 제제는 약 351 내지 약 1000 밀리오스몰의 제제들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
폴리올은 약 1 M 이하의 양으로 본원에 기재된 제제에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 제제는 약 50 mM, 약 75 mM, 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 225 mM, 약 240 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 600 mM, 약 650 mM, 약 700 mM, 약 750 mM, 약 800 mM, 약 850 mM, 약 900 mM, 약 950 mM, 약 1 M, 또는 이들 사이의 임의의 정수의 양으로 폴리올을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 300 mM 미만의 양으로 폴리올을 함유하고, 상기 제제는 약 100 mM 내지 약 175 mM 농도의 염을 이용하여 등장성으로 제조된다. 예를 들면, 300 mM 미만의 양으로 폴리올을 함유하는 제제는 약 130 mM 농도의 염을 이용하여 등장성으로 제조된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 폴리올 농도를 지칭할 때, 용어 "약"은 표시된 값의 ± 2%를 의미한다. 한 양태에서, 본원에서 제공된 제제에서 사용될 폴리올은 당, 예를 들면, 비-환원 당일 수 있다. 비-환원 당의 대표적인 예로는 트레할로스 및 수크로스가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 제제는 약 200 mM 내지 약 300 mM의 트레할로스 또는 수크로스를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 약 240 mM의 트레할로스 또는 수크로스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 당은 약 200 mM 내지 약 300 mM의 양(농도)의 소르비톨일 수 있다. 한 실시양태에서, 제제는 약 240 mM의 소르비톨을 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 제제의 추가 비-한정적 예는 표 1의 제제 1 내지 39 중 어느 한 제제이다.
Figure 112015032373064-pct00001
Figure 112015032373064-pct00002
본원에서 제공된 제제는 약 4.0 내지 약 7.5의 pH를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에서 제공된 제제는 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5 또는 약 7.0의 pH를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, pH를 지칭할 때, 용어 "약"은 pH ± 0.05, 0.1 또는 0.2를 지칭한다.
당업자는 본원에 기재된 방법에 의해 확인된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 제제가 원하는 순도를 갖는 단백질을 임의적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 안정화제와 수용액의 형태로 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다는 것을 이해할 것이다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)).
허용가능한 담체는 투여받은 환자에게 생리학적으로 허용가능하고 그 자신과 함께 투여되는 화합물의 치료 성질을 보유한다. 허용가능한 담체들 및 이들의 제제는 예를 들면, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990))에 일반적으로 기재되어 있다. 한 예시적인 담체는 생리식염수이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "약학적으로 허용가능한 담체"는 대상 화합물을 신체의 한 장기 또는 부분의 투여 부위로부터 신체의 또 다른 장기 또는 부분으로 운반하거나 수송하는 데에 관여하는 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제 및/또는 용매를 의미한다. 각각의 담체는 제제의 다른 성분과 상용가능하고 그 자신이 투여되는 대상체에게 유해하지 않다는 의미에서 허용가능하다. 허용가능한 담체는 대상 화합물의 특이적 활성도 변경시키지 않아야 한다.
한 양태에서, 본원은 투여에 적합한 (수성 또는 비-수성) 용매, 용액, 유액, 분산 매질, 코팅제, 등장화제 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 또는 생리학적으로 허용가능한 조성물을 제공한다. 따라서, 조성물 또는 제제는 대상체에서 치료 및/또는 진단 사용에 적합한 조성물을 지칭한다. 조성물 및 제제는 소정량의 본원에 기재된 화합물 및 약힉적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
조성물은 구체적인 투여 경로(즉, 전신 또는 국소)에 적합하도록 제제화될 수 있다. 따라서, 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
조성물은 예를 들면, 피하, 유리체내, 피내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 근육내 주사를 포함하나 이들로 한정되지 않는 주사에 의해 투여될 수 있다. 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 발생된 용액은 그 자체로서 사용되도록 포장될 수 있거나 동결건조될 수 있고; 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 용액과 추후 조합될 수 있다. 정맥내 주사 또는 통증 부위에서의 주사의 경우, 활성 성분은 발열원을 함유하지 않고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 당업자는 예를 들면, 등장성 비히클, 예컨대, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액 또는 락테이트 함유 링거 주사액을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이 성분들의 조합물과 함께 활성 성분을 요구된 양으로 적절한 용매에 도입한 후, 요구되는 경우 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 계면활성제를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 제제는 임의적으로 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 20 또는 80, 트윈®, 플루로닉® F68 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
조성물이 약제 또는 본원에서 제공된 방법들 중 임의의 방법에서 사용될 것으로 고려되는 경우, 조성물은 이 조성물이 인간 환자에게 투여될 때 염증 반응 또는 안전하지 않은 알레르기 반응을 야기하지 않도록 발열원을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다고 생각된다. 발열원에 대한 조성물의 시험 및 발열원을 실질적으로 함유하지 않는 조성물의 제조는 당업자에게 잘 이해되어 있고 상업적으로 입수가능한 포장물을 사용함으로써 달성될 수 있다.
어구 "약학적으로 허용가능한"은 대상체에게 투여될 때 생리학적으로 내성을 나타내고 전형적으로 알레르기 또는 유사한 부적절한 반응, 예컨대, 급성위연동이상항진, 현기증 등을 발생시키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다.
치료 조성물의 언급에서 사용될 때 용어 "유닛 용량"은 대상체를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 유닛으로서, 요구된 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 예정된 양의 활성 물질을 각각 함유하는 유닛을 지칭한다.
조성물은 투약 제제와 상용가능한 방식으로 및 치료 유효량으로 투여될 수 있다. 투여될 양은 치료될 대상체, 활성 성분을 사용하는 대상체의 면역 시스템의 성능, 및 원하는 결합 성능의 정도에 의존한다. 투여되기 위해 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 의존하고 각각의 개체마다 상이하다. 초기 투여 및 부스터 숏에 적합한 요법도 변경될 수 있으나, 전형적으로 초기 투여에 이어서 1시간 이상의 간격으로 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 반복된 투약에 의해 예시된다. 대안적으로, 혈중 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥내 관주가 고려된다.
한 실시양태는 본원에 기재된 병태, 질환 또는 장애 치료용 약제를 제조하기 위한 본원에 기재된 조성물의 용도를 고려한다. 약제는 치료를 필요로 하는 환자/대상체의 신체적 특징을 기초로 제제화될 수 있고, 병태, 질환 또는 장애의 병기를 기초로 단일 또는 다중 제제로 제제화될 수 있다. 약제는 병원 및 진료소에의 배포를 위해 적절한 표지와 함께 적합한 포장물 내에 포장될 수 있고, 이때 상기 표지는 본원에 기재된 질환을 갖는 대상체의 치료를 표시하기 위한 것이다. 약제는 단일 또는 다중 유닛으로서 포장될 수 있다. 조성물의 용량 및 투여에 대한 설명서는 후술된 바와 같이 포장물과 함께 포함될 수 있다.
또한, 본원은 본원에 기재된 제제를 포함하는, 정맥내 또는 유리체내 투여에 적합한 예비충전된 주사기를 제공한다. 이러한 예비충전된 주사기는 포장될 수 있고 혈관신생 관련 병태, 예컨대, 본원에 기재된 병태들 중 임의의 병태의 치료를 위한 사용에 대해 표지될 수 있다. 포장물은 저장 및 투여에 대한 설명서도 포함할 수 있다. 본원은 전술된 제제들 중 임의의 제제를 포함하는, 정맥내 또는 유리체내 투여에 적합한 하나 이상의 예비충전된 주사기를 함유하는 포장물을 제공한다. 본원은 혈관신생 관련 병태, 예컨대, 본원에 기재된 병태들 중 임의의 병태의 치료를 위한 본원에 기재된 제제를 함유하는 약제의 제조도 제공한다.
치료 방법
본원은 CD105에 우선적으로 결합하는 항체의 제제를 대상체에게 투여함으로써 대상체(인간 또는 비-인간)를 치료하는 방법을 제공한다. 본원은 혈관신생/신생혈관형성, 과도한 혈관형성, 종양 성장, 종양 세포 증식 또는 소혈관 확장과 관련된 하나 이상의 질환 또는 질병을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 조성물을 투여하여 질환 또는 그의 중증도를 예방하거나, 치료하거나, 호전시키거나 완화시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 효과적인 반응은 대상체가 질병의 징후 또는 증상의 정체, 또는 부분적인 또는 전체적인 완화 또는 감소를 경험할 때 달성되고, 구체적으로 생존의 연장을 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 예상되는 무진행 생존 시간은 재발 횟수, 질환의 병기 및 다른 인자를 포함하는 예후 인자에 따라 수개월 내지 수년으로 측정될 수 있다. 생존의 연장은 1개월 이상, 약 2개월 이상, 약 3개월 이상, 약 4개월 이상, 약 6개월 이상, 약 1년 이상, 약 2년 이상, 약 3년 이상, 약 4년 이상, 약 5년 이상 등의 기간 또는 이들 사이의 임의의 시간 간격을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 전체 또는 무진행 생존도 수개월 내지 수년으로 측정될 수 있다. 대안적으로, 효과적인 반응은 대상체의 징후 또는 증상, 또는 암 존재량이 정체 상태로 남아있고 악화되지 않는다는 것일 수 있다. 징후의 치료의 추가 표시는 더 상세히 후술되어 있다.
본원에 기재된 항체의 조성물은 비-치료제(예를 들면, 친화성 정제 물질)로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 한 실시양태에서, 당분야에서 공지되어 있는 통상적인 방법을 이용하여 관심있는 단백질을 고체상, 예컨대, 세파덱스® 수지 또는 필터지 상에 고정시킨다. 고정된 단백질을, 정제될 관심있는 표적(또는 이의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 고정된 항체에 결합되어 있는, 표적 단백질을 제외한 샘플 중의 모든 물질들을 실질적으로 제거할 적합한 용매를 사용하여 지지체를 세척한다. 마지막으로, 표적 단백질을 방출시킬 또 다른 적합한 용매, 예컨대, 글리신 완충제(pH 5.0)를 사용하여 지지체를 세척한다. 조성물은 정제 이외에 CD105와 관련된 질환 및 장애의 검출, 진단 및 치료를 위해 사용될 수 있다.
"접촉"은 본원에서 제공된 제제를 본원에 기재된 바와 같이 세포, 장기, 조직 또는 유체와 물리적으로 근접하게 위치시킨다는 의미로서 본원에서 정의된다. 접촉은 본원에서 제공된 제제들 중 임의의 제제의 전신 또는 국소 투여를 포괄하고, 시험관내, 생체내 및/또는 생체외 절차 및 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. "조합" 및 "접촉"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 동일한 방식으로 정의되기 위한 것이다. 생체내 적용의 경우, 접촉은 예를 들면, 임의의 적합한 수단으로 조성물을 환자에게 투여함으로써 일어날 수 있고; 약학적으로 허용가능한 부형제 및 담체를 갖는 조성물은 더 상세히 전술되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "예방"은 혈관신생과 관련된 또는 CD105 활성과 상호관련된 질환 또는 장애의 예방, 징후 또는 증상의 발생의 예방, 또는 진행의 예방을 지칭한다. 1 기 암으로 진단된 한 비-한정적 실시양태에서, 본원에 기재된 제제를 투여하여 상기 암이 2 기로 진행하는 것을 예방할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 증상을 나타내지 않되 하나 이상의 암 생체마커에 대해 양성으로 시험되는 환자는 본원에 기재된 제제를 투여받아 암의 진행을 예방할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "억제", "치료" 및 "치료하는"은 상호교환적으로 사용되고, 예를 들면, 징후 또는 증상의 정체, 생존의 연장, 징후 또는 증상의 부분적인 또는 전체적인 호전, 및 종양 또는 전이의 부분적인 또는 전체적인 박멸을 지칭한다.
"대상체" 또는 "환자"(예를 들면, 포유동물, 예컨대, 인간 또는 비-인간 동물, 예컨대, 영장류, 설치류, 소, 말, 돼지, 양, 낙타, 라마 등)는 본원에 기재된 질환 또는 장애의 하나 이상의 임상 징조 및/또는 징후 또는 증상을 나타내는 포유동물일 수 있다. 일부 상황에서, 대상체는 증상을 나타내지 않을 수 있으나 여전히 질환 또는 장애의 임상 징조를 가질 수 있다. 항체는 치료 모이어티에 접합될 수 있거나 치료 모이어티를 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 항체는 검출가능한 모이어티에 접합될 수 있거나 검출가능한 모이어티를 함유하는 융합 단백질일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체는 치료 모이어티 및 검출가능한 모이어티 둘다에 접합될 수 있다. 항체는 친화성 태그(예를 들면, 정제 태그)에 접합될 수 있거나 이러한 친화성 태그로 재조합적으로 조작될 수 있다. 친화성 태그는 당분야에서 통상적이다.
본원에서 제공된 항체 또는 이의 단편은 치료 모이어티 및/또는 영상화 또는 검출가능한 모이어티 및/또는 친화성 태그에 접합될 수 있거나 연결될 수 있는 항체 또는 그의 단편이다. 폴리펩티드를 접합시키거나 연결하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 화합물과 표지 사이의 회합(결합)은 공유 및 비-공유 상호작용, 화학적 접합뿐만 아니라 재조합 기법을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 당분야에서 공지되어 있는 임의의 수단을 포함한다.
"혈관신생"은 혈관 유지 및 발생의 모든 양태를 포함하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 혈관신생은 신생혈관형성뿐만 아니라 기존 혈관구조 및 소혈관의 유지 및 조절을 유발하는 새로운 모세혈관의 형성(새로이 형성되든 아니면 기존 혈관으로부터 형성되든 관계없음)을 포함한다. 혈관신생은 혈관 기저막 및 간질 매트릭스의 내피세포 매개 분해, 내피세포의 이동, 내피세포의 증식 및 내피세포에 의한 모세혈관 루프의 형성을 포함하는 일련의 순차적인 단계들을 포함하는 복잡한 과정이다. 혈관신생은 새로운 혈관의 성장 및/또는 발생(신생혈관형성으로서도 지칭됨), 소혈관의 확장, 과도한 또는 연장된 혈관 성장 및 기존 혈관구조의 유지를 포함한다.
용어 "혈관신생 관련 질환"은 혈관신생이 비정상적으로 연장되는 인간의 특정 병리학적 과정을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 이것은 혈관신생 병태 및 질환, 예컨대, 혈관신생과 관련된, 혈관신생에 의해 야기된 또는 혈관신생과 연관된 질환 및 병태를 추가로 포함한다. 이러한 질환의 비-한정적 예로는 다양한 형태의 암 및 전이, 황반 변성 및 CNV가 있다. 본원에 기재된 항체는 CD105에 결합하고 혈관신생을 억제함으로써 혈관신생 관련 질환을 치료하는 데에 사용될 수 있다.
용어 "항-혈관신생 치료"는 (정지 혈관구조에 비해 증식 혈관구조 상에서 고수준으로 발현되는) CD105를 발현하는 세포 및/또는 혈관구조로 표적화된 치료를 의미하기 위해 본원에서 사용되고; 이것은 혈관신생에 대해 유도된 치료(즉, 신생혈관형성을 유발하는 새로운 모세혈관의 형성), 기존 혈관구조 및/또는 과도한 혈관형성 또는 혈관 성장에 대해 유도된 치료, 소혈관의 확장에 대해 유도된 치료, 및 질환 또는 병태에 대해 유도된 치료(예를 들면, 혈관 표적화 치료)를 추가로 포함한다. 본 발명 내에서 고려되는 예시적인 질환 또는 병태는 다양한 형태의 암 및 전이를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원은 혈관신생 관련 질환의 치료를 필요로 하는 환자(대상체)에서 혈관신생 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 제제는 환자에게 유리체내로 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 혈관신생 관련 질환은 예를 들면, 암 또는 전이일 수 있다. 한 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 치료될 암은 예를 들면, 상피계 종양을 포함한다. 이러한 제제로 치료될 암의 비-한정적 예로는 폐암, 부인과 악성 종양, 흑색종, 유방암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 대장암, 전립선암, 신장암, 두부암, 췌장암, 간암(간세포암), 자궁암, 경부암, 신장암(신세포암), 육종, 골수종 및 림프종이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 암 또는 전이의 치료를 위한 제제는 환자에게 정맥내로 투여될 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 혈관신생 관련 질환은 예를 들면, 안과적 병태일 수 있다. 안과적 병태는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종 및/또는 맥락막 신생혈관형성을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 연령 관련 황반 변성(AMD)은 습성 AMD 또는 건성 AMD일 수 있다. 안과적 병태의 치료를 위한 제제는 환자에게 유리체내로 투여될 수 있다.
이러한 방법에서, 제제는 환자에게 1회 이상 투여될 수 있다. 예를 들면, 제제는 매일 1회, 매주 1회, 매월 1회, 격월로 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 치료 일정은 치료에 대한 환자의 반응에 따라 필요한 경우 증가될 수 있거나 감소될 수 있다.
한 양태에서, 제제는 혈관신생 관련 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상이 감소될 때까지 투여된다.
안과적 병태와 관련하여, 상기 하나 이상의 징후 또는 증상은 혈관의 수축, 안 질환과 관련된 내피세포 증식의 억제, 출혈의 징후 또는 증상의 제거, 뿌옇게 보이는 증상의 치료, 시력 손실의 정체 제공, 시력의 개선, 및/또는 혈관 누출의 예방을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
암 또는 전이에 대하여, 치료는 환자의 상태를 개선할 수 있고, 치료는 하기 인자들 중 하나 이상의 인자가 발생하였는지를 확인함으로써 평가될 수 있다: 감소된 세포 증식, 감소된 세포 수, 증가된 아폽토시스, 또는 세포 증식성 장애를 포함하는 세포의 적어도 일부의 감소된 생존.
치료는 종양 또는 전이를 부분적으로 또는 전체적으로 제거할 수 있고/있거나 환자의 생존을 연장시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 징후 또는 증상은 하나 이상의 용량의 제제를 환자에게 투여한 후 중증도 또는 지속시간에 있어 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 감소된다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 징후 또는 증상은 하나 이상의 용량의 제제를 환자에게 투여한 후 중증도 또는 지속시간에 있어 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 90배, 약 95배, 약 100배 또는 그 이상 감소된다.
본원은 안과적 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 안과적 병태를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 안과적 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상이 상기 치료에 의해 호전된다. 제제의 투여는 유리체내 투여일 수 있다.
또한, 본원은 암 또는 전이의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 또는 전이를 예방하거나 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 제제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 암 또는 전이의 하나 이상의 징후 또는 증상이 호전된다. 제제의 투여는 정맥내 투여일 수 있다.
용어 "재발생", "재발" 또는 "재발된"은 질환의 소멸의 임상적 평가 후 암 또는 질환의 복귀를 지칭한다. 원거리 전이 또는 국소 재발생의 진단이 재발로서 간주될 수 있다.
용어 "유지 치료"는 이전 치료의 효과를 유지하는 데에 도움을 주기 위해 제공되는 계획된 재치료를 지칭한다. 유지 치료는 종종 질환 진행과 관계없이 암이 관해 상태를 유지하는 것을 돕거나 특정 치료에 대한 반응을 연장시키기 위해 제공된다.
종양학에서 용어 "무진행 생존"은 암이 진행하지 않는, 치료 동안 및 치료 후 기간을 지칭한다. 무진행 생존은 환자가 완전한 반응 또는 부분적인 반응을 경험한 시간뿐만 아니라 환자가 안정한 질환을 경험한 시간도 포함한다.
한 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 조성물들 중 임의의 조성물을, 암 또는 전이를 앓고 있는 환자에게 투여함으로써 대상체에서 암 또는 전이를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 환자는 증상을 나타낼 수 있거나 증상을 나타내지 않을 수 있다.
일부 경우, 조성물의 투여는 치료될 환자의 수명을 연장시키거나, 종양 부피를 감소시키거나, 종양을 제거하거나, 세포 증식을 감소시키거나, 종양 세포의 아폽토시스를 증가시키거나, 이들의 조합 효과를 나타낸다.
필요한 경우, 상기 방법들은 암의 수술적 제거 및/또는 추가 항암제 또는 치료제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 항암제는 본원의 임의의 부분에서 제공되어 있다.
한 양태에서, 암을 앓고 있는 환자의 징후 또는 증상이 호전된다. 호전은 예를 들면, 통증의 감소, 감소된 종양 크기, 종양의 제거, 종양 크기의 증가 또는 질환의 진행의 예방, 전이의 형성의 예방 또는 전이성 성장의 억제, 또는 이들의 조합 효과로서 나타날 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기재된 제제의 투여는 환자가 수술을 받거나 하나 이상의 추가 항암제 또는 치료제를 사용한 치료를 받을 필요성을 감소시키거나 제거한다.
항-CD105 항체를 함유하는 조성물은 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편)를 함유하는 조성물과 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 서로 약 12주 이내, 서로 약 8주 이내, 서로 약 4주 이내, 서로 약 3주 이내, 서로 약 2주 이내, 서로 약 1주 이내, 서로 1일 이내, 서로 약 12시간 이내, 서로 약 6시간 이내, 서로 약 3시간 이내, 서로 약 1시간 이내, 서로 약 30분 이내, 동일한 날, 동일한 시간, 또는 이들의 조합 시점에서의 투여를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다중 용량의 본 발명의 조성물 및/또는 조합된 치료 모이어티가 고려되는 경우, 상업적으로 입수가능한 제품의 표준물을 사용하여 대상체의 연령, 신장, 체중, 건강 및 다른 신체적 특징을 기초로 공지된 용량 및 농도를 이용하여 각각의 용량을 실험적으로 결정할 수 있다는 것이 이해된다.
제제는 임의의 의학적 치료에 적용될 수 있는 합리적인 이익/위험 비에서 질환 또는 장애를 억제함으로써 일부 원하는 치료 효과를 생성하기에 효과적인 치료 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. 본 제제를 인간 환자에게 투여하는 경우, 상기 제제는 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 제제화될 수 있다. 치료 유효량은 장기 또는 조직에서 적어도 부분적으로 원하는 치료 또는 예방 효과를 달성하는 양이다. 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치유 치료를 달성하기 위해 필요한 항-CD105 항체 또는 항-VEGF 항체의 양은 그 자체로 고정되어 있지 않다. 투여되는 항체의 양은 질환의 유형, 질환의 광범위성, 및 질환 또는 장애를 앓고 있는 포유동물의 크기에 따라 달라질 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 두 항체들은 전술된 바와 같이 환자에게 조합 투여된다. 조합 투여는 단일 제제 또는 별도의 제제로의 투여를 지칭할 수 있다.
"투여"는 제제가 환자의 신체 내부에 존재하게 하는 방식으로 하나 이상의 제제를 환자에게 제공하는 것으로서 본원에서 지칭된다. 이러한 투여는 피하, 유리체내, 피내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 근육내 투여(예를 들면, 주사)에 의해 국소, 국부 또는 전신 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 경로로 달성될 수 있다.
제제 중의 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 구체적인 환자, 제제 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 변경될 수 있다. 선택된 용량 수준은 사용되는 구체적인 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 구체적인 화합물의 배출 속도, 치료의 지속시간, 사용되는 구체적인 제제와 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 선행 병력, 및 의학 분야에서 잘 공지되어 있는 기타 인자들을 포함하는 다양한 인자들에 의존할 것이다.
추가로, 항체의 용량(들)은 매주 2회, 주마다, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 6주마다, 8주마다, 12주마다, 24주마다, 또는 이들 사이의 주들의 임의의 조합 간격으로 투여될 수 있다. 투약 주기, 예를 들면, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 동안 주마다 1회 또는 2회 항체 투여 후 치료 없는 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주도 고려된다. 대안적으로, 치료에 대한 대상체의 반응에 따라 치료 사이의 순환 시간은 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월일 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 용량 및 주 단위 주기의 상이한 조합을 포함하는 추가 투약 주기도 본 발명 내에서 고려된다.
의사 또는 수의사는 요구되는 제제의 유효량(ED50)을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들면, 의사 또는 수의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 수준보다 더 낮은 수준으로 제제에서 사용되는 화합물의 용량으로 출발할 수 있고 원하는 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 용량은 일정하게 유지될 수 있다.
제제는 임의의 편리한 경로, 예컨대, 전술된 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 선택된 투여 경로와 관계없이, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 제제는 예컨대, 후술되어 있는 바와 같이 또는 당업자에게 공지되어 있는 다른 통상적인 방법에 의해 허용가능한 투약 제형으로 제제화된다.
세포 배양 분석 및/또는 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용될 용량의 범위를 공식화하는 데에 사용될 수 있다. 용량은 사용되는 투약 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 임의의 화합물의 경우, 치료 유효 용량은 먼저 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 측정될 때 IC50(즉, 절반 최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 더 정확하게 결정하는 데에 사용될 수 있다. 화합물들의 조합물을 함유하는 제제도 이들 방법들 중 임의의 방법을 이용함으로써 평가될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 조직에서의 혈관신생의 억제를 고려한다. 조직에서의 혈관신생의 정도 및 이로써 달성되는 억제의 정도는 다양한 방법, 예컨대, 본원에 기재된 방법에 의해 평가될 수 있다.
CD105 또는 VEGF를 인식하고(예를 들면, 우선적으로 결합하고) 혈관신생을 억제하는 항체의 독특한 특이성은 혈관신생(신생혈관형성), 소혈관 확장, 과도한 혈관형성, 종양 세포 증식 및/또는 종양 성장을 특징으로 하는 질환을 위한 진단 및 치료 용도를 제공한다. 항체는 다양한 형태의 암(일차 종양 및 전이)을 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다.
당업자는 본원에 기재된 제제의 투여 이외에 대상체를 하나 이상의 추가 혈관신생 억제제로 치료할 수도 있다는 것이 본원에서 고려된다는 것을 이해할 것이다.
본 명세서 및 특허청구범위의 목적상, 용어 "혈관신생 억제제"는 혈관신생을 억제하는 작용을 하는 펩티드, 단백질, 효소, 다당류, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, 재조합 벡터 및 약물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 화합물 또는 분자를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 혈관신생 억제제는 당분야에서 공지되어 있고, 모든 유형들이 본원에서 고려된다. 화합물 및 분자의 비-한정적 예로는 천연 생체분자 및 합성 생체분자, 예컨대, 파클리탁셀(paclitaxel), O-(클로로아세틸-카보밀) 푸마길롤(fumagillol)("TNP-470" 또는 "AGM 1470"), 트롬보스폰딘(thrombospondin)-1, 트롬보스폰딘-2, 안지오스타틴(angiostatin), 인간 연골세포 유래의 혈관신생 억제제("hCHIAMP"), 연골 유래의 혈관신생 억제제, 혈소판 인자-4, gro-베타, 인간 인터페론 유도성 단백질 10("IP10"), 인터류킨 12, Ro 318220, 트리사이클로데칸-9-일 잔테이트("D609"), 이르소글라딘(irsogladine), 8,9-디하이드록시-7-메틸-벤조[b] 퀴놀리지늄 브로마이드("GPA 1734"), 메드록시프로게스테론(medroxyprogesterone), 헤파린과 코르티손의 조합물, 글루코시다제 억제제, 제니스테인(genistein), 탈리도마이드(thalidomide), 디아미노-안트라퀴논, 허비마이신(herbimycin), 우르솔산(ursolic acid) 및 올레아놀산(oleanolic acid)이 있다. 항체의 비-한정적 예로는 분자, 예컨대, VEGF, VEGF 수용체 또는 CD105의 상이한 에피토프에 대해 유도된 항체가 있다. 추가로, VEGF 수용체의 소분자 억제제가 공지되어 있고 본원에서 고려된다. VEGF 수용체 억제제의 비-한정적 예로는 라니비주맙(ranibizumab), 애플리버셉트(aflibercept), 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 악시티닙(axitinib), 페갑타닙(pegaptanib) 및 파조파닙(pazopanib)이 있다.
이들 VEGF 수용체 억제제의 다중 조합물이 본원에 기재된 제제와 함께 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 조합물은 기재된 항체 또는 항원 결합을 위해 보다 낮은 용량이 사용되게 할 수 있다. 투약에서의 이러한 변경은 항체들의 조합물의 상승작용적 효과로부터 비롯될 수 있다.
암
CD105는 종양 혈관신생과 관련되어 있고 정상 조직에 비해 다양한 종양 조직들의 내피에서 강하게 상향조절된다. CD105는 광범위한 종양 내피에서 상향조절된다. 추가로, 상응하는 정상 조직보다 종양 내피에서 CD105의 보다 강한 발현이 있다. 따라서, 항-CD105 항체를 사용한 혈관신생의 억제는 암성 종양에 대한 치료 방법을 대표한다. 본원에 기재된 제제는 암성 종양 및 전이를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 제제는 암성 종양 및 전이의 치료를 위한 약제의 제제화에서도 사용될 수 있다.
VEGF는 그의 발현이 광범위한 고형 종양에서 상향조절되기 때문에 항종양 치료를 위한 한 표적을 대표한다. VEGF는 기존 혈관으로부터의 새로운 혈관의 성장인 혈관신생의 주요 조절제이다. 이 과정은 새로운 혈관의 형성에 의존하는 고형 종양의 성장에 기초한다. 일부 소분자 치료제들은 혈관 내피 성장 인자 수용체("VEGFR")를 표적화할 수 있고; 소분자 치료제에 의한 이러한 표적화는 항암 효과를 발생시킬 수 있다. VEGF 수용체-표적화된 물질은 새로운 혈관 형성의 억제를 통해 종양 성장을 간접적으로 차단한다. VEGF-유도된 혈관신생의 억제는 대식세포, 파골세포 또는 연골파괴세포의 VEGF 자극을 유의하게 억제하지 않으면서 항종양 또는 개선된 항종양 효과를 발휘할 수 있다.
용어 "종양"은 (동일한 유형의 정상 조직에 의한 발현에 비해) CD105 및/또는 VEGF를 발현하는 암성 조직을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 종양은 고형 종양 및 반고형 종양을 포함할 수 있다. 종양의 비-한정적 예로는 비-T 세포 유형(비-T) 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및 골수-단핵세포 백혈병을 비롯한 인간 백혈병; 및 혈관육종, 유방 암종, 위암, 결장 암종, 호지킨 림프종, 림프종, 다형성 아교모세포종(GBM), 폐 암종, 흑색종, 골수종, 림프종, 골육종, 난소 암종, 이하선 종양, 인두 암종, 전립선 암종, 간세포 암종, 신장 암종 및 직장구불결장 암종을 비롯한, (동일한 유형의 정상 조직에 의한 발현에 비해) 중간 내지 높은 수준으로 CD105를 발현하는 그의 주변 혈관구조를 갖는 인간 고형 종양 및 반고형 종양이 있다.
치료될 암성 조직은 예를 들면, 비정상적인 수준의 CD105 및/또는 VEGF를 발현하는 내피 조직이다.
종양 조직의 신생혈관형성의 부재 하에서, 종양 조직은 요구된 영양분을 수득하지 않고, 성장에서 느리고, 추가 성장을 중단하고, 퇴행하고 궁극적으로 종양의 사멸을 초래하는 괴사를 겪게 된다. 본원은 종양 혈관신생을 억제함으로써 종양 신생혈관형성을 억제하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본원은 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 전이성 암세포가 일차 종양을 빠져나올 수 있도록 전이의 형성이 일차 종양의 혈관형성을 요구하고 이차 부위에서의 전이성 암세포의 확립이 전이의 성장을 뒷받침하기 위해 신생혈관형성을 요구하기 때문에 전이의 형성에 대해 특이 효과적이기도 하다.
본 발명의 "암/전이를 앓고 있는 대상체"는 돌연변이체 단백질(종양 관련 항원) 또는 돌연변이체 유전자를 발현할 수 있고 질환에 대한 증상을 아직 나타내지 않을 수 있다는 것이 인식될 것이다. (돌연변이체 K-ras 단백질과 관련되어 있는) 결장암의 한 비-한정적 예에서, 일부 결장 세포들에서 돌연변이체 K-ras 단백질을 갖는 대상체는 이 대상체가 결장암에 대한 증상을 아직 나타내지 않을 수 있을지라도 치료될 대상체이다. "질병의 징후 또는 증상"은 질환의 임상적으로 인식된 징조 또는 조짐을 나타낸다.
종양 또는 전이를 앓고 있는 대상체를 "치료하는"은 대상체의 징후 또는 증상이 치료 후 부분적으로 호전되거나, 전체적으로 호전되거나 정체 상태로 남아있다는 것을 의미한다. 치료된 환자는 종양 존재량의 부분적 또는 전체적 경감을 나타낼 수 있다. 이것은 예방, 치료 및 치유를 포괄하기 위한 것이다. 한 비-한정적 예에서, 고도 전이성 암(예를 들면, 유방암)을 앓고 있는 대상체가 치료되고, 이때 추가 전이는 일어나지 않거나 치료를 제공받지 않은 대상체에 비해 수치 면에서 감소된다. 또 다른 비-한정적 예에서, 대상체는 치료되고, 이때 대상체의 고형 암은치료를 제공받지 않은 대상체에 비해 크기 면에서 감소되거나 크기 면에서 증가하지 않는다. 또 다른 비-한정적 예에서, 치료된 대상체의 암세포의 수는 치료를 제공받지 않은 대상체에서의 암세포의 수에 비해 증가하지 않거나 감소된다. 개선은 예를 들면, 감소된 세포 증식, 감소된 세포 수, 증가된 아폽토시스, 및/또는 치료되는 대상체의 증가된 생존으로서 정의될 수도 있다.
치료는 종양 또는 전이를 부분적으로 또는 전체적으로 제거할 수 있고/있거나, 환자의 생존을 연장시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 징후 또는 증상은 하나 이상의 용량의 제제를 환자에게 투여한 후 중증도 또는 지속시간 면에서 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100% 감소된다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 징후 또는 증상은 하나 이상의 용량의 제제를 환자에게 투여한 후 중증도 또는 지속시간 면에서 약 2배, 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 90배, 약 95배, 약 100배 또는 그 이상 감소된다.
본원에 기재된 방법에서 치료될 종양 또는 암은 폐암, 부인과 악성 종양, 흑색종, 유방암, 뇌암(예를 들면, 다형성 아교모세포종, "GBM" 또는 신경교종), 췌장암, 난소암, 자궁암, 대장암, 전립선암, 신장암, 두부암, 간암(간세포암), 경부암, 신장암(신세포암), 음경암, 위암, 갑상선암, 방광암, 육종, 암종, 골수종 및 림프종을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 치료될 종양은 고형 또는 반고형 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료될 종양은 일차 종양이다. 또 다른 실시양태에서, 치료될 종양은 전이성 종양이다. 한 실시양태에서, 치료될 종양 또는 암은 상피로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 치료될 암은 골수종이다. 또 다른 실시양태에서, 치료될 암은 난소암이다. 또 다른 실시양태에서, 치료될 암은 신장/콩팥암이다. 또 다른 실시양태에서, 치료될 암은 간세포/간암이다.
필요에 따라 화합물은 아드리아마이신, 사이클로포스프아미드, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 테모졸로마이드, 옥살리플라틴, 세툭시맙, 파니투무맙, 소라페닙, 수니티닙, 제피티닙, 에를로티닙, 5-플루오로우라실, 이리노테칸, 토포테칸, 류코보린, 보르테주밉, 레날리도마이드, 탈리도마이드, 카페시타빈, 도세탁셀 및 본원에 기재된 많은 다른 통상적인 암 치료제를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 추가 치유적 치료와 함께 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "방사선"은 예를 들면, 마이크로파, 자외선(UV), 적외선(IR), 알파-방사선, 베타-방사선 또는 감마-방사선을 지칭한다. 방사선은 전신에 방사선을 조사하지 않으면서 하나 이상의 종양의 부위에 방사선을 표적화시키는 통상적인 기법을 이용함으로써 "집중될" 수 있거나 국소적으로 전달될 수 있다. 당업자는 하기 나열된 치료 요법들의 목록이 통상적인 치료를 대표하나, 본 발명이 본원에 구체적으로 개시되어 있지 않은 다른 공지된 치료 요법을 포괄한다는 것을 이해할 것이다.
한 실시양태에서, 암은 난소암이고, 하나 이상의 추가 치유적 치료는 수술, 화학치료(예를 들면, 독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀, 젬시타빈, 및 백금-기제 화학치료제, 예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴), 멜팔란, 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대, 토포테칸 및 이리노테칸, 탁산-기제 치료, 호르몬, 방사선 치료, 전신 저온법, 이소플라본 유도체, 세포독성 마크롤라이드, 예컨대, 에포틸론, 혈관신생 억제제, 예컨대, 베바시주맙, 신호 전달도입 억제제, 예컨대, 트라스투주맙, 유전자 치료, RNAi 치료, 면역치료, 단일클론 항체, 포스파티딜이노시톨 유사 키나제 억제제, 예컨대, 라파마이신, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 본원에 기재된 항체와 난소암 치료의 조합 치료는 상기 치료들의 공-투여로부터의 상승작용적 효과로 인해 어느 한 치료 또는 이들 치료 둘다의 보다 낮은 용량을 제공할 수도 있다.
한 실시양태에서, 암은 콩팥/신장암이고, 하나 이상의 추가 치유적 치료는 수술, 화학치료, 파조파닙, 인터페론-알파 또는 IL-2이다. 또 다른 실시양태에서, 추가 약제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비-한정적 예로는 전술된 물질들, 애플리버셉트, 수니티닙, 소라페닙, 악시티닙 및 파조파닙이 있다. 본원에 기재된 항체와 신장암 치료의 조합 치료는 상기 치료들의 공-투여로부터의 상승작용적 효과로 인해 어느 한 치료 또는 이들 치료 둘다의 보다 낮은 용량을 제공할 수도 있다.
한 실시양태에서, 암은 골수종이고, 하나 이상의 추가 치유적 치료는 수술, 방사선치료, 보르테조밉, 레날리도마이드 또는 탈리도마이드이다. 이들 치료들 중 임의의 치료의 용량은 당분야에서 공지되어 있고, 따라서 조합 치료로 조절될 수 있다.
한 실시양태에서, 암은 전립선암이고, 하나 이상의 추가 치유적 치료는 수술, 방사선치료(예를 들면, 외부 광선 또는 근접치료), 호르몬 고갈(아비라테론(abiraterone)을 사용한 안드로겐 억제를 비롯한 안드로겐 억제), 열 충격 단백질 90(HSP90) 억제제, 화학치료(예를 들면, 도세탁셀, 에스트라무스틴, 백금-기제 화학치료, 예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 사트라플라틴 및 옥살리플라틴), 프레드니손 또는 프레드니솔론, 콜레스테롤 강하 약물, 예컨대, 스타틴, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 작용제, RNAi 치료, 수지상세포-기제 치료, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 분비하도록 유전적으로 변경된 전체 종양 세포(GVAX로서도 공지되어 있음), 또는 이들의 임의의 조합물이다. 또 다른 실시양태에서, 추가 약제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비-한정적 예로는 애플리버셉트, 수니티닙, 소라페닙, 악시티닙 및 파조파닙이 있다.
한 실시양태에서, 암은 폐암이고, 하나 이상의 추가 치유적 치료는 수술, 방사선치료(예를 들면, 흉부 방사선치료, 하전된 입자를 사용한 방사선치료, 우라실-테가푸르 및 백금-기제 화학치료(예를 들면, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴 등) 및 비노레블린, 에를로티닙, 제피티닙, 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들면, 세툭시맙), 티로신 키나제의 소분자 억제제, 폐암 세포 증식에 관여하는 단백질의 직접적인 억제제, 아우로라(Aurora) 키나제 억제제, 레이저-유도된 열치료, RNAi 치료, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 분비하도록 유전적으로 변경된 전체 종양 세포(GVAX로서도 공지되어 있음), 또는 이들의 임의의 조합물이다. 추가 치유적 치료는 파클리탁셀 또는 페메트렉세드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 추가 약제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비-한정적 예로는 애플리버셉트, 수니티닙, 소라페닙, 악시티닙 및 파조파닙이 있다. 이들 치료들 중 임의의 치료의 용량은 당분야에서 공지되어 있고, 따라서 조합 치료로 조절될 수 있다.
한 실시양태에서, 암은 유방암이고, 하나 이상의 추가 치유적 치료는 수술, 단일클론 항체(예를 들면, Her-2 항체, 헤르셉틴), 보조제 화학치료, 예컨대, 단일 약제 화학치료 또는 조합 화학치료(예를 들면, 안쓰라사이클린-기제 및 탁산-기제 다중화학치료), 또는 PMRT와 함께 또는 PMRT 없이 내분비 조작을 이용하거나 이용하지 않으면서 사용되는 표적 특이적 트라스투주맙, 비노렐빈, 아드리아마이신, 사이클로포스프아미드, 카페시타빈, 도세탁셀, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 예컨대, 타목시펜 및 랄록시펜, 알로스테릭 에스트로겐 수용체 조절제, 예컨대, 트릴로스탄, 방사선(예를 들면, 간질 근접치료, 맘모사이트(Mammosite) 디바이스, 3차원 입체 외부 방사선 및 수술중 방사선치료), 전신 합성을 억제하는 아로마타제 억제제(예를 들면, 아나스트로졸, 엑세메스탄 및 레트로졸), RNAi 치료, 면역억제성 및 항-증식성을 나타내는 라파마이신의 정맥내 유사체, 예컨대, 템시롤리무스, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 유방암의 3차원 시험관내 조직 배양 모델을 수행하는 방법의 검토는 문헌(Kim et al., Breast Cancer Research Treatment 85(3): 281-91 (2004))에 기재되어 있다. 암을 시험하기 위한 다른 생체내 모델 및 시험관내 모델은 공지되어 있고 본원에 기재된 항체를 시험하는 데에 이용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 추가 약제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비-한정적 예로는 애플리버셉트, 수니티닙, 소라페닙, 악시티닙 및 파조파닙이 있다. 이들 치료들 중 임의의 치료의 용량은 당분야에서 공지되어 있고, 따라서 조합 치료로 조절될 수 있다.
한 실시양태에서, 암은 결장암이고, 하나 이상의 추가 치유적 치료는 수술, 방사선치료 및 화학치료(예를 들면, 5-플루오로우라실, 레바미솔, 류코보린 또는 세무스틴(메틸 CCNU)), N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크리딘-4-카복스아미드 및 다른 관련된 카복스아미드 항암 약물; 비-토포이소머라제 II 억제제, 이리노테칸, 리포좀 토포테칸, 탁산 클래스의 항암제(예를 들면, 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 잔테논 아세트산 클래스의 화합물(예를 들면, 5,6-디메틸안테논-4-아세트산 PMAA), 라미나린(laminarin), 부위 선택적 사이클릭 AMP 유사체(예를 들면, 8-클로로아데노신 3',5'-사이클릭 포스페이트), Cox-2의 피라노인돌 억제제, Cox-2의 카바졸 억제제, Cox-2의 테트라하이드로카바졸 억제제, Cox-2의 인덴 억제제, NSAIDS의 국소화된 억제제(예를 들면, 안쓰라닐산, 아스피린(5-아세틸살리실산), 아조디살 나트륨, 카보헤테로사이클산, 카프로펜, 클로람부실, 디클로페낙, 펜부펜, 펜클로페낙, 페노프로펜, 플루페남산, 플루르비프로펜, 플루프로펜, 푸로세마이드, 금 나트륨 티오말레이트, 이부프로펜, 인도메타신, 인도프로펜, 케토프로펜, 로나졸락, 록소프로펜, 메클로페남산, 메파남산, 멜팔란, 나프록센, 페니실아민, 페닐아세트산, 프로프리온산, 살리실산, 살라조설파피리딘, 설린닥, 톨메틴, 피라졸론 부타존 프로파존, NSAID, 멜록시캄, 옥시캄, 피록시캄, 펠덴, 피록시캄 베타 사이클로덱스트란, 테녹시캄, 에토돌락 및 옥사프로진), HER-2/neu의 억제제, RNAi 치료, GM-CSF, 단일클론 항체(예를 들면, 항-Her-2/neu 항체, 항-CEA 항체, A33(HB 8779), 100-210(HB 11764) 및 100-310(HB 11028)), 세툭시맙, 파니투무맙, 호르몬 치료, 피리미딘아민, 캄프토테신 유도체(예를 들면, CPT-11), 폴린산(FA), 젬시타빈, Ara-C, 백금-기제 화학치료제, 예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴, cGMP 특이적 포스포디에스터라제 억제제, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 한 실시양태에서, 추가 치유적 치료는 5-플루오로우라실, 류코보린 및 옥살리플라틴의 조합물(FOLFOX)이다. 한 실시양태에서, 추가 치유적 치료는 5-플루오로우라실, 이리노테칸 및 류코보린의 조합물(IFL)이다. 한 실시양태에서, 추가 약제는 세툭시맙이다. 한 실시양태에서, 추가 약제는 파니투무맙이다. 또 다른 실시양태에서, 추가 약제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비-한정적 예로는 애플리버셉트, 수니티닙, 소라페닙, 악시티닙 및 파조파닙이 있다. 이들 치료들 중 임의의 치료의 용량은 당분야에서 공지되어 있고, 따라서 조합 치료로 조절될 수 있다.
한 실시양태에서, 암은 췌장암이고, 하나 이상의 추가 치유적 치료 또는 치유적 치료의 조합은 수술, 방사선치료, 5-플루오로우라실 및 방사선치료, 전신 치료, 스텐팅, 젬시타빈, 젬시타빈 및 방사선치료, 세툭시맙, 에를로티닙, 화학방사선, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 또 다른 실시양태에서, 추가 약제는 VEGF 수용체 억제제이다. VEGF 수용체 억제제의 비-한정적 예로는 애플리버셉트, 수니티닙, 소라페닙, 악시티닙 및 파조파닙이 있다.
환자는 치료 요법 전, 동안 및 후를 포함하는 하나 이상의 다수의 시점에서 징후 또는 증상에 대하여 평가될 수 있다. 치료는 대상체의 상태를 개선할 수 있고, 하기 인자들 중 하나 이상이 발생되는지를 확인함으로써 평가될 수 있다: 감소된 종양 크기, 감소된 세포 증식, 감소된 세포 수, 감소된 신생혈관형성, 증가된 아폽토시스, 또는 세포 증식성 장애를 포함하는 세포의 적어도 일부의 감소된 생존. 이들 사건들 중 하나 이상은 일부 경우 암을 부분적으로 또는 전체적으로 제거할 수 있고/있거나 환자의 생존을 연장시킬 수 있다. 대안적으로, 말기 암의 경우, 치료는 질환의 정체, 삶의 보다 우수한 질 및/또는 생존의 연장을 발생시킬 수 있다.
조성물이 순차적으로 투여될 때, 본원에 기재된 항-CD105 항체를 포함하는 조성물은 예를 들면, 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편) 전에 및/또는 후에 투여될 수 있다.
조성물이 동시적으로 투여될 때, 항-CD105 항체를 함유하는 조성물은 항-VEGF 항체를 함유하는 조성물과 동일한 부위 또는 상이한 부위에서 투여될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원은 CD105 및 VEGF 각각의 생물학적 활성들 중 하나 이상, 예컨대, 유사분열촉진 활성, 세포 증식, 종양 성장, 신생혈관형성 또는 혈관신생 활성을 억제할 수 있는 항-CD105 항체 및 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편)를 함유하는 조성물(약제)을 제공한다.
당업자는 치료 요법이 본원에 기재된 조성물들 각각의 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 별도의 조성물의 투여는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 6 내지 12 주기 동안 또는 종양 진행까지 1주 내지 3주마다 투여된다. 상기 방법은 최대 2년 동안 1주 내지 12주마다 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 비-한정적 실시예에서, 항-CD105 항체 및 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 동시 투여가 1주에서 일어난 후, 1주, 2주, 3주 또는 4주에서 조성물의 추가 투여가 일어나고, 이때 동시 투여는 6 내지 12 주기 동안 또는 종양 진행까지 반복된 후, 최대 2년 동안 1주 내지 12주마다 조성물의 투여가 일어난다.
환자에서 암을 치료하는 방법의 한 비-한정적 예에서, 상기 방법은 암을 수술적으로 제거하는 단계, 및 12개월 동안 또는 종양 진행까지 1주 내지 3주에서 항-CD105 항체 및 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편)를 투여한 후 1주 내지 12주에서 일정 용량으로 항-CD105 항체 및 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편)를 동시 투여하는 단계를 포함한다. 추가로, 항-CD105 항체 및 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 동시 투여는 최대 6 주기 동안 1주 내지 3주마다 반복될 수 있다. 임의적으로, 상기 방법은 최대 2년 동안 1주 내지 12주마다 항-CD105 항체 및 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 치료 요법은 추가 용량의 항-CD105 항체 및 항-VEGF 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 투여될 필요가 있는지 및 투여될 필요가 있을 때를 확인하기 위해 본원에서 제공된 모니터링 방법과 조합될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
조합 치료는 상승작용적 및/또는 유리한 효과를 제공할 수 있거나 보다 낮은 용량의 조합물이 보다 높은 안전성 한계를 제공하게 할 수 있다. 본 발명은 암 또는 다른 질환의 예방, 관리, 치료 또는 제거를 위해 항-CD105 항체 및 항-VEGF(또는 이의 항원 결합 단편)의 예방 또는 치료 효과를 향상시키는 치료 프로토콜을 포괄한다.
한 실시양태에서, 추가 치유적 치료, 예를 들면, (본원에 기재된) 혈관신생 억제제가 대상체에게 투여된다. 이러한 추가 치유적 치료를 함유하는 조성물은 본원에 기재된 다른 조성물과 (순차적으로 또는 동시에) 조합 투여될 수 있다.
본원에서 제공된 암을 치료하는 한 비-한정적 방법에서, 추가 치유적 치료는 암의 수술적 제거, 방사선조사, 하나 이상의 화학치료제 또는 이들의 조합, 및 본원에 기재된 하나 이상의 조성물의 동시 투여를 포함한다. 한 양태에서, 조성물의 투여는 예를 들면, 20분 정맥내 관주일 수 있다.
혈관신생을 수반하는 안 질병
한 양태에서, 본 발명은 본원에서 제공된 제제들 중 하나 이상을 환자에게 치료 유효량으로 투여함으로써 환자에서 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 맥락막 신생혈관형성, 황반 부종 또는 신생혈관 녹내장을 치료하는 방법을 제공한다.
황반 변성(AMD)은 높은 예리한 시력을 담당하는 중심 망막(황반으로서 지칭됨)의 부분에서의 광수용체의 손실이다. 황반의 변성은 망막 색소 상피 및 혈관 맥락막 사이의 막에서 세포외 매트릭스 성분 및 다른 조직파편(debris)의 비정상적인 침착과 관련되어 있다. 이 조직파편 유사 물질은 드루젠(drusen)으로서 지칭된다. 드루젠은 안저 눈 검사에 의해 관찰된다. 정상적인 눈은 드루젠을 갖지 않는 황반을 가질 수 있으나, 드루젠은 망막 주변에 풍부하게 존재할 수 있다. 황반 시력의 임의의 손실의 부재 하에서 황반에서의 연질 드루젠의 존재는 AMD의 초기 단계로서 간주된다. 황반 변성은 망막의 망막 색소 상피(RPE) 층 아래의 비정상적인 혈관의 발생인 맥락막 신생혈관형성(CNV)을 특징으로 한다. 이들 혈관은 브루크 막을 뚫고 나아가 망막 착색된 상피를 파괴하고, 출혈시키고 궁극적으로 중심 시력의 심각한 손실을 초래하는 황반 흉터형성(원반형 흉터형성)을 야기한다.
맥락막 신생혈관형성(CNV)은 다른 안 장애 이외에 황반 변성에서 통상적으로 일어나고, 맥락막 내피세포의 증식, 세포외 매트릭스의 과다생성 및 섬유혈관 망막하 막의 형성과 관련되어 있다. 망막 색소 상피세포 증식 및 혈관신생 인자의 생성은 맥락막 신생혈관형성에 영향을 미치는 듯하다.
당뇨병성 망막병증(DR)은 모세혈관 기저막의 비후화, 및 모세혈관의 주변세포와 내피세포 사이의 접촉의 결여로 인해 당뇨병에서 발생하는 과도한 혈관신생을 특징으로 하는 안 장애이다. 주변세포의 손실은 모세혈관의 누출을 증가시키고 혈액-망막 장벽의 분해를 초래한다. 당뇨병성 망막병증은 미세혈관 망막 변화의 결과이다. 고혈당증-유도된 주변세포 사멸 및 기저막의 비후화는 혈관벽의 무능력을 초래한다. 이들 손상은 혈액-망막 장벽의 형성을 변화시키고, 또한 망막 혈관을 보다 더 투과가능한 상태로 만든다. 소혈관, 예컨대, 눈의 혈관은 특히 좋지 않은 혈당(혈액 글루코스) 조절에 취약하다. 글루코스 및/또는 프럭토스의 과다축적은 망막에서 소혈관을 손상시킨다. 손상된 혈관이 유체 및 지질을 황반 상으로 누출시킬 때 황반 부종도 발생할 수 있다. 이들 유체는 황반이 팽창하게 하고, 이것은 시력을 흐리게 한다. 이 손상은 망막에서의 산소의 결핍도 초래한다.
질환이 진행됨에 따라, 망막에서의 산소의 결핍은 망막을 따라 혈관신생을 자극하고 눈의 내부를 채우는 투명한 겔 유사 유리체액에서 혈관신생을 자극한다. 시기적절한 치료가 없으면 이들 새로운 혈관은 출혈할 수 있고 시력을 흐리게 할 수 있고 망막을 파괴할 수 있다. 섬유혈관 증식도 견인 망막 박리를 야기할 수 있다. 새로운 혈관은 눈의 전방각 내로 성장할 수도 있고 신생혈관 녹내장을 야기할 수 있다.
증식 유리체망막병증은 유리체막 내부에서 및 망막 표면 상에서 세포막 및 섬유증막의 세포 증식과 관련되어 있다. 망막 색소 상피세포 증식 및 이동은 이 안 장애에서 공통된다. 증식 유리체망막병증과 관련된 막은 세포외 매트릭스 성분, 예컨대, 콜라겐 I형, II형 및 IV형, 및 피브로넥틴을 함유하고, 점진적으로 섬유증성을 나타내게 된다.
연령 관련 황반 변성(AMD) 및 당뇨병성 망막병증은 개발된 세계에서 실명의 2가지 주요 원인이다. 애플리버셉트, 라니비주맙 및 페갑타닙은 AMD 환자를 위해 이용될 수 있는 치료 방법을 개선하였다. 라니비주맙은 Fab이고, 애플리버셉트는 융합 단백질이다. 이들은 둘다 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합하고, 최근까지 AMD 치료에 대한 가장 인상적인 결과를 나타내었으나; 치료받은 환자의 소수만이 시력의 유의한 개선을 경험한다. VEGF 이외의 표적에 초점을 맞춘 항-혈관신생 치료는 VEGF 경로를 표적화하는 물질과 관련된 한계들 중 일부를 극복할 수 있다.
본원에 기재된 항-CD105 항체는 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증 또는 증식 유리체망막병증의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항체의 투여를 통해 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종 또는 증식 유리체망막병증을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 항-CD105 항체는 혈관을 수축시킬 수도 있고/있거나, 안 질환과 관련된 내피세포 증식을 억제할 수도 있고/있거나, 출혈의 징후 또는 증상을 제거할 수도 있고/있거나, 뿌옇게 보이는 증상을 치료할 수도 있고/있거나, 시력 손실의 정체를 제공할 수도 있고/있거나, 시력을 개선할 수도 있고/있거나, 혈관의 누출을 예방할 수도 있다. 본원에 기재된 항-CD105 항체는 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종 또는 증식 유리체망막병증의 치료를 위한 약제에서 사용될 수도 있다.
추가로, 본원에 기재된 항-CD105 항체는 황반 변성, CNV, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종 또는 증식 유리체망막병증의 치료를 위한 공지된 치료 및/또는 화합물과 함께 사용될 수도 있다. 이러한 화합물의 예로는 라니비주맙, 애플리버셉트 및 페갑타닙이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 본원에 기재된 투여 방식 이외에 항-CD105 항체는 유리체내 경로를 통해 투여될 수 있다. 유리체내 투여 방식의 비-한정적 예로는 유리체내 주사 및 유리체내 이식물의 사용이 있다.
환자는 개선 및 치료에 대한 반응성에 대해 평가될 수 있다. 치료는 황반 부종의 감소, CNV의 감소된 면적, 및 증가된 시력을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 징후 또는 증상의 측정은 당분야에서 공지되어 있고 하기 실시예에 더 기재되어 있다.
본원에 기재된 실시양태에 따라, 본원에 기재된 제제는 단독으로 투여될 수 있거나, 하나 이상의 추가 활성 또는 불활성 물질과 함께 투여될 수 있다. 조합물이 사용되는 경우, 항-CD105 항체 및 항-VEGF 항체(이의 항원 결합 단편)의 동시적 또는 순차적 투여가 이용될 수 있다.
기능 분석
본원에 기재된 제제는 다양한 시험관내 분석, 생체내 분석 및 생체외 분석에서 평가될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 임의의 적합한 분석이 이러한 효과를 모니터링하는 데에 사용될 수 있다. 여러 이러한 기법들이 본원에 기재되어 있다.
CD105 신호전달 및 기능에 대한 분석
CD105(엔도글린)는 증식 내피세포에 의해 발현되는 TGF-β 수용체 패밀리의 구성원이고, 정상 수준의 CD105가 내피세포 증식을 위해 필요하다. CD105는 고형 종양의 혈관신생 혈관구조에서 강하게 발현되고, 혈관신생/혈관 발생에 관여하고 보조 형질전환 성장 인자 β(TGF-β) 수용체이다. CD105는 백혈병 세포 및 내피세포 상에서 발현되는 동종이량체 세포 막 당단백질이다. 그들의 세포질 꼬리의 아미노산 서열에서 상이한 CD105의 두 동형체인 L-엔도글린(170 kDa) 및 S-엔도글린(160 kDa)이 특징규명되어 있다.
CD105 발현은 저산소증-유도성 인자-1-α(HIF-1-α)의 생성을 통해 세포 저산소증에 의해 증가되고, 아폽토시스로부터 저산소증 세포를 보호한다. CD105는 TGF-β 수용체(TGF-βR), 액티빈 수용체 유사 키나제(ALK) 및 액티빈 수용체를 포함하는 TGF-β 수퍼패밀리의 다중 키나제 수용체 복합체의 신호전달을 조절하는 작용을 한다. CD105의 부재 하에서, TGF-β 수용체의 활성화는 내피세포 생장을 억제하는 SMAD 단백질의 인산화를 초래한다. 그러나, TGF-β에 의한 CD105의 활성화는 SMAD 단백질 인산화를 조절한다. 최종 결과는 내피세포에 대한 TGF-β 수용체 활성화의 생장 억제 효과의 방출이다.
항-CD105 항체에 의한 CD105 활성화의 방지는 TGF-β와 상승작용적으로 작용하여 내피세포 생장을 억제한다. TGF-β는 내피세포에서 상반되는 효과로 2개의 상이한 I형 수용체/SMAD 신호전달 경로들을 자극할 수 있다. TGF-β/ALK5 신호전달 경로(A)는 세포 증식 및 이동의 억제를 유발하는 반면, TGF-β/ALK1 경로(B)는 내피세포 증식 및 이동을 유도한다. 혈관신생 동안 고도로 발현되는 보조 TGF-β 수용체인 CD105는 ALK1 신호전달을 위해 필수적이다. CD105의 부재 하에서, TGF-β/ALK5 신호전달이 우세하고 정지 내피를 유지한다. 높은 CD105 발현은 ALK1 경로를 자극하고 ALK5 신호전달을 간접적으로 억제함으로써 혈관신생의 활성화 상태를 촉진한다.
한 비-한정적 실시양태에서, 항체는 혈관신생 및 내피세포 증식의 억제에 대해 평가될 수 있다. 항-CD105 항체와 HUVEC의 결합은 TGF-β와 HUVEC의 후속 결합을 방해하지 않는다. 따라서, 항-CD105 항체에 의한 내피세포 생장의 직접적인 억제는 항-혈관신생 및 종양 억제 효과가 생체내에서 관찰되게 하는 근본적인 기작들 중 하나에 해당한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 Smad1/5/8 인산화 및/또는 신호전달을 방해함으로써 혈관신생을 차단하는 것에 대해 평가될 수 있다. CD105는 Smad2/3 단백질의 인산화의 감소 및/또는 차단을 수반하는, TGF-β/ALK1의 신호전달을 통해 혈관신생의 촉진에 참여한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 Smad2/3 인산화 및/또는 신호전달을 향상시킴으로써 혈관신생을 차단하는 것에 대해 평가될 수 있다.
TGF-β/ALK1 신호전달 경로 및/또는 Smad1/5의 인산화에 대한 본원에서 제공된 항체의 차단 또는 억제 효과를 분석하는 방법 및 기법은 공지된 분자 기법들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로 내의 단백질들 중 임의의 단백질에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 이용하여 TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 대한 본원에 개시된 항-CD105 항체의 억제 및/또는 자극 효과를 측정할 수 있다. 유사하게, TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 관여하는 단백질에 대한 mRNA의 검출 또는 mRNA의 조절을 이용하여 본원에 개시된 항체의 억제 및/또는 자극 효과를 분석할 수 있다. TGF-β/ALK5 또는 TGF-β/ALK1 경로에 대한 세포 신호전달을 분석하는 추가 방법은 당분야에서 공지되어 있고 본원에서 고려된다.
본원에 개시된 항-CD105 항체의 활성은 당분야에서 인정된 분석, 예를 들면, 결합 분석, 예컨대, ELISA, 경쟁 ELISA, 표면 플라스몬 공명, 및 더 상세히 후술된 HUVEC 세포에 대한 효과를 이용함으로써 평가될 수 있다.
SCID/누드 마우스
종양 성장을 분석하는 한 방법은 다음과 같이 SCID 마우스를 사용한다: 서브컨플루언트(subconfluent) 인간 M21 흑색종 세포를 수거하고 세척하고 멸균 PBS에 재현탁한다(㎖ 당 20 x 106). SCID 마우스를 100 ㎕의 M21 인간 흑색종 세포(2 x 106) 현탁액으로 피하 주사한다. 종양 세포 주사로부터 3일 후, 마우스를 치료하지 않거나, 하나 이상의 대조군 또는 시험 제제로 정맥내 또는 복강내(예를 들면, 100 ㎍/마우스)로 치료한다. 마우스를 24일 동안 매일 치료한다. 종양 크기를 칼리퍼로 측정하고 수학식 V = (L x W2)/2(이때, V는 부피에 해당하고, L은 길이에 해당하고, W는 폭에 해당함)를 이용하여 부피를 추정한다.
종양 성장을 분석하는 한 방법은 다음과 같이 누드 마우스를 사용한다: 50 ㎕ PBS 중의 MDA-MB-435 종양 세포(0.4 x 106개 세포/마우스)를 암컷 누드 마우스(5주령 내지 6주령)의 유선 지방 패드 내에 정위 이식하였다. 종양의 평균 부피가 대략 50 내지 80 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 무작위 배정하고(10마리 이상/군) 용량 당 1 ㎍(0.05 mg/kg), 10 ㎍(0.5 mg/kg), 100 ㎍(5 mg/kg) 또는 200 ㎍(10 mg/kg)의 하나 이상의 항체, 100 ㎕ PBS 중의 100 ㎍ 대조군 항체, 또는 100 ㎕ 비히클 PBS를 사용한 정맥내 또는 복강내 치료를 주 당 2회 시작하고; 일부 연구에서, 비치료군도 평가하였다. 종양 크기를 칼리퍼로 측정하고 수학식 V = (L x W2)/2(이때, V는 부피에 해당하고, L은 길이에 해당하고, W는 폭에 해당함)를 이용하여 부피를 추정한다.
BALB/c 동계(syngeneic) 마우스 모델
대안적으로, BALB/c 동계 마우스 모델도 예를 들면, 문헌(Tsujie et al., Int. J. Oncology, 29: 1087-1094 (2006))에 의해 예시된 바와 같이 본원에 기재된 항체에 의한 종양 성장 및 이의 억제를 평가하는 데에 사용될 수 있다.
마우스
또 다른 분석은 키메라 마우스:인간 마우스 모델에서 혈관신생을 측정하고, 키메라 마우스 분석으로서 지칭된다. 상기 분석은 다른 문헌에 상세히 기재되어 있고, 혈관신생, 신생혈관형성 및 종양 조직의 퇴행을 측정하기 위해 본원에도 기재되어 있다. 문헌(Yan, et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:986-996)을 참조한다.
키메라 마우스 분석은 이식된 피부 이식물이 정상 인간 피부와 조직학적으로 매우 유사하고 전체 조직의 신생혈관형성이 일어나기 때문에 생체내 혈관신생에 대한 유용한 분석 모델이고, 이때 실제 인간 혈관은 이식된 인간 피부의 표면 상에서 이식된 인간 피부로부터 인간 종양 조직 내로 성장한다. 인간 이식물 내로의 신생혈관형성의 기원은 인간 특이적 내피세포 마커를 사용한 신생혈관구조의 면역조직화학적 염색에 의해 입증될 수 있다.
키메라 마우스 분석은 새로운 혈관 성장의 퇴행의 양 및 정도 둘다를 기초로 신생혈관형성의 퇴행을 입증한다. 나아가, 이식된 피부 상에 이식된 임의의 조직, 예컨대, 종양 조직의 성장에 대한 효과를 모니터링하는 것이 용이하다. 마지막으로, 상기 분석은 분석 시스템에서 독성에 대한 내부 대조군이 있기 때문에 유용하다. 키메라 마우스는 임의의 시험 시약에 노출되므로, 마우스의 건강은 독성의 표시이다. 본원에 기재되어 있고 당분야에서 공지되어 있는 다른 동물 모델도 본원에 기재된 방법에서 이용될 수 있다.
토끼 눈 분석
혈관신생의 또 다른 측정 수단은 생체내 토끼 눈 모델이고, 토끼 눈 분석으로서 지칭된다. 토끼 눈 분석은 다른 문헌에 상세히 기재되어 있고, 문헌(D'Amato et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(9): 4082-4085)에 의해 예시된 바와 같이 혈관신생 억제제의 존재 하에서 혈관신생 및 신생혈관형성 둘다를 측정하는 데에 사용되어 왔다.
토끼 눈 분석은 각막의 가장자리로부터 각막 내로 성장하는 토끼 혈관에 의해 예시된 신생혈관형성 과정이 눈의 천연적으로 투명한 각막을 통해 용이하게 가시화되기 때문에 생체내 혈관신생에 대한 인정된 분석 모델이다. 추가로, 신생혈관형성의 자극 또는 억제, 또는 신생혈관형성의 퇴행의 정도 및 양 둘다가 시간에 따라 용이하게 모니터링될 수 있다.
마지막으로, 토끼는 임의의 시험 시약에 노출되므로, 토끼의 건강은 시험 시약의 독성의 표시이다.
요약하건데, 닭 융모요막(CAM) 분석을 수행하고, 하나 이상의 대조군 또는 시험 화합물을 함유하는 0.5% 카복시메틸셀룰로스 펠렛의 이식 후 48시간에서 발달하는 혈관구조에 대한 효과를 기록한다. 각막 신생혈관형성은 수크랄페이트(수크로스 황산알루미늄; 부크 메디텍(Bukh Meditec), 코펜하겐 소재)에 결합된 650 ng의 강력한 혈관신생 단백질 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)를 함유하는 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(하이드론(Hydron); 인터페론 사이언시스(Interferon Sciences), 뉴저지주 뉴 브룬스윅 소재)의 이식된 펠렛에 의해 유도된다. 펠렛에의 수크랄페이트의 첨가는 분해로부터 bFGF를 보호하고 그의 느린 방출을 제공함으로써, bFGF/하이드론 단독에 의해 유도된 혈관신생보다 더 두드러진 일관된 공격적인 혈관신생을 생성한다. 수크랄페이트/하이드론을 함유하는 펠렛으로부터의 bFGF의 방출은 하이드론만을 갖는 펠렛의 경우 단지 1일에 비해 펠렛이 형성된 후 최대 4일 동안 시험관내에서 검출될 수 있다. 펠렛은 12 ㎍의 재조합 bFGF(다케다(Takeda), 오사카 소재)를 함유하는 110 ㎕의 식염수를 40 mg의 수크랄페이트와 혼합함으로써 제조되고; 이 현탁액은 80 ㎕의 에탄올 중의 12%(중량/부피) 하이드론에 첨가된다. 그 다음, 이 혼합물의 분취액(10 ㎕)을 테플론 페그(Teflon pegs) 상에 피펫팅하고 대략 17개의 펠렛을 생성하도록 건조시킨다.
펠렛을 윤부로부터 2 mm 떨어진, 마취된 암컷 뉴질랜드 백색 토끼의 각각의 눈의 각막 마이크로포켓 내로 이식한 후, 에리쓰로마이신 연고를 각막의 표면 상에 단회 국소 도포한다. 연일 수행된 조직학적 검사는 펠렛을 향한 각막 내로의 점진적인 혈관 성장을 입증하는데, 이때 드문 염증 세포만이 관찰된다. 이 혈관신생 반응은 전신 방사선조사에 의한 심각한 면역 억제에 의해 변경되지 않고, 수크랄페이트만을 갖는 펠렛은 혈관신생을 유도하지 않는다. 새로운 혈관은 염증에 의해서 유도되기보다는 오히려 bFGF에 의해 주로 유도된다. 동물은 0.5% 카복시메틸셀룰로스에 현탁된 하나 이상의 화합물 또는 비히클 단독에 의한 위 세척을 이식 후 2일부터 매일 공급받는다. 면역억제된 동물은 펠렛의 이식 직전에 6분 동안 6 Gy의 전신 방사선을 제공받는다. 이 용량의 방사선은 2일째 날까지 80% 초과의 백혈구 카운트 감소 및 3일째 날까지 90% 초과의 백혈구 카운트 감소를 갖는 현저한 백혈구감소증(이전 보고와 일치하는 결과)을 초래한다.
동물은 동일한 각막 전문가(M.S.L.)에 의해 차폐된 방식으로 이틀마다 슬릿 램프로 검사받는다. 각막 신생혈관형성의 면적은 윤부로부터의 혈관 길이(L) 및 관련된 윤부의 클록 아워스(clock hours)(C)의 수를 십자선으로 측정함으로써 결정된다. 하기 수학식이 원형 밴드 절편의 면적을 측정하는 데에 이용된다: C/12 x 3.1416 [r2 - (r - L)2](이때, r은 토끼 각막의 측정된 반경인 6 mm이다). 펠렛에 인접한 신생혈관형성의 균일한 인접 밴드를 측정하여, 신생혈관형성의 총 억제를 평가할 수 있다.
마우스 매트리겔 플러그 혈관신생 분석
혈관신생에 대한 제제의 효과를 확인하기 위해, 마우스 매트리겔 플러그 혈관신생 분석을 이용할 수 있다. 다양한 성장 인자들(예를 들면, IGF-1, bFGF 또는 VEGF)(250 ng) 및 헤파린(0.0025 유닛/㎖)을 이전에 기재된 바와 같이 성장 인자-감소된 매트리겔과 혼합한다(Montesano, et al., J. Cell Biol. 1983, 97:1648-1652; Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141). 하나 이상의 동물 용량 군을 이용하여 본원에 기재된 제제 또는 대조군 항체를 매트리겔 제제에 포함시킬 수 있다. 대조군 실험에서, 매트리겔을 성장 인자의 부재 하에서 제조한다. 마우스를 0.5 ㎖의 매트리겔 제제로 피하 주사하고, 1주 동안 항온처리한다. 항온처리 기간 후, 마우스를 희생시키고 중합된 매트리겔 플러그를 수술적으로 제거한다. 매트리겔 플러그 내에서의 혈관신생을, 면역조직화학적 분석 및 헤모글로빈 함량을 포함하는 2종의 확립된 방법으로 정량한다(Furstenberger, et al., Lancet. 2002, 3:298-302; Volpert, et al., Cancer Cell 2002, 2(6):473-83; and Su, et al., Cancer Res. 2003, 63:3585-3592). 면역조직화학적 분석을 위해, 매트리겔 플러그를 OCT에 파묻고 급속 동결시키고 4 ㎛ 절편을 제조한다. 동결된 절편을 메탄올/아세톤(1:1)에서 고정시킨다. 동결된 절편을 CD31에 대해 유도된 다중클론 항체로 염색한다. 혈관신생을 20개의 고배율(200X) 현미경 시야 내의 미세혈관 밀도 카운트로 정량한다.
헤모글로빈 함량을 이전에 기재된 바와 같이 정량할 수 있다(Schnaper, et al., J. Cell Physiol. 1993, 256:235-246; Montesano, et al., J. Cell Biol. 1983, 97:1648-1652; Stefansson, et al., J. Biol. Chem. 2000, 276:8135-8141; and Gigli, et al., J. Immunol. 1986, 100:1154-1164). 매트리겔 이식물을 드라이 아이스 상에서 급속 동결시키고 밤새 동결건조한다. 건조된 이식물을 1시간 동안 0.4 ㎖의 1.0% 사포닌(칼바이오켐(Calbiochem))에 재현탁하고 격렬한 피펫팅으로 파괴한다. 제제를 15분 동안 14,000 X g에서 원심분리하여 임의의 미립자를 제거한다. 그 다음, 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 상청액 중의 헤모글로빈의 농도를 직접적으로 측정하고 정제된 헤모글로빈의 표준 농도와 비교한다.
세포 이동을 분석하는 방법
세포 이동에 대한 분석은 문헌, 예를 들면, 문헌(Brooks, et al., J. Clin. Invest 1997, 99:1390-1398)에 기재되어 있고, 세포 이동을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 본원에 기재된 세포 이동을 측정하는 한 방법에서, 트랜스웰 이동 챔버로부터의 막을 기질(여기서, CD105 및/또는 VEGF)로 코팅하고, 트랜스웰을 세척하고, 비-특이적 결합 부위를 BSA로 차단한다. 서브컨플루언트 배양물로부터 종양 세포를 수거하고 세척하고 분석 항체의 존재 또는 부재 하에서 이동 완충제에 재현탁한다. 종양 세포가 코팅된 트랜스웰 막의 하부측으로 이동한 후, 막의 상부측에 남아 있는 세포를 제거하고, 하부측으로 이동한 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색한다. 그 다음, 세포 이동을 현미경 시야 당 직접적인 세포 카운트로 정량한다.
세포 증식을 분석하는 방법
세포 증식을 당업자에게 공지되어 있는 방법으로 분석할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 서브컨플루언트 인간 내피세포(HUVEC)를 ECV 또는 ECVL 세포로부터의 CM(25 ㎕)의 존재 또는 부재 하에서 낮은(5.0%) 혈청을 함유하는 증식 완충제에 재현탁할 수 있고, 내피세포가 24시간 동안 증식하게 할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 WST-1 분석 키트(케미콘(Chemicon))를 사용하여 미토콘드리아 데하이드로게나제 활성을 측정함으로써 증식을 정량할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 표준 방법을 이용하여 3H 도입을 측정함으로써 증식을 정량할 수 있다(She et al., Int. J. Cancer, 108: 251-257 (2004)).
세포 증식을 평가하는 다른 방법은 당분야에서 공지되어 있고 본원에서 고려된다. 추가 비-한정적 예는 실시예에 더 상세히 기재되어 있다.
CDC, ADCC 및 옵소닌화를 유도하는 방법
형질전환된 세포에 대한 신체의 천연 면역 반응을 증강시키기 위해 다양한 치료가 유도되었다. 통상적인 이펙터 방법은 보체 의존적 세포용해("CDC"), 항체 의존적 세포 매개 세포독성("ADCC") 및 식세포작용(표적 세포가 면역글로불린으로 코팅된 후 세망내피 시스템에 의한 제거)을 포함한다. 항체의 존재 하에서 일부 이펙터 세포들, 예컨대, 항체의 Fc 영역에 대한 표면 결합된 수용체를 갖는 림프 세포는 표적 세포에 대한 항체 의존적 세포 매개 세포독성("ADCC") 반응을 매개한다. 이들 이펙터 세포는 ADCC에 의해 이러한 표적 세포에 대한 세포용해 활성을 발휘한다.
두 유형의 ADCC 반응이 시험관내에서 입증되었다. 고전적인 ADCC 반응에서, 이펙터 세포는 항체-코팅된 표적 세포에 부착한 후 표적 세포의 세포용해를 야기한다(A. H. Greenberg et al., "Characteristics Of The Effector Cells Mediating Cytotoxicity Against Antibody-Coated Target Cells," Immunology, 21, p. 719 (1975)). 이펙터와 표적 세포 사이의 이 부착은 표적 세포를 코팅하는 항체의 Fc 영역과 이펙터 세포의 Fc 수용체의 상호작용으로부터 발생된다. 이러한 유형의 ADCC 반응의 한 단점은 이 반응이 이펙터 세포의 Fc 수용체에 대해 표적 세포-결합된 항체와 경쟁하는, 종종 다양한 질환들과 관련된 순환 항원-항체 복합체에 의해 방해받을 수 있다는 점이다(I. C. M. MacLennan, "Competition For Receptors For Immunoglobulin On Cytotoxic Lymphocytes," Clin. Exp. Immunol., 10, p. 275 (1972)). 고전적인 ADCC의 이러한 단점으로 인해, 제2 유형의 ADCC 반응, 즉 항체-유도된 ADCC가 이용될 수 있다. 항체-유도된 ADCC에서, 표적 특이적 항체는 먼저 이펙터 세포에 부착되고, 그 후 발생된 복합체가 항체를 통해 표적 세포 표면 상의 그의 특이적 항원으로 "향한다". 유리하게는, 항체-유도된 ADCC는 숙주 시스템에서 순환하는 항원-항체 복합체의 존재에 의해 영향받지 않을 수 있다. Fc 영역/Fc 수용체 부착을 통한 항체와 이펙터 세포 사이의 상호작용은 정상적으로 약하다. 그리고, 일부 경우, 항체는 표적 세포의 용해를 허용하기에 충분한 시간 동안 이펙터 세포와 회합된 상태로 남아있지 않는다. 이 잠재적인 문제점을 고려하여, 폴리에틸렌 글리콜 및 프탈레이트 오일들의 혼합물을 사용한 전처리를 이용하여 항체를 이펙터 세포에 부착하였다(J. F. Jones and D. M. Segal, "J. Immunol., 125, pp. 926-33 (1980)). 그러나, 생체내 치료를 위한 이 방법의 적용가능성은 항체-이펙터 세포 복합체 상의 임의의 폴리에틸렌 글리콜 및 프탈레이트 오일 잔류물이 신체에 대해 나타낼 수 있는 독성 효과에 의해 감소될 수 있다.
대안적으로, 세포독성 약물을 사용한 보조 화학치료로 항체-유도된 ADCC를 향상시키는 방법이 제안되었다(I. R. Mackay et al., Cancer Immunol. Immunother., 16, pp. 98-100 (1983)). ADCC에 대해 시험하는 분석은 당분야, 예를 들면, 미국 특허 제5,756,097호에서 잘 공지되어 있다.
따라서, 본 실시양태는 신생혈관형성 또는 혈관신생에 있어서 일정한 역할을 갖는 세포에 결합할 수 있거나 식세포작용 및 세포의 사멸을 향상시킴으로써 생체내에서 보호를 향상시킬 수 있는 항체를 제공한다. 항체가 결합할 수 있고 동일한 효과를 갖는 결합 부위 또는 에피토프에 면역반응하거나, 특이적으로 결합하거나 우선적으로 결합하는 다른 항체 및 이의 기능성 단편도 제공한다.
항체는 신생혈관형성 또는 혈관신생에 있어서 일정한 역할을 갖는 세포(예를 들면, 내피세포)에 대안 옵소닌성도 가질 수 있거나 옵소닌 활성도 나타낼 수 있다. 당업자가 인식하는 바와 같이, "옵소닌 활성"은 항원 또는 세포 수용체에 결합하여 식세포에의 항원 또는 세포 수용체의 부착을 촉진함으로써 식세포작용을 향상시키는 옵소닌(일반적으로 항체 또는 혈청 인자 C3b)의 능력을 지칭한다. 일부 세포들은 옵소닌 항체로 코팅될 때 식세포, 예컨대, 호중구 및 대식세포에 극도로 끌리게 되고, 혈류로부터의 그들의 제거 속도가 현저히 향상된다. 옵소닌 활성은 예를 들면, 미국 특허 제6,610,293호에 기재된 바와 같이 임의의 통상적인 방식으로 측정될 수 있다.
또 다른 비-한정적 실시양태에서, 신생혈관 장애 또는 혈관신생 의존적 장애를 갖는 환자는 혈관신생으로부터 항원/펩티드(예를 들면, CD105)를 발생시킨다. 이들 항원/펩티드는 "종양 관련 항원"일 수 있다. 이러한 환자는 상기 항원/펩티드(예를 들면, CD105)에 대한 항체를 전신적으로 투여받을 수 있고, 본원에 기재된 경로들 중 임의의 경로를 개시하여 CDC, ADCC, 옵소닌화, 또는 임의의 다른 형태의 세포 매개 사멸을 유도할 수 있다.
추가 분석
당분야에서 공지되어 있는 다른 분석도 본원에 기재된 제제, 예를 들면, 하기 실시예에 기재된 제제의 효과를 시험하는 데에 이용될 수 있다.
실시예
본원은 본원의 예시적인 실시양태로서 제공되는 하기 비-한정적 실시예를 참고함으로써 더 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 예시적인 실시양태를 더 전체적으로 설명하기 위해 제공되나, 어떠한 방식으로든 본원의 넓은 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원의 일부 실시양태들이 본원에 제시되어 있고 기재되어 있지만, 이러한 실시양태들이 단지 예로서 제공된다는 것은 자명할 것이다. 다수의 변경, 변화 및 치환이 일어날 수 있고; 본원에 기재된 실시양태들에 대한 다양한 대안이 본원에 기재된 방법을 실시하는 데에 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1: 투여를 위한 예시적인 용량 스케쥴
당분야에서 인정된 방법을 전술된 바와 같이 이용하여 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여의 최적 용량 스케쥴을 결정할 수 있다.
한 비-한정적 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 다양한 기간에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용량(들)은 주 당 2회, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 6주마다, 8주마다, 12주마다, 또는 이들 사이의 주들의 임의의 조합으로 투여될 수 있다. 투약 주기, 예를 들면, 4주 동안 주 당 1회 또는 2회의 항체 투여에 이어서, 치료 없는 2주도 고려된다. 예를 들면, 본원에 기재된 용량 및 주 단위 주기의 상이한 조합을 포함하는 추가 투약 주기도 본원에서 고려된다.
실시예 2: 비아코어(표면 플라스몬 공명; SPR) 분석
예를 들면, 표준 프로토콜을 이용한 비아코어 분석을 이용하여 항체의 친화성을 평가할 수 있다. 요약하건대, 항-CD105 항체의 결합을 측정하는 데에 이용될 His-태그 부착된 재조합 인간 CD105의 포획을 위해 항-히스티딘 태그 항체를 비아코어 칩에 커플링시킨다. SPR 분석의 현상은 최소한 2개의 칩 제조 회분 + 8개의 분석 회분에서 수행된다. 하기 파라미터들이 분석의 현상에서 평가된다:
(a) CM5 칩에의 항-his 항체의 커플링
EDC/NHS를 이용하여 통상적인 아민 화학반응으로 항-his 태그 항체를 비아코어 CM5 칩에 커플링시킨다. 반응 조건(농도 및 pH)이 최적화될 것이다.
(b) 인간 CD105의 결합 및 바이오센서 칩의 재생
인간 CD105의 결합, 및 결합된 항체를 용출하기 위한 다양한 완충제(이전 실험에 기초함)를 사용한 칩의 재생에 대해 조건을 시험한다. 일단 후보 재생 방법이 개발되면, 단일 칩 표면의 결합 성능 및 배경을 25 이상의 주기에 걸쳐 측정한다. 목표는 평균적으로 주기 당 10 RU 미만의 배경 증가 및 주기 당 1% 미만의 성능 감소를 수득하는 것이다.
(c) 인간 CD105의 결합
최대 결합에 도달하기에 적합한 농도를 결정하기 위해 인간 CD105의 용량 반응을 측정한다.
(d) 항-CD105 항체의 결합
(상대적인 동역학적 상수인 ka 및 kd의 비교, 또는 평행선 방법에 의한 상대적인 효능의 비교를 포함할 수 있는) 동역학적 또는 평형 결합 실험에 대한 적합한 범위를 결정하기 위해 항-CD105 항체의 용량 반응을 측정한다.
(e) 예비검증 실험
측정의 정밀성 및 정확성에 대한 예비 정보를 수득하기 위해 상이한 칩, 상이한 유동 셀 및 상이한 경우를 이용하여 선택된 조건 하에서 결합 실험을 3회 이상 반복한다. 모든 비아코어 실험을 HBS-EP 런닝 완충제에서 25℃에서 수행한다.
실시예 3: 항-CD105 항체 결합에 대한 ELISA
ELISA를 이용하여 항-CD105 항체와 CD105의 결합을 분석할 수 있다. 요약하건대, ELISA를 하기 단계에 따라 수행한다:
1. PBS 중의 1500 ng/㎖ 농도로 MAB9811-01(단일클론 항-CD105 항체)을 사용하여 플레이트를 100 ㎕/웰의 밀도로 코팅한다. 상기 플레이트를 밀봉기(sealer)로 커버하고 4℃에서 밤새(16시간 내지 24시간) 항온처리한다.
2. 상기 플레이트를 200 ㎕의 PBS(트윈을 갖지 않음)로 2회 세척한다.
3. 상기 플레이트를, 트윈을 함유하는 PBS(PBS-T)로 3회 세척한다.
4. 0.1% BSA를 갖는 PBS-T 중의 100 ng/㎖ 농도로 100 ㎕/웰의 CD105를 첨가하고 실온에서 60분 동안 항온처리한다.
5. 상기 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한다.
6. 시험 웰에서: 20, 10, 4, 2, 1, 0.5 및 0.2 ng/㎖(0.1% BSA를 갖는 PBS-T로 희석됨) 농도로 100 ㎕/웰의 항-CD105 항체를 첨가하고 실온에서 60분 동안 항온처리한다. 음성 대조군 웰에서: 100 ㎕/웰의 동종형 일치된 대조군 항체를 첨가한다.
7. 상기 플레이트를 PBS-T로 3회 세척한다.
8. 0.1% BSA를 갖는 PBS-T로 1:10000 희석된, HRP에 접합된 염소 항-인간 IgG를 100 ㎕/웰의 양으로 모든 웰들에 첨가하고; 실온에서 30분 내지 60분 동안 항온처리한다.
9. 상기 플레이트를 PBS-T로 5회 세척한다.
10. 100 ㎕/웰의 TMB 기질 용액을 첨가하고 암실에서 15분 동안 덮여지지 않은 상태로 항온처리한다.
11. 100 ㎕/웰의 TMB 중단 용액을 첨가하여 반응을 중단시킨다.
샘플들을 삼중으로 런닝시키고, 광학 밀도를 판독하여 표준 곡선을 구축하고 결합 상수를 결정한다. 스튜던트 t-검정 또는 또 다른 표준 검정을 이용하여 통계학적 분석을 수행한다.
당업자는 항체와 VEGF의 결합에 대해 시험하기 위해 유사한 프로토콜을 이용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 4: CD105 발현 세포 상의 사용가능한 에피토프의 항체 결합활성 및 수
표준 프로토콜을 이용한 스캐차드 플롯(Scatchard plot) 분석을 이용하여 CD105 발현 세포 상의 사용가능한 에피토프의 항체 결합활성 및 수를 평가할 수 있다.
요약하건대, 방사성표지된 항-CD105 항체와 CD105 발현 KM-3 백혈병 세포 및 서브컨플루언트 증식 HUVEC의 직접적인 결합의 스캐차드 플롯 분석을 수행한다. 정제된 항-CD105 항체를, 당업자에게 공지되어 있는 표준 방법에 따라 요오도-진(Iodo-Gen)을 이용하여 125I로 개별적으로 방사성표지한다. 방사성표지된 항-CD105 항체들을 각각 IgG 분자 당 평균 요오드 원자 수에 대해 분석한다. 고정된 양(0.1 ㎍)의 각각의 125I-표지된 mAb 및 2배 연속 증가량의 CD105 발현 KM-3 또는 HUVEC 세포를 사용하여 적정 실험을 수행함으로써 항원 결합 활성을 측정한다. 결합 데이터의 스캐차드 플롯의 분석을 공지된 방법에 따라 수행한다. 결합된 mAb/세포의 평형 상수 및 평균 최대 수를 이 분석으로 추정한다.
실시예 5: 차단 활성에 대한 웨스턴 블롯 분석
CD105를 발현하는 세포의 CD105 자극된 활성화를 차단하는 항-CD105 항체의 능력을 웨스턴 블롯을 통해 분석하여 CD105 신호전달 경로에 관여하는 단백질의 인산화를 검출할 수 있다.
공지된 웨스턴 블롯팅 기법에 따라 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 인산화된 Smad1/5/8 또는 Smad2를 확인한다. PSmad1 및 PSmad2 항체는 형질감염되지 않은 내피세포에서 인산화된 Smad1/5 또는 인산화된 Smad2를 특이적으로 인식한다. Smad1, Smad2, Smad5, Id1(산타 크루즈(Santa Cruz)) 및 CD105에 대한 일차 항체를 사용하여 샘플에서 분자를 검출한다. 검출은 향상된 화학발광(ECL)에 의해 수행된다.
실시예 6: HUVEC 생장 및 3 H-티미딘 도입 분석의 억제
다수의 분석들이 세포 생장의 억제를 평가하는 데에 이용될 수 있다.
한 예에서, HUVEC를 서브컨플루언트 조건 하에서 37℃에서 CO2 항온처리기 내에서 75 cm2 플라스크(팔콘(Falcon), 벡톤-딕킨슨(Becton-Dickinson), 뉴저지주 플랭클린 레이크스 소재)에서 배양한다. 37℃에서 25 mM HEPES 완충제(pH 7.3) 중의 15 mM EDTA를 갖는 행크의 균형잡힌 염 용액과 함께 15분 동안 항온처리함으로써 세포를 탈착시킨다. 빙냉 PBS로 2회 세척한 후, 세포를 25,000개 세포/㎖의 농도로 내피세포 생장 배지에 재현탁한다.
추가 실험에서, 인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVEC)를 FBS 및 소 뇌 추출물 무함유 내피세포 생장 배지에 현탁하고 이 배지에서 배양한다. 세포 현탁액의 200 ㎕ 분취액을 96웰 배양 플레이트의 각각의 웰에 시딩한다. 세포를 CO2 항온처리기 내에서 37℃에서 밤새 배양한 후, 항-CD105 항체, 항-VEGF 항체, 항-CD105 항체와 항-VEGF 항체의 조합물, 대조군 IgG 또는 TGF-β1을 삼중으로 첨가한다. 배양 플레이트를 72시간 동안 항온처리기 내에서 보관하고, 이 기간 동안 새로운 배지 및 항체 또는 대조군을 24시간마다 교체한다. 3H-티미딘(1 μCi)을 각각의 웰 내에 첨가하고, 플레이트를 20시간 동안 항온처리한다. 세포를 PBS로 세척한 후, 37℃에서 100 ㎕/웰 트립신-EDTA(0.05% 트립신, 0.53 mM EDTA)로 15분 동안 처리한다. 하베스터(Harvester) 96(톰텍(TOMTEC), 코넥티컷주 햄덴 소재)을 이용하여 세포를 유리 섬유 필터(왈락 프린티드 필터매트 A(Wallac Printed Filtermat A)) 상에서 수거하고, 3H-방사성을 트릴룩스(Trilux) 1540 마이크로베타(MicroBeta) 액체 신틸레이션 및 발광 카운터(왈락, 핀란드 투르쿠 소재)에서 측정한다.
실시예 7: 세포 이동의 억제에 대한 분석
보이덴(Boyden) 챔버를 이용하여 세포 증식 및 활성화의 척도로서 이동(화학운동성)을 측정한다.
요약하건대, 세포 이동을 다음과 같이 평가한다: 코스타(Costar) 뉴클레오포어 필터(8 mm 포어)를 4℃에서 피브로넥틴으로 밤새 코팅한다. 챔버를 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 혈청을 갖거나 갖지 않고 TGF-β3을 갖거나 갖지 않는 DMEM으로 하부 챔버를 충전한다. 세포를 트립신으로 처리하고 대조군 항체, 항-CD105 항체, 항-VEGF 항체 또는 이들의 조합물의 존재 하에서 DMEM에 50,000개 세포/㎖의 최종 농도로 현탁한다. 세포 현탁액의 150 ㎕ 분취액을 상부 챔버에 첨가하고 37℃에서 항온처리한다. 16시간 후, 세포를 세척하고, 상부 표면을 닦아내어 이동하지 않은 세포를 제거한다. 막을 메탄올에서 고정시키고 물로 세척하고 염색하고 하부 표면 상에 존재하는 세포의 수를 카운팅한다.
실시예 8: ADCC 분석
예를 들면, 하기 프로토콜을 이용하여 본원에 기재된 항체들을, IL-2 활성화된 천연 살해(NK) 세포를 발생시키고 ADCC를 유도하는 그들의 능력에 대해 평가할 수 있다.
NK 단리 및 IL-2 활성화된 NK 세포의 발생
PBMC를 단리하고 10% FBS를 갖는 RPMI에서 4℃에서 24시간 동안 휴면 상태로 있게 한다. 그 다음, PBMC를 2% FBS 함유 RPMI(총 부피 = 50 ㎖)에 넣고, 10 ㎖의 세포 현탁액을 페트리 디쉬에 플레이팅한다. PBMC를 37℃에서 2시간 동안 항온처리하고, 부착되지 않은 세포를 수집한다. NK 세포를 48시간 동안 1000 U/㎖의 IL-2와 함께 8 x 106개/㎖의 농도로 배양한 후, 분석에서 사용하기 전에 5일 내지 8일 동안 정상 배양한다.
천연 세포독성 및 ADCC 분석
NK 세포를 배양물로부터 긁어내어 50 ㎖ 원추 튜브 내에 수집한다. 세포를 RPMI 완전 배지로 1회 세척하고 10분 동안 1200 rpm에서 회전시킨다. 그 다음, NK 세포를 5 ㎖의 RPMI 완전 배지에 재현탁하고 카운팅한다. 분석을 수행하기 전, NK 세포 카운트를 10:1의 이펙터:표적 비로 표준화한다. 표준화된 NK 세포를 플레이팅하고 10 ㎕의 항-CD105 항체를 지정된 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 항온처리한다. 대조군 샘플은 처리되지 않은 세포 집단 또는 대조군 항체로 처리된 세포 집단을 포함한다.
관심있는 표적 세포를 수집하고(HUVEC 세포), 세척하고 1200 rpm에서 10분 동안 회전시키고, 5 ㎖ RPMI 완전 배지에 재현탁한다. 표적 세포를 다시 세척하고 1 x 106개 세포/㎖의 최종 농도까지 무혈청 RPMI에 재현탁한다. 그 다음, 표적 세포를 37℃에서 1시간 동안 최종 농도 5 ㎍/㎖의 칼세인 AM으로 표지한 후 RPMI 완전 배지로 2회 세척한다. 그 다음, 표적 세포를 재현탁하고 NK 세포 웰에 첨가한다. 표적 세포/NK 세포 조합물을 37℃에서 4시간 동안 항온처리한다. 항온처리 후, 플레이트를 1200 rpm에서 5분 동안 회전시키고, 세포를 DPBS로 세척하고 DPBS에 재현탁한다. 450/530 nm의 여기/방사를 이용하여 형광을 판독하고, 방사는 항체에 의해 매개된 세포 사멸의 척도이다.
실시예 9: TRC105(항-CD105 항체) 제제의 안정성 평가
본 발명자들은 5 mg/㎖보다 더 높은 농도의 TRC105에 대한 적절한 안정성을 제공한 제제를 확인하였다. 초기 연구는 TRC105가 임의의 겉보기 가용성 문제없이 25 mg/㎖ 이상까지 농축될 수 있다는 것을 보여주었다. 따라서, 스크리닝 연구를 위한 초기 농도로서 25 mg/㎖ TRC105를 선택하였다. 이들 연구의 과정 동안, 50 mg/㎖만큼 높은 농도의 TRC105를 갖는 제제를 평가하였다. 7 mg/㎖ 농도의 TRC105 및 100 mg/㎖ 농도의 TRC105를 갖는 추가 제제도 평가하였다.
절차
자외선(UV) 흡광도 분광법
UV 분광법을 이용하여 다양한 안정성 샘플들에서 단백질 농도를 측정하였다. 1.61 ㎖/mg*cm의 흡광 계수를 유발하는 1 mm 경로길이 셀을 이용하여 280 nm에서의 벌크 물질(7.0 mg/㎖)의 흡광도가 1.13이라는 것을 확인하였다. 이 프로젝트에서 모든 계산을 위해 이 값을 사용하였다. 고농도 샘플에 더 적합한 0.0096 cm 셀을 이용하여 추가 측정을 수행하였다.
TRC105 열안정성 샘플의 항온처리
각각의 열안정성 제제를 루어 록(Luer lock) 주사기가 부착된 0.22 마이크론 밀렉스(Millex) 필터에 통과시킨 후, 1 ㎖ 동결건조 바이알 내로 분취하였다. 각각의 바이알을 부틸 마개로 밀봉하고 알루미늄 캡으로 구부렸다. 샘플을 표시된 온도에서 안정성 챔버 내에 넣고 표시된 항온처리 기간(주 단위) 후에 제거하였다.
TRC105의 동결-해동 및 교반
동결-해동(F/T) 샘플을 25분 동안 동결시킨 후, 25분 동안 0회, 3회 또는 5회 해동시켰다. 모든 동결을 -80℃에서 수행하였다. 해동된 샘플을 완전한 해동에 대해 검사한 후 냉동고에 다시 넣었다. 각각의 동결-해동 샘플은 100 ㎕의 용액을 함유하였고 0.5 ㎖ 에펜도르프 튜브 내에서 저장되었다. 각각의 샘플은 0.1% F68 또는 0.005% 트윈 80을 함유하였거나 계면활성제를 함유하지 않았다.
교반 연구 샘플을 바이알 당 350 ㎖로 제조하고 정지 또는 진탕으로서 표지하였다. 모든 샘플들을 4℃의 냉장실로 옮겼다. 진탕으로서 표지된 샘플을 150 RPM에서 작동하는 궤도 진탕기 상에 놓았다. 정지 샘플을 궤도 진탕기 옆의 선반 상에 놓았다. 각각의 샘플은 0.1% F68 또는 0.005% 트윈 80을 함유하였거나 계면활성제를 함유하지 않았다. 샘플을 표시된 조건에서 24시간 동안 항온처리하였다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)
0.2 M의 일염기성 인산나트륨을 함유하는 이동상을 제조하고 1.0 M의 수산화나트륨을 사용하여 pH 7.0으로 조절하였다. TSK 겔 G3000 PWx1 컬럼(7.8 mm x 30 cm, 7 ㎛ 입자 # P0047-02PN)을 모든 분리를 위해 사용하였다. 1 ㎖/분의 유속을 사용하였고, 검출 파장을 280 nm로 설정하였다. 주입 부피는 25 mg/㎖ 샘플의 경우 2 ㎕이었고 50 mg/㎖ 샘플의 경우 1 ㎕이었다. 각각의 삼중 샘플 분석 전에 완충제 블랭크를 런닝시켰고, 이들 크로마토그램을 적절하게 공제하였다. 피크의 모든 적분을 크로멜레온(Chromeleon) 6.08에서 수행하였다.
모세관 IEF(cIEF)
모세관 등전 포커싱(cIEF) 분석을 벡크만 코울터(Beckman Coulter)에 의해 공개된 PA 800 플러스 적용 지침에 기재된 바와 같이 수행하였다. 더 상세한 설명은 문헌(Mack et al., Electrophoresis 2009, 30 (23), 4049-4058)에서 발견될 수 있다. 30 cm 총 길이(20 cm 유효) 중성 모세관(50 ㎛ 내경)을 가지면서 주위 온도에서 작동하는 벡크만 코울터 P/ACE™ MDQ 시스템(벡크만 코울터 인코포레이티드(Beckman Coulter, Inc.); 캘리포니아주 브레아 소재)을 이용하여 모든 분석들을 수행하였다. 문헌(Gao et al., Anal Chem 2004, 76 (24), 7179-7186)에 기재된 방법을 이용하여 폴리(아크릴아미드)를 모세관 벽에 고정시킴으로써 중성 모세관을 제조하였다. 0.25 mg/㎖의 관심있는 단백질을, 양성전해질, 음극 안정화제, 양극 안정화제 및 pH 마커를 함유하는 3 M 우레아-cIEF 겔의 혼합물과 혼합함으로써 모든 cIEF 샘플들을 제조하였다. 샘플을 4.1분 동안 9.5 psi에서 모세관 내로 압력 주입하였고, 이 시간 후 양극액과 음극액 사이에 15분 동안 25 kV의 전압을 인가함으로써 초점을 맞추었다. 이 단계 후, 양극액과 화학적 이동화제 사이에 30분 동안 30 kV에서 화학적으로 이동시켰다. pI 마커 및 관심있는 단백질을 이동 단계 동안 280 nm에서 흡광도로 검출하였다. pI 표준물로부터 수득된 pI 대 제1 피크 모멘트의 발생된 회귀 방정식으로부터 단백질의 pI를 계산하였다.
결과 및 논의
연구 1
TRC105의 샘플을 5 mg/㎖보다 더 높은 농도까지 성공적으로 농축하였다. 그 결과, 25 mg/㎖의 단백질 농도를 이용하여 연구 1을 수행하였다. 샘플을 40℃에서 2주 동안 저장하였다. pH 및 완충제 조성의 효과에 초점을 맞추면서 15개의 제제들을 제조하였다(표 2). 이들 샘플들의 안정성을 평가하기 위해 이용된 일차 분석 방법은 SEC이었다. 40℃에서 2주 동안 저장한 후, 단량체 함량 또는 고분자량 응집체의 양 면에서 SEC에 의해 매우 작은 변화가 관찰되었다(표 3). 모든 제제들이 저장 후 99% 초과의 단량체를 여전히 함유하였다.
Figure 112015032373064-pct00003
Figure 112015032373064-pct00004
TRC105는 매우 안정한 것으로 발견되었다.
연구 2
상기 연구 1로부터의 결과를 이용하여 새로운 연구를 디자인하였다. 연구 2에서, 아세테이트, 히스티딘 및 시트레이트로 4.0 내지 5.5의 pH 범위를 평가하였다. 선택된 긴장성 변경제/안정화제는 소르비톨 및 트레할로스이었다. 최종적으로, 25 mg/㎖의 제제 이외에 50 mg/㎖의 3개 제제들을 조사하였다.
Figure 112015032373064-pct00005
TRC105의 안정성을 고려하여, 제제들을 보다 더 높은 정도로 구별하고자 이들 샘플들을 40℃에서 4주 동안 저장하였다. 일차 스크리닝 수단은 SEC이었다.
Figure 112015032373064-pct00006
연구 1에서 관찰된 바와 유사하게, 거의 모든 제제들의 단량체 함량은 40℃에서 1개월 후조차도 99.5%를 초과한다(표 5). 한 샘플은 증가된 응집 수준을 보이는 듯하고, 이것은 F16이었고; 이것이 실제 결과인지를 알아보기 위해 이 샘플을 재시험하지는 않았다. 상기 결과는 히스티딘에서의 pH 5.5보다 아세테이트에서의 pH 4가 적절한 및 필적할만한 안정성을 제공하는 듯하다는 것을 시사한다. 시트레이트 및 자극에 대한 우려를 고려하여, 상기 결과를 추가 고려사항으로부터 제거하였다.
또한, 모세관 등전 포커싱(cIEF)을 이용하여 이들 샘플들을 분석하였다. cIEF 전기영동도의 전체 중심을 제1 모멘트로서 계산하였다. 이들 값은 샘플의 평균 pI 값인 것으로 간주될 수 있다(표 6).
Figure 112015032373064-pct00007
전체적으로, 제제들 중 임의의 제제에 대한 pI 값의 변화는 작은데, 이것은 탈아미드화, 즉 하전된 Asp 생성물을 형성하기 위한 Asn 측쇄의 가수분해가 상대적으로 느리다는 것을 암시한다(표 6). 따라서, TRC105의 이들 제제들은 물리적으로 안정하고(즉, 거의 또는 전혀 응집이 없음) 화학적으로 안정한(즉, 단편화가 없고 탈아미드화가 거의 또는 전혀 없음) 듯하다.
다른 우려는 이들 보다 높은 농도의 제제들이 불리한 점성을 나타내어 그들의 임상적 사용을 제한하는지 여부이었다.
Figure 112015032373064-pct00008
TRC105는 50 mg/㎖에서조차도 취급 및 투여를 제한하는 것에 대한 우려를 야기할 임의의 값보다 충분히 낮은 2 cSt 미만의 점성을 나타낸다(표 7 참조).
교반 연구
열적 스트레스가 상이한 안정성의 제제들을 식별하는 데에 유용하지만, 이것은 단백질이 받을 수 있는 유일한 스트레스가 아니다. 단백질의 계면 손상은 흔하고 계면 스트레스에 대한 민감성이 평가되어야 한다. 교반 및 반복된 동결-해동(F/T) 순환을 이용하여 이것을 수행하였다.
Figure 112015032373064-pct00009
교반 시 단량체의 인식가능한 손실은 없고, 이때 모든 제제들이 99.7% 초과의 단량체를 나타내고 정지 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다(표 8). 계면활성제, 예컨대, 플루로닉 F-68 또는 폴리소르베이트 80의 첨가는 교반 시 안정성에 도움을 주거나 안정성을 손상시키는 것처럼 보이지 않는다.
F/T 연구
계면 스트레스에 대한 TRC105의 민감성을 조사하는 제2 연구는 반복된 동결-해동 주기에의 노출을 포함하였다. 이것은 계면(예컨대, 얼음-물 계면)에서의 손상에 대한 정보를 제공할 뿐만 아니라, TRC105 샘플이 후속 분석 또는 운반 동안 동결될 수 있는지에 대한 필수 정보도 제공한다.
Figure 112015032373064-pct00010
반복된 F/T 순환 시 단량체 함량에서의 변화는 사실상 없다(표 9). 놀랍게도, 계면활성제, 예컨대, 플루로닉 F-68 또는 폴리소르베이트 80의 첨가는 반복된 F/T 순환 시 안정성을 변경시키지 않았다. 교반 데이터와 함께, 계면 손상이 우려될 정도로 TRC105가 표면 활성을 나타낸다는 것을 시사하는 것은 없다. 따라서, 계면활성제는 액체 제제를 위해 필요하지 않다.
요약
50 mg/㎖ 이하의 단백질 농도에서 TRC105에 대한 제제 스크리닝 연구를 수행하였다. 이 단백질은 꽤 안정하여, 4주 동안 40℃에서 저장된 후조차도 SEC에 의한 측정 시 단량체 함량의 작은 감소만을 보인다. 단편화는 SEC에 의해 거의 보이지 않았다. 한편, cIEF 분석은 전체 pI에서의 작은 변화만이 관찰되었다는 것을 보여주었는데, 이것은 탈아미드화가 해당 pH 범위(4.0 내지 5.5)에 걸쳐 최소한이었다는 것을 암시한다. 계면 손상에 대한 민감성에 대한 증거는 없었는데, 이것은 계면활성제가 TRC105의 액체 제제에 필요하지 않았다는 것을 시사한다.
사용된 주요 제제들은 긴장성 변경제 및 안정화제로서 소르비톨 또는 트레할로스와 함께 pH 4.0의 아세테이트 완충제 또는 pH 5.5의 히스티딘 완충제를 사용하였다.
실시예 10: TRC105 제제의 장기간 안정성 평가
장기간 안정성 평가를 수행하여 연구 1 및 연구 2에서의 결과를 검증하였다. 표 10에서 제시된 제제들의 샘플들을 5℃ 및 25℃에서 저장하였다.
Figure 112015032373064-pct00011
결과 및 논의
여러 시험 제제들을 5℃에서 1년 및 25℃에서 6개월의 과정에 걸쳐 평가하였다. 5℃에서, 모든 제제들이 잘 수행되었다. 본 연구에서 모든 시점들에서 모든 샘플들에 대한 시각적 외관은 투명하였고 무색이었다. 일반적으로, pH 값은 연구의 지속시간 동안 모든 새로운 제제들에 걸쳐 일정하게 유지되었다(표 11 및 12 참조). 값은 0.1 내지 0.2 유닛만큼 목표보다 약간 더 높았으나 안정한 상태로 유지되었다. UV에 의해 확인된 새로운 제제들에 대한 농도 값은 농도와 관계없이 원래의 목표 값의 약 3% 내지 4% 내에서 일정하게 유지되었다(표 11 및 12 참조). 이들 값들은 연구 과정에 걸쳐 유의하게 변화하지 않았다. 5℃에서 SEC에 의한 측정 시 최소한의 단량체 손실(표 13 참조), 및 cIEF에 의한 측정 시 최소량의 화학적 분해(표 15 및 16 참조)가 있었다. F05에 대한 초기 결과를 제외한 CD105 결합 ELISA 결과에서 약간의 변동성이 있었지만, 모든 값들은 기준 표준물의 값에 비해 50% 내지 150%의 허용 기준 내에 있었고, 이것은 ELISA 분석의 개발 단계와 일치한다(표 17 참조). CE-SDS 시험에 대한 결과는 샘플이 1년의 과정에 걸쳐 5℃에서 기준 물질에 필적할만하였다는 것을 시사하였다(데이터는 제시되지 않음).
5℃에서 저장된 샘플이 본질적으로 변화되지 않았지만, 제제화 파라미터들은 25℃ 샘플의 안정성에 영향을 미쳤다. 무엇보다도 특히, 아세테이트 완충제 시스템을 함유하는 제제들(F03, F05 및 F07)은 히스티딘 완충제를 함유하는 제제들(F01, F02, F04 및 F06)보다 더 큰 % 단량체 감소를 나타내었다(표 14 참조). 한편, 단백질 농도의 변화는 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 듯하다. 2개의 100 mg/㎖ 제제들(F06 및 F07)은 그들의 SEC 프로파일 및 cIEF 프로파일 면에서 그들의 50 mg/㎖ 대응물(F04 및 F05)에 필적할만하다.
Figure 112015032373064-pct00012
Figure 112015032373064-pct00013
Figure 112015032373064-pct00014
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Figure 112015032373064-pct00017
Figure 112015032373064-pct00018
실시예 11: 4 mg/㎖ TRC105 제제의 장기간 안정성 평가
145 mM 염화나트륨을 갖는 17 mM 포스페이트 완충제(pH 7.2)에서 4 mg/㎖의 농도로 제제화된 TRC105(로트 FIN-0536)에 대한 안정성 연구를 수행하였다. 36개월의 안정성 데이터는 권장된 저장 조건(2℃ 내지 8℃)에서 입수가능하고, 1개월의 데이터는 25℃/60% RH의 가속화된 조건에서 입수가능하다. 안정성 데이터는 하기 표에 제시되어 있다. 수행된 시험들 중 임의의 시험에 대한 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 결과적으로, 이들 연구들은 145 mM 염화나트륨을 갖는 17 mM 포스페이트 완충제(pH 7.2)에서 4 mg/㎖의 농도로 제제화된 TRC105가 2℃ 내지 8℃에서 저장될 때 36개월 이상 동안 안정하다는 것을 시사한다.
Figure 112015032373064-pct00019
Figure 112015032373064-pct00020
SEC-HPLC 및 UV에 대한 분석 절차는 실시예 9에 기재된 분석 절차와 동일하다. CD105 결합 ELISA에 대한 분석 절차는 실시예 3에 기재된 분석 절차와 동일하다. 비-환원된 SDS-PAGE, 환원된 SDS-PAGE 및 IEF에 대한 분석 절차는 후술되어 있다.
비-환원된 단백질 및 펩티드의 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색
폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 이용하여 동일성 및 순도를 평가한다. 단백질을 변성 조건 하에서 분리한다. 미리-주조된 4% 내지 12% 비스-트리스 SDS 함유 겔을 사용한다. SDS는 단백질과 상호작용하여 음으로 하전된 복합체들을 형성하는 음이온성 세제이다. 이들 복합체들은 보다 작은 단백질이 보다 큰 단백질보다 더 빨리 이동하도록 그들의 크기에 따라 폴리아크릴아미드 겔을 통해 이동한다. 표준물, 대조군 및 시험 제품을 변성시키고 겔 상에 적재한다. 런닝을 완결한 후, 겔을 쿠마시 블루로 염색한다. 영상화 밀도측정기를 이용하여 겔을 스캐닝한다.
각각의 염색된 밴드의 상대적인 양을 각각의 시험 제품 레인에 대한 밀도측정으로 결정한다. 이들 양을 그 레인에 대해 수득된 총 밴드 양의 백분율로서 표현한다. 시험 제품 밴드의 분자량(kDa) 값을, 분자량 마커와의 비교를 기초로 결정한다.
환원된 단백질의 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색
환원된 단백질에 대한 SDS-PAGE 방법은 비-환원된 샘플에 대해 (상기) 단락 1.3.2에 기재된 바와 동일하되, 이때 (단백질 서브유닛뿐만 아니라 다른 응집체를 유리시키기 위해 분자간 이황화 결합 및 분자내 이황화 결합을 절단하기 위한) 환원 단계가 추가된다. 단백질을 환원시키기 위해, 디티오쓰레이톨(50 mM)을 샘플 및 기준물에 첨가한 후, 85℃에서 5분 동안 가열한다. 환원된 단백질이 런닝될 때 항산화제를 런닝 완충제에 첨가한다.
수평 등전 포커싱(IEF)
인가된 전기력 하에서 단백질 상의 상이한 전하를 이용하여 단백질을 분리한다. 음극과 양극 사이에 pH 구배가 확립되되, 이때 음극이 보다 높은 pH 값을 갖는다. 단백질들이 양쪽성 성질을 갖기 때문에, 이들은 그들의 pI 미만의 양으로 하전된 값 및 그들의 pI 초과의 음으로 하전된 값을 보유할 것이다. 전기력의 영향 하에서 pH 구배가 확립되고, 단백질들은 이동하여 그들의 등전점에서 집중될 것이다. 절차는 미리-주조된 겔을 수평 포맷으로 사용하는 단백질 샘플의 등전 포커싱의 사용을 포함한다. 전기영동 후, 겔을 쿠마시 염색한다. 각각의 밴드의 면적을 각각의 샘플 레인에 대한 밀도측정으로 측정한다. 밴드의 면적을 총 밴드 면적의 백분율로서 계산한다. 각각의 밴드에 대한 pI 및 Rf 값도 측정한다.
실시예 12: 대장암에 대한 임상 시험
본 실시예는 대장암을 갖는 환자에서 항-CD105 항체의 안전성 및 효능의 예비 평가를 제공하도록 디자인된 무작위배정 맹검 플라세보-대조 다중심 II 기 연구를 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자들이 등록되고, 이때 약 50명 내지 약 400명의 환자들이 치료군으로 배정되고, 약 50명 내지 약 400명의 환자들이 플라세보 군으로 배정된다. 상기 시험은 6 내지 10 주기 동안 2주마다 약 0.1 내지 약 10 mg/kg의 정맥내 반복 용량의 항-CD105 항체 또는 플라세보의 투여로 구성될 것이다. 화학치료가 모든 군들에서 사용될 수 있다. VEGF 억제제가 모든 군들에서 사용될 수 있다. 본 연구의 기간은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되고, 이때 초기 연구의 말기에서 표시된 반응자들은 계속된 치료를 제공받는다. 추가 결과 측정치는 다음과 같다:
일차 결과 측정치: 전체 반응률. 본 연구의 한 목적은 대조군 IgG와 비교될 때 항-CD105 항체를 사용한 치료로부터의 증가된 전체 반응률을 입증하는 것이다.
평가될 수 있는 이차 결과 측정치는 반응의 지속시간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존, 심각한 부작용 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들면, 치료는 질환의 진행을 예방할 수 있거나(즉, 정체) 개선을 발생시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하기 측정치들 중 하나 이상에 대하여 다른 목적들이 측정될 수 있다: 감소된 종양 존재량, 감소된 신생혈관형성, 감소된 부작용, 감소된 불리한 반응 및/또는 증가된 환자 순응성.
실시예 13: 신장암에 대한 임상 시험
본 실시예는 신세포암(신장암)을 갖는 환자에서 항-CD105 항체의 안전성 및 효능의 예비 평가를 제공하도록 디자인된 무작위배정 맹검 플라세보-대조 다중심 II 기 임상을 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자들이 등록되고, 이때 약 50명 내지 약 400명의 환자들이 치료군으로 배정되고, 약 50명 내지 약 400명의 환자들이 플라세보 군으로 배정된다. 상기 시험은 3 내지 6 주기 동안 또는 진행될 때까지 1주 내지 3주마다 약 0.1 내지 약 30 mg/kg의 정맥내 반복 용량의 항-CD105 항체 또는 플라세보의 투여로 구성될 것이다. 인터페론도 두 치료 집단에서 사용될 수 있다. VEGF 억제제가 두 치료 집단에서 사용될 수 있다. 본 연구의 기간은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되고, 이때 초기 연구의 말기에서 표시된 반응자들은 계속된 치료를 제공받는다. 추가 결과 측정치는 다음과 같다:
일차 결과 측정치: 무진행 생존. 본 연구의 한 목적은 플라세보와 비교될 때 항-CD105 항체를 사용한 치료 후 무진행 생존의 증가를 입증하는 것이다.
평가될 수 있는 이차 결과 측정치는 반응의 지속시간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존, 심각한 부작용 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들면, 치료는 질환의 진행을 예방할 수 있거나(즉, 정체) 개선을 발생시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하기 측정치들 중 하나 이상에 대하여 다른 목적들이 측정될 수 있다: 감소된 종양 존재량, 감소된 신생혈관형성, 감소된 부작용, 감소된 불리한 반응 및/또는 증가된 환자 순응성.
실시예 14: 간세포암에 대한 임상 시험
본 실시예는 간세포암(간암)을 갖는 환자에서 항-CD105 항체의 안전성 및 효능의 예비 평가를 제공하도록 디자인된 무작위배정 맹검 플라세보-대조 다중심 II 기 연구를 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자들이 등록되고, 이때 약 50명 내지 약 400명의 환자들이 치료군으로 배정되고, 약 50명 내지 약 400명의 환자들이 플라세보 군으로 배정된다. VEGF 억제제가 두 군에서 사용될 수 있다. 상기 시험은 1주 내지 3주마다 또는 진행될 때까지 약 0.1 내지 약 30 mg/kg의 정맥내 반복 용량의 항-CD105 항체 또는 플라세보의 투여로 구성될 것이다. 본 연구의 기간은 약 6개월 내지 약 5년으로 추정되고, 이때 초기 연구의 말기에서 표시된 반응자들은 계속된 치료를 제공받는다. 추가 결과 측정치는 다음과 같다:
일차 결과 측정치: 무진행 생존. 본 연구의 한 목적은 플라세보와 비교될 때 항-CD105 항체를 사용한 치료 후 무진행 생존의 증가를 입증하는 것이다.
평가될 수 있는 이차 결과 측정치는 반응의 지속시간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존, 심각한 부작용 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들면, 치료는 질환의 진행을 예방할 수 있거나(즉, 정체) 개선을 발생시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하기 측정치들 중 하나 이상에 대하여 다른 목적들이 측정될 수 있다: 감소된 종양 존재량, 감소된 신생혈관형성, 감소된 부작용, 감소된 불리한 반응 및/또는 증가된 환자 순응성.
실시예 15: 난소암에 대한 임상 시험
본 실시예는 난소암을 갖는 환자에서 항-CD105 항체의 안전성 및 효능의 예비 평가를 제공하도록 디자인된 무작위배정 맹검 플라세보-대조 다중심 II 기 연구를 기술한다. 대략 약 100명 내지 약 800명의 환자들이 등록되고, 이때 약 50명 내지 약 400명의 환자들이 치료군으로 배정되고, 약 50명 내지 약 400명의 환자들이 플라세보 군으로 배정된다. 상기 시험은 5 주기 동안 1주 내지 3주마다 약 0.1 내지 약 30 mg/kg의 정맥내 반복 용량의 항-CD105 항체 또는 플라세보의 투여로 구성될 것이다. 화학치료도 두 치료 집단에서 사용될 수 있다. VEGF 억제제가 두 치료 집단에서 사용될 수 있다. 본 연구의 기간은 6개월 내지 약 5년으로 추정되고, 이때 초기 연구의 말기에서 표시된 반응자들은 계속된 치료를 제공받는다. 추가 결과 측정치는 다음과 같다:
일차 결과 측정치: 무진행 생존. 본 연구의 한 목적은 플라세보와 비교될 때 항-CD105 항체를 사용한 치료 후 무진행 생존의 증가를 입증하는 것이다.
평가될 수 있는 이차 결과 측정치는 반응의 지속시간, 종양 진행까지의 시간, 전체 생존, 심각한 부작용 및 심각하지 않은 부작용을 포함한다. 예를 들면, 치료는 질환의 진행을 예방할 수 있거나(즉, 정체) 개선을 발생시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 하기 측정치들 중 하나 이상에 대하여 다른 목적들이 측정될 수 있다: 감소된 종양 존재량, 감소된 신생혈관형성, 감소된 부작용, 감소된 불리한 반응 및/또는 증가된 환자 순응성.
실시예 16: 연령 관련 황반 변성의 치료
제1 연구
연령 관련 황반 변성을 나타내는 환자를 항-CD105 항체 또는 대조군 항체의 유리체내 주입으로 치료하여 신생혈관형성, 황반 질환 및 망막 손상의 발생을 감소시키거나 예방한다.
치료의 제1 단계로서, 환자는 눈 건강의 기준을 확립하기 위한 전체 안과 검사를 제공받아야 한다. 안과 검사는 간접적인 검안경검사, 슬릿-램프 생체현미경관찰, 말초 망막 검사, 안내압 측정, 시력(교정되지 않은 시력 및 가장 잘 교정된 시력) 종합적 증상, 안저촬영, 플루오레세인 혈관조영술, 광학 간섭 단층촬영, 망막전도검사 및 A-스캔 측정을 포함한다.
예비 검사 후, 전술된 유리체내 주입을, AMD를 나타내는 환자의 영향받은 눈에게 제공한다. 양눈이 영향받은 경우, 양눈을 별도로 치료할 수 있다. 안과 용액을 치료될 눈에 주입한다.
치료 후, 환자의 눈을 일(1)일째 날, 이(2)일째 날, 칠(7)일째 날, 십오(15)일째 날, 삼십(30)일째 날 및 육십(60)일째 날, 및 그 후 2년 동안 매월 검사해야 한다. 재발의 가능성 때문에, 그 후 환자는 매월 주기적 검사를 위해 되돌아와야 한다. 검사일마다 유리체 액화에 대해 환자를 모니터링한다. 추가로, 공막 누르기와 함께 간접적인 검안경검사를 이용하여 후방 유리체 탈착에 대해 환자를 모니터링한다. 마지막으로, 주기적 망막 검사, 광학 간섭 단층촬영 및 플루오레세인 혈관조영상을 통해 환자에 의해 제시된 AMD의 정도를 연속적으로 모니터링하여 망막하 유체, 혈액, 삼출물, RPE 탈착 또는 낭성 망막 변화의 존재, 또는 회녹색 망막하 신생혈관막의 존재에 대해 모니터링한다. 재발 신생혈관형성의 징후가 관찰되는 경우 추가 치료가 요구될 수 있다. 추가 치료는 매주 또는 매월 제공될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 초기 치료 후 1개월 내지 6개월의 간격을 두고 후속 치료가 제공된다.
제2 연구
목적: 신생혈관 연령 관련 황반 변성(AMD)의 치료를 위한 유리체내 항-CD105 항체의 효능을 입증하는 것이다. VEGF 억제제가 모든 환자들에서 사용될 수 있다.
방법: AMD로부터 발생되는 중심와하 맥락막 신생혈관형성(CNV)을 갖는 50명 내지 500명의 환자들(50개 내지 500개의 눈)이 승인된 장소에서 본 연구에 참여할 것이다.
재주입에 대한 기준은 황반에서의 유체의 존재, 100 마이크론 이상의 증가된 중심 망막 두께(CRT), 황반에서의 증가된 유체와 관련된 5개 문자 이상의 시력 손실, 새로운 전형적 CNV, 또는 새로운 황반 출혈이다. 주요 결과 측정치는 12개월 후 15개 문자 미만의 시력을 손실하는 눈의 비율이다. 가장 잘 교정된 시력 측정 및 임상 눈 검사를 1주 또는 1개월에서 수행한 후, 5개월 내지 12개월 동안 매달 수행한다.
평균 시력 및 평균 CRT를 기준과 비교하여 측정한다. 눈 및/또는 전신 부작용을 인지한다.
실시예 17: 인간화된-탈면역화된 항체 서열
단리된 인간화된-탈면역화된 항-CD105 항체는 서열 번호 11로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
Figure 112015032373064-pct00021
인간화된-탈면역화된 중쇄의 다른 비-한정적 예로는 서열 번호 13, 14, 15 및 16이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
Figure 112015032373064-pct00022
인간화된-탈면역화된 경쇄의 다른 비-한정적 예로는 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
Figure 112015032373064-pct00023
본원에 기재된 실시양태들의 양태는 그의 사상 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서 다른 형태로 구현될 수 있거나 다른 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 모든 양태에서 예시되고 한정되지 않는 것으로서 간주되어야 하고, 균등론의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화들이 본 개시내용에 포함되기 위한 것이다.
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Claims (105)

  1. 25 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖의 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 10 mM 내지 20 mM의 완충제, 최대 240 mM의 폴리올, 및 4.0 내지 5.5의 pH를 포함하며, 상기 완충제는 아세테이트 또는 히스티딘이고, 상기 폴리올은 트레할로스 또는 소르비톨인 제제.
  2. 제1항에 있어서, 2 내지 8℃에서 12개월 이상 동안 저장 후 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정될 때 항-CD105 항체의 95% 이상이 단량체로서 존재하는 것인 제제.
  3. 제1항에 있어서, 25℃에서 6개월 이상 동안 저장 후 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정될 때 항-CD105 항체의 95% 이상이 단량체로서 존재하는 것인 제제.
  4. 제1항에 있어서, 25℃에서 6개월 이상 동안 저장 후 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정될 때 항-CD105 항체의 90% 이상이 단량체로서 존재하는 것인 제제.
  5. 제1항에 있어서, 완충제가 히스티딘인 제제.
  6. 제1항에 있어서, 완충제가 아세테이트이고 pH가 4인 제제.
  7. 제1항에 있어서, 완충제가 히스티딘이고 pH가 5.5인 제제.
  8. 제1항에 있어서, 항-CD105 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2 내지 8℃에서 12개월 이상 동안 저장 후 CD105 ELISA 결합 분석에 의해 50% 내지 150% 결합을 나타내는 것인 제제.
  9. 제1항에 있어서, 항-CD105 항체의 평균 등전점(pI)이 모세관 전기영동-등전 포커싱으로 측정될 때 2 내지 8℃에서 12개월 이상 동안 저장 후 8.7 내지 9.2인 제제.
  10. 제1항에 있어서, 항-CD105 항체가 서열 번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 서열 번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역(CL); 서열 번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 불변 영역(Fc)을 포함하는 것인 제제.
  11. 제1항에 있어서, 항-CD105 항체가 서열 번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열 번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 서열 번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 번호 10으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 것인 제제.
  12. 제1항에 있어서, 25 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제제.
  13. 제1항에 있어서, 50 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제제.
  14. 제1항에 있어서, 100 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 제제.
  15. 제1항에 있어서, 완충제가 아세테이트인 제제.
  16. 제1항에 있어서, 20 mM의 히스티딘 또는 아세테이트를 포함하는 제제.
  17. 제1항에 있어서, 제제가 유리체내 또는 정맥내 투여를 위해 제제화된 것인 제제.
  18. 제1항에 있어서, 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 제제.
  19. 제18항에 있어서, 담체 또는 부형제가 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 제제.
  20. 제1항에 있어서, 등장성 또는 고장성인 제제.
  21. 제1항에 있어서, 폴리올은 240 mM 미만이고, 제제는 염을 이용하여 등장성으로 제조된 것인 제제.
  22. 제1항에 있어서, 제제의 동결 및 해동 주기 이후 SEC로 측정될 때 항-CD105 항체의 95% 이상이 단량체로서 존재하는 것인 제제.
  23. 제1항에 있어서, 교반 스트레스를 받은 경우 SEC로 측정될 때 항-CD105 항체의 95% 이상이 단량체로서 존재하는 것인 제제.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 제1항에 있어서, 240 mM의 트레할로스 또는 소르비톨을 포함하는 제제.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 제1항에 있어서, 계면활성제를 추가로 포함하는 제제.
  31. 제30항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 플루로닉(Pluronic)® F68인 제제.
  32. 제1항 내지 제23항, 제27항, 제30항 및 제31항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는, 정맥내 또는 유리체내 투여에 적합한 예비충전된(pre-filled) 주사기.
  33. 제1항 내지 제4항, 제8항, 제9항, 제18항 내지 제20항, 제22항 및 제23항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는, 혈관신생 관련 질환을 치료하기 위한 약제로서, 상기 혈관신생 관련 질환은 암 또는 암의 전이, 또는 혈관신생과 관련된 안과적 병태(ophthalmologic condition)인 약제.
  34. 제33항에 있어서, 제제 중의 항-CD105 항체가 서열 번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 서열 번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역(CL); 서열 번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 불변 영역(Fc)을 포함하는 것인 약제.
  35. 제33항에 있어서, 제제 중의 항-CD105 항체가 서열 번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열 번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 서열 번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 번호 10으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 것인 약제.
  36. 제33항에 있어서, 제제가 25 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 약제.
  37. 제33항에 있어서, 제제가 50 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 약제.
  38. 제33항에 있어서, 제제가 100 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 약제.
  39. 제33항에 있어서, 제제가 240 mM 미만의 폴리올을 포함하고 염을 이용하여 등장성으로 제조된 것인 약제.
  40. 삭제
  41. 제33항에 있어서, 제제가 20 mM의 히스티딘 또는 아세테이트를 포함하는 것인 약제.
  42. 삭제
  43. 삭제
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  45. 제33항에 있어서, 제제가 240 mM의 트레할로스 또는 소르비톨을 포함하는 것인 약제.
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 제33항에 있어서, 제제가 유리체내 또는 정맥내 투여를 위해 제제화된 것인 약제.
  49. 제33항에 있어서, 제제가 계면활성제를 추가로 포함하는 것인 약제.
  50. 제49항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 플루로닉® F68인 약제.
  51. 제33항에 있어서, 혈관신생 관련 질환이 암 또는 암의 전이인 약제.
  52. 제51항에 있어서, 암이 고형 종양인 약제.
  53. 제51항에 있어서, 암이 상피 기원의 암인 약제.
  54. 제51항에 있어서, 암이 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 대장암, 전립선암, 신장암, 두부암, 간암, 또는 뇌암인 약제.
  55. 제51항에 있어서, 암이 흑색종, 림프종, 육종, 또는 골수종인 약제.
  56. 제33항에 있어서, 혈관신생 관련 질환이 안과적 병태(ophthalmologic condition)인 약제.
  57. 제56항에 있어서, 안과적 병태가 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 또는 맥락막 신생혈관형성인 약제.
  58. 제57항에 있어서, 연령 관련 황반 변성(AMD)이 습성 AMD 또는 건성 AMD인 약제.
  59. 제33항에 있어서, 제제가 환자에게 1회 이상 투여를 위해 제제화된 것인 약제.
  60. 제33항에 있어서, 제제가 매일 1회, 매주 1회, 매월 1회, 격월로 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회 또는 6개월마다 1회 투여를 위해 제제화된 것인 약제.
  61. 제33항에 있어서, 제제는 혈관신생 관련 질환의 하나 이상의 징후 또는 증상이 감소될 때까지 투여를 위해 제제화된 것이고, 상기 혈관신생 관련 질환은 안과적 병태인 약제.
  62. 제61항에 있어서, 하나 이상의 징후 또는 증상이 혈관의 수축, 안 질환과 관련된 내피세포 증식의 억제, 출혈의 징후 또는 증상의 제거, 뿌옇게 보이는 증상의 치료, 시력 손실의 정체 제공, 시력의 개선, 혈관 누출의 예방 또는 이들의 조합인 약제.
  63. 제33항에 있어서, 치료가 환자의 상태를 개선하고 하기 인자들 중 하나 이상이 발생하였는지를 확인함으로써 평가될 수 있는 것인 약제: 감소된 세포 증식, 감소된 세포 수, 증가된 아폽토시스, 또는 세포 증식성 장애를 포함하는 세포의 적어도 일부의 감소된 생존.
  64. 제33항에 있어서, 치료가 i) 암 또는 암의 전이를 부분적으로 또는 전체적으로 제거하는 것; ii) 환자의 생존을 연장시키는 것; 또는 iii) 상기 i) 및 ii) 모두인 약제.
  65. 제1항 내지 제9항, 제12항 내지 제20항, 제22항, 제23항, 제27항, 제30항 및 제31항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는, 안과적 병태를 치료하기 위한 약제.
  66. 제65항에 있어서, 안과적 병태가 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증 또는 맥락막 신생혈관형성인 약제.
  67. 제66항에 있어서, 연령 관련 황반 변성(AMD)이 습성 AMD 또는 건성 AMD인 약제.
  68. 제65항에 있어서, 제제 중의 항-CD105 항체가 서열 번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 서열 번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역(CL); 서열 번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 불변 영역(Fc)을 포함하는 것인 약제.
  69. 제65항에 있어서, 제제 중의 항-CD105 항체가 서열 번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열 번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 서열 번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 번호 10으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 것인 약제.
  70. 제65항에 있어서, 하나 이상의 징후 또는 증상이 혈관의 수축, 안 질환과 관련된 내피세포 증식의 억제, 출혈의 징후 또는 증상의 제거, 뿌옇게 보이는 증상의 치료, 시력 손실의 정체 제공, 시력의 개선, 혈관 누출의 예방 또는 이들의 조합인 약제.
  71. 제65항에 있어서, 제제가 240 mM 미만의 폴리올을 포함하고 염을 이용하여 등장성으로 제조된 것인 약제.
  72. 제1항 내지 제4항, 제8항, 제9항, 제18항 내지 제20항, 제22항, 및 제23항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는, 암 또는 암의 전이를 치료하기 위한 약제.
  73. 제72항에 있어서, 제제 중의 항-CD105 항체가 서열 번호 1로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 서열 번호 2로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 불변 영역(CL); 서열 번호 3으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 서열 번호 4로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 불변 영역(Fc)을 포함하는 것인 약제.
  74. 제72항에 있어서, 제제 중의 항-CD105 항체가 서열 번호 5로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; 서열 번호 6으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 서열 번호 7로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3; 서열 번호 8로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; 서열 번호 9로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 서열 번호 10으로서 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 것인 약제.
  75. 제72항에 있어서, 제제는 대상체에 투여될 때 대상체의 수명을 연장시키는 것인 약제.
  76. 제72항에 있어서, 암이 일차 종양 또는 전이성 종양인 약제.
  77. 제72항에 있어서, 암이 고형 종양인 약제.
  78. 제77항에 있어서, 고형 종양이 피부, 폐, 췌장, 유방, 난소, 결장, 직장, 위, 갑상선, 후두, 전립선, 머리, 목, 눈, 입, 인후, 식도, 흉부, 뼈, 고환, 림프, 골수, 결합조직, 땀샘, 간, 신장, 및 뇌로 이루어진 군에서 선택된 조직 또는 장기의 고형 종양인 약제.
  79. 제78항에 있어서, 고형 종양이 피부, 폐, 췌장, 유방, 난소, 결장, 직장, 위, 갑상선, 후두, 전립선, 머리, 목, 눈, 입, 인후, 식도, 흉부, 뼈, 고환, 림프, 골수, 결합조직, 땀샘, 간, 신장, 및 뇌로 이루어진 군에서 선택된 조직 또는 장기의 전이인 약제.
  80. 제72항에 있어서, 제제를 이용한 치료가 대상체의 상태를 개선하고 하기 인자들 중 하나 이상이 발생하였는지를 확인함으로써 평가될 수 있는 것인 약제: 감소된 세포 증식, 감소된 세포 수, 증가된 아폽토시스, 또는 세포 증식성 장애를 포함하는 세포의 적어도 일부의 감소된 생존.
  81. 제72항에 있어서, 제제를 이용한 치료가 i) 암 또는 암의 전이를 부분적으로 또는 전체적으로 제거하는 것; ii) 환자의 생존을 연장시키는 것; 또는 iii) 상기 i) 및 ii) 모두인 약제.
  82. 제72항에 있어서, 제제가 25 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 약제.
  83. 제72항에 있어서, 제제가 50 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 약제.
  84. 제72항에 있어서, 제제가 100 mg/㎖의 항-CD105 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 약제.
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  86. 제72항에 있어서, 제제가 20 mM의 히스티딘 또는 아세테이트를 포함하는 것인 약제.
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  90. 제72항에 있어서, 제제가 240 mM의 트레할로스 또는 소르비톨을 포함하는 것인 약제.
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  93. 제72항에 있어서, 제제가 240 mM 미만의 폴리올을 포함하고 염을 이용하여 등장성으로 제조된 것인 약제.
  94. 제72항에 있어서, 제제가 계면활성제를 추가로 포함하는 것인 약제.
  95. 제94항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 또는 플루로닉® F68인 약제.
  96. 제72항에 있어서, 제제가 정맥내 투여를 위해 제제화된 것인 약제.
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