EA029214B1 - Композиции антител и их применения - Google Patents

Композиции антител и их применения Download PDF

Info

Publication number
EA029214B1
EA029214B1 EA201590412A EA201590412A EA029214B1 EA 029214 B1 EA029214 B1 EA 029214B1 EA 201590412 A EA201590412 A EA 201590412A EA 201590412 A EA201590412 A EA 201590412A EA 029214 B1 EA029214 B1 EA 029214B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
composition according
antibody
antibodies
cells
Prior art date
Application number
EA201590412A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201590412A1 (ru
Inventor
Сюзан Бенедикт
Марк Корнелл Мэннинг
Брайан М. Мерфи
Шэрон Риал
Чарльз Тьюэр
Original Assignee
Тракон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Тракон Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Тракон Фармасьютикалз, Инк.
Publication of EA201590412A1 publication Critical patent/EA201590412A1/ru
Publication of EA029214B1 publication Critical patent/EA029214B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к композициям антител против CD105 и к их применениям. Другой аспект относится к предварительно заполненным шприцам с композициями антител против CD105. Другой аспект относится к применению композиций для ослабления одного или более чем одного признака или симптома расстройства, связанного с ангиогенезом, такого как раковые заболевания и офтальмологические заболевания.

Description

Изобретение относится к композициям антител против СИ105 и к их применениям. Другой аспект относится к предварительно заполненным шприцам с композициями антител против СИ105. Другой аспект относится к применению композиций для ослабления одного или более чем одного признака или симптома расстройства, связанного с ангиогенезом, такого как раковые заболевания и офтальмологические заболевания.
029214 Β1
029214
Перекрестная ссылка
В данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/697111, поданной 5 сентября 2012 г., которая включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте.
Данная заявка относится к следующим одновременно рассматриваемым патентным заявкам: публикации США № И8 2010-0098692 А1 [№ патентного реестра 35882-706.201]; патенту США № 8221753 [№ патентного реестра 35882-706.202]; заявке на патент США № 13/485702 [№ патентного реестра 35882706.301] и заявке на патент США № 13/390896 [№ патентного реестра 35882-712.201], которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в формате А8СП посредством ЕР8-\УсЬ и является тем самым включенным посредством ссылки во всей его полноте. Указанная копия А8СП, созданная 4 сентября 2013 года, названа 35882-714.601_§Ь.1х1 и имеет размер 22121 байт.
Предшествующий уровень техники
Рак является второй после коронарной болезни ведущей причиной смерти человека. Миллионы людей умирают от рака во всем мире каждый год. В одних Соединенных Штатах каждый год рак приводит к смерти значительно более чем полумиллиона человек, причем в год диагностируются примерно 1,4 миллиона новых случаев. В то время как смерти от сердечных заболеваний значимо снижались, число смертей от рака, в общем, увеличивается. Во многих странах рак уже является ведущей причиной смерти.
Кроме того, даже для тех раковых пациентов, которые первоначально пережили их первичные раковые заболевания, обычный опыт показывает, что их жизни значительно изменяются. Многие раковые пациенты испытывают сильную тревожность, обусловленную осознанием возможности рецидива или неблагоприятного исхода лечения. Многие раковые пациенты испытывают значительное физическое истощение после лечения.
В общих чертах, фундаментальной проблемой в лечении самых смертельных раковых заболеваний является отсутствие эффективных и нетоксичных системных терапий. Рак представляет собой комплексное заболевание, характеризуемое генетическими мутациями, которые приводят к неконтролируемому росту клеток. Раковые клетки присутствуют во всех организмах, и при нормальных условиях их избыточный рост четко регулируется различными физиологическими факторами.
Ангиогенез представляет собой физиологический процесс, посредством которого новые кровеносные сосуды развиваются из предсуществующих сосудов. Предполагается, что ангиогенез играет роль как в нормальных, так и в патологических процессах. Например, ангиогенные процессы участвуют в развитии сосудистых систем органов и тканей животных.
При определенных патологических состояниях ангиогенез стимулируется как средство обеспечения адекватного снабжения клеток в пораженной ткани кровью и питательными веществами. Во многих из этих патологических состояний участвуют нарушенная пролиферация клеток и/или регуляция. Солидные раковые заболевания и экссудативная дегенерация желтого пятна зависят от организации новой поставки крови для длительного роста, а также метастазирования.
Краткое изложение сущности изобретения
В одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом, содержащая от примерно 1 до примерно 100 мг/мл антитела против СО 105, вплоть до примерно 100 мМ забуферивающего агента, вплоть до примерно 1М полиола, и имеющая рН от примерно 4,0 до примерно 5,5.
В одном воплощении композиции по изобретению указанный забуферивающий агент представляет собой гистидин.
В еще одном воплощении композиции по изобретению забуферивающий агент представляет собой ацетат и рН составляет примерно 4.
В еще одном воплощении композиции по изобретению забуферивающий агент представляет собой гистидин и рН составляет примерно 5,5.
В одном воплощении композиции по изобретению указанное антитело против СО105 содержит вариабельную область легкой цепи (УД имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕС 10 N0: 1, константную область легкой цепи (СД имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Еф ГО N0: 2, вариабельную область тяжелой цепи (Ун), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Еф ГО N0: 3, и константную область (Ре), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Еф ГО N0: 4.
В еще одном воплощении композиции по изобретению указанное антитело против СО105 содержит СОК1 (определяющая комплементарность область 1) Уъ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как §Е(3 ГО N0: 5, СОК2 Уъ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Еф ГО N0: 6, СОК3 Уъ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Еф ГО N0: 7, СОК1 Ун, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Еф ГО N0: 8, СОК2 Ун, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Еф
- 1 029214
ΙΌ N0: 9, и СЭЕ3 νΗ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как §Еф ГО N0: 10.
В одном воплощении композиция по изобретению содержит примерно 25 мг/мл, примерно 50 мг/мл или примерно 100 мг/мл антитела против СГО105.
В одном воплощении композиция по изобретению содержит забуферивающий агент, представляющий собой гистидин или ацетат.
В предпочтительном воплощении композиция по изобретению содержит примерно 20 мМ гистидин или ацетат.
В одном воплощении изобретения композиция изготовлена для интравитреального или внутривенного введения.
В еще одном воплощении композиция дополнительно содержит приемлемый носитель или эксципиент.
В предпочтительном воплощении композиция по изобретению содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
В одном воплощении изобретения композиция является изотоничной или гипертоничной.
В одном воплощении изобретения количество полиола в композиции по изобретению составляет меньше чем 300 мМ и данная композиция сделана изотоничной с использованием соли.
В конкретном воплощении композиции полиол представляет собой сахар.
В более конкретном воплощении указанный сахар представляет собой невосстанавливающий сахар.
В еще более конкретном воплощении невосстанавливающий сахар представляет собой трегалозу или сахарозу.
В еще одном конретном воплощении сахар представляет собой сорбит.
В еще одном воплощении композиция по изобретению дополнительно содержит поверхностноактивное вещество.
В предпочтительном воплощении поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20, полисорбат 80 или Иитошс® Р68.
В еще одном воплощении композиция по изобретению предназначена для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом и представляющего собой рак, в том числе метастазирующий.
В конкретном воплощении изобретения рак представляет собой солидную опухоль.
В еще одном конкретном воплощении изобретения рак имеет эпителиальное происхождение.
В еще одном конкретном воплощении изобретения рак представляет собой рак легкого, меланому, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак матки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, рак печени, саркому, миелому, рак мозга или лимфому.
В еще одном воплощении композиция по изобретению предназначена для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом и представляющего собой офтальмологическое состояние.
В конкретном воплощении изобретения офтальмологическое состояние представляет собой возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию или хороидальную неоваскуляризацию.
В более конкретном воплощении изобретения указанная возрастная дегенерация желтого пятна (ΑΜΌ) представляет собой влажную ΑΜΌ или сухую ΑΜΌ.
В еще одном аспекте изобретения предложен предварительно заполненный шприц, подходящий для внутривенного введения, содержащий композицию по изобретению.
В еще одном аспекте изобретения предложен предварительно заполненный шприц, подходящий для внутривенного введения, содержащий композицию по изобретению, где композиция содержит примерно 25 мг/мл или примерно 50 мг/мл анти-СГО105 антитела.
В еще одном аспекте изобретения предложено применение композиции по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом.
В конкретном воплощении изобретения композицию применяют для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом и представляющего собой рак, в том числе метастазирующий.
В конкретном воплощении изобретения композицию применяют для лечения солидной опухоли.
В еще одном конкретном воплощении изобретения композицию применяют для лечения рака эпителиального происхождения.
В еще одном конкретном воплощении изобретения композицию применяют для лечения рака представляющего собой рак легкого, меланому, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак матки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, рак печени, саркому, миелому, рак мозга или лимфому.
В одном конкретном воплощении изобретения композицию применяют для лечения заболевание, связанного с ангиогенезом и представляющего собой офтальмологическое состояние.
В еще одном конкретном воплощении изобретения композицию применяют для лечения офтальмологического состояния представляющего собой возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию или хороидальную неоваскуляризацию.
В еще одном конкретном воплощении изобретения указанная возрастная дегенерация желтого пятна (ΑΜΌ) представляет собой влажную ΑΜΌ или сухую ΑΜΌ.
- 2 029214
Включение посредством ссылки
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании изобретения, включены сюда посредством ссылки в той же самой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана как включенная посредством ссылки.
Краткое описание графических материалов
Новые характеристики воплощений подробно изложены в приложенной формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящих воплощений можно получить посредством ссылки на следующее подробное описание, которое излагает иллюстративные воплощения, в которых используются принципы воплощений, и на сопровождающие графические материалы, в которых
на фиг. 1А-Й приведены типичные аминокислотные последовательности описанного здесь антитела против СО 105 (ТКС105). Фиг. 1А представляет репрезентативную вариабельную область легкой цепи (УЪ) антитела против СЭ105 (8ЕС ГО N0: 1); фиг. 1Б представляет репрезентативную константную область легкой цепи (СЬ) антитела против СГО105 (8ЕС ГО N0: 2); фиг. 1В представляет репрезентативную вариабельную область тяжелой цепи (УН) антитела против СГО105 (8ЕС ГО N0: 3), и фиг. 1Г представляет репрезентативную константную область гамма-1 тяжелой цепи антитела против СГО105 (8ЕС ГО N0: 4). Фиг. 1Д-Ж представляют СОК 1, 2 и 3 УЪ соответственно. Фиг. 13-Й представляют СОК 1, 2 и 3 УН соответственно;
на фиг. 2 - диаграмма сигнального пути Τ0Ρ-β/ΑΤΚ5. Путь Τ0Ρ-βΑΕΚ5 (А) приводит к ингибированию пролиферации клеток. Путь Τ0Ρ-β/ΑΡΚ1 (Б) индуцирует пролиферацию эндотелиальных клеток и требует СГО105 (эндоглин) для сигнализации АЬК1. Пунктирные линии указывают неактивные или заблокированные пути. Жирная стрелка указывает стимуляцию сигнального пути.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что использованная здесь терминология служит лишь для описания конкретных воплощений и не предназначена для того, чтобы быть ограничивающей. Кроме того, понятно, что в воплощении настоящих изобретений на практике можно использовать целый ряд способов и материалов, аналогичных или эквивалентных описанным здесь способам и материалам.
Согласно настоящей заявке можно использовать традиционные методики клеточной биологии, молекулярной биологии, микробиологии и генной инженерии, как подробно описано в данной области.
Формы в единственном числе в том виде, в котором они используются в данном описании изобретения и приложенной формуле изобретения, включают ссылки во множественном числе, если контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, ссылки на "способ" включают один или более чем один способ и/или стадию описанного здесь типа, и/или которые станут очевидными специалистам в данной области при прочтении данного описания.
Антитела против СО 105 можно использовать для лечения или предупреждения разных форм расстройств, связанных с ангиогенезом. Здесь описаны способы лечения разных форм рака, солидных опухолей и метастазов, и тому подобного посредством введения описанных здесь композиций.
Терминология, относящаяся к антителам.
Термин "антитело" в том виде, как он здесь используется, относится к иммуноглобулину (1д), независимо от того, является ли он природным или частично, или полностью синтетически продуцированным. Данный термин также охватывает любой полипептид или белок, имеющий связывающий домен, который представляет собой антигенсвязывающий домен или гомологичен антигенсвязывающему домену. Данный термин также включает "антигенсвязывающие фрагменты" и другие взаимозаменяемые термины для аналогичных связывающих фрагментов, таких как описанные ниже.
Нативные антитела и нативные иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (Ь) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь типично связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как число дисульфидных связей среди тяжелых цепей иммуноглобулинов разных изотипов варьирует. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет внутрицепочечные дисульфидные мостики на регулярном расстоянии друг от друга. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен ("УН" или "УН"), с последующим рядом константных доменов ("СН" или "СН"). Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен ("Уъ" или "УЬ") и константный домен ("Сь" или "СЬ") на ее другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что поверхность соприкосновения между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепи формируют конкретные аминокислотные остатки.
Термины "синтетический полинуклеотид", "синтетический ген" или "синтетический полипептид" в том виде, как они здесь используются, означают то, что соответствующая полинуклеотидная последовательность или ее часть, или аминокислотная последовательность или ее часть происходят из последовательности, которая была сконструирована или синтезирована 4с ηονο, или модифицирована по сравнению с эквивалентной последовательностью, встречающейся в природе.
- 3 029214
Синтетические полинуклеотиды (антитела или антигенсвязывающие фрагменты) или синтетические гены могут быть получены известными в данной области способами, включая химический синтез нуклеиновокислотной последовательности или аминокислотной последовательности, но не ограничиваясь ими. Синтетические гены типично отличаются от встречающихся в природе генов либо на аминокислотном, либо на полинуклеотидном уровне (либо на обоих) и типично локализуются в контексте синтетических последовательностей контроля экспрессии. Полинуклеотидные последовательности синтетических генов не обязательно могут кодировать белки с другими аминокислотами по сравнению с природным геном; например, они также могут охватывать синтетические полинуклеотидные последовательности, которые включают другие кодоны, но которые кодируют ту же самую аминокислоту (т.е. нуклеотидные замены представляют молчащие мутации на аминокислотном уровне).
В том, что касается антител, термин "вариабельный домен" относится к вариабельным доменам антител, которые используются при связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность не распределена по всем вариабельным доменам антител равномерно. Наоборот, она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями (также известными как СОК), в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называют "каркасными областями" или "РК". Каждый из вариабельных доменов немодифицированных тяжелых и легких цепей содержит четыре РК (РК1, РК2, РК3 и РК4), принимающих, главным образом, β-складчатую конфинурацию, перемежающихся с тремя СОК, которые образуют петли, соединяющие и, в некоторых случаях, являющиеся частью β-складчатой структуры. СОК в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости посредством РК и, с СОК из другой цепи, способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (см. КаЬа! с1 а1., Зециеисез οί Рго1ешз οί 1штиио1од1са1 йИегезк 5ΐΗ Εά. РиЪйс НеаЙЬ Зету1се, Ναΐίοηαΐ 1изй1и1ез οί НеаЙЬ, ВеШезйа, Μά. (1991), страницы 647-669).
Термины "гипервариабельная область" и "СОК", при использовании здесь, относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. СОК содержат аминокислотные остатки из трех областей последовательности, которые комплементарно связываются с антигеном и известны как СОК1, СОК2 и СОК3 для каждой из цепей УН и Уь. В вариабельном домене легкой цепи СОК типично соответствуют приблизительно остаткам 24-34 (СОКЬ1), 50-56 (СОКЬ2) и 89-97 (СОКЬЗ), и в вариабельном домене тяжелой цепи СОК типично соответствуют приблизительно остаткам 31-35 (СОКН1), 50-65 (СОКН2) и 95-102 (СОКН3) согласно КаЬа! е1 а1., Зециеисез οί Рго1етз οί Iттииο1οд^са1 1и1егез1, 5ΐΗ Εά. РиЪйс НеаЙЬ Зетуюе, №-Июпа1 1изй1и1ез οί НеаЙЬ, ΒеΐЬезάа, Μά. (1991). Понятно, что СОК разных антител могут содержать вставки, таким образом, нумерация аминокислот может отличаться. Система нумерации КаЬа! учитывает такие вставки, представляя собой схему нумерации, в которой используются буквы, связанные с конкретными остатками (например, 27А, 27В, 27С, 270, 27Е и 27Р СОКЕ1 в легкой цепи) для того, чтобы отражать любые вставки в нумерациях при сравнении разных антител. В качестве альтернативы, в вариабельном домене легкой цепи СОК типично соответствуют приблизительно остаткам 26-32 (СОКЬ1), 50-52 (СОКЬ2) и 91-96 (СОКЬ3), и в вариабельном домене тяжелой цепи СОК типично соответствуют приблизительно остаткам 26-32 (СОКН1), 53-55 (СОКН2) и 96101 (СОКН3) согласно С^Ша, Ьезк, 1. Μο1. Βίο1., 196: 901-917 (1987).
Термин "каркасная область" или "РК" в том виде, как он здесь используется, относится к аминокислотным остаткам каркасной области, которые образуют часть антигенсвязывающего кармана или бороздки. В некоторых воплощениях каркасные остатки образуют петлю, которая представляет собой часть антигенсвязывающего кармана или бороздки, и аминокислотные остатки в данной петле могут контактировать или могут не контактировать с антигеном. Каркасные области обычно содержат области между СОК. В вариабельном домене легкой цепи РК типично соответствуют приблизительно остаткам 0-23 (РКЬ1), 35-49 (РКЬ2), 57-88 (РКЬ3) и 98-109, и в вариабельном домене тяжелой цепи РК типично соответствуют приблизительно остаткам 0-30 (РКН1), 36-49 (РКН2), 66-94 (РКН3) и 103-133 согласно КаЬа! е1 а1., Зециеисез οί Рго1етз οί Iттииο1οд^са1 1и1егез1, 5ТЬ Εά. РиЪйс НеаЙЬ Зетуюе, Ν;·ιΙίοη;ά 1пзШШез οί НеаНЬ, ΒеίЬезάа, Μά. (1991). Как обсуждалось выше в отношении нумерации легкой цепи по КаЬа1, в тяжелой цепи вставки также учитываются аналогичным образом (например, 35 А, 35В СОКН1 в тяжелой цепи). В качестве альтернативы, в вариабельном домене легкой цепи РК типично соответствуют приблизительно остаткам 0-25 (РКЬ1), 33-49 (РКЬ2), 53-90 (РКЬ3) и 97-109 (РКЬ4), и в вариабельном домене тяжелой цепи РК типично соответствуют приблизительно остаткам 0-25 (РКН1), 33-52 (РКН2), 56-95 (РКН3) и 102-113 (РКН4) согласно С^Ша, Ьезк, 1. Μο1. Βίο1., 196: 901-917 (1987).
Константные домены (Рс) антител не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но, скорее, демонстрируют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности посредством взаимодействий с, например, рецепторами Рс (РсК). Домены Рс также могут увеличивать биодоступность антитела в системе кровообращения после введения пациенту. Замена мышиного домена Рс человеческим доменом Рс также может уменьшать побочные реакции НАМА (человеческих противомышиных антител).
Иммуноглобулины можно приписывать к разным классам в зависимости от аминокислотной после- 4 029214
довательности константного домена их тяжелых цепей. Существует пять главных классов иммуноглобулинов: 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1§С и 1дМ, и некоторые из них можно дополнительно разделять на подклассы (изотипы), например 1§С1, 1§С2, 1§С3, 1§С4, 1дА1 и 1дА2. Константные домены тяжелой цепи (Ре), которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.
"Легкие цепи" антител из любого вида позвоночных могут быть приписаны к одному из двух явно отличающихся типов, именуемых каппа или ("к") и лямбда или ("λ"), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.
Термины "антигенсвязывающая часть антитела", "антигенсвязывающий фрагмент", "антигенсвязывающий домен", "фрагмент антитела" или "функциональный фрагмент антитела" используются здесь взаимозаменяемо для отнесения к одному или более чем одному фрагменту антитела, который сохраняет способность специфично связываться с антигеном. Неограничивающие примеры фрагментов антитела, включенных в такие термины, включают (1) фрагмент РаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов Уъ, νΗ, Съ и СН1; (2) фрагмент Р(аЬ')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента РаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (3) фрагмент Ρά, состоящий из доменов νΗ и СН1; (4) фрагмент Ρν, содержащий домены V,, и νΗ одного плеча антитела; (5) фрагмент άАЬ (\УшЛ е! а1., (1989) №ш.1гс 341:544 546), который содержит домен νΗ; и (6) выделенная СОК, но не ограничиваются ими. Дополнительно включенными в данное определение являются "половинные" антитела, содержащие одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Здесь также охвачены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела.
Группировки "Р(аЬ')2" и "РаЬ" можно получать путем обработки 1д протеазой, такой как пепсин и папаин, и они включают фрагменты антител, полученные посредством расщепления иммуноглобулина около дисульфидных связей, существующих между шарнирными областями, в каждой из двух тяжелых цепей. Например, папаин расщепляет 1§С выше от дисульфидных связей, существующих между шарнирными областями, в каждой из двух тяжелых цепей, с получением двух гомологичных фрагментов антитела, в которых легкая цепь, состоящая из V и Сь (константная область легкой цепи), и фрагмент тяжелой цепи, состоящий из νΗ и области Свд (γ1) в константной области тяжелой цепи, соединены на их С-концевых областях дисульфидной связью. Каждый из двух данных гомологичных фрагментов антител называется РаЬ'. Пепсин также расщепляет 1§С ниже от дисульфидных связей, существующих между шарнирными областями, в каждой из двух тяжелых цепей с получением фрагмента антитела, немного большего, чем фрагмент, описанный выше, в котором два вышеупомянутых РаЬ' соединены в шарнирной области. Данный фрагмент антитела называется Р(аЬ')2.
Фрагмент РаЬ также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Фрагменты РаЬ' отличаются от фрагментов РаЬ добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена СН1 тяжелой цепи, включающих один или более чем один цистеин из шарнирной области антитела. РаЬ'-8Н представляет собой здесь обозначение РаЬ', в котором остаток(ки) цистеина константного домена несёт(ут) свободную тиольную группу. Фрагменты Р(аЬ')2 антитела исходно получали в виде пар фрагментов РаЬ', которые имеют между ними цистеины шарнирной области. Также известны другие химические сочетания фрагментов антитела.
"Εν" относится к фрагменту антитела, который содержит полный сайт распознавания антигена и связывания антигена. Данная область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной нековалентной или ковалентной ассоциации (РУ, связанные дисульфидной связью, были описаны в данной области, Кейет е! а1. (1996) Ыа!иге Вю!есйпо1о§у 14:1239-1245). Именно в этой конфигурации три СОК каждого вариабельного домена взаимодействуют с определением антигенсвязывающего сайта на поверхности димера νΕ-ν1. Совместно комбинация одной или более чем одной СОК из каждой цепи νΗ и ν2 придает антителу специфичность связывания антигена. Например, было бы понятным, что, например, СОКН3 и СОКЕ3 могли бы быть достаточными для придания антителу специфичности связывания антигена при переносе на цепи νΗ и ν2 антителареципиента или его антигенсвязывающего фрагмента, и данную комбинацию СОК можно тестировать на связывание, аффинность и т.д. с использованием любой из описанных здесь методик. Даже один вариабельный домен (или половина Βν, содержащая только три СОК, специфичных в отношении антигена) имеет способность распознавать и связывать антиген, хотя, вероятно, и с меньшей аффинностью, чем при объединении со вторым вариабельным доменом. Кроме того, несмотря на то что два домена фрагмента Ρν (ν и νΗ) кодируются отдельными генами, их можно соединить с использованием рекомбинантных способов посредством синтетического линкера, который позволяет сделать их в виде одной белковой цепи, в которой области М и νΗ формируют пару с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Ρν (8сΡν); Βίτά е! а1. (1988) 8с1епсе 242:423-426; Низ!оп е! а1. (1988) Ргос. Ыа!1. Асаά. 8с1. И8А 85:5879-5883 и ОзЬоитп е! а1. (1998) ΝηΙ. Вю!есйпо1. 16:778). Также подразумевается, что такие 8сΡν охвачены термином "антигенсвязывающая часть" антитела. Любые последовательности νΗ и ν2 специфичного 8сΡν могут быть связаны с кДНК (комплементарная ДНК) или геномными последовательностями области Рс для того, чтобы получать экспрессионные векторы, кодирующие молекулы
- 5 029214
полных Ι§ (например Ι§0) или других изотипов. Ун и Уъ также можно использовать в получении РаЬ, Ρν или других фрагментов Ι§ с использованием либо белковой химии, либо методик рекомбинантных ДНК.
Фрагменты антитела "одноцепочечный Ρν" или "δΡν" содержат домены Ун и Уъ антитела, где данные домены присутствуют в одной полипептидной цепи. В некоторых воплощениях полипетид Ρν дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами Ун и Уь, который позволяет δΡν формировать желаемую структуру для связывания антигена. Относительно обзора δΡν, см., например, Р1иск1Ьип, ТЬе РЬаттасо1оду οί Мопос1опа1 АпЬЬоФек, Уо1. 113, КокепЬитд апб Мооге е<8. §рттдет-Ует1ад, №\у Уотк, рр. 269-315 (1994).
Термин "АУОУТЕК™" относится к классу терапевтических белков человеческого происхождения, которые не являются родственными антителам или фрагментам антител и состоят из нескольких модульных и пригодных для многократного использования связывающих доменов, именуемых А-доменами (также именуемых модуль класса А, повтор типа комплемента или домен рецептора ЬОЬ (липопротеин низкой плотности) класса А). Их разработали из доменов внеклеточных человеческих рецепторов путем перетасовки экзонов ш уйго и фагового дисплея (ЗПуегтап е! а1., 2005, Ν;·ιΙ. Вю1есЬпо1. 23:1493-1494; δί1уегтап е! а1., 2006, Ν;·ιΙ. Вю1есЬпо1. 24:220). Образующиеся белки могут содержать множество независимых связывающих доменов, которые могут демонстрировать улучшенную аффинность (в некоторых случаях субнаномолярную) и специфичность по сравнению с белками, связывающими один эпитоп. См., например, публикации заявок на патент США № 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0053973 и 2005/0089932, 2005/0048512 и 2004/0175756, каждая из которых включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте.
Каждый из известных 217 человеческих А-доменов содержит приблизительно 35 аминокислот (приблизительно 4 кДа); и данные домены разделены линкерами, которые имеют в среднем пять аминокислот в длину. Нативные А-домены быстро и эффективно сворачиваются в однородную, стабильную структуру, опосредованную, в первую очередь, связыванием кальция и формированием дисульфидных связей. Для этой общей структуры требуется консервативный каркасный мотив лишь из 12 аминокслот. Конечным результатом является одна белковая цепь, содержащая множество доменов, каждый из которых представляет отдельную функцию. Каждый домен данных белков связывается независимо, и энергентические вклады каждого домена являются аддитивными. Данные белки были названы "АУТМЕК™" от авидных мультимеров.
Термин "диатела" относится к маленьким фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, содержащим вариабельный домен тяжелой цепи (Ун), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи в той же самой полипептидной цепи (УН-УЪ). Посредством применения линкера, который является слишком коротким для того, чтобы обеспечивать образование пары между двумя доменами на той же самой цепи, заставляют домены образовать пары с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела более подробно описаны, например, в ЕР 404097; \УО 93/11161 и НоШпдет е1 а1., Ргос. №11. Асаб. 8ά. И8А 90:6444 6448 (1993).
Антигенсвязывающие полипептиды также включают димеры тяжелой цепи, такие как, например, антитела от представителей семейства представителей семейства Верблюдовых и акул. Антитела представителей семейства Верблюдовых и акул содержат гомодимерную пару двух цепей из У-подобных и С-подобных доменов (ни одно не имеет легкой цепи). Поскольку область Ун димера тяжелых цепей 1§О у представителей семейства Верблюдовых не должна образовывать гидрофобных взаимодействий с легкой цепью, область в тяжелой цепи, которая обычно контактирует с легкой цепью, заменена у представителей семейства Верблюдовых гидрофильными аминокислотными остатками. Домены Ун димера тяжелых цепей 1§О называют доменами Унн. Ι§-ΝΑΚ акул содержат гомодимер из одного вариабельного домена (именуемого У-ΝΑΚ домен) и пяти С-подобных константных доменов (С-ΝΑΚ домены). У представителей семейства Верблюдовых разнообразие репертуара антител определяется СОК 1, 2 и 3 в областях Ун или Унн. СЭК3 в области Унн верблюда характеризуется ее относительно большой длиной, составляющей в среднем 16 аминокислот (МиуКеттапк е1 а1., 1994, Рто1ет Епдтеегтд 7(9): 1129). Это представляет собой отличие от областей СОК3 антител многих других видов. Например, СОК3 Ун мыши имеет в среднем 9 аминокислот. Библиотеки вариабельных областей антител, происходящих из представителей семейства Верблюдовых, которые сохраняют ш у1уо разнообразие вариабельных областей представителей семейства Верблюдовых, можно получать, например, способами, раскрытыми в заявке на патент США с серийным № 20050037421.
"Химерные" формы антител, не являющихся человеческими (например, мышиных), включают химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из 1д, не являющегося человеческим. Главным образом, химерные антитела представляют собой мышиные антитела, в которые вставлена по меньшей мере часть константной области (Рс) иммуноглобулина, типично по меньшей мере часть константной области человеческого иммуноглобулина, вместо мышиной Рс. Относительно подробностей, см. 1опе8 е1 а1., №1ите 321: 522-525 (1986); КеюЬтапп е1 а1., №1ите 332: 323-329 (1988) и Рте51а, Сигг. Ор. §1тис1. Бю1., 2: 593-596 (1992).
Термин "моноклональное антитело" в том виде, как он здесь используется, относится к антителу,
- 6 029214
полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных происходящих естественным образом мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от традиционных препаратов (поликлональных) антител, которые могут включать разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Модификатор "моноклональный" указывает характер антитела, как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требование получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным КоЫег е! а1., №-11игс 256:495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). В определенных воплощениях моноклональные антитела можно выделять из библиотек фаговых антител с использованием методик, описанных, например, в С1аск§ои е! а1., №Циге 352:624-628 (1991) и Магкк с! а1., 1. Мо1. Бю1. 222:581-597 (1991).
Антитела можно выделять и очищать из вышеупомянутых супернатанта культуры или асцитов посредством осаждения насыщенным сульфатом аммония, способом осаждения с эуглобулином, способом с капроновой кислотой, способом с каприловой кислотой, ионообменной хроматографией (на ΌΕΑΕ или ΌΕ52) или аффинной хроматографией с использованием колонки против 1д или колонки с белком Α, С или Ь, такой как описанная более подробно ниже.
При конструировании молекулы иммуноглобулина вариабельные области или их части можно сливать, соединять или иным образом связывать с одной или более чем одной константной областью или ее частью с получением любого из описанных здесь антител. Это можно осуществлять целым рядом способов, известных в данной области, включая методики молекулярного клонирования или прямого синтеза нуклеиновых кислот, кодирующих данные молекулы, но не ограничиваясь ими.
Термин "иммунореактивный" в том виде, как он здесь используется, относится к связывающим агентам, антителам или их фрагментам, которые являются специфичными к последовательности аминокислотных остатков ("сайт связывания" или "эпитоп"), тем не менее, при перекрестной реактивности с другими пептидами/белками, они не являются токсичными в концентрациях, в которых их готовят для введения для применения у человека. Термин "связывание" относится к прямой ассоциации между двумя молекулами, обусловленной, например, ковалентными, электростатическими, гидрофобными и ионными и/или опосредованными водородными связями взаимодействиями при физиологических условиях и включая такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики, и любые другие традиционные способы связывания. Термин "предпочтительно связывается" означает то, что связывающийся агент связывается с сайтом связывания с большей аффинностью, чем он связывается с неродственными аминокислотными последовательностями. Аффинность может быть по меньшей мере в 1 раз большей, по меньшей мере в 2 раза большей, по меньшей мере в 3 раза большей, по меньшей мере в 4 раза большей, по меньшей мере в 5 раз большей, по меньшей мере в 6 раз большей, по меньшей мере в 7 раз большей, по меньшей мере в 8 раз большей, по меньшей мере в 9 раз большей, в 10 раз большей, по меньшей мере в 20 раз большей, по меньшей мере в 30 раз большей, по меньшей мере в 40 раз большей, по меньшей мере в 50 раз большей, по меньшей мере в 60 раз большей, по меньшей мере в 70 раз большей, по меньшей мере в 80 раз большей, по меньшей мере в 90 раз большей, по меньшей мере в 100 раз большей или по меньшей мере в 1000 раз большей, чем аффинность связывающего агента в отношении неродственных аминокислотных последовательностей. Термины "иммунореактивный" и "предпочтительно связывается" используются здесь взаимозаменяемо.
Термин "аффинность" в том виде, как он здесь используется, относится к константе равновесия для обратимого связывания двух агентов, и она выражается в виде Кб. Аффинность связывающего белка с лигандом, как, например, аффинность антитела в отношении эпитопа, может быть, например, от примерно 100 наномолярной (нМ) до примерно 0,1 нМ, от примерно 100 нМ до примерно 1 пикомолярной (пМ) или от примерно 100 нМ до примерно 1 фемтомолярной (фМ). Термин "авидность" в том виде, как он здесь используется, относится к устойчивости комплекса из двух или более чем двух агентов к диссоциации после разведения. Кажущиеся аффинности можно определять такими способами, как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) или любая другая методика, знакомая специалисту в данной области. Авидности можно определять такими способами, как анализ по Скэтчарду или любая другая методика, знакомая специалисту в данной области.
Термин "эпитоп" относится к той части антигена или другой макромолекулы, которая способна формировать связывающее взаимодействие со связывающим карманом вариабельной области антитела. Такие связывающие взаимодействия могут проявляться в виде межмолекулярного контакта с одним или более чем одним аминокислотным остатком одной или более чем одной СОК. Связывание антигена может включать, например, СОК3 или пару СОК3, или, в некоторых случаях, взаимодействия вплоть до всех шести СОК цепей νΗ и Уь. Эпитоп может представлять собой линейную пептидную последовательность (т.е. быть "непрерывным") или может состоять из несмежных аминокислотных последовательностей (т.е. быть "конформационным" или "прерывистым"). Антитело может распознавать одну или более
- 7 029214
чем одну аминокислотную последовательность; следовательно, эпитоп может определять более чем одну отдельную аминокислотную последовательность. Эпитопы, распознаваемые антителами, можно определять методиками пептидного картирования и анализа последовательностей, хорошо известными специалистам в данной области. Связывающие взаимодействия проявляются в виде межмолекулярных контактов с одним или более чем одним аминокислотным остатком СЭК. ТКС105 представляет собой мышиное антитело, которое имеет такую же аминокислотную последовательность, что и мышиное антитело, описанное как Υ4-2Ρ1 или 8Ν6) в патентах США номер 5928641, 6200566, 6190660 и 7097836. Эпитопы, распознаваемые Υ4-2Ρ1 и 8Ν6). и, таким образом, ТКС105, были идентифицированы ранее.
Термин "специфичный" относится к ситуации, в которой антитело не будет демонстрировать какого-либо значимого связывания с молекулами, отличными от антигена, содержащего эпитоп, распознаваемый данным антителом. Данный термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен является специфичным в отношении конкретного эпитопа, который несут многие антигены, в данном случае антитело сможет связываться с различными антигенами, несущими данный эпитоп. Термины "предпочтительно связывается" или "специфично связывается" означают, что антитела связываются с эпитопом с большей аффинностью, чем они связываются с неродственными аминокислотными последовательностями, и, при перекрестной реактивности с другими полипептидами, содержащими данный эпитоп, не являются токсичными в концентрациях, в которых их готовят для введения для применения у человека. В одном аспекте такая аффинность по меньшей мере в 1 раз больше, по меньшей мере в 2 раза больше, по меньшей мере в 3 раза больше, по меньшей мере в 4 раза больше, по меньшей мере в 5 раз больше, по меньшей мере в 6 раз больше, по меньшей мере в 7 раз больше, по меньшей мере в 8 раз больше, по меньшей мере в 9 раз больше, в 10 раз больше, по меньшей мере в 20 раз больше, по меньшей мере в 30 раз больше, по меньшей мере в 40 раз больше, по меньшей мере в 50 раз больше, по меньшей мере в 60 раз больше, по меньшей мере в 70 раз больше, по меньшей мере в 80 раз больше, по меньшей мере в 90 раз больше, по меньшей мере в 100 раз больше или по меньшей мере в 1000 раз больше, чем аффинность антитела в отношении неродственных аминокислотных последовательностей. Термины "иммунореактивный", "связывается", "предпочтительно связывается" и "специфично связывается" используются здесь взаимозаменяемо. Термин "связывание" относится к прямой ассоциации между двумя молекулами, обусловленной, например, ковалентными, электростатическими, гидрофобными и ионными и/или опосредованными водородными связями взаимодействиями при физиологических условиях, и включая такие взаимодействия, как солевые мостики и водные мостики, а также любые другие традиционные способы связывания.
Термин "выделенный" (используется взаимозаменяемо с "по существу, чистый"), при применении к полипептидам, означает полипептид или его часть, который, благодаря его происхождению или манипуляции: (1) присутствует в клетке-хозяине в виде продукта экспрессии части экспрессионного вектора; или (2) связан с белком или другой химической группировкой, отличной от тех, с которыми он связан в природе; или (3) не встречается в природе, например, белок, который подвергся химической манипуляции путем присоединения или добавления к белку по меньшей мере одной гидрофобной группировки так, что данный белок находится в форме, не встречающейся в природе. Под "выделенным", кроме того, подразумевается то, что белок: (1) синтезирован химически; или (2) экспрессирован в клетке-хозяине и очищен от ассоциированных и загрязняющих белков. Данный термин, в общем, означает полипептид, который был отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он встречается в природе. Типично данный полипептид также отделен от таких веществ, как антитела или гелевые матрицы (полиакриламид), которые используются для его очистки.
Терминология, связанная с ангиогенезом.
Термины "ингибиторный в отношении ангиогенеза", "ингибирующий ангиогенез" или "антиангиогенный" в том виде, как они здесь используются, включают ингибирование васкулогенеза, и подразумевается, что они означают осуществление уменьшения степени, количества или скорости образования новых сосудов. Осуществление уменьшения степени, количества или скорости пролиферации или миграции эндотелиальных клеток в ткани является конкретным примером ингибирования ангиогенеза.
Термин "композиция, ингибирующая ангиогенез" относится к композиции, которая ингибирует процессы, опосредованные ангиогенезом, такие как миграция эндотелиальных клеток, пролиферация, формирование трубки, и впоследствии приводит к ингибированию образования новых кровеносных сосудов из существующих сосудов, и, следовательно, влияет на состояния, зависимые от ангиогенеза.
Подразумевается, что термин "состояние, зависимое от ангиогенеза" в том виде, как он здесь используется, означает состояние, где процесс ангиогенеза или васкулогенеза поддерживает или усиливает патологическое состояние или оказывает полезное влияние на нормальные физиологические процессы. Следовательно, лечение состояния, зависимого от ангиогенеза, при котором ангиогенез поддерживает патологическое состояние, могло бы приводить к ослаблению заболевания, тогда как лечение состояния, зависимого от ангиогенеза, при котором ангиогенез оказывает полезное влияние на нормальные физиологические процессы, могло бы приводить, например, к усилению нормального процесса.
Ангиогенез представляет собой образование новых кровеносных сосудов из предсуществующих капилляров или посткапиллярных венул. Васкулогенез происходит в результате образования новых кро- 8 029214
веносных сосудов, возникающих из ангиобластов, которые являются предшественниками эндотелиальных клеток. Оба процесса приводят к образованию новых кровеносных сосудов и включены в значение термина "состояния, зависимые от ангиогенеза". Подразумевается, что термин "ангиогенез" в том виде, как он здесь используется, включает образование сосудов бе ηονο, такое как происходящее в результате васкулогенеза, а также сосудов, возникающих в результате ветвления и отрастания существующих сосудов, капилляров и венул. Ангиогенез также может включать индукцию сигнализации ЛЬК1 и связанного с ней фосфорилирования §шаб 1/5/8, и/или сигнализации. Также известно, что ΟΌ105 участвует в пути сигнализации ЛЬК1, и, таким образом, он также включен в значение ангиогенеза.
Популяции клеток ΟΌ105+, инициирующие опухоль, были обнаружены в человеческих почечных карциномах. Клетки ΟΌ105+ имели характеристики опухолевых стволовых клеток, описанных ранее для раковых стволовых клеток, присутствующих в других типах опухолей. Наблюдаемые клетки ΟΌ105+ были клоногенными, экспрессировали маркеры стволовых клеток и не имели маркеров дифференциации, могли дифференцироваться ίη νίίτο в типы эпителиальных и эндотелиальных клеток и могли генерировать ίη νίνο серийно трансплантируемые опухоли. Данные опухоли, несмотря на происхождение из клонов, экспрессирующих мезенхимные маркеры, представляют собой эпителиальные карциномы по происхождению опухоли и характеризуются поддержанием опухолегенной популяции ΟΌ105+ и присутствием популяции неопухолегенных дифференцированных ΟΌ105-.
Фраза "индуцирование иммунного ответа у хозяина" означает то, что пациент испытывает облечение или уменьшение признаков или симптомов заболевания и конкретно включает, без ограничения, продление выживания.
Термины "пролиферативное расстройство" и "пролиферативное состояние" в том виде, как они здесь используются, означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризуемое нарушенной или нежелательной пролиферацией. Термины "клеточное пролиферативное расстройство" и "клеточное пролиферативное состояние" означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризуемое нарушенной или нежелательной пролиферацией клеток, а также включающее состояния, характеризуемые нежелательной или неблагоприятной пролиферацией клеток или выживанием клеток (например, из-за недостаточного апоптоза), состояния, характеризуемые недостаточным или нарушенным апоптозом, а также состояния, характеризуемые нарушенным или нежелательным, или неблагоприятным выживанием клеток. Термин "расстройство дифференциации" означает любое патологическое или непатологичекое физиологическое состояние, характеризуемое нарушенной или недостаточной дифференциацией.
Расстройства пролиферации или дифференциации, поддающиеся лечению, включают заболевания и состояния, доброкачественные и неопластические, характеризуемые ненормальным или нежелательным числом клеток, ростом клеток или выживанием клеток. Такие расстройства или состояния могут, следовательно, составлять болезненное состояние и включают все типы ракового роста или онкогенных процессов, метастатические ткани или злокачественно трансформированные клетки, ткани или органы.
Клетки, участвующие в пролиферативном расстройстве или расстройстве дифференциации могут быть агрегированными в клеточную массу или диспергированными. Термин "несолидная опухоль" относится к неоплазиям гемопоэтической системы, таким как лимфомы, миеломы и лейкозы, или к неоплазиям, которые являются диффузными по природе, поскольку они типично не образуют плотную массу. Конкретные примеры лейкозов включают, например, острую и хроническую лимфобластную, миелобластную и множественную миелому.
Термин "солидная опухоль" относится к неоплазиям или метастазам, которые типично агрегируют вместе и образуют массу. Такие расстройства включают новообразования или раковые заболевания, которые могут поражать фактически любой тип клеток или тканей, например карциному, саркому, меланому, метастатические расстройства или гемопоэтические неопластические расстройства. Метастатическая опухоль может возникать из множества типов первичных опухолей, включая опухоли молочной железы, легкого, щитовидной железы, головы и шеи, мозга, лимфатической системы, желудочно-кишечного (рот, пищевод, желудок, тонкая кишка, толстая кишка, прямая кишка), мочеполового тракта (матка, яичник, шейка матки, мочевой пузырь, яичко, пенис, предстательная железа), почки, поджелудочной железы, печени, кости, мышцы, кожи и т.д., но не ограничиваясь ими.
Карциномами называют злокачественные заболевания эпителиальной или эндокринной ткани, и они включают карциномы дыхательной системы, карциномы желудочно-кишечной системы, карциномы мочеполовой системы, карциномы яичка, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, карциномы эндокринной системы и меланомы. Типичные карциномы включают карциномы, образующиеся из шейки матки, легкого, предстательной железы, молочной железы, головы и шеи, толстой кишки, печени и яичника. Данный термин также включает карциносаркомы, например, которые включают злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. Аденокарцинома включает карциному железистой ткани, или при которой опухоль образует железисто-подобную структуру.
Раковой тканью, подлежащей лечению, является, например, эндотелиальная ткань или трансформированная клетка, экспрессирующая ненормальный уровень ΟΌ105. Термин "трансформированные клет- 9 029214
ки" в том виде, как он здесь используется, относится к клеткам, которые спонтанно перешли в состояние неограниченного роста, т.е. они приобрели способность расти в культуре посредством неопределенного числа делений. Трансформированные клетки могут быть охарактеризованы такими терминами, как неопластические, анапластические и/или гиперпластические, в том, что касается потери ими контроля роста. Для задач данного изобретения подразумевается, что термины "трансформированный фенотип злокачественных клеток млекопитающих" и "трансформированный фенотип" охватывают любой из следующих фенотипических признаков, ассоциированных с клеточной трансформацией клеток млекопитающих: иммортализация, морфологическая или ростовая трансформация и опухолегенность при выявлении посредством длительного роста в культуре клеток, роста в полутвердых средах или опухолегенного роста в иммунонекомпетентных или сингенных животных, но не ограничиваются ими.
Термин "антиген опухолевой клетки" определяется здесь как антиген, который присутствует в больших количествах на опухолевой клетке или в жидкостях организма, чем в неродственных опухолевых клетках, нормальных клетках или в нормальной жидкости организма. Присутствие антигена можно тестировать посредством любого числа анализов, известных специалистам в данной области, и они включают, без ограничения, негативный и/или позитивный отбор с использованием антител, как, например, анализ ЕЬ1§Л, радиоиммуноанализ или вестерн-блоттинг.
Термины "апоптоз" или "программируемая гибель клеток" относятся к физиологическому процессу, посредством которого нежелательные или бесполезные клетки устраняются во время развития и других нормальных биологических процессов. Апоптоз представляет собой способ гибели клеток, который происходит при нормальных физиологических условиях, и клетка является активным участником в ее собственной смерти ("клеточное самоубийство"). Он чаще всего встречается во время нормального обмена клеток и тканевого гомеостаза, эмбриогенеза, индукции и поддержания иммунотолерантности, развития нервной системы и атрофии ткани, зависимой от эндокринной системы. Клетки, подвергающиеся апоптозу, демонстрируют характерные морфологические и биохимические характеристики. Данные характеристики включают агрегацию хроматина, конденсацию ядра и цитоплазмы, разделение цитоплазмы и ядра на везикулы, связанные мембраной (апоптозные тельца), которые содержат рибосомы, морфологически интактные митохондрии и ядерный материал. Ιη νίνο данные апоптозные тельца быстро распознаются и фагоцитируются макрофагами, дендритными клетками или смежными эпителиальными клетками. Из-за этого эффективного механизма удаления апоптозных клеток ίη νίνο не индуцируется воспалительный ответ. Ιη νίίτο апоптозные тельца, а также остающиеся фрагменты клеток, в конечном счете, разбухают и, наконец, лизируются. Эту конечную фазу гибели клетки ίη νίίτο называли "вторичным некрозом". Апоптоз можно измерять способами, известными специалистам в данной области, такими как определение фрагментации ДНК, экспонирования аннексина V, активации каспаз, высвобождения цитохрома с и т.д. Клетка, которая была индуцирована к гибели, называется здесь "апоптозная клетка".
Здесь определено, что "агент, индуцирующий апоптоз", индуцирует апоптоз/программируемую гибель клетки, и они включают, например, антитела против СЭ105, антитела против νΈΟΡ (фактор роста эндотелия сосудов), излучение, химиотерапевтические агенты или агенты, лигирующие рецептор, где клетки, например опухолевые клетки или эндотелиальные клетки, индуцируются к тому, чтобы подвергаться клеточной гибели. Типичные агенты, индуцирующие апоптоз, более подробно описаны ниже.
Апоптоз можно тестировать с использованием стандартного анализа апоптоза с аннексином V: клетки NIΗ:ΟVСАΚ-3 выращивают в 6-луночных планшетах (МИМС) и облучают или обрабатывают антагонистом (или в комбинации с другим противораковым лекарственным средством) в течение 4-48 ч, промывают и окрашивают аннексином ν-РГГС (флуоресцеинизотиоцианат) (ВН-РЬагттдеи) в течение 1 ч. Клетки анализируют проточной цитометрией (ΒοοΙοη-ΟίαΚίηδοη. Сс110ис51). контрастно окрашивают йодидом пропидия и вновь анализируют в проточном цитометре.
Способы получения и экспрессирования антител.
Химерные иммуноглобулины конструировали способами генной инженерии. Большинство химерных иммуноглобулинов, которые были описаны ранее, содержали νΗ и ντ из мышиного моноклонального антитела и СЬ и Рс человеческого антитела. Можно использовать области Рс из любого из описанных здесь изотипов. Как здесь описано, химерный иммуноглобулин также может включать критерии, посредством которых ограниченное число аминокислот в каркасе вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи модифицируют для повышения аффинности антитела.
Химерные антитела обычно имеют несколько потенциальных преимуществ над мышиными антителами для применения в терапии человека. Поскольку эффекторная часть антитела является человеческой, считается, что она лучше взаимодействует с другими частями человеческой иммунной системы (например, более эффективно разрушает клетки-мишени посредством комплементзависимой цитотоксичности (СЭС) или антител озависимой клеточной цитотоксичности (АЭСС)). Кроме того, человеческая иммунная система не должна распознавать константную область химерного антитела как чужеродную и, следовательно, антительный ответ против такого инъецированного антитела типично должен быть меньшим, чем против полностью чужеродного мышиного антитела. Наконец, известно, что мышиные антитела имеют период полувыведения в человеческой системе кровообращения, который значительно короче, чем период полувыведения человеческих антител. Предположительно химерные антитела могут иметь
- 10 029214
более сходный период полувыведения со встречающимися в природе человеческими антителами, позволяя давать меньшие и менее частые дозы.
Когда желательна повышенная аффинность антитела, остатки в пределах СЭР антитела можно дополнительно заменять другими аминокислотами. Типично заменяют не более четырех аминокислотных остатков в СОР, и наиболее типично будут заменены не более двух остатков в СОР, за исключением СЭР2 тяжелой цепи, где можно заменять вплоть до 10 остатков. Изменения аффинности можно измерять традиционными способами, такими как описанные здесь способы (например, Ыасоге).
Антитела можно конструировать и получать с использованием традиционных методик, известных в данной области. Кроме того, полученные рекомбинантно антитела часто можно продуцировать в больших количествах, в частности, при использовании векторов с высоким уровнем экспрессии.
Для ветеринарных применений можно синтезировать антитело для введения животному, не являющемуся человеком (например примату, корове, лошади, свинье и т.д.), с использованием Рс, не являющейся человеческой.
Для модифицирования нуклеотидов, кодирующих аминокислотные последовательности, с применением методик генной инженерии в сайтах эндонуклеаз рестрикции, можно использовать известные в данной области методики, такие как методики, приведенные и включенные в описание изобретения.
В том, что касается экспрессии, экспрессионной системой является экспрессионная система, в которой применяется система С8 (Ьоп/а) с использованием гена глутаминсинтетазы в качестве селектируемого маркера. Вкратце, трансфекцию проводят в клетках СНО (яичники китайского хомяка) посредством электропорации (250 В) с применением системы О§ (Ьоп/а). используя ген глутаминсинтетазы в качестве селектируемого маркера. Клетки СНО дикого типа выращивают в ΌΜΕΜ (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) (81дша), содержащей 10% диализированной фетальной телячей сыворотки (РС8) с 2 мМ глутамином. 6х107 клеток СНО трансфицируют 300 мкг линеаризованной ДНК посредством электропорации. После электропорации клетки ресуспендируют в ΌΜΕΜ с глутамином и переносят на 36 х 96-луночных планшетов (50 мкл/лунку) и инкубируют при 37°С в 5%-ном СО2. На следующие сутки добавляют 150 мкл/лунку селективной среды (ΌΜΕΜ без глутамина). Приблизительно через 3 недели колонии подвергают скринингу посредством ΕΌΙδΑ (см. ниже) с использованием иррелевантного антитела в качестве негативного контроля. Все колонии, продуцирующие более 20 мкг/мл, размножают в 24-луночных планшетах и затем в колбах Т25 в двойной повторности.
Для продуцирования на высоком уровне широко используемой экспрессионной системой млекопитающих является экспрессионная система, в которой используется процедура амплификации генов, обеспечиваемая дефицитными по дегидрофолатредуктазе ("бЬГг-") клетками яичника китайского хомяка. Данная система основана на гене дегидрофолатредуктазы "бЫг", который кодирует фермент ΌΗΡΡ, который катализирует превращение дегидрофолата в тетрагидрофолат. Для достижения высокой продукции клетки СНО бЬГг- трансфицируют экспрессионным вектором, содержащим функциональный ген ΌΗΡΡ вместе с геном, который кодирует желательный белок. В данном случае желательным белком является рекомбинантная тяжелая цепь и/или легкая цепь антитела.
Посредством увеличения количества конкурентного ингибитора ΌΗΡΡ-метотрексата (МТХ) у рекомбинантных клеток развивается устойчивость посредством амплификации гена бНГг. В стандартных случаях используемая амплификационная единица значительно больше, чем размер гена бЫг, и в результате соамплифицируется тяжелая цепь антитела.
Когда желательна крупномасшабная продукция белка, такого как цепь антитела, принимаются во внимание как уровень экспрессии, так и стабильность используемых клеток. В долговременной культуре популяции рекомбинантных клеток СНО теряют гомогеность в отношении их удельной продуктивности антител во время амплификации, даже несмотря на то что они происходят из одного родительского клона.
Согласно настоящей заявке предложен выделенный полинуклеотид (нуклеиновая кислота), кодирующий антитело или его часть, как здесь описано, векторы, содержащие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева и экспрессионные системы для осуществления транскрипции и трансляции таких полинуклеотидов в полипептиды.
Согласно настоящей заявке также предложены конструкции в форме плазмид, векторов, транскрипционных или экспрессионных кассет, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, как описано выше.
Согласно настоящей заявке также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более чем одну конструкцию, как описано выше. Нуклеиновая кислота, кодирующая любое описанное здесь антитело, образует один аспект настоящей заявки, как и способ получения антитела, который включает экспрессию от кодирующей его нуклеиновой кислоты. Экспрессии можно с удобством добиваться путем культивирования рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих данную нуклеиновую кислоту, при подходящих условиях. После продуцирования путем экспрессии антитело или его часть можно выделять и/или очищать с использованием любой подходящей методики, а затем использовать подходящим образом.
- 11 029214
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие специфичные антитела (или их части), и векторы, содержащие данные молекулы нуклеиновых кислот, можно получать выделенными и/или очищенными, например, из их природного окружения в, по существу, чистой или гомогенной форме. В случае нуклеиновой кислоты - не содержащей или, по существу, не содержащей нуклеиновую кислоту или гены, которые имеют происхождение, отличное от последовательности, кодирующей полипептид с требующейся функцией. Нуклеиновокислотные последовательности могут содержать ДНК или РНК и могут быть полностью или частично синтетическими. Способы очистки хорошо известны в данной области.
Хорошо известны системы для клонирования и экспрессии полипептида в ряде разных клетокхозяев. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, клетки млекопитающих, дрожжи и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомяка, клетки НеЬа, клетки почки детеныша хомяка, клетки миеломы мыши N80 и многие другие, но не ограничиваются ими.
Также полезным в экспрессии последовательностей ДНК является широкий спектр одноклеточных клеток-хозяев. Данные хозяева включают хорошо известных эукариотических и прокариотических хозяев, таких как штаммы Е. сой, Ркеиботопак, ВасШик, 8(гер(ошусе8, грибы, такие как дрожжи, и клетки животных, такие как клетки СНО (яичника китайского хомяка), ΥΒ/20, N80, 8Р2/0, К.1.1, В-ν и Ь-М, клетки почки африканской зеленой мартышки (например, СО8 1, СО8 7, В8С1, В8С40 и ВМТ10), клетки насекомых (е.д., 8Τ9), человеческие клетки и растительные клетки в культуре ткани.
В данной области хорошо известна экспрессия антител или их частей в прокариотических клетках, таких как Е.сой. Относительно обзора см., например, Р1иск1йип, А. Вю/Тесйпо1оду 9: 545-551 (1991).
В качестве опции для продуцирования описанных здесь антител специалистам в данной области также доступна экспрессия в эукариотических клетках в культуре, относительно недавних обзоров см., например, Ка£Т М.Е. (1993) Сигг. Оршюп Вю(есй. 4: 573-576; ТгШ 1.1. е( а1. (1995) Сигг. Оршюп Вю(есй 6: 553-560, каждая из которых включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте.
Можно выбрать или сконструировать подходящие векторы, содержащие подходящие регуляторные последовательности, включающие промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности, сообразно обстоятельствам. Векторы могут представлять собой плазмиды, вирусные векторы, например фаг или фагмиду, сообразно обстоятельствам. Относительно дальнейших подробностей, см., например, Мо1еси1аг С1ошпд: а ЬаЬога(огу Мапиа1: 2пб ебйюп, 8атйгоок е( а1., 1989, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога(огу Ргекк. Многие известные методики и протоколы для манипуляции с нуклеиновой кислотой, например, при получении нуклеиновокислотных конструкций, мутагенезе, секвенировании, введении ДНК в клетки и экспрессии генов, и для анализа белков подробно описаны в 8йог1 Рго(осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 8есопб Ебйюп, Аи8иЬе1 е( а1. ебк., 1ойп \УПеу & 8опк, 1992. Описания способов 8атЬгоок е( а1. и Аи8иЬе1 е( а1. включены сюда посредством ссылки во всей их полноте и являются хорошо известными в данной области.
Таким образом, согласно другому аспекту предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, как здесь описано. Согласно еще одному аспекту предложен способ, включающий введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Для введения можно использовать любую доступную методику. Для эукариотических клеток подходящие методики могут включать, например, трансфекцию с фосфатом кальция, ΌΕΑΕ декстраном (диэтиламиноэтилдекстран), электропорацию, трансфекцию, опосредованную липосомами, и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например вируса коровьей оспы или, в случае клеток насекомых, бакуловируса. Для бактериальных клеток подходящие методики могут включать, например, трансформацию с хлоридом кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофага.
После введения может следовать вызывание или обеспечение экспрессии от нуклеиновой кислоты, например, путем культивирования клеток-хозяев при условиях для экспрессии гена.
В одном воплощении нуклеиновая кислота интегрируется в геном (например в хромосому) клеткихозяина. Интеграция может стимулироваться включением последовательностей, которые стимулируют рекомбинацию с геномом, согласно стандартным методикам. Может быть инициировано 1д-усиление, по мере необходимости для максимизации экспрессии.
Согласно настоящей заявке также предложен способ, который включает применение конструкции, как изложено выше, в экспрессионной системе для того, чтобы осуществлять экспрессию антител (или их частей), как описано выше.
Настоящая заявка также относится к выделенным нуклеиновым кислотам, таким как молекулы рекомбинантной ДНК или клонированные гены, или их вырожденные варианты, мутанты, аналоги или фрагменты, которые кодируют антитело, которое связывается с СЭ105.
В другом воплощении всю последовательность ДНК рекомбинантной молекулы ДНК или клонированного гена описанных здесь антитела или его части можно связывать функциональным образом с последовательностью контроля экспрессии, которую можно вводить подходящему хозяину. Данная заявка, соответственно, распространяется на одноклеточных хозяев, трансформированных клонированным геном или молекулой рекомбинантной ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую УН, Уь,
- 12 029214
Сь и/или Рс антитела.
Другим признаком является экспрессия раскрытых здесь последовательностей ДНК. Как хорошо известно в данной области, последовательности ДНК можно экспрессировать путем их связывания функциональным образом с последовательностью контроля экспрессии в подходящем экспрессионном векторе и использования данного экспрессионного вектора для трансформации подходящего одноклеточного хозяина.
Такое связывание функциональным образом последовательности ДНК с последовательностью контроля экспрессии, естественно, включает предоставление инициирующего кодона, АТС, если он еще не является частью последовательности ДНК, в правильной рамке считывания перед последовательностью ДНК.
Полинуклеотиды и векторы могут быть предоставлены в выделенной и/или очищенной форме (например, не содержащими или, по существу, не содержащими полинуклеотидов другого происхождения, чем полинуклеотид, кодирующий полипептид с требующейся функцией). Термины "по существу, чистый" и "по существу, не содержащий" в том виде, как они здесь используются, относятся к раствору или суспензии, содержащим меньше, чем, например, примерно 20% или менее постороннего вещества, примерно 10% или менее постороннего вещества, примерно 5% или менее постороннего вещества, примерно 4% или менее постороннего вещества, примерно 3% или менее постороннего вещества, примерно 2% или менее постороннего вещества или примерно 1% или менее постороннего вещества.
При осуществлении экспрессии последовательностей ДНК по настоящему изобретению можно использовать широкий спектр комбинаций хозяев/экспрессионных векторов. Полезные экспрессионные векторы, например, могут состоять из отрезков последовательностей хромосомной, нехромосомной и синтетической ДНК. Подходящие векторы включают производные §У40 и известные бактериальные плазмиды, например плазмиды Е.соН со1 Е1, Рсг1, РЬт322, РтЬ9 и их производные, такие плазмиды, как КР4; фаговые ДНК, например многочисленные производные фага λ, например ΝΜ989, и ДНК других фагов, например М13 и одноцепочечную ДНК нитчатого фага; дрожжевые плазмиды, такие как плазмида 2и или ее производные; полезные в эукариотических клетках векторы, такие как векторы, полезные в клетках насекомых или млекопитающих; векторы, происходящие из комбинаций плазмид и фаговых ДНК, таких как плазмиды, которые были модифицированы для применения фаговой ДНК, но неограничиваются ими, или другие последовательности контроля экспрессии и тому подобное.
Здесь также предложена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или более чем одну полинуклеотидную конструкцию. Полинуклеотид, кодирующий антитело, как здесь предложено, образует один аспект настоящей заявки, как и способ получения антитела, который включает экспрессию от одного или более чем одного полинуклеотида. Экспрессия может достигаться, например, путем культивирования рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих полинуклеотид, при подходящих условиях. Антитело можно затем выделять и/или очищать с использованием любой подходящей методики и использовать подходящим образом.
Для экспрессии последовательностей ДНК в данных векторах можно использовать любую из широкого спектра последовательностей контроля экспрессии - последовательностей, которые контролируют экспрессию последовательности ДНК, связанной с ними функциональным образом. Такие полезные последовательности контроля экспрессии включают, например, ранние или поздние промоторы §У40, СМУ (цитомегаловирус), вируса коровьей оспы, полиомы или аденовируса, систему 1ас, систему 1гр. систему ТАС, систему ТКС, систему ЬТК, области главного оператора и промотора фага λ, контрольные области белка оболочки й, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы (например, РНо5), промоторы дрожжевых факторов спаривания альфа и другие последовательности, для которых известно, что они контролируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и их различные комбинации.
Будет понятно, что не все векторы, последовательности контроля экспрессии и хозяева будут одинаково хорошо функционировать для экспрессии последовательностей ДНК. Все хозяева также не будут функционировать одинаково хорошо при использовании той же самой системы экспрессии. Однако специалист в данной области без чрезмерного экспериментирования сможет выбрать подходящие векторы, последовательности контроля экспрессии и хозяев для осуществления желаемой экспрессии без отступления от объема данной заявки. Например, при выборе вектора должен рассматриваться хозяин, так как вектор должен функционировать в нем. Также будут рассматриваться число копий вектора, способность контролировать данное число копий и экспрессия любых других белков, кодируемых вектором, таких как маркеры антибиотиков. Обычный специалист в данной области может выбирать подходящие векторы, последовательности контроля экспрессии и хозяев для осуществления желаемой экспрессии без отступления от объема данной заявки. Например, при выборе вектора рассматривается хозяин, так как вектор функционирует в нем. Также могут рассматриваться число копий вектора, способность контролировать данное число копий и экспрессия любых других белков, кодируемых вектором, таких как маркеры антибиотиков.
Согласно настоящей заявке также предложены конструкции в форме плазмид, векторов, транс- 13 029214
крипционных или экспрессионных кассет, как описано здесь в других местах, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, как описано выше. Можно выбрать или сконструировать подходящие векторы, содержащие подходящие регуляторные последовательности, включающие промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, селектируемые маркеры и другие последовательности, сообразно обстоятельствам. Векторы могут представлять собой плазмиды, вирусные, например фаг, фагмида и т.д., сообразно обстоятельствам. Относительно дальнейших подробностей, см., например, Мо1еси1аг Ο1οηίη§: а ЬаЪогаШгу Мапиа1: 2ηά ебйюп, ЗатЬгоок е! а1., 1989, Со1б Зргшд НагЬог ЬаЪогаШгу Ргекк. Многие известные методики и протоколы для манипуляции с нуклеиновой кислотой, например при получении нуклеиновокислотных конструкций, мутагенезе, секвенировании, введении ДНК в клетки и экспрессии генов, и для анализа белков подробно описаны в ЗЬой Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Зесопб ЕбШоп. ЛикиЪе1 е! а1. ебк., 1о1т \УПеу & Зопк, 1992. Способы и описания ЗатЬгоок е! а1. и ЛикиЪе1 е! а1. включены сюда посредством ссылки.
При выборе последовательности контроля экспрессии обычно будет рассматриваться множество факторов. Они включают, например, относительную силу системы, ее контролируемость и ее совместимость с конкретной последовательностью ДНК или геном, подлежащим экспрессии, особенно в том, что касается потенциальных вторичных структур. Подходящие одноклеточные хозяева будут выбраны при рассмотрении, например, их совместимости с выбранным вектором, их характеристик секреции, их способности правильно сворачивать белки и требований для их ферментации, а также токсичности для хозяина продукта, кодируемого последовательностями ДНК, подлежащими экспрессии, и легкости очистки продуктов экспрессии.
Согласно другому аспекту предложена клетка-хозяин, содержащая один или более чем один полинуклеотид, как здесь описано. Согласно еще одному аспекту предложен способ введения такого одного или более чем одного полинуклеотида в клетку-хозяина посредством любой доступной методики. Для эукариотических клеток подходящие методики могут включать, например, трансфекцию с фосфатом кальция, ΌΕΑΕ декстраном, электропорацию, трансфекцию, опосредованную липосомами, и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса (например, вируса коровьей оспы) или, в случае клеток насекомых, бакуловируса. Для бактериальных клеток подходящие методики могут включать, например, трансформацию с хлоридом кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофагов.
После введения может следовать вызывание или обеспечение экспрессии от одного или более чем одного полинуклеотида, например, путем культивирования клеток-хозяев при условиях для экспрессии одного или более чем одного полипептида от одного или более чем одного полинуклеотида. Можно использовать индуцибельные системы, и экспрессия индуцируется добавлением активатора.
В одном воплощении полинуклеотиды могут интегрироваться в геном (например, в хромосому) клетки-хозяина. Интеграция может стимулироваться включением последовательностей, которые стимулируют рекомбинацию с геномом, согласно стандартным методикам. В другом воплощении нуклеиновая кислота сохраняется на эписомном векторе в клетке-хозяине.
Здесь предложены способы, которые включают применение конструкции, как изложено выше, в экспрессионной системе для того, чтобы осуществлять экспрессию конкретного полипептида.
Принимая во внимание эти и другие факторы, специалист в данной области сможет сконструировать множество комбинаций вектор/последовательность контроля экспрессии/хозяин, которые будут экспрессировать последовательности ДНК при ферментации или в крупномасштабной животной культуре.
Полинуклеотид, кодирующий антитело или его часть, можно получать рекомбинантно/синтетически в дополнение к клонированию или вместо клонирования. Можно конструировать полинуклеотид с подходящими кодонами. В общем, при использовании последовательности для экспрессии будут выбраны предпочтительные кодоны для намеченного хозяина. Полный полинуклеотид может быть собран из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами и собранных в полную кодирующую последовательность. См., например, Ебде, ЫаШге, 292:756 (1981); ЫатЪаи е! а1., Зае^е, 223:1299 (1984); 1ау е! а1., 1. Бю1. СЬет., 259:6311 (1984).
Одновременное включение нуклеиновых кислот, кодирующих антитело (или его часть), и замены аминокислот в выбранных положениях можно осуществлять рядом способов, известных специалистам в данной области, включающих, например, рекомбинантные способы и химический синтез.
Антитела против СЭ105.
Эндоглин (СЭ105) экспрессируется на поверхности клетки в виде 180 кДа гомодимерного трансмембранного белка. Наружный домен с высокой аффинностью (50 нМ) связывается с изоформами 1 и 3 ΤΟΡ-β (бета-трансформирующий фактор роста), и трансмембранный и внутриклеточный домены СЭ105 имеют 71%-ное сходство последовательности с бета-гликаном. Человеческий ген СЭ105 локализован на хромосоме 9с|34 при идентификации флуоресцентной гибридизацией ίη кйи, и кодирующая область содержит 14 экзонов, и были охарактеризованы две разные изоформы (Ь и З) СЭ105 со способностью свя- 14 029214
зываться с ТСР-β. Ь-00105 состоит из 633 аминокислотных остатков с 47 аминокислотными остатками в цитоплазматическом хвосте, в отличие от 8-00105. который состоит из 600 аминокислотных остатков с 14-аминокислотным цитоплазматическим хвостом. Однако Ь-00105 является преобладающей формой. В эндотелиальных клетках 00105 является конститутивно фосфорилированным, главным образом. по остаткам серина и треонина. и данное фосфорилирование обусловлено конститутивно активным в клетке КП ТОР-β. Связывание ТСР-β с СО 105 приводит к понижающей регуляции фосфорилирования. аналогично эффектам. наблюдаемым с ингибиторами протеинкиназы С. Аминокислотная последовательность человеческого 00105 содержит трипептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (КОО). локализованный в экспонированной области внеклеточного домена. Пептид КОО является ключевой распознаваемой структурой. находящейся на белках ЕСМ (внеклеточный матрикс). таких как фибронектин. витронектин. фактор фон Виллебранда (ννΤ). коллаген типа I и фибриноген. и он распознается интегринами поверхности клетки. Интегриновую адгезию связывали с гемостазом. тромбозом. ангиогенезом и воспалением процессами. в которых критическую роль играет эндотелий. (ОиП с1 а1.. РА8ЕВ ί.. 17:984-992 (2003)).
00105 является членом семейства рецепторов ТОР-β. который экспрессируется пролиферирующими эндотелиальными клетками. Для пролиферации эндотелиальных клеток нужны нормальные уровни 00105. Экспрессия 00105 усиливается клеточной гипоксией через продукцию индуцируемого гипоксией фактора 1-а (ΗΓΤ-1-α) и защищает гипоксические клетки от апоптоза. Несколько функций 00105 ассоциированы с сигнализацией ТОР-β. ТОР-β осуществляет сигнализацию через гетеродимерные рецепторы. состоящие из сериновых киназ - рецептор I (ΚΙ) и рецептор II (КП). Связывание ТОР-β с наружными доменами рецептора демаскирует цитоплазматическую активность киназы КП. которая фосфорилирует К! ТОР-β. который может затем взаимодействовать с расположенными ниже участниками пути сигнализации. такими как белки 8тай. 00105 образует часть рецепторного комплекса ТОР-β. но он может существовать на поверхности клетки независимо. Во многих клетках 00105 подавляет сигнализацию ТОР-β ίη νίίτο.
00105 также связывается с другими факторами роста. такими как активин А и морфогенные белки кости (ΒΜΡ) -10. -9. -7 и -2. Для связывания ТОР-β или других лигандов факторов роста с 00105 требуется присутствие. по меньшей мере. рецептора КП. и он сам по себе не может связываться с лигандами. Ассоциация 00105 с рецепторами не изменяет их аффинности в отношении самого лиганда. При ассоциации цитоплазматический домен 00105 фосфорилируется Ы ТОР-β и КП ТОР-β; затем киназа К! ТОР-β. но не КП ТОР-β диссоциирует от рецепторного комплекса.
Экспрессия 00105 ингибирует уровни фосфорилирования КП ТОР-β. но увеличивает уровни фосфорилирования К ТОР-β. приводя к повышенному фосфорилированию 8тай 2. но не 8тай 3. Поскольку 8тай 2 может взаимодействовать с множеством транскрипционных факторов. соактиваторов и супрессоров. фосфорилированный 8тай 2 может действовать в качестве интегратора многочисленных сигналов. модулируя транскрипцию генов. Таким образом. 00105 модулирует функции ТОР-β через взаимодействие с Ы ТОР-β и КП ТОР-β и модифицирует фосфорилирование работающих ниже белков 8тай.
00105 действует. модулируя сигнализацию многочисленных комплексов рецепторных киназ надсемейства ТОР-β. включая рецепторы ТОР-β (ТОР^К). киназы. подобные рецептору активина (АЬК) и рецепторы активина. В отсутствие 00105 активация рецепторов ТОР-β приводит к фосфорилированию белков 8МАО (8МАО 2 и 3). которые ингибируют рост эндотелиальных клеток. Однако активация 00105 посредством ТОР-β модулирует фосфорилирование белка 8МА0 (включая фосфорилирование 8МАО 1. 5 и 8). Конечным результатом является высвобождение ингибирующих рост эффектов активации рецептора ТОР-β на эндотелиальные клетки (см. фиг. 2). Не удивительно то. что предотвращение активации 00105 посредством антитела против 00105 или антисмыслового олигонуклеотида действует синергетически с ТОР-β. предотвращая рост эндотелиальных клеток.
Промотор 00105 имеет длину 2.6 т.п.н.. но не содержит ТАТА-бокс или СААТ-бокс. инициирующие транскрипцию. Однако он имеет две О0-богатые области. консенсусные мотивы для 8р1. сК ОАТ А. АР-2. ЫОР-β и Май. а также элементы ответа на ТОР-β. Тем не менее. 00105 имеет относительно ограниченное распределение в клетках. Для базового уровня транскрипции. по-видимому. требуется сайт сН в положении -68 и сайты 8р1. но относительное ограничение экспрессии. например. эндотелиальными клетками. по-видимому. включает многочисленные регуляторные области. в частности. одну в положении от -1294 до -932 и другую - очень близко к сайту инициации транскрипции. 00105 подвергается повышающей регуляции посредством ТОР-β. и было показано. что для этого требуется сайт 8р1 в положении от -37 до -29. также включающий расположенные выше смежно один или более чем один сайт 8ΒΕ. связывающий 8тай 3 и/или 4 (которые активируются сигнализацией ТОР-β). Гипоксия является общей характеристикой ишемических тканей и опухолей и мощным стимулятором экспрессии гена 00105 в сосудистых эндотелиальных клетках (ЕС). Такой эффект потенцируется в комбинации с ТОР-β 1. Подвергающийся повышающей регуляции 00105 может иметь самозащитную роль в ЕС при гипоксическом стрессе.
Сосудистые ЕС являются главным источником 00105. Другие типы клеток. включающие гладко- 15 029214
мышечные клетки сосудов, фибробласты, макрофаги, лейкозные клетки пре-В и миеломоноцитарного происхождения и эритроидные предшественники экспрессируют ί'.Ό105 в меньшей степени.
ί'.Ό105 участвует в ангиогенезе. Эксперименты с антисмысловыми последовательностями продемонстрировали, что подавление экспрессии 6.0105 в НИУЕС (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) приводит к заметному ингибированию ангиогенеза ίη νΐίτο в комбинации с ΤΟΡ-Ρ1, указывая на то, что 6Ό105 является проангиогенным компонентом в эндотелиальных клетках. Другое доказательство важной роли 6Ό105 в ангиогенезе происходит из исследований нокаутированных по СО105 мышей. "Нулевые" по СО 105 мыши демонстрируют многочисленные сосудистые и сердечные дефекты, приводящие к смерти на ранней эмбриональной стадии. Тяжелые сосудистые нарушения, наблюдаемые у "нулевых" по СО 105 мышей, указывают на то, что СЭ105 требуется для образования зрелых кровеносных сосудов в экстраэмбриональной сосудистой сети, дополнительно подтверждая прямую роль СО 105 в ангиогенезе.
ί'.Ό105. также известный, среди прочего, как эндоглин или ебд-1, представляет собой гомодимерный мембранный гликопротеин типа I, который экспрессируется на высоком уровне в пролиферирующих эндотелнальных клетках сосудов. Таким образом, СО 105, прежде всего, представляет собой ассоциированный с пролиферацией маркер эндотелиальных клеток, претерпевающих активный ангиогенез. Однако может иметь место ограниченная экспрессия СО 105 эндотелием сосудов нормальных тканей. Известно, что человеческий СИ 105 специфично связывается с трансформирующим фактором роста-β (ΊΌΡ-β), и выведенная аминокислотная последовательность СО105 имеет сильную гомологию с βгликаном - типом рецептора ΤΟΡ-β.
СО105 служил в качестве мишени в способах уменьшения сосудистой сети опухоли, основанных на антителах, поскольку СО105 представляет собой ассоциированный с пролиферацией антиген на эндотелиальных и лейкозных клетках. Его экспрессия подвергается повышающей регуляции в эндотелии сосудов, ассоциированном с опухолью, и СИ 105 является необходимым для ангиогенеза. Ангиогенез включает образование новых капиллярных кровеносных сосудов, приводя к неоваскуляризации, а также к поддержанию существующей сосудистой сети. Он представляет собой сложный процесс, который включает серию последовательных стадий, включающих опосредованную эндотелиальными клетками деградацию базальной мембраны сосудов и интерстициальных матриксов, миграцию эндотелиальных клеток, пролиферацию эндотелиальных клеток и образование эндотелиальными клетками петель капилляров.
СО105 может находиться на клетках, которые составляют и поддерживают существующую сосудистую сеть, а также на клетках, которые стимулируют рост и становятся частью новой сосудистой сети. Данные антитела могут связываться с СЭ105 и, посредством этого, ингибировать ангиогенез, ингибировать существующую сосудистую сеть или поддержание существующей сосудистой сети, и/или ингибировать расширение маленьких сосудов. Помимо их применения для очистки СО 105, данные антитела являются полезными для очистки, выявления и диагностических целей, а также терапевтических целей. Предложенные здесь антитела можно использовать для получения лекарственных средств для лечения множества состояний и заболеваний, в способах лечения указанных состояний и заболеваний и в способах выявления или диагностики. Термин "ангиогенез" в том виде, как он здесь используется, включает рост и/или развитие новых кровеносных сосудов (также именуемое неоваскуляризацией), расширение маленьких сосудов, избыточный или продолжительный рост сосудов и поддержание существующей сосудистой сети. Ангиогенными состояниями и заболеваниями называют те заболевания и состояния, которые связаны, вызваны или ассоциированы с ангиогенезом. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают, например, различные формы рака (первичные опухоли и метастазы). Были получены мышиные моноклональные антитела (тАЬ) против СО 105, которые модулируют активность СО 105 и, посредством этого, ингибируют аниогенез и/или ингибируют расширение маленьких кровеносных сосудов. Данные мышиные антитела описаны в патентах США 5928641, 6200566, 6190660 и 7097836, каждый из которых включен сюда во всей их полноте. Кроме того, была продемонстрирована эффективность ряда данных антител ех νΐνο и ш νΐνο; моноклональные антитела, которые связываются с СО 105, представляют интерес в качестве соединений, модулирующих СО105. Терапевтическое применение мышиных антител, однако, не является возможным, поскольку введение мышиных антител имеет ряд ограничений, включая иммуногенность, например, в форме человеческих противомышиных антител (НАМА).
Описано несколько антител против СО105, в частности, моноклональные антитела ("тАЬ") против СО105. МАЬ §N6 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации мышей смесями гликопротеинов клеточных мембран человеческих лейкозных клеток (НагШа апб §еоп, 1986, Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8с1. 83:7898-7902). §N6 представляет собой мышиное тАЬ, которое распознает человеческий СО105. МАЬ 44Ο4 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации мышей цельноклеточными суспензиями человеческих пре-В лейкозных клеток (Ооидок, Ье1ат1е, 1988, 1. 1ттипо1. 141:1925-1933; 1990, 1. Бю1. СЬет. 265:8361-8364). 44Ο4 также представляет собой мышиное тАЬ, которое распознает человеческий СО105. МАЬ М17/18 представляет собой антитело, полученное в результате иммунизации крыс воспаленной кожей мышей (Ое, Ви1сЬет, 1994, выше). М17/18 также представляет собой тАЬ, которое распознает мышиный СО105. МАЬ Тес-11 представляет собой антитело, полученное
- 16 029214
в результате иммунизации мышей человеческими эндотелиальными клетками пупочной вены (Вштоте с1 а1., 1995, С1ш. Сапсег Кек. 1:1623-1634). Тес-11 представляет собой мышиное шЛЬ с реактивностью, ограниченной человеческим СО105. Здесь описаны химерные антитела, которые связываются с СО105, которые демонстрируют пониженную иммуногенность при сохранении и/или улучшении их специфичности. Кроме того, для решения проблем, ассоциированных с мышиными антителами, здесь описаны химерные антитела, которые связываются с СО 105 и уменьшают и/или ингибируют ангиогенез, демонстрирующие пониженную иммуногенность при сохранении и/или улучшении их специфичности. Данные антитела против СЭ105 являются полезными для диагностики и лечения различных состояний и заболеваний, а также для очистки и выявления СЭ105. Антитела против СО 105 представляют собой важную область для разработки терапий для лечения множества заболеваний и состояний, в которые вовлечен ангиогенез, которые подвержены влиянию или воздействию ангиогенеза.
Здесь предложены антитела, которые связываются с СО105. Также предложены антитела (или их антигенсвязывающие фрагменты), которые связываются с СО 105 и ингибируют (частично или полностью) или управляют/подвергают воздействию (частично или полностью) ангиогенез/неоваскуляризацию, расширение маленьких сосудов, ингибирование пролиферации клеток или ингибирование роста опухоли. Аналогично, ингибирование функции СО105 (например, сигнализации, связывания, активации и тому подобного) также включено в значение ингибирования или связывания СО105. В еще одном воплощении антитело ингибирует ангиогенез путем связывания с СО105. Согласно данной заявке также предложены линии клеток, которые можно использовать для продуцирования антител, способы получения данных линий клеток, способы осуществления экспрессии антител и их очистки.
Понятно, что антитела, которые специфично связываются с СО105, полученные с использованием описанных здесь способов, можно тестировать с использованием предложенных здесь или известных в данной области анализов на способность связываться с СО105, используя традиционные способы, включая, без ограничения, ЕЫ§А. Аффинность описанных здесь антител также можно определять с использованием традиционных способов, включая, без ограничения, В1асоте или поверхностный плазмонный резонанс.
Здесь предложены антитела, которые связываются с СО105. Также здесь предложены антитела, которые связываются с СО105 и ингибируют ангиогенез.
Здесь предложено антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕО ГО N0: 1, константную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 2, вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 3, и константную область (Рс) гамма 1 (γ1), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 4; и константную область (Рс), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 4.
В другом неограничивающем воплощении антитело против СО105 содержит СОК1 Уь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 5, С0К2 Уь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 6, С0К3 Уъ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 7, С0К1 Ун, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 8, С0К2 Ун, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 9, и С0К3 Ун, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 10.
В другом неограничивающем воплощении выделенное гуманизированное, деиммунизированное антитело против СО105 может содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 11, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 5>Е0 ГО N0: 12. Другие неограничивающие примеры гуманизированных-деиммунизированных тяжелых цепей включают 8Е0 ГО N0: 13, 14, 15 и 16, но не ограничиваются ими. Другие неограничивающие примеры гуманизированныхдеиммунизированных легких цепей включают 5>Е0 ГО N0: 17, 18, 19, 20, 21, 22 и 23, но не ограничиваются ими. Данные последовательности приведены ниже в примере 17.
В другом аспекте согласно настоящей заявке предложено антитело, способное конкурировать с описанным здесь антителом против СО 105 при условиях, в которых по меньшей мере 5% антитела, имеющего последовательности Ун и Уъ антитела, блокировано от связывания с СО105 путем конкуренции с таким антителом в анализе ЕЬ1§А.
Здесь предложены нейтрализующие антитела, которые связываются с СО105 и модулируют активность СО105. Данное нейтрализующее антитело может, например, ингибировать ангиогенез путем связывания с СО105.
Описанные здесь антитела являются полезными в применениях для выявления или диагностики, как более подробно описано ниже. Описанные здесь антитела являются полезными для связывания с СО105, что, в свою очередь, может ингибировать ангиогенез, как здесь описано.
Описанные здесь антитела могут дополнительно содержать терапевтическую группировку для использования в терапевтических применениях.
- 17 029214
Описанные здесь антитела также можно использовать в виде иммуноконъюгатов. Термин "иммуноконъюгаты" в том виде, как он здесь используется для задач описания и формулы изобретения, относится к конъюгатам, состоящим из антител против СО105 или их фрагментов согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одной терапевтической метки. Терапевтические метки включают противоопухолевые агенты и ингибиторы ангиогенеза. Такие противоопухолевые агенты известны в данной области и включают токсины, лекарственные средства, ферменты, цитокины, радиоактивные изотопы, фотодинамические агенты и ингибиторы ангиогенеза, но не ограничиваются ими. Токсины включают цепь А рицина, мутантные экзотоксины Ркеиботопак, дифтерийный анатоксин, стрептонигрин, боамицин, сапорин, гелонин и антивирусный белок лаконоса, но не ограничиваются ими. Лекарственные средства включают даунорубицин, метотрексат и калихеамицины. Радиоактивные изотопы включают радиоактивные металлы. Цитокины включают трансформирующий фактор роста (ΤΟΡ)-β, интерлейкины, интерфероны и факторы некроза опухолей, но не ограничиваются ими. Фотодинамические агенты включают порфирины и их производные, но не ограничиваются ими. Дополнительные терапевтические метки будут известны в данной области и также здесь рассматриваются. Способы образования комплекса шАЬ против СО 105 или их фрагментов с по меньшей мере одним противоопухолевым агентом хорошо известны специалистам в данной области (т.е. конъюгаты антител, обзор которых дается СНеОе е1 а1., 1994, РНагтасо1. ТНег. 63:209-34). В таких способах можно использовать один из нескольких доступных гетеробифункциональных реактивов, используемых для соединения или связывания молекул. Здесь, кроме того, описаны дополнительные радиоактивные изотопы, наряду с дополнительными способами связывания молекул, таких как терапевтические и диагностические метки.
Антитела можно модифицировать с использованием методик, известных в данной области для различных целей, таких как, например, добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ). Модификация посредством ПЭГ (ПЭГилирование) может приводить к одному или более чем одному из следующего: увеличенное время циркуляции, улучшенная растворимость, улучшенная устойчивость к протеолизу, пониженная антигенность и иммуногенность, улучшенная биодоступность, пониженная токсичность, улучшенная стабильность и более легкое приготовление (относительно обзора, см. Ргапс18 е1 а1., 1п1егпа0опа1 1оитпа1 о£ Нета1о1оду 68:1-18, 1998).
Рс части антител можно модифицировать для увеличения периода полувыведения в системе кровообращения при введении пациенту. Модификации можно определять с использованием традиционных в данной области способов, таких как, например, описанные в патенте США № 7217798, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.
Также известны другие способы улучшения периода полувыведения слитых белков на основе антител в системе кровообращения, такие как, например, описанные в патентах США № 7091321 и 6737056, каждый из которых включен сюда посредством ссылки. Кроме того, антитела можно получать или экспрессировать так, чтобы они не содержали фукозу на их сложных Ν-гликозид-связанных сахарных цепях. Известно, что удаление фукозы из сложных Ν-гликозид-связанных сахарных цепей увеличивает эффекторные функции антител и антигенсвязывающих фрагментов, включая антителозависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) и комплементзависимую цитотоксичность (СИС), но не ограничиваясь ими. Аналогично, антитела, которые могут связываться с СИ 105, можно присоединять их С-концом ко всей тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, происходящим из любого изотипа антитела, например, 1дС, 1дА, 1§Е, 1§И и 1§М, и любого из подклассов изотипа, в частности 1§С1, 1дС2Ь. 1§С2а, 1§С3 и 1§С4.
Кроме того, описанные здесь антитела также можно модифицировать так, чтобы они могли проходить через гематоэнцефалический барьер. Такая модификация описанных здесь антител обеспечивает лечение заболеваний мозга, таких как мультиформная глиобластома (СВМ). Типичные модификации, позволяющие белкам, таким как антитела, проходить через гематоэнцефалический барьер, описаны в публикации патента США 20070082380, которая тем самым включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте.
Было показано, что гликозилирование иммуноглобулинов имеет значительные эффекты на их эффекторные функции, структурную стабильность и скорость секреции из клеток, продуцирующих антитела (Ьеа1НегЬагго\у е1 а1., Мо1. 1ттипо1. 22:407 (1985)). Углеводные группы, ответственные за данные свойства, обычно присоединены к константным (С) областям антител. Например, гликозилирование 1дС по аспарагину 297 в домене СН2 требуется для полной способности 1§С активировать классический путь комплемензависимого цитолиза (Тао, Моткоп, 1. 1ттипо1. 143:2595 (1989)). Гликозилирование 1дМ по аспарагину 402 в домене СН3 необходимо для правильной сборки и цитолитической активности антитела (Мигаока, 8Ни1тап, 1. 1ттипо1. 142:695 (1989)). Удаление сайтов гликозилирования в положениях 162 и 419 доменов СН1 и СН3 антитела 1дА приводило к внутриклеточной деградации и по меньшей мере 90%ному ингибированию секреции (Тау1ог, ^а11, Мо1. Се11. Вю1. 8:4197 (1988)). Кроме того, антитела могут быть продуцированы или экспрессированы так, что они не содержат фукозу на их сложных Ν-гликозидсвязанных сахарных цепях. Известно, что удаление фукозы из сложных Ν-гликозид-связанных сахарных цепей увеличивает эффекторные функции антител и антигенсвязывающих фрагментов, включая антителозависимую клеточную цитотоксичность (АОСС) и комплементзависимую цитотоксичность (СОС), но
- 18 029214
не ограничиваясь ими. Данные "дефукозилированные" антитела можно получать посредством ряда систем с использованием методик молекулярного клонирования, известных в данной области, включая, без ограничения, трансгенных животных, трансгенные растения или линии клеток, которые были генетически сконструированы так, чтобы они больше не содержали ферменты или биохимические пути, необходимые для включения фукозы в сложные Ν-гликозид-связанные сахарные цепи (также известные как нокаутированные по фукозилтрансферазе животные, растения или клетки). Неограничивающие примеры клеток, которые могут быть сконструированы так, чтобы они были нокаутированными по фукозилтрансферазе клетками, включают клетки СНО, клетки 8Р2/0, клетки N80 и клетки ΥΒ2/0.
Также наблюдали гликозилирование иммуноглобулинов в вариабельной (V) области. 8ох и Нооб сообщали о том, что примерно 20% человеческих антител гликозилированы в V области (Ргос. Ναΐΐ. Асаб. 8с1. И8А 66:975 (1970)). Предполагают, что гликозилирование V домена возникает в результате случайных появлений сигнала Ν-связанного гликозилирования А8и-Хаа-8ег/ТЬг в последовательности V области и, как считается в данной области, не играет роли в функции иммуноглобулина.
Гликозилирование по каркасному остатку вариабельного домена может изменять взаимодействия связывания антитела с антигеном. Настоящее изобретение включает критерии, посредством которых выбирают ограниченное число аминокислот в каркасе или СОК цепи иммуноглобулина, которые подлежат мутации (например, посредством замены, делеции или присоединения остатков) для того, чтобы увеличивать аффинность антитела.
Аффинность в отношении связывания антигена обычно можно модулировать путем введения одной или более чем одной мутации в каркас области V, типично в смежные области с одной или более чем одной СОК и/или в одну или более чем одну каркасную область. Типично такие мутации включают введение консервативных аминокислотных замен, которые либо разрушают, либо создают последовательности сайта гликозилирования, но, по существу, не влияют на гидрофобные структурные свойства полипептида. Типично избегают мутаций, которые вводят остаток пролина. Гликозилирование антител, кроме того, описано в патенте США № 6350861, который включен сюда посредством ссылки в том, что касается гликозилирования.
Антитела могут быть приготовлены для кратковременной доставки или длительной (долговременной) доставки.
Антитела, которые связываются с СО105, также можно использовать для очистки СО105 и/или для выявления уровней СО105 в образце или у пациента для того, чтобы выявлять или диагностировать заболевание или расстройство, ассоциированное с СО105, как более подробно описано ниже.
Антитела, которые связываются с СО105, полученные с использованием таких способов, можно тестировать на предмет одного или более чем одного из их аффинности связывания, авидности и нейтрализующей способности. Полезные антитела можно использовать для введения пациенту для предупреждения, ингибирования, управления или лечения состояния, заболевания или расстройства, ассоциированного с ангиогенезом.
Антитела можно оценивать на предмет одного или более чем одного из аффинности связывания, скоростей ассоциации, скоростей диссоциации и авидности. В одном аспекте антитела можно оценивать на предмет их способности нейтрализовать активность СО105 или УБОР. Измерение аффинности связывания, скоростей ассоциации, скоростей диссоциации и авидности можно осуществлять с использованием известных в данной области анализов, включающих, без ограничения, твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А), анализ Скэтчарда, анализ В1АСОКЕ (поверхностный плазмонный резонанс) и т.д., а также других анализов, обычно используемых и известных обычным специалистам в данной области.
Измерение связывания антител с СО 105 и/или способности антител, например, ингибировать антиогенез можно проводить с использованием, например, твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А), анализа конкурентного связывания, анализа ЕЫ8РОТ (метод иммуноферментных пятен) или любого другого полезного анализа, известного в данной области. Данные анализы широко используются и хорошо известны обычным специалистам в данной области.
В одном неограничивающем воплощении анализ ЕЬ18А можно использовать для измерения способности к связыванию специфичных антител, которые связываются с СО105.
Анализы, такие как ЕЬ18А, также можно использовать для идентификации антител, которые демонстрируют повышенную специфичность в отношении СО105 по сравнению с другими антителами. Анализы, такие как ЕЬ18А, также можно использовать для идентификации антител, которые связываются с эпитопами, находящимися на одном или более чем одном полипептиде или на одном или более чем одном типе СО 105 или ЕГОР. Анализ специфичности можно проводить путем проведения параллельных ЕЬ18А, в которых тестируемое антитело подвергается скринингу одновременно в отдельных камерах для анализа на способность связываться с одним или более чем одним эпитопом на разных вариантах полипептида, содержащих эпитопы СО105, для идентификации антител, которые связываются с СО105. Другой методикой измерения кажущейся аффинности связывания, известной специалистам в данной области, является методика поверхностного плазмонного резонанса (анализируемого на системе В1АСОКЕ 2000) (ЫЩеЫаб е1 а1., О1усо. 1. 2000, 17:323-329). Стандартные измерения и традиционные анализы свя- 19 029214
зывания описаны Нее1еу К.Р., ЕпДосг. Кек. 2002, 28:217-229.
Антитела, которые специфично связываются с СО 105, также можно анализировать на предмет их способности лечить различные заболевания и состояния, связанные с ангиогенезом, в связи с различными формами рака (например, первичные опухоли, повторные опухоли и метастазы). Для отслеживания таких эффектов можно использовать любой подходящий анализ, известный специалисту в данной области. Здесь описано несколько таких методик. В одном примере описанные здесь антитела анализируют на предмет их способности связываться с СО105. В другом примере определяют константы аффинности для описанных здесь антител посредством поверхностного плазмонного резонанса (8РК). В еще одном примере описанные здесь антитела анализируют на предмет их эффекта на ингибирование ангиогенеза.
Композиции.
Предложенные здесь композиции, помимо активного ингредиента (антител против СО 105), могут включать фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор, поверхностноактивное вещество или другие вещества, хорошо известные специалистам в данной области. Такие вещества должны быть нетоксичными и не должны мешать эффективности активного(ых) ингредиента(ов). Точная природа носителя или другого вещества будет зависеть от пути введения.
Здесь предложены новые композиции антител против СО 105, предварительно заполненные шприцы, содержащие данные композиции, и применение таких комозиций, полезных для лечения расстройств, связанных с ангиогенезом. Согласно настоящей заявке предложены композиции, которые можно использовать для внутривенного или внутриглазного введения, например, для лечения раковых заболеваний, ассоциированных с СО 105, и офтальмологических состояний. Связывание, аффинность, авидность и активность антитела с описанным здесь СО105 можно оценивать с использованием известных в данной области способов, включающих анализы, описанные выше и ниже в примерах, но не ограничиваясь ими.
В одном аспекте здесь предложена композиция, содержащая от примерно 1 до примерно 100 мг/мл антитела против СО105, вплоть до примерно 100 мМ забуферивающего агента, вплоть до примерно 1М полиола и имеющая рН от примерно 4,0 до примерно 5,5.
В одном аспекте данная композиция является стабильной после получения, что можно тестировать согласно традиционным способам. Безопасное обращение и введение композиций, содержащих белки, представляют собой значительные задачи для изготовителей фармацевтических композиций. Белки обладают уникальными химическими и физическими свойствами, которые представляют проблемы стабильности: для белков существует ряд путей деградации, в которые вовлечены как химическая, так и физическая нестабильность. Химическая нестабильность включает дезаминирование, агрегацию, обрезание пептидного остова и окисление остатков метионина. Физическая нестабильность включает многие феномены, включающие, например, агрегацию.
"Стабильная" композиция представляет собой композицию, в которой находящийся в ней белок, по существу, сохраняет его физическую стабильность и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении. В данной области доступны разные аналитические методики для измерения стабильности белка, и их обзор дается, например, в РерДДе апД Рго!еш Эгид ОеНуегу, 247-301, νίηсеп! Ьее ЕД., Магсе1 Оеккег, 1пс., Νον Уогк, Ν.Υ., РиЬк. (1991) и 1опек Α. АДу. Огид ОеНуегу Кеу. 10: 29-90 (1993). Стабильность можно измерять при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. Предпочтительно, композиция является стабильной при комнатной температуре (примерно 30°С) или при 40°С в течение по меньшей мере 1 месяца и/или стабильной при примерно 2-8°С в течение по меньшей мере 1 года или по меньшей мере 2 лет. Кроме того, композиция может быть стабильной после замораживания (например, до -80°С) и оттаивания данной композиции.
Белок "сохраняет его физическую стабильность" в фармацевтической композиции, если он не демонстрирует признаков агрегации, выпадения в осадок и/или денатурации при визуальном исследовании цвета и/или прозрачности, или при измерении светорассеяния в УФ (ультрафиолетовая область спектра) или посредством гель-хроматографии (§ЕС). Способы определения таких измерений известны в данной области и более подробно описаны ниже.
Белок "сохраняет его химическую стабильность" в композиции, если химическая стабильность в данное время является такой, что считается, что белок все еще сохраняет его биологическую активность, как определено ниже. Химическую стабильность можно оценивать путем выявления и количественного определения измененных форм белка. Химическое изменение может включать модификацию размера (например, усечение), которую можно оценивать с использованием, например, гель-хроматографии, δϋδ-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и/или времяпролетной масс-спектрометрии с ионизацией методом лазерной десорбции из матрицы (ΜΑ6ΟΙ/Τ0Ε Μδ). Другие типы химического изменения включают изменение заряда (например, происходящее в результате дезамидирования), которое можно оценивать, например, ионообменной хроматографией или капиллярным электрофорезом-изоэлектрическим фокусированием (сГЕР).
Антитело "сохраняет его биологическую активность" в композиции, если биологическая активность данного антитела в данное время находится, например, в пределах примерно 50-150% (в пределах ошибок анализа) от биологической активности, демонстрируемой во время, когда была получена данная
- 20 029214
композиция, при определении, например, в анализе связывания антигена. Другие анализы "биологической активности" антител разработаны ниже.
В том что касается стабильности композиции во времени, по меньшей мере 95% антитела против СГО105 может присутствовать в виде мономера после хранения при примерно 2-8°С в течение по меньшей мере примерно 12 месяцев при измерении гель-хроматографией (§ЕС). Здесь также рассматриваются другие известные в данной области способы оценки стабильности, включающие способы, описанные в примерах, но не ограничивающиеся ими.
Кроме того, антитело против СГО105 может демонстрировать примерно 50-150% связывания, определенного анализом связывания СО 105 посредством ЕЬ1§А, после хранения при примерно 2-8°С в течение по меньшей мере примерно 12 месяцев.
Средняя изоэлектрическая точка (р1) антитела против СЭ105 может составлять от примерно 8,8 до примерно 9,2 после хранения при 2-8°С в течение по меньшей мере примерно 12 месяцев при измерении, например, капиллярным электрофорезом-изоэлектрическим фокусированием.
Было бы понятно, что антитело против СГО105 может быть стабильным в течение по меньшей мере примерно 12 месяцев, по меньшей мере примерно 18 месяцев, по меньшей мере примерно 24 месяцев, по меньшей мере примерно 30 месяцев, по меньшей мере примерно 36 месяцев или более.
Композиция может содержать по меньшей мере 95% антитела против СО 105, присутствующего в виде мономера, при измерении посредством §ЕС после циклов замораживания и оттаивания композиции. В качестве альтернативы или кроме того, композиция может содержать по меньшей мере 95% антитела против ί'.Ό105. присутствующего в виде мономера, при измерении посредством §ЕС при воздействии стресса в виде встряхивания.
Антитело против СГО105 или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать любую последовательность тех СОК, которые способны связываться с СЭ105. В одном неограничивающем воплощении антитело против СЮ 105 представляет собой ТКС105, которое содержит вариабельную область легкой цепи (УЪ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8ЕО ГО N0: 1, константную область легкой цепи (СЬ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 2, вариабельную область тяжелой цепи (УН), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 3, и константную область (Рс), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 4.
В другом неограничивающем воплощении антитело против СЮ105 содержит СГОК1 УЪ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 5, СГОК2 УЪ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 6, СГОК3 УЪ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 7, СГОК1 УН, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 8, СГОК2 УН, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 9 и СГОК3 УН, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО N0: 10.
Композиция может содержать от примерно 1 до примерно 100 мг/мл антитела против СО 105, или любое значение между ними, включающее, без ограничения, примерно 2 мг/мл, примерно 5 мг/мл, примерно 7,5 мг/мл, примерно 10 мг/мл, примерно 20 мг/мл, примерно 25 мг/мл, примерно 30 мг/мл, примерно 35 мг/мл, примерно 40 мг/мл, примерно 45 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 55 мг/мл, примерно 60 мг/мл, примерно 65 мг/мл, примерно 70 мг/мл, примерно 75 мг/мл, примерно 80 мг/мл, примерно 85 мг/мл, примерно 90 мг/мл, примерно 95 мг/мл, примерно 100 мг/мл или любое целое число между ними. Термин "примерно" в том виде, как он здесь используется, относительно концентраций антител означает плюс/минус 2% от указанного значения.
В одном воплощении композиция содержит примерно 25 мг/мл антитела против СГО105. В другом воплощении композиция содержит примерно 50 мг/мл антитела против СГО105. В еще одном воплощении композиция содержит примерно 100 мг/мл антитела против СЭ105.
Композиции, как здесь описано, могут содержать забуферивающий агент, такой как, например, гистидин, ацетат, цитрат или фосфат. Забуферивающие агенты могут быть включены в количестве от примерно 5 мМ до примерно 100 мМ. В одном воплощении композиция содержит примерно 5 мМ, примерно 7,5 мМ, примерно 10 мМ, примерно 12,5 мМ, примерно 15 мМ, примерно 17,5 мМ, 20 мМ, примерно 22,5 мМ, примерно 25 мМ, примерно 30 мМ, примерно 35 мМ, примерно 40 мМ, примерно 45 мМ, примерно 50 мМ, примерно 55 мМ, примерно 60 мМ, примерно 65 мМ, примерно 70 мМ, примерно 75 мМ, примерно 80 мМ, примерно 85 мМ, примерно 90 мМ, примерно 95 мМ, примерно 100 мМ гистидин, ацетат, цитрат или фосфат, или любое целое число между ними. Термин "примерно" в том виде, как он здесь используется, относительно концентраций буфера означает плюс/минус 2% от указанного значения.
Композиции можно готовить для любого типа введения, известного для антител, включающего интравитреальное и внутривенное введение, но не ограничивающегося ими.
Предложенные здесь композиции могут дополнительно включать приемлемый носитель или эксципиент, включая любой носитель или эксципиент, который представляет собой фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, и который приемлем для введения пациенту.
В одном воплощении предложенная здесь композиция является изотоничной. Типичные изотонич- 21 029214
ные композиции включают композиции, которые являются от примерно 250 до примерно 350 миллиосмолярными, но не ограничиваются ими. В другом воплощении предложенная здесь композиция является гипертоничной. Типичные гипертоничные композиции включают композиции, которые являются от примерно 351 до примерно 1000 миллиосмолярными, но не ограничиваются ими.
В описанную здесь композицию могут быть добавлены полиолы в количестве вплоть до примерно 1 М. Например, данная композиция может содержать полиол в количестве примерно 50 мМ, примерно 75 мМ, примерно 100 мМ, примерно 150 мМ, примерно 200 мМ, примерно 225 мМ, примерно 240 мМ, примерно 250 мМ, примерно 300 мМ, примерно 350 мМ, примерно 400 мМ, примерно 450 мМ, примерно 500 мМ, примерно 550 мМ, примерно 600 мМ, примерно 650 мМ, примерно 700 мМ, примерно 750 мМ, примерно 800 мМ, примерно 850 мМ, примерно 900 мМ, примерно 950 мМ, примерно 1 М или любое целое число между ними. В одном воплощении предложенная здесь композиция содержит полиол в количестве, меньшем чем 300 мМ, и данную композицию делают изотоничной солью в концентрации от примерно 100 мМ до примерно 175 мМ. Например, композицию, содержащую полиол в количестве, меньшем чем 300 мМ, делают изотоничной солью в концентрации примерно 130 мМ. Термин "примерно" в том виде, как он здесь используется, относительно концентраций полиола означает плюс/минус 2% от указанного значения. В одном аспекте полиол, подлежащий применению в описанных здесь композициях, может представлять собой сахар, такой как, например, невосстанавливающий сахар. Типичные примеры невосстанавливающих сахаров включают трегалозу и сахарозу, но не ограничиваются ими. Например, композиция может содержать от примерно 200 до примерно 300 мМ трегалозы или сахарозы. В одном воплощении композиция может содержать примерно 240 мМ трегалозу или сахарозу. В качестве альтернативы сахар может представлять собой сорбит в количестве (концентрации) от примерно 200 до примерно 300 мМ. В одном воплощении композиция может содержать примерно 240 мМ сорбит.
Другими неограничивающими примерами предложенной здесь композиции является любая из композиций 1-39 в табл. 1.
Таблица 1
№ композиции рН фос (мМ) ΗΪ8 (мМ) цитрат (мМ) ацетат (мМ) N3(21 (мМ) трегалоза (мМ) сорбит Белок мг/мл
Р01 7 20 0 0 0 130 0 0 25
Р02 6 20 0 0 0 130 0 0 25
РОЗ 6 0 20 0 0 130 0 0 25
Р04 5 0 20 0 0 130 0 0 25
Р05 6 0 0 20 0 130 0 0 25
Р06 5 0 0 20 0 130 0 0 25
Р07 4 0 0 0 20 130 0 0 25
Р08 5 0 0 0 20 130 0 0 25
Р09 5 0 20 0 0 0 240 0 25
Р10 5 0 0 20 0 0 240 0 25
Р11 5 0 0 0 20 0 240 0 25
Р12 6 10 0 0 0 0 240 0 25
Р13 6 0 10 0 0 0 240 0 25
Р14 6 10 0 0 0 80 120 0 25
Р15 6 0 10 0 0 80 120 0 25
Р16 7 20 0 0 0 130 0 0 25
Р17 6 20 0 0 0 130 0 0 25
Р18 6 0 20 0 0 130 0 0 25
Р19 5 0 20 0 0 130 0 0 25
Р20 6 0 0 20 0 130 0 0 25
Р21 5 0 0 20 0 130 0 0 25
Р22 4 0 0 0 20 130 0 0 25
- 22 029214
Р23 5 0 0 0 20 130 0 0 25
Р24 5 0 20 0 0 0 240 0 25
Р25 5 0 0 20 0 0 240 0 25
Р26 5 0 0 0 20 0 240 0 25
Р27 6 10 0 0 0 0 240 0 25
Р28 6 0 10 0 0 0 240 0 50
Р29 6 10 0 0 0 80 120 0 50
РЗО 6 0 10 0 0 80 120 0 50
Р31 7 17 0 0 0 145 0 0 5
Р32 7 17 0 0 0 145 0 0 7
РЗЗ 5,5 0 20 0 0 0 240 0 25
Р34 5,5 0 20 0 0 0 0 240 25
Р35 4 0 0 0 20 0 0 240 25
Р36 5,5 0 20 0 0 0 240 0 50
Р37 4 0 0 0 20 0 240 0 50
Р38 5,5 0 20 0 0 0 240 0 100
Р39 4 0 0 0 20 0 240 0 100
Фос: забуференный фосфатом физиологический раствор;
Ηΐδ: гистидин.
Предложенная здесь композиция может иметь рН от примерно 4,0 до примерно 5,5. В одном воплощении предложенная здесь композиция может иметь рН примерно 4,5, примерно 5,0, примерно 5,5. Термин "примерно" при использовании здесь относительно рН относится к рН плюс/минус 0,05, 0,1 или 0,2.
Было бы понятно, что композиции, содержащие антитело, идентифицированное описанными здесь способами, можно готовить для хранения путем смешивания белка, имеющего желаемую степень чистоты, с возможными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами и/или стабилизаторами в форме вводных растворов (КеттцЮпТ РИагтасеиПса! δοίοποοδ 16ΐΗ ебФоп, 0δοί, А. Εά. (1980)).
Приемлемые носители являются физиологически приемлемыми для пациента, которому осуществляется введение, и сохраняют терапевтические свойства соединений, с которыми они вводятся/которые в них вводятся. Приемлемые носители и их композиции, в общем, описаны, например, в КеттцЮп' рНагтасеиПса! δс^еηсеδ (18Ф Εάίΐίοπ, еб. А. Оеппаго, Маск ΡυΜΐδΗΐη§ Со., Εаδΐοη, РА 1990). Одним типичным носителем является физиологический раствор. Фраза "фармацевтически приемлемый носитель" в том виде, как она здесь используется, означает приемлемое вещество, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент и/или растворитель, участвующий в переносе или транспортировке у субъекта соединений от места введения в одном органе или части организма до другого органа или части организма. Каждый носитель является приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и не вредит субъекту, которому он вводится. Приемлемый носитель не должен изменять удельную активность рассматриваемых соединений.
В одном аспекте здесь предложены фармацевтически приемлемые или физиологически приемлемые композиции, включающие растворители (водные или неводные), растворы, эмульсии, диспергирующие среды, покрытия, изотоничные и стимулирующие или задерживающие поглощение агенты, совместимые с введением. Композиции, следовательно, относятся к подходящей композиции для терапевтического и/или диагностического применения у субъекта. Композиции включают определенное количество описанного здесь соединения и фармацевтически или физиологически приемлемого носителя.
Композиции можно готовить так, чтобы они были совместимыми с конкретным путем введения (т.е. системным или локальным). Таким образом, композиции включают носители, разбавители или эксципиенты, подходящие для ведения разными путями.
Композиции можно вводить, например, путем инъекции, включая подкожную, интравитреальную, внутрикожную, внутривенную, внутриартериальную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию, но не ограничиваясь ими. В композицию можно включать изотоничные агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, и хлорид натрия. Образующиеся растворы могут быть упакованы для применения в том виде, в котором они находятся, или лиофилизированы; лиофилизированный препарат можно позднее объединять со стерильным раствором перед введением. Для внутривенной инъекции или инъекции в место поражения активный ингредиент может находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, который является апирогенным и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Специалисты с надлежащей квалификацией в данной области могут хорошо готовить подходящие растворы с использованием, например, изотоничных носителей, таких как
- 23 029214
раствор хлорида натрия для инъекции, раствор Рингера для инъекции, раствор Рингера с лактатом для инъекции. При необходимости, можно включать консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Стерильные инъецируемые растворы можно получать включением активного ингредиента в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией перечисленных выше ингредиентов, по мере необходимости, с последующей стерилизацией на фильтре.
В одном воплощении описанная здесь композиция не включает поверхностно-активные вещества. В другом воплощении описанная здесь композиция возможно включает поверхностно-активное вещество, такое как, например, полисорбат 20 или 80, ТХУЕЕЖ®, РЬИК0№С® Р68 или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
При рассмотрении композиций для применения в лекарственных средствах или любом из предложенных здесь способов рассматривается то, что композиция может, по существу, не содержать пирогенов, так что данная композиция при введении пациенту, являющемуся человеком, не будет вызывать воспалительную реакцию или небезопасную аллергическую рекцию. Тестирование композиций на предмет пирогенов и получение композиций, по существу, не содержащих пирогены, хорошо понятно обычному специалисту в данной области и может осуществляться с использованием имеющихся в продаже пакетов.
Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к молекулам и композициям, которые, при введении субъекту, являются физиологически переносимыми и типично не дают аллергическую или аналогичную нежелательную реакцию, такую как расстройство желудка, головокружение и тому подобное.
Термин "единичная доза", при использовании относительно терапевтической композиции, относится к физически отличным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъектов, причем каждая единица содержит заданное количество активного вещества, рассчитанное так, чтобы давать желаемый терапевтический эффект, в ассоциации с необходимым разбавителем, т.е. носителем или наполнителем.
Композиции можно вводить способом, совместимым с дозируемой композицией, и в терапевтически эффективном количестве. Подлежащее введению количество зависит от субъекта, подлежащего лечению, способности иммунной системы субъекта использовать активный ингредиент и желаемого уровня связывающей способности. Точные количества активного ингредиента, которые требуется вводить, зависят от решения лечащего врача и являются особенными для каждого индивида. Подходящие схемы для первоначального ведения и бустер-инъекций также варьируют, но являются типичными для первоначального введения с последующими повторными дозами с интервалом один или более чем один час, с последующей инъекцией или другим введением. В качестве альтернативы, рассматриваются непрерывные внутривенные инфузии, достаточные для поддержания концентраций в крови.
В одном воплощении рассматривается применение описанных здесь композиций для получения лекарственного средства для лечения описанного здесь состояния, заболевания или расстройства. Лекарственные средства можно готовить на основе физических характеристик пациента/субъекта, нуждающегося в лечении, и их можно готовить в одной или многих композициях на основе стадии состояния, заболевания или расстройства. Лекарственные средства могут быть упакованы в подходящие упаковки с подходящими этикетками для распространения в больницы и клиники, где этикетка предназначена для указания способа лечения субъекта, имеющего описанное здесь заболевание. Лекарственные средства могут быть упакованы в виде одиночных или многих единиц. Вместе с упаковками, как описано ниже, можно включать инструкции для дозировки и введения композиций.
Здесь также предложены предварительно заполненные шприцы для внутривенного или интравитреального введения, содержащие описанную здесь композицию. Такие предварительно заполненные шприцы можно упаковывать и прикреплять к ним этикетку, указывающую их применение для лечения состояния, связанного с ангиогенезом, такого как любое из описанных здесь состояний. Упаковки могут дополнительно включать указания по хранению и введению. Здесь предложена упаковка, содержащая один или более чем один предварительно заполненный шприц, подходящий для внутривенного или интравитреального введения, содержащий композицию по любому из предшествующих пунктов. Здесь также предложен препарат лекарственного средства, содержащий описанную здесь композицию, для лечения состояния, связанного с ангиогенезом, такого как любое из описанных здесь состояний.
Способы лечения.
Здесь предложен способ лечения субъекта (человека или не являющегося человеком) путем введения субъекту композиции антитела, которое предпочтительно связывается с СЭ105. Здесь предложены способы предупреждения или лечения одного или более чем одного заболевания или расстройства, ассоциированного с ангиогенезом/неоваскуляризацией, избыточной васкуляризацией, ростом опухоли, пролиферацией опухолевых клеток или расширением маленьких сосудов, включающие введение композиции, содержащей антитело против СЭ105, посредством этого предупреждая, осуществляя лечение, уменьшая интенсивность или облегчая заболевание или его тяжесть.
Эффективный ответ по настоящему изобретению достигается, когда субъект испытывает стаз либо частичное или полное облегчение, или уменьшение признаков или симптомов заболевания, и он конкретно включает, без ограничения, продление выживания. Ожидаемое время выживания без прогресси- 24 029214
рования заболевания может измеряться месяцами-годами, в зависимости от прогностических факторов, включающих число рецидивов, стадию заболевания и другие факторы. Продление выживания включает, без ограничения, время, составляющее по меньшей мере 1 месяц (мес.), по меньшей мере примерно 2 мес., по меньшей мере примерно 3 мес., по меньшей мере примерно 4 мес., по меньшей мере примерно 6 мес., по меньшей мере примерно 1 год (г.), по меньшей мере примерно 2 года, по меньшей мере примерно 3 года, по меньшей мере примерно 4 года, по меньшей мере примерно 5 лет и т.д. или любой интервал между ними. Общая выживаемость или выживание без прогрессирования заболевания также могут измеряться месяцами-годами. В качестве альтернативы, эффективным ответом может быть то, что признаки или симптомы субъекта или тяжесть ракового заболевания остаются статичными и не ухудшаются. Далыпейшие указания к лечению показаний описаны более подробно ниже.
Описанные здесь композиции антител можно использовать в качестве нетерапевтических агентов (например, в качестве агентов для аффинной очистки). В общем, в одном таком воплощении интересующий белок иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола 8ерЬабех® или фильтровальная бумага, используя традиционные способы, известные в данной области. Иммобилизованный белок приводят в контакт с образцом, содержащим интересующую мишень (или ее фрагмент), подлежащую очистке, и затем подложку промывают подходящим растворителем, который будет удалять, по существу, все вещество в образце, за исключением белка-мишени, который связывается с иммобилизованным антителом. Наконец, подложку промывают другим подходящим растворителем, таким как глициновый буфер, рН 5,0, который будет высвобождать белок-мишень. Помимо очистки, композиции можно использовать для выявления, диагностики и терапии заболеваний и расстройств, ассоциированных с СЭ105.
"Приведение в контакт" определяется здесь как способ приведения предложенной здесь композиции в физическую близость с клеткой, органом, тканью или жидкостью, как здесь описано. Приведение в контакт охватывает системное или местное введение любой из предложенных здесь композиций и включает, без ограничения, процедуры и способы ίη νίίΓο, ίη νίνο и/или ех νίνο. "Объединение" и "приведение в контакт" используются здесь взаимозаменяемо, и подразумевается, что они определяются одинаково. Для приложений ίη νίνο приведение в контакт может происходить, например, посредством введения композиции пациенту посредством любого подходящего способа; композиции с фармацевтически приемлемыми эксципиентами и носителями были более подробно описаны выше.
Термин "предупреждение" в том виде, как он здесь используется, относится к профилактике, предупреждению появления признаков или симптомов, предупреждению прогрессирования заболевания или расстройства, ассоциированного с ангиогенезом или коррелирующего с активностью СО 105. В одном неограничивающем воплощении диагностированному с раковым заболеванием стадии 1 можно вводить описанную здесь композицию, предупреждая, посредством этого, прогрессирование рака до стадии 2. В еще одном воплощении пациенту, который является асимптоматическим, но дает положительную реакцию на один или более чем один биомаркер рака, можно вводить описанную здесь композицию, предупреждая посредством этого прогрессирование рака. Термины "ингибирование", "лечение" и "проведение лечения" в том виде, как они здесь используются, используются взаимозаменяемо и относятся, например, к стазу признаков или симптомов, пролонгированию выживания, частичному или полному облегчению признаков или симптомов и частичному или полному уничтожению опухоли или метастазов.
"Субъект" или "пациент" (например, млекопитающее, такое как человек или животное, не являющееся человеком, такое как примат, грызун, корова, лошадь, свинья, овца, верблюд, лама и т.д.) может представлять собой млекопитающее, которое демонстрирует одно или более чем одно клиническое проявление и/или признак или симптом описанного здесь заболевания или расстройства. В определенных ситуациях субъект может быть асимптоматическим и все же иметь клинические проявления заболевания или расстройства. Антитело может быть конъюгировано с терапевтической группировкой или представлять собой слитый белок, содержащий терапевтическую группировку. Антитело может быть конъюгировано с выявляемой группировкой или представлять собой слитый белок, содержащий выявляемую группировку. В одном воплощении антитело может быть конъюгировано как с терапевтической группировкой, так и с выявляемой группировкой. Антитело может быть конъюгировано с аффинной меткой (например, меткой для очистки) или рекомбинантно модифицировано с включением аффинной метки (например, метки для очистки). Аффинные метки являются традиционными в данной области.
Предложенные здесь антитела являются такими, что они могут быть конъюгированы или связаны с терапевтической группировкой и/или группировкой для визуализации, или выявляемой группировкой, и/или аффинной меткой. Способы конъюгирования или связывания полипептидов хорошо известны в данной области. Ассоциации (связывание) между соединениями и метками включают любые способы, известные в данной области, включающие ковалентные и нековалентные взаимодействия, химическое конъюгирование, а также рекомбинантные методики, но не ограничивающиеся ими.
Термин "ангиогенез" используется здесь для включения всех аспектов поддержания и развития кровеносных сосудов. Таким образом, ангиогенез включает образование новых капиллярных кровеносных сосудов (независимо от того, бе ηονο или из предсуществующих сосудов), приводящее к неоваскуляризации, а также к поддержанию и контролю существующей сосудистой сети и маленьких кровеносных сосудов. Ангиогенез представляет собой сложный процесс, который включает серию последовательных
- 25 029214
этапов, включающих деградацию базальной мембраны сосуда и межуточного матрикса, опосредованную эндотелиальными клетками, миграцию эндотелиальных клеток, пролиферацию эндотелиальных клеток и образование капиллярных петель эндотелиальными клетками. Ангиогенез включает рост и/или развитие новых кровеносных сосудов (также именуемое неоваскуляризацией), расширение маленьких сосудов, избыточный или пролонгированный рост сосудов и поддержание существующей сосудистой сети.
Термин "заболевание, связанное с ангиогенезом", используется здесь для обозначения определенных патологических процессов у человека, когда ангиогенез является ненормально пролонгированным. Он, кроме того, включает связанные с ангиогенезом состояния и заболевания, такие как те заболевания и состояния, которые относятся к ангиогенезу, вызваны или ассоциированы с ангиогенезом. Неограничивающие примеры таких заболеваний включают различные формы раковых заболеваний и метастазов, дегенерацию желтого пятна и СNУ (хороидальная неоваскуляризация). Описанные здесь антитела можно использовать для лечения заболевания, ассоциированного с ангиогенезом, путем связывания с ί'.Ό105 и ингибирования ангиогенеза.
Термин "антиангиогенная терапия" используется здесь для обозначения терапии, направленной на клетки и/или сосудистую сеть, экспресирующие СИ 105 (экспрессируется на высоком уровне на пролиферирующей сосудистой сети по сравнению с сосудистой сетью в состоянии покоя); он, кроме того, включает терапию, которая направлена против ангиогенеза (т.е. формирования новых капиллярных кровеносных сосудов, приводящего к неоваскуляризации), терапию, которая направлена против существующей сосудистой сети и/или избыточной васкуляризации или роста кровеносных сосудов, терапию, направленную на расширение маленьких сосудов, и терапию, направленную на заболевание или состояние (например, терапия, направленная на сосуды). Типичные заболевания или состояния, рассматриваемые в пределах данного изобретения, включают разные формы рака и метастазов, но не ограничиваются ими.
Здесь предложен способ лечения заболевания, связанного с ангиогенезом, у пациента (субъекта), нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту описанной здесь композиции. Такие композиции можно вводить пациенту интравитреально или внутривенно.
Описанное здесь заболевание, связанное с ангиогенезом, может представлять собой, например, рак или метастаз. В одном воплощении рак представляет собой солидную опухоль. Раковые заболевания, подлежащие лечению, включают, например, опухоль на основе эпителия. Неограничивающие примеры раковых заболеваний, подлежащих лечению такими композициями, включают рак легкого, гинекологическое злокачественное образование, меланому, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак матки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, рак головы, рак поджелудочной железы, рак печени (печеночно-клеточный рак), рак матки, рак шеи, рак почки (почечноклеточный рак), саркому, миелому и лимфому, но не ограничиваются ими. Композиции для лечения рака или метастаза могут вводиться пациенту внутривенно.
В качестве альтернативы, описанное здесь заболевание, связанное с ангиогенезом, может представлять собой, например, офтальмологическое состояние. Офтальмологические состояния включают возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию, макулярный отек и/или хороидальную неоваскуляризацию, но не ограничиваются ими. Возрастная дегенерация желтого пятна (АМЭ) может представлять собой влажную АМЭ или сухую АМЭ. Композиции для лечения офтальмологического состояния можно вводить пациенту интравитреально.
В таких способах композицию можно вводить пациенту один или более чем один раз. Например, композицию можно вводить один раз в сутки, один раз в неделю, один раз в месяц, один раз в два месяца, один раз каждые два месяца, один раз каждые три месяца, один раз каждые четыре месяца, один раз каждые 5 месяцев или один раз каждые 6 месяцев. Интенсивность схем лечения можно увеличивать или уменьшать, по необходимости, в зависимости от ответа пациента на лечение.
В одном аспекте композицию вводят до тех пор, пока не ослабевает один или более чем один признак или симптом заболевания, связанного с ангиогенезом.
В том, что касается офтальмологических состояний, один или более чем один признак или симптом может включать сужение кровеносных сосудов, ингибирование пролиферации эндотелиальных клеток, ассоциированной с глазным заболеванием, уменьшение признаков или симптомов кровотечения, лечение мутного зрения, обеспечение остановки потери зрения, улучшение зрения и/или предупреждение транссудации из кровеносных сосудов, но не ограничивается ими.
В том что касается раковых заболеваний или метастазов, лечение может приводить к улучшению состояния пациента, и лечение можно оценивать путем определения того, наблюдается ли один или более чем один из следующих факторов: пониженная пролиферация клеток, пониженное число клеток, усиленный апоптоз или пониженное выживание по меньшей мере части клеток, участвующих в клеточном пролиферативном расстройстве.
Лечение может приводить к частичному или полному устранению опухоли или метастазов и/или к продлению выживания пациента.
В одном воплощении один или более чем один признак или симптом уменьшается по тяжести или продолжительности примерно на 2%, примерно на 5%, примерно на 10%, примерно на 15%, примерно на
- 26 029214
20%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 35%, примерно на 40%, примерно на 45%, примерно на 50%, примерно на 55%, примерно на 60%, примерно на 65%, примерно на 70%, примерно на 75%, примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 95% или примерно на 100% после введения одной или более чем одной дозы данной композиции пациенту.
В другом воплощении один или более чем один признак или симптом уменьшается по тяжести или продолжительности примерно в 2 раза, примерно в 5 раз, примерно в 10 раз, примерно в 15 раз, примерно в 20 раз, примерно в 25 раз, примерно в 30 раз, примерно в 35 раз, примерно в 40 раз, примерно в 45 раз, примерно в 50 раз, примерно в 55 раз, примерно в 60 раз, примерно в 65 раз, примерно в 70 раз, примерно в 75 раз, примерно в 80 раз, примерно в 90 раз, примерно в 95 раз, примерно в 100 раз или более, после введения одной или более чем одной дозы данной композиции пациенту.
Здесь предложен способ лечения офтальмологического состояния у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту описанной здесь композиции, при этом посредством данного лечения уменьшается интенсивность одного или более чем одного признака или симптома указанного офтальмологического состояния. Введение композиции может представлять собой интравитреальное введение.
Здесь также предложен способ предупреждения или лечения рака или метастаза у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту описанной здесь композиции, при этом уменьшается интенсивность одного или более чем одного признака или симптома указанного ракового заболевания или метастаза. Введение композиции может представлять собой внутривенное введение.
Термины "повторное проявление", "рецидив" или "рецидивирующий" относятся к возвращению рака или заболевания после клинической оценки исчезновения заболевания. Рецидивом будет считаться диагноз удаленных метастазов или местного повторного проявления.
Термин "поддерживающая терапия" относится к повторному лечению по графику, которое дают для того, чтобы помочь поддерживать эффекты предыдущего лечения. Поддерживающую терапию часто дают для того, чтобы помочь поддерживать рак в состоянии ремиссии или продлить ответ на специфичную терпию, независимо от прогрессирования заболевания.
Термин "выживаемость без прогрессирования заболевания" в онкологии относится к продолжительности времени на протяжении и после лечения, когда рак не прогрессирует. Выживаемость без прогрессирования заболевания включает количество времени, на протяжении которого пациенты испытывают полный ответ или частичный ответ, а также количество времени, на протяжении которого пациенты испытывают стабильное заболевание.
В одном аспекте здесь предложен способ предупреждения или лечения рака или метастаза у субъекта путем введения любой из предложенных здесь композиций пациенту, страдающему от рака или метастаза. Такой пациент может быть симпоматическим или асимптоматическим.
В некоторых случаях введение данной композиции продлевает жизнь пациента, которого лечат, уменьшает объем опухоли, устраняет опухоль, уменьшает пролиферацию клеток, увеличивает апоптоз опухолевых клеток или приводит к комбинации перечисленного.
При необходимости данные способы могут дополнительно включать хирургическое удаление рака и/или введение дополнительного противоракового агента или лечения. Противораковые агенты были предложены здесь в других местах.
В одном аспекте уменьшается интенсивность признаков или симптомов у пациента, страдающего от рака. Уменьшение интенсивности может проявляться, например, как уменьшение боли, уменьшение размера опухоли, устранение опухолей, предупреждение увеличений размера опухоли или прогрессирования заболевания, предупреждение образования метастаза или ингибирование метастатического роста, или как их комбинация.
В одном аспекте введение описанной здесь композиции уменьшает или устраняет необходимость для пациента подвергаться хирургическому вмешательству или лечению одним или более чем одним дополнительным противораковым агентом или способом лечения.
Композиции, содержащие антитело против ί'.Ό105. можно вводить последовательно или одновременно с композицией, содержащей антитело против УЕОР (или его антигенсвязывающий фрагмент). Такие введения включают, без ограничения, введение в пределах примерно 12 недель друг за другом, в пределах примерно 8 недель друг за другом, в пределах примерно 4 недель друг за другом, в пределах примерно 3 недель друг за другом, в пределах примерно 2 недель друг за другом, в пределах примерно недели друг за другом, в пределах суток друг за другом, в пределах примерно 12 ч друг за другом, в пределах примерно 6 ч друг за другом, в пределах примерно 3 ч друг за другом, в пределах примерно 1 ч друг за другом, в пределах примерно 30 мин друг за другом, в те же самые сутки, в то же самое время или их комбинацию. При рассмотрении многих доз композиции по настоящему изобретению и/или комбинированной терапевтической группировки, понятно, что дозы каждой могут быть определены эмпирически с использованием известных доз и концентраций на основе возраста, роста, массы, состояния здоровья и других физических характеристик субъекта, используя стандарты имеющихся в продаже продуктов.
Композиции можно вводить пациенту в терапевтически эффективном количестве, которое является
- 27 029214
эффективным для получения некоторого желаемого терапевтического эффекта путем ингибирования заболевания или расстройства при приемлемом отношении польза/риск, приложимом к любому медицинскому лечению. Для введения настоящих композиций пациентам-людям данные композиции можно готовить посредством методологии, известной специалисту в данной области. Терапевтически эффективное количество представляет собой количество, при котором по меньшей мере частично достигается желаемый терапевтический или профилактический эффект в органе или ткани. Количество антитела против ί'.Ό105 или антитела против νΕΟΡ, необходимое для осуществления предупреждения и/или терапевтического лечения заболевания или расстройства, само по себе не является фиксированным. Количество введенного антитела может варьировать в зависимости от типа заболевания, обширности заболевания и размера млекопитающего, страдающего от заболевания или расстройства. В одном воплощении пациенту вводят два описанных здесь антитела, как описано выше. Введение в комбинации может относиться к введению в одной композиции или в отдельных композициях.
Термин "введение" относится здесь к предоставлению одной или более чем одной композиции пациенту таким способом, который приводит к тому, что композиция оказывается внутри организма пациента. Такое введение можно осуществлять любым путем, включающим, без ограничения, местное, региональное или системное, посредством подкожного, интравитреального, внутрикожного, внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного или внутримышечного введения (например, инъекции).
Реальные уровни дозировок активных ингредиентов в композициях могут варьировать так, чтобы получать такое количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без того, чтобы быть токсичными для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от ряда факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, путь введения, время введения, скорость выделения конкретного используемого соединения, продолжительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или вещества, используемые в комбинации с конкретной применяемой композицией, возраст, пол, массу, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую медицинскую историю пациента, которого лечат, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
Кроме того, дозу(ы) антитела можно вводить дважды в неделю, еженедельно, каждые 2 недели, каждые 3 недели, каждые 4 недели, каждые 6 недель, каждые 8 недель, каждые 12 недель, каждые 24 недели или на протяжении любой комбинации числа недель между ними. Также рассматриваются циклы дозирования, такие как, например, введение антител один или два раза в неделю в течение 2, 3, 4, 5 или 6 недель, с последующими 1, 2, 3, 4, 5 или 6 неделями без терапии. В качестве альтернативы, в зависимости от ответа субъекта на терапию, время между циклами лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев. В пределах данного изобретения также рассматриваются дополнительные циклы дозирования, включающие, например, разные комбинации описанных здесь доз и еженедельных циклов.
Лечащий врач или ветеринар может легко определять и прописывать эффективное количество (ΕΌ50) требующейся композиции. Например, лечащий врач или ветеринар мог бы начинать с доз соединений, используемых в композиции, имеющих меньшие уровни, чем уровни, требующиеся для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку, пока не будет достигнут желаемый эффект. В качестве альтернативы, доза может оставаться постоянной.
Композиции можно вводить пациенту любым удобным путем, таким как описанные выше. Независимо от выбранного пути введения, соединения по настоящему изобретению, которые можно использовать в подходящей гидратированной форме, и/или композиции готовят в приемлемых лекарственных формах, таких как описанные ниже, или другими традиционными способами, известными специалистам в данной области.
Данные, полученные из анализов культуры клеток и/или исследований на животных можно использовать для приготовления ряда дозировок для применения у человека. Дозировка может варьировать в пределах данного интервала в зависимости от используемой дозировки и применяемого пути введения. Для любого соединения терапевтически эффективную дозу можно исходно оценивать из анализов на культуре клеток. В животных моделях доза может быть приготовлена для достижения интервала концентрации, циркулирующей в плазме, который включает 1С50 (т.е. концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование), при определении в культуре клеток. Уровни в плазме можно измерять, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией. Такую информацию можно использовать для более точного определения полезных доз у человека. Композиции, содержащие комбинации соединений, также можно оценивать с использованием любого из данных способов.
В одном воплощении согласно изобретению рассматривается ингибирование ангиогенеза в ткани. Уровень ангиогенеза в ткани и, следовательно, степень достигаемого ингибирования можно оценивать рядом способов, таких как описанные здесь.
Уникальная специфичность антител, которые распознают (например, предпочтительно связываются) с ί'.Ό105 или νΕΟΡ и ингибируют ангиогенез, обеспечивает диагностические и терапевтические применения в отношении заболеваний, характеризующихся ангиогенезом (неоваскуляризацией), расширением маленьких сосудов, избыточной васкуляризацией, пролиферацией опухолевых клеток и/или ростом
- 28 029214
опухоли. Антитела можно вводить субъекту, страдающему от разных форм рака (первичных опухолей и метастазов).
Было бы понятно, что помимо введения описанных здесь композиций здесь рассматривается то, что субъекта также можно лечить одним или более чем одним дополнительным ингибитором ангиогенеза.
Термин "ингибитор ангиогенеза" в том виде, в котором он здесь используется для задач описания и формулы изобретения, означает соединение или молекулу, включающую, без ограничения, пептиды, белки, ферменты, полисахариды, олигонуклеотиды, ДНК, РНК, реомбинантные векторы и лекарственные средства, которые функционируют, ингибируя ангиогенез. Ингибиторы ангиогенеза известны в данной области, и здесь рассматриваются все их типы. Неограничивающие примеры соединений и молекул включают природные и синтетические биомолекулы, такие как паклитаксел, О(хлорацетилкарбомил)фумагиллол ("ΤΝΈ-470" или "АОМ 1470"), тромбоспондин-1, тромбоспондин-2, ангиостатин, происходящий из хондроцитов человека ингибитор ангиогенеза ("ЙСН1АМР"), ангиогенный ингибитор, происходящий из хряща, фактор тромбоцитов-4, дго-бета, человеческий интерферониндуцибельный белок 10 ("1Р10"), интерлейкин 12, Ко 318220, трициклодекан-9-ил-ксантат ("Ό609"), ирсогладин, 8,9-дигидрокси-7-метил-бензо[Ь]хинолизиния бромид ("ОРА 1734"), медроксипрогестерон, комбинация гепарина и кортизона, ингибиторы глюкозидазы, генистеин, талидомид, диаминоантрахинон, гербимицин, урсоловая кислота и олеанолевая кислота. Неограничивающие примеры антител включают антитела, направленные против таких молекул, как УЕОР, рецептор УЕОР или разные эпитопы ί'Ό105. Кроме того, известны и рассматриваются здесь низкомолекулярные ингибиторы рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают ранибизумаб, афлиберцепт, сунитиниб, сорафениб, акситиниб, пегаптаниб и пазопаниб.
С описанными здесь композициями можно вводить многочисленные комбинации данных ингибиторов рецептора УЕОР. В одном воплощении комбинации могут приводить к применению меньших доз описанных антител или антигенсвязывающих фрагментов. Такие изменения дозировки могут возникать в результате синергических эффектов комбинаций антител.
Рак.
ί'Ό105 ассоциирован с ангиогенезом опухолей и подвергается сильной повышающей регуляции в эндотелии различных опухолевых тканей по сравнеию с регуляцией в нормальных тканях. СО 105 подвергается повышающей регуляции в широком спектре эндотелиев опухолей. Кроме того, происходит более сильная экспрессия СО 105 в эндотелии опухоли, чем в соответствующей нормальной ткани. Таким образом, ингибирование ангиогенеза антителами против ί'Ό105 представляет собой возможность лечения раковых опухолей. Описанные здесь композиции можно использовать для лечения раковых опухолей и метастазов. Данные композиции также можно использовать в композициях лекарственных средств для лечения раковых опухолей и метастазов.
УЕОР представляет собой одну мишень для противоопухолевой терапии, так как его экспрессия подвергается повышающей регуляции в целом ряде солидных опухолей. УЕОР представляет собой важный регулятор ангиогенеза - роста новых сосудов из предсуществующих сосудов. Данный процесс играет фундаментальную роль для роста солидных опухолей, который основан на образовании новых кровеносных сосудов. Определенные низкомолекулярные терапевтические агенты могут нацеливаться на рецептор фактора роста эндотелия сосудов ("УЕОРК"); такое нацеливание низкомолекулярных терапевтических средств может приводить к противораковым эффектам. Агенты, нацеленные на рецептор УЕОР, опосредованно блокируют рост опухоли через ингибирование образования новых сосудов. Ингибирование ангиогенеза, индуцированного УЕОР, может оказывать противоопухолевый или улучшенный противоопухолевый эффект без значимого ингибирования стимуляции макрофагов, остеокластов или хондрокластов посредством УЕОР.
Термин "опухоль" используется здесь для названия раковой ткани, экспрессирующей СО 105 и/или УЕОР (по сравнению с экспрессией нормальной тканью того же самого типа). Опухоли могут включать солидные опухоли и полусолидные опухоли. Неограничивающие примеры опухолей включают человеческие лейкозы, включая острый лимфобластный лейкоз (АРЬ) не Т-клеточного типа (не Т), миеломоноцитарный лейкоз и человеческие солидные и полусолидные опухоли с окружающей их сосудистой сетью, экспрессирующие СО 105 на уровне от умеренного до высокого (по сравнению с экспрессией нормальной тканью того же самого типа), включая ангиосаркому, карциному молочной железы, рак желудка, ходжкинскую лимфому, лимфому, мультиформную глиобластому (ОВМ), карциному легкого, меланому, миелому, лимфому, остеосаркому, карциному яичника, опухоль околоушной железы, карциному глотки, карциному предстательной железы, печеночно-клеточную карциному, карциному почки и карциному ректосигмоидного отдела.
Раковая ткань, подлежащая лечению, представляет собой, например, эндотелиальную ткань, экспрессирующую ненормальный уровень СО 105 и/или УЕОР.
В отсутствие неоваскуляризации опухолевой ткани данная опухолевая ткань не получает требующихся питательных веществ, замедляет рост, прекращает дополнительный рост, регрессирует и, в конечном счете, становится некротической, приводя к уничтожению опухоли. Здесь предложены способы ингибирования неоваскуляризации опухоли путем ингибирования ангиогенеза опухоли. Аналогично, здесь
- 29 029214
предложены способы ингибирования роста опухоли.
Данные способы также являются особенно эффективными против образования метастазов, так как для их образования требуется васкуляризация первичной опухоли, так что метастатические раковые клетки могут покидать первичную опухоль, и для того, чтобы они обосновались во вторичном сайте, требуется неоваскуляризация для поддержки роста метастазов.
Будет понятно, что у "субъекта, страдающего от рака/метастаза", по изобретению, может экспрессироваться мутантный белок (ассоциированный с опухолью антиген) или мутантный ген, и он все еще может не быть симптоматическим в отношении заболевания. В одном неограничивающем примере рака толстой кишки (который ассоциирован с мутантным белком К-газ) субъект с мутантным белком К-газ в некоторых клетках толстой кишки представляет собой субъекта, подлежащего лечению, даже несмотря на то что субъект все еще может не быть симптоматическим в отношении рака толстой кишки. "Признаки или симптомы заболевания" представляют собой клинически признанные проявления или признаки заболевания.
Под "лечением" субъекта, страдающего от опухоли или метастаза, подразумевается то, что признаки или симптомы субъекта частично снимаются, полностью снимаются или остаются статичными после лечения. Пациент, которого лечили, может демонстрировать частичное или полное снятие опухолевой нагрузки. Подразумевается, что это охватывает профилактику, терапию и излечение. В одном неограничивающем примере лечат субъекта, страдающего от высокометастатического рака (например, рака молочной железы), при чем дополнительные метастазы либо не появляются, либо уменьшаются в числе по сравнению с субъектом, который не получает лечение. В другом неограничивающем примере субъекта лечат, причем солидный рак субъекта либо уменьшается в размере, либо не увеличивается в размере по сравнению с субъектом, который не получает лечение. В еще одном неограничивающем примере число раковых клеток у субъекта, которого лечат, либо не возрастает, либо уменьшается по сравнению с числом раковых клеток у субъекта, который не получает лечение. Улучшение также можно определять, например, как пониженную пролиферацию клеток, уменьшенное число клеток, усиленный апоптоз и/или улучшенное выживание субъекта, которого лечат.
Лечение может приводить к частичному или полному устранению опухоли или метастазов и/или к продлению выживания пациента.
В одном воплощении тяжесть или продолжительность одного или более чем одного признака или симптома уменьшается примерно на 2%, примерно на 5%, примерно на 10%, примерно на 15%, примерно на 20%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 35%, примерно на 40%, примерно на 45%, примерно на 50%, примерно на 55%, примерно на 60%, примерно на 65%, примерно на 70%, примерно на 75%, примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 95% или примерно на 100% после введения пациенту одной или более чем одной дозы композиции.
В другом воплощении тяжесть или продолжительность одного или более чем одного признака или симптома уменьшается примерно в 2 раза, примерно в 5 раз, примерно в 10 раз, примерно в 15 раз, примерно в 20 раз, примерно в 25 раз, примерно в 30 раз, примерно в 35 раз, примерно в 40 раз, примерно в 45 раз, примерно в 50 раз, примерно в 55 раз, примерно в 60 раз, примерно в 65 раз, примерно в 70 раз, примерно в 75 раз, примерно в 80 раз, примерно в 90 раз, примерно в 95 раз, примерно в 100 раз или более после введения пациенту одной или более чем одной дозы композиции.
Опухоль или рак, подлежащие лечению в описанных здесь способах, включают рак легкого, гинекологическое злокачественное образование, меланому, рак молочной железы, рак мозга (например мультиформная глиобластома, "ΟΒΜ" или глиома), рак поджелудочной железы, рак яичника, рак матки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, рак головы, рак печени (печеночно-клеточный рак), рак шеи, рак почки (почечно-клеточный рак), рак пениса, рак желудка, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, саркому, карциному, миелому и лимфому, но не ограничиваются ими. В одном воплощении опухоль, подлежащая лечению, представляет собой солидную или полусолидную опухоль. В другом воплощении опухоль, подлежащая лечению, представляет собой первичную опухоль. В другом воплощении опухоль, подлежащая лечению, представляет собой метастатическую опухоль. В одном воплощении опухоль или рак, подлежащие лечению, имеют эпителиальное происхождение. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой миелому. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой рак яичника. В другом воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой рак почки/почечный рак. В еще одном воплощении рак, подлежащий лечению, представляет собой печеночно-клеточный рак/рак печени.
При необходимости соединения можно вводить в комбинации с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим лечением, включающим, без ограничения, следующие: адриамицин, циклофосфамид, паклитаксел, пеметрексед, темозоломид, оксалиплатин, цетуксимаб, панитумумаб, сорафениб, сунитиниб, гефитиниб, эрлотиниб, 5-фторурацил, иринотекан, топотекан, лейковорин, бортезумиб, леналидомид, талидомид, капецитабин, доцетаксел и многие другие описанные здесь традиционные противораковые терапии. Термин "излучение" в том виде, как он здесь используется, относится, например, к микроволнам, ультрафиолетовому (УФ), инфракрасному (ИК) или альфа-, бета-, или гамма-излучению. Излучение может быть "сфокусировано" или доставлено локально с использованием традиционных ме- 30 029214
тодик для нацеливания излучения на место одной или более чем одной опухоли без облучения всего организма. Было бы понятно, что перечисление перечисленных ниже терапевтических схем представляет традиционные терапии, но настоящее изобретение охватывает другие известные терапевтические схемы, которые здесь конкретно не раскрыты.
В одном воплощении рак представляет собой рак яичника, и одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургию, химиотерапию (например, доксорубицин, липосомы с доксорубицином НС1, гемцитабин и химиотерапевтические средства на основе платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин), мелфалан, ингибиторы топоизомеразы I, такие как топотекан и иринотекан, терапия на основе таксанов, гормоны, лучевая терапия, гипотермия всего организма, производные изофлавона, цитотоксические макролиды, такие как эпотилоны, ингибиторы ангиогенеза, такие как бевацизумаб, ингибиторы трансдукции сигнала, такие как трастузумаб, генотерапия, терапия на основе РНКи (РНК-интерференция), иммунотерапия, моноклональные антитела, ингибиторы фосфатидилинозитол-подобной киназы, такие как рапамицин, или любая их комбинация. Также можно предоставить комбинированную терапию описанными здесь антителами с терапиями против рака яичника для снижения доз любой из двух терапий или обеих благодаря синергическому эффекту в результате совместного введения данных терапий.
В одном воплощении рак представляет собой почечный рак/рак почки, и одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургию, химиотерапию, пазопаниб, интерферон-альфа или 1Ь-2 (интерлейкин-2). В еще одном воплощении дополнительный агент представляет собой ингибитор рецептора ΥΞΟΡ. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора ΥΞΟΡ включают описанные выше ингибиторы, афлиберцепт, сунитиниб, сорафениб, акситиниб и пазопаниб. Также можно предоставить комбинированную терапию описанными здесь антителами с терапиями против рака почки для снижения доз любой из двух терапий или обеих благодаря синергическому эффекту в результате совместного введения данных терапий.
В одном воплощении раковое заболевание представляет собой миелому, и одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургию, лучевую терапию, бортезомиб, леналидомид или талидомид. Дозировки для любой из этих терапий известны в данной области и могут быть соответствующим образом скорректированы при комбинированной терапии.
В одном воплощении раковое заболевание представляет собой рак предстательной железы, и одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургию, лучевую терапию (например терапию внешним пучком или брахитерапию), гормональную депривацию (подавление андрогена, включая абиратерон), ингибиторы белка теплового шока 90 (Н8Р90), химиотерапию (например доцетаксел, эстрамустин, химиотерапия на основе платины, как, например, цисплатин, карбоплатин, сатраплатин и оксалиплатин), преднизон или преднизолон, снижающие уровень холестерина лекарственные средства, такие как статины, агонисты рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (ЬНКН), терапия на основе РНКи, терапии на основе дендритных клеток, целые опухолевые клетки, генетически модифицированные для секреции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р) (также известные как ОVАX) или любую их комбинацию. В еще одном воплощении дополнительный агент представляет собой ингибитор рецептора ΥΞΟΡ. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора ΥΞΟΡ включают афлиберцепт, сунитиниб, сорафениб, акситиниб и пазопаниб.
В одном воплощении раковое заболевание представляет собой рак легкого, и одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургию, лучевую терапию (например торакальную лучевую терапию, лучевую терапию заряженными частицами, химиотерпию на основе урацил-тегафура и платины (например цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин и т.д.) и винорелбин, эрлотиниб, гефитиниб, антитела против рецептора эпидермального фактора роста (например цетуксимаб), низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ, прямые ингибиторы белков, участвующих в пролиферации клеток рака легкого, ингибиторы киназы Ашота, термотерапия, индуцированная лазером, терапия на основе РНКи, целые опухолевые клетки, генетически модифицированные для секреции гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (ОМ-С8Р) (также известные как ОVАX) или любую их комбинацию. Дополнительные терапевтические лечения включают паклитаксел или пеметрексед. В еще одном воплощении дополнительный агент представляет собой ингибитор рецептора УБОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора ΥΈΟΡ включают афлиберцепт, сунитиниб, сорафениб, акситиниб и пазопаниб. Дозировки для любой из данных терапий известны в данной области и могут быть соответствующим образом скорректированы при комбинированной терапии.
В одном воплощении рак представляет собой рак молочной железы, и одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургию, моноклональные антитела (например антитела против Нег-2, герцептин), адъювантную химиотерапию, как, например, химиотерапию с одним агентом или комбинированную химиотерапию (например полихимиотерапии на основе антрациклина и таксана), специфичный в отношении мишени трастузумаб с манипуляцией эндокринной системой или без нее, с РМКТ (постмастэктомическая лучевая терапия) или без нее, винорелбин), адриамицин, циклофосфамид, капецитабин, доцетаксел, селективные модуляторы рецептора эстрогена, такие как тамоксифен и ралоксифен, аллостерические модуляторы рецептора эстрогена, такие как трилостан, излу- 31 029214
чение (например интерстициальная брахитерапия, устройство Маттокйе, 3-мерное конформное внешнее излучение и интраоперационная лучевая терапия), ингибиторы ароматазы, которые подавляют общий синтез в организме (например анастрозол, экземестан и летрозол), терапия на основе РНКи, внутривенные аналоги рапамицина, которые являются иммуносупрессивными и антипролиферативными, такие как темсиролимус, или любую их комбинацию. Обзор способов осуществления трехмерного моделирования рака молочной железы на основе культуры ткани ίη νίίΐΌ описан Кат е! а1., Вгеак! Сансег КекеагсЬ Тгеа1теШ 85(3): 281-91 (2004). Известны другие модели ίη νί\Ό и ίη νίΙΐΌ для тестирования раковых заболеваний, и их можно использовать для тестирования описанных здесь антител. В еще одном воплощении дополнительный агент представляет собой ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают афлиберцепт, сунитиниб, сорафениб, акситиниб и пазопаниб. Дозировки для любой из данных терапий известны в данной области и могут быть соответствующим образом скорректированы при комбинированной терапии.
В одном воплощении раковое заболевание представляет собой рак толстой кишки, и одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой хирургию, лучевую терапию и химиотерапию (например 5-фторурацил, левамизол, лейковорин или семустин (метил ССЫи)), N-[2(диметиламино)этил]акридин-4-карбоксамид и другие родственные карбоксамидные противораковые лекарственные средства; ингибиторы топоизомеразы, не являющиеся ингибиторами топоизомеразы II, иринотекан, липосомный топотекан, противораковые агенты из класса таксанов (например паклитаксел или доцетаксел), соединение из класса ксантенон-уксусной кислоты (например 5,6-диметилантенон-4уксусная кислота РМАА), ламинарин, сайт-селективные аналоги циклического АМФ (например, 8хлораденозин-3',5'-циклический фосфат), пираноиндольные ингибиторы Сох-2 (циклооксигеназа-2), карбазольные ингибиторы Сох-2, тетрагидрокарбазольные ингибиторы Сох-2, инденовые ингибиторы Сох2, локализованные ингибиторы Ν3ΑΙΌ (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства) (например антраниловые кислоты, аспирин (5-ацетилсалициловая кислота), азодисалицилат натрия, карбогетероциклические кислоты, карпрофен, хлорамбуцил, диклофенак, фенбуфен, фенклофенак, фенопрофен, флуфенамовая кислота, флурбипрофен, флупрофен, фуросемид, ауротиомалат натрия, ибупрофен, индометацин, индопрофен, кетопрофен, лоназолак, локсопрофен, меклофенамовая кислота, мефанамовая кислота, мелфалан, напроксен, пеницилламин, фенилуксусные кислоты, проприоновые кислоты, салициловые кислоты, салазосульфапиридин, сулиндак, толметин, пиразолон, бутазон, пропазон, Ν3ΑΙΌ, мелоксикам, оксикамы, пироксикам, фелден, пироксикам-бета-циклодекстран, теноксикам, этодолак и оксапрозин), ингибитор НЕК^Шеи, терапия на основе РНКи, ОМ-СЗР, моноклональные антитела (например антитела против Нег-2/ю, антитела против СЕА (карциноэмбриональный антиген), Α33 (НВ 8779), 100-210 (НВ 11764) и 100-310 (НВ 11028)), цетуксимаб, панитумумаб, гормональная терапия, пиримидинамины, производные камптотецина (например СРТ-11), фолиновая кислота (ΡΑ), гемцитабин, Ага-С, химиотерапевтические средства на основе платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин, цГМФ(циклический гуанозинмонофосфат)-специфичный ингибитор фосфодиэстеразы или любую их комбинацию. В одном воплощении дополнительное терапевтическое лечение представляет собой комбинацию 5-фторурацила, лейковорина и оксалиплатина (РОЬРОХ). В одном воплощении дополнительное терапевтическое лечение представляет собой комбинацию 5-фторурацила, иринотекана и лейковорина (1РЬ). В одном воплощении дополнительный агент представляет собой цетуксимаб. В одном воплощении дополнительный агент представляет собой панитумумаб. В еще одном воплощении дополнительный агент представляет собой ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают афлиберцепт, сунитиниб, сорафениб, акситиниб и пазопаниб. Дозировки для любой из данных терапий известны в данной области и могут быть соответствующим образом скорректированы при комбинированной терапии.
В одном воплощении раковое заболевание представляет собой рак поджелудочной железы, и одно или более чем одно дополнительное терапевтическое лечение представляет собой комбинацию терапевтических лечений в виде хирургии, лучевой терапии, 5-фторурацила и лучевой терапии, системной терапии, стентирования, гемцитабина, гемцитабина и лучевой терапии, цетуксимаба, эрлотиниба, химиолучевой терапии или любую их комбинацию. В еще одном воплощении дополнительный агент представляет собой ингибитор рецептора УЕОР. Неограничивающие примеры ингибиторов рецептора УЕОР включают афлиберцепт, сунитиниб, сорафениб, акситиниб и пазопаниб.
Пациентов можно оценивать в отношении признаков или симптомов в один или более чем один из множества моментов времени, включая моменты до, во время и после схем лечения. Лечение может приводить к улучшению состояния субъекта и может быть оценено путем определения того, наблюдается ли один или более чем один из следующих факторов: уменьшенный размер опухоли, пониженная пролиферация клеток, пониженное число клеток, ослабленная неоваскуляризация, усиленный апоптоз или пониженное выживание по меньшей мере части клеток, участвующих в клеточном пролиферативном расстройстве. Одно или более чем одно из данных проявлений может, в некоторых случаях, приводить к частичному или полному устранению рака и/или продлению выживания пациента. В качестве альтернативы, для последних стадий раковых заболеваний, лечение может приводить к стазу заболевания, лучшему качеству жизни и/или продлению выживания.
- 32 029214
При введении композиций последовательно композицию, описанную здесь, содержащую антитело против СО105, можно, например, вводить до и/или после антитела против УЕСР (или его антигенсвязывающего фрагмента).
При введении композиций одновременно композицию, содержащую антитело против СО105, можно вводить в тот же самый сайт или в другой сайт, чем композицию, содержащую антитело против УЕСР.
В еще одном воплощении здесь предложены композиции (лекарственные средства), содержащие антитело против ί'.Ό105 и антитело против УЕСР (или его антигенсвязывающий фрагмент), способные ингибировать одну или более чем одну биологическую активность СО 105 и УЕСР соответственно, такую как митогенная активность, пролиферация клеток, рост опухоли, неоваскуляризация или ангиогенная активность.
Было бы понятно, что схемы лечения могут включать одно или более чем одно введение каждой из описанных здесь композиций. Композицию можно вводить в одной дозе или во многих дозах. Введение отдельных композиций может осуществляться тем же самым путем или разными путями.
В одном воплощении композицию вводят каждые 1-3 недели в течение 6-12 циклов или пока опухоль прогрессирует. Данный способ может дополнительно включать стадию введения композиции каждые 1-12 недель в течение вплоть до 2 лет. В другом неограничивающем примере одновременное введение антитела против СО105 и антитела против УЕСР (или его антигенсвязывающего фрагмента) происходит в неделю 1, с последующим дополнительным введением композиций в неделю 1, 2, 3 или 4, причем одновременное введение повторяют в течение 6-12 циклов или пока опухоль прогрессирует и с последующим введением композиций каждые 1-12 недель в течение вплоть до 2 лет.
В одном неограничивающем примере способа лечения рака у пациента данный способ включает хирургическое удаление рака и введение антитела против СО105 и антитела против УЕСР (или его антигенсвязывающего фрагмента) в 1-3 недели в течение 12 месяцев или пока опухоль прогрессирует, с последующим одновременным введением антитела против СО105 и антитела против УЕСР (или его антигенсвязывающего фрагмента) в дозе в 1-12 недель. Кроме того, одновременное введение антитела против СО105 и антитела против УЕСР (или его антигенсвязывающего фрагмента) можно повторять каждые 1-3 недели в течение вплоть до 6 циклов. Возможно данный способ дополнительно включает введение антитела против СО 105 и антитела против УЕСР (или его антигенсвязывающего фрагмента) каждые однудвенадцать недель в течение вплоть до двух лет. Будет понятно, что схемы лечения можно объединять с предложенными здесь способами отслеживания для определения того, нужно ли или когда нужно вводить дополнительные дозы антитела против СО105 и антитела против УЕСР (или его антигенсвязывающего фрагмента).
Комбинированная терапия может давать синергический и/или полезный эффект или может позволить использовать меньшие дозы комбинаци для обеспечения большей степени безопасности. Данное изобретение охватывает протоколы лечения, которые улучшают профилактический или терпевтический эффект антитела против СО105 и антитела против УЕСР (или его антигенсвязывающего фрагмента) для предупреждения, управления, лечения или удаления рака или других заболеваний.
В одном воплощении субъекту вводят дополнительное терапевтическое лечение, такое как, например, ингибитор ангиогенеза (как здесь описано). Композицию, содержащую такое дополнительное терапевтическое лечение, можно вводить в комбинации (либо последовательно, либо одновременно) с другими описанными здесь композициями.
В одном неограничивающем предложенном здесь способе лечения рака дополнительное терапевтическое лечение включает хирургическое удаление рака, облучение, один или более чем один химиотерапевтический агент или их комбинацию и одновременное введение одной или более чем одной описанной здесь композиции. В одном аспекте введение композиции может представлять собой, например, 20минутную внутривенную инфузию.
Глазные состояния, включающие ангиогенез.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения диабетической ретинопатии, дегенерации желтого пятна, хороидальной неоваскуляризации, макулярного отека или неоваскулярной глаукомы у пациента путем введения данному пациенту терапевтически эффективного количества одной или более чем одной предложенной здесь композиции.
Дегенерация желтого пятна (АМО) представляет собой потерю фоторецепторов в части центральной сетчатки, называемой макулой, отвественной за острое зрение. Дегенерация желтого пятна ассоциирована с ненормальным отложением компонентов внеклеточного матрикса и другого дебриса в мембране между пигментным эпителием сетчатки и сосудистой оболочкой глаза. Такой дебрисподобный материал называют друзами. Друзы наблюдаются при офтальмоскопическом исследовании глаза. Нормальные глаза могут иметь желтые пятна, не содержащие друзы, тем не менее, друзы могут быть многочисленными на периферии сетчатки. Присутствие мягких друз в желтом пятне в отстутствие какой-либо потери зрения, опосредованного желтым пятном, считается ранней стадией АМО. Дегенерация желтого пятна характеризуется хороидальной неоваскуляризацией (С№У) - развитием ненормальных кровеносных сосудов под слоем пигментного эпителия сетчатки (КРЕ). Данные сосуды прорываются через мембрану
- 33 029214
Бруха. разрывая пигментный эпителий сетчатки. кровоточат и. в конечном счете. вызывают образование рубцов в желтом пятне. приводя к глубокой потере центрального зрения (образование дисковидных рубцов).
Хороидальная неоваскуляризация (0Νν) обычно наблюдается при макулярной дегенерации. помимо других глазных расстройств. и ассоциирована с пролиферацией хороидальных эпителиальных клеток. сверхпродуцированием внеклеточного матрикса и образованием волокнисто-сосудистой субретинальной мембраны. Пролиферация клеток пигментного эпителия сетчатки и продуцирование ангиогеных факторов. по-видимому. оказывают эффект на хороидальную неоваскуляризацию.
Диабетическая ретинопатия (ЭК) представляет собой глазное расстройство. характеризуемое избыточным ангиогенезом. который развивается при диабете из-за утолщения базальных мембран капилляров и отсутствия контакта между перицитами и эндотелиальными клетками капилляров. Потеря перицитов увеличивает транссудацию из капилляров и приводит к нарушению гематоретинального барьера. Диабетическая ретинопатия является результатом изменений в микрососудах сетчатки. Индуцированные гипергликемией гибель перицитов и утолщение базальной мембраны приводят к функциональной недостаточности стенок сосудов. Эти повреждения изменяют образование гематоретинального барьера и также делают кровеносные сосуды сетчатки более проницаемыми. Маленькие кровеносные сосуды. такие как кровеносные сосуды в глазу. особенно чувствительны к плохому контролю сахара в крови (глюкозы в крови). Избыточное накопление глюкозы и/или фруктозы повреждает очень мелкие кровеносные сосуды в сетчатке. При транссудации жидкости и липидов из поврежденных кровеносных сосудов в желтое пятно также может развиваться макулярный отек. Данные жидкости заставляют желтое пятно набухать. что размывает зрение. Данное повреждение также приводит к недостатку кислорода в сетчатке.
По мере прогрессирования заболевания недостаток кислорода в сетчатке стимулирует ангиогенез во всей сетчатке и в прозрачном гелеподобном стекловидном теле. которое заполняет внутреннюю часть глаза. Без своевременного лечения эти новые кровеносные сосуды могут кровоточить. замутнять зрение и разрушать сетчатку. Сосудисто-волокнистая пролиферация также может вызывать тракционную отслойку сетчатки. Новые кровеносные сосуды также могут врастать в угол передней камеры глаза и вызывать неоваскулярную глаукому.
Пролиферативная витреоретинопатия ассоциирована с клеточной пролифрацией клеточных и фиброзных мембран внутри стекловидных мембран и на поверхностях сетчатки. Пролиферация и миграция клеток пигментного эпителия сетчатки является обычной при данном глазном расстройстве. Мембраны. ассоциированные с пролиферативной витреоретинопатией. содержат компоненты внеклеточного матрикса. такие как коллаген типов I. II и IV и фибронектин. и постепенно становятся фиброзными.
Возрастная дегенерация желтого пятна (АМЭ) и диабетическая ретинопатия являются двумя ведущими причинами слепоты в развитых странах. Афлиберцепт. ранибизумаб и пегаптаниб улучшили возможности лечения. доступные для пациентов с АМЭ. Ранибизумаб представляет собой РаЬ. и афлиберцепт представляет собой слитый белок. Они оба связываются с фактором роста эндотелия сосудов (VΕОР) и к настоящему времени продемонстрировали наиболее впечатляющие результаты в лечении АМЭ; однако. лишь меньшинство пациентов. подвергавшихся лечению. испытывают значительное улучшение остроты зрения. Антиангиогенная терапия. сфокусированная на мишени. отличной от VΕОР. может преодолевать некоторые ограничения. ассоциированные с агентами. которые направленно действуют на путь VΕОР.
Описанные здесь антитела против 0Ό105 можно использовать для лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна. 0Νν. диабетической ретинопатии или пролиферативной витреоретинопатии. Здесь описаны способы лечения или предупреждения дегенерации желтого пятна. 0Νν. диабетической ретинопатии. макулярного отека или пролиферативной витреоретинопатии посредством введения описанных здесь антител. Описанные здесь антитела против 0Ό105 также могут сужать кровеносные сосуды. ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток. ассоциированную с глазным заболеванием. уменьшать признаки или симптомы кровотечения. лечить мутное зрение. обеспечивать остановку потери зрения. улучшать зрение и/или предупреждать транссудацию из кровеносных сосудов. Описанные здесь антитела против 0Ό105 также можно использовать в лекарственных средствах для лечения дегенерации желтого пятна. 0Νν. диабетической ретинопатии. макулярного отека или пролиферативной витреоретинопатии.
Кроме того. описанные здесь антитела против 0Ό105 также можно использовать в комбинации с известными терапиями и/или соединениями для лечения дегенерации желтого пятна. 0Νν. диабетической ретинопатии. макулярного отека или пролиферативной витреоретинопатии. Примеры таких соединений включают ранибизумаб. афлиберцепт и пегаптаниб. но не ограничиваются ими. Помимо описанных здесь способов введения. антитела против 0Ό105 можно вводить посредством интравитреальных путей. Неограничивающие примеры интравитреальных способов введения включают интравитреальную инъекцию и применение интравитреальных имплантов.
Пациентов можно оценивать на предмет улучшения и чувствительности к лечению. Лечение включает уменьшение макулярного отека. уменьшение площадей 0Νν и повышение остроты зрения. но не ограничивается ими. Измерения признаков и симптомов известны в данной области и дополнительно
- 34 029214
описаны в приведенных ниже примерах.
Согласно описанным здесь воплощениям описанные здесь композиции можно вводить одни или в комбинации с одним или более чем одним дополнительным активным или неактивным агентом. При использовании комбинаций можно использовать одновременное или последовательное введение антител против ί'.Ό1()5 и антител против УЕОР (их антигенсвязывающих фрагментов).
Функциональные анализы.
Описанные здесь композиции можно оценивать в ряде анализов ίη νίίΐΌ, ίη νί\Ό и ех νί\Ό. Для отслеживания таких эффектов можно использовать любой подходящий анализ, известный специалисту в данной области. Здесь описано несколько таких методик.
Анализ сигнализации и функции ΟΌ105.
ΟΌ105 (эндоглин) является членом семейства рецептора ТОР-β (трансформирующий фактор ростабета), который экспрессируется пролиферирующими эндотелиальными клетками, и для пролиферации эндотелиальных клеток нужны нормальные уровни ΟΌ105. ΟΌ105 сильно экспрессируется в ангиогенной сосудистой сети солидных опухолей, участвует в ангиогенезе/развитии сосудов и представляет собой вспомогательный рецептор трансформирующего фактора роста β (ТОР-β). ΟΌ105 представляет собой гомодимерный гликопротеин клеточной мембраны, который экспрессируется на лейкозных клетках и эндотелиальных клетках. Были охарактеризованы две изоформы ΟΌ105: Ь-эндоглин (170 кДа) и 8эндоглин (160 кДа), отличающиеся аминокислотной последовательностью их цитоплазматических хвостов.
Экспрессия ΟΌ105 усиливается клеточной гипоксией через продукцию индуцируемого гипоксией фактора-1-α (Н1Р-1-а) и защищает подверженные гипоксии клетки от апоптоза. ΟΌ105 действует, модулируя сигнализацию многочисленных комплексов рецепторных киназ надсемейства ТОР-β, включая рецепторы ТОР-β (ТОР-РК), киназы, подобные рецептору активина (АЬК), и рецепторы активина. В отсутствие ΟΌ105 активация рецепторов ТОР-β приводит к фосфорилированию белков 8МАЭ, которые ингибируют рост эндотелиальных клеток. Однако активация ΟΌ105 посредством ТОР-β модулирует фосфорилирование белков 8МАЭ. Конечным результатом является высвобождение ингибирующих рост эффектов активации рецептора ТОР-β на эндотелиальных клетках.
Предотвращение активации ΟΌ105 посредством антитела против ΟΌ105 действует синергически с ТОР-β, подавляя рост эндотелиальных клеток. ТОР-β может стимулировать два отличных рецептора типа Ι/пути сигнализации 8МАЭ с противоположными эффектами в эндотелиальных клетках. Путь сигнализации ТОР-(1/Ли<5 (А) приводит к ингибированию пролиферации и миграции клеток, тогда как путь ТОР-(’)/Аи<1 (Б) индуцирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. ΟΌ105, вспомогательный рецептор ТОР-β, высокоэкспрессируемый во время ангиогенеза, является необходимым для сигнализации АЬК1. В отсутствие ΟΌ105 сигнализация ТОР^/АЬК5 преобладает и поддерживает эндотелий в состоянии покоя. Высокая экспрессия ΟΌ105 стимулирует путь АЬК1 и опосредованно ингибирует сигнализацию АЬК5, таким образом, стимулируя состояние активации ангиогенеза.
В одном неограничивающем воплощении антитела можно оценивать в отношении ингибирования ангиогенеза и пролиферации эндотелиальных клеток. Связывание антител против ΟΌ105 с НиУЕС не предотвращает последующее связывание ТОР-β с ΗυνΈΟ. Таким образом, прямое подавление роста эндотелиальных клеток антителами против ΟΌ105 представляет собой один из лежащих в основе механизмов, посредством которых наблюдаются антиангиогенные и подавляющие опухоли эффекты ίη νί\Ό. В другом воплощении антитела можно оценивать в отношении блокирования ангиогенеза посредством предотвращения фосфорилирования и/или сигнализации 8таά1/5/8. ΟΌ105 участвует в стимуляции ангиогенеза через сигнализацию ТОР^/АЬК1, которая, в свою очередь, вовлекает снижение и/или блокировку фосфорилирования белков 8таά2/3. В еще одном воплощении антитела можно оценивать в отношении блокирования ангиогенеза посредством усиления фосфорилирования и/или сигнализации 8таά2/3.
Способы и методики для анализа блокирующего или ингибирующего эффекта предложенных здесь антител на путь сигнализации ТОР^/АЬК1 и/или фосфорилирование 8таά1/5 включают известные молекулярные методики, но не ограничиваются ими. В качестве примера, для определения ингибирующего и/или стимулирующего эффекта раскрытых здесь антител против ΟΌ105 на пути ТОР^/АЬК5 или ТОРβ/Л^К1 можно использовать вестерн-блоттинг с антителами, специфичными к любому из белков в путях ТОР^/АЬК5 или ТОР^/АЬК1. Аналогичным образом, для анализа ингибирующего и/или стимулирующего эффекта раскрытых здесь антител можно использовать выявление мРНК (матричная РНК) или регуляцию мРНК для белков, участвующих в путях ТОР^/АЬК5 или ТОР^/АЬК1. В данной области известны и рассматриваются здесь дополнительные способы анализа клеточной сигнализации в отношении путей ТОР^/АЬК5 или ТОР-3/АЬК1.
Активность раскрытых здесь антител против ΟΌ105 можно оценивать с использованием признанных в данной области анализов, например анализами связывания, такими как ЕЬ18А, конкурентные ЕЬ18А, поверхностный плазмонный резонанс и эффект на клетки ΗυνΕΟ, как более подробно описано ни- 35 029214
же.
8СГО/"голые" мыши.
В одном способе анализа роста опухолей используют мышей §СГО (тяжелый комбинированный иммунодефицит) следующим образом: отбирают субконфлюентные клетки человеческой меланомы М21, промывают и ресуспендируют в стерильном РВ§ (забуференный фосфатом физиологический раствор) (20х106 на мл). Мышам §СГО подкожно инъецируют 100 мкл суспензии клеток человеческой меланомы М21 (2х106). Через трое суток после инъекции опухоли мышей либо оставляют необработанными, либо внутривенно или внутрибрюшинно обрабатывают (например 100 мкг/мышь) одной или более чем одной контрольной или темтируемой композицией. Мышей обрабатывают ежесуточно в течение 24 суток. Размер опухоли измеряют циркулями, и объем оценивают с использованием формулы У=(ЬхА2)/2, где У представляет собой объем, Ь представляет собой длину и А представляет собой ширину.
В одном способе анализа роста опухолей используют "голых" мышей следующим образом: опухолевые клетки МОА-МВ-435 (0,4х106 клеток/мышь) в 50 мкл РВ§ ортотопически имплантируют в жировое тело молочной железы самок "голых" мышей (в возрасте от пяти до шести недель). При достижении опухолями среднего объема приблизительно 50-80 мм мышей рандомизируют (по меньшей мере 10/группу) и инициируют внутривенную или внутрибрюшинную обработку одним или более чем одним антителом в количестве 1 мкг (0,05 мг/кг) на дозу, 10 мкг (0,5 мг/кг), 100 мкг (5 мг/кг) или 200 мкг (10 мг/кг), или 100 мкг контрольного антитела в 100 мкл РВ§, или наполнителем - 100 мкл РВ§ дважды в неделю; в некоторых исследованиях также можно оценивать необработанную группу. Размер опухоли измеряют циркулями, и объем оценивают с использованием фломулы У=(ЬхА2)/2, где У представляет собой объем, Ь представляет собой длину, и А представляет собой ширину.
Модели на основе ВАЬВ/с сингенных мышей.
В качестве альтернативы, для оценки роста опухоли и его ингибирования антителами, или как здесь описано, также можно использовать модели на основе сингенных мышей ВАЬВ/с, как проиллюстрировано, например, у Ткире е1 а1., Ιηΐ. 1. Опсо1оду, 29: 1087-1094 (2006).
Мыши.
В другом анализе измеряют ангиогенез в мышиной модели химерная мышь: человек, и это называется анализом химерных мышей. Данный анализ был подробно описан другими авторами и дополнительно был описан здесь для измерения ангиогенеза, неоваскуляризации и регрессии опухолевых тканей. См. Уап, е1 а1. (1993) 1. С1ш. 1пуе81. 91:986-996.
Анализ химерных мышей является полезной моделью для анализа ангиогенеза ίη у|уо, так как трансплантированные лоскуты кожи имеют близкое гистологическое сходство с нормальной человеческой кожей, и происходит неоваскуляризация всей ткани, при которой реальные человеческие кровеносные сосуды растут из пересаженной человеческой кожи в человеческую опухолевую ткань на поверхности пересаженной человеческой кожи. Источник неоваскуляризации в человеческом трансплантате может быть продемонстрирован посредсвтом иммуногистохимического окрашивания новых сосудов на специфичные для человека маркеры эндотелиальных клеток.
Анализ химерных мышей демонстрирует регрессию неоваскуляризации на основе как количества, так и степени регрессии роста новых сосудов. Кроме того, легко отслеживать эффекты на рост любой ткани, трансплантированной на пересаженную кожу, такой как опухолевая ткань. Наконец, данный анализ является полезным, так как имеется внутренний контроль токсичности в данной системе анализа. Химерную мышь подвергают воздействию любого тестируемого реактива, и, следовательно, здоровье мыши является показателем токсичности. В описанных здесь способах также могут быть использованы другие животные модели, описанные здесь и известные в данной области.
Анализ глаза кролика.
Другой мерой ангиогенеза является модель глаза кролика ίη у|уо, и она называется анализом глаза кролика. Анализ глаза кролика был подробно описан другими авторами и был использован для измерения как ангиогенеза, так и неоваскуляризации в присутствии ингибиторов ангиогенеза, как проиллюстрировано примерами у О'АтаЮ е1 а1. (1994) Ргос. №й1. Асаб. §сг и§А, 91(9): 4082-4085.
Анализ глаза кролика является признанной моделью анализа для ангиоенеза ίη νίνΌ, поскольку процесс неоваскуляризации, проиллюстрированный примерами кровеносных сосудов кролика, растущих из края роговицы в роговицу, легко визуализировать через прозрачную по ее природе роговицу глаза. Кроме того, можно легко отслеживать во времени как степень, так и количество стимуляции или ингибирования неоваскуляризации или регрессии неоваскуляризации.
Наконец, кролика подвергают воздействию любого тестируемого реактива, и, следовательно, здоровье кролика является показателем токсичности тестируемого реактива.
Вкратце, проводят анализы на куриной хориоаллантоисной мембране (САМ), и эффекты на развивающуюся сосудистую сеть записываются в 48 ч после имплантации гранулы 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозы, содержащего одно или более чем одно контрольное или тестируемое соединение. Неоваскуляризация роговицы индуцируется имплантированной гранулой из поли(гидроксиэтилметакрилата) (Ну6гоп; Ιπ^γΙοιόπ З^енсек, Νον ВгишМск, N1), содержащим 650 нг мощного ангиогенного белка - основ- 36 029214
ного фактора роста фибробластов (ЬРОР), связанного с сукральфатом (сахарозы алюминия сульфат; ВикЬ МебЬес, Копенгаген). Добавление сукральфата в гранулы защищает ЬРОР от деградации и обеспечивает его медленное высвобождение, таким образом вызывая устойчивый агрессивный ангиогенез, который является более выраженным, чем ангиогенез, индуцированный только ЬРОР/гидроном. Высвобождение ЬРОР из гранул, содержащих сукральфат/гидрон, можно выявлять ш у 11го в течение вплоть до 4 суток после образования таких гранул по сравнению с лишь 1 сутками для гранул с одним гидроном. Гранулы делают путем смешивания 110 мкл физиологического раствора, содержащего 12 мкг рекомбинантного ЬРОР (Такеба, Осака) с 40 мг сукральфата; данную суспензию добавляют в 80 мкл 12% (мас./об.) гидрона в этаноле. Аликвоты (10 мкл) данной смеси затем переносят пипеткой на тефлоновые шитфты и дают высохнуть с получением приблизительно 17 гранул.
Гранулу имплантируют в микрокарманы роговицы каждого глаза анестезированных самок кролика Νν 2еа1апб \У1н1е в 2 мм от края, с последующим однократным местным нанесением эритромициновой мази на поверхность роговицы. Гистологическое исследование в последующие сутки демонстрирует прогрессирующий рост кровеносных сосудов в роговицу по направлению к грануле с наблюдением лишь редких воспалительных клеток. Данный ангиогенный ответ не изменяется тяжелой иммуносупрессией посредством облучения всего организма, и гранулы с одним сукральфатом не индуцируют ангиогенез. Новые сосуды индуцируются, прежде всего, ЬРОР, а не воспалением. Животным посредством промывания желудка ежесуточно, начиная с суток 2 после имплантации, скармливают одно или более чем одно соединение, суспендированное в 0,5%-ной карбоксиметилцеллюлозе, или один носитель. Непосредственно перед имплантацией гранул животные с иммуносупрессией получают воздействие радиации 6 Гр (Грэй) на весь организм в течение 6 мин. Данная доза радиации приводит к заметной лейкоцитопении с более чем 80%-ным уменьшением числа лейкоцитов к суткам 2 и более чем 90%-ным уменьшением к суткам 3, давая результаты, согласующиеся с предыдущими сообщениями.
Тот же самый специалист по роговице (М.§.Ь.) обследовал животных с использованием щелевой лампы через сутки маскированным способом. Площадь неоваскуляризации роговицы определяют измерением с использованием окулярной сетки длины сосудов (Ь) от края и количества участвующих сегментов края, соответствующих часам на циферблате (С). Формула, используемая для определения площади сегмента круговой полосы, является следующей:
С/12 х 3,1416 [г2-(г-Ь)2],
где г (измеренный радиус роговицы кролика) равен 6 мм. Измеряют однородную непрерывную полосу неоваскуляризации, прилегающую к грануле, таким образом, может быть оценено общее ингибирование неоваскуляризации.
Анализы ангиогенеза у мышей с использованием вставки из матригеля.
Для подтверждения эффектов композиции на ангиогенез можно использовать анализ ангиогенеза у мышей с использованием вставки из матригеля. Различные факторы роста (например 1ОР-1 (инсулиноподобный фактор роста-1), ЬРОР или УЕОР) (250 нг) и гепарин (0,0025 единиц на мл) смешивают с матригелем с пониженным содержанием факторов роста, как описано ранее (Моп!екапо е! а1., I. Се11 Вю1. 1983, 97:1648-1652; 5>1еГапккоп е! а1., ί. Вю1. СЬет. 2000, 276:8135-8141). Описанные здесь композиции или контрольные антитела можно включать в препараты матригеля с использованием одной или более чем одной группы дозировки животных. В контрольных экспериментах матригель готовят в отсутствие факторов роста. Мышам подкожно инъецируют 0,5 мл препарата матригеля и оставляют инкубироваться в течение одной недели. После периода инкубации мышей умерщвляют и хирургически удаляют полимеризованные вставки из матригеля. Ангиогенез внутри вставок из матригеля количественно измеряют двумя установленными способами, включающими иммуногистохимический анализ и определение содержания гемоглобина (Ригк!епЬег§ег е! а1., Ьапсе!. 2002, 3:298-302; Уо1рей е! а1., Сапсег Се11 2002, 2(6):473-83 и §и е! а1., Сапсег Кек. 2003, 63:3585-3592). Для иммуногистохимического анализа вставки из матригеля погружают в ОСТ, быстро замораживают и получают 4 мкм срезы. Замороженные срезы фиксируют в метаноле/ацетоне (1:1). Замороженные срезы окрашивают поликлональным антителом, направленным на СЭ31. Ангиогенез количественно измеряют путем подсчета плотности микрососудов в 20 микроскопических полях при большом увеличении (200х).
Содержание гемоглобина можно количественно измерять, как описано ранее (8сЬпарег е! а1., I. Се11 РЬукю1. 1993, 256:235-246; Моп!екапо е! а1., I. Се11 Вю1. 1983, 97:1648-1652; §!е£аиккοη е! а1., I. Вю1. СЬет. 2000, 276:8135-8141 и О1дЬ е! а1., I. 1ттипо1. 1986, 100:1154-1164). Матригелевые импланты быстро замораживают на сухом льду и лиофилизируют в течение ночи. Высушенные импланты ресуспендируют в 0,4 мл 1,0%-ного сапонина (Са1ЬюсЬет) в течение одного часа и разрушают энергичным пипетированием. Препараты центрифугируют при 14000 х д в течение 15 мин для удаления любых твердых частиц. Затем прямо определяют концентрацию гемоглобина в супернатанте путем измерения поглощения при 405 нм и сравнивают со стандартной концентрацией очищенного гемоглобина.
Способы анализа миграции клеток.
Анализы миграции клеток были описаны в литературе, например, Вгоокк е! а1., I. С1ш. 1пуск! 1997, 99:1390-1398, и способы измерения миграции клеток известны специалистам в данной области. В одном
- 37 029214
описанном здесь способе измерения миграции клеток мембраны из камер Тгапк^еИ для определения миграции покрывают субстратом (здесь СО105 и/или νΈΟΡ), камеры Тгапк^еН промывают и сайты неспецифичного связывания блокируют с помощью ΒδΑ (бычий сывороточный альбумин). Опухолевые клетки из субконфлюентных культур отбирают, промывают и ресуспендируют в буфере для миграции в присутствии или в отсутствие анализируемых антител. После того как опухолевым клеткам позволяют мигрировать на нижнюю сторону мембран Тгапк^еИ с покрытием, клетки, остающиеся на верхней стороне мембраны, удаляют, и клетки, которые мигрируют на нижнюю сторону, окрашивают кристаллическим фиолетовым. Миграцию клеток затем количественно измеряют прямым подсчетом клеток на микроскопическое поле.
Способы анализа пролиферации клеток.
Пролиферацию клеток можно анализировать способами, известными специалистам в данной области. Как здесь описано, субконфлюентные человеческие эндотелиальные клетки (НШУРС) можно ресуспендировать в буфере для пролиферации, содержащем малое (5%) количество сыворотки в присутствии или в отсутствие СМ (25 мкл) из клеток ЕСV или ЕСУЪ, и эндотелиальным клеткам давали пролиферировать в течение 24 ч. Пролиферацию можно количественно оценивать измерением митохондриальной дегидрогеназной активности с использованием имеющегося в продаже набора для анализа Υδ^1 (СНетюоп). Также, как здесь описано, пролиферацию можно количественно оценивать измерением включения 3Н с использованием стандартных способов. (δΗе е( а1., Ιπί. ί. Сапсег, 108: 251-257 (2004)).
В данной области известны и рассматриваются здесь другие способы оценки пролиферации клеток. Другие неограничивающие примеры более подробно описаны в примерах.
Способы индуцирования СЭС. ΑΩΕΕ и опсонизации.
На усиление природного иммунного ответа организма на трансформированные клетки были направлены различные терапии. Традиционные эффекторные способы включают комплементзависимый цитолиз ("СОС"), антителозависимую клеточную цитотоксичность ("ΑΩΕΕ") и фагоцитоз (клиренс ретикулоэндотелиальной системой после покрытия клетки-мишени иммуноглобулином). Известно, что в присутствии антител определенные эффекторные клетки, такие как лимфоидные клетки, имеющие связанные с поверхностью рецепторы к областям Рс антител, опосредуют реакцию антителозависимой клеточной цитотоксичности ("ΑΩΡΌ') против клеток-мишеней. Посредством ΑΩΕΕ данные эффекторные клетки оказывают цитолитическую активность против таких клеток-мишеней.
Было продемонстрировано два типа реакций ΑΩΟΌ’ ш уНго. В классических реакциях ΑΩΕΕ эффекторные клетки прикрепляются к клеткам-мишеням, покрытым антителами, и затем вызывают цитолиз клеток-мишеней (А.Н. ОгеепЬегд е! а1., "СНагасЮгйНск ОГ ТНе ЕГГесЮг Се11к ΜеД^аΐ^ηд СуЮЮхюйу Αда^η8ΐ ΑηΗЬоДу-СоаΐеД Тагде! Се11к," 1ттипо1оду, 21, р. 719 (1975)). Данное присоединение между эффекторной клеткой и клеткой-мишенью происходит в результате взаимодействия области Рс антитела, покрывающего клетку-мишень, и рецептора Рс эффекторной клетки. Одним недостатком данного типа реакции ΑΩΕΈ' является то, что она может затрудняться находящимися в системе кровообращения комплексами антиген-антитело, часто ассоциированными с различными заболеваниями, которые конкурируют с антителом, связанным с клеткой-мишенью, за рецепторы Рс эффекторных клеток (1.С.М. Μас^еηηаη, "СотреННоп Рог КесерЮгк Рог 1ттипод1оЬи1ш Оп СуЮЮхю ЬутрНосу!е8," СНп. Ехр. 1ттипо1., 10, р. 275 (1972)). Из-за этого недостатка классической ΑΩΕΈ' может использоваться второй тип реакции ΑΩΕΕ - направляемая антителами ΑΩΕΌ При направляемой антителами ΑΩΕΕ специфичное к мишени антитело сперва присоединяется к эффекторной клетке, и образующийся комплекс затем "направляется", посредством антитела, к его специфичному антигену на поверхности клетки-мишени. Преимущественно, направляемая антителами ΑΩΕΕ может не подвергаться влиянию присутствия комплексов антиген-антитело, циркулирующих в системе хозяина. Взаимодействие между антителами и эффекторными клетками через присоединение области Рс к рецептору Рс обычно является слабым. И, в некоторых случаях, антитела не остаются ассоциированными с эффекторными клетками в течение достаточного периода времени для обеспечения лизиса клеток-мишеней. Ввиду этой потенциальной проблемы антитела были присоединены к эффекторным клеткам с использованием предобработки полиэтиленгликолем и смесью фталатных масел (!Р. 1опе8, Ό.Μ. δеда1, "ί. 1ттипо1., 125, рр. 926-33 (1980)). Применимость данного способа для обработок ш У1уо, однако, может быть снижена токсичными эффектами на организм, которые могут иметь остатки полиэтиленгликоля и фталатного масла на комплексе антитело-эффекторная клетка.
В качестве альтернативы, был предложен способ усиления направляемой антителами ΑΩΕΈ' посредством адъювантной химиотерапии с цитотоксическими лекарственными средствами (Ι.Κ. Μаскау е( а1., Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!Нег., 16, рр. 98-100 (1983)). Анализы для тестирования ΑΩΕΕ хорошо известны в данной области, как, например, патент США № 5756097.
Соответственно, согласно настоящим воплощениям предложены антитела, которые могут связываться с клетками, имеющими роль в неоваскуляризации или ангиогенезе, или которые могут усиливать фагоцитоз и умерщвление клеток и, посредством этого, усиливать защиту ш У1уо. Также предложены другие антитела и их функциональные фрагменты, которые являются иммуннореактивными, специфично связываются или предпочтительно связываются с сайтом связывания или эпитопом, с которым такие антитела могут связываться, и которые имеют такой же эффект.
- 38 029214
Антитела также могут быть опсоническими или демонстрировать опсоническую активность в отношении клеток, имеющих роль в неоваскуляризации или ангиогезе (например эндотелиальных клеток). Как известно специалистам в данной области, термин "опсоническая активность" относится к способности опсонина (обычно либо антитело, либо сывороточный фактор С3Ь) связываться с антигеном или рецептором клетки для стимуляции присоединения антигена или клеточного рецептора к фагоциту и посредством этого усиления фагоцитоза. Определенные клетки становятся особенно привлекательными для фагоцитов, таких как нейтрофилы и макрофаги, когда они покрыты опсоническим антителом, и их скорость клиренса из кровотока поразительно увеличивается. Опсоническую активность можно измерять любым традиционным способом, как описано, например, в патенте США № 6610293.
В другом неограничивающем воплощении пациент, имеющий неоваскулярное расстройство или расстройство, зависимое от ангиогенеза, выделяет антигены/пептиды (например СО 105) в результате ангиогенеза. Данные антигены/пептиды могут представлять собой "антигены, ассоциированные с опухолью". Таким пациентам можно системно вводить антитело на антиген/пептид (например СО105), и у них может инициироваться любой из описанных здесь путей для индуцирования СОС, АОСС, опсонизации или любой другой формы клеточно-опосредованного умерщвления.
Дополнительные анализы.
Для тестирования эффекта описанных здесь композиций, таких как, например, композиции, описанные в приведенных ниже примерах, также можно использовать другие анализы, известные в данной области.
Примеры
Изобретение можно лучше понять посредством ссылки на следующие неограничивающие примеры, которые приведены как типичные воплощения заявки. Следующие примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать типичные воплощения, и они, однако, ни в коей мере не должны истолковываться как ограничивающие широкий объем данной заявки. В то время как здесь были показаны и описаны определенные воплощения настоящей заявки, будет очевидным, что такие воплощения приведены лишь в качестве примера. Могут иметь место многочисленные вариации, изменения и замены; следует понимать, что в применении описанных здесь способов на практике можно использовать разные альтернативы описанных здесь воплощений.
Пример 1. Типичные схемы дозировки для введения.
Оптимальные схемы дозировки для введения описанных здесь антител и их антигенсвязывающих фрагментов можно определять с использованием известных в данной области способов и как описано выше.
В одном неограничивающем воплощении описанные здесь антитела можно вводить субъекту на протяжении разных временных рамок. Дозу(ы) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента можно вводить дважды в неделю, еженедельно, каждые две недели, каждые три недели, каждые 4 недели, каждые 6 недель, каждые 8 недель, каждые 12 недель или в течение любой из приведенных здесь комбинаций недель. Также рассматриваются циклы дозирования, такие как, например, введение антител один или два раза в неделю в течение 4 недель, с последующими двумя неделями без терапии. Здесь также рассматриваются дополнительные циклы дозирования, включающие, например, описанные здесь различные комбинации доз и недельных циклов.
Пример 2. Анализ В1Асоге (поверхностный плазмонный резонанс: §РК).
Аффинность антител можно оценивать с использованием, например, анализа В1Асоге, используя стандартные протоколы. Вкратце, антитело против гистидиновой метки связывают с чипом В1Асоге для захвата Ηίδ-меченного рекомбинантного человеческого СО105, который, в свою очередь, будет использоваться для измерения связывания антитела против СО105. Анализ §РК проводят минимум на 2 партиях препаратов чипов с 8 аналитическими партиями. В ходе данного анализа оценивают следующие параметры.
(а) Связывание антитела против Ηΐδ с чипами СМ5.
Антитело против Ηίδ-метки связывают с чипом СМ5 В1Асоге посредством традиционной аминной химии с использованием ЕОС/ΝΗδ (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид/Ыгидроксисукцинимид). Условия реакции (концентрация и рН) будут оптимизированы.
(б) Связывание человеческого СО105 и регенерация биосенсорного чипа.
Тестируют условия для связывания человеческого СО 105 и регенерации чипа с использованием разных буферов (на основе предыдущего опыта) для элюции связанного антитела. Как только был разработан потенциальный способ регенерации, измеряли способность к связыванию и фон одной поверхности чипа на протяжении по меньшей мере 25 циклов. Целью является получение увеличения фона в среднем на менее чем 10 КИ (резонансная единица) за цикл и снижение способности на менее чем 1% за цикл.
(в) Связывание человеческого СО105.
Измеряют ответ на дозу человеческого СО105 для того, чтобы определить подходящую концентрацию для достижения максимального связывания.
(г) Связывание антитела против СО105.
- 39 029214
Измеряют ответ на дозу антитела против СО105 для того, чтобы определить подходящий интервал для экспериментов по кинетике или равновесному связыванию (которые могут включать сравнение относительных кинетических констант, ка и к4, или сравнение относительной эффективности посредством способа параллельных линий).
(д) Эксперименты по предварительной валидации.
Эксперименты по связыванию повторяют по меньшей мере три раза при выбранных условиях с использованием разных чипов, разных проточных ячеек и в разных ситуациях для того, чтобы получить предварительную информацию относительно точности и аккуратности измерений. Все эксперименты В1Асоге проводят при 25°С в буфере для анализа НВ8-ЕР.
Пример 3. ЕЫ§А для связывания антитела против СЭ105.
ЕЫ§А можно использовать для анализа связывания антител против СЭ105 с СЭ105. Вкратце, ЕЫ8А проводят согласно следующим этапам.
1. Покрыть планшет МАВ9811-01 (моноклональное антитело против СЮ 105) в концентрации 1500 нг/мл в РВ§, 100 мкл/лунку. Накрыть планшет запечатывающей пленкой и инкубировать в течение ночи (16-24 ч) при 4°С.
2. Промыть планшет 2х 200 мкл РВ§ (без Т\уееп).
3. Промыть планшет 3х РВ§, содержащим Т\уееп (РВ8-Т).
4. Добавить 100 мкл/лунку СО105 в концентрации 100 нг/мл в РВ8-Т с 0,1% В8А и инкубировать 60 мин при комнатной температуре.
5. Промыть планшет 3х РВ8-Т.
6. В опытные лунки: добавить 100 мкл/лунку антител против СО105 в концентрации 20, 10, 4, 2, 1, 0,5 и 0,2 нг/мл (разведенных в РВ8-Т с 0,1% В8А) и инкубировать 60 мин при комнатной температуре. В лунки негативного контроля: добавить 100 мкл/лунку контрольного антитела, соответствующего по изотипу.
7. Промыть планшет 3х РВ8-Т.
8. Добавить 100 мкл/лунку козьего противочеловеческого 1§О, конъюгированного с НКР (пероксидаза хрена), разведенного 1:10000 в РВ8-Т с 0,1% В8А во все лунки; инкубировать 30-60 мин при комнатной температуре.
9. Промыть планшет 5х РВ8-Т.
10. Добавить 100 мкл/лунку раствора субстрата ТМВ (тетраметилбензидин) и инкубировать в незакрытом планшете в темноте в течение 15 мин.
11. Остановить реакцию добавлением 100 мкл/лунку останавливающего реакцию раствора с ТМВ.
Образцы анализаруют в тройной повторности и считывают оптическую плотность для построения
стандартной кривой и определения константы связывания. Статистический анализ проводят с использованием ΐ-критерия Стьюдента или другого стандартого критерия.
Было бы понятно, что аналогичный протокол можно использовать для тестирования связывания антител с УЕОР.
Пример 4. Авидность антител и количество доступных эпитопов на клетках, экспресирующих СО105.
Авидность антител и количество доступных эпитопов на клетках, экспрессирующих СО105, можно оценивать с использованием анализов графиков Скэтчарда с использованием стандартных протоколов.
Вкратце, проводят анализы графиков Скэтчарда прямого связывания радиоактивно меченных антител против СО105 с лейкозными клетками КМ-3, экспрессирующими СО105, и субконфлюентными пролиферирующими НИУЕС. Очищенные антитела против СЭ105 индивидуально радиоактивно метят 1251 с использованием Ιηάο-Оеп и согласно стандартным способам, известным специалистам в данной области. Радиоактивно меченные антитела против СО105 анализируют на предмет атомов йода, в среднем приходящихся на молекулу 1§О, соответственно. Проводят эксперименты по титрованию с использованием фиксированного количества (0,1 мкг) каждого тАЬ (моноклональное антитело), меченного 125Ι, и 2кратных серийных инкрементов КМ-3, экспрессирующих СО105, или клеток НИУЕС для определения антигенсвязывающей активности. Анализ графика Скэтчарда данных связывания проводят согласно известным способам. Посредством данного анализа оценивают константу равновесия и среднее максимальное число связанных тАЬ/клетку.
Пример 5. Анализ блокирующей активности с использованием вестерн-блоттинга.
Способность антител против СО 105 блокировать стимулируемую СО 105 активацию клеток, которые экспрессируют СО105, можно анализировать посредством вестерн-блоттинга для выявления фосфорилирования белков, участвующих в пути сигнализации СО105.
Вестерн-блоттинг-анализы проводят для идентификации фосфорилированных §та41/5/8 или §та42 согласно известным методикам вестерн-блоттинга. Антитела Р8та41 и Р§та42 специфично распознают фосфорилированный §та41/5 или фосфорилированный §та42 в нетрансфицированных эндотелиальных клетках. Для выявления молекул в образцах используют первичные антитела против §та41, 8та42, 8та45, Ι41 (§ап1а Сш/) и СО 105. Выявление осуществляют посредством усиленной хемилюминисцен- 40 029214
ции (ЕСЬ).
Пример 6. Ингибирование роста НИУЕС и анализ включения 3Н-тимидина.
Доступен ряд анализов для оценки ингибирования роста клеток.
В одном примере НИУЕС культивируют в 75 см2 флаконах (Ра1соп, ВесФп-Эюкткоп, РгапкНп Ьаке8, N1) в инкубаторе с СО2 при 37°С при субконфлюентных условиях. Клетки отделяют путем инкубирования со сбалансированным солевым раствором Хэнкса с 15 мМ ЕИТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в 25 мМ буфере НЕРЕ8, рН 7,3 при 37°С в течение 15 мин. После двухкратной промывки ледяным РВ§ клетки ресуспендируют в среде для роста эндотелиальных клеток в концентрации 25000 клеток/мл.
В дополнительных экспериментах человеческие эндотелиальные клетки пупочной вены (НИУЕС) суспендируют и культивируют в среде для роста эндотелиальных клеток, не содержащей РВ§ (фетальная телячья сыворотка) и экстракт бычьего мозга. 200 мкл аликвоту клеточной суспензии высевают в каждую лунку 96-луночных культивиральных планшетов. Перед добавлением в тройной повторности антител против СИ 105, антител против УЕСР, комбинации антител против СИ 105 и антител против УЕСР, контрольного 1дС или ТСР-β 1 клетки культивируют при 37°С в инкубаторе с СО2 в течение ночи. Культуральные планшеты выдерживают в инкубаторе в течение 72 ч, на протяжении которых каждые 24 ч осуществляется замена на свежие среды и антитела или контроли. В каждую лунку добавляют 3Нтимидин (1 мкКи), и планшеты инкубируют в течение 20 ч. Клетки промывают РВ§ с последующей обработкой 100 мкл/лунку трипсина-ЕИТА (0,05% трипсин, 0,53 мМ ЕИТА) при 37°С в течение 15 мин. Клетки отбирают на фильтры из стекловолокна (^а11ас Рпп1еб Р|1(егта1Л) с использованием сборщика клеток 96 (ТОМТЕС, Натбеп, СТ), и радиоактивность Н определяют на жидкостном сцинтилляционном и люминисцентном счетчике ТгПих 1540 М1сгоВе1а (^а11ас, Турку, Финляндия).
Пример 7. Анализ ингибирования миграции клеток.
Миграцию (хемокинез) как меру пролиферации и активации клеток измеряют с использованием камеры Бойдена.
Вкратце, миграцию клеток оценивают следующим образом: нуклеопоровый фильтр СоЧаг (поры 8 мм) покрывают фибронектином в течение ночи при 4°С. Камеру промывают забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ§), и нижнюю камеру заполняют ИМЕМ с сывороткой или без нее и с ТСР-|)3 или без него. Клетки трипсинизируют и суспендируют в конечной концентрации 50000 клеток/мл в ИМЕМ в присутствии контрольного антитела, антитела против СИ105, антитела против УЕСР или их комбинации. В верхнюю камеру добавляют 150 мкл аликвоту суспензии клеток и инкубируют при 37°С. Через 16 ч клетки промывают и верхнюю поверхность протирают для удаления немигрирующих клеток. Мембраны фиксируют в метаноле, промывают водой, окрашивают и подсчитывают число клеток, присутствующих на нижней поверхности.
Пример 8. Анализ АИСС.
Описанные здесь антитела можно оценивать в отношении их способности генерировать естественные клетки-киллеры (ΝΚ), активируемые 1Ь-2 (интерлейкин-2), и индуцировать АИСС с использованием, например, следующих протоколов.
Выделение ΝΚ и получение клеток ΝΚ, активируемых ГЬ-2.
РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяют и дают им находиться в покое в течение 24 ч при 4°С в КРМ1 с 10% РВ§. РВМС затем помещают в КРМ1 с 2% РВ§ (общий объем - 50 мл) и 10 мл клеточной суспензии переносят в чашки Петри. РВМС инкубируют в течение 2 ч при 37°С и собирают неприкрепившиеся клетки. Клетки ΝΚ культивируют в количестве 8х106 /мл с 1000 И/мл 1Ь-2 в течение 48 ч, затем посредством нормального культивирования в течение 5-8 суток перед использованием в анализе.
Анализы цитотоксичности естественных киллеров и АИСС.
Клетки ΝΚ соскабливают из культуры и отбирают в 50 мл коническую пробирку. Клетки один раз промывают полной КРМ1 и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин. Клетки ΝΚ затем ресуспендируют в 5 мл полной среды КРМ1 и подсчитывают. Перед проведением анализа число клеток ΝΚ нормируют к соотношению эффектор:мишень 10:1. Нормированные клетки ΝΚ переносят на планшет и в обозначенные лунки добавляют 10 мкл антител против СИ 105 и инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Контрольные образцы включают необработанные или обработанные контрольным антителом популяции клеток.
Интересующие клетки-мишени собирают (клетки НИУЕС), промывают, центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин и ресуспендируют в 5 мл полных сред КРМР Клетки-мишени снова промывают и ресуспендируют в бессывороточной КРМ1 до конечной концентрации 1х106 клеток/мл. Клетки-мишени затем метят конечной концентрацией 5 мкг/мл кальцеина АМ в течение 1 ч при 37°С с последующими двумя промывками полной КРМР Клетки-мишени затем ресуспендируют и добавляют в лунки с клетками ΝΚ. Комбинацию клетка-мишень/клетка ΝΚ инкубируют при 37°С в течение 4 ч. После инкубации планшеты центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин и клетки промывают и ресуспендируют в ИРВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор, модифицированный по Дульбекко). Флуорес- 41 029214
ценцию считывают с использованием возбуждения/испускания 450/530 нм, и испускание является мерой умерщвления клеток, опосредованного антителами.
Пример 9. Оценка стабильности композиций ТКС105 (антитело против СЭ105).
Авторы настоящего изобретения идентифицировали композиции, которые обеспечивали адекватную стабильность для концентрации ТКС105 больше чем 5 мг/мл. Исходные исследования показали, что ТКС105 могло быть сконцентрировано до по меньшей мере 25 мг/мл без каких-либо очевидных проблем с растворимостью. Следовательно, 25 мг/мл ТКС105 выбрали в качестве исходной концентрации для исследований по скринингу. По ходу данных исследований оценивали композиции, содержащие вплоть до 50 мг/мл ТКС105. Также оценивали дополнительные композиции с концентрациями 7 мг/мл ТКС105 и 100 мг/мл ТКС105.
Методики
Абсорбционная спектроскопия в ультрафиолетовой (УФ) области.
Для определения концентрации белка в образцах с различной стабильностью использовали УФ спектроскопию. Определили, что поглощение основной части вещества (7,0 мг/мл) при 280 нм составляет 1,13 при использовании ячейки с длиной пути 1 мм, что дает коэффициент экстинкции 1,61 мл/мг-см. Данное значение использовали для всех расчетов в данном проекте. Дальнейшие измерения проводили с использованием ячейки с длинной пути 0,0096 см, которая больше подходила для образцов с высокой концентрацией.
Инкубация образцов ТКС105 для определения тепловой стабильности.
Каждую композицию для определения тепловой стабильности пропускали через 0,22 мкм фильтр МШех с использованием шприца с наконечником Люэра и затем аликвотировали в 1 мл лиофилизационные флаконы. Каждый флакон закрывали бутиловой пробкой и обжимали алюминиевым колпачком. Образцы помещали при указанной температуре в камеры для определения стабильности и удаляли из них после указанного периода инкубации, через недели.
Замораживание-оттаивание и встряхивание ТКС105.
Образцы для замораживания-оттаивания (Р/Т) замораживали в течение 25 мин, затем оттаивали в течение 25 мин 0, 3 или 5 раз. Все замораживания проводили при -80°С. Оттаявшие образцы проверяли на предмет полного оттаивания перед возвращением в морозильник. Каждый образец для замораживания-оттаивания содержал 100 мкл раствора и хранился в 0,5 мл пробирках Эппендорфа. Каждый образец содержал 0,1% Р68, 0,005% Т\уееп 80 или не содержал поверхностно-активное вещество.
Образцы для исследования влияния встряхивания готовили в количестве 350 мл на флакон и метили как находящиеся в состоянии покоя, либо встряхиваемые. Все образцы перемещали в холодную комнату с температурой 4°С. Образцы, помеченные как встряхиваемые, помещали на орбитальный шейкер, работающий на скорости 150 об/мин. Образцы, находящиеся в состоянии покоя, помещали на полку, расположенную рядом с орбитальным шейкером. Каждый образец содержал 0,1% Р68, 0,005% Т\уееп 80 или не содержал поверхностно-активное вещество. Образцы инкубировали в течение 24 ч при указанных условиях.
Гель-хроматография (§ЕС).
Получали подвижную фазу, содержащую 0,2М одноосновный фосфат натрия, доведенный до рН 7,0 с использованием 1,0М гидроксида натрия. Для всех разделений использовали колонку Т8К Ое1 03000 РАх1 (7,8 мм х 30 см, частицы 7 мкм № Р0047-02РЩ. Использовали скорость тока 1 мл/мин, и длина волны выявления была установлена на 280 нм. Инъекционный объем составлял 2 мкл для образцов с концентрацией 25 мг/мл и 1 мкл для образцов с концентрацией 50 мг/мл. Перед анализом каждого образца в тройной повторности прогоняли пустые пробы, содержащие только буфер, и данные хроматограммы надлежащим образом вычитали. Все интегрирования пиков проводили на СЬготе1еоп 6.08.
Капиллярное 1ЕР (с1ЕР).
Анализ капиллярным изоэлектрическим фокусированием (с1ЕР) проводили, как описано в руководстве по применению РА 800 р1ик, опубликованному Весктап СоиЬет. Более подробное описание можно найти у Маск е1 а1. (Е1ес1торЬоте515 2009, 30 (23), 4049-4058). Все анализы проводили с использованием системы Весктап СоиЬет Р/АСЕ™ МЭР (Весктап СоиЬет, 1пс.; Вгеа, СА), работающей при температуре окружающей среды с нейтральным капилляром (внутр. диаметр 50 мкм) общей длины 30 см (20 см эффективной длины). Нейтральный капилляр получали путем иммобилизации поли(акриламида) в стенку капилляра с использованием способа, описанного 0ао е1 а1. (Апа1 СЬет 2004, 76 (24), 7179-7186). Все образцы для с1ЕР получали смешиванием интересующего белка в концентрации 0,25 мг/мл со смесью 3М мочевины-амфолита, содержащего гель для с1ЕР, катодного стабилизатора, анодного стабилизатора и маркеров р1. Образец инъецировали в капилляр под давлением 65,5 кПа в течение 4,1 мин, после этого времени его фокусировали путем приложения напряжения 25 кВ между анолитом и католитом на 15 мин. После данной стадии следовала химическая мобилизация при 30 кВ между анолитом и химическим мобилизатором в течение 30 мин. Во время стадии мобилизации маркеры р1 и интересующий белок выявляли с использованием поглощения при 280 нм. р1 данного белка рассчитывали из полученного уравнения регрессии р1 относительно момента первого пика, полученного со стандартами р1.
- 42 029214
Результаты и обсуждение
Исследование 1.
Образцы ТКС105 успешно концентрировали до концентраций, превышающих 5 мг/мл. В результате исследование 1 проводили с использованием концентрации белка 25 мг/мл. Образцы хранили в течение двух недель при 40°С. Готовили пятнадцать препаратов, сосредотачиваясь на эффектах рН и состава буфера (табл. 2). Первичным аналитическим способом, используемым для оценки стабильности данных образцов, была ЗЕС. После хранения в течение двух недель при 40°С посредством ЗЕС наблюдали очень маленькое изменение либо содержания мономера, либо количества высокомолекулярных агрегатов (табл. 3). После хранения все композиции все еще содержали более чем 99% мономера.
Таблица 2. Состав композиции ТКС105, оцениваемой в исследовании 1
Номер композиции рН фос. (мМ) ΗΪ8 (мМ) цитрат (мМ) ацетат (мМ) Ν3<71 (мМ) трегалоза (мМ)
Р01 7 20 0 0 0 130 0
Р02 6 20 0 0 0 130 0
РОЗ 6 0 20 0 0 130 0
Р04 5 0 20 0 0 130 0
Р05 6 0 0 20 0 130 0
Р06 5 0 0 20 0 130 0
Р07 4 0 0 0 20 130 0
Р08 5 0 0 0 20 130 0
Р09 5 0 20 0 0 0 240
Р10 5 0 0 20 0 0 240
Р11 5 0 0 0 20 0 240
Р12 6 10 0 0 0 0 240
Р13 6 0 10 0 0 0 240
Р14 6 10 0 0 0 80 120
Р15 6 0 10 0 0 80 120
Таблица 3. Краткое изложение уровней мономера и агрегатов, измеренных посредством ЗЕС, для композиций из исследования 1 в исходный момент времени и момент времени две недели (ί2)
Номер композиции рН исходный % агрегатов исходный % мономера % агрегатов в две недели % мономера в две недели
Р01 7 0,32 99,54 0,48 99,52
Р02 6 0,19 99,70 0,22 99,71
РОЗ 6 0,19 99,78 0,14 99,82
Р04 5 0,14 99,82 0,13 99,85
Р05 6 0,19 99,78 0,28 99,71
Р06 5 0,13 99,83 0,21 99,77
Р07 4 0Д1 99,86 0,10 99,88
Р08 5 о,п 99,85 0,26 99,72
Р09 5 0,16 99,81 0,09 99,90
Р10 5 0,13 99,84 0,19 99,79
Р11 5 0,15 99,82 0,16 99,82
Р12 6 0,19 99,78 0,53 99,45
Р13 6 0,21 99,76 0,15 99,81
Р14 6 0,20 99,76 0,45 99,52
Р15 6 0,21 99,79 0,21 99,77
Обнаружили, что ТКС105 является очень стабильным.
Исследование 2.
Имея в распоряжении результаты исследования 1, разработали новое исследование. В исследовании 2 рН варьировал от 4,5 до 5,5, и оценивали эффекты ацетата, гистидина и цитрата. Выбранными модифи- 43 029214
каторами/стабилизаторами тоничности были сорбит и трегалоза. Наконец, помимо композиций с концентрацией 25 мг/мл, исследовали три композиции с концентрацией 50 мг/мл.
Таблица 4. Состав композиции ТКС105, оцениваемой в исследовании 2
Номер композиции рН Белок Мг/мл ΗΪ8 (мМ) цитрат (мМ) ацетат (мМ) сорбит трегалоза
Р01 5,5 25 0 0 20 0 0
Р02 4,5 25 0 0 20 0 0
РОЗ 5,5 25 0 20 0 0 0
Р04 5,5 25 20 0 0 0 0
Р05 4,5 25 0 0 10 0 0
Р06 4,0 25 0 0 10 0 0
Р07 5,5 25 20 0 0 240 0
Р08 5,5 25 20 0 0 0 240
Р09 4,0 25 0 0 20 240 0
Р10 4,0 25 0 0 20 0 240
Р11 5,5 25 0 10 0 240 0
Р12 5,5 25 0 10 0 0 240
Р13 5,5 25 10 0 0 240 0
Р14 5,5 25 10 0 0 0 240
Р15 4,0 50 0 0 10 0 0
Р16 5,0 50 0 0 20 0 0
Р17 5,5 50 20 0 0 240 0
Принимая во внимание стабильность ТКС105, данные образцы хранили в течение четырех недель при 40°С для того, чтобы постараться в большей степени различать композиции. Первичным инструментом для скрининга была ЗЕС.
Таблица 5. Краткое изложение уровней мономера и агрегатов, измеренных посредством ЗЕС, для композиций из исследования 1 в исходный момент времени и момент времени четыре недели
Номер рН буфер исходный исходный % агрегатов % мономера
композиции % % мономера в четыре в четыре
агрегатов недели недели
Р01 5,5 ацетат 0,17 99,83 0,27 99,73
Р02 4,5 ацетат 0,10 99,90 0,16 99,84
РОЗ 5,5 цитрат 0,14 99,86 0,22 99,78
- 44 029214
Р04 5,5 Из 0,17 99,83 0,13 99,87
Р05 4,5 ацетат о,п 99,89 0,14 99,86
Р06 4,0 ацетат 0,10 99,90 0,12 99,88
Р07 5,5 Шз 0,15 99,85 0,13 99,87
Р08 5,5 Шз 0,23 99,77 0,16 99,84
Р09 4,0 ацетат 0,14 99,86 0,15 99,85
Р10 4,0 ацетат 0,15 99,85 0,15 99,85
Р11 5,5 цитрат 0,16 99,84 0,30 99,70
Р12 5,5 цитрат 0,21 99,79 0,28 99,72
Р13 5,5 Шз 0,19 99,81 0,15 99,85
Р14 5,5 Шз 0,27 99,73 0,16 99,84
Р15 4,0 ацетат 0,17 99,83 0,16 99,84
Р16 5,0 ацетат 0,19 99,81 0,85 99,15
Р17 5,5 Шз 0,24 99,76 0,26 99,74
Аналогично тому, что наблюдали в исследовании 1, содержание мономера практически во всех композициях превышает 99,5%, даже после одного месяца при 40°С (табл. 5). Один образец, повидимому, демонстрирует повышенный уровень агрегации, и им был Р16; данный образец не подвергали повторному испытанию для того, чтобы понять, был ли этот результат реальным. Показателем является то, что рН 4 в ацетате или рН 5,5 в гистидине, по-видимому, обеспечивают адекватную и сравнимую стабильность. Принимая во внимание связь цитрата и раздражения, его удалили из дальнейшего рассмотрения.
Данные образцы также анализировали с использованием капиллярного изоэлектрического фокусирования (с1ЕР). Общий центр электрофореграммы с1ЕР считали в качестве первого момента. Данные значения можно рассматривать как средние значения р1 образца (табл. 6).
Таблица 6. Среднее значение р1 для композиций ТКС из исследования 2 в исходный момент времени и момент времени четыре недели
№ композиции рН буфер исходный 4 недели
Р01 5,5 ацетат 8,97 8,88
Р02 4,5 ацетат 8,76 8,94
РОЗ 5,5 цитрат 8,84 8,88
Р04 5,5 Из 8,94 8,88
Р05 4,5 ацетат 8,78 8,87
Р06 4,0 ацетат 8,86 8,89
Р07 5,5 Шз 8,87 8,88
Р08 5,5 Шз 8,93 8,87
Р09 4,0 ацетат 8,92 8,90
Р10 4,0 ацетат 8,92 8,92
Р11 5,5 цитрат 8,96 8,87
Р12 5,5 цитрат 8,92 8,85
Р13 5,5 Шз 8,91 8,90
Р14 5,5 Шз 8,95 8,92
Р15 4,0 ацетат 8,90 8,87
Р16 5,0 ацетат 8,90 8,86
Р17 5,5 Шз 8,95 8,93
В целом, изменение значения р1 для любой из композиций является малым, свидетельствуя о том, что дезамидирование, т.е. гидролиз боковых цепей Азп с образованием продуктов в виде заряженных Азр, является относительно медленным (табл. 6). Таким образом, данные композиции ТКС105, повидимому, являются физически стабильными (т.е. демонстрируют мало агрегации или не демонстрируют ее) и химически стабильными (т.е. не демонстрируют фрагментацию и демонстрируют мало дезамиди- 45 029214
рования или не демонстрируют его).
Другая проблема касалась того, демонстрировали ли данные композиции с более высокой концентрацией неблагоприятную вязкость, ограничивая посредством этого их клиническое применение.
Таблица 7. Динамическая вязкость ТРС105 в ацетатном и гистидиновом буферах при концентрациях примерно 25 и примерно 50 мг/мл
Композиция рН [Белок] Вязкость (сСт)
20 мМ ацетат 4,0 25,1 1,19 ±0,01
4,0 51,8 1,53 ±0,01
20 мМ гистидин 5,5 23,8 1,22 ±0,01
5,5 47,6 1,65 ±0,04
Даже в концентрации 50 мг/мл ТРС105 демонстрирует вязкость меньше чем 2 сСт, что значительно меньше любого значения, которое вызвало бы проблему органичений при обращении и введении (см. табл. 7).
Исследование встряхивания.
В то время как тепловой стресс является полезным для различения композиций разной стабильности, он является не единственным стрессовым воздействием, с которым может сталкиваться белок. Обычным является повреждение белков на границе раздела фаз, и должна оцениваться их чувствительность к напряжению на границе раздела фаз. Это делали с использованием встряхивания и повторных циклов замораживания-оттаивания (Р/Т).
Таблица 8. Содержание мономера, определенное посредством δΕΑ для композиций ТРС105, которые встряхивали в течение 24 ч при 150 об/мин, и соответствующих образцов в состоянии покоя. Все образцы выдерживали при 4°С
Композиция Поверхностноактивное вещество Белок Мономер (покой) Мономер (стресс)
рН 5, 20 мМ ацетат Нет 25 99,84 99,84
Р68 25 99,83 99,83
Р880 25 99,81 99,82
рН 5, 20 мМ ацетат Нет 50 99,82 99,83
Р68 50 99,82 99,82
Р880 50 99,81 99,83
рН 5,5, 20 мМ Ηϊδ Нет 25 99,75 99,76
Р68 25 99,74 99,76
Р880 25 99,76 99,77
рН 5,5, 20 мМ Ηΐδ Нет 50 99,77 99,75
Р68 50 99,76 99,75
Р880 50 99,76 99,77
Ощутимая потеря мономера при встряхивании отсутствует, причем все композиции демонстрируют более чем 99,7% мономера и отсутствие значимого отличия от контроля, находящегося в состоянии покоя (табл. 8). Добавление поверхностно-активного вещества, такого как Р1игошс Р-68 или полисорбат 80, по-видимому, не улучшает или не вредит стабильности при встряхивании.
Исследование Р/Т.
Второе исследование, проверяющее чувствительность ТРС105 к напряжению на границе раздела фаз, включало воздействие повторных циклов замораживания-оттаивания. Это не только дает информацию о повреждении на границах раздела фаз (подобных границе лед-вода), но и обеспечивает необходимую информацию о том, можно ли замораживать образцы ТРС105 для последующего анализа или во время перевозки.
- 46 029214
Таблица 9. Содержание мономера, определенное посредством 8ЕС, для композиций ТКС105, подвергнутых 0, 3 и 5 циклам Р/Т
Композиция Поверхностноактивное вещество Белок мг/мл 0 циклов 3 цикла 5 циклов
рН 5, 20 мМ ацетат Нет 25 99,86 99,83 99,82
Г68 25 99,84 99,81 99,82
Р880 25 99,84 99,83 99,80
рН 5, 20 мМ ацетат Нет 50 99,81 99,64 99,80
Г68 50 99,81 99,68 99,81
Р880 50 99,82 99,65 99,80
рН 5,5, 20 мМ ΗΪ8 Нет 25 99,79 99,74 99,72
Р68 25 99,79 99,75 99,73
Р880 25 99,76 99,74 99,74
рН 5,5, 20 мМ ΗΪ8 Нет 50 99,76 99,79 99,75
Р68 50 99,75 99,82 99,73
Р880 50 99,75 99,79 99,73
Фактически отсутствует изменение содержания мономера при повторном циклическом воздействии Р/Т (табл. 9). Неожиданно, добавление поверхностно-активного вещества, такого как Р1игошс Р-68 или полисорбат 80, не изменяло стабильность при повторном циклическом воздействии Р/Т. Наряду с данными по встряхиванию нет указания, что ТКС105 является поверхностно активным в такой степени, что может вызывать проблему повреждения на границе раздела фаз. Таким образом, для жидкой композиции не требуется поверхностно-активное вещество.
Краткое изложение
Провели исследования по скринингу композиций на ТКС105 при концентрациях белка вплоть до 50 мг/мл. Данный белок является достаточно стабильным, демонстрируя лишь небольшие снижения содержания мономера, определенные посредством 8ЕС, даже после хранения при 40°С в течение четырех недель. Посредством 8ЕС совсем не наблюдали фрагментацию. Тем временем, анализ с1ЕР продемонстрировал, что наблюдались лишь маленькие изменения общей р1, свидетельствуя о минимальном дезамидировании в рассматриваемом интервале рН (от 4,0 до 5,5). Не было доказательства чувствительности к повреждению на границе раздела фаз, указывая на то, что в жидких композициях ТКС105 не требуется поверхностно-активное вещество.
В лучших композициях использовался ацетатный буфер с рН 4,0 или гистидиновый буфер с рН 5,5, наряду с сорбитом или трегалозой в качестве модификатора тоничности и стабилизатора.
Пример 10. Оценка долговременной стабильности композиций ТКС105.
Оценку долговременной стабильности проводили для того, чтобы подтвердить результаты исследования 1 и исследования 2. Образцы композиций, представленных в табл. 10, хранили при 5 и 25°С.
Таблица 10. Композиции для подтверждающего исследования
Номер композиции Композиция [белок]
Р01 рН 5,5, 20 мМ гистидин, 240 мМ трегалоза 25 мг/мл
Р02 рН 5,5, 20 мМ гистидин, 240 мМ сорбит 25 мг/мл
РОЗ рН 4,0, 20 мМ ацетат, 240 мМ сорбит 25 мг/мл
Р04 рН 5,5, 20 мМ гистидин, 240 мМ трегалоза 50 мг/мл
Р05 рН 4,0, 20 мМ ацетат, 240 мМ трегалоза 50 мг/мл
Р06 рН 5,5, 20 мМ гистидин, 240 мМ трегалоза 100 мг/мл
Р07 рН 4,0, 20 мМ ацетат, 240 мМ трегалоза 100 мг/мл
Результаты и обсуждение
Семь тестируемых композиций оценивали на протяжении одного года при 5°С и 6 месяцев при 25°С. При 5°С все композиции работали хорошо. По внешнему виду все образцы во все моменты времени в данном исследовании были прозрачными и бесцветными. В общем, значения рН во всех новых ком- 47 029214
позициях на протяжении всего исследования оставались постоянными (см. табл. 11 и 12). Значения были слегка выше, чем целевые, на 0,1-0,2 единицы, но оставались стабильными. Значения концентрации для новых комозиций, определенные с помощью в УФ, оставались постоянными в пределах примерно 3-4% отклонения от исходных намеченных значений, независимо от концентрации (см. табл. 11 и 12). Данные значения значимо не изменялись по ходу исследования. Имела место минимальная потеря мономера, определенная посредством 8ЕС при 5°С (см. табл. 13), и минимальные количества химической деградации, определенные посредством с1ЕР (см. табл. 15 и 16). В то время как имело место некоторое варьирование результатов ЕЫ8А по связыванию СЭ105, за исключением первоначальных результатов для Р05, все значения находились в границах критерия приемлемости от 50 до 150% по сравнению со значением эталонного стандарта, что согласуется с результатами этапа разработки анализа ЕЫ8А (см. табл. 17). Результаты тестирования СР-8С8 (капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия) показали то, что образцы были сравнимыми с эталонным веществом при 5°С на протяжении одного года (данные не показаны).
В то время как образцы, которые хранили при 5°С, были, по существу, неизменными, параметры композиции имели влияние на стабильность для образцов, которые хранили при 25°С. Примечательнее всего то, что композиции, содержащие систему на основе ацетатного буфера (Р03, Р05, Р07), демонстрировали большие снижения процента мономера, чем композиции, содержащие гистидиновый буфер (Р01, Р02, Р04 и Р06) (см. табл. 14). Тем временем, изменения концентрации белка, по-видимому, имеют небольшой эффект или не имеют эффекта. Две композиции с концентрацией 100 мг/мл (Р06, Р07) являются сравнимыми с их аналогами с концентрацией 50 мг/мл (Р04, Р05) в показателях их профилей 8ЕС и профилей с1ЕР.
Таблица 11. рН и концентрации в мг/мл, определенные в УФ, при 5°С
Композиция Исходные 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев
рН КОНЦ. рН КОНЦ. рН КОНЦ. рН КОНЦ.
Р01 5,6 25 5,6 24 5,6 27 5,6 24
Р02 5,6 24 5,5 23 5,6 25 5,6 25
РОЗ 4,2 25 4,2 25 4,3 27 4,2 26
Р04 5,6 50 5,6 51 5,6 54 5,5 52
Р05 4,2 50 4,3 52 4,3 54 4,2 52
Р06 5,6 98 5,7 99 5,7 104 5,6 105
Р07 4,3 99 4,4 102 4,4 108 4,3 102
Таблица 12. рН и концентрации в мг/мл, определенные в УФ, при 25°С
Композиция Исходные 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев
рН КОНЦ. рН КОНЦ. рН КОНЦ. рН КОНЦ.
Р01 н/а н/а 5,6 25 5,6 27 5,6 26
Р02 н/а н/а 5,6 24 5,6 25 5,6 24
РОЗ н/а н/а 4,3 25 4,3 27 4,3 26
Р04 н/а н/а 5,8 50 5,6 53 5,6 51
Р05 н/а н/а 4,3 53 4,3 53 4,3 52
Р06 н/а н/а 5,7 100 5,8 105 5,6 105
Р07 н/а н/а 4,4 109 4,5 104 4,4 103
- 48 029214
Таблица 13. Гель-хроматография (БЕС) при 5°С
Композиция % мономера
Исходный 3 месяца 6 месяца 12 месяца
Р01 99,36 99,36 99,38 99,37
Р02 99,37 99,37 99,34 99,37
РОЗ 99,37 99,35 99,31 99,24
Р04 99,35 99,33 99,32 99,31
Р05 99,38 99,35 99,31 99,24
Р06 99,24 99,22 99,19 99,18
Р07 99,35 99,29 99,23 99,17
Таблица 14. Гель-хроматография (БЕС) при 25°С
Композиция % мономера
Исходный 3 месяца 6 месяцев
Р01 99,36 99,27 96,37
Р02 99,37 99,28 96,25
РОЗ 99,37 96,02 93,64
Р04 99,35 99,18 96,51
Р05 99,38 96,07 93,70
Р06 99,24 98,99 96,23
Р07 99,35 96,02 93,84
Таблица 15. с1ЕР - средняя р1 при 5°С
Композиция Средняя р!
Исходный 3 месяца 6 месяцев 12 месяцев
Р01 9,0 8,9 9,0 9,0
Р02 8,9 8,9 8,9 9,0
РОЗ 8,9 8,9 9,0 9,1
Р04 8,9 8,9 8,9 9,0
Р05 8,9 8,9 8,9 9,0
Р06 8,9 8,9 8,9 9,0
Р07 8,9 8,9 8,9 9,0
Таблица 16. с1ЕР - средняя р1 при 25°С
Композиция Средняя р!
Исходный 3 месяца 6 месяцев
Р01 9,0 8,9 9,0
Р02 8,9 9,0 8,9
РОЗ 8,9 8,9 8,9
Р04 8,9 8,9 8,9
Р05 8,9 8,9 8,8
Р06 8,9 8,9 8,9
Р07 8,9 8,9 8,9
- 49 029214
Таблица 17. Связывание 0Ώ105. определенное посредством ЕЫ8А при 5°0
Композиция Процент относительной способности связывания СП105
Исходное 6 месяцев 12 месяцев
Р01 101 94 68
Р02 90 90 69
РОЗ 124 Не тестировали 77
Р04 123 97 74
Р05 179 Не тестировали 96
Р06 93 95 115
Р07 100 Не тестировали 86
Пример 11. Оценка долговременной стабильности композиции ТК0105 в концентрации 4 мг/мл. Исследования стабильности проводили на ТК0105. приготовленном в концентрации 4 мг/мл в 17
мМ фосфатном буфере со 145 мМ хлоридом натрия с рН 7.2 (партия РШ-0536). Доступны данные по стабильности в течение тридцати шести месяцев при рекомендованных условиях хранения (2-8°0). и доступен один месяц данных при ускоренных условиях 25°0/КН (относительная влажность) 60%. Данные по стабильности представлены в таблицах. приведенных ниже. Ни для одного из проведенных тестов не наблюдали значимых изменений. Следовательно. эти исследования показывают. что ТК0105. приготовленный в концентрации 4 мг/мл в 17 мМ фосфатном буфере со 145 мМ хлоридом натрия с рН 7.2. является стабильным в течение по меньшей мере 36 месяцев при хранении при 2-8°0.
- 50 029214
Таблица 18. Данные по стабильности для ТКС105, которое хранили при рекомендованных условиях хранения - 2-8°С
Тест Исходные 6 месяцев 9 месяцев 12 месяцев
Внешний вид и Прозрачный Прозрачный Прозрачный Прозрачный
описание бесцветный бесцветный бесцветный бесцветный
раствор. раствор без раствор с раствор с
Минорное наличия присутствием присутствием
количество видимых минорного минорного
серых частиц. количества количества
пылеобразных белых частиц. белых частиц.
частиц.
δϋδ-ΡΑΟΕ, Сравнимо с Сравнимо с Сравнимо с Сравнимо с
условия
δϋδ-ΡΑΟΕ 98% 96% 97% 98%
восстанавливающие
условия
ΙΕΡ Сравнимо с Сравнимо с Сравнимо с Сравнимо с
эталоном эталоном эталоном эталоном
δΕΟ-ΗΡΕΟ 96,62% 96,97 % 96,91 % 96,77 %
Связывание СО 105, Активность Активность Активность Активность
определенное связывания связывания связывания связывания
посредством ΕΕΙδΑ 88% 110% 104% 91%
относительно относительно относительно относительно
эталонного эталонного эталонного эталонного
стандарта стандарта стандарта стандарта
Поглощение в 4,3 мг/мл 4,2 мг/мл 4,2 мг/мл 4,2 мг/мл
УФ(А280)
рН 7,2 7,3 7,2 7,2
Стерильность Не тестировали Не тестировали Не тестировали Не тестировали
- 51 029214
Тест 18 месяцев 24 месяца 30 месяцев 36 месяцев
Внешний вид и Прозрачный Прозрачный Прозрачный Прозрачный
описание бесцветный бесцветный бесцветный бесцветный
раствор с раствор без раствор без раствор без
небольшим присутствия присутствия присутствия
количеством присутствующих белых частиц частиц частиц частиц
δϋδ-ΡΑΟΕ, Сравнимо с Сравнимо с Сравнимо с Сравнимо с
невосстанавливающие условия эталоном эталоном эталоном эталоном
δϋδ-ΡΑΟΕ восстанавливающие условия 97% 96% 97% 96%
ΙΕΡ Сравнимо с Сравнимо с Сравнимо с Сравнимо с
эталоном эталоном эталоном эталоном
8ЕС-НРЕС 96,32% 96,86 % 96,60 % 94,04 %
Связывание СО 105, Активность Активность Активность Активность
определенное связывания 88% связывания связывания связывания
посредством ЕБ18А относительно 136% 88% 105%
эталонного относительно относительно относительно
стандарта эталонного стандарта эталонного стандарта эталонного стандарта
Поглощение в УФ(А280) 4,2 мг/мл 4,2 мг/мл 4,2 мг/мл 4,2 мг/мл
рн 7,2 7,2 7,2 7,3
Стерильность Не тестировали Проходит тест Не тестировали Проходит тест
- 52 029214
Таблица 19. Данные по стабильности для партии ΕΙΝ-0536, которую хранили в ускоренных условиях - 25°С/КН 60%
Тест Исходные 1 месяц
Внешний вид и Прозрачный Прозрачный
описание бесцветный бесцветный
раствор. Минорное раствор без наличия
количество серых пылеобразных частиц. видимых частиц.
δϋδ-ΡΑΟΕ, Сравнимо с Сравнимо с
невосстанавливающие условия эталоном эталоном
δϋδ-ΡΑΟΕ восстанавливающие условия 98% 96%
ΙΕΡ Сравнимо с эталоном Сравнимо с эталоном
огг’ ттт Γλ/Γ ГЧ/Г Л ГП /
νυ,υζ’/ο νυ,4·37ο
Связывание СО 105, Активность Активность
определенное связывания 88% связывания 91%
посредством ΕϋΙδΑ относительно эталонного стандарта относительно эталонного стандарта
Поглощение в УФ(А280) 4,3 мг/мл 4,2 мг/мл
рн 7,2 7,3
Аналитическая методика для 8ЕС-НРЬС и УФ является такой же, как описанная в примере 9. Аналитическая методика для ΕΕΙ8.Α для определения связывания СО105 является такой же, как описанная в примере 3. Аналитические методики для 8Ώ8-ΡΑ(Ε при невосстанавливающих условиях, 808-РАСЕ при восстанавливающих условиях и ΙΕΕ описаны ниже.
8Э8-РАСЕ невосстановленных белков и пептидов, окрашивание Кумасси.
Идентичность и чистоту оценивают с использованием анализа посредством электрофореза в полиакриламидном геле. Белки разделяют при денатурирующих условиях. Используют готовые 4-12%-ные Βΐδ-Τπδ гели, содержащие 808. 808 представляет собой анионный детергент, который взаимодействует с белками с образованием отрицательно заряженных комплексов. Данные комплексы перемещаются через полиакриламидные гели согласно их размеру так, что меньшие белки перемещаются быстрее, чем большие белки. Стандарты, контроли и тестируемые образцы денатурируют и загружают на гель. После завершения разделения гели окрашивают Кумасси синим. Гели сканируют с использованием денситометра изображений.
Относительное количество каждой окрашенной полосы определяют посредством денситометрии для каждой дорожки тестируемого образца. Данные количества выражают в виде процентной доли от общего количества для всех полос, полученного для данной дорожки. Значения молекулярной массы (кДа) полос тестируемых образцов определяют на основе сравнения с маркерами молекулярной массы.
8Ο8-ΡΑ('.ιΕ восстановленных белков, окрашивание Кумасси.
Способ 8Ο8-ΡΑ(ιΕ для восстановленных белков является таким же, как описанный в разделе 1.3.2 (выше) для невосстановленных образцов, с добавлением стадии восстановления (для расщепления межи внутримолекулярных дисульфидных связей с высвобождением субъединиц белка, а также других агрегатов). Для восстановления белков к образцам и эталонам добавляют дитиотреитол (50 мМ) перед нагреванием при 85°С в течение пяти минут. При разделении восстановленных белков в буфер для анализа
- 53 029214
добавляют антиоксидант.
Горизонтальное изоэлектриеское фокусирование (1ЕР).
Для разделения белков используют изменяющийся заряд на белках при приложении электрической силы. Устанавливается градиент рН между катодом и анодом, причем катод находится при более высоком значении рН. Поскольку белки имеют амфотерные свойства, они будут обладать положительным значением заряда при значениях рН ниже их р1 и отрицательным значением заряда при значениях рН выше их р1. Под влиянием электрической силы устанавливается градиент рН, и белки будут перемещаться и фокусироваться в их изоэлектрической точке. Данная методика включает применение изоэлектрического фокусирования образцов белка с использованием готовых гелей в горизонтальном формате. После электрофореза гели окрашивают Кумасси. Площадь каждой полосы определяют посредством денситометрии для дорожки каждого образца. Площадь полос рассчитывают как процентную долю от площади всех полос. Для каждой полосы также определяют значения р1 и КТ.
Пример 12. Клиническое испытание для колоректального рака.
В данном примере описано рандомизированное, слепое, многоцентровое исследование фазы II с контролем в виде плацебо, разработанное для предоставления предварительной оценки безопасности и эффективности антитела против ί'.Ό105 у пациентов с колоректальным раком. В исследование включают приблизительно от примерно 100 до примерно 800 пациентов, причем от примерно 50 до примерно 400 пациентов относят к группе лечения, и от примерно 50 до примерно 400 пациентов относят к группе плацебо. Данное испытание будет заключаться в введении внутривенных повторных доз антитела против ί'.Ό105 в дозировке от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг или плацебо каждые две недели в течение 6-10 циклов. Во всех группах можно использовать химиотерапию. Во всех группах можно использовать ингибитор УЕСР. Временные рамки исследования составляют примерно 6 месяцев - примерно 5 лет с непрерывной терапией для респондеров, как указано в конце исходного исследования. Дополнительными мерами результата являются следующие.
Первичная мера результата: общая частота ответа. Одной целью данного исследования является демонстрация увеличения общей частоты ответа в результате лечения антителом против СЭ105 по сравнению с контрольным 1§С.
Вторичные меры результата, которые можно оценивать, включают продолжительность ответа, время до прогрессирования опухоли, общее выживание, серьезные и несерьезные нежелательные явления. Например, лечение может предупреждать прогрессирование заболевания (т. е. стаз) или может приводить к улучшению. Альтернативно или дополнительно, можно измерять другие целевые показатели в отношении одного или более чем одного из следующего: пониженная опухолевая масса, пониженная неоваскуляризация, ослабленные побочные эффекты, ослабленные вредные реакции и/или улучшенное соблюдение пациентом схемы и режима лечения.
Пример 13. Клиническое испытание для рака почки.
В данном примере описано рандомизированное, слепое, многоцентровое исследование фазы II с контролем в виде плацебо, разработанное для предоставления предварительной оценки безопасности и эффективности антитела против ί'.Ό105 у пациентов с почечно-клеточным раком (раком почки). В исследование включают приблизительно от примерно 100 до примерно 800 пациентов, причем от примерно 50 до примерно 400 пациентов относят к группе лечения, и от примерно 50 до примерно 400 пациентов относят к группе плацебо. Данное испытание будет заключаться в введении внутривенных повторных доз антитела против СЭ105 в дозировке от примерно 0,1 до примерно 30 мг/кг или плацебо каждые одну-три недели в течение 3-6 циклов или пока происходит прогрессирование. В обеих группах обработки также можно использовать интерферон. В обеих группах обработки можно использовать ингибитор УЕСР. Временные рамки исследования составляют примерно 6 месяцев - примерно 5 лет с непрерывной терапией для респондеров, как указано в конце исходного исследования. Дополнительными мерами результата являются следующие.
Первичная мера результата: выживаемость без прогрессирования заболевания. Одной целью исследования является демонстрация увеличения выживаемости без прогрессирования заболевания после обработки антителом против ί'.Ό105 по сравнению с плацебо.
Вторичные меры результата, которые можно оценивать, включают продолжительность ответа, время до прогрессирования опухоли, общее выживание, серьезные и несерьезные нежелательные явления. Например, лечение может предупреждать прогрессирование заболевания (т. е. стаз) или может приводить к улучшению. Альтернативно или дополнительно, можно измерять другие целевые показатели в отношении одного или более чем одного из следующего: пониженная опухолевая масса, пониженная неоваскуляризация, ослабленные побочные эффекты, ослабленные вредные реакции и/или улучшенное соблюдение пациентом схемы и режима лечения.
Пример 14. Клиническое испытание для печеночно-клеточного рака.
В данном примере описано рандомизированное, слепое, многоцентровое исследование фазы II с контролем в виде плацебо, разработанное для предоставления предварительной оценки безопасности и эффективности антитела против СЭ105 у пациентов с печеночно-клеточным раком (раком печени). В исследование включают приблизительно от примерно 100 до примерно 800 пациентов, причем от при- 54 029214
мерно 50 до примерно 400 пациентов относят к группе лечения, и от примерно 50 до примерно 400 пациентов относят к группе плацебо. В обеих группах можно использовать ингибитор УЕОР. Данное испытание будет заключаться в введении внутривенных повторных доз антитела против 6Ό105 в дозировке от примерно 0,1 до примерно 30 мг/кг или плацебо каждые одну-три недели или пока происходит прогрессирование. Временные рамки исследования составляют примерно 6 месяцев - примерно 5 лет с непрерывной терапией для респондеров, как указано в конце исходного исследования. Дополнительными мерами результата являются следующие.
Первичные меры результата: выживаемость без прогрессирования заболевания. Одной целью исследования является демонстрация увеличения выживаемости без прогрессирования заболевания после обработки антителом против 6Ό105 по сравнению с плацебо.
Вторичные меры результата, которые можно оценивать, включают продолжительность ответа, время до прогрессирования опухоли, общее выживание, серьезные и несерьезные нежелательные явления. Например, лечение может предупреждать прогрессирование заболевания (т. е. стаз) или может приводить к улучшению. Альтернативно или дополнительно, можно измерять другие целевые показатели в отношении одного или более чем одного из следующего: пониженная опухолевая масса, пониженная неоваскуляризация, ослабленные побочные эффекты, ослабленные вредные реакции и/или улучшенное соблюдение пациентом схемы и режима лечения.
Пример 15. Клиническое испытание для рака яичника.
В данном примере описано рандомизированное, слепое, многоцентровое исследование фазы II с контролем в виде плацебо, разработанное для предоставления предварительной оценки безопасности и эффективности антитела против С.О105 у пациентов с раком яичника. В исследование включают приблизительно от примерно 100 до примерно 800 пациентов, причем от примерно 50 до примерно 400 пациентов относят к группе лечения, и от примерно 50 до примерно 400 пациентов относят к группе плацебо. Данное испытание будет заключаться в введении внутривенных повторных доз антитела против 6Ό105 в дозировке от примерно 0,1 до примерно 30 мг/кг или плацебо каждые одну-три недели в течение 5 циклов. В обеих группах обработки также можно использовать химиотерапию. В обеих группах обработки можно использовать ингибитор УЕОР. Временные рамки исследования составляют примерно 6 месяцев примерно 5 лет с непрерывной терапией для респондеров, как указано в конце исходного исследования. Дополнительными мерами результата являются следующие.
Первичная мера результата: выживаемость без прогрессирования заболевания. Одной целью исследования является демонстрация увеличения выживаемости без прогрессирования заболевания после обработки антителом против 6Ό105 по сравнению с плацебо.
Вторичные меры результата, которые можно оценивать, включают продолжительность ответа, время до прогрессирования опухоли, общее выживание, серьезные и несерьезные нежелательные явления. Например, лечение может предупреждать прогрессирование заболевания (т. е. стаз) или может приводить к улучшению. Альтернативно или дополнительно, можно измерять другие целевые показатели в отношении одного или более чем одного из следующего: пониженная опухолевая масса, пониженная неоваскуляризация, ослабленные побочные эффекты, ослабленные вредные реакции и/или улучшенное соблюдение пациентом схемы и режима лечения.
Пример 16. Лечение возрастной дегенерации желтого пятна.
Первое исследование.
Пациентов, демонстрирующих возрастную дегенерацию желтого пятна, лечат интравитреальной инъекцией антитела против СО 105 или контрольного антитела для уменьшения или предупреждения развития неоваскуляризации, макулярного заболевания и повреждения сетчатки.
В качестве первой стадии лечения пациенты должны получать полное офтальмологическое обследование для установления исходного уровня состояния здоровья глаз. Офтальмологическое обследование включает непрямую офтальмоскопию, биомикроскопию посредством щелевой лампы, обследование периферической части сетчатки, измерения внутриглазного давления, симптоматологию остроты зрения (без вспомогательных средств и с наилучшей коррекцией), фотографию глазного дна, ангиографию с флуоресцеином, оптическую когерентную томографию, электроретинографию и измерения в режиме А.
После предварительного обследования в пораженный глаз пациента, демонстрирующего АМО, осуществляли интравитреальную инъекцию, как описано выше. При поражении обоих глаз их можно лечить раздельно. В глаз, подлежащий лечению, инъецируют офтальмологический раствор.
После лечения глаза пациента следует обследовать в сутки один (1), два (2), семь (7), пятнадцать (15), тридцать (30) и шестьдесят (60) и затем каждый месяц в течение 2 лет. Из-за возможности рецидива пациенты должны затем возвращаться для периодических обследований на ежемесячной основе. В каждые сутки обследования у пациента отслеживают разжижение стекловидного тела. Кроме того, у пациентов отслеживают заднее отслоение стекловидного тела с использованием непрямой офтальмоскопии с использованием депрессии склеры. Наконец, непрерывно отслеживают степень АМО, демонстрируемой пациентами, посредством периодических обследований сетчатки, оптической когерентной томографии и ангиограмм с флуоресцеином для отслеживания присутствия жидкости под сетчаткой, крови, экссудатов, отслойки КРЕ, кистозных изменений сетчатки или присутствия серовато-зеленой субретинальной неова- 55 029214
скулярной мембраны. Дополнительные лечения могут потребоваться при наблюдении признаков повторно происходящей неоваскуляризации. Дополнительные лечения можно давать на еженедельной или ежемесячной основе. В предпочтительном воплощении после исходного лечения следуют последующие лечения, разделенные интервалом 1-6 месяцев.
Второе исследование.
Цель: продемонстрировать эффективность интравитреальных антител против СП 105 для лечения неоваскулярной возрастной дегенерации желтого пятна (А\ГО). У всех пациентов можно использовать ингибитор УЕОР.
Способы: от 50 до 500 пациентов (от 50 до 500 глаз) с субфовеальной хориоидальной неоваскуляризацией (СКУ), возникающей в результате А\ГО, будут участвовать в исследовании в одобренном месте.
Критериями для повторной инъекции является присутствие жидкости в желтом пятне, увеличенная толщина центральной области сетчатки (СИТ) по меньшей мере на 100 мкм, снижение остроты зрения по меньшей мере на 5 букв, ассоциированная с увеличением количества жидкости в желтом пятне, новая классическая СNУ или новое кровоизлияние в желтом пятне. Главной мерой результата является доля глаз со снижением остроты зрения меньше чем 15 букв через 12 месяцев. Измерение остроты зрения с наилучшей коррекцией и клиническое исследование глаз проводят в неделю 1, месяц 1 и затем ежемесячно в течение 5-12 месяцев.
Среднюю остроту зрения и среднюю СИТ измеряют в сравнении с исходным уровнем. Отмечают глазные и/или системные побочные эффекты.
Пример 17. Последовательности гуманизированных-деиммунизированных антител.
Выделенное гуманизированное деиммунизированное антитело против ΟΌ105 может содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как ЗЕ(1 ГО N0: 11, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как ЗЕр ГО N0: 12.
ЗЕЦ ГО ΝΟ: 11: О1и Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СНу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а Тгр Ме! Азр Тгр Уа1 Агд СНп А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1 О1у О1и А1а Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Из А1а ТЬг Туг Туг А1а О1и Зег Уа1 Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи СНп Ме! Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
8Е<3 ГО ΝΟ: 12: Азр Не О1п Ме! ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у Азр Агд А1а ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! Из Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго СНу Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр А1а Туг А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз
Другие неограничивающие примеры гуманизированных-деиммунизированных тяжелых цепей включают ЗЕР ГО N0: 13, 14, 15 и 16, но не ограничиваются ими.
ЗЕЦ ГО ΝΟ: 13: О1и Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СНу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а Тгр Ме! Азр Тгр Уа1 Агд СНп А1а Рго СНу Ьуз СНу Ьеи СНи Тгр Уа1 А1а СНи Не Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Из А1а ТЬг Туг Туг А1а СНи Зег Уа1 Ьуз СНу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи СНп Ме! Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СНи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СНу СНп СНу ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
ЗЕЦ ГО ΝΟ: 14: О1и Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СНу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а Тгр Ме! Азр Тгр Уа1 Агд СНп А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1 СНу О1и Не Агд Зег О1п А1а Зег Азп Из А1а ТЬг Туг Туг А1а СНи Зег Уа1 Ьуз СНу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи
- 56 029214
Туг Ьеи СНп Ме! Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СНи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 15: О1и Уа1 О1п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у О1у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СНу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а Тгр Ме! Азр Тгр Уа1 Агд СНп А1а Рго СНу Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1 О1у О1и Пе Агд Зег Агд А1а Зег Азп Из А1а ТЬг Туг Туг А1а СНи Зег Уа1 Ьуз СНу Агд РЬе ТЬг Пе Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи СНп Ме! Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СНи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СНу СНп СНу ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 16: СНи Уа1 СНп Ьеи Уа1 СНи Зег СНу СПу СНу Ьеи Уа1 Ьуз Рго СНу СНу Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СНу РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а Тгр Ме! Азр Тгр Уа1 Агд СНп А1а Рго СНу Ьуз СНу Ьеи СНи Тгр Уа1 Зег СНи Пе Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Из А1а ТЬг Туг Туг А1а СНи Зег Уа1 Ьуз СНу Агд РЬе ТЬг Пе Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи СНп Ме! Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг СНи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр СНу СНп СНу ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
Другие неограничивающие примеры гуманизированных-деиммунизированных легких цепей включают 8ЕС) ГО ΝΟ: 17. 18. 19. 20. 21. 22 и 23. но не ограничиваются ими.
ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 17: Азр Пе СНп Ьеи ТЬг СНп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 СНу Азр Агд А1а ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! Из Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго СНу Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр А1а Туг А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег СНу Зег СНу Зег СНу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи СНп Рго СНи Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз СНп СНп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг РЬе СНу СНу СНу ТЬг Ьуз Уа1 СНи Пе Ьуз
ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 18: Азр Пе СНп Ьеи ТЬг СНп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 СНу Азр Агд А1а ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! Из Тгр Туг СНп СНп Ьуз Рго СНу Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр Пе Туг А1а Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег СНу Зег СНу Зег СНу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи СНп Рго СНи Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз СНп СНп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг РЬе СНу СНу СНу ТЬг Ьуз Уа1 СНи Пе Ьуз
ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 19: Азр Пе О1п Ьеи ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у Азр Агд Уа1 ТЬг Пе Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! Из Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго СНу Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр А1а Туг А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и Азр РЬе
- 57 029214
А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр 8ег 8ег Азп Рго Ьеи ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Пе Ьуз
5Е<3 Ιϋ ΝΟ: 20: Азр Пе О1п Ьеи ТПг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у Азр Агд Уа1 ТПг Пе Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! Из Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго СНу Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр Пе Туг А1а Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РПе Зег СНу Зег СНу Зег СНу ТПг Азр Туг ТПг Ьеи ТПг Пе Зег Зег Ьеи СНп Рго СНи Азр РПе А1а ТПг Туг Туг Суз СНп СНп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТПг РПе СНу СНу СНу ТПг Ьуз Уа1 СНи Пе Ьуз
8Е<3 ГО ΝΟ: 21: Азр Пе О1п Ме! ТПг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у Азр Агд Уа1 ТПг Пе Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! Шз Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго СНу Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр Пе Туг А1а Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег О1у Зег О1у Иг Азр Туг Иг Ьеи Иг Пе Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и Азр РПе А1а ТПг Туг Туг Суз СНп СНп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТПг РПе СНу СНу СНу ТПг Ьуз Уа1 СНи Пе Ьуз
8Е<3 ГО ΝΟ: 22: Азр Пе СНп Ме! ТПг СНп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 СНу Азр Агд А1а ТПг Пе ТПг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! Шз Тгр Туг СНп СНп Ьуз Рго СНу Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр Пе Туг А1а Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег О1у Зег О1у ТПг Азр Туг ТПг Ьеи ТПг Пе Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и Азр РПе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Пе Ьуз
8Е<3 ГО ΝΟ: 23: Азр Пе СНп Ме! ТЬг СНп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 СНу Азр Агд Уа1 ТЬг Пе Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! Шз Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго СНу Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр А1а Туг А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег СНу Зег СНу Зег СНу ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи СНп Рго СНи Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз СНп СНп Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг РЬе СНу СНу СНу ТЬг Ьуз Уа1 СНи Пе Ьуз
Аспекты описанных здесь воплощений могут быть реализованы в других формах или осуществлены другими способами без отступления от их сущности или существенных характеристик. Настоящее описание, следовательно, во всех аспектах следует рассматривать как иллюстративное и не ограничивающее, и подразумевается, что в нем охвачены все изменения, которые попадают в пределы значения и интервала эквивалентности.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ТРАКОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.
<120> КОМПОЗИЦИИ АНТИТЕЛ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 35882-714.601
<140>
<141>
<150> 61/697,111
<151> 2012-09-05
<160> 23
<170> РаЬепЫп версия 3.5
<210> 1
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
- 58 029214
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 1 Рго А1а 11е 10 Ьеи Зег А1а Зег Рго 15 О1у
О1п 1 11е Уа1 Ьеи Зег 5 О1п Зег
О1и Ьуз Уа1 ТЬг МеЬ ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Ηΐ3 Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Зег Зег Рго Ьуз Рго Тгр 11е Туг
35 40 45
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Зег О1у Зег
50 55 60
О1у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг 11е Зег Агд Уа1 О1и А1а О1и
65 70 75 80
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у А1а О1у ТЬг Ьуз Ьеи О1и Ьеи Ьуз
100 105
<210> 2
<211> 107
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 2
Агд 1 ТЬг Уа1 А1а А1а 5 Рго Зег Уа1 РЬе 11е 10 РЬе Рго Рго Зег Азр 15 О1и
О1п Ьеи Ьуз Зег 20 О1у ТЬг А1а Зег Уа1 25 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп 30 Азп РЬе
Туг Рго Агд 35 О1и А1а Ьуз Уа1 О1п 40 Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп 45 А1а Ьеи О1п
Зег О1у 50 Азп Зег О1п О1и Зег 55 Уа1 ТЬг О1и О1п Азр 60 Зег Ьуз Азр Зег
ТЬг 65 Туг Зег Ьеи Зег Зег 70 ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег 75 Ьуз А1а Азр Туг О1и 80
- 59 029214
О1у Ьеи Зег Зег
95
Ьуз Ηΐ3 Ьуз Уа1 Туг 85 А1а Суз О1и Уа1 ТЬг 90 Нчз О1п
Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд С1у О1и Суз
100 105
<210> 3
<211> 118
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид
синтетический
<400> 3 О1и 5 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи 10 Уа1
О1и 1 Уа1 Ьуз Ьеи
Зег МеЬ Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг
20 25
Тгр МеЬ Азр Тгр Уа1 Агд О1п Зег Рго О1и Ьуз О1у
35 40
А1а О1и 11е Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Нчз А1а ТЬг
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр
65 70 75
Уа1 Туг Ьеи О1п МеЬ Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр
85 90
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр
100 105
О1п Рго О1у 15 О1у
РЬе Зег 30 Азр А1а
Ьеи 45 О1и Тгр Уа1
Туг Туг А1а О1и
Зег Ьуз Зег Зег 80
ТЬг О1у 11е 95 Туг
О1у О1п 110 О1у ТЬг
ТЬг Ьеи
ТЬг Уа1
Зег Зег
115
<210> 4
<211> 330
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности полипептид
синтетический
<400> 4
А1а Зег ТЬг Ьуз О1у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а
1 5 10
Рго Зег Зег Ьуз
15
- 60 029214
Зег ТЬг Зег О1у 20 О1у ТЬг А1а А1а Ьеи 25 О1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз 30 Азр Туг
РЬе Рго О1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег О1у А1а Ьеи ТЬг Зег
35 40 45
О1у Уа1 Ηΐ3 ТЬг РЬе Рго А1а Уа1 Ьеи О1п Зег Зег О1у Ьеи Туг Зег
50 55 60
Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи О1у ТЬг О1п ТЬг
65 70 75 80
Туг 11е Суз Азп Уа1 Азп Н1з Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз
85 90 95
Ьуз Уа1 О1и Рго Ьуз Зег Суз Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг Суз Рго Рго Суз
100 105 110
Рго А1а Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго
115 120 125
Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е Зег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз
130 135 140
Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег Н1з О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр
145 150 155 160
Туг Уа1 Азр О1у Уа1 О1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и
165 170 175
О1и О1п Туг Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
180 185 190
Ηΐ3 О1п Азр Тгр Ьеи Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп
195 200 205
Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз О1у
210 215 220
О1п Рго Агд О1и Рго О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег Агд Азр О1и
225 230 235 240
Ьеи ТЬг Ьуз Азп О1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг
245 250 255
Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 О1и Тгр О1и Зег Азп О1у О1п Рго О1и Азп
- 61 029214
260 265 270
Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр О1у Зег РЬе РЬе
275 280 285
Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр О1п О1п О1у Азп
290 295 300
Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Мер Н1з О1и А1а Ьеи Нтз Азп Нтз Туг ТЬг
305 310 315 320
О1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у Ьуз
325 330
<210> 5
<211> 10
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 5
Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Мер Нтз
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 6
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 7
О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг 1 5
<210> 8
<211> 5
- 62 029214
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 8
Азр А1а Тгр МеЬ Азр
1 5
<210> 9
<211> 19
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 9
О1и 11е Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Ηΐ3 А1а ТЬг Туг Туг А1а О1и Зег 1 5 10 15
Уа1 Ьуз О1у
<210> 10
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 10
Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег
1 5
<210> 11
<211> 118
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 11 Уа1 5 О1и Зег О1у О1у О1у 10 Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у 15 О1у
О1и 1 Уа1 О1п Ьеи
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а
20 25 30
Тгр МеЬ Азр Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1
- 63 029214
35 40 45
О1у О1и А1а Агд Зег Ьуз А1а 55 Зег Азп Н1з А1а ТЬг Туг 60 Туг А1а О1и
50
Зег Уа1 Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи О1п МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр О1у О1п О1у ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 12
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 12
Азр 1 11е О1п МеЬ ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр Агд А1а ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр А1а Туг
35 40 45
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег
50 55 60
О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 13
<211> 118
- 64 029214
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 13
О1и 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи 10 Уа1 Ьуз Рго С1у 15 О1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а
20 25 30
Тгр МеЬ Азр Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а О1и 11е Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Н1з А1а ТЬг Туг Туг А1а О1и
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи О1п МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр С1у О1п О1у ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 14
<211> 118
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 14 Зег О1у О1у О1у 10 Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у 15 О1у
О1и 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1и
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 О1у РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Азр А1а
Тгр МеЬ Азр Тгр 35 Уа1 Агд О1п А1а Рго 40 О1у Ьуз О1у Ьеи 45 О1и Тгр Уа1
О1у О1и 11е Агд Зег О1п А1а Зег Азп Нтз А1а ТЬг Туг Туг А1а О1и
- 65 029214
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи О1п МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр О1у О1п О1у ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 15
<211> 118
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 15
О1и 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1и Зег С1у О1у О1у Ьеи 10 Уа1 Ьуз Рго О1у 15 О1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а
20 25 30
Тгр МеЬ Азр Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1
35 40 45
О1у О1и 11е Агд Зег Агд А1а Зег Азп Н1з А1а ТЬг Туг Туг А1а О1и
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи О1п МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр О1у О1п О1у ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 16
<211> 118
- 66 029214
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 16
О1и 1 Уа1 О1п Ьеи Уа1 5 О1и Зег О1у О1у О1у Ьеи 10 Уа1 Ьуз Рго О1у 15 О1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе Зег Азр А1а
20 25 30
Тгр МеЬ Азр Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег О1и 11е Агд Зег Ьуз А1а Зег Азп Нчз А1а ТЬг Туг Туг А1а О1и
50 55 60
Зег Уа1 Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азр Зег Ьуз Азп ТЬг
65 70 75 80
Ьеи Туг Ьеи О1п МеЬ Азп Зег Ьеи Ьуз ТЬг О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг
85 90 95
Туг Суз ТЬг Агд Тгр Агд Агд РЬе РЬе Азр Зег Тгр О1у О1п О1у ТЬг
100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 17
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 17 Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр 1 11е О1п Ьеи ТЬг О1п 5 Зег
Азр Агд А1а ТЬг 20 11е ТЬг Суз Агд А1а 25 Зег Зег Зег Уа1 Зег 30 Туг МеЬ
Нчз Тгр Туг 35 О1п О1п Ьуз Рго О1у 40 Ьуз А1а Рго Ьуз Рго 45 Тгр А1а Туг
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег
- 67 029214
50 55 60
О1у 65 Зег О1у ТЬг Азр Туг 70 ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег 75 Зег Ьеи О1п Рго О1и 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 18
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 18
Азр 1 11е О1п Ьеи ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр Агд А1а ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Н1з Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр 11е Туг
35 40 45
А1а Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег
50 55 60
О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 19
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 19
- 68 029214
Азр 1 11е О1п Ьеи ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Ηΐ3 Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр А1а Туг
35 40 45
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег
50 55 60
О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 20
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 20 ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр 1 11е О1п Ьеи
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Нчз Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр 11е Туг
35 40 45
А1а Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег
50 55 60
О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
- 69 029214
100
105
<210> 21
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 21
Азр 1 11е О1п МеЬ ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Ηΐ3 Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр 11е Туг
35 40 45
А1а Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег
50 55 60
О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 22
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 22 ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр 1 11е О1п МеЬ
Азр Агд А1а ТЬг 20 11е ТЬг Суз Агд А1а 25 Зег Зег Зег Уа1 Зег 30 Туг МеЬ
Нтз Тгр Туг 35 О1п О1п Ьуз Рго О1у 40 Ьуз А1а Рго Ьуз Рго 45 Тгр 11е Туг
- 70 029214
А1а Зег 50 Зег Азп Ьеи А1а Зег 55 О1у Уа1 Рго Зег Агд 60 РЬе Зег О1у Зег
О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
100 105
<210> 23
<211> 106
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид
<400> 23 ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 О1у
Азр 1 11е О1п МеЬ
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеЬ
20 25 30
Нтз Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Рго Тгр А1а Туг
35 40 45
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у Зег
50 55 60
О1у Зег О1у ТЬг Азр Туг ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго О1и
65 70 75 80
Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег Зег Азп Рго Ьеи ТЬг
85 90 95
РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз
100 105

Claims (37)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом, содержащая от примерно 1 до примерно 100 мг/мл антитела против СО 105, вплоть до примерно 100 мМ забуферивающего агента, вплоть до примерно 1М полиола, и имеющая рН от примерно 4,0 до примерно 5,5.
2. Композиция по п.1, в которой указанный забуферивающий агент представляет собой гистидин.
3. Композиция по п.1, в которой забуферивающий агент представляет собой ацетат и рН составляет примерно 4.
4. Композиция по п.1, в которой забуферивающий агент представляет собой гистидин и рН состав- 71 029214
ляет примерно 5,5.
5. Композиция по п.1, в которой указанное антитело против СБ105 содержит вариабельную область легкой цепи (^), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 1, константную область легкой цепи (Съ), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 2, вариабельную область тяжелой цепи (^), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 3, и константную область (Рс), имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 4.
6. Композиция по п.1, в которой указанное антитело против СБ105 содержит СБК1 (определяющая комплементарность область 1) ^, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 5, СБК2 ^, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 6, СБК3 ^, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 7, СБК1 ^, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 8, СБК2 ^, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 9, и СБК3 ^, имеющую аминокислотную последовательность, представленную как 8Е0 ГО NО: 10.
7. Композиция по п.1, содержащая примерно 25, примерно 50 или примерно 100 мг/мл антитела против СБ105.
8. Композиция по п.1, в которой указанный забуферивающий агент представляет собой гистидин или ацетат.
9. Композиция по п.8, содержащая примерно 20 мМ гистидин или ацетат.
10. Композиция по п.1, изготовленная в форме для интравитреального или внутривенного введения.
11. Композиция по п.1, дополнительно содержащая приемлемый носитель или эксципиент.
12. Композиция по п.11, в которой указанный носитель или эксципиент представляет собой фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
13. Композиция по п.1, которая является изотоничной или гипертоничной.
14. Композиция по п.1, где количество полиола меньше чем 300 мМ и данная композиция сделана изотоничной с использованием соли.
15. Композиция по п.1, в которой полиол представляет собой сахар.
16. Композиция по п.15, в которой указанный сахар представляет собой невосстанавливающий сахар.
17. Композиция по п.16, в которой невосстанавливающий сахар представляет собой трегалозу или сахарозу.
18. Композиция по п.15, в которой сахар представляет собой сорбит.
19. Композиция по п.1, дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество.
20. Композиция по п.19, в которой поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20, полисорбат 80 или Р1иготс® Р68.
21. Композиция по п.1, где заболевание, связанное с ангиогенезом, представляет собой рак, в том числе метастазирующий.
22. Композиция по п.21, где рак представляет собой солидную опухоль.
23. Композиция по п.21, где рак имеет эпителиальное происхождение.
24. Композиция по п.21, где рак представляет собой рак легкого, меланому, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак матки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, рак печени, саркому, миелому, рак мозга или лимфому.
25. Композиция по п.1, где указанное заболевание, связанное с ангиогенезом, представляет собой офтальмологическое состояние.
26. Композиция по п.25, где офтальмологическое состояние представляет собой возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию или хороидальную неоваскуляризацию.
27. Композиция по п.26, где указанная возрастная дегенерация желтого пятна (АМБ) представляет собой влажную АМБ или сухую АМБ.
28. Предварительно заполненный шприц, подходящий для внутривенного введения, содержащий композицию по любому из пп.1-27.
29. Предварительно заполненный шприц, подходящий для интравитреального введения, содержащий композицию по любому из пп.1-27, где композиция содержит примерно 25 или примерно 50 мг/мл анти-СБ105 антитела.
30. Применение композиции по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с ангиогенезом.
31. Применение по п.30, где заболевание, связанное с ангиогенезом, представляет собой рак, в том числе метастазирующий.
32. Применение по п.31, где рак представляет собой солидную опухоль.
33. Применение по п.31, где рак имеет эпителиальное происхождение.
34. Применение по п.31, где рак представляет собой рак легкого, меланому, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак матки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, рак печени, саркому, миелому, рак мозга или лимфому.
- 72 029214
35. Применение по п.30, где указанное заболевание, связанное с ангиогенезом, представляет собой офтальмологическое состояние.
36. Применение по п.35, где офтальмологическое состояние представляет собой возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетическую ретинопатию или хороидальную неоваскуляризацию.
37. Применение по п.36, где указанная возрастная дегенерация желтого пятна (ΑΜΌ) представляет собой влажную ΑΜΌ или сухую ΑΜΌ.
A. Уь ТКС105: СБК подчеркнуты
ОIУЪ505ΡΑΙЪ5А5РСЕКУТМТСКАЗЗЗуЗУМНИУООКРСЗ5РКРИIΥΑΤ3ΝΣΑ3СУРУКГЗ бЗбЗбТЗУЗЪТТЗКУЕАЕРААТУУСООМЗЗЫРЪТгеАбТКЪЕЪК (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 1)
Б. Сь ТКС105:
КТУААРЗУЕ1ЕРРЗОЕ0ЬКЗСТАЗУУСЬ]АЖЕ¥РКЕАКУ<2ИКУОЕАЬ<23СЕ30ЕЗУТЕ<2ОЗК ОЗТУЗЬЗЗТЬТЬЗКАОУЕКНКУУАСЕУТНОСЬЗЗРУТКЗЕЕНСЕС (ЗЕО Ю N0: 2)
B. Ун ТКС105: СБК подчеркнуты
ЕУКЬЕЕ3СССЬУОРССЗМКЬЗСААЗСЕТЕЗРАИМРИУКОЗРЕКОЬЕИУАЕТКЗКАЗЫНАТУУ АЕЗУКСКЕЫЗКРРЗКЗЗУУЬОМНЗЬКАЕРТбТУУСТКМККЕЕРЗМОООТТЬТУЗЗ (ЗЕО ΙΒ N0: 3)
Г. Су1 ТКС105
АЗТКСРЗУЕРЬАРЗЗКЗТЗССТААЬССЬУКВУЕРЕРУТУЗИКЗСАЬТЗСУНТЕРАУЬОЗЗСЬ Υ3Ρ33νντνΡ333ΡΟΤ0ΤΥΙΟΝνΝΗΚΡ3ΝΤΚνΌΚΚνΕΡΚ3ΟΌΚΤΗΤΟΡΡΟΡΑΡΕΡΡΟΟΡ3νΕ ΡΕΡΡΚΡΚΌΤΡΜΙ3ΗΤΡΕνΤθνννΌν3ΗΕΌΡΕνΚΕΝΐΛΓΥνΌθνΕνΗΝΑΚΤΚΡΗΕΕ0ΥΝ3ΤΥΗνν 3νΡΤνΡΗ0ϋ^ΝΟΚΕΥΚΟΚν3ΝΚΑΡΡΑΡΙΕΚΤΙ3ΚΑΚΟ0ΡΚΕΡ0νΥΤΡΡΡ3ΚΟΕΡΤΚΝ0ν3Ρ ΤΟΡνΚΟΕΥΡ3ΌΙΑνΕΜΕ3ΝΟ0ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΡΌ3ΌΟ3ΕΕΡΥ3ΚΡΤνΌΚ3ΗΐΛΓ00ΟΝνΕ3Ο3ν МНЕАЬНЫНУТОКЗЬЗЬЗРСК (ЗЕО ΙΌ N0: 4)
д. 0ΌΗ1 УЬ: НАЗЗЗУЗУМН (ЗЕО ΙΌ N0: 5) Ε. 0ΌΗ2 УЬ: АТЗЫЬАЗ (ЗЕО ΙΌ N0: 6) Ж. 0ΌΗ3 УЬ: ООИЗЗЫРЬТ (ЗЕО ΙΌ N0: 7) 3. 0ΌΗ1 УН: ΌΑΜΜΌ (ЗЕО ΙΌ N0: 8) и. 0ΌΗ2 УН: ΕΙΗ3ΚΑ3ΝΗΑΤΥΥΑΕ3νΚ0 (ЗЕО ΙΌ N0: 9) й. СРЕЗ УН: ИИИЕЕРЗ (ЗЕО ΙΡ N0: 10
EA201590412A 2012-09-05 2013-09-05 Композиции антител и их применения EA029214B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261697111P 2012-09-05 2012-09-05
PCT/US2013/058265 WO2014039682A1 (en) 2012-09-05 2013-09-05 Antibody formulations and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201590412A1 EA201590412A1 (ru) 2015-08-31
EA029214B1 true EA029214B1 (ru) 2018-02-28

Family

ID=50237600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201590412A EA029214B1 (ru) 2012-09-05 2013-09-05 Композиции антител и их применения

Country Status (19)

Country Link
US (2) US10195281B2 (ru)
EP (1) EP2892559A4 (ru)
JP (3) JP2015532657A (ru)
KR (2) KR20180007014A (ru)
CN (2) CN108785669A (ru)
AU (2) AU2013312536B2 (ru)
BR (1) BR112015004875A2 (ru)
CA (1) CA2883343A1 (ru)
EA (1) EA029214B1 (ru)
GE (1) GEP201706789B (ru)
HK (1) HK1210714A1 (ru)
IL (1) IL237287A0 (ru)
MX (1) MX368996B (ru)
MY (1) MY180157A (ru)
NZ (1) NZ705109A (ru)
PH (1) PH12015500480A1 (ru)
SG (2) SG10201705070PA (ru)
UA (1) UA115789C2 (ru)
WO (1) WO2014039682A1 (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1888059T3 (en) 2005-06-01 2015-03-30 Edison Pharmaceuticals Inc Redox-active therapeutic products for the treatment of mitochondrial diseases and other conditions as well as modulation of energy biomarkers
EP1986636B1 (en) 2006-02-22 2013-04-24 Edison Pharmaceuticals, Inc. Phenol and 1,4-benzoquinone derivatives for use in the treatment of mitochondrial diseases
US8221753B2 (en) 2009-09-30 2012-07-17 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies
UA115789C2 (uk) 2012-09-05 2017-12-26 Трейкон Фармасутікалз, Інк. Композиція антитіла до cd105 та її застосування
US9926375B2 (en) 2014-11-12 2018-03-27 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
AU2015346444A1 (en) 2014-11-12 2017-05-04 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
US10703701B2 (en) 2015-12-17 2020-07-07 Ptc Therapeutics, Inc. Fluoroalkyl, fluoroalkoxy, phenoxy, heteroaryloxy, alkoxy, and amine 1,4-benzoquinone derivatives for treatment of oxidative stress disorders
CN106928359B (zh) * 2015-12-30 2020-10-13 广西医科大学 一种CD105纳米抗体Nb59
CN106928355B (zh) * 2015-12-30 2020-09-29 广西医科大学 一种CD105纳米抗体Nb184
CN106478820A (zh) * 2016-10-10 2017-03-08 米度（南京）生物技术有限公司 一种肝癌pet诊断示踪剂及其制备方法与用途
CA3082899A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Amgen Inc. Vegfr-fc fusion protein formulations
MX2020007697A (es) * 2018-02-09 2020-09-14 Genmab As Composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos biespecificos dirigidos contra grupo de diferenciacion 3 (cd3) y grupo de diferenciacion 20 (cd20) y sus usos.
CN113474360A (zh) 2019-02-18 2021-10-01 伊莱利利公司 治疗性抗体制剂
CN112717129A (zh) * 2019-10-14 2021-04-30 百奥泰生物制药股份有限公司 抗vegf抗体制剂
AU2021342342A1 (en) 2020-09-10 2023-04-13 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20 for treating chronic lymphocytic leukemia
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
WO2024163905A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Genzyme Corporation Hsc-specific antibody conjugated lipid nanoparticles and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010032059A2 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune Llc Targeted binding agents directed to cd105 and uses thereof
WO2010039873A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Humanized endoglin antibodies
WO2011022339A1 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-vegf agents
WO2011041441A1 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US928641A (en) 1908-10-09 1909-07-20 Levi E Edmunds Clasp for pilings.
US4957939A (en) 1981-07-24 1990-09-18 Schering Aktiengesellschaft Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging
US4472509A (en) 1982-06-07 1984-09-18 Gansow Otto A Metal chelate conjugated monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5308626A (en) 1985-06-28 1994-05-03 Toni N. Mariani Lymphokine activated effector cells for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) treatment of cancer and other diseases
US4938948A (en) 1985-10-07 1990-07-03 Cetus Corporation Method for imaging breast tumors using labeled monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4868103A (en) 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
GB9022788D0 (en) 1990-10-19 1990-12-05 Cortecs Ltd Pharmaceutical formulations
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
EP0552108B1 (en) 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Energy transfer phase-modulation fluoro-immunoassay
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US6096289A (en) 1992-05-06 2000-08-01 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular, and endoscopic tumor and lesion detection, biopsy and therapy
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US20020136725A1 (en) 1996-01-17 2002-09-26 Smithkline Beecham Corporation Antithrombotic agents
US6107090A (en) 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
EP0938505B1 (en) 1996-05-31 2002-03-06 Health Research, Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in anti-angiogenesis therapy
US6190660B1 (en) 1996-05-31 2001-02-20 Health Research, Inc. Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy
US5796097A (en) 1997-03-05 1998-08-18 California Lightwave Laboratories, Inc. Chemical sensor and method
ES2190087T3 (es) 1997-06-13 2003-07-16 Genentech Inc Formulacion estabilizada de un anticuerpo.
US6610293B1 (en) 1997-06-16 2003-08-26 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Opsonic and protective monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of gram positive bacteria
EP1140840B1 (en) 1999-01-13 2006-03-22 Bayer Pharmaceuticals Corp. -g(v)-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6635677B2 (en) 1999-08-13 2003-10-21 Case Western Reserve University Methoxyamine combinations in the treatment of cancer
WO2001058957A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
DE10013850A1 (de) * 2000-03-15 2001-09-20 Schering Ag Gasgefüllte Mikrokapseln enthaltend funktionalisiertes Polyalkylcyanacrylat, sowie Verfahren zu deren Herstellung
DE60139944D1 (de) 2000-10-12 2009-10-29 Genentech Inc Niederviskose konzentrierte proteinformulierungen
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002069232A2 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gmbh Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
WO2002072824A2 (en) 2001-02-20 2002-09-19 Bayer Aktiengesellschaft Human transient receptor potential channel protein.
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
PT1390535E (pt) 2001-04-26 2010-10-04 Amgen Mountain View Inc Bibliotecas combinatórias de domínios monoméricos
CA2444483A1 (en) 2001-04-26 2002-11-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
CA2491864C (en) 2001-07-12 2012-09-11 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US7371849B2 (en) 2001-09-13 2008-05-13 Institute For Antibodies Co., Ltd. Methods of constructing camel antibody libraries
US20030211075A1 (en) 2001-09-27 2003-11-13 Thorpe Philip E. Combined compositions for tumor vasculature coagulation and treatment
US7115716B2 (en) 2001-11-19 2006-10-03 Eli Lilly And Company Tumor specific monoclonal antibodies
SI1475101T1 (sl) 2002-02-14 2011-03-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Farmacevtski proizvodi iz raztopine, ki vsebuje protitelo
EP1494714A4 (en) 2002-04-05 2008-03-05 Amgen Inc HUMAN ANTI-OPGL NEUTRALIZING ANTIBODIES AS SELECTIVE OPGL PATH HEMMER
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
US7754884B2 (en) 2005-01-03 2010-07-13 Vanderbilt University Targeted, NIR imaging agents for therapy efficacy monitoring, deep tissue disease demarcation and deep tissue imaging
US7691374B2 (en) 2002-10-23 2010-04-06 Health Research, Inc. Method for increasing the efficacy of anti-tumor agents by anti-endoglin antibody
US7097836B1 (en) 2002-10-23 2006-08-29 Health Research, Inc. Method for increasing the efficacy of anti-tumor agents by anti-endoglin antibody
DE10303664A1 (de) 2003-01-23 2004-08-12 Nemod Immuntherapie Ag Erkennungsmoleküle zur Behandlung und Detektion von Tumoren
US7120987B2 (en) 2003-08-05 2006-10-17 Avery Dennison Corporation Method of making RFID device
WO2005037867A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. ALTERATION OF Fc-FUSION PROTEIN SERUM HALF-LIVES BY MUTAGENESIS OF POSITIONS 250, 314 AND/OR 428 OF THE HEAVY CHAIN CONSTANT REGION OF IG
AU2004284090A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1871882A1 (en) 2005-03-25 2008-01-02 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules directed to mcsp and having increased fc receptor binding affinity and effector function
PT2586459T (pt) 2005-03-25 2017-07-25 Regeneron Pharma Formulações antagonistas de fcev
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
JP2009507838A (ja) 2005-09-12 2009-02-26 ノビミューン エスアー 抗ｃｄ３抗体製剤
WO2007041643A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 University Of Tennessee Research Foundation Dietary calcium for reducing the production of reactive oxygen species
US8053569B2 (en) 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
EP3753548A1 (en) 2006-06-16 2020-12-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration
KR20090060453A (ko) * 2006-09-25 2009-06-12 메디뮨 엘엘씨 안정화된 항체 제제 및 그것의 용도
WO2008038127A2 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Merck Serono S.A. Junctional adhesion molecule-c (jam-c) binding compounds and methods of their use
WO2008045373A2 (en) 2006-10-06 2008-04-17 Amgen Inc. Stable antibody formulations
ES2925992T3 (es) 2006-10-20 2022-10-20 Amgen Inc Formulaciones estables de polipéptidos
TW200838875A (en) 2007-02-01 2008-10-01 Genentech Inc Combination therapy with angiogenesis inhibitors
CN101970472B (zh) 2007-06-06 2013-10-30 研究发展基金会 Rtef-1变体及其用于抑制血管发生的用途
CA2696049A1 (en) * 2007-08-17 2009-02-26 Amgen Inc. Formulations of antibodies and fc-fusion molecules using polycations
US8524722B2 (en) 2007-09-14 2013-09-03 Bayer Intellectual Property Gmbh Substituted tricyclic compounds and methods of use thereof
AR069501A1 (es) 2007-11-30 2010-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti- vegf (factor de crecimiento endotelial vascular)
BRPI0905660A2 (pt) 2008-01-14 2015-07-07 Genentech Inc "método para reduzir ou inibir a angiogênese"
PE20110677A1 (es) 2008-08-29 2011-09-16 Bayer Ip Gmbh Polimorfo b de la n-(2-aminofenil)-4-[n-(piridin-3-il) metoxicarbonilamino-metil]benzamida (ms-275)
US8699361B2 (en) 2008-09-30 2014-04-15 Qualcomm Incorporated Out-of-synchronization handling method and apparatus
EP2196476A1 (en) 2008-12-10 2010-06-16 Novartis Ag Antibody formulation
BRPI1006519A2 (pt) 2009-03-06 2016-08-09 Genentech Inc formulação de anticorpos
US20180057602A1 (en) 2009-08-17 2018-03-01 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-vegf agents
CN103108658B (zh) * 2010-07-02 2015-08-19 米迪缪尼有限公司 抗体制剂
CN108341863A (zh) 2011-04-20 2018-07-31 阿塞勒隆制药公司 内皮糖蛋白多肽及其用途
JP2014524417A (ja) 2011-08-01 2014-09-22 タフツ メディカル センター インコーポレイテッド 心不全および関連状態の処置
UA115789C2 (uk) 2012-09-05 2017-12-26 Трейкон Фармасутікалз, Інк. Композиція антитіла до cd105 та її застосування
US10214590B2 (en) 2013-09-20 2019-02-26 Tufts Medical Center, Inc. Inhibitors of endoglin activity for the treatment of fibrosis
AU2015346444A1 (en) 2014-11-12 2017-05-04 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof
US9926375B2 (en) 2014-11-12 2018-03-27 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Anti-endoglin antibodies and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010032059A2 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune Llc Targeted binding agents directed to cd105 and uses thereof
WO2010039873A2 (en) * 2008-10-01 2010-04-08 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Humanized endoglin antibodies
WO2011022339A1 (en) * 2009-08-17 2011-02-24 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-vegf agents
WO2011041441A1 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOWE D. et al. Aggregation, Stability and Formulation of Human Antibody Therapeutics, ADVANCES IN PROTEIN CHEMISTRY AND STRUCTURAL BIOLOGY, 2011, Vol. 84, pg. 41-61, pg. 54 A *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2892559A4 (en) 2016-05-11
CA2883343A1 (en) 2014-03-13
JP2018076350A (ja) 2018-05-17
SG11201501659SA (en) 2015-04-29
EA201590412A1 (ru) 2015-08-31
CN104684580A (zh) 2015-06-03
IL237287A0 (en) 2015-04-30
MX2015002840A (es) 2015-08-12
AU2018204044A1 (en) 2018-06-28
CN108785669A (zh) 2018-11-13
US10195281B2 (en) 2019-02-05
JP2019059753A (ja) 2019-04-18
AU2013312536B2 (en) 2018-04-19
JP6602446B2 (ja) 2019-11-06
MX368996B (es) 2019-10-23
KR20180007014A (ko) 2018-01-19
JP2015532657A (ja) 2015-11-12
US20150209430A1 (en) 2015-07-30
JP6445671B2 (ja) 2018-12-26
AU2013312536A1 (en) 2015-03-05
KR101820582B1 (ko) 2018-01-22
WO2014039682A1 (en) 2014-03-13
PH12015500480B1 (en) 2015-04-27
KR20150048877A (ko) 2015-05-07
UA115789C2 (uk) 2017-12-26
HK1210714A1 (en) 2016-05-06
SG10201705070PA (en) 2017-07-28
MY180157A (en) 2020-11-23
PH12015500480A1 (en) 2015-04-27
BR112015004875A2 (pt) 2017-11-21
EP2892559A1 (en) 2015-07-15
NZ705109A (en) 2018-04-27
GEP201706789B (en) 2017-12-11
US20180311359A1 (en) 2018-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029214B1 (ru) Композиции антител и их применения
JP6000427B2 (ja) 抗エンドグリン抗体及び抗ｖｅｇｆ剤を用いる癌の併用療法
KR101398707B1 (ko) 엔도글린 항체
JP2020007359A (ja) 癌治療のためのｐｄ−１拮抗薬およびｖｅｇｆｒ阻害剤の組み合わせ
JP2019151673A (ja) 血管漏出症候群および癌を治療する方法
JP2013520171A (ja) Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害するモノクローナル抗体ならびにその製造方法およびその使用方法
JP7460608B2 (ja) 抗ｐｄ－１抗体と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いるがんの治療方法
JP7408559B2 (ja) プラチナベースの薬剤と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートの組み合わせを用いるがんの治療方法
JP2021501776A (ja) 抗組織因子抗体−薬物コンジュゲートおよびがんの治療におけるその使用
CN112105388A (zh) 抗组织因子抗体-药物偶联物及其在癌症治疗中的应用
JP2022513386A (ja) 抗ｖｅｇｆ抗体と抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートとの組み合わせを用いてがんを治療する方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU