JP6667519B2 - 高濃度の抗ｖｅｇｆ抗体を含有する安定状態のタンパク質溶液製剤 - Google Patents

高濃度の抗ｖｅｇｆ抗体を含有する安定状態のタンパク質溶液製剤 Download PDF

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Description

本出願は、その開示が参照により本明細書に具体的に組み込まれている、２０１４年１２月５日に出願された米国仮出願第６２／０８８，０６１号、および２０１４年１１月７日に出願された米国仮出願第６２／０７６，７７０号の優先権を主張するものである。
発明の分野
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体の水性医薬製剤、その調製法、およびこれらの製剤の使用に関する。
発明の背景
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は血管形成および血管新生の周知のレギュレーターであり、腫瘍および眼内障害と関係がある血管新生の重要なメディエーターであることが示されている（Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)）。ＶＥＧＦのｍＲＮＡは多くのヒト腫瘍において過剰発現され、眼内分泌液中のＶＥＧＦの濃度は、糖尿病および他の虚血関連網膜症を有する患者において活発に増殖する血管の存在と強く相関する（Berkman et al., J Clin Invest 91:153-159 (1993)；Brown et al. Human Pathol. 26:86-91 (1995)；Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993)；Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996)；およびDvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)；Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)）。さらに、近年の研究は、ＡＭＤに罹患した患者の脈絡膜新生血管膜における局所ＶＥＧＦの存在を示している（Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)）。抗ＶＥＧＦ中和抗体を使用して、ヌードマウス中で様々なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制することができ、虚血性網膜障害のモデルにおいて眼内血管形成を阻害することもできる（Kim et al. Nature 362:841-844 (1993)；Warren et al. J Clin Invest 95:1789-1797 (1995)；Borgstrom et al. Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)；およびMelnyk et al. Cancer Res. 56:921-924 (1996)）（Adamis et al. Arch. Opthalmol. 114:66-71 (1996)）。
抗ＶＥＧＦ抗体を含む幾つかの抗体が、ヒトおよび他の哺乳動物における治療用途に認められている。液状医薬製剤中の治療用抗体の濃度は、例えば投与の経路に応じて広く変化する。小体積が望まれるとき、高濃度の抗体製剤がしばしば必要である。例えば、高濃度の製剤は硝子体内注射または皮下投与に望ましい可能性がある。
しかしながら、高濃度の抗体を含む製剤は短い貯蔵寿命を有する可能性があり、製剤化抗体は、保存中の化学的および物理的不安定性による原因で生物活性を失う可能性がある。凝集、脱アミド化、および酸化は、抗体分解の最も一般的な原因であることが知られている。特に、凝集は患者における免疫応答の増大をもたらす可能性があり、安全上の問題となる。したがって、それは最小化または予防されなければならない。
生物療法用製剤中での粒子の形成も品質上の大きな問題である。数十ミクロンからミリメートル未満およびミリメートルサイズまでの範囲の粒子は、一般に人間の肉眼によって見ることができるからである（Das, 2012, AAPS PharmSciTech, 13:732-746参照）。治療用点眼剤調製物中の粒子は、眼に対するダメージを引き起こす可能性がある。したがって、点眼剤製剤中の肉眼で見えない粒状物質の含有量が特定制限範囲内にあることを保証するための規制基準が存在する。例えば、米国薬局方（ＵＳＰ）は、顕微鏡による粒子計測法により決定して、直径１０μｍ以上の粒子の最大数が１ｍＬあたり５０であること、直径２５μｍ以上の粒子の最大数が１ｍＬあたり５であること、および直径５０μｍ以上の粒子の最大数が１ｍＬあたり２であることなどの、点眼剤溶液中の粒状物質に関する要件を設定している（USP General Chapter <789>参照）。
高濃度の抗体製剤を生成するための方法は知られている。しかしながら、凝集体を形成する、または様々な医薬賦形剤、バッファーなどの存在下で分解するその傾向に対する抗体のアミノ酸配列の予想外の影響を克服するための普遍的な手法は存在しない。さらに、高濃度の（抗体などの）タンパク質を含み許容レベルの肉眼で見えない粒子を含有する点眼剤製剤の調製は、難題であり予測可能でない。
本発明の目的は、ヒト、特にヒトの眼に投与するのに適した、高濃度の抗ＶＥＧＦ抗体および低レベルの抗体凝集体および肉眼で見えない粒子を含む、さらなる改良型の製剤を提供することである。
発明の概要
したがって本発明は、点眼剤注射に適した、高濃度の抗ＶＥＧＦ抗体を含む水性医薬組成物を対象とする。ある特定の態様では、本発明の水性医薬組成物は低レベル〜検出不能レベルの抗体凝集または分解を示し、製造、調製、輸送および長期保存中に生物活性の減少がほとんど〜全くなく、抗ＶＥＧＦ抗体の濃度は少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌ、１６０ｍｇ／ｍｌ、１８０ｍｇ／ｍｌ、または２００ｍｇ／ｍｌである。
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体、安定剤、バッファー、および界面活性剤を含む水性医薬組成物を提供する。ある特定の態様では、水性医薬組成物は、（ｉ）少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体、（ｉｉ）安定剤としてスクロースまたはトレハロース、（ｉｉｉ）クエン酸またはヒスチジンバッファー、および（ｉｖ）界面活性剤としてポリソルベート８０を含む。
ある特定の態様では、水性医薬組成物は、約４．５％〜１１％ｗ／ｖのスクロースまたは５％〜１０％のトレハロース、０．００６％〜０．０１２％のクエン酸（ｗ／ｖ）、０．２％〜０．６％のクエン酸三ナトリウム二水和物（ｗ／ｖ）、および約０．０１％〜０．１％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）を含み、この製剤のｐＨは６．３〜７．３である。
本発明の具体的な好ましい実施形態は、以下のある特定の好ましい実施形態および特許請求の範囲のより詳細な記載から明らかとなる。
異なるｐＨで製剤化した１００８に関する濁度アッセイの結果を示すグラフである。ｘ軸は５５℃でのインキュベーション時間を示し、一方ｙ軸は３５０ｎｍでモニタリングした光学濃度を示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、１８０分間５５℃でインキュベートした異なる１００８製剤に関して、ＯＤ３６０の変化をモニタリングした濁度アッセイを示す図である（図２Ａ）。６０分で得たＯＤ３６０曲線を拡大し示す（図２Ｂ中）。図２Ａおよび図２Ｂ中のサンプル番号は、表１３中の製剤番号に対応する。 簡略化のため、０分から９０分の間で回収したデータでの濁度アッセイを示す図である。実験は全体で１８０分であった。５５℃でインキュベートした異なる１００８製剤に関してＯＤ３６０の変化をモニタリングした。この図中のサンプル番号は表１５中の製剤番号に対応する。 ４０℃で６週間保存した間の、選択した８製剤における主ピークに関するＳＥＣの結果を示すグラフである。
発明の詳細な記載
本発明は、高濃度の抗ＶＥＧＦ抗体を含む水性医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の水性医薬組成物は２〜８℃で少なくとも１８カ月安定状態であり、注射または注入を含む眼部投与に適している。特定の実施形態では、本発明の水性医薬組成物は、粒状物質の存在に関するＵＳＰ＜７８９＞の要件を満たす。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の水性医薬組成物における直径１０μｍ以上の粒子の最大数は１ｍＬあたり５０であり、本発明の水性医薬組成物における直径２５μｍ以上の粒子の最大数は１ｍＬあたり５であり、本発明の水性医薬組成物における直径５０μｍ以上の粒子の最大数は１ｍＬあたり２であり、米国薬局方Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈａｐｔｅｒ＜７８９＞により要求されるように、前記粒子数は、光の不透明度および／または顕微鏡による粒子計測法により決定した。
本明細書で使用する「水性」医薬組成物は、水性担体が蒸留水である医薬用途に適した組成物である。医薬用途に適した組成物は滅菌、均質および／または等張状態であってよい。水性医薬組成物は、水性形態、例えば直ちに使用できる予め充填した注射器で直接（「液体製剤」）、または使用直前に復元される凍結乾燥物として、のいずれかで調製することができる。本明細書で使用する用語「水性医薬組成物」は、液体製剤または復元した凍結乾燥製剤を指す。ある特定の実施形態では、本発明の水性医薬組成物はヒト対象への点眼剤投与に適している。具体的な実施形態では、本発明の水性医薬組成物は硝子体内投与に適している。別の実施形態では、本発明の水性医薬組成物は硝子体内注入による投与に適している。
本発明は、新規な医薬製剤、特にその活性成分がヒトＶＥＧＦに対する抗体を含む新規な医薬製剤を提供する。一態様では、本発明は、高濃度の抗ＶＥＧＦ抗体を含む水性医薬組成物に関する。本発明の製剤において好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００９／１５５７２４号パンフレット中に記載されている。
本明細書で使用する用語「抗体」は、完全抗体およびその任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」、「抗原結合ポリペプチド」、もしくは「イムノバインダー」）または単鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に結合した少なくとも二本の重（Ｈ）鎖および二本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１ドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるさらに保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細かく分けることができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んだ、３ＣＤＲと４ＦＲで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の主要成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子と、免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
用語、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原（例えばＶＥＧＦ）と特異的に結合する能力を保持した抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる単一ドメインまたはｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、ならびに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）または（ｖｉｉ）場合によっては合成リンカーにより接合し得る２つ以上の単離ＣＤＲの組合せがある。さらに、Ｆｖ断片の２ドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、組換え法を使用し、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になり一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することができる合成リンカーにより、それらを接合することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。このような単鎖抗体も用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されると考えられる。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技法を使用して得られ、完全抗体と同じ形式で有用性に関して断片をスクリーニングする。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって、または完全免疫グロブリンの酵素もしくは化学的切断によって生成することができる。抗体は異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であってよい。
好ましい実施形態では、本発明の水性医薬組成物は、配列番号１で示す配列を有する可変重鎖および配列番号２で示す配列を有する可変軽鎖を含む。
ＶＨ：配列番号１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＳＬＴＤＹＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＤＰＤＤＤＰＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＤＨＮＳＧＷＧＬＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＬ：配列番号２
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣＱＡＳＥＩＩＨＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＹＬＡＳＴＮＧＡＮＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧ
別の好ましい実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、以下の配列を含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片である：
ＥＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＴＣＱＡＳＥＩＩＨＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＹＬＡＳＴＮＧＡＮＦＧＱＧＴＫＬＴＶＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＳＬＴＤＹＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＤＰＤＤＤＰＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧＧＤＨＮＳＧＷＧＬＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３）
本発明の水性医薬組成物中の抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば国際公開第２００９／１５５７２４号パンフレット中に記載されたように生成することができる。本明細書に記載する発現ベクターを使用してｓｃＦｖを生成することができる。発現ベクター中の開始コドン由来のメチオニンは、それが翻訳後に切断されなかった場合、最終タンパク質中に存在する（実施例の配列番号４を参照）。
ある特定の実施形態では、本発明の水性医薬組成物中の抗ＶＥＧＦ抗体は、それぞれ配列番号５、６および７で示す重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号８、９および１０で示す軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。
配列番号５ ＧＦＳＬＴＤＹＹＹＭＴ
配列番号６ ＦＩＤＰＤＤＤＰＹＹＡＴＷＡＫＧ
配列番号７ ＧＤＨＮＳＧＷＧＬＤＩ
配列番号８ ＱＡＳＥＩＩＨＳＷＬＡ
配列番号９ ＬＡＳＴＬＡＳ
配列番号１０ ＱＮＶＹＬＡＳＴＮＧＡＮ
一実施形態では、本発明の水性医薬組成物中の抗ＶＥＧＦ抗体の濃度は少なくとも５０ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、本発明の水性医薬組成物は、約５０ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ、約７０ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約１１０ｍｇ／ｍｌ、約１２０ｍｇ／ｍｌ、約１３０ｍｇ／ｍｌ、約１４０ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１６０ｍｇ／ｍｌ、約１７０ｍｇ／ｍｌ、約１８０ｍｇ／ｍｌ、約１９０ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約２１０ｍｇ／ｍｌ、約２２０ｍｇ／ｍｌ、約２３０ｍｇ／ｍｌ、約２４０ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌまたは約３００ｍｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の水性医薬組成物は、６０ｍｇ／ｍｌから１２０ｍｇ／ｍｌの間の抗ＶＥＧＦ抗体、例えば配列番号１および配列番号２を含む抗体を含む。
一実施形態では、本発明の水性医薬組成物は、配列番号３を含む６０ｍｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体を含む。
別の実施形態では、本発明の水性医薬組成物は、配列番号３を含む１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体を含む。
本発明の水性医薬組成物は、抗ＶＥＧＦ抗体以外に、１つまたは複数の以下の：（ｉ）安定剤、（ｉｉ）緩衝剤、（ｉｉｉ）界面活性剤、および（ｉｖ）遊離アミノ酸などの、さらなる成分を含む。それぞれのこのような追加的成分を含めることによって、抗ＶＥＧＦ抗体の凝集が少ない組成物を得ることができる。本発明の水性医薬組成物は、抗ＶＥＧＦ抗体以外に、（ｉ）安定剤、（ｉｉ）緩衝剤、および（ｉｉｉ）界面活性剤を含むことが好ましい。
本発明と共に使用するのに適した安定剤は、例えば増粘剤、バルキング剤、可溶化剤などとして作用することができる。安定剤はイオン性または非イオン性（例えば糖）であってよい。糖として、単糖、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど、二糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど、多糖、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、スターチなど、およびアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）などがあるが、これらだけには限られない。例えば、糖はスクロース、トレハロース、ラフィノース、マルトース、ソルビトールまたはマンニトールであってよい。糖は糖アルコールまたはアミノ糖であってよい。スクロースおよびトレハロースが好ましい。最も好ましいのはスクロースである。イオン性安定剤として、ＮａＣｌなどの塩またはアルギニン−ＨＣｌなどのアミノ酸成分を含めることができる。
本発明と共に使用するのに適した緩衝剤には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸の塩などの有機酸塩、トリス、トロメタミン塩酸塩またはリン酸バッファーがあるが、これらだけには限られない。さらに、アミノ酸成分を緩衝剤として使用することもできる。１０〜２０ｍＭのヒスチジンバッファー、例えば０．１３％〜０．２６％（ｗ／ｖ）のヒスチジンおよび０．０３％〜０．０７％（ｗ／ｖ）のヒスチジン塩酸塩一水和物、または１０〜２０ｍＭのクエン酸バッファー、例えば０．００６％〜０．０１２％のクエン酸（ｗ／ｖ）および０．２％〜０．６％のクエン酸三ナトリウム二水和物（ｗ／ｖ）を含む、クエン酸またはヒスチジンバッファーが特に有用である。本発明の製剤中で使用されるクエン酸は、任意の水和形型、例えば無水物または一水和物であってよい。
水性医薬組成物は、このような緩衝剤またはｐＨ調整剤を含み、改善されたｐＨ制御をもたらす。ある特定の実施形態では、本発明の水性医薬組成物は、５．０から８．０の間、５．０から７．０の間、６．０から８．０の間、または６．０から７．０の間のｐＨを有する。一実施形態では、本発明の水性医薬組成物のｐＨは約６．３〜約７．３である。具体的な実施形態では、本発明の水性医薬組成物は約６．８のｐＨを有する。
本明細書中で使用する用語「界面活性剤」は、両親媒性構造、すなわち正反対の可溶性傾向の基、典型的には油溶性炭化水素鎖および水溶性イオン基で構成される構造を有する有機物質を本明細書中で指す。界面活性剤は、表面活性部分の電荷に応じて、様々な医薬組成物および生体材料の調製物用のアニオン性、カチオン性、および分散剤に分類することができる。
本発明と共に使用するのに適した界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤および両イオン性界面活性剤があるが、これらだけには限られない。本発明と共に使用するのに典型的な界面活性剤には、ソルビタン脂肪酸エステル（例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート）、ソルビタントリオレート、グリセリン脂肪酸エステル（例えばグリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート、グリセリンモノステアレート）、ポリグリセリン脂肪酸エステル（例えばデカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート）、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（例えばポリオキシエチレンソルビトールテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビトールテトラオレエート）、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル（例えばポリオキシエチレングリセリルモノステアレート）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えばポリエチレングリコールジステアレート）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（例えばポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えばポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（例えばポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）、ポリオキシエチレンビーズワックス誘導体（例えばポリオキシエチレンソルビトールビーズワックス）、ポリオキシエチレンラノリン誘導体（例えばポリオキシエチレンラノリン）、およびポリオキシエチレン脂肪酸アミド（例えばポリオキシエチレンステアリン酸アミド）、Ｃ１０〜Ｃ１８アルキル硫酸（例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム）、平均２〜４モルのエチレンオキシド単位が付加されたポリオキシエチレンＣ１０〜Ｃ１８アルキルエーテル硫酸Ｃ１０〜Ｃ１８（例えばポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム）、およびＣ１〜Ｃ１８アルキルスルホコハク酸エステル塩（例えばラウリルスルホコハク酸ナトリウムエステル）、およびレシチン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質（例えばスフィンゴミエリン）などの天然界面活性剤、およびＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のスクロースエステルがあるが、これらだけには限られない。組成物は１つまたは複数のこれらの界面活性剤を含むことができる。好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリソルベート２０、４０、６０または８０である。ポリソルベート８０が特に好ましい。
本発明と共に使用するのに適した遊離アミノ酸には、アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、グリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸があるが、これらだけには限られない。塩基性アミノ酸、すなわちアルギニン、リシンおよび／またはヒスチジンを含めることが好ましい。組成物がヒスチジンを含む場合、これは緩衝剤および遊離アミノ酸の両方として作用することができるが、ヒスチジンバッファーを使用するときは、典型的には非ヒスチジン遊離アミノ酸を含み、例えばヒスチジンバッファーおよびリシンを含む。アミノ酸はそのＤ型および／またはＬ型で存在し得るが、Ｌ型が典型的である。アミノ酸は任意の適切な塩、例えばアルギニン−ＨＣｌなどの塩酸塩として存在し得る。好ましい一実施形態では、本発明の水性医薬組成物は如何なるこのような遊離アミノ酸も含まない。
好ましい実施形態では、例えば水中での凍結乾燥物の復元後に、糖は３％から１１％の間の濃度（ｗ／ｖ）で本発明の水性医薬組成物中に存在する。ある特定の実施形態では、糖は約４．５％〜約１１％の濃度のスクロース、または約５％〜約１０％の濃度のトレハロースである。６．７５％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロースが好ましい。
好ましい実施形態では、例えば水中での凍結乾燥物の復元後に、緩衝剤は１ｍＭから６０ｍＭの間、例えば１０〜４０ｍＭ、１５〜３０ｍＭ、１５〜２５ｍＭの濃度で本発明の水性医薬組成物中に存在する。ある特定の実施形態では、緩衝剤はクエン酸またはヒスチジンである。１５ｍＭの濃度のクエン酸バッファーが好ましい。
好ましい実施形態では、例えば水中での凍結乾燥物の復元後に、界面活性剤は最大０．２（体積）％、例えば０．０１〜０．１％、０．０３〜０．０８％、０．０４〜０．０８％の濃度で本発明の水性医薬組成物中に存在する。０．０５％の濃度のポリソルベート８０が好ましい。
本発明の水性医薬組成物において利用できる、他の企図される賦形剤には、例えば抗菌剤、抗酸化剤、静電気防止剤、リン脂質または脂肪酸などの脂質、コレステロールなどのステロイド、血清アルブミン（ヒト血清アルブミン）、組換えヒトアルブミン、ゼラチン、カゼインなどのタンパク質賦形剤、ナトリウムなどの塩形成対イオンなどがある。本発明の製剤において使用するのに適した、これらおよび他の知られている医薬賦形剤および／または添加剤は、例えばThe Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th edition, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003)およびRemington: the Science and Practice of Pharmacy, 21stedition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005)中に列記されたように、当技術分野で知られている。
本発明の好ましい製剤は、以下の実施例の表４０中に示される。
ある特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体の凍結乾燥は、患者を治療するための本発明の水性医薬組成物をもたらすと企図される。
抗体を凍結乾燥するための技法は当技術分野でよく知られており、例えばJohn F. Carpenter and Michael J. Pikal, 1997 (Pharm. Res. 14. 969-975)；Xialin (Charlie) Tang and Michael J. Pikal, 2004 (Pharm. Res. 21, 191-200)を参照。
凍結乾燥物を患者に投与することができる状態にする前に、それを水性復元剤で復元しなければならない。このステップによって、凍結乾燥物中の抗体および他の成分を再溶解させて、患者への注射に適した溶液を得ることができる。
復元に使用される水性物質の体積が、生成する医薬組成物中の抗体の濃度を決定する。凍結乾燥前体積より小体積の復元剤を用いた復元は、凍結乾燥前より濃縮された組成物をもたらす。復元率（凍結乾燥後の製剤の体積：凍結乾燥前の製剤の体積）は１：０．５〜１：６であってよい。１：３の復元率が有用である。前述のように、本発明の凍結乾燥物を復元して少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、または１３０ｍｇ／ｍｌ）の抗ＶＥＧＦ抗体濃度を有する水性組成物を得ることができ、復元剤の体積はそれに応じて選択される。必要な場合、復元した製剤は患者への投与前に適切に希釈し、目的用量を送達することができる。
凍結乾燥抗体に典型的な復元剤には、場合によっては防腐剤を含有する滅菌水またはバッファーがある。凍結乾燥物が緩衝剤を含む場合、復元剤は（凍結乾燥物の緩衝剤と同じであるかもしくは異なってよい）さらなる緩衝剤を含むことができ、または復元剤はその代わりに緩衝剤（例えば、ＷＦＩ（注射用水）、もしくは生理食塩水）を含まない可能性がある。
抗ＶＥＧＦ抗体を含む本発明の水性医薬組成物を使用して、様々な疾患または障害を治療することができる。抗ＶＥＧＦ抗体を含む医薬組成物は、対象における眼内血管新生疾患を治療するのに特に有用である。
本発明の水性医薬組成物を使用して治療することができる「眼内血管新生疾患」には、異常な血管形成、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、網膜血管透過性亢進、網膜浮腫、糖尿病性網膜症（特に増殖性糖尿病性網膜症）、糖尿病性黄斑浮腫、ｎＡＭＤ（血管新生型ＡＭＤ）を伴うＣＮＶを含めた血管新生（滲出型）加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜虚血を伴う後遺症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、および後眼部血管新生を含むが、これらだけには限られない、眼内血管新生と関係がある状態、疾患、または障害がある。
本発明の水性医薬組成物は、抗ＶＥＧＦ抗体以外に、さらなる活性成分を含むことができる。さらなる薬理活性物質は、例えば眼部疾患を治療するのに有用な他の抗体を含むことができる。
本発明の水性医薬組成物は患者に投与することができる。本明細書で使用する用語「対象」または「患者」は、霊長類、ウサギ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、およびウシを含むが、これらだけには限られない、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を指す。対象または患者はヒトであることが好ましい。
投与は典型的には注射器を介して行う。したがって本発明は、本発明の医薬組成物を含む送達デバイス（例えば注射器）を提供する（例えば予め充填した注射器）。患者は有効量（すなわち、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに充分な量）の抗ＶＥＧＦ抗体を主要活性成分として投与される。疾患と関係がある症状または状態の漸増的変化をもたらすことさえできれば、治療有効用量は充分である。治療有効用量が疾患を完全に治癒する、または症状を完全に排除する必要はない。治療有効用量は、既に疾患に罹患している患者における疾患およびその合併症を、少なくとも部分的に抑制できることが好ましい。この使用に有効な量は、治療する障害の重症度、および患者自身の免疫系の一般的状態に依存する。
疾患または状態の治療に関して通常の技能を有する医師により、周知の投与量調節技法を使用して投与する量を容易に決定することができる。本発明の水性医薬組成物中に使用する抗ＶＥＧＦ抗体の治療有効量は、例えば所望の用量体積および投与形式（複数可）を考慮することによって決定される。典型的には、１回あたり０．００１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌの範囲の投与量で、治療に有効な組成物を投与する。本発明の方法で使用する投与量は、約６０ｍｇ／ｍｌ〜約１２０ｍｇ／ｍｌ（すなわち、約６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０ｍｇ／ｍｌ）であることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用する抗ＶＥＧＦ抗体の投与量は６０ｍｇ／ｍｌまたは１２０ｍｇ／ｍｌである。
ある特定の実施形態では、患者の眼に直接、１用量を投与する。一実施形態では、眼あたりの用量は少なくとも約０．５ｍｇから最大約６ｍｇである。眼あたりの好ましい用量は、約０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．２ｍｇ、１．４ｍｇ、１．６ｍｇ、１．８ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、および６．０ｍｇを含む。５０μｌまたは１００μｌなどの点眼剤投与に適した様々な体積で、例えば３ｍｇ／５０μｌまたは６ｍｇ／５０μｌを含む用量を投与することができる。１０μｌ以下、例えば約１０μｌまたは約８μｌを含む、より少ない体積を使用することもできる。ある特定の実施形態では、１．２ｍｇ／１０μｌまたは１ｍｇ／８．０μｌ（例えば１ｍｇ／８．３μｌ）の用量を、前に記載した１つまたは複数の疾患および障害を治療または軽減するため患者の眼に送達する。送達は、例えば硝子体内注射または注入であってよい。
本発明は、医薬品として使用するため、例えば患者に抗体を送達する際の使用のため、または前に記載した１つまたは複数の疾患および障害を治療または軽減する際の使用のための、本発明の製剤（すなわち水性医薬組成物）も提供する。
本発明は、本発明の水性医薬組成物を患者に投与するステップを含む、患者に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法をさらに提供する。
ある特定の実施形態では、患者に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法は、（ｉ）本発明の凍結乾燥物を復元して水性製剤を得るステップ、および（ｉｉ）患者に水性製剤を投与するステップを含む。ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）の２４時間以内（例えば１２時間以内、６時間以内、３時間以内、または１時間以内）に行うことが理想的である。
本発明のある特定の具体的な実施形態を、以下に番号付けしたように記載する：
１．（ｉ）それぞれ配列番号５、６、および７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号８、９、および１０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体、（ｉｉ）スクロースまたはトレハロース、（ｉｉｉ）クエン酸またはヒスチジンバッファー、ならびに（ｉｖ）界面活性剤としてポリソルベート８０を含む水性医薬組成物。
２．４．５％〜１１％（ｗ／ｖ）のスクロースまたは５％〜１０％のトレハロース、０．００６％〜０．０１２％のクエン酸（ｗ／ｖ）、０．２％〜０．６％のクエン酸三ナトリウム二水和物（ｗ／ｖ）、および０．０１％〜０．１％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）を含み、そのｐＨが約６．３〜約７．３である、実施形態１に記載の水性医薬組成物。
３．スクロースの濃度が６．７５％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸の濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸三ナトリウム二水和物の濃度が約０．４２８％（ｗ／ｖ）であり、ポリソルベート８０の濃度が約０．０５％（ｗ／ｖ）であり、ｐＨが約６．８である、実施形態２に記載の水性医薬組成物。
４．抗ＶＥＧＦ抗体の濃度が少なくとも６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、実施形態１から３のいずれか１つに記載の水性医薬組成物。
５．抗ＶＥＧＦ抗体の濃度が少なくとも６０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１４０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌである、実施形態１から４のいずれか１つに記載の水性医薬組成物。
６．抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号１および配列番号２の配列を含む、実施形態１から５のいずれか１つに記載の水性医薬組成物。
７．抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号３の配列を含む、実施形態１から６のいずれか１つに記載の水性医薬組成物。
８．抗ＶＥＧＦ抗体の濃度が約６０ｍｇ／ｍｌまたは約１２０ｍｇ／ｍｌである、実施形態１から７のいずれか１つに記載の水性医薬組成物。
９．実施形態１から８のいずれか１つに記載の水性医薬組成物を含む送達デバイス。
１０．予め充填した注射器である、実施形態９に記載の送達デバイス。
１１．対象に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法であって、実施形態１から８のいずれか１つに記載の水性医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法。
１２．ＶＥＧＦによって媒介される眼部疾患または障害を治療する方法であって、実施形態１から８のいずれか１つに記載の水性医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
１３．前記眼部疾患または障害が眼部血管新生疾患である、実施形態１２に記載の方法。
１４．実施形態１から８のいずれか１つに記載の水性医薬組成物の凍結乾燥によって調製される凍結乾燥製剤。
１５．凍結乾燥物を調製するための方法であって、（ｉ）抗ＶＥＧＦ抗体、スクロースまたはトレハロース、クエン酸またはヒスチジンバッファー、および界面活性剤の水溶液を調製するステップ、ならびに（ｉｉ）水溶液を凍結乾燥するステップを含む方法。
１６．抗ＶＥＧＦ抗体がそれぞれ配列番号５、６、および７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号８、９、および１０の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、実施形態１５に記載の方法。
１７．抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号１および配列番号２の配列を含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号３の配列を含む、実施形態１６から１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．対象に水性医薬組成物を投与するステップを含む、対象に抗ＶＥＧＦ抗体を送達する際の使用のための、実施形態１から８のいずれか１つに記載の水性医薬組成物。
２０．対象に水性医薬組成物を投与することを含む、ＶＥＧＦによって媒介される眼部疾患または障害を治療する際の使用のための、実施形態１から８のいずれか１つに記載の水性医薬組成物。
２１．前記眼部疾患または障害が眼部血管新生疾患である、実施形態２０に記載の使用。
別段の記述がない限り、本明細書中で使用する全てのパーセンテージは重量パーセンテージである。
別段の指示がない限り、本明細書中で使用する用語「ａ」と「ａｎ」は「１つ」、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味すると考えられる。文脈による別段の要請がない限り、本明細書中で使用する単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
本明細書を通じて引用する任意の特許、特許出願、および参照文献の内容は、参照によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている。
本発明の他の実施形態は、本明細書を考慮し、本明細書に開示する本発明を実践することにより、当業者には明らかとなる。本明細書および実施例は例示的なものに過ぎないと考えられ、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲およびその均等物によって示されるものとする。
実施例
以下の実施例は、抗体１００８を含む安定状態の高濃度溶液を提供して、点眼剤製品に関する規制要件を満たす、冷蔵保存条件で少なくとも１８カ月の貯蔵寿命があるＩＶＴ製剤を可能にするのに適切な安定化手法および組成を同定するように設計された製剤開発努力を記載する。
１００８抗体は、ヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）と結合しその生物活性を阻害する単鎖抗体である。発現された１００８のアミノ酸配列は以下の通りである：
ＭＥＩＶＭＴＱＳＰＳ ＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶ ＩＩＴＣＱＡＳＥＩＩ ＨＳＷＬＡＷＹＱＱＫ ＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ ＬＡＳＴＬＡＳＧＶＰ ＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡ ＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱ ＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱ ＮＶＹＬＡＳＴＮＧＡ ＮＦＧＱＧＴＫＬＴＶ ＬＧＧＧＧＧＳＧＧＧ ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧ ＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧ ＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬ ＲＬＳＣＴＡＳＧＦＳ ＬＴＤＹＹＹＭＴＷＶ ＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ ＶＧＦＩＤＰＤＤＤＰ ＹＹＡＴＷＡＫＧＲＦ ＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴ ＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡ ＥＤＴＡＶＹＹＣＡＧ ＧＤＨＮＳＧＷＧＬＤ ＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶ ＳＳ（配列番号４）
ｐＨ６．２５で０．００１％のポリソルベート２０を含む１５ｍＭのクエン酸バッファー中の等張溶液として１００８を製剤化したとき、６０ｍｇ／ｍｌの濃度の１００８で相当量の肉眼で見えない粒子を観察した。この初期製剤に関する大きな問題は、−２０℃で保存したときでさえ、注射用点眼剤溶液に関する規制制限（ＵＳＰ＜７８９＞）を超える粒状物質があることであった。
以下の実施例は、少なくとも１８カ月間２〜８℃の保存時に安定状態の、６０および１２０ｍｇ／ｍｌの１００８硝子体内（ＩＶＴ）溶液の製剤開発を要約する。製剤開発努力は、肉眼で見えない粒子の形成の阻害、ならびに含有量、純度および効力に関するＵＳＰ要件を満たすことに焦点を当てた。
分析法
以下の方法を、示す通り実施例全体で使用した。
マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）法
賦形剤スクリーニング、６０ｍｇ／ｍｌの最適化試験に関する試験１および試験２の分析に使用したＭＦＩ法は以下の通りであった：
使用した合計サンプル体積：０．５０ｍＬ
パージ体積：０．２０ｍＬ
分析体積：０．２６ｍＬ
最適化照射ステップを、精製濾過した、粒子を含まない水で行った。
１２０ｍｇ／ｍｌの１００８に関する試験３および試験４の分析に使用したＭＦＩ法：
使用した合計サンプル体積：０．８０ｍＬ
パージ体積：０．２３ｍＬ
分析体積：０．４８ｍＬ
最適化照射ステップを、精製濾過した、粒子を含まない水で行った。
ＳＥＣ法
ＳＥ−ＨＰＬＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）は、タンパク質をそれらのサイズに応じて分離する。サンプル分子が多孔性粒子固定相を通過したとき、それらの差次的排除、または包接によって分離を実施した。０．２５ｍｌ／分の流速および４℃のサンプル温度を維持することができ、ＴＯＳＯＨ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）、および２１４ｎｍと２８０ｎｍで同時に作動可能な検出器を備える高速液体クロマトグラフィーシステム。この方法は純度試験に使用した。
ＩＥＸ−ＨＰＬＣ法
ＡＩＥＸ−ＨＰＬＣ（アニオン交換高速液体クロマトグラフィー）は、それらの正味電荷に従いタンパク質を分離する。この手順は、強アニオン交換カラムを含有する（２５℃に設定した）温度制御型カラムコンパートメント、（４℃に設定した）オートサンプラー、および２８０ｎｍで作動可能な可変波長ＵＶ検出器を用いて、０．８ｍｌ／分の流速を維持することができる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して実施した。
ＣＧＥ法
キャピラリーゲル電気泳動法を、ＳＤＳゲルキャピラリー電気泳動による分子量１０ｋＤａから２２５ｋＤａの間のタンパク質の同一性および純度を決定するために実施した。キャピラリーには、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒの０．２％ＳＤＳゲルバッファー、ｐＨ８、専売製剤を動的に充填した。タンパク質の分離は、分子ふるい電気泳動により実施した。タンパク質分子量の対数は、その相互電気泳動移動度と直線関係が認められた。タンパク質の同一性は、分子量標準とその移動を比較することにより決定した。純度は、親ピークおよび不純物の面積割合の分析によって決定した。フォトダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）を使用して２２０ｎｍでサンプルを分析した。
効能分析
競合ＥＬＩＳＡを効能試験に使用した。競合ＥＬＩＳＡで、ビオチニル化ＶＥＧＦをめぐってＶＥＧＦＲ２／Ｆｃと競合する１００８の能力を測定した。観察したシグナルは１００８の濃度と反比例関係にあった。１００８の量が増加するにつれ、ビオチニル化ＶＥＧＦとその受容体ＶＥＧＦＲ２／Ｆｃとの結合が効率よく遮断されたからである。それぞれのサンプルは１００８参照標準に対して９６ウエルマイクロタイタープレート中で分析し、参照標準の効能に対するサンプルの相対的効能を報告した。
実施例１
賦形剤スクリーニング
ｐＨ６．２５でクエン酸バッファー中で１００８を製剤化した。製剤の組成を表１に示す。
相当数の肉眼で見えない粒子を前述の製剤において観察した。−２０℃で保存したときでさえ、粒状物質は、ＵＳＰ＜７８９＞の注射用点眼剤溶液に関する規制制限を超えていた。
肉眼で見えない粒子の形成に対する様々な賦形剤の影響を調べて、より安定した１００８の液体溶液を開発した。異なる賦形剤を含有するタンパク質溶液を４０℃で６０ｍｇ／ｍｌで保存し、ＭＦＩにより１〜１００μｍのサイズの粒子に関して分析した。実験データによって、アルギニン、デキストラン、アスコルビン酸、メチオニン、および酢酸アンモニウムを含めて、試験した大部分の賦形剤が、粒子の形成を低減しないことを実証した。スクロースおよびトレハロースなどの非還元糖の存在下でのみ、粒子の形成が有意に低減した。
さらなる賦形剤スクリーニングを実施した。１００８の安定性に対する賦形剤の影響は、約６０ｍｇ／ｍｌの１００８溶液において評価した。０．１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、０．１％のポロキサマー４０７、０．１％のＢｒｉｊ３５、３％のグリシン、５０ｍＭのグリセリンを含有するタンパク質溶液を４０℃で保存し、保存８、２１、および２８日後にＭＦＩ、ＳＥＣおよびＩＥＸによりサンプルをアッセイした。結果を表２に示す。実験データによって、試験した賦形剤の存在下でのタンパク質の不安定状態を実証した。
５７ｍｇ／ｍｌの１００８の安定性を、ｐＨ６．２５で２０ｍＭのリン酸バッファーにおいて調べた。９％のスクロースおよび０．１％のＰＳ８０を含有する製剤を４０℃での保存６、１４および２７日後にアッセイした。結果を表３に列記する。
実施例２
新たな製剤開発
試験１
賦形剤スクリーニング
ｐＨ６．２５で０．００１％のポリソルベート２０および０．７３％のＮａＣｌを含有する、２０ｍＭのクエン酸バッファー中６０ｍｇ／ｍｌの１００８のタンパク質溶液を、サンプル調製に使用した。原型タンパク質溶液中の界面活性剤を除去するため、最初に、ＮＡＰ−２５カラムを使用したバッファー交換を、ポリソルベート２０を含まないビヒクルを使用して実施した。次いでバッファー交換したタンパク質溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎフィルターおよび１０ｋＤａ ＭＷＣＯを使用し約６０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＨＳＡ、グリシン、グリセリン、ポロキサマー４０７、およびＢｒｉｊ３５の賦形剤を個々にスパイク添加した。次いで調製したサンプルを、４ｍＬ透明ガラス製バイアルに０．２ｕｍＰＶＤＦ膜を介してシリンジ濾過した。約１００μＬのサンプルを初期アッセイに使用し、一方で残りのサンプルは４０℃で保存した。各製剤の１ミリリットルサンプルを、ＭＦＩ、ＳＥＣおよびＩＥＸによる分析用に、４０℃での保存８、２１、および２８日後に取り出した。
バッファー、糖および界面活性剤の成分の選択
内部で実施した賦形剤スクリーニング試験に基づき、２つのバッファー（クエン酸およびヒスチジン）、糖（スクロースおよびトレハロース）、ならびに界面活性剤（ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）を製剤成分選択で選択した。２０ｍＭのバッファー強度、２６４ｍＭの糖濃度、および０．１％の界面活性剤濃度を試験用に選択した。全要因実験試験を以下の表に示すように設計した。
使用した全設計を以下の表５に示す：
他のパラメーター：
濃度／ｐＨ ｐＨ６．２５で５０〜６０ｍｇ／ｍｌの１００８
バッファー交換 ＮＡＰ２５カラム、Ｖｉｖａｓｐｉｎの１０ｋＤａ ＭＷＣＯで濃縮
サンプルサイズ／Ｐｋｇ スクリューキャップ付き４ｍＬ透明ガラス製バイアル中に２〜２．５ｍＬ
保存／取り出し ４０℃／０、１、２および４週
アッセイ ＭＦＩ、ＳＥＣおよびＩＥＸ
０．００１％のポリソルベート２０を含有する原型バッファー中６０ｍｇ／ｍｌの１００８のタンパク質溶液を、サンプル調製に使用した。異なるバッファー／糖の組合せ（２０ｍＭクエン酸／２６４ｍＭトレハロース、２０ｍＭクエン酸／２６４ｍＭスクロース、２０ｍＭヒスチジン／２６４ｍＭトレハロース、２０ｍＭヒスチジン／２６４ｍＭスクロース）を含む４つの新たなビヒクルバッファーを調製した。１００８薬剤物質（ＤＳ）を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してビヒクルバッファーに最初に交換した。カラムを２５ｍＬのクエン酸バッファーで平衡状態にした。次いで２ｍＬの１００８ＤＳをカラムにロードした。ＤＳ溶液をカラムに完全に移動させた後、カラムの平衡状態化に使用したのと同じ２ｍＬのバッファーでカラムを洗浄した。カラムから溶出した６ｍＬの溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ６濃縮装置（１０ｋＤａ ＭＷＣＯ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に回収した。次いで６ｍＬの溶出溶液を、９３８４×ｇおよび４℃でＢｅｃｋｍａｎ ＧＳ−１５Ｒ遠心分離機を使用して約２ｍＬに濃縮した。次いでタンパク質の濃度を、ＯＤ２８０を使用してＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計で測定した。ポリソルベート２０（ＰＳ２０）またはポリソルベート８０（ＰＳ８０）を、０．１％の最終濃度まで製剤にスパイク添加した。次いで調製した製剤を、０．２ｕｍＰＶＤＦシリンジフィルターを介して濾過し、４ｍＬ透明ガラス製バイアルに充填した。約１００μＬのサンプルを初期アッセイに使用し、一方で残りのサンプルは４０℃で保存した。１ミリリットルのサンプルを、ＭＦＩ、ＳＥＣおよびＩＥＸによる分析用に、４０℃で１、２および４週間の保存後に取り出した。
定性試験を実施して、製剤に最適な糖／界面活性剤／バッファー成分を選択した。２つのバッファー（クエン酸およびヒスチジン）、糖（スクロースおよびトレハロース）、ならびに界面活性剤（ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）を、前で論じたようにこの試験設計で使用した。４週間の安定性試験を加速条件下（４０℃）で実施した。安定性試験のサンプルはＳＥＣ、ＩＥＸおよびＭＦＩによってアッセイした。表６はＳＥＣ、ＩＥＸによる安定性試験の結果、およびμＤＳＣによる融点（Ｔｍ）を示す。
安定性試験の結果は、Ｍｉｎｉｔａｂ（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．、Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ＰＡ）を使用して分析した。ＳＥＣおよびＩＥＸは同じ傾向を示したので、ＳＥＣのデータのみをＭｉｎｉｔａｂによって分析し報告した。ＳＥＣの結果は、界面活性剤が唯一の有意な因子であり、反応に影響を与えた可能性がある他の要因にはバッファー選択および（低い程度で）バッファーおよび糖の間の相互作用があることを実証した。ＳＥＣのデータは、最適な製剤成分はバッファーとしてクエン酸、界面活性剤としてポリソルベート８０、および糖としてスクロースであることを示唆した。
ＭＦＩによる粒子に関する実験結果もＭｉｎｉｔａｂによって分析した。評価した３因子（糖、界面活性剤およびバッファー）はいずれも有意ではないようであった（α＝０．０５）。粒子に対する主な影響を比較すると、クエン酸はヒスチジンより好影響であり、ＰＳ８０はＰＳ２０より好影響であり、スクロースはトレハロースと同等またはトレハロースより若干好影響であった。したがって、バッファーとしてクエン酸、界面活性剤としてポリソルベート８０、および糖としてスクロースを、さらなる試験用に選択した。
試験２
バッファー、糖および界面活性剤に関する濃度の最適化
２つの中心点での２レベルにおける３因子を含有する全要因試験を、クエン酸バッファーおよびヒスチジンバッファーでそれぞれ実施して、選択したそれぞれの製剤成分に最適な濃度を決定した。３因子はバッファー（クエン酸またはヒスチジン）、ポリソルベート８０およびスクロースである。因子および設計スペースを表７に作表し、詳細な実験設計を表８および９に示す。
個々の製剤を調製するため、ｐＨ６．２５で０．００１％のポリソルベート２０／０．７３％のＮａＣｌを含有するクエン酸バッファー中６０ｍｇ／ｍｌの１００８のタンパク質溶液を使用した。最初にタンパク質溶液を、ＮＡＰ−２５カラムを使用してビヒクルにバッファー交換した。このビヒクルは、バッファーおよびスクロースをそれらの標的濃度で含有していた。交換したタンパク質溶液を、Ｖｉｖａｓｐｉｎの１０ｋＤａ ＭＷＣＯを使用して約６０ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した。
次いでバッチ量のポリソルベート８０および塩化ナトリウムを加え、最終製剤組成物を作製した。各サンプル中のタンパク質濃度は、２８０ｎｍでＵＶにより測定した吸光度を使用し理論上の吸光係数で確認した。
次いで調製した製剤を、０．２μｍＰＶＤＦシリンジフィルターを介して４ｍＬ透明ガラス製バイアルに濾過した。約１００μＬのサンプルをＳＥＣおよびＩＥＸによる初期アッセイに使用し、一方で約２〜２．５ｍＬのサンプルを４０℃で保存した。約６００μＬのサンプルをＭＦＩ、ＳＥＣおよびＩＥＸによる分析用に、４０℃で１１、２０および２７日の保存後に取り出した。
試験１の結果に基づき、２つの中心点での２レベルにおける３因子を含有する全要因試験を、クエン酸バッファーとヒスチジンバッファーでそれぞれ実施して、選択したそれぞれの製剤成分に最適な濃度を決定した。試験したサンプルは４０℃で保存し、ＭＦＩ、ＳＥＣおよびＩＥＸによる分析用に０、１．６、２．９および４週間で取り出した。結果を表１０および１１に作表する。
実験データはＭｉｎｉｔａｂによって分析した。クエン酸バッファーにおけるＳＥＣの結果に関しては、界面活性剤がタンパク質凝集に影響を与えた主要因子であり、一方スクロース、スクロースおよびポリソルベート８０の間の相互作用、ならびにバッファー強度はあまり有意な役割は果たさなかった。高スクロース濃度および低ポリソルベート８０濃度がタンパク質の安定性に好ましかった。タンパク質の安定性は凝集に若干影響を与え、高いクエン酸バッファー強度は若干良いタンパク質の安定性を助長した。
クエン酸バッファーにおけるＭＦＩの結果に関しては、スクロースおよびポリソルベート８０の因子、ならびにスクロースおよびポリソルベート８０の相互作用が、粒子形成において同等に有意な役割を果たした。高スクロースおよび高ポリソルベート８０が粒子形成を有意に抑制し、一方１０〜２０ｍＭの範囲のバッファー強度は粒子形成に若干影響を与え、低いバッファー強度が好ましかった。
ヒスチジンバッファー溶液のＭｉｎｉｔａｂ分析による結果は、界面活性剤、ポリソルベート８０はタンパク質凝集に影響を与える主要因子であり、一方バッファー強度およびポリソルベート８０の間の相互作用、ならびにスクロースはあまり有意な役割は果たさなかったことを示した。低濃度のポリソルベート８０がタンパク質の安定性に好ましかった。バッファー強度およびスクロース濃度は、タンパク質凝集に影響を与えないようであった。
ヒスチジンバッファーにおけるＭＦＩの結果に関しては、ポリソルベート８０、スクロース、ならびにスクロースおよびポリソルベート８０の相互作用が、粒子形成において有意な役割を果たした。高スクロースおよび低ポリソルベート８０、および低バッファー強度が、粒子形成を抑制するのに好ましかった。
ｐＨ最適化
１００８の凝集挙動に対するｐＨの影響を、０．１％のＮａＣｌ、６．７５％のスクロースおよび０．０５％のＰＳ８０を含有する１５ｍＭのクエン酸バッファーにおいて６つのｐＨ条件下（５．０、６．０、６．２５、６．５０、６．７５および７．０）で試験した。最初に１００８薬剤物質を、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して異なるｐＨの（ＰＳ８０を含まない）ビヒクルに交換した。最初にカラムを１５ｍＬのクエン酸バッファーで平衡状態にした。次いで１ｍＬの１００８ＤＳをカラムに充填した。ＤＳ溶液をカラムに完全に移動させた後、カラムの平衡状態化に使用したのと同じ２ｍＬのクエン酸バッファーでカラムを洗浄した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ２濃縮装置（１０ｋＤ ＭＷＣＯ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にカラムから溶出した２ｍＬ溶液を回収した。次いで２ｍＬの溶出溶液を、９３８４×ｇおよび４℃でＢｅｃｋｍａｎ ＧＳ−１５Ｒ遠心分離機を使用して。次いでタンパク質の濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計で測定した。この試験の最終１００８濃度は約７０ｍｇ／ｍｌであると決定した。ＰＳ８０を０．０５％の最終標的濃度まで製剤にスパイク添加した。動力学的な濁度アッセイを、２箇所セルホルダーおよび温度制御用水浴を備えるＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ３５分光光度計を使用して実施した。１ｃｍパス長を有するＳｔａｒｎａサブマイクロ体積石英セル（Ｓｔａｒｎａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、イングランド）において、２５０μＬの１００８製剤または対応するビヒクルを加えた。セルは予め５５℃に加熱したセルホルダーに置いた。１００８製剤におけるＯＤ３５０の変化を１２０分間モニタリングした。次いで異なるｐＨの製剤に関して得たＯＤ３５０のデータを、比較用に時間に対してプロットした。
濁度ベースの動力学アッセイを使用して、１００８の凝集挙動に対するｐＨの影響を、ｐＨ５．０〜７．０で約７０ｍｇ／ｍｌの１００８を含有する製剤で試験した。濁度アッセイに関して、ＯＤ３５０の急激な増大はタンパク質の主要凝集事象と関係があった。したがって、それぞれの製剤のＯＤ３５０が増大するのに必要なインキュベーション時間の差は、製剤中タンパク質の異なる物理的安定性を反映し得る。図１中に示したように、試験した製剤条件下でｐＨ６．７５において、１００８は最も安定していたようであった。ＯＤ３５０の急激な増大前にそれが最長インキュベーション時間を有していたからである。類似した結果での反復実験によって、試験した製剤はｐＨ６．７５で最も安定していることを確認した。
試験３
賦形剤および高活性化濃度の影響
半要因試験（表１２）を実施して、タンパク質（６０〜１２０ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（４．５〜９．０％）、クエン酸バッファー（１０〜２０ｍＭ）およびポリソルベート８０（０．０１〜０．１％）の濃度を含む主要製剤条件の影響を調べた。
前述の製剤を調製するため、２０％のクエン酸バッファー、ｐＨ６．５および２０ｍＭのクエン酸バッファー、ｐＨ６．５中３０％のスクロースストック溶液を最初に調製した。次いでクエン酸バッファー、ストック溶液および注射用水を適切な割合で混合して、ＰＳ８０を含む５つのバッファーを作製し、それらは１０ｍＭのクエン酸中４．５％のスクロース、１０ｍＭのクエン酸中９％のスクロース、２０ｍＭのクエン酸中４．５％のスクロース、２０ｍＭのクエン酸中９％のスクロースおよび１５ｍＭのクエン酸中６．７５％のスクロースであった。続いて１００８ＤＳはＩｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してこれら５バッファーに交換し、次にＶｉｖａｓｐｉｎ６濃縮装置（５ｋＤ ＭＷＣＯ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて５℃で８０００×で濃縮した。各サンプル中のタンパク質濃度は、遠心分離中にＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計で測定した。最初の４バッファーにおけるサンプルに関して、１００８濃度が約７０ｍｇ／ｍｌに達したとき、サンプルの一部を濃縮装置から除去し、これらを使用して、適量の対応するバッファーを加え１０％のＰＳ８０をスパイク添加することにより６０ｍｇ／ｍｌのＡＰＩを含む製剤（表１２中の番号１、３、５および７）を調製した。残りのサンプルは１３０ｍｇ／ｍｌ超までさらに濃縮し、次いでバッファーおよび１０％のＰＳ８０を加えて最終製剤（表１２中の番号２、４、６および８）を得た。表１２中の製剤番号９および１０は、バッファー番号５に交換した１００８サンプルを約１０８ｍｇ／ｍｌまで濃縮することによって調製し、次いでバッファーおよび１０％のＰＳ８０と混合して最終製剤濃度に到達させた。全最終製剤のｐＨ値を測定し、６．５に調節した。
前に記載したアッセイから改変した濁度アッセイを、評価用の分析ツールとして使用した。この改変型濁度アッセイでは、１２箇所セルＣａｒｙ１００ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用した。このアッセイ中で使用したキュベットは、ストッパー付き１ｍｍ石英キュベットであった。それぞれのキュベット中に、３００μＬのサンプルを試験用に加えた。５５℃でインキュベートした製剤に関する３６０ｎｍでの光学濃度の変化をモニタリングした。
賦形剤および高活性化濃度の影響
試験３に関する全製剤の測定した１００８濃度および最終ｐＨを表１３に要約する。低、中および高１００８濃度（表４．３．１．−１）および異なるスクロース、ＰＳ８０濃度およびバッファー強度を有する製剤を５５℃でインキュベートし、ＯＤ３６０の変化をモニタリングした。図２に示したように、製剤に関して異なる凝集傾向を観察した。インキュベーション開始後即座にほぼ凝集した２つの製剤は製剤２および６であり、これらは比較的高い１００８濃度（約１２０ｍｇ／ｍｌ）および低いスクロース濃度（４．５％）を含有していた。他方で、比較的低い１００８濃度（約６０ｍｇ／ｍｌ）および高いスクロース濃度（９％）を含有した製剤３および７は、他の製剤よりゆっくりと凝集した。中程度１００８濃度とスクロース濃度の他の組合せの凝集傾向は前述の２群の間であった。
それぞれの製剤のＯＤ３６０が０．２５に達した時間を基準として使用し、異なる製剤因子の影響を比較した。これらの結果は、スクロース、次にＡＰＩ濃度が１００８の凝集に対して最も強い影響があることを示唆した。スクロースおよびＡＰＩ濃度の影響は正反対であり、高スクロースおよび低ＡＰＩ濃度がより良い製剤安定性に好ましいことを示した。他の２因子、バッファー強度およびＰＳ８０はあまり影響を示さなかった。
試験４
活性化およびスクロース濃度に関するさらなる試験
前述の試験３からの結果に基づき、試験４を実施して、ｐＨ６．５０で０．０５％のＰＳ８０を含有する１５ｍＭのクエン酸バッファーにおける、タンパク質濃度（６０〜１２０ｍｇ／ｍｌ）およびスクロース濃度（６〜９％のより狭い範囲）の影響をさらに調べた。試験設計を以下の表に示す。
製剤を調製するため、約８０ｇの１００８薬剤物質をＴＦＦシステムにロードし、次いでバッファー交換を、薬剤物質のほぼ５倍の体積で６％のスクロースを含有する１５ｍＭのクエン酸バッファーを用いて実施した。バッファー交換後、タンパク質溶液の体積を、ＴＦＦシステムを使用し初期体積のほぼ半分まで減らした。約４４ｇの濃縮１００８溶液を回収し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計により測定したところ、濃縮タンパク質は約１１２ｍｇ／ｍｌであった。次いで濃縮１００８溶液を使用して、０、６％および／または４０％のスクロースを含有する適量の１０％のＰＳ８０および１５ｍＭのクエン酸バッファーとの混合により製剤番号１、３、５、７〜１２を調製して、これらの製剤各々において対応する最終ＡＰＩ、スクロースおよびＰＳ８０濃度を得た。１００８溶液の残りはさらに約１３２ｍｇ／ｍｌに濃縮して、同じ形式で製剤番号２と４を調製した。最後に、約１７１ｍｇ／ｍｌに１００８溶液を濃縮することによって製剤番号６を調製し、タンパク質、スクロースおよびＰＳ８０の濃度は、０、６％および／または４０％のスクロースを含有する１０％のＰＳ８０および１５ｍＭのクエン酸バッファーを用いて調節した。それぞれの製剤における１００８の最終濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計を用いて測定し、ｐＨは６．５に調節した。
サンプルは、前に記載した濁度アッセイを使用して分析した。８個の選択した製剤（番号１〜４および番号７〜１０）も６週間４０℃の実験用インキュベーター中で保存し、異なる時間地点でＭＩＦ、ＩＥＸおよびＳＥＣ法を用いて分析した。
表１５に列記した１２の製剤を調べた。
５５℃での濁度アッセイを使用して製剤の凝集をモニタリングした。図３に示すように、同じ熱ストレスの下で、異なる程度の製剤の凝集が示された。（表１５中の製剤番号２および６などの）比較的高い１００８濃度および低いスクロース濃度を有した製剤は、インキュベーションによって急速に凝集した製剤であった。比較的低い１００８濃度および高いスクロース濃度を有した製剤（表１５中の製剤番号３および５）は、残りの全ての製剤よりゆっくりと凝集した。様々な製剤に関する濁度アッセイから得た曲線はシグモイド関数に適合させた。移行の中期に対応するインキュベーション時間を、それぞれの製剤に関するＴｍ（移行中間点時間）として記録した。結果を表１５に列記する。スクロース濃度および１００８濃度に対するＴｍ値は、タンパク質凝集に対するスクロース濃度および１００８濃度の正反対の影響を示した。
５５℃での濁度アッセイを使用した試験以外に、４０℃での８個の選択した製剤の安定性も６週間にわたりＭＦＩ、ＳＥＣおよびＩＥＸによってモニタリングした。製剤および結果を表１６〜２３に列記する。濁度アッセイと一致して、ＭＦＩの結果は、高１００８濃度（約１２０ｍｇ／ｍｌ）を有した製剤は、低ＡＰＩ濃度を有した製剤と比較してより多くの粒子、特に２５μｍを超える粒子を形成したことを示した。ＭＦＩの結果は、同量の１００８を含んだ製剤（製剤番号７〜１０）に関するスクロース濃度の明確な影響は示さなかった。図４に示すように、４０℃で６週間の保存後、高１００８濃度を有した２つの製剤（製剤番号２および４）が最も劣化し、約６０ｍｇ／ｍｌの１００８濃度を有した製剤は他の全ての製剤ほど劣化しなかった。約９０ｍｇ／ｍｌの１００８を有した製剤に関しては、低スクロース濃度（製剤番号７）より若干低い劣化を高スクロース濃度で観察した（製剤番号８）。ＩＥＸの結果はＳＥＣと同じ傾向を示した。
実施例３
探索的安定性試験
対照製剤
探索的安定性試験を、ｐＨ６．２５で対照として、６０ｍｇ／ｍｌの１００８溶液、２０ｍＭのクエン酸、０．００１％のＰＳ２０中の製剤に関して実施した。対照製剤は０．２ｕｍシリンジフィルターを介して濾過し、４０℃、周囲室温、および冷蔵庫で保存した。サンプルは、０、２および５週に４０℃サンプルを、ならびに２６週に周囲室温および冷蔵庫保存したサンプルを取り出した。選択した安定性試験用サンプルは、Ａ２８０、ＳＥＣ、ＩＥＸ、ＣＧＦおよびＥＬＩＳＡによりｐＨ、重量オスモル濃度、含有量に関して試験した。結果を表２４に示す。
対照製剤に関する別の試験を、ｐＨ６．２５で、２０ｍＭのクエン酸、０．００１％のＰＳ２０および０．７３％のＮａＣｌ中６０ｍｇ／ｍｌの１００８溶液に関して実施した。製剤は０．２μｍシリンジフィルターを介して濾過し４０℃で保存した。サンプルはＭＦＩ分析用に１、２、３および４週に取り出した。結果を表２５に示す。
９％のスクロースおよび０．５％のポリソルベート８０を含む６０ｍｇ／ｍｌの１００８に関する探索的安定性試験
探索的安定性試験を、９％のスクロースおよび０．５％のＰＳ８０を含有する６０ｍｇ／ｍｌの１００８製剤に関して実施した。製剤は０．２μｍシリンジフィルターを介して濾過し４０℃で保存した。サンプルは１．６、２．９および４週に取り出し、ＭＦＩ、ＳＥＣおよびＩＥＸによって分析した。結果を表２６に作表する。
ｐＨ６．２５での６０ｍｇ／ｍｌの１００８、９％のスクロース、２０ｍＭのクエン酸、０．１％のＰＳ８０に関するパイロットスケール安定性試験
６０ｍｇ／ｍｌの１００８溶液のリアルタイム安定性試験を、表２７中に示すように、ｐＨ６．２５で９％のスクロース、２０ｍＭのクエン酸、０．１％のＰＳ８０を含有する製剤に関して実施した。安定性試験のサンプルは２〜８℃、２５℃、４０℃およびライトキャビネット（ＬＣ）で保存し、それらにさらに３サイクルの凍結−解凍（ＦＴ）を施した。サンプルは表２８に示したスケジュールに従い取り出し、ｐＨ、重量オスモル濃度、ＭＦＩ、含有量、ＳＥＣ、ＩＥＸ、ＣＧＥおよび効能などを様々な分析法によって分析した。
初期段階では、６０ｍｇ／ｍｌの１００８溶液のリアルタイム安定性試験を開始した。表２９に示すように、製剤はｐＨ６．２５で９％のスクロース、２０ｍＭのクエン酸、０．１％のＰＳ８０を含有した。サンプルは２〜８℃、２５℃、４０℃およびライトキャビネット（ＬＣ）で保存し、それらにさらに３サイクルの凍結−解凍（ＦＴ）を施した。サンプルは表３０に示したスケジュールに従い取り出し、様々な分析法によって分析した。安定性試験の結果を表３１〜３３に作表する。
クエン酸バッファー：６０ｍｇ／ｍｌの１００８、１５ｍＭのクエン酸／６．７５％のスクロース／０．０５％のＰＳ８０／ｐＨ６．７５中における探索的安定性試験
１５ｍＭのクエン酸／６．７５％のスクロース／０．０５％のＰＳ８０／ｐＨ６．７５において６０ｍｇ／ｍｌの１００８の製剤に関して、クエン酸バッファーで探索的安定性試験を実施した。安定性試験のサンプルは５℃および２５℃で保存し、さらに凍結−解凍サイクルを施した。サンプルは以下の表に示したスケジュールに従い取り出し、外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、ＭＦＩ、含有量、ＳＥＣ、およびＩＥＸに関して分析した。
同様に、１５ｍＭのヒスチジン／６．７５％のスクロース／０．０５％のＰＳ８０／ｐＨ６．７５において６０ｍｇ／ｍｌの１００８の製剤に関して、ヒスチジンバッファーで探索的安定性試験を実施した。安定性試験のサンプルは５℃および２５℃で保存した。サンプルはさらに凍結−解凍サイクルを施した。サンプルは以下の表に示したスケジュールに従い取り出し、外観、ｐＨ、重量オスモル濃度、ＭＦＩ、含有量、ＳＥＣ、およびＩＥＸに関して分析した。
実験データを以下の表に作表する。
実験データは、試験したこれらの製剤の安定性は、６０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で対照製剤の安定性と比較して、特に粒状物質の形成の抑制に関して有意に向上したことを示した。
安定状態を確認した溶液製剤は、表４０に示すように１５ｍＭのクエン酸／６．７５％のスクロース／０．０５０５％のＰＳ８０を含有していた。
本発明およびその実施形態を詳細に記載してきた。しかしながら、本発明の範囲は、本明細書中に記載した任意のプロセス、製造法、組成物、化合物、手段、方法、および／またはステップの特定の実施形態に限定されるとは考えられない。様々な修正、置換、および変更を、本発明の精神および／または本質から逸脱せずに、開示した題材に施すことができる。したがって当業者は、本明細書中に記載する実施形態とほぼ同じ機能を果たす、またはほぼ同じ結果を得る、後の修正、置換、および／または変更を、本発明のこのような関連実施形態に従い利用できることを本開示から容易に理解する。したがって、以下の特許請求の範囲は、本明細書中に開示したプロセス、製造法、組成物、化合物、手段、方法、および／またはステップの修正、置換、および変更をそれらの範囲内に包含すると考えられる。特許請求の範囲は、その趣旨が言及されない限り、記載した順序または要素に限定されると読むべきではない。添付の特許請求の範囲から逸脱せずに、形式および詳細の様々な変更を施すことができることは理解されるはずである。

以下の態様を包含し得る。
［１］ （ｉ）配列番号１および配列番号２の配列を含む少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体、（ｉｉ）スクロースまたはトレハロース、（ｉｉｉ）クエン酸またはヒスチジンバッファー、ならびに（ｉｖ）界面活性剤としてポリソルベート８０を含む水性医薬組成物。
［２］ 約４．５％〜１１％（ｗ／ｖ）のスクロースまたは約５％〜１０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、０．００６％〜０．０１２％のクエン酸（ｗ／ｖ）、０．２％〜０．６％のクエン酸三ナトリウム二水和物（ｗ／ｖ）、および０．０１％〜０．１％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）を含み、そのｐＨが約６．３〜約７．３である、上記［１］に記載の水性医薬組成物。
［３］ そのｐＨが約６．８である、上記［２］に記載の水性医薬組成物。
［４］ 前記抗体が配列番号３の配列を含む、上記［１］に記載の水性医薬組成物。
［５］ 前記抗ＶＥＧＦ抗体の濃度が約６０ｍｇ／ｍｌであり、スクロースの濃度が約６．７５％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸の濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸三ナトリウム二水和物の濃度が約０．４２８％（ｗ／ｖ）であり、かつポリソルベート８０の濃度が約０．０５％（ｗ／ｖ）である、上記［１］に記載の水性医薬組成物。
［６］ 前記抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号３の配列を含み、ｐＨが約６．８である、上記［５］に記載の水性医薬組成物。
［７］ 前記抗ＶＥＧＦ抗体の濃度が約１２０ｍｇ／ｍｌであり、スクロースの濃度が約６．８％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸の濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸三ナトリウム二水和物の濃度が約０．４２８％（ｗ／ｖ）であり、かつポリソルベート８０の濃度が約０．０５％（ｗ／ｖ）である、上記［１］に記載の水性医薬組成物。
［８］ 前記抗ＶＥＧＦ抗体が配列番号３の配列を含み、ｐＨが約６．８である、上記［７］に記載の水性医薬組成物。
［９］ 上記［１］に記載の水性医薬組成物を含む送達デバイス。
［１０］ 予め充填した注射器である、上記［９］に記載の送達デバイス。
［１１］ 上記［２］に記載の水性医薬組成物を含む送達デバイス。
［１２］ 予め充填した注射器である、上記［１１］に記載の送達デバイス。
［１３］ 上記［７］に記載の水性医薬組成物を含む送達デバイス。
［１４］ 予め充填した注射器である、上記［１３］に記載の送達デバイス。
［１５］ 対象に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法であって、上記［１］に記載の水性医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
［１６］ ＶＥＧＦによって媒介される眼部疾患または障害を治療する方法であって、上記［１］に記載の水性医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
［１７］ 前記眼部疾患または障害が眼部血管新生疾患である、上記［１６］に記載の方法。
［１８］ 上記［１］に記載の水性医薬組成物の凍結乾燥によって調製される凍結乾燥製剤。
［１９］ 対象に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法であって、上記［２］に記載の水性医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
［２０］ ＶＥＧＦによって媒介される眼部疾患または障害を治療する方法であって、上記［２］に記載の水性医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
［２１］ 前記眼部疾患または障害が眼部血管新生疾患である、上記［２０］に記載の方法。
［２２］ 上記［２］に記載の水性医薬組成物の凍結乾燥によって調製される凍結乾燥製剤。
［２３］ 対象に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法であって、上記［７］に記載の水性医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
［２４］ ＶＥＧＦによって媒介される眼部疾患または障害を治療する方法であって、上記［７］に記載の水性医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
［２５］ 前記眼部疾患または障害が眼部血管新生疾患である、上記［２４］に記載の方法。
［２６］ 上記［７］に記載の水性医薬組成物の凍結乾燥によって調製される凍結乾燥製剤。

Claims (25)

  1. （ｉ）配列番号４または配列番号３の配列からなる少なくとも５０ｍｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ抗体、（ｉｉ）スクロースまたはトレハロース、（ｉｉｉ）クエン酸またはヒスチジンバッファー、ならびに（ｉｖ）界面活性剤としてポリソルベート８０を含む水性医薬組成物。
  2. 約４．５％〜１１％（ｗ／ｖ）のスクロースまたは約５％〜１０％（ｗ／ｖ）のトレハロース、０．００６％〜０．０１２％のクエン酸（ｗ／ｖ）、０．２％〜０．６％のクエン酸三ナトリウム二水和物（ｗ／ｖ）、および０．０１％〜０．１％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）を含み、そのｐＨが約６．３〜約７．３である、請求項１に記載の水性医薬組成物。
  3. そのｐＨが約６．８である、請求項２に記載の水性医薬組成物。
  4. 前記抗ＶＥＧＦ抗体の濃度が約６０ｍｇ／ｍｌであり、スクロースの濃度が約６．７５％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸の濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸三ナトリウム二水和物の濃度が約０．４２８％（ｗ／ｖ）であり、かつポリソルベート８０の濃度が約０．０５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の水性医薬組成物。
  5. ｐＨが約６．８である、請求項４に記載の水性医薬組成物。
  6. 前記抗ＶＥＧＦ抗体の濃度が約１２０ｍｇ／ｍｌであり、スクロースの濃度が約６．８％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸の濃度が約０．０１％（ｗ／ｖ）であり、クエン酸三ナトリウム二水和物の濃度が約０．４２８％（ｗ／ｖ）であり、かつポリソルベート８０の濃度が約０．０５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の水性医薬組成物。
  7. ｐＨが約６．８である、請求項６に記載の水性医薬組成物。
  8. 請求項１に記載の水性医薬組成物を含む送達デバイス。
  9. 予め充填した注射器である、請求項８に記載の送達デバイス。
  10. 請求項２に記載の水性医薬組成物を含む送達デバイス。
  11. 予め充填した注射器である、請求項１０に記載の送達デバイス。
  12. 請求項６に記載の水性医薬組成物を含む送達デバイス。
  13. 予め充填した注射器である、請求項１２に記載の送達デバイス。
  14. 対象に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法で用いるための請求項１に記載の水性医薬組成物であって、前記方法は、前記水性医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、水性医薬組成物。
  15. ＶＥＧＦによって媒介される眼部疾患または障害を治療する方法で用いるための請求項１に記載の水性医薬組成物であって、前記方法は、前記水性医薬組成物を対象に投与することを含む、水性医薬組成物。
  16. 前記眼部疾患または障害が眼部血管新生疾患である、請求項１５に記載の水性医薬組成物。
  17. 請求項１に記載の水性医薬組成物の凍結乾燥によって調製される凍結乾燥製剤。
  18. 対象に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法で用いるための請求項２に記載の水性医薬組成物であって、前記方法は、前記水性医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、水性医薬組成物。
  19. ＶＥＧＦによって媒介される眼部疾患または障害を治療する方法で用いるための請求項２に記載の水性医薬組成物であって、前記方法は、前記水性医薬組成物を対象に投与することを含む、水性医薬組成物。
  20. 前記眼部疾患または障害が眼部血管新生疾患である、請求項１９に記載の水性医薬組成物。
  21. 請求項２に記載の水性医薬組成物の凍結乾燥によって調製される凍結乾燥製剤。
  22. 対象に抗ＶＥＧＦ抗体を送達するための方法で用いるための請求項６に記載の水性医薬組成物であって、前記方法は、前記水性医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、水性医薬組成物。
  23. ＶＥＧＦによって媒介される眼部疾患または障害を治療する方法で用いるための請求項６に記載の水性医薬組成物であって、前記方法は、前記水性医薬組成物を対象に投与することを含む、水性医薬組成物。
  24. 前記眼部疾患または障害が眼部血管新生疾患である、請求項２３に記載の水性医薬組成物。
  25. 請求項６に記載の水性医薬組成物の凍結乾燥によって調製される凍結乾燥製剤。
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