JP7538552B2 - Ｌｉｆに特異的な結合分子及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、ＬＩＦに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片、及び本発明の単離抗体又はその抗原結合断片の使用、及び本発明の単離抗体又はその抗原結合断片を使用した治療方法に関する。
白血病抑制因子（ＬＩＦ）はＩＬ６型サイトカインのメンバーであり、これは、細胞増殖、分化及び生存の各々を刺激又は阻害することを含め、様々な生物学的活性を有する［１］。ヒトＬＩＦタンパク質は２０２アミノ酸を有し、これは、細胞膜表面上の２つの受容体、ＧＰ１３０及びＬＩＦＲを有する。ＬＩＦタンパク質がこれらの２つの受容体に結合すると、２つの受容体によるヘテロ二量体の形成が起こり、ＭＡＰＫシグナル伝達経路及びＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路などの下流シグナル伝達経路が活性化される［２］。ＬＩＦタンパク質の過剰発現及びＬＩＦタンパク質の血清レベルの増加が複数の腫瘍の予後不良と相関することが報告されている［３、４］。ＬＩＦは、癌幹細胞の主要制御因子であり、幹細胞維持、自己複製及び多能性等において重要な役割を果たし、化学療法抵抗性に関連する［５、６］。加えて、ＬＩＦはまた、腫瘍の成長及び転移も促進し得る［７］。最近のエビデンスから、ＬＩＦが腫瘍においてオートクリン・パラクリン機構によってＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を上方制御し、それによって腫瘍成長を促進し、及び免疫応答を阻害する役割を果たしたことが示されている［８、９、１０］。従って、ＬＩＦは治療標的候補である。しかしながら、現在開発されているＬＩＦ標的に対する治療方法は、楽観的ではない。例えば、多くの文献が、ＲＮＡ干渉によってＬＩＦタンパク質の発現を低下させると、腫瘍成長を阻害できることを報告しているが［１１、１２］、しかしＲＮＡ干渉技法には、ターゲティング不良、短い半減期、膜透過性不良といった弱点があり、医薬として成り立たせるのは困難である。ＥＣ３５９は、ＬＩＦＲに対する小分子阻害薬である。これは、ＬＩＦＲによるＬＩＦへの結合を阻害するのみならず、ＯＳＭ、ＣＴＦ１及びＣＮＴＦによるＬＩＦＲへの結合も阻害することができる［１３］。これらの追加的な阻害が追加的な毒性につながるかどうかは不明であり、ＬＩＦタンパク質に特異的な小分子阻害薬はまだ報告されていない。ＬＩＦタンパク質を標的とする抗体薬が一つだけあって、現在、臨床開発段階にあるが、その関連する安全性及び有効性データはまだ公開されていない。
従って、ＬＩＦ標的に対する薬物及び併用療法を開発するには、更なる研究が必要である。
本発明は、ＬＩＦに特異的に結合する単離抗体又は抗原結合断片及び疾患の治療におけるその使用を提供する。
ある点において、本発明は、ヒトＬＩＦタンパク質のアミノ酸配列ＴＹＧＰＤＴＳＧＫＤＶＦＱＫＫ（配列番号６１）によって表されるエピトープ又は別の哺乳類種の対応するアミノ酸配列のエピトープに結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の点において、本発明は、
（ａ）配列番号１又は６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＬＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２又は６７からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＬＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３又は６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＬＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４又は６９からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＨＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５、４５、又は７０からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＨＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号６又は７１からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＨＣＤＲ３
を含む単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
任意選択で、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３は、１７アミノ酸以下の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有する。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＬＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＬＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＬＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＨＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５又は４５からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＨＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含むＨＣＤＲ３
を含む。
任意選択で、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３は、１７アミノ酸以下の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有する。
一部の実施形態において、任意選択で、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３は、９アミノ酸以下の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有する。
一部の実施形態において、任意選択で、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３は、５アミノ酸以下の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有する。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
１）（ａ）配列番号１を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号５を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３；
２）（ａ）配列番号１を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４５を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３；又は
３）（ａ）配列番号６６を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６７を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号６８を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号６９を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７０を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７１を含むＨＣＤＲ３
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
１）（ａ）配列番号１を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号５を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３；又は
２）（ａ）配列番号１を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４５を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号１を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号５を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号１を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４５を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号６６を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６７を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号６８を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号６９を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７０を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号７１を含むＨＣＤＲ３
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、マウス抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗体若しくはその抗原結合断片、完全ヒト抗体若しくはその抗原結合断片、又はヒト化抗体若しくはその抗原結合断片である。
一部の実施形態において、単離抗体は、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域又はそのフレームワーク領域変異体を含むヒト化抗体である。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号７、１１、１５、１９、４６、７４又は８２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び
（ｉｉ）配列番号２３、２７、３１、４８、７５又は８３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号７、１１、１５、１９又は４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び
（ｉｉ）配列番号２３、２７、３１又は４８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号７、１１、１５又は１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び
（ｉｉ）配列番号２３、２７又は３１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、軽鎖可変領域は、（ｉ）から選択される軽鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び重鎖可変領域は、（ｉｉ）から選択される重鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
１）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
２）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
３）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
４）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
５）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
６）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
７）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
８）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
９）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
１０）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
１１）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
１２）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
１３）配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
１４）配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；又は
１５）配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
１）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
２）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
３）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
４）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
５）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
６）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
７）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
８）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
９）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
１０）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；
１１）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；又は
１２）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
を含む。
一部の実施形態において、軽鎖及び重鎖可変領域は、それぞれ、１）～１５）から選択される軽鎖及び重鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある点において、本発明は、以下の（ｉ）～（ｉｉ）のいずれか１つから選択される重鎖及び軽鎖可変領域の組み合わせを含む単離抗体又はその抗原結合断片を提供する：
（ｉ）配列番号７、１１、１５、１９、４６又は８２のいずれか１つと同じ配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；及び
（ｉｉ）配列番号２３、２７、３１、４８又は８３のいずれか１つと同じ配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は軽鎖及び重鎖を含み、ここで、
（Ｉ）軽鎖は、配列番号９、１３、１７、２１、３７、３９、５０又は５４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含み；及び
（ＩＩ）重鎖は、配列番号２５、２９、３３、３５、５２又は５６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は軽鎖及び重鎖を含み、ここで、
（Ｉ）軽鎖は、配列番号９、１３、１７、２１、３７、３９又は５０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含み；及び
（ＩＩ）重鎖は、配列番号２５、２９、３３、３５又は５２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は軽鎖及び重鎖を含み、ここで、
（Ｉ）軽鎖は、配列番号９、１３、１７又は２１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含み；及び
（ＩＩ）重鎖は、配列番号２５、２９又は３３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、及びその保存的修飾を含む。
一部の実施形態において、軽鎖は、（Ｉ）から選択される軽鎖と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び重鎖は、（ＩＩ）から選択される重鎖と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
１）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
２）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
３）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
４）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
５）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
６）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
７）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
８）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
９）配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
１０）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
１１）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
１２）配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
１３）配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
１４）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、
１５）配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、又は
１６）配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、軽鎖及び重鎖は、それぞれ、１）～１６）から選択される軽鎖及び重鎖と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、
配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖
を含む。
別の点において、本発明は、（ａ）配列番号１を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号５を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３を含む単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
更に別の点において、本発明は、（ａ）配列番号１を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号２を含むＬＣＤＲ２、（ｃ）配列番号３を含むＬＣＤＲ３、（ｄ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、（ｅ）配列番号４５を含むＨＣＤＲ２、及び（ｆ）配列番号６を含むＨＣＤＲ３を含む単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
更に別の点において、本発明は、配列番号７によって表される軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３によって表される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
更に別の点において、本発明は、配列番号１１によって表される軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１によって表される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
更に別の点において、本発明は、配列番号１９によって表される軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１によって表される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
一部の実施形態において、単離抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト改変抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、Ｆｖ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ又はＦ（ａｂ’）２である。
一部の実施形態において、単離抗体は、ＩｇＧである。
一部の実施形態において、単離抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）アンタゴニストである。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＩＦの発現の阻害能及び／又はＬＩＦの活性の遮断能を有する。
一部の実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、ＬＩＦへの結合に関する競合能又は交差競合能を有する。
更に別の点において、本発明は、本発明の単離抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子を含むヌクレオチド組成物を提供する。一部の実施形態において、ヌクレオチド分子はＤＮＡ又はＲＮＡである。一部の実施形態において、ヌクレオチド分子はＤＮＡである。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
（ｉ）配列番号７、１１、１５、１９、４６又は８２のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子；及び
（ｉｉ）配列番号２３、２７、３１、４８又は８３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
（ｉ）配列番号７、１１、１５、１９又は４６のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子；及び
（ｉｉ）配列番号２３、２７、３１又は４８のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
（ｉ）配列番号７、１１、１５、又は１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子；及び
（ｉｉ）配列番号２３、２７又は３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、第１の核酸分子は、（ｉ）から選択される第１の核酸分子と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するＤＮＡを含み；第２の核酸分子は、（ｉｉ）から選択される第２の核酸分子と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するＤＮＡを含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
１）配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
２）配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
３）配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
４）配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
５）配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
６）配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
７）配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
８）配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
９）配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１０）配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１１）配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１２）配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１３）配列番号４６のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号４８のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１４）配列番号７４のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号７５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；又は
１５）配列番号８２のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号８３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
１）配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
２）配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
３）配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
４）配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
５）配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
６）配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
７）配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
８）配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
９）配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１０）配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１１）配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；又は
１２）配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む；
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号４６のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号４８のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号７４のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号７５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号８２のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号８３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、それぞれ、１）～１５）から選択される第１の核酸配列又は第２の核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するＤＮＡ配列を含む。
一部の実施形態において、配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡは、配列番号８として示される。
一部の実施形態において、配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡは、配列番号１２として示される。
一部の実施形態において、配列番号１５のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡは、配列番号１６として示される。
一部の実施形態において、配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡは、配列番号２０として示される。
一部の実施形態において、配列番号４６のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡは、配列番号４７として示される。
一部の実施形態において、配列番号７４のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡは、配列番号７６として示される。
一部の実施形態において、配列番号８２のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡは、配列番号７２として示される。
一部の実施形態において、配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡは、配列番号２４として示される。
一部の実施形態において、配列番号２７のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡは、配列番号２８として示される。
一部の実施形態において、配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡは、配列番号３２として示される。
一部の実施形態において、配列番号４８のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡは、配列番号４９として示される。
一部の実施形態において、配列番号７５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡは、配列番号７７として示される。
一部の実施形態において、配列番号８３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡは、配列番号７３として示される。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
（Ｉ）配列番号９、１３、１７、２１、３７、３９、５０又は５４のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸配列；及び
（ＩＩ）配列番号２５、２９、３３、３５、５２又は５６のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸配列
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
（Ｉ）配列番号９、１３、１７、２１、３７、３９又は５０のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子；及び
（ＩＩ）配列番号２５、２９、３３、３５又は５２のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
（Ｉ）配列番号９、１３、１７又は２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子；及び
（ＩＩ）配列番号２５、２９又は３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、第１の核酸分子は、（Ｉ）から選択される第１の核酸分子と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するＤＮＡを含み；第２の核酸分子は、（ＩＩ）から選択される第２の核酸分子と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するＤＮＡを含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
１）配列番号９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
２）配列番号９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
３）配列番号９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
４）配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
５）配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
６）配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
７）配列番号１７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
８）配列番号１７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
９）配列番号１７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１０）配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１１）配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１２）配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１３）配列番号３７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１４）配列番号３９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
１５）配列番号５０のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号５２のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；又は
１６）配列番号５４のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号５６のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、第１の核酸分子及び第２の核酸分子は、１）～１６）から選択される第１の核酸分子又は第２の核酸分子と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するＤＮＡを含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号１７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号３７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号３９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号５０のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号５２のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド組成物は、
配列番号５４のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号５６のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
を含む。
一部の実施形態において、配列番号９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号１０として示される。
一部の実施形態において、配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号１４として示される。
一部の実施形態において、配列番号１７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号１８として示される。
一部の実施形態において、配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号２２として示される。
一部の実施形態において、配列番号３７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号３８として示される。
一部の実施形態において、配列番号３９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号４０として示される。
一部の実施形態において、配列番号５０のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号５１として示される。
一部の実施形態において、配列番号５４のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡは、配列番号５５として示される。
一部の実施形態において、配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号２６として示される。
一部の実施形態において、配列番号２９のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号３０として示される。
一部の実施形態において、配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号３４として示される。
一部の実施形態において、配列番号３５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号３６として示される。
一部の実施形態において、配列番号５２のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号５３として示される。
一部の実施形態において、配列番号５６のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡは、配列番号５７として示される。
更に別の点において、本発明は、本発明のヌクレオチド組成物を含むベクターを提供する。
一部の実施形態において、ベクターは、真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター又はウイルスベクターである。
更に別の点において、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
一部の実施形態において、ベクターを含む宿主細胞は、ベクター形質転換によって入手される。
一部の実施形態において、宿主細胞は、細菌、酵母又は哺乳類細胞である。
一部の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌、ピキア酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト胎児腎臓２９３細胞である。
更に別の点において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、本発明の宿主細胞において抗体又はその抗原結合断片を発現させること、及び抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む方法を提供する。
更に別の点において、本発明は、治療有効量の上述の単離抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
更に別の点において、本発明は、生体試料中のＬＩＦを検出するための、上述の単離抗体又はその抗原結合断片を含む試薬を提供する。
一部の実施形態において、生体試料は、異常なＬＩＦレベルを有する疑いがある血液、血清、尿、生検材料、腫瘍、又は任意の組織である。
別の点において、本発明は、ＬＩＦの発現を阻害し及び／又はＬＩＦの活性を遮断する方法であって、それを必要としている患者に、治療有効量の上述の単離抗体又はその抗原結合断片、及び／又は上述の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
更に別の点において、本発明は、ＬＩＦの発現を阻害し及び／又はＬＩＦの活性を遮断するために使用される医薬品の製造における、上述の単離抗体又はその抗原結合断片、及び／又は上述の医薬組成物の使用を提供する。
更に別の点において、本発明は、ＬＩＦの発現の阻害及び／又はＬＩＦの活性の遮断における使用のための上述の単離抗体又はその抗原結合断片及び／又は上述の医薬組成物を提供する。
別の点において、本発明は、ＬＩＦに関連する疾患又は病態を治療する方法であって、必要としている患者に、治療有効量の上述の単離抗体又は抗原結合断片、及び／又は上述の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＬＩＦに関連する疾患又は病態は、腫瘍である。一部の実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍は、膠芽腫、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌又は前立腺癌を含む。
更に別の点において、本発明は、ＬＩＦに関連する疾患又は病態を治療するための医薬品の製造における、上述の単離抗体又はその抗原結合断片、及び／又は上述の医薬組成物の使用を提供する。一部の実施形態において、ＬＩＦに関連する疾患又は病態は、腫瘍である。一部の実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍は、膠芽腫、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌又は前立腺癌を含む。
更に別の点において、本発明は、ＬＩＦに関連する疾患又は病態の治療における使用のための上述の単離抗体又はその抗原結合断片、及び／又は上述の医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、ＬＩＦに関連する疾患は、腫瘍である。一部の実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍である。一部の実施形態において、固形腫瘍は、膠芽腫、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌又は前立腺癌を含む。
ＬＩＦに関連する疾患又は病態とは、ＬＩＦ及びＬＩＲＲ及び／又はＧＰ１３０を遮断すると、その疾患又は病態が治療され、緩和され、軽減され、及び／又は安定化し得ることを意味する。
別の点において、本発明は、生体試料中のＬＩＦの検出方法であって、（ｉ）対象の組織又は体液試料を入手すること、（ｉｉ）組織又は体液試料を上述の単離抗体若しくはその抗原結合断片又は上述の試薬に曝露すること；及び（ｉｉｉ）（ｉｉ）の組織又は体液試料へのＬＩＦ結合を対照試料へのＬＩＦ結合と比較することであって、ここで対照試料と比較したＬＩＦ結合量の増加が、ＬＩＦの産生、発現又は活性化レベルの異常を示すこと、を含む方法を提供する。
一部の実施形態において、組織又は体液試料は、異常なＬＩＦレベルを有する疑いがある血液、血清、尿、生検材料、腫瘍、又は任意の組織を含む。
注記: CDR及びフレームワーク領域のアミノ酸番号は全て、Kabat方式のEUインデックスに基づきアノテートされる(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。いずれの配列も、シグナルペプチドは含まない。aa: アミノ酸、nt: ヌクレオチド。
ヒトＬＩＦタンパク質に対する本発明のＬＩＦ抗体の結合能力を示す； マウスＬＩＦタンパク質に対する本発明のＬＩＦ抗体の結合能力を示す； フィリピンカニクイザルＬＩＦタンパク質に対する本発明のＬＩＦ抗体の結合能力を示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体が抗原に結合する親和性を示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体がヒトＬＩＦタンパク質への結合に関してＬＩＦＲと競合する能力を示す； Ｐ３６－０３３抗体がヒトＬＩＦタンパク質への結合に関してＧＰ１３０受容体と競合する能力を示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体及びＰ３６－０３３抗体のＩＬ－６ファミリータンパク質との交差反応を示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１Ｒ抗体が変性ヒトＬＩＦタンパク質を認識することを示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体が、ヒトＬＩＦタンパク質によって誘導される結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）のリン酸化を阻害することを示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体が、ヒトＬＩＦタンパク質によって誘導される膵癌細胞（ＫＰ４）のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害することを示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体が、ＣＴ２６－ｈＬＩＦ細胞によって分泌されるヒトＬＩＦによる膵癌細胞ＫＰ４のＳＴＡＴ３の活性化を遮断することを示す； 本発明のＰ３６－０３３抗体が、ヒトＬＩＦタンパク質によって誘導される結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）のＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害することを示す； 本発明の３８Ｅ１Ｅ１Ｃ１１及びＰ３６－０３３抗体が、ＬＩＦによって引き起こされるＭ１細胞の増殖阻害を逆転させることを示す； 本発明の３８Ｅ１Ｅ１Ｃ１１抗体が、ＢＡＢＬ／ｃマウスにおけるＣＴ２６－ｈＬＩＦ細胞の成長を阻害することを示す； ヒトＬＩＦタンパク質による刺激に対する３つのヒト膵癌細胞株の感受性を示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１Ｒ抗体が、ＬＩＦタンパク質によって刺激されたＫＰ４細胞のＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することを示す； 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体による完全長ヒトＬＩＦタンパク質並びにヘテロ接合ＬＩＦタンパク質の認識についての実験結果を示す 本発明の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体が、完全長ヒトＬＩＦタンパク質及びヘテロ接合ＬＩＦタンパク質によって引き起こされるＭ１細胞増殖阻害を逆転させることができるという実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体の抗原結合特性についての実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体の非特異的結合親和性についての実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体がヒトＬＩＦタンパク質への結合に関してＬＩＦＲと競合することについての実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体がＧＰ１３０と競合してヒトＬＩＦタンパク質に結合することについての実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体が抗原特異性を認識することについての実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体が完全長ヒトＬＩＦタンパク質及びヘテロ接合ＬＩＦタンパク質を認識することについての実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体が、完全長ＬＩＦタンパク質及びハイブリッドタンパク質によるＭ１細胞増殖の阻害を遮断することについての実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体が、ＬＩＦタンパク質によって誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害することについての実験結果を示す； 本発明のヒト化抗ＬＩＦ抗体が、ヒトＬＩＦタンパク質によるＭ１細胞増殖の阻害を逆転させることができるという実験結果を示す。 ＨＴＦＲ法によって検出された、ヒト化抗ＬＩＦ抗体によって阻害されたＬＩＦタンパク質誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化レベル及び総ＳＴＡＴ３レベルを示す。 ヒト化抗ＬＩＦ抗体のＡＤＣＣ効果を示す。
定義
本説明をより容易に理解し得るように、初めに幾つかの用語を定義する。更なる定義は、詳細な説明全体を通じて示す。
用語「ＬＩＦ」は、本明細書で使用されるとき、白血病抑制因子を指す。ＬＩＦのアミノ酸配列は公的に利用可能である（Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＭ＿００１２５７１３５）。一部の実施形態において、ＬＩＦは、ヒトＬＩＦ、マウスＬＩＦ（Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＭ＿００１０３９５３７．２）、又はフィリピンカニクイザルＬＩＦ（ＸＭ＿０１５４５７５１８．１）であり得る。本明細書の他の部分に記載されるとおり、ＬＩＦは、組換え型及び／又はグリコシル化型又は非グリコシル化型であり得る。
用語「抗体」には、本明細書で使用されるとき、全抗体及びその任意の抗原結合断片（即ち、「抗原結合部分」）又は単鎖が含まれ得る。「抗体」は、一実施形態では、ジスルフィド結合によって互いにつながった２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を少なくとも含む糖タンパク質又はその抗原結合部分を指す。各重鎖が、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略する）と重鎖定常領域とを含む。一部の天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＡ抗体では、重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。一部の天然に存在する抗体では、各軽鎖が、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略する）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域とに更に細分することができ、これらは両方とも、互いに入り混じって並んでいる。本明細書では、ＶＨ領域のＣＤＲはＨＣＤＲと省略し、つまり、ＶＨ領域の３つのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と省略することができる；ＶＬ領域のＣＤＲはＬＣＤＲと省略し、つまり、ＶＬ領域の３つのＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と省略することができる。各ＶＨ及びＶＬが、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並ぶ３つのＣＤＲと４つのＦＲとを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含め、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
抗体の重鎖は、末端リジン（Ｋ）、又は末端グリシン及びリジン（ＧＫ）を含むことも、又は含まないこともある。従って、本明細書に提供される重鎖配列及び重鎖定常領域配列のいずれも、配列の最後のアミノ酸が何を提供するかに関わらず、ＧＫ若しくはＫのいずれかで終わってもよく、又はＫ若しくはＧＫを欠いていてもよい。これは、末端リジン並びに時にグリシン及びリジンが抗体の発現中に切断されるためである。
抗体は典型的にはそのコグネイト抗原に対し、１０－７～１０－１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）に反映される高親和性で特異的に結合する。約１０－６Ｍより高いＫＤはいずれも、概して非特異的な結合を示していると見なされる。本明細書で使用されるとき、抗原に「特異的に結合する」抗体とは、抗原及び実質的に同一の抗原に高親和性で結合する抗体を指し、これはつまり、１０－７Ｍ以下、好ましくは１０－８Ｍ以下、更により好ましくは５×１０－９Ｍ以下、及び最も好ましくは１０－８Ｍ～１０－１０Ｍ以下のＫＤを有するが、無関係の抗原には高親和性で結合しないということを意味する。抗原は、それが所与の抗原と高度な配列同一性を呈する場合、例えば、それが所与の抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％又はそれ以上の配列同一性を呈する場合、所与の抗原と「実質的に同一」である。
免疫グロブリンは、限定はされないが、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含め、一般に公知のアイソタイプのいずれであってもよい。ＩｇＧアイソタイプは、幾つかの種ではサブクラスに分けられる：ヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、マウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３。特定の実施形態において、本明細書に記載される抗ＬＩＦ抗体は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えばヒトＩｇＧ１は数種のアロタイプで存在し、それらの互いの違いは多くても数アミノ酸である。「抗体」には、例として、天然に存在する及び天然に存在しない抗体；モノクローナル及びポリクローナル抗体；キメラ及びヒト化抗体；ヒト及び非ヒト抗体；完全合成抗体；及び単鎖抗体がいずれも含まれ得る。
抗体の「抗原結合部分」又は抗体の「抗原結合断片」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体、例えば本明細書に記載される抗ＬＩＦ抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又は（ｖｉｉ）任意選択で合成リンカーによって連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは異なる遺伝子によってコードされるが、それらを組換え方法を用いて合成リンカーによって連結すると、ＶＬ及びＶＨ領域が対を成す単一のタンパク質鎖として作ることが可能となり、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子が形成される；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照）。かかる単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されることが意図される。上記及び他の潜在的な構築物について、Ｃｈａｎ ＆ Ｃａｒｔｅｒ（２０１０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３０１に記載されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて入手され、断片は、有用性に関して、インタクトな抗体と同様にスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法によるか、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって作製することができる。
用語「保存的修飾形態のアミノ酸配列」は、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性が大きい影響又は変化を被ることのないアミノ酸修飾を指し、そうした修飾には、アミノ酸置換、付加及び欠失が含まれる。修飾は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、標準技法によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明の抗体のＣＤＲ領域内にある１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、改変された抗体は、本明細書に記載される機能アッセイを用いて機能の保持に関して試験することができる。好ましくは、保存的修飾の数は１又は２を超えない。
本発明においては、本明細書に記載されるアミノ酸配列の修飾、特に、アジア人集団に見られるものなど、所望のアロタイプに配列を適合させるようなヒト重鎖定常領域の修飾が望ましい。
例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ又はＣＤＲ群をフレームワーク（ヒトフレームワークなど）にグラフト化して、抗体分子を提供することができる。フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列又は非生殖細胞系列遺伝子配列であり得る。このように、フレームワークは生殖細胞系列であってもよく、ここではフレームワークの１つ以上の残基が、同等の位置で最も類似したヒト生殖細胞系列フレームワークの残基と一致するように交換され得る。このように、本発明の結合メンバーは、ヒト生殖細胞系列フレームワーク、例えば、ヒト生殖細胞系列ＩｇＧ ＶＨフレームワークの範囲内にあるＨＣＤＲ群を有する単離されたＶＨドメインであってもよい。結合メンバーはまた、ヒト生殖細胞系列ＩｇＧ ＶＬフレームワークにあるような、ＬＣＤＲ群を含むＶＬドメインも有し得る。
ＶＨ及び／又はＶＬ足場残基は、本明細書で例示されるとおり、部位特異的突然変異誘発を用いるなどして考察されるとおり修飾されてもよい。本発明のＶＨ又はＶＬドメイン、又は結合メンバーには、かかるＶＬドメインが含まれる。
１つ以上のフレームワーク領域及び／又は１つ以上のＣＤＲに変化を設けてもよく、それらの変化は、通常は機能喪失をもたらさないため、かかる変化したアミノ酸配列を含む結合メンバーは、ＬＩＦを結合及び／又は中和する能力を維持しているはずである。それは、本明細書に記載される分析的方法によって測定したとき、変化していない結合メンバーと同じ数の結合及び／又は中和能力を維持していてもよい。かかる変化したアミノ酸配列を含む結合メンバーは、ＬＩＦを結合及び／又は中和する能力の向上を示し得る。
変化としては、１つ以上のアミノ酸残基から天然に存在しない又は非標準のアミノ酸への置換、１つ以上のアミノ酸残基から天然に存在しない又は非標準の形態への修飾、又は配列への１つ以上の天然に存在しない又は非標準のアミノ酸の挿入を挙げることができる。本発明の配列中の変化の位置及び数の例は、本明細書の他の部分に記載される。天然に存在するアミノ酸には、その標準的な１文字コードによってＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして識別される２０個の「標準」Ｌ－アミノ酸が含まれる。非標準アミノ酸には、ポリペプチド骨格に取り込み得る、又は既存のアミノ酸残基から修飾し得る任意の他の残基が含まれる。非標準アミノ酸は、天然に存在するものであっても、又は天然に存在しないものであってもよい。幾つかの天然に存在する非標準アミノ酸が、４－ヒドロキシプロリン、５－ヒドロキシリジン、３－メチルヒスチジン、Ｎ－エチルセリンなど、当該技術分野において公知である（Ｖｏｅｔ ＆ Ｖｏｅｔ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｗｉｌｅｙ））。そのＮ－α位で誘導体化されるアミノ酸残基は、アミノ酸配列のＮ末端にのみ位置することになる。概して、本発明のアミノ酸はＬ－アミノ酸であるが、それはＤ－アミノ酸であってもよい。従って、変化には、Ｌ－アミノ酸による修飾又はＤ－アミノ酸によるＬ－アミノ酸の置換が含まれ得る。ホルミル化、アセチル化及び／又はリン酸化した形態のアミノ酸が公知であり、本発明のアミノ酸がそのように修飾されてもよい。
本発明の結合メンバー及び抗体ドメインのアミノ酸配列は、上記に記載される非天然又は非標準アミノ酸を含み得る。非標準アミノ酸（Ｄ－アミノ酸など）は、合成中に、又はアミノ酸合成後に「元の」標準アミノ酸の修飾若しくは置換によってアミノ酸配列に取り込まれてもよい。
非標準の及び／又は天然に存在しないアミノ酸を用いると、構造及び機能の多様性が向上し、本発明の結合メンバーに所望のＬＩＦ結合及び中和特性が実現する可能性を高めることができる。加えて、Ｌ－アミノ酸を含むポリペプチドはヒトなどの動物への投与後にインビボで分解されるため、標準のＬ－アミノ酸と比較して、Ｄ－アミノ酸及びその類似体は、薬物動態特性がより良好であることが示されている。
本発明のＣＤＲ誘導体化配列を有する新規ＶＨ又はＶＬ領域の作成には、全ての変異領域に突然変異体が作成されるようにＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子から選択される１つ以上のランダム突然変異誘発を用いることができる。かかる技法については、Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６－３５８０）に記載され、これはエラープローンＰＣＲを用いるものである。一部の実施形態では、全ての変異領域又はＣＤＲ群に１つ以上のアミノ酸置換が作られる。
用いることのできる別の方法は、ＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域の標的化した突然変異誘発である。かかる方法は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９－３８１３）及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１－５６７）によって発表されている。
上記に記載される方法は、いずれも当該技術分野において公知であり、当業者は、かかる方法を使用し、当該技術分野における従来方法を採用することにより、本発明の結合メンバーを提供することが可能であろう。
考察されるとおり、本発明においては、本明細書に開示される特定の配列を有する任意のＶＨ及びＶＬドメインアミノ酸配列変異体を使用することができる。特定の変異体は、１つ以上のアミノ酸配列変化（アミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入）を含み得る。一部の実施形態において、変異体は、かかる変化を約１７個未満、９個未満、又は５個未満有する。
上記に示すとおり、実質的に本明細書に記載されるとおりのＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体変異構造領域又はそのほとんどにおけるＣＤＲとして担持され得る。実質的に本明細書に記載されるとおりのＨＣＤＲ３配列は、本発明の実施形態に相当し、その各々が、ヒト抗体変異領域又はそのほとんどにＣＤＲとして、任意選択で本発明のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３との組み合わせで担持され得る。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用されるとき、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す抗体、又はその中の全ての抗体が特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す抗体の組成物を指す。典型的には、かかるモノクローナル抗体は、単一の抗体をコードする細胞又は核酸に由来することになり、いかなる配列改変も意図的に導入することなく増殖させることになる。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び任意選択の定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックな又はトランス染色体性の非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖トランス遺伝子及び軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス）に由来するＢ細胞を不死化細胞と融合することによって入手されるハイブリドーマによって作製される。用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。
用語「組換えヒト抗体」には、本明細書で使用されるとき、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックな又はトランス染色体性の動物（例えば、マウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列から他のＤＮＡ配列へのスプライシングが関わる任意の他の手段によって調製され、発現し、作製され、又は単離された抗体など、組換え手段によって調製され、発現し、作製され、又は単離されるあらゆるヒト抗体が含まれる。かかる組換えヒト抗体は、特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を利用する、及び生殖細胞系列遺伝子によってコードされる可変領域及び定常領域を含むが、続いて、例えば抗体成熟中に起こる再配列及び突然変異を含む。当該技術分野において公知のとおり（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１１７－１１２５を参照）、可変領域は抗原結合ドメインを含み、これは、再配列によって外因性抗原に特異的な抗体を形成する様々な遺伝子によってコードされる。再配列に加えて、可変領域は更に、外因性抗原に対する抗体の親和性を増加させるため、複数の単一アミノ酸変化（体細胞突然変異又は超突然変異と称される）による修飾を受けることができる。抗原に更に応答して、定常領域が変化することになる（即ち、アイソタイプスイッチ）。従って、軽鎖及び重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸配列が抗原に応答して再配列し、及び体細胞突然変異すると、それは元の生殖細胞系列配列と同じではなくなり得るが、代わりに実質的に同一又は同様のもの（即ち、少なくとも８０％の同一性を有するもの）となる。
「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）とは、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載される抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされるのでないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって導入されるか、又はインビボで体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用されるとき、マウスなどの別の哺乳類種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフト化された抗体は含まないことが意図される。用語「ヒト」抗体と「完全ヒト」抗体とは、同義語として使用される。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外にあるアミノ酸の一部、ほとんど又は全てがヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸に置き換えられている抗体を指す。ヒト化形態の抗体の一実施形態では、ＣＤＲドメイン外にあるアミノ酸の一部、ほとんど又は全てがヒト免疫グロブリンのアミノ酸に置き換えられている一方、１つ以上のＣＤＲ領域内の一部、ほとんど又は全てのアミノ酸は変化していない。アミノ酸の僅かな付加、欠失、挿入、置換又は修飾は、それが特異的抗原に結合する抗体の能力を消失させない限り、許容できる。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持している。
「キメラ抗体」は、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体など、可変領域が一つの種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。
本発明の機能性抗体断片は、ペグ化又はリポソームへの取込みによるなど、化学修飾によって半減期が増加している任意の機能性断片を含む。
本発明の抗体には、二重特異性抗体が含まれる。二重特異性又は二機能性抗体は第２世代モノクローナル抗体を形成し、ここでは２つの異なる変異領域が同じ分子に組み合わされている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｌｅｎ，１９９９ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｒｅｖ．１８：４１１－４１９）。新規エフェクター機能を動員し、又は腫瘍細胞の表面上にある一部の分子を標的化するその能力ゆえに、診断及び治療領域におけるその応用が解明されている。二重特異性抗体が使用されるとき、例えば、化学的に調製される又はハイブリッドに由来するハイブリドーマは、様々な方法で製造することのできる従来の二重特異性抗体であってもよく（ＨｏｌｌｉｇｅｒＰ．＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６－４４９：１９９３）、又は上述の二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。これらの抗体は、化学的方法又は体細胞的方法によって入手することができ、しかし同様に、及び好ましくは、ヘテロ二量体化の実施を可能にし、且つ入手された抗体の精製プロセスを促進する遺伝子工学的方法によって入手することができる。二重特異性抗体の例としては、ＢｉＴＥＴＭ法のものが挙げられ、ここでは異なる特異性を有する２つの抗体の結合ドメインが使用され、それらを短い可動性ペプチドによって直接連結することができる。これは、２つの抗体を短い単一のポリペプチド鎖上に組み合わせる。ダイアボディ及びｓｃＦｃはＦｃ領域なしに構築され、変異領域のみが使用され、これにより抗イディオタイプ反応の効果が低下する可能性がある。
二重特異性抗体は、完全長ＩｇＧ、二重特異性（Ｆａｂ’）２、（Ｆａｂ’）ＰＥＧ、ダイアボディ又は他の二重特異性ｓｃＦｖとして構築することができる。更に、当該技術分野において公知の従来方法を用いて２つの二重特異性抗体を連結することにより、四価抗体を形成することができる。
二重特異性全抗体と比較して、構築が容易で、且つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させることができるため、二重特異性ダイアボディもまた特に有用である。ファージディスプレイライブラリを使用すると（国際公開第１９９４／１３８０４号パンフレット）、適切な結合特異性のダイアボディ（及び抗体断片など、他の多くのポリペプチド）を容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが一定に保たれている場合、そのとき他方のアームが突然変異しているライブラリが調製され、適切な特異性の抗体が選択される。二重特異性全抗体は種々のエンジニアリング方法によって調製することができ、それらについては、Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９，６１６－６２１，１９９６）又は国際公開第１９９６／２７０１１号パンフレット、国際公開第１９９８／５０４３１号パンフレット及び国際公開第２００６／０２８９３６号パンフレットに記載されている。
「修飾された重鎖定常領域」は、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む重鎖定常領域であって、それらの定常ドメインのうちの１つ以上が異なるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）であるものを指す。一部の実施形態において、修飾された定常領域は、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ１ドメイン及びヒトＩｇＧ２ヒンジがヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン及びヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに融合したものを含む。特定の実施形態において、かかる修飾された定常領域はまた、野生型アミノ酸配列と比べてドメインのうちの１つ以上の範囲内にアミノ酸修飾も含む。
本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体）を指す。
「アロタイプ」は、特定のアイソタイプ群における天然に存在する変異体を指し、こうした変異体は数アミノ酸が異なる（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）ｍＡｂｓ １：１を参照）。本明細書に記載される抗体は、任意のアロタイプであってよい。
本明細書において特に指定のない限り、全てのアミノ酸番号は、Ｋａｂａｔ方式のＥＵインデックスに基づく（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。
用語「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。
用語「単離抗体」は、本明細書で使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＬＩＦに特異的に結合する単離抗体は、ＬＩＦ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＬＩＦのエピトープに特異的に結合する単離抗体は、異なる種の他のＬＩＦタンパク質への交差反応性を有し得る。
「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域によるＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用、又はそれによって生じる生化学的イベントを指す。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ及び抗体依存性細胞媒介性貪食（ｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）（ＡＤＣＰ）などのＦｃγＲ介在性エフェクター機能、並びに細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御が含まれる。かかるエフェクター機能は、概して、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせになる必要がある。
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これには、それらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシングを受けた形態も含まれる。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性化型受容体（マウスではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃγＲＩＶ；ヒトではＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＡ）及び１つの抑制型受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）からなる。ヒトＦｃγＲの様々な特性を表Ａに要約する。生得的エフェクター細胞タイプの大多数は、１つ以上の活性型ＦｃγＲ及び抑制型ＦｃγＲＩＩＢを共発現するが、一方、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、１つの活性化型Ｆｃ受容体（マウスではＦｃγＲＩＩＩ及びヒトではＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現するものの、マウス及びヒトの抑制型ＦｃγＲＩＩＢは発現しない。ヒトＩｇＧ１は、ほとんどのヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性化型Ｆｃ受容体のタイプはマウスＩｇＧ２ａに等しいと考えられている。
「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖定常領域のドメインを指し、ヒンジの上側部分、中間部分、及び下側部分を含む（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ １６１：４０８３）。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域との間に様々なレベルの可動性をもたらし、また、２つの重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合部位ももたらす。
用語「ヒンジ」には、野生型ヒンジ、並びにその変異体（例えば、天然に存在しないヒンジ又は修飾されたヒンジ）が含まれる。例えば、用語「ＩｇＧ２ヒンジ」には、野生型ＩｇＧ２ヒンジ、及び１、２、３、４、５、１～３、１～５、３～５個及び／又は多くても５、４、３、２、又は１個の突然変異、例えば、置換、欠失又は付加を有する変異体が含まれる。
用語「ＣＨ１ドメイン」は、重鎖定常ドメインにおいて可変ドメインをヒンジに連結する重鎖定常領域を指す。用語「ＣＨ１ドメイン」には、野生型ＣＨ１ドメイン、並びにその変異体（例えば、天然に存在しないＣＨ１ドメイン又は修飾されたＣＨ１ドメイン）が含まれる。例えば、用語「ＣＨ１ドメイン」には、野生型ＣＨ１ドメイン及び１、２、３、４、５、１～３、１～５、３～５個及び／又は多くても５、４、３、２、又は１個の突然変異、例えば、置換、欠失又は付加を有するその変異体が含まれる。例示的ＣＨ１ドメインとしては、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ又は半減期など、抗体の生物学的活性を変化させる突然変異を有するＣＨ１ドメインが挙げられる。
用語「ＣＨ２ドメイン」は、重鎖定常ドメインのヒンジをＣＨ３ドメインに連結する重鎖定常領域を指す。用語「ＣＨ２ドメイン」には、野生型ＣＨ２ドメイン、並びにその変異体（例えば、天然に存在しないＣＨ２ドメイン又は修飾されたＣＨ２ドメイン）が含まれる。例えば、用語「ＣＨ２ドメイン」には、野生型ＣＨ２ドメイン及び１、２、３、４、５、１～３、１～５、３～５個及び／又は多くても５、４、３、２、又は１個の突然変異、例えば、置換、欠失又は付加を有するその変異体が含まれる。例示的ＣＨ２ドメインとしては、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ又は半減期など、抗体の生物学的活性を変化させる突然変異を有するＣＨ２ドメインが挙げられる。
用語「ＣＨ３ドメイン」は、重鎖定常ドメインのＣＨ２ドメインのＣ末端側にある重鎖定常領域を指す。用語「ＣＨ３ドメイン」には、野生型ＣＨ３ドメイン、並びにその変異体（例えば、天然に存在しないＣＨ３ドメイン又は修飾されたＣＨ３ドメイン）が含まれる。例えば、用語「ＣＨ３ドメイン」には、野生型ＣＨ３ドメイン及び１、２、３、４、５、１～３、１～５、３～５個及び／又は多くても５、４、３、２、又は１個の突然変異、例えば、置換、欠失又は付加を有するその変異体が含まれる。例示的ＣＨ３ドメインとしては、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ又は半減期など、抗体の生物学的活性を変化させる突然変異を有するＣＨ３ドメインが挙げられる。
「ＣＬドメイン」は、軽鎖の定常ドメインを指す。用語「ＣＬドメイン」には、野生型ＣＬドメイン及びその変異体が含まれる。
「天然配列Ｆｃ領域」又は「天然配列Ｆｃ」は、自然中に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧｌ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；及び天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域並びに天然に存在するその変異体が含まれる。天然配列Ｆｃには、様々なアロタイプのＦｃが含まれる（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００９） ｍＡｂｓ １：１を参照）。
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原（例えば、ＬＩＦ）上の部位を指す。タンパク質抗原内のエピトープは、連続したアミノ酸で形成されることもでき（通常は線状エピトープ）、又はタンパク質の三次の折り畳みによって並んで置かれた不連続なアミノ酸で形成されることもできる（通常は立体エピトープ）。連続したアミノ酸で形成されたエピトープは、常にというわけではないが、典型的には変性溶媒への曝露時にも保持されているが、一方、三次の折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸をユニークな空間配置で含む。どのエピトープが所与の抗体の結合を受けるかの決定方法（即ち、エピトープマッピング）は、当該技術分野において周知であり、例えば、イムノブロッティング及び免疫沈降分析が挙げられ、ここでは重複する又は連続したペプチド（例えば、ＬＩＦ由来）が、所与の抗体（例えば、抗ＬＩＦ抗体）との反応性に関して試験される。エピトープの空間配置を決定する方法としては、当該技術分野における技法及び本明細書に記載される技法、例えば、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴及びＨＤＸ－ＭＳが挙げられる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照）。
「標的への結合に関して別の抗体と競合する」抗体とは、別の抗体による標的への結合を阻害する（部分的に又は完全に阻害する）抗体を指す。２つの抗体が標的への結合に関して互いに競合するかどうか、即ち、一つの抗体がもう一つの抗体による標的への結合を阻害するかどうか、及びどの程度まで阻害するかは、本実施例に記載されるものなど、公知の競合実験を用いて決定されてもよい。特定の実施形態において、抗体は別の抗体と競合し、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の結合を阻害する。阻害又は競合の程度は、いずれの抗体が「遮断抗体」（即ち、初めに標的とインキュベートされるコールド抗体）であるかに応じて異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏ ｔｏｅ；２００６；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４２７７又はＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ １９９９による「Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」の第１１章に記載されるとおり行うことができる。競合抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ又は隣接エピトープ（例えば、立体障害から明らかなとおり）に結合する。
他の競合的結合アッセイとしては、固相ダイレクト又はインダイレクトラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相ダイレクト又はインダイレクト酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２（１９８３）を参照）；固相ダイレクトビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４（１９８６）を参照）；固相ダイレクト標識アッセイ、固相ダイレクト標識サンドイッチ分析（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照）；Ｉ－１２５標識を使用した固相ダイレクト標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７（１９８８）を参照）；固相ダイレクトビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６（１９９０））；及びダイレクト標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７（１９９０））が挙げられる。
用語「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」は、本明細書で使用されるとき、特異的抗体－抗原相互作用の会合速度定数を指すことが意図され、一方、用語「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」は、本明細書で使用されるとき、特異的抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指すことが意図される。用語「ＫＤ」は、本明細書で使用されるとき、平衡解離定数を指すことが意図され、これは、ＫｄのＫａに対する比（即ち、Ｋｄ／Ｋａ）から求められ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立されている方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いることにより、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）表面プラズモン共鳴システムなどのバイオセンサーシステム又はフローサイトメトリー及びスキャッチャードを用いて分析することである。
用語「ＥＣ５０」は、抗体又はその抗原結合断片を使用するインビトロ又はインビボアッセイの文脈では、最大反応の５０％の反応、即ち、最大反応とベースラインとの間の中間の反応を生じさせる抗体又はその抗原結合部分の濃度を指す。
用語「ＩＣ５０」、機能分析では、ＩＣ５０は、ｎＭを単位として取って、生物学的反応をその最大値の５０％に低減することのできる結合メンバーの濃度である。リガンド結合研究では、ＩＣ５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％に低減する濃度である。ＩＣ５０は、最大生物学的活性反応のパーセンテージを結合メンバーの対数濃度の関数としてプロットし、Ｏｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）などのソフトウェアプログラムを使用して、Ｓ関数をデータに当てはめてＩＣ５０値を生成するなどにより計算し得る。効力は、当業者に公知の及び／又は本明細書に記載若しくは参照される１つ以上の分析的方法を用いて決定又は測定される。結合メンバーの中和効力は、幾何平均として表すことができる。
用語「天然に存在する」は、本明細書で物体に適用して使用されるとき、物体が自然中に見られるという事実を指す。例えば、自然の供給源から単離することのできる、且つ実験室で人の手によって意図的に修飾されていない、生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続的に連結されるアミノ酸残基を含む鎖を指し、ここで鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基は、限定はされないが、グリコシル化、リン酸化又はジスルフィド結合など、修飾を含有し得る。「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチドを含み得る。
用語「核酸分子」は、本明細書で使用されるとき、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、単鎖又は二重鎖であってもよく、及びｃＤＮＡであってもよい。また、本明細書に記載される配列番号に規定される配列の「保存的配列修飾」、即ち、そのヌクレオチド配列によってコードされる又はそのアミノ酸配列を含有する抗体による抗原への結合を消失させることのないヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾も提供される。かかる保存的配列修飾には、保存的ヌクレオチド及びアミノ酸置換、並びに、ヌクレオチド及びアミノ酸付加及び欠失が含まれる。例えば、修飾は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介性突然変異誘発など、当該技術分野において公知の標準技法により、本明細書に記載される配列番号に導入することができる。保存的配列修飾には、保存的アミノ酸置換が含まれ、ここではアミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。それらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
核酸について、用語「実質的な同一性」とは、２つの核酸、又はその指定される配列が、最適にアラインメントして比較したとき、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を入れると、少なくとも約８０％のヌクレオチド、通常は少なくとも約９０％～９５％、及びより好ましくは少なくとも約９８％～９９．５％のヌクレオチドで同一であることを指し示している。或いは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で鎖の相補体とハイブリダイズするであろう場合、実質的な同一性が存在する。
ポリペプチドについて、用語「実質的な同一性」とは、２つのポリペプチド、又はその指定される配列が、最適にアラインメントして比較したとき、適切なアミノ酸挿入又は欠失を入れると、少なくとも約８０％のアミノ酸、通常は少なくとも約９０％～９５％、及びより好ましくは少なくとも約９８％～９９．５％のアミノ酸で同一であることを指し示している。
２つの配列間の同一性％は、配列を最適にアラインメントしたときにそれらの配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（即ち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）、ここで最適なアラインメントは、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要のあるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮して決定される。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に記載するとおりの数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）を用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列及びギャップの重み４０、５０、６０、７０、又は８０及び長さの重み１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することができる。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性もまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８９））のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティー４を使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３（１９７０））のアルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれか、及びギャップの重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４及び長さの重み１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することができる。
本明細書に記載される核酸及びタンパク質配列は、更に、例えば近縁の配列を同定するため、公開データベースの検索を実行する際の「問い合わせ配列」として使用することができる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）で実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記載される核酸分子と同一のヌクレオチド配列を入手するために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に記載されるタンパク質分子と同一のアミノ酸配列を入手するため、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行することができる。比較を目的としてギャップ付きアラインメントを達成するには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されるとおりのギャップ付きＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
これらの核酸は、全細胞、細胞ライセート、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸（例えば、染色体の他方の部分）又はタンパク質が、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野において周知の他の技法を含めた標準技法によって精製されて取り去られているとき、「単離されている」又は「実質的に純粋にされている」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと。
核酸、例えばｃＤＮＡは、遺伝子配列を提供する標準技法に従い突然変異させてもよい。コード配列について、こうした突然変異は、アミノ酸配列に所望のとおりの影響を及ぼし得る。具体的には、天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチ及び本明細書に記載される他のかかる配列と実質的に同一であるか、又はそれに由来するＤＮＡ配列が企図される。
用語「ベクター」は、本明細書で使用されるとき、それが連結されている別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指すことが意図される。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、他のＤＮＡセグメントを連結し得る環状二重鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでは他のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結されていてもよい。一部のベクターは、それが導入される宿主細胞で自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、従って宿主ゲノムと共に複製することができる。更に、一部のベクターは、それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指図する能力を有する。かかるベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に、「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において使用される発現ベクターは、多くの場合にプラスミドの形態である。本記載では、「プラスミド」及びプラスミドと同義的に使用され得る「ベクター」が、最も多く使用される形態のベクターである。しかしながら、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）など、等価な機能を果たす他の形態の発現ベクターもまた含まれる。
用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、本明細書で使用されるとき、その細胞に天然では存在しない核酸を含む細胞を指すことが意図され、組換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る。かかる用語が特定の対象細胞を指すのみならず、かかる細胞の子孫も指すよう意図されることは理解されなければならない。後続の世代では、突然変異又は環境の影響のいずれかに起因して何らかの修飾が現れ得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではないこともあるが、それでもなお、本明細書で使用されるとおりの用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「抗原」は、任意の天然又は合成の免疫原性物質、例えば、タンパク質、ペプチド、又はハプテンなどを指す。抗原はＬＩＦ又はその断片であり得る。
本明細書で使用されるとき、用語「阻害」又は「遮断」（例えば、ＬＩＦ結合又は活性の阻害／遮断と言うときの）は、同義的に使用され、部分的及び完全な阻害／遮断の両方を包含する。
本明細書で使用されるとき、「癌」は、体内での異常細胞の無制御な成長によって特徴付けられる幅広い一群の疾患を指す。無秩序な細胞分裂が悪性腫瘍又は細胞の形成を生じさせるため、これは隣接組織に浸潤することもあり、リンパ系又は血流を通じて体の遠隔部位に転移し得る。
用語「治療する」、「治療すること」、及び「治療」は、本明細書で使用されるとき、疾患に関連する症状、合併症、病態又は生化学的指標の進行、発症、重症度又は再発を好転させ、軽減し、改善し、阻害し、又は減速させ若しくは予防する目的で対象に対して実施されるあらゆる種類の介入又は処理、又は対象への活性薬剤の投与を指す。予防とは、疾患が起こるのを防ぎ、又はそれが起こった場合に、その効果を最小限に抑えるための、疾患を有しない対象への投与を指す。
用語「有効用量」又は「有効投薬量」は、所望の効果を実現する又は少なくとも部分的に実現するのに十分な量として定義される。薬物又は治療用薬剤の「治療有効量」又は「治療有効投薬量」は、単独で、又は別の治療用薬剤と組み合わせて使用したときに、その薬物が、疾患症状の重症度の低下、無疾患症状期間の頻度及び期間の増加、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは身体障害の予防によって明らかになる疾患の退縮を促進する任意の量である。薬物の「予防有効量」又は「予防有効投薬量」は、疾患を発症するリスクがある、又は疾患の再発を被る対象に、単独で、又は別の治療用薬剤と組み合わせて投与したときに、その薬物が疾患の発症又は再発を阻害する量である。治療用又は予防用薬剤が疾患の退縮を促進し、又は疾患の発症若しくは再発を阻害する能力は、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性の予測指標となる動物モデル系において、又はインビトロアッセイで薬剤の活性をアッセイすることによるなど、当業者に公知の種々の方法を用いて判定することができる。
用語「患者」及び「対象」は、予防処置又は治療処置のいずれかを受ける任意のヒト又は非ヒト動物を指す。例えば、本明細書に記載される方法及び組成物を使用して、癌を有する対象を治療することができる。用語「非ヒト動物」には、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類など、哺乳類及び非哺乳類が含まれる。
実施例１ 抗ヒトＬＩＦモノクローナル抗体のスクリーニング及び同定
１．１ ハイブリドーマ法による抗ヒトＬＩＦモノクローナル抗体３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１の調製
モノクローナル抗体調製方法に従い（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５）、組換えヒトＬＩＦタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した）をＢＡＢＬ／ｃマウスの免疫化に使用した。２５μｇ組換えヒトＬＩＦタンパク質を等容積のフロイント完全アジュバントと共に使用して、背中への頻回皮下注射による初回免疫を行った。４週間後、フロイント不完全アジュバント＋２５μｇの組換えヒトＬＩＦタンパク質を使用して２回目の免疫化を行った。２０日後、インダイレクトＥＬＩＳＡ法を用いて抗体力価を検出した。２～３週間の間隔を置いた後、５０μｇの組換えヒトＬＩＦタンパク質を腹腔内注射して免疫を強化した。３日後、動物を犠牲死させて、融合用の脾臓細胞を取り出した。
対数増殖期のマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０を取り出してカウントし、免疫マウスの脾臓細胞懸濁液を調製した。５０％ＰＥＧを使用して従来方法に従い脾臓細胞をＳＰ２／０細胞と融合した。融合した細胞を栄養膜細胞（６週齢ＢＡＢＬ／ｃマウス腹膜マクロファージ）の９６ウェルプレートに加え、スクリーニングし、１％ＨＡＴ及び２０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中で培養した。クローンがプレートの底から３分の１にまで成長したところで、培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＬＩＦタンパク質によってコートし、インダイレクトＥＬＩＳＡ法を用いて培養上清中の抗ＬＩＦ抗体を検出し、抗ヒトＬＩＦ抗体を分泌するクローンをスクリーニングした。更に、高親和性抗ヒトＬＩＦモノクローナル抗体を安定に分泌する細胞株を限界希釈を用いたモノクローナル抗体化によって入手し、この分泌抗体を３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１と命名した。３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体の軽鎖及び重鎖をコードする完全長遺伝子配列は、それぞれ配列番号４２及び配列番号４４に示されるとおり決定され、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体の軽鎖及び重鎖の対応する完全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号４１及び配列番号４３に示された；３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする遺伝子配列は、それぞれ配列番号７６及び配列番号７７に示された；及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の対応するアミノ酸配列は、配列番号７４及び配列番号７５に示される。Ｋａｂａｔ方式によれば、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１に示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２に示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３に示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４に示され、及びＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４５に示され、及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６に示された。３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体の免疫グロブリンタイプ及びサブタイプを同定した（結果は、ＩｇＧ１サブタイプ、κタイプ軽鎖である）。
抗体を安定に分泌する能力のあるハイブリドーマ細胞株を入手した後、ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒのＣＤハイブリドーマ無血清培地によって細胞を順化させ、無血清懸濁液振盪培養に適合させて、次に抗体を発現させて、無血清培地を用いて精製した。
１．２ ファージディスプレイ技術による抗ヒトＬＩＦモノクローナル抗体Ｐ３６－０３３の調製
組換えヒトＬＩＦタンパク質をＢＡＢＬ／ｃマウスの免疫化に使用した。２５μｇ組換えヒトＬＩＦタンパク質を等容積のフロイント完全アジュバントと共に使用して、背中への頻回皮下注射による初回免疫を行った。４週間後、フロイント不完全アジュバント＋２５μｇの組換えヒトＬＩＦタンパク質を使用して２回目の免疫化を行う。２０日後、インダイレクトＥＬＩＳＡ法を用いて抗体力価を検出した。２～３週間の間隔を置いた後、５０μｇの組換えヒトＬＩＦタンパク質を腹腔内注射して免疫を強化した。３日後、動物を犠牲死させて、融合用の脾臓細胞を取り出した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＲＩＺＯＬ試薬を用いて脾臓細胞から全ＲＮＡを抽出し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃＤＮＡ逆転写キットを用いてｃＤＮＡに逆転写した。マウス軽鎖及び重鎖可変領域の変性プライマーによって抗体遺伝子を増幅し、ファージディスプレイベクターとなるように構築して、ファージ抗体ライブラリを構築した。熱式自動磁気ビーズ選別システムを使用してファージ抗体ライブラリの取捨選択を行い、ファージＥＬＩＳＡを用いて、組換えヒトＬＩＦタンパク質への結合能を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンを選択し、抗体の配列を決定した。更に、ＥＬＩＳＡ及び細胞生存率の同定によってＰ３６－０３３抗体を入手した。Ｐ３６－０３３軽鎖及び重鎖の完全長遺伝子配列は、それぞれ配列番号５５及び配列番号５７に示され、Ｐ３６－０３３抗体の軽鎖及び重鎖の対応する完全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５４及び配列番号５６に示される；Ｐ３６－０３３抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする遺伝子配列は、それぞれ配列番号７２及び配列番号７３に示され、Ｐ３６－０３３抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の対応するアミノ酸配列は、配列番号８２及び配列番号８３に示される。Ｋａｂａｔ方式によれば、Ｐ３６－０３３抗体のＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号６６に示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号６７に示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号６８に示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号６９に示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号７０に示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号７１に示される。
１．３ 陽性対照抗体５Ｄ８の発現及び精製
特許文献の国際公開第２０１８／１１５９６０ Ａ１号パンフレットの報告によれば、抗体５Ｄ８は、ＬＩＦタンパク質とＧＰ１３０との結合を阻害する抗体である。この特許文献によれば、この発明の複数の遺伝子配列が合成されており、種々の軽鎖及び重鎖が種々の組み合わせで対を成してヒトＩｇＧ１形態の完全長抗体が構築され、それらのうちＬＩＦタンパク質への結合が最良である１つが最終的に見出され、一方でそれは、細胞生存率の同定を通じて、ヒトＧＰ１３０との組換えヒトＬＩＦタンパク質の結合を遮断する能力及び組換えヒトＬＩＦタンパク質によるＨＣＴ１１６細胞のＳＴＡＴ３リン酸化を遮断する能力を有したため、従って、本発明はそれを、フォローアップ試験における陽性対照抗体として５Ｄ８と名付けた。５Ｄ８抗体の重鎖及び軽鎖をコードする完全長遺伝子配列は、それぞれ配列番号６３及び配列番号６５に示されるとおり決定され、５Ｄ８抗体の重鎖及び軽鎖の対応する完全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６２及び配列番号６４に示された；５Ｄ８抗体の可変領域をコードする遺伝子配列は、それぞれ配列番号８０及び配列番号８１に示されるとおり決定され、５Ｄ８抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７８及び配列番号７９に示される。
実施例２ ヒトＬＩＦタンパク質に対する抗ヒトＬＩＦ抗体の結合実験
組換えヒトＬＩＦタンパク質を１μｇ／ｍＬに希釈し、酵素標識プレートにコートし、１００μＬのタンパク質を各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。翌日、酵素標識プレートを取り出し、液体を廃棄し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡによって室温で１時間ブロックし、次にＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ヒトＬＩＦ抗体３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１、５Ｄ８及びＰ３６－０３３を種々の濃度で加え、室温で１時間インキュベートした。液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。プレートにＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦａｂ抗体又はヤギ抗ヒトＦＣ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。次に液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ発色溶液と共に室温で１０分間インキュベートした。２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより発色を停止させ、自動プレート光度計を用いて４５０ｎｍの吸光値を定量化する。この結果は図１に示した。これらの結果は、ヒトＬＩＦタンパク質に対する３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体及びＰ３６－０３３抗体の結合が、ヒトＬＩＦタンパク質に対する５Ｄ８抗体の結合よりも強いことを示している。
実施例３ マウスＬＩＦタンパク質に対する抗ヒトＬＩＦ抗体の結合実験
組換えマウスＬＩＦタンパク質（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した）を１μｇ／ｍＬに希釈し、酵素標識プレートにコートし、１００μＬのタンパク質を各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。翌日、酵素標識プレートを取り出し、液体を廃棄し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡによって室温で１時間ブロックし、次にＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ヒトＬＩＦ抗体３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１、５Ｄ８及びＰ３６－０３３を種々の濃度で加え、室温で１時間インキュベートした。液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。プレートにＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦａｂ抗体又はヤギ抗ヒトＦＣ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。次に液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ発色溶液と共に室温で１０分間インキュベートした。２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより発色を停止させ、自動プレート光度計を用いて４５０ｎｍの吸光値を定量化する。この結果は図２に示した。これらの結果は、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体がマウスＬＩＦタンパク質に対して結合活性を有さず、Ｐ３６－０３３抗体がマウスＬＩＦタンパク質に対して５Ｄ８抗体よりも低い結合活性を有することを示している。
実施例４ フィリピンカニクイザルＬＩＦタンパク質に対する抗ヒトＬＩＦ抗体の結合実験
組換えフィリピンカニクイザルＬＩＦタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した）を０．５μｇ／ｍＬに希釈し、酵素標識プレートにコートし、１００μＬのタンパク質を各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。翌日、酵素標識プレートを取り出し、液体を廃棄し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳ中２％ＢＳＡによって室温で１時間ブロックし、次にＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ヒトＬＩＦ抗体３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１、５Ｄ８及びＰ３６－０３３を種々の濃度で加え、室温で１時間インキュベートした。液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。プレートにＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦａｂ抗体又はヤギ抗ヒトＦＣ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。次に液体を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ発色溶液と共に室温で１０分間インキュベートした。２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより発色を停止させ、自動プレート光度計を用いて４５０ｎｍの吸光値を定量化する。この結果は図３に示した。これらの結果は、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１及びＰ３６－０３３の結合活性が５Ｄ８の結合活性よりも良好であることを示している。
実施例５ 抗ヒトＬＩＦ抗体の親和性アッセイ
組換えヒトＬＩＦタンパク質に対する精製モノクローナル抗体の親和性をＫｉｎＥｘＡ ４０００によって決定した。２００ｍｇ ＰＭＭＡ硬質ビーズを３０μｇの３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体と共に加え、更にコーティング溶液を１ｍＬになるまで加えた。緩衝液組成は、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％ＮａＮ３である。そしてビーズが溶液中に完全に懸濁されたことを確かめる。室温で２時間回転させた。ビーズを自然に沈降させるか、又は低速で素早く遠心した。上清を除去し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでビーズをブロックした。１５ｍＬの３００ｐＭ抗原溶液及び１５ｍＬの２４０ｐＭ Ａｂ２（３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１）溶液を調製した。０．６ｍＬの３００ｐＭ抗原及び０．６ｍＬの２４０ｐＭ抗体Ａｂ２（３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１）を異なる試料チューブに別々に入れた。これらの２本のチューブの試料を十分に混合して１本のチューブにまとめ、この時点で抗原の濃度は１５０ｐＭであり、抗体Ａｂ２（３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１）の濃度は１２０ｐＭであり、溶液をチューブホルダーの対応する位置に置いた。１６群を調製し、各群のインキュベーション時間は異なった。各群に１μｇ／Ｌｌストレプトアビジンタンパク質、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０溶液を加え、２４時間インキュベートするように設定した機械上で検出した。ＫｉｎＥｘａｔｍ Ｐｒｏソフトウェアにおいて、ｎ曲線解析についての平衡解離定数（Ｋｄ）を未知のリガンドモデルによって計算した。この結果は図４に示す。これらの結果は、ヒトＬＩＦタンパク質に対する３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂの親和性が４．５２×１０－１２Ｍであることを示している。
実施例６ Ｐ３６－０３３ ｍＡＢ及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂはヒトＬＩＦタンパク質への結合に関してＬＩＦＲと競合する
組換えヒトＬＩＦタンパク質を酵素標識プレートに１μｇ／ｍＬの濃度でコートし、０．６１２５μｇ／ｍＬの濃度のＬＩＦＲタンパク質（ヒトＦＣと融合発現させた）を加え（５０μＬ／ウェル）、同時に種々の濃度のＣＨＯ細胞によって組換え発現する抗ヒトＬＩＦ抗体３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１、Ｐ３６－０３３及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１Ｒ（配列番号４１及び４３）を別々に加え（５０μＬ／ウェル）、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦＣ二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ発色溶液を１０分間かけて加えた。酵素標識計測器を使用して４５０ｎｍの吸光値を定量化する。及びＯｒｉｇｉｎ ｐｒｏ ９ソフトウェアを用いてデータを分析し、プロットした。この結果は図５に示した。これらの結果は、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂ及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１がヒトＬＩＦによるヒトＬＩＦＲへの結合を阻害することができ、一方、Ｐ３６－０３３ ｍＡｂはヒトＬＩＦによるヒトＬＩＦＲへの結合を阻害できないことを示している。
実施例７ Ｐ３６－０３３ ｍＡＢ及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂはヒトＬＩＦタンパク質への結合に関してＧＰ１３０と競合する
組換えヒトＬＩＦタンパク質を酵素標識プレートに１μｇ／ｍＬの濃度でコートし、２０μｇ／ｍＬの濃度のＧＰ１３０タンパク質（ヒトＦＣと融合発現させた）を加え（５０μＬ／ウェル）、同時に種々の濃度の抗ヒトＬＩＦ抗体Ｐ３６－０３３及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１を別々に加え（５０μＬ／ウェル）、室温で２時間インキュベートした。同時に、抗体を加えてＧＰ１３０タンパク質を加えない対照ウェルをセットした。室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦＣ二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ発色溶液を１０分間かけて加えた。酵素標識計測器を使用して４５０ｎｍの吸光値を定量化する。及びＯｒｉｇｉｎ ｐｒｏ ９ソフトウェアを用いてデータを分析し、プロットした。この結果は図６に示した。これらの結果は、Ｐ３６－０３３及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１がヒトＬＩＦによるヒトＧＰ１３０タンパク質への結合を阻害できることを示している。
実施例８ ３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂの特異性の検出
ヒトＬＩＦ、ヒトＩＬ－６、ヒトＯＳＭ、ヒトＣＮＴＦ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した）を酵素標識プレートに１μｇ／ｍＬの濃度で別々にコートし、種々の濃度の抗ヒトＬＩＦ抗体３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１、Ｐ３６－０３３及び５Ｄ８を別々に加え、室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦＣ二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ発色溶液を加えて室温で１０分間発色させた。４５０ｎｍの吸光値を酵素標識計測器によって定量化する。及びＯｒｉｇｉｎ ｐｒｏ ９ソフトウェアを用いてデータを分析し、プロットした。この結果は図７に示した。これらの結果は、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂ及びＰ３６－０３３ ｍＡｂがヒトＬＩＦタンパク質にのみ結合し、ヒトＩＬ－６、ヒトＯＳＭ及びヒトＣＮＴＦには結合しなかったが、５Ｄ８抗体はヒトＯＳＭ及びヒトＣＮＴＦタンパク質に結合したことを示している。
実施例９ ヒトＬＩＦタンパク質についての３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂを使用することのできるウエスタンブロット検出
組換えヒトＬＩＦタンパク質を図８に示す濃度に希釈した。５×ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液と共に３日間培養したＣＴ２６及びＣ２６－ｈＬＩＦ細胞の細胞上清を１０分間煮沸した。１０μＬ試料を取り出してＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、次に電気泳動バンドをＰＶＤＦ膜に転写してウエスタンブロット検出を行った。検出に使用した一次抗体は１μｇ／ｍＬの濃度の３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体であり、室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴ緩衝液によって３回洗浄する。次に１：３０００希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体を加え、室温で２時間インキュベートし、室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴ緩衝液によって３回洗浄した。次に高感度化学発光溶液（Ｐｅｒｉｃｅ）と共にインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００超高感度多機能イメージング装置によって検出し、写真を撮った。この結果は図８に示した。これらの結果は、ヒトＬＩＦタンパク質のウエスタンブロット検出に３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂを使用できることを示している。
実施例１０ 抗ヒトＬＩＦ抗体細胞活性アッセイ
１０．１ ＨＣＴ１１６細胞におけるＳＴＡＴ３活性化の阻害の検出
ＨＣＴ１１６細胞を消化及び遠心し、次に細胞を再懸濁し、１２ウェルプレートに１ｍＬの容積中５×１０５細胞／ウェルで播いた。次に細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、元の培地を廃棄し、１００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＬＩＦタンパク質及び種々の濃度の抗ＬＩＦ抗体を含有する細胞培養培地を加えて３７℃で３０分間インキュベートし、同時に、組換えヒトＬＩＦタンパク質を含有しない、及び組換えヒトＬＩＦタンパク質のみを含有して抗体を含まない対照ウェルをセットした。次に培地を取り除き、１２ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ １×ライセートを加え、細胞を氷上で３０分間溶解させた。ライセートを１．５ｍＬ遠心チューブに移し、ライセートが入ったチューブを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。上清を取り出してＳＴＡＴ３のリン酸化のウエスタンブロット検出にかけた。結果は図９Ａ及び図１１に示した。これらの結果から、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体及びＰ３６－０３３抗体が、ヒトＬＩＦタンパク質によって誘導されたＨＣＴ１１６細胞のＳＴＡＴ３リン酸化を阻害できることが明らかになった。
１０．２ ＫＰ４細胞のＳＴＡＴ３活性化の阻害試験を通じた抗ヒトＬＩＦ抗体の活性の検出
ＫＰ４細胞を消化及び遠心し、細胞を再懸濁し、１２ウェルプレートに１ｍＬの容積中５×１０５細胞／ウェルで播いた。次に細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、元の培地を廃棄し、５０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＬＩＦタンパク質及び種々の濃度の抗ＬＩＦ抗体を含有する細胞培養培地を加えて３７℃で３０分間インキュベートし、同時に、組換えヒトＬＩＦタンパク質を含有しない、及び組換えヒトＬＩＦタンパク質のみを含有して抗体を含まない対照ウェルをセットした。次に培地を取り除き、１２ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ １×ライセートを加え、細胞を氷上で３０分間溶解させた。ライセートを１．５ｍＬ遠心チューブに移し、ライセートが入ったチューブを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。上清を取り出してＳＴＡＴ３のリン酸化のウエスタンブロット検出にかけた。結果は図９Ｂに示した。これは、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体が、ヒトＬＩＦタンパク質によって誘導されたＫＰ４細胞のＳＴＡＴ３リン酸化を阻害できることを示している。
１０．３ ＫＰ４細胞のＳＴＡＴ３活性化の阻害試験を通じた抗ヒトＬＩＦ抗体の活性の検出
ＫＰ４細胞を消化及び遠心し、細胞を再懸濁し、１２ウェルプレートに１ｍＬの容積中５×１０５細胞／ウェルで播いた。次に細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、元の培地を廃棄し、１：１の容積比の種々の濃度の抗ＬＩＦ抗体及びＣＴ２６－ｈＬＩＦ細胞の細胞培養培地を加え、３７℃で３０分間インキュベートし、同時に、ＣＴ２６の培養上清を含有する対照ウェルをセットした。次に培地を取り除き、細胞に１００μＬ １×ライセートを加え、細胞を氷上で３０分間溶解させた。ライセートを１．５ｍＬ遠心チューブに移し、ライセートが入ったチューブを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。上清を取り出してＳＴＡＴ３のリン酸化のウエスタンブロット検出にかけた。図１０は、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体が、ＣＴ２６－ｈＬＩＦ細胞によって分泌されるヒトＬＩＦタンパク質によって誘導されたＫＰ４細胞のＳＴＡＴ３リン酸化を阻害できることを示している。
１０．４ Ｍ１細胞増殖試験を通じたＬＩＦ抗体活性の検出
Ｍ１細胞を遠心し、ＲＰＭＩ１６４０培地によって２回洗浄し、Ｍ１細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬ細胞の容積中２×１０５細胞／ｍＬの密度で播いた。１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＬＩＦタンパク質及び種々の濃度の抗ＬＩＦ抗体を含有する細胞培養培地を、各ウェルの容積が最終的に２００μＬに達するまで加え、インキュベーターにおいて３７℃で７２時間インキュベートした。同時に、ヒトＬＩＦタンパク質を含まない対照ウェルをセットした。ＣＣＫ－８を加えて細胞増殖を測定した。この結果は図１２に示した。及びこれらの結果は、ｍＡｂ３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂ及びＰ３６－０３３ ｍＡｂが両方とも、ヒトＬＩＦタンパク質によって誘導されるＭ１細胞増殖の阻害を逆転させることができることを示している。
実施例１１ インビボでの抗ヒトＬＩＦ抗体の抗腫瘍活性の検出
ＥＬＩＳＡアッセイによると、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体はマウスＬＩＦタンパク質と交差反応しなかった。インビボでの活性判定を実施するためには、ヒトＬＩＦタンパク質を過剰発現するＣＴ２６細胞株を構築する必要があった。文献によれば、ヒトＬＩＦタンパク質は、マウス細胞の表面上のＬＩＦＲ及びＧＰ１３０に結合することができ、そのため下流シグナルを活性化させることができる。従って、ヒトＬＩＦタンパク質を高度に発現するＣＴ２６細胞によって分泌されるヒトＬＩＦタンパク質はマウスの免疫系を阻害することができ、抗ＬＩＦタンパク質が阻害効果を放ち、ひいては抗腫瘍効果を発揮することができると推測された。
１１．１ ヒトＬＩＦ－を過剰発現するＣＴ２６細胞株の構築
ヒトＬＩＦ遺伝子を含有する構築したレンチウイルスにマウス結腸癌細胞株ＣＴ２６を感染させた。４８時間後、ＬＩＦタンパク質の発現を検出した。細胞株を限界希釈法によってクローニングし、１μｇ／ｍＬの最終濃度のピューロマイシンを含む培地を加えて加圧スクリーニングにかけた。最終的に、ヒトＬＩＦタンパク質を安定且つ高度に発現するＣＴ２６細胞株が入手された。
１１．２ ＣＴ２６－ｈＬＩＦ ＢＡＢＬ／Ｃ皮下移植モデルによって検出される抗ヒトＬＩＦ抗体の抗腫瘍活性
１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０培地でＣＴ２６－ｈＬＩＦ細胞を培養し、対数増殖期の細胞を回収し、ＰＢＳに１０７細胞／ｍＬとなるように再懸濁し、ＢＡＢＬ／ｃマウスに皮下接種した。接種翌日、マウスを群分けし、それぞれ、媒体対照、抗ヒトＬＩＦ抗体を注射した。投与濃度は、１５ｍｇ／ｋｇ体重、週２回、４週間連続であり、腫瘍容積を週２回測定し、腫瘍成長曲線を描き、及び腫瘍阻害率を計算する。この結果は図１３に示した。これらの結果は、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂがＢＡＢＬ／ｃマウスにおけるＣＴ２６－ｈＬＩＦ細胞の増殖を阻害できることを示している。
１１．３ ＬＩＦタンパク質の刺激に対する種々の膵癌細胞株の感受性の測定
ヒト膵癌細胞株Ｐａｎｃ０２．０３、ＫＰ４、ＭＩＡ ｐａｃａ２を別々に６ウェルプレートに１０６細胞／ウェルの密度で接種した。一晩インキュベートした後に培地を新鮮培地に交換し、５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＬＩＦタンパク質及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体を加え、一方、ＬＩＦタンパク質を含まない対照ウェルをセットした。治療ウェル及び対照ウェルを３７℃で３０分間インキュベートした。次に培地を取り除き、各ウェルにつき２００μＬの細胞に２００μＬ １×ライセートを加え、細胞を氷上で３０分間溶解させた。ライセートを１．５ｍＬ遠心チューブに移し、ライセートが入ったチューブを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。上清を取り出してＳＴＡＴ３のリン酸化のウエスタンブロット検出にかけた。この結果は図１４に示した。これらの結果は、ＫＰ４細胞株がヒトＬＩＦタンパク質の刺激に対して最も高い感受性であったことを示している。
実施例１２ ３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡｂ抗体及びＰ３６－０３３ ｍＡｂの組換え発現及び妥当性確認
３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ ｍＡＢ及びＰ３６－０３３ ｍＡｂの軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子を同一の組換え技法によって真核生物発現ベクターＰＣＤＮＡ３．１＋に構築した。組換え抗体をＴｈｅｒｍｏのＥｘｐｉＣＨＯ発現システムによって発現させて、組換え抗体をプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製抗体のエンドトキシン除去は、Ｓｍａｒｔ－ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社によって製造されるエンドトキシン除去ビーズを使用して行う。具体的な実験方法については、実施例１０．２を参照した。図１５は、ＣＨＯ細胞によって組換え発現した３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体（３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１Ｒと表示される）が、ヒトＬＩＦタンパク質によって誘導されたＫＰ４細胞のＳＴＡＴ３リン酸化を阻害する能力を有することを示している。
実施例１３ ３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体によって認識されるエピトープの同定
予備実験により、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体（配列番号４１及び４３）がヒトＬＩＦタンパク質（配列番号５８）の表面上の線状エピトープを認識したことが確認された。この抗体はマウスＬＩＦタンパク質を認識することはできず、ヒトＬＩＦタンパク質及びヒトＬＩＦＲタンパク質の結合を遮断することができた。これらの３点によれば、種々のオンラインタンパク質線状エピトープ予測ソフトウェアの分析と合わせると、抗体の認識エピトープがＬＩＦタンパク質の１６０～２０２アミノ酸配列に位置すると推測されたため、本発明では、以下のヘテロ接合ＬＩＦタンパク質を合成した。Ｍｕｔ３（配列番号５９）は、ヒトＬＩＦタンパク質の１８２～２０２アミノ酸配列をマウスＬＩＦタンパク質のものに置き換えることであり、ｍｕｔ４（配列番号６０）は、ヒトＬＩＦタンパク質の１６６～２０２アミノ酸配列をマウスＬＩＦタンパク質のものに置き換えることである。ｍｕｔ３、ｍｕｔ４及び完全長ヒトＬＩＦタンパク質を含有するプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。３日間培養した後、２９３Ｔ細胞の培養上清を取り出してＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びウエスタンブロットにかけた。２９３Ｔ細胞の培養上清を陰性対照として使用し、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１を一次抗体として使用し、及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦａｂを二次抗体として使用した。同時に、Ｍ１細胞増殖実験を用いてハイブリッドタンパク質の活性を検出し、ハイブリッドタンパク質に対する３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１の中和活性を確かめた。同時に複数の対照ウェル群、ヒト組換えＬＩＦタンパク質（ｒｈＬＩＦ、Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕから購入、製品番号は、１４８９０－ＨＮＡＨである）を加える対照ウェル、ｒｈＬＩＦ及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１を加える対照ウェル、並びにｒｈＬＩＦ及びＬＩＦ抗体を加えない対照ウェルをセットアップした。これらの結果から、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体は変性した完全長ＬＩＦタンパク質及びｍｕｔ３タンパク質を認識することができたが、ｍｕｔ４タンパク質は認識できなかったことが示された（図１６Ａ）。このＭ１細胞増殖実験は、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体が完全長ＬＩＦタンパク質及びＭｕｔ３タンパク質によるＭ１細胞増殖の阻害を逆転させることができるが、Ｍｕｔ４タンパク質の阻害効果は逆転させることができないことを示している（図１６Ｂ）。要約すれば、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体の認識エピトープは、ヒトＬＩＦタンパク質の１６７～１８１アミノ酸配列に位置し、つまり、アミノ酸ＴＹＧＰＤＴＳＧＫＤＶＦＱＫＫ（配列番号６１）であった。
実施例１４ ヒト化ＬＩＦ抗体の設計及び発現精製
マウスを免疫して得られたモノクローナル抗体３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１をヒト化した。ヒト化は、標準的なＣＤＲグラフト法によって実施した。３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１ハイブリドーマから標準的な分子クローニング技術によって重鎖及び軽鎖領域をクローニングし、サンガー法によってシーケンシングした。次にヒト重鎖及び軽鎖可変配列に関してＢＬＡＳＴ検索を実施し、３つ又は４つの配列をヒト化用の受容フレームとして選択した。３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を３つの異なる重鎖受容フレーム（Ｈ１～Ｈ３）及び４つの異なる軽鎖フレーム（Ｌ１～Ｌ４）にクローニングし、一方、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１のＨＣＤＲ２（突然変異前のアミノ酸配列は配列番号４５に示されるとおり）を点突然変異させて（突然変異後のアミノ酸配列は配列番号５に示されるとおり）、重鎖定常領域にヒトＩｇＧ１アイソフォームを選択し、軽鎖定常領域にヒトκ鎖を選択した。ヒト化抗体重鎖及びヒト化抗体軽鎖の遺伝子を含有する発現ベクターを２９３Ｓ細胞にコトランスフェクトした。重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子配列、可変領域のアミノ酸配列、完全長遺伝子配列及び完全長アミノ酸配列を表１に示した。次に、２９３Ｓ細胞におけるこれらの１２個の異なる抗体の組み合わせの発現レベル、抗原結合能力及び熱安定性を調べた。３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１キメラ抗体（キメラ）を陽性対照として使用し、続くアッセイでは、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１キメラ抗体は全て、３８Ｅキメラ抗体又は３８Ｅキメラ（配列番号５２及び配列番号５０）と省略した。培地を回収し、そこでのＩｇＧの発現レベルをＧａｔｏｒ（Ｏｃｔｅｔと同様）で定量化し、ＥＬＩＳＡによって補正した。種々の組み合わせの抗原結合能力をＥＬＩＳＡによって比較した（表２、表３）。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
各ウェルを１００μＬの０．５μｇ／ｍｌ抗原でコートし、４℃で一晩インキュベートし、プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。プレートを２００μＬの封じ込め緩衝液（２％ウシ血清アルブミン）によって室温で６０分間封じ込めた。プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。各ウェルに種々の濃度の１００μＬの希釈抗ＬＩＦ抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で４回洗浄した。１：５０００希釈の１００μＬのＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で６回洗浄した。１００μＬのＨ２Ｏ２－Ａｍｐｌｘ発色溶液を加え、暗所条件下に室温で１０分間発色させた。ＯＤ４５０値を酵素マーカーにより読み取った。熱処理：発現培地をＰＣＲ機において７０℃で５分間加熱し、次に室温に急冷した。続くＥＬＩＳＡアッセイを上記のとおり実施する。
実施例１５ 精製ＩｇＧ試料による選択されたヒト化候補抗体の特徴付け
結合親和性、ヒト化率、抗体発現レベル及び熱安定性データに基づき、次の特徴付けステップに以下の５つの候補抗体：Ｈ１Ｌ１、Ｈ１Ｌ４、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ２、Ｈ３Ｌ４を選択し、これらの５つの候補抗体の番号を、３８Ｅ ＨｕＨ１Ｌ１（配列番号２５及び９）、３８Ｅ ＨｕＨ１Ｌ４（配列番号２５及び２１）、３８Ｅ ＨｕＨ２Ｌ４（配列番号２９及び２１）、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２（配列番号３３及び１３）、及び３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４（配列番号３３及び２１）と付け直した。次に選択されたＶＨ／ＶＬプラスミドを２９３Ｓ細胞にコトランスフェクトし、細胞培養上清を回収し、抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製した抗体を結合ＥＬＩＳＡ分析に使用して、ヒト化抗体の特異的結合能力を３８Ｅキメラ抗体と比較した。本発明はまた、その熱安定性及び非特異的結合を比較する幾つかの予備的分析も行った。これらの結果から、精製されている候補抗体と３８Ｅキメラ抗体とが極めて良く似た抗原結合特性を有したことが示された（図１７Ａ、図１７Ｃ）。７０℃で５分間処理した後、５つ全てのヒト化抗体が、キメラ抗体と同程度の結合能力を示した（図１７Ｂ、図１７Ｄ）。
実施例１６ ヒト化候補抗体の非特異的結合の判定
ＬＩＦ陰性ＨＥＫ２９３細胞ＦＡＣＳを予備的アッセイに用いることにより、抗体の潜在的な非特異的結合リスクを評価した。
ＨＥＫ２９３細胞をトリプシンで消化し、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、再懸濁し、１．５～２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度に調整し、９６ウェルＵ字型プレートに加えた。検出しようとする抗体の濃度を２０μｇ／ｍＬに調整し、次に合計８濃度が得られるように３倍勾配希釈を実施し、ブランク対照及び陰性対照（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ））をセットアップした。希釈した抗体及びブランク対照を９６ウェルプレート内の細胞に加え、各ウェルに１００μＬの抗体を加えた。細胞を４℃で１時間インキュベートし、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を慎重に廃棄し、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、最後に１％ＦＢＳを含有する２００μＬのＰＢＳで再懸濁し、最後に、１％ＦＢＳを含有する２００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー分析を実施した。ＨＥＫ２９３細胞の非特異的結合ＦＡＣＳアッセイでは、３８Ｅ ＨｕＨ１Ｌ１、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４、３８Ｅ ＨｕＨ１Ｌ４、３８Ｅキメラ抗体及び陰性対照（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ））が、ＨＥＫ２９３細胞に対して良く似た非特異的結合親和性を有した一方、３８Ｅ ＨｕＨ２Ｌ４は、ＨＥＫ２９３細胞に対してより高い非特異的結合親和性を有した（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。
実施例１７ 抗体純度のＣＥ－ＳＤＳ分析
ＣＥ－ＳＤＳ分析のワーキング濃度は１ｍｇ／ｍＬとし、抗体試料をローディング緩衝液で指定される濃度に希釈した。
非還元ＣＥ－ＳＤＳ電気泳動試料の調製：９５μＬの希釈した試料溶液を取り、５μＬの０．８Ｍアンモニウムヨード酢酸水溶液及び５μＬの内部参照を加え、ボルテックスし、十分に混合した。９５μＬのブランク対照を取り、５μＬの０．８Ｍアンモニウムヨード酢酸水溶液及び５μＬの内部参照を加え、ボルテックスし、十分に混合して、非還元ブランク対照とした。次に金属浴中７０℃で５分間加熱し、室温に冷却し、６０００ｒｐｍで１分間遠心した。
還元試料溶液の調製：９５μＬの希釈した試料溶液を取り、５μＬの２－メルカプトエタノール溶液及び５μＬの内部参照を加え、ボルテックスし、十分に混合した。９５μＬのブランク対照を取り、５μＬの２－メルカプトエタノール溶液及び５μＬの内部参照を加え、ボルテックスし、十分に混合して、還元ブランク対照とした。次に金属浴中７０℃で１５分間加熱し、室温に冷却し、６０００ｒｐｍで１分間遠心した。
試料分析：７５μＬの試料を試験管に加え、その試験管をビーカーに置いた。ビーカーを注入トレーに慎重に挿入し、３０秒の還元試料注入時間及び４０秒の非還元試料注入時間、２０℃のキャピラリー温度、２０℃の試料温度、１５ＫＶの集束電圧、４０分の集束時間で試験プログラムを走らせ、２１４ｎｍのＰＤＡ検出器でデータを収集した。ＣＥ結果を表４、表５に示す。
実施例１８ 示差走査蛍光（ＤＳＦ）／静的光散乱（ＳＬＳ）技法による熱安定性分析
試料をＵＮｃｌｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）にかけて分析した。ＤＳＦ及びＳＬＳに関して２５℃～９５℃の温度範囲を１℃／分でモニタした。ＵＮｃｌｅは、２６６ｎｍ及び４７３ｎｍでＳＬＳを測定した。ＵＮｃｌｅ分析ソフトウェアを用いてＴｍ及びＴａｇｇを計算し、分析した。
ＩｇＧは、多構造ドメインであり、各々がその独自の融解温度（Ｔｍ）を有する。ＣＨ２構造ドメインは、典型的にはＰＢＳ中で約７０℃のＴｍであり、ＣＨ３は約８０℃のＴｍで、安定性がより高い。Ｆａｂは、可変配列が多くあるため、約５０～８５℃のより幅広い範囲のＴｍを有する。従って、様々な分析技法によって測定されるＴｍ値は、通常は、各構造ドメインの真のＴｍ値というより、むしろ「見かけの」転移温度である。このＤＳＦ分析であっても、２つ以上のＴｍ値が生じ得ることは明らかであり、治療用抗体の熱安定性はＴｍ１のみを用いて判定される。Ｔａｇｇは、ＳＬＳが凝集を検出し始める温度である。Ｔａｇｇ２６６は２６６ｎｍでＳＬＳを測定し、これは感度がより高く、小型の凝集粒子の検出に一層好適である。Ｔａｇｇ４７３は４７３ｎｍでＳＬＳを測定し、これは大型粒子の検出に一層好適である。
表６に示されるとおり、３つのヒト化候補抗体の全てが、３８Ｅキメラ抗体と比べると融解温度（Ｔｍ１）が高く、凝集リスクが低い。
実施例１９ 動的光散乱技法（ＤＬＳ）を用いた抗体の凝集傾向の分析
ＵＮｃｌｅシステム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）でＤＬＳを実施した。ＤＬＳは２５℃で測定した。データはＵＮｃｌｅ分析ソフトウェアを用いて計算し、分析した。動的光散乱（ＤＬＳ）は、抗体試料の凝集の検出に用いられる。「モード径」はタンパク質粒子の直径を指し、「質量百分率」は各粒径画分の割合を指す。「ＰＤＩ」は多分散性指数を指し、この指数が高いほど、多分散性の高い試料となる。ＰＤＩが０．２５以下の場合、その試料は単分散と見なすことができる。表７に示されるとおり、４つの抗体試料の全てが主「ピーク」（９９％を超える質量分率）を有し、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４はキメラ抗体よりも良好なＰＤＩを有し、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２はキメラ抗体と同程度であり、及び３８Ｅ ＨｕＨ１Ｌ１はキメラ抗体よりも悪いＰＤＩを有した。
実施例２０ 抗体親和性アッセイ
ヒトＬＩＦタンパク質に対する抗ＬＩＦ抗体の親和性をＧａｔｏｒを用いて決定した。初めに抗ヒトＬＩＦ抗体をＰＢＳで５ｕｇ／ｍＬに希釈し、次に９６ウェルプレートの２列目のＡ～Ｆウェルに加えた（各ウェル２００μＬ）。ヒトＬＩＦタンパク質濃度をＰＢＳでそれぞれ１００、５０、２５、１２．５及び６．２５μｇ／ｍＬに勾配希釈し、希釈したＬＩＦタンパク質を９６ウェルプレートの４列目のウェルＡ～Ｅウェルに加え（各ウェル１００μＬ）、Ｆウェルにブランク対照としてＰＢＳを加えた。１列目及び３列目のＡ～ＦウェルにＰＢＳを加えた（各ウェル２００μＬ）。９６ウェルプレートを機器に入れ、抗ヒトＦｃバイオセンサーで検出した。結果は表８に示し、ここでは３つのヒト化抗体の親和性がキメラ抗体に近いことが示された。
実施例２１ ヒト化抗体及び３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体の発現精製
ヒト化抗体３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２及び３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４の軽鎖及び重鎖の可変領域をマウス抗体の定常領域（重鎖の定常領域はマウスＩｇＧ１であり、軽鎖の定常領域はκ鎖であった）と連結し、それぞれＰＣＤＮＡ．３．４ベクターにクローニングし、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２－ｍ（３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２－ｍ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする完全長遺伝子配列は、それぞれ配列番号３６及び配列番号３８に示される；３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２－ｍ抗体の重鎖及び軽鎖の対応する完全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３５及び配列番号３７に示される）及び３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４－ｍ（重鎖及び軽鎖の完全長遺伝子配列は、それぞれ配列番号３６及び配列番号４０に示され、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４－ｍ抗体の重鎖及び軽鎖の対応する完全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３５及び配列番号３９に示される）と命名した。遺伝子トランスフェクション及び抗体発現をｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒのＥｘｐｉ ＣＨＯ発現キットを使用して実施した。細胞培養上清を回収し、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して抗体を精製した。精製した抗体を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ限外ろ過チューブを使用した限外ろ過によって交換し、最後に抗体をｐＨ７．４のＰＢＳに溶解させた。３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体もまた、同じように発現させて、精製した。
実施例２２ ヒト化抗ＬＩＦ抗体はヒトＬＩＦタンパク質への結合に関してＬＩＦＲと競合する
酵素標識プレートに組換えヒトＬＩＦタンパク質を１μｇ／ｍＬの濃度でコートし、０．６１２５μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬ／ウェルの組換えヒトＬＩＦＲタンパク質（ヒトＦｃと融合発現したもの、ＡＣＲＯから購入、品目番号：ＬＩＲ－Ｈ４２５２）を加え、一方で、種々の濃度の１００μＬ／ウェルの種々のＬＩＦ抗体３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２－ｍ（配列番号３５及び３７）、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４－ｍ（配列番号３５及び３９）、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１（配列番号４１及び４３）、Ｐ３６－０３３（配列番号５４及び５６）を加えた。抗ＣＤ３抗体を陰性対照として使用した（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入、番号３１７３２６）。プレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を加え、プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ発色溶液を加え、室温で１０分間発色させた。４５０ｎｍの吸光値を酵素マーカーにより読み取った。データは、Ｏｒｉｇｉｎ ｐｒｏ ９ソフトウェアを使用して分析し、プロットした。結果は図１９に詳述した。これらの結果から、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２－ｍ、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４－ｍが組換えヒトＬＩＦによるヒトＬＩＦＲへの結合を、それぞれ、０．０７４μｇ／ｍｌ、０．１４５μｇ／ｍｌ及び０．１０３μｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害可能であったことが示された。Ｐ３６－０３３は阻害効果が弱く、陰性対照抗ＣＤ３抗体は、組換えヒトＬＩＦによるヒトＬＩＦＲへの結合を阻害することができなかった。
実施例２３ ヒト化抗ＬＩＦ抗体はヒトＬＩＦタンパク質への結合に関してＧＰ１３０と競合しない
酵素標識プレートに組換えヒトＬＩＦタンパク質を１μｇ／ｍＬの濃度でコートし、１２μｇ／ｍＬの濃度の５０μＬ／ウェルの組換えヒトＧＰ１３０タンパク質（ヒトＦｃと融合発現したもの、Ｙｉｊｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕから購入、品目番号：１０９７４－Ｈ０３Ｈ）を加え、一方で、種々の濃度の１００μＬ／ウェルのＬＩＦ抗体３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２－ｍ（（配列番号３５及び３７）、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４－ｍ（配列番号３５及び３９）及びＰ３６－０３３（配列番号５６及び５４）を加え、抗ＣＤ２８抗体を陰性対照とした（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入、品目番号３０２９１４）。プレートを室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ発色溶液を加え、室温で１０分間発色させた。４５０ｎｍの吸光値を酵素マーカーにより読み取った。データは、Ｏｒｉｇｉｎ ｐｒｏ ９ソフトウェアを使用して分析し、プロットした。結果は図２０に詳述した。これらの結果から、ヒト化抗体３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ２－ｍ、３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４－ｍ及び抗ＣＤ２８抗体の陰性対照抗体が組換えヒトＬＩＦによるヒトＧＰ１３０タンパク質への結合を阻害しなかったこと、及びＰ３６－０３３が組換えヒトＬＩＦによるヒトＧＰ１３０タンパク質への結合を阻害できたことが示された。
実施例２４ ヒト化抗ＬＩＦ抗体の抗原認識特異性アッセイ
酵素標識プレートに、ヒトＬＩＦ、ヒトＩＬ－６、ヒトＯＳＭ及びヒトＣＮＴＦ（４つのタンパク質は、いずれもＹｉｊｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕから購入した、それぞれ品目番号１４８９０－ＨＮＡＨ；１０３９５－ＨＮＡＥ；１０４５２－ＨＮＡＨ；１１８４１－Ｈ０７Ｅ）を１μｇ／ｍＬの濃度でコートし、種々の濃度のＬＩＦ抗体３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１、３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ２－ｍ、３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ４－ｍを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦａｂ二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＴＭＢ発色溶液を加え、室温で１０分間発色させた。４５０ｎｍの吸光値を酵素マーカー（ｍａｋｅｒ）により読み取った。データは、Ｏｒｉｇｉｎ ｐｒｏ ９ソフトウェアを使用して分析し、プロットした。この結果は図２１に示した。この結果は、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１、３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ２－ｍ及び３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ４－ｍ抗体がヒトＬＩＦタンパク質にのみ結合し、しかしヒトＩＬ－６、ＯＳＭ及びＣＮＴＦには結合しないことを示している。
実施例２５ ヒト化抗ＬＩＦ抗体によって認識されるエピトープの同定
本発明では、前出の実験において、３８Ｅ１０Ｅ１Ｃ１１抗体がＬＩＦタンパク質の線状エピトープを認識することが見出されたため、従って３８Ｅヒト化抗体がなおもＬＩＦタンパク質の線状エピトープを認識するかどうかを初めに確かめる必要があった。ヒトＬＩＦ完全長遺伝子配列、Ｍｕｔ３及びＭｕｔ４タンパク質配列をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の３日間培養した後の上清、及び２９３Ｔ細胞培養上清の陰性対照を取り、５×ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液を加え、１０分間煮沸した。次に１０μＬの試料を取ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、次に電気泳動バンドをＰＶＤＦ膜に転写してウエスタンブロット検出を行った。検出用の一次抗体は１μｇ／ｍＬの濃度の３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ２又は３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ４抗体であり、室温で２時間インキュベートした。次にＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、１：３０００の希釈比で希釈したＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトＦｃ二次抗体を加え、二次抗体と共に室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、高感度化学発光溶液（Ｐｅｒｉｃｅ、品目番号３４０７９）を加え、インキュベートした。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６００超高感度多機能イメージング装置を使用して検出し、写真を撮った。結果は図２２Ａに示した。この結果は、両方のヒト化抗体とも、変性ヒトＬＩＦタンパク質及びＭｕｔ３タンパク質を認識することができたが、Ｍｕｔ４タンパク質は認識しなかったことを示している。Ｍ１細胞増殖アッセイでも同じ結果が得られ、この結果は図２２Ｂに詳述した。従って、３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ２及び３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ４抗体によって認識されるエピトープ配列は、ＴＹＧＰＤＴＳＧＫＤＶＦＱＫＫ（配列番号６１）であると決定された。
実施例２６ ＫＰ４細胞のＳＴＡＴ３活性化阻害アッセイによるヒト化抗ＬＩＦ抗体活性の検出
ＫＰ４細胞を消化及び遠心した後、細胞を再懸濁し、１２ウェルプレートに１ｍＬ、５×１０５細胞／ウェルで播いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、元の培地を廃棄し、５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＬＩＦタンパク質及び種々の濃度の抗ＬＩＦヒト化抗体を含有する細胞培地をそれぞれ加えた。組換えヒトＬＩＦタンパク質を含まない、及び組換えヒトＬＩＦタンパク質のみを含んで抗体を含まない対照ウェルをセットアップし、プレートを３７℃のインキュベーターで３０分間インキュベートした。次に培地を取り除き、各ウェルに１００μＬの１×細胞溶解溶液を加え、この混合物を氷上で３０分間溶解させた。ライセートを１．５ｍＬ遠心チューブに移し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収した。上清を取り出してウエスタンブロット検出にかけ、ＳＴＡＴ３のリン酸化を検出した。これらの結果から、ヒト化抗体３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ４及び３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ２が、ＬＩＦタンパク質の誘導によるＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害可能であったことが示された（図２３）。
実施例２７ Ｍ１細胞増殖アッセイによるヒト化抗ＬＩＦ抗体の活性の検出
Ｍ１の遠心後、ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、２．５×１０５細胞／ｍＬの密度で９６ウェルプレートを接種した。各ウェルに８０μＬの細胞を接種し、４ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＬＩＦタンパク質及び種々の濃度の抗ＬＩＦ抗体を含有する培地を加えることにより、各ウェルの最終容積を１６０μＬにした。一方でＬＩＦを含まない対照ウェルをセットアップし、３７℃で７２時間インキュベートし、ＣＣＫ－８を加えることによって増殖を検出した。結果は図２４に詳述した。この結果は、ヒト化抗体３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ４－ｍ及び３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ２－ｍの両方とも、それぞれ６．５２μｇ／ｍＬ及び８．９３μｇ／ｍＬのＥＣ５０でヒトＬＩＦタンパク質によるＭ１細胞の増殖阻害を逆転させることが可能であったことを示している。
実施例２８：ＬＩＦ抗体によるＬＩＦ誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化の阻害効果
１００，０００個のＫＰ４細胞を９６ウェルプレートに接種した；勾配希釈したＬＩＦ抗体を２０～１００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦタンパク質と共に室温で０．５～１時間インキュベートして、ＬＩＦ－Ａｂ混合物を形成した。細胞ウェルにＬＩＦ－Ａｂ混合物を加え、３７℃で５～３０分間刺激した。Ｐ－ＳＴＡＴ３（ＴＹＲ７０５）ＫＩＴＳ（Ｃｉｓｂｉｏ）及び全ＳＴＡＴ３ ＫＩＴＳ（Ｃｉｓｂｉｏ）の指示に従いＰ－ＳＴＡＴ３及び全ＳＴＡＴ３タンパク質発現レベルを検出すること。各ウェルについてドナー及びアクセプターの発光シグナル比を計算した：比＝シグナル６６５ｎｍ／シグナル６２０ｎｍ×１０４。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータグラフを作成し、ＬＩＦ抗体の阻害率をカウントした。これらの結果から、ＬＩＦ抗体３８Ｅ ＨｕＨ３Ｌ４が、図２５に示されるとおり、ＬＩＦによって誘導されたＳＴＡＴ３リン酸化のリン酸化の阻害効果を有し、ＩＣ５０は３．４１５ｎＭであったことが示された。
実施例２９：ＬＩＦ抗体のＡＤＣＣ活性の検出
ＬＩＦはＧＰ１３０及びＬＩＦＲに結合する一方、ヒト化ＬＩＦ抗体はＬＩＦによるＬＩＦＲへの結合を遮断するが、ＬＩＦによるＧＰ１３０への結合は遮断しない。ヒト化ＬＩＦ抗体がＬＩＦによって媒介されて細胞表面に結合し、ひいてはＡＤＣＣが働くかどうかを検出すること。抗体アービタックス（Ｅｐｉｄｕｏ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ、陽性対照）及びヒトＩｇＧ２（カタログ番号ＨＧ２Ｋ、Ｓｉｎｏ、陰性対照）をＡＤＣＣ緩衝液（ＲＰＭＩ－１６４０＋１％ＦＢＳ）で順次希釈した；次にＬＩＦタンパク質を含有するＡＤＣＣ緩衝液で３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ４抗体をトリプリケート及び８点勾配で希釈し、取りのけておいた。ＤＬＤ－１細胞をトリプシン（カタログ番号２５２０００７２、ＧＩＢＣＯ）で消化し、反応の終了後、細胞をブローしてばらばらにし、遠心チューブに回収し、１５００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を廃棄し、細胞をＡＤＣＣ緩衝液で再懸濁してカウントした。細胞濃度を調整し、取りのけておいた。ＰＢＭＣ細胞（カタログ番号ＳＬＢ－ＨＰ０１０Ｂ、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＳＡＩＬＹＢＩＯ Ｌｔｄ．）を蘇生し、１０ｍＬのＡＤＣＣ緩衝液を加え、２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を廃棄した。ＰＢＭＣ細胞をＡＤＣＣ緩衝液に再懸濁してカウントした。細胞濃度を調整し、取りのけておいた；及び９６ウェルＵ字底細胞培養プレートを取り出し、５０μｌの標的細胞ＤＬＤ－１、５０μｌの抗体、及び５０μｌのＰＢＭＣエフェクター細胞を順番に加えた。ＰＢＭＣエフェクター細胞と標的細胞の比は３０：１であった。反応を５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で６時間行った。Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ９６非放射性細胞傷害性アッセイキット（カタログ番号Ｇ１７８０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＬＤＨを検出し、吸光度値を４９０ｎｍで酵素マーカーを用いて測定した。
全ての実験ウェル、標的細胞ＬＤＨ自然発光ウェル（ＴＣＲ）、及びエフェクター細胞ＬＤＨ自然発光ウェル（ＥＣＲ）の平均吸光度値をブランク培地（ＣＭＢ）の平均吸光度値から差し引くようにして、各並行ウェルの平均吸光度値を計算した。標的細胞ＬＤＨ最大発光ウェル（ＴＣＭ）の平均吸光度値を容積補正対照ウェル（ＶＣＣ）の平均吸光度値から差し引いた。各抗体濃度から、上記の補正値を用いて以下の式に従い細胞傷害性（％）を計算した。
細胞傷害性（％）＝（Ａ－Ｂ－Ｃ）／（Ｄ－Ｃ）×１００％
Ａ：実験ウェルの補正後の平均吸光度値
Ｂ：補正後エフェクター細胞ＬＤＨ自然発光ウェルの平均吸光度値
Ｃ：補正後標的細胞ＬＤＨ自然発光ウェルの平均吸光度値
Ｄ：標的細胞の補正後ＬＤＨ最大発光ポアの平均吸光度値
図２６に示すとおり、３８Ｅ ｈｕＨ３Ｌ４抗体はＡＤＣＣ活性を有しなかった。
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Claims (29)

  1. ａ）配列番号７によって表される軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号２３によって表される重鎖可変領域（ＶＨ）；又は
    ｂ）配列番号１１によって表される軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１によって表される重鎖可変領域（ＶＨ）；又は
    ｃ）配列番号１９によって表される軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び配列番号３１によって表される重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ＬＩＦタンパク質に結合する単離抗体又はその抗原結合断片。
  2. 前記単離抗体が、ＩｇＧである、請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記単離抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４である、請求項１又は２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記単離抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト改変抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、Ｆｖ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ又はＦ（ａｂ’）2である、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  5. 白血病抑制因子（ＬＩＦ）アンタゴニストである、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  6. ＬＩＦの発現の阻害能及び／又はＬＩＦの活性の遮断能を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  7. ＬＩＦへの結合に関する競合能又は交差競合能を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子を含むヌクレオチド組成物。
  9. １）配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
    ２）配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；又は
    ３）配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
    を含む、請求項８に記載のヌクレオチド組成物。
  10. １）配列番号７のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡが、配列番号８として示される、
    ２）配列番号１１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡが、配列番号１２として示される、
    ３）配列番号１９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするＤＮＡが、配列番号２０として示される、
    ４）配列番号２３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡが、配列番号２４として示される、及び／又は
    ５）配列番号３１のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするＤＮＡが、配列番号３２として示される、請求項９に記載のヌクレオチド組成物。
  11. １）配列番号９のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；
    ２）配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子；又は
    ３）配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡを含む第１の核酸分子及び配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡを含む第２の核酸分子
    を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載のヌクレオチド組成物。
  12. １）配列番号１３のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡが、配列番号１４として示される、
    ２）配列番号２１のアミノ酸配列によって表されるとおりの軽鎖をコードするＤＮＡが、配列番号２２として示される、
    ３）配列番号２５のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡが、配列番号２６として示される、及び／又は
    ４）配列番号３３のアミノ酸配列によって表されるとおりの重鎖をコードするＤＮＡが、配列番号３４として示される、
    、請求項１１に記載のヌクレオチド組成物。
  13. 請求項８～１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド組成物を含む、ベクター。
  14. 真核生物発現ベクター、原核生物発現ベクター又はウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
  15. 請求項１３又は１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
  16. 前記ベクターを含む前記宿主細胞が、ベクター形質転換によって入手される、請求項１５に記載の宿主細胞。
  17. 細菌、酵母又は哺乳類細胞である、請求項１５又は１６に記載の宿主細胞。
  18. 大腸菌、ピキア酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はヒト胎児腎臓２９３細胞である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  19. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の宿主細胞において前記抗体又はその抗原結合断片を発現させること、及び前記抗体又はその抗原結合断片を単離することを含む、方法。
  20. 治療有効量の請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
  21. 生体試料中のＬＩＦを検出するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片を含む試薬。
  22. 前記生体試料が、異常なＬＩＦレベルを有する疑いがある血液、血清、尿、生検材料、腫瘍、又は任意の組織である、請求項２１に記載の試薬。
  23. ＬＩＦの発現を阻害するために、及び／又はＬＩＦの活性を遮断するために使用される医薬品の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片、及び／又は請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
  24. 生体試料中のＬＩＦを検出するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、（ｉ）対象から得られた組織又は体液試料を請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片又は請求項２１又は２２に記載の試薬に曝露すること；及び（ｉｉ）（ｉ）の前記組織又は体液試料へのＬＩＦ結合を対照試料へのＬＩＦ結合と比較することであって、ここで前記対照試料と比較したＬＩＦ結合量の増加が、ＬＩＦの産生、発現又は活性化レベルの異常を示すことを含む、方法。
  25. 前記組織又は体液試料が、異常なＬＩＦレベルを有する疑いがある血液、血清、尿、生検材料、腫瘍、又は任意の組織を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. ＬＩＦに関連する疾患又は病態を治療するための医薬品の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片、及び／又は請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
  27. ＬＩＦに関連する前記疾患又は病態が、腫瘍である、請求項２６に記載の使用。
  28. 前記腫瘍が、固形腫瘍である、請求項２７に記載の使用。
  29. 前記固形腫瘍が、膠芽腫、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膵癌又は前立腺癌を含む、請求項２８に記載の使用。
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