KR20200130363A - 재조합 단일 쇄 면역글로불린 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL), 면역글로불린 경쇄 불변 영역(CL), 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH), 및 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하는 항체, 및 치료 또는 진단 목적을 위한 이의 용도에 관한 것이며, 여기서 VH는 PL1을 통해 VL에 융합되고 CL는 PL2를 통해 CH에 융합된다. 본 발명은 또한 상기 항체를 암호화하는 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포, 형질도입 유기체 또는 상기 재조합 핵산 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
Description
발명의 분야
본 발명은 의약 분야, 특히 의도적으로 B-세포 특이성을 재-가공(re-engineer)하기 위해 록(lock)을 파괴시킬 수 있는 면역글로불린의 새로운 구조에 관한 것이다.
발명의 배경
암 치료요법은 면역치료요법, 세포 치료요법 및 유전자 치료요법 둘 모두의 측면에서 다수 발전된 매우 활성인 분야이다. 종양-특이적인 항원을 표적화하는 항체 또는 면역 체크포인트(immune checkpoint)는 많은 종양 유형의 예후를 완벽하게 변경시켜, 장기간 차도를 수득하였고 궁극적으로 불치 질환을 면역계에 의한 조절 하에서 거의 만성 질환으로 변경시켰다.
따라서 항체 분자가 암에 대해 주요한 도구가 되었지만, 이러한 약물을 생산하는 세포는 여전히 생명공학적 조작 및 세포 치료요법을 위한 사용에 접근불가능하게 남아있다. 몇개의 보고서는 혈장 세포에 의해, 그러나 단지 단기간 동안 및 실험실 설정으로 재조합 단백질(특히 응고 인자)의 생산을 이미 수득하였다(Hung et al., 2018. Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther., 26, 456-467; Levy et al. 2016. J. Thromb. Haemost. JTH, 14, 2478?-2492). 의도적으로 B-세포 특이성을 재가공하여 종양-특이적인 B-세포를 생성하는 것이 매우 흥미로움이 명백할 수 있지만, 이는 2개의 생화학적 록에 의해 제한된다.
우선, 면역글로불린은 화학량론적 발현을 필요로 하고 2개의 재조합 단백질이 정확한 Ig 생산을 위해 동시 발현되는 것을 필요로 하는 H-L 중합체이다. 둘째로, B 세포는 다량의 내인성 Ig를 강력하게 발현한다. 따라서, Hr 및 Lr 분자를 이미 발현하는 수용체(r) 세포 내에서, 추가의 공여체(d) Hd 및 Ld 쇄의 단순한 첨가(및 궁극적으로 불량한 발현)은 하이브리드 분자(HrLr, HrLd, HdLr 및 HdLd...)의 혼합물을 생성하며, 이들 중에서 바람직한 공여체-유사 특이성을 지닌 정확하게 조립된 HL 쇄의 양은 잘 예측될 수 없다.
발명의 요약
제1 양태에서, 본 발명은
- 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 서열,
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 서열,
- 경쇄 불변 영역(CL)을 암호화하는 서열,
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이며,
여기서 핵산 분자는 다음의 구조를 포함하고:
VH-PL1-VL-CL-PL2,
여기서,
PL1 및 PL2는 동일하거나 상이하다.
재조합 핵산 분자는 공여체 스플라이스 부위(donor splice site)를 추가로 포함할 수 있고 다음의 구조 VH-PL1-VL-CL-PL2-공여체 스플라이스 부위를 나타낼 수 있다.
대안적으로, 재조합 핵산 분자는
- 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 서열,
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 서열,
- 경쇄 불변 영역(CL)을 암호화하는 서열,
- 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH)을 암호화하는 서열, 및
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함할 수 있고,
여기서 핵산 분자는 다음의 구조를 포함한다:
VH-PL1-VL-CL-PL2-CH
여기서 PL1 및 PL2는 동일하거나 상이하다.
바람직하게는, 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 암호화하는 서열은 3 또는 4개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 암호화한다.
재조합 핵산 분자는 정밀한 위치에서 동종 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내, 바람직하게는 면역글로불린 중 유전자자리(immunoglobulin heavy lucus), 보다 바람직하게는 연결 영역(JH) 유전자와 면역글로불린 중쇄의 불변 영역(CH) 유전자 사이 내로 상기 핵산 분자의 통합을 지시하기 위한 추가의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 공여체 스플라이스 부위는 불변 면역글로불린 중 유전자의 CH1 도메인과 접합시키기 위한 공여체 스플라이스 부위이다.
바람직하게는, 펩타이드 링커는 10 내지 25개 아미노산 길이, 바람직하게는 15 내지 20개 아미노산 길이이다.
다른 양태에서, 본 발명은 조절 서열(control sequence)과 혼용성(compatible)인 조건 하에서 적합한 숙주 세포 내에서 상기 핵산의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트(expression cassette)에 관한 것이다.
특히, 재조합 핵산 분자는 면역글로불린 VH 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
벡터는 바람직하게는 바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 및 심지어 보다 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이다.
바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 바람직하게는 AAV6 벡터이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다.
바람직하게는, 세포는 마우스 배아 줄기 세포이다.
대안적으로, 세포는 B 세포, 바람직하게는 사람 B 세포이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 세포를 포함하는, 사람을 제외한 형질도입 유기체에 관한 것이며, 바람직하게는 상기 형질도입 유기체는 마우스이다.
다른 양태에서, 본 발명은
- 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH),
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL),
- 면역글로불린 경쇄 불변 영역(CL),
- 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH), 및
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하는 항체에 관한 것이며,
여기서 VH는 PL1을 통해 VL에 융합되고 CL은 PL2를 통해 CH에 융합되며, 여기서 PL1 및 PL2는 동일하거나 상이하다.
본 발명은 또한 상기 항체를 발현하는 본 발명의 세포 또는 형질도입 유기체를 제공는 단계, 및 세포 배양물로부터 또는 상기 유기체의 샘플로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 세포 또는 항체, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
도 1: 면역글로불린 G1 부류(좌측, 선행 기술) 및 본 발명의 전체 길이의 단일 쇄 Ig G1 유형(우측)을 나타내는 개략도. 천연의 IgG1과 비교하여, 중 가변 도메인이 펩타이드 링커에 의해 중 가변 도메인의 C 말단으로부터 경쇄 가변 도메인의 N-말단까지 경쇄 가변 도메인에 연결되어 있다. 경 불변 도메인의 C-말단 부분은 다른 펩타이드 링커에 의해 N-말단 중 불변 도메인에 부착되어 있다.
도 2: 리툭시맙의 VDJ 서열은 위트로우(Whitlow) 218 링커에 의해 VJ 서열에 연결되었다. 전사를 최적화시키기 위해, 인트론 구조(intronic structure)를 가변 중 도메인을 암호화하는 제1 엑손과 제2 엑손 사이에 보존시켰다. 불변 카파 서열은 동일한 위트로우 218 링커에 의해 불변 중쇄에 연결시켰다. 이러한 서열의 합성은 Genecust Company로부터 주문되어, pCDNA3.1 (+) 벡터 내로 삽입되었다.
도 3: 형질감염된 CHO 또는 HEK 293 세포주의 상층액을 ELISA 방법으로 분석하였다. 상층액 속의 IgG 분자를 96 플레이트 상에 코팅된 항-Fc 폴리클로날 항체에 의해 트랩(trap)시켰다. 검출은 HRP-커플링된 항-IgG(H+L) 폴리클로날 항체의 첨가로 실현시켰다. IgG1 재조합 단백질은 양성 대조군으로 사용한 반면 음성 대조군은 IgM-부류 재조합 분자이었다.
도 4: scFull-Ig 상층액을 사용한 표적 세포의 염색. 4a) 유동 세포분석 프로파일: 양성 CD20 세포주(SUDHL4 및 DOHH), 또는 음성 대조군: cd20 발현을 위해 파괴된 DOHH KOCD20에서 scFull-Ig 항-CD20의 검출. SUDHL4 세포주를 50 μL의 상층액과 함께 2 내지 8℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 세척 후, 형광성 폴리클로날 항-hIgG(H+L) 항체를 20분 동안 2 내지 8℃에서 항온처리하였다. 세포를 FACSCalibur 세포분석기 상에서 유동 분석 전에 세척하였다. 형광성의 기하 평균을 상이한 세포주(SUDHL4, DOHH2 및 DOHH2 KO CD20)에서 측정하였고, 희석된 상층액과 함께 항온처리 후 우측 막대그래프에 플롯팅하였다(4b).
도 2: 리툭시맙의 VDJ 서열은 위트로우(Whitlow) 218 링커에 의해 VJ 서열에 연결되었다. 전사를 최적화시키기 위해, 인트론 구조(intronic structure)를 가변 중 도메인을 암호화하는 제1 엑손과 제2 엑손 사이에 보존시켰다. 불변 카파 서열은 동일한 위트로우 218 링커에 의해 불변 중쇄에 연결시켰다. 이러한 서열의 합성은 Genecust Company로부터 주문되어, pCDNA3.1 (+) 벡터 내로 삽입되었다.
도 3: 형질감염된 CHO 또는 HEK 293 세포주의 상층액을 ELISA 방법으로 분석하였다. 상층액 속의 IgG 분자를 96 플레이트 상에 코팅된 항-Fc 폴리클로날 항체에 의해 트랩(trap)시켰다. 검출은 HRP-커플링된 항-IgG(H+L) 폴리클로날 항체의 첨가로 실현시켰다. IgG1 재조합 단백질은 양성 대조군으로 사용한 반면 음성 대조군은 IgM-부류 재조합 분자이었다.
도 4: scFull-Ig 상층액을 사용한 표적 세포의 염색. 4a) 유동 세포분석 프로파일: 양성 CD20 세포주(SUDHL4 및 DOHH), 또는 음성 대조군: cd20 발현을 위해 파괴된 DOHH KOCD20에서 scFull-Ig 항-CD20의 검출. SUDHL4 세포주를 50 μL의 상층액과 함께 2 내지 8℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 세척 후, 형광성 폴리클로날 항-hIgG(H+L) 항체를 20분 동안 2 내지 8℃에서 항온처리하였다. 세포를 FACSCalibur 세포분석기 상에서 유동 분석 전에 세척하였다. 형광성의 기하 평균을 상이한 세포주(SUDHL4, DOHH2 및 DOHH2 KO CD20)에서 측정하였고, 희석된 상층액과 함께 항온처리 후 우측 막대그래프에 플롯팅하였다(4b).
발명의 상세한 설명
본 발명자는 본원에서 특히 항원용 막-연결된 B-세포 수용체(BCR)로서 또는 분비된 항체로서 단일-쇄 발현에 적합한 면역글로불린 형태를 사용하여, 의도적으로 B-세포 특이성을 재-가공하기 위해 록을 파괴시키는 전략을 제공한다. 실제로, 이들은 재조합 전체 길이의 면역글로불린은 2개의 링커를 포함하는 단일 쇄 분자로서 발현될 수 있으며 정상의 및 완전한 면역글로불린에 대해 구조상 매우 유사할 수 있다. 이러한 분자는 적어도 2개의 펩타이드 링커, 즉, 중 가변 영역의 C 말단을 경 가변 영역의 N 말단에 융합시키는 제1의 링커 및 경 불변 영역의 C 말단을 중 γ불변 영역 CH1 도메인의 N-말단 부분에 융합시키는 제2 링커의 사용 덕분에 항체의 모든 도메인의 융합으로 수득되었다(도 1). 본 출원의 실험 단락에 나타낸 바와 같이, 본 발명자는 상기 전체 길이의 단일 쇄 면역글로불린을 암호화하는 핵산으로 형질전환된 CHO 및 HEK 293 세포가 재조합 항체를 효율적으로 생산할 수 있고 이러한 항체가 이의 항원을 효율적으로 인식할 수 있음을 증명하였다.
이러한 전략은 중쇄와 경쇄 사이의 화학량론과 관련한 문제를 해결할 뿐만 아니라, 내인성 면역글로불린 중쇄 발현을 용이하게 차단하여 재조합 항체의 고 발현을 촉진하고 막-유형 및 분비된-유형의 Ig의 대안적인 스플라이싱 및 폴리아데닐화를 조절하는 내인성 조절 서열을 잠재적으로 사용함으로써 재조합 항체가 기억 B-림프세포 내에서 막 결합된 BCR로서 또는 혈장 세포 내에서 분비된 Ig로서 발현될 수 있도록 한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은
- 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 서열,
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 서열,
- 경쇄 불변 영역(CL)을 암호화하는 서열,
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 재조합 핵산 분자에 관한 것이며,
여기서 핵산 분자는 다음의 구조를 포함한다:
VH-PL1-VL-CL-PL2.
바람직하게는, 구조 VH-PL1-VL-CL-PL2는 모든 이러한 성분이 이의 이웃(들)에 바로 인접하고 있음을 의미하는데, 즉, VH를 암호화하는 서열은 PL1을 암호화하는 서열에 직접 연결되고, PL1을 암호화하는 서열은 VL을 암호화하는 서열에 직접 연결되며, VL을 암호화하는 서열은 CL을 암호화하는 서열에 직접 연결되고 CL을 암호화하는 서열은 PL2를 암호화하는 서열에 직접 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산 분자", "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 딘일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈성 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 푸린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연적으로, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연의, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드의 골격은 당 및 포스페이트 그룹을 포함함 수 있거나(전형적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있는 바와 같이), 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트 그룹을 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드의 골격은 포스포르아미데이트와 같은 합성 소단위의 중합체를 포함할 수 있으므로 올리고데옥시뉴클레소시드 포스포르아미데이트(P-NH2) 또는 혼합된 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 본 발명의 핵산은 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 화학적 합성, 재조합, 및 돌연변이유발에 의해 제조할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산은 DNA 분자, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 분자이며, 이는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 재조합 방법으로 합성될 수 있다.
"재조합 핵산"은 가공되어 천연 환경에서 및 특히 야생형 유기체내에서 자체로 발견되지 않는 핵산을 나타낸다.
본 발명의 핵산 분자는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 서열 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 서열을 포함한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 용어 "면역글로불린 중쇄 가변 영역" 또는 "중쇄의 가변 도메인"은 "V H "로서 지칭될 수 있다. 용어 "면역글로불린 경쇄 가변 영역" 또는 "경쇄의 가변 도메인"은 "V L "로서 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며 항원-결합 부위를 함유한다.
경쇄 또는 중쇄 가변 영역(VL 또는 VH)은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로서 지칭된 3개의 초가변 영역에 의해 차단된 골격으로 이루어진다. VL 또는 VH는 이후에 4개의 골격 영역 또는 "FR"을 포함하며, 이는 당해 분야에서 "골격 영역 1" 또는 "FR1"으로서; "골격 영역 2" 또는 "FR2"로서; "골격 영역 3" 또는 "FR3"로서; 및 "골격 영역 4" 또는 "FR4"로서 각각 지칭된다. 이러한 골격 영역 및 상보성 결정 영역은 바람직하게는 다음의 순서로 작동적으로 연결된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(아미노 말단으로부터 카복시 말단까지).
골격 영역 및 CDR의 정도는 예를 들면, 카밧(Kabat)에서와 같이 이미 정의되었다(참고: "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)). 주어진 VH 또는 VL의 CDR은 당해 분야의 기술자에게 이용가능한 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 에를 들면, 및 비-제한적 방식으로, 클로티아(Chlothia) 또는 카밧 방법을 사용하여 CDR을 측정할 수 있다(Chothia et al., Nature 342, 877-883; Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). CDR을 측정하는 대안적인 방법, 예를 들면 AbM(Oxford Molecular AbM antibody modeling software)으로 불리는 클로티아와 카밧 사이의 중간 방법 또는 이용가능한 복합체 구조의 분석을 기반으로 하는 소위 "접촉" 방법을 또한 사용할 수 있다.
구성성분 경쇄 및 중쇄의 조합된 골격 영역, 항체의 골격 영역은 위치를 지정하고 CDR을 조정하기 위해 제공되며, 이는 주로 항체에 대한 결합에 관여한다.
본 발명의 핵산 분자는 경쇄 불변 영역(CL)을 암호화하는 서열을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 "불변 영역"은 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 불변 영역 유전자 중 하나에 의해 암호화된 항체-유래된 불변 영역을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역글로불린 경쇄 불변 영역", "불변 경쇄" 또는 "경쇄 불변 영역"은 카파(Ckappa) 또는 람다(Clambda) 경쇄에 의해 암호화된 항체의 영역을 의미하며 "CL"로 지칭될 수 있다. 불변 경쇄는 전형적으로 단일 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는,
- 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 서열,
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 서열,
- 경쇄 불변 영역(CL)을 암호화하는 서열,
- 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH)을 암호화하는 서열, 및
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지며,
여기서 핵산 분자는 다음의 구조를 포함한다:
VH-PL1-VL-CL-PL2-CH
바람직하게는, PL2를 암호화하는 서열은 CH를 암호화하는 서열에 직접 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역글로불린 중쇄 불변 영역", "불변 중쇄" 또는 "중쇄 불변 영역"은 뮤(mu), 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론 유전자에 의해 암호화되어 IgM, IgD, IgG, IgA, 또는 IgE로서 각각 항체의 동형을 정의하는 항체의 영역을 의미한다. 이러한 영역은 "CH"로서 지칭될 수 있다.
불변 중쇄는 전형적으로 3 또는 4개의 도메인을 포함한다. 나타낸 바와 같이, 전체 길이의 IgD, IgG 또는 IgA 항체의 경우, 본원에 정의된 바와 같은 불변 중 영역은 CH1 도메인의 N-말단으로부터 CH3 도메인의 C-말단까지를 지칭하며, 전체 길이의 IgE 또는 IgM 항체의 경우, 본원에 정의된 바와 같은 불변 중 영역은 CH1 도메인의 N-말단 내지 CH4 도메인의 C-말단을 지칭한다.
대안적으로, CH 영역은 전체 길이의 항체의 불변 중쇄의 단편을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 예를 들면, CH 영역은 1 또는 2개의 도메인, 예를 들면, CH1 및/또는 CH2를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는
- 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 서열,
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 서열,
- 경쇄 불변 영역(CL)을 암호화하는 서열,
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열, 및
- 공여체 스플라이스 부위를 포함하거나, 이로 이루어지며,
여기서 핵산 분자는 다음의 구조를 포함한다:
VH-PL1-VL-CL-PL2-공여체 스플라이스 부위.
바람직하게는, PL2를 암호화하는 서열은 공여체 스플라이스 부위를 포함하는 서열에 직접 연결된다.
공여체 스플라이스 부위는 본 발명의 핵산의 발현을 위해 고려된 숙주 세포 및 예상된 통합 부위에 따라 설계된다.
공여체 스플라이스 부위는 바람직하게는 숙주 세포의 불변 면역글로불린 중쇄 유전자의 CH1 도메인과의 접합을 위해 설계된다. 이러한 공여체 스플라이스 부위의 용도는 델피(Delpy) 등의 문헌(Eur. J. Immunol., 2003, 33, 2108?2113) or Casola et al. (Nat. Immunol., 2004, 5, 317-327)에 나타나 있다.
다수의 생물정보학 도구가 기술자에 의해 공지되어 있으며 스플라이싱 신호 및 스플라이싱 이벤트(splicing event), 예를 들면, 진스플라이서(GeneSplicer)(http://ccb.jhu.edu/software/genesplicer/) 또는 스플라이스포트(Spliceport)(http://spliceport.cbcb.umd.edu/)를 예측하고 설계하기 위해 사용될 수 있다. 또한 Breathnach R, Chambon P. Annu Rev Biochem. 1981;50:349-83 참고. 일 구현예에서, 공여체 스플라이스 부위는 크립틱(cryptic) 스플라이스 부위이다.
본 발명의 핵산 분자는 펩타이드 링커, 즉, PL1 및 PL2를 암호화하는 적어도 2개의 서열을 포함한다.
펩타이드 링커 PL1 및 PL2는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 항체에서, 펩타이드 링커 PL1은 VH 영역의 C 말단을 VL 영역의 N-말단에 결합시키고, 펩타이드 링커 PL2는 CL 영역의 C-말단을 CH 영역의 N-말단에 결합시킨다.
본 발명의 핵산 분자에 있어서, 펩타이드 링커 PL1을 암호화하는 서열은 VH 영역을 암호화하는 서열을 VL 영역을 암호화하는 서열에 결합시킨다.
구현예에 따라서, 펩타이드 링커 PL2를 암호화하는 서열은 CL 영역을 암호화하는 서열을 CH 영역을 암호화하는 서열 또는 공여체 스플라이스 부위를 포함하는 서열에 결합시킨다.
펩타이드 링커는 전형적으로 길이가 5 내지 50개 아미노산으로 변한다. 바람직하게는, 펩타이드 링커는 10 내지 25개 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 15 내지 20개 아미노산 길이, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 18개 아미노산 길이이다.
전형적으로, 펩타이드 링커의 서열은 대부분의 친수성 아미노산을 포함하거나, 소수성 아미노산, 예를 들면, 글리신 및 세린으로 이루어진다.
본 발명에 유용한 펩타이드 링커는 단일-쇄 단편 가변(scFv) 항체에서 이미 기술된 임의의 펩타이드 링커로부터 기술자에 의해 선택될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커의 예는 구(Gu) 등의 문헌(Ann Biomed Eng. 2010 Feb;38(2):537-49), 볼켈(Voelkel) 등의 문헌(Protein Eng. 2001 Oct;14(10):815-23), 판톨리아노(Pantoliano) 등의 문헌(Biochemistry. 1991 Oct 22;30(42):10117-25), 휘틀로우(Whitlow) 등의 문헌(Protein Eng. 1993 Nov;6(8):989-95) 또는 헨넥케(Hennecke) 등의 문헌(Protein Eng. 1998 May;11(5):405-10)에 기술되어 있다.
이러한 펩타이드 링커의 특수한 예는 하기 나타낸다:
특수한 구현예에서, PL1 및/또는 PL2는 서열 번호: 1 내지 7의 서열, 및 서열 번호: 1 내지 7의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
특수한 구현예에서, PL1 및/또는 PL2는 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열 번호: 1), 또는 서열 번호: 1과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 폴리펩타이드 서열의 정렬로부터 위치내 일치(match)의 수(%)(동일한 아미노산 잔기)를 지칭한다. 서열 동일성은 오버랩(overlap)을 최대화시키면서 서열 갭(gap)을 최소화하기 위해 정렬시키는 경우 서열을 비교함으로써 측정된다. 특히, 서열 동일성은 2개 서열의 길이에 따라, 임의의 다수의 수학적인 전체 또는 국소 정렬 알고리즘을 사용함으로써 측정할 수 있다. 유사한 길이의 서열은 전체 길이에 걸쳐 최적으로 서열을 정렬시키는 전반적인 정렬 알고리즘(예컨대, Needleman and Wunsch algorithm; Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 바람직하게 정렬되지만, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 바람직하게는 국소 정렬 알고리즘(예컨대, 스미쓰(Smith) 및 워터만(Waterman) 알고리즘(Smith and Waterman, 1981) 또는 알츠슐 알고리즘(Altschul algorithm)(Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005))을 사용하여 정렬된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 측정하려는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방식, 예를 들면, 인터넷 웹 사이트, 예를 들면, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)에서 이용가능한 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 측정할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 값의 %은 니들만-운슈 알고리즘(Needleman-Wunsch algorithm)을 사용하여 2개의 서열의 최적의 전반적인 정렬을 생성하는 쌍식 서열 정렬 프로그램 EMBOSS 니들(Needle)을 사용하여 생성된 값을 지칭하며, 여기서 모든 조사 매개변수는 디폴트 값(default value)으로 설정되는데, 즉 점수매김 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 오픈(Gap open) = 10, 갭 연장(Gap extend) = 0.5, 말단 갭 페널티(End gap penalty) = 거짓(false), 말단 갭 오픈(End gap open) = 10 및 말단 갭 연장(End gap extend) = 0.5.
본 발명의 재조합 핵산 분자는 정밀한 위치에서 동종 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 상기 핵산 분자의 통합을 지시하기 위한 추가의 서열을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈의 정밀한 위치에 대해 상동성인 서열에 의해 말단 둘 다에서 플랭킹(flanking)된다. 이러한 서열은 기술자에 의해 용이하게 정의될 수 있다.
동종 재조합은 이러한 재조합, 예를 들면, ZFN, TALE 뉴클레아제, CRISPR/Cas9에 통상적으로 사용된 뉴클레아제의 도움으로 또는 이의 도움없이 수행될 수 있다.
특히, 추가의 서열은 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 생성된 이중 가닥 브레이크(double strand break: DSB) 지점에 걸쳐 진행되는(striding) 미세상동성 서열(microhomology sequence)일 수 있다. 미세상동성 서열은 주어진 유전자에 대해 매우 특이적인 짧은(일반적으로 약 10 내지 50 bp) 서열을 특징으로 하며 표적화된 게놈의 다른 위치에서 발견되지 않는다. 다수의 생물정보학 도구가 기술자에 의해 공지되어 있으며 NBRP Medaka(http://viewer.shigen.info/cgi-bin/crispr/crispr.cgi)와 같이 이러한 서열을 설계하기 위해 사용될 수 있다. 임의로, 이러한 미세상동성 서열은 통합을 위한 MMEJ(미세상동성-매개된 말단-결합(microhomology-mediated end-joining)) 메카니즘을 사용하기 위해 PITCh 결합 부위에 의해 플랭킹될 수 있다(Sakuma et al., Nat Protoc. 2016 Jan;11(1):118-33).
바람직한 구현예에서, 이러한 추가의 서열은 동종 재조합에 의해 면역글로불린 중쇄 유전자자리 내, 보다 바람직하게는 결합 영역(JH) 유전자와 면역글로불린 중쇄의 불변 영역(CH) 유전자 사이로의 통합을 허용한다. 바람직하게는, 이러한 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 상기 정의된 바와 같은 다음의 구조 VH-PL1-VL-CL-PL2-공여체 스플라이스 부위를 나타내며 RNA 스플라이싱은 VH-PL1-VL-CL-PL2-CH(여기서 CH는 숙주 세포 게놈에 의해 암호화된다)을 포함하는 융합 단백질을 야기한다. 이의 서열이 상동성 서열을 설계하는데 사용되는, 삽입 부위는 이후에 임의의 Ig 중쇄 유전자로부터 임의의 CH1 엑손의 상부에서 선택될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 대조군 서열과 혼용성인 조건 하에 적합한 숙주 세포내에서 상기 핵산의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.
용어 "조절 서열"은 유전자의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 조절 서열은 천연적(천연적으로 존재하는 게놈내 암호화 서열에 작동적으로 연결됨)이거나 이종(천연적으로 존재하는 게놈내 암호화 서열에 대해 작동적으로 연결된 대조군 서열과는 상이함)일 수 있다. 이러한 조절 서열은 리더(leader), 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 신호 펩타이드 서열, 및 전사 종결인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동적으로 연결된"은 단일 핵산 분자 상에서 핵산 서열의 회합(association)으로 하나의 작용이 다른 것에 의해 영향받도록 하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 이러한 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우, 즉, 암호화 서열이 프로모터의 전사 조절 하에 있는 경우 프로모터는 암호화 서열과 작동적으로 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 카세트"는 암호화 서열 및 상기 암호화 서열의 발현에 필요한 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 핵산 작제물을 지칭한다. 일반적으로, 발현 카세트는 목적한 유전자 생성물의 발현에 요구되는 암호화 서열을 선행하는(5' 비-암호화 서열) 및 후속되는(3' 비-암호화 서열) 암호화 서열 및 조절 서열을 포함한다. 따라서, 발현 카세트는 전형적으로 프로모터 서열, 5′ 해독되지 않는 영역, 암호화 서열 및 일반적으로 폴리아데닐화 부위 및/또는 전사 종결인자를 함유하는 3' 해독되지 않은 영역을 포함한다. 발현 카세트는 또한 추가의 조절 성분, 예를 들면, 인핸서(enhancer) 서열, 벡터 내에서 DNA 단편의 삽입을 촉진하는 폴리링커 서열 및/또는 스플라이싱 신호 서열을 포함할 수 있다. 발현 카세트는 일반적으로 벡터 내에 포함되어 클로닝 및 형질전환을 촉진한다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 재조합 핵산은 면역글로불린 VH 프로모터, 바람직하게는 고려된 숙주 세포의 면역글로불린 VH 프로모터에 작동적으로 연결된다. 이러한 프로모터는 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 바람직하게는, 고려된 숙주 세포는 사람 숙주 세포이고 프로모터는 사람 프로모터, 바람직하게는 사람 면역글로불린 VH 프로모터, 또는 B-세포 계통에서 활성인 임의의 프로모터이다.
바람직한 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 이러한 프로모터를 사용하여, 의도적으로 재조합 단일-쇄 항체 생산을 개시(trigger)하는 것이 가능하다.
본 발명의 발현 카세트는 정밀한 위치에서 동종 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 이의 통합을 지시하기 위한 추가의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열은 재조합 핵산 분자에 대해 상기 정의한 바와 같을 수 있다.
재조합 핵산 분자의 모든 구현예가 이러한 양태에서 또한 고려된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"벡터"는 예를 들면, 내부로 핵산 서열이 삽입되거나 클로닝될 수 있는, 플라스미드, 박테리오파아지 또는 바이러스로부터 유래된 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 비-제한적인 예는 플라스미드, 파아지, 코스미드, 파아지미드, 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC), 사람 인공 염색체(HAC), 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 및 유전 가공에 통상적으로 사용되고/되거나 목적한 DNA 서열을 숙주 세포내 목적한 위치에 운반할 수 있는 다른 DNA 서열을 포함한다.
벡터는 바람직하게는 하나 이상의 제한 부위를 함유하며 표적 세포 또는 조직 또는 후대 세포 또는 이의 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있거나, 정의된 숙주의 게놈과 부분적으로 또는 전체적으로 통합되어 클로닝된 서열이 재생가능하도록 할 수 있다. 따라서, 벡터는 자가 복제하는 벡터, 즉, 염색체외 실체로서 존재하는 벡터일 수 있으며, 이의 복제는 염색체 복제, 예컨대, 선형 또는 폐쇄된 환형 플라스미드, 염색체외 성분, 미니염색체, 또는 인공 염색체와는 독립적이다. 벡터는 자가-복제를 보증하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포내로 도입시, 게놈 내로 통합되고 이것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터와 벡터가 도입되는 숙주 세포의 혼용성에 의존할 것이다.
벡터는 선택가능한 마커, 예를 들면, 영양요구성 마커(예컨대, LEU2, URA3, TRP 1 또는 HIS3), 검출가능한 표지, 예를 들면, 형광성 또는 발광성 단백질(예컨대, GFP, eGFP, DsRed, CFP), 또는 화학적/독성 단백질(예컨대, 테모졸로마이드에 대해 내성을 부여하는 MGMT 유전자)에 대해 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 마커는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하거나 검출하는데 사용될 수 있으며 숙주 세포에 따라 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 숙주 세포 내에서 본 발명의 재조합 핵산 분자의 발현을 확립하는데 요구되는 임의의 성분을 포함하는 바이러스 게놈 벡터, 예를 들면, 프로모터, ITR, 리보소옴 결합 성분, 종결인자, 인핸서, 선택 마커, 인트론(intron), 폴리A 신호, 및/또는 복제 오리진(origin of replication)이다.
일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들면, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) 벡터(MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV 또는 SNV로부터 유래된 벡터, 렌티바이러스 벡터(예컨대, 사람 면역결핍성 바이러스(HIV), 시미안 면역결핍증 바이러스(SIV), 고양이과 면역결핍증 바이러스(FIV), 소 면역결핍증 바이러스(BIV) 또는 말과 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래됨), 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 40(SV-40) 벡터, 소 파필로마 바이러스 벡터, 엡슈타인-바르 바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 박시니아 바이러스 벡터, 하베이 쥐 육종 바이러스(Harvey murine sarcoma virus) 벡터, 쥐 유방 종양 바이러스 벡터, 로우스 육종 바이러스 벡터이다.
특수한 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터 도는 비-병원성 파르바이러스이다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, 사용을 위해 고려된 특수한 바이러스 벡터에 따라서, 적합한 서열을 작용성 바이러스 벡터를 수득하기 위한 본 발명의 벡터, 예를 들면, AAV 벡터의 경우 AAV ITR, 또는 렌티바이러스 벡터의 경우 LTR 내로 도입시킬 수 있다.
바람직한 구현예에서, 벡터는 AAV 벡터이다.
사람 파르보바이러스 아데노-관련 바이러스(AAV)는 감염된 세포의 게놈내로 통합되어 감복성 감염을 확립할 수 있는 천연적으로 복제 결함성인 데펜도바이러스(dependovirus)이다. 통합이 염색체 19에 위치하는, AAVS1으로 불리는 사람 게놈내 특수한 부위(19ql3.3-qter)에서 발생하므로 최종 특성은 포유동물 바이러스 중에서도 독특한 것으로 여겨진다. 따라서, AAV는 사람 유전자 치료요법을 위한 잠재적인 벡터로서 고려할만한 관심을 불러일으켰다. 바이러스의 유리한 특성 중에는 임의의 사람 질병과의 회합의 이의 결여, 분열하는 및 분열하지 않는 세포 둘 다를 감염시키는 이의 능력, 및 감염시킬 수 있는 상이한 조직으로부터 유래된 광범위한 세포주가 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "AAV 벡터"는 적어도 하나의 AAV 역위된 말단 반복 서열(ITR), 바람직하게는 2개의 ITR에 의해 플랭킹된 하나 이상의 이종 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 벡터를 지칭한다. 이러한 AAV 벡터는 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되고(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하는) AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포내에 존재하는 경우 복제되어 감염성 바이러스 입자 내로 패키지(package)된다.
"역위된 말단 반복체" 또는 "ITR" 서열은 당해 분야에서 잘 이해된 용어이며 반대 배향으로 존재하는 바이러스 게놈의 말단에서 발견된 비교적 짧은 서열을 지칭한다. "AAV 역위된 말단 반복체(ITR)" 서열은 천연의 단일-가닥 AAV 게놈의 말단 둘 다에 존재하는 대략 145개 뉴클레오타이드 서열이다. ITR의 최외부곽의 125개 뉴클레오타이드는 2개의 교호하는 배향 중 어느 하나로 존재하여 상이한 AAV 게놈사이 및 단일 AAV 게놈의 2개의 말단 사이에서 이종성(heterogeneity)을 야기한다. 최외부곽의 125개 뉴클레오타이드는 또한 자가-상보성(A, A', B, B', C, C 및 D 영역으로 지정됨)의 수개의 보다 짧은 영역을 함유함으로써 가닥 내 염기 쌍화가 ITR의 이러한 부위 내에서 발생하도록 한다. 본 발명의 벡터 내에서 사용하기 위한 AAV ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있거나 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. AAV 벡터의 역위된 말단 반복체(ITR)의 혈청형은 임의의 공지된 사람 또는 비사람 AAV 혈청형으로부터 선택될 수 있다.
12개의 사람 혈청형 및 비사람 영장류로부터의 100개 이상의 혈청형을 포함하는, 아데노-관련 바이러스(AAV)의 다수의 혈청형이 현재 확인되어 있다(Howarth al., 2010, Cell Biol Toxicol 26: 1-10). 이러한 혈청형 중에서, 사람 혈청형 2는 유전자 전달 벡터로서 개발된 첫번째 AAV이었다. 현재 사용된 다른 AAV 혈청형은 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAVrh74 및 AAVdj 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 비-천연 가공된 변이체 및 키메라 AAV가 또한 유용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터는 AAV6 벡터이다.
AAV 벡터가 보다 큰 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 염색체 또는 클로닝 또는 형질감염에 사용된 플라스미드와 같은 다른 벡터) 내로 혼입되는 경우, AAV 벡터는 AAV 패키지 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재하에서 복제 및 캡시드화(capsidation)에 의해 구조(rescue)될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로서 지칭될 수 있다. 본 발명의 AAV 벡터는 임의의 수의 형태, 예를 들면, 이에 한정되지 않는 플라스미드, 선형 인공 염색체일 수 있으며, 지질과 복합체화되고, 리포좀 내에 캡슐화(encapsulating)되며 바이러스 입자, 예컨대, AAV 입자 내에 캡시드화될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 발현 카세트는 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 벡터 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자 및 발현 카세트의 모든 구현예가 또한 당해 양태에서 고려된다.
본 발명의 벡터는 바이러스 캡시드 내로 패키지되어 "바이러스 입자"를 생성할 수 있다. 따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 바이러스 입자에 관한 것이다.
특수한 구현예에서, 벡터는 AAV 벡터이고 AAV-유래된 캡시드 내로 패키지되어 "아데노-관련 바이러스 입자" 또는 "AAV 입자"를 생성한다. 따라서, 본원에 사용된, 용어 "AAV 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 AAV 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
캡시드 혈청형은 AAV 입자의 향성 범위(tropism range)를 결정한다.
캡시드 혈청형은 이미 확인된 사람 또는 비-사람 혈청형으로부터 또는 비-천연의 가공된 변이체 및 키메라 AAV 캡시드로부터 선택될 수 있다. 특히, 캡시드 단백질은 형질도입 효율을 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체일 수 있다.
상이한 AAV 혈청형을 사용하여 특수한 표적 세포의 형질도입을 최적화시키거나 특수한 표적 조직 내에서 특이적인 세포 유형을 표적화한다. AAV 입자는 바이러스 단백질 및 동일한 혈청형의 바이러스 핵산 또는 AAV의 임의의 천연 또는 인공 서열 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, AAV 입자는 AAV6 캡시드 단백질 및 적어도 하나, 바람직하게는 2개의, AAV6 ITR을 포함할 수 있다. AAV 입자의 생산을 위한 AAV 혈청형의 임의의 조합은 각각의 조합이 본원에 명확하게 기술된 경우와 같이 본원에 제공된다.
바람직한 구현예에서, AAV 입자는 AAV6-유래된 캡시드를 포함한다.
AAV 바이러스는 통상의 생물학 기술을 사용하여 가공할 수 있으며, 핵산 서열의 세포 특이적인 전달을 위해, 면역원성을 최소화하기 위해, 안정성 및 입자 수명을 조율하기 위해, 효율적인 분해를 위해, 핵으로의 정밀한 전달을 위해 이러한 입자를 최적화하는 것이 가능하도록 한다.
AAV 천연 혈청형을 사용하는 것에 대한 대안으로, 인공 AAV 혈청형, 예를 들면, 그러나 제한없이, 비-천연적으로 존재하는 캡시드 단백질을 지닌 AAV를 본 발명의 맥락에서 사용할 수 있다. 이러한 인공 캡시드는 임의의 적합한 기술에 의해, 선택된 AAV 서열(예컨대, VPl 캡시드 단백질의 단편)을 상이한 선택된 AAV 혈청형, 동일한 AAV 혈청형의 비-연속 부위로부터, 비-AAV 바이러스 공급원으로부터, 또는 비-바이러스 공급원으로부터 수득될 수 있는 이종 서열과 함께 사용하여 발생시킬 수 있다. 인공의 AAV 혈청형은 제한없이, 키메라 AAV 캡시드 또는 돌연변이된 AAV 캡시드일 수 있다.
키메라 캡시드는 적어도 2개의 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된 VP 캡시드 단백질을 포함할 수 있거나 VP 단백질 영역 또는 적어도 2개의 AAV 혈청형으로부터 유래된 도메인을 조합하는 적어도 하나의 키메라 VP 단백질을 포함한다.
캡시드 단백질은 또한 돌연변이되어, 특히, 형질도입 효율을 향상시킬 수 있다. 돌연변이된 AAV 캡시드는 오류 유발(error prone) PCR 및/또는 펩타이드 삽입에 의해 또는 하나 또는 수개의 아미노산 치환을 포함함으로써 삽입된 캡시드 변형으로부터 수득될 수 있다.
또한, AAV 입자의 게놈 벡터(즉, 본 발명의 벡터)는 단일 가닥 또는 자가-상보성 이중-가닥 게놈일 수 있다. 자가-상보성 이중-가닥 AAV 벡터는 하나의 AAV 말단 반복체로부터 말단 분해 부위(terminal resolution site: trs)를 결실시킴으로써 생성시킨다. 이의 복제하는 게놈이 야생형 AAV 게놈의 길이의 1/2인 이러한 변형된 벡터는 DNA 이량체를 패키지하는 경향을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 실시에 시행된 AAV 입자는 단일 가닥 게놈을 갖는다.
바이러스 입자, 및 특히 AAV 입자를 생산하기 위한 다수의 방법, 예를 들면, 형질감염, 안정한 세포주 생산, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드(Conway, JE et al., (1997) Virology 71(11):8780-8789) 및 바큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생산 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다.
AAV 바이러스 입자의 생산을 위한 AAV 생산 배양물 모두는 1) 바큘로바이러스 생산 시스템의 경우에, 예를 들면, 사람-유래된 세포주를 포함하는 적합한 숙주 세포, 예를 들면, HeLa, A549, 또는 293 세포, 또는 곤충-유래된 세포주, 예를 들면, SF-9; 2) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예를 들면, 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바큘로바이러스, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물에 의해 제공된 적합한 헬퍼 바이러스 기능; 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 생성물; 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열에 의해 플랭킹된 목적한 핵산, 예컨대, 본 발명의 벡터; 및 5) 당해 분야에 잘 공지된 AAV 생산을 뒷받침하는 적합한 배지 및 배지 구성성분을 필요로 한다.
본 발명을 실시하는데 있어서, AAV 입자를 생산하기 위한 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 미생물 및 효모를 포함한다. 숙주 세포는 또한 패키징 세포일 수 있으며 여기서 AAV rep 및 cap 유전자는 숙주 세포 또는 AAV 벡터 게놈이 안정하게 유지되는 생산자 세포 내에서 안정하게 유지된다. 예시적인 패키징 및 생산자 세포는 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래된다. AAV 입자는 이후에 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 정제하고 제형화된다.
본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트 또는 벡터의 모든 구현예가 또한 당해 양태에서 고려된다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자를 포함하거나, 이로 형질전환되거나 형질감염된 단리된 숙주 세포에 관한 것이다.
숙주 세포는 동일하거나 상이한, 본 발명의 1개 또는 수개의 재조합 핵산, 발현 카세트 또는 벡터를 포함할 수 있다.
특수한 구현예에서, 숙주 세포는 이의 3' 말단에 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 본 발명의 재조합 핵산을 포함하며, 상기 스플라이스 공여체 부위는 숙주 세포의 게놈 내에서 스플라이스 수용체 부위와 혼용성이다.
용어 "숙주 세포"는 또한 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인하여 모 숙주 세포와는 동일하지 않는 모 숙주 세포의 임의의 후대세포를 포함한다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 본 발명의 재조합 핵산 분자를 발현하는데 적합한 임의의 세포를 포함한다. 항체-암호화 벡터의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에 기술된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다.
예를 들면, 항체는 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않는 경우, 세균 내에서 생산할 수 있다. 세균 내에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현을 위해서는, 예컨대, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참고한다. (또한 이. 콜라이(E. coli) 내에서 항체 단편의 발현을 기술하는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 참고). 발현 후, 항체는 가용성 분획으로서 세균 세포 분해물로부터 단리할 수 있으며 추가로 정제할 수 있다.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵세포 미생물은 항체-암호화 벡터용의 적합한 발현 숙주, 예를 들면, 이의 글리코실화 경로가 "사람화"되어, 부분적으로 또는 완전한 사람 글리코실화 패턴을 지닌 항체의 생산을 야기하는 진균 및 효모 균주이다. 참고: Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(비척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 비척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 확인되었다. 식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 활용될 수 있다. 참고: 예컨대, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 현탁액 속에서 성장하도록 채택된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 사람 배아 신장 세포주(예컨대, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(Sertoli) 세포(예컨대, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO- 76); 사람 자궁경부 암종 세포(HELA); 개과 신장 세포(MDCK; 버팔로(buffalo) 랫트 간 세포(BRL 3A); 사람 폐 세포(W138); 사람 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예컨대, Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, 예를 들면, DHFR- CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정의 포유동물 숙주 세포주의 고찰을 위해서는, 예컨대, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참고한다.
특수한 구현예에서, 숙주 세포는 마이코박테리아(mycobacteria) 세포, 진균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 비-사람 동물 세포, 사람 세포, 또는 세포 융합, 예를 들면, 하이브리도마로부터 선택된다. 바람직하게는, 세포는 포유동물로부터 선택된다. 바람직하게는, 세포는 사람, 영장류, 토끼 또는 설치류(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그) 세포로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 세포는 사람 및 마우스 세포로부터 선택된다. 심지어 보다 바람직하게는, 세포는 사람 세포이다. 바람직한 구현예에서, 사람 배아 줄기 세포는 제외된다.
바람직한 구현예에서, 세포는 B 세포, 바람직하게는 사람 또는 마우스 B 세포, 보다 바람직하게는 사람 B 세포이다.
숙주 세포, 바람직하게는 비-사람 세포는 또한 분화전능성(totipotent), 다능성, 또는 성체 줄기 세포, 접합체(zygote), 또는 체세포일 수 있다. 구현예에서, 숙주 세포는 배아 줄기 세포, 바람직하게는 비-사람 배아 줄기 세포, 보다 바람직하게는 마우스 배아 줄기 세포이다.
본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 인산칼슘-DNA 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 전기천공, 미세주입, 바이올리스틱(biolistic), 지질감염, 또는 바이러스 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 공지된 기술을 사용하여 숙주 세포내로 형질감염될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 이소성 형태(ectopic form)로 존재할 수 있거나 게놈 내로 통합될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 바이러스 감염에 의해, 바람직하게는 본 발명의 바이러스 입자를 사용하여, 보다 바람직하게는 본 발명의 AAV 입자를 사용하여 숙주 세포내로 형질감염된다.
본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스 입자의 모든 구현예는 또한 이러한 양태에서 고려된다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 숙주 세포를 포함하는, 형질도입 유기체, 바람직하게는 비-사람 형질도입 유기체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 형질도입 숙주 세포를 포함하는 형질도입 유기체를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자 및 숙주 세포의 모든 구현예가 또한 이러한 양태에서 고려된다.
특히, 유기체는 비-사람 동물, 에를 들면, 영장류(예컨대, 비-사람 영장류, 예를 들면, 원숭이), 토끼, 또는 설치류(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니아 피그)일 수 있다. 바람직하게는, 형질도입 유기체는 비-사람 포유동물이다. 보다 바람직하게는, 형질도입 유기체는 마우스이다.
형질도입 유기체, 특히 형질도입 마우스를 생성시키는 방법은 기술자에 의해 잘 공지되어 있다. 임의의 이러한 방법을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있고 본원에 개시된 방법이 비-제한적임이 이해되어야 한다.
특히, 형질도입 유기체를 생성하는 방법은
본 발명의 발현 카세트 또는 벡터를 비-사람 배아 줄기 세포 내로 도입시키는 단계,
형질도입 배아 줄기 세포를 수득하는 단계(여기서 본 발명의 재조합 핵산 분자는 바람직하게는 동종 재조합에 의해 게놈 내로 삽입된다),
상기 형질도입 배아 줄기 세포를 비-사람 동물의 배반포 내로 주입하여 키메라를 형성시키는 단계, 및
상기 주입된 배반세포를 양모(foster mother) 내로 재이식시키는 단계를 포함할 수 있다.
배아 줄기(ES) 세포는 전형적으로 시험관내에서 배양된 이식 전 배아로부터 수득된다. 바람직하게는, 본 발명의 카세트 또는 벡터는 전기천공에 의해 상기 ES 세포 내로 형질감염된다. ES 세포는 관련 분야에 공지된 방법을 사용하여 형질감염 용으로 배양하고 제조한다. 본 발명의 카세트 또는 벡터로 형질감염될 ES 세포는 이들이 도입되어야 하는 발달하는 배아 또는 배반포와 동일한 종의 배아 또는 배반포로부터 유래된다. ES 세포는 전형적으로 내부 세포 덩어리(inner cell mass) 내로 통합하고 발달의 배반포 단계에서 배아로서 동물 내로 도입되는 경우 개인의 배선에 기여하는 이들의 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, ES 세포는 마우스 배반포로부터 단리된다.
ES 세포 내로 형질감염 후, 본 발명의 재조합 핵산 분자는 하기 정의한 바와 같은 본 발명의 항체를 생산하기 위하여 세포의 게놈 DNA와 함께 통합시킨다.
형질감염 후, ES 세포는 형질감염된 세포를 검출하기에 적합한 조건 하에서 배양된다. 예를 들면, 카세트 또는 벡터가 마커 유전자, 예컨대, 항생제 내성 마커, 예컨대, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 경우, 세포는 이러한 항생제 속에서 배양된다. ES 세포를 생존시키는 DNA 및/또는 단백질 발현은 카세트의 적절한 통합을 입증하기 위하여 서던 블롯 기술(Southern Blot technology)을 사용하여 분석할 수 있다.
이후에 선택된 ES 세포를 비-사람 동물의 배반세포내로 주입하여 키메라를 형성시킨다. 비-사람 동물은 바람직하게는 마우스, 햄스터, 랫트 또는 토끼이다. 보다 바람직하게는, 비-사람 동물은 마우스이다.
특히, ES 세포는 미세주입을 사용하여 조기 배아 내로 삽입시킬 수 있다. 주입된 배반세포는 양모 내로 재-이식된다. 자손이 태어나면, 이들을 예컨대, 서던 블롯 및/또는 PCR 기술을 사용하여 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트 또는 벡터의 존재에 대해 스크리닝한다. 이형접합체를 확인한 다음 서로 교배하여 동형접합성 동물을 생성한다.
다른 구현예에서, 형질도입 유기체를 생성시키는 방법은
비-사람 수정란 내에 (i) 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터 및 (ii) 이러한 카세트 또는 벡터를 표적화하는데 사용된 뉴클레아제 시스템을 동종 재조합에 의해 정확한 유전자자리(locus)에서 도입시키는 단계,
형질도입 수정란을 수득하는 단계(여기서 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 동종 재조합에 의해 게놈 내로 삽입된다), 및
상기 주입된 수정란을 양모 내로 재이식시키는 단계를 포함할 수 있다.
정확한 유전자자리에서 카세트 또는 벡터를 표적화하는데 사용된 뉴클레아제 시스템은 기술자에 의해 공지된 임의의 적합한 시스템, 예를 들면, ZFN, TALE 또는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 포함하는 시스템일 수 있다.
바람직하게는, 뉴클레아제 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다. Cas9를 사용하여 게놈 서열을 변형시키기 위하여, 단백질을 세포로 직접 전달할 수 있다. 대안적으로, Cas9를 암호화하는 mRNA를 세포로, 또는 Cas9를 암호화하는 mRNA의 발현을 제공하는 유전자를 세포로 전달할 수 있다. 또한, 표적 특이적인 crRNA 및 tracrRNA 또는 표적 특이적인 gRNA(들)은 세포로 전달될 수 있다(이러한 RNA는 대안적으로 이러한 RNA를 발현하도록 작제된 유전자에 의해 생산될 수 있다). 표적 부위의 선택 및 crRNA/gRNA의 설계는 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
본 발명은 또한 세포 또는 조직, 예를 들면, 본 발명의 형질도입된 비-사람 동물 및 이의 자손으로부터 유래된, 무한증식 세포주(immortalized cell line) 및 주요 세포 또는 조직, 특히 본 발명의 항체를 생산하는 세포 또는 조직, 예를 들면, 하이브리도마 또는 골수종이다.
다른 양태에서, 본 발명은
- 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH),
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL),
- 면역글로불린 경쇄 불변 영역(CL),
- 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH), 및
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하는 항체에 관한 것이며,
여기서 VH는 VL에 PL1을 통해 융합되고 CL은 CH에 PL2를 통해 융합된다.
PL1 및 PL2는 동일하거나 상이할 수 있다.
특히, 본 발명의 항체는 본 발명의 재조합 핵산 분자의 암호화 서열의 발현을 통해 수득된 임의의 항체일 수 있다.
본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 및 형질도입 동물의 모든 구현예가 또한 이러한 양태에서 고려된다.
본원에서 용어 "항체"는 최광의의 의미에서 사용되며, 이들이 VH, VL, CL, CH, PL1, PL2, PL1을 통해 VL에 융합되는 VH 및 PL2를 통해 CH에 융합되는 CL를 포함하는 쇄를 포함하는 한, 모노클로날 항체(전체 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다특이적 항체(예컨대, 이특이적 항체), 항체 단편, 및 이의 유도체를 구체적으로 포함한다.
본 발명의 항체는 VH, VL, CL, CH, PL1 및 PL2를 포함하는 하나의 쇄 만을 포함하는 단일 쇄 항체일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 VH, VL, CL, CH, PL1 및 PL2를 포함하는 적어도 2개의 쇄를 포함할 수 있으며, 상기 쇄는 바람직하게는 이황화물 브릿지를 통해 서로 연결된다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 항체는 1개 또는 수개의 이황화물 브릿지를 통해 연결된 2개의 쇄를 포함하며, 각각의 쇄는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH), 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL), 면역글로불린 경쇄 불변 영역(CL), 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH), 및 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하며, 여기서 VH는 VL에 PL1을 통해 융합되고 CL은 CH에 PL2를 통해 융합된다.
일부 구현예에서, 항체는 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유결합성 또는 비-공유결합성 회합에 의해 형성된, 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는 추가의 항체 도메인, 예컨대, 추가의 중쇄 및 경쇄 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 전체 길이의 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "전체 길이의 항체"는 천연의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하나, 하기 정의된 바와 같은 항체 단편을 지칭하지는 않는다. 이러한 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 지닌 항체를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 전체 길이의 IgG 항체, 바람직하게는 전체 길이의 IgG1 항체이다. 그러나, 임의의 다른 면역글로불린 부류가 사용될 수 있다.
일부 다른 구현에에서, 항체는 항체 단편이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체 단편"은 전체 길이의 항체 중 일부, 바람직하게는 중쇄, 링커 PL1, 경쇄, 링커 P2의 가변 도메인을 포함하는 단편 및 적어도 불변 중쇄의 N-말단의 단편을 지칭한다. 항체 단편은 바람직하게는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 F(ab)3로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
항체 단편은 기술자에 의해 잘 공지된, 완전한 항체의 단백질분해성 분해 뿐만 아니라, 본원에 기술된 재조합 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 항체의 파파인 분해는 각각 단일의 항원-결합 부위를 지닌, "Fab" 단편 및, 잔류 "Fc" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하며, 이의 명칭은 용이하게 결정화하는 이의 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 가지고 여전히 항원을 가교-결합시킬 수 있는 F(ab′)2 단편을 생성한다.
본원에 사용된 바와 같은 "Fab", "Fab 단편" 또는 "Fab 영역"은 VH, CH1, VL, 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. Fab는 단리된 이러한 영역 또는 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드의 맥락에서 이러한 영역을 지칭할 수 있다.
Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇개의 잔기의 첨가에 의해서 Fab 단편과는 상이하다. F(ab')2 항체 단편은 기본적으로 이들 사이에 힌지 시스테인(hinge system)을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로써 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체 유도체"는 본원에 제공된 항체, 예컨대, 전체 길이의 항체 또는 항체의 단편을 지칭하며, 여기서 아미노산 중 하나 이상은 예컨대, 알킬화, 페길화(PEGylation), 아실화, 에스테르 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 변형된다. 특히, 이러한 용어는 당해 분야에 공지되고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형된 본원에 제공된 항체를 지칭할 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 예는 PEG, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로즈, 덱스트란 및 폴리비닐 알코올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
유도체는 또한 하나 이상의 이종 분자(들), 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 세포독성제, 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 형광성 모이어티, 진단 방사선동위원소 또는 영상화제; 또는 고체 지지체, 예를 들면, 아가로즈 비드(bead) 등에 접합된 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체일 수 있다. 세포독성제의 예는 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예컨대, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사활성 동위원소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 기술자에게 잘 공지된 다양한 이기능성 단백질 커플링제를 사용하여 제조할 수 있다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-분해가능한 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광분해가능한 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992))가 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 기능성 Fc 영역, 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역을 포함할 수 있다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 효과기 기능을 지닌다. 예시적인 "효과기 기능"은 C1q 결합; 세포 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC), 식세포작용, 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP), 세포 표면 수용체의 하향 조절 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예컨대, 항체 가변 도메인)과 조합되도록 하는 것이 요구되며 다양하게 잘 공지된 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견된 Fc 영역, 바람직하게는 천연 서열 사람 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 천연에서 발견된 Fc 영역, 바람직하게는 천연 서열 사람 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)으로 인하여 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예컨대, 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 및 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 내에 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 및 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 이와 적어도 약 95% 서열 동일성을 지닌다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 다특이적 항체, 예컨대, 이특이적 항체이다. 다특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 다특이적 항체는 본 발명의 2개의 단일 쇄 항체를 생성하는 본 발명의 2개의 재조합 핵산 분자의 숙주 세포내 재조합 동시-발현을 통해 수득될 수 있다. 이러한 쇄는 이황화물 브릿지를 통해 천연적으로 함께 회합되어 적어도 2개의 경쇄 및 적어도 2개의 중쇄를 포함하는 다특이적 항체를 형성하며, 상기 쇄의 가변 도메인은 적어도 2개의 상이한 에피토프를 인식한다.
일부 구현예에서, 항체는 정제된 항체이다. "정제된" 항체는 바람직하게는 이의 생산 세포 및/또는 다른 항체로부터 분리된, 이의 생산 환경의 구성성분으로부터 분리된 것이다. 특히, 항체는 예를 들면, 전기영동적(예컨대, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(isoelectric focusing: IEF), 모세관 전기영동) 또는 크래마토그래피적(예컨대, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정된 바와 같이 95% 또는 99% 이상의 순도로 정제될 수 있다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 고찰을 위해, 예컨대, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참고한다. 항체는 예를 들면, 본 발명의 재조합 핵산 분자를 발현하는 숙주 세포를 포함하는 배양 배지로부터 정제될 수 있다.
본 발명 또는 본원의 항체를 생산하는 방법에 따라서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 상동성인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 또한, 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상의(폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 모노클로날 항체는 기술자에 의해 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 항체는 키메라, 사람화된 또는 사람 항체일 수 있다.
"키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 부위가 특수한 종으로부터 유래되거나 특수한 항체 부류 또는 소부류에 속하는 항체 내 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성이지만, 쇄(들)의 나머지는, 이들이 목적한 생물학적 활성을 나타내는 한(Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81:6851-6855 (1984)) 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 소부류 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성이다. 바람직하게는, 항체의 골격의 적어도 일부는 사람 컨센서스 골격 서열(human consensus framework sequence)이다.
비-사람(예컨대, 쥐) 항체의 "사람화된" 형태는 비-사람 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에서, 사람화된 항체는 수용체의 초가변 영역 잔기가 비-사람 종(공여체 항체), 예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼 또는 목적한 특이성, 친화성, 및 능력을 가진 비사람 영장류로부터의 초가변 영역 잔기에 의해 대체된 사람 면역글로불린(수용체 항체)이다. 또한, 사람화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체 내에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정의하도록 한다. 일반적으로, 사람화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 영역 중 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기서 초가변 영역 중 모두 또는 실질적으로 모두는 비-사람 면역글로불린의 것에 상응하며 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 사람 면역글로불린 서열의 것에 상응한다. 사람화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 사람 면역글로불린의 것을 포함한다(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323.329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). 추가의 골격 영역 변형은 사람 골격 서열 내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 사람화된 항체는 또한 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 변형은 항체 기능을 추가로 정의하기 위해 이루어질 수 있고/있거나 사람화 과정을 증가시켰다. 항체의 "사람다움(humanness)"은 T20 점수매김 분석기를 사용하여 측정함으로써 문헌(Gao S H, Huang K, Tu H, Adler A S. BMC Biotechnology. 2013: 13:55)에 기술된 바와 같은 항체의 가변 영역의 사람다움을 정량화할 수 있다. "사람 항체" 또는 "완전한 사람 항체"는 사람에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 지니고/지니거나 본원에 개시된 바와 같은 사람 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 사람 항체의 정의는 비-사람 항원-결합 잔기를 포함하는 사람화된 항체를 구체적으로 배제한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 바람직하게는 사람 모노클로날 항체이다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 치료학적 항체이다. 치료학적 항체는 임의의 질환, 예를 들면, 암, 염증성 질환, 감염성 질환 또는 자가면역 질환의 치료에 유용할 수 있다.
특히, 본 발명의 항체는 치료학적 항체, 바람직하게는 승인된(예컨대, EMA 또는 FDA 승인된) 치료학적 항체의 가변 및/또는 불변 영역을 포함할 수 있다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 항체는 치료학적 항체, 바람직하게는 승인된 치료학적 항체의 가변 및 불변 영역을 포함한다. 이러한 치료학적 항체의 예는 아브킥시맙(abciximab), 아달리무맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베바키주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 브로달루맙, 카나키누맙, 카프로맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두필루맙, 두르발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에볼로쿠맙, 골리무맙, 이브리투맙, 이다루키주맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 나탈리주맙, 네키투무맙, 니볼루맙, 오빌톡삭시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 라무키루맙, 라니비주맙, 레슬리주맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 토킬리주맙, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 사릴루맙, 리툭시맙, 구셀쿠맙, 이노투주맙, 아달리무맙, 겜투주맙, 베바키주맙, 벤랄리주맙, 에미키주마 및 트라스투주맙을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 숙주 세포 또는 본 발명의 형질도입 유기체를 제공하는 단계, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 또는 상기 유기체가 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 성장하도록 하는 단계, 및 임의로 숙주 세포 배양물로부터 또는 상기 유기체의 샘플로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 임의로, 회수된 항체를 추가로 정제할 수 있다. 적합한 배지, 배양 조건 및 생산 방법은 기술자에게 잘 공지되어 있으며 생산될 숙주 세포 및 항체에 따라 용이하게 선택될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포 또는 형질도입 유기체는 비-사람이다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 또는 항체, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 조성물은 본 발명의 1개 또는 수개의 재조합 핵산 분자, 1개 또는 수개의 발현 카세트, 1개 또는 수개의 벡터, 1개 또는 수개의 바이러스 입자, 1개 또는 수개의 숙주 세포 및/또는 1개 또는 수개의 항체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적 제형" 또는 "약제학적 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하도록 하는 형태이며, 제형이 투여될 수 있는 대상체에게 허용불가능하게 독성인 추가의 구성성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 제형은 멸균성인데, 즉, 무균성이거나 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자를 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물 및/또는 사람에서 사용하기 위한, 유럽 약전(European Pharmacopeia)과 같은 인식된 약전 또는 규제기관(regulatory agency)에 의해 승인됨을 의미한다. 용어 "부형제"는 이와 함께 치료제가 투여되는 희석제, 보조제(adjuvant), 담체 또는 비히클(vehicle)을 지칭한다.
허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에 대해 무독성이며, 완충화제, 안정화제, 보존제, 등장화제(isotonifier), 비-이온성 세제, 항산화제 및 다른 다양한 첨가제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
당해 분야에 잘 공지된 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 부형제는 약리학적으로 효과적인 물질의 투여를 촉진시키는 비교적 불활성인 물질이며 액체 용액 또는 현탁액으로서, 유액(emulsion)으로서, 또는 사용 전에 액체 속에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형으로서 적용될 수 있다. 예를 들면, 부형제는 형태 또는 조도(consistency)를 제공할 수 있거나 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 삼투압을 변화시키는 염, 캡슐화제(encapsulating agent), pH 완충 물질, 및 완충제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 부형제는 과도한 독성없이 투여될 수 있는 눈에 직접 전달하기에 적합한 임의의 약제학적 제제를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 소르비톨, 임의의 다양한 트윈(tween) 화합물, 및 액체, 예를 들면, 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 광산 염, 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트 등; 및 유기 산의 염, 예를 들면, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 이에 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제의 완전한 논의는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition에서 이용가능하다.
약제학적 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법(regimen)은 치료될 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중, 및 성별 등에 의존한다.
투여에 사용된 용량은 다양한 매개변수의 함수로서, 및 특히 사용된 투여 방식, 관련 병리학, 또는 대안적으로 목적한 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제형화될 수 있다.
바람직하게는, 약제학적 제형은 주사될 수 있는 제형이다. 이는 특히 등장성, 멸균, 염수 용액(인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리학적 염수의 첨가시 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 동결-건조된 조성물일 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 적절한 용매 속에 필요한 양의 활성 화합물을 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 혼입시키고, 필요한 경우, 여과된 멸균화에 의해 제조할 수 있다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 및 추가의 목적한 성분을 이의 멸균-여과된 용액으로부터 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
비경구 투여, 예를 들면, 정맥내 또는 근육내 주사를 위해 제형화된 조성물 외에, 다른 약제학적으로 허용되는 형태는 예컨대, 경구 투여용 정제 또는 다른 고체; 시간 방출 캡슐(time release capsule); 및 현재 사용된 임의의 다른 형태를 포함한다.
약제학적 조성물은 1개 또는 수개의 추가의 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 활성 화합물의 예는 화학치료학적 약물, 항생제, 항기생충 제제, 항진균제 또는 항바이러스제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 및 항체의 모든 구현예가 또한 이러한 양태에서 고려된다.
본 발명은 또한 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포, 항체 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 질환의 치료를 위한 의약으로서 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포, 항체 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약의 제작 또는 제조를 위한 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포 또는 항체의 용도에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 상기 대상체에게 유효량의 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포, 항체 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 대상체에서 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 사람을 지칭한다.
질환은 항체, 특히 본 발명의 항체의 작용을 통해 치료되거나, 예방되거나, 완화될 수 있는 임의의 질환일 수 있다. 이러한 질환의 예는 암, 감염성 질환, 자가-면역 질환 및 염증성 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포, 항체 및 약제학적 조성물의 모든 구현예가 또한 이러한 양태에서 고려된다.
본 발명은 또한 질환의 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한, 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포, 항체 또는 약제학적 조성물, 바람직하게는 항체에 관한 것이다.
진단되거나 검출될 질환은 항체에 의존한다.
방법은 샘플 속에서 존재하는 경우, 이의 항원에 대한 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 생물학적 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계, 및 복합체가 항체와 이의 항원 사이에 형성되어 있는지를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 방법일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 진단 방법에 사용된 본 발명의 항체가 표지된다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 모이어티(예를 들면, 형광성, 발색성, 전자-밀도, 발광성, 및 방사활성 표지) 뿐만 아니라 모이어티, 예를 들면, 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 이는 예컨대, 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출된다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 핵산 분자, 발현 카세트, 벡터, 바이러스 입자, 숙주 세포, 항체 또는 약제학적 조성물, 및 임의로 이러한 키트(kit)를 사용하기 위한 안내서를 제공하는 전단(leaflet)을 포함하는 질환의 진단 또는 검출용 키트(kit)에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 또한 본 발명의 항체와 이의 항원의 복합체를 검출하는데 요구된 1개 또는 수개의 시약을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 질환을 진단하거나 검출하기 위한 본 발명의 키트의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 명시된 값의 값 ± 10%의 범위, 보다 바람직하게는 명시된 값의 값 ± 5%의 범위를 지칭한다. 예를 들면, "약 1"은 10%를 고려하는 경우 0.9 내지 1.1를 의미하며 5%를 고려한 경우 0.95 내지 1.05이다.
본원에 사용된 바와 같은, 동사 "포함하기 위한"은 이의 비-제한적 의미 내에서 단어 다음의 항목이 포함되지만, 구체적으로 언급되지 않는 항목이 배제되지 않음을 의미하기 위해 사용된다. 또한, 부정 관사 "하나"("a" 또는 "an")에 의한 성분에 대한 참고는 문맥이 성분들 중 하나 및 단지 하나가 존재함을 명확히 요구하지 않는 한, 성분 중 하나 이상이 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정 관사 "하나"("a" 또는 "an")는 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌 참고문헌은 이의 전문이 참고로 본원에 포함된다.
다음의 실시예는 설명의 목적으로 제공되며 제한하지 않는다.
실시예
물질 및 방법
항-CD20 scFull-Ig의 작제
유전자 합성 반응을 사용하여 항-CD20 scFull-Ig(단일 쇄 전체 길이 Ig)를 암호화하는 완전한 합성 카세트를 생성하였다. 가변 도메인은 리툭시맙 서열을 기반으로 하였다. 단일-쇄 Fab 단편을 수득하기 위하여, 본 발명자들은 원래의 전략을 설계하였으며 이에 의해:
- 전체 길이의 VH, DJH 및 VkJk가 18개 잔기 링커(휘트로우(Whitlow) 218 링커; GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열 번호: 1)에 의해 연결되고
- 다음에 매우 동일한 18-잔기 링커 서열에 의해 다시 연결된 Ck 및 γ 중쇄 CH1 도메인이 연결된다.
단일 쇄 "Fab" 도메인을 암호화하는 이러한 서열에 이어 CH2 및 CH3 서열 및 폴리아데닐화 부위가 뒤따른다. Ig 서열의 최적의 발현은 인트론(intron)에 의해 선호되므로, 본 발명자들은 VH 서열의 상부에 천연의 제1의 인트론[리더 엑손-VH 엑손]을 포함함으로써 배선 서열에 따라 엑손 1 및 2를 지닌 VH 게놈 구조를 보존하였다. 또한, VH 프로모터 서열은 작제물의 상부에 삽입시켰다.
최종적으로, 작제물을 pCDNA3.1(+) 벡터 내로 클로닝하였으며, 이는 HindIII 및 EcoRI 부위에서 선택을 위한 네오마이신 유전자 내성을 함유한다.
생산
CHO 및 293 세포를 막스펙틴 시약(Macsfectin reagent)에 의해 플라스미드 벡터로 형질감염시키고, 형질감염 후 0.5 내지 1 mg/mL G418 보충된 배지를 사용하여 선택하였다. 3 내지 4주 후, 상층액을 효소-연결된 면역흡착성 검정, 및 유동 세포분석에 의해 발현에 대해 스크리닝(screening)하였다. 상층액은 궁극적으로 10-kDa 컷-포프(cut-off)를 사용한 비바스핀 배치(Vivaspin disposal) 상에서 원심분리에 의해 농축시켰다.
특성화
ELISA의 경우, scFull-Ig를 폴리클로날 항-사람 Fc-특이적인 항체에 의해 포획하고, HRP-접합된 항-사람 IgG(H+L) 항체(둘 다 Sigma Aldrich로부터 구입)로 검출하였다.
유동 세포분석을 위해, CD20 막 항원(또는 음성 대조군 세포)를 발현하는 100 000개의 세포를 50 μL의 상층액과 함께 30분 동안 2 내지 8℃에서 항온처리하였다. 냉 PBS-1% SAB로 3회 세척 후, 10 μL의 희석된 항-사람 IgG(H+L)-Dylight 650을 세포 현탁액에 가하였다. 후속적으로, 2 내지 8℃에서 20분 동안 항온처리 후, 세포를 3회 세척하고 최종적으로 300 μl의 완충액으로 재-현탁시켰다. 요오드화프로피듐을 죽은 세포를 배제시키기 위해 판독 직전에 가하였다. 살아있는 세포 상에 게이트된(gated) 10 000개의 현상을 FACS Calibur 세포분석기 상에 기록하였다.
결과
도 1: scFull-Ig 전략의 개략도
도 2: 항-CD20 scFull-Ig 발현을 위해 작제된 플라스미드의 맵(map). 작제물은 HindIII 및 EcoRI 부위에서 pCDNA3.1(+) 벡터 내로 삽입되었다.
도 3: ELISA에 의한 미가공 상층액(raw supernatant) 속에서 재조합 mAb의 검출. 형질감염된 세포로부터의 상층액을 수집하고 ELISA로 분석하였다. 재조합 IgG1 및 IgM mAb를 각각 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 예측한 바와 같이, scFull-Ig를 CHO 및 293 형질감염된 세포주 상층액에서 둘 다 검출하였다.
도 4: scFull-Ig 상층액을 사용한 표적 세포의 염색, scFull-Ig 구조의 기능성을 보증하기 위하여, 상이한 세포 표적을 미가공 상층액의 상이한 배치(batch) 또는 희색액과 함께 항온처리하였다. 4a, 시험한 상이한 미가공 상층액을 사용하여 SUD 세포주에서 관찰된 대표적인 염색(typical taining). 4b, 양성(SUD 및 DOHH2) 또는 음성(DOHH2-KO CD20) CD20 세포주에서 측정된 기하 평균 형광성. 리툭시맙은 양성 대조군으로서 사용하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> ETABLISSEMENT FRANCAIS DU SANG
<120> RECOMBINANT SINGLE CHAIN IMMUNOGLOBULINS
<130> IP20203868FR
<160> 7
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Whitlow 218 linker
<400> 1
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker PT1
<400> 2
Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker PT2
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker PT3
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker L205
<400> 5
Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala
1 5 10 15
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly
20 25
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker LLB18
<400> 6
Ser Pro Asn Gly Ala Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Gln Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ala Ser Gly Ser Gln
20
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide linker Linker-M
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Claims (31)
- - 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH)을 암호화하는 서열,
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 서열,
- 경쇄 불변 영역(CL)을 암호화하는 서열,
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로서,
여기서 핵산 분자가 다음의 구조:
VH-PL1-VL-CL-PL2,
를 포함하는 재조합 핵산 분자로,
상기 PL1 및 PL2는 동일하거나 상이한, 재조합 핵산 분자. - 제1항에 있어서, 공여체 스플라이스 부위(donor splice site)를 추가로 포함하고 다음의 구조: VH-PL1-VL-CL-PL2-공여체 스플라이스 부위,를 포함하는, 재조합 핵산 분자.
- 제1항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH)을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 재조합 핵산 분자로서, 여기서 핵산 분자가 다음의 구조를 포함하는 재조합 핵산 분자:
VH-PL1-VL-CL-PL2-CH . - 제3항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 암호화하는 서열이 3개 또는 4개의 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 암호화하는, 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자가 정확한 위치에서 상동성 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 상기 핵산 분자의 통합을 지시하기 위한 추가의 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 재조합 핵산 분자.
- 제5항에 있어서, 상기 추가의 폴리뉴클레오타이드가 면역글로불린 중 유전자자리(immunoglobulin heavy locus) 내로, 보다 바람직하게는 면역글로불린 중쇄의 결합 영역(joining region: JH) 유전자와 불변 영역(CH) 유전자 사이로의 통합을 지시하는 재조합 핵산 분자.
- 제2항, 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 공여체 스플라이스 부위가 불변 면역글로불린 중 유전자의 CH1 도메인과의 접합을 위한 공여체 스플라이스 부위인 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 링커가 10 내지 25개 아미노산 길이, 바람직하게는 15 내지 20개 아미노산 길이인 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, PL1 및/또는 PL2가 서열 번호: 1 내지 7의 서열, 및 서열 번호: 1 내지 7의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 이루어진, 재조합 핵산 분자.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, PL1 및/또는 PL2가 서열 번호: 1의 서열, 또는 서열 번호: 1의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성을 포함하거나, 이로 이루어진, 재조합 핵산 분자.
- 조절 서열과 혼용성인 조건 하에서 적합한 숙주 세포 내에서 재조합 핵산 분자의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 재조합 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트(expression cassette).
- 제11항의 발현 카세트를 포함하는 벡터.
- 제12항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터인 벡터.
- 제13항에 있어서, 상기 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 보다 바람직하게는 AAV6 벡터인 벡터.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 바이러스 입자.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 카세트, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 제15항에 따른 바이러스 입자를 포함하는 단리된 세포.
- 제16항에 있어서, 단리된 세포가 사람 배아 줄기 세포가 아닌 단리된 세포.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 세포가 마우스 배아 줄기 세포인 세포.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 B 세포, 바람직하게는 사람 B 세포인 세포.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 세포를 포함하는 형질도입 유기체, 바람직하게는 비-사람 형질도입 유기체.
- 제20항에 있어서, 상기 유기체가 마우스인 형질도입 유기체.
- - 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH),
- 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL),
- 면역글로불린 경쇄 불변 영역(CL),
- 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH), 및
- 펩타이드 링커(PL1 및 PL2)를 암호화하는 2개의 서열을 포함하는 항체로서, 여기서 VH가 PL1을 통해 VL에 융합되고 CL이 PL2를 통해 CH에 융합되며, 여기서 PL1 및 PL2가 동일하거나 상이한, 항체. - 제22항에 있어서, 전체 길이의 항체, 바람직하게는 전체 길이의 IgG 항체인 항체.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 항체가 치료학적 항체인 항체.
- 제24항에 있어서, 상기 항체가 아브킥시맙, 아달리무맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베바키주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 브로달루맙, 카나키누맙, 카프로맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두필루맙, 두르발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에볼로쿠맙, 골리무맙, 이브리투맙, 이다루키주맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 나탈리주맙, 네키투무맙, 니볼루맙, 오빌톡삭시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 라무키루맙, 라니비주맙, 레슬리주맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 토킬리주맙, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 사릴루맙, 리툭시맙, 구셀쿠맙, 이노투주맙, 아달리무맙, 겜투주맙, 베바키주맙, 벤랄리주맙, 에미키주마 및 트라스투주맙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 치료학적 항체의 가변 및/또는 불변 영역을 포함하는 항체.
- 항체를 발현하는, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 제20항 또는 제21항에 따른 형질도입 유기체를 제공하는 단계, 및 상기 항체를 세포 배양물로부터 또는 상기 유기체의 샘플로부터 회수하는 단계를 포함하는, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항체의 생산 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 카세트, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제15항에 따른 바이러스 벡터, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 질환의 예방 또는 치료시 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 카세트, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제15항에 따른 바이러스 벡터, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제27항에 따른 약제학적 조성물.
- 질환의 진단 또는 검출시 사용하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 카세트, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제15항에 따른 바이러스 벡터, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제27항의 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자, 제11항에 따른 발현 카세트, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제15항에 따른 바이러스 벡터, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제27항의 약제학적 조성물, 및 임의로 키트(kit)를 사용하기 위한 안내서를 제공하는 전단(leaflet)을 포함하는, 질환의 진단 또는 검출용 키트.
- 질환을 진단 또는 검출하기 위한, 제30항에 따른 키트의 용도.
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