CN111902426A - 重组单链免疫球蛋白 - Google Patents

重组单链免疫球蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN111902426A
CN111902426A CN201980017280.8A CN201980017280A CN111902426A CN 111902426 A CN111902426 A CN 111902426A CN 201980017280 A CN201980017280 A CN 201980017280A CN 111902426 A CN111902426 A CN 111902426A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
nucleic acid
cell
acid molecule
vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980017280.8A
Other languages
English (en)
Inventor
雅尼茨·当热
米歇尔·科涅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fa Guoxueyejigou
Francais du Sang Ets
Original Assignee
Fa Guoxueyejigou
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fa Guoxueyejigou filed Critical Fa Guoxueyejigou
Publication of CN111902426A publication Critical patent/CN111902426A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
    • G01N33/541—Double or second antibody, i.e. precipitating antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种抗体，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白轻链可变区(VL)、免疫球蛋白轻链恒定区(CL)、免疫球蛋白重链恒定区(CH)和两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，其中VH通过PL1与VL融合并且CL通过PL2与CH融合，以及其用于治疗或诊断目的的用途。本发明还涉及一种编码所述抗体的重组核酸分子，以及包含所述重组核酸分子的表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞、转基因生物或药物组合物。

Description

重组单链免疫球蛋白
技术领域
本发明涉及医学领域，特别是涉及一种免疫球蛋白的新结构，其可以打开枷锁以根据目的重新设计B细胞特异性。
背景技术
癌症治疗是一个非常活跃的领域，在免疫疗法、细胞疗法和基因疗法方面有多重发展。靶向肿瘤特异性抗原或免疫检查点的抗体已经完全改变了许多肿瘤类型的预后，产生长期缓解并最终将致命疾病转变为几乎在免疫系统控制之下的慢性疾病。
尽管抗体分子已因此成为抗癌的主要工具，但产生这些药物的细胞仍无法进行生物技术操作和用于细胞疗法。一些报道已经初步获得了通过浆细胞产生重组蛋白(特别是凝血因子)，但仅仅是在短期和实验情形下(Hung等,2018.Mol.Ther.J.Am.Soc.GeneTher.,26,456-467；Levy等,2016.J.Thromb.Haemost.JTH,14,2478-2492)。尽管根据目的重新设计B细胞特异性并产生肿瘤特异性B细胞显然引起了很高的关注，但这受到两个生化枷锁的阻碍。
首先，免疫球蛋白是H-L聚合物，需要化学计量表达，并且需要同时表达两个重组蛋白才能产生正确的Ig。其次，B细胞强烈表达大量的内源性Ig。因此，在已经表达Hr和Lr分子的接受者(r)细胞中，简单地添加额外的供体(d)Hd和Ld链(和最终表达不良)产生杂合分子(HrLr、HrLd、HdLr和HdLd…)的混合物，其中具有所需供体样特异性的正确组装的HL链的量非常难以预测。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种重组核酸分子，其包含
-编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的序列，
-编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的序列，
-编码轻链恒定区(CL)的序列，
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，并且
其中所述核酸分子包含以下结构：
VH-PL1-VL-CL-PL2，
其中PL1和PL2相同或不同。
重组核酸分子还可包含供体剪接位点并表现出以下结构VH-PL1-VL-CL-PL2-供体剪接位点。
或者，重组核酸分子可包含
-编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的序列，
-编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的序列，
-编码轻链恒定区(CL)的序列，
-编码免疫球蛋白重链恒定区(CH)的序列，和
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，
其中所述核酸分子包含以下结构：
VH-PL1-VL-CL-PL2-CH
其中PL1和PL2相同或不同。
优选地，编码免疫球蛋白重链恒定区的序列编码三个或四个免疫球蛋白重链恒定结构域。
重组核酸分子还可包含另外的多核苷酸，所述另外的多核苷酸用于指导所述核酸分子通过同源重组在精确位置处整合到宿主细胞的基因组中，优选整合到免疫球蛋白重链基因座中，更优选在免疫球蛋白重链的连接区(JH)基因与恒定区(CH)基因之间。
优选地，供体剪接位点是用于与恒定免疫球蛋白重链基因的CH1结构域连接的供体剪接位点。
优选地，肽接头为10至25个氨基酸长度，优选为15至20个氨基酸长度。
在另一方面，本发明涉及一种表达盒，其包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的重组核酸分子，所述一个或多个控制序列指导所述核酸在与所述控制序列相容的条件下在合适的宿主细胞中的表达。
特别地，重组核酸分子可以可操作地连接至免疫球蛋白VH启动子。
在另一方面，本发明涉及一种包含本发明表达盒的载体。
所述载体优选是病毒载体，更优选是逆转录病毒载体，甚至更优选是慢病毒载体。
在优选的实施方式中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体，优选是AAV6载体。
在另一方面，本发明涉及一种包含本发明载体的病毒颗粒。
在另一方面，本发明涉及一种分离的细胞，其包含本发明的重组核酸分子、表达盒、载体或病毒颗粒。
优选地，所述细胞是小鼠胚胎干细胞。
或者，所述细胞是B细胞，优选是人类B细胞。
在另一方面，本发明涉及一种除人类以外的转基因生物，其包含至少一个本发明的细胞，优选地所述转基因生物是小鼠。
在另一方面，本发明涉及一种抗体，其包含
-免疫球蛋白重链可变区(VH)，
-免疫球蛋白轻链可变区(VL)，
-免疫球蛋白轻链恒定区(CL)，
-免疫球蛋白重链恒定区(CH)，和
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，
其中VH通过PL1与VL融合并且CL通过PL2与CH融合，并且其中PL1和PL2相同或不同。
本发明还涉及一种产生本发明抗体的方法，所述方法包括提供本发明的细胞或转基因生物，所述细胞或生物表达所述抗体，以及从细胞培养物中或从所述生物的样品中回收所述抗体。
在另一方面，本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、细胞或抗体，以及药学上可接受的赋形剂。
附图说明
图1：免疫球蛋白G1类(左，现有技术)和本发明的全长单链Ig G1类(右)的示意图。与天然IgG1相比，重链可变结构域通过肽接头从重链可变结构域的C末端到轻链可变结构域的N末端与轻链可变结构域连接。轻链恒定结构域的C末端部分通过另一个肽接头与N末端重链恒定结构域连接。
图2：利妥昔单抗(rituximab)的VDJ序列通过Whitlow 218接头与VJ序列连接。为了优化转录，在编码重链可变结构域的第一外显子与第二外显子之间保留了内含子结构。恒定κ序列通过相同的Whitlow 218接头连接至恒定重链。该序列的合成定购自GenecustCompany，并插入pCDNA3.1(+)载体中。
图3：转染的CHO或HEK 293细胞系的上清液通过ELISA方法分析。上清液中的IgG分子被包被在96孔板上的抗Fc多克隆抗体捕获。通过添加HRP偶联的抗IgG(H+L)多克隆抗体来实现检测。IgG1重组蛋白用作阳性对照，而阴性对照是IgM类重组分子。
图4：用scFull-Ig上清液对靶细胞染色。4A)流式细胞术概况：在阳性CD20细胞系(SUDHL4和DOHH)或CD20表达受破坏的阴性对照DOHH KOCD20上检测到scFull-Ig抗CD20抗体。在30分钟内在2-8℃下将SUDHL4细胞系与50μL上清液一起温育。洗涤后，将荧光多克隆抗hIgG(H+L)抗体在2-8℃下温育20分钟。洗涤细胞，然后在FACSCalibur细胞仪上进行流式分析。与稀释的上清液一起温育后，在不同的细胞系(SUDHL4、DOHH2和DOHH2 KO CD20)上测量荧光的几何平均值，将其绘制在右侧直方图上(4B)。
具体实施方式
本文的发明人提供了一种策略来打开枷锁以根据目的重新设计B细胞特异性，特别是采用适合于单链表达的免疫球蛋白形式作为抗原的膜连接B细胞受体(BCR)，或作为分泌的抗体。实际上，他们证实重组全长免疫球蛋白可以表达为包含两个接头的单链分子，并且其结构与正常和完整的免疫球蛋白高度相似。由于使用至少两个肽接头，通过抗体的所有结构域的融合获得了该分子，第一接头将重链可变区的C末端融合至轻链可变区的N末端并且第二接头将轻链恒定区的C末端融合至γ重链恒定区CH1结构域的N末端部分(图1)。如本申请的实验部分所示，本发明人证实了用编码所述全长单链免疫球蛋白的核酸转化的CHO和HEK 293细胞可以有效地产生重组抗体，并且该抗体可以有效地识别其抗原。
该策略不仅解决了关于重链与轻链之间的化学计量的问题，而且还可以容易地中断内源性免疫球蛋白重链的表达，促进重组抗体的高表达，并有可能使用控制膜型和分泌型Ig的交替剪接和聚腺苷酸化的内源性调控序列，使得重组抗体可以在记忆B淋巴细胞中以膜结合BCR的形式表达，或者在浆细胞中以分泌型Ig的形式表达。
因此，在第一方面，本发明涉及一种重组核酸分子，其包含以下或由以下组成：
-编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的序列，
-编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的序列，
-编码轻链恒定区(CL)的序列，
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，并且
其中所述核酸分子包含以下结构：
VH-PL1-VL-CL-PL2。
优选地，结构VH-PL1-VL-CL-PL2意味着这些元件中的每一个都紧邻其相邻元件，即编码VH的序列直接连接至编码PL1的序列，编码PL1的序列直接连接至编码VL的序列，编码VL的序列直接连接至编码CL的序列，并且编码CL的序列直接连接至编码PL2的序列。
如本文所用，术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA，基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合物，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其它天然、化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸酯基团(通常可在RNA或DNA中发现)，或者修饰或取代的糖或磷酸酯基团。或者，多核苷酸的骨架可以包含合成亚基例如氨基磷酸酯的聚合物，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。可以通过本领域技术人员已知的任何方法来制备本发明的核酸，包括化学合成、重组和诱变。在优选的实施方式中，本发明的核酸是DNA分子，优选双链DNA分子，其可以通过本领域技术人员众所周知的重组方法合成。
“重组核酸”表示已被工程化并且在自然环境中，特别是在野生型生物中未发现的核酸。
本发明的核酸分子包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的序列和编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的序列。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。术语“免疫球蛋白重链可变区”或“重链可变结构域”可以称为“VH”。术语“免疫球蛋白轻链可变区”或“轻链可变结构域”可以称为“VL”。这些结构域通常是抗体中变化最大的部分并且含有抗原结合位点。
轻链或重链可变区(VL或VH)由被称为“互补决定区”或“CDR”的三个高变区中断的框架组成。于是，VL或VH通常包括四个框架区或“FR”，其在本领域中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；以及“框架区4”或“FR4”。这些构架区和互补决定区优选以下列顺序可操作地连接：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(从氨基末端到羧基末端)。
框架区和CDR的范围已被精确地定义，例如在Kabat中(参见"具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)",E.Kabat等,U.S.Department of Health and Human Services,(1983))。给定的VH或VL的CDR可通过本领域技术人员可用的任何方法来确定。举例来说并且以非限制性方式，Chlothia或Kabat方法可用于确定CDR(Chothia等,Nature 342,877-883；Kabat等,1991,具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,UnitedStates Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda)。也可以使用确定CDR的替代方法，例如Chlothia和Kabat之间的中间方法，称为AbM(OxfordMolecular AbM抗体建模软件)，或基于对可用复杂结构的分析的所谓“接触”方法。
抗体的构架区，即组成轻链和重链的组合构架区，用于定位和排列主要负责与抗原结合的CDR。
本发明的核酸分子包含编码轻链恒定区(CL)的序列。
如本文所定义的“恒定区”是指抗体来源的恒定区，其由轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因之一编码。
如本文所用，“免疫球蛋白轻链恒定区”、“恒定轻链”或“轻链恒定区”是指由κ(Cκ)或λ(Cλ)轻链编码的抗体的区域，并且可以被称为“CL”。恒定轻链通常包含单个结构域。
在一些实施方式中，本发明的核酸分子包含以下或由以下组成：
-编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的序列，
-编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的序列，
-编码轻链恒定区(CL)的序列，
-编码免疫球蛋白重链恒定区(CH)的序列，和
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，和
其中所述核酸分子包含以下结构：
VH-PL1-VL-CL-PL2-CH
优选地，编码PL2的序列直接连接至编码CH的序列。
如本文所用，“免疫球蛋白重链恒定区”、“恒定重链”或“重链恒定区”是指由μ、δ、γ、α或ε基因编码以分别将抗体同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE的抗体区域。该区域可以被称为“CH”。
恒定重链通常包含三个或四个结构域。作为说明，对于全长IgD、IgG或IgA抗体，如本文所定义的重链恒定区是指CH1结构域的N末端至CH3结构域的C末端，并且对于全长IgE或IgM抗体，如本文所定义的重链恒定区是指CH1结构域的N末端至CH4结构域的C末端。
或者，CH区可包含全长抗体的恒定重链的片段或由全长抗体的恒定重链的片段组成。例如，CH区可以包含一个或两个结构域如CH1和/或CH2，由一个或两个结构域如CH1和/或CH2组成。
在一些其它实施方式中，本发明的核酸分子包含以下或由以下组成：
-编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的序列，
-编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的序列，
-编码轻链恒定区(CL)的序列，
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，和
-供体剪接位点
其中所述核酸分子包含以下结构：
VH-PL1-VL-CL-PL2-供体剪接位点
优选地，编码PL2的序列直接连接至包含供体剪接位点的序列。
根据预期用于表达本发明核酸的宿主细胞和设想的整合位点来设计供体剪接位点。
供体剪接位点优选被设计用于与宿主细胞的恒定免疫球蛋白重链基因的CH1结构域连接。这种供体剪接位点的使用说明于以下文章中：Delpy等(Eur.J.Immunol.,2003,33,2108-2113)或Casola等(Nat.Immunol.,2004,5,317-327)。
众多生物信息学工具是技术人员已知的，并且可以用于预测和设计剪接信号和剪接事件，例如GeneSplicer(http://ccb.jhu.edu/software/genesplicer/)或Spliceport(http://spliceport.cbcb.umd.edu/)。也参见Breathnach R,Chambon P.Annu RevBiochem.1981；50:349-83。在一个实施方式中，供体剪接位点是隐性剪接位点。
本发明的核酸分子包含至少两个编码肽接头即PL1和PL2的序列。
肽接头PL1和PL2可以相同或不同。
在由本发明的核酸分子编码的抗体中，肽接头PL1将VH区的C末端与VL区的N末端接合，并且肽接头PL2将CL的C末端与CH区的N末端接合。
在本发明的核酸分子中，编码肽接头PL1的序列将编码VH区的序列与编码VL区的序列接合。
取决于实施方式，编码肽接头PL2的序列将编码CL区的序列与编码CH区的序列或包含供体剪接位点的序列接合。
肽接头的长度通常为5至50个氨基酸。优选地，肽接头为10至25个氨基酸长度，更优选为15至20个氨基酸长度，甚至更优选为约18个氨基酸长度。
通常，肽接头的序列包含大多数亲水性氨基酸如甘氨酸和丝氨酸，或由亲水性氨基酸如甘氨酸和丝氨酸组成。
技术人员可以从先前在单链片段可变(scFv)抗体中描述的任何肽接头中选择可用于本发明的肽接头。此类肽接头的实例描述于Gu等(Ann Biomed Eng.2010年2月；38(2):537-49)，
Figure BDA0002666629340000101
等(Protein Eng.2001年10月；14(10):815-23)，Pantoliano等(Biochemistry.1991年10月22日；30(42):10117-25)，Whitlow等(Protein Eng.1993年11月；6(8):989-95)或Hennecke等(Protein Eng.1998年5月；11(5):405-10)。
此类肽接头的具体实例呈现如下：
Figure BDA0002666629340000111
在一个特定的实施方式中，PL1和/或PL2包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：序列SEQ ID NO:1至7，以及与SEQ ID NO:1至7的序列具有至少80％、优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一个特定的实施方式中，PL1和/或PL2包含以下或由以下组成：序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:1)，或与SEQ ID NO:1具有至少80％、优选至少90％、更优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”是指来自两个多肽序列的比对的位置中的匹配(相同氨基酸残基)的数目(％)。通过在比对时比较序列以使重叠和同一性最大化并同时使序列空位最小化来确定序列同一性。特别地，取决于两个序列的长度，可以使用多种数学全局或局部比对算法中的任一种来确定序列同一性。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch,1970)进行比对，该算法在整个长度上对序列进行最佳比对，而基本上不同长度的序列则优选使用局部比对算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman,1981)或Altschul算法(Altschul等,1997；Altschul等,2005)进行比对。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以本领域技能范围内的各种方式来实现比对，例如，使用可在互联网网站如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上获得的公开可用计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，氨基酸序列同一性％值是指使用逐对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序使用Needleman-Wunsch算法来创建两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数均设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝错，末端空位开放＝10，和末端空位延伸＝0.5。
本发明的重组核酸分子还可包含用于指导所述核酸分子通过同源重组在精确位置处整合到宿主细胞的基因组中的另外的序列。
优选地，本发明的核酸分子在两个末端上侧接有与宿主细胞基因组的精确位置同源的序列。此类序列可以被技术人员容易地定义。
同源重组可以在有或没有常规用于这种重组的核酸酶如ZFN、TALE核酸酶、CRISPR/Cas9的帮助下进行。
特别地，另外的序列可以是跨越由CRISPR/Cas9系统产生的双链断裂(DSB)点的微同源序列。微同源序列的特征是对给定基因具高度特异性并且在靶向基因组的另一个位置未发现的短(通常约10至50bp)序列。众多生物信息学工具是技术人员已知的，并且可以用于设计这些序列如NBRP Medaka(http://viewer.shigen.info/cgi-bin/crispr/crispr.cgi)。任选地，这些微同源序列可以侧接有PITCh结合位点使用MMEJ(微同源介导的末端接合)机制进行整合(Sakuma等,Nat Protoc.2016年1月；11(1):118-33)。
在优选的实施方式中，这些另外的序列允许通过同源重组整合到免疫球蛋白重链基因座中，更优选在免疫球蛋白重链的连接区(JH)基因与恒定区(CH)基因之间。优选地，在该实施方式中，本发明的核酸分子表现出以下结构：如上文所定义的VH-PL1-VL-CL-PL2-供体剪接位点，并且RNA剪接产生包含VH-PL1-VL-CL-PL2-CH的融合蛋白，其中CH由宿主细胞基因组编码。然后可以从任何Ig重链基因的任何CH1外显子的上游选择插入位点，该插入位点的序列用于设计同源序列。
在另一方面，本发明涉及一种表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的重组核酸分子，所述一个或多个控制序列指导所述核酸在与所述控制序列相容的条件下在合适的宿主细胞中的表达。
术语“控制序列”是指基因表达所必需的核酸序列。控制序列可以是天然的(可操作地连接至天然存在的基因组中的编码序列)或异源的(不同于可操作地连接至天然存在的基因组中的编码序列的控制序列)。这样的控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上的核酸序列的缔合，使得一个核酸分子的功能受到另一个核酸分子的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，即该编码序列在该启动子的转录控制下，该启动子与该编码序列可操作地连接。
如本文所用，术语“表达盒”是指包含编码序列和表达所述编码序列所需的一个或多个控制序列的核酸构建体。通常，表达盒包含表达目标基因产物所需的编码序列和在所述编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常包含启动子序列、5'非翻译区、编码序列和3'非翻译区，其通常含有聚腺苷酸化位点和/或转录终止子。表达盒还可以包含另外的调控元件，例如，增强子序列、促进DNA片段在载体内插入的多接头序列和/或剪接信号序列。表达盒通常包含在载体内，以促进克隆和转化。
在一个具体的实施方式中，本发明的重组核酸与免疫球蛋白VH启动子、优选预期宿主细胞的免疫球蛋白VH启动子可操作地连接。这样的启动子可以由技术人员容易地选择。优选地，预期的宿主细胞是人类宿主细胞，并且启动子是人类启动子，优选人类免疫球蛋白VH启动子，或在B细胞谱系中有活性的任何启动子。
在优选的实施方式中，启动子是诱导型启动子。利用该启动子，可以根据目的触发重组单链抗体的产生。
本发明的表达盒还可以包含用于指导其通过同源重组在精确位置处整合到宿主细胞的基因组中的另外的序列。这些序列可以如上文对于重组核酸分子所定义的。
在这方面也考虑了重组核酸分子的所有实施方式。
在另一方面，本发明涉及包含本发明的重组核酸分子或表达盒的载体。
“载体”是指核酸分子，优选地是例如源自质粒、噬菌体或病毒的DNA分子，核酸序列可插入其中或克隆于其中。载体的非限制性实例包括质粒，噬菌体，粘粒，噬菌粒，酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)，人类人工染色体(HAC)，病毒载体如腺病毒载体或逆转录病毒载体，以及其它DNA序列，它们通常用于基因工程和/或能够将所需的DNA序列传递至宿主细胞内的所需位置。
载体优选含有一个或多个限制位点，并且能够在包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织的限定宿主细胞中自主复制，或与限定宿主的基因组部分或完全整合，使得克隆的序列是可复制的。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如线性或封闭的环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可含有任何确保自我复制的构件。或者，载体可以是这样的载体：当引入宿主细胞时，该载体被整合到基因组中并与已经整合到其中的染色体一起复制。载体的选择通常取决于载体与要将载体引入其中的宿主细胞的相容性。
所述载体还可包含一种或多种编码可选择标志物如营养缺陷型标志物(例如LEU2、URA3、TRP 1或HIS3)、可检测标记如荧光或发光蛋白(例如GFP、eGFP、DsRed、CFP)、或赋予对化学/有毒化合物的抗性的蛋白质(例如，赋予替莫唑胺抗性的MGMT基因)的核酸序列。这些标志物可以用于选择或检测包含载体的宿主细胞，并且可以由技术人员根据宿主细胞容易地选择。
本发明的载体优选是病毒基因组载体，其包括在宿主细胞中建立本发明的重组核酸分子表达所需的任何元件，例如启动子、ITR、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标志物、内含子、polyA信号和/或复制起点。
在一些实施方式中，载体是病毒载体，例如源自莫洛尼(Moloney)鼠类白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV或SNV的载体，慢病毒载体(例如源自人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)或马感染性贫血病毒(EIAV))，腺病毒(Ad)载体，腺相关病毒(AAV)载体，猿猴病毒40(SV-40)载体，牛乳头瘤病毒载体，爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)，疱疹病毒载体，牛痘病毒载体，哈维(Harvey)鼠类肉瘤病毒载体，鼠类乳腺肿瘤病毒载体，劳斯(Rous)肉瘤病毒载体。
在特定实施方式中，载体是逆转录病毒载体，优选慢病毒载体或非病原性细小病毒。
如本领域中已知的，取决于考虑使用的特定病毒载体，应当将合适的序列引入本发明的载体中以获得功能性病毒载体，例如用于AAV载体的AAV ITR或用于慢病毒载体的LTR。
在优选的实施方式中，载体是AAV载体。
人类细小病毒腺相关病毒(AAV)是天然复制缺陷型依赖病毒，其能够整合到受感染细胞的基因组中以建立潜伏感染。最后的特性似乎在哺乳动物病毒中是独特的，因为整合发生在人类基因组中被称为AAVS1的位于19号染色体的特定位点(19ql3.3-qter)处。因此，AAV作为人类基因疗法的潜在载体已经引起了相当大的关注。所述病毒的有利特性包括缺乏与任何人类疾病的关联性，感染分裂细胞和非分裂细胞的能力，以及可以感染的源自不同组织的多种细胞系。
如本文所用，术语“AAV载体”是指包含一个或多个异源序列(即，非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列侧接有至少一个AAV反向末端重复序列(ITR)，优选两个ITR。当存在于已经被合适的辅助病毒(或表达合适的辅助功能)感染并且表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，这种AAV载体可以被复制并包装到感染性病毒颗粒中。
“反向末端重复”或“ITR”序列是本领域众所周知的术语，并且是指在病毒基因组的末端以相反方向存在的相对较短的序列。“AAV反向末端重复(ITR)”序列是存在于天然单链AAV基因组的两个末端的大约145个核苷酸的序列。ITR的最外侧125个核苷酸可以两种交替方向之一存在，从而导致不同AAV基因组之间以及单个AAV基因组的两个末端之间的异质性。最外侧的125个核苷酸还含有若干较短的自互补区域(指定为A、A'、B、B'、C、C和D区域)，从而允许在ITR的这个部分内发生链内碱基配对。用于本发明载体的AAV ITR可以具有野生型核苷酸序列或者可以通过插入、缺失或取代而改变。AAV载体的反向末端重复序列(ITR)的血清型可选自任何已知的人类或非人类AAV血清型。
现已鉴定到多种腺相关病毒(AAV)血清型，包括12种人类血清型和超过100种来自非人类灵长类动物的血清型(Howarth等,2010,Cell Biol Toxicol 26:1-10)。在这些血清型中，人类血清型2是第一个作为基因转移载体开发的AAV。当前使用的其它AAV血清型包括但不限于AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAVrh74和AAVdj等。另外，非天然工程化变体和嵌合AAV也可能有用。
优选地，本发明的载体是AAV6载体。
当将AAV载体整合到更大的多核苷酸中时(例如，在染色体中或在另一种载体如用于克隆或转染的质粒中)，则AAV载体可以被称为“原载体”，其可以通过在AAV包装功能和合适的辅助功能存在的情况下进行复制和衣壳化来“拯救”。本发明的AAV载体可以是多种形式中的任何一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体，其与脂质复合，封装在脂质体中并且在病毒颗粒例如AAV颗粒中衣壳化。
可通过技术人员已知的任何方法将本发明的重组核酸分子或表达盒引入载体中。
在这方面也考虑了本发明的重组核酸分子和表达盒的所有实施方式。
本发明的载体可以包装到病毒衣壳中以产生“病毒颗粒”。因此，在另一方面，本发明还涉及一种包含本发明载体的病毒颗粒。
在一个特定的实施方式中，载体是AAV载体，并包装到AAV来源的衣壳中以产生“腺相关病毒颗粒”或“AAV颗粒”。因此，本文所用的术语“AAV颗粒”是指由至少一个AAV衣壳蛋白和衣壳化的AAV载体基因组组成的病毒颗粒。
衣壳血清型决定了AAV颗粒的向性范围。
衣壳血清型可以选自先前鉴定的人类或非人类血清型，或者选自非天然工程化变体和嵌合AAV衣壳。特别地，衣壳蛋白可以是包含一种或多种增强转导效率的氨基酸取代的变体。
不同的AAV血清型被用于优化特定靶细胞的转导或靶向特定靶组织内的特定细胞类型。AAV颗粒可以包含相同血清型的病毒蛋白和病毒核酸或AAV的任何天然或人工序列变体。例如，AAV颗粒可包含AAV6衣壳蛋白和至少一种、优选两种AAV6 ITR。本文提供了用于产生AAV颗粒的AAV血清型的任何组合，如同每种组合已经在本文中明确指出一样。
在优选的实施方式中，AAV颗粒包含AAV6来源的衣壳。
可以使用常规分子生物学技术对AAV病毒进行工程化，从而可以优化这些颗粒，以实现核酸序列的细胞特异性递送，使免疫原性最小化，调节稳定性和颗粒寿命，有效降解，准确递送至核中。
除了使用AAV天然血清型以外，在本发明的上下文中可以使用人工AAV血清型，包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。可以通过任何合适的技术，使用选择的AAV序列(例如，VP1衣壳蛋白的片段)与异源序列组合来产生这种人工衣壳，所述异源序列可以从不同的选择的AAV血清型、相同AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳或突变的AAV衣壳。
嵌合衣壳包含源自至少两种不同AAV血清型的VP衣壳蛋白，或包含至少一种组合了源自至少两种AAV血清型的VP蛋白区域或结构域的嵌合VP蛋白。
衣壳蛋白也可以被突变，特别是为了增强转导效率。突变的AAV衣壳可以从通过易错PCR和/或肽插入或通过包括一个或几个氨基酸取代而插入的衣壳修饰中获得。
另外，AAV颗粒的基因组载体(即本发明的载体)可以是单链或自互补的双链基因组。通过从一个AAV末端重复序列中缺失末端解链位点(trs)，生成自互补双链AAV载体。这些修饰的载体(其复制基因组是野生型AAV基因组长度的一半)具有包装DNA二聚体的趋势。在一个优选的实施方式中，在本发明的实践中实施的AAV颗粒具有单链基因组。
用于生产病毒颗粒，特别是AAV颗粒的众多方法是本领域中已知的，包括转染，稳定的细胞系生产，以及包括腺病毒-AAV杂合物、疱疹病毒-AAV杂合物(Conway,JE等,(1997)Virology 71(11)：8780-8789)和杆状病毒-AAV杂合物的感染性杂合病毒生产系统。
用于生产AAV病毒颗粒的AAV生产培养物都需要：1)在杆状病毒生产系统的情况下，合适的宿主细胞，包括例如人源细胞系如HeLa、A549或293细胞，或昆虫源细胞系如SF-9；2)合适的辅助病毒功能，由野生型或突变型腺病毒(例如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)AAV rep和cap基因和基因产物；4)侧接有至少一个AAV ITR序列的目标核酸，例如本发明的载体；以及5)本领域众所周知的用于支持AAV生产的合适的培养基和培养基组分。
在实施本发明时，用于产生AAV颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞，其中AAV rep和cap基因被稳定地维持在宿主细胞或生产细胞中，其中AAV载体基因组被稳定地维持。示例性包装和生产细胞源自293、A549或HeLa细胞。然后使用本领域已知的标准技术纯化和配制AAV颗粒。
在这方面也考虑了本发明的重组核酸分子、表达盒或载体的所有实施方式。
在另一方面，本发明还涉及一种分离的宿主细胞，其包含用本发明的表达盒、载体或病毒颗粒转化或转染。
宿主细胞可包含相同或不同的一种或几种本发明的重组核酸、表达盒或载体。
在一个特定的实施方式中，宿主细胞包含本发明的重组核酸，所述重组核酸在其3'端包括剪接供体位点，所述剪接供体位点与宿主细胞基因组中的剪接受体位点相容。
术语“宿主细胞”还涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本宿主细胞不同的亲本宿主细胞的任何后代。
术语“细胞”或“宿主细胞”包括适合于表达本发明的重组核酸分子的任何细胞。用于表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。
例如，可以在细菌中产生抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号和第5,840,523号。(还参见Charlton,分子生物学方法(Methods in Molecular Biology),第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，抗体可以以可溶级分从细菌细胞裂解物中分离出来，并可以进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母菌也是编码抗体的载体的合适表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”从而产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适用于表达糖基化抗体的宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定到许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号和第6,417,429号。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人类胚胎肾细胞系(293或293细胞，如例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠Sertoli细胞(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人类宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A)；人类肺细胞(W138)；人类肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。关于某些适于产生抗体的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,分子生物学方法(Methods in Molecular Biology),第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
在一个特定的实施方式中，宿主细胞选自分枝杆菌细胞，真菌细胞，酵母细胞，植物细胞，昆虫细胞，非人类动物细胞，人类细胞，或细胞融合体，例如杂交瘤。优选地，所述细胞选自哺乳动物。优选地，所述细胞选自人类、灵长类、兔或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)细胞。更优选地，所述细胞选自人类和小鼠细胞。甚至更优选地，所述细胞是人类细胞。在优选的实施方式中，排除人类胚胎干细胞。
在优选的实施方式中，所述细胞是B细胞，优选人类或小鼠B细胞，更优选人类B细胞。
宿主细胞，优选非人类细胞，也可以是全能、多能或成体干细胞，合子或体细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是胚胎干细胞，优选是非人类胚胎干细胞，更优选是小鼠胚胎干细胞。
可以使用任何已知技术将本发明的表达盒或载体转移到宿主细胞中，所述技术包括但不限于磷酸钙-DNA沉淀、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔、显微注射、生物弹射、脂质转染或病毒感染，并且可以以异位形式维持在宿主细胞中或可以整合到基因组中。
在优选的实施方式中，本发明的表达盒或载体通过病毒感染被转移到宿主细胞中，优选使用本发明的病毒颗粒，更优选使用本发明的AAV颗粒。
在这方面也考虑了本发明的重组核酸分子、表达盒、载体或病毒颗粒的所有实施方式。
在另一方面，本发明还涉及包含至少一个本发明宿主细胞的转基因生物，优选非人类转基因生物。本发明还涉及产生包含至少一个本发明的转基因宿主细胞的转基因生物的方法。
在这方面也考虑了本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒和宿主细胞的所有实施方式。
特别地，所述生物可以是非人类动物，例如灵长类动物(例如，非人类灵长类动物如猴子)，兔或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠)。优选地，转基因生物是非人类哺乳动物。更优选地，转基因生物是小鼠。
产生转基因生物，特别是转基因小鼠的方法是技术人员众所周知的。应当理解，这些方法中的任何一种都可以用于实施本发明，并且本文公开的方法是非限制性的。
特别地，产生转基因生物的方法可以包括
在非人类胚胎干细胞中引入本发明的表达盒或载体，
获得转基因胚胎干细胞，其中优选通过同源重组将本发明的重组核酸分子插入基因组中，
将所述转基因胚胎干细胞注射到非人类动物的胚泡中以形成嵌合体，以及
将所述经注射的胚泡重新植入养母中。
胚胎干(ES)细胞通常从体外培养的植入前胚胎中获得。优选地，通过电穿孔将本发明的盒或载体转染到所述ES细胞中。使用相关领域中已知的方法培养ES细胞并准备用于转染。用本发明的盒或载体转染的ES细胞源自于与要引入它们的发育中的胚胎或胚泡相同种类的胚胎或胚泡。ES细胞通常因为它们在被引入处于胚泡发育阶段的动物的胚胎中时能够整合到内部细胞团中并有助于个体的种系而被选择。在一个实施方式中，从小鼠胚泡中分离出ES细胞。
转染到ES细胞中后，本发明的重组核酸分子与细胞的基因组DNA整合，以产生如下定义的本发明的抗体。
转染后，在合适的条件下培养ES细胞以检测转染的细胞。例如，当盒或载体包含标志物基因(例如抗生素抗性标志物，例如新霉素抗性基因)时，在所述抗生素中培养细胞。可以使用Southern Blot技术分析存活的ES细胞的DNA和/或蛋白质表达，以验证盒的适当整合。
然后将选择的ES细胞注射到非人类动物的胚泡中以形成嵌合体。非人类动物优选是小鼠、仓鼠、大鼠或兔。更优选地，非人类动物是小鼠。
特别地，可以使用显微注射将ES细胞插入早期胚胎中。将经注射的胚泡重新植入养母中。当后代出生时，例如使用Southern Blot和/或PCR技术，针对本发明的重组核酸分子、表达盒或载体的存在对它们进行筛选。鉴定杂合子，然后彼此杂交以产生纯合动物。
在另一个实施方式中，产生转基因生物的方法可以包括
在非人类受精卵中引入(i)本发明的表达盒或载体，以及(ii)用于通过同源重组将所述盒或载体靶向适当基因座的核酸酶系统，
获得转基因受精卵，其中通过同源重组将本发明的表达盒或载体插入基因组中，以及
将所述经注射的受精卵重新植入养母中。
用于将盒或载体靶向适当基因座的核酸酶系统可以是技术人员已知的任何合适的系统，例如涉及ZFN、TALE或CRISPR/Cas9核酸酶的系统。
优选地，所述核酸酶系统是CRISPR/Cas9系统。为了使用Cas9来修饰基因组序列，可以将蛋白质直接递送至细胞。或者，可以将编码Cas9的mRNA递送至细胞，或者可以将提供编码Cas9的mRNA表达的基因递送至细胞。另外，靶标特异性crRNA和tracrRNA或靶标特异性gRNA可以被递送至细胞(这些RNA可替代地由被构建成表达这些RNA的基因产生)。靶位点的选择和crRNA/gRNA的设计是本领域众所周知的。
本发明还提供了源自本发明的转基因非人类动物及其后代的细胞或组织，包括永生化的细胞系和原代细胞或组织，特别是产生本发明的抗体的细胞或组织，例如杂交瘤或骨髓瘤。
在另一方面，本发明涉及一种抗体，其包含
-免疫球蛋白重链可变区(VH)，
-免疫球蛋白轻链可变区(VL)，
-免疫球蛋白轻链恒定区(CL)，
-免疫球蛋白重链恒定区(CH)，和
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，
其中VH通过PL1与VL融合并且CL通过PL2与CH融合。
PL1和PL2可以相同或不同。
特别地，本发明的抗体可以是经由表达本发明的重组核酸分子的编码序列获得的任何抗体。
在这方面也考虑了本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞和转基因动物的所有实施方式。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段及其衍生物，只要它们包括包含VH、VL、CL、CH、PL1、PL2的链即可，其中VH通过PL1与VL融合并且CL通过PL2与CH融合。
本发明的抗体可以是仅包含一条包含VH、VL、CL、CH、PL1和PL2的链的单链抗体。或者，本发明的抗体可包含至少两条包含VH、VL、CL、CH、PL1和PL2的链并且如上文所定义，其中所述链优选地经由二硫桥连接在一起。
在一个特定的实施方式中，本发明的抗体包含经由一个或几个二硫桥连接的两条链，其中每条链包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、免疫球蛋白轻链可变区(VL)、免疫球蛋白轻链恒定区(CL)，免疫球蛋白重链恒定区(CH)和两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，其中VH通过PL1与VL融合并且CL通过PL2与CH融合。
在一些实施方式中，抗体可以是较大融合分子的一部分，所述较大融合分子通过抗体与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成。特别地，本发明的抗体还可包含另外的抗体结构域，例如另外的重链和轻链结构域。
在一些实施方式中，抗体是全长抗体。如本文所用，术语“全长抗体”是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体，而不是如下文所定义的抗体片段。所述术语特别是指具有包含Fc区的重链的抗体。在优选的实施方式中，全长IgG抗体中的抗体选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，优选全长IgG1抗体。然而，可以使用任何其它免疫球蛋白类别。
在一些其它实施方式中，抗体是抗体片段。如本文所用，术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，优选地是包含重链的可变结构域、接头PL1、轻链、接头P2和恒定重链的N末端的至少一个片段的片段。抗体片段优选地选自Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和F(ab)3。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于技术人员众所周知的完整抗体的蛋白水解消化，以及本文描述的重组技术。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点；以及残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')2片段。
如本文所用的“Fab”、“Fab片段”或“Fab区”是指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可指分离的该区域或如本文所述多肽的上下文中的该区域。
Fab'片段与Fab片段的区别在于，在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab')2抗体片段最初作为成对的Fab'片段产生，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
如本文所用，术语“抗体衍生物”是指本文提供的抗体，例如全长抗体或抗体片段，其中一个或多个氨基酸例如通过烷基化、聚乙二醇化、酰化、酯或酰胺形成等而被化学修改。特别地，该术语可以指本文提供的抗体，其被进一步修饰成包含本领域已知且容易获得的其它非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的实例包括但不限于PEG，乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖和聚乙烯醇。
衍生物也可以是免疫缀合物，其包含与一个或多个异源分子缀合的本发明的抗体，所述异源分子包括但不限于细胞毒性剂，可检测部分如荧光部分，诊断性放射性同位素或显像剂；或固体支持物，例如琼脂糖珠粒等。细胞毒性剂的实例包括但不限于化学治疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用技术人员众所周知的多种双功能蛋白偶联剂来制备。接头可以是“可裂解的接头”，其促进细胞毒性药物在细胞中的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感性接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992))。
本发明的抗体可包含功能性Fc区、天然序列Fc区或变体Fc区。
“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的效应子功能。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；细胞依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，吞噬作用，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞表面受体的下调等。此类效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合并且可以使用各种众所周知的测定法进行评估。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列，优选天然序列人类Fc区。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰，优选一个或多个氨基酸取代而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如，约1至约10个氨基酸取代，并且优选约1至约5个氨基酸取代。本文的变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的序列同一性，并且最优选与其具有至少约90％的序列同一性，更优选与其具有至少约95％的序列同一性。在一些实施方式中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。
本发明的多特异性抗体可通过以下来获得：在宿主细胞中重组共表达本发明的两个重组核酸分子以得到两种本发明的单链抗体。这些链经由二硫桥自然地缔合在一起以形成包含至少两条轻链和至少两条重链的多特异性抗体，其中所述链的可变结构域识别至少两个不同的表位。
在一些实施方式中，抗体是纯化的抗体。“纯化的”抗体是已经与其生产环境的组分分离的抗体，优选与其生产细胞和/或其它抗体分离的抗体。特别地，可以将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)所测定的。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。例如，可以从包含表达本发明的重组核酸分子的宿主细胞的培养基中纯化抗体。
取决于产生本发明或本申请的抗体的方法，本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。优选地，抗体是单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，是针对单个抗原位点的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体可以通过技术人员已知的任何方法来制备。
本发明的抗体可以是嵌合、人源化或人类抗体。
“嵌合”抗体是这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性即可(Morrison等,Proc.Natl.Acad Sci.USA81:6851-6855(1984))。优选地，抗体框架的至少一部分是人类共有框架序列。
非人类(例如鼠类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者的高变区残基被来自非人类物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的具有所需特异性、亲和力和能力的高变区残基代替。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体包含基本上全部的至少一个并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人类免疫球蛋白的高变区，并且所有或基本上所有的FR是人类免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分(Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等,Nature 332:323.329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。可以在人类框架序列内进行另外的框架区修饰。因此，人源化抗体还可包含在接受者抗体或供体抗体中均未发现的残基。可以进行此类氨基酸修饰以进一步改善抗体功能和/或增加人源化过程。抗体的“人性”可以使用用于定量抗体可变区的人性的T20得分分析仪来测量，如Gao S H,Huang K,Tu H,Adler A S.BMC Biotechnology.2013:13:55中所述。“人类抗体”或“完全人类抗体”是具有与由人类产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或已经使用如本文公开的任何用于制备人类抗体的技术制备的人类抗体。人类抗体的这一定义特别排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。
在优选的实施方式中，本发明的抗体是单克隆抗体，优选是人类单克隆抗体。
本发明的抗体优选是治疗性抗体。所述治疗性抗体可用于治疗任何疾病，例如癌症、炎性疾病、感染性疾病或自身免疫性疾病。
特别地，本发明的抗体可包含治疗性抗体、优选地被批准的(例如EMA或FDA批准的)治疗性抗体的可变区和/或恒定区。在一个特定的实施方式中，本发明的抗体包含治疗性抗体、优选被批准的治疗性抗体的可变区和恒定区。此类治疗性抗体的实例包括但不限于阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、布罗达单抗(brodalumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡罗单抗(capromab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)、地努图昔单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊匹单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥托昔单抗(obiltoxaximab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、苏金单抗(secukinumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、尤特克单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、撒利鲁单抗(sarilumab)、利妥昔单抗(rituximab)、古塞库单抗(guselkumab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab)、阿达木单抗、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、贝伐珠单抗、贝那利珠单抗(benralizumab)、艾美赛珠单抗(emicizuma)和曲妥珠单抗(trastuzumab)。
本发明还涉及一种产生本发明的抗体的方法，所述方法包括提供本发明的宿主细胞或转基因生物，在适合于抗体表达的条件下培养所述宿主细胞或使所述生物生长，以及任选地从宿主细胞培养物中或所述生物的样品中回收抗体。任选地，所回收的抗体可以进一步纯化。合适的培养基、培养条件和生产方法是技术人员众所周知的，并且可以根据宿主细胞和要生产的抗体容易地选择。优选地，宿主细胞或转基因生物是非人类的。
在另一方面，本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞或抗体，以及药学上可接受的赋形剂。所述组合物可包含一种或几种重组核酸分子、一种或几种表达盒、一种或几种载体、一种或几种病毒颗粒、一种或几种宿主细胞和/或一种或多种本发明的抗体。
如本文所用，术语“药物制剂”或“药物组合物”是指这样的制备物，其形式为允许活性成分的生物活性有效，并且不包含对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它组分。优选地，这样的制剂是无菌的，即灭菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指被监管机构或公认的药典如欧洲药典批准用于动物和/或人类。术语“赋形剂”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、载体或媒介物。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和其它各种添加剂。
如本领域中众所周知的，药学上可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其有助于施用药理学上有效的物质，并且可以以液体溶液或悬浮液形式，乳剂形式或适于在使用前溶解或悬浮于液体中的固体形式提供。例如，赋形剂可以赋予形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂，润湿剂和乳化剂，用于改变摩尔渗透压浓度的盐，包封剂，pH缓冲物质和缓冲剂。这样的赋形剂包括适合于直接递送至眼睛的任何试剂，其可以被施用而没有过度的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇，各种吐温(tween)化合物中的任何一种，以及液体如水、盐水、甘油和乙醇。其中可以包含药学上可接受的盐，例如，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。雷明顿药学(Remington's Pharmaceutical Sciences,第15版)中提供了药学上可接受的赋形剂的详尽讨论。
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案取决于要治疗的疾患，疾病的严重程度，患者的年龄、体重和性别等。
用于施用的剂量可以根据各种参数，特别是根据所使用的施用模式、相关病理学或者期望的治疗持续时间进行调节。
可将本发明的药物组合物配制成用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等。
优选地，药物制剂是能够被注射的制剂。这些制剂可以特别是等渗的无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠，氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或此类盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，其根据情况在添加无菌水或生理盐水后，允许配制可注射溶液。
可以通过将所需量的活性化合物与所需的上述各种其它成分掺入适当的溶剂中，接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其它所需成分的粉末。
除了被配制成用于肠胃外施用(例如静脉内或肌内注射)的组合物外，其它药学上可接受的形式包括例如用于口服施用的片剂或其它固体；定时释放胶囊；以及当前使用的任何其它形式。
药物组合物还可包含一种或几种另外的活性化合物。另外的活性化合物的实例包括但不限于化学治疗药物、抗生素、抗寄生虫剂、抗真菌剂或抗病毒剂。
在这方面也考虑了本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞和抗体的所有实施方式。
本发明还涉及一种用于预防或治疗疾病的本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞、抗体或药物组合物。
本发明涉及本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞、抗体或药物组合物作为用于治疗疾病的药物的用途。本发明还涉及本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞或抗体用于制造或制备药物的用途。
特别地，本发明涉及一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞、抗体或药物组合物。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物，优选人类。
所述疾病可以是可通过抗体、特别是本发明抗体的作用来治疗、预防或减轻的任何疾病。此类疾病的实例包括但不限于癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病和炎性疾病。
在这方面也考虑了本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞、抗体和药物组合物的所有实施方式。
本发明还涉及本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞、抗体或药物组合物，优选本发明的抗体，其用于诊断或检测疾病的方法中。
待诊断或检测的疾病取决于抗体。
所述方法可包括在允许抗体与其抗原(如果样品中存在的话)结合的条件下使生物样品与本发明的抗体接触，以及检测抗体与其抗原之间是否形成复合物。这样的方法可以是体外或体内方法。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。
在优选的实施方式中，对诊断方法中使用的本发明抗体进行标记。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用而间接检测的部分如酶或配体。
本发明还涉及一种用于诊断或检测疾病的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的重组核酸分子、表达盒、载体、病毒颗粒、宿主细胞、抗体或药物组合物，以及任选的提供使用所述试剂盒的指南的活页。本发明的试剂盒还可包含检测本发明的抗体与其抗原的复合物所需的一种或几种试剂。本发明还涉及本发明的试剂盒用于诊断或检测疾病的用途。
如本说明书中所用，术语“约”是指值±指定值的10％的范围，更优选值±指定值的5％的范围。例如，“约1”是指当考虑10％时为0.9至1.1，而当考虑5％时为0.95至1.05。
如本文所用，动词“包括”在其非限制性含义上用来表示包括该词之后的项目，但是不排除未特别提及的项目。另外，除非上下文明确要求存在一个且仅一个要素，否则不带具体数量所指的要素不排除存在超过一个要素的可能性。因此，不带具体数量的指称通常表示“至少一个/种”。
本说明书中引用的所有专利和参考文献均特此通过引用整体并入。
给出以下实施例是为了说明而不是限制的目的。
实施例
材料和方法
抗CD20scFull-Ig的构建
基因合成反应用于产生编码抗CD20 scFull-Ig(单链全长Ig)的完全合成盒。可变结构域是基于利妥昔单抗序列。为了获得单链Fab片段，我们设计了一种原始策略，通过该策略：
-全长VH、DJH和VkJk通过18残基接头(Whitlow 218接头；GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQID NO:1))连接
-在这之后接着的是Ck和γ重链CH1结构域，该结构域再次由非常相同的18残基接头序列连接。
然后，该编码单链“Fab”结构域的序列后面接着的是CH2和CH3序列以及聚腺苷酸化位点。由于内含子有利于Ig序列的最佳表达，我们根据种系序列在VH序列的上游包括了天然的第一内含子[前导外显子-VH外显子]，以保留具有外显子1和2的VH基因组结构。另外，在构建体上游插入了VH启动子序列。
最后，在HindIII和EcoRI位点处将构建体克隆到pCDNA3.1(+)载体中，该载体含有新霉素基因选择抗性。
生产
通过Macsfectin试剂用质粒载体转染CHO和293细胞，并在转染后第二天用0.5-1mg/mL G418补充培养基进行选择。3-4周后，通过酶联免疫吸附测定法和流式细胞术筛选上清液中的表达。最终将上清液通过Vivaspin处理(截止值为10kDa)进行离心浓缩。
表征
对于ELISA，scFull-Ig被多克隆抗人类Fc特异性抗体捕获，并通过HRP缀合的抗人类IgG(H+L)抗体(均来自Sigma Aldrich)检测。
对于流式细胞术，在2-8℃下在30分钟内将100 000个表达CD20膜抗原的细胞(或阴性对照细胞)与50μL上清液一起温育。用冷的PBS-1％SAB洗涤3次后，将10μL稀释的抗人类IgG(H+L)-Dylight 650添加至细胞悬浮液中。随后在2-8℃下温育20分钟，将细胞再洗涤3次，最后重悬于300μl缓冲液中。在读取之前，加入碘化丙锭以排除死细胞。在FACSCalibur细胞仪上记录10 000个活细胞门控事件。
结果
图1：scFull-Ig策略的示意图
图2：为抗CD20 scFull-Ig表达构建的质粒的图谱。将构建物在HindIII和EcoRI位点处插入pCDNA3.1(+)载体中。
图3：通过ELISA检测原始上清液中的重组mAb。收集转染细胞的上清液并通过ELISA进行分析。重组IgG1和IgM mAb分别用作阳性和阴性对照。如所预期，在CHO和293转染的细胞系上清液中均检测到scFull-Ig。
图4：用scFull-Ig上清液对靶细胞染色。为了确保scFull-Ig结构的功能性，将不同的细胞靶标与原始上清液的不同批次或稀释液一起温育。4A，在SUD细胞系上观察到典型的染色，其中测试了不同的原始上清液。4B，在阳性(SUD和DOHH2)或阴性(DOHH2-KO CD20)CD20细胞系上测量的几何平均荧光。利妥昔单抗用作阳性对照。
序列表
<110> 法国血液机构（ETABLISSEMENT FRANCAIS DU SANG）
<120> 重组单链免疫球蛋白
<130> B2704
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Whitlow 218接头
<400> 1
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头PT1
<400> 2
Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头PT2
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头PT3
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头L205
<400> 5
Ser Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Asp Ala
1 5 10 15
Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly
20 25
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头LLB18
<400> 6
Ser Pro Asn Gly Ala Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Gln Thr Gly Ser
1 5 10 15
Ala Ser Gly Ser Gln
20
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头接头-M
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (31)

1.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含
-编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的序列，
-编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的序列，
-编码轻链恒定区(CL)的序列，
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，并且
其中所述核酸分子包含以下结构：
VH-PL1-VL-CL-PL2，
其中PL1和PL2相同或不同。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子还包含供体剪接位点并包含以下结构
VH-PL1-VL-CL-PL2-供体剪接位点。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子还包含编码免疫球蛋白重链恒定区(CH)的序列，其中所述核酸分子包含以下结构：
VH-PL1-VL-CL-PL2-CH。
4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述编码免疫球蛋白重链恒定区的序列编码三个或四个免疫球蛋白重链恒定结构域。
5.如权利要求1至4中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸分子还包含用于指导所述核酸分子通过同源重组在精确位置处整合到宿主细胞的基因组中的另外的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的重组核酸分子，其中所述另外的多核苷酸指导整合到免疫球蛋白重链基因座中，更优选在免疫球蛋白重链的连接区(JH)基因与恒定区(CH)基因之间。
7.如权利要求2、5或6所述的重组核酸分子，其中所述供体剪接位点是用于与恒定免疫球蛋白重链基因的CH1结构域连接的供体剪接位点。
8.如权利要求1至7中任一项所述的重组核酸分子，其中所述肽接头为10至25个氨基酸长度，优选为15至20个氨基酸长度。
9.如权利要求1至8中任一项所述的重组核酸分子，其中PL1和/或PL2包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：序列SEQ ID NO:1至7，以及与SEQ ID NO:1至7的序列具有至少80％、优选至少90％序列同一性的序列。
10.如权利要求1至9中任一项所述的重组核酸分子，其中PL1和/或PL2包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1的序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％、优选至少90％序列同一性的序列。
11.一种表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至一个或多个控制序列的如权利要求1至10中任一项所述的重组核酸分子，所述控制序列指导所述核酸在与所述控制序列相容的条件下在合适的宿主细胞中的表达。
12.一种载体，所述载体包含如权利要求11所述的表达盒。
13.如权利要求12所述的载体，所述载体是病毒载体。
14.如权利要求13所述的载体，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体，更优选AAV6载体。
15.一种病毒颗粒，所述病毒颗粒包含如权利要求12至14中任一项所述的载体。
16.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含如权利要求1至10中任一项所述的重组核酸分子、如权利要求11所述的表达盒、如权利要求12至14中任一项所述的载体或如权利要求15所述的病毒颗粒。
17.如权利要求16所述的分离的细胞，其中所述分离的细胞不是人类胚胎干细胞。
18.如权利要求16或17所述的细胞，其中所述细胞是小鼠胚胎干细胞。
19.如权利要求16至18中任一项所述的细胞，其中所述细胞是B细胞，优选是人类B细胞。
20.一种转基因生物，优选非人类转基因生物，所述转基因生物包含至少一个如权利要求16至19中任一项所述的细胞。
21.如权利要求20所述的转基因生物，所述生物是小鼠。
22.一种抗体，所述抗体包含
-免疫球蛋白重链可变区(VH)，
-免疫球蛋白轻链可变区(VL)，
-免疫球蛋白轻链恒定区(CL)，
-免疫球蛋白重链恒定区(CH)，和
-两个编码肽接头(PL1和PL2)的序列，
其中VH通过PL1与VL融合并且CL通过PL2与CH融合，并且其中PL1和PL2相同或不同。
23.如权利要求22所述的抗体，所述抗体是全长抗体，优选是全长IgG抗体。
24.如权利要求22或23所述的抗体，所述抗体是治疗性抗体。
25.如权利要求24所述的抗体，其中所述抗体包含治疗性抗体的可变区和/或恒定区，所述治疗性抗体优选地选自：阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、阿利库单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐珠单抗、贝洛托单抗、博纳吐单抗、本妥昔单抗、布罗达单抗、卡那单抗、卡罗单抗、西妥昔单抗、达利珠单抗、达雷木单抗、地诺单抗、地努图昔单抗、度匹鲁单抗、德瓦鲁单抗、依库珠单抗、埃罗妥珠单抗、依洛尤单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、依达赛珠单抗、英夫利昔单抗、伊匹单抗、依奇珠单抗、美泊利单抗、那他珠单抗、耐昔妥珠单抗、纳武单抗、奥托昔单抗、奥比妥珠单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、雷莫芦单抗、兰尼单抗、瑞利珠单抗、苏金单抗、司妥昔单抗、托珠单抗、尤特克单抗、维多珠单抗、撒利鲁单抗、利妥昔单抗、古塞库单抗、奥英妥珠单抗、阿达木单抗、吉妥珠单抗、贝伐珠单抗、贝那利珠单抗、艾美赛珠单抗和曲妥珠单抗。
26.一种产生如权利要求22至25中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括提供如权利要求16至19中任一项所述的细胞或如权利要求20或21所述的转基因生物，所述细胞或生物表达所述抗体，以及从细胞培养物中或从所述生物的样品中回收所述抗体。
27.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至10中任一项所述的重组核酸分子、如权利要求11所述的表达盒、如权利要求12至14中任一项所述的载体、如权利要求15所述的病毒颗粒、如权利要求16至19中任一项所述的宿主细胞或如权利要求22至25中任一项所述的抗体，以及药学上可接受的赋形剂。
28.如权利要求1至10中任一项所述的重组核酸分子，如权利要求11所述的表达盒，如权利要求12至14中任一项所述的载体，如权利要求15所述的病毒颗粒，如权利要求16至19中任一项所述的宿主细胞，如权利要求22至25中任一项所述的抗体或如权利要求27所述的药物组合物，其用于预防或治疗疾病。
29.如权利要求1至10中任一项所述的重组核酸分子，如权利要求11所述的表达盒，如权利要求12至14中任一项所述的载体，如权利要求15所述的病毒颗粒，如权利要求16至19中任一项所述的宿主细胞，如权利要求22至25中任一项所述的抗体或如权利要求27的药物组合物，其用于诊断或检测疾病的方法中。
30.一种用于诊断或检测疾病的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1至10中任一项所述的重组核酸分子、如权利要求11所述的表达盒、如权利要求12至14中任一项所述的载体、如权利要求15所述的病毒颗粒、如权利要求16至19中任一项所述的宿主细胞、如权利要求22至25中任一项所述的抗体或如权利要求27所述的药物组合物，以及任选的提供使用所述试剂盒的指南的活页。
31.如权利要求30所述的试剂盒用于诊断或检测疾病的用途。
CN201980017280.8A 2018-03-05 2019-03-05 重组单链免疫球蛋白 Pending CN111902426A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18305232.3 2018-03-05
EP18305232 2018-03-05
EP18183739 2018-07-16
EP18183739.4 2018-07-16
PCT/EP2019/055453 WO2019170677A1 (en) 2018-03-05 2019-03-05 Recombinant single chain immunoglobulins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111902426A true CN111902426A (zh) 2020-11-06

Family

ID=65576375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980017280.8A Pending CN111902426A (zh) 2018-03-05 2019-03-05 重组单链免疫球蛋白

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210024632A1 (zh)
EP (1) EP3762425A1 (zh)
KR (1) KR20200130363A (zh)
CN (1) CN111902426A (zh)
AU (1) AU2019232523A1 (zh)
CA (1) CA3096764A1 (zh)
WO (1) WO2019170677A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102371173B1 (ko) 2018-12-21 2022-03-04 오제 이뮈노테라프틱스 인간화된 항-인간-pd-1 항체
CA3122914A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/sirp.alpha. molecule
EP3898677A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 OSE Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule
AU2019406453A1 (en) 2018-12-21 2021-07-22 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule directed against human PD-1
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6066718A (en) * 1992-09-25 2000-05-23 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
EP2050764A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
CN104640561A (zh) * 2012-07-23 2015-05-20 酵活有限公司 包含轻链和重链的选择性配对的免疫球蛋白构建体
WO2017005923A1 (en) * 2015-07-09 2017-01-12 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Lentiviral vector expressing membrane-anchored or secreted antibody
WO2018017863A1 (en) * 2016-07-21 2018-01-25 Dcb-Usa Llc Modified antigen-binding fab fragments and antigen-binding molecules comprising the same

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
US20060156422A1 (en) * 2005-01-10 2006-07-13 Medical Research Council Methods and compositions for the generation of antibodies
EP2662451A1 (en) * 2012-05-07 2013-11-13 Stefan Kochanek Nucleic acid construct and use of the same
JP6699551B2 (ja) * 2014-07-15 2020-05-27 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトＴｉｅ２抗体
US20200095327A1 (en) * 2017-02-08 2020-03-26 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6066718A (en) * 1992-09-25 2000-05-23 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
EP2050764A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
CN104640561A (zh) * 2012-07-23 2015-05-20 酵活有限公司 包含轻链和重链的选择性配对的免疫球蛋白构建体
WO2017005923A1 (en) * 2015-07-09 2017-01-12 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Lentiviral vector expressing membrane-anchored or secreted antibody
WO2018017863A1 (en) * 2016-07-21 2018-01-25 Dcb-Usa Llc Modified antigen-binding fab fragments and antigen-binding molecules comprising the same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨跃梅等: "抗体-药物偶联物药物用抗体研究进展", 国际药学研究杂志 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3762425A1 (en) 2021-01-13
CA3096764A1 (en) 2019-09-12
WO2019170677A1 (en) 2019-09-12
US20210024632A1 (en) 2021-01-28
KR20200130363A (ko) 2020-11-18
JP2021516961A (ja) 2021-07-15
AU2019232523A1 (en) 2020-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111902426A (zh) 重组单链免疫球蛋白
KR100498664B1 (ko) Cre매개부위특이적재조합을이용한항체의제조
SG181477A1 (en) Mice that make heavy chain antibodies
US20230010106A1 (en) Single chain vh and heavy chain antibodies
US20230345919A1 (en) Non-human animals comprising a humanized asgr1 locus
CN114026224A (zh) 具有sirt-1基因敲除的哺乳动物细胞系
JP2023542228A (ja) 遺伝子ノックアウトを有する哺乳動物細胞株
JP7497292B2 (ja) 遺伝子組換え単鎖免疫グロブリン
CN114080451B (zh) 通过使用Cre mRNA进行的靶向整合来产生蛋白质表达细胞的方法
US20210139599A1 (en) Recombinant immunoglobulins of a new igg5 class, encoded by the human heavy chain pseudo-gamma gene
CN113993887A (zh) 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生多价双特异性抗体表达细胞的方法
JP7446342B2 (ja) 所定の構成の複数の発現カセットの標的化組込みによって三価の抗体を発現する細胞を生成するための方法
RU2796949C2 (ru) Животные, отличные от человека, содержащие гуманизированный локус asgr1
CN114008081A (zh) 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生二价双特异性抗体表达细胞的方法
CN114258403A (zh) 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生多价多特异性抗体表达细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination