KR101965585B1

KR101965585B1 - 항체 글리코실화 변이체

Info

Publication number: KR101965585B1
Application number: KR1020127013467A
Authority: KR
Inventors: 진쿠앙 루오; 스테판 멕카시; 티. 샨타 라주; 버나드 스칼론; 트레이시 스핀카-돔스
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2009-10-29
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2019-04-04
Also published as: JP2013509415A; WO2011059684A1; IL219289A0; EA201290241A1; KR20120101404A; US20120276092A1; MX2012005006A; AU2010318542B2; AU2010318542A1; CN102770554B; CN102770554A; EP2494061B1; CA2778809C; CA2778809A1; ES2622102T3; EP2494061A1; EP2494061A4; BR112012010252A2

Abstract

Fc 영역 내에 글리코실화 변이를 갖는 항체 및 기타 Fc-함유 분자는 프로테아제, 예를 들어 펩신, 플라스민, 트립신, 키모트립신, 매트릭스 메탈로프로테이나아제, 세린 엔도펩티다아제 및 시스테인 프로테아제에 대하여 증가된 내성을 나타낸다. Fc-함유 분자는 다양한 질환 및 장애의 치료에 유용하다.

Description

항체 글리코실화 변이체{ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS}

본 발명은 항체 및 다른 Fc 함유 분자의 Fc 서열의 평가, 및 더욱 구체적으로는 항체 제제 및 다른 Fc 함유 분자를 제조, 변경 및 사용하여 프로테아제에 대한 민감성을 변경하는 방법에 관한 것이다.

Fc 도메인 내의 아미노산 변형은 알로스테릭(allosteric) 효과, 즉, 멀리서 Fc 배좌에 영향을 주는 효과로 간주될 수 있는 것을 가질 수 있다. 특히, CH3 도메인에서의 아미노산 치환은 Fc-감마 수용체에의 결합에 영향을 주는 것으로 밝혀졌는데, 상기 수용체는 CH2 도메인이기도 한 중쇄들 사이의 사슬간 다이설파이드 결합 아래의 항체 (하부 경첩 영역)에 결합한다 (문헌[Shields et al. (2001) J Biol Chem 276:6591]; 문헌[Stavenhagen et al.(2007) Cancer Res 67:8882]).

성숙 항체에 있어서, Asn297에 부착된 2개의 복합 2안테나형(bi-antennary) 올리고당류가 CH2 도메인들 사이에 묻혀 있어서 폴리펩티드 골격과의 광범위한 접촉부를 형성한다. 이들의 존재는 항체가 이펙터(effector) 기능, 예를 들어 ADCC를 매개하는 데 필수적임이 밝혀졌다 (문헌[Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995)]; 문헌[Jefferis, R., et al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998)]; 문헌[Wright, A. and Morrison, S. L., supra]). 다른 이들에 의한 그리고 본 출원인에 의한 연구 (국제특허 공개 WO2007005786호)에 의하면 Fc 영역에서 이러한 자연적으로 부가된 글리칸의 올리고당 조성은 당해 폴리펩티드 사슬의 다양한 비인접 부위에서 Fc-수용체 결합 친화성 및 프로테아제 민감성을 또한 변경시킴이 추가로 입증되었다 (문헌[Raju, S.T. 2008 Curr Op Immunol 20:471-478]; 국제특허 공개 WO2007024743호).

따라서, 항체 분자의 다양한 배좌적 측면의 이해가 발전되고 모델링 및 단백질 공학 기술이 더욱 정교해지게 됨에 따라, 특정 용도 또는 징후에 있어서 원하는 스펙트럼의 생체 내 상호 작용들이 매칭되도록 변형시키기 위하여 치료적 항체 후보 내의 영역을 표적화하는 것이 지금에 와서야 가능해졌다. 그러한 변형은 안전성이 유지된 개선된 항체 치료제를 제공할 수 있다.

본 발명은 Fc 영역을 포함하고 하나 이상의 엔지니어링된 Asn-결합 글리코실화 부위("N-글리코실화")를 갖는 것과 같이 항체 또는 항체-유사 치료제의 엔지니어링에서 유용한 변형된 글리코실화 면역글로불린 불변 도메인의 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 361 위치에서의 돌연변이에 의한 359 위치에서의 N-글리코실화 부위 및/또는 421 위치에서의 돌연변이에 의한 419 위치에서의 N-글리코실화 부위가 있다. 부가적으로, Asn297에서의 천연 Fc 글리코실화가 존재하며, 다른 실시 형태에서는 천연 Fc 글리코실화가 부재할 수도 있다. 항체-유래된 제작물은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서열로부터 유래되거나 그를 포함하는 이량체형 단백질 구조체이다. 일 태양에서, 당해 제작물은 경첩 영역에서 228, 234, 또는 235 위치 (카밧(Kabat) EU 넘버링)에서 아미노산 치환을 함유한다.

본 발명의 다른 목적은 유사한 비변형 면역글로불린 불변 도메인을 갖는 화합물과 비교할 때 개선된 특성을 갖는 변형된 글리코실화 면역글로불린 불변 도메인을 기재로 한 화합물을 포함하며, 상기 특성은 프로테아제 민감성, 혈청중 반감기 및 Fc-수용체 결합성을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 추가의 목적은 글리코실화된 항체 제제가 프로테아제에 의한 절단에 저항하는 능력을 향상시키는 조성물 및 방법을 제공하고 따라서 프로테아제의 상승된 수준의 존재와 결부된 병리학적 병태, 예를 들어 암을 치료하는 항체 제제를 제공하는 것이다. 본 방법의 또 다른 실시 형태에서, 글리코실화된 Fc-함유 단백질은 항체, 바람직하게는 치료적 단클론 항체이다. 절단 활성에 대하여 내성이 있어야 하는 프로테아제는 펩신, 플라스민, 트립신, 키모트립신, 매트릭스 메탈로프로테이나아제, 세린 엔도펩티다아제 및 시스테인 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들은 기생충, 박테리아 또는 바이러스일 수 있는 숙주 또는 병원체에서 생긴다. 특정 실시 형태에서, 프로테아제는 젤라티나아제 A (MMP2), 젤라티나아제 B (MMP-9), 매트릭스 메탈로프로테이나아제-7 (MMP-7), 스트로멜리신 (MMP-3), 및 대식세포 엘라스타아제 (MMP-12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 매트릭스 메탈로프로테이나아제이다. 변형은 항체 서열 내로 도입될 수 있다. 개시된 변형 제작물은 생리학적으로 관련된 프로테아제에 대하여 더욱 큰 내성을 나타낸다.

<도 1>
도 1은 IgG4 기반의 변이체의 경첩 및 Fc 도메인의 아미노산 서열들의 정렬을 나타내며, 숫자는 EU 항체 카밧 숫자이다. 나타낸 서열은 코어 경첩부 (잔기 227)로 시작되고 Fc 도메인의 C-말단 (잔기 447)으로 끝나며, 이는 CNTO 5303 및 CNTO 7363이 359 위치에서 Thr 대신 Asn (N)을 갖고 361 위치에서 Asn 대신 Thr (T)을 가짐으로써 각각 CNTO 530 및 CNTO 736과 상이해지게 됨을 나타내는데, 이는 글리코실화 모티프를 생성하고 당해 단백질이 Asn359에서 글리코실화되게 한다. 변이체, CNTO 5304 및 CNTO 7364는 299 위치에서 Thr이 Asn으로 대체됨으로서 CNTO 5303 및 CNTO 7363과 상이해지게 되고, 이럼으로써 Asn297에서 당해 모티프 및 글리코실화가 제거된다. NEM 3052 서열은, 위치 419 및 421에서의 아미노산의 변화에 의해 위치 419에서 글리코실화 모티프 및 글리코실화를 생성한다. 글리코실화 모티프 위치의 생성에 대하여 예시된 다른 부위는 382와 384 사이에 있으며 이는 도면에서 ("가능한 변이체")로서 나타내어져 있다. 도트는 그 아미노산이 야생형 서열과 동일함을 나타낸다.
<도 2>
도 2는 둘 모두의 중쇄에서 강조된 새로운 글리코실화 부위인 Fc 단편의 잔기 359의 구조를 나타낸다.
<도 3>
도 3은 SDS-PAGE 겔 (비환원)을 통하여 분획화한 CNTO 530 및 그의 변이체를 나타낸다.
<도 4>
도 4는 두 미메티바디(MIMETIBODY)^TM 제작물 변이체가 인간 FcRn에의 결합에 대하여 바이오티닐화 mAb와 어떻게 잘 경쟁하는지에 대한 알파스크린(AlphaScreen)-기반의 분석을 나타낸다.
<도 5a 내지 도 5f>
도 5a 내지 도 5f는 인간 MMP-3 또는 인간 호중구 엘라스타아제(neutrophil elastase; NE)와 함께 인큐베이션 시에 시간이 지남에 따른 온전한 Fc-제작물의 소멸 속도의 MALDI-TOF-MS 추적에 대하여 유도된 데이터를 나타내는데, 도 5a 내지 도 5d는 MMP-3 또는 NE와 함께 인큐베이션할 때 CNTO 5303과 CNTO 530 그리고 CNTO 7363과 CNTO 736의 비교를 나타낸 것이며, 도 5e 및 도 5f는 두 프로테아제와 함께 인큐베이션할 때 CNTO 5304 및 CNTO 7364를 포함하는 모든 샘플을 나타낸 것이다.
<도 6>
도 6은 도 1에서와 같이 IgG1-기반의 변이체의 경첩 및 Fc 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
<도 7>
도 7은 CNTO530 및 CNTO5303 둘 모두의 분자를 주사한 생쥐의 혈액에서의 CNTO530 대 CNTO5303의 혈청중 지속성을 나타내는 그래프이다.

약어

AA = 안트라닐산; α1,3GT = α-1,3-갈락토실트랜스퍼라아제; ARD = 급성 호흡 곤란; β1,4GT = β-1,4-갈락토실트랜스퍼라아제; α2,3ST = α-2,3-시알릴트랜스퍼라아제; ADCC = 항체 의존성 세포독성; CDC = 보체 의존성 세포독성; CMP-Sia = 시티딘 모노포스페이트 N-아세틸뉴라민산; FBS = 소 태아 혈청; IgG = 면역글로불린 G; MALDI-TOF-MS = 매트릭스 지원 레이저/탈착 이온화 비행 시간형 질량 분석법(matrix-assisted laser/desorption ionization time-of-flight mass spectrometry); NANA = 시알산의 N-아세틸뉴라민산 이성체; NGNA = 시알산의 N-글리콜릴뉴라민산 이성체; OA = 골관절염; PNGase F = 펩티드 N-글리코시다아제 F; HPLC = 역상 고성능 액체 크로마토그래피; RA = 류마티스 관절염; SA = 시냅산; Sia = 시알산; SDHB = 염화나트륨을 함유하는 다이하이드록시벤조산; UDP-Gal = 우리딘 다이포스페이트 갈락토스; UDP-GlcNAc = 우리딘 다이포스페이트 N-아세틸글루코사민.

용어의 설명 및 정의

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc," "Fc-함유 단백질" 또는 "Fc-함유 분자"는 적어도 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 단량체형, 이량체형 또는 헤테로이량체형 단백질을 말한다. CH2 및 CH3 도메인은 당해 단백질/분자 (예를 들어, 항체)의 이량체 영역의 적어도 일부분을 형성할 수 있다.

용어 "항체"는 항체, 그의 분해 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고자 의도되며, 이는 한정됨이 없이 항체 모방체(mimetic)를 포함하거나 한정됨이 없이 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 미니바디(minibody) 및 이의 단편을 포함하는, 항체 또는 이의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 기능적 단편은 관심있는 표적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fab (예를 들어, 파파인 분해에 의해), Fab' (예를 들어, 펩신 분해 및 부분적인 환원에 의해) 및 F(ab')₂ (예를 들어, 펩신 분해에 의해), facb (예를 들어, 플라스민 분해에 의해), pFc' (예를 들어, 펩신 또는 플라스민 분해에 의해), Fd (예를 들어, 펩신 분해, 부분적인 환원 및 재응집에 의해), Fv 또는 scFv (예를 들어, 분자생물학 기술에 의해) 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 표적 항원 또는 이의 일부에 결합할 수 있는 항체 단편이 항체라는 용어에 포함된다 (예를 들어, [Colligan, Immunology, 상기 문헌] 참조).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체"는 동물 항체의 적어도 하나의 종의 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 도메인 중 적어도 하나에 대하여 상당한 상동성을 유지하는 적어도 하나의 리간드 결합 도메인을 포함하는 Fc-함유 융합 단백질의 특정 형태이다.

개관

본 발명은 페길화(PEGylation)를 위한 Fc 도메인 상의 새로운 부위의 확인에 있어서의 관심에서 원동력을 얻었다. 변형을 위한 특정 표적화 부위를 제공하는 단백질의 글리칸에의 PEG 부분(moiety)의 콘쥬게이션에 대한 기술이 공지되어 있기 때문에, Asn297에서의 천연 글리칸의 이용이 시도되었지만, Fc-이량체 구조체의 3차 및 4차 구조로 인하여, 천연 Fc 글리칸은 큰 PEG 구조체의 콘쥬게이션을 가능하게 하기에는 불충분하게 접근가능한 것으로 밝혀졌다.

따라서, 다른 또는 추가의 N-결합 글리코실화 부위가 진핵 세포의 소포체에서 글리코실트랜스퍼라아제의 인식 부위로 공지된, 모티프 서열 Asn-Xxx-Ser/Thr에서의 엔지니어링에 의해 조작될 수 있는 Fc 도메인 상의 위치들이 고려되었다. 두 상이한 Fc-함유 제작물, CNTO 530 (EPO 미메티바디^TM 제작물) 및 CNTO 736 (GLP-1 미메티바디^TM 제작물)의 이러한 글리칸 변이체의 제조에 있어서, 비-페길화 글리칸 변이체는 단백질 분해 효소에 대하여 유의하게 증가된 내성을 예기치 못하게도 나타냄이 관찰되었다.

당해 바디는 단백질의 소화 및 리모델링을 위하여 프로테아제를 천연적으로 생성하는데, 치료적 단백질도 상기 소화 및 리모델링에 처해진다. 병원체 비-인도성 질환 상태, 예를 들어 RA 및 기타 염증성 질환 및 암에 있어서, 특정한 스펙트럼의 단백질 분해 효소가 상승됨이 잘 알려져 있다. 또한, 인간 프로테아제는 염증성 질환, 증식성 질환, 전이성 질환, 및 감염성 질환과 관련됨이 잘 알려져 있다. 순환 면역글로불린, 및 특히 IgG 클래스의 항체들이 주요 혈청 단백질이다. 인간 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로테이나아제(MMP) 및 호중구 엘라스타아제는 박테리아 프로테아제, 예를 들어, 글루타밀 엔도펩티다아제 (스타필로코커스 아우레우스(Staph. aureus)) 또는 연쇄상구균(스트렙토코커스 피오제네스(Strep. pyogenes))의 면역글로불린 분해 효소와 유사하게 각 프로테아제에 독특한 잔기에서 IgG 중쇄 폴리펩티드를 절단한다. 상기 중쇄 내의 절단 부위는 경첩 도메인(hinge domain)으로 불리는 영역 주위에 밀집되어 있으며, 여기에서 두 중쇄의 사슬간 다이설파이드 결합이 나타난다. 경첩부 아래의 영역은 Fc 영역을 구성하며 IgG의 이펙터(effector) 기능에 책임이 있는 결합 부위를 포함한다. 미생물의 경우, 경첩부 아래의 절단에 의한 Fc 도메인의 단백질 분해적 방출이 그렇지 않으면 그 병리학적 세포의 표적화 및 사멸을 유도할 기능들을 효과적으로 중화시키는 한은, 프로테아제 발현은 유기체가 옵소닌작용(opsonization)을 피하도록 하는 잠재적인 부속 발병 경로이다(문헌[Rooijakkers et al. Microbes and Infection 7: 476-484, 2005]). 따라서, 특정 프로테아제의 정교화(elaboration)는 암, 염증 및 감염성 질환을 비롯한 수많은 질환 상태를 나타낼 수 있다. IgG 분해가 병리적 생체 내 환경에서 향상된다는 것은 절단된 경첩 도메인에 결합하는 천연 IgG 자기항체의 존재에 의해 추가로 입증된다 (문헌[Knight et al., 1995, Nasu et al., 1980, Persselin and Stevens, 1985, Terness, et al. 1995 J Imunol. 154:6446-6452]). 따라서, 생리학적으로 관련있는 프로테아제에 대한 증가된 내성은 특히 프로테아제-풍부 환경에서 치료적 Fc-함유 분자에 있어서의 생체 내 반김기 연장으로 이어질 수 있으며, 이는 효능을 증가시킬 수 있고/있거나 덜 빈번한 투약을 가능하게 할 수 있다.

본 출원과 공히 소유된 국제특허 공개 WO2009/023457호에는 IgG를 분해시킬 수 있고 암, 염증 및 감염과 같은 질환 또는 병리학적 상태와 관련된 프로테아제가 개시되어 있다. 정보는 표 1 (하기에 재현됨)에 요약되며, 여기서 "응집 프로테이나아제"는 F.XIIa, FIXa, F.Xa, 트롬빈 및 활성화된 단백질 C를 포함하였으며; 플라스민은 플라스미노겐 활성자를 이용하여 공동 인큐베이션한 플라스미노겐이었으며; tPA, 스트렙토키나아제 및 스타필로키나아제; "플라스미노겐 활성자 단독"은 플라스미노겐이 없으며; MMP는 활성 형태로서 또는 프로-효소로서 얻은 재조합 프로테이나아제였으며; "없음"은 24시간 내에 검출가능한 절단이 없음을 나타낸다. 표시된 곳을 제외하고는, 모든 효소는 인간 효소였다. 잔기 표기는 전 성숙 IgG1 항체 중쇄의 EU 넘버링 시스템에 대한 것이다.

[표 1]

올리고당의 기능

세포로부터의 방출을 위한 신호 서열에 의해 명시되는 단백질의 정상적인 프로세싱으로서 진핵 세포의 소포체에서 일어나는 글리코실화의 결과로서 특정 올리고당류가 분비 단백질 상에 존재한다. 단백질에 부가된 올리고당의 조성은 단백질의 성질, 세포의 기원의 종, 배양 조건 및 세포외 환경과 같은 요인에 의해 영향을 받는다. 종에 따른 또는 심지어 개체에 따른 "글라이콤"의 성질은 항원 에피토프의 기원, 예를 들어 인간 혈액형으로서 오랫동안 인식되었다. 따라서, 단백질 표면 글리코실화는 특정 글리칸 구조체 또는 말단 당류에 대하여 특이적인 또는 비특이적인 수용체를 표적화함으로써 단백질의 인식을 변경시키는 방법을 대표한다. 렉틴, 예를 들어 셀렉틴과 유사한 포유류 수용체의 리간드 또는 올리고당류, 예를 들어, 만노스-결합 단백질, L-셀렉틴 및 P-셀렉틴.

포유류 IgG 분자 내의 CH2 도메인의 Asn 297에 정상적으로 부가된 글리칸은 두 CH3 도메인의 비공유적 회합에 의한 그리고 CH2 도메인 근처의 경첩 영역에서 공유 결합된 두 폴리펩티드 사슬, Fc에 3차 구조를 제공하는 작용을 한다. 비글리코실화(aglycosylated) IgG는 Fc-수용체에 결합하지 않거나 또는 ADCC 또는 CDC의 이펙터 기능을 나타내지 않거나 또는 보체 C1q에 결합하지 않는다. 최근의 연구 (문헌[Kaneko, 2006 Science 313: 670-673]; 문헌[Shields et al., 2002 J Biol. Chem. 277:30 26733-26740])는 Asn297 결합된 글리칸의 함량이 Fc(감마) 수용체에의 IgG 분자의 결합 친화성에 또한 영향을 줄 수 있음을 입증하였다.

IVIG로 공지된 인간 감마 글로불린의 제제는 일반적인 항염증 치료제로 오랫동안 사용되어 왔다. 고용량 인간 IVIG를 이용한 치료가 관절염을 억제하는 쥐과 혈청-유도 관절염 모델에서의 최근의 연구는 IVIG의 이전의 효소적 탈시알릴화가 그의 치료 효과를 없애며, 반면에 IVIG의 시알릴화 분획물의 농후화는 그의 항염증 효과를 향상시킴을 보여주었다 (문헌[Kaneko, 2006 Science 313: 670-673]).

항염증 특성은 IVIG의 Fc 부분에 의해 결정됨이 오랫동안 공지되었다. 후속적인 연구는 쥐과 관절염 모델에서 관절 염증 억제에 일차적으로 책임이 있는 IVIG 분자의 분획물이 α2,3 결합의 시알산을 포함하는 것과는 대조적으로 갈락토스와의 α2,6 결합의 Fc 시알산을 포함하는 것임을 입증하였다 (문헌[Anthony et al., (2008) Science 320:373]). 비장 대식세포의 표면 상에서 발현된 생쥐 렉틴, SIGN-R1은 인간 수지상 세포 상에서 발현된 인간 렉틴, DC-SIGN이 그러한 것과 같이 α2,6 시알릴화 Fc 단편의 수용체이다 (문헌[Anthony, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 16;105(50):19571-8.]).

따라서, 본 발명의 단백질 조성물을 이용하여, 특정 올리고당 구조, 말단, 또는 함량을 갖는 단백질 조성물이 숙주 세포 조작 및 당공학을 통하여 합성될 수 있거나, 또는 렉틴-친화성 크로마토그래피 또는 효소 처리 또는 몇몇 방법들의 조합을 이용하여 분획화와 같은 단백질 정제 전 또는 단백질 정제 후 프로세싱에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법은 본 명세서에 교시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 유전 공학, 효소학, 단백질 분획 등에서의 공지된 방법을 이용하여 개발되고 있거나 개발될 수 있다. 이들 제제는 특정 수용체가 선택된 세포 유형, 조직 또는 기관 상에 나타날 때 상기 특정 수용체를 표적화하는 데 사용될 수 있다.

단백질의 글리코실화 또는 과글리코실화는 단백질의 수화 부피를 증가시키며, 시알산 잔기의 존재로 인하여 음전하를 부가할 수 있다. 이들 변경은 단백질이 신장 여과에 의해 덜 청소되게 한다. 따라서, Fc 단편이 순환혈 중 단백질 반감기를 향상시키는 수단으로서의 FcRn 결합에 더하여, 당해 단백질의 증가된 둘레는 상가적 효과를 생성할 것이며, 단 추가의 글리코실화는 FcRn 결합을 감소시키지 않는다.

변경된 Fc-함유 분자의 제조 방법

추가의 글리코실화의 부위는 Fc의 구조 또는 기능에 영향을 주지 않고서 Asn-결합 글리칸을 부가하고자 하는 요구에 기초하여 선택되었다. IgG4 Fc 구조 (1adq) (문헌[Corper et al (1997) Nat Struct Biol. 4: 374])를 분석하여 잠재적인 변형 부위를 확인하였다. 하부 경첩부 내의 Fc(감마)R 결합 부위로부터 멀리 있는 그리고 CH2-CH3 접합 영역에서 FcRn 결합 부위로부터 멀리 있는 CH3 도메인의 루프 영역이 표적화되었다. 359-TKNQVS-364, 382-ESNGQP-387, 및 419-EGNVFS-424 루프는 변형에 따르는 것으로 보이는 잔기를 함유한다. 이들 루프 내에서, 잔기 359, 382, 및 419는 노출되는 표면에 기초하여 그리고 글리코실화가 생성되는 Asn 치환이 구조적으로 양립가능할 것이라는 예측에 기초하여 글리코실화를 도입하는 매력적인 부위로 확인되었다. 그 후, 다수의 N-글리코실화 서열 모티프 (N X S/T)가 이들 위치에 대하여 컴퓨터에 의해 생성되었으며, 상기 서열들을 NetNGlyc 서버(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)에 제출함으로써 글리코실화에 대한 이들의 잠재력을 개산하였다. 점수가 0.5 이하인 모티프는 제거되었다. 시험 분자 내로의 도입용으로 선택된 모티프는 359NKT 및 419NGT였다 (도 1). 382 부위는, 새로운 글리칸이 FcRn 결합을 간섭하지 않는 방향으로 향할 수도 있다는 생각으로 인하여 추구되지 않았다. 그러나, 잔기 382에서의 글리코실화 부위의 도입은 완전한 기능성의 Fc 도메인을 생성하지 않는 것이 가능하다.

Fc-함유 단백질의 효소적 변형

특정 글리칸 구조 또는 특정한 올리고당 내용물을 갖는 Fc-함유 단백질을 제조하는 한 가지 방법은 Fc-함유 단백질 제제를 사카라아제, 예를 들어 푸코시다아제 또는 시알리다아제 효소로 처리하고 이럼으로써 특정 당 잔기, 예를 들어 푸코스 또는 시알산을 제거함에 의한 것이다. Fc 영역에의 당류의 부가는 시험관 내 글리코실화 방법을 이용하여 또한 성취될 수 있다.

글리코실트랜스퍼라아제는 천연적으로 올리고당류를 합성하는 기능을 한다. 글리코실트랜스퍼라아제는 탁월한 입체화학적인 그리고 위치화학적인 기하학적 배치를 갖는 특정 생성물을 생성한다. 글리코실 잔기의 이전은 올리고당류 또는 다당류의 합성 또는 신장으로 이어진다. 다수의 글리코실트랜스퍼라아제 유형이 기재되었으며, 이는 시알릴트랜스퍼라아제, 푸코실트랜스퍼라아제, 갈락토실트랜스퍼라아제, 만노실트랜스퍼라아제, N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라아제 등을 포함한다. 본 발명에서 유용한 글리코실트랜스퍼라아제는 예를 들어 α-시알릴트랜스퍼라아제, α-글루코실트랜스퍼라아제, α-갈락토실트랜스퍼라아제, α-푸코실트랜스퍼라아제, α-만노실트랜스퍼라아제, α-자일로실트랜스퍼라아제, α-N-아세틸헥소스아미닐트랜스퍼라아제, β-시알릴트랜스퍼라아제, β-글루코실트랜스퍼라아제, β-갈락토실트랜스퍼라아제, β-푸코실트랜스퍼라아제, β-만노실트랜스퍼라아제, β-자일로실트랜스퍼라아제, 및 β-N-아세틸헥소스아미닐트랜스퍼라아제, 예를 들어 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 또는 기타 박테리아 공급원 유래의 것, 및 쥐, 생쥐, 토끼, 소, 돼지, 인간 및 곤충 및 바이러스 공급원 유래의 것을 포함한다. 바람직하게는, 글리코실트랜스퍼라아제는 막 결합 도메인이 결실된 글리코실트랜스퍼라아제 효소의 절단 변이체이다. 예시적인 갈락토실트랜스퍼라아제에는 α(1,3) 갈락토실트랜스퍼라아제 (E.C. 번호: 2.4.1.151, 예를 들어 문헌[Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993)] 및 문헌[Yamamoto et al. Nature 345:229-233 (1990)] 참조) 및 α(1,4) 갈락토실트랜스퍼라아제 (E.C. 번호: 2.4.1.38)가 포함된다. 다른 글리코실트랜스퍼라아제, 예를 들어 시알릴트랜스퍼라아제가 사용될 수 있다.

흔히 시알릴트랜스퍼라아제로 칭해지는 α(2,3)시알릴트랜스퍼라아제가 시알릴 락토스 또는 더욱 높은 차수의 구조체의 생성에 사용될 수 있다. 이 효소는 시알산(NeuAc)을 CMP-시알산으로부터 Gal 잔기로 이전시키며, 이때 두 당류 사이에 α-결합이 형성된다. 상기 당류들 사이의 결합(연결)은 Gal의 3-위치와 NeuAc의 2-위치 사이에 있다. α(2,3)시알릴트랜스퍼라아제 (EC 2.4.99.6)로 칭해지는 예시적인 α(2,3)시알릴트랜스퍼라아제는 시알산을 글리코사이드 또는 Galβ1→3Glc 이당의 비-환원 말단 Gal로 이전시킨다. 문헌[Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem., 256:3159 (1981)], 문헌[Weinstein et al., J. Biol. Chem., 257:13845 (1982)] 및 문헌[Wen et al., J. Biol. Chem., 267:21011 (1992)]을 참조하라. 다른 예시적인 α-2,3-시알릴트랜스퍼라아제 (EC 2.4.99.4)는 시알산을 글리코사이드 또는 이당의 비-환원 말단 Gal로 이전시킨다. 문헌[Rearick et al., J. Biol. Chem., 254:4444 (1979)] 및 문헌[Gillespie et al., J. Biol. Chem., 267:21004 (1992)]을 참조하라. 추가의 예시적인 효소에는 Gal-β-1,4-GlcNAc α-2,6 시알릴트랜스퍼라아제가 포함된다 (문헌[Kurosawa et al. Eur. J. Biochem. 219: 375-381 (1994) 참조).

본 발명의 올리고당류의 제조에서 특히 유용한 다른 글루코실트랜스퍼라아제로는 Pmt1, OCh1, Dol-P-Man 신타아제, β(1,4) 만노실트랜스퍼라아제, α(1,3) 만노실트랜스퍼라아제, 및 α(1,2) 만노실트랜스퍼라아제를 포함하는 만노실트랜스퍼라아제가 있다. 또 다른 글루코실트랜스퍼라아제는 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제를 포함하며, 이는 α(1,3) N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제, β(1,4) N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제 (문헌[Nagata et al. J. Biol. Chem. 267:12082- 12089 (1992)] 및 문헌[Smith et al. J. Biol Chem. 269:15162 (1994)]) 및 폴리펩티드 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라아제 (문헌[Homa et al. J. Biol Chem. 268:12609 (1993)])를 포함한다. 적합한 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라아제는 GnTI (2.4.1.101, 문헌[Hull et al., BBRC 176:608 (1991)]), GnTII, 및 GnTIII (문헌[Ihara et al. J. Biolchem. 113:692 (1993)]), GnTV (문헌[Shoreiban et al. J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)])를 포함한다.

본 방법이 상업적 규모로 실행되어야 하는 실시 형태에 있어서, 글리코실 트랜스퍼라아제를 지지체 상에 고정하는 것이 유리할 수 있다. 이 고정은 생성물 배치로부터의 당해 효소의 제거 및 당해 효소의 후속적인 재사용을 용이하게 한다. 글리코실 트랜스퍼라아제의 고정은 예를 들어 트랜스퍼라아제로부터 그의 막 결합 도메인을 제거하고 그의 적소에 셀룰로오스 결합 도메인을 부착시킴으로써 달성될 수 있다. 당업자라면 다른 고정 방법이 또한 사용될 수 있으며 이는 입수가능한 문헌에 기재되어 있음을 이해할 것이다. 본질적으로 수용자 기질은 특정 글리코실 트랜스퍼라아제가 특이성을 나타내는 말단 당류 잔기를 갖는 임의의 단당류 또는 올리고당류일 수 있기 때문에, 기질은 그의 비-환원 말단 위치에서 치환될 수 있다. 따라서, 글리코사이드 수용자는 단당류, 올리고당류, 형광-표지된 당류, 또는 당류 유도체, 예를 들어 아미노글리코사이드 항생제, 강글리오사이드, 또는 항체 및 기타 Fc-함유 단백질을 포함하는 당단백질일 수 있다. 바람직한 실시 형태의 한 군에서, 글리코사이드 수용자는 올리고당류, 바람직하게는 Galβ(1-3)GlcNAc, Galβ(1-4)GlcNAc, Galβ(1-3)GalNAc, Galβ(1-4)GalNAc, Man α(1,3)Man, Man α(1,6)Man, 또는 GalNAcβ(1-4)-만노스이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 올리고당류 수용자는 Fc-함유 단백질의 CH2 도메인에 부착된다.

활성화된 당 기질, 즉, 당-뉴클레오시드 포스페이트의 사용은 글리코트랜스퍼라아제 반응과 동시에 재생 반응을 이용함으로써 (재활용 시스템으로도 공지됨) 회피될 수 있다. 예를 들어, 예컨대 미국 특허 제6,030,815호에 교시된 바와 같이, CMP-시알산 재활용 시스템은 CMP-시알산 신테타아제를 이용하여 CMP-시알산(CMP-NeuAc)을 보충하며, 그 이유는 이것이 α(2,3)시알릴트랜스퍼라아제의 존재 하에 시알릴트랜스퍼라아제 수용자와 반응하여 시알릴-당류를 형성하기 때문이다. 본 발명에서 유용한 CMP-시알산 재생 시스템은 시티딘 모노포스페이트(CMP), 뉴클레오시드 트라이포스페이트(예를 들어, 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 포스페이트 공여자 (예를 들어, 포스포엔올피루베이트 또는 아세틸 포스페이트), 키나아제 (예를 들어, 피루베이트 키나아제 또는 아세테이트 키타아제) - 이는 포스페이트를 포스페이트 공여자로부터 뉴클레오시드 다이포스페이트로 이전시킬 수 있음 - 및 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나아제 (예를 들어, 마이오키나아제) - 말단 포스페이트를 뉴클레오시드 트라이포스페이트로부터 CMP로 이전시킬 수 있음 - 를 포함한다. α(2,3)시알릴트랜스퍼라아제 및 CMP-시알산 신테타아제는 또한 CMP-시알산 재생 시스템의 일부로 보일 수 있으며, 그 이유는 활성화된 시알산의 제거가 정방향 합성 속도를 유지하는 역할을 하기 때문이다. 변형 CMP-시알산 신테타아제 효소의 유전자를 포함하는 파지미드를 이용한 시알릴화 절차에서의 시알산 화합물의 사용 및 합성은 1992년 10월 1일자로 공개된 국제특허 공개 WO 92/16640호에 개시되어 있다.

올리고당류의 대안적인 제조 방법은 글리코실트랜스퍼라아제 및 공여자 당으로서 활성화 글리코실 유도체를 사용하여 공여자 당으로서 당 뉴클레오티드를 필요로 하는 것을 배제하는 것을 통한 것이며, 이는 미국 특허 제5,952,203호에 교시된 바와 같다. 활성화된 글리코실 유도체는 자연 발생 기질에 대한 대안으로서 작용하는데, 이는 고가의 당-뉴클레오티드, 일반적으로 뉴클레오티드 다이포스포당 또는 뉴클레오티드 모노포스페이트당이고, 여기서 상기 뉴클레오티드 포스페이트는 당의 1-위치에 α-결합된다.

유용한 활성화 글리코시드 유도체는 예를 들어 플루오로, 클로로, 브로모, 토실레이트 에스테르, 메실레이트 에스테르, 트라이플레이트 에스테르 등과 같이 활성화된 이탈기를 포함한다. 활성화된 글리코시드 유도체의 바람직한 실시 형태는 글리코실 플루오라이드 및 글리코실 메실레이트를 포함하며, 이때 글리코실 플루오라이드가 특히 바람직하다. 글리코실 플루오라이드 중에서, α-갈락토실 플루오라이드, α-만노실 플루오라이드, α-글루코실 플루오라이드, α-푸코실 플루오라이드, α-자일로실 플루오라이드, α-시알릴 플루오라이드, 알파-N-아세틸글루코스아미닐 플루오라이드, α-N-아세틸갈락토스아미닐 플루오라이드, β-갈락토실 플루오라이드, β-만노실 플루오라이드, β-글루코실 플루오라이드, β-푸코실 플루오라이드, β-자일로실 플루오라이드, 베타-시알릴 플루오라이드, β-N-아세틸글루코스아미닐 플루오라이드 및 β-N- 아세틸갈락토스아미닐 플루오라이드가 가장 바람직하다.

글리코실 플루오라이드는 먼저 당을 아세틸화하고 이어서 이것을 HF/피리딘으로 처리함으로써 유리 당으로부터 제조될 수 있다. 아세틸화된 글리코실 플루오라이드는 메탄올 중 온화한 (촉매적) 염기(예를 들어, NaOMe/MeOH)와의 반응에 의해 탈보호될 수 있다. 게다가, 많은 글리코실 플루오라이드는 구매가능하다. 다른 활성화된 글리코실 유도체는 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 글리코실 메실레이트는 완전히 벤질화된 헤미아세탈 형태의 당을 메실 클로라이드로 처리하고, 이어서 촉매적으로 수소화하여 벤질기를 제거함으로써 제조될 수 있다.

당해 반응의 추가의 구성요소는 촉매량의 뉴클레오시드 포스페이트 또는 이의 유사체이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 뉴클레오시드 모노포스페이트는 예를 들어 아데노신 모노포스페이트(AMP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 이노신 모노포스페이트(IMP) 및 티미딘 모노포스페이트(TMP)를 포함한다. 본 발명에 따라 사요뉴클레오시드 트라이포스페이트는 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 시티딘 트라이포스페이트(CTP), 우리딘 트라이포스페이트(UTP), 구아노신 트라이포스페이트(GTP), 이노신 트라이포스페이트(ITP) 및 티미딘 트라이포스페이트(TTP)를 포함한다. 바람직한 뉴클레오시드 트라이포스페이트는 UTP이다. 바람직하게는, 뉴클레오시드 포스페이트는 뉴클레오시드 다이포스페이트, 예를 들어 아데노신 다이포스페이트(ADP), 시티딘 다이포스페이트(CDP), 우리딘 다이포스페이트(UDP), 구아노신 다이포스페이트(GDP), 이노신 다이포스페이트(IDP) 및 티미딘 다이포스페이트(TDP)이다. 바람직한 뉴클레오시드 다이포스페이트는 UDP이다. 상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 뉴클레오시드 포스페이트의 유사체를 이용하여 또한 실행될 수 있다. 적합한 유사체는 예를 들어 뉴클레오시드 설페이트 및 설포네이트를 포함한다. 또 다른 유사체는 단순 포스페이트, 예를 들어 파이로포스페이트를 포함한다.

예를 들어 쥐과 세포에서 생성되는 재조합 단백질을 변형시키는 한 가지 절차 - 여기서, 하이드록실화된 형태의 시알산이 우세함 (NGNA) - 는 상기 단백질을 시알리다아제로 처리하여 NGNA형 시알산을 제거하고, 이어서 시약 UDP-Gal 및 베타1,4 Gal트랜스퍼라아제를 이용하여 효소적으로 갈락토실화하여 고도로 균질한 G2 당형을 생성하는 것이다. 이어서 상기 제제를 선택적으로 시약 CMP-NANA 및 알파-2,3 시알릴트랜스퍼라아제로 처리하여 고도로 균질한 G2S2 당형을 제공할 수 있다.

본 발명의 목적상, 당형에 있어서 사실상 균질하다는 것은 약 85% 이상의 그 당형, 그리고 바람직하게는 약 95% 이상의 그 당형을 의미할 것이다.

프로테아제 및 항체의 프로테아제 민감성

펩신은 낮은 pH에서 자가 활성화되어 활성을 갖게 되는데, 그 이유는 이것이 식사 후 위 내강 내로 분비되는 위액의 정상적인 성분이기 때문이다. 낮은 수준의 전구 효소 펩시노겐이 혈청에서 발견될 수 있지만, 활성화 및 활성은 산 의존성이기 때문에 이는 생리학적으로 순환 항체에 관련되지 않는다. 펩신은 하부 경첩부에서 류신_234-류신₂₃₅ 사이에서 인간 IgG1을 절단한다. 이 절단 부위는 항원 결합에 대하여 2가인 F(ab')₂분자를 생성하는, 다이설파이드 결합을 통하여 두 중쇄를 연결하는 두 시스테인 잔기를 함유하는 경첩부 코어(-C-P-P-C-)로부터 하류에 있다.

하부 경첩부 및 CH2 영역의 시작, P-A-P-E-F/L-L-G-G-P-S-V-F (서열 번호 1 및 2의 잔기 5-16)는 매트릭스메탈로프로테이나아제, MMP-3 및 MMP-12의 절단 부위를 포함한다. 펩신 및 MMP-7도 이 영역(P-A-P-E-L*L-G)에서 절단한다. 게다가, 생리학적으로 관련있는 효소군; 호중구 엘라스타아제(HNE), 스트로멜리신(MMP-3) 및 대식세포 엘라스타아제(MMP-12)는 몇몇 위치에서 IgG를 절단하여 미묘하게 상이한 F(ab')₂, Fab 및 Fc 단편을 생성한다 (표 1 참조).

당형 변이체의 생물학적 특성화

Fc-함유 단백질은 몇몇의 잘 알려진 시험관 내 분석법에 의해 기능성에 대하여 비교될 수 있다. 특히, Fcγ 수용체의 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 패밀리의 구성원에 대한 친화성이 흥미롭다. 이들 측정은 재조합 용해성 형태의 수용체 또는 세포-결부된 형태의 수용체를 이용하여 행해질 수 있다. 게다가, IgG의 연장된 순환혈중 반감기에 책임이 있는 수용체인 FcRn에 대한 친화성은 예를 들어 재조합 용해성 FcRn를 이용하여 바이아코어(BIAcore)에 의해 측정될 수 있다. 세포-기반 기능 분석법, 예를 들어 ADCC 분석법 및 CDC 분석법은 특정 변이체 구조의 가능한 기능적 결과에 대한 통찰을 제공한다. 일 실시 형태에서, ADCC 분석은 NK 세포가 일차 이펙터 세포가 되도록 구성되며, 이럼으로써 FcγRIIIA 수용체에 대한 기능적 영향을 반영하게 된다. 세포 반응, 예를 들어 수퍼옥사이드 또는 염증 매개자 방출을 측정하는 분석법에서 그러할 수 있듯이, 식균작용 분석법을 또한 이용하여 상이한 변이체들의 면역 이펙터 기능을 비교할 수 있다. 예를 들어 생쥐에서 T 세포 활성화를 측정하기 위하여 항-CD3 항체의 변이체를 이용하는 경우, Fcγ 수용체와 같이 특정 리간드와 맞물린 Fc 도메인에 의존적인 활성뿐만 아니라 생체 내 모델도 사용될 수 있다.

단백질 생성 과정

Fc-함유 단백질의 생성과 관계있는 상이한 과정들이 Fc 올리고당 구조에 영향을 줄 수 있다. 하나의 예에서, Fc-함유 단백질을 분비하는 숙주 세포는 혈청, 예를 들어 이전에 상승된 열처리 (예를 들어, 56℃, 30분)에 처해지지 않은 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)의 존재 하에 배양된다. 이는 상기 세포로부터 분비되는 Fc-함유 단백질로부터 시알산을 제거할 수 있는 활성 시알리다아제 효소의 혈청 중에의 자연적인 존재로 인하여 시알산을 전혀 함유하지 않거나 또는 매우 적은 양의 시알산을 함유하는 Fc-함유 단백질로 이어질 수 있다. 다른 실시 형태에서, Fc-함유 단백질을 분비하는 세포는 상승된 열처리에 처해지고 이럼으로써 시알리다아제 효소가 불활성화된 혈청의 존재 하에, 또는 시알리다아제 효소를 함유할 수 있어서 Fc-함유 단백질이 더 높거나 또는 더 낮은 수준의 글리코실화 또는 글리코실화 변이체를 갖게 되는 혈청 또는 기타 배지 성분의 부재 하에 배양된다.

다른 실시 형태에서, Fc-함유 단백질을 정제하고 추가로 가공하는 데 사용되는 조건이 확립되며, 이는 최적 글리칸 함량에 유리할 것이다. 일 실시 형태에서, 당해 조건은 최대 또는 최소의 올리고당 내용물을 생성하거나 또는 우세한 당형의 발현 Fc-함유 폴리펩티드의 변환을 야기한다. 예를 들어, 시알산은 산-불안정성이기 때문에, 낮은 pH 환경에의 장기간 노출, 예를 들어 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출 이후 또는 바이러스 불활성화 노력은 시알산 함량을 감소시킬 수 있다. 다른 실시 형태에서, 글리코실화된 물질은 특정 당류 또는 올리고당 복합체류를 디스플레이하는 단백질에 선택적으로 결합하거나 상기 단백질의 통과를 지연시킬 레시틴-고정 지지체 물질을 이용한 크로마토그래피에 처해진다. 고정-렉션 컬럼의 경우, 비결합 플로우-쓰루(flow-through; T, 쓰루) 또는 컬럼 미결합 분획물은 결합 분획물(B, 결합)로부터 분리될 수 있으며, 후자는 용출 완충액을 컬럼에 통과시키는 동안 수집된다. 약하게 결합된 분획물 또는 컬럼 지연 분획물(R, 지연)을 예를 들어 원래의 샘플 완충액을 이용한 컬럼의 계속적인 세척 동안 용출되는 Fc-함유 단백질의 수집에 의해 별도로 수집하는 것이 또한 가능할 수 있다. 시알릴화 또는 비시알릴화 Fc-함유 단백질이 농후해질 수 있는 렉틴의 예로는 말단 시알산을 갖는 올리고당류에 특이적으로 결합하는 마키아 아무렌시스(Maackia amurensis; MAA) 유래의 렉틴, 및 말단 시알산 또는 말단 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는 올리고당류에 특이적으로 결합하는 렉틴 밀 배아 응집소(wheat germ agglutinin; WGA)가 있다. 다른 예로는 렉틴 리신(Ricin) I(RCA)이 있으며, 이는 말단 갈락토스를 갖는 올리고당류에 결합한다. 후자의 예에서, 비결합 플로우-쓰루 분획물은 시알릴화 Fc-함유 분자가 농후해질 수 있다. 당업계에 공지된 다른 렉틴은 벡터 랩스(Vector labs) 및 이와이 랩스(EY labs)에 의해 제공되는 것을 포함한다.

숙주 세포 선발 또는 숙주 세포 엔지니어링

본 명세서에 기재된 바와 같이, 재조합 Fc-함유 단백질 또는 단클론 항체 발현용으로 선택된 숙주 세포는 한정됨이 없이 면역글로불린 CH2 도메인에서 당해 단백질을 장식하는 올리고당 부분의 조성의 변동을 포함하여 최종 조성물에 대한 중요한 기여자이다. 따라서, 본 발명의 일 태양은 원하는 치료 단백질을 발현하는 생산 세포의 개발 및/또는 사용을 위한 적절한 숙주 세포의 선발을 수반한다.

항체 또는 Fc-융합물의 시알산 함량이 감소된 일 실시 형태에서, 숙주 세포는 시알릴트랜스퍼라아제가 천연적으로 결핍된 또는 전혀 없는 세포이다. 다른 실시 형태에서, 숙주 세포는 시알릴트랜스퍼라아제가 전혀 없도록 유전자 변형된다. 추가의 실시 형태에서, 숙주 세포는 감소된 또는 검출가능하지 않은 수준의 시알릴트랜스퍼라아제를 발현하도록 선발된 숙주 세포주 유도체이다. 또 다른 실시 형태에서, 숙주 세포는 시알산을 항체에 이전시키기 위하여 시알릴트랜스퍼라아제에 의해 사용되는 시알산 공급원인 CMP-시알산의 형성을 촉매하는 효소인 CMP-시알산 신테타아제가 자연적으로 전혀 없거나, 또는 상기 신테타아제가 없도록 유전자 변형된다. 관련 실시 형태에서, 숙주 세포는 피루브산으로부터 시알산을 형성하는 효소인 피루브산 신테타아제가 자연적으로 전혀 없을 수 있거나, 또는 상기 신테타아제가 전혀 없도록 유전자 변형된다.

추가의 실시 형태에서, 숙주 세포는 숙주 세포에서 발현되는 항체가 갈락토스가 결여되도록 갈락토실트랜스퍼라아제가 자연적으로 전혀 없을 수 있거나, 또는 상기 갈락토실트랜스퍼라아제가 전혀 없도록 유전자 변형된다. 갈락토스가 없으면 시알산은 부착되지 않을 것이다. 별도의 실시 형태에서, 숙주 세포는 생성 동안 항체로부터 시알산을 제거하는 시알리다아제 효소를 천연적으로 과다발현하거나, 또는 상기 효소를 과다발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 그러한 시알리다아제 효소는 항체가 분비되기 전에 항체 상에 세포내에서 작용할 수 있거나 또는 배양 배지 내로 분비되어 상기 배지 내로 이미 분비된 항체 상에 작용할 수 있고 갈락타아제를 추가로 포함할 수 있다. 변경된 글리코실라아제를 포함하며 변경된 탄수화물 조성을 갖는 당단백질을 발현하는 세포주의 선발 방법은 개시되었다 (문헌[Ripka and Stanley, 1986. Somatic Cell Mol Gen 12:51-62]; 미국 특허 공개 제2004/0132140호). 향상된 ADCC로 이어지는 변경된 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 숙주 세포의 엔지니어링 방법은 미국 특허 제6,602,864호에 교시되어 있으며, 여기서 숙주 세포는 적어도 하나의 당단백질 변형 글리코실 트랜스퍼라아제, 구체적으로 β (1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라아제 III(GnTIII)을 코딩하는 핵산을 지닌다.

숙주 세포 글리코실트랜스퍼라아제의 조작을 통한 숙주 세포의 글리코실화 특성의 유전자 엔지니어링을 위한 한 가지 접근법은 유럽 특허 제1,176,195호에 교시된 바와 같이 그 활성, 구체적으로는 알파1,6 푸코실트랜스퍼라아제 (FUT8 유전자 생성물)를 제거하거나 또는 억제하는 것을 수반한다. 상기에 인용된 구체적인 예 이외의 것에서의 숙주 세포 엔지니어링 방법의 실행이 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 엔지니어링된 숙주 세포는 포유류 기원의 것일 수 잇거나, 또는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이의 임의의 유도체, 불사화된 또는 형질전환된 세포로부터 선택될 수 있다.

다른 실시 형태에서, 올리고당 부착에 필요한 효소의 활성을 억제하거나 없애는 방법은 유전자 넉아웃(knock-out), siRNA의 이용에 의한 것과 같은 유전자 사일런싱(gene silencing), 또는 효소에 특이적이며 결합하여 그의 효소 활성을 차단하는 세포내 항체 또는 펩티드의 동시 발현에 의한 것과 같은 효소 저해제의 첨가, 및 기타 공지된 유전자 엔지니어링 기술로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 당류 부착을 차단하는 효소, 또는 이미 부착되어 있는 당을 제거하는 사카라이다아제 효소의 발현 또는 활성을 향상시키는 방법은 재조합 효소 유전자를 이용한 트랜스펙션, 효소의 RNA의 합성을 향상시키는 전사 인자의 트랜스펙션, 및 효소의 RNA의 안정성을 향상시키는 유전자 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는데, 이들 모두는 효소, 예를 들어 시알리다아제의 활성을 향상시키며 이는 정제된 생성물 중 시알산의 더욱 낮은 수준으로 이어진다. 다른 실시 형태에서, 특정 효소 저해제가 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어 원핵 세포 또는 유기체, 예를 들어 천연 또는 엔지니어링된 이. 콜라이(E. coli) spp, 클렙시엘라(Klebsiella) spp., 또는 슈도모나스(Pseudomonas) spp. 및 그의 것으로부터 선택될 수 있다

항체

본 출원에 기재된 항체는 인간, 생쥐, 토끼, 쥐, 설치류, 영장류, 염소, 또는 이의 임의의 조합과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 임의의 포유류를 포함하거나 또는 그로부터 유래될 수 있으며, 단리된 인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간화 및/또는 CDR-그래프팅된 항체, 면역글로불린, 이의 절단 생성물 및 기타 특정 부분 및 변이체를 포함한다.

본 명세서에 개시된 항체, Fc-함유 단백질, 또는 Fc 단편은 당업계에 잘 알려진 몇몇 방식으로 유도될 수 있다. 일 태양에서, 항체는 표적 펩티드, 세포 또는 조직 추출물을 이용하여 생쥐 또는 기타 동물을 면역화함으로써 제조되는 하이브리도마로부터 편리하게 얻어진다. 따라서 항체는 당업계에 잘 알려진 임의의 하이브리도마 기술을 이용하여 얻을 수 있으며, 예를 들어 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참고하며 이들 각각은 전체적으로 참고로 본 명세서에 포함된다.

항체 또는 Fc-융합 단백질 또는 이의 구성요소 및 도메인은 그러한 도메인 또는 구성요소의 라이브러리, 예를 들어 파지 라이브러리로부터 선발에 의해 또한 얻어질 수 있다. 파지 라이브러리는 면역화된 동물 또는 인간의 B-세포로부터의 것과 같이, 관심있는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드의 라이브러리의 삽입에 의해 생성될 수 있다 (문헌[Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317]). 항체 파지 라이브러리는 하나의 파지 내에 중쇄(H chain) 및 경쇄(L chain) 가변 영역 쌍을 함유하여 단쇄 Fv 단편 또는 Fab 단편의 발현을 허용한다 (문헌[Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8]). 파지미드 라이브러리의 다양성을 조작하여서 라이브러리의 단클론 항체의 면역특이성을 증가시키고/시키거나 변경하여 추가의 바람직한 인간 단클론 항체를 생성하여 후속적으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 중쇄(H chain) 및 경쇄(L chain) 면역글로불린 분자 코딩 유전자들은 랜덤하게 혼합되어 (셔플링되어) 조립 면역글로불린 분자 내의 새로운 HL 쌍을 생성할 수 있다. 부가적으로, 어느 하나의 또는 둘 모두의 H 사슬 및 L 사슬을 코딩하는 유전자는 면역글로불린 폴리펩티드의 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이될 수 있으며, 후속적으로 바람직한 친화성 및 중화 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 또한 항체 라이브러리는 하나 이상의 인간 프레임워크(framework) 서열을 선택하고, 인간 항체 레파토리로부터 유래된 CDR 카세트의 컬렉션(collection)을 도입함으로써 합성에 의해 생성하거나, 또는 디자인된 변이를 통하여 생성될 수 있다 (문헌[Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602]). 다양성의 위치는 CDR에 한정되지 않지만, 가변 영역의 프레임워크 세그먼트를 또한 포함할 수 있거나, 또는 항체 가변 영역 이외의 것, 예를 들어 펩티드를 포함할 수도 있다. 항체 가변 영역 이외의 것을 포함할 수도 있는 표적 결합 구성요소의 다른 라이브러리로는 리보좀 디스플레이, 효소 디스플레이 및 박테리아 디스플레이가 있다. 리보좀 디스플레이는 단백질이 RNA에 계속하여 부착되게 하면서 mRNA를 그의 동계 단백질로 번역하는 방법이다. 핵산 코딩 서열은 RT-PCR에 의해 회수된다 (문헌[Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022]). 효소 디스플레이는 막-결부된 알파-응집소 효모 유착 수용체, aga1 및 aga2 - 교배형 시스템의 일부분 - 의 융합 단백질의 제작물을 기반으로 한다 (문헌[Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7]). 박테리아 디스플레이는 세포막 또는 세포벽과 결부된 엑스포트된(exported) 박테리아 단백질에의 표적의 융합을 기반으로 한다 (문헌[Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503]). 하이브리도마 기술과 비교하여, 파지 및 기타 항체 디스플레이 방법은 항원에 대한 숙주의 영향의 가능성을 한정하지 않고서 그리고 시험관 내에서 항원 표적에 대한 선발을 조작할 기회를 생성하거나 또는 그 역도 또한 같다.

또한 본 발명은 조성물 또는 이의 유도된 돌연변이 유발원의 원핵, 진핵 또는 선상 파지 발현, 분비 및/또는 디스플레이와 양립가능한 벡터를 포함하는 발현 벡터의 일부로서 또는 단리된 폴리뉴클레오티드로서 본 발명의 조성물을 코딩하는 핵산을 제공한다.

Fc-함유 분자의 사용

임의의 상기에 기재된 방법에 의해 생성된 조성물 (항체, Fc-융합물, Fc 단편)은 세포, 조직, 기관, 유체, 또는 일반적으로 숙주에서 인간 질환 또는 특정 병상을 진단, 치료, 검출 또는 조정하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 교시된 바와 같이, 처리 표적인 유체, 구획, 조직 또는 기관에 존재하는 것으로 공지된 프로테아제에 의한 단백질 분해적 소화에 저항하기 위한 항체, Fc-융합 단백질, 또는 Fc 단편의 Fc 부분의 글리코실화의 변형을 이용하여 치료 분자를 생성할 수 있으며, 이들 분자는 그의 원래의 표적화 특성을 유지할 수도 있고, 이들 프로테아제에 의한 분해가 덜 쉬울 것이다.

절단 활성에 대하여 내성이 있어야 하는 프로테아제는 펩신, 플라스민, 트립신, 키모트립신, 매트릭스 메탈로프로테이나아제, 세린 엔도펩티다아제 및 시스테인 프로테아제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들은 기생충, 박테리아 또는 바이러스일 수 있는 숙주 또는 병원체에서 생긴다. 특정 실시 형태에서, 프로테아제는 젤라티나아제 A (MMP2), 젤라티나아제 B (MMP-9), 매트릭스 메탈로프로테이나아제-7 (MMP-7), 스트로멜리신 (MMP-3), 및 대식세포 엘라스타아제 (MMP-12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 매트릭스 메탈로프로테이나아제이다. 당해 분자 또는 Fc 분자의 Fc 부분의 글리코실화의 변경을 위한 변경 (EU 넘버링을 이용함)은 CH2 도메인에서의 글리코실화 부위의 제거 (Asn 297의 치환), 359에서의 Asn 및 361에서의 Thr의 치환에 의한 CH3 도메인에서의 N-결합 글리코실화 부위의 부가, 382에서의 Asn 및 384에서의 Thr의 치환에 의한 CH3 도메인에서의 N-결합 글리코실화 부위의 부가, 및 419에서의 Asn 및 421에서의 Thr의 치환에 의한 CH3 도메인에서의 N-결합 글리코실화 부위의 부가로부터 선택될 수 있다. 글리코실화 부위를 CH3 도메인에 부가하는 것은 생성된 분자의 수화의 부피를 증가시키고 체내에서의 지속성을 증가시킬 것으로 예상된다.

본 발명에 의해 제공되는 조성물을 사용한 치료에 따를 수 있는 질환 또는 병상은 암 또는 증식성 질환, 염증성 또는 류마티스성 질환, 자가면역 장애, 신경 장애, 섬유증, 심혈관 질환, 피부 및 감염성 질환, 및 화상 또는 상해에서 생기는 병태를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물을 이용한 치료에 따르는 암 또는 증식성 장애는 고형 종양, 전이성 종양, 액성 종양 및 양성 종양, 예를 들어 림프종, 림프아구성 또는 골수성 백혈병, (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML), 만성 골수구성 백혈병(chronic myelocytic leukemia; CML), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia; CLL), 모발상 세포 백혈병, 골수 형성 이상 증후군(myelodyplastic syndrome; MDS), 림프증식성 질환, 호지킨병(Hodgkin's disease), 캐슬만병(Castleman's disease), 악성 림프종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 다발성 골수종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 결장직장 암종, 췌장 암종, 신당 세포 암종, 유방암, 비인두 암종, 악성 조직구증, 선암종, 편평 세포 암종, 육종, 악성 흑색종, 특히 전이성 흑색종 및 혈관종으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물을 이용한 치료에 따르는 염증성 또는 면역계 매개 질환은 류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염, 전신형 연소성 류마티스 관절염, 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 위궤양, 관절병증 및 관절경 플라크(arthroscopic plaque), 골관절염, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 전신성 홍반성 루푸스, 항인지질 증후군, 포도막염, 시신경염, 특발성 폐 섬유증, 전신성 혈관염, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 사르코이도시스(sarcoidosis), 고환염, 알러지성 및 아토피성 질환, 천식 및 아토피성 천식, 알러지성 비염, 습진, 알러지성 접촉성 피부염, 알러지성 결막염, 과민성 폐렴, 장기 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 및 전신성 염증 반응 증후군으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물을 이용한 치료에 따르는 다른 질환 또는 병태로는 천포창, 경피증, 만성 폐쇄성 폐질환, 그람 음성균 또는 그람 양성균의 감염, 바이러스 감염, 예를 들어 인플루엔자 및 HIV, 기생충에 의한 감염, 예를 들어 말라리아 또는 리슈마니아증, 나병, 뇌염, 칸디다증(Candidiasis), 아밀로이드증, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 심근 경색, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중 및 출혈이 있다.

본 명세서에 구체적으로 예시된 바와 같이, (359에서의 Asn 잔기 및 361에서의 Thr 잔기 (EU 넘버링)의 치환에 의해) Fc 영역의 CH3 도메인에서 N-결합 글리칸을 부가하면 펩티드 Fc-융합 단백질인 화합물은 분자의 FcRn 결합 친화성 및 ADCC/CDC 활성을 유지하면서 매트릭스 메탈로프로테이나아제 (MMP-3) 및 세린 엔도펩티다아제 (NE)에 대해서 덜 민감해지게 된다.

본 발명을 일반적인 개념으로 개시하였지만, 본 발명의 실시 형태는 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안되는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.

실시예 1. Fc 글리코실화 변이체의 제작

미국 특허 제7,393,662호의 EPO 미메티바디^TM 제작물 (Fc 융합물)로 개시된 EMP-1 Fc 융합물 (CNTO530) (서열 번호 88) 및 국제특허 공개 WO/05097175호에 개시된 GLP-1 미메티바디^TM 제작물 (Fc 융합물) (CNTO736)에서 실험을 실시하였다. 둘 모두의 제작물은 도 1에 도시된 바와 같이 인간 IgG4 항체로부터 유래된 Fc 영역을 함유한다.

CNTO 530 변이체

표준 재조합 PCR 및 클로닝 방법을 사용하여, CNTO530을 코딩하는 플라스미드, p2630을 출발 물질로 이용하여 NEM2631을 제조하였다. EPO 미메티바디^TM 제작물 CNTO 530 내로 T359N/N361T 치환을 도입하기 위하여, CH3-코딩 제한효소 단편을 NEM 2631 T359N/N361T 플라스미드 p3051로부터 단리하였으며, CNTO 530을 코딩하는 플라스미드 p2630 내의 상응하는 단편을 대신하여 클로닝하였다. 생성된 플라스미드, p3201은 단백질 CNTO 530 T359N/N361T를 코딩하며, 이는 본 명세서에서 CNTO 5303으로 칭하였다 (도 2 및 표 1 참조).

동일한 T359N/N361T 치환을 갖지만 297 위치에서 천연 Fc 글리코실화가 결여된 CNTO 530 변이체를 제조하기 위하여, 플라스미드 p3201의 적절한 부분을 돌연변이원성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR-증폭시키고, 클로닝하여 T299N 코돈 치환을 생성하였다(즉, ₂₉₇NST₂₉₉로부터 ₂₉₇NSN₂₉₉로 변화). 생성된 플라스미드는 단백질 CNTO 530 T359N/N361T/T299N을 코딩하는 p3576이었으며, 이는 본 명세서에서 CNTO 5304로 칭하였다.

CNTO 736 변이체

CNTO 736 내로 T359N/N361T 치환을 도입하기 위하여, CH3-코딩 제한효소 단편을 NEM 2631 T359N/N361T 플라스미드 p3051로부터 단리하였으며, CNTO 736을 코딩하는 플라스미드 p2538 내의 상응하는 단편을 대신하여 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 CNTO 736 T359N/N361T를 코딩하는 p3349였으며, 이는 본 명세서에서 CNTO 7363으로 칭하였다 (표 1).

동일한 T359N/N361T 치환을 갖지만 297 위치에서 천연 Fc 글리코실화가 결여된 CNTO 736 변이체를 제조하기 위하여, 플라스미드 p3349의 적절한 부분을 PCR-증폭시키고 클로닝하여 T299N 코돈 치환을 생성하였다. 생성된 플라스미드는 단백질 CNTO 736 T359N/N361T/ T299N을 코딩하는 p3577이었으며, 이는 본 명세서에서 CNTO 7364로 칭하였다.

[표 1]

발현 및 정제. CHO-K1SV 세포 (C1013A)는 CNTO 5303을 코딩하는 p3201 플라스미드로 안정하게 트랜스펙션시켜 CNTO 5303-생성 세포주 C1514A를 단리하였다. CNTO 5304, CNTO 7363, 및 CNTO 7364를 코딩하는 상기에 기재된 플라스미드를 이용하여 생쥐 NS0 세포를 안정하게 트랜스펙션시켜 각각 트랜스펙션된 세포주 C1670A, C1528A, 및 C1671A를 단리하였다 (표 1). 모든 4가지 미메티바디^TM 제작물 변이체를 표준 단백질 A 크로마토그래피에 의해 트랜스펙션 세포 상청액으로부터 정제하였다. 단백질 A 및 FcRn 둘 모두는 Fc 도메인의 CH2-CH3 접합부에서 결합하기 때문에, 단백질 A 컬럼을 이용한 성공적인 정제는 새로운 글리코실화 부위가 FcRn에의 결합에 영향을 주지 않을 수도 있음을 시사하였다 (하기 참조).

실시예 2. Fc 글리코실화 변이체의 특성화

일련의 분석적 시험, 생물물리학적 시험, 및 생물활성 시험을 실시예 1의 발현된 제작물에서 실시하였다.

MALDI-TOF-MS 분석을 실시하여 미메티바디^TM 제작물 변이체의 글리칸 구조를 특성화하고, 중쇄의 얼마만큼의 비율이 새로운 부위에서 글리코실화되었는지를 확립하였다.

온전한 미메티바디^TM 제작물의 MALDI-TOF-MS 분석에 의하면 CNTO 5303, CNTO 5304, CNTO 7363, 및 CNTO 7364 샘플이 새로운 부위에서 글리칸에 의해 75 - 95% 점유되었음이 나타났다. 이들 샘플의 글리칸 분석에 의하면, 상기 샘플은 CNTO 530 및 CNTO 736 미메티바디^TM 제작물 글리칸보다 더 불균질하였으며, 이때 359 위치의 글리칸은 2안테나형, 3안테나형 및 4안테나형 구조를 포함하였다. CNTO 5303 and CNTO 7363에 있어서 297 위치의 천연 Fc 글리칸은 각각 CNTO 530 및 CNTO 736에 있어서의 천연 Fc 글리칸과 동일한 구조의 것이었으며, 이때 유일한 관찰된 차이는 원래의 미메티바디^TM 제작물에서의 약간 더 많은 갈락토실화였다 (예를 들어, CNTO 530의 경우 약 50%의 G0 대 CNTO 5303의 경우 약 70%).

크기 및 이동성을 SDS-PAGE로 분석하였다

정제한 CNTO 530, CNTO 5303, 및 CNTO 5304는 비-환원 조건 하에 레인 당 1 ㎍을 1.0 ㎜ 두께의 비스 트리스 4-12% 구배 겔 상에 로딩하고, MOPS SDS 진행 완충액에서 200 V에서 50분 동안 분획물을 진행시킴으로써 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 겔을 쿠마시(coomassie) G250 (심플리블루 세이프 스테인(SimplyBlue Safe Stain), 인비트로겐(Invitrogen))로 염색하고, 생성된 이미지를 알파이미저(AlphaImager) 2200 이미징 시스템 (알파 이노테크(Alpha Innotech))을 이용하여 포착하였다 (도 4).

SDS 겔에서의 관찰된 이동은 예상과 일치하였으며, 즉, 총 4개의 N-글리코실화 부위를 갖는 CNTO 5303은 2개의 N-글리코실화 부위를 갖는 CNTO 5304 및 CNTO 530보다 더 서서히 이동하였으며, 겉보기 분자량은 3-4 kDa만큼 증가하였다. CNTO 5304는 동일한 수의 글리코실화 부위를 가짐에도 불구하고 CNTO 530보다 더 늦게 이동하는 것으로 보였다. 이는 CNTO 530 상에서의 천연 글리코실과 관련하여 더 많은 3안테나형 및 4안테나형 구조뿐만 아니라 더 큰 수준의 갈락토실화 및 시알릴화를 갖는 CNTO 5304 상의 새로운 글리코실화 부위로 인한 것이다. 상기 분자량 개산치는 각각 CNTO 530, CNTO 5303, 및 CNTO 5304의 경우 57.5, 61.5 및 59.5 kDa이다.

FcRn 결합 분석에 의해 평가한 생물활성.

새로운 글리코실화를 어디에 도입하는지를 선택하는 데 있어서의 한 가지 요인은 FcRn 결합 영역을 피하고자 하는 것이기 때문에, CNTO 5303에 의한 FcRn에의 결합을 알파스크린을 이용하여 CNTO 530과 비교하였다. 두 미메티바디^TM 제작물 샘플은 패키지 설명서에 따라 슬라이드-에이-라이저 미니(Slide-A-Lyzer MINI) 투석 유닛 (10K MWCO; 서모 사이언티픽(Thermo Scientific) (피어스(Pierce)))을 이용하여 pH 6.0의 분석 완충액 (0.05M MES, 0.025% BSA, 0.001% 트윈(Tween) 20, pH 6.0) 내로 4℃에서 하룻밤 먼저 투석시켰다. 항체 농도를 OD₂₈₀에 의해 결정하였다. 이어서 하기 성분들을 96웰의 절반 구역의 평평한 바닥의 비결합 백색 폴리스티렌 분석 플레이트에서 동시 인큐베이션하였으며, 이때 실온에서 1시간 동안 혼합하였다: 바이오티닐화 인간 IgG1 mAb (CNTO 6234; 4 ㎍/㎖의 최종 농도), 연속 희석시킨 시험 샘플, 폴리히스티딘-태그된 인간 FcRn (8 ㎍/㎖의 최종 농도), 알파스크린 니켈 킬레이트 수용자 비드 (100 ㎍/㎖의 최종 농도), 및 알파스크린 스트렙타비딘-코팅된 공여자 비드 (1:250의 최종 희석). 모든 재료들을 상기에 설명한 바와 같이 분석 완충액을 이용하여 희석시켰다. 인큐베이션 후, 플레이트를 알파스크린 프로토콜을 이용하여 인비전(EnVision) 기기에서 판독하였다. 결과 (도 5)는 CNTO 5303이 유사한 친화도로 FcRn에 결합했음을 보여주었으며 (CNTO 530보다 단지 2배 더 약한 K_D), 이는 FcRn 결합이 CNTO 5303에서 보존되었음을 나타내는 것이었다.

프로테아제-민감성 평가.

이어서 정제된 미메티바디^TM 분자를 두 인간 프로테아제, 재조합 매트릭스 메탈로프로테이나아제-3(MMP-3) 및 호중구 엘라스타아제(NE)에 대한 그의 상대적인 민감성에 대하여 평가하였다. 하부 경첩부에서 ₂₂₈SCPAP 서열 이후를 절단하는 것으로 여겨지는 MMP-3은 폴리His-태그된 프로-MMP-3으로서의 HEK 세포에서의 일시적 발현, 탈론(Talon) 친화성 컬럼에 의한 정제에 의해 센토코르(Centocor)에서 제조되었으며, 이는 분취량으로 냉동시켰다. 주로 ₂₂₀CDKT 상부 경첩부 서열 이후를 보통 절단하지만 하부 경첩부 내의 이차 부위에서도 절단할 수 있는 인간 NE (하기 참조)를 애틴즈 리서치 앤드 테크놀로지즈(Athens Research and Technologies; 미국 조지아주 애틴즈 소재)로부터 획득하였다.

프로테아제 민감성

MMP-3. 냉동시킨 MMP-3을 해동시키고, 이어서 55℃에서 25분 동안 인큐베이션함으로써 활성화시킨 후 MMP-3 소화를 실시하였다. 2 mM 염화칼슘을 함유하는 pH 7.0의 20 mM 트리스-HCl 완충액 중 활성화 MMP3 (1:50, w/w)을 이용하여 대략 1 ㎎/㎖의 정제된 미메티바디^TM 제작물 샘플을 37℃에서 처리하였다. 분취물 (대략 2 ㎕)을 고정된 시간 간격 (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 hr)으로 꺼내고, 2 ㎕의 매트릭스 용액과 즉시 혼합하였다 (매트릭스 용액은 0.1% 트라이플루오로아세트산을 함유하는 물 중 50% 아세토니트릴 1.0 ㎖ 중에 10 ㎎의 시납산을 용해시킴으로써 제조하였다). 2 ㎕의 이 용액을 MALDI 표적 플레이트 상에 로딩하고, 공기 건조시킨 후 하기에 설명한 질량 분광 분석을 하였다.

호중구 엘라스타아제. 미메티바디^TM 제작물의 N-말단 펩티드 부분은 NE 소화에 대하여 극도로 민감하기 때문에 (이럼으로써 온전한 분자의 정량화가 복잡해지고 경첩부-Fc 내성에의 집중이 간섭됨), 그리고 이차 ne 절단 부위는 하부 경첩 영역 내의 어떤곳에, 특히 비글리코실화된 IgG 내에 존재하는 것으로 관찰되었기 때문에, 먼저 파파인-생성된 Fc 단편을 각각의 미메티바디^TM 제작물 샘플로부터 제조하였다. 대략 1 ㎎/㎖의 농도로 있을 동안 각각의 미메티바디^TM 제작물로부터의 Fc 단편을 37℃에서 pH 7.0의 20 mM 트리스-HCl 완충액 중 NE (1:50, w/w)로 처리하였다. 분취물 (대략 2 ㎕)을 고정된 시간 간격 (0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 hr)으로 꺼내고, 2 ㎕의 매트릭스 용액과 즉시 혼합하였다 (매트릭스 용액은 0.1% 트라이플루오로아세트산을 함유하는 물 중 50% 아세토니트릴 1.0 ㎖ 중에 10 ㎎의 시납산을 용해시킴으로써 제조하였다). 2 ㎕의 이 용액을 MALDI 표적 플레이트 상에 로딩하고, 공기 건조시킨 후 질량 분광 분석을 하였다.

단백질 분해적 소화물 중 IgG 및 IgG 단편을 MALDI-TOF-MS 분석법을 이용하여 분석하였다. MALDI-TOF-MS 분석은 추출을 지연시키면서 선형 또는 리플렉트론(reflectron) 양이온([M + H]⁺) 모드에서 보이저 디이 바이오스펙트로미트리(Voyager DE Biospectrometry) 워크스테이션 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied BioSystems))을 이용하여 수행하였다. 이 기기는 단백질 보정 키트 (시그마(Sigma))를 이용하여 외부적으로 보정하였다. 결과는 Asn359에서의 N-결합 글리코실화의 존재가 하부 경첩 영역에서 이들 기질을 절단하는 두 프로테아제, MMP-3 (도 5a, 5c, 5e) 및 NE (도 5b, 5d, 5f) 둘 모두에 대하여 더욱 큰 내성을 명백하게 부여함을 보여주었다. MMP-3과 함께 8시간 인큐베이션한 후, 원래의 CNTO 530의 20% 미만이 온전하게 남아있으며, 반면 CNTO 5303의 60% 미만이 온전하게 남아있었다. 유사한 결과가 CNTO 7363 및 CNTO 736에서 관찰되었다. NE와 함께 8시간 인큐베이션한 후, CNTO 530 Fc의 10% 미만이 온전하였으며, 반면 CNTO 5303 Fc의 50%가 온전하였고, 유사한 결과가 CNTO 7363 및 CNTO 736 유래의 Fc 단편에서 또한 관찰되었다. 359 위치에서 새로운 글리코실화를 갖지만 297에서 천연 Fc 글리코실화가 결여된 CNTO 5304 및 CNTO 7364 변이체는 MMP-3에 대하여 중간의 민감성을 나타냈지만 (도 5e) NE에 대해서는 두드러진 더욱 큰 민감성을 나타냈다 (도 5f). 어느 정도로 NE 민감성이 천연 Fc 글리코실화의 결여에 의해 직접적으로 영향을 받는지 또는 천연 글리코실화의 부재 하에 상부 Fc 도메인의 생성된 잘못된 폴딩에 의해 간접적으로 영향을 받는지를 여전히 결정해야 한다. MMP-3 및 NE 둘 모두는 미메티바디^TM 제작물 경첩 영역의 근처에서 절단하기 때문에, 당해 절단 부위들로부터 멀리에 도입된 새로운 글리코실화 부위 (도 2 참조)는 단백질 배좌에 대하여 알로스테릭 효과를 명백히 가지며, 이는 몇몇 아미노산 치환에서 관찰된 바와 같다. 그러나, T359N 또는 N361T 치환 그 자체가 그러한 알로스테릭 효과로 이어질 수도 있음이 배제될 수는 없다.

실시예 3. Fc 글리코실화 변이체의 생체 내 거동

이 연구에서, CNTO530의 글리코실화 변이체의 약동학적 특성을 생쥐에서 비교하였다. 찰스 리버스 래보러토리즈 (미국 노스캐롤라이나주 롤리 소재)로부터 8-12주령 (대략 18-22 g)의 건강한 정상 암컷 Balb/c 생쥐를 중량에 의해 랜덤화하고, 플라스틱 필터를 씌운 케이지 내에 군별로 수용하고 (4마리의 생쥐/케이지), 상업적 설치류 음식물 및 산성화된 물을 마음대로 하도록 공급하였다. 생쥐 (시험 용품 당 4마리)는 1 ㎎/㎏의 용량을 성취하기 위하여 0.1 ㎎/㎖로 둘베코 PBS(Dulbecco's PBS) 중에 제형화한 10 ㎖/㎏의 용량의 CNTO 530 또는 CNTO 5303을 복강내 주사하였다.

처음 26일 동안 각각의 CO_2-마취 생쥐로부터의 연속 후안와 채혈에 의해 2, 7, 16, 26, 및 35일에 혈액 샘플을 수집하였다. 말단 혈액 샘플을 CO_2-마취 생쥐로부터 심장 천자를 통하여 35일에 수집하였다. 시간 코스 분석을 각각의 개별 동물에서 실시할 수 있도록 모든 샘플을 그가 유래된 동물에 대하여 표시하였다.

모든 혈액 샘플을 30분 이상, 그러나 1시간 이하 동안 실온에서 정치시키고, 3500 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 혈청을 분리하였다. 혈청 샘플을 연구 마지막까지 -20℃에서 보관하였으며, 이 시점에서 모든 샘플을 함께 분석하였다.

모든 생쥐 유래의 혈청 샘플은 다클론 염소 항-인간 IgG Fc 단편으로 96웰 EIA 플레이트를 코팅하고, 다양한 농도의 혈청 샘플을 인큐베이션하고, 결합 인간 IgG를 HRP-콘쥬게이션된 다클론 염소 항-인간 IgG로 검출하고, 이어서 적절한 컬러 기질을 첨가하는 것을 수반하는 표준 ELISA에 의해 인간 Fc에 대하여 분석하였다. 정량화 목적을 위하여 표준 곡선을 확립하기 위하여 정상 혈청 내로 스파이크한 시험 용품의 적정된 양을 이용하였다.

각각의 혈청 샘플에 대하여 결정한 인간 Fc의 농도를 2일에서의 혈청중 수준에 대하여 정규화하고, 그래프로 나타냈다. 그 결과는 CNTO 5303 글리코실화 변이체의 약동학적 프로파일이 CNTO 530의 것과 본질적으로 구별불가능함을 나타냈으며, 이는 신규한 글리칸이 건강한 정상 생쥐에 있어서 반감기에 대하여 해로운 영향을 주지 않았음을 나타낸다 (도 7).

SEQUENCE LISTING <110> CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC. <120> ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS <130> CEN5274PCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2010-10-25 <150> 61/255986 <151> 2009-10-29 <160> 2 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Mutagen <222> (3) <223> Wherein Xaa at position (3) can be Serine or Proline <220> <221> Mutagen <222> (9) <223> Wherein Xaa at position (9) can be Phenylalanine or Leucine <220> <221> Mutagen <222> (10) <223> Wherein Xaa at position (10) can be Phenylalanine or Leucine <220> <221> Mutagen <222> (74) <223> Wherein Xaa at position (74) can be Threonie or Asparagine <220> <221> Mutagen <222> (134) <223> Wherein Xaa at position (134) can be Threonine or Asparagine <220> <221> Mutagen <222> (136) <223> Wherein Xaa at position (136) can be Threonine or Asparagine and when Xaa at position (134) is Threonine then Xaa at position (136) is Asparagine <220> <221> Mutagen <222> (157) <223> Wherein Xaa at position (157) can be Threonine or Asparagine <220> <221> Mutagen <222> (159) <223> Wherein Xaa at position (159) can be Threonine or Asparagine and when Xaa at position (134) is Asparagine then Xaa at position (136) is Threonone <220> <221> Mutagen <222> (194) <223> Wherein Xaa at position (194) can be Threonine or Asparagine <220> <221> Mutagen <222> (196) <223> Wherein Xaa at position (196) can be Threonine or Asparagine and when Xaa at position (134) is Asparagine then Xaa at position (196) is Threonine. <400> 1 Cys Pro Xaa Cys Pro Ala Pro Glu Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Xaa Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Gln Glu Glu Met Xaa Lys Xaa Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Xaa Ser Xaa Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Xaa Gly Xaa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 2 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Mutagen <221> (9)|(10) <223> Wherein Xaa at positions (9) and (10) may be Alanine or Leucine <220> <221> Mutagen <221> (74) <223> Wherein Xaa at positions (74)may be Threonine or Asparagine <220> <221> Mutagen <222> (134) <223> Wherein Xaa at position (134) can be Threonine or Asparagine <220> <221> Mutagen <222> (136) <223> Wherein Xaa at position (136) can be Threonine or Asparagine and when Xaa at position (134) is Asparagine then Xaa at position (136) is Threonine <220> <221> Mutagen <222> (194) <223> Wherein Xaa at position (194) can be Glutamine or Asparagine <220> <221> Mutagen <222> (196) <223> Wherein Xaa at position (196) can be Asparagine or Threonine <400> 2 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Xaa Xaa Gly Gly Pro Ser Val Phe 1 5 10 15 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 35 40 45 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Xaa Tyr Arg Val Val Ser Val 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 85 90 95 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 Ser Arg Asp Glu Leu Xaa Lys Xaa Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 145 150 155 160 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 165 170 175 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 180 185 190 Gln Xaa Gly Xaa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 195 200 205 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

Claims

CH3 도메인 내 루프(loop) 구조의 말단에 N-글리코실화 부위를 갖는 변형된 항체 Fc 도메인 아미노산 서열을 포함하는 Fc-함유 분자로서, Fc 도메인이 EU 넘버링(numbering)을 기준으로 Fc 도메인의 잔기 359에서 N-글리코실화 부위를 나타내며, 상응하는 비변형된 항체 Fc 도메인 아미노산 서열을 갖는 Fc-함유 분자와 비교하여 프로테아제에 대한 내성이 증가된 Fc-함유 분자.
제1항에 있어서, Fc 도메인이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 분자 중 어느 하나로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제1항에 있어서, Fc-함유 분자가 항체 또는 Fc 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제1항에 있어서, 프로테아제가 펩신, 플라스민, 트립신, 키모트립신, 매트릭스 메탈로프로테이나아제(matrix metalloproteinase; MMP), 세린 엔도펩티다아제 및 시스테인 프로테아제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제4항에 있어서, 프로테아제가 젤라티나아제 A(MMP2), 젤라티나아제 B(MMP-9), 매트릭스 메탈로프로테이나아제-7(MMP-7), 스트로멜라이신(MMP-3) 및 대식세포 엘라스타아제(MMP-12)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 매트릭스 메탈로프로테이나아제인 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제1항에 있어서, Fc 도메인이 EU 넘버링을 기준으로 Fc 도메인의 잔기 382 및 419 중 적어도 하나에서 추가의 N-글리코실화 부위를 나타내는 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제6항에 있어서, Fc 도메인이 EU 넘버링을 기준으로 Fc 도메인의 잔기 359, 382 및 419에서 N-글리코실화 부위를 나타내는 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제6항에 있어서, Fc 도메인이 EU 넘버링을 기준으로 Fc 도메인의 잔기 359, 382 및 419에서 N-글리코실화 부위를 나타내고, Fc 도메인의 잔기 297의 N-글리코실화 부위는 제거된 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제8항에 있어서,
잔기 299가 Thr에서 Asn으로 변경되고,
잔기 359가 Thr에서 Asn으로 변경되고,
잔기 361이 Asn에서 Thr으로 변경되고,
잔기 419가 Thr에서 Asn으로 변경되고,
잔기 421이 Asn에서 Thr으로 변경된 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제6항에 있어서, Fc 도메인의 잔기 359, 361, 419 및 421이 야생형으로부터 변경된 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
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제10항에 있어서, 잔기 359가 Thr에서 Asn으로 변경되고, 잔기 361이 Asn에서 Thr으로 변경되고, 잔기 419가 Thr에서 Asn으로 변경되고, 잔기 421이 Asn에서 Thr으로 변경된 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제1항에 있어서, EU 넘버링을 기준으로 힌지(hinge) 영역 내의 잔기 228, 234 및 235 중 적어도 하나가 변형된 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제1항에 있어서, EU 넘버링을 기준으로 Fc 도메인의 잔기 359, 382 및 419에서 N-글리코실화 부위를 가지고, Fc 도메인의 잔기 297의 N-글리코실화 부위는 제거된 항체 Fc 도메인을 포함하고, Fc 도메인의 잔기 299, 359, 361, 419 및 421이 야생형으로부터 변경된 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제15항에 있어서, EU 넘버링을 기준으로 힌지 영역 내의 잔기 228, 234 및 235 중 적어도 하나가 변형된 것을 특징으로 하는 Fc-함유 분자.
제1항 내지 제10항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 Fc-함유 분자를 포함하는, 암 또는 증식성 질환; 염증성 또는 류마티스성 질환; 자가면역 장애; 신경 장애; 섬유증; 심혈관 질환; 피부 및 감염성 질환; 및 화상 또는 상해에서 생기는 병태로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 프로테아제의 상승된 수준의 존재와 관련된 질환 치료용 약제학적 조성물.
EU 넘버링을 기준으로 359, 382 및 419 위치 중 적어도 하나에서 Fc-함유 단백질에 N-글리코실화 부위를 부가하되, 반드시 359 위치에는 N-글리코실화 부위를 부가하는 단계를 포함하는, 프로테아제에 의한 절단에 대한 Fc-함유 단백질의 내성을 증가시키는 방법.
제18항에 있어서, EU 넘버링을 기준으로 359, 382 및 419 위치에서 Fc-함유 단백질에 N-글리코실화 부위를 부가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, EU 넘버링을 기준으로 297 위치에서 N-글리코실화 부위를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, EU 넘버링을 기준으로 힌지 영역 내의 잔기 228, 234 및 235 중 적어도 하나를 야생형으로부터 변경시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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