ES2835869T3 - Anticuerpos anti-PD-L1 - Google Patents

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ES2835869T3 ES16735235T ES16735235T ES2835869T3 ES 2835869 T3 ES2835869 T3 ES 2835869T3 ES 16735235 T ES16735235 T ES 16735235T ES 16735235 T ES16735235 T ES 16735235T ES 2835869 T3 ES2835869 T3 ES 2835869T3
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Hsueh Ling Janice Oh
Siok Ping Yeo
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Abstract

Un anticuerpo, o un fragmento de union a antigeno, que es capaz de unirse a PD-L1, que tiene: al menos una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, y al menos una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 8 o 35.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-PD-LI
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen al ligando 1 de muerte programada (PD-L1).
Antecedentes de la invención
El agotamiento de las células T es un estado de disfunción de las células T que se produce durante muchas infecciones crónicas y cánceres. Se define por una función efectora deficiente de las células T, expresión sostenida de receptores inhibidores y un estado transcripcional distinto del de las células T efectoras o de memoria funcionales. El agotamiento impide un control óptimo de las infecciones y los tumores. (E John Wherry, Nature Immunology 12, 492-499 (2011)).
El agotamiento de las células T se caracteriza por la pérdida gradual y progresiva de las funciones de las células T. El agotamiento está bien definido durante la infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica crónica y comúnmente se desarrolla en condiciones de persistencia de antígenos, que tienen lugar después de muchas infecciones crónicas entre las que se incluyen la infección por el virus de la hepatitis B, por el virus de la hepatitis C y por el virus de la inmunodeficiencia humana, así como durante la metástasis tumoral. El agotamiento no es un escenario de discapacitación uniforme, ya que puede manifestarse una gradación de defectos fenotípicos y funcionales, y estas células son distintas de las células T prototípicas efectoras, de memoria y también anérgicas. Aparecen células T agotadas la mayoría de las veces durante infecciones crónicas de alto grado, y los niveles y la duración de la estimulación antigénica son determinantes críticos del proceso. (Yi et al., Immunology, abril de 2010; 129(4):474-481).
Las células T CD8+ específicas de tumores humanas circulantes pueden ser citotóxicas y producir citocinas in vivo, lo que indica que las células T CD8+ humanas específicas de tumores y propias pueden alcanzar la competencia funcional después de una inmunoterapia potente tal como la vacunación con péptidos, adyuvante incompleto de Freund (IFA) y CpG o después de una transferencia adoptiva. A diferencia de lo que ocurre en la sangre periférica, las células T que se infiltran en los sitios tumorales a menudo son funcionalmente deficientes, con una producción de citocinas anormalmente baja y regulación positiva de los receptores inhibidores PD-1, CTLA-4 y TIM-3. La deficiencia funcional es reversible, ya que las células T aisladas de tejido de melanoma pueden restaurar la producción de IFN-y después de un cultivo in vitro a corto plazo. Sin embargo, queda por determinar si en este deterioro funcional están implicadas otras vías moleculares, que posiblemente se asemejan al agotamiento o anergia de las células T definidos en modelos animales. (Baitsch et al., J Clin Invest. 2011; 121(6):2350-2360).
La proteína de muerte celular programada 1 (PD-1), también denominada CD279, es una proteína de membrana de tipo I codificada en humanos por el gen PDCD1. Tiene dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. PD-L1, también denominado CD274 o homólogo 1 de B7 (B7-H1) es una proteína transmembrana de tipo I de 40 kDa codificada en humanos por el gen CD274.
PD-1 se expresa en la superficie de células T activadas y PD-L1 se expresa en la superficie de células presentadoras de antígeno (APC), tales como células dendríticas y macrófagos. PD-L1 también se sobreexpresa en varios tumores, entre los que se incluyen tumores de mama, pulmón, vejiga, cabeza y cuello y otros cánceres. Cuando PD-L1 o PD-L2 se unen a PD-1, se transmite una señal inhibidora al interior de la célula T, que reduce la producción de citocinas y suprime la proliferación de células T.
La vía de PD-1 es un mediador inmunoinhibidor clave del agotamiento de las células T. La proteína PD-1 actúa limitando la actividad de células T ya activadas en la periferia durante la respuesta inflamatoria a la infección para limitar la autoinmunidad. El bloqueo de esta vía puede conducir a la activación, expansión y aumento de las funciones efectoras de las células T. Por lo tanto, PD-1 regula negativamente las respuestas de las células T. PD-1 se ha identificado como un marcador de células T agotadas en estados patológicos crónicos, y se ha demostrado que el bloqueo de las interacciones PD-1:PD-L1 restaura parcialmente la función de las células T. (Sakuishi et al., JEM Vol.
207, 27 de septiembre de 2010, pp 2187-2194). En el documento WO 2006/133396 se desvelan métodos y composiciones para el tratamiento de infecciones persistentes y cáncer mediante la inhibición de la vía de PD-1. Se describen anticuerpos monoclonales humanos contra PD-L1 en los documentos WO 2007/005874, US2011/209230, US2013/0309250, US 8.217.149 y WO 2014/055897.
Sumario de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones.
La presente divulgación se refiere a anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, que se unen a PD-L1. También se desvelan polipéptidos de cadena pesada y ligera. Los anticuerpos, fragmentos y polipéptidos de unión a antígeno se pueden proporcionar en forma aislada y/o purificada y se pueden formular en composiciones adecuadas para su uso en investigación, terapia y diagnóstico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el polipéptido pueden ser eficaces para restaurar la función de las células T en las células T, por ejemplo, células T CD8+, que presentan agotamiento de células T o anergia de células T.
En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo puede comprender las secuencias de aminoácidos i) a iii), o las secuencias de aminoácidos iv) a vi) o, preferentemente, las secuencias de aminoácidos i) a vi):
i) LC-CDR1: una de SGRSSNIASHDVF (SEQ ID NO: 9), GGDNIGRKSVH (SEQ ID NO: 12), SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO: 15) o TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 18);
ii) LC-CDR2: una de ETNKRPW (SEQ ID NO: 10), DDGDRPS (SEQ ID NO: 13), DNNERLS (SEQ ID NO: 16) o GNSNRPS (SEQ ID NO: 19);
iii) LC-CDR3: una de GAWDSGLTGML (SEQ ID NO: 11), QAWDSTVV (SEQ ID NO: 14), GTWDSSLSVVV (SEQ ID NO: 17) o QSYDSSLSGSYVV (SEQ ID NO: 20);
iv) HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21);
v) HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22);
vi) HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (SEQ ID NO: 26);
o una variante de las mismas en la que uno o dos o tres aminoácidos en una o más de las secuencias (i) a (vi) se han reemplazado por otro aminoácido, donde Xi = ausente (es decir, sin aminoácido) o G, X2 = G o S, X3 = G o Y, X4 = S, G o H, X5 = Y o G, Xs = G, N o Y, X7 = L o Y, X3 = Y o G, X9 = I o Y.
En algunas realizaciones, HC-CDR3 es una de GGSYGSLYAFDI (SEQ ID NO: 23), GGYGGNSLYAFDI (SEQ ID NO: 24) o SGHGYSYGAFDY (SEQ ID NO: 25).
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, puede comprender al menos una región variable de cadena ligera que incorpora las siguientes CDR:
LC-CDR1: SGRSSNIASHDVF (SEQ ID NO: 9)
LC-CDR2: ETNKRPW (SEQ ID NO: 10)
LC-CDR3: GAWDSGLTGML (SEQ ID NO: 11)
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, puede comprender al menos una región variable de cadena ligera que incorpora las siguientes CDR:
LC-CDR1: GGDNIGRKSVH (SEQ ID NO: 12)
LC-CDR2: DDGDRPS (SEQ ID NO: 13)
LC-CDR3: QAWDSTVV (SEQ ID NO: 14)
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, puede comprender al menos una región variable de cadena ligera que incorpora las siguientes CDR:
LC-CDR1: SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO: 15)
LC-CDR2: DNNERLS (SEQ ID NO: 16)
LC-CDR3: GTWDSSLSVVV (SEQ ID NO: 17)
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, puede comprender al menos una región variable de cadena ligera que incorpora las siguientes CDR:
LC-CDR1: TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 18)
LC-CDR2: GNSNRPS (SEQ ID NO: 19)
LC-CDR3: QSYDSSLSGSYVV (SEQ ID NO: 20)
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, puede comprender al menos una región variable de cadena pesada que incorpora las siguientes CDR:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (SEQ ID NO: 26)
donde Xi = ausente o G, X2 = G o S, X3 = G o Y, X4 = S, G o H, X5 = Y o G, Xs = G, N o Y, X7 = L o Y, X8 = Y o G, X9 = I o Y.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, puede comprender al menos una región variable de cadena pesada que incorpora las siguientes CDR:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: GGSYGSLYAFDI (SEQ ID NO: 23)
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, puede comprender al menos una región variable de cadena pesada que incorpora las siguientes CDR:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: GGYGGNSLYAFDI (SEQ ID NO: 24)
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, puede comprender al menos una región variable de cadena pesada que incorpora las siguientes CDR:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: SGHGYSYGAFDY (SEQ ID NO: 25)
El anticuerpo puede comprender al menos una región variable de cadena ligera que incorpora las CDR mostradas en la Figura 1 o 3. El anticuerpo puede comprender al menos una región variable de cadena pesada que incorpora las CDR mostradas en la Figura 2 o 3.
El anticuerpo puede comprender al menos una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 1, 9, 10, 11; o 2, 12, 13, 14; o 3, 15, 16, 17; o 4, 18, 19, 20, o una de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, más preferentemente uno de al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO 1, 9, 10, 11; o 2, 12, 13, 14; o 3, 15, 16, 17; o 4, 18, 19, 20, o con la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la cadena Vl que se muestra en la Figura 1.
El anticuerpo puede comprender al menos una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 5, 21,22, 23; o 6, 21,22, 23; o 7, 21,22, 24; o 8, 21,22, 25; o 35, 21,22, 25, o una de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, más preferentemente uno de al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO 5, 21,22, 23; o 6, 21,22, 23; o 7, 21,22, 24; o 8, 21,22, 25; o 35, 21,22, 25, o con la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la cadena Vh que se muestra en la Figura 2.
El anticuerpo puede comprender al menos una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO 1, 9, 10, 11; o 2, 12, 13, 14; o 3, 15, 16, 17; o 4, 18, 19, 20, o una de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 1 (o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, más preferentemente uno de al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO 1, 9, 10, 11; o 2, 12, 13, 14; o 3, 15, 16, 17; o 4, 18, 19, 20, o con una de las secuencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de cadena Vl mostrada en la Figura 1) y al menos una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO 5, 21, 22, 23; o 6 , 21,22, 23; o 7, 21,22, 24; o 8, 21,22, 25; o 35, 21, 22, 25, o una de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 2 (o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, más preferentemente uno de al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, de identidad de secuencia con una de las SEQ ID NO 5, 21,22, 23; o 6, 21,22, 23; o 7, 21,22, 24; o 8, 21,22, 25; o 35, 21,22, 25, o con una de las secuencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de cadena Vh mostrada en la Figura 2).
El anticuerpo puede unirse opcionalmente a PD-L1, opcionalmente a PD-L1 humana o murina. El anticuerpo puede tener opcionalmente componentes de secuencia de aminoácidos como se han descrito anteriormente. El anticuerpo puede ser una IgG. En una realización se proporciona un complejo in vitro, opcionalmente aislado, que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, como se describe en el presente documento, unido a PD-L1.
El anticuerpo puede inhibir o prevenir opcionalmente la interacción o asociación funcional entre la PD-1 humana y el PD-L1 humano, o entre la PD-1 murina y el PD-L1 murino. Tal inhibición o prevención de la interacción o asociación funcional entre PD-1 y PD-L1 puede inhibir o prevenir la activación mediada por PD-L1 de la señalización de PD-1 o PD-L1/PD-1.
En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un polipéptido de región variable de cadena pesada aislado, comprendiendo el polipéptido de región variable de cadena pesada las siguientes CDR:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (SEQ ID NO: 26)
donde Xi = ausente o G, X2 = G o S, X3 = G o Y, X4 = S, G o H, X5 = Y o G, Xs = G, N o Y, X7 = L o Y, X8 = Y o G, X9
= I o Y.
En algunas realizaciones, HC-CDR3 es una de GGSYGSLYAFDI (SEQ ID NO: 23), GGYGGNSLYAFDI (SEQ ID NO:
24) o SGHGYSYGAFDY (SEQ ID NO: 25).
En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, comprendiendo el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, una secuencia de región variable de cadena pesada y cadena ligera, en donde:
la cadena pesada comprende una HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3, que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia total con HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21), HC-CDR2 RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22), HC-CDR3: una de X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (SEQ ID NO: 26) o GGSYGSLYAFDI (SEQ ID NO: 23) o GGYGGNSLYAFDI (SEQ ID NO: 24) o SGHGYSYGAFDY (SEQ ID NO: 25), respectivamente, donde Xi = ausente o G, X2 = G o S, X3 = G o Y, X4 = S, G o H, X5 = Y o G, Xs = G, N o Y, X7 = L o Y, X8 = Y o G, X9 = I o Y, y
la cadena ligera comprende una LC-CDR1, LC-CDR2, LC-CDR3, que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia total con LC-CDR1: una de SGRSSNIASHDVF (SEQ ID NO: 9), GGDNIGRKSVH (SEQ ID NO: 12), SGSSSNIGNNYVS (SEC ID NO: 15) o TGSSSNIGAGYDVH (SEC ID NO: 18), LC-CDR2: una de ETNKRPW (SEQ
ID NO: 10), DDGDRPS (SEQ ID NO: 13), DNNERLS (SEQ ID NO: 16) o GNSNRPS (SEQ ID NO: 19), LC-CDR3:
una de GAWDSGLTGML (SEQ ID NO: 11), QAWDSTVV (SEQ ID NO: 14), GTWDSSLSVVV (SEQ ID NO: 17) o QSYDSSLSGSYVV (SEQ ID NO: 20).
En algunas realizaciones, el grado de identidad de secuencia puede ser uno del 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %,
92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, opcionalmente aislado, que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y de cadena ligera, en donde:
la secuencia de cadena pesada tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8 o 35 (Figura 2), y
la secuencia de cadena ligera tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera: SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4 (Figura 1). En algunas realizaciones, el grado de identidad de secuencia puede ser uno del 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el polipéptido comprende además secuencias marco de cadena pesada de región variable entre las CDR de acuerdo con la disposición HCFR1:HC-CDR1:HCFR2:HC-CDR2:HCf R3:HC-CDR3:HCFR4. Las secuencias marco pueden derivar de secuencias marco consenso humanas.
En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un polipéptido de región variable de cadena pesada aislado, opcionalmente en combinación con un polipéptido de región variable de cadena ligera como se describe en el presente documento, comprendiendo el polipéptido de región variable de cadena pesada las siguientes CDR:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: X1X2X3X4X5X6SX7X8AFDX9 (SEQ ID NO: 26)
donde Xi = ausente
Figure imgf000005_0001
= G, N o Y, X = I o Y.
En algunas realizaciones, HC-CDR3 es GGSYGSLYAFDI (SEQ ID NO: 23) o GGYGGNSLYAFDI (SEQ ID NO: 24) o SGHGYSYGAFDY (SEQ ID NO: 25).
En algunas realizaciones, el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno o el polipéptido comprende además secuencias marco de cadena ligera de región variable entre las CDR de acuerdo con la disposición LCFR1:LC-CDR1:LCFR2:LC-CDR2:LCFR3:LC-CDR3:LCFR4. Las secuencias marco pueden derivar de secuencias marco consenso humanas.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión del anticuerpo, puede comprender además una región constante humana. Por ejemplo, seleccionada de una de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión del anticuerpo, puede comprender además una región constante murina. Por ejemplo, seleccionada de una de IgG1, IgG2A, IgG2B e IgG3.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, opcionalmente aislado, que es capaz de unirse a PD-L1, que es un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno biespecífico. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno biespecífico comprende (i) un fragmento o polipéptido de unión a antígeno capaz de unirse a PD-L1 como se describe en el presente documento, y (ii) un fragmento de unión a antígeno que es capaz de unirse a una proteína diana distinta de PD-L1.
En algunas realizaciones, la proteína diana distinta de PD-L1 puede ser un receptor de la superficie celular, por ejemplo, un receptor expresado en la superficie celular de las células T. En algunas realizaciones, el receptor de la superficie celular puede ser un receptor de punto de control inmunitario, por ejemplo, un receptor coestimulador o un receptor inhibidor. En algunas realizaciones, el receptor coestimulador puede seleccionarse de CD27, CD28, ICOS, CD40, CD122, OX40, 4-1BB y GITR. En algunas realizaciones, el receptor inhibidor puede seleccionarse de LAG-3, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, A2AR, VISTA, TIM-3, PD-1 y KIR.
En algunas realizaciones, la proteína diana distinta de PD-L1 puede ser un marcador de cáncer cuya expresión está asociada a un cáncer. En algunas realizaciones, el marcador de cáncer puede expresarse en la superficie celular. En algunas realizaciones, el marcador de cáncer puede seleccionarse de HER-2, h ER-3, EGFR, EpCAM, CD30, CD33, CD38, CD20, CD24, CD90, CD15, CD52, CA-125, CD34, CA-15-3, CA-19-9, CEA, CD99, CD117, CD31, CD44, CD123, CD133, ABCB5 e CD45.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica o un medicamento. La composición puede comprender un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o polipéptido como se describe en el presente documento y al menos un vehículo, excipiente, adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o polipéptido como se describe en el presente documento. El ácido nucleico puede tener una secuencia de una de las SEQ ID NO 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34 o 36 (Figura 4), o una secuencia codificante que está degenerada como resultado del código genético, o puede tener una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 70 % de identidad con la misma, opcionalmente uno del 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %.
En un aspecto de la presente divulgación se proporciona un vector que comprende un ácido nucleico descrito en el presente documento. En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona una célula hospedadora que comprende el vector. Por ejemplo, la célula hospedadora puede ser eucariota o de mamífero, por ejemplo, de ovario de hámster chino (CHO) o de humano, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, E. coli. En un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para preparar un anticuerpo, o fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento, comprendiendo el método cultivar una célula hospedadora como se describe en el presente documento en condiciones adecuadas para la expresión de un vector que codifica el anticuerpo, o fragmento o polipéptido de unión a antígeno, y recuperar el anticuerpo, o fragmento o polipéptido de unión a antígeno.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno para su uso en terapia o en un método de tratamiento médico. En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de un trastorno disfuncional de células T. En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona el uso de un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un trastorno disfuncional de células T.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para mejorar la función de las células T que comprende administrar un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento a una célula T disfuncional. El método puede realizarse in vitro o in vivo.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para tratar un trastorno disfuncional de células T, comprendiendo el método administrar un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento a un paciente que padece un trastorno disfuncional de células T.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno para su uso en el tratamiento de un cáncer. En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona el uso de un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un cáncer.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para matar a una célula tumoral, comprendiendo el método administrar un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento a una célula tumoral. El método puede realizarse in vitro o in vivo. La muerte de una célula tumoral puede, por ejemplo, ser el resultado de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), o mediante la acción de un fármaco conjugado con el anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para tratar un cáncer, comprendiendo el método administrar un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento a un paciente que padece un cáncer.
El cáncer puede ser un cáncer que sobreexpresa PD-L1, o puede comprender células que sobreexpresan PD-L1. El cáncer puede ser un carcinoma colorrectal o un melanoma.
En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento, de manera que se modula la respuesta inmunitaria en el sujeto.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para inhibir el crecimiento de células tumorales, que comprende administrar un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento. El método puede ser in vitro o in vivo. En algunas realizaciones se proporciona un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método, comprendiendo el método poner en contacto una muestra que contiene, o que se sospecha que contiene, PD-L1 con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, como se describe en el presente documento, y detectar la formación de un complejo de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, y PD-L1.
En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona un método para diagnosticar una enfermedad o afección en un sujeto, comprendiendo el método poner en contacto, in vitro, una muestra del sujeto con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, como se describe en el presente documento, y detectar la formación de un complejo de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, y PD-L1.
En un aspecto adicional de la presente divulgación se proporciona el uso de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, como se describe en el presente documento, para la detección de PD-L1 in vitro. En otro aspecto de la presente divulgación se proporciona el uso de un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, como se describe en el presente documento, como un agente de diagnóstico in vitro.
En los métodos de la presente divulgación, el anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno se puede proporcionar como una composición como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser el clon A1, C2, C4, H12 o H12_GL como se describe en el presente documento.
Descripción
Anticuerpos
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación se unen preferentemente a PD-L1 (el antígeno), preferentemente a PD-L1 humana o murina, opcionalmente con una Kd en el intervalo de 0,1 a 4 nM.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden proporcionarse en forma aislada.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden presentar al menos una de las siguientes propiedades:
a) se une al PD-L1 de humano, ratón o macaco cynomolgus con una Kd de 1 |jM o menor, preferentemente una de <10 nM, <1 nM <500 j M, <400 j M o <300 j M;
(b) no se une sustancialmente a la PD-1 humana, PD-L2, TIM-3, LAG3, ICOS, CTLA-4, BTLA o CD28 c) inhibe o previene la interacción entre la PD-1 humana y el PD-L1 humano o inhibe o previene la interacción entre la PD-1 murina y el PD-L1 murino;
d) aumenta la proliferación de células T en un ensayo de reacción mixta de linfocitos (MLR) (por ejemplo, véase Bromelow et al J. Immunol Methods, 1 de enero de 2001; 247 (1-2): 1-8);
e) aumenta la producción de interferón-gamma en un ensayo MLR;
f) aumenta la producción de interferón-gamma por los linfocitos que se infiltran en tumores ex vivo;
g) aumenta la producción de interferón-gamma por los linfocitos en respuesta a una infección
h) inhibe el crecimiento tumoral, opcionalmente in vivo;
i) se une al PD-L1 (opcionalmente PD-L1 humano) con mayor afinidad que, o con afinidad similar a, la afinidad de unión por atezolizumab (MPDL3280A; RG7446);
j) se une a PD-L1 (opcionalmente PD-L1 humano) con mayor avidez que, o con una avidez similar a, la avidez de unión por atezolizumab;
k) inhibe o previene la interacción entre PD-L1 y PD-1 (opcionalmente PD-L1 humano y PD-1 humana) en mayor medida que, o en una medida similar, a la inhibición/prevención de la interacción por atezolizumab.
En el término "anticuerpo" se incluye un fragmento o derivado del mismo, o un anticuerpo sintético o fragmento de anticuerpo sintético.
En vista de las técnicas actuales en relación con la tecnología de anticuerpos monoclonales, se pueden preparar anticuerpos para la mayoría de los antígenos. La porción de unión al antígeno puede ser parte de un anticuerpo (por ejemplo, un fragmento Fab) o un fragmento de anticuerpo sintético (por ejemplo, un fragmento Fv monocatenario [ScFv]). Pueden prepararse anticuerpos monoclonales adecuados para antígenos seleccionados mediante técnicas conocidas, por ejemplo, las divulgadas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", JGR Hurrell (CRC Press, 1982). Los anticuerpos quiméricos se analizan por Neuberger et al (1988, 8° Simposio Internacional de Biotecnología, Parte 2, 792-799).
Los anticuerpos monoclonales (mAb) son útiles en los métodos de la presente divulgación y son una población homogénea de anticuerpos que se dirigen específicamente a un solo epítopo en un antígeno.
Los anticuerpos policlonales son útiles en los métodos de la presente divulgación. Se prefieren los anticuerpos policlonales monoespecíficos. Pueden prepararse anticuerpos policlonales adecuados utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
También pueden usar/proporcionar fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, tales como Fab y Fab2, así como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos modificados genéticamente. Los dominios pesado variable (Vh) y ligero variable (Vl) del anticuerpo están implicados en el reconocimiento de antígenos, un hecho reconocido por primera vez por los primeros experimentos de digestión con proteasas. Se encontró una confirmación adicional mediante la "humanización" de anticuerpos de roedores. Pueden fusionarse dominios variables de origen de roedor con dominios constantes de origen humano de manera que el anticuerpo resultante retenga la especificidad antigénica del anticuerpo parental de roedor (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851-6855).
El hecho de que la especificidad antigénica se confiere por dominios variables y es independiente de los dominios constantes se sabe por experimentos en los que está implicada la expresión bacteriana de fragmentos de anticuerpos, que contienen todos ellos uno o más dominios variables. Estas moléculas incluyen moléculas de tipo Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv monocatenarias (ScFv) donde los dominios asociados Vh y Vl se unen a través de un oligopéptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85, 5879) y anticuerpos de dominio único (dAb) que comprenden dominios V aislados (Ward et al (1989) Nature 341,544). En Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299 se encuentra una revisión general de las técnicas implicadas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que retienen sus sitios de unión específicos.
Por "moléculas ScFv" se entienden moléculas en las que los dominios asociados Vh y Vl se unen de forma covalente, por ejemplo, mediante un oligopéptido flexible.
Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse todos ellos y secretarse a partir de E. coli, permitiendo de esta manera la producción fácil de grandes cantidades de dichos fragmentos.
Los anticuerpos completos y los fragmentos F(ab')2 son "bivalentes". Por "bivalente" se entiende que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab')2 tienen dos sitios de combinación de antígenos. Por el contrario, los fragmentos Fab, Fv, ScFv y dAb son monovalentes, teniendo solo un sitio de combinación de antígenos. También pueden prepararse anticuerpos sintéticos que se unen a PD-L1 usando tecnología de presentación en fagos como es bien conocido en la técnica.
La presente solicitud también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es capaz de unirse a PD-L1, y que es un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno biespecífico. En algunas realizaciones, se puede aislar el anticuerpo biespecífico o el fragmento de unión a antígeno biespecífico.
En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos y los fragmentos de unión a antígeno biespecíficos comprenden un fragmento de unión a antígeno o un polipéptido de acuerdo con la presente divulgación.
En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos y los fragmentos de unión a antígeno biespecíficos comprenden un fragmento de unión a antígeno capaz de unirse a PD-L1, en donde el fragmento de unión a antígeno que es capaz de unirse a PD-L1 comprende o consiste en un fragmento de unión a antígeno o un polipéptido de acuerdo con la presente divulgación.
En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos y los fragmentos de unión a antígeno biespecíficos comprenden un fragmento de unión a antígeno capaz de unirse a PD-L1, y un fragmento de unión a antígeno capaz de unirse a otra proteína diana.
El fragmento de unión a antígeno capaz de unirse a otra proteína diana puede ser capaz de unirse a otra proteína distinta de PD-L1.
En algunas realizaciones, la proteína diana puede ser un receptor de la superficie celular. En algunas realizaciones, la proteína diana puede ser un receptor de superficie celular expresado en la superficie celular de una célula inmunitaria, por ejemplo, una célula T. En algunas realizaciones, el receptor de la superficie celular puede ser un receptor de punto de control inmunitario. En algunas realizaciones, el receptor del punto de control inmunitario puede ser un receptor coestimulador. En algunas realizaciones, el receptor coestimulador puede seleccionarse de CD27, CD28, ICOS, CD40, CD122, OX40, 4-1BB y GITR. En algunas realizaciones, el receptor del punto de control inmunitario puede ser un receptor inhibidor. En algunas realizaciones, el receptor inhibidor puede seleccionarse de LAG-3, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, A2AR, VISTA, TIM-3, PD-1 y KIR.
En algunas realizaciones, la proteína diana puede ser un marcador de cáncer. Es decir, la proteína diana puede ser una proteína cuya expresión (por ejemplo, expresión regulada positivamente) está asociada a un cáncer. En algunas realizaciones, el marcador de cáncer puede expresarse en la superficie celular. En algunas realizaciones, el marcador de cáncer puede ser un receptor. En algunas realizaciones, el marcador de cáncer puede seleccionarse de HER-2, HER-3, EGFR, EpCAM, CD30, CD33, CD38, CD20, CD24, CD90, CD15, CD52, CA-125, CD34, CA-15-3, CA-19-9, CEA, CD99, CD117, CD31, CD44, CD123, CD133, ABCB5 e CD45.
En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD27 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD27 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD27 clon 0323 (Millipore) o varlilumab (Celldex Therapeutics). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD28 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD28 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD28 clon CD28.6 (eBioscience), clon CD28.2, clon JJ319 (Novus Biologicals), clon 204.12, clon B-23, clon 10f3 (Thermo Scientific Pierce Antibodies), clon 37407 (R&D Systems), clon 204-12 (Abnova Corporation), clon 15E8 (EMD Millipore), clon 204-12, clon y Th 913.12 (AbD Serotec), clon B-T3 (Acris Antibodies), clon 9H6E2 (Sino Biological), clon C28/77 (MyBio-Source.com), clon k OlT-2 (ALPc O), clon 152-2E10 (Santa Cruz Biotechnology) o clon XPH-56 (Creative Diagnostics). En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno para ICOS puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a ICOS, por ejemplo, el anticuerpo anti-ICOS clon ISA-3 (eBioscience), clon SP98 (Novus Biologicals), clon 1G1, clon 3G4 (Abnova Corporation), clon 669222 (R&D Systems), clon TQ09 (Creative Diagnostics) o clon C398.4A (BioLegend). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD40 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD40 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD40 clon 82111 (R&D Systems) o ASKP1240 (Okimura et al., AM J Transplant (2014) 14 (6) 1290-1299). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD122 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD122 del anticuerpo anti-CD122 clon mikp2 (PharMingen). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para OX40 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a OX40 de, por ejemplo, anticuerpos anti-OX40 desvelados en el documento US 20130280275, US 8283450 o WO2013038191, por ejemplo, clon 12h 3 o clon 20E5. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para 4-1BB puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a 4-1BB de, por ejemplo, el anticuerpo anti-4-1BB PF-05082566 (Fisher et al., Cancer Immunol Immunother (2012) 61: 1721-1733), o urelumab (BMS-665513; Bristol-Myers Squibb; Li y Liu, Clin Pharmacol (2013); 5: 47-53). En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno para GITR puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a GITR de, por ejemplo, el anticuerpo anti-GITR TRX-518 (TolerxR; Schaer et al., (2010) 11 (12): 1378-1386) o clon AIT 518D (LifeSpan Biosciences). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para LAG3 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a LAG3 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-LAG3 clon 17B4 (Enzo Life Sciences), clon 333210 (R&D Systems) o clon 14L676 (United States Biological). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para B7-H3 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a B7-H3 de, por ejemplo, clones de anticuerpos anti-B7-H3 desvelados en el documento US 20130078234, WO2014160627 o WO2011109400. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para B7-H4 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a B7-H4 de, por ejemplo, clones de anticuerpos anti-B7-H4 desvelados en el documento WO2013067492, WO2009073533 o EP2934575, por ejemplo, clon 2h 9. En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno para BTLA puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a BTLA de, por ejemplo, el anticuerpo anti-BTLA clon 1B7, clon 2G8, clon 4C5 (Abnova Corporation), clon 4B8 (antibodies-online), clon MIH26 (Thermo Scientific Pierce Antibodies), clon UMAB61 (OriGene Technologies), clon 330104 (R&D Systems), clon 1B4 (LifeSpan BioSciences), clon 440205, clon 5E7 (Creative Diagnostics). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CTLA4 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CTLA4 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CTLA4 clon 2F1, clon 1F4 (Abnova Corporation), clon 9H10 (EMD Millipore), clon BNU3 (GeneTex), clon 1 E2 , clon AS32 (LifeSpan BioSciences), clon A3.4H2.H12 (Acris Antibodies), clon 060 (Sino Biological), clon BU5G3 (Creative Diagnostics), clon MIH8 (MBL International), clon A3.6B10.G1 o clon L3D10 (BioLegend). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para A2AR puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a A2AR de, por ejemplo, el anticuerpo anti-A2AR clon 7F6 (Millipore; Koshiba et al. Molecular Pharmacology (1999); 55: 614-624. En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno para VISTA puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a VISTA de, por ejemplo, anticuerpos anti-VISTA desvelados en los documentos WO2015097536 o US20140105912, por ejemplo, clon 13F3. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para TIM-3 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a TIM-3 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-TIM-3 clon F38-2E2 (BioLegend), clon 2E2 (Merck Millipore; Pires da Silva et al., Cancer Immunol Res (2014) 2 (5): 410-422), clon 6B6E2, clon 024 (Sino Biological), clon 344801 (R&D Systems), clon E-18, clon H-191 (Santa Cruz Biotechnology) 0 clon 13A224 (United States Biological). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para PD-1 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a PD-1 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 clon J116, clon MIH4 (eBioscience), clon 7A11B1 (Rockland Immunochemicals Inc.), clon 192106 (R&D Systems), clon J110, clon J105 (Mb L International), clon 12A7D7, clon 7A11B1 (Abbiotec), clon #9X21 (MyBioSource.com), clon 4H4D1 (Proteintech Group), clon D3W4U, clon D3O4S (Cell Signaling Technology), clon RMP1-30, clon RMP1-14 (Merck Millipore), clon EH12.2H7 (BioLegend), clon 10B1227 (United States Biological), clon UMAB198, clon UMAB197 (Origene Technologies), nivolumab (BMS-936558), lambrolizumab o anticuerpos anti-PD-1 descritos en los documentos WO 2010/077634 o WO 2006/121168. En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno para KIR puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a KIR, por ejemplo, del anticuerpo anti-KIR clon 1-7F9 (Romagne et al., Blood (2009) 114 (13): 2667-2677), lirilumab (BMS-986015; Sola et al., J Immunother Cancer (2013); 1:P40) o anticuerpos anti-KIR descritos en los documentos US 2015/0344576 o WO 2014/066532. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para HER-2 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a HER-2 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-HER-2 trastuzumab (Herceptin) o de anticuerpos anti-HER-2 descritos en los documentos WO 2003/006509 o WO 2008/019290. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para HER-3 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a HER-3 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-HER-3 clon MM-121 (Lyu et al., Int. J Clin Exp Pathol (2015) 8 (6): 6143-6156), MEHD7945A (Schaefer et al., Cancer Cell (2011) 20(4): 472-486), AMG 888 (U3-1287; Aurisicchio et al., Oncotarget (2012) 3(8): 744-758) o de anticuerpos anti-HER-3 descritos en los documentos WO2008/100624 o WO 2013048883. En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno para EGFR puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a EGFR de, por ejemplo, el anticuerpo anti-EGFR panitumumab (ABX-EGF; Vectibix), cetuximab (Erbitux), nimotuzumab, matazumab (e Md 7200) o el anticuerpo del clon 048-006 (Sogawa et al., Nucl Med Comm (2012) 33 (7): 719-725). En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno para EpCAM puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a EpCAM de, por ejemplo, el anticuerpo anti-EpCAM edrecolomab, ING-1, 3622W4 o adecatumumab (Munz et al., Cancer Cell Int (2010) 10:44). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD30 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD30 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD30 brentuximab (cAC10), clon Sg N-30 (Wahl et al., Cancer Res 200262 (13): 3736-3742), clon 5F11 (Borchmann et al., Blood (2003) 102 (1): 3737-3742) o de anticuerpos anti-CD30 descritos en los documentos WO 1993024135 o WO 2003059282. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD33 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD33 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD33 lintuzumab (SGN-33), gemtuzumab (Mylotarg) o el clon hP67.7 (Sievers et al., Blood (1999) 93 (11): 3678-3684). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD38 puede comprender las c Dr , dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD38 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD38 daratumumab (Darzalex), SAR650984 (Martin et al., J Clin Oncol (2014) 32: 5s, (supl; abstr 8532) o MOR202 (MorphoSys AG), o de anticuerpos anti-CD38 descritos en los documentos w O 2006099875 o US 20100285004. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD20 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD20 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD20 rituximab, ocrelizumab, ofatumumab, obinutuzumab o BM-ca (Kobayashi et al., Cancer Med (2013) 2 (2): 130­ 143). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD24 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD24 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD24 clon eBioSN3 (eBioscience), clon ML5 (BD Biosciences), o anticuerpos anti-CD24 descritos en el documento WO 2008059491. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD90 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD90 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD90 clon 5E10 (BD Biosciences). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD15 puede comprender las CDr , dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD15 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD15 clon C3D-1, Carb-3 (DAKO A/S), Mm A (Roche) o BY87 (Abcam). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD52 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD52 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD52 alemtuzumab, clon HI186 o clon YTH34.5 (AbD Serotec). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CA-125 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CA-125 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CA-125 oregovomab. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD34 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD34 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD34 clon 561 (BioLegend), clon 581 (Beckton Dickinson) o clon 5F3 (Sigma Aldrich). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para c A-15-3 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CA-15-3 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CA-15-3 clon 2F16 (USBiological), clon TA998 (ThermoFisher Scientific), clon 1D1 (Sigma Aldrich) o Mab AR20.5 (Qi et al., Hybrid Hybridomics (2001) 20 (5-6): 313-324). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CA-19-9 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CA-19-9 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CA-19-9 clon 116-NS-19-9 (DAKO A/S), clon SPM110 o clon 121SLE (ThermoFisher Scientific). En algunas realizaciones, el fragmento de unión al antígeno para CEA puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CEA de, por ejemplo, el anticuerpo anti­ CEA labetuzumab, C2-45 (Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd.) o de anticuerpos anti-CEA descritos en Imakiire et al., Int J Cancer (2004) 108: 564-570 o en el documento WO 2011034660. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD99 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD99 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD99 clon C7A (Moricoli et al., J Immunol Methods (2014) 408: 35­ 45) o clon 12E7 (DAKO A/S). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD117 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD117 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD117 clon CK6 (Lebron et al., Cancer Biol Ther (2014) 15 (9): 1208-1218), o clon 104D2 (Sigma Aldrich). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD31 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD31 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD31 clon JC70A (DAKO A/S). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD44 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD44 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD44 PF-03475952 (Runnels et al., Adv Ther (2010); 27(3): 168-180), RG7356 (Vugts et al., MAbs (2014) 6 (2): 567-575), clon IM7 o clon A3D8 (Sigma Aldrich). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD123 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD123 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD123 CSL362 (Nievergall et al., Blood (2014) 123 (8): 1218-1228), CSL360 (He et al., Leuk Lymphoma (2015) 56 (5): 1406-1415) 73G (Jin et al., Cell Stem Cell (2009) 5 (1): 31-42) clon 6H6 (AbD Serotec) o de anticuerpos anti-CD123 descritos en el documento WO 2014130635. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD133 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD133 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD133 clon 6B3, clon 9G4, clon AC141 (Wang et al., Hybridoma (Larchmt) (2010) 29 (3): 241-249), clon 6b6 (Chen et al., Hybridoma (Larchmt) (2010) 29 (4): 305-310, clon AC113 (Miltenyi Biotec), o de anticuerpos anti-CD133 descritos en el documento WO 2011149493. En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para ABCB5 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a ABCB5 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-ABCB5 clon 5H3C6 (Thermo Fisher Scientific). En algunas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno para CD45 puede comprender las CDR, dominios variables de cadena ligera y pesada u otro fragmento de unión a CD45 de, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD45 YAML568 (Glatting et al., J Nucl Med (2006) 47 (8): 1335-1341) o clon BRA-55 (Sigma Aldrich).
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno biespecífico de acuerdo con la presente divulgación puede ser cualquier fragmento de un polipéptido que sea capaz de unirse a un antígeno. En algunas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno comprende al menos las tres CDR de cadena ligera (es decir, LC-CDR1, LC-CDR2 y LC-CDR3) y tres CDR de cadena pesada (es decir, HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3) que conjuntamente definen la región de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno puede comprender el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno puede comprender el polipéptido de cadena ligera y el polipéptido de cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.
Los anticuerpos biespecíficos y los fragmentos de unión a antígeno biespecíficos de acuerdo con la presente divulgación pueden proporcionarse en cualquier formato adecuado, tal como los formatos descritos en Kontermann MAbs 2012, 4 (2): 182-197. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un fragmento de unión a antígeno biespecífico puede ser un conjugado de anticuerpo biespecífico (por ejemplo, una IgG2, F(ab')2 o CovX-Body), una IgG biespecífica o una molécula de tipo IgG (por ejemplo, una IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 2 in 1-IgG, mAb2 o Tandemab de LC común), una IgG asimétrica biespecífica o una molécula de tipo IgG (por ejemplo, una IgG kih, IgG kih de LC común, CrossMab, IgG kih-scFab, mAb-Fv, par de carga o SEED-body), una pequeña molécula de anticuerpo biespecífico (por ejemplo, un diacuerpo (Db), dsDb, DART, scDb, tandAb, scFv en tándem (taFv), dAb en tándem//VHH, triple cuerpo, triple cabeza, Fab-scFv o F (ab')2-scFv2), una Fc y Ch biespecíficas3 proteína de fusión (por ejemplo, una taFv-Fc, Di-diacuerpo, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc o scFv-kih-CH3), o una proteína de fusión biespecífica (por ejemplo, una scFv2-albúmina, scDb-albúmina, taFv-toxina, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-citocina2). Véase en particular la Figura 2 de Kontermann MAbs 2012, 4 (2): 182-19.
El experto en la materia puede diseñar y preparar anticuerpos biespecíficos y fragmentos de unión a antígenos biespecíficos de acuerdo con la presente divulgación.
Los métodos para producir anticuerpos biespecíficos incluyen entrecruzamiento químico de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, con enlaces disulfuro reducibles o tioéter no reducibles, por ejemplo, como se describe en Segal y Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16. Por ejemplo, Puede usarse W-succinimidil-3-(-2-piridilditio)-propionato (SPDP) para entrecruzar químicamente, por ejemplo, fragmentos Fab a través de grupos SH de regiones bisagra, para crear heterodímeros F(ab)2 biespecíficos con enlaces disulfuro.
Otros métodos para producir anticuerpos biespecíficos incluyen fusionar hibridomas productores de anticuerpos, por ejemplo, con polietilenglicol, para producir una célula de cuadroma capaz de secretar anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, como se describe en D. M. y Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16.
Los anticuerpos biespecíficos y los fragmentos de unión a antígenos biespecíficos de acuerdo con la presente divulgación también se pueden producir de forma recombinante, por expresión de, por ejemplo, una construcción de ácido nucleico que codifica polipéptidos para las moléculas de unión a antígeno, por ejemplo, como se describe en Antibody Engineering: Methods and Protocols, Segunda edición (Humana Press, 2012), en el capítulo 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz), o French, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339.
Por ejemplo, se puede preparar mediante técnicas de clonación molecular una construcción de ADN que codifica los dominios variables de cadena ligera y pesada para los dos fragmentos de unión a antígeno (es decir, los dominios variables de cadena ligera y pesada para el fragmento de unión a antígeno capaz de unirse a PD-L1, y los dominios variables de cadena ligera y pesada para el fragmento de unión a antígeno capaz de unirse a otra proteína diana), y que incluye secuencias que codifican un enlazador o dominio de dimerización adecuado entre los fragmentos de unión a antígeno. Posteriormente, el anticuerpo biespecífico recombinante puede producirse mediante expresión (por ejemplo, in vitro) de la construcción en una célula hospedadora adecuada (por ejemplo, una célula hospedadora de mamífero), y después puede purificarse opcionalmente el anticuerpo biespecífico recombinante expresado.
Los anticuerpos pueden producirse mediante un proceso de maduración por afinidad en el que se genera un anticuerpo modificado que tiene una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental no modificado. Los anticuerpos madurados por afinidad se pueden producir mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, Marks et al., Rio/Technology 10: 779-783 (1992); Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 331 0-159 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación presentan preferentemente unión específica a PD-L1. Un anticuerpo que se une específicamente a una molécula diana se une preferentemente a la diana con mayor afinidad y/o con mayor duración de la que se une a otras dianas. Los presentes anticuerpos pueden unirse con mayor afinidad a PD-L1 que a otro miembro de la familia CD28. En algunas realizaciones, los presentes anticuerpos pueden unirse con mayor afinidad a PD-L1 que a uno o más de PD-L2, TIM-3, LAG-3, Ic Os , BTLA, CD28 o CTLA-4. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo a una diana no relacionada es menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a la diana según se mide, por ejemplo, por ELISA o por radioinmunoensayo (RIA). Como alternativa, la especificidad de unión puede reflejarse en términos de afinidad de unión cuando el anticuerpo anti-PD-L1 de la presente divulgación se une a PD-L1 con una Kd que es al menos 0,1 órdenes de magnitud (es decir, 0,1 x 10n, donde n es un número entero que representa el orden de magnitud) mayor que la Kd del anticuerpo hacia otra molécula diana, por ejemplo, otro miembro de la familia CD28. Este puede ser opcionalmente uno de al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5 o 2,0.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación tienen preferentemente una constante de disociación (Kd) de uno de <10 nM, <1 nM, <500 pM, <400 pM o <300 pM. La Kd puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 nM. La afinidad de unión de un anticuerpo por su diana se describe a menudo en términos de su constante de disociación (Kd). La afinidad de unión se puede medir mediante métodos conocidos en la técnica, tales como resonancia de plasmón superficial (SPR), o mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de la molécula de anticuerpo y antígeno.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación presentan preferentemente unión a PD-L1 (por ejemplo, PD-L1 humana) con mayor afinidad que, o con una afinidad similar a, la afinidad de unión por atezolizumab (MPDL3280A; RG7446).
Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo que muestra "mayor afinidad" por una molécula diana dada en comparación con un anticuerpo de referencia se une a esa molécula diana con mayor fuerza en comparación con la fuerza de unión del anticuerpo de referencia a la molécula diana. La afinidad de un anticuerpo por una molécula diana dada se puede determinar cuantitativamente.
La afinidad relativa de unión de un anticuerpo según la presente divulgación a PD-L1 en comparación con atezolizumab puede determinarse, por ejemplo, mediante ELISA, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede tener una constante de disociación (Kd) para PD-L1 que es menor o igual que la Kd de atezolizumab para PD-L1.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede tener una afinidad por PD-L1 que es 1,01 veces o más, 1,05 veces o más, 1,1 veces o más, 1,15 veces o más, 1,2 veces o más, 1,25 veces o más, 1,3 veces o más, 1,35 veces o más, 1,4 veces o más, 1,45 veces o más, 1,5 veces o más veces la afinidad de atezolizumab por PD-L1, en un ensayo dado. En algunas realizaciones, un anticuerpo según la presente divulgación puede unirse a PD-L1 con un valor de Kd que es 0,99 veces o menos, 0,95 veces o menos, 0,9 veces o menos, 0,85 veces o menos, 0,8 veces o menos, 0,75 veces o menos, 0,7 veces o menos, 0,65 veces o menos, 0,6 veces o menos, 0,55 veces o menos, 0,5 veces o menos veces el valor de Kd de atezolizumab para PD-L1, en un ensayo dado.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación presentan preferentemente unión a PD-L1 (por ejemplo, PD-L1 humana) con mayor avidez que, o con una avidez similar a, la avidez de unión por atezolizumab.
Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo que muestra "mayor avidez" por una molécula diana dada en comparación con un anticuerpo de referencia se une a esa molécula diana para formar un complejo anticuerpo:diana más fuerte (por ejemplo, un complejo anticuerpo:diana más estable) en comparación con el complejo anticuerpo:diana formado por unión del anticuerpo de referencia a la molécula diana. La avidez de un anticuerpo por una molécula diana dada se puede determinar cuantitativamente.
La avidez relativa de unión de un anticuerpo según la presente divulgación a PD-L1 en comparación con atezolizumab puede determinarse, por ejemplo, mediante ELISA, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede tener una avidez de unión por PD-L1 que es mayor o igual que la avidez de unión de atezolizumab por PD-L1.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede tener una avidez de unión por PD-L1 que es 1,01 veces o más, 1,05 veces o más, 1,1 veces o más, 1,15 veces o más, 1,2 veces o más, 1,25 veces 0 más, 1,3 veces o más, 1,35 veces o más, 1,4 veces o más, 1,45 veces o más, 1,5 veces o más veces la avidez de unión de atezolizumab por PD-L1, en un ensayo dado.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación preferentemente inhiben o previenen la interacción entre PD-L1 y PD-1 (por ejemplo, PD-L1 humano y PD-1 humana) en mayor medida que, o en una medida similar a, la inhibición/prevención de la interacción entre PD-L1 y PD-1 por atezolizumab. La inhibición/prevención relativa de la interacción entre PD-L1 y PD-1 de un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación para PD-L1 en comparación con atezolizumab se puede determinar, por ejemplo, mediante ELISA, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede inhibir/prevenir la interacción entre PD-L1 y PD-1 en un grado que es mayor o igual que la inhibición/prevención de la interacción entre PD-L1 y PD-1 por atezolizumab. En algunas realizaciones, un anticuerpo según la presente divulgación puede inhibir/prevenir la interacción entre PD-L1 y PD-1 en una medida que es 1,01 veces o más, 1,05 veces o más, 1,1 veces o más, 1,15 veces o más, 1,2 veces o más, 1,25 veces o más, 1,3 veces o más, 1,35 veces o más, 1,4 veces o más, 1,45 veces o más, 1,5 veces o más veces la inhibición/prevención de la interacción entre PD-L1 y PD-1 por atezolizumab, en un ensayo dado.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede inhibir/prevenir la interacción entre PD-L1 y PD-1 con un valor para inhibición semimáxima de la interacción (es decir, un valor de CI50 de inhibición de la interacción entre PD-L1 y PD-1) que es menor que el valor de CI50 para la inhibición de la interacción entre PD-L1 y PD-1 por atezolizumab. En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación puede inhibir/prevenir la interacción entre PD-L1 y PD-1 con un valor de CI50 que es 0,99 veces o menos, 0,95 veces o menos, 0,9 veces o menos, 0,85 veces o menos, 0,8 veces o menos, 0,75 veces o menos, 0,7 veces o menos, 0,65 veces o menos, 0,6 veces o menos, 0,55 veces o menos, 0,5 veces o menos el valor de CI50 para la inhibición de la interacción entre PD-L1 y PD-1 por atezolizumab, en un ensayo dado.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden ser anticuerpos "antagonistas" que inhiben o reducen una actividad biológica del antígeno al que se unen. El bloqueo de la interacción entre PD-1 y PD-L1 ayuda a restaurar la función de las células T al inhibir la vía de señalización inhibidora inmunitaria mediada por PD-1.
También se ha demostrado que PD-L1 se une a B7-1 (CD80), una interacción que también suprime la proliferación de células T y la producción de citocinas.
En algunos aspectos, el anticuerpo es el clon A1 o una variante de A1. A1 comprende las siguientes secuencias de CDR:
Cadena ligera:
LC-CDR1 SGRSSNIASHDVF (SEQ ID NO 9)
LC-CDR2 ETNKRPW (SEQ ID NO 10)
LC-CDR3 GAWDSGLTGML (SEQ ID NO 11)
Cadena pesada:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: GGSYGSLYAFDI (SEQ ID NO: 23)
Secuencias de CDR determinadas por definición de Kabat.
En algunos aspectos, el anticuerpo es el clon C2 o una variante de C2. C2 comprende las siguientes secuencias de CDR:
Cadena ligera:
LC-CDR1 GGDNIGRKSVH (SEQ ID NO 12)
LC-CDR2 DDGDRPS (SEQ ID NO 13)
LC-CDR3 QAWDSTVV (SEQ ID NO 14)
Cadena pesada:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: GGSYGSLYAFDI (SEQ ID NO: 23)
Secuencias de CDR determinadas por definición de Kabat.
En algunos aspectos, el anticuerpo es el clon C4 o una variante de C4. C4 comprende las siguientes secuencias de CDR:
Cadena ligera:
LC-CDR1: SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO: 15)
LC-CDR2: DNNERLS (SEQ ID NO: 16)
LC-CDR3: GTWDSSLSVVV (SEQ ID NO: 17)
Cadena pesada:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: GGYGGNSLYAFDI (SEQ ID NO: 24)
Secuencias de CDR determinadas por definición de Kabat.
En algunos aspectos, el anticuerpo es el clon H12 o una variante de H12. En algunos aspectos, el anticuerpo es el clon H12_GL o una variante de H12_GL. cada uno de H12 y H12_GL comprende las siguientes secuencias de CDR:
Cadena ligera:
LC-CDR1 TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 18)
LC-CDR2 GNSNRPS (SEQ ID NO: 19)
LC-CDR3 QSYDSSLSGSYVV (SEQ ID NO: 20)
Cadena pesada:
HC-CDR1: SYAIS (SEQ ID NO: 21)
HC-CDR2: RIIPILGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 22)
HC-CDR3: SGHGYSYGAFDY (SEQ ID NO: 25)
Secuencias de CDR determinadas por definición de Kabat.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden comprender las CDR de A1, C2, C4, H12 o H12_GL o una de las SEQ ID NO: 1 y 5; 2 y 6; 3 y 7; 4 y 8; o 4 y 35. En un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación, una o dos o tres o cuatro de las seis secuencias de CDR pueden variar. Una variante puede tener una o dos sustituciones de aminoácidos en una o dos de las seis secuencias de CDR.
En las Figuras 1 y 2 se muestran secuencias de aminoácidos de las cadenas Vh y Vl de clones de anti-PD-LI. En la Figura 4 se muestran las secuencias de nucleótidos codificantes.
Las CDR de cadena ligera y pesada también pueden ser particularmente útiles junto con varias regiones marco diferentes. Por consiguiente, las cadenas ligeras y/o pesadas que tienen LC-CDR1-3 o HC-CDR1-3 pueden poseer una región marco alternativa. Las regiones marco adecuadas son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en M. Lefranc & G. Le:franc (2001) "The Immunoglobulin FactsBook", Academic Press.
En la presente memoria descriptiva, los anticuerpos pueden tener cadenas Vh y/o Vl que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un alto porcentaje de identidad de secuencia con una o más de las secuencias de aminoácidos de Vh y/o Vl de las SEQ ID NO: 1 y 5; 2 y 6; 3 y 7; 4 y 8; o 4 y 35, o con una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 1 y 2.
Por ejemplo, los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación incluyen anticuerpos que se unen a PD-L1 y tienen una cadena Vh o Vl que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, más preferentemente uno de al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cadena Vh o V l de una de las SEQ ID NO: 1 a 8 y 35, o con una de las secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 1 y 2.
Los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación pueden marcarse de forma detectable o, al menos, deben tener capacidad de detección. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un átomo radiactivo o una molécula coloreada o una molécula fluorescente o una molécula que se puede detectar fácilmente de cualquier otra forma. Las moléculas detectables adecuadas incluyen proteínas fluorescentes, luciferasa, sustratos enzimáticos y radiomarcadores. El resto de unión puede marcarse directamente con un marcador detectable o puede marcarse indirectamente. Por ejemplo, el resto de unión puede ser un anticuerpo no marcado que puede ser detectado por otro anticuerpo que está marcado por sí mismo. Como alternativa, el segundo anticuerpo puede haberse unido a biotina y se usa la unión de estreptavidina marcada a la biotina para marcar indirectamente el primer anticuerpo.
Métodos de detección
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden usarse en métodos que implican la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a PD-L1. Dichos métodos pueden implicar la detección del complejo unido de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, y PD-L1. Por lo tanto, en una realización se proporciona un método, comprendiendo el método poner en contacto una muestra que contiene, o que se sospecha que contiene, PD-L1 con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describe en el presente documento y detectar la formación de un complejo de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, y PD-L1.
Los formatos de método adecuados son muy conocidos en la técnica, incluyendo inmunoensayos tales como ensayos en sándwich, por ejemplo, ELISA. El método puede implicar marcar el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, o PD-L1, o ambos, con un marcador detectable, por ejemplo, fluorescente, luminiscente o radiomarcador. La expresión de PD-L1 puede medirse mediante inmunohistoquímica (IHC), por ejemplo, de una muestra de tejido obtenida mediante biopsia.
Los métodos de este tipo pueden proporcionar la base de un método de diagnóstico de una enfermedad o afección que requiera la detección o cuantificación de PD-L1 o PD-1. Tales métodos pueden realizarse in vitro en la muestra de un paciente o después del procesamiento de la muestra de un paciente. Una vez que se ha recogido la muestra, no es necesario que el paciente esté presente para realizar el método de diagnóstico in vitro y, por lo tanto, el método puede ser uno que no se practique en el cuerpo humano o el cuerpo de un animal.
Dichos métodos pueden implicar la determinación de la cantidad de PD-L1 presente en la muestra de un paciente. El método puede comprender además comparar la cantidad determinada con un valor estándar o de referencia como parte del proceso para llegar a un diagnóstico. Se pueden usar otras pruebas de diagnóstico junto con las que se describen aquí para mejorar la precisión del diagnóstico o pronóstico o para confirmar un resultado obtenido mediante las pruebas descritas aquí.
Las células cancerosas pueden aprovechar la vía de PD-1 para crear un entorno inmunosupresor, regulando positivamente la expresión de PD-L1 y/o PD-1, permitiendo la activación del receptor de PD-1 inhibidor en cualquier célula T que se infiltre en el microambiente tumoral y suprimiendo así su actividad. La regulación positiva de la expresión de PD-L1 y/o PD-1 se ha demostrado en muchos tipos de cáncer diferentes, y la expresión alta de PD-L1/PD-1 también se ha relacionado con malos resultados clínicos.
El nivel de PD-L1 o PD-1 presente en la muestra de un paciente puede ser indicativo de que un paciente puede responder al tratamiento con un anticuerpo anti-PD-L1. La presencia de un alto nivel de PD-L1 o PD-1 en una muestra puede usarse para seleccionar un paciente para el tratamiento con un anticuerpo anti-PD-L1. Por tanto, los anticuerpos de la presente divulgación se pueden usar para seleccionar un paciente para el tratamiento con terapia anti-PD-L1.
La detección en una muestra de PD-L1 o PD-1 puede usarse con el propósito de diagnosticar un trastorno disfuncional de células T o una afección cancerosa en el paciente, para diagnosticar una predisposición a una afección cancerosa o para proporcionar un pronóstico de (pronosticar) una afección cancerosa. El diagnóstico o pronóstico puede relacionarse con una afección cancerosa existente (diagnosticada previamente), que puede ser benigna o maligna, puede relacionarse con una supuesta afección cancerosa o puede relacionarse con la detección de afecciones cancerosas en el paciente (que pueden no haber sido diagnosticadas previamente).
En una realización, puede detectarse el nivel de expresión de PD-1 en las células T CD8+ para indicar el grado de agotamiento de las células T y la gravedad del estado patológico.
En una realización, el nivel de expresión de PD-L1, por ejemplo, en células presentadoras de antígenos o células tumorales, puede detectarse para indicar la existencia o gravedad de un estado patológico, por ejemplo de inflamación tisular o cáncer.
Se puede tomar una muestra de cualquier tejido o fluido corporal. La muestra puede comprender o derivar de: una cantidad de sangre; una cantidad de suero procedente de la sangre del individuo que puede comprender la porción fluida de la sangre obtenida después de la eliminación del coágulo de fibrina y las células sanguíneas; una muestra de tejido o una biopsia; o células aisladas de dicho individuo.
Los métodos de acuerdo con la presente divulgación se realizan preferentemente in vitro. El término "in vitro" pretende abarcar experimentos con células en cultivo, mientras que el término "in vivo" pretende abarcar experimentos con organismos multicelulares intactos.
Aplicaciones terapéuticas
Los anticuerpos, fragmentos y polipéptidos de unión a antígeno de acuerdo con la presente divulgación y las composiciones que comprenden dichos agentes pueden proporcionarse para su uso en métodos de tratamiento médico. Se puede proporcionar tratamiento a sujetos que tengan una enfermedad o afección que necesite tratamiento. La enfermedad o afección puede ser un trastorno disfuncional de las células T, incluyendo un trastorno disfuncional de las células T asociado a un cáncer, o un cáncer, o un trastorno disfuncional de las células T asociado ca una infección, o una infección.
Un trastorno disfuncional de las células T puede ser una enfermedad o afección en la que la función normal de las células T se ve afectada, lo que provoca una regulación negativa de la respuesta inmunitaria del sujeto a antígenos patógenos, por ejemplo, generada por infección por agentes exógenos tales como microorganismos, bacterias y virus, o generada por el hospedador en algunos estados patológicos, tales como algunas formas de cáncer (por ejemplo, en forma de antígenos asociados a tumores).
El trastorno disfuncional de las células T puede comprender agotamiento de células T o anergia de células T. El agotamiento de células T comprende un estado en el que las células T CD8+ no proliferan o no ejercen funciones efectoras de las células T tales como citotoxicidad y secreción de citocinas (por ejemplo, IFNy) en respuesta a la estimulación por el antígeno. Las células T agotadas también pueden caracterizarse por una expresión sostenida de PD-1, donde el bloqueo de las interacciones PD-1:PD-L1 puede revertir el agotamiento de las células T y restaurar las respuestas de las células T específicas de antígeno.
El trastorno disfuncional de las células T puede manifestarse como una infección o como una incapacidad para crear una respuesta inmunitaria eficaz contra una infección. La infección puede ser crónica, persistente, latente o lenta, y puede ser el resultado de una infección bacteriana, vírica, fúngica o parasitaria. Por lo tanto, se puede proporcionar tratamiento a pacientes que tienen una infección bacteriana, vírica o fúngica. Los ejemplos de infecciones bacterianas incluyen infección con Helicobacterpylori. Los ejemplos de infecciones víricas incluyen infección por VIH, hepatitis B o hepatitis C.
El trastorno disfuncional de las células T puede estar asociado a un cáncer, tal como el escape inmunitario tumoral. Muchos tumores humanos expresan antígenos asociados a tumores reconocidos por las células T y capaces de inducir una respuesta inmunitaria. Sin embargo, es común evasión inmunitaria y se cree que está mediada por varios factores solubles, entre los que se incluyen PD-L1. Por lo tanto, el bloqueo de la interacción de PD-1 y PD-L1 puede inhibir esta señal inmunorreguladora negativa a las células tumorales y mejorar la inmunidad de las células T CD8+ específicas de tumor.
También pueden tratarse cánceres cuando no hay indicios de un trastorno disfuncional de las células T, tal como el agotamiento de las células T, pero el uso de un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno de acuerdo con la presente divulgación permite al sujeto suprimir la señalización de PD-1 y crear una respuesta inmunitaria eficaz con un deterioro, evasión o inducción de escape inmunitario tumoral limitados. En tales tratamientos, el anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno puede proporcionar un tratamiento para el cáncer que implica la prevención del desarrollo del escape inmunitario tumoral.
También se pueden tratar cánceres que sobreexpresan PD-L1. Por ejemplo, las células tumorales que sobreexpresan PD-L1 pueden destruirse directamente por tratamiento con anticuerpos anti-PD-L1, por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o utilizando conjugados anticuerpo anti-PD-L1-fármaco.
El tratamiento puede tener como objetivo la prevención del trastorno disfuncional de las células T, por ejemplo, la prevención de infecciones o del desarrollo o progresión de un cáncer. Por lo tanto, los anticuerpos, fragmentos y polipéptidos de unión a antígeno pueden usarse para formular composiciones farmacéuticas o medicamentos y los sujetos pueden tratarse profilácticamente contra el desarrollo de un estado patológico. Esto puede tener lugar antes de la aparición de los síntomas del estado patológico y/o puede administrarse a sujetos que se considera que tienen un mayor riesgo de infección o desarrollo de cáncer.
El tratamiento puede comprender la terapia conjunta con una vacuna, por ejemplo, vacuna de células T, que puede implicar una terapia simultánea, separada o secuencial, o la administración combinada de vacuna y anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno en una sola composición. En este contexto, el anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno puede proporcionarse como adyuvante de la vacuna. El potencial proliferativo limitado de las células T agotadas se ha atribuido como la razón principal del fracaso de la inmunoterapia de células T y la combinación de un agente capaz de bloquear o revertir el agotamiento de las células T es una estrategia potencial para mejorar la eficacia de la inmunoterapia de células T (Barber et al., Nature Vol 439, N.° 9 p682-687, febrero de 2006).
La administración de un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno se realiza preferentemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz", que es suficiente para mostrar un efecto beneficioso en el individuo. La cantidad real administrada, y la velocidad y la evolución temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y de la gravedad de la enfermedad que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la posología, etc., son responsabilidad de los médicos de cabecera y otros facultativos, y normalmente se tiene en cuenta el trastorno que ha de tratarse, el estado del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los facultativos. Se pueden hallar ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.
Formulación de composiciones y medicamentos farmacéuticamente útiles
Los anticuerpos, fragmentos y polipéptidos de unión a antígeno de acuerdo con la presente divulgación pueden formularse como composiciones farmacéuticas para uso clínico y pueden comprender un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con la presente divulgación, también se proporcionan métodos para la producción de composiciones farmacéuticamente útiles, pudiendo comprender dichos métodos de producción una o más etapas seleccionadas de: aislar un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento; y/o mezclar un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno aislado como se describe en el presente documento con un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Por ejemplo, un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un método para formular o producir un medicamento o composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un trastorno disfuncional de células T, comprendiendo el método formular una composición farmacéutica o un medicamento mezclando un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento con un vehículo, adyuvante, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Infección
Una infección puede ser cualquier infección o enfermedad infecciosa, por ejemplo, infección bacteriana, vírica, fúngica o parasitaria. En algunas realizaciones, puede ser particularmente deseable tratar infecciones crónicas/persistentes, por ejemplo, cuando tales infecciones están asociadas a la disfunción de las células T o el agotamiento de las células T.
Está bien establecido que el agotamiento de las células T es un estado de disfunción de las células T que aparece durante muchas infecciones crónicas (incluidas las virales, bacterianas y parasitarias), así como en el cáncer (Wherry Nature Immunology Vol. 12, N.° 6 , p492-499, junio de 2011).
Una infección o enfermedad infecciosa puede ser aquella en la que la PD-1 está regulada positivamente (por ejemplo, según lo informado por Radziewicz H, et al., J Virol. 2007; 81(6): 2545-2553 y Golden-Mason L et al., J Virol. 2007; 81 (17): 9249-9258), por lo que también implica la interacción p D-1 :PD-L1 como parte del estado patológico.
Los ejemplos de infecciones bacterianas que pueden tratarse incluyen la infección por Bacillus spp., Bordetella pertussis, Clostridium spp., Corynebacterium spp., Vibrio chloerae, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Escherichia, Klebsiella, Proteus, Yersinia, Erwina, Salmonella, Listeria sp, Helicobacter pylori, micobacterias (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis) y Pseudomonas aeruginosa. Por ejemplo, la infección bacteriana puede ser septicemia o tuberculosis.
Yao et al. (PD-1 on dendritic cells impedes innate immunity against bacterial infection. Blood 113 (23): 5811-5818, 4 de junio de 2009) establecieron PD-1 en la regulación negativa de la función de CD durante la respuesta inmunitaria innata a la infección por Listeria monocytogenes. Brahmamdam et al (Delayed administration of anti-PD-1 antibody reverses immune dysfunction and improves survival during sepsis. Journal of Leukocyte Biology vol. 88, n.° 2233-240, agosto de 2010) notificaron que un anticuerpo anti-PD-1 administrado 24 h después de la septicemia prevenía el agotamiento de linfocitos y CD inducido por la septicemia, aumentaba Bcl-xL, bloqueaba la apoptosis y mejoraba la supervivencia. Se ha notificado que las interacciones Tim3:Galectina-9 median el agotamiento de las células T y median la respuesta inmunitaria innata adaptativa a la infección por Mycobacterium tuberculosis (Jayaraman et al., The Journal of Immunology 2012, 188, 70.6).
Los ejemplos de infecciones víricas que pueden tratarse incluyen la infección por el virus de la gripe, virus del sarampión, virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la coriomeningitis linfocítica (VCML), Virus del herpes simple y virus del papiloma humano.
Las infecciones víricas crónicas, tales como las causadas por el VHC, el VHB y el VIH, suelen implicar mecanismos para evadir el aclaramiento inmunitario. Se ha identificado que la expresión de PD-1 y TIM-3 se correlaciona con respuestas defectuosas de células T al virus de la hepatitis C (VHC) (McMahan et al., The Journal of Clinical Investigation Vol. 120, N.° 12 p4546-4557, diciembre de 2010). En el VHC, McMahan et al. (supra) descubrieron que el nivel de expresión dual de TIM-3 y PD-1 en CTL específicos del VHC era anterior al desarrollo de la persistencia viral, proporcionando información de pronóstico. Barber et al. (Nature Vol 439, N.° 9 p682-687, febrero de 2006) notificaron que la PD-1 se regula positivamente durante la infección vírica crónica. En ratones infectados con VCML, notificaron que el bloqueo de la vía inhibidora de PD-1/PD-L1 tenía un efecto beneficioso sobre las células T CD8, restaurando su capacidad para experimentar la proliferación, secretar citocinas, destruir las células infectadas y disminuir la carga viral. La PD-1 también está regulada positivamente en la infección por VIH (Said et al., Nature Medicine Vol. 16, N.° 4 p452-460, abril de 2010). El bloqueo de la interacción entre PD-1 y PD-L1 contribuyó al aclaramiento viral y mejoró la función de las células T en modelos animales de infección viral crónica (Said et al., supra).
Los ejemplos de infecciones fúngicas que pueden tratarse incluyen infección por Alternaría sp, Aspergillus sp, Candida sp e Histoplasma sp. La infección fúngica puede ser septicemia fúngica o histoplasmosis.
Chang et al. (Blockade of the negative co-stimulatory molecules PD-1 and CTLA-4 improves survival in primary and secondary fungal sepsis. Critical Care 2013, 17: R85) notificaron que los anticuerpos anti-PD1 eran altamente eficaces para mejorar la supervivencia en la septicemia fúngica primaria y secundaria. Lazar-Molnar et al. (The PD-1/PD-L costimulatory pathway critically affects host resistance to the pathogenic fungus Histoplasma capsulatum PNAS vol.
105, n.° 7, p2658-2663, 19 de febrero de 2008) notificaron que el anticuerpo anti-PD-1 aumentaba significativamente la supervivencia de ratones infectados con Histoplasma capsulatum. Por lo tanto, la importancia del agotamiento de las células T en la mediación de la infección fúngica está bien establecida.
Los ejemplos de infecciones parasitarias que pueden tratarse incluyen la infección por especies de Plasmodium (por ejemplo, Plasmodium falciparum, Plasmodium yoeli, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax o Plasmodium chabaudi chabaudi). La infección parasitaria puede ser una enfermedad tal como la malaria, leishmaniasis y toxoplasmosis.
Se ha demostrado que la infección de humanos con Plasmodium falciparum tiene como resultado una mayor expresión de PD-1 y agotamiento de células T en ratones (Butler et al., Nature Immunology Vol.13, No.12, p 188-195, febrero de 2012). El bloqueo de PD-L1 y LAG-3 utilizando anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 y anti-LAG-3 in vivo contribuyó a la restauración de la función de células T CD4+, amplificación del número de células T auxiliares foliculares, células B del centro germinal y plasmablastos, al aumento de anticuerpos protectores y al aclaramiento rápido de la malaria en estadio sanguíneo en ratones. También se demostró que bloquea el desarrollo de infecciones crónicas (Butler et al., supra).
Cáncer
Un cáncer puede ser cualquier proliferación celular no deseada (o cualquier enfermedad que se manifieste por proliferación celular no deseada), neoplasia o tumor o mayor riesgo de o predisposición a la proliferación celular no deseada, neoplasia o tumor. El cáncer puede ser benigno o maligno y puede ser primario o secundario (metastásico). Una neoplasia o tumor puede ser cualquier crecimiento o proliferación anormal de células y puede estar ubicado en cualquier tejido. Los ejemplos de tejidos incluyen la glándula suprarrenal, médula suprarrenal, ano, apéndice, vejiga, sangre, hueso, médula ósea, cerebro, mama, ciego, cerebelo del sistema nervioso central (incluido o excluido el cerebro), cuello del útero, colon, duodeno, endometrio, células epiteliales (por ejemplo, epitelios renales), vesícula biliar, esófago, células gliales, corazón, íleon, yeyuno, riñón, glándula lacrimal, laringe, hígado, pulmón, linfa, ganglio linfático, linfoblasto, maxilar superior, mediastino, mesenterio, miometrio, nasofaringe, omento, cavidad oral, ovario, páncreas, glándula parótida, sistema nervioso periférico, peritoneo, pleura, próstata, glándula salival, colon sigmoide, piel, intestino delgado, tejidos blandos, bazo, estómago, testículos, timo, glándula tiroidea, lengua, amígdala, tráquea, útero, vulva, glóbulos blancos.
Los tumores a tratar pueden ser tumores del sistema nervioso o de otro sistema. Los tumores del sistema nervioso pueden originarse en el sistema nervioso central o periférico, por ejemplo, glioma, meduloblastoma, meningioma, neurofibroma, ependimoma, schwannoma, neurofibrosarcoma, astrocitoma y oligodendroglioma. Los cánceres/tumores no relacionados con el sistema nervioso pueden originarse en cualquier otro tejido no nervioso, incluyendo los ejemplos melanoma, mesotelioma, linfoma, mieloma, leucemia, linfoma no Hodgkin (NLH), linfoma de Hodgkin, leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma cutáneo de células T (CTCL, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica crónica (LLC), hepatoma, carcinoma epidermoide, carcinoma de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, carcinoma tímico, NSCLC, cáncer hematológico y sarcoma.
Terapia de transferencia adoptiva de células T
La terapia de transferencia adoptiva de células T en general se refiere a un proceso en el que se extraen glóbulos blancos de un sujeto, normalmente extrayendo una muestra de sangre de la que se separan los glóbulos blancos, se expanden in vitro o ex vivo y se devuelven al mismo sujeto o a un sujeto diferente. Con este tratamiento normalmente se pretende aumentar la cantidad/concentración de una forma activa de la población de células T requerida en el sujeto. Dicho tratamiento puede ser beneficioso en sujetos que experimentan agotamiento de células T.
Los anticuerpos capaces de bloquear el mecanismo de agotamiento de células T, o de revertirlo, proporcionan un medio para mejorar la actividad de las células T y promover la expansión de las células T.
Por consiguiente, en un aspecto adicional de la presente divulgación se proporciona un método para expandir una población de células T, en donde se ponen en contacto células T in vitro o ex vivo con un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno de acuerdo con la presente divulgación.
El método puede comprender opcionalmente una o más de las siguientes etapas: tomar una muestra de sangre de un sujeto; aislar las células T de la muestra de sangre; cultivar las células T en un cultivo celular in vitro o ex vivo (donde pueden entrar en contacto con el anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno), recoger una población expandida de células T; mezclar las células T modificadas con un adyuvante, diluyente o vehículo; y administrar las células T expandidas a un sujeto.
Por consiguiente, en algunos aspectos de la presente divulgación se proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno disfuncional de células T, comprendiendo el método obtener una muestra de sangre de un sujeto que necesita tratamiento, cultivar células T obtenidas de la muestra de sangre en presencia de un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno de acuerdo con la presente divulgación para expandir la población de células T, recoger las células T expandidas y administrar las células T expandidas a un sujeto que necesita tratamiento.
Las células T pueden obtenerse de un sujeto que requiera tratamiento y pueden aislarse y/o purificarse. Pueden ser una población de células T CD4+ y/o CD8+. Las células T pueden representar una población que experimenta agotamiento de células T y, opcionalmente, pueden tener una expresión regulada positivamente de PD-1 y/o PD-L1.
Durante el cultivo, las células T pueden entrar en contacto con el anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno en condiciones y durante un período de tiempo adecuados para permitir la expansión de las células T a un número deseado de células. Después de un período de tiempo adecuado, las células T se pueden recolectar, opcionalmente se pueden concentrar y pueden mezclarse con un vehículo, adyuvante o diluyente adecuado y devolverse al cuerpo del sujeto. Un sujeto puede someterse a uno o más ciclos de dicha terapia.
En la técnica son bien conocidos métodos de expansión de células T, tales como los descritos en Kalamasz et al., J Immunother 2004 septiembre-octubre; 27(5): 405-18; Montes et al., Clin Exp Immunol 2005 noviembre; 142 (2): 292­ 302; Wolfl y Greenburg, Nature Protocols 9 p950-966, 27 de marzo de 2014; Trickett y Kwan, Journal of Immunological Methods Vol. 275, Números 1-2, 1 de abril de 2003, p251-255; Butler et al PLoSOn E 7 (1) 12 de enero de 2012.
Administración simultánea o secuencial
Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o secuencial dependiendo de la afección que se vaya a tratar.
En esta memoria descriptiva, un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno de la presente divulgación y un agente antiinfeccioso o agente quimioterapéutico (agente terapéutico) pueden administrarse simultánea o secuencialmente.
En algunas realizaciones, el tratamiento con un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno de la presente divulgación puede ir acompañado de quimioterapia.
La administración simultánea se refiere a la administración del anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno y agente terapéutico conjuntamente, por ejemplo como una composición farmacéutica que contiene ambos agentes (preparación combinada), o uno inmediatamente después del otro y opcionalmente a través de la misma vía de administración, por ejemplo, en la misma arteria, vena u otro vaso sanguíneo.
La administración secuencial se refiere a la administración de uno del anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno o agente terapéutico seguido, después de un intervalo de tiempo dado, por la administración separada del otro agente. No es necesario que los dos agentes se administren por la misma vía, aunque esto ocurre en algunas realizaciones. El intervalo de tiempo puede ser cualquier intervalo de tiempo.
Agentes antiinfecciosos
En el tratamiento de infecciones, un anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno de la presente divulgación se puede administrar en combinación con un agente antiinfeccioso, como se ha descrito anteriormente. El agente antiinfeccioso puede ser un agente que se sabe que tiene acción contra el microorganismo o virus responsable de la infección.
Los agentes antiinfecciosos adecuados incluyen antibióticos (tales como penicilinas, cefalosporinas, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas, sulfonamidas, macrólidos, lincosamidas, tetraciclinas, lipopéptidos cíclicos, glicilciclinas, oxazolidinonas y lipiarmicinas), agentes antivirales (tales como inhibidores de la transcriptasa inversa, inhibidores de la integrasa, inhibidores del factor de transcripción, agentes antisentido y ARNip e inhibidores de proteasa), agentes antifúngicos (tales como polienos, imidiazoles, triazoles, tiazoles, alilaminas y equinocandinas) y agentes antiparasitarios (tales como agentes antinematodos, agentes anticestodos, agentes antitrematodos, agentes antiamebianos y agentes antiprotozoarios).
Quimioterapia
La quimioterapia se refiere al tratamiento de un cáncer con un fármaco o con radiación ionizante (por ejemplo, radioterapia con rayos X o rayos y). En realizaciones preferidas, la quimioterapia se refiere al tratamiento con un fármaco. El fármaco puede ser una entidad química, por ejemplo, un producto farmacéutico de molécula pequeña, antibiótico, intercalador de ADN, inhibidor de proteínas (por ejemplo, inhibidor de quinasa), o un agente biológico, por ejemplo, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero de ácido nucleico o péptido, ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN), péptido, polipéptido o proteína. El fármaco se puede formular como una composición farmacéutica o un medicamento. La formulación puede comprender uno o más fármacos (por ejemplo, uno o más agentes activos) junto con uno o más diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Un tratamiento puede implicar la administración de más de un fármaco. Un fármaco puede administrarse solo o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o secuencial dependiendo de la afección que se vaya a tratar. Por ejemplo, la quimioterapia puede ser una coterapia que implica la administración de dos fármacos, uno o más de los cuales pueden estar destinados a tratar el cáncer.
La quimioterapia puede administrarse mediante una o más vías de administración, por ejemplo, parenteral, inyección intravenosa, oral, subcutánea, intradérmica o intratumoral.
La quimioterapia puede administrarse de acuerdo con un régimen de tratamiento. El régimen de tratamiento puede ser un calendario, plan, esquema o programa predeterminado de administración de quimioterapia que puede prepararse por un médico o facultativo y puede adaptarse para adecuarse al paciente que requiere tratamiento.
El régimen de tratamiento puede indicar uno o más de: el tipo de quimioterapia a administrar al paciente; la dosis de cada fármaco o radiación; el intervalo de tiempo entre administraciones; la duración de cada tratamiento; el número y la naturaleza de los descansos de tratamiento, si lo hay, etc. Para una coterapia se puede proporcionar un solo régimen de tratamiento que indique cómo se debe administrar cada fármaco.
Los fármacos quimioterapéuticos y productos biológicos se pueden seleccionar entre:
• agentes alquilantes tales como cisplatino, carboplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida;
• antimetabolitos de purina o pirimidina tales como azatiopurina o mercaptopurina;
• alcaloides y terpenoides, tales como alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina), podofilotoxina, etopósido, tenipósido, taxanos tales como paclitaxel (Taxol™), docetaxel;
• inhibidores de la topoisomerasa tales como los inhibidores de la topoisomerasa de tipo I camptotecinas, irinotecán y topotecán, o los inhibidores de la topoisomerasa de tipo II amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido;
• antibióticos antitumorales (por ejemplo, antibióticos de antraciclina) tales como dactinomicina, doxorrubicina (Adriamycin ™), epirrubicina, bleomicina, rapamicina;
• agentes basados en anticuerpos, tales como anticuerpos anti-PD-1, anticuerpos anti-TIM-3, anti-CTLA-4, anti-LAG-3, anti-4-1 BB, anti-GITR, anti-CD27, anti-BLTA, anti-OX40, anti-VEGF, anti-TNFa, anti-IL-2, antiGpNb/NIa, anti CD-52, anti-CD20, anti-RSV, anti-HER2/neu (erbB2), anti-receptor de TNF, anticuerpos anti-EGFR, anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo, incluyendo los ejemplos: cetuximab, panitumumab, infliximab, basiliximab, bevacizumab (Avastin®), abciximab, daclizumab, gemtuzumab, alemtuzumab, rituximab (Mabthera®), palivizumab, trastuzumab, etanorcept, adalimumab, nimotuzumab
• Inhibidores de EGFR tales como erlotinib, cetuximab y gefitinib
• agentes antiangiogénicos tales como bevacizumab (Avastin®)
• vacunas contra el cáncer tales como Sipuleucel-T (Provenge®)
En una realización, el agente quimioterapéutico es un anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-TIM-3, anti-CTLA-4, anti-LAG3, anti-41BB, anti-GITR, anti-CD27, anti-BLTA, anti-OX40, anti-VEGF, anti-TNFa, anti-IL2, anti-GpIIb/IIIa, anti-CD-52, anti-CD20, anti-RSV, anti-HER2/neu (erbB2), anti-receptor de TNF, anti-EGFR u otro anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de punto de control inmunitario o una molécula de coestimulación.
Se pueden seleccionar más fármacos quimioterapéuticos de: Ácido 13-cis-retinoico, 2-Clorodesoxiadenosina, 5-Azacitidina, 5-Fluorouracilo, 6-Mercaptopurina, 6-Tioguanina, Abraxane, Accutane®, Actinomicina-D Adriamycin®, Adrucil®, Afinitor®, Agrylin®, Ala-Cort®, Aldesleukina, Alemtuzumab, ALIMTA, Alitretinoina, Alkaban-AQ®, Alkeran®, Ácido retinoico todo trans, Interferón alfa, Altretamina, Ametopterina, Amifostina, Aminoglutetimida, Anagrelida, Anandron®, Anastrozol, Arabinosilcitosina, Aranesp®, Aredia®, Arimidex®, Aromasin®, Arranon®, Trióxido de arsénico, Asparaginasa, ATRA Avastin®, Azacitidina, BCG, BCNU, Bendamustina, Bevacizumab, Bexaroteno, BEXXAR®, Bicalutamida, BiCNU, Blenoxane®, Bleomicina, Bortezomib, Busulfán, Busulfex®, Leucovorina Calcio, Campath®, Camptosar®, Camptotecina-11, Capecitabina, Carac™, Carboplatino, Carmustina, Casodex®, CC-5013, CCI-779, CCNU, CDDP, CeeNU, Cerubidine®, Cetuximab, Clorambucilo, Cisplatino, Factor Citrovorum, Cladribina, Cortisona, Cosmegen®, CPT-11, Ciclofosfamida, Cytadren®, Citarabina Cytosar-U®, Cytoxan®, Dacogen, Dactinomicina, Darbepoyetina Alfa, Dasatinib, Daunomicina, Daunorrubicina, Danurrobicina clorhidrato, Daunorrubicina Liposomal, DaunoXome®, Decadron, Decitabina, Delta-Cortef®, Deltasone®, Denileukin, Diftitox, DepoCyt™, Dexametasona, Dexametasona Acetato, Dexametasona Fosfato Sódico, Dexasona, Dexrazoxano, DHAD, DIC, Diodex, Docetaxel, Doxil®, Doxorrubicina, Doxorrubicina Liposomal, Droxia™, DTIC, DTIC-Dome®, Duralone®, Eligard™, Ellence™, Eloxatin™, Elspar®, Emcyt®, Epirrubicina, Epoetina Alfa, Erbitux, Erlotinib, L-asparaginasa de Erwinia, Estramustina, Ethyol Etopophos®, Etopósido, Fosfato de etopósido, Eulexin®, Everolimus, Evista®, Exemestano, Faslodex®, Femara®, Filgrastim, Floxuridina, Fludara®, Fludarabina, Fluoroplex®, Fluorouracilo, Fluoximasterona, Flutamida, Ácido folínico, FUDR®, Fulvestrant, Gefitinib, Gemcitabina, Gemtuzumab ozogamicina, Gleevec™, Oblea Gliadel®, Goserelina, Factor estimulador de colonias de granulocitos, Factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos, Herceptin®, Hexadrol, Hexalen®, Hexametilmelamina, HMM, Hycamtin®, Hydrea®, Hydrocort Acetate®, Hidrocortisona, Hidrocortisona fosfato de sodio, Hidrocortisona succinato de sodio, Hidrocortisona fosfato, Hidroxiurea, Ibritumomab, Ibritumomab Tiuxetan, Idamycin®, Idarrubicina, Ifex®, IFN-alfa, Ifosfamida, IL-11, IL-2, Imatinib mesilato, Imidazol Carboxamida, Interferón alfa, Interferón Alfa-2b (conjugado con PEG), Interleucina-2, Interleucina-11, Intron A® (interferón alfa-2b), Iressa®, Irinotecán, Isotretinoína, Ixabepilona, Ixempra™, Kidrolasa, Lanacort®, Lapatinib, L-asparaginasa, LCR, Lenalidomida, Letrozol, Leucovorina, Leukeran, Leukine™, Leuprolida, Leurocristina, Leustatin™, Liposomal Ara-C, Liquid Pred®, Lomustina, L-PAM, L-Sarcolisina, Lupron®, Lupron Depot®, Matulane®, Maxidex, Mecloretamina, Mecloretamina clorhidrato, Medralone®, Medrol®, Megace®, Megestrol, Megestrol Acetato, Melfalán, Mercaptopurina, Mesna, Mesnex™, Metotrexato, Metotrexato sodio, Metilprednisolona, Meticorten®, Mitomicina, Mitomicina-C, Mitoxantrona, M-Prednisol®, MTC, MTX, Mustargen®, Mustina, Mutamicina®, Myleran®, Mylocel™, Mylotarg®, Navelbine®, Nelarabina, Neosar®, Neulasta™, Neumega®, Neupogen®, Nexavar®, Nilandron®, Nilutamida, Nipent®, Mostaza nitrogenada, Novaldex®, Novantrone®, Octreótido, Octreótido acetato, Oncospar®, Oncovin®, Ontak®, Onxal™, Oprevelkin, Orapred®, Orasone®, Oxaliplatino, Paclitaxel, Paclitaxel unido a proteína, Pamidronato, Panitumumab, Panretin®, Paraplatin®, Pediapred®, Interferón pegilado, Pegaspargasa, Pegfilgrastim, PEG-INTRON™, PEG-L-asparaginasa, PEMETREXED, Pentostatina, Mostaza de Fenilalanina, Platinol®, Platinol-AQ®, Prednisolona, Prednisona, Prelone®, Procarbazina, PROCRIT®, Proleukin®, Prolifeprospan 20 con implante de carmustina Purinethol®, Raloxifeno, Revlimid®, Rheumatrex®, Rituxan®, Rituximab, Roferon-A® (interferón Alfa-2a), Rubex®, Rubidomicina clorhidrato, Sandostatin® Sandostatin LAR®, Sargramostim, Solu-Cortef®, Solu-Medrol®, Sorafenib, SPRYCEL™, STI-571, Estreptozocina, SU11248, Sunitinib, Sutent®, Tamoxifeno, Tarceva®, Targretin®, Taxol®, Taxotere®, Temodar®, Temozolomida, Temsirolimus, Tenipósido, TESPA, Talidomida, Thalomid®, TheraCys®, Tioguanina, Thioguanine Tabloid®, Tiofosfoamida, Thioplex®, Tiotepa, TICE®, Toposar®, Topotecán, Toremifeno, Torisel®, Tositumomab, Trastuzumab, Treanda®, Tretinoína, Trexall™, Trisenox®, TSPA, Ty Ke RB®, VCR, Vectibix™, Velban®, Velcade®, VePesid®, Vesanoid®, Viadur™, Vidaza®, Vinblastina, Vinblastina sulfato, Vincasar Pfs®, Vincristina, Vinorelbina, Vinorelbina tartrato, VLB, VM-26, Vorinostat, VP-16, Vumon®, Xeloda®, Zanosar®, Zevalin™, Zinecard®, Zoladex®, Ácido zolendrónico, Zolinza, Zometa®.
Vías de administración
Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, polipéptidos y otros agentes terapéuticos, medicamentos y composiciones farmacéuticas de acuerdo con los aspectos de la presente divulgación pueden formularse para su administración por varias vías, incluyendo, aunque no de forma limitativa, parenteral, intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intratumoral y oral. Los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, polipéptidos y otros agentes terapéuticos, se pueden formular en forma líquida o sólida. Las formulaciones líquidas se pueden formular para la administración mediante inyección en una región seleccionada del cuerpo humano o animal.
Régimen de dosificación
Pueden proporcionarse múltiples dosis del anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno. Una o más, o cada una, de las dosis pueden ir acompañadas de la administración simultánea o secuencial de otro agente terapéutico.
Las dosis múltiples pueden separarse por un intervalo de tiempo predeterminado, que puede seleccionarse para ser uno de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días, o 1,2, 3, 4, 5 o 6 meses. A modo de ejemplo, las dosis se pueden administrar una vez cada 7, 14, 21 o 28 días (más o menos 3, 2 o 1 días).
Kits
En algunos aspectos de la presente divulgación se proporciona un kit de partes. En algunas realizaciones, el kit puede tener al menos un recipiente que tiene una cantidad predeterminada del anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno. El kit puede proporcionar el anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno en forma de un medicamento o composición farmacéutica, y se puede proporcionar junto con instrucciones para la administración a un paciente con el fin de tratar una enfermedad o afección específica. El anticuerpo, fragmento o polipéptido de unión a antígeno se puede formular de manera que sea adecuado para inyección o infusión en un tumor o en la sangre.
En algunas realizaciones, el kit puede comprender además al menos un recipiente que tiene una cantidad predeterminada de otro agente terapéutico (por ejemplo, agente antiinfeccioso o agente de quimioterapia). En dichas realizaciones, el kit también puede comprender un segundo medicamento o composición farmacéutica de modo que los dos medicamentos o composiciones farmacéuticas se puedan administrar de forma simultánea o separada de modo que proporcionen un tratamiento combinado para la enfermedad o afección específica. El agente terapéutico también se puede formular para que sea adecuado para inyección o infusión en un tumor o en la sangre.
Sujetos
El sujeto a tratar puede ser cualquier animal o un ser humano. El sujeto es preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. El sujeto puede ser un mamífero no humano, pero más preferentemente es un ser humano. El sujeto puede ser un hombre o una mujer. El sujeto puede ser un paciente. Al sujeto se le puede haber diagnosticado una enfermedad o afección que requiera tratamiento, o se sospecha que tiene tal enfermedad o afección.
Expresión de proteínas
Las técnicas de biología molecular adecuadas para producir polipéptidos de acuerdo con la presente divulgación en células son muy conocidas en la técnica, tales como las establecidas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989
El polipéptido puede expresarse a partir de una secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede estar contenida en un vector presente en una célula o puede incorporarse al genoma de la célula.
Un "vector", tal como se usa en el presente documento, es una molécula de oligonucleótido (ADN o ARN) que se usa como vehículo para transferir material genético exógeno a una célula. El vector puede ser un vector de expresión para la expresión del material genético en la célula. Dichos vectores pueden incluir una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del gen a expresar. Un vector también puede incluir un codón de terminación y potenciadores de la expresión. Se puede usar cualquier vector, promotor, potenciador y codón de terminación adecuado conocido en la técnica para expresar polipéptidos a partir de un vector de acuerdo con la presente divulgación. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, vectores binarios, vectores virales y cromosomas artificiales (por ejemplo, cromosomas artificiales de levadura).
En esta memoria descriptiva, la expresión "unido operativamente" puede incluir la situación en la que una secuencia de nucleótidos seleccionada y una secuencia de nucleótidos reguladora (por ejemplo, promotor y/o potenciador) están unidas covalentemente de tal manera que tenga lugar la expresión de la secuencia de nucleótidos bajo la influencia o control de la secuencia reguladora (formándose así un casete de expresión). Por tanto, una secuencia reguladora está unida operativamente a la secuencia de nucleótidos seleccionada si la secuencia reguladora es capaz de efectuar la transcripción de la secuencia de nucleótidos. Cuando sea apropiado, el transcrito resultante se puede traducir posteriormente en una proteína o polipéptido deseado.
Puede usarse cualquier célula adecuada para la expresión de polipéptidos para producir péptidos de acuerdo con la presente divulgación. La célula puede ser procariota o eucariota. Las células procariotas adecuadas incluyen E. coli.
Los ejemplos de células eucariotas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal, una célula de insecto o una célula de mamífero. En algunos casos, la célula no es una célula procariota porque algunas células procariotas no permiten las mismas modificaciones postraduccionales que las eucariotas. Además, en los eucariotas son posibles niveles de expresión muy altos y las proteínas pueden ser más fáciles de purificar a partir de eucariotas usando etiquetas apropiadas. También se pueden utilizar plásmidos específicos que mejoran la secreción de la proteína en el medio.
Los métodos para producir un polipéptido de interés pueden implicar el cultivo o fermentación de una célula modificada para expresar el polipéptido. El cultivo o fermentación puede realizarse en un biorreactor provisto de un aporte adecuado de nutrientes, aire/oxígeno y/o factores de crecimiento. Las proteínas secretadas se pueden recoger separando los medios de cultivo/caldo de fermentación de las células, extrayendo el contenido de proteína y separando proteínas individuales para aislar el polipéptido secretado. Los expertos en la materia conocen bien las técnicas de cultivo, fermentación y separación.
Los biorreactores incluyen uno o más recipientes en los que se pueden cultivar células. El cultivo en el biorreactor puede realizarse de forma continua, con un flujo continuo de reactivos hacia y un flujo continuo de células cultivadas desde el reactor. Como alternativa, el cultivo puede realizarse en lotes. El biorreactor supervisa y controla condiciones ambientales tales como el pH, el oxígeno, los caudales de entrada y salida y la agitación dentro del recipiente de manera que se proporcionen condiciones óptimas para las células que se están cultivando.
Después del cultivo de células que expresan el polipéptido de interés, preferentemente se aísla ese polipéptido. Puede usarse cualquier método adecuado para separar polipéptidos/proteínas del cultivo celular conocido en la técnica. Para aislar un polipéptido/proteína de interés a partir de un cultivo, puede ser necesario separar primero las células cultivadas de los medios que contienen el polipéptido/proteína de interés. Si el polipéptido/proteína de interés se secreta de las células, las células pueden separarse del medio de cultivo que contiene el polipéptido/proteína secretada por centrifugación. Si el polipéptido/proteína de interés se acumula dentro de la célula, será necesario romper las células antes de la centrifugación, por ejemplo usando sonicación, congelación-descongelación rápida o lisis osmótica. La centrifugación producirá un sedimento que contiene las células cultivadas, o restos celulares de las células cultivadas, y un sobrenadante que contiene el medio de cultivo y el polipéptido/proteína de interés.
Entonces puede ser deseable aislar el polipéptido/proteína de interés del sobrenadante o medio de cultivo, que puede contener otros componentes proteicos y no proteicos. Un enfoque común para separar componentes de polipéptido/proteína de un sobrenadante o medio de cultivo es mediante precipitación. Los polipéptidos/proteínas de diferente solubilidad se precipitan a diferentes concentraciones de agente de precipitación tal como el sulfato de amonio. Por ejemplo, a bajas concentraciones de agente de precipitación, se extraen proteínas solubles en agua. Por tanto, mediante la adición de concentraciones crecientes de agente de precipitación, se pueden distinguir proteínas de diferente solubilidad. Posteriormente se puede utilizar diálisis para eliminar el sulfato de amonio de las proteínas separadas.
En la técnica se conocen otros métodos para distinguir diferentes polipéptidos/proteínas, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de tamaños. Estos pueden usarse como una alternativa a la precipitación, o pueden realizarse posteriormente a la precipitación.
Una vez que el polipéptido/proteína de interés se ha aislado del cultivo, puede ser necesario concentrar la proteína. En la técnica se conocen varios métodos para concentrar una proteína de interés, tal como la ultrafiltración o la liofilización.
Identidad de secuencia
El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o nucleótidos puede conseguirse de varias maneras conocidas para el experto en la materia, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como el programa ClustalW 1.82. T-coffee o Megalign (DNASTAR). Cuando se usa dicho programa, preferentemente se usan parámetros por defecto, por ejemplo, para penalización por hueco y penalización por extensión. Los parámetros por defecto de ClustalW 1.82 son: Penalización por apertura de hueco de proteína = 10,0, Penalización por extensión de hueco de proteína = 0,2, Matriz de proteína = Gonnet, Proteína/ADN ENDGAP = -1, Proteína/ADN GAPDIST = 4.
La presente divulgación incluye la combinación de los aspectos y características preferidas descritos, exceptuando cuando tal combinación sea claramente inaceptable o se evite expresamente.
Los encabezados de sección usados en el presente documento tienen fines organizativos solamente y no deben considerarse limitantes de la materia objeto descrita.
A continuación se ilustrarán aspectos y realizaciones de la presente divulgación, a modo de ejemplo, haciendo referencia a las figuras adjuntas. Serán evidentes para los expertos en la materia aspectos y realizaciones adicionales.
A lo largo de toda la presente memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un elemento integrante o etapa, o grupo de elementos integrantes o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento integrante o etapa, o grupo de elementos integrantes o etapas.
Cabe señalar que, tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/uno", "una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En el presente documento los intervalos se pueden expresar como desde "aproximadamente" un valor particular y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa dicho intervalo, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular constituye otra realización.
Breve descripción de las figuras
Las realizaciones y experimentos que ilustran los principios de la invención se analizarán a continuación con referencia a las figuras adjuntas en las que:
Figura 1. Secuencias de dominio variable de cadena ligera para los clones de anticuerpo anti-PD-L1 A1, C2, C4, H12 e H12_GL. Las CDR están subrayadas y se muestran por separado.
Figura 2. Secuencias de dominio variable de cadena pesada para los clones de anticuerpo anti-PD-L1 A1, C2, C4, H12 e H12_GL. Las CDR están subrayadas y se muestran por separado.
Figura 3. Tabla que muestra las secuencias de CDR de cadena ligera y cadena pesada para los clones de anticuerpo anti-PD-L1 A1, C2, C4, H12 e H12_GL.
Figura 4. Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificados de secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera para los clones de anticuerpo anti-PD-L1 A1, C2, C4, H12 e H12_GL.
Figura 5. Gráfico de barras que muestra la unión de anticuerpos anti-PD-L1 A1, C2, C4 y H12 conjugados con Fc humano y anticuerpos de control A3 (que se unen a PD-L1 humano pero no murino) y E3 (que no se unen a PD-L1 humano ni murino).
Figura 6. Gráfico que muestra la inhibición de la interacción PD-1 humana/PD-L1 humano por anticuerpos conjugados con Fc humano A1, C2, C4 y H12, según se determinó por ELISA.
Figura 7. Gráfico que muestra la inhibición de la interacción PD-1 murina/PD-L1 murino por anticuerpos conjugados con Fc humano A1, C2, C4 y H12, según se determinó por ELISA.
Figura 8. Gráfico que muestra la inhibición de la interacción PD-1 murina/PD-L1 murino por H12 (IgG1) y el anticuerpo comercial anti-PD-L1 de ratón.
Figura 9. Gráfico de barras que muestra la secreción de IFNy de las células T agotadas en respuesta a los anticuerpos H12, nivolumab (anticuerpo comercial anti-PD-1) y control de isotipo y sin anticuerpo.
Figura 10. Gráfico de barras que muestra la proliferación de células T agotadas en respuesta a los anticuerpos anti-PD-LI H12, nivolumab y control de isotipo y sin anticuerpo.
Figura 11. Sensograma que muestra la afinidad de anti-PD-LI H12 por PD-L1 humano determinada por resonancia de plasmón superficial (SPR). KD = 3,13 x10-10 M.
Figura 12. Sensograma que muestra la afinidad de anti-PD-LI H12 por PD-L1 murino según se determina por resonancia de plasmón superficial (SPR). KD = 3,04 x10-9 M.
Figura 13. Gráficos de barras que muestran la secreción de IFNy (A) de tejido de tumor pulmonar disociado y (B) tejido de tumor pulmonar disociado cocultivado con células dendríticas (CD) alogénicas en una reacción mixta de linfocitos (MLR), en respuesta a nivolumab, labrolizumab (ambos anticuerpos comerciales anti-PD-1), anticuerpo H12 y controles de isotipo y sin anticuerpos.
Figura 14. Gráfico de barras que muestra la secreción de IFNy después del cultivo de PBMC con Influenza en presencia del nivolumab, labrolizumab, anticuerpo H12-IgG4, anticuerpo H12-IgGi, y controles de isotipo y sin anticuerpos.
Figura 15. Gráfico de barras que muestra ELISA con H12 en diferentes antígenos: PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CTL-A4, BLTA, ICOS y CD28 humanos (hu), y PD-L1 de macaco cynomolgus (cy) y ratón (mo).
Figura 16. Gráficos que muestran la inhibición del crecimiento tumoral por el anticuerpo H12 en (A) un modelo de cáncer de colon de ratón utilizando la línea celular CT26 y (B) un modelo de melanoma de ratón usando la línea celular B16F10.
Figura 17. Gráfico que muestra la eficiencia del bloqueo de la interacción entre PD-1 y PD-L1 por anticuerpos H12-IgGi, H12-IgG4, H12_GL-IgGi y H12_GL-IgG4, según se determina mediante ensayo de bloqueo usando células HEK293-6E transfectadas con PD-L1 humano.
Figura 18. Gráficos que muestran la eficacia in vivo del anticuerpo anti-PD-L1 H12 para controlar el crecimiento tumoral en un modelo de ratón. Se inocularon células MC38 en ratones y se administraron por vía intraperitoneal cinco dosis de 200 |jg por animal del anticuerpo indicado a partir del día 8. (A) y (B) muestran los resultados de crecimiento tumoral (media ± SEM) para dos experimentos independientes.
Figura 19. Gráficos que muestran la unión de los anticuerpos H12, C4 y atezolizumab a PD-L1 humano, y la avidez de la unión. (A) Unión de H12, C4, atezolizumab y anticuerpos de control de isotipo a PD-L1 humano (media ± SD de duplicados). (B) Avidez de la unión de H12, C4, atezolizumab y anticuerpos de control de isotipo a PD-L1 humano (media ± SD de duplicados).
Figura 20. Gráfico que muestra la unión de IgG 1 H12, IgG 1 C4, atezolizumab y anticuerpos IgG1 DEN contra células de cáncer de mama humano MDA-MB-231. Se muestra el índice medio de fluorescencia (MFI) (media ± SD de duplicados).
Figura 21. Gráfico que muestra la unión de PD-L1 a PD-1 en presencia de H12, C4, atezolizumab y anticuerpos de control de isotipo. El gráfico muestra la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de PD-L1 a su receptor PD-1 (media ± SD de duplicados).
Ejemplos
Los inventores describen en los siguientes ejemplos la identificación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de anticuerpos aislados, o las porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a PD-L1 humano y murino, bloquean la vía de PD-1 y restauran la actividad de las células T agotadas.
Ejemplo 1: Aislamiento de anticuerpos anti-PD-L1 humanos
Se aislaron anticuerpos anti-PD-L1 de una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpos humanos mediante selección in vitro.
Se recubrieron perlas magnéticas de estreptavidina con PD-L1 humano biotinilado y se usaron para capturar fagos específicos de anti-PD-L1 usando clasificación magnética. En el proceso de selección se añadieron algunas etapas para eliminar los posibles anticuerpos anti-biotina.
Los anticuerpos Fab específicos se identificaron originalmente mediante ELISA con PD-L1 humano como antígeno. Se conservaron cuatro clones para una caracterización adicional basada en su lenta disociación del PD-L1 humano: los clones A1, C2, C4 e H12. Se realizó una primera exploración de clonalidad mediante huellas de ADN; y posteriormente se confirmó la clonalidad mediante secuenciación.
Ejemplo 2: Unión a PD-L1 humano y murino
Se acoplaron PD-L1 humano y murino a Fc humano y se usaron como antígenos aplicados como un recubrimiento en placas de ELISA para investigar la unión de anticuerpos.
En resumen, se recubrieron placas de ELISA con PD-L1-Fc humano o murino en tampón carbonato, después las placas se bloquearon con una solución de caseína y, después de lavados considerables en PBS Tween-20, se añadieron anticuerpos anti-PD-L1 en formato Fab a los pocillos de ELISA en presencia de leche al 7 % en PBS. Después de 90 minutos a temperatura ambiente con agitación y lavados considerables, se añadió un anticuerpo de cabra anti-Fab humano acoplado a HRP. Una hora más tarde, se lavaron las placas y se añadió sustrato TMB. La reacción se detuvo con HCl 1 M y se midió la densidad óptica a 450 nm con una referencia a 670 nm.
Los resultados se muestran en la Figura 5. Se descubrió que los anticuerpos A1, C2, C4 y H12 eran capaces de reconocer tanto PD-L1 humano como murino (barras negras y rayadas, respectivamente), y no la parte Fc acoplada (barras blancas). El clon A3, que reconoce PD-L1 humano pero no murino, y clon E3 que no reconoce PD-L1 humano ni murino, se incluyeron como controles.
Se descubrió que los clones de anticuerpo A1, C2, C4 y H12 tenían reactividad cruzada para PD-L1 humano y PD-L1 murino. H12 demostró una unión similar a PD-L1 humano y PD-L1 murino.
Ejemplo 3: Bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 in vitro
Se investigó la capacidad de los anticuerpos anti-PD-LI para bloquear la unión de PD-L1 a PD-1 mediante ensayo ELISA usando PD-1 acoplado a Fc humano como antígeno. Se preincubó PD-L1 humano o murino biotinilado en presencia de Fab A1, C4, C2 o H12 antes de la adición a PD-1. La unión de PD-L1 a PD-1 se determinó usando estreptavidina-HRP/sustrato TMB. Los resultados de estas investigaciones se muestran en las Figuras 6 y 7.
Se descubrió que los anticuerpos A1, C2, C4 y H12 expresados como Fab inhibían eficazmente la unión de PD-L1 humano a PD-1 humana de una manera dependiente de la dosis (Figura 6). Se descubrió que los clones A1, C2 y C4 inhibían esta interacción con una eficacia similar, mientras que se descubrió que H12 era ligeramente más eficaz que A1, C2 y C4 (Figura 6).
También se descubrió que los anticuerpos A1, C2, C4 y H12 expresados como Fab podían bloquear la unión de PD-L1 murino a PD-1 murina (Figura 7). Aunque se descubrió que los anticuerpos A1, C2 y C4 rompían la interacción entre PD-L1 murino y PD-1 murina a concentraciones más altas que la concentración necesaria para bloquear la unión de PD-L1 humano a PD-1 humana, se observó que H12 era capaz de neutralizar la unión a concentraciones similares a las necesarias para bloquear la interacción entre PD-L1 humano y PD-1 humana (Figura 7).
También se investigó la inhibición de la unión entre PD-L1 murino y PD-1 murina mediante el anticuerpo H12 expresado en formato IgG1, y se comparó con la inhibición mediante un anticuerpo IgG anti-PD-L1 murino disponible comercialmente [10F.9G2 (BioLegend, Inc, San Diego, CA, Estados Unidos)]. Los resultados se muestran en la Figura 8. Se descubrió que el anticuerpo H12 era significativamente más eficaz para inhibir la interacción entre PD-L1 murino y PD-1 murina a concentraciones de anticuerpo más bajas en comparación con el anticuerpo IgG anti-PD-L1 murino disponible comercialmente.
Ejemplo 4: Restauración de la actividad de las células T agotadas
Se investigó la capacidad del anticuerpo anti-PD-L1 H12 para restaurar la actividad de las células T agotadas.
En resumen, se aislaron células T de un donante sano y se cultivaron durante 7 días con células dendríticas derivadas de monocitos obtenidas de otro donante (50.000 células T/5.000 CD), en una reacción alogénica. Las células T se sometieron a dos ciclos de estimulación para lograr el agotamiento. Las células T agotadas se cultivaron en presencia del anticuerpo H12 o el anticuerpo anti-PD-1 Nivolumab en el segundo ciclo de estimulación durante 5 días, antes de la medición de IFN-y en los sobrenadantes y la cuantificación de la proliferación usando timidina tritiada.
Los resultados se muestran en las Figuras 9 y 10. Se descubrió que el anticuerpo H12 suprime el agotamiento de las células T, restaurando tanto la secreción de IFN-y (Figura 9) como la proliferación (Figura 10) de las células T. La proliferación y la secreción de IFN-y se restauraron a un nivel similar mediante el tratamiento con H12 a 1000 ng/ml como con el tratamiento con Nivolumab a 1000 ng/ml. De manera destacable, la proliferación y la secreción de IFN-y fue mayor para las células T tratadas con anticuerpo H12 que para Nivolumab a concentraciones de 200 ng/ml y 40 ng/ml.
Ejemplo 5: Afinidad del anticuerpo por PD-L1
La afinidad para el anticuerpo H12 por PD-L1 humano y PD-L1 murino se investigó mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR). En resumen, se inmovilizó PD-L1 humano o de ratón acoplado a Fc en un chip sensor compatible con el Bioanalizador Proteon XPR36 (BioRad). Posteriormente, se pasó sobre el chip el extracto de Fab H12, se registró y analizó la asociación/disociación y se calculó la afinidad (Kd).
Los resultados se muestran en las Figuras 11 y 12. Se descubrió que H12 tiene una alta afinidad por el PD-L1 humano de Kd = 0,313 nM, y para PD-L1 murino de Kd = 3,04 nM.
Ejemplo 6: Uso de anticuerpos anti-PD-L1 para tratar tumores: activación ex vivo de linfocitos infiltrantes de tumores
Se obtuvieron muestras de tumores de pulmón del Centro Nacional del Cáncer de Singapur después de su aprobación. Las muestras se disociaron usando un kit de disociación de tumores humanos y un dispositivo de disociación de tejidos.
La mezcla disociada de tumor se cultivó con IgGi anti-PDL-1 clon H12 durante 7 días antes de la medición de IFN-y en el sobrenadante por ELISA. Se utilizaron nivolumab y lambrolizumab como controles positivos en el ensayo (ambos son anticuerpos anti-PD-1) y se utilizó un anticuerpo de isotipo como control negativo.
La Figura 13A muestra la secreción de IFN-y por linfocitos infiltrantes de tumor después de 7 días de cultivo en presencia de los anticuerpos. H12 reactivó la secreción de IFN-y de los linfocitos de una manera dependiente de la dosis.
Se cocultivó otra fracción de la mezcla disociada con células dendríticas alogénicas (CD) para iniciar una reacción mixta de linfocitos (MLR). Las células se cultivaron primero durante 7 días sin anticuerpos y después durante 7 días en presencia de H12 o anticuerpos de control. Después de estos 2 ciclos, se ensayó el IFN-y en los sobrenadantes mediante ELISA.
La Figura 13B muestra la secreción de IFN-y después de la MLR en presencia de los anticuerpos. H12 restauró la capacidad de los linfocitos tumorales para secretar IFN-y de una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 7: Uso de anticuerpos anti-PD-LI para tratar infecciones: activación autóloga de células T en presencia de Influenza
Se extrajo sangre de donantes positivos para Influenza. Se infectaron CD derivadas de monocitos con el virus de la gripe A/PR/8/34 (H1N1). Las CD infectadas se mezclaron con PBMC del mismo donante durante un primer ciclo de cultivo de 5 días. Después, las células se cultivaron durante un segundo ciclo de 5 días en presencia de H12 o anticuerpos de control. Después de estos 2 ciclos, la mayoría de las células en el cultivo son células T específicas de la gripe. Al final de los 2 ciclos de cultivo, se ensayó el IFN-y en los sobrenadantes mediante ELISA. En este ensayo, H12 se probó como un anticuerpo IgGi o como un anticuerpo IgG4.
La Figura 14 muestra el IFN-y secretado después del cultivo de PBMC con Influenza en presencia de los anticuerpos. Tanto H12-IgGi como H12-IgG4 pudieron restaurar la capacidad de los linfocitos para secretar IFN-y tras la estimulación viral de una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 8: Especificidad/reactividad cruzada de H12
Se probó mediante ELISA el reconocimiento de varios miembros de la familia CD28 por H12.
La figura 15 muestra el ELISA con H12 sobre diferentes antígenos: PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG-3, CTL-A4, BLTA, ICOS y CD28 humanos (hu), y PD-L1 de macaco cynomolgus (cy) y ratón (mo). H12 mostró especificidad por la molécula de PD-L1 y reactividad cruzada entre especies.
Ejemplo 9: Eficacia preliminar in vivo del anticuerpo H12
Se probó H12 en 2 modelos de tumores: un modelo de cáncer de colon que usa la línea celular CT26 y un modelo de melanoma que usa la línea celular B16F10.
Se inocularon ratones Balb/C o C57BL/6 en el costado izquierdo con 0,5 x 106 células tumorales CT26 o 0,2 x 106 células tumorales B16F10, respectivamente, el día 0, y se inyectaron por vía intraperitoneal 250 |jg de H12 o IgG1 de isotipo los días 7, 11, 14, 18 y 2 l. Después se analizó el crecimiento del tumor, se midió el tamaño con un calibre y se calculó el volumen de la siguiente manera: V= I2 x L/2 (siendo I = lado más corto y L= lado más largo).
Las Figuras 16A y 16B muestran el crecimiento tumoral después de la inoculación del tumor en ambos modelos. H12 inhibió el crecimiento tumoral en ambos modelos.
Ejemplo 10: Datos con anticuerpo H12 modificado por ingeniería genética
Se modificó por ingeniería genética el clon H12 para revertir su región marco a una región marco similar a la de la línea germinal; la cadena pesada del nuevo clon H12_GL se modificó ligeramente, la cadena ligera permaneció igual que para el clon original H12.
H12_GL se probó en un ensayo de bloqueo. En resumen, se transfectaron células HEK 293 con el plásmido pcDNA3.1 que expresaba la proteína PD-L1 humana usando 293tfectin (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La expresión de PD-L1 se confirmó con PD-L1 anti-ratón o anti-humano comercial conjugado con PECy7 (Biolegend). Se usaron de 50 a 100 nM de PD-1 humana recombinante marcada con ficoeritrina (PE) para unir la PD-L1 expresada en las células transfectadas. Se mezclaron anticuerpos diluidos en serie (H12 anti-PD-L1, H12_GL o control de isotipo) con PD-1-PE humana durante 30 minutos antes de añadirlos a las células transfectadas con PD-L1. Las células se lavaron 3 veces con PBS y todos los datos se recogieron en un BD FACSCanto II (BD Bioscience) y se analizaron en el programa BD FACSDiva (BD Bioscience).
La Figura 17 muestra que H12_GL bloqueaba las interacciones PD-1/PD-L1 con tanta eficacia como H12.
Ejemplo 11: Eficacia in vivo del anticuerpo H12 anti-PD-L1: control del crecimiento tumoral en modelo de ratón Como se demostró que H12 reacciona de forma cruzada con PD-L1 de ratón, se evaluó la capacidad de este anticuerpo para controlar el crecimiento tumoral en un modelo de ratón usando células MC38 de carcinoma de colon.
Se inocularon dos millones de células MC38 en ratones por vía subcutánea el día 0 y se inyectaron por vía intraperitoneal cinco dosis de 200 |jg por animal de IgGi H12 anti-PD-LI o anticuerpo de control de isotipo, a partir del día 8. durante todo el experimento se midió el tamaño del tumor.
En las Figuras 18A y 18B se muestran los resultados de dos experimentos independientes. Los gráficos muestran el crecimiento tumoral (media ± SEM) en el modelo de crecimiento tumoral MC38 en presencia de anticuerpo anti-PD-L1 H12 o control de isotipo negativo. En ambos experimentos, H12 pudo controlar el crecimiento tumoral.
Ejemplo 12: Unión de mAb anti-PD-LI a la diana y comparación con atezolizumab
La unión de los clones H12 y C4 de anti-PD-LI a PD-L1 humano se comparó con la de atezolizumab, un anticuerpo IgG1 anti-PD-L1 disponible comercialmente.
Los anticuerpos se aplicaron como un recubrimiento en una placa y se añadieron varias concentraciones de PD-L1 biotinilado. La unión se midió mediante ELISA. Los anticuerpos se aplicaron como un recubrimiento sobre placas maxisorp a 2 jg/m l en tampón de recubrimiento y se incubaron durante la noche a 4 °C. El día siguiente, las placas se lavaron con tampón de lavado (PBS Tween-20 al 0,05 %) y bloqueante con caseína durante 1 hora, a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron de nuevo usando tampón de lavado. A continuación, se añadieron a las placas diversas concentraciones de PD-L1 humano biotinilado y posteriormente las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, las placas se lavaron de nuevo usando tampón de lavado. Después se añadió estreptavidina-HRP y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente para detectar el PD-L1 humano biotinilado unido a los diferentes anticuerpos. A continuación, las placas se lavaron de nuevo usando tampón de lavado. Por último, se añadió TMB para desarrollar el ELISA; la conversión de TMB por HRP se detuvo usando H-Cl 1 M.
La avidez también se evaluó mediante ELISA, con el antígeno PD-L1 unido a una placa a una sola concentración y adición de varias concentraciones de anticuerpos. Se utilizó un anticuerpo secundario para detectar el anticuerpo anti-PD-L1 complejado con el antígeno. Se recubrieron con neutravidina placas maxisorp a 2 jg/m l en tampón de recubrimiento y se incubaron durante la noche a 4 °C. El día siguiente, las placas se lavaron con tampón de lavado (PBS Tween-20 al 0,05 %) y bloqueante con caseína durante 1 hora, a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron de nuevo usando tampón de lavado. Después se añadió PD-L1 humano biotinilado a las placas a 0,2 jg/m l y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron de nuevo usando tampón de lavado. Después se añadieron los diferentes anticuerpos a diversas concentraciones y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron de nuevo usando tampón de lavado. Después se añadió anti-Fc humano-HRP y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron de nuevo usando tampón de lavado. Por último, se añadió TMB para desarrollar el ELISA; la conversión de TMB por HRP se detuvo usando H-Cl 1 M.
La Figura 19A presenta la unión de los anticuerpos (y el control de isotipo) a PD-L1 (media ± SD de duplicados). H12 muestra una curva de unión para PD-L1 similar a la del atezolizumab. La afinidad de H12 por PD-L1 es mayor que la afinidad de atezolizumab por PD-L1.
La Figura 19B presenta la avidez de los anticuerpos por su diana (media ± SD de duplicados). H12 muestra una gran avidez por PD-L1, similar a la del atezolizumab, mientras que C4 muestra una avidez media. La avidez de H12 por PD-L1 es mayor que la avidez de atezolizumab por PD-L1.
La unión a PD-L1 también se probó investigando la unión a una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 que expresa constitutivamente PD-L1 en la membrana celular. La unión de los anticuerpos se midió mediante citometría de flujo.
La Figura 20 presenta el índice medio de fluorescencia (MFI) para diferentes concentraciones de anticuerpos (media ± SD de duplicados). Los anticuerpos anti-PD-L1 IgG1 H12 e IgG1 C4 se unen eficazmente a las células que expresan PD-L1.
Ejemplo 13: Actividad in vitro de anticuerpos anti-PD-L1: bloqueo de la unión de PD-L1 a PD-1
La capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de PD-L1 a su receptor PD-1 se evaluó mediante ELISA. En resumen, los anticuerpos se preincubaron con PD-L1 y después se añadieron a placas ELISA sobre las que se había aplicado PD-1 como recubrimiento. Después del lavado, se detectó la presencia de PD-L1 unido a PD-1 con un anticuerpo.
La Figura 21 presenta los resultados de experimentos que investigan la unión de PD-L1 a PD-1 en presencia o ausencia de anticuerpos anti-PD-L1 (o control de isotipo) (media ± SD de duplicados). Los anticuerpos anti-PD-L1 H12 y C4 pueden bloquear la unión de PD-L1 a su receptor PD-1. Tanto H12 como C4 pudieron bloquear la interacción entre PD-L1 y PD-1 con mayor eficacia que atezolizumab.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, que es capaz de unirse a PD-L1, que tiene:
al menos una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, y
al menos una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 8 o 35.
2. Los anticuerpos, o los fragmentos de unión a antígeno, de acuerdo con la reivindicación 1, que se unen específicamente a PD-L1 humano y PD-L1 murino.
3. Los anticuerpos, o los fragmentos de unión a antígeno, de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que inhiben la interacción entre PD-1 humana y PD-L1 humano, e inhiben la interacción entre PD-1 murino y PD-L1 murino.
4. Los anticuerpos, o los fragmentos de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo es eficaz para restaurar la función de las células T en las células T que presentan agotamiento de las células T o anergia de las células T.
5. Un anticuerpo biespecífico, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico, que es capaz de unirse a PD-L1, que comprende (i) un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y (ii) un fragmento de unión a antígeno que es capaz de unirse a una proteína diana distinta de PD-L1.
6. El anticuerpo biespecífico, o el fragmento de unión a antígeno biespecífico, de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el fragmento de unión a antígeno que es capaz de unirse a una proteína diana distinta de PD-L1 es capaz de unirse a uno de CD27, CD28, ICOS, CD40, CD122, OX40, 4-1BB, GITR, LAG-3, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, A2AR, VISTA, TIM-3, PD-1, KIR, HER-2, HER-3, EGFR, EpCAM, CD30, CD33, CD38, CD20, CD24, CD90, CD15, CD52, CA-125, CD34, CA-15-3, CA-19-9, CEA, CD99, CD117, CD31, CD44, CD123, CD133, ABCB5 e CD45.
7. Un complejo in vitro que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, unido a PD-L1.
8. Una composición que comprende el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6.
10. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, para su uso en terapia o en un método de tratamiento médico.
11. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento de un cáncer o una enfermedad infecciosa.
12. Un método in vitro para mejorar la función de las células T que comprende administrar un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico, de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, a una célula T disfuncional.
13. Un método in vitro de detección de PD-L1 en una muestra, que comprende poner en contacto una muestra que contiene, o que se sospecha que contiene, PD-L1 con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico, de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, y detectar la formación de un complejo de anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, y PD-L1.
14. Un método in vitro de diagnóstico de una enfermedad o una afección en un sujeto, comprendiendo el método poner en contacto, in vitro, una muestra del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico, de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, y detectar la formación de un complejo de anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, y PD-L1.
15. Un método in vitro/ex vivo para expandir una población de células T, en donde se ponen en contacto células T in vitro o ex vivo con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un anticuerpo biespecífico, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico, de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6.
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