MX2013013587A - Dominios que enlazan suero desinmunizados y su uso para prolongar la vida media en suero. - Google Patents

Dominios que enlazan suero desinmunizados y su uso para prolongar la vida media en suero.

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Abstract

La presente invención se dirige a un polipéptido (por ejemplo, una molécula que enlaza antígeno) que comprende una porción de polipéptido de una proteína que enlaza suero desinmunizada capaz de enlazar a la proteína de suero. La presencia de la proteína que enlaza suero prolonga la vida media en suero del polipéptido, con relación a la vida media en suero del polipéptido si carece de la porción de polipéptido de la proteína que enlaza suero desinmunizada. La invención también pertenece a métodos y usos que emplean tales moléculas.

Description

DOMINIOS QUE ENLAZAN SUERO DESINMUNIZADOS Y SU USO PARA PROLONGAR LA VIDA MEDIA EN SUERO Referencia cruzada con solicitudes relacionadas: Esta Solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente de EE UU con Nro. de Serie 61/488.725 (presentada el 21 de Mayo 2011; pendiente) cuya solicitud se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
Referencia al Listado de Secuencias: Esta Solicitud incluye uno o más Listados de Secuencias conforme a lo dispuesto en el 37 C.F.R. 1,821 et seq., que se divulgan tanto en papel como en medios susceptibles de leerse por computadora, y cuyas divulgaciones en papel y en medios susceptibles de leerse por computadora se incorporan en este documento a modo de referencia en su totalidad.
Antecedentes de la invención: 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un polipéptido (por ejemplo, una molécula que se une a los antígenos) que comprende una porción de polipéptido de una proteína desinmunizada que se une al suero capaz de unirse a dicha proteína del suero. La presencia de la proteína que se une al suero extiende la vida media sérica del polipéptido, con relación a la vida media sérica del polipéptido si carece de la porción de polipéptido de la proteína desinmunizada que se une al suero. La invención se refiere además a métodos y usos que emplean dichas moléculas.
La presente invención se refiere en forma particular a moléculas de diacuerpo, denominadas de otro modo como "reactivos de reorientación de afinidad dual" ("DARTS"), y sus usos en el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos, que incluyen trastornos inmunológicos y cánceres. Las moléculas de diacuerpo de la invención comprenden por lo menos dos cadenas de polipéptidos que se asocian para formar por lo menos dos sitios de unión a epítopes, que pueden reconocer los mismos epítopes u otros diferentes. En forma adicional, los epítopes pueden ser de las mismas o de diferentes moléculas o ubicarse en las mismas o en diferentes células. Las cadenas de polipéptidos individuales de la molécula de diacuerpo pueden unirse en forma covalente a través de enlaces covalentes unidos no peptídicos, tales como, aunque sin limitarse a, unión de disulfuro de residuos de cisteína ubicados dentro de cada cadena de polipéptido. En realizaciones particulares, las moléculas de diacuerpo de la presente invención comprenden en forma adicional una región de Fe, lo cual permite que el grupo funcional símil anticuerpo se diseñe en la molécula. 2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El diseño de diacuerpos covalentes se basa en la construcción de Fv de cadena simple (scFv) (Holliger et al. (1993) "'Diabodies ': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; incorporada en este documento en su totalidad a modo de referencia). En una IgG no modificada, intacta, los dominios VL y VH se ubican en cadenas de polipéptidos separadas, es decir, la cadena liviana y la cadena pesada, respectivamente. La interacción de una cadena liviana de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo y, en particular, la interacción de los dominios VL y VH forma uno de los sitios que se unen al epítope del anticuerpo. En contraste, la construcción de scFv comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en una cadena de polipéptido simple en donde los dominios se separan por medio de una ligadura flexible de suficiente longitud para permitir el auto-montaje de los dos dominios en un sitio de unión al epítope funcional. Donde el auto-montaje del dominio es imposible debido a una ligadura de longitud insuficiente (menos de alrededor de 12 residuos de aminoácidos), dos de las construcciones de scFv interactúan entre sí para formar una molécula bivalente, el VL de una cadena que se asocia con el VH de la otra (revisado en Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, " Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). Más aún, la incorporación de un residuo de cisteína al c-término de la construcción se ha demostrado que permite la unión de disulfuro de las cadenas de polipéptidos, estabilizando el dímero resultante sin interferir con las características de unión de la molécula bivalente (véase por ej., Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, " Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27). Además, donde los dominios VL y VH de especificidad diferente se seleccionan, puede construirse una molécula no solo bivalente, sino también bi-específica.
Los diacuerpos bivalentes tienen un amplio rango de aplicaciones que incluyen terapia y diagnóstico inmunológico. La bivalencia permite la gran flexibilidad en el diseño e ingeniería del diacuerpo en varias aplicaciones, lo que proporciona aumento d ela avidez para antígenos multiméricos, el entrecruzamiento de diferentes antígenos, y orientación dirigida a tipos de células específicas que se basa en la presencia de ambos antígenos de destino. Debido a su mayor valencia, índices bajos de disociación y rápida depuración de la circulación (para diacuerpos de tamaño pequeño, en o por debajo de -50 kDa), las moléculas de diacuerpo conocidas en la técnica también han mostrado uso particular en el campo de la toma de imágenes de tumores (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris, " Protein Eng. 10:1221). Es de particular importancia el entrecruzamiento de diferentes células, por ejemplo el entrecruzamiento de células T citotóxicas a las células tumorales (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells, " Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, " Protein Eng. 9:299-305). Los dominios de unión al epítope del diacuerpo también pueden orientarse a un determinante de superficie de cualquier célula generadora de respuesta inmunológica tales como CD3, CD16, CD32, o CD64, que se expresan en los linfocitos T, células asesinas naturales (NK) u otras células mononucleares. En muchos estudios, la unión del diacuerpo a determinantes de células generadoras de respuesta, por ej., receptores Fcy (FcyR), también se encontró que activan la célula generadora de respuesta (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, " Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusión Proteins, " Cáncer Res. 59:2909-2916). Normalmente, la activación de células generadoras de respuesta se desencadena por la unión de un anticuerpo que se une al antígeno a una célula generadora de respuesta por medio de interacción Fc-FcyR; de este modo, en este aspecto, las moléculas de diacuerpo de la invención pueden exhibir funcionalidad similar a Ig independiente de si comprenden un dominio Fe (por ej., como se evalúa en cualquier ensayo de la función generadora de respuesta conocido en la técnica o ejemplificado en este documento (por ej., ensayo ADCC)). Por medio del entrecruzamiento de células tumorales y generadoras de respuesta, el diacuerpo no sólo lleva la célula generadora de respuesta dentro de la proximidad de las células tumorales sino que conduce a la matanza efectiva del tumor (véase por ej., Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics, " Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197, incorporada en este documento en su totalidad a modo de referencia). 2.1 RECEPTORES DE CÉLULAS GENERADORAS DE RESPUSETA Y SUS FUNCIONES EN EL SISTEMA INMUNOLÓGICO En la función inmunológica tradicional la interacción de los complejos anticuerpo-antígeno con células del sistema inmunológico produce un amplio abanico de respuetas, que oscila desde funciones de generador de respuesta tales como citotoxicidad que depende de los anticuerpos, desgranulación de mastocitos, y fagocitosis a las señales inmuno moduladoras tales como regular la proliferación de linfocitos y secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fe de los anticuerpos o complejos inmunológicos a los receptores de la superficie celular especializados sobre células hematopoyéticas. La diversidad de respuestas celulares desencadenadas por los anticuerpos y los complejos inmunológicos se obtiene de la heterogeneidad estructural de los receptores de Fe. Los receptores de Rf comparten dominios de unión al antígeno estructualmente relacionados que supuestamente median la señalización intracelular.
Los receptores Fcy, miembros de la súper familia del gen de inmunoglobulina de las proteínas, son glicoproteínas de superficie que pueden unirse a la porción Fcy de las moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento sobre la cadena alfa del receptor Fcy. Los receptores Fcy se definen por su especificidad por los sub-tipos de inmunoglobulina. Los receptores Fcy para IgG se denominan como FcyR, para IgE como FCER, y para IgA como Fc R. Las diferentes células accesorias llevan receptores Fcy para anticuerpos de diferente isotipo, y el isotipo del anticuerpo determina qué células accesorias se verán comprometidas en una respueta dada (revisado por Ravetch J.V. et al. (1991) "Fe Receptors," Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. et al. (2001) "Stimulatory And Inhibitory Signáis Originating From The Macrophage Fcgamma Receptors," Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. et al. (2002), "ITAMs Versus ITIMs: Striking A Balance During Cell Regulation, " The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-1681; Ravetch J.V. et al. (2000) "Immune Inhibitory Receptors, " Science, 290: 84-89; Ravetch J.V. et al, (2001) "IgG Fe Receptors," Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. (1994) 'Te Receptors: Rubor Redux, " Cell, 78(4): 553-60). Los diferentes receptores de Fcy, las células que los expresan, y su especificidad por los isotipos se resume en la Tabla 1 (adaptada de Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4,h ed. 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York).
Receptores de Fcy Cada miembro de esta familia es una glicoproteína integral de la membrana, que posee dominios extracelulares relacionados con un conjunto C2 de dominios relacionados con inmunoglobulina, un dominio de abanico de membrana única y un dominio intracitoplasmático de longitud variable. Existen tres FcyRs conocidos, designados FcyRI(CD64), FcyRII(CD32), y FcyRIII(CD16). LOS tres receptores están codificados por genes distintivos; sin embargo, la homología extensiva entre los tres miembros de la familia sugiere que surgen de un progenitor común quizas por duplicación génica.
FcyRII(CD32) Las proteínas FcyRII son glicoproteínas de membrana integral de 40 kDa que sólo se unen a la IgG que forma complejo debido a una baja afinidad por Ig monomérico (106 M"1). Este receptor es el FcyR expresado más ampliamente, presente en todas las células hematopoyéticas, que incluyen monocitos, macrófagos, células B, células NK, neutrófilos, mastocitos, y plaquetas. El FcyRII tiene sólo dos regiones con aspecto de inmunoglobulina en su cadena de unión a la inmunoglobulina y por lo tanto una afinidad mucho más baja por IgG que FcyRI. Existent res genes FcyRII humanos (FcyRII-A, FcyRII-B, FcyRII-C), la totalidad de los cuales se unen a IgG en agregados o complejos inmunológicos.
Distintas diferencias dentro de los dominios citoplasmático deFcyRII-A y FcyRII-B crean dos respuestas heterogéneas fiincionalmente a la ligación del receptor. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular que conduce a la activación celular tales como fagocitosis y estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia señales inhibitorias, por ej., al inhibir la activación de células B.
FcyRIII (CD16) Debido a la heterogeneidad dentro de esta clase, el tamaño de FcyRIII oscila entre 40 y 80 kDa en el ratón y en el hombre. Dos genes humanos codifican dos transcripciones, FcyRIII A, una glicoproteína de membrana integral, y FcyRIIIB, una versión ligada a glicosilfosfatidil-inositol (GPI). Un gen murino codifica un FcyRIII homólogo al abanico de membrana FcyRIIIA humano. El FcyRIII comparte características estructurales con cada uno de los otros dos FcyRs. Como FcyRII, FcyRIII se une a IgG con baja afinidad y contiene los correspondientes dos dominios similares a Ig extracelular. FcyRIIIA se expresa en macrófagos, mastocitos y es el único FcyR en células NK. El FcyRIIIB ligado a GPI se conoce actualmente porque se expresa sólo en neutrófilos humanos.
Señalización a través de FcyRs Ambas señales de activación e inhibición se transducen a través de los FcyRs luego de la ligación. Estas funciones diametralmente opuestas son el resultado de diferencias estructurales entre las diferentes isoformas del receptor. Dos dominios distintos dentro de los dominios de señalización citoplasmática del receptor llamado tirosina inmuno receptora basada en motivos de activación (ITAMs) o tirosina inmuno receptora basada en motivos de inhibición (ITIMS) justifican las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplasmáticas para estas estructuras dicta la evolución de las respuestas celulares mediadas por FcyR. Los complejos FcyR que contienen ITAM incluyen FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, mientras los complejos que contienen ITIM solo incluyen FcyRIIB.
Los neutrófilos humanos expresan el gen FcyRIIA. La agrupación génica de FcyRIIA por medio de complejos inmunológicos o entrecruzamiento específico de anticuerpos sirve para agregar ITAM junto con las quinasas asociadas al receptor que facilitan la fosforilación de ITAM. La fosforilación de ITAM como sitio de anclaje para la quinase Syk, cuya activación produce la activación de los sustratos descendentes (por ej., PI3K). La activación cellular conduce a la liberación de mediadores pro inflamatorios.
El gen FcyRIIB se exprea en linfocitos B; su dominio extracelular es 96% idéntico a FcyRIIA y se une a complejos IgG en un modo no distinguible. La presencia de un ITIM en el dominio citoplasmático de FcyRIIB define esta sub-clase inhibidora de FcyR. Recientemente se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se liga conjuntamente con un FcyR de activación, el ITIM en FcyRIIB se fosforila y atrae el dominio SH2 de la inosital polifosfato 5'-phosphatase (SHIP), que hidroliza los mensajeros de fosfoinositol liberados como consecuencia de la activación de quinase de tirosina FcyR que contiene ITAM, lo que previene, como consecuencia, el flujo hacia adentro de Ca++ extracelular. De este modo el entrecruzamiento de FcyRIIB humedece la respuesta de activación para la ligación de FcyR e inhibe la sensibilidad celular. La activación de las células B, proliferación de las células B y secreción de anticuerpos de este modo se interrumpe. 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en particular a diacuerpos covalentes y/o moléculas de diacuerpo covalentes y a su uso en el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos que incluyen cáncer, trastornos autoinmunes, trastornos alérgicos y enfermedades infecciosas causadas por bacterias, hongos o virus. Con preferencia, el diacuerpo de la presente invención puede unirse a dos epítopes diferentes en dos células diferentes en donde el primer epítope se expresa en un tipo de célula diferente que el segundo epítope, de manera tal que el diacuerpo pueda unir las dos células.
En detalle, la invención proporciona un polipéptido (y en esencia una molécula que se une a los antígenos) que comprende una cadena de polipéptido que comprende una porción de una proteína desinmunizada que se une al suero capaz de unirse a dicha proteína del suero; en donde dicha porción de la proteína que se une al suero extiende la vida media sérica de dicho polipéptido, con relación a la vida media sérica de dicho polipéptido si carece de dicha porción de dicha proteína desinmunizada que se une al suero.
La invención se refiere además a los usos de (o métodos que implican el uso de) dicha porción de polipéptidos de una proteína desinmunizada que se une al suero para extender la vida media sérica de un polipéptido que se une en forma covalente al anterior, la extensión de la vida media sérica es con relación a la vida media sérica de la molécula que se une al antígeno si se carece de la proteína que se une a la albúmina.
La invención en forma adicional se refiere a la realización del polipéptido o los usos mencionados con anterioridad, en donde la cadena de polipéptido comprende una porción adicional de una proteína desinmunizada que se une al suero, en donde las porciones de la proteína desinmunizada que se une al suero son ambas capaces de unirse a la proteína del suero.
La invención se refiere en particular a la realización de los polipéptidos o los usos mencionados con anterioridad en donde la porción del polipéptido de la proteína desinmunizada que se une al suero es un dominio que se une a la albúmina (ABD) de una Proteína G de Estreptococo, o su variante que se une a la albúmina, y en especial en donde el dominio que se une a la albúmina (ABD) de la Proteína G de Estreptococo es un dominio que se une a la albúmina 3 (ABD3) de la cepa de la Proteína G de Estreptococo G148.
La invención se refiere en particular a la realización de los polipéptidos o los usos mencionados con anterioridad en donde el dominio que se une a la albúmina comprende: (A) una variación de valina a alanina en la posición 71 , en la posición 74, o en la posición 79; (B) una variación de leucina a alanina en la posición 64, variación de isoleucina a alanina en la posición 65, y variación de valina a alanina en la posición 71 ; o (C) una variación de asparagina a ácido aspártico en la posición 66, una sustitución de treonina a serina en la posición 70, y una variación de valina a alanina en la posición 71.
La invención se refiere en forma adicional a la realización de los polipéptidos o los usos mencionados con anterioridad en donde el dominio que se une a la albúmina tiene la secuencia de la SEC ID NRO.: 304, SEC ID NRO.: 323, SEC ID NRO.: 324, SEC ID NRO.: 325, SEC ID NRO.: 326, SEC ID NRO.: 327, SEC ID NRO.: 328, o SEC ID NRO.: 329.
La invención se refiere en forma adicional a la realización de las moléculas que se unen al antígeno o los usos descritos con anterioridad en donde la molécula que se une al antígeno es una molécula que se une a los antígenos. La invención se refiere en forma adicional a la realización en la cual la molécula que se une al antígeno es un diacuerpo compuesto por lo menos por una primera y una segunda cadena de polipéptidos las cuales interactúan entre sí para formar dos sitios que se unen al antígeno, en donde por lo menos una de las cadenas de polipéptidos comprende la segunda porción de polipéptidos que comprende la porción de la proteína desinmunizada que se une al suero que es capaz de unirse a la proteína sérica. La invención se refiere en forma adicional a la realizacións de dichos diacuerpos en donde tanto la primera como la segunda cadenas de polipéptidos comprenden segundas porciones de polipéptidos que comprenden la porción de la proteína desinmunizada que se une al suero capaz de unirse a la proteína sérica y/o en donde la primera y la segunda cadenas de polipéptidos se unen en forma covalente entre sí.
La invención se refiere en particular a la realización de los diacuerpos o los usos mencionados con anterioridad, en donde el diacuerpo binds to: (A) el receptor del Grupo 2D Asesino Natural o el receptor de células T (TCR); y (B) un antígeno asociado con el tumor La invención se refiere en particular a la realización de la totalidad de los diacuerpos o los usos mencionados con anterioridad, en donde el antígeno es un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de ovarios, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de cáncer de cuello de útero, un antígeno de cáncer de páncreas, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de vesícula, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer de testículos, un antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una enfermedad de las células B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no de Hodgkins, o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.
En una realización, la presente invención se refiere a un diacuerpo biespecífico covalente, cuyo diacuerpo comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítope, y, en forma opcional, (iii) un tercer dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1), y, en forma opcional, (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están ligadas en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une al primer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítope.
En otra realización, la presente invención se refiere a un diacuerpo biespecífico covalente, cuyo diacuerpo comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítope y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o porción de los anteriores, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl), cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el tercero y cuarto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están ligadas en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VHl) que se une al primer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítope.
En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a una molécula de diacuerpo, cuya molécula comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítope y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o porción de los anteriores, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl), y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están ligadas en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une al primer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítope.
En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a un diacuerpo biespecífico covalente, cuyo diacuerpo es un dímero de moléculas de diacuerpo, cada molécula de diacuerpo que comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítope y (üi) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o porción de los anteriores, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1), y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido de cada molécula de diacuerpo están ligados en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une al primer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítope.
Incluso, en otras realizaciones, la presente invención se refiere a un diacuerpo tetra específico covalente, cuyo diacuerpo es un dímero de moléculas de diacuerpo, la primera molécula de diacuerpo que comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítope y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o porción de los anteriores, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1), y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están ligadas en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une al primer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítope; y the second diabody molecule que comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un tercer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un cuarto epítope y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o porción de los anteriores, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la cuarta inmunoglobulina (VL4), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3), y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están ligadas en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL3) (VH3) que se une al tercer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL4) (VH4) que se une al cuarto epítope.
En ciertos aspectos de la invención el primer epítope, segundo epítope, y donde corresponda, tercer epítope y cuarto epítope pueden ser iguales. En otros aspectos, el primer epítope, segundo epítope, y donde corresponda, tercer epítope y cuarto epítope pueden cada uno ser diferentes entre sí. En ciertos aspectos de la invención que comprende un tercer dominio que se une al epítope, el primer epítope y tercer epítope pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la invención que comprende un cuarto dominio que se une al epítope, el primer epítope y cuarto epítope pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la invención que comprende un tercer dominio que se une al epítope, el segundo epítope y tercer epítope pueden ser iguales. En ciertos aspectos de la invención que comprende un cuarto dominio que se une al epítope, el segundo epítope y cuarto epítope pueden ser iguales. In preferred aspects de la invención, el primer epítope y segundo epítope son diferentes. Incluso en otras realizaciones de la invención que comprende un tercer dominio que se une al epítope y un cuarto dominio que se une al epítope, el tercer epítope y cuarto epítope pueden ser diferentes. Se debe entender que cualquier combinación de los anteriores se abarca en la presente invención.
En particular aspects de la invención, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o molécula del diacuerpo pueden derivar de la misma inmunoglobulina. En otro aspecto, el segundo domino y el cuarto dominio del diacuerpo o molécula del diacuerpo pueden derivar de la misma inmunoglobulina. Incluso en otro aspecto, el primer dominio y el quinto dominio del diacuerpo o molécula del diacuerpo pueden derivar de una inmunoglobulina diferente. Incluso en otro aspecto, el segundo domino y el cuarto dominio del diacuerpo o molécula del diacuerpo pueden derivar de una inmunoglobulina diferente. Se debe entender que cualquier combinación de los anteriores se abarca en la presente invención.
En ciertos aspectos de la invención, la ligadura covalente entre la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido del diacuerpo o molécula del diacuerpo can be por medio de una unión de disulfuro entre por lo menos un residuo de cisteína sobre la primera cadena de polipéptido y por lo menos un residuo de cisteína sobre la segunda cadena de polipéptido. Los residuos de cisteína sobre la primera y la segunda cadenas de polipéptidos que son responsables de la unión de disulfuros pueden encontrarse en cualquier lugar sobre la cadena de polipéptido que incluyen dentro del primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto dóminos. En una realización específica el residuo de cisteína sobre la primera cadena de polipéptido se encuentra en el primer dominio y el residuo de cisteína sobre la segunda cadena de polipéptido se encuentra en el quinto dominio. El primero, segundo, cuarto y quinto dóminos corresponden a las regiones variables responsables de la unión. En realizaciones preferidas, los residuos de cisteína responsables de la unión de disulfuros entre la primera y la segunda cadena de polipéptidos se ubican dentro del tercero y sexto dominios, respectivamente. En un aspecto particular de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende los 6 aminoácidos de extremo terminal Ces de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23), que pueden codificarse por medio de la secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 17). En otro aspecto de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende los 6 aminoácidos de extremo terminal Ces de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23), que pueden codificarse por medio de la secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 17). In still another aspect de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos VEP SC (SEC ID NRO.: 77), derivada del dominio de bisagra de una IgG humana, y que pueden codificarse por medio de la secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 78). En otro aspecto de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEC ID NRO.: 77), derivada del dominio de bisagra de una IgG humana, y que pueden codificarse por medio de la secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 78). En ciertos aspectos de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende los 6 aminoácidos de extremo terminal Ces de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23); y el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEC ID NRO.: 77). En otros aspectos de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende los 6 aminoácidos de extremo terminal Ces de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23); y el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEC ID NRO.: 77). Incluso en otras realizaciones de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende los 6 aminoácidos de extremo terminal Ces de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23); y el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende a hinge domain. En otros aspectos de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende los 6 aminoácidos de extremo terminal Ces de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23); y el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende el dominio de bisagra. Incluso en otras realizaciones de esta realización, el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende los 6 aminoácidos de extremo terminal Ces de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23); y el sexto dominio de la primera cadena de polipéptido comprende un dominio Fe, o porción de los anteriores. Incluso en otros aspectos de esta realización, el sexto dominio de la segunda cadena de polipéptido comprende los 6 aminoácidos de extremo terminal Ces de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23); y el tercer dominio de la primera cadena de polipéptido comprende un dominio Fe, o porción de los anteriores.
En otras realizaciones, los residuos de cisteína en el primero o segundo polipéptido que son responsables de la unión de disulfuros pueden ubicarse fuera del primero, segundo o tercer dominio sobre la primera cadena de polipéptido y fuera del cuarto, quinto y sexto dominio sobre la segunda cadena de polipéptido. En particular, el residuo de cisteína sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el primer dominio o puede ser de extremo terminal C para el primer dominio. El residuo de cisteína sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el segundo domino o can be de extremo terminal C to el segundo domino. El residuo de cisteína sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el tercer dominio o puede ser de extremo terminal C para el tercer dominio. Además, el residuo de cisteína sobre la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el cuarto dominio o puede ser de extremo terminal C para el cuarto dominio. El residuo de cisteína sobre la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el quinto dominio o puede ser de extremo terminal C para el quinto dominio. De acuerdo con lo anterior, el residuo de cisteína sobre la segunda cadena de polipéptido puede ser de extremo terminal C para el sexto dominio o puede ser N-terminal para el sexto dominio. En un aspecto particular, la unión de disulfuro puede ser entre por lo menos dos residuos de cisteína sobre la primera cadena de polipéptido y por lo menos dos residuos de cisteína sobre la segunda cadena de polipéptido. En un aspecto particular, en donde el tercer dominio y sexto dominio no comprenden un dominio Fe, o porción de los anteriores, el residuo de cisteína puede estar en el C-término de la primera cadena de polipéptido y en el C-término de la segunda cadena de polipéptido. Se debe entender que cualquier combinación de los anteriores se abarca en la presente invención.
En realizaciones específicas de la invención como se describió con anterioridad, el diacuerpo covalente de la invención abarca dímeros de moléculas de diacuerpo, en donde cada molécula de diacuerpo comprende a first y la segunda cadena de polipéptido. En ciertos aspectos de esta realización las moléculas de diacuerpo pueden estar ligadas en forma covalente para formar el dímero, con la salvedad de que la ligadura covalente no es una unión peptídica. En aspectos preferidos de esta realización, la ligadura covalente es una unión de disulfuro entre por lo menos un residuo de cisteína sobre la primera cadena de polipéptido de cada una de las moléculas de diacuerpo del dímero. Incluso en otros aspectos preferidos de esta invención, la ligadura covalente es una unión de disulfiiro entre por lo menos un residuo de cisteína sobre la primera cadena de polipéptido de cada una de las moléculas de diacuerpo forming el dímero, en donde dicho por lo menos un residuo de cisteína se ubica en el tercer dominio de cada primera cadena de polipéptido.
En ciertos aspectos de la invención, el primer dominio sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el segundo domino o puede ser de extremo terminal C para el segundo domino. El primer dominio sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el tercer dominio o puede ser de extremo terminal C para el tercer dominio. El segundo domino sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el primer dominio o puede ser de extremo terminal C para el primer dominio. Además, el segundo domino sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el tercer dominio o puede ser de extremo terminal C para el tercer dominio. De acuerdo con lo anterior, el tercer dominio sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el primer dominio o puede ser de extremo terminal C para el primer dominio. El tercer dominio sobre la primera cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el segundo domino o puede ser de extremo terminal C para el segundo domino. Con respecto a la segunda cadena de polipéptido, el cuarto dominio puede ser N-terminal para el quinto dominio o puede ser de extremo terminal C para el quinto dominio. El cuarto dominio puede ser N-terminal para el sexto dominio o puede ser de extremo terminal C para el sexto dominio. El quinto dominio sobre la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el cuarto dominio o puede ser de extremo terminal C para el cuarto dominio. El quinto dominio sobre la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el sexto dominio o puede ser de extremo terminal C para el sexto dominio. De acuerdo con lo anterior el sexto dominio sobre la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el cuarto dominio o puede ser de extremo terminal C para el cuarto dominio. El sexto dominio sobre la segunda cadena de polipéptido puede ser N-terminal para el quinto dominio o puede ser de extremo terminal C para el quinto dominio. Se debe entender que cualquier combinación de los anteriores se abarca en la presente invención.
En ciertas realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio puede ubicarse en el extremo terminal C al tercer dominio sobre la primera cadena de polipéptido; o el primer dominio y el segundo dominio pueden ubicarse en el extremo terminal N al tercer dominio sobre la primera cadena de polipéptido. Con respecto a la segunda cadena de polipéptido, el cuarto dominio y quinto dominio puede ubicarse en el extremo terminal C al sexto dominio, o el cuarto dominio y quinto dominio pueden ubicarse en el extremo terminal N al sexto dominio. En ciertos aspectos de esta realización, la presente invención se refiere a un diacuerpo biespecífico covalente, cuyo diacuerpo es un dímero de moléculas de diacuerpo, cada molécula de diacuerpo que comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítope y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o porción de los anteriores, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope y en donde el tercer dominio se ubica en el extremo terminal N tanto para el primero como el segundo dominio; y cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl), y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido de cada molécula de diacuerpo están ligados en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VHl) que se une al primer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio de cada molécula de diacuerpo se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítope.
Incluso en otra realización, la presente invención se refiere a un diacuerpo tetra específico covalente, cuyo diacuerpo es un dímero de moléculas de diacuerpo, la primera molécula de diacuerpo que comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una primera inmunoglobulina (VL1) específica para un primer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica para un segundo epítope y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o porción de los anteriores, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope y en donde el tercer dominio se ubica en el extremo terminal N tanto para el primero como el segundo dominio; y cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la segunda inmunoglobulina (VL2), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VHl), y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están ligadas en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL1) (VH1) que se une al primer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL2) (VH2) que se une al segundo epítope; y the second molécula del diacuerpo comprende una primera o una segunda cadena de polipéptidos, cuya primera cadena de polipéptidos comprende (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de una tercera inmunoglobulina (VL3) específica para un tercer epítope, (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una cuarta inmunoglobulina (VH4) específica para un cuarto epítope y (iii) un tercer dominio que comprende un dominio Fe o porción de los anteriores, cuyo primero y segundo dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el primero y segundo dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope y en donde el tercer dominio se ubica en el extremo terminal N tanto para el primero como el segundo dominio; y cuya segunda cadena de polipéptidos comprende (i) un cuarto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena liviana de la cuarta inmunoglobulina (VL4), (ii) un quinto dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la tercera inmunoglobulina (VH3), y (iii) un sexto dominio que comprende por lo menos un residuo de cisteína, cuyos cuarto y quinto dominios están ligados en forma covalente de manera tal que el cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio que se une al epítope; y en donde la primera cadena de polipéptido y la segunda cadena de polipéptido están ligadas en forma covalente, con la salvedad de que el enlace covalente no es una unión peptídica; en donde el primer dominio y el quinto dominio se asocian para formar un primer sitio de unión (VL3) (VH3) que se une al tercer epítope; en donde el segundo domino y el cuarto dominio se asocian para formar un segundo sitio de unión (VL4) (VH4) que se une al cuarto epítope.
Como se discutió con anterioridad, los dominios on las cadenas de polipéptidos individuales están ligados en forma covalente. En aspectos específicos, el enlace covalente entre el primero y el segundo dominio, primero y tercer dominio, segundo y tercer dominio, cuarto y quinto dominio, cuarto y sexto dominio, y/o quinto y sexto dominio pueden ser una unión de péptidos. En particular, el primero y segundo dominios, y el cuarto y quinto dominios pueden separarse mediante el tercer dominio y sexto dominio, respectivamente, o por residuos adicionales de aminoácidos, en la medida que el primero y segundo, y cuarto y quinto dominios no se asocian para formar un sitio de unión. La cantidad de residuos de aminoácidos puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 residuos de aminoácidos. En un aspecto preferido, la cantidad de residuos de aminoácidos entre los dominios es 8.
En ciertos aspectos de la invención, los dominios de la primera y segunda cadena de polipéptidos que comprende un dominio Fe, es decir, en forma opcional, el tercero y sexto dominios, respectivamente, pueden comprender en forma adicional un dominio de bisagra de manera tal que el dominio comprende una región de bisagra-Fe. En realizaciones alternativas, la primera cadena de polipéptido o la segunda cadena de polipéptido pueden comprender un dominio de bisagra sin comprender además un dominio Fe. Las cadenas pesadas, cadenas livianas, regiones de bisagra, dominios Fe, y/o dominiso Fe de bisagra para usar en la invención pueden derivar de cualquier tipo de inmunoglobulina que incluyen IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En un aspecto preferido, el tipo de inmunoglobulina es IgG, o cualquier sub-tipo de los anteriores, es decir, IgGi, IgG2, IgG3 o IgG . En otros aspectos, la inmunoglobulina de la cual derivan las cadenas liviana y pesada es humanizada o quimerizada.
Además, el primer epítope y segundo epítope, y, donde corresponda, tercer epítope y cuarto epítope, al cual el diacuerpo o molécula del diacuerpo se une pueden ser diferentes epitopes del mismo antígeno o pueden ser diferentes epitopes de diferentes antígenos. Los antígenos pueden ser cualquier molécula a la cual puede generarse un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de la superficie celular, marcadores autoinmunes, proteínas virales, fármacos, etc. En aspectos particulares, por lo menos un sitio de unión al epítope del diacuerpo es específico para un antígeno en una célula particular, tales como una célula B, una célula T, una célula fagocítica, una célula asesina natural (NK) o una célula dendrítica.
En ciertos aspectos de la realización preferida, por lo menos un sitio de unión al epítope del diacuerpo o molécula del diacuerpo es específico para un receptor de Fe, cuyo receptor de Fe puede ser un receptor de Fe de activación o un receptor de Fe de inhibición. En aspectos particulares, el receptor de Fe es un receptor de Fcy, y el receptor de Fcy es un receptor FcyRI, FcyRII o FcyRIII. En aspectos más preferidos, el receptor de FcyRIII es el receptor de FcyRIIIA (CD16A) o el receptor de FcyRIIIB (CD16B), y, con mayor preferencia, el receptor de FcyRIII es el receptor de FcyRIIIA (CD16A). En otro aspecto preferido, el receptor de FcyRII es el receptor de FcyRIIA (CD32A) o el receptor de FcyRIIB (CD32B), y con mayor preferencia el receptor de FcyRIIB (CD32B). En un aspecto de particular preferencia, un sitio de unión del diacuerpo es específico para CD32B y el otro sitio de unión es específico para CD16A. En una realización específica de la invención, por lo menos un sitio de unión al epítope del diacuerpo o molécula del diacuerpo es específico para an activating Fe receptor y por lo menos un sitio distinto es específico para un receptor de Fe de inhibición. En ciertos aspectos de esta realización el receptor de Fe de activación es CD32A y el receptor de Fe de inhibición es CD32B. En otros aspectos de esta realización el receptor de Fe de activación es BCR y el receptor de Fe de inhibición es CD32B. Incluso en otros aspectos de esta realización, el receptor de Fe de activación is IgERI y el receptor de Fe de inhibición es CD32B.
En casos en los cuales un sitio de unión al epítope es específico para CD16A, los dominios VL y VH pueden ser iguales que o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón 3G8, cuya secuencia se ha clonado y se indica en este documento. En otros casos en los cuales un sitio de unión al epítope es específico para CD32A, los dominios VL y VH pueden ser iguales que o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón IV,3. Incluso en otros casos en los que un sitio de unión al epítope es específico para CD32B, los dominios VL y VH pueden ser iguales que o similares a los dominios VL y VH del anticuerpo de ratón 2B6, cuya secuencia se ha clonado y se indica en este documento. Se debe entender que cualquiera de los dominios VL o VH de los anticuerpos 3G8, 2B6 e IV.3 pueden usarse en cualquier combinación. La presente invención también se refiere a un diacuerpo biespecífico o molécula del diacuerpo en donde el primer epítope es específico para CD32B, y el segundo epítope es específico para CD16A.
En otros aspectos, un sitio que se une al epítope puede ser específico para un antígeno patogénico. Como se usa en este documento, un antígeno patogénico es un antígeno involucrado en una enfermedad patogénica específica, que incluyen cáncer, infección o enfermedad autoinmune. De este modo, el antígeno patogénico puede ser un antígeno de tumor, un antígeno bacteriano, un antígeno viral, o un antígeno autoinmune. Los antígenos patogénicos ejemplificativos incluyen, aunque no se limitan a, lipopolisacárido, antígenos virales seleccionados del grupo que consiste en antígenos virales del virus de inmunodeficiencia humana, Adenovirus, Virus Sincitial Respiratorio, Virus del Nilo Occidental (por ej., antígenos E16 y/o E53) y virus de la hepatitis, ácidos nucleicos (ADN y ARN) y colágeno. Con preferencia, el antígeno patogénico es un antígeno neutralizante. En un aspecto preferido, donde un sitio de unión al epítope es específico para CD16A o CD32A, el otro sitio que se une al epítope es específico para un antígeno patogénico sin incluir los antígenos autoinmunes. Incluso en otro aspecto preferido, donde un sitio de unión al epítope es específico para CD32B, el otro sitio que se une al epítope es específico para cualquier antígeno patogénico. En realizaciones específicas, el diacuerpo molecule de la invención se une a dos antígenos diferentes en la misma célula, por ejemplo, un sitio que se une al antígeno es específico para un receptor de Fe de activación mientras que el otro es específico para un receptor de Fe de inhibición. En otras realizaciones, la molécula de diacuerpo se une dos epítopes neutralizantes virales distintos, por ejemplo, aunque sin limitarse a, El 6 y E53 del Virus del Nilo Occidental.
Incluso en otra realización de la presente invención, los diacuerpos de la invención pueden usarse para tratar una variedad de enfermedades y trastornos. De acuerdo con lo anterior, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de un diacuerpo covalente o molécula del diacuerpo de la invención en la cual por lo menos un sitio de unión es específico para un antígeno patogénico, tales como un antígeno expresado sobre la superficie de una célula cancerosa o sobre la superficie de una bacteria o virión y por lo menos un sitio de unión distinto es específico para un receptor de Ve, por ej., CD16A.
Incluso en otra realización, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de un diacuerpo o molécula del diacuerpo de la invención, en la cual por lo menos un sitio de unión es específico para CD32B y por lo menos un sitio de unión distinto es específico para CD16A.
Incluso en otra realización, la invención se refiere a un método para inducir la tolerancia inmunológica a un antígeno patogénico que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de un diacuerpo covalente o molécula del diacuerpo dovalente de la invención, en la cual por lo menos un sitio de unión es específico para CD32B y por lo menos un sitio de unión distinto es específico para dicho antígeno patogénico. En aspectos de esta realización, el antígeno patogénico puede ser un alérgeno u otra molécula para la cual se desea tolerancia inmunológica, tales como una proteína expresada sobre tejido transplantado.
Incluso en otra realización, la presente invención se refiere a un método para destoxificación que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad efectiva de un diacuerpo covalente o molécula del diacuerpo de la invención, en la cual por lo menos un sitio de unión es específico para un marcador de la superficie celular y por lo menos un sitio de unión distinto es específico para una toxina. En aspectos particulares, el diacuerpo de la invención administrado es aquel donde un sitio de unión es específico para un marcador de la superficie celular tales como un Fe y el otro sitio de unión es específico para una toxina bacteriana o para un fármaco. En un aspecto, el marcador de la superficie celular no se encuentra en los glóbulos rojos.
La presente invención en forma adicional se refiere a un método para aumentar la vida media de una molécula que comprende un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo, en donde el método comprende ligar (por ej., directa o indirectamente por medio de conjugación, o por unión, etc.), dos o más dominios que se unen a la albúmina a la molécula. La invención se refiere en particular a la realización de dicho método en donde la ligación de dos o más dominios que se unen a la albúmina comprende ligar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios que se unen a la albúmina a la molécula, y más particularmente se refiere a la realización de dicho método en donde la ligación de dos o más dominios que se unen a la albúmina comprende ligar 2 dominios que se unen a la albúmina a la molécula. Dichos dos o más dominios que se unen a la albúmina pueden ser iguales o diferentes y pueden seleccionarse en forma independiente con preferencia del grupo que consiste en la secuencia de la SEC ID NRO.: 304, SEC ID NRO.: 323, SEC ID NRO.: 324, SEC ID NRO.: 325, SEC ID NRO.: 326, SEC ID NRO.: 327, SEC ID NRO.: 328, o SEC ID NRO.: 329. La invención se refiere en particular a la realización de dichos métodos en donde los dos o más dominios que se unen a la albúmina son iguales o en donde 2 de los dominios que se unen a la albúmina son iguales. La invención se refiere en particular a la realización de dicho método en donde the molecule que comprende un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo es un diacuerpo. 3.1 DEFINICIONES Salvo que se defina de otro modo, todos los terminus de arte, anotaciones y otros términos y terminología científica usados aquí pretenden tener los significados comúnmente entendidos por aquellas personas con experiencia en la materia a la cual pertenece esta invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente comprendidos se definen en este documento para generar claridad y/o para una amplia referencia, y la inclusión de dichas definiciones en este documento no necesariamente deben construirse para representar una diferencia sustancial por sobre lo que generalmente se entiende en la materia. La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos, e inmunología, que se encuentran dentro de la habilidad en la materia. Dichas técnicas se explican en detalle en la bibliografía, tales como, Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, que incluyen supplements through 2001); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, que incluyen supplements through 2001); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and ussel, 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Métodos of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, y N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lañe Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; y Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000).
Como se usa en este documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos policlonales, anticuerpos camELISAdos, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs biespecíficos con unión de disulfuro (sdFv), intracuerpos, y anticuerpos anti-idiotípicos (que incluyen, por ej., anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id a anticuerpos de la invención), y los fragmentos que se unen a los epítopes de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen las moléculas de inmunoglobulina y los fragmentos inmunológicamente activos de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio que se une al antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY), class (por ej., IgGh IgG2, IgG3, IgG4, IgAi and IgA2) o subclase.
Como se usa en este documento, los términos "se une en forma inmunoespecífica," "reconoce en forma inmunoespecífíca," "se une en forma específica," "reconoce en forma específica" y términos análogos se refieren a moléculas que se unen en forma específica a un antígeno (por ej., epítope o complejo inmune) y no se unen en forma específica a otra molécula. Una molécula que se une en forma específica a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad según se determina por, or ej., inmunoensayos, BIAcore, o otros ensayos conocidos en la materia. Con preferencia, las moléculas que se unen en forma específica a un antígeno no reaccionan en forma cruzada con otras proteínas. Las moléculas que se unen en forma específica a un antígeno pueden identificarse, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore, u otras técnicas conocidas para aquellas personas con experiencia en la materia.
Como se usa en este documento, "complejo inmune" se refiere a una estructura que se forma cuando por lo menos una molécula de destino y por lo menos un polipéptido que contiene región Fcy heteróloga se unen entre sí, formando un complejo de peso molecular más grande. Algunos ejemplos de complejos inmunes son complejos de antígeno-anticuerpo que pueden ser en forma indistinta solubles o en partículas (por ej., un complejo antígeno/anticuerpo sobre una superficie celular.).
Como se usa en este documento, los términos "cadena pesada," "cadena liviana," "región variable," "región de marco," "dominio constante," y similares, tienen su significado normal en la materia de la inmunología y se refieren a dominios en inmunoglobulinas que ocurren naturalmente y los dominios correspondientes de proteínas de unión sintética (por ej., recombinante) (por ej., anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos quiméricos, etc.). La unidad estructural básica de inmunoglobulinas que ocurren naturalmente (por ej., IgG) es un tetrámero que tiene dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas, usualmente expresadas como una glicoproteína de alrededor de 150.000 Da. La porción amino terminal ("N") de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 hasta 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de los antígenos. La porción carboxi-terminal ("C") de cada cadena define una región constante, con cadenas livianas que tienen una constante de dominio simple y cadenas pesadas usualmente tienen tres constantes de dominio y región de bisagra. De este modo, la estructura de las cadenas livianas de una molécula de IgG es n-VL-CL-C y la estructura de cadenas pesadas de IgG es n-VH-CHi-H-CH2-CH3-c (donde H es la región de bisagra). Las regiones variables de una molécula de IgG consisten en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), que contienen los residuos en contacto con antígeno y segmentos que no son CDR, denominados como segmentos de marco, que en general mantienen la estructura y determinan el posicionamiento de los bucles de CDR (aunque ciertos residuos de marco también pueden contactar el antígeno). De este modo, los dominios VL y VH tienen la estructura n-FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c. .
Cuando se hace referencia a la unión de proteínas o anticuerpos (como se define en este documento en sentido amplio), la asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas livianas y pesadas maduras de inmunoglobulinas se designan por medio de la posición de un aminoácido en la cadena. Kabat describió numerosas secuencias de aminoácidos para anticuerpos, identificó una secuencia de aminoácidos de consenso para cada sub-grupo, y asignó un número de residuo a cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat es extendible a anticuerpos no incluidos en su compendio por medio de la alineación del anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de consenso en Kabat con referencia a aminoácidos conservados. Este método para la asignación de números de residuos se ha tornado estándar en el campo e identifica ampliamente aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos, que incluyen variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido en la posición 50 de una cadena liviana humana de anticuerpo ocupa la posición equivalente a un aminoácido en la posición 50 de una cadena liviana de anticuerpo de ratón.
Como se usa en este documento, el término "cadena pesada" se usa para definir la cadena pesada de un anticuerpo de IgG. En una IgG nativa, intacta, la cadena pesada comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, hinge, CH2 y CH3. En toda la presente solicitud, la numeración de los residuos en una cadena pesada de IgG es la del índice EU como en Kabat et al, Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991), incorporadas expresamente en este documento a modo de referencias. El "índice de EU como Kabat" se refiere a la numeración del anticuerpo EU de IgGl humano. Algunos ejemplos de las secuencias de aminoácidos que contienen la bisagra de IgGl humana, dominios CH2 y CH3 se muestran en las FIGS. 1A y IB como se describe, más abajo. Las FIGS. 1A y IB establecen además secuencias de aminoácidos de la bisagra, dominios CH2 y CH3 de las cadenas pesadas de IgG2, IgG3 y IgG4. Las secuencias de aminoácidos de los isotipos IgG2, IgG3 y IgG4 están alineados con la secuencia de IgGl por colocación del primero y el último residuos de cisteína de las respectivas regiones de bisagra, que forman las uniones entre cadenas pesadas S-S, en las mismas posiciones. Para la región de bisagra de IgG2 e IgG3, no todos los residuos esán numerados por el índice EU.
La "región de bisagra" o "dominio de bisagra" se define en general como que se estira de Glu216 a Pro230 de IgGl humana. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de la región de bisagra de IgGl humana se muestra en la FIG. 1A (residuos de aminoácidos en la FIG. 1A se numeran de acuerdo con el sistema Kabat). Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia IgGl colocando the primero y último residuos de cisteína formando una unión S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones como se muestra en la FIG. 1A.
Como se usa en este documento, el término "región de Fe," "dominio de Fe" o términos análogos se usan para definir una región de extremo terminal C de una cadena pesada de IgG. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos que contiene la IgGl humana se muestra en la FIG. IB. Aunque los límites pueden variar levemente, según la numeración de acuerdo con el sistema Kabat, el dominio Fe se extiende desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 447 (los residuos de aminoácidos en la FIG. IB se numeran de acuerdo con el sistema Kabat). La FIG. IB también proporciona algunos ejemplos de las secuencias de aminoácidos de las Regiones Fe de los isotipos IgG IgG2, IgG3, y IgG4.
La región Fe de una IgG comprende dos dominio constantes, CH2 y CH3. El dominio CH2 de una región Fe de IgG humana usualmente se extiende desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 341 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (FIG. IB). El dominio CH3 de una región Fe de IgG humana usualmente se extiende desde los aminoácidos 342 hasta 447 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (FIG. IB). El dominio CH2 de una región Fe de IgG humana (también denominado como dominio "Cy2") es único en el sentido que no se empareja de cerca con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificadas ligadas por N se interponen entre los dos dominios CH2 de una IgG nativa intacta.
Como se usa en este documento los términos "proteína que se une a FcyR," "anticuerpo FcyR," y "anticuerpo anti-FcyR", se usan en forma indistinta y se refieren a una variedad de proteínas con aspecto de inmunoglobulina o derivadas de inmunoglobulina. Las "proteínas que se unen a FcyR" se unen a FcyR por medio de una interacción con dominios VL y/o VH (como distinción de la unión mediada por Fcy). Algunos ejemplos de las proteínas que se unen a FcyR incluyen anticuerpos humanizados y quiméricos, policlonales, completamente humanos (por ej., que comprenden 2 cadenas pesadas y 2 cadenas livianas), fragmentos de los anteriores {por ej., Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv), anticuerpos bifuncionales o multifuncionales (véase, por ej., Lanzavecchia et al. (1987) "The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes, " Eur. J. Immunol. 17:105-1 11), anticuerpos de cadena simple (véase, por ej., Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteínas, " Science 242:423-26), proteínas de fusión (por ej., proteínas de fusión de visualización de fago), "minicuerpos" (véase, por ej., Patente de los EE UU Nro. 5,837,821) y otras proteínas que se unen a los antígenos que comprenden un dominio VL y/o VH O fragmento de los anteriores. En un aspecto, la proteína que se une a FcyRIIIA es un "anticuerpo tetramérico" es decir, que en general tiene la estructura de una IgG que ocurre en la naturaleza y que comprende dominios variables y constantes, es decir, dos cadenas livianas que comprende un dominio VL y un dominio constante de cadena liviana y dos cadenas pesadas que comprende un dominio VH y dominios constantes y de bisagra de cadena pesada.
Como se usa en este documento el término "antagonistas de FcyR" y términos análogos se refieren a sustancias de proteínas y no proteináceas, que incluyen moléculas pequeñas que antagonizan por lo menos una actividad biológica de un FcyR, por ej., señalización en bloque. Por ejemplo, las moléculas de la invención señalización en bloque mediante el bloqueo de la unión de IgGs a un FcyR.
Como se usa en este documento, el término "derivado" en el contexto de polipéptidos o proteínas se refiere a un polipéptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha alterado por la introducción de sustituciones, eliminaciones o adiciones a los residuos de aminoácidos. El término "derivado" como se usa en este documento se refiere, además, a un polipéptido o proteína que se ha modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido o la proteína. Por ejemplo, aunque no a modo de limitación, un anticuerpo puede modificarse, por ej., por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por medio de grupos protectores/ de bloqueo conocidos, descomposición proteolítica, ligadura a un antígeno celular u otra proteína, etc. Un polipéptido o una proteína derivada puede producirse por medio de modificaciones químicas con el uso de técnicas conocidas para aquellas personas con experiencia en la materia, que incluyen, aunque sin limitarse a descomposición química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido o una proteína derivada derivado posee una función idéntica o similar al polipéptido o la proteína de la cual derivó.
Como se usa en este documento, el término "derivado" en el contexto de un derivado no proteináceo se refiere a una segunda molécula orgánica o inorgánica que se forma en base a la estructura de una primera molécula orgánica o inorgánica. Un derivado de una molécula orgánica incluye, pero no se limita a, una molécula modificada, por ej., por medio de la adición o eliminación de un grupo hidroxilo, metilo, etilo, carbonilo o amina. Una molécula orgánica también puede ser esterificada, alquilada y/o fosforilada.
Como se usa en este documento, el término "molécula del diacuerpo" se refiere a un complejo de dos o más cadenas de polipéptidos o proteínas, donde cada una comprende por lo menos un dominio VL y uno VH o fragmento de los anteriores, en donde ambos dominios están comprendidos dentro de una cadena de polipéptido simple. En ciertas realizaciones "molécula del diacuerpo" incluye moléculas que comprenden un Fe o un dominio Fc-bisagra. Dichas cadenas de polipéptidos en el complejo pueden ser iguales o diferentes, es decir, la molécula de diacuerpo puede ser un homo-multímero o un hétero-multímero. En aspectos específicos, "molécula del diacuerpo" incluye dímeros o tetrámeros o dichas cadenas de polipéptidos que contienen ambos, un dominio VL y uno VH. Las cadenas de polipéptidos individuales que comprenden las proteínas multiméricas pueden unirse en forma covalente a por lo menos un polipéptido distinto del multímero por uniones de disulfuro entre cadenas.
Como se usa en este documento, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan en forma indistinta para referirse a una afección en un sujeto. En particular, el término "enfermedad autoinmune" se usa en forma indistinta con el término "trastorno autoinmune" para referirse a una afección en un sujeto caracterizada por lesión celular, a tejido y/u órgano causada por una reacción inmunológica del sujeto a sus propias células, tejidos y/u órganos. El término "enfermedad inflamatoria" se usa en forma indistinta con el término "trastorno inflamatorio" para referirse a una afección en un sujeto caracterizado por inflamación, con preferencia inflamación crónica. Los trastornos autoinmunes pueden o no estar asociados con inflamación. Más aún, la inflamación puede o no ser causada por un trastorno autoinmune. De este modo, ciertos trastornos pueden caracterizarse como ambos trastornos inflamatorios y autoinmunes.
"Cadenas de polipéptidos idénticas" como se usa en este documento se refiere, además, a cadenas de polipéptidos que tienen secuencia de aminoácidos casi idénticas, por ejemplo, que incluyen cadenas que tienen una o más diferencias de aminoácidos, con preferencia sustituciones de aminoácidos conservadores, de manera tal que la actividad de las dos cadenas de polipéptidos no es significativamente diferente.
Como se usa en este documento, el término "cáncer" se refiere a un neoplasma o tumor que resulta del crecimiento no controlado anormal de las células. Como se usa en este documento, cáncer incluye en forma explícita, leucemias y linfomas. En algunas realizaciones, cáncer se refiere a un tumor benigno, que ha permanecido localizado. En otras realizaciones, cáncer se refiere a un tumor maligno, que ha invadido y ha destruido estructuras corporales vecinas y se esparció a sitios distantes. En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con un antígeno específico del cáncer.
Como se usa en este documento, el término "agente modulador inmunológico" y sus variaciones se refieren a un agente que modula el sistema inmunológico de un huésped. En ciertas realizaciones, un agente modulador inmunológico es un agente inmunosupresor. En ciertas otras realizaciones, un agente modulador inmunológico es es un agente inmunoestimulador. Los agentes inmunomoduladores incluyen, aunque no se limitan a, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas, agentes miméticos, y moléculas orgánicas.
Como se usa en este documento, el término "epítope" se refiere a un fragmento de un polipéptido o proteína o una molécula de proteínas que tiene actividad inmunogénica o antigénica en un animal, con preferencia en un mamífero, y con mayor preferencia en un humano. Un epítope que tiene actividad inmunogénica es un fragmento de un polipéptido o proteína que genera una respueta al anticuerpo en un animal. Un epítope que tiene actividad antigénica es un fragmento de un polipéptido o proteína al cual un anticuerpo se une en forma inmunoespecífica según se determina por cualquier método muy conocido para una persona con experiencia en la materia, por ejemplo por inmunoensayos. Los epítopes antigénicos no necesariamente tienen que ser inmunogénicos.
Como se usa en este documento, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 60 residuos de amino contiguos, por lo menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos contiguous 80 residuos de aminoácidos, por lo menos contiguous 90 residuos de aminoácidos, por lo menos contiguous 100 residuos de aminoácidos, por lo menos contiguous 125 residuos de aminoácidos, por lo menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos contiguous 175 residuos de aminoácidos, por lo menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o por lo menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido. En una realización específica, un f agmento de un polipéptido mantiene por lo menos una función del polipéptido.
Como se usa en este documento, los términos "ácidos nucleicos" y "secuencias de nucleótidos" incluyen moléculas de ADN (por ej., cDNA o ADN genómico), moléculas de ARN (por ej., mRNA), combinaciones de moléculas de ADN y ARN o moléculas híbridas de ADN/ARN, y análogos de moléculas de ADN o ARN. Dichos análogos pueden generarse con el uso de, por ejemplo, análogos de nucleótidos, que incluyen, aunque no se limitan a, bases inosina o tritiladas. Dichos análogos también pueden comprender DNA o moléculas de ARN que comprenden cadenas principales modificadas que prestan atributos beneficiosos a la moléculas tales como, por ejemplo, resistencia a la nucleasa o un aumento en la capacidad de cruzar membranas celulares. Los ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos pueden ser de hebra simple, de doble hebra, pueden contener ambas porciones de hebra simple o de hebra doble, y pueden contener porciones de hebra triple, pero con preferencia es ADN de doble hebra.
Como se usa en este documento, una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a esa cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar o manejar una enfermedad o un trastorno. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede referirse a la cantidad de agente terapéutico suficiente para demorar o minimizar el inicio de la enfermedad, por ej., demorar o minimizar la diseminación del cáncer. Una cantidad terapéuticamente efectiva también puede referirse a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de una enfermedad. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva con respecto a un agente terapéutico de la invención se refiere a la cantidad de agente terapéutico solo, o en combinación con otros tratamientos, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de una enfermedad.
Como se usa en este documento, los términos "agente profiláctico" y "agente agentes profilácticos" se refieren a cualquier agente que puede usarse en la prevención de un trastorno o prevención de recurrencia o diseminación de un trastorno. Una cantidad efectiva como profilaxis puede referirse a la cantidad de agente profiláctico suficiente para prevenir la recurrencia o diseminación de enfermedad hiper-proliferativa, en particular el cáncer, o la ocurrencia de la misma en un paciente, que incluyen aunque sin limitarse a aquellos predisupuestos a la enfermedad hiper-proliferativa, por ejemplo aquellos predispuestos genéticamente al cáncer o aquellos previamente expuestos a los carcinógenos. Una cantidad efectiva como profilaxis también puede referirse a la cantidad del agente profiláctico que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad. Además, una cantidad efectiva como profilaxis con respecto a un agente profiláctico de la invención significa esa cantidad de agente profiláctico solo, o en combinación con otros agentes, que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad.
Como se usa en este documento, los términos "previene", "prevenir" y "prevención" se refieren a la prevención de la recurrencia o el inicio de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto como resultado de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.
Como se usa en este documento, el término "en combinación" se refiere al uso de más de un agente profiláctico y/o terapéutico. El uso del término término "en combinación" no restringe el orden en la cual se administran agentes profilácticos y/o terapéuticos a un sujeto con un trastorno. Un primer agente profiláctico o terapéutico puede administrarse antes de (por ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas antes), en forma concomitante con, o posterior a (por ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto con un trastorno.
"Función efectora" como se usa en este documento se refiere a un evento bioquímico que resulta de la interacción de una región del anticuerpo Fe con un receptor de Fe o un antígeno. Las funciones efectoras incluyen aunque no se limitan a citotoxicidad mediada por células dependientes de los anticuerpos (ADCC), fagocitosis mediadas por células que dependen de los anticuerpos (ADCP), y citotixicidad que depende de los complementos (CDC). Las funciones efectoras incluyen tanto aquellas que operan después de la unión de un antígeno y aquellas que operan independientes de la uñón al antígeno.
"Célula efectora" como se usa en este documento se refiere a una célula del sistema inmunológico que expresa uno o más receptores de Fe y media una o más de las funciones efectoras. Las células efectoras incluyen aunque no se limitan a monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulados grandes, células de Langerhans, células asesinas naturales (NK), y pueden ser de cualquier organismo que incluyen aunque sin limitarse a humanos, ratones, ratas, conejos, y monos.
Como se usa en este documento, el término "se une en forma específica a un complejo inmune" y términos análogos se refieren a moléculas que se unen en forma específica a un complejo inmune y no se unen en forma específica a otra molécula. Una molécula que se une en forma específica a un complejo inmune puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad según se determina por, por ej., inmunoensayos, BIAcore, o otros ensayos conocidos en la materia. Con preferencia, las moléculas que se unen en forma específica a un complejo inmune no reaccionan en forma cruzada con otras proteínas. Las moléculas que se unen en forma específica a un complejo inmune pueden identificarse, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore, u otras técnicas conocidas para aquellas personas con experiencia en la materia.
Una "proteína de fusión estable" como se usa en este documento se refiere a una proteína de fusión que sufre un nivel mínimo a no detectable de degradación durante la producción y/o el almacenamiento según se evalúa con el uso de ensayos funcionales y bioquímicos comunes conocidos por los expertos en el arte, y pueden almacenarse durante un período prolongado de tiempo con sin pérdida de actividad biológica, por ej., unión a FcyR. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGS. 1 A-B SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DE BISAGRA DE CH1 DE IgG HUMANA Y REGIONES DE Fe La Figura 1(A) y (B) proveen las secuencias de aminoácidos de IgGl humana, Bisagra IgG2, IgG3 y IgG4 (A) y dominios Fe (B). (Dominio de bisagra IgGl (SEC ID NRO.: 1); dominio de bisagra IgG2 (SEC ID NRO.: 2); dominio de bisagra IgG3 (SEC ID NRO.: 3); dominio de bisagra IgG4 (SEC ID NRO.: 4); dominio IgGl Fe (SEC ID NRO.: 5); dominio IgG2 Fe (SEC ID NRO.: 6); dominio IgG3 Fe (SEC ID NRO.: 7); dominio IgGl Fe (SEC ID NRO.: 8)). Los residuos de aminoácidos que se muestran en las FIGS. 1 A y IB se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de abat EU. Las secuencias de isotipos están alineadas con la secuencia IgGl colocando el primero y último residuos de cisteína de las respectivas regiones de bisagra, que forman las uniones S-S inter-cadena pesada, en las mismas posiciones. Para la Figura IB, los residuos en el dominio CH2 se indican por +, mientras que los residuos en el dominio CH3 se indican por ~.
FIG. 2 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE CADENAS DE POLIPÉPTIDOS DE DIACUERPOS BIFUNCIONALES COVALENTES Los polipéptidos de diacuerpo bifuncional, covalente consisten en un anticuerpo VL y un dominio de anticuerpo VH separado por una ligadura de péptido corta. La nigadura de residuo de 8 aminoácidos evita el auto montaje de una cadena de polipéptido simple en construcciones scFv, y, en su lugar, interacciones entre los dominios VL y VH de diferentes cadenas de polipéptidos predominan. Se crearon 4 construcciones (cada construcción se describe a partir del término amino ("n"), el lado izquierdo de la construcción, hacia el término carboxi ("c"), lado derecho de la figura): la construcción (1) (SEC ID NRO.: 9) comprendía, ligadura del dominio de n-VL (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia de extremo terminal C (LGGC)-c; la construcción (2) (SEC ID NRO.: 11) comprendía el dominio de n-VL Hu3G8 -ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia de extremo terminal C (LGGC)-c; la construcción (3) (SEC ID NRO.: 12) comprendía el dominio de n-VL Hu3G8 - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia de extremo terminal C (LGGC)-c; la construcción (4) (SEC ID NRO.: 13) comprendía ligadura del dominio de n-VL (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y una secuencia de extremo terminal C (LGGC)-c.
FIG. 3 ANÁLISIS POR SDS-PAGE DE DIACUERPOS PURIFICADOS POR AFINIDAD Los diacuerpos purificados por afinidad se sometieron a análisis por SDS-PAGE en condiciones de reducción (hileras 1-3) y sin reducción (hileras 4-6). Los pesos moleculares aproximados del estándar (entre hileras 3 y 4) son los que se indican. Hileras 1 y 4, h3G8 CMD; Hileras 2 y 5, h2B6 CMD; y Hileras 3 y 6, h2B6-h3G8 CBD.
FIGS. 4 A-B ANÁLISIS SEC DE DIACUERPOS PURIFICADOS POR AFINIDAD Los diacuerpos purificados por afinidad se sometieron a análisis SEC. (A) Perfil de elución de estándares desconocidos: IgG de longitud completa (~150 kDa), fragmento Fab de IgG (-50 kDa), y scFv (-30 kDa); (B) Perfil de elución de h2b6 CMD, h3G8 CMD, y h2B6-h3G8 CBD.
FIG. 5 UNIÓN DE h2B6-h3G8 CBD A sCD32B Y sCDlóA La unión de h2B6-h3G8 CBD a sCD32B y sCDlóA se analizó en un ELISA sándwich. Se usó sCD32B como proteína blanco. La sonda secundaria fue sCDlóA conjugado con HRP. h3G8 CMD, que se une CD16A, se usó como control.
FIGS. 6 A-C ANÁLISIS BIACORE DE LA UNIÓN DEL DIACUERPO A SCD16A, sCD32B Y sCD32B La unión de h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD y h3G8 CMD a sCDlóA, sCD32B, y sCD32A (control negativo) se analizó por análisis SPR. h3G8 scFv también se evaluó como control. (A) Unión a sCDló; (B) Unión a sCD32B and (C) Unión a sCD32A. Se inyectaron los diacuerpos a una concentración de 100 NM, y scFv a una concentración de 200 nM, sobre las superficies receptoras en un índice de flujo de 50 ml/min durante 60 seg.
FIGS. 7 A-C ANÁLISIS BIACORE DE LA UNIÓN DEL DIACUERPO A SCD16A Y SCD32B La unión de h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD y h3G8 CMD a sCD16A, y sCD32B se analizó por análisis SPR. h3G8 scFv también se evaluó como control. (A) Unión a h3G8 CMD sCDlóA; (B) Unión de h2B6-h3G8 CBD a sCDlóA; (C) Unión de h3G8 scFv a sCD16A; (D) Unión de h2B6 CMD to sCD32B; y (E) Unión de h2B6-h3G8 CBD a sCD32B. Se inyectaron los diacuerpos a concentraciones de 6,25-200 nM sobre las superficies receptoras en un índice de flujo de 70 ml/min durante 180 seg.
FIG. 8 ESQUEMA QUE MUESTRA LA INTERACCIÓN DE CADENAS DE POLIPÉPTIDOS QUE COMPRENDEN LOS DOMINIOS VL y VH PARA FORMAR UNA MOLÉCULA DE DIACUERPO BIESPECÍFICO COVALENTE NH2 y COOH represent el término amino y el término carboxi, respectivamente de cada cadena de polipéptidos. S representa el residuo de cisteína de extremo terminal C en cada cadena de polipéptido. VL y VH indican el dominio liviano variable y doinio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas e intermitentes son para distinguir entre las dos cadenas de polipéptidos y, en particular, representan las porciones de ligadura de dichas cadenas. h2B6 Fv y h3G8 Fv indican un sitio que se une al epítope específica para CD32B y CD16, respectivamente.
FIG. 9 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE CADENAS DE POLIPÉPTIDOS QUE CONTIENEN DOMINIOS Fe DE DIACUERPOS BIESPECÍFICOS COVALENTES Representación de construcciones de polipéptidos de las moléculas de diacuerpo de la invención (cada construcción se describe a partir del término amino ("n"), el lado izquierdo de la construcción, hacia el término carboxi ("c"), lado derecho de la figura). La construcción (5) (SEC ID NRO.: 14) comprendía, n-VL dominio Hu2B6 - una primera ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - a segunda ligadura (LGGC)- and a de extremo terminal C Fe dominio de IgGl humana-c; la construcción (6) (SEC ID NRO.: 15) comprendía el dominio de n-VL Hu3G8 - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y segunda ligadura (LGGC)- y un dominio Fe de extremo terminal C de IgGl humana-c; la construcción (7) (SEC ID NRO.: 16) comprendía el dominio de n-VL Hu2B6 - una primera ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y una secuencia de extremo terminal C (LGGCFNRGEC) (SEC ID NRO.: 17)-c; la construcción (8) (SEC ID NRO.: 18) comprendía el dominio de n-VL Hu3G8 - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - y segunda ligadura (LGGC)- y un dominio Fc/bisagra de extremo terminal C de IgGl humana (con sustitución de aminoácidos A215V)-c.
FIG,10 UNIÓN DE MOLÉCULAS DE DIACUERPO QUE COMPRENDE DOMINIOS Fe A sCD32B Y sCD16A La unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe a sCD32B y sCD16A se analizó en un ELISA sandwich. Los diacuerpos analizados se produjeron por 3 sistemas de expresión recombinantes: co-transfección de pMGX669 y pMGX674, que expresan las construcciones 1 y 6, respectivamente; co-transfección de pMGX667 y pMGX676, que expresan las construcciones 2 y 5, respectivamente; y co-transfección de pMGX674 y pMGX676, que expresan las construcciones 5 y 6, respectivamente. Se usó sCD32B como proteína blanco. La sonda secundaria fue sCDlóA conjugado con HRP. FIG. 11 ESQUEMA QUE MUESTRA LA INTERACCIÓN DE DOS CADENAS DE POLIPÉPTIDOS DONDE CADA UNA COMPRENDE UN DOMINIO Fe PARA FORMAR UN DIACUERPO COVALENTE, BIVALENTE NH2 y COOH representan el término amino y el término carboxi, respectivamente de cada cadena de polipéptidos. S representa el por lo menos un enlace disulfuro entre un residuo de cisteína en la segunda secuencia de unión de cada cadena de polipéptidos. VL y VH indican el dominio liviano variable y doinio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas e intermitentes son para distinguir entre las dos cadenas de polipéptidos y, en particular, representan las primeras porciones de ligadura de dichas cadenas. CH2 y CH3 representan los dóminos constantes CH2 y CH3 de un dominio Fe. h2B6 Fv y h3G8 Fv indican un sitio que se une al epítope específico para CD32B y CD16, respectivamente. FIG,12 UNIÓN DE MOLÉCULAS DE DIACUERPO QUE COMPRENDEN DOMINIOS BISAGRA/Fc PARA sCD32B Y sCD16A La unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe para sCD32B y sCD16A se analizó en un ELISA sandwich. Los diacuerpos analizados se produjeron por 4 sistemas de expresión recombinantes: co-transfección de pMGX669 + pMGX674, que expresan las construcciones 1 y 6, respectivamente; co-transfección de pMGX669 + pMGX678, que expresan las construcciones 2 y 8, respectivamente; co-transfección de pMGX677 + pMGX674, que expresan las construcciones 7 y 6, respectivamente; y co-transfección de pMGX677 + pMGX678, que expresan las construcciones 7 y 8, respectivamente. Se usó sCD32B como proteína blanco. La sonda secundaria ftie sCDlóA conjugado con HRP.
FIG. 13 ESQUEMA QUE MUESTRA LA INTERACCIÓN DE CADENAS DE POLIPÉPTIDOS PARA FORMAR UNA MOLÉCULA DE DIACUERPO TETRAMÉRICO NH2 y COOH representan el término amino y el término carboxi, respectivamente de cada cadena de polipéptidos. S representa el por lo menos un enlace disulfuro entre un residuo de cisteína en la segunda secuencia de unión que lleva Fe, cadena de polipéptido "más pesada" y un residuo de cisteína en la secuencia de extremo terminal C de la cadena de polipéptidos "más liviana", que no lleva Fe. VL y VH indican el dominio liviano variable y doinio pesado variable, respectivamente. Las líneas punteadas e intermitentes son para distinguir entre cadenas de polipéptidos y, en particular, representan las primeras porciones de ligadura de cadenas más pesadas o la ligadura de dichas cadenas más livianas. CH2 y CH3 representan los dóminos constantes CH2 y CH3 de un dominio Fe. h2B6 Fv y h3G8 Fv indican un sitio que se une al epítope específico para CD32B y CD16, respectivamente.
FIG. 14 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE CADENAS DE POLIPÉPTIDOS QUE CONTIENEN DOMINIOS Fe QUE FORMAN DIACUERPOS BIESPECÍFICOS COVALENTES Representación de construcciones de polipéptidos which form las moléculas de diacuerpo de la invención (cada construcción se describe a partir del término amino ("n"), el lado izquierdo de la construcción, hacia el término carboxi ("c"), lado derecho de la figura). La construcción (9) (SEC ID NRO.: 19) comprendía un dominio n-bisagra/Fc de IgGl humana - el dominio VL Hu3G8 - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10))- y una secuencia LGGC de extremo terminal C-c; la construcción (10) (SEC ID NRO.: 20) comprendía n-un dominio Fe de IgGl humana - el dominio VL Hu3G8 - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10))- and una secuencia LGGC de extremo terminal C-c; la construcción (11) (SEC ID NRO.: 21) comprendía el dominio de n-VL Hu2B6 (G105C) - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu3G8 - y un dominio Fc/bisagra de extremo terminal C de IgGl humana con sustitución de aminoácidos A215V-c; la construcción (12) (SEC ID NRO.: 22) comprendía el dominio de n-VL Hu3G8 - ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu2B6 (G44C) - y una secuencia FNRGEC de extremo terminal C (SEC ID NRO.: 23)-c.
FIG. 15 A-B ANÁLISIS SDS-PAGE Y TRANSFERENCIA WESTERN DE DIACUERPOS TETRAMÉRICOS POR AFINIDAD Los diacuerpos producidos por sistemas de expresión recombinantes co-transfectados con vectores que expresan las construcciones 10 y 1, construcciones 9 y 1, y construcciones 11 y 12 se sometieron a análisis por SDS-PAGE en condicciones no reducidas (A) y análisis de Transferencia Western con el uso de IgGl H+L anti humana de cabra como sonda (B). Las proteínas en el gel de SDS-PAGEl se visualizaron con Simply Blue Safestain (Invitrogen). Para ambos paneles A y B, las moléculas de diacuerpo que comprenden construcciones 10 y 1, construcciones 9 y 1, y construcciones 11 y 12A se encuentran en las hileras 1, 2 y 3, respectivamente.
FIG,16 UNIÓN DE MOLÉCULAS DE DIACUERPO QUE COMPRENDEN DOMINIOS Fe Y UNIONES DE DISULFURO ENTRE CADENAS DISEÑADOS ESPECIALMENTE PARA sCD32B Y sCD16A La unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe y uniones de disulfuro diseñadas específicamente entre las cadenas de polipéptidos más "livianas" y "pesadas" para sCD32B y sCD16A se analizó en un ELISA sandwich. Los diacuerpos analizados se produjeron por 3 sistemas de expresión recombinantes: que expresan las construcciones 1 y 10, que expresan las construcciones 1 y 9, y que expresan las construcciones 11 y 12, respectivamente. Se usó sCD32B como proteína blanco. La sonda secundaria fue sCD16A conjugado con HRP. Unión de h3G8 se usó como control.
FIG. 17 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE PRECURSOR DE POLIPROTEÍNAS DE LA MOLÉCULA DEL DIACUERPO Y REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE CADENAS DE POLIPÉPTIDOS QUE CONTIENEN CADENA LIVIANA LAMBDA Y/O DOMINIOS DE BISAGRA Representación de construcciones de polipéptidos que compreden las moléculas de diacuerpo de la invención (cada construcción se describe a partir del término amino ("n"), el lado izquierdo de la construcción, hacia el término carboxi ("c"), lado derecho de la figura). La construcción (13) (SEC ID NRO.: 95) comprendía, n-VL dominio 3G8 - una primera ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de 2,4G2VH - una segunda ligadura (LGGC)- sitio de reconocimiento de fiirina (RAKR (SEC ID NRO.: 93))-dominio VL de 2,4G2- una tercera ligadura (GGGSGGG (SEC ID NRO.: 10)-dominio VH de 3G8- y un dominio LGGC de extremo terminal C; (secuencia de nucleósido que codifica SEC ID NRO.: 95 se proporciona en SEC ID NRO.: 96). La construcción (14) (SEC ID NRO.: 97) comprendía, n-VL dominio 3G8 - una primera ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de 2,4G2VH - una segunda ligadura (LGGC)- sitio de reconocimiento de furina (RAKR (SEC ID NRO.: 93))-Sitio FMD (Proteasa del Virus de la Enfermedad de Pies y Boca C3)-dominio VL de 2,4G2- una tercera ligadura (GGGSGGG (SEC ID NRO.: 10)-dominio VH de 3G8- y un dominio LGGC de extremo terminal C; (secuencia de nucleósido que codifica SEC ID NRO.: 97 se proporciona en SEC ID NRO.: 98). La construcción (15) (SEC ID NRO.: 99) comprendía, n-VL dominio Hu2B6 - una ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu3G8- y un dominio de extremo terminal C FNRGEC (SEC ID NRO.: 23); (secuencia de nucleósido que codifica SEC ID NRO.: 99 se proporciona en la SEC ID NRO.: 100). La construcción (16) (SEC ID NRO.: 101) comprendía, n-VL dominio Hu3G8 - una ligadura (GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10)) - el dominio VH de Hu2B6- y un dominio de extremo terminal C VEPKSC (SEC ID NRO.: 77); (secuencia de nucleósido que codifica SEC ID NRO.: 101 se proporciona en la SEC ID NRO.: 102).
FIG. 18 UNIÓN DE MOLÉCULAS DE DIACUERPO DERIVADAS DE UNA MOLÉCULA PRECURSORA DE POLIPROTEÍNAS PARA mC D32B Y sCD16A La unión de moléculas de diacuerpo derivadas de la construcción de molécula precursora de poliproteínas 13 (SEC ID NRO.: 95) para CD32B de murino (mCD32B) y CD16A soluble (sCDlóA) se analizó en un ELISA sándwich. mCD32B se usó como proteína blanco. La sonda secundaria fue sCDlóA conjugado con biotina.
FIG,19 UNIÓN DE MOLÉCULAS DE DIACUERPO QUE COMPRENDEN CADENA LAMBDA Y/O DOMINIOS DE BISAGRA PARA sCD32B Y sCDlóA La unión de moléculas de diacuerpo que comprenden dominios derivados del extremo terminal C de la cadena liviana humana lambda y/o el dominio de bisagra de IgG para sCD32B y sCDlóA se evaluó y se comparó con el diacuerpo que comprende construcciones 1 y 2 (FIG. 5) en un ELISA sándwich. Los diacuerpos analizados se produjeron por por sistema de expresión recombinante que expresan las construcciones 15 y 16 (SEC ID NRO.: 99 y SEC ID NRO.: 101, respectivamente). Se usó sCD32B como pro teína blanco. La sonda secundaria fue sCDlóA conjugado con HRP. Las barras con casilleros pequeños representan la combinación de construcción 15/16 mientras que las barras con casilleros grandes representan la combinación de la construcción 1/2.
FIG. 20 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE 2B6/4420 DART UNIDO A CD32B UBICADO EN LA SUPERFICIE DE UNA CÉLULA Y UNA MOLÉCULA CONJUGADA CON FLOURESCEÍNA El diagrama muestra la flexibilidad de la rama anti-fluoresceína "adaptadora universal" del DART así como también la posibilidad de sustituir otras especificidades para la rama 2B6. Las regiones V se muestran como casilleros, las ligaduras GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) se muestran como líneas, el enlace de disulfuro se muestra conectando las dos cadenas. Los constituyentes de una cadena se muestran en azul mientras que el otro es de color rosa. N, término amino; C, término carboxi; FL, fluoresceína, VL, región variable de cadena liviana; VH, región variable de cadena pesada.
FIG. 21 (PANELES A Y B) EL 2B6/4420 DART SE UNE ESPECÍFICAMENTE A MOLÉCULAS CONJUGADAS CON FLUORESCEÍNA Y PUEDEN UNIRSE EN FORMA SIMULTÁNEA A CD32B.
(A) 2B6/4420 o 2B6/3G8 se unieron a placas para ELISA recubiertas con Proteína FITC-S. La unión y función de la rama 2B6 se detectaron por compromiso de CD32B soluble, seguido de un anticuerpo específico para CD32B y un anticuerpo de detección secundario conjugado con HRP. (B) 2B6/4420 o 2B6/3G8 se unieron a placas para ELISA recubiertas con HuIgG o FITC-HuIgG (conjugado con fluoresceína). La unión se detectó por encastre con un suero policlonal específico para 2B6 Fv seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP.
FIG. 22 (PANELES A Y B) ACTIVACIÓN DE CÉLULAS B PURIFICADAS CON EL USO DE ANTICUERPOS CD79B ANTI- HUMANOS.
Células B purificadas se activaron con el uso de concentraciones crecientes de anticuerpos CD79b anti-humanos conjugados con FITC, CB3,1-FITC (A) o CB3,2-FITC (B) y 50 g/ml de fragmento F(ab')2 de GAM IgG Específico de Fe (eje x). Las células B se activaron en la presencia de PBS (barras blancas) o 5 µg/ml de cualquiera de <xFITCaCD32BD ART (barras negras) o aCD16aCD32BDART (barras grises). Las reacciones se realizaron por triplicado y se calcularon las desviaciones estándar.
FIG. 23 (PANELES A Y B) ACTIVACIÓN DE CÉLULAS B PURIFICADAS Células B purificadas de un segundo donante sano se activaron como se describe en la FIG. 22, Panel B. El índice de proliferación se midió en células activadas en la presencia del anticuerpo anti CD79b conjugado con FITC CB3.2-FITC (A) y se comparó con el índice de proliferación de células activadas en la presencia del anticuerpo no rotulado CB3.2 (B).
FIG. 24 (Paneles superior e inferior) DEPLECIÓN DE CÉLULAS DE RATÓN IN VIVO EN RATONES TRANSGÉNICOS HCD16A/B CON EL USO DE MGD261 Ratones mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/- hCD32B+ C57B1/6 and mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6 de la colonia de reproducción MacroGenics se inyectaron IV en los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17 con MGD261 (10, 3, 1 o 0,3mg/kg), o un anticuerpo irrelevante (hE16 10mg/kg). Se tomaron muestras de sangre en los días -19 (antes del sangrado), 4, 11, 18, 25 y 32 para análisis de FACS. Se registró la salud y la actividad del animal tres veces por semana. Panel superior: h2B6-3G8 y WNV mAb; Panel Inferior: ratones h2B6-3G8 -hCD16A o -hCD32B y ratones WNV mAb -hCDlóA o - hCD32B.
FIG. 25 DEPLECIÓN DE CÉLULAS DE RATÓN IN VIVO EN RATONES TRANSGÉNICOS HCD16A/B CON EL USO DE 2,4G2-3G8 DB Ratones mCDló-/-, mCDló-/- hCD16A+ C57B1/6, mCDló-/- hCD16B+ y mCDló-/- hCD16A+ hCD16B+ de la colonia de reproducción MacroGenics se inyectaron IP en los días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 y 18 con 2,4G2-3G8 DB (75ug/ratón), o PBS. Se tomaron muestras de sangre en los días -10 (antes del sangrado), 4, 11 y 18 para análisis de FACS. Se registró la salud y la actividad del animal tres veces por semana.
FIG. 26 DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-TUMORAL DE MGD261 CON EL USO DE UN MODELO INTRAVENOSO (IV) DE LA LÍNEA CELULAR RAJI DE TUMOR HUMANO Ratones de doce-veinte semanas de vida mCDló-/-, hCD16A+, RAG1-/- C57B1/6 de la colonia de reproducción MacroGenics se inyectaron IV at day 0 con 5x106 células Raji. En los días 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 y 30 los ratones también recibieron tratamiento por vía intraperitoneana (IP) con 250, 25 o 2,5ug de MGD261 o con PBS (control negativo). Los ratones se observaron todos los días y el peso del cuerpo se registró dos veces por semana. Los ratones que desarrollaron parálisis de las patas posteriores se sacrificaron. FIG. 27 EXPRESIÓN DE DART EN UN HUÉSPED NO MAMÍFERO Se transformaron células BL21DE3 (Novagen) con el plásmido pET25b(+) 77-lac+ 3G8/3G8 un una colonia resistente a amp se usó para sembrar el cutivo del caldo. Cuando el cultivo alcanzó 0,5 OD600 unidades, 0,5mM de IPTG se agregó para inducir la expresión. El cultivo se desarrolló a 30°C durante 2 horas y se recolectó el medio libre de células.
FIG. 28 DART ELISA Los ELISA de unión a DART h3G8-h3G8 DART se condujeron con el uso de placas Maxisorp de 96 pocilios. Luego de la reacción, la placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 µ?/pocillo de sustrato de TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se interrumpió por 40 µ?/pocillo de 1% H2S04. El OD450 nm se leyó con el uso de un lector de placas de 96 pocilios y software SOFT max. La lectura obtenida se gráfico con el uso de software GraphPadPrism 3.03.
FIG. 29 MUERTE DE CÉLULAS B HUMANAS INDUCIDAS POR DART Se incubaron PBMC humanas durante la noche con las moléculas indicadas. Se analizó la apoptosis por análisis FACS como porcentaje de población de PI+Annexin-V+ de células B (Células CD20+) sobre el total de la población FSC/SSC sin compuertas.
FIG. 30 CONSTRUCCIONES DART 8B5-CB3.1 Múltiples construcciones DART 8B5-CB3.1 se produjeron para ilustrar la presente invención. La construcción 5 y 6, o 6 y 7, u 8 y 9, o 9 y 10, codificó los plásmidos de expresión que se co-transfectaron en células HEK-293 para expresar 8B5-CB3.1 DART con o sin marca anti bandera con el uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El medio acondicionado se cosechó en cada tres días durante tres veces. El medio acondicionado se purificó a continuación con el uso de columna por afinidad CD32B.
FIG. 31 ELISA 8B5-CB3.1 DART Se condujeron ELISA de competición 8B5-CB3.1 DART/ch8B5 se condujeron con el uso de placas Maxisorp de 96 pocilios. Luego de la reacción, la placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 µ?/pocillo de sustrato de TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se interrumpió por 40 µ?/pocillo de 1% H2S04. El OD450 nm se leyó con el uso de un lector de placas de 96 pocilios y software SOFT max. La lectura obtenida se gráfico con el uso de software GraphPadPrism 3.03.
FIG. 32 ILUSTRACIÓN ESQUEMÁTICA DE ESTRUCTURA DART TETRAVALENTE Ilustra la estructura general de una especie DART producida a través del montaje de cuatro cadenas de polipéptidos. Los cuatro dominios que se unen al antígeno del DART similar a Ig se muestran como elipses grises rasgadas y oscuras.
FIG. 33 DART TETRAVALENTE SÍMIL Ig Proporciona una visualización esquemática de los sitios que se unen al epítope de un DART tetravalente símil Ig.
FIG. 34 ELISA DE UNIÓN a mCD32-hCD16A Proporciona los resultados de ELISAs que demuestran que la especie DART tetravalente símil Ig del Ejemplo 6.10 se une al antígeno con mayor afinidad que el anticuerpo de control (ch-mCD32 mAb) o otras especies DART.
FIG. 35 ILUSTRACIÓN ESQUEMÁTICA DE MOLÉCULAS DART DE IG Proporciona una visualización esquemática de moléculas DART de Ig. La especificidad se indica por medio de regiones sobreadas, con patrones o de color blanco, las regiones constantes se muestran en negro, y los enlaces de disulfuro se indican por líneas negras punteadas. Los términos N de todas las cadenas de proteínas se orientan hacia la parte superior de la figura, mientras que los términos C de todas las cadenas de proteínas se orientan hacia la parte inferior de la Figura. Las ilustraciones A-E son biespecíficas y las ilustraciones F-J son triespecíficas. Las ilustraciones A and E son tetravalentes. Las ilustraciones B, C, F, I, y J son hexavalentes. Las ilustraciones D, G, y H son octavalentes. Remitirse a las Figuras 1, 2, 9, 14 y 17 y a la sección 3.1 para obtener descripciones detalladas de los dominios individuales.
FIG. 36 CAPACIDAD DE UNIÓN DE DIACUERPO BIOESPECÍFICO HU2B64.5-HU3G8 5.1 La Figura 36 muestra la capacidad de el diacuerpo bioespecífico Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 (cuadrados) de unirse a CD32B y CDlóa con relación a diacuerpos Hu2B6 4.5 o Hu3G8 5.1 (triángulos).
FIG. 37 ESQUEMA DE DERIVADOS DART DE E-COIL Y K-COIL La Figura 37 ilustra la confirmación general de derivados DART E-coil y K-coil.
FIG. 38 DISPOSICIONES HÉLICE DE SEPARADORES E-COIL Y K-COIL PREFERIDOS La Figura 38 muestra las disposiciones hélice de la secuencia "E-coil" preferida (EVAALEK)4 (SEC ID NRO.: 299) y la secuencia "K-coil" preferida (KVAALKE)4 (SEC ID NRO.: 300).
FIG. 39 DERIVADOS DART QUE CONTIENEN Fe de E-COIL y K-COIL La Figura 39 ilustra las diferentes especies de derivados DART que contienen Fe de E-coil y K-coil que pueden formarse por medio de intercambio de cadena. FIG. 40 CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN DE TAMAÑO SOBRE DERIVADOS E-COIL Y/O K-COIL Y DERIVADOS QUE CONTIENEN FC- DE E-COIL Y/O K-COIL DE DARTS h2B6YAhCB3 La Figura 40 muestra los resultados de cromatografía por exclusión de tamaño sobre Derivados E-coil y/o K-coil y derivados que contienen Fe- de E-coil y/o K-coil de h2B6YAhCB3 DARTS. Se analizaron cuatro especies de dichas moléculas; todas tenían un E-coil y un K-coil: EK (sin región Fe), 2,1 mg; EFc/K (Fe ligado a E-coil), 2,7 mgs; E/KFc (Fe ligado a K-coil), 1,8 mgs; EFc/KFc (Fe ligado al K-coil y el E-coil del mismo DART), 2,0 mg FIG. 41 ESTRUCTURA DE MOLÉCULAS DE DÍMEROS PRODUCIDAS La Figura 41 muestra la posible estructura de la molécula de dímero producida identificada en la cromatografía por exclusión de tamaño de la Figura 40.
FIG. 42 ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO CON GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS DE LOS DERIVADOS DE E-COIL Y/O K- COIL Y DERIVADOS DART QUE CONTIENEN FC DE E-COIL Y/O K-COIL DE h2B6YAhCB3 La Figura 42 muestra los resultados de un análisis electroforético con gel de poliacrilamida SDS de las fracciones obtenidas de la cromatografía por exclusión de tamaño (Figura 40) de derivados E-coil y/o K-coil y derivados que contienen Fe- de E-coil y/o K-coil de h2B6YAhCB3 DARTs. Hileras circundantes: controles de marcador molecular; Hilera 1 : EK (sin región Fe); Hilera 2: EFc/K, fracción agregada; Hilera 3: EFc/K, fracción de monómero; Hilera 4: E/KFc, fracción agregada; Hilera 5: E/KFc, fracción de monómero; Hilera 6: EFc/KFc, fracción agregada; Hilera 7: EFc/KFc, fracción de dímero; Hilera 8: EFc/KFc, fracción de monómero.
FIG. 43 ANÁLISIS DE ELISA DE UNIÓN BIESPECÍFICA DE La Figura 43 muestra el resultado de un ELISA de unión biespecífica que compara derivados DART de E-coil / K-coil que contienen Fe h2B6YAhCB3 (EFc/K o E/KFc), h2B6YAhCB3 DART, control y un derivado DART EFc/KFc h2B6YAhCB3. FIG. 44 HABILIDAD DE LOS DERIVADOS E-COIL Y/O K-COIL Y DERIVADOS DARTS QUE CONTIENEN FC- DE E-COIL Y/O K- COIL DE h2B6YAhCB3 PARA INHIBIR LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS T La Figura 44 muestra la capacidad de los derivados DARTS de E-coil y/o K-coil y derivados que contienen Fe- de E-coil y/o K-coil de h2B6YAhCB3 para inhibir la proliferación de células T.
FIG. 45 ABD-DART hCD16-hCD32B La Figura 45 muestra una visualización esquemática de una molécula de anticuerpo recombinante, ABD-DART hCD16-hCD32B compuesta por el dominio ABD3 de proteína de estreptococo G fusionada a un DART biespecífico recombinante que es inmuno reactivo con lols antígenos hCDló y hCD32B.
FIG. 46A-46J AFINIDAD DE UNIÓN DE ABD-DART hCD16-hCD32B Se recubrieron placas de ELISA con cualquiera de antígeno CD16 (Figura 46A) o human serum albumin (Figura 46B) a una concentración de 2µ§/??1^. Concentraciones variables de ABD-DART hCD16-hCD32B (¦) y DART de control hCD16-hCD32B (o) comenzando con 2 g/mL se unieron. Se agregó antígeno sD32B biotinilado a la placa seguido de Estreptavidina conjugada con HRP para detección. La Figura 46C muestra que la molécula ABD-DART era capaz de unión simultánea a CD32B, CD16A y HSA. Las Figuras 46D-46I demuestran que el ABD-DART hCD16-hCD32B y su derivado de fusión ABD se encontraron que exhiben unión equivalente a CD32B soluble (sCD32B) y a CD16A(158F) soluble (sCD16A). La Figura 46 J demuestra que la fusión DART ABD mantuvo la unión bi-específica de su DART de origen, y mostró la unión a sCD16A y CD32B que no se vio afectado por la presencia de albúmina de suero humano.
FIG. 47A/47B CITOTOXICIDAD DE PROTEÍNAS DART La Figura 47A demuestra citotoxicidad mediada por PBMC de Proteínas DART. Se realizaron ensayos ADCC con el uso de líneas de células B humanas, Daudi como células diana incubadas con PBMC como células efectoras. Los ensayos individuales se realizaron por triplicado en una proporción de efector a blanco de 20:1 y una titulación de los anticuerpos: hCD16A-hCD32B DART (·) y hCD16A-hCD32B ABD DART (¦). La citotoxicidad mediada por células se midió por ensayo de liberación de LDH. La menor curva a 10° es hCD16A-hCD32B ABD DART (¦). La Figura 47B demuestra que el DART CD16xCD32B se une a células efectoras que expresan CD16B y por lo tanto recluta dichas células para matar (por matanza redirigida) células que expresan CD32B.
FIG. 48 PROPIEDADES DE FARMACOCINÉTICA MEJORADAS DE ABD-DART hCD16-hCD32B EN RATONES C57BI/6 Los ratones (n=3) se inyectaron con una inyección intravenosa única de (A) ABD-DART hCD16-hCD32B (·) y (B) hCD16-hCD32B DART (A) a 5mg kg. Se recolectó el suero de ratón en varios momentos de medición y las concentraciones de proteína en el suero se calificaron por ELISA. Los cálculos de farmacocinética se realizaron con el uso de WinNonlin Professional 5,1.
FIG. 49A-49C ACTIVIDAD BIOLÓGICA IN VIVO DEL ABD-DART Las FIG. 49A-49C demuestran que el ABD-DART hCD16-hCD32B mantenía y exhibía actividad biológica, in vivo, después de la administración a ratones. Una dosis única del ABD-DART o su DART de origen en ratones Tg (mCD16-/-hCD16A+32B+) se encontró que es capaz de deprimir selectivamente las concentraciones de células B (Figura 49 A) sin afectar las concentraciones de células T (Figura 49B) o células PM (Figura 49C). FIG. 50A-50E ACTIVIDAD DE HER2 x TCRb SOBRE EL PANEL DE LÍNEAS CELULARES DE BAJA EXPRESIÓN DE HER2 Las moléculas DART que tienen dominios de unión al receptor de Her2 y células T (TCR) se analizaron para determinar su capacidad de mediar la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de vesícula que se habían caracterizado previamente como que exhiben bajos niveles de expresión de HER2 (y de este modo se hace refractario al tratamiento con el anticuerpo anti-Her2/neu, Herceptin®. Las líneas celulares de cáncer de mama analizadas son ZR75-1 (HER2 2+) (FIG. 50 A), MCF-7 (HER2 1+) (FIG. 50B) y MDA-MB468 (HER2-ve) (FIG. 50C). Las líneas celulares que no son de cáncer de mama analizadas son HT-29 (línea celular de cáncer de colon) (FIG. 50D) y SW780 (línea celular de cáncer de vesícula) (FIG. 50E).
FIG. 51A-51B PURIFICACIÓN DE KYK2VL-4420VH-GFNRGEC (SEC ID NRO.: 313) - E COIL Y 4420VL-KYK2VH-GVEPKSC (SEC ID NRO.: 314) POLIPÉPTIDOS Las FIG. 51A-51B muestran la purificación de polipéptidos KYK2VL-4420VH-GFNRGEC (SEC ID NRO.: 313) - E Coil y 4420VL-KYK2VH-GVEPKSC (SEC ID NRO.: 314).
FIG. 52 ESPECIFICIDAD DE UNIÓN DE DART KYK2-4420 VF La FIG. 52 muestra la especificidad de unión de DART KYK2-4420 VF.
FIG. 53 CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO pPAL7 KCOIL-ABD La FIG. 53 muestra una descripción esquemática de la construcciónion del plásmido pPAL7 Kcoil -ABD.
FIG. 54 ANÁLISIS POR TRANSFERENCIA WESTERN DE PROTEÍNA ABD K COIL PURIFICADA POR LA RESINA DE PURIFICACIÓN PROFINITY EXACT™ PURIFICATION RESIN La Figura 54 muestra un análisis por transferencia Western de proteína ABD coil purificada por la resina de purificación PROFINITY EXACT™ PURIFICATION RESIN (pequeña escala de 10 mi de cultivo). Hileras 1 y 5: lisatos crudos; hileras 2 y 6: fluyen a través, hileras 3, 4, 8, y 9: proteína purificada; hilera 7: Marcador. Anticuerpo primario: Anticuerpo policlonal anti-EK de conejo; Anticuerpo secundario: HRP anti conejo.
FIG. 55 ANÁLISIS POR SDS-PAGE DE PROTEÍNA ABD K COIL PURIFICADA POR LA RESINA DE PURIFICACIÓN PROFINITY EXACT™ La Figura 55 muestra los resultados de Análisis por SDS-PAGE sobre las fracciones eluidas de la resina de purificación PROFINITY EXACT™ PURIFICATION. L: Lisato de E. coli crudo; FT: Fluyen a través; W: Lavado; M: Marcador.
FIG. 56A-56C UNIÓN DE DART ABD KYK2 4420 EK POR ELISA DE AFINIDAD DUAL Las Figuras 56A-56C muestran resultados de ELISA que demuestran que los complejos YK2-4420 VF DART con la molécula de Coil-ABD forman un ABD DART E Coil - K Coil que tiene propiedades mejoradas. Figura 56A: DARTs capturados con NKG2D Fe y detectados con anticuerpo anti-EK monoclonal biotinilado. Figura 56B: DARTs capturados con anticuerpo-E monoclonal y detectados con albúmina humana-HRP. Figura 56C: DARTs capturados con NKG2D Fe y detectados con anticuerpo anti-FITC biotinilado. Los resultados de ELISA muestran que la totalidad de los dominios en el complejo puede unirse a sus respectivos ligandos.
FIG. 57 ELISA DE ABD DESINMUNIZADO La Figura 57 muestra resultados de ELISA que demuestran los cambios en la unión causados por modificaciones en la secuencia de dominios de unión a la albúmina. FIG. 58 ENSAYO DE UNIÓN A LA ALBÚMI A La Figura 58 muestra el resultado de ensayos de unión a la albúmina para las variantes de ABD Y61A/I65A, Y61A/N66D, L64A/I65A* y L64A/N66D y para el tipo salvaje.
FIG. 59 ENSAYO DE UNIÓN A LA ALBÚMINA La Figura 59 muestra el resultado de ensayos de unión a la albúmina para las variantes de ABD L64G N66D, I65A/N66D, N66S/T70S* e Y61A/N66S/T70S y para el tipo salvaje.
FIG. 60 ENSAYO DE UNIÓN A LA ALBÚMINA La Figura 60 muestra el resultado de ensayos de unión a la albúmina para las variantes de ABD Y60A/Y61A, Y60T/Y61A, I65A/N66D/V71A, Y61A/I65A/V71A, L64A/N66D/V71 A y para el tipo salvaje.
FIG. 61 ENSAYO DE UNIÓN A LA ALBÚMINA La Figura 61 muestra el resultado de ensayos de unión a la albúmina para las variantes de ABD Y60A/Y61A/V71A, Y60T/Y61A/V71A, L64A/I65A/V71A y para el tipo salvaje.
FIG. 62 ENSAYO DE UNIÓN A LA ALBÚMINA La Figura 62 muestra el resultado de ensayos de unión a la albúmina para las variantes de ABD L64G/I65A/V71A, L64G/N66D/V71A, Y61A/T70S, N66S, T70S, Y61 A/N66S, L64A/I65A y para el tipo salvaje.
FIG. 63 PROPIEDADES DE FARMACOCINÉTICA MEJORADAS DE LAS VARIANTES CD16xCD32B ABD-DART Y ABD-DART EN RATONES C57BL/6 La Figura 63 muestra las propiedades de farmacocinética mejoradas de las variantes CD16 x CD32B ABD-DARTS y ABD-DART en ratones C57B1/6. Los ratones (n=3) se inyectaron con una inyección intravenosa única de ABD- Proteínas DART a 5 mg/kg. Se recolectó el suero de ratón en varios momentos de medición y las concentraciones de proteína en el suero se calificaron por ELISA. Los cálculos de farmacocinética se realizaron con el uso de WinNonlin Professional 5.1 FIG. 64A y 64B PROTEÍNAS DART ABD MULTIVALENTES Las Figuras 64A y 64B ilustran las estructuras de DARTs que contienen ABDs multivalentes, construidas por fusión de ABDs al final de ambas cadenas (hCD16xhCD32B E ABD/K ABD DART) (Figura 64A) o por fusión de ABDs en tánden al final de una cadena (hCD16xhCD32B E ABD ABD/K DART) (Figura 64B).
FIG. 65(A-C) ACTIVIDAD BIESPECÍFICA DE ABD DARTs hCD16xhCD32B Las Figuras 65A-65C ilustran la actividad biespecífica de hCD16xhCD32B ABD DARTs con el uso de ELISA específico dual. Se recubrieron placas de ELISA con 2 µg/ml de antígeno CD16. Las concentraciones variables de ABD DARTs y Fe DART se unieron a la placa. Finalmente se agregó antígeno sD32B biotinilado a la placa seguido de Estreptavidina conjugada con HRP para detección.
FIG. 66 VIDA MEDIA SÉRICA DE DARTS ABD Y DARTS FC La Figura 66 muestra los resultados de un estudio de PK in vivo en el cual los ratones C57B1/6 recibieron una sola inyección IV de DARTS ABD o DARTs Fe (5 mg/kg) con el fin de evaluar vida media sérica. 5. DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS Cada cadena de polipéptido de la molécula de diacuerpo comprende un dominio VL y un dominio VH, que están ligados en forma covalente de manera tal que los dominios estén limitados de auto armarse. La interacción de dos de las cadenas de polipéptidos producirán dos pares de VL-VH, formando dos sitios de unión al epítope, es decir, una molécula bivalente. Ninguno de los dominios VH o VL se restringe a ninguna posición dentro de la cadena de polipéptidos, es decir, se restringe al término amino (N) o carboxi (C), como tampoco se restringen los dominios en sus posiciones relativas entre sí, es decir, el dominio VL puede ser N-terminal al dominio VH y viceversa. La única restricción es que una cadena de polipéptido complementaria esté disponible con el fin de formar diacuerpo funcional. Donde los dominios VL y VH derivan del mismo anticuerpo, las dos cadenas complementarias de polipéptidos pueden ser idénticas. Por ejemplo, donde los dominios de unión derivan de un anticuerpo específico para el epítope A (es decir, el dominio de unión se forma a partir de una interacción de VLA-VHA), cada polipéptido comprenderá un VHA y un VLA. La homodimerización de dos cadenas de polipéptidos del anticuerpo producirá la formación de dos sitios de unión VLA-VHA, lo que produce un anicuerpo monoespecífico. Donde los dominios VL y VH derivan de anticuerpos específica para diferentes antígenos, la formación de un diacuerpo biespecífico funcional requiere la interacción de dos cadenas de polipéptidos diferentes, es decir, formación de un heterodímero. Por ejemplo, para un diacuerpo biespecífico, una cadena de polipéptido comprenderá un VLA y un VLB; la homodimerización de dicha cadena producirá la formación de dos sitios de unión VLA-VHB, ya sea sin unión o de unión impredecible. En contraste, donde dos cadenas de polipéptidos diferentes estén libres para interactuar, por ej., en un sistema de expresión recombinante, uno que comprende un VLA y u VHB y el otro que comprende un VLB y un VHA, dos sitios de unión diferentes formarán: VLA-VHA y VLB-V¾. Para los pares de cadenas de polipéptidos, la posibilidad de deficiencia de alineación o de unión de las dos cadenas es una posibilidad, es decir, la interacción de dominios VL-VL o VH-VH; sin embargo, la purificación de diacuerpos funcionales se maneja fácilmente en base a la inmunoespecificidad del sitio de unión dimerizado apropiadamente con el uso de cualquier método basado en afinidad conocido en el área o ejemplificado en este documento, por ej., cromatografía por afinidad.
En otras realizaciones, una o más de las cadenas de polipéptidos del diacuerpo comprende un dominio Fe. Los dominios Fe en las cadenas de polipéptidos de las moléculas de diacuerpo dimerizarán con preferencia, lo que produce la formación de una molécula del diacuerpo que exhibe propiedades similares a la inmunoglobulina, interacciones por ej., Fc-FcyR,. Los diacuerpos que contienen Fe pueden ser dímeros, por ej., formados por dos cadenas de polipéptidos, donde cada una comprende un dominio VH, un dominio VL y un dominio Fe. La dimerización de dichas cadenas de polipéptidos produce un diacuerpo bivalente que comprende un dominio Fe, aunque con una estructura distinta de la de un anticuerpo bivalente no modificado (FIG. 11). Dichas moléculas de diacuerpo exhibirán fenotipos alterados con relación a una inmunoglobulina de tipo salvaje, por ej., vida media sérica alterada, propiedades de unión, etc. En otras realizaciones, las moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe pueden ser tetrámeros. Dichos tetrámeros comprenden dos cadenas de polipéptidos "más pesadas", es decir una cadena de polipéptido que comprende un dominio VL, VH y un dominio Fe, y dos cadenas de polipéptidos "más livianas", es decir, cadena de polipéptido que comprende un VL y un VH. Dichas cadenas más livianas y más pesadas interactúan para formar un monómero, y dichos monómeros interactúan por medio de sus dominios Fe sin pares para formar una molécula con aspecto de Ig. Dicho diacuerpo con aspecto de Ig es tetravalente y puede ser monoespecífico, biespecífíco o tetraespecífico.
Los por lo menos dos sitios de unión de la molécula de diacuerpo pueden reconocer epítopes iguales o diferentes. Diferentes epítopes pueden ser del mismo antígeno o epítopes de diferentes antígenos. En una realización, los epítopes son de células diferentes. En otra realización, los epítopes son de antígenos de superficie celular en la misma célula o virus. Los sitios de unión a los epítopes pueden reconocer cualquier antígeno al cual puede generarse un anticuerpo. Por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, toxinas bacterianas, marcadores de la superficie celular, marcadores autoinmunes, proteínas virales, fármacos, etc. En aspectos particulares, por lo menos un sitio de unión al epítope del diacuerpo es específico para un antígeno en una célula particular, tales como una célula B o célula T, una célula fagocitótica, una célula asesina natural (NK) o una célula dendrítica.
Cada dominio de la cadena de polipéptido del diacuerpo, es decir, el dominio VL, VH y FC puede ser separado por una ligadura de péptido. La ligadura de péptido puede ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 aminoácidos. En ciertas realizaciones la secuencia de ligadura de aminoácidos es GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) codificada por la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NRO.: 74).
En ciertas realizaciones, cada cadena de polipéptido de la molécula de diacuerpo se diseña para comprender por lo menos un residuo de cisteína que interactuará con una contraparte por lo menos un residuo de cisteína en una segunda cadena de polipéptido de la invención para formar un enlace de disulfuro entre cadenas. Dichos enlaces de disulfuro entre cadenas sirven para estabilizar la molécula de diacuerpo, mejorando la expresión y recuperación en sistemas recombinantes, lo que produce una formulación estable y consistente así como también mejorar la estabilidad del produto aislado y/o purificado in vivo. Dicho por lo menos un residuo de cisteína puede introducirse como una cadena de aminoácido simple o como parte de una secuencia de aminoácido más grande, por ej. dominio de bisagra, en cualquier porción of the polypeptide chain. En una realización específica, dicho por lo menos un residuo de cisteína está diseñado para ocurrir en el extremo terminal C de la cadena de polipéptidos. En algunas realizaciones, dicho por lo menos un residuo de cisteína se introduce en la cadena de polipéptido dentro de la secuencia de aminoácidos LGGC. En una realización específica, el extremo terminal C de la cadena de polipéptido que comprende la molécula de diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos LGGC. En otra realización, dicho por lo menos un residuo de cisteína se introduce en el polipéptido dentro de una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio de bisagra, por ej. SEC ID NRO.: 1 o SEC ID NRO.: 4. En una realización específica, el extremo terminal C de una cadena de polipéptido de la molécula de diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de una IgG dominio de bisagra, por ej. SEC ID NRO.: 1. En otra realización, el extremo terminal C de una cadena de polipéptido de una molécula del diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEC ID NRO.: 77), que pueden codificarse por medio de secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 78). En otras realizaciones, dicho por lo menos un residuo de cisteína se introduce en la cadena de polipéptido dentro de la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (SEC ID NRO.: 17), que pueden codificarse por medio de la secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 76). En una realización específica, el extremo terminal C de una cadena de polipéptido que comprende el diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (SEC ID NRO.: 17), que pueden codificarse por medio de la secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 76). Incluso, en otras realizaciones, dicho por lo menos un residuo de cisteína se introduce en la cadena de polipéptido dentro de la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEC ID NRO.: 23), que pueden codificarse por medio de la secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 75). En una realización específica, el extremo terminal C de una cadena de polipéptido que comprende el diacuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEC ID NRO.: 23), que pueden codificarse por medio de la secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 75).
En ciertas realizaciones, la molécula de diacuerpo comprende por lo menos dos cadenas de polipéptidos, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos LGGC y están ligadas en forma covalente por una unión de disulfuro entre los residuos de cisteína en dichas secuencias LGGC. En otra realización específica, la molécula de diacuerpo comprende por lo menos dos cadenas de polipéptidos, una de las cuales comprende la secuencia FNRGEC (SEC ID NRO.: 23) mientras que la otra comprende un dominio de bisagra (que contiene por lo menos un residuo de cisteína), en donde dichas por lo menos dos cadenas de polipéptidos están ligadas en forma covalente por una unión de disulfuro entre el residuo de cisteína en FNRGEC (SEC ID NRO.: 23) y un residuo de cisteína en el dominio de bisagra. En aspectos particulares, el residuo de cisteína responsable del enlace de disulfuro ubicado en el dominio de bisagra es Cys-128 (según la numeración de acuerdo con Kabat EU; located en el dominio de bisagra de una cadena pesada de IgG intacta, no modificada) y el residuo de cisteína contraparte en la SEC ID NRO.: 23 es Cys-214 (según la numeración de acuerdo con Kabat EU; ubicado en el extremo terminal C de una cadena de IgG intacta, no modificada) (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains, " J. Biol. Chem. 280:14402-14412; incorporada en este documento en su totalidad a modo de referencia). Incluso, en otras realizaciones, el por lo menos un residuo de cisteína está diseñado para ocurrir en el extremo terminal N de la cadena de aminoácidos. Incluso en otras realizaciones, el por lo menos un residuo de cisteína está diseñado para ocurrir en la porción de la ligadura de la cadena de polipeptido de la molécula de diacuerpo. En realizaciones adicionales, the VH o VL dominio se diseña para comprender por lo menos una modificación de aminoácido con relación al dominio VH o VL de origen de manera tal que dicha modificación de aminoácido comprende una sustitución de un aminoácido de origen con cisteína.
La invención abarca moléculas de diacuerpo que comprenden un dominio Fe o porción de los anteriores (por ej. un dominio CH2, o dominio CH3). El dominio Fe o porción de los anteriores puede derivar de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina que incluyen, aunque sin limitarse a, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En realizaciones preferidas, el dominio Fe (o porción de los anteriores) deriva de IgG. En realizaciones específicas, el isotipo de IgG es IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 o un alotipo de los anteriores. En una realización, la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fe, which Fe dominio comprende un dominio CH2 y dominio CH3 seleccionado en forma independiente de cualquier isotipo de inmunoglobulina (es decir un dominio Fe que comprende el dominio CH2 derivado de IgG y el dominio CH3 que deriva de IgE, o el dominio CH2 derivado de IgGl y el dominio CH3 derivado de IgG2, etc.). Dicho dominio de Fe puede diseñarse en una cadena de polipéptido que comprende la molécula de diacuerpo de la invención en cualquier posición con relación a otros dominios o porciones de dicha cadena de polipéptido (por ej., el dominio de Fe, o porción de los anteriores, puede ser del extremo terminal C para ambos dominios VL y VH del polipéptido de la cadena; puede ser n-terminal para ambos dominios VL y VH; o puede ser n-terminal para un dominio y de extremo terminal C para otro (es decir, entre dos dominios de la cadena de polipéptidos)).
La presente invención abarca, además, moléculas que comprenden un dominio de bisagra. El dominio de bisagra es derivado de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina que incluyen IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En realizaciones preferidas, el dominio de bisagra deriva de IgG, en donde el isotipo de IgG es IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4, o un alotipo de los anteriores. Dicho dominio de bisagra puede diseñarse en una cadena de polipéptido que comprende la molécula de diacuerpo junto con un dominio Fe de manera tal que la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc-bisagra. En ciertas realizaciones, el dominio Fe y de bisagra se seleccionan en forma independiente de cualquier isotipo de inmunoglobulina conocido en la técnica o ejemplificado en este documento. En otras realizaciones el dominio Fe y de bisagra se separan por medio de por lo menos un dominio distinto de la cadena de polipéptidos, por ej., el dominio VL. El dominio de bisagra, o en forma opcional el dominio bisagra-Fc, puede diseñarse en un polipéptido de la invención en cualquier posición con relación a otros dominios o porciones de dicha cadena de polipéptido. En ciertas realizaciones, una cadena de polipéptido de la invención comprende un dominio de bisagra, cuyo dominio de bisagra se encuentra en el extremo terminal C de la cadena de polipéptidos, en donde dicha cadena de polipéptido no comprende un dominio Fe. Incluso, en otras realizaciones, una cadena de polipéptido de la invención comprende un dominio Fc-bisagra, cuyo dominio bisagra-Fc se encuentra en el extremo terminal C de la cadena de polipéptidos. En realizaciones adicionales, una cadena de polipéptido de la invención comprende un dominio Fc-bisagra, cuyo dominio bisagra-Fc se encuentra en el extremo terminal N de la cadena de polipéptidos.
Como se discutió con anterioridad, la invención abarca multímeros de cadenas de polipéptidos, cada una de cuyas cadenas de polipéptidos comprenden un dominio VH y VL. En ciertos aspectos, las cadenas de polipéptidos en dichos multímeros comprenden en forma adicional un dominio Fe. La dimerización de los dominios Fe conduce a la formación de una molécula del diacuerpo que exhibe funcionalidad similar a la inmunoglobulina, es decir, función mediada por Fe (por ej., interacción Fc-Fc R, unión complementaria, etc.). En ciertas realizaciones, los dominios VL y VH que comprende cada cadena de polipéptido tienen la misma especificidad, y dicha molécula del diacuerpo es bivalente y monoespecífica. En otras realizaciones, los dominios VL y VH que comprende cada cadena de polipéptido tienen diferente especificidad y el diacuerpo es bivalente y biespecífico.
Incluso, en otras realizaciones, las moléculas de diacuerpo de la invención abarcan tetrámeros de cadenas de polipéptidos, cada una de cuya cadena de polipéptido comprende un dominio VH y VL. En ciertas realizaciones, dos cadenas de polipéptidos del tetrámero comprenden en forma adicional un dominio Fe. El tetrámero por lo tanto está formado por dos cadenas de polipéptidos "más pesadas", donde cada una comprende un dominio VL, VH y Fe, y dos cadenas de polipéptidos "más livianas", que comprenden un dominio VL y VH. La interacción de una cadena más pesada y más liviana en un monómero bivalente acoplado con dimerization de dichos monómeros por medio de los dominios Fe de las cadenas más pesadas conducirá a la formación de una molécula con estructura de inmunoglobulina tetravalente (se ejemplifica en el Ejemplo 6.2 y Ejemplo 6.3). En ciertos aspectos los monómeros son iguales, y la molécula tetravalente del diacuerpo is monospecific o biespecífico. En otros aspectos los monómeros son diferentes, y la molécula tetravalente es biespecífica o tetraespecífica.
La formación de una molécula del diacuerpo tetraespecífico como se describió con anterioridad requiere la interacción de cuatro diferentes de polipéptidos. Dichas interacciones son difíciles de lograr con eficiencia dentro de un sistema de producción recombinante de células simples, debido a las muchas variantes de potenciales emparejamientos erróneos de la cadena. Una solución para aumentar la probabilidad de emparejamientos erróneos, es diseñar mutaciones del tipo "bultos en orificios" en los pares deseados de la cadena de polipéptidos. Dichas mutaciones favorecen la heterodimerización por sobre la homodimerización. Por ejemplo, con respecto a interacciones Fc-Fc, una sustitución de aminoácidos (con preferencia una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral volumétrico que forma un "bulto", por ej., tryptophan) puede introducirse en el dominio CH2 o CH3 de manera tal que la interferencia estérica evitará la interacción con un dominio mutado en forma similar y obligará al dominio mutado a emparejarse con un dominio en el cual una complementariedad, o mutación de acomodación se ha diseñado, es decir, 'el orificio' (por ej., una sustitución con glicina). Dichos conjuntos de mutaciones pueden diseñarse en cualquier par del polipéptidos que comprende la molécula de diacuerpo, y además, se diseña en una porción de las cadenas de polipéptidos de dicho par. Los métodos de diseño de proteínas para favorecer la heterodimerización por sobre la homodimerización se conocen muy bien en la materia, en particular con respecto a el diseño de moléculas con aspecto de inmunoglobulina, y se abarcan en este documento (véase por ej., Ridgway et al. (1996) " 'knobs-in-holes ' Engineering Of CH3 Antibody Domains for Heavy Chain Heterodimerization , " Proteina Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domaín Interface Of A Homodimer usina A Phage Display Library, " J. Mol. Biol. 270: 26-35, y Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expresión y Tumor Cell Lysis, " J. Immunol. Métodos 296:95-101; cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad).
La invención abarca, además, moléculas de diacuerpo que comprenden dominios variantes Fe de bisagra o variantes Fe (o porción de los anteriores), cuyo dominio de Fe variante comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ej. sustitución, inserción, eliminación) con relación a un dominio Fe tipo salvaje comparable o dominio Fe de bisagra (o porción de los anteriores). Las moléculas que comprenden dominios variantes Fe o dominiso Fe de bisagra (o porción de los anteriores) (por ej., anticuerpos) normalmente tienen fenotipos alterados con relación una moléculas que comprenden dominios Fe tipo salvaje o dominios Fe de bisagra o porciones de los anteriores. El fenotipo variante puede expresarse como vida media sérica alterada, estabilidad alterada, susceptibilidad alterada a enzimas celulares o alteración de la función efectora según se evalúa en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófago. Los dominios variantes Fe identificados como aquellos que alteran la función efectora se divulgan en la Solicitud Internacional WO04/063351, Publicaciones de Solicitud de Patente de los EE UU 2005/0037000 y 2005/0064514, Solicitudes Provisionales de los EE UU 60/626,510, presentada el 10 de noviembre de 2004, 60/636,663, presentada el 15 de diciembre de 2004, y 60/781,564, presentada el 10 de marzo de 2006, y Solicitudes de Patentes de EE UU 11/271, 140, presentada el 10 de noviembre de 2005, y 11/305,787, presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes concurrentes de los Inventores, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.
Los diacuerpos biespecífícos de la invención pueden unir en forma simultánea dos epítopes separados y distintos. En ciertas realizaciones los epítopes son del mismo antígeno. En otras realizaciones, los epítopes son de diferentes antígenos. En realizaciones preferidas, por lo menos un sitio de unión al epítope es específico para un determinante expresado en una célula efectora inmune (por ej. CD3, CD16, CD32, CD64, etc.) que se expresan en los linfocitos T, células asesinas naturales (NK) u otras células mononucleares. En una realización, la molécula de diacuerpo se une a la célula determinante generadora de respuesta y además activa dicha célula efectora. En este aspecto, las moléculas de diacuerpo de la invención pueden exhibir funcionalidad similar a Ig independiente de si comprenden en forma adicional un dominio Fe (por ej., como se evalúa en cualquier ensayo de la función efectora conocido en la técnica o ejemplificado en este documento (por ej., ensayo ADCC). En ciertas realizaciones el diacuerpo biespecífico de la invención se une tanto a un antígeno de cáncer en una célula tumoral como una célula efectora determinante mientras que activa dicha célula. En realizaciones alternativas, el diacuerpo biespecífico o molécula del diacuerpo de la invención puede inhibir la activación de una célula blanco, por ej., efectora, por unión simultánea de, y de este modo entrecruzamiento, un receptor de activación e inhibición en la misma célula (por ej., se une tanto a CD32A como CD32B, BCR y CD32B, o IgERI y CD32B) como se describió con anterioridad (véase, Sección de Antecedentes). En un aspecto adicional de esta realización, el diacuerpo biespecífico puede exhibir propiedades anti-virales por unión simultánea de dos epítopes neutralizantes en un virus (por ej., epítopes RSV; epítopes WNV tales como E16 y E53).
En ciertas realizaciones, las moléculas biespecíficas de diacuerpo de la invención ofrecen oportunidades únicas para dirigir tipos de células específicas. Por ejemplo, el diacuerpo biespecífico o molécula del diacuerpo puede diseñarse para comprender una combinación de sitios que se unen al epítope que reconocen un conjunto de antígenos únicos para una célula de destino o tipo de tejido. En forma adicional, donde cualquiera o ambos de los antígenos individuales es/son bastante comunes separados en otro tejido y/o Tipo de Células, pueden usarse dominios de unión de baja afinidad para construir el diacuerpo o molécula del diacuerpo. Dichos dominios de baja afinidad serán incapaces de unirse al epítope o antígen individual con suficiente avidez para fines terapéuticos. Sin embargo, donde ambos epítopes o antígenos estén presentes en una célula o tejido de destino único, la avidez del diacuerpo o molécula del diacuerpo por la célula o el tejido, con relación a una célula o tejido que expresa solamente uno de los antígenos, aumentará de manera tal que dicha célula o tejido puede dirigirse en forma efectiva por la invención. Dicha molécula biespecífica puede exhibir unión potenciada a uno o ambos de sus antígenos de destino en células que expresan ambos de dichos antígenos con relación a un diacuerpo monoespecífico o un anticuerpo con una especificidad por solamente uno de los antígenos.
Con preferencia, las propiedades de unión de los diacuerpos de la invención se caracterizan por ensayo funcionales in vitro para determinar la actividad de unión y/o una o más funciones de la célula electora del mediador de FcyR (mediadas por la interacción Fc-FcyRs o por la unión inmunoespecífica de una molécula del diacuerpo a un FcyR) (Remitirse a la sección 5.4.2 y 5.4.3). Las afinidades y propiedades de unión de las moléculas, por ej., diacuerpos, de la invención para un FcyR pueden determinarse con el uso de ensayos in vitro (ensayos con base bioquímica o inmunológica) conocidos en la materia para la determinación de la unión dominio-antígeno o interacción Fc-FcyRs, es decir, la unión específica de un antígeno a un dominio de unión o la unión específica de una región de Fe a un FcyR, respectivamente, que incluyen aunque sin limitarse a ensayo ELISA, ensayo por resonancia plasmónica de superficie, ensayos de inmunoprecipitación (Remitirse a la sección 5.4.2). En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la invención tienen propiedades similares de unión en modelos in vivo (tales como aquellas que se describen y se divulgan en este documento) como aquellos ensayos de base in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye moléculas de la invención que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos de base in vitro pero no exhiben el fenotipo deseado en vivo.
En algunas realizaciones, las moléculas de la invención se diseñan para comprender un patrón de glicosilación alterada o una glicoforma alterada con relación a la porción comparable de la molécula patrón. Las glicoformas diseñadas pueden ser útiles para una variedad de finalidades, que incluyen, aunque sin limitarse a, potenciación de la función efectora. Las glicoformas diseñadas pueden generarse por medio de cualquier método conocido por los expertos en el arte, por ejemplo por medio del uso de cepas de expresión variantes o diseñadas, por la co-expresión con una o más enzimas, por ejemplo, DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIl l), por medio de la expresión de un diacuerpo de la invención en varios organismos o líneas celulares de varios organismos, o por la modificación de carbohidrato(s) después de que el diacuerpo se ha expresado y purificado. Los métodos para generar glicoformas diseñadas se conocen en la materia, e incluyen aunque no se limitan a aquellos que se describen en Umana et al. (1999) "Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgGl With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity, " Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fe Gamma RIII, " Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgGl N-Linked Oligosaccharide Improves Binding to Human Fe gamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity, " J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al. (2003) "The Absence Of Fucose But Not The Presence of Galactose o Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgGl Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, " J Biol Chem 278:3466-3473) US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/1 13,929; PCT WO 00/61739A1 ; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, NJ); tecnología de diseño de glicosilación GlycoMAb™ (biotecnología GLYCART AG, Zurich, Suiza); cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. Véase, por ej., WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al. (2004) "Fucose Depletion From Human IgGl Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Entre IgGl y FcGammaRIIIA, " JMB, 336: 1239-49 cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
La invención abarca, además, la incorporación de aminoácidos no naturales para generar los diacuerpos de la invención. Dichos métodos are known to those skilled en la materia tales como those con el uso de the natural biosynthetic machinery to allow la incorporación de aminoácidos no naturales into proteínas, véase, or ej., Wang et al. (2002) "Expanding The Genetic Code, " Chem. Comm. 1 : 1-11; Wang et al. (2001) "Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli, " Science, 292: 498-500; van Hest et al. (2001) "Protein-Based Materials, Toward A New Level OfStructural Control, " Chem. Comm. 19: 1897-1904, cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. Las estrategias alternativas se basan en las enzimas responsables de la biosíntesis de amino acil-tARN, véase, por ej., Tang et al. (2001) "Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Proteín Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host, " J. Am. Chem. Soc. 123(44): 1 1089-1 1090; iick et al. (2001) "Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli, " FEBS Lett. 502(1 -2):25-30; cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
En algunas realizaciones, la invención abarca métodos para la modificación de un dominio VL, VH o Fc de una molécula de la invención mediante el agregado o eliminación de un sitio de glicosilación. Los métodos para modificar el carbohidrato de las proteínas se conocen muy bien en la materia y se abarcan dentro de la invención, véase, por ej., Patente de los EE UU Nro. 6,218,149; EP 0 359 096 Bl ; U.S. Publication No. US 2002/0028486; WO 03/035835; U.S. Publication No. 2003/01 15614; Patente de los EE UU Nro. 6,218,149; Patente de los EE UU Nro. 6,472,511 ; la totalidad de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
Las moléculas de diacuerpo de la presente invención pueden construirse para comprender un dominio que es un ligando de unión para el receptor del Grupo 2D Asesino Natural. Dichos ligandos de unión, y en particular aquellos que no se expresan en células normales, incluyen la molécula de histocompatilibilidad 60 (H60), el producto del gen-1 inducible en su etapa inicial por ácido retinoico (RAE-1), y la transcripción 1 símil proteína murina que se une a UL16 (MULT1) (Raulet D.H. (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands " Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells " Blood 106: 171 1-1717). Los ligandos adicionales reactivos con NKG2D humano incluyen las moléculas relacionadas con la cadena de clase I de MHC polimórfico MICA y MICB (Diefenbach, A. et al. (1999) "Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In," Curr. Biol. 9(22):R851-R8533; Bauer, S. et al. (1999) "Activation ofNK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA " Science 285(5428):727-729; Stephens, H.A. (2001) "MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved?," Trends Immunol. 22:378-385.
La secuencia de MICA es SEC ID NRO.: 311: MGLGPVFLLL AG I FPFAPPG AAAE PHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH LDGQP FLRCD RQKCRAKPQG QWAE DVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL AH IKDQKEGL HSLQE I RVCE I HE DNSTRSS QH FYYDGELF LSQNLETKEW TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA La secuencia de MICB es SEC ID NRO.: 312: PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCEIHED SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLA N VTNFWKEDAM KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT LT RQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RTDFPYVSAA MPCFVIIIIL CVPCCKKKTS AAEGP Los anticuerpos que se unen en forma específica al receptor de células T incluyen el anticuerpo anti-TCR BMA 031 (Kurrle, R. et al. (1989) "BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antihody For Clinical Application " Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) "Fine Specificity Of A Panel of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression, and Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human a/ß T Cell," J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expresión y Caracterización de Humanized Antibodies Directed Against The Human a/ß T Cell Receptor " J. Immunol. 147(12):4366-4373). Los anticuerpos que se unen en forma específica al receptor NKG2D incluyen KYK-2,0 (Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, and Caracterización de A Human Anti-NKG2D humano Monoclonal Anticuerpo Con Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156; y PCT/US09/54911).
A través del uso de dicho diacuerpo, la célula de destino se re-dirige ahora para ser una célula que puede unirse por células que forman el receptor (NK.G2D). El receptor NKG2D se expresa en todas las células asesinas naturales humanas (y de otros mamíferos) (Bauer, S. et al. (1999) "Activation of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA " Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing " Immunity 17(1): 19-29) así como también en todas las células T CD8+ (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation 0 €O8aß T Cells By NKG2D by the Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells " Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "7%e Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing " Immunity 17(1): 19-29).
En forma alternativa, las moléculas de diacuerpo de la presente invención pueden construirse para comprender un dominio que es un ligando de unión para el receptor de células T ("TCR"). El TCR se expresa en forma negativa por células T CD4+ o CD8+, y permiten que dichas células reconozcan péptidos antigénicos que se uneny se presentan por proteínas MHC de clase I o clase II de células que presentan antígenos. El reconocimiento del complejo pMHC (péptido-MHC) por medio de un TCR inicia la propagación de una respuesta inmune celular que conduce a la producción de citoquinas y la lisis de la célula que presenta antígenos (véase, por ej., Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes " Biochem. J. 415(Pt 2): 183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T Cell Epitopes For Adoptive T Cell Therapy," Cytometry A. 73(11): 1093-1099; Beier, .C. et al. (2007) "Master Switches Of T Cell Activation And Differentiation," Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes," Am. J. Ther. 12(6):534-550).
Por medio de la construcción de dichas moléculas de diacuerpo para comprender en forma adicional por lo menos un dominio que se une al epítope capaz de unirse a, por ejemplo, un receptor presente sobre la superficie de una célula de destino, dichas moléculas de diacuerpo serán moléculas DART y de este modo serán capaces de unirse a las células de destino y de este modo harán que las células de destino muestren el ligando de unión para el receptor del Grupo 2D Asesino Natural o para el TCR (cualquiera esté presente en el diacuerpo que se une a la célula) (véase, por ej., Germain, C. et al. (2008) "Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein " Prot. Engineer. Design Selection 21(11):665-672).
Dichos diacuerpos pueden usarse para re-dirigir cualquier célula de destino deseada en una célula que es un blanco de lisis celular mediada por células NK o la citotoxicidad mediada por células T. En una realización, el dominio que se une al epítope del diacuerpo capaz de unirse a un receptor presente sobre la superficie de una célula de destino es un epítope que se une a un antígeno asociado con el tumor de manera tal que dirige dichas células con cáncer en sustratos para lisis celular mediada por células NK o la citotoxicidad mediada por células T. Es de particular interés un antígeno asociado con los tumores que es un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de ovarios, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de cáncer de cuello de útero, un antígeno de cáncer de páncreas, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de vesícula, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer de testículos, un antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una enfermedad de las células B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no de Hodgkins, o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.
Los antígenos asociados con tumores apropiados para dicho uso incluyen A33 (un antígeno de carcinoma colo-rectal; Almqvist, Y. 2006, Nucí Med Biol. Nov;33(8):991-998); Bl (Egloff, A.M. et al. 2006, Cáncer Res. 66(l):6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); beta-catenina (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); CA125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cáncer 15 Suppl 3:274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33 (2): 167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): 1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 1 l(l):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N YAcad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (antígeno carcinoembriónico; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fértil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidérmico; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cáncer. 90 Spec No:S228-32); Erb (ErbBl; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J C ncer. 118(1 ): 123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cáncer Immunol Immunother. 54(10):1018-25); gplOO (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); HER-2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); human papillomavirus-E6/human papillomavirus-E7 (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; SA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005 Cáncer Treat Res. 123: 157-80); MAGE (MAGE-1 ; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fértil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); N-acetilglucosaminiltransferasa (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(l):21-34); pl5 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA (antígeno específico de la próstata; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (Ragupathi, G. 2005 Cáncer Treat Res. 123:157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); receptor de TNF (receptor de TNF-a, receptor de TNF-ß; o receptor de TNF-?; van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. l l(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. l(4):327-64); o receptor de VEGF (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. l l(9):992-8).
Los antígenos asociados con tumores adicionales para dicho uso (y publicaciones que divulgan específicamente anticuerpos reactivos para dichos antígenos) incluyen ADAM-9 (Publicación de Patente de los Estados Unidos Nro. 2006/0172350; Publicación por PCT Nro. WO 06/084075); ALCAM (Publicación por PCT Nro. WO 03/093443); Carboxipeptidasa M (Publicación de Patente de los Estados Unidos Nro. 2006/0166291); CD46 (Patente de los Estados Unidos Nro. 7,148,038; Publicación por PCT Nro. WO 03/032814); Citoqueratina 8 (Publicación por PCT Nro. WO 03/024191); Receptores de efrina (y en particular EphA2 (Patente de los Estados Unidos Nro. 7,569,672; Publicación por PCT Nro. WO 06/084226); Alfa-V-Beta-6 Integrina (Publicación por PCT Nro. WO 03/087340); JAM-3 (Publicación por PCT Nro. WO 06/084078); KID3 (Publicación por PCT Nro. WO 05/028498); KID31 (Publicación por PCT Nro. WO 06/076584); LUCA-2 (Publicación de Patente de los Estados Unidos Nro. 2006/0172349; Publicación por PCT Nro. WO 06/083852); Oncostatina M (Oncostatin Receptor Beta) (Patente de los Estados Unidos Nro. 7,572,896; Publicación por PCT Nro. WO 06/084092); PIPA (Patente de los Estados Unidos Nro. 7,405,061; Publicación por PCT Nro. WO 04/043239); RAAG10 (Patente de los Estados Unidos Nro. 7,527,969; Publicación por PCT Nro. WO 04/001381); ROR1 (Patente de los Estados Unidos Nro. 5,843,749); TES 7 (Publicación por PCT Nro. WO 08/066691); y el Receptor de Transferrina (Patente de los Estados Unidos Nro. 7,572,895; Publicación por PCT Nro. WO 05/121179).
Además son de interés los antígenos específicos para agentes infecciosos particulares, por ej., viral agents que incluyen, aunque sin limitarse a virus de inmunodeficiencia humana (HIV), virus de hepatitis B (HBV), gripe, virus del papiloma humano (HPV), pie y boca (coxsackievirus), el virus de la rabia, virus de herpes simple (HSV), y los agentes causantes de gastroenteritis, que incluyen rotavirus, adenovirus, calicivirus, astrovirus y virus de Norwalk; agentes bacterianos que incluyen, aunque sin limitarse a E. coli, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus infiuenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis y Streptococcus pneumoniae, agentes fiingicos y parásitos tales como Giardi.
En forma alternativa, dicho epítope puede unirse a un receptor de Fe (por ej., FcyRI o FcyRII), con el fin de, por ejemplo redirigir las células leucémicas monocíticas agudas en sustratos para lisis celular mediada por células NK. 5.1 DOMINIOS DE UNIÓN DE DIACUERPOS Los diacuerpos de la presente invención comprenden dominios de unión a los antígenos que derivan en general de inmunoglobulinas o anticuerpos. Los anticuerpos de los cuales los dominios de unión usados en los métodos de la invención derivan pueden ser de cualquier origen animal que incluyen aves y mamíferos (por ej., humano, primate no humano, murino, burro, oveja, conejo, cabra, cobayo, camello, caballo, o pollo). Con preferencia, los anticuerpos son anticuerpos humanos o humanizados monoclonales. Como se usa en este documento, anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o bibliotecas de secuencias de codificación de inmunoglobulina humana sintética o del arroz que expresa anticuerpos de genes humanos.
La invención contempla el uso de cualquier anticuerpo conocido en la materia para el tratamiento y/o prevención del cáncer, enfermedad autoinmune, enfermedad inflamatoria o enfermedad infecciosa como origen de los dominios de unión para los diacuerpos de la invención. Algunos ejemplos no limitativos de anticuerpos conocidos contra el cáncer se proporcionan en la sección 5.7.1 así como también otros anticuerpos específicos para los antígenos de destino mencionados y antígenos de anticuerpos contra el cáncer enumerados en la sección 5.6.1 ; algunos ejemplos no limitativos ejemplos de anticuerpos conocidos para el tratamiento y/o prevención de enfermedad autoinmune y enfermedad inflamatoria se proporcionan en la sección 5.7.2. así como también anticuerpos contra los antígenos de destino mencionados y anticuerpos contra los antígenos enumerados en la sección 5.6.2; en otras realizaciones pueden usarse anticuerpos contra epítopes asociados con enfermedades infecciosas como se enumera en la sección 5.6.3. En ciertas realizaciones, los anticuerpos comprenden una región Fe variante que comprende una o más modificaciones de aminoácidos, que se han identificado por medio de los métodos de la invención porque tienen una función efectora conferida y/o afinidad potenciada por FcyRIIB y una afinidad reducida por FcyRIIIA con relación a una molécula comparable que comprende una región de Fe de tipo salvaje. Un ejemplo no limitativo de los anticuerpos que se usan para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios que pueden diseñarse de acuerdo con la invención se presenta en la Tabla 9, y un ejemplo no limitativo de los anticuerpos que se usan para el tratamiento o la prevención de trastorno autoinmune se presenta en la Tabla 10.
Para algunos usos, que incluyen el uso in vivo de los anticuerpos en humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible el uso de diacuerpos con dominios variables derivados de anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados. Los dominios variables de anticuerpos completamente humanos se desean en particular el tratamiento terapéutico de sujetos humanos. Los anticuerpos humanos pueden realizarse por una variedad de métodos conocidos en la materia que incluyen métodos de visualización de fago descritos con anterioridad con el uso de bibliotecas de anticuerpos derivados de secuencias de inmunoglobulina humana. Véase también Patentes de EE UU Nros. 4,444,887 y 4,716,111 ; y Publicaciones Internacionales Nros. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741 ; cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo, una variante o un fragmento de los anteriores que es capaz de unirse a un antígeno predeterminado y que comprende una región de marco que tiene en forma sustancial la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana y un CDR que tiene en forma sustancial la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado puede comprender en forma sustancial la totalidad de por lo menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los cuales todas o en forma sustancial la totalidad de las regiones de CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones de marco son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana.
Las regiones de CDR y marco de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder precisamente a las secuencias de origen, por ej., el CDR donante o el marco de consenso puede mutagenizarse por sustitución, inserción o eliminación de por lo menos un residuo de modo tal que el CDR o residuo de marco en ese sitio no corresponde a ninguno del anticuerpo de consenso o donante. Dichas mutaciones, sin embargo, con preferencia no son extensivos. Usualmente, por lo menos 75% de los residuos de anticuerpo humanizados corresponderán a aquellas de la región de marco de origen (FR) y secuencias de CDR, con mayor frecuencia 90%, y con mayor preferencia más del 95%. Los anticuerpos humanizados pueden producirse con el uso de una variedad de técnicas conocidas en la materia, que incluyen aunque sin limitarse a, injerto de CDR (Patente Europea Nro. EP 239,400; Publicación Internacional Nro. WO 91/09967; y Patentes de EE UU Nros. 5,225,539, 5,530,101, y 5,585,089), recubrimiento o reformación de la superficie (Patentes Europeas Nros. EP 592,106 y EP 519,596; Padlan (1991) "A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Variable Antibody Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties, " Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) "Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues, " Proteína Engineering 7(6):805-814; y Roguska et al. (1994) "Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing, " Proc Nati Acad Sci USA 91 :969-973), reacomodamiento de cadena (Patente de los EE UU Nro. 5,565,332), y técnicas divulgadas en, por ej., Patentes de EE UU Nros. 6,407,213, 5,766,886, 5,585,089, Publicación Internacional Nro. WO 9317105, Tan et al. (2002) " 'Superhumanized' Antibodies: Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Región Grafting With Human Germline Sequences: Application To An Anti-CD28, " J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al. (2000) "Diseño y Synthesis Of Germline-Based Hemi-Humanized Single-Chain Fv Against The CD18 Surface Antigen, " Proteín Eng. 13:353-60, Morea et al. (2000) "Anticuerpo Modeling: Implications For Engineering And Design, " Methods 20:267-79, Baca et al. (1997) "Anticuerpo Humanization With the Use of Monovalent Phage Display, " J. Biol. Chem. 272: 10678-84, Roguska et al. (1996) "A Comparison Of Two Murine Monodonal Antibodies Humanized By CDR Graft And Variable Dominio Resurfacing, " Protein Eng. 9:895-904, Couto et al. (1995) "Designing Human Consensus Antibodies With Minimal Positional Templates, " Cáncer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s, Couto et al. (1995) "Anti-BA46 Monodonal Anticuerpo Mc3: Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In Vitro Characterization, " Cáncer Res. 55:1717-22, Sandhu (1994) "A Rapid Procedure For The Humanization Of Monodonal Antibodies, " Gene 150:409-10, Pedersen et al. (1994) "Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Dominios. Implication For Humanization Of Murine Antibodies, " J. Mol. Biol. 235:959-973, Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In a Human Antibody With Those From A Mouse, " Nature 321 :522-525, Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy, " Nature 332:323-327, y Presta (1992) "Antibody Engineering, " Curr. Op. Biotech. 3(4):394-398. Con frecuencia, los residuos de marco en las regiones de marco se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo de CDR donante para alterar, con preferencia mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de marco are identified by métodos well conocidos en la materia, por ej., por modelado de las interacciones del CDR y los residuos de marco para identificar los residuos de marco importante para unión al antígeno y comparación de la secuencia para identificar residuos de marco inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ej., Queen et al, Patente de los EE UU Nro. 5,585,089; Publicaciones de EE UU Nros. 2004/0049014 y 2003/0229208; Patentes de EE UU Nros. 6,350,861 ; 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; y 5,530,101 y Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy, " Nature 332:323-327, la totalidad de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en sus totalidades.).
En una realización más preferida, el dominio de unión humanizado se une en forma específica al mismo epítope que el anticuerpo murino donante. Una persona con experiencia en el arte apreciará que la invención abarca injerto CDR de los anticuerpos en general. De este modo, los anticuerpos donante y receptor puede derivar de animales de la misma especie e incluso la misma clase o sub-clase de anticuerpo. Más usualmente, sin embargo, los anticuerpos donante y receptor derivan de animales de diferentes especies. Normalmente el anticuerpo donante es un anticuerpo no humano, tales como un mAb de roedor y el anticuerpo receptor es un anticuerpo humano.
En algunas realizaciones, por lo menos un CDR del anticuerpo donante se injerta sobre el anticuerpo humano. En otras realizaciones, por lo menos dos y con preferencia la totalidad de tres CDRs de cada una de las regiones variables de cadena liviana y/o pesada se injertan sobre el anticuerpo humano. Los CDRs pueden comprender los CDRs de Kabat, los CDRs del circuito estructural o una combinación de los anteriores. En algunas realizaciones, la invención abarca un anticuerpo FcyRIIB inmunizado que comprende por lo menos una cadena pesada de injerto de CDR y por lo menos una cadena liviana de injerto de CDR.
Los diacuerpos usados en los métodos de la invención incluyen derivados que se modifican, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al diacuerpo. Por ejemplo, aunque no a modo de limitación, los derivados de diacuerpo incluyen diacuerpos que se han modificado, por ej., por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por medio de grupos protectores/ de bloqueo conocidos, descomposición proteolítica, ligadura a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo por técnicas conocidas, que incluyen, aunque sin limitarse a, descomposición química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. En forma adicional, el derivado puede contener uno o más aminoácidos clásicos.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porcioens del anticuerpo derivan de diferentes moléculasde inmunoglobulina tales como anticuerpos having a región variable derivado de a non-humun anticuerpo and una inmunoglobulina humana constant región. Los métodos for producing anticuerpos quiméricos se conocen en la materia. Véase por ej., Morrison (1985) "Transfectomes Provide Novel Chimeric Antibodies, " Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) "Chimeric Antibodies, " BioTechniques 4:214-221 ; Gillies et al. (1989) "High-Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Región Cassettes, " J. Immunol. Methods 125:191-202; y Patentes de EE UU Nros. 6,311,415, 5,807,715, 4,816,567, y 4,816,397, las cuales se incorporan en este documento a modo de referencia en su totalidad.
Con frecuencia, los residuos de marcos en las regiones de marco se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo de CDR donante para alterar, con preferencia mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de marco se identifican por métodos muy conocidos en la materia, por ej., por modelado de las interacciones del CDR y los residuos de marco para identificar los residuos de marco importante para unión al antígeno y comparación de la secuencia para identificar residuos de marco inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ej., Patente de los EE UU Nro. 5,585,089; y Riechmann et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy, " Nature 332:323-327, las cuales se incorporan en este documento a modo de referencia en sus totalidades.) Los anticuerpos monclonales de los cuales los dominios de unión de los diacuerpos de la invención pueden prepararse con el uso de una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinante y de visualización de fago, o una combinación de los anteriores. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse con el uso de técnicas de hibridoma que incluyen aquellas conocidas en la materia y se enseñan, por ejemplo, en Harlow et al, Antibodies: A Laboratorv Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al, en: Monoclonal Antibodies and T Cell Hvbridomas. pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (ambos de los cuales se incorporan a modo de referencia en sus totalidades). El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en este documento no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hidriboma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un clon simple, que incluye cualquier clon eucariótico, procariótico o fago, y no el método por el cual se produce.
Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos con el uso de la tecnología de hibridoma son de rutina y muy conocidos en la materia. En un ejemplo no limitativo, los ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés o una célula que expresa dicho antígeno. Una vez que se ha detectado la respueta inmunológica, por ej., anticuerpos específicos para el antígeno se detectan en el suero de ratón, el bazo del ratón se cosecha y se aislan los esplenocitos. Luego los esplenocitos se fusionan por técnicas muy conocidas a cualquier célula de mieloma apropiada. Los hibridomas se seleccionan y se clonan limitando la dilución. Los clones de hibridoma luego se evalúan por métodos conocidos en la materia para células que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno. El fluido de ascitis, que en general contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse por inoculación de ratones por vía intraperitoneana con clones de hidridoma positivos. Los antígenos de interés incluyen, aunque no se limitan a, antígenos asociados con los cánceres que se presentan en la sección 5.8.1, antígenos asociados con las enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias presentadas en la sección5.8.2, antígenos asociados con las enfermedades infecciosas provistas en la sección 5.8.3, y las toxinas provistas en la sección 5.8.4.
También pueden generarse anticuerpos con el uso de various métodos de visualización de fago conocidos en la materia. En los métodos de visualización de fago, los dominios de anticuerpos funcionales se visualizan sobre la superficie de partículas de fago que llevan las secuencias de polinucleótidos que las codifican. En una realización particular, dicho fago puede utilizarse para mostrar dominios de unión a los antígenos, tales como Fab y Fv o Fv estabilizado con unión a disulftiro, expresado a partir de una biblioteca de anticuerpos combinatorios o repertorios (por ej., humano o murino). El fago que expresa un dominio que se une al fago que se une al antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con antígeno, por ej., con el uso de antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie o perla sólida. Los fagos usados en estos métodos normalmente son fago filamentosos, que incluyen fd y MI 3. Los dominios de unión a los antígenos se expresan como proteína fusionada en forma recombinante a cualquiera del gen de fagoIII o la proteína del gen VIII. Algunos ejemplos de métodos de visualización de fago que pueden usarse para hacer las inmunoglobulinas, o fragmentos de los anteriores, de la presente invención incluyen aquellos divulgados en Brinkmann et al. (1995) "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments, " J. Immunol. Métodos, 182:41-50; Ames et al. (1995) "Conversión Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Inmunoglobulins, " J. Immunol. Métodos, 184: 177-186; Kettleborough et al. (1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Anticuerpo Librarles And The Re-Construcción de Whole Antibodies From These Anticuerpo Fragments, " Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al. (1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies o Their Fragments After Selection From Phage Display Librarles, " Gene, 187:9-18; Burton et al. (1994) "Human Antibodies From Combinatorial Libraries, " Advances in Immunology, 57:191-280; PCT Application No. PCT/GB91/01134; Publicaciones por PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401 ; y Patentes de EE UU Nros. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
La tecnología de visualización de fago puede usarse para aumentar la afinidad de un anticuerpo por su antígeno. Esta técnica sería útil en la obtención de anticuerpos de alta afinidad. La tecnología, denominada maduración por afinidad, emplea mutagénesis o movimiento de CDR y re-selección con el uso del antígeno cognato para identificar anticuerpos que se unen con mayor afinidad al antígeno cuando compared con el anticuerpo inicial o de origen (Véase, por e .,Glaser et al. (1992) "Dissection Of The Combining Site In an Humanized Anti-Tac Antibody, " J. Immunology 149:2607-2614). La mutagénesis entre codones en lugar de nucleótidos individuales produce un repertorio aleatorizado de mutaciones de aminoácidos. Pueden construirse bibliotecas que consisten en un pool de clones variantes cada uno de los cuales difiere por una sola alteración en la cadena de aminoácidos en un CDR individual y que contiene variantes que representan cada posible sustitución de aminoácidos para cada residuo de CDR. Los mutantes con mayor afinidad de unión por el antígeno puede seleccionarse por medio del contacto de los mutantes inmovilizados con antígeno marcado. Cualquier método de selección conocido en la materia puede usarse para identificar anticuerpos mutantes con aumento de la avidez al antígeno (por ej., ELISA) (Véase Wu et al. (1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized mAb, " Proc Nati. Acad Sci. USA 95:6037-6042; Yelton et al. (1995) "Affinity Maturation Of The Br96 Anti-Carcinoma Anticuerpo By Codon-Based Mutagénesis, " J. Immunology 155:1994-2004). El movimiento de CDR que radomiza la cadena liviana también es posible (Véase Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of Complementarity Determinant Regions In The Center Del anticuerpo Binding Site, " J. Mol. Bio. 263:551-567).
La presente invención abarca, además, el uso de dominios de unión que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de unión descritos en este documento o conocidos en la materia con mutaciones (por ej., una o más sustituciones de aminoácidos) en el marco o las regiones de CDR. Con preferencia, las mutaciones en estos dominios de unión mantienen o potencian la avidez y/o afinidad de los dominios de unión por FcyRIIB a los cuales se unen en forma inmunoespecífica. Las técnicas estándar conocidas por aquellas personas con experiencia en la materia (por ej., inmunoensayos) pueden usarse para evaluar la afinidad de un anticuerpo para un antígeno particular.
Las técnicas estándar conocidas por aquellas personas con experiencia en la materia pueden usarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifican un anticuerpo, o fragmento de los anteriores, que incluyen, por ej., mutagénesis orientada al sitio y mutagénesis mediada por PCR, lo cual produce sustituciones de aminoácidos. Con preferencia, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con relación al anticuerpo original o fragmento de los anteriores. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones de aminoácidos conservadores hechas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. 5.1.1 DIACUERPOS QUE COMPRENDEN SITIOS QUE SE UNEN AL EPÍTOPE QUE SE UNEN EN FORMA INMUNOESPECÍFICA AFcyRIIB En una realización particular, por lo menos uno de los dominios de unión de los diacuerpos de la invención agoniza por lo menos una actividad de FcyRIIB. En una realización de la invención, dicha actividad es la inhibición de señalización mediada por el receptor de células B. En otra realización, el dominio de unión inhibe activación de células B, proliferación de las células B, producción de anticuerpos, influjo de calcio intracelular de células B, progresión del ciclo de las células, o actividad de una o más moléculas de señalización descendente en la vía de transducción de señal de FcyRIIB. Incluso en otra realización, el dominio de unión potencia la fosforilación de FcyRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una realización adicional de la invención, el dominio de unión inhibe la actividad de quinasa MAP o reclutamiento de Akt en la vía de señalización mediada por el receptor de células B. En otra realización, el dominio de unión agoniza la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcsRI. En una realización particular, dicho dominio de unión inhibe la activación de mastocitos inducida por FCGRI, movilización del calcio, desgranulación, producción de citoquinas, o liberación de serotonina. En otra realización, los dominios de unión de la invención estimulan la fosforilación de FcyRIIB, estimulan el reclutamiento de SHIP, estimulan la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, o inhiben la activación de miembros de la familia de quinasa MAP (por ej., Erkl, Erk2, JNK, p38, etc.). Incluso en otra realización, los dominios de unión de la invención potencian la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra realización, los dominios de unión de la invención inhiben la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos o macrófagos.
En otra realización, los dominios de unión antagonize por lo menos una actividad de FcyRIIB. En una realización, dicha actividad es activación de señalización mediada por el receptor de células B. En una realización particular, los dominios de unión potencian la actividad de las células B, proliferación de las células B, producción de anticuerpos, intracellular calcium influx, o actividad de una o más moléculas de señalización descendente en la vía de transducción de señal de FcyRIIB. Incluso otra realización particular, los dominios de unión reducen la fosforilación de FcyRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una realización adicional de la invención, los dominios de unión potencian la actividad de quinasa o reclutamiento de Akt en la vía de señalización mediada por el receptor de células B. En otra realización, los dominios de unión antagonize la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FceRI. En una realización particular, los dominios de unión enhance la activación de mastocitos inducida por FCERI, movilización del calcio, desgranulación, producción de citoquinas, o liberación de serotonina. En otra realización, los dominios de unión inhiben la fosforilación de FcyRIIB, inhiben el reclutamiento de SHIP, inhiben la fosforilación de y su asociación con Shc, potencian la activación de miembros de la familia de quinasa MAP (por ej., Erkl, Erk2, JNK, p38, etc.). Incluso en otra realización, los dominios de unión inhiben la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra realización, los dominios de unión potencan la fagocitosis mediada por FcyR en monocitos o macrófagos. En otra realización, los dominios de unión previenen la fagocitosis, depuración de partículas opsonizadas por macrófagos esplénicos.
En otras realizaciones, por lo menos uno de los dominios de unión pueden usarse para dirigir los diacuerpos de la invención a células que expresan FcyRIIB.
En una realización particular, uno de los dominios de unión deriva de un anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6 o 3H7, que tiene números de acceso a ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente. Los hibridomas que producen los anticuerpos 2B6 y 3H7 se han depositado en la American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 13 de agosto de 2002 bajo las disposiciones del tratado de Budapest on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures, y recibieron los números de acceso PTA-4591 (para producir el hibridoma 2B6) y PTA-4592 (para producir el hibridoma 3H7), respectivamente, y se incorporan en este documento a modo de referencia. En una realización preferida, los dominios de unión son humanos o se han humanizado, con preferencia derivan de una versión humanizada del anticuerpo producido por el clon 3H7 o 2B6.
La invención abarca, además, los diacuerpos con dominios de unión a partir de otros anticuerpos, que se unen en forma específica a FcyRIIB, con preferencia FcyRIIB humano, con mayor preferencia FcyRIIB humana nativa, que derivan de clones que incluyen aunque sin limitarse a 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, y 1F2 que tiene números de acceso a ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. Los hibridomas que producen los clones identificados con anterioridad se depositaron bajo las disposiciones del tratado de Budapest con el American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209) el 7 de mayo de 2004, y se incorporan en este documento a modo de referencia. En realizaciones preferidas, los dominios de unión de los anticuerpos descritos con anterioridad, son inmunizados.
En una realización específica, los dominios de unión usados en los diacuerpos de la presente invención son de un fragmento que se une al anticuerpo o antígeno de los anteriores (por ej., que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs), con preferencia la totalidad de los 6 CDRs) del anticuerpo producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. En otra realización, el dominio de unión se une al mismo epítope que el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2, respectivamente y/o compite con el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 según se determina, por ej., en an ensayo ELISA o otro inmunoensayo competitivo apropiado, y además se une a FcyRIIB con una mayor afinidad que el dominio de unión se une a FcyRIIA.
La presente invención abarca, además, los diacuerpos con dominios de unión que comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena variable pesada y/o cadena variable liviana que es por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la cadena variable pesada y/o cadena liviana del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. La presente invención abarca, además, los diacuerpos con dominios de unión que se unen en forma específica a FcyRIIB con mayor afinidad que dicho anticuerpo o fragmento de los anteriores se une a FcyRIIA, y que comprenden una secuencia de aminoácidos de one o más CDRs que es por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de uno o más CDRs del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. La determinación del porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos pueden determinarse por cualquier método conocido por los expertos en el arte, que incluyen búsquedas de proteínas por BLAST.
La presente invención abarca, además, el uso de diacuerpos que contienen dominios de unión que se unen en forma específica a FcyRIIB con mayor afinidad que dominio de unión se une a FcyRIIA, los cuales están codificados por una secuencia de nucleótidos que se híbrida a la secuencia de nucleótidos del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 en condiciones rigurosas. En una realización preferida, el dominio de unión se une en forma específica a FcyRIIB con mayor afinidad que FcyRIIA, y comprende una cadena variable liviana y/o cadena variable pesada codificada por una secuencia de nucleótidos que se híbrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de la cadena variable liviana y/o cadena variable pesada del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 en condiciones rigurosas. En otra realización preferida, los dominios de unión se unen en forma específica a FcyRIIB con mayor afinidad que FcyRIIA, y comprenden uno o más CDRs codificados por una secuencia de nucleótidos que se híbrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de uno o más CDRs del anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen, aunque no se limitan a, hibridación al ADN adherido al filtro en citrato de sodio/ cloruro de sodio 6X (SSC) a alrededor de 45°C seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC/0,1% SDS a alrededor de 50-65°C, condiciones altamente rigurosas tales como hibridación al ADN adherido al filtro en SSC 6X a alrededor de 45°C seguido de uno o más lavados en 0,1X SSC/0,2% SDS a alrededor de 60°C, o cualquier otra condición de hibridación rigurosa conocida por aquellas personas expertas en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology. vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley and Sons, Inc., NY en las páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2,10,3, incorporadas aquí a modo de referencia).
La presente invención abarca, además, el uso de dominios de unión que comprenden la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los dominios de unión descritos con anterioridad con mutaciones (por ej., una o más sustituciones de aminoácidos) en el marco o las regiones de CDR. Con preferencia, las mutaciones en estos dominios de unión mantienen o potencian la avidez y/o afinidad de los dominios de unión por FcyRIIB a los cuales se unen en forma inmunoespecífica. Las técnicas estándar conocidas por aquellas personas con experiencia en la materia (por ej. , inmunoensayos) pueden usarse para evaluar la afinidad de un anticuerpo para un antígeno particular.
Las técnicas estándar conocidas por aquellas personas con experiencia en la materia pueden usarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifican un anticuerpo, o fragmento de los anteriores, que incluyen, or ej., mutagénesis orientada al sitio y mutagénesis mediada por PCR, lo cual produce sustituciones de aminoácidos. Con preferencia, los derivados incluyen menos de 15 sustituciones de aminoácidos, menos de 10 sustituciones de aminoácidos, menos de 5 sustituciones de aminoácidos, menos de 4 sustituciones de aminoácidos, menos de 3 sustituciones de aminoácidos, o menos de 2 sustituciones de aminoácidos con relación al anticuerpo original o fragmento de los anteriores. En una realización preferida, los derivados tienen sustituciones de aminoácidos conservadores hechas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos.
En realizaciones preferidas, los dominios de unión derivan de anticuerpos humanizados. Un anticuerpo específico de FcyRIIB humanizado puede comprender en forma sustancial la totalidad de por lo menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los cuales todas o en forma sustancial la totalidad de las regiones de CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones de marco son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana.
Los diacuerpos de la presente invención comprenden dominios variables específicos humanizados para FcyRIIB en los cuales una o más regiones de uno o más CDRs de las regiones variables de cadena liviana y/o pesada de un anticuerpo humano (el anticuerpo receptor) se ha sustituido por partes análogas de uno o más CDRs de un anticuerpo monoclonal donante que se une en forma específica a FcyRIIB, con una mayor afinidad que FcyRIIA, por ej., un anticuerpo monclonal producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados se unen al mismo epítope que 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2, respectivamente.
En una realización preferida, las regiones de CDR del dominio de unión FcyRIIB humanizado derivan de un anticuerpo murino específico para FcyRIIB. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados descritos en este documento comprenden alteraciones, que incluyen aunque sin limitarse a eliminaciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos, del anticuerpo receptor, es decir, regiones de marco de dominio variable de cadena liviana y/o pesada, humanas que son necesarias para retener la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal donante. En algunas realizaciones, las regiones de marco de los anticuerpos humanizados descritos en este documento no necesariamente consiste en la secuencia precisa de aminoácidos de the región de marco de una región variable del anticuerpo humano natural, sino que contiene varias alteraciones, que incluyen aunque sin limitarse a eliminaciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos que alteran la propiedad del anticuerpo humanizado, por ejemplo, mejoran las propiedades de unión de un anticuerpo humanizado región que es específico para el mismo objetivo que el anticuerpo específico murino FcyRIIB. En las realizaciones más preferidas, una cantidad mínima de alteraciones se realizan a la región de marco con el fin de evitar introducciones a gran escala de residuos de marco no humanos y asegurar la inmunogenicidad mínima del anticuerpo inmunizado en humanos. El anticuerpo monoclonal donante es con preferencia un anticuerpo monclonal producido por los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D1 1, o 1F2.
En una realización específica, el dominio de unión abarca dominios variables de un anticuerpo con injerto de CDR que se une en forma específica a FcyRIIB con una mayor afinidad que dicho anticuerpo se une a FcyRIIA, en donde el anticuerpo con injerto CDR comprende a cadena pesada región variable dominio que comprende residuo de marcos of el anticuerpo receptor y residuos del anticuerpo monoclonal donante, que se une en forma específica a FcyRIIB con una mayor afinidad que dicho anticuerpo se une a FcyRIIA, por ej., anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. En otra realización específica, los diacuerpos de la invención comprenden dominios variables de un anticuerpo con injerto de CDR que se une en forma específica a FcyRIIB con una mayor afinidad que dicho anticuerpo se une a FcyRIIA, en donde el anticuerpo con injerto CDR comprende a cadena liviana región variable dominio que comprende residuo de marcos of el anticuerpo receptor y residuos del anticuerpo monoclonal donante, que se une en forma específica a FcyRIIB con una mayor afinidad que dicho anticuerpo se une a FcyRIIA, por ej., anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2.
Los dominios variables anti- FcyRIBB humanizados usados en la invención pueden tener una cadena pesada región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEC ID NRO.: 24 o SEC ID NRO.: 25) y/o CDR2 (SEC ID NRO.: 26 o SEC ID NRO.: 27) y/o CDR3 (SEC ID NRO.: 28 o SEC ID NRO.: 29) y/o una cadena liviana región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 (SEC ID NRO.: 30 o SEC ID NRO.: 31) y/o a CDR2 (SEC ID NRO.: 32, SEC ID NRO.: 33, SEC ID NRO.: 34, o SEC ID NRO.: 35) y/o CDR3 (SEC ID NRO.: 36 o SEC ID NRO.: 37).
En una realización específica, el diacuerpo comprende dominios variables de un anticuerpo 2B6 humanizado, en donde la región VH consiste en los fragmentos FR del segmento VH de la línea germinal humana VH1-18 (Matsuda et al. (1998) "The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy Chain Variable Región Locus, " J. Exp. Med. 188:2151-2162) and JH6 (Ravetch et al. (1981) "Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus: Caracterización de Embryonic And Rearranged J And D Genes, " Cell 27(3 Pt. 2): 583-91), y una o más regiones de CDR del 2B6 VH, que tiene la secuencia de aminoácidos de SED ID NO:24, SEC ID NRO.: 26, o SEC ID NRO.: 28. En una realización, el 2B6 VH tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NRO.: 38. En otra realización el dominio 2B6 VH tiene la secuencia de aminoácidos de Hu2B6VH, SEC ID NRO.: 85, y puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NRO.: 86. En otra realización específica, el diacuerpo comprende, en forma adicional, una región VL, que consiste en los segmentos FR del segmento VL de la línea germinal humana VK-A26 (Lautner-Rieske et al. (1992) "The Human Immunoglobulin Kappa Locus. Caracterización de The Duplicated A Regions, " Eur. J. Immunol. 22:1023-1029) and JK4 (Hieter et al. (1982) "Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Región Genes, " J. Biol. Chem. 257:1516-22), y una o más regiones de CDR of 2B6VL, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NRO.: 30, SEC ID NRO.: 32, SEC ID NRO.: 33, SEC ID NRO.: 34, y SEC ID NRO.: 36. En una realización, el 2B6 VL tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NRO.: 39; SEC ID NRO.: 40, o SEC ID NRO.: 41. En una realización específica, el 2B6 VL tiene la secuencia de aminoácidos de Hu2B6VL, SEC ID NRO.: 87, y puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos provista en la SEC ID NRO.: 88.
En otra realización específica, el diacuerpo tiene dominios variables de un anticuerpo 3H7 humanizado, en donde la región VH consiste en los fragmentos FR de un segmento VH de la linea germinal humana y las regiones de CDR del 3H7 VH, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NRO.. 35. En otra realización específica, the humanized 3H7 anticuerpo comprende, en forma adicional, una región VLs, que consiste en los segmentos FR de un segmento VL de línea germinal humana y las regiones de CDR de 3H7VL, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NRO.: 42.
En particular, dominios de unión inmunológica se unen en forma específica a dominios extracelulares de FcyRIIB humano nativo, y comprenden (o en forma alternativa, consisten en) secuencias de CDR de 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2, en cualquiera de las siguientes combinaciones: un VH CDRl y un VL CDRl ; un VH CDRl y un VL CDR2; un VH CDRl y un VL CDR3; un VH CDR2 y un VL CDRl ; VH CDR2 y VL CDR2; un VH CDR2 y un VL CDR3; un VH CDR3 y un VH CDRl ; un VH CDR3 y un VL CDR2; un VH CDR3 y un VL CDR3; un VH1 CDRl, un VH CDR2 y un VL CDRl; un VH CDRl , un VH CDR2 y un VL CDR2; un VH CDRl , un VH CDR2 y un VL CDR3; un VH CDR2, un VH CDR3 y un VL CDRl, un VH CDR2, un VH CDR3 y un VL CDR2; un VH CDR2, un VH CDR2 y un VL CDR3; un VH CDRl, un VL CDRl y un VL CDR2; un VH CDRl, un VL CDRl y un VL CDR3; un VH CDR2, un VL CDRl y un VL CDR2; un VH CDR2, un VL CDRl y un VL CDR3; un VH CDR3, un VL CDRl y un VL CDR2; un VH CDR3, un VL CDRl y un VL CDR3; un VH CDRl , un VH CDR2, un VH CDR3 y un VL CDRl; un VH CDRl, un VH CDR2, un VH CDR3 y un VL CDR2; un VH CDRl, un VH CDR2, un VH CDR3 y un VL CDR3; un VH CDRl, un VH CDR2, un VL CDRl y un VL CDR2; un VH CDRl, un VH CDR2, un VL CDRl y un VL CDR3; un VH CDRl, un VH CDR3, un VL CDRl y un VL CDR2; un VH CDRl, un VH CDR3, un VL CDRl y un VL CDR3; un VH CDR2, un VH CDR3, un VL CDRl y un VL CDR2; un VH CDR2, un VH CDR3, un VL CDRl y un VL CDR3; un VH CDR2, un VH CDR3, un VL CDR2 y un VL CDR3; un VH CDRl, un VH CDR2, un VH CDR3, un VL CDRl y un VL CDR2; un VH CDRl, un VH CDR2, un VH CDR3, un VL CDRl y un VL CDR3; un VH CDRl , un VH CDR2, un VL CDRl, un VL CDR2, y un VL CDR3; un VH CDRl, un VH CDR3, un VL CDRl, un VL CDR2, y un VL CDR3; un VH CDR2, un VH CDR3, un VL CDRl, un VL CDR2, y un VL CDR3; o cualquiera de las combinaciones de los anteriores de los VH CDRs y VL CDRs divulgados en este documento.
Los anticuerpos para derivar los dominios de unión que se incluirán en los diacuerpos de la invención pueden caracterizarse en forma adicional por mapeo de epítopes, de modo tal que puedan seleccionarse anticuerpos que tengan la mayor especificidad por FcyRIIB cuando se compara con FcyRIIA. Los métodos de mapeo de epítopes de los anticuerpos se conocen muy bien en la materia y se abarcan dentro de los métodos de la invención. En ciertas realizaciones proteínas de fusión que comprende una o más regiones de FcyRIIB pueden usarse en el trazado del mapa del epítope de un anticuerpo de la invención. En una realización específica, la proteína de fusión contiene la secuencia de aminoácidos de una región de un FcyRIIB fusionada a una porción Fe de IgG2 humana. Cada proteína de fusión puede comprender en forma adicional sustituciones de aminoácidos y/o reemplazos de ciertas regiones del receptor con la región correspondiente de un receptor homólogo, por ej., FcyRIIA, como se muestra en la Tabla 2 a continuación. pMGX125 y pMGX132 contienen el sitio de unión de IgG del receptor de FcyRIBB, el primero con el extremo terminal C de FcyRIBB y el último con el extremo terminal C de FcyRIIA y puede usarse para diferenciar la unión al extremo terminal C. Los otros tienen sustituciones de FcyRIIA en el sitio de unión de IgG y cualquiera del extremo terminal N de FcylIA o FcylIB. Estas moléculas pueden ayudar a determinar la parte de la molécula del receptor donde se unen los anticuerpos.
Tabla 2. Lista de las proteínas de fusión que pueden usarse para investigar el epítope de los anticuerpos anti-FcyRIIB monoclonales. Los residuos 172 a 180 pertenecen al sitio de unión de IgG de FcyRIIA y B. Los aminoácidos específicos de la secuencia de FcyRIIA están en negrita.
Las proteínas de fusión pueden usarse en cualquier ensayo bioquímico para la determinación de unión a un anticuerpo anti FcyRIIB de la invención, por ej., un ELISA. En otras realizaciones, la confirmación adicional de la especificidad por el epítope puede realizarse por medio del uso de péptidos con residuos específicos reemplazados con aquellos de la secuencia FcyRIIA.
Los anticuerpos pueden caracterizarse con el uso de ensayos para identificar la función de los anticuerpos de la invención, en particular la actividad de modular la señalización de FcyRIIB. Por ejemplo, los ensayos de caracterización de la invención pueden medir la fosforilación de los residuos de tirosina en el motivo ITIM de FcyRIIB, o medir la inhibición de la movilización del calcio generada or el receptor de células B. Los ensayos de caracterización de la invención pueden ser ensayos basados en células o libres de células.
Se ha establecido muy bien en la materia que en la co-agregación de mastocitos de FcyRIIB con el receptor de IgE de alta afinidad, FcsRI, conduce a la inhyibición de la desgranulación inducida por antígenos, movilización del calcio, y producción de citoquinas (Metcalfe D.D. et al. (1997) "Mastocytes, " Physiol. Rev. 77:1033-1079; Long E.O. (1999) "Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors, " Annu. Rev. Immunol. 17: 875-904). Los detalles moleculares de esta vía de señalización se han elucidado recientemente (Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammalIB Inhibition OfFc Epsilon RI Signaling, " i. Immunol. 162(9):4430-4439). Una vez coagregado con FcsRI, FcyRIIB se fosforila rápidamente sobre la tirosina en su motivo de ITIM, y luego recluta Src Homology-2 que contiene inositol-5-fosfatasa (SHIP), una 5-fosfatasa de inositol polifosfato que contiene un dominio SH2, que a su vez se fosforila y se asocia con Shc y p62dok (p62dok es el prototipo de una familia de moléculas adaptadora, que incluye dominios de señalización tales como un dominio de homología de plecstrina aminoterminal (PH domain), un dominio de PTB, y una región terminal carboxi que contiene motivos PXXP y numerosos sitios de fosforilación (Carpino et al. (1997) "p62(dok): A Constitutively Tyrosine-Phosphorilated, GAP-Associated Proteína In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Cells," Cell, 88: 197-204; Yamanshi et al. (1997) "Identification Of The Abl- And rasGAP -Associated 62 kDa Protein As A Docking Protein, Dok, " Cell, 88:205-211).
Los anticuerpos anti-FcyRIIB para usar en la invención pueden caracterizarse del mismo modo para determinar la capacidad de modular una o más respuestas mediadas por IgE. Con preferencia, las líneas celulares que co-expresan el receptor con alta afinidad de IgE y el receptor de bja afinidad por FcyRIIB se usará en la caracterización de los anticuerpos anti-FcyRIIB en la modulación de las respuestas mediadas por IgE. En una realización específica, se usarán las células de una línea celular de leucemia basofílica de rata (RBL-H23; Barsumian E.L. et al. (1981) "IgE-Induced Histamine Reléase From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones, " Eur. J. Immunol, 11 :317-323, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad) transfectadas con FcyRIIB humano de longitud completa. RBL-2H3 es una línea celular de rata bien caracterizada que se ha usado extensivamente para estudiar los mecanismos de señalización que siguen a la activación celular mediada por IgE. Cuando se expresa en células RBL -2H3 y coagregado con FceRI, FcyRIIB inhibe la movilización del calcio inducida por FCERI, desgranulación, y producción de citoquinas ( albec et al. (1998) "Fe Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Fosforilation Of Fe Gamma Receptor IIB During Negative Regulation Of Mastocyte Activation, " J. Immunol. 160:1647-1658; Daeron et al. (1995) "Regulation Of High-Affinity IgE Receptor-Mediated Mastocyte Activation By Murine Low-Affmity IgG Receptors, " J. Clin. Invest. 95:577; Ott V. L. (2002) "Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammalIB Inhibition Of Fe Epsilon RI Signaling, " J. Immunol. 162(9):4430-4439).
Los anticuerpos para usar en la invención también pueden estar caracterizados para la inhibición de activación de mastocitos inducida por FcsRI. Por ejemplo, las células de una línea celular de leucemia basofílica de rata (RBL-H23; Barsumian E.L. et al. (1981) "IgE-Induced Histamine Reléase From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones, " Eur. J. Immunol, 11 :317-323) que se han transfectado con FcyRIIB se sensibilizan con IgE y se estimulan en forma indistinta con fragmentos F(ab')2 de IgG anti-ratón de conejo, para agregar FcsRI solo, o con IgG anti-ratón de conejo completo para coagregar FcyRIIB y FcsRI. En este sistema, la modulación indirecta de moléculas de señalización descendente puede evaluarse luego de la incorporación de los anticuerpos de la invención a las células sensibilizadas y estimuladas. Por ejemplo, la fosforilación de tirosina de FcyRIIB reclutamiento y fosforilación de SHIP, activación de miembros de la familia de quinasa MAP, que incluyen aunque sin limitarse a Erkl, Erk2, JNK, o p38; y la fosforilación de tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y RasGAP puede evaluarse.
Un ensayo ejemplificativo para determinar la inhibición de activación de mastocitos inducida por FcsRI por los anticuerpos de la invención pueden incluir los siguientes: transfectar las células RBL-H23 con FcyRIIB humano; sensibilizar las células RBL-H23 con IgE; estimular células RBL-H23 con cualquiera de F(ab')2 de IgG anti-ratón de conejo (para agregar FcsRI solo y generar la señalización mediada por FceRI, como control), o estimular células RBL-H23 con IgG anti-ratón de conejo completo (para coagregar FcyRIIB y FCERI, lo que produce inhibición de la señalización mediada por FceRI). Las células que se han estimulado con anticuerpos IgG anti-ratón de conejo completo puede pre-incubarse en forma adicional con los anticuerpos de la invención. La medición de la actividad de FceRI de las células que se han pre-incubado con los anticuerpos de la invención y células que no se han pre-incubado con los anticuerpos de la invención, y que compara niveles de actividad dependiente de FceRI en estas células, indicarían una modulación de actividad dependiente de FcsRI por los anticuerpos de la invención.
El ensayo ejemplificativo descrito con anterioridad puede usarse por ejemplo, para identificar anticuerpos que bloquean la unión de ligandos (IgG) un receptor de FcyRIIB y antagonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FceRI por medio de la prevención de la co-agregación de FcyRIIB y FcsRI. Este ensayo del mismo modo identifica anticuerpos que potencian la co-agregación de FcyRIIB y FcsRI y agonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcsRI al promover la co-agregación de FcyRIIB y FceRI.
En algunas realizaciones, los diacuerpos anti-FcyRIIB, que comprenden los dominios de unión de epítopes de anticuerpos anti-FcyRIIB identificados descritos en este documento o conocidos en la materia, de la invención se caracterizan por su capacidad de modular una respuesta mediada por IgE por medio del monitoreo y/o la medición de la desgranulación de mastocitos o basófilos, con preferencia en un ensayo basado en células. Con preferencia, mastocitos o basófilos para usar en dichos ensayos se han diseñado para contener FcyRIIB humano con el uso de métodos recombinantes estándar conocidos por los expertos en el arte. En una realización específica los anticuerpos anti-FcyRIIB de la invención se caracterizan por su capacidad de modular una respuesta mediada por IgE en un ensayo de liberación de ß-hexosaminidasa basada en células (enzima contenida en los gránulos). La liberación de ß-hexosaminidasa de los mastocitos y basófilos es un evento primario en la afección inflamatoria y alérgica aguda (Aketani et al. (2001) "Correlation Between Cytosolic Calcium Concentration And Desgranulation In RBL -2H3 Cells In The Presence Of Varióos Concentrations Of Antigen-Specific IgEs, " Immunol. Lett. 75: 185-189; Aketani et al. (2000) "A Screening Method For Antigen-Specific IgE con el uso de Mastocitos Based On Intracellular Calcium Signaling, " Anal. Chem. 72: 2653-2658). Reléase of other inflammatory mediators que incluyen aunque sin limitarse a serotonin and histamine may be assayed to measure una respuesta mediada por IgE de acuerdo con los métodos de la invención. Aunque sin intención de ligarse a un mecanismo de acción particular, liberación de los gránulos tales como aquellos que contienen ß-hexosaminidasa de los mastocitos y basófilos es un proceso dependiente de la concentración de calcio intracelular que se inicia por el entrecruzamiento de FcyRIs con antígeno multivalente.
La habilidad de estudiar mastocitos humanos se ha limitado por la ausencia de cultivos de mastocitos humanos a largo plazo apropiados. Recientemente dos nuevas líneas de mastocitos humanos que dependen del factor de células cebada, designadas LAD 1 y LAD2, se establecieron de aspiraciones de médula ósea de un paciente con sarcoma de mastocito/leucemia (Kirshenbaum et al. (2003) "Caracterización de Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mastocyte Lines LAD 1 y 2 Established From a Patient With Sarcoma de mastocito/leucemia; Activation Following Aggregation Of FcRI o FcyRI, " Leukemia research, 27:677-82, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.). Ambas líneas celulares se han descrito para expresar FceRI y varios marcadores de mastocitos humanos. Las células LAD 1 y 2 pueden usarse para evaluar el efecto de los anticuerpos de la invención sobre respuestas mediadas por IgE. En una realización específica, los ensayos de liberación de ß-hexosaminidasa basado en células tales como las que se describieron con anterioridad pueden usarse en células LAD para determinar cualquier modulación de la respuesta mediada por IgE por medio de los anticuerpos anti-FcyRIBB de la invención. En un ensayo ejemplificativo, los mastocitos humanos, por ej., LAD 1, se ceban con anti-nitrofenol de IgE humana quimérica (NP) y se provocan con BSA-NP, el antígeno polivalente, y la desgranulación celular se monitorea por la medición de ß-hexosaminidasa liberada en el sobrenadante (Kirshenbaum et al. (2003) "Caracterización de Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mastocyte Lines LAD 1 y 2 Established From a Patient With Mastocyte Sarcoma /Keukemia; Activation Following Aggregation OfFcRI o FcyRI, " Leukemia research, 27:677-82, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.).
En algunas realizaciones, si los mastocitos humanos tienen una baja expresión de FcyRIIB endógeno, según se determina con el uso de métodos estándar conocidos en la materia, por ej., tintura de FACS, puede ser difícil monitorear y/o detectar diferencias en la activación de la vía de inhibición mediada por los diacuerpos anti-FcyRIIB de la invención. La invención abarca de este modo métodos alternativos, por lo cual la expresión de FcyRIIB puede regularse en forma ascendente con el uso de citoquinas y condiciones de crecimiento particulares. FcyRIIB se ha descrito por ser altamente regulado hacia arriba en líneas celulares de monocitos humanos, por ej., THP1 y U937, (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expresión y Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells, " J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089) y en monocitos humanos primarios (Pricop et al. (2001) "Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fe Gamma Receptors On Human Monocitos By Thl and Th2 Cytokines, " J. of Immunol., 166: 531-537) por IL4. La diferenciación de células U937 con AMP cíclico de dibutirilo has been described to increase expression of FcyRII (Cameron et al. (2002) "Differentiation Of The Human Monocyte Cell Line, U937, Con Dibutyryl CyclicAMP Induces The Expression Of The Inhibitory receptor de Fe, FcgammaRIIB, " Immunology Letters 83, 171-179). De este modo, la expresión endógena de FcyRIIB en mastocitos humanos para usar en los métodos de la invención puede regularse hacia arriba con el uso de citoquinas, por ej., IL-4, IL-13, con el fin de potenciar la sensibilidad de detección.
Los diacuerpos anti-FcyRIIB también pueden evaluarse para determinar la inhibición de la señalización mediada por el receptor de células B (BCR). la señalización mediada por BCR puede incluir por lo menos una o más respuestas biológicas descendentes, tales como activación y proliferación de células B, producción de anticuerpos, etc. La co-agregación de FcyRIIB y BCR conduce a la inhibición de la progresión del ciclo de las células y la sobrevida celular. Además, la co-agregación de FcyRIIB y BCR conduce a la señalización de señalización mediada por BCR.
Específicamente, la señalización mediada por BCR comprende por lo menos uno o más de los siguientes: modulación de moléculas de señalización desdeendente (por ej., estado de fosforilación de FcyRIIB, el reclutamiento de SHIP, localización de Btk y/o PLCy, actividad de quinasa MAP, reclutamiento de Akt (señal anti-apoptótica), movilización del calcio, progresión del ciclo de las células, y proliferación celular.
Aunque numerosas funciones de la inhibición mediada por la señalización de FcyRIIB de BCR están mediadas a través de SHIP, recientemente se ha demostrado que las células B activadas por lipopolisacárido (LPS) de ratones con deficiencia de SHIP exhiben significativa inhibición mediada por FcyRIIB de movilización del calcio, producción de Ins(l,4,5)P3, y fosforilación de Erk y Akt (Brauweiler et al. (2001) "Partially Distinct Molecular Mechanisms Medíate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells, " Journal of Immunology, 167(1): 204-211). De acuerdo con lo anterior, células B ex vivo de ratones con deficiencia de SHIP pueden usarse para caracterizar los anticuerpos de la invención. Un ensayo ejemplificativo para determinar la señalización de la inhibición mediada por FcyRIIB de BCR por los anticuerpos de la invención pueden comprender los siguientes: aislar células B de bazo de ratones con deficiencia de SHIP, activar dichas células con lipopolisacárido, y estimular dichas células con cualquiera de F(ab')2 anti-IgM para agregar BCR o con anti-IgM para co-agregar BCR con FcyRIIB. Las células que se han estimulado con anti-IgM intacta para coagregar BCR con FcyRIIB puede pre-incubarse en forma adicional con los anticuerpos de la invención. La actividad dependiente de FcyRIIB de las células puede medirse por técnicas estándar conocidas en la materia. Al comparar el nivel de la actividad dependiente de FcyRIIB en células que se han pre-incubado con los anticuerpos y células que no se han pre-incubado, y comparar los niveles se indicaría una modulación de la actividad dependiente de FcyRIIB por medio de los anticuerpos.
La medición de la actividad dependiente de FcyRIIB puede incluir, por ejemplo, medir la movilización intracelular del calcio por citometría de flujo, medir la fosforilación de Akt y/o Erk, medir la acumulación mediada por BCR de PI(3,4,5)P3, o medir la proliferación de céluals B mediada por FcyRIIB.
Los ensayos pueden usarse, por ejemplo, para identificar diacuerpos o anti-FcyRIIB anticuerpos para usar en la invención que modulan la señalización de la inhibición mediada por FcyRIIB de BCR mediante el bloqueo del sitio de unión al ligando (IgG) al receptor de FcyRIIB y antagonizar la señalización de la inhibición mediada por FcyRIIB de BCR mediante la prevención de la co-agregación de FcyRIIB y BCR. Los ensayos también pueden usarse para identificar los anticuerpos que potencian la co-agregación de FcyRIIB y BCR y agonizan la señalización de la inhibición mediada por FcyRIIB de BCR.
Los anticuerpos anti-FcyRIIB también pueden analizarse para determinar la señalización mediada por FcyRJI en monocitos/macrófagos humanos. La co-agregación de FcyRIIB con un receptor que lleva el motivo de activación basado en tirosina inmunosupresora (ITAM) actúa para regular hacia abajo, la fagocitosis mediada por FcyR con el uso de SHIP como su efector (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expresión y Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells, " J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089). La co-agregación de FcyRIIA con FcyRIIB produce rápida fosforilación del residuo de tirosina sobre el motivo ITIM de FcyRIIB, lo que conduce a una potenciación en la fosforilación de SHIP, asociación de SHIP con Shc, y fosforilación de las proteínas que tienen el peso molecular de 120 y 60-65 kDa. Además, la co-agregación de FcyRIIA con FcyRIIB produce la regulación hacia abajo de la fosforilación de Akt, que es una quinasa de serina-treonina que se ilvolucra en la regulación celular y sirve para suprimir la apoptosis.
Los diacuerpos anti-FcyRIIB también pueden evaluarse para determinar la inhibición de fagocitosis mediada por FcyR en monocitos/macrófagos humanos. Por ejemplo, las células de una línea celular monocítica humana, THP-1 puede estimularse indistintamente con fragmentos Fab de anticuerpo monoclonal de ratón IV.3 contra FcyRII y anticuerpo anti-ratón de cabra (para agregar FcyRIIA solo), o con anticuerpo monoclonal de ratón IV.3 completo y un anticuerpo anti-ratón de cabra (para coagregar FcyRIIA y FcyRIIB). En este sistema, la modulación de moléculas de señalización desdcendente, tales como la fosforilación de tirosina de FcyRIIB, fosforilación of SHIP, asociación de SHIP con Shc, fosforilación de Akt, y fosforilación de las proteínas que tienen el peso molecular de 120 y 60-65 kDa puede evaluarse luego de la incorporación de moléculas de la invención a las células estimuladas. Además, la eficiencia fagocítica dependiente de FcyRIIB de la línea celular monocítica puede medirse directamente en presencia y ausencia de los anticuerpos de la invención.
Otro ensayo ejemplificativo para determinar la inhibición de fagocitosis mediada por FcyR en monocitos/macrófagos humanos por los anticuerpos de la invención pueden comprender los siguientes: estimular células THP-1 con cualquier Fab de un anticuerpo anti-FcyRII de ratón IV.3 y un anticuerpo anti-ratón de cabra (para agregar FcyRIIA solo y generar la señalización mediada por FcyRIIA); o con anticuerpo anti-FcyRII de ratón y un anticuerpo anti-ratón de cabra (para coagregar FcyRIIA y FcyRIIB e inhibir la señalización mediada por FcyRIIA. Las células que se han estimulado con anticuerpo anti-FcyRII de ratón y un anticuerpo anti-ratón de cabra puede pre-incubarse en forma adicional con las moléculas de la invención. La medición de la actividad dependiente de FcyRIIA de células estimuladas que se han pre-incubado con moléculas de la invención y células que no se han pre-incubado con los anticuerpos de la invención y la comparación de los niveles de actividad dependiente de FcyRIIA en estas células indicarían una modulación de actividad dependiente de FcyRIIA por los anticuerpos de la invención.
El ensayo ejemplificativo descrito puede usarse por ejemplo, para identificar dominios de unión que bloquea la unión al ligando del receptor FcyRIIB y antagonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA mediante la prevención de la co-agregación de FcyRIIB y FcyRIIA. Este ensayo del mismo modo identifica dominios de unión que potencian la co-agregación de FcyRIIB y FcyRIIA y agonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA.
Los dominios de unión de FcyRIIB de interés pueden evaluarse mientras que incluían los anticuerpos I por medición de la capacidad de las células THP-1 de opsonizar glóbulos rojos de oveja de IgG con fagocitosa fluoresceína (SRBC) por métodos descritos con anterioridad (Tridandapani et al. (2000) "The Adapter LAT Protein Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells, " J. Biol. Chem. 275: 20480-7). Por ejemplo, un ensayo ejemplificativo para medir la fagocitosis comprende: tratar las células THP-1 con los anticuerpos de la invención o con un anticuerpo de control que no se une a FcyRII, que compara los niveles de actividad de dichas células, en donde una diferencia en las actividades de las células (por ej., actividad de acumulación en rosetas (la cantidad de células THP-1 que se unen a SRBC recubierto con IgG), actividad de adherencia (el número total de SRBC unido a células THP-1), e índice fagocítico) indicarían una modulación de actividad dependiente de FcyRIIA por los anticuerpos de la invención. Este ensayo puede usarse para identificar, por ejemplo, anticuerpos que bloquean la unión al ligando del receptor FcyRIIB y antagonizan la inhibición mediada por FcyRIIB de fagocitosis. Este ensayo puede identificar también anticuerpos que potencian la inhibición mediada por FcyRIIB de la señalización de FcyRIIA.
En una realización preferida, los dominios de unión modulan la actividad dependiente de FcyRIIB en monocitos/macrófagos humanos en por lo menos uno o más de los siguientes modos: modulación de las moléculas de señalización descendiente (por ej., modulación del estado de fosforilación de FcyRIIB, modulación de fosforilación de SHIP, modulación de SHIP y asociación de Shc, modulación de fosforilación de Akt, modulación de fosforilación de proteínas adicionales alrededor de 120 y 60-65 kDa) y modulación de fagocitosis. 5.1.2 DOMINIOS DE UNIÓN DE CD16A La siguiente sección discute proteínas de unión a CD16A que pueden usarse como fuentes para regiones variables de cadena liviana y pesada para la producción de diacuerpo covalente. En la presente invención las proteínas de unión a CD16A incluye moléculas que comprenden los dominios VL y VH de anticuerpos anti-CD16A, cuyos dominios VH y VL se usan en la producción de los diacuerpos de la presente invención.
Una variedad de proteínas de unión a CD16A pueden usarse en conexión con la presente invención. Las proteínas apropiadas de unión a CD16A incluyen anticuerpos monoclonales humanos o humanizados así como también fragmentos de anticuerpo que se unen a CD16A (por ej., scFv o anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, minicuerpos) y otras proteínas con aspecto de anticuerpo que se unen a CD16A por medio de una interacción con un dominio variable de región de cadena liviana, un dominio variable de región de cadena pesada, o ambos.
En algunas realizaciones, la proteína que se une a CD16A para usar de acuerdo con la invención comprende un dominio VL y/o VH que tiene uno o más CDRs con sequences derivado de un anticuerpo anti-CD16A no humano, tales como un anticuerpo anti-CD16A de ratón, y una o más regiones de marco con derivado de secuencias de marco de una o más inmunoglobulinas humanas. Una cantidad de anticuerpos anti-CD16A monoclonales no humanos, de los cuales la CDR y otras secuencias pueden obtenerse, se conocen (véase, por ej., Tamm et al. (1996) "The Binding Epítopes Of Human CD16 (Fe gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding, " J. Imm. 157:1576-81; Fleit et al. (1989) p,159; LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherz et al, eds. New York: Springer-Verlag; (1986); LEUCOCYTE TYPING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J, ed., Oxford: Oxford University Press, 1986); LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kapp et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Schlossman et al., eds. Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto, ed. Taylor & Francis. Además, como se muestra en los Ejemplos, nuevas proteínas de unión a CD16A que reconocen CD16A humano expresado en células puede obtenerse con el uso de métodos muy conocidos para la producción y selección de anticuerpos monoclonales o proeínas de unión relacionadas (por ej., la tecnología de hibridoma, visualización de fago, y similares). Véase, por ejemplo, O'Connell et al. (2002) "Phage Versus Phagemid Librarles For Generation Of Monoclonal Human Antibodies, " J. Mol. Biol. 321 :49-56; Hoogenboom et al. (2000) "Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology, " Imm. Today 21 :371078; Krebs et al. (2001) "High-Throughput Generation And Engineering Of Recombinant Human Antibodies, " J. Imm. Methods 254:67-84; y otras referencias citadas en este documento. Los anticuerpos monoclonales de una especie no humana pueden quimerizarse o humanizarse con el uso de humanización de anticurepos conocidas en la materia.
En forma alternativa, los anticuerpos totalmente humanos contra CD16A pueden producirse con el uso de animales transgénicos que tienen elementos de un sistema inmunológico humano (véase, por ej., U.S. Pat. Nos. 5,569,825 y 5,545,806), con el uso de células de sangre periférica humana (Casali et al. (1986) "Human Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV, " Science 234:476-479), por selección de una biblioteca de ADN de las células B humanas de acuerdo con el protocolo general definido por Huse et al. (1989) "Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda, " Science 246:1275-1281, y por otros métodos.
En una realización preferida, el donante de unión es del anticuerpo 3G8 o una versión humanizada de los anteriores, por ej., tales como aquellas divulgadas en la publicación de solicitud de patente de EE UU 2004/0010124, que se incorpora a modo de referencia en este documento en su totalidad. Se contempla que, para algunos fines, puede ser ventajoso usar proteínas de unión a CD16A que se unen al receptor de CD16A en el mismo epítope unido por 3G8, o por lo menos lo suficientemente cerca para que este epítope bloquee la unión por 3G8. Los métodos para mapeo de epítopes y experimentos de unión competitiva para identificar proteínas de unión con las propiedades de unión deseadas como resulta conocido para aquellas personas expertas en la materia de inmunología experimental. Véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, citada con anterioridad; Stáhli et al. (1983) "Distinction Of Epítopes By Monoclonal Antibodies, " Methods in Enzymology 92:242-253; Kirkland et al. (1986) "Analysis Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of Monoclonal Anti-Lipid A Anticuerpos, " J. Immunol. 137:3614-3619; Morel et al. (1988) "Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin: Affinity And Specificity Determinations, " Molec. Immunol. 25:7-15; Cheung et al. (1990) "Epitope-Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatits B Virus In Infected Ducks, " Virology 176:546-552; y Moldenhauer et al. (1990) "Identity OfHML-1 Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B-ly7 Antigen On Hairy Cell Leukaemia, " Scand. J. Immunol. 32:77-82. Por ejemplo, es posible determinar si dos anticuerpos se unen al mismo sitio por medio del uso de uno de los anticuerpos para capturar el antígeno en una placa de ELISA y luego midiendo la capacidad del segundo anticuerpo de unirse al antígeno capturado. La comparación de epítopes también puede lograrse rotulando un primer anticuerpo, directa o indirectamente, con una enzima, radionuclida o fluoroforo, y midiendo la capacidad de un segundo anticuerpo no marcado para inhibir la unión del primer anticuerpo al antígeno en las células, en solución, o en una fase sólida.
También es posible medir la habilidad de los anticuerpos de bloquear la unión del receptor de CD16A a compuestos inmunes formados sobre placas de ELISA. Dichos complejos inmunes se forman primero recubriendo la placa con un antígeno tales como fiuoresceína, luego aplicando un anticuerpo anti-fluoresceína específico a la placa. Este complejo inmune luego sirve como el ligando para los receptores solubles de Fe tales como sFcRIIIa. En forma alternativa un complejo inmune soluble puede formarse y rotularse, directa o indirectamente, con una radionuclida o fluoroforo enzimático. La habilidad de los anticuerpos de inhibir la unión de estos complejos inmunes rotulados a los receptores de Fe en las células, en solución o en una fase sólida pueden entonces medirse.
Las proteínas de unión a CD16A de la invención pueden o no comprender una región Fe de inmunoglobulina humana. Las regiones de Fe no están presentes, por ejemplo, en proteínas de unión a scFv. Las regiones de Fe están presentes, por ejemplo, en anticuerpos IgG monoclonales tetraméricos humanos o humanizados. Como se describió con anterioridad, en algunas realizaciones de la presente invención, la proteína que se une a CD16A incluye una región de Fe que tiene una alteración de la función efectora, por ej., la afinidad reducida por un ligando efector tales como un receptor de Fe o componente Cl de complemento cuando se compara con la región Fe no alterada (por ej., Fe de IgGl natural, proteínas). En una realización la región Fe no se glicosila en el aminoácido de la región Fe correspondiente a la posición 297. Dichos anticuerpos carecen de función efectora de Fe.
De este modo, la proteína que se une a CD16A puede no inhibir la unión mediada por Fe a un ligando efector tales como un receptor de Fe o el componente Cl de complemento debido a la ausencia del término dominio Fe en la proteína de unión mientras que, en otros casos, la falta de unión o función efectora se debe a una alteración en la región constante del anticuerpo. 5.1.2.1 Las proteínas de unión a CD16A Que comprenden secuencias de CDR similares a las secuencias de CDR mAb 3G8.
Las proteínas de unión a CD16A que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen proteínas que comprende un derivado de la secuencia de CDR (es decir, que tiene una secuencia igual o similar) los CDRs del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8. Los cADNs complementarios las regiones variables de cadena pesada y cadena liviana del anticuerpo moclonal de ratón 3G8, que incluyen las secuencias de codificación de CDR, se clonaron y se secuenciaron como se describió. Las secuencias de ácidos nucleicos y de proteínas de 3G8 se proveen a continuación. Con el uso de la región variable de ratón y secuencias de CDR, un gran número de anticuerpos humanizados monoclonales y quiméricos, que comprende regiones determinantes de complementariedad derivadas de CDRs 3G8 se produjeron y se analizaron sus propiedades. Para identificar los anticuerpos humanizados que se unen a CD16A con alta afinidad y tienen otras propiedades deseables, anticuerpo cadena pesadas que comprende una región VH con CDRs derivado de 3G8 se produjeron y se combinaron (por co-expresión) con cadenas livianas de anticuerpos que comprende una región VL con CDRs derivado de 3G8 para producir un anticuerpo tetramérico para análisis. Las propiedades de los anticuerpos tetraméricos resultantes se determinaron como se describe a continuación. Como se describe a continuación, las proteínas de unión a CD16A que comprenden 3G8 CDRs, tales como las proteínas de anticuerpos humanizados descritas en este documento, pueden usarse de acuerdo con la invención. 5.1.2.1.1 Región VH En un aspecto, la proteína que se une a CD16A de la invención puede comprender un dominio variable de cadena pesada en la cual por lo menos un CDR (y usualmente tres CDRS) tienen la secuencia de un CDR (y más normalmente los tres CDRS) de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 y para los cuales las porciones restantes de la proteína de unión son sustancialmente humanas (derivadas de y en forma sustancial similares a, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos).
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo 3G8 humanizado o fragmento de anticuerpos que contienen CDRs derivados del anticuerpo 3G8 en un marco sustancialmente humano, pero por el cual por lo menos uno de los CDRs del dominio variable de cadena pesada difiere en secuencia del correspondiente CDR de cadena pesada del anticuerpo 3G8 de ratón. Por ejemplo, en una realización, el CDR(S) difiere de la secuencia de CDR 3G8 por lo menos por tener una o más sustituciones de CDR que se muestran conocidos en la materia por afectar la unión de 3G8 a CD16A, como se conoce en la materia o como se divulga en las Tablas 3 y 4A-H. Las proteínas de unión a CD16 apropiadas pueden comprender 0, 1, 2, 3, o 4, o o más de estas sustituciones (y con frecuencia tienen desde 1 hasta 4 de estas sustituciones) y en forma opcional pueden tener sustituciones adicionales también.
Tabla 3. Sustituciones de dominio VH Tabla 4A. Secuencias de VH Derivadas de 3G8 VH *Las letras en la Tabla 4A se refieren a secuencias en las Tablas 4 B-H.
TABLE 4B: FRl TABLA 4C: CDR1 TABLA 4D: FR2 TABLA 4E: CDR2 TABLA 4F: FR3 TABLA 4G: CDR3 TABLA 4H: FR4 En una realización, una proteína que se une a CD16A puede comprender un dominio de secuencia variable de cadena pesada que es igual que o similar a, el dominio VH de la construcción Hu3G8VH-l, cuya secuencia se proporciona en la SEC ID NRO.: 68. Por ejemplo, la invención proporciona una secuencia que se une a CD16A que comprende un dominio variable con una secuencia que (1) difiere del dominio VH de Hu3G8VH-l (SEC ID NRO.: 68) por cero, una o más de una de las sustituciones de CDR establecidas en la Tabla 1; (2) difiere del dominio VH de Hu3G8VH-l por cero, una o más de una de las sustituciones de marco que se indican en la Tabla 1; y (3) es por lo menos alrededor de 80% idéntica, con frecuencia por lo menos alrededor de 90%, y en ocasiones por lo menos alrededor de 95% idéntica, o even por lo menos alrededor de 98% idéntica la secuencia de Hu3G8VH-l VH en las posiciones restantes.
Los dominios VH ejemplificativos de las proteínas de unión CD16 de la invención tienen la secuencia de 3G8VH, Hu3G8VH-5 y Hu3G8VH-22 (SEC ID NRO.: 79, SEC ID NRO.: 69 y SEC ID NRO.: 70, respectivamente). Las secuencias ejemplificativas de nucleótidos que codifican las secuencias de 3G8VH y Hu3G8VH-5 (SEC ID NRO.: 79 y SEC ID NRO.: 69, respectivamente) se proveen por la SEC ID NRO.: 80 y SEC ID NRO.: 81, respectivamente.
El dominio VH puede tener una secuencia que difiere de la de Hu3G8VH-l (SEC ID NRO.: 68) por lo menos por una, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro 4, por lo menos cinco, o por lo menos seis de las sustituciones que se muestran en la Tabla 3. Se considera que estas sustituciones producen una mayor capacidad por CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de una secuencia que se une a CD16A cuando se administra a humanos. En ciertas realizaciones, el grado de identidad de secuencia con el dominio VH Hu3G8VH-l en las posiciones restantes es por lo menos alrededor de 80%, por lo menos alrededor de 90%, por lo menos alrededor de 95% o por lo menos alrededor de 98%.
Para ilustración y no como limitación, las secuencias de una cantidad de dominios VH de proteínas que construyen CD16A se muestra en la Tabla 4. Las cadenas pesadas que comprenden estas secuencias fusionadas a una región constante Cy humana se coexpresaron con la cadena liviana hu3G8VL-l (descrita a continuación) para formar anticuerpos tetraméricos, y unión de los anticuerpos a CD16A se midió para evaluar el efecto de las sustituciones de aminoácidos cuando se compara con el dominio VH hu3G8VH-l. Las construcciones en la cual el dominio VH tiene una secuencia de hu3G8VH-l, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 42, 43, 44 y 45 muestra alta unión por afinidad, con dominios VH hu3G8VH-6 y -40 que muestran proteínas de unión a CD16A que se unen en forma intermedia que comprende los dominios VH de hu3G8VH-5 y Hu3G8VH-22 (SEC ID NRO.: 69 y SEC ID NRO.: 70, respectivamente) se considera que tienen propiedades de unión particularmente favorables. 5.1.2.2 Región VL Se condujeron estudios similares para identificar secuencias de dominio variable de cadena liviana con propiedades de unión favorables. En un aspecto, la invención proporciona una secuencia que se une a CD16A que contiene un dominio variable de cadena liviana en la cual por lo menos un CDR (y usualmente tres CDRs) tiene la secuencia de a CDR (y más normalmente los tres CDRs) del anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 cadena liviana y para los cuales las porciones restantes de la proteína de unión son sustancialmente humanas (derivadas de y en forma sustancial similares a, la región variable de cadena pesada de un anticuerpo o anticuerpos humanos).
En un aspecto, la invención proporciona un fragmento de un anticuerpo 3G8 humanizado que contiene CDRs derivados del anticuerpo 3G8 en un marco sustancialmente humano, pero por el cual por lo menos uno de los CDRs de la cadena liviana variable dominio difiere en secuencia de the mouse monoclonal anticuerpo 3G8 cadena liviana CDR. En una realización, el CDR(S) difiere de la secuencia 3G8 por lo menos por tener una o más sustituciones de aminoácidos en un CDR, tales como, una o más sustituciones que se muestran en la Tabla 2 (por ej., arginina en la posición 24 en CDR1 ; serina en la posición 25 en CDR1; tirosina en la posición 32 en CDR1; leucina en la posición 33 en CDR1; ácido aspártico, triptofano o serina en la posición 50 en CDR2; serina en la posición 53 en CDR2; alanine o glutamine en la posición 55 en CDR2; treonina en la posición 56 en CDR2; serina en la posición 93 en CDR3; y/o treonina en la posición 94 en CDR3). En varias realizaciones, el dominio variable puede tener 0, 1, 2, 3, 4, 5, o o más de estas sustituciones (y con frecuencia tienen desde 1 hasta 4 de estas sustituciones) y en forma opcional, puede tener sustituciones adicionales también.
En una realización, una proteína de unión CD16A apropiada puede comprender una secuencia de dominio variable de cadena liviana que es igual que o similar a, el dominio VL de la construcción Hu3G8VL-l (SEC ID NRO.: 71), cuya secuencia se proporciona en la Tabla 6. Por ejemplo, la invención proporciona una secuencia que se une a CD16A que comprende un dominio VL con una secuencia que (1) difiere del dominio VL de Hu3G8VL-l (SEC ID NRO.: 71) por cero, uno, o más de las sustituciones de CDR establecidas en la Tabla 5; (2) difiere del dominio VL de Hu3G8VL-l por cero, una o más de las sustituciones de marco que se establecen en la Tabla 5; y (3) es por lo menos alrededor de 80% idéntica, con frecuencia por lo menos alrededor de 90%, y en ocasiones por lo menos alrededor de 95% idéntica, o incluso por lo menos alrededor de 98% idéntica a la secuencia de VL Hu3G8VL (SEC ID NRO.: 71) en las posiciones restantes.
Tabla 5. Sustituciones de dominio VL 3G8 Table 6. Secuencias VL derivadas de 3G8 VL* *Las letras en la Tabla 6A se refieren a secuencias en las Tablas 6B-H.
TABLA 6B: FRl TABLA 6C: CDRl TABLA 6D: FR2 TABLA 6E: CDR2 TABLA 6F: FR3 TABLA 6G: CDR3 TABLA 6H : FR4 Los dominios VL ejemplificativos de las proteínas de unión CD16 de la invención tienen la secuencia de 3G8VL, Hu3G8VL-l o Hu3G8VL-43, (SEC ID NRO.: 82, SEC ID NRO.: 71 y SEC ID NRO.: 72, respectivamente) como se muestra en la Tablas 5 y 6. Las secuencias ejemplificativas de nucleótidos que codifican 3G8VL (SEC ID NRO.: 82) y Hu3G8VL-l (SEC ID NRO.: 71) se proporcionan en la SEC ID NRO.: 83 y SEC ID NRO.: 84, respectivamente.
El dominio VL puede tener una secuencia que difiere de la de Hu3G8VL- 1 (SEC ID NRO.: 71) por cero, una, por lo menos dos, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, o por lo menos 9 de las sustituciones que se muestran en la Tabla 2. Se considera que estas sustituciones producen una mayor capacidad por CD16A y/o reducen la inmunogenicidad de una secuencia que se une a CD16A cuando se administra a humanos. En ciertas realizaciones, el grado de identidad de secuencia en las posiciones restantes es por lo menos alrededor de 80%, por lo menos alrededor de 90% por lo menos alrededor de 95% o por lo menos alrededor de 98%.
Para ilustración y no como limitación, las secuencias de una cantidad deproteínas de unión a CD16A VL dominios se muestra en la Tabla 6. Las cadenas livianas que comprenden estas secuencias fusionadas a un dominio CK. humano constante se co-expresaron con una cadena pesada Hu3G8VH (se describió con anterioridad) para formar anticuerpos tetraméricos, y la unión de los anticuerpos a CD16A se midió para evaluar el efecto de las sustituciones de aminoácidos cuando se compara con el. dominio VL Hu3G8VL-l (SEC ID NRO.: 71). Las construcciones en la cual el dominio VL tiene una secuencia de hu3G8VL-l, 2, 3, 4, 5, 10, 16, 18, 19, 21, 22, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 35, 36, 37, y 42 muestra alta unión por afinidad y hu3G8VL-15, 17, 20, 23, 25, 26, 29, 30, 31, 38, 39, 40 y 41 mostraron proteínas de unión que se unen en forma intermedia a CD16A que comprenden los dominios VL de Hu3G8VL-l , hu3G8VL-22, y hu3G8VL-43 se considera que tienen propiedades de unión particularmente favorables (SEC ID NRO.: 71, SEC ID NRO.: 73 y SEC ID NRO.: 72, respectivamente). 5.1.2.2.1 Combinaciones de Dominios VL y/o VH Como se conoce en la materia y se describió en este documento en algún otro lugar, las cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulina pueden expresarse en forma recombinante en condiciones en las cuales se asocian para producir un diacuerpo, o pueden así combinarse in vitro. Se apreciará en forma adicional que un dominio VL derivado de 3G8 descrito en este documento puede combinarse con dominios VH derivados de 3G8 descritos en este documento para producir un diacuerpo que se une a CD16A, y se contemplan todas dichas combinaciones.
Para ilustración y no para limitación, algunos ejemplos de diacuerpos CD16A útiles son aquellos que comprenden por lo menos un dominio VH y por lo menos un dominio VL, donde el dominio VH es de hu3G8VH-l, hu3G8VH-22 o hu3G8VH-5 (SEC ID NRO.: 68, SEC ID NRO.: 70 y SEC ID NRO.: 69, respectivamente) y el dominio VL es de hu3G8VL-l, hu3G8VL-22 o hu3G8VL-43 (SEC ID NRO.: 71, SEC ID NRO.: 73 y SEC ID NRO.: 41, respectivamente). En particular, los anticuerpos humanizados que comprenden hu3G8VH-22 (SEC ID NRO.: 22) cualquiera de, hu3G8VL-l, hu3G8VL-22 o hu3G8VL-43 (SEC ID NRO.: 71, SEC ID NRO.: 70 y SEC ID NRO.: 72, respectivamente), o hu3G8VH-5 (SEC ID NRO.: 69) y hu3G8VL-l (SEC ID NRO.: 71) tienen propiedades favorables.
Aquellas personas con experiencia en la materia las secuencias de los dominios VL y VH descritos aquí y pueden modificarse en forma adicional por métodos conocidos en el arte tales como maduración por afinidad (Véase Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution of Complementaríty Determinating Regions In The Center Del Antibody Binding Site, " J. Mol. Biol. 263:551-567; Daugherty et al. (1998) "Antibody Affinity Maduration Using Bacterial Surface Display, " Protein Eng. 11 :825-832; Boder et al. (1997) "Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Librarles, " Nat. Biotechnol. 15:553-557; Boder et al. (2000) "Directed Evolution Of Antibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen-Binding Affinity, " Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A 97: 10701-10705; Hudson et al. (2003) "Engineered Antibodies, " Nature Medicine 9:129-39). Por ejemplo, las proteínas de unión a CD16A pueden modificarse con el uso de técnicas de maduración por afinidad para identificar proteínas con una mayor capacidad por CD16A y/o menor afinidad por CD16B.
Una porteína de unión a CD16 ejemplificativa s el anticuerpo de ratón 3G8. La secuencia de aminoácidos que comprende los dominios VH y VL de 3G8 humanizados se describen en las FIGS. 2, 9, 14 y que se establecen en la SEC ID NRO.: 9, SEC ID NRO.: 11, SEC ID NRO.: 12, SEC ID NRO.: 14, SEC ID NRO.: 15, SEC ID NRO.: 16, SEC ID NRO.: 18, SEC ID NRO.: 19, SEC ID NRO.: 20, SEC ID NRO.: 21, SEC ID NRO.: 22, SEC ID NRO.: 68, SEC DD NRO.: 69, SEC ID NRO.: 70, SEC ID NRO.: 71 y SEC ID NRO.: 72. 5.2 DIACUERPOS QUE COMPRENDEN REGIONES Fe o PORCIONES DE LOS ANTERIORES La invención abarca moléculas de diacuerpo que comprenden dominios Fe o porciones de los anteriores (por ej., a CH2 o dominio CH3). En ciertas realizaciones, el dominio de Fe, o porción(es) de los anteriores, comprende uno o más dominios constante(s) de la región Fe de IgG2, IgG3 o IgG4 (por ej., CH2 o CH3). En otras realizaciones, la invención abarca moléculas que comprenden un dominio Fe o porción de los anteriores, en donde dicho dominio de Fe o porción de los anteriores comprende por lo menos una modificación de aminoácido (por ej. sustitución) con relación a un dominio Fe tipo salvaje comparable o porción de los anteriores. Los dominios variantes Fe se conocen muy bien en la materia, y se usan principalmente para alterar el fenotipo del anticuerpo que comprende dicho dominio Fe variante como se evalúa en cualquiera de los ensayos de la actividad de unión o función efectora muy conocidos en la materia, por ej. ELISA, análisis SPR, o ADCC. Dichos dominios variantes Fe, o porciones de los anteriores, tienen uso en la presente invención al conferir o modificar la función efectora exhibida por una molécula del diacuerpo de la invención que comprende un dominio Fe (o porción de los anteriores) como se analiza en forma funcional, por ej., en un ensayo dependiente de NK o macrófago.
Los dominios variantes Fe identificados como aquellos que alteran la función efectora se divulgan en la Solicitud Internacional WO04/063351, Publicaciones de Solicitud de Patente de los EE UU 2005/0037000 y 2005/0064514, Solicitudes Provisionales de los EE UU 60/626,510, presentada el 10 de noviembre de 2004, 60/636,663, presentada el 15 de diciembre de 2004, y 60/781,564, presentada el 10 de marzo de 2006, y Solicitudes de Patentes de EE UU 11/271, 140, presentada el 10 de noviembre de 2005, y 11/305,787, presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes concurrentes de los Inventores, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.
En otras realizaciones, la invención abarca el uso de cualquier variante Fe conocida en la materia, tales como aquellos divulgados en Duncan et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity receptor de Fe On IgG, " Nature 332:563-564; Lund et al. (1991) "Humun Fe Gamma RI And Fe Gamma RII Interactúan Con Distinct But Overlapping Sites On Human IgG, " J. Immunol. 147:2657-2662; Lund et al. (1992) "Múltiple Binding Sites On CH2 Domain of IgG For Mouse Fe Gamma RII, " Mol. Immunol. 29:53-59; Alegre et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Anticuerpo Retains Immunosuppressive Properties In Vivo, " Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, and Reduced Immunogenicity In Mice Con A Gamma 4 Variant Of Campath-IH, " Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 92:11980-11984; Jefferis et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fe Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation, " Immunol. Lett. 44:111-117; Lund et al. (1995) "Oligosaccharide-Proteína Interacciones In IgG Can Modulate Recognition By Fe Gamma Receptors, " FASEB J. 9:115-119; Jefferis et al. (1996) "Modulation of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interacciones, " Immunol. Lett. 54:101-104; Lund et al. (1996) "Múltiple Interactions of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Humun Fe Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains, " J. Immunol. 157:4963-4969; Armour et al. (1999) "Recombinant Human IgG Moléculas Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities, " Eur. J. Immunol. 29:2613-2624; Idusogie et al. (2000) "Mapping Of The C1Q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgGI Fe, " J. Immunol. 164:4178-4184; Reddy et al. (2000) "Elimination Of receptor of Fc-Dependent Effector Functions Of A Modified lgG4 Monoclonal Anticuerpo To Human CD4, " J. Immunol. 164:1925-1933; Xu et al. (2000) "In Vitro Caracterización de Cinco Humanized OKT3 Effector Function Variant Antbodies, " Cell. Immunol. 200:16-26; Idusogie et al. (2001) "Engineered Antibodies With Inereased Activity To Recruit Complement, " J. Immunol. 166:2571-2575; Shields et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fe gamma RI, Fe gamma RII, Fe gamma RIII, y FcRn And Design De IgGl Variants With Improved Binding to The Fe gamma R, " J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Jefferis et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models, " Immunol. Lett. 82:57-65; Presta et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function, " Biochem. Soc. Trans. 30:487-490); US 5,624,821; US 5,885,573; US 6,194,551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572; cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
En ciertas realizaciones, dicha una o más modificaciones a los aminoácidos de la región Fe reducen la afinidad y la avidez de la región Fe y, de este modo, la molécula de diacuerpo de la invención, para uno o más receptores de FcyR. En una realización específica, la invención abarca diacuerpos que comprenden una región Fe variante, o porción de los anteriores, en donde dicha región Fe variante comprende por lo menos una modificación de aminoácido con relación a una región de Fe de tipo salvaje, cuya región Fe variante sólo se une a un FcyR, en donde dicho FcyR es FcyRIIIA. En otra realización específica, la invención abarca diacuerpos que comprenden una región Fe variante, o porción de los anteriores, en donde dicha región Fe variante comprende por lo menos una modificación de aminoácido con relación a una región de Fe de tipo salvaje, cuya región Fe variante sólo se une a un FcyR, en donde dicho FcyR es FcyRIIA. En otra realización específica, la invención abarca diacuerpos que comprenden una región Fe variante, o porción de los anteriores, en donde dicha región Fe variante comprende por lo menos una modificación de aminoácido con relación a una región de Fe de tipo salvaje, cuya región Fe variante sólo se une a un FcyR, en donde dicho FcyR es FcyRIIB. En ciertas realizaciones, la invención abarca moléculas que comprenden un dominio Fe variante en donde dicha variante confiere o media el aumento en la actividad de ADCC y/o un aumento en la unión a FcyRIIA (CD32A), con relación a una molécula que no comprende dominio Fe o que comprende un dominio Fe tipo salvaje, según se mide con el uso de métodos conocidos por los expertos en el arte y descritos en este documento. En realizaciones alternativas, la invención abarca moléculas que comprenden un dominio Fe variante en donde dicha variante confiere o media una reducción en la actividad de ADCC (u otra función efectora) y/o un aumento en la unión a FcyRIIB (CD32B), con relación a una molécula que no comprende dominio Fe o que comprende un dominio Fe tipo salvaje, según se mide con el uso de métodos conocidos por los expertos en el arte y descritos en este documento.
La invención abarca, además, el uso de un dominio Fe que comprende dominios o regiones de dos o más isotipos IgG. Como se conoce en la materia, la modificación de aminoácidos de la región Fe puede afectar profundamente la función efectora mediada por Fe y/o actividad de unión. Sin embargo, estas alteraciones en las características funcionales puede refinarse y/o manipularse en forma adicional cuando se implementa en el contexto de isotipos IgG seleccionados. En forma similar, las características originales del isotipo Fe pueden manipularse por la una o más modificaciones de aminoácidos. Los múltiples isotipos IgG (es decir, IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4) exhiben diferentes propiedades físicas y funcionales que incluyen vida media sérica, fijación de complementos, afinidades de unión a FcyR y actividades de la función efectora (por ej. ADCC, CDC) debido a diferencias en las secuencias de aminoácidos de sus dominios de bisagra y/o Fe. En ciertas realizaciones, la modificación de aminoácidos y la región Fe de IgG se seleccionan en forma independiente en base a sus respectivas actividades separadas de unión y/o función efectora con el fin de diseñar un diacuerpo con características deseadas. En la mayoría de las realizaciones, dicha modificación de aminoácidos y regiones Fc/bisagra de IgG se han evaluado por separado para determinar la actividad de unión y/o función efectora como se describe en este documento o se conoce en la materia en un contexto de un IgGl . En ciertas realizaciones, dicha modificación de aminoácido y región de Fc/bisagra de IgG muestran funcionalidad similar, por ej., una mayor capacidad por FcyRIIA, cuando cuando se evalúan por separado para determinar la unión o la función efectora de FcyR en el contexto de la molécula de diacuerpo u otra molécula que contiene (por ej. e inmunoglobulina). La combinación de dicha modificación de aminoácido y región Fe de IgG seleccionada actúan entonces en forma adicional o, con mayor preferencia, en forma sinérgica para modificar dicha funcionalidad en la molécula de diacuerpo de la invención, con relación a una molécula del diacuerpo de la invención que comprende una región Fe de tipo salvaje. En otras realizaciones, dicha modificación de aminoácido y la región Fe de IgG muestran funcionalidades opuestas, por ej., aumento o reducción de, respectivamente, afinidad por FcyRIIA, cuando cuando se evalúan por separado para determinar la unión de FcyR y/o función efectora en el contexto de la molécula de diacuerpo u otra molécula que contiene Fe (por ej., una inmunoglobulina) que comprende una región Fe de tipo salvaje como se describe en este documento o se conoce en la materia; la combinación de dicha modifricación "opuesta" de aminoácidos y región de IgG seleccionada que actúan para evitar o reducir en forma selectiva una funcionalidad específica en el diacuerpo de la invención con relación a un diacuerpo de la invención no comprende una región de Fe o que comprende una región Fe de tipo salvaje del mismo isotipo. En forma alternativa, la invención abarca regiones Fe variantes que comprenden combinaciones de las modificaciones de aminoácidos conocidas en la materia y región de IgG seleccionadas que exhiben novedodas propiedades, cuyas propiedades no fueron detectables cuando dichas modificaciones y/o regiones se evaluaron en forma independiente como se describió con anterioridad.
Las características funcionales de los múltiples isotipos IgG, y dominios de los anteriores, se conocen muy bien en la materia. Las secuencias de aminoácidos de IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4 se presentan en las FIGS. 1A-1B. La selección y/o combinaciones de dos o más dominios de isotipos específicos IgG para usar en los métodos de la invención puede basarse en cualquier parámetro conocido de los isotipos de origen que incluyen afinidad por FcyR (Tabla 7; Flesch et al. (2000) "Functions Of Fe Receptors for Immunoglobulin G, " J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) "Identification Of A Segundoary Fe Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody, " J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) "Identification OfThe Fe Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgGl/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:9036-9040, cada uno de los cuales se incorpora por este medio a modo de referencia en su totalidad). Por ejemplo, uso de regiones o dominios de los isotipos IgG que existen limitada o ninguna unión a FcyRIIB, por ej., IgG2 o IgG4, pueden encontrar uso particular donde un diacuerpo se desea diseñarse para maximizar la unión a un receptor de activación y minimizar la unión a un receptor inhibidor. En forma similar, el uso de regiones Fe o dominios de los isotipos IgG conocidos por unirse en forma preferencial a Clq o FcyRIIIA, por ej., IgG3 (Brüggemann et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Inmunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies, " J. Exp. Med. 166:1351-1361), pueden combinarse con Fe las modificaciones de aminoácidos de aquellos conocidos en la materia por potenciar ADCC, diseñar una molécula del diacuerpo de manera tal que la actividad de la función efectora, por ej., activación de complementos o ADCC, se maximice.
Tabla 7. Características generales de unión de IgG a FcyR, adaptada de Flesch and Neppert, 1999, J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156 se une sólo a IgG en complejo 5.3 CONJUGADOS MOLECULARES Las moléculas de diacuerpo de la invención pueden fusionarse en forma recombinante o conjugarse en forma química (que incluyen ambas conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos heterólogos (es decir, un polipéptido no relacionado; o porción de los anteriores, con preferencia por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80, por lo menos 90 o por lo menos 100 aminoácidos del polipéptido para generar propiedades de fusión. La fusión no necesariamente necesita ser directa, sino ocurrir a través de secuencias de ligadura.
Además, las moléculas de diacuerpo de la invención (es decir, polipéptidos) pueden conjugarse con un agente terapéutico o un resto farmacológico que modifica una respuesta biológica dada. Como alternativa para orientar la conjugación, debido a los múltiples sitios que se unen al epítope en las moléculas de diacuerpo multivalentes, por ej., tetravalentes, de la invención, por lo menos una región de unión del diacuerpo puede diseñarse para unirse a agente terapéutico o resto farmacológico deseado sin afectar la unión del diacuerpo.
Los agentes terapéuticos o restos farmacológicos no se construyen como limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o un polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas incluyen, por ejemplo, una toxina tales como abrina, ricina A, endotoxina pseudomonas (es decir, PE-40), o toxina de difteria, ricina, gelonina, y proteína antiviral pokeweed, una proteína tales como factor de necrosis tumoral, interferones que incluyen, aunque sin limitarse a, a-interferón (IFN-a), ß-interferón (IFN-ß), factor de crecimiento de nervio (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), activador de plasminógeno de tejidos (TPA), un agente apoptótico (por ej., TNF-a, TNF-ß, AIM I como se divulga en la Publicación por PCT Nro. WO 97/33899), AIM II (véase, Publicación por PCT Nro. WO 97/34911), Fas ligy, y VEGI (Publicación por PCT Nro. WO 99/23105), un agente trombótico o un agente anti-angiogénico (por ej., angiostatina o endostatina), o un modificador de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, una linfoquina (por ej., interleucina-1 ("IL- 1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de la colonia de macrófago de granulocitos ("GM-CSF"), y factor estimulante de la colonia de granulocitos ("G-CSF"), factor estimulante de la colonia de macrófagos, ("M-CSF"), o un factor de crecimiento (por ej., hormona de crecimiento ("GH"); proteasas, o ribonucleasas.
Las moléculas de diacuerpo de la invención (es decir, polipéptidos) pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, el marcador secuencia de aminoácidos es un péptido de hexa-histidina, tales como el tag provisto en un receptor de pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales se encuentran disponibles en el mercado. Como se describe en la Gentz et al. (1989) "Bioassay For Trans-Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein: Trans-Activation Require mRNA Synthesis, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86:821-824, por ejemplo, hexa-histidine proporciona purificación conveniente de la proteína de fusión. Otros rótulos de péptidos útiles para purificación incluyen, aunque no se limitan a, la marca de hemaglutinina "HA", que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al. (1984) "The Structure of An Antigenic Determinant In A Protein, " Cell, 37:767-778) y la marca de "bandera" (Knappik et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification of Recombinant Antibody Fragments, " Biotechniques, 17(4):754-761).
Pueden generarse proteínas de fusión adicionales a través de las técnicas de reacomodamiento génico, reacomodamiento de motivo, reacomodamiento de exones, y/o reacomodamiento de codones (denominado en forma colectiva como "reacomodamiento de ADN"). El reacomodamiento de ADN puede emplearse para alterar las actividades de las moléculas de la invención {por ej., sitios que se unen al epítope con afinidades superiores y menores tasas de disociación). Véase, en general, Patentes de EE UU Nros. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721 ; 5,834,252; y 5,837,458, y Patten et al. (1997) "Applications OfDNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines, " Curr. Opinión Biotechnol. 8:724-733; Harayama (1998) "Artificial Evolution By DNA Shuffling, " Trends Biotechnol. 16:76-82; Hansson et al. (1999) "Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling, " J. Mol. Biol. 287:265-276; y Lorenzo et al. (1998) "PCR-Based Method Fort he Introduction of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus, " BioTechniques 24:308-313 (cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan por este medio a modo de referencia en su totalidad). Las moléculas de diacuerpo de la invención, o los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la invención, pueden alterarse en forma adicional al someterse a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos antes de la recobminación. Una o más porciones de un polinucleótido que codifica una molécula de la invención, puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
La presente invención abarca, además, las moléculas de diacuerpo de la invención conjugado con o reconociendo específicamente un agente de diagnóstico o terapéutico o cualquier otra molécula para la cual la vida media sérica desea aumentarse y/o reducirse hasta un subgrupo particular de células. Las moléculas de la invención pueden usarse como diagnóstico para, por ejemplo, monitorear el desarrollo o la progresión de una enfermedad, un trastorno o una infección como parte de un procedimiento de análisis clínico para, por ej., determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por acople de las moléculas de la invención a una sustancia detectable o por las moléculas que reconocen en forma inmunoespecífica la sustancia detectable. Algunos ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones, y iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse a o conjugarse ya sea directamente a las moléculas de la invención o indirectamente, a través de un intermediario (tales como, por ejemplo, una ligadura conocida en la materia) con el uso de técnicas conocidas en la materia, o la molécula puede reconocer en forma inmunoespecífica la sustancia detectable: uniendo en forma inmunoespecífica dicha sustancia. Véase, por ejemplo, Patente de los EE UU Nro. 4,741,900 para iones de metales que pueden conjugarse con anticuerpos para usar como diagnósticos de acuerdo con la presente invención. Dicho diagnóstico y detección puede lograrse designando las moléculas para reconocer en forma inmunoespecífica la sustancia detectable o por acoplamiento de las moléculas de la invención a sustancias detectables que incluyen, aunque sin limitarse a, varias enzimas, enzimas que incluyen, aunque sin limitarse a, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; complejos del grupo prostético tales como, aunque sin limitarse a, estreptavidina / biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, aunque sin limitarse a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; material luminiscente tales como, aunque sin limitarse a, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, aunque sin limitarse a, luciferasa, luciferina, y aequorina; material radiactivo tales como, aunque sin limitarse a, bismuto (213Bi), carbono (14C), cromio (51Cr), cobalto (57Co), fluoro (18F), gadolinio (153Gd, 159Gd), galio (68Ga, 67Ga), germanio (68Ge), holmio (166Ho), indio (U5In, 113In, l l2In, mIn), yodo (131I, ,25I, 123I, 121I), lantanio (140La), lutetio (177Lu), manganeso (54Mn), molibdeno (99Mo), paladio (103Pd), fósforo (32P), praseodimio (142Pr), prometió (149Pm), renio (186Re, 188Re), rodio (105Rh), rutemio (97Ru), samario (153Sm), escandio (47Sc), selenio (75Se), estroncio (85Sr), azufre (35S), tecnetio (99Tc), talio (20ITi), tin (1 I3Sn, l l7Sn), tritio (3H), xenón (133Xe), yterbio (169Yb, 175Yb), ytrio (90Y), zinc (65Zn); metales emisores de positrones con el uso de varias tomografías emisoras de positrones, y iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
Las moléculas de diacuerpo de la invención pueden reconocer en forma inmunoespecífica o conjugarse con un resto terapéutico tales como una citotoxina (por ej., un agente citostático o citocidal), un agente terapéutico o un elemento radiactivo (por ej., alfa emisores, gamma-emisores, etc.). Las citotoxinas o agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que es perjudicial para las células. Algunos ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los anteriores. Los agentes terapéuticos incluyen, aunque no se limitan a, antimetabolitos (por ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilación (por ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y Lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cisdiclorodiamina de paladio (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ej., daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (por ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC), y agentes anti-mitóticos (por ej., vincristina y vinblastina).
Más aún, una molécula del diacuerpo de la invención puede conjugarse con o diseñarse para immunoespecíficamente reconocer restos terapéuticos tales como a materiales radiactivos o queladores macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (Véase con anterioridad para obtener ejemplos de materiales radiactivos). En ciertas realizaciones, el quelador macrocíclico es ácido 1, 4,7,10-tetraazaci clododecan-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA) que puede unirse al polipéptido por medio de una molécula de ligadura. Dichas moléculas de ligadura se conocen comúnmente en la materia y se describen en Denardo et al. (1998) "Comparison Of 1,4, 7,10-Tetraazacyclododecane-N,N',N",N"'-Tetraacetic Acid (DOTA)-Peptide-ChL6, A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker, To 2-Iminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-DOTA-ChL6 In Breast Cáncer Xenografis, " Clin. Cáncer Res. 4:2483-2490; Peterson et al. (1999) "Enzymatic Cleavage Of Peptide-Linked Radiolabels From Immunoconjugates, " Bioconjug. Chem. 10:553-; y Zimmerman et al, (1999) "A Triglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67-Cu-Labeled Anti-Neuroblastoma mAb chCE7 F(ab')2 Fragments, " Nucí. Med. Biol. 26:943-950 cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en sus totalidades.
Las técnicas para conjugar dichos restos terapéuticos a polipéptidos, que incluyen por ej., dominios Fe, se conocen muy bien; véase, por ej., Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; y Thorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Anticuerpo-Toxin Conjugates, " Immunol. Rev., 62:119-158.
La molécula de diacuerpo de la invención puede administrarse con o sin un conjugado resto terapéutico con éste, administrado solo o en combinación con factor(es) citotóxicos y/o citoquina(s) para usar como un tratamiento terapéutico. Donde se administra solo, por lo menos un epítope de una molécula multivalente, por ej., tetravalente, molécula del diacuerpo puede diseñarse para reconocer en forma inmunoespecífíca un agente terapéutico, por ej., factor(es) citotóxicos y/o citoquina(s), que puede administrarse en forma concurrente o consecutiva a la molécula de la invención. De este modo, la molécula de diacuerpo puede orientar específicamente el agente terapéutico de un modo similar para orientar la conjugación. En forma alternativa, una molécula de la invención puede conjugarse con un anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo tal como lo describe Segal en la Patente de los EE UU Nro. 4,676,980, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. Las moléculas de diacuerpo de la invención también pueden adjuntarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno de destino. Dichos soportes sólidos incluyen, aunque no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
CARACTERIZACIÓN DE UNIÓN DE MOLÉCULAS DE DIACUERPO Las moléculas de diacuerpo de la presente invención pueden caracterizarse en una variedad de modos. En particular, las moléculas de la invención pueden evaluarse para determinar la capacidad de unirse inmunológicamente en forma específica a un antígeno, or ej., FcRIIIA o FcRIIB, o, donde la molécula comprende un dominio Fe (o porción de los anteriores) para determinar la habilidad de exhibir interacción de Fc-FcyRs, es decir la unión específica de un dominio Fe (o porción de los anteriores) a un FcyR. Dicho ensayo puede realizarse en solución (por ej., Houghten (1992) "The Use Of Synthetic Peptide Combinatoria! Librarles For The Identification Of Bioactive Peptides, " BioTechniques, 13:412-421), on beads (Lam (1991) "A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity, " Nature, 354:82-84, sobre chips (Fodor (1993) "Multiplexed Biochemical Assays With Biológica! Chips, " Nature, 364:555-556), sobre bacterias (Patente de los EE UU Nro. 5,223,409), sobre esporas (Patentes de EE UU Nros. 5,571,698; 5,403,484; y 5,223,409), sobre plásmidos (Culi et al. (1992) "Screening For Receptor Ligands Using Large Peptide Librarles Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869) o sobre fago (Scott et al. (1990) "Searching For Peptide Ligands With An Epítope Library, " Science, 249:386-390; Devlin (1990) "Random Peptide Librarles: A Source Of Specific Protein Binding Moléculas, " Science, 249:404-406; Cwirla et al. (1990) "Peptides On Phage: A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382; y Felici (1991) "Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector, " J. Mol. Biol., 222:301-310) (cada una de estas referencias se incorpora a modo de referencia en este documento en su totalidad). Las moléculas que se han identificado para unirse inmunológicamente en forma específica a un antígeno, por ej., FcyRIIIA, pueden entonces evaluarse para determinar su especificidad y afinidad por el antígeno.
Las moléculas de la invención que se han diseñado para comprender múltiples dominios de unión al epítope pueden evaluarse para determinar la uñón inmunoespecífica a uno o más antígenos (por ej., antígeno contra el cáncer y reactividad cruzada con otros antígenos (por ej., FcyR)) o, donde las moléculas comprenden un dominio Fe (o porción de los anteriores) para interacción Fc-FcyR por cualquier método conocido en la materia. Los inmunoensayos que pueden usarse para analizar la unión inmunoespecífica, reactividad cruzada, e interacciones Fc-FcyR incluyen, aunque no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos con el uso de técnicas tales como transferencias western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), "sandwich" inmunoensayos, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reaccioens de difusión de gel de precipitina, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complementos, ensayos inmuno-radiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, sólo para nombrar algunos. Dichos ensayos son de rutina y muy conocidos en la materia (véase, por ej., Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, que se incorpora a modo de referencia en este documento en su totalidad).
La afinidad de unión y la desviación de interacción de antígeno-dominio de unión o interacción Fc-FcyR pueden determinarse por ensayos de unión competitivos. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígeno rotulado, tales como FcyR tetramérico (por ej., H o I, remitirse a la sección 5.4.1) con una molécula de interés (por ej., las moléculas de la presente invención que comprenden múltiples dominios de unión al epítope en la presencia de cantidades crecientes de epítope no marcado, tales como FcyR tetramérico (remitirse a la sección 5.4.1), y la detección de la molécula unida al antígeno marcado. La afinidad de la molécula de la presente invención para un antígenoy calificaciones de unión pueden determinarse a partir de los datos de saturación por análisis de Scatchard.
Las afinidades y propiedades de unión de las moléculas de la invención para un antígeno FcyR pueden determinarse inicialmente con el uso de ensayos in vitro (ensayos con base bioquímica o inmunológica) conocidos en la materia para interacciones de antígeno-dominio de unión o Fc-FcyR, que incluyen aunque sin limitarse a ensayo ELISA, ensayo por resonancia plasmónica de superficie, ensayos de inmunoprecipitación. Con preferencia, las propiedades de unión de las moléculas de la invención también se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de la célula efectora del mediador de FcyR, como se describe en la Sección 5.4.2. En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la invención tienen propiedades similares de unión en modelos in vivo (tales como aquellas que se describen y se divulgan en este documento) como aquellos en los ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye moléculas de la invención que no exhiben el fenotipo deseado en ensayos basados in vitro pero no exhiben el fenotipo deseado in vivo.
En algunas realizaciones, la selección e identificación de las moléculas que comprenden múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, dominios Fe (or porciones de los anteriores) se realizan con ensayos de base funcional, con preferencia en un modo de alto rendimiento. Los ensayos de base funcional pueden ser cualquier ensayo conocido en la materia para caracterizar una o más funciones de las células efectoras mediadas por FcyR tales como las que se describen en este documento en las Secciones 5.4.2 y 5.4.3. Algunos ejemplos no limitativos de funciones de la célula electora que pueden usarse de acuerdo con los métodos de la invención, incluyen aunque no se limitan a, la citotoxicidad mediada por células que dependen de los anticuerpos (ADCC), Fagocitosis que depende de los anticuerpos, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión celular, formación de rosetas, unión a Clq, y la citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento.
En una realización preferida, el análisis cinético BIAcore se usa para determinar la unión de los índices en o fuera de las moléculas de la presente invención a un antígeno o FcyR. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la unión y disociación de un antígeno o FcyR de chips con moléculas inmovilizadas (por ej., moléculas que comprenden dominios de unión al epítope o dominios Fe (o porciones de los anteriores), respectivamente) sobre su superficie. El análisis BIACORE se describe en la Sección 5.4.3.
Con preferencia, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), con el uso de cualquiera de las técnicas conocidas por aquellas personas expertas en la materia, se usa para ensayo de base funcional o inmunológica para caracterizar moléculas de la invención. Los clasificadores de flujo son capaces de examinar rápidamente un gran número de células individuales que se han unido, por ej., posonizado, por moléculas de la invención (por ej., 10-100 millones de células por hora) (Shapiro et al. (1995) Practical Flow Cytometry). En forma adicional, los parámetros específicos usados para optimización del comportamiento del diacuerpo, incluyen aunque no se limitan a, concentración de antígenos (es decir, complejo tetramérico FcyR, remitirse a la sección 5.4.1), tiempo de competición cinética, o rigurosidad de FACS, cada una de las cuales puede variarse con el fin de seleccionar las moléculas de diacuerpo que comprenden moléculas de la invención que exhiben propiedades de unión específicas, por ej., concurrent unión a múltiple epítopes.
Los citómetros de flujo para clasificar y examinar células biológicas se conocen muy bien en la materia. Los citómetros de flujo conocidos se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE UU Nros. 4,347,935; 5,464,581 ; 5,483,469; 5,602,039; 5,643,796; y 6,21 1,477; cuyos contenidos completos se incorporan a modo de referencia en este documento. Otros citómetros de flujo conocidos son el sistema FACS Vantage™ fabricado por Becton Dickinson and Company, y el sistema COPAS™ fabricado por Union Biometrica.
La caracterización de la afinidad de unión al antígeno de destino o afinidad de unión a Fc-FcyR, y evaluación del antígeno de destino o densidad de FcyR sobre una superficie celular puede realizarse por métodos muy conocidos en la materia tales como análisis de Scatchard o por medio del uso de kits según las instrucciones del fabricante, tales como Quantum™ Simply Cellular ® (Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). El o los ensayos funcionales pueden ser cualquier ensayo conocido en la materia para caracterizar una o más funciones de células efectoras mediadas por FcyR según lo conocido por los expertos en el arte o como se describe en este documento. En realizaciones específicas, las moléculas de la invención que comprende múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, y dominio Fe (o porción de los anteriores) se evalúan en an ensayo ELISA para determinar la unión a uno o más antí genos de destino o uno o más FcyRs, por ej., FcyRIIIA, FcyRIIA, FcyRIIA; seguido de uno o más ensayos ADCC realizados. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención se evalúan en forma adicional con el uso de un ensayo basado en resonancia plasmónica de superficie, por ej., BIAcore. Los ensayos basados en resonancia plasmónica de superficie se conocen muy bien en la materia, y se discuten en forma adicional en la Sección 5.4.3, y ejemplificado en este documento, por ej., en el Ejemplo 6.1.
En las realizaciones más preferidas, las moléculas de la invención que comprende múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, y dominio Fe (o porción de los anteriores) se caracteriza en forma adicional en un modelo animal para determinar la interacción con un antígeno de destino (por ej., un FcyR) o para interacción Fc-FcyR. Donde deseen evaluarse las interacciones Fc-FcyR, los modelos animales preferidos para usar en los métodos de la invención are, por ejemplo, los FcyR humanos que expresan ratones transgénicos, por ej., cualquier modelo animal descrito en la Patente de los EE UU Nro. 5,877,397, y 6,676,927 las cuales se incorporan en este documento a modo de referencia en su totalidad. Ratones transgénicos adicionales para usar en dichos métodos incluyen, aunque no se limitan a, ratones con knockout de FcyRIIA lampiños que llevan FcyRIIIA humano; ratones con knockout de FcyRIIA lampiños que llevan FcyRIIA humano; ratones con knockout de FcyRIIA lampiños que llevan FcyRIIB humano y FcyRIIA humano; ratones con knockout de FcyRIIA lampiños que llevan FcyRIIB humano y FcyRIIA humano; ratones lampiños con knockout de FcyRIIIA y FcyRIIA que llevan FcyRIIIA humano y FcyRIIA y ratones lampiños con knockout de FcyRIIIA, FcyRIIA y FcyRIIB que llevan FcyRIIIA humano, FcyRIIA and FcyRIIB. 5.3.1 ENSAYOS DE UNIÓN QUE COMPRENDEN FcyR La caracterización de unión a FcyR por moléculas que comprenden un dominio Fe (o porción de los anteriores) y/o que comprende epítope dominio de unión específica para un FcyR puede realizarse con el uso de cualquier FcyR, que incluyen aunque sin limitarse a variantes polimórfícas de FcyR. En algunas realizaciones, una variante polimórfica de FcyRIIIA se usa, que contiene una fenilalanina en la posición 158. En otras realizaciones, la caracterización se realiza con el uso de una variante polimórfica de FcyRIIIA que contiene una valina en la posición 158. FcyRIIIA 158V muestra una mayor afinidad para IgGl que 158F y un aumento en la actividad de ADCC (véase, por ej., Koene et al. (1997) "Fe gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences the Binding of IgG By Natural Killer Cell Fe gammaRIIIa, Independently Of The Fe gammaRIIIa-48L/R/H Phenotype, " Blood, 90:1109-14; Wu et al. (1997) "A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa (CD16) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease, " J. Clin. Invest. 100: 1059-70, ambas de las cuales se incorporan en este documento a modo de referencia en sus totalidades); este residuo interactúa de hecho directamente con la región inferior de bisagra de IgGl como se mostró recientemente por estudios de co-cristalización de IgGl -FcyRIIIA, véase, por ej., Sondermann et al (2000) "The 3,2-A Crystal Structure of Human IgGl Fe Fragment-Fc gammaRIII complex, " Nature, 406(6793):267-273, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. Los estudios han demostrado que en algunos casos, los anticuerpos terapéuticos tienen mejorada eficacia en pacientes homócigos de FcyRJIIA-158V. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD20 Rituximab fue terapéuticamente más efectivo en Pacientes homócigos FcyRIIIA 158 V cuando se compara con pacientes homócigos FcyRIIIA 158F (Véase, por ej., Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activity Of The Humanized Monoclonal Antibody anti-CD20 And Polymorphism In IgG Fe Receptor FcgammaRIIIA Gene, " Blood, 99(3): 754-758). En otras realizaciones, las moléculas terapéuticas que comprenden esta región también pueden ser más efectivas en pacientes heterócigos para FcyRIIIA-158V y FcyRIIIA- 158F, y en pacientes con FcyRIIA-131H. Aunque sin intención de ligarse a un mecanismo de acción particular, la selección de moléculas de la invención con alotipos alternativos pueden proporcionar variantes que una vez diseñados en diacuerpos terapéuticos serán clínicamente más eficaces para pacientes homócigos para dicho alotipo.
Un ensayo de unión a FcyR se desarrolló para determinar la unión de las moléculas de la invención to FcyR, y, en particular, para determinar unión de dominios Fe a FcyR. El ensayo permitió la detección y cuantificación de interacciones Fc-FcyR, a pesar de la afinidad inherentemente débil del receptor para su ligando, por ej., en el rango micromolar para FcyRIIB y FcyRIIIA. El método se describe en detalle en la Solicitud Internacional WO04/063351 y Publicaciones de Solicitud de Patente de los EE UU 2005/0037000 y 2005/0064514, cada uno de los cuales se incorpora por este medio a modo de referencia en su totalidad. En forma sintética, el método incluye la formación de un complejo FcyR que puede usarse en cualquier inmunoensayo estándar conocido en la materia, por ej., FACS, ELISA, resonancia plasmónica de superficie, etc. En forma adicional, el complejo FcyR tiene una avidez mejorada por una región de Fe, con relación a un FcyR sin complejo. De acuerdo con la invención, el complejo molecular preferido es un complejo inmunológico tetramérico, que comprende: (a) la región soluble de FcyR (por ej., la región soluble de FcyRIIIA, FcyRIIA o FcyRIIB); (b) una secuencia AVITAG de 15 aminoácidos biotinilada (AVITAG) ligada en forma operativa al extremo terminal C de la región soluble de FcyR (por ej., la región soluble de FcyRIIIA, FcyRIIA o FcyRIIB); y (c) estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE); en una proporción molar para formar un complejo de FcyR tetramérico (con preferencia en una proporción molar 5:1). La proteína de fusión se biotinila en forma enzimática, con el uso de por ejemplo, la enzima de E.coli Bir A, una ligasa de biotina que biotiniliza específicamente un residuo de Usina en la secuencia de 15 aminoácidos AVITAG. Las proteínas solubles biotiniladas FcyR luego se mezclan con SA-PE en una proporcón molar de FcyR soluble biotinilada IX SA-PE:5X para formar un complejo FcyR tetramérico.
Se ha demostrado que los polipéptidos que comprenden regiones Fe have se unen a los complejos FcyR tetraméricos con por lo menos una afinidad 8 veces mayor que el FcyR monomérico no complejado. La unión de polipéptidos que comprende regiones Fe a los complejos FcyR tetraméricos puede determinarse con el uso de las técnicas estándar conocidas por aquellas personas con experiencia en la materia, tales como por ejemplo, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), radioinmunoensayos, ensayos ELISA, etc.
La invención abarca el uso de los complejos inmunes que comprenden moléculas de la invención, y formados de acuerdo con los métodos descritos con anterioridad, para determinar la funcionalidad de las moléculas que comprenden una región de Fe ensayos basads en células o libres de células.
Por una cuestión de conveniencia, los reactivos pueden proporcionarse en un kit para ensayo, es decir, una combinación envasada de reactivos para analizar la capacidad de moléculas que comprenden regiones Fe de unirse a complejos FcyR tetraméricos. Otras formas de complejos moleculares para usar en la determinación de interacciones Fc-FcyR también se contemplan para usar en los métodos de la invención, por ej., proteínas de fusión formadas como se describe en la Solicitud Provisional de EE UU 60/439,709, presentada el 13 de enero de 2003; que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. 5.3.2 ENSAYOS FUNCIONALES DE MOLÉCULAS CON CADENAS PESADAS VARIANTES La invención abarca caracterización de las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, dominios Fe (or porciones de los anteriores) con el uso de ensayos conocidos por aquellas personas expertas en la materia para identificar la función generadora de respuesta de la célula de las moléculas. En particular, la invención abarca caracterizar las moléculas de la invención para la función efectora de células mediada por FcyR. En forma adicional, donde por lo menos uno de los antígenos de destino de la molécula de diacuerpo de la invención es un FcyR, la unión de FcyR por la molécula de diacuerpo puede servir para activar las vías mediadas por FcyR similares a las activadas por la unión a FcyR-Fc. De este modo, donde por lo menos un dominio de unión al epítope de la molécula de diacuerpo reconoce un FcyR, la molécula de diacuerpo puede generar función de células efectoras mediada por FcyR sin contiene contener un dominio Fe (o porción de los anteriores), o sin unión concomitante de Fc-FcyR. Algunos ejemplos de funciones de la célula efectora que pueden evaluarse de acuerdo con la invención, incluyen aunque no se limitan a, la citotoxicidad mediada por células que dependen de los anticuerpos, fagocitosis, opsonización, opsono fagocitosis, unión a Clq, y la citotoxicidad mediada por células que dependen del complemento. Cualquier ensayo basado en células o libre de células conocido por aquellas personas expertas en la materia para determinar la actividad de la función de la célula efectora puede usarse (para obtener ensayos de célula efectora, véase Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells, " Methods Mol. Biol. 121 : 179-92; Baggiolini et al. (1988) "Cellular Models For The Detection And Evaluation OfDrugs That Modulate Human Phagocyte Activity, " Experientia, 44(10): 841-848; Lehmann et al. (2000) "Phagocytosis: Measurement Por Flow Cytometry, " J. Immunol. Métodos, 243(1-2): 229-42; Brown (1994) "In Vitro Assays OfPhagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signa! Transduction, " Métodos Cell Biol., 45: 147-64; Munn et al. (1 90) "Fagocitosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Estimulating Factor, " J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majid et al. (2002) "Fe Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Ñervo us System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, " Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Ding et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids, " Immunity 8:403-411, cada una de las cuales se incorpora a modo de referencia en este documento en su totalidad).
En una realización, las moléculas de la invención pueden evaluarse para fagocitosis mediada por FcyR en monocitos humanos. En forma alternativa, la fagocitosis mediada por FcyR de las moléculas de la invención puede evaluarse en otros fagocitos, por ej., neutrófilos (leucocitos polimorfonucleares; PMN); monocitos de sangre periférica humana, macrófagos derivados de monocitos, que pueden obtenerse con el uso de procedimientos estándar conocidos por aquellas personas expertas en la materia (por ej., see Brown (1994) "In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction, " Métodos Cell Biol., 45: 147-164). En una realización, la función de las moléculas de la invención se caracteriza por la medición de la capacidad de las células THP-1 de fagocitar glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgG con fluoresceína (SRBC) por métodos descritos con anterioridad (Tridandapani et al. (2000) "The Adapter Proteína LAT Enhances Fcgamma Receptor- Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells, " J. Biol. Chem. 275: 20480-20487).
Otro ensayo ejemplificativo para determinar la fagocitosis de las moléculas de la invención es un ensayo de opsonofagocitosis que depende del anticuerpo (ADCP) que puede comprender los siguientes: recubrir una biopartícula de destino tales como FITC marcado con Escherichia coli (Molecular Probes) o FITC Staphylococcus aureus con (i) anticuerpo 4-4-20 tipo salvaje, un anticuerpo para fluoresceína (Véase Bedzyk et al. (1989) "Comparison Of Variable Región Primary Structures Within de An Anti-Fluoresceína Idiotype Family, " J. Biol. Chem, 264(3): 1565-1569, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad), como anticuerpo de control para ADCP dependiente de FcyR; o (ii) anticuerpo 4-4-20 que alberga la mutación D265A que knoquea la unión a FcyRIII, como un control anterior para ADCP dependiente de FcyR (iii) un diacuerpo que comprende el dominio de unión al epítope de 4-4-20 y un dominio Fe y/o un dominio de unión al epítope específico para FcyRIII; y formar la partícula opsonizada; agregar cualquiera de las partículas opsonizadas descritas (i-iii) para células efectoras THP-1 (una línea celular monocítica disponible de ATCC) a una proporción de 1 :1, 10:1, 30:1, 60: 1, 75:1 o 100: 1 para permitir que ocurra la fagocitosis mediada por FcyR; con preferencia incubar las células y E. co/z'-FITC/anticuerpo a 37°C durante 1,5 hora; agregar azul de tripan después de la incubación (con preferencia a temperatura ambiente durante 2-3 min.) a las células para desactivar la fluorescencia de las bacterias que se adhieren a la parte exterior de la superficie celular sin internalizarse; transferir las células a un buffer de FACS (por ej., 0,1%, BSA en PBS, 0,1%, azida de sodio), analizar la fluorescencia de las células THP 1 con el uso de FACS (por ej., BD FACS Calibur). Con preferencia, las células THP-1 used in the assay se analizaron por FACS para determinar la expresión de FcyR en la superficie celular. Las células THP-1 expresan ambos CD32A y CD64. CD64 es un FcyR de alta afinidad que se bloquea al conducir el ensayo ACDP de acuerdo con los métodos de la invención. Las células THP-1 con preferencia se bloquean con 100 µg/mL de IgGl soluble o 10% suero humano. Para analizar el grado de ADCP, la puerta se fija con preferencia en las células THP-1 y se mide la intensidad de fluorescencia media. La actividad de ADCP para imitantes individuales se calcula y se informa como un valor normalizado al chMab 4-4-20 obtenido tipo salvaje. Las partículas opsonizadas se agregan a las células THP-1 de manera tal que la proporción de las partículas opsonizadas a las células THP-1 es 30:1 o 60:1. En las realizaciones más preferidas, el ensayo ACDP se conduce con controles, tales como E. coli-FYTC en medio, E. coli-FYTC y las células THP-1 (para servir como actividad de ADCP independiente de FcyR), E. coli-FYTC, las células THP-1 y anticuerpo 4-4-20 tipo salvaje (para servir como actividad de ADCP dependiente de FcyR), E coli-FYTC, las células THP-1, 4-4-20 D265A (para servir como el control anterior para la actividad de ADCP dependiente de FcyR).
En otra realización, las moléculas de la invención pueden evaluarse para determinar la actividad de ADCC mediada por FcyR en células efectoras, por ej., células asesinas naturales, con el uso de cualquiera de los métodos estándar conocidos por aquellas personas expertas en la materia {Véase por ej., Perussia et al. (2000) "Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells, " Métodos Mol. Biol. 121 : 179-92; Weng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma, " J. Clin. Oncol. 21 :3940-3947; Ding et al. (1998) "Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids, " Immunity 8:403-411). Un ensayo ejemplificativo para determinar la actividad de ADCC de las moléculas de la invención se basa en un ensayo de liberación de 5 lCr que comprende: marcar las células de destino con [51Cr]Na2Cr04 (esta molécula de membrana celular permeable se usa comúnmente para marcar ya que se une a proteínas citoplasmáticas y aunque se libere espontáneamente de células con cinética lenta, se libera en forma masiva luego de la necrosis de células de destino); opsonizar las células de destino con las moléculas de la invención que comprende cadenas pesadas variantes; combinar las células de destino radiomarcadas opsonizadas con células efectoras en una placa de microtitulación en una proporción apropiada de células de destino a células efectoras; incubar la mezcla de células durante 16-18 horas a 37°C; recolectar los sobrenadantes; y analizar la radiactividad. La citotoxicidad de las moléculas de la invención luego puede determinarse, por ejemplo con el uso de la siguiente fórmula: % lisis = (cpm experimental - cpm de fuga de destino)/(cpm de lisis de detergente - cpm de fuga de destino) x 100%. En forma alternativa, % lisis = (ADCC-AICC)/(liberación máxima-liberación espontánea). La lisis específica puede calcularse con el uso de la fórmula: specific lisis = % lisis con las moléculas de la invención - % lisis en ausencia de las moléculas de la invención. Puede generarse un gráfico variando en forma indistinta la proporción de célula efectora: de destino o concentración de anticuerpo.
Con preferencia, la célula generadora de respuestas usada en los ensayos ADCC realizados de la invención son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que con preferencia se purifican de sangre humana normal, con el uso de métodos estándar conocidos por los expertos en el arte, por ej., con el uso de centrifugado de gradiente por densidad de Ficoll-Paque. Las células efectoras preferidas para usar en los métodos de la invención expresan diferentes receptores de activación de FcyR. La invención abarca, células efectoras, THP-1, que expresan FcyRI, FcyRIIA y FcyRIIB, y macrófagos derivados de monocitos de sangre humana completa que expresan ambos FcyRIIIA y FcyRIIB, para determinar si los imitantes de anticuerpos de cadena pesada muestran el aumento en la actividad de ADCC y fagocitosis con relación a anticuerpos de IgGl tipo salvaje.
La línea celular de monocitos humanos, THP-1, activa la fagocitosis a través de la expresión del receptor FcyRI de alta afinidad y el receptor de baja afinidad FcyRIIA (Fleit et al. (1991) "The Human Monocyte-Like Cell Line THP-1 Expresses Fe Gamma RI And Fe Gamma RII, " J. Leuk. Biol. 49: 556-565). Las células THP-1 no expresan constitutivamente FcyRIIA o FcyRIIB. La estimulación de estas células con citoquinas afecta el patrón de expresión de FcR (Pricop et al. (2001) "Differential Modulation of Stimulatory And Inhibitory Fe Gamma Receptors On Human Monocytes By Thl y Th2 Cytokines, " J. of Immunol., 166: 531-537). El crecimiento de las células THP-1 en la presencia de la citoquina IL4 induce la expresión de FcyRIIB y causa una reducción en la expresión de FcyRIIA y FcyRI. La expresión de también puede potenciarse al aumentar la densidad celular (Tridandapani et al. (2002) "Regulated Expresión y Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells, " J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089). En contraste, se ha reportado que IFNy puede conducir a la expresión de FcyRIIIA (Pearse et al. (1993) "Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High-Affinity receptor de Fe Para IgG Requiere Assembly Of A Complex That Includes The 91-kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF3, " Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 4314-4318). La presencia o ausencia de receptores en la superficie celular pueden determinarse por FACS con el uso de métodos comunes conocidos por los expertos en el arte. La expresión inducida por citoquinas de FcyR en la superficie celular proporciona un sistema para analizar tanto la activación como la inhibición en la presencia de FcyRIIB. Si las células THP-1 son incapaces de expresar el FcyRIIB la invención abarca, además, otra línea celular de monocitos humanos, U937. Se ha demostrado que estas células se diferencian en forma terminal en macrófagos en la presencia de IFNy y TNF (Koren et al. (1979) "In Vitro Activation of A Human Macrophage-Like Cell Line, " Nature 279: 328-331).
La matanza de células tumorales que dependen de FcyR está mediada por macrófago y células NK en modelos de tumores de ratón (Clynes et al. (1998) "Fe Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma, " Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 652-656). La invención abarca el uso de monocitos elutriados de donantes como células efectoras para analizar la eficiencia de imitantes de Fe para desencadenar la citotoxicidad celular de células de destino tanto en ensayos realizados de fagocitosis como ADCC. Los patrones de expresión de FcyRI, FcyRIIIA, y FcyRIIB se ven afectados por diferentes condiciones de crecimiento. La expresión de FcyR de monocitos elutriados, monocitos elutriados frescos, monocitos mantenidos en 10% FBS, y monocitos cultivados en FBS + GM-CSF y lo en suero humano puede determinarse con el uso de métodos comunes conocidos por aquellas personas expertas en la materia. Por ejemplo, las células pueden mancharse con anticuerpos específicos de y analizarse por FACS para determinar los perfiles de FcR. Las condiciones que simplemente imitan mejor el la expresión de FcyR de macrófago in vivo se usa luego para los métodos de la invención.
En algunas realizaciones, la invención abarca el uso de células de ratón en especial cuando las células humanas con los perfiles correctos de FcyR son incapaces de obtenerse. En algunas realizaciones, la invención abarca la línea celular de macrófago de ratón RAW264,7(ATCC) que puede transfectarse con human FcyRIIIA y transfectantes estables aislados con el uso de métodos conocidos en la materia, véase, por ej., Ralph et al. (1977) "Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage-Related Cell Lines: Enhancement By PPD Y LPS, " J. Immunol. 119: 950-4). Los transfectantes pueden cuantificarse para determinar la expresión de FcyRIIIA por análisis FACS con el uso de experimentación de rutina y altos expresores puede usarse enh los ensayos ADCC realizados de la invención. En otras realizaciones, la invención abarca aislamiento de macrófago peritoneano de bazo que expresa FRcyR humano de ratones knock out transgénicos tales como aquellos divulgados en este documento.
Los linfocitos pueden cosecharse de sangre periférica de donantes (PBM) con el uso de un gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia). Dentro de la población mononuclear aislada de células, la mayoría de la actividad de ADCC ocurre por medio de las células naturales asesinas (NK) que contienen FcyRIIIA aunque no FcyRIIB sobre su superficie. Los resultados con estas células indican la eficacia de mutantes al desencadenar el ADCC de las células NK y establecer los reactivos para evaluar con monocitos elutriados.
Las células de destino usadas en los ensayos ADCC realizados de la invención incluyen, aunque no se limitan a, líneas celulares de cáncer de mama, por ej., SK-BR-3 con número de acceso al ATCC HTB-30 (véase, por ej., Tremp et al. (1976) "Human Breast Cáncer In Culture, " Recent Results Cáncer Res. 33-41); linfocitos B; células derivadas de linfoma de Burkitts, por ej., células Raji con número de acceso al ATCC CCL-86 (véase, por ej., Epstein et al. (1965) "Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain (EB1) Of Human Lymphoblasts From Burkitt's Lymphoma, " J. Nati. Cáncer Inst 34: 231-240), y células de Daudi con número de acceso al ATCC CCL-213 (véase, por ej., Klein et al. (1968) "Surface IgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In Derived Culture Lines, " Cáncer Res. 28: 1300-1310). Las células de destino deben ser reconocidas por el sitio que se une al antígeno de la molécula de diacuerpo que se analizará.
El ensayo de ADCCse basa en la capacidad de células NK de mediar la muerte celular por medio de una vía apoptótica. Las ccélulas NK median la muerte celular en parte por el reconocimiento de FcyRIIIA de un dominio Fe de IgG unido a un antígeno sobre una superficie celular. Se realizaron ensayos ADCC usados de acuerdo con los métodos de la invención pueden ser ensayos de base radiactiva o ensayos de base fluorescente. El ensayo de ADCC usado para caracterizar las moléculas de la invención que comprenden regiones Fe variantes comprende marcar las células de destino, por ej., SK-BR-3, MCF-7, OVCAR3, Raji, células de Daudi, células de destino opsonizadas con un anticuerpo que reconoce un receptor de la superficie celular on la célula de destino por medio de su sitio de unión al antígeno; combinar las células de destino opsonizadas rotuladas y la célula generadora de respuestas en una proporción apropiada, que pueden determinarse por experimentación de rutina; cosecha de células; detectar el rótulo en el sobrenadante de las células de destino Usadas, con el uso de un esquema de detección apropiado en base al rótulo usado. Las células de destino pueden rotularse en forma indistinta con un rótulo radiactivo o un rótulo fluorescente, con el uso de métodos estándar conocidos en la materia.
Por ejemplo los rótulos incluyen, aunque no se limitan a, [51Cr]Na2Cr04; y el éster de acetoximetilo del ligando potenciador de fluorescencia, 2,2':6',2"-terpiridina-6-6"-dicarboxilato (TDA).
En una realización específica, un ensayo fluorimétrico resuelto con el tiempo se usa para medir la actividad de ADCC contra las células blanco que se han marcado con el éster de acetoximetilo del ligando potenciador de fluorescencia, 2,2':6',2"-terpiridina-6-6"-dicarboxilato (TDA). Dichos ensayos fluorimétricos se conocen en la materia, por ej., véase, Blomberg et al. (1996) "Time-Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence Enhancing Ligand, " Journal of Immunological ethods, 193: 199-206; que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. En forma sintética, las células de destino se marcan con el diéster de acetoximetilo permeable a la membrana de TDA (bis(acetoxoximetil) 2,2':6',2"-terpiridina-6-6"-dicarboxilato, (BATDA), que se difunde rápidamente a través de la membrana de células viables. Las esterasas intracelulares se separan de los grupos éster y la molécula de TDA impermeable a la membrana regenerada se atrapa dentro de la célula. Después de la incubación de las células efectoras y de destino, por ej., durante por lo menos dos horas, hasta 3,5 horas, a 37°C, bajo 5% C02, el TDA liberado de las células blanco lisadas se quela con con Eu3+ y la fluorescencia de los quelatos de Europio -TDA formados se cuantifica en un fluorómetro con resolución en el tiempo (por ej., Victor 1420, Perkin Elmer/Wallace).
En otra realización específica, el ensayo de ADCC usado para caracterizar las moléculas de la invención que comprende múltiple sitios que se unen al epítope y, en forma opcional, un dominio Fe (o porción de los anteriores) comprende los siguientes steps: Con preferencia 4-5xl06 células de destino (por ej., S -BR-3, MCF-7, OVCAR3, células Raji) se rotulan con bis(acetoximetil) 2,2':6',2"-terpiridina-t-6"-dicarboxilato (DELFIA BATDA Reagent, Perkin Elmer/Wallac). Para lograr una óptima eficiencia de rotulado, la cantidad de células de destino usadas en el ensayo de ADCC con preferencia no deben exceder 5x106. El reactivo BATDA se agrega a las células y la mezcla se incuba a 37°C con preferencia bajo 5% de C02, durante por lo menos 30 minutos. A continuación las células se lavan con un buffer fisiológico, por ej., PBS con sulfinilpirazol 0,125 mM, y medios que contienen sulfinilpirazol 0,125 mM. Las células de destino rotuladas a continuación se opsonizan (se recubren) con una molécula de la invención que comprende un dominio de unión al epítope específico para FcyRIIA y, en forma opcional, un dominio Fe (o porción de los anteriores). En realizaciones preferidas, la molécula usada en el ensayo de ADCC también es específica para un receptor de la superficie celular, un antígeno del tumor, o un antígeno del cáncer. La molécula de diacuerpo de la invención pueden unirse en forma específica a cualquier antígeno del cáncer o del tumor, tales como aquellos enumerados en la sección 5.6.1. Las células de destino en el ensayo de ADCC se eligen de acuerdo con los sitios que se unen al epítope diseñados en el diacuerpo de la invención, de manera tal que el diacuerpo se une a un receptor de la superficie celular de la célula de destino específicamente.
Las células de destino se agregan a células efectoras, por ej., PBMC, para producir proporciones de efector: destino de aproximadamente 1 :1, 10:1, 30:1, 50:1, 75:1, o 100:1. Las células efectoras y de destino se incuban durante por lo menos dos horas, hasta 3,5 horas, a 37°C, bajo 5% de C02. Los sobrenadantes de células se cosechan y se agregan a una solución ácida de europio (por ej., DELFIA Europium Solution, Perkin Elmer/Wallac). La fluorescencia de los quelatos de Europio-TDA formados se cuantifica en un fluorómetro con resolución en el tiempo (por ej., Víctor 1420, Perkin Elmer/Wallac). La máxima liberación (MR) y la liberación espontánea (SR) se determinan por incubación de las células de destino con 1% TX-100 y medios solos, respectivamente. La citotoxicidad celular independiente del anticuerpo (AICC) se mide por incubación de células efectoras y de destino en ausencia de una molécula de análisis, por ej., diacuerpo de la invención. Cada ensayo se realiza con preferencia por triplicado. El porcentaje promedio de lisis específica se calcula como: Liberación experimental (ADCC) - AICC)/(MR-SR) x 100.
La invención abarca ensayos conocidos en la materia, y ejemplificados en este documento, para caracterizar la unión de Clq y mediación de citotixicidad que depende de los complementos (CDC) por moléculas de la invención que comprenden dominios Fe (or porciones de los anteriores). Para determinar la unión a Clq, un ELISA de Clq de la unión puede realizarse. Un ensayo ejemplificativo pueden comprender los siguientes: placas de ensayo pueden recubrirse durante toda la noche a 4°C con polipéptido que comprende una molécula de la invención o polipéptido de inicio (control) en un buffer de recubrimiento. La placas a continuación pueden lavarse y bloquearse. Luego del lavado, una alícuota de Clq humana puede agregarse a cada pocilio e incubarse durante 2 hrs a temperatura ambiente. Luego de un lavado adicional, 100 uL de un anticuerpo conjugado con peroxidasa de Clq anti-complemento de oveja puede agregarse a cada pocilio e incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa puede lavarse nuevamente con buffer de lavado y 100 ul de buffer de sustrato que contiene OPD (Diclorhidrato de O-fenilendiamina (Sigma)) puede agregarse a cada pocilio. La reacción de oxidación, observada por la aparición de un color amarillo, puede dejarse proceder durante 30 minutos y detenerse por la incorporación de 100 ul de 4,5 NH2 S04. La absorbancia puede leerse entonces a (492-405) nm.
Para evaluar la activación de complementos, puede realizarse un ensayo de citotixicidad que depende de los complementos (CDC), por ej. como se describe en Gazzano-Santoro et al. (1997) "A Non-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay For Anti-CD20 Monoclonal Antibody, " J. Immunol. Métodos 202:163-171, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. En forma sintética, varias concentraciones de la molécula que comprende un dominio Fe (variante) (o porción de los anteriores) y complemento humano puede diluirse con buffer. Las células que expresan el antígeno al cual la molécula de diacuerpo se une pueden diluirse hasta una densidad de alrededor de lxl 06 células/ml. Las mezclas de las moléculas de diacuerpo que comprenden un dominio Fe (variante) (o porción de los anteriores), complemento humano diluido y células que expresan el antígeno pueden agregarse a una placa de cultivo de tejidos de 96 pocilios de base plana y se dejó incubar durante 2 hrs a 37°C. y 5% C02 para facilitar la lisis celular mediada por complementos. 50 uL de azul de alamar (Accumed International) pueden agregarse luego a cada pocilio e incubarse durante toda la noche a 37°C. La absorbancia se mide con el uso de un fluorómetro de 96 pocilios con excitation a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados pueden expresarse en unidades de fluorescencia relativa (RFU). Las concentraciones de muestra pueden computarse a partir de una curva estándar y el porcentaje de actividad se compara con la molécula no variante, es decir, una molécula no comprende un dominio Fe o que comprende un dominio Fe no variante, se informa para la variante de interés. 5.3.3 OTROS ENSAYOS Las moléculas de la invención que comprenden múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, un dominio Fe puede evaluarse con el uso de cualquier ensayo basado en resonancia plasmónica de superficie conocidos en la materia para caracterizar los parámetros cinéticos de un dominio de unión al antígeno o unión a Fc-FcyR. Cualquier instrumento de SPR disponible en el mercadoque incluyen, aunque sin limitarse a, instrumentos de BIAcore, disponible de Biacore AB (Uppsala, Sueca); instrumentos IAsys disponible de Affinity Sensors (Franklin, MA.); Sistema IBIS disponible de Windsor Scientific Limited (Berks, UK), Sistemas SPR-CELLIA disponibles de Nippon Laser and Electronics Lab (Hokkaido, Japan), y SPR Detector Spreeta disponible de Texas Instruments (Dallas, TX) puede usarse en la presente invención. Para obtener una revisión de la tecnología basada en SPR véase Mullet et al. (2000) "Plasmon Surface Resonance -Based Inmunoassays, " Métodos 22: 77-91 ; Dong et al. (2002) "Some new aspects in biosensors, " Reviews in Mol. Biotech. 82: 303-23; Fivash et al. (1998) "BIAcore For Macromolecular Interaction, " Current Opinión in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al. (2000) "Advances In Plasmon Surface Resonance Biosensor Analysis, " Current Opinión in Biotechnology 11 : 54-61 ; la totalidad de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. En forma adicional, cualquiera de los instrumentos SPR y métodos basados SPR para la medición de interacciones proteína-proteína interacciones descritos en las Patentes de EE UU Nros. 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125, la totalidad de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad, se contemplan en los métodos de la invención.
En forma sintética, ensayos basados en SPR incluyen inmovilizar un miembro de un par de unión en una superficie, y monitorear su interaction con el otro miembro del par de unión en solución en tiempo real. SPR se basa en la medición del cambio en el índice refractivo del solvente cerca de la superficie que ocurre luego de la formación o disociación de complejos. The surface onto which the immobilization occurs is the sensor chip, which is at the heart of the SPR technology; it consists of a glass surface coated con a thin layer of gold and forms the basis for a range of specialized surfaces designed to optimize la unión de una molécula to the surface. Una variedad de sensor chips are disponible en el mercadoen especial from the companies Usted supra, all of which may be usados en los métodos de la invención. Algunos ejemplos de sensor chips incluyen those disponible de BIAcore AB, Inc., por ej., Sensor Chip CM5, SA, NT A, y HPA. Una molécula de la invención may be immobilized onto the surface of a sensor chip con el uso de any of the immobilization métodos and chemistries conocidos en la materia, que incluyen aunque sin limitarse a, direct covalent coupling por medio de amine groups, direct covalent coupling por medio de sulfhydryl groups, biotin attachment to avidin coated surface, aldehyde coupling to carbohydrate groups, y attachment through the histidine tag con NT A chips.
En algunas realizaciones, los parámetros cinéticos de la unión de moléculas de la invención que comprende múltiple sitios que se unen al epítope y, en forma opcional, y Fe domain, a un antígeno o un FcyR puede determinarse con el uso de un instrumento BIAcore (por ej., BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, NJ). Como se discutió con anterioridad, remitirse a la sección 5.4.1, cualquier FcyR puede usarse para evaluar la unión de las moléculas de la invención en forma indistinta donde por lo menos un sitio de unión al epítope de la molécula de diacuerpo reconoce en forma inmunoespecífica un FcyR, y/o donde la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fe (o porción de los anteriores). En una realización específica el FcyR es FcyRIIIA, con preferencia un FcyRIIIA monomérico soluble. Por ejemplo, en una realización, el FcyRIIIA monomérico soluble es la región extracelular de FcyRIIIA unido a la secuencia AVITAG-ligadura (véase, Solicitud Provisional de EE UU Nro. 60/439,498, presentada el 9 de enero de 2003 y Solicitud Provisional de EE UU Nro. 60/456,041 presentada el 19 de marzo de 2003, las cuales se incorporan en este documento a modo de referencia en sus totalidades). En otra realización específica, el FcyR es FcyRIIB, con preferencia un FcyRIIB dimérico soluble. Por ejemplo en una realización, la proteína FcyRIIB dimérico soluble se prepara de acuerdo con la metodología que se describe en la Solicitud Provisional de EE UU Nro. 60/439,709 presentada el 13 de enero de 2003, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
Para todos los ensayos inmunológicos, el reconocimiento de/la unión a FcyR por una molécula de la invención puede efectuarse por múltiples dominios: en ciertas realizaciones, las moléculas de la invención reconocen en forma inmunoespecífica un FcyR por medio de uno de los múltiples dominios que se unen al epítope; incluso, en otras realizaciones, donde la molécula de la invención comprende un dominio Fe (o porción de los anteriores), la molécula de diacuerpo pueden reconocer en forma inmunoespecífica un FcyR por medio de interacciones Fc-FcyR; incluso en otras realizaciones, donde una molécula de la invención comprende ambos, un dominio Fe (o porción de los anteriores) y un sitio que se une al epítope que reconoce en forma inmunoespecífica un FcyR, la molécula de diacuerpo puede reconocer un FcyR por medio de uno o ambos de un dominio de unión al epítope y el dominio Fe (o porción de los anteriores). Un ensayo ejemplificativo para determinar los parámetros cinéticos de una molécula que comprende múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, y dominio Fe (o porción de los anteriores) a un antígeno y/o un FcyR con el uso de un instrumento BIAcore comprende los siguientes: un primer antígeno se inmoviliza sobre una de las cuatro células de flujo de una superficie del chip sensor, con preferencia a través de química de acoplamiento de amina de manera tal que alrededor de 5000 unidades de respuesta (RU) de dicho primer antígeno se inmovilizan sobre la superficie. Una vez que la superficie apropiada se prepara, las moléculas de la invención que reconocen en forma inmunoespecífica dicho primer antígeno se pasan sobre la superficie, con preferencia por inyecciones de un minuto de una solución de 20 µg/mL a un caudal de fujo de 5µ1/p?. Los niveles de las moléculas de la invención unidas a la superficie en esta etapa normalmente oscila entre 400 y 700 RU. A continuación, la serie de dilución de un segundo antígeno (por ej., FcyR) o receptor FcyR en buffer HBS-P (20mM HEPES, 150 mM NaCl, 3mM EDTA, pH 7,5) se inyectan sobre la superficie a 100 µ??p???. La regeneración de moléculas entre diferentes diluciones de segundo antígeno o receptor se lleva a cabo con preferencia por 5 segundas inyecciones individuales de lOOmM NaHC03 pH 9,4; 3M NaCl. Cualquier técnica de regeneración conocida en la materia se contempla en el método de la invención.
Una vez recolectados los datos completos, las curvas de unión resultantes se adaptan en forma global con el uso de algoritmos para computadoras provistos por el fabricante de instrumentos SPR, por ej., BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ). Estos algoritmos calculan ambos el Ko„ and Kotr, del cual la constante de unión en equilibrio óptima, ¾ se deduce como la proporción de las dos constantes de velocidad (es decir, Koff Kon). Los tratamientos más detallados of how the individual rate constante are derived can be found in the BIAevaluaion Software Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). The análisis of the generated data puede realizarse con el uso de any method conocidos en la materia. Para obtener una revisión de los varios métodos de interpretación de los datos cinéticos generados véase Myszka (1997) "Kinetic Análisis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors, " Current Opinión in Biotechnology 8: 50-7; Fisher et al. (1994) "Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions, " Current Opinión in Biotechnology 5: 389-95; O'Shannessy (1994) "Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium Binding Constants For Macromolecular Interactions: A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature, " Current Opinión in Biotechnology, 5:65-71 ; Chaiken et al. (1992) "Análisis Of Macromolecular Interactions Using Immobilized Lig nds, " Analytical Biochemistry, 201 : 197-210; Morton et al. (1995) "Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors: A Comparison Of Análisis By Linearization, The Integrated Rate Equation, and Numerical Integration, " Analytical Biochemistry 227: 176-85; O'Shannessy et ai, 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83; la totalidad de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
En realizaciones preferidas, los parámetros cinéticos determinados con el uso de un análisis SPR, por ej., BIAcore, puede usarse como medida predictiva de cómo una molécula de la invención funcionará en un ensayo funcional, por ej., ADCC. Un método ejemplifícativo para predecir la eficacia de una molécula de la invención basado en parámetros cinéticos obtenidos de un análisis SPR pueden comprender los siguientes: determinar los valores Koff para la unión de una molécula de la invención a FcyRIIIA y FcyRIIB (via un dominio de unión al epítope y/o un dominio Fe (o porción de los anteriores)); graficar (1) Koff (wt)/Koff (mut) para FcyRIIIA; (2) Koff (mut)/Koff (wt) para FcyRIIB contra los datos de ADCC. Los números mayores que uno muestran una reducción del índice de disociación para FcyRIIIA y un aumento del índice de disociación para FcyRIIB con relación al tipo salvaje; y posee una función potenciada de ADCC. 5.4 MÉTODOS OF PRODUCING MOLÉCULAS DE DIACUERPO DE LA INVENCIÓN Las moléculas de diacuerpo de la presente invención pueden producirse con el uso de una variedad de métodos muy conocidos en la materia, que incluyen la síntesis de nuevo de la proteína y la expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión. Las secuencias de ácido nucleico deseadas pueden producirse por métodos recombinantes (por ej., mutagénesis por PCR de una variante preparada anterior del polinucleótido deseado) o por síntesis de ADN en fase sólida. Usualmente se usan métodos de expresión recombinantes. En un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un CD16A VH y/o VL; en otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un CD32B VH y/o VL. Debido a la degeneración del código genético, una variedad de secuencias de ácido nucleico codifican cada secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina, y la presente invención incluye todos los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión que se describen en este documento. 5.4.1 POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN LAS MOLÉCULAS DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye, además, polinucleótidos que codifican las moléculas de la invención, que incluyen los polipéptidos y los anticuerpos. Los polinucleótidos que codifican las moléculas de la invención pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, por cualquier método conocido en la materia.
Una vez que la secuencia de nucleótidos de las moléculas que se identifican por los métodos de la invención se determina, la secuencia de nucleótidos puede manipularse con el uso de métodos muy conocidos en la materia, por ej., técnicas de ADN recombinante, mutagénesis orientada al sitio, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas que se describen en Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; y Ausubel et al, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, NY, que se incorporan ambas a modo de referencia en este documento en sus totalidades), para generar, por ejemplo, anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo por generación de sustituciones de aminoácidos, eliminaciones, y/o inserciones.
En una realización, bibliotecas humanas o cualquier otra biblioteca disponible en la materia, pueden seleccionarsepor técnicas estándar conocidas en la materia, para clonar los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de la invención. 5.4.2 EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE MOLÉCULAS DE LA INVENCIÓN Una vez que una secuencia de ácido nucleico que codifica las moléculas de la invención (es decir, anticuerpos) se ha obtenido, el vector para la producción de las moléculas puede producirse por medio de tecnología de ADN recombinante con el uso de técnicas muy conocidas en la materia. Los métodos que resultan conocidos para aquellas personas expertas en la materia pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen las secuencias de codificación para las moléculas de la invención y señales apropiadas de control de transcripción y traducción. Estos métodos incluyen, por ejemplo, in vitro técnicas de ADN recombinante, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. (Véase, por ejemplo, las técnicas que se describen en Sambrook et al, 1990, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, NY).
Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de una molécula identificada por los métodos de la invención puede transfectarse a una célula huésped por técnicas convencionales (por ej., electroporación, transfección por liposomas, y precipitación de fosfato de calcio) y las células transfectadas a continuación se cultivan por técnicas convencionales para producir las moléculas de la invención. En realizaciones específicas, la expresión de las moléculas de la invención se regula por un promotor específico de un tejido o constitutivo o inducible.
Las células huésped usadas para expresar las moléculas identificadas por los métodos de la invención pueden ser en forma indistinta células bacterianas tales como Escherichia coli, or, con preferencia, células eucarióticas, en especial para la expresión de molécula de inmunoglobulina recombinante entera. En particular, células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), en conjunción con un vector tal como el elemento promotor de genes iniciales intermedios mayores de citomegalovirus humanos es un sistema de expresión efevtivo para las inmunoglobulinas (Foecking et al. (1986) "Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors, " Gene 45:101-106; Cockett et al. (1990) "High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chínese hámster ovary cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification, " Biotechnology 8:662-667).
Una variedad de sistemas de vector de expresión-huésped puede utilizarse para expresar las moléculas identificadas por los métodos de la invención. Dichos sistemas de expresión-huésped representan vehículos por los cuales las secuencias de codificación de las moléculas de la invención pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o se transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, expresar las moléculas de la invención in situ. Estos incluyen, aunque no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ej., E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN plásmido o ADN cósmido que contienen secuencias de codificación para las moléculas identificadas por los métodos de la invención; levadura (por ej., Saccharomyces pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ej., baclovirus) que contienen las secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención; sistemas de células vegtetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ej., virus mosaico de la coliflor (CaMV) y virus mosaico de tabaco (TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinante (por ej., plásmido Ti) que contienen las secuencias que codifican las moléculas identificadas por los métodos de la invención; o sistemas de células de mamífero (por ej., células de COS, CHO, BHK, 293, 293T, 3T3, células linfocíticas (Véase U.S. 5,807,715), Células Per C,6 (células de retina humana desarrolladas por Crucell) que rodean las construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ej., promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ej., el promotor tardío de adeno virus; el promotor de 7,5K del virus de vaccinia).
En sistemas bacterianos, una cantidad de vectores de expresión pueden seleccionarse en forma ventajosa dependiendo del uso pretendido para la molécula expresada. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de dicha proteína desea producirse, para la generación de composiciones farmacéuticas de un anticuerpo, los vectores que orientan la expresión de altos niveles de los productos de proteína de fusión que se purifican ampliamente pueden ser deseables. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Rüther et al. (1983) "Easy Identification Of cDNA Clones, " EMBO J. 2:1791-1794), en la cual la secuencia de codificación del anticuerpo puede ligarse individualmene en el vector en marco con la región de codificación lac Z de modo tal que la proteína de fusión se produce; vectores pIN (Inouye et al. (1985) "Up-Promoter Mutations In The Ipp Gene Of Escherichia Coli, " Nucleic Acid Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) "Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli, " J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares, los vctores pGEX también pueden usarse para expresar polipéptidos extranjeros como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse ampliamente a partir de células Usadas por absorción y unión a una matriz de perlas de glutationa-agarosa seguido de elución en la presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir trombina o sitios de separación de la proteasa del factor Xa con el fin de que el producto génico de destino clonado pueda liberarse de un resto GST.
En un sistema de insectos, el virus de polihedrosis uclear Autographa californica (AcNPV) se usa como vector para expresar genes extranjeros. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación del anticuerpo puede clonarse en forma individual en regiones no esenciales (por ej., gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ej., el promotor de polihedrina).
En células huésped de mamífero, una cantidad de sistemas de expresión con base viral puede utilizarse. En casos en los cuales un adenovirus se usa como vector de expresión, la secuencia de codificación del anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/ traducción del adenovirus, por ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma de adenovirus por recombinación in vi tro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ej., región El o E3) producirá un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en huéspedes infectados (por ej., véase Logan et al. (1984) "Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :3655-3659). Las señales de iniciación específicas también pueden requerirse para la traducción eficiente de las secuencias de codificación insertadas del anticuerpo. Estas señales incluyen codón de iniciación de ATG y secuencias adyacentes. En forma adicional, el codón de iniciación debe ser en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción de la inserción completa. Estas señales de control de traducción exógena y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede potenciarse por lainclusión de elementos potenciadores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc. (Véase Bitter et al. (1 87) "Expresión y Secretion Vectors For Yeast, " Methods in Enzymol. 153:516-544).
Además, una cepa de célula huésped puede elegirse que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en el modo deseado específico. Dichas modificaciones (por ej., glicosilación) y procesamiento (por ej., cleavage) de productos de proteínas pueden ser importantes para la función de la proteína. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los polipéptidos que comprenden una molécula del diacuerpo de la invención puede expresarse como un producto génico simple (por ej., como cadena de polipéptido simple, es decir, como un Precursor de Poliproteínas), que requiere la descomposición proteolítica por mecanismos celulares nativos o recombinantes para formar los polipéptidos separados de las moléculas de diacuerpo de la invención. La invención abarca de este modo diseñar una secuencia de ácido nucleico para codificar una molécula precursora de poliproteínas que comprende los polipéptidos de la invención, que incluye secuencias de codificación capaces de dirigir la disociación post translacional de dicho precursor de poliproteínas. La disociación post translacional del precursor de poliproteínas produce los polipéptidos de la invención. La disociación post translacional de la molécula precursora que comprende los polipéptidos de la invención puede ocurrir in vivo {es decir, dentro de la célula huésped por sistemas/mecanismos de células recombinantes o nativos, por ej. separación de furina en un sitio apropiado) o puede ocurrir in vitro (por ej. incubación de dicha cadena de polipéptido en una composición que comprende proteasas o peptidasas de actividad conocida y/o en una composición que comprende condiciones o reactivos conocido por impulsar la acción proteolítica deseada). La purificación y modificación de proteínas recombinantes es muy conocida en la materia de manera tal que el diseño del precursor de poliproteínas podrían incluir una cantidad de realizaciones ampliamente apreciadas por un trabajador capacitado. Cualquier proteasa o peptidasa conocida en la materia puede usarse para la modificación descrita de la molécula precursora, por ej., trombina (que reconoce la secuencia de aminoácidos LVPR GS (SEC ID NRO.: 89)), o factor Xa (que reconoce la secuencia de aminoácidos I(E/D)GRA (SEC ID NRO.: 90) (Nagai et al. (1985) "Ox gen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli, " Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255, y revisado en Jenny et al. (2003) "A Critical Review Of Methods For Cleavage Of Fusión Proteins With Thrombin And Factor Xa, " Protein Expr. Purif. 31 :1-11, cada una de las cuales se incorpora a modo de referencia en este documento en su totalidad)), enteroquinasa (que reconoce la secuencia de aminoácidos DDDDKA (SEC ID NRO.: 91) (Collins-Racie et al. (1995) "Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusión Partner DsbA, " Biotechnology 13:982-987 incorporada en este documento en su totalidad a modo de referencia)), furina (que reconoce la secuencia de aminoácidos RXXRA, con una preferencia por RX(K/R)RA (SEC ID NRO.: 92 y SEC ID NRO.: 93, respectivamente) (un adicional de R en la posición P6 potencia la separación)), y AcTEV (que reconoce la secuencia de aminoácidos ENLYFQ G (SEC ID NRO.: 94) (Parks et al. (1994) "Reléase OfProteins And Peptides From Fusión Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase, " Anal. Biochem. 216:413-417 incorporada en este documento en su totalidad a modo de referencia)) y la Proteasa del Virus de la Enfermedad de Pies y Boca C3. Véase por ejemplo, sección 6,4, supra.
Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento post-translacional y modificación de las proteínas y productos génicos. Las líneas celulares apropiadas o sistemas huésped pueden elegirse para correcta modificación y procesamiento de la proteína extraña expresada. Hasta este punto, pueden usarse las células huésped eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado de transcripción primaria, glicosilación, y fosforilación del producto génico. Dichas células huésped de mamífero incluyen aunque no se limitan a CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.
Para la producción de proteínas recombinantes de alto rendimiento, a largo plazo, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan en forma estable un anticuerpo de la invención pueden diseñarse. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células huésped pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ej., promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Luego de la introducción del ADN extranjero, las células diseñadas pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego es cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células se integren en forma estable al plásmido en sus cromosomas y crecen para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en las líneas celulares. Este método puede usarse en forma ventajosa para diseñar las líneas celulares que expresan los anticuerpos de la invención. Dichas líneas celulares diseñadas pueden ser particularmente útiles en la selección y evaluación de compuestos que interactúan directa o indirectamente con las moléculas de la invención.
Una cantidad de sistemas de selección puede usarse, que incluyen aunque sin limitarse a la quinasa de timidina del virus de herpes simple (Wigler et al. (1977) "Transfer Of P rified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells, " Cell 11 : 223-232), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska et al. (1992) "Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation of Mammalian Cells: First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Terapia génica, " Bioessays 14: 495-500), y genes adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al. (1980) "Isolating Transforming DNA: Cloning The Hámster aprt Gene, " Cell 22: 817-823) pueden emplearse en células tk-, hgprt- o aprt- cells. Además, la resistencia antimetabolito puede usarse como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al. (1980) "Transformation of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) "Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resístame By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reducíase, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan et al. (1981) "Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Tolstoshev (1993) "Terapia génica, Concepts, Current Triáis And Future Directions, " Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Terapia génica, " Science 260:926-932; y Morgan et al. (1993) "Human Terapia génica, " Ann. Rev. Biochem. 62:191-217) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al. (1984) "Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromicina B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells, " Gene 30:147-156). Los métodos comúnmente conocidos en la materia de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en Chapters 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), 1 94, Current Protocols in Human Genetics. John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al. (1981) "A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukariotic Cells, " J. Mol. Biol. 150: 1-14.
Los niveles de expresión de una molécula de la invención pueden aumentarse por amplificación del vector (para obtener una revisión, véase Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning. Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987). Cuando un marcador en el sistema de vectores que expresa un anticuerpo es susceptible de amplificarse, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará la cantidad de copias del gen marcador. Dado que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos de un polipéptido de la molécula de diacuerpo, la producción del polipéptido también aumentará (Crouse et al. (1983) "Expresión y Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reducíase Minigenes, " Mol. Cell. Biol. 3:257-266).
La célula huésped puede co-transfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector codifica el primer polipéptido de la molécula de diacuerpo y el segundo vector codifica el segundo polipéptido de la molécula de diacuerpo. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de ambos polipéptidos. En forma alternativa, un vector simple puede usarse que codifique ambos polipéptidos. Las secuencias de codificación los polipéptidos de las moléculas de la invención pueden comprender cDNA o ADN genómico.
Una vez que una molécula de la invención {es decir, diacuerpos) se ha expresado en forma recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la materia para purificación de polipéptidos, poliproteínas o diacuerpos (por ej., análogos a los esquemas de purificación del anticuerpo basados en la selectividad con el antígeno) por ejemplo, por cromatografía (por ej., intercambio de iones, afinidad, en particular por afinidad por el antígeno específico (en forma opcional después de la selección de la Proteína A donde la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fe (o porción de los anteriores)), y cromatografía en columna por tamaño), centrifugado, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de polipéptidos, poliproteínas o diacuerpos. 5.5 MÉTODOS TERAPÉUTICOS Y PROFILÁCTICOS Las moléculas de la invención son particularmente útiles para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, trastorno o infección donde una función de la célula efectora (por ej., ADCC) mediada por FcyR se desea (por ej., cáncer, enfermedad infecciosa). Como se discutió con anterioridad, los diacuerpos de la invención pueden exhibir funcionalidad similar al anticuerpo al generar función efectora aunque la molécula de diacuerpo no comprende un dominio Fe. Al comprender por lo menos un dominio de unión al epítope que reconoce en forma inmunoespecífica un FcyR, la molécula de diacuerpo puede exibir unión a FcyR y actividad análoga a interacciones Fc-FcyR. Por ejemplo, las moléculas de la invención pueden unirse a un antígeno de la superficie de la célula y un FcyR (por ej., FcyRIIIA) en una célula efectora inmune (por ej., célula NK), estimular una función efectora (por ej., ADCC, CDC, fagocitosis, opsonización, etc.) contra dicha célula.
En otras realizaciones, la molécula de diacuerpo de la invención comprende un dominio Fe (o porción de los anteriores). En dichas realizaciones, el dominio Fe puede comprender en forma adicional por lo menos una modificación de aminoácido con relación a un dominio Fe de tipo salvaje (o porción de los anteriores) y/o puede comprender dominios de uno o más isotipos IgG (por ej., IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4). Las moléculas de la invención que comprenden dominios variantes Fe pueden exhibir fenotipos conferidos o alterados con relación una moléculas que comprenden el dominio Fe tipo salvaje tales como una actividad alterada o conferida de la función efectora (por ej., según se evalúa en un ensayo dependiente de NK o dependiente de macrófago). In said realizaciones, las moléculas de la invención con actividad conferida o alterada de la función efectora son útiles para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, trastorno o infección donde an enhanced efficacy of la actividad de la función efectora se desea. En ciertas realizaciones, las moléculas de diacuerpo de la invención que comprende un dominio Fe (o porción de los anteriores) median la cascada que depende de los complementos. Los dominios variantes Fe identificados como aquellos que alteran la función efectora se divulgan en la Solicitud Internacional WO04/063351, Publicaciones de Solicitud de Patente de los EE UU 2005/0037000 y 2005/0064514, Solicitudes Provisionales de los EE UU 60/626,510, presentada el 10 de noviembre de 2004, 60/636,663, presentada el 1 de diciembre de 2004, y 60/781,564, presentada el 10 de marzo de 2006, y Solicitudes de Patentes de EE UU 11/271,140, presentada el 10 de noviembre de 2005, y 11/305,787, presentada el 15 de diciembre de 2005, solicitudes concurrentes de los Inventores, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.
La invención abarca métodos y composiciones para el tratamiento, prevención o manejo de un cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más moléculas que comprenden uno o más sitios que se unen al epítope, y en forma opcional, un dominio Fe (o porción de los anteriores) diseñados de acuerdo con la invención, cuya molécula se une en forma adicional a un antígeno del cáncer. Las moléculas de la invención son particularmente útiles para la prevención, inhibición, reducción del crecimiento o regresión de tumores primarios, metástasis de células cancerosas, y enfermedades infecciosas. Aunque sin intención de ligarse a un mecanismo de acción particular, las moléculas de la invención median la función efectora lo que produce depuración del tumor, reducción del tumor o una combinación de los anteriores. En realizaciones alternativas, los diacuerpos de la invención median la actividad terapéutica por entrecruzamiento de antígenos de la superficie celular y/o receptores y apoptosis mejorada o negativa señalización regulatoria del crecimiento.
Aunque sin intención de ligarse a un mecanismo de acción particular, las moléculas de diacuerpo de la invención exhiben potenciada eficacia terapéutica con relación a anticuerpos terapéuticos conocidos en la materia, en parte, debido a la capacidad del diacuerpo de unirse inmunológicamente en forma específica a una célula blanco que expresa un antígeno particular (por ej., FcyR) en niveles reducidos, por ejemplo, en virtud de la habilidad del diacuerpo de permanecer sobre la célula de destino más tiempo debido a una mejorada avidez de la interacción diacuerpo-epítope.
Los diacuerpos de la invención con afinidad potenciada y la avidez por los antígenos (por ej., FcyRs) son particularmente útiles para el tratamiento, prevención o manejo de un cáncer, u otra enfermedad o trastorno, en un sujeto, en donde los FcyRs se expresan en bajos niveles en las poblaciones de células de destino. Como se usa en este documento, la expresión de FcyR en las células se define en términos de la densidad de dichas moléculas por célula según se mide con el uso de métodos comunes conocidos por aquellas personas expertas en la materia. Las moléculas de la invención que comprenden múltiples sitios que se unen al epítope y, en forma opcional, y FcyR (o porción de los anteriores) con preferencia también tienen una avidez conferida o potenciada y afinidad y/o función efectora en las células que expresan un antígeno de destino, por ej., un antígeno del cáncer, a una densidad de 30.000 hasta 20.000 moléculas/célula, a una densidad de 20.000 hasta 10.000 moléculas/célula, a una densidad de 10.000 moléculas/célula o menos, a una densidad de 5000 moléculas/célula o menos, o a una densidad de 1000 moléculas /cell o menos. Las moléculas de la invención tienen utilidad particular en el tratamiento, prevención o manejo de una enfermedad o un trastorno, tales como cáncer, en una sub-población, en donde el antígeno de destino se expresa en bajos niveles en la población de células de destino.
Las moléculas de la invención también pueden utilizarse en forma ventajosa en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos en la materia para el tratamiento o la prevención de enfermedades, tales como cáncer, enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios, y enfermedades infecciosas. En una realización específica, las moléculas de la invención may be used en combinación con monoclonal o anticuerpos quiméricos, linfoquinas, o factores del crecimiento hematopoyético (tales como, por ej., IL-2, IL-3 y IL-7), los cuales, por ejemplo, sirven para aumentar la cantidad o la actividad de células efectoras que interactúan con las moléculas y, aumentan la respuesta inmunológica. Las moléculas de la invención también pueden utilizarse en forma ventajosa en combinación con uno o más fármacos usados para tratar una enfermedad, trastorno o infección tales como, por ejemplo agentes contra el cáncer, agentes antiinflamatorios o agentes antivirales, por ej., como se detalla en la Sección 5,7. 5.5.1 CÁNCERES La invención abarca métodos y composiciones para el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más moléculas que comprenden múltiples dominios que se unen al epítope. En algunas realizaciones, la invención abarca métodos y composiciones para el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto con polimorfismos de FcyR tales como aquellos homócigos para los alelos FyRIIIA-158V o Fc7RIIIA-158F. En algunas realizaciones, la invención abarca diseñar por lo menos un dominio de unión al epítope de la molécula de diacuerpo para unirse inmunológicamente en forma específica a FcyRIIIA (158F). En otras realizaciones, la invención abarca diseñar por lo menos un dominio de unión al epítope de la molécula de diacuerpo para unirse inmunológicamente en forma específica a FcyRIIIA (158V).
La eficacia de la terapia estándar con anticuerpo monoclonal depende del polimorfismo FcyR del sujeto (Cartron et al. (2002) "Therapeutic Activit Of Humanized Monoclonal Antibody anti-CD20 And Polimorphism In IgG Fe Receptor FcRIIÍa Gene, " Blood 99: 754-758; Weng et al. (2003) "Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polimorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma, " J Clin Oncol. 21(21):3940-3947, ambas de las cuales se incorporan en este documento a modo de referencia en sus totalidades). Estos receptores se expresan sobre la superficie de la célula generadora de respuestas y mediante ADCC. Los alelos de alta afinidad, de los receptores de activación de baja afinidad, mejoran la capacidad de las células generadoras de respuesta de mediar ADCC. En contraste con basarse en interacciones Fc-FcyR para efectuar función efectora, los métodos de la invención abarcan diseñar moléculas para reconocer en forma inmunoespecífica los receptores de activación de baja afinidad, permitiendo que las moléculas estén diseñadas para un polimorfismo específico. En forma alternativa o en forma adicional, la molécula de la invención puede diseñarse para comprender un dominio Fe variante que exhibe potenciada afinidad por Fc R (con relación a un dominio tipo salvaje) sobre células efectoras. Las moléculas diseñadas de la invención proveen mejores reactivos de inmunoterapia para los pacientes sin importar su polimorfismo de FcyR.
Las moléculas de diacuerpo diseñadas de acuerdo con la invención se analizan por ADCC con el uso de cualquiera de una línea de células cultivadas o células PMBC derivadas del paciente para determinar la capacidad de las mutaciones de Fe para potenciar ADCC. El ADCC estándar se realiza con el uso de métodos divulgados en este documento. Los linfocitos se cosechan de sangre periférica con el uso de un gradiente de Ficoll-Paque (Pharmacia). Las células de destino, es decir, líneas celulares o células derivadas de pacientes, se cargan con Europio (PerkinElmer) y se incuban con efectores durante 4 hrs a 37°C. El Europio liberado se detecta con el uso de un lector de placa fluorescente (Wallac). Los datos de ADCC resultantes indican la eficacia de las moléculas de la invención para detectar la citotoxicidad mediada por células NK y establecer qué moléculas pueden evaluarse con ambas muestras de pacientes y monocitos elutriados. Las moléculas de diacuerpo que muestran el mayor potencial de generar la actividad de ADCC luego se evalúan en un ensayo ADCC con el uso de PBMCs de pacientes. Las PBMC de donantes sanos se usan como células efectoras.
De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona métodos para prevenir o tratar el cáncer caracterizados por un antígeno del cáncer al diseñar la molécula de diacuerpo para reconocer en forma inmunoespecífica dicho antígeno del cáncer de manera tal que la molécula de diacuerpo sea en sí misma citotóxica (por ej., por medio del entrecruzamiento de receptores de superficie que conduce a aumento de la apoptosis o desregulación de señales proliferativas) y/o comprende un dominio Fe, de acuerdo con la invención, y/o media una o más funciones efectoras (por ej., ADCC, fagocitosis). Los diacuerpos que se han diseñado de acuerdo con la invención son útiles para la prevención o tratamiento del cáncer, dado que tienen una actividad citotóxica (por ej., mayor matanza de células tumorales y/o mayor actividad, por ejemplo, actividad de de ADCC o CDC).
Los cánceres asociados con un antígeno del cáncer pueden tratarse o prevenirse por administración de un diacuerpo que se une un antígeno del cáncer y es citotóxico, y/o se ha diseñado de acuerdo con los métodos de la invención para exhibir función efectora. Por ejemplo, aunque no a modo de limitación, los cánceres asociados con los siguientes antígenos del cáncer pueden tratarse o prevenirse por los métodos y composiciones de la invención: Antígeno del carcinoma pan KS 1/4 (Pérez et al. (1989) "Isolation And Caracterization of A Cdna Encoding The Ksl/4 Epithelial Carcinoma Marker, " J. Immunol. 142:3662-3667; Móller et al. (1991) "Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarían Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes, " Cáncer Immunol. Immunother. 33(4):210-216), antígeno de carcinoma de ovario (CA125) (Yu et al (1991) " Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants, " Cáncer Res. 51(2):468-475), fosfato de ácido prostático (Tailor et al. (1990) "Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone, " Nucí. Acids Res. 18(16):4928), antígeno específico de la próstata (Henttu et al. (1989) "cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes, " Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen, " Cáncer Res. 53:227-230), antigen p97 asociado con melanoma (Estin et al. (1989) "Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levéis Of Human Melanoma-Associated Antigen p97, " J. Nati. Cáncer Instit. 81(6):445-454), antígeno gp75 de melanoma (Vijayasardahl et al. (1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product, " J. Exp. Med. 171 (4): 1375- 1380), antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) (Natali et al. (1987) "Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140,240 y Its Possible Prognostic Significance, " Cáncer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) "Active Specific Immunotherapy En pacientes Con Melanoma. A Clinical Triol With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies, " J. Clin. Invest. 86:2136-2144)), antígeno específico de la membrana prostática, antígeno carbinoembriónico (CEA) (Foon et al. (1995) "Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine, " J. Clin. Invest. 96(l):334-42), antígeno de mucina epitelial polimórfico, antígeno de glóbulo de grasa de leche humana, Antígenos asociados con el tumor colo-rectal tales como: CEA, TAG-72 (Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms, " Cáncer Res. 52:3402-3408), COI 7-1 A (Ragnhammar et al. (1993) "Effect OfMonoclonal Antibody 17-1 A And GM-CSF En pacientes With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced, " Int. J. Cáncer 53:751-758); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) "Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, and Pancreatic Carcinoma, " J. Clin. Immunol. 2:135-140), CTA-1 y LEA, antígeno del linfoma de Burkitt 38.13, CD19 (Ghetie et al (1994) "Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest, " Blood 83:1329-1336), antígeno de linfoma B humano CD20 (Reff et al. (1994) "Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20, " Blood 83:435-445), CD33 (Sgouros et al. (1993) "Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody MI 95 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia, " J. Nucí. Med. 34:422-430), antígenos específicos de melanoma tales como gangliosida GD2 (Saleh et al. (1993) "Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen, " J.Immunol., 151, 3390-3398), gangliosida GD3 (Shitara et al. (1993) "A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities, " Cáncer Immunol. Immunother. 36:373-380), gangliosida GM2 (Livingston et al. (1994) "Improved Survival In Stage III Melanoma Patients Con GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination Con GM2 Ganglioside, " J. Clin. Oncol. 12:1036-1044), gangliosida GM3 (Hoon et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers, " Cáncer Res. 53:5244-5250), tipo de transplante específico del tumor de antígeno de superficie celular (TSTA) tales como antígenos de tumores inducidos por virus que incluyen virus de tumor de ADN de antígeno T y antígenos de envoltura de virus de ARN del tumor, fetoproteína alfa de antígeno oncofetal tales como CEA de colon, antígeno oncofetal de tumor de vesícula (Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas, " Cáncer. Res. 45:2210-2188), antígeno de diferenciación tales como antígeno de carcinoma de pulmón humano L6, L20 (Hellstrom et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, " Cáncer Res. 46:3917-3923), antígenos de fíbrosarcoma, antígeno de células T de leucemia humana Gp37 (Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) "Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Caracterización de A Monoclonal Idiotype Cascade (Abl, Ab2, y Ab3), " J. Immunol. 141 :1398-1403), neoglicoproteína, esfingolípidos, antígeno del cáncer de mama tales como EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), antígeno HER2 (pl85HER2), mucina epitelial polimórfica (PEM) (Hilkens et al. (1992) "Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property, " Trends in Biochem. Sci. 17:359-363), antígeno APO-1 de linfocitos humano maligno (Trauth et al. (1989) "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis, " Science 245:301-304), antígeno de diferenciación (Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteínas And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens, " Nature 314:53-57) tales como antígeno I encontrado en eritrocitos de feto y endoderma primario, I(Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos, MI 8 y M39 encontrado en epitelio de mama, SSEA-1 encontrado en células mieloides, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, y Dt56-22 encontrado en cáncer colorrectal, TRA-1-85 (grupo sanguíneo H), C14 encontrado en adenocarcinoma de colon, F3 encontrado en adenocarcinoma de pulmón, AH6 encontrado en cáncer gástrico, Y hapten, Ley encontrado en células de carcinoma embrionario, TL5 (grupo sanguíneo A), EGF receptor encontrado en células A431, serue Et (grupo sanguíneo B) encontrado en cáncer de páncreas, FC10,2 encontrado en células de carcinoma de embrión, gastric adenocarcinoma, CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado en adenocarcinoma, NS-10 encontrado en adenocarcinomas, CO-43 (grupo sanguíneo Leb), G49, receptor EGF, (grupo sanguíneo ALeb/Ley) encontrado en adenocarcinoma de colon, 19,9 encontrado en cáncer de colon, mucinas de cáncer gástrico, T5A7 encontrado en células mieloides, R24 encontrado en melanoma, 4,2, GD3, Dl,l, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, Ml :22:25:8 encontrado en células de carcinoma de embrión y SSEA-3, SSEA-4 encontrado en embriones de etapa de célula 4-8. En otra realización, el antígeno es un péptido derivado del receptor de células T de un linfoma de células T cutáneas (Véase Edelson (1998) "Cutaneous T Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy, " Cáncer J Sci Am. 4:62-71).
Los Cánceres y trastornos relacionados que pueden tratarse o prevenirse por los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen, aunque no se limitan a, los siguientes: Leucemias que incluyen, aunque sin limitarse a, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemias mielocíticas agudas tales como leucemias mieloblásticas, promielocíticas, mielomonocíticas, monocíticas, eritroleucemia y síndrome mielodisplásico, leucemias crónicas tales como aunque sin limitarse a, leucemia mielocítica crónica (granulocítica), leucemia linfocítica crónica, leucemia de células capilares; policitemia vera; linfomas tales como aunque sin limitarse a enfermedad de Hodgkin, enfermedad no de Hodgkin; mielomas múltiples tales como aunque sin limitarse a mieloma múltiple latente, mieloma no secretorio, mieloma osteoartrítico, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma solitario y plasmacitoma extramedular; macroglobulinemia de Waldenstróm; gamopatía monoclonal de importancia indeterminada; gamopatía monoclonal benigna; enfermedad de cadena pesada; sarcomas de tejido conectivo y óseo tales como aunque sin limitarse a sarcoma de huesos, osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, tumor de células gigantes malignas, fibrosarcoma de hueso, cordoma, sarcoma periosteal, sarcomas de tejidos blandos, angiosarcoma (hemangiosarcoma), fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, neurilemoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial; tumores de cerebro que incluyen aunque sin limitarse a, glioma, astrocitoma, glioma de encéfalo, ependimoma, oligodendroglioma, tumor no glial, neurinoma acústico, craniofaringioma, meduloblastoma, meningioma, pineocitoma, pineoblastoma, linfoma cerebral primario; cáncer de mama que incluye, aunque sin limitarse a, adenocarcinoma, carcinoma lobular (células pequeñas), carcinoma intraductal, cáncer de mama medular, cáncer de mama mucinoso, cáncer de mama tubular, cáncer de mama papilar, enfermedad de Paget enfermedad, y cáncer de mama inflamatorio; cáncer adrenal, que incluyen aunque sin limitarse a, carcinoma de feocromocitoma y adrenocortical; cáncer de tiroides tales como aunque sin limitarse a cáncer de tiroides papilar o folicular, cáncer medular de tiroides y cáncer anaplástico de tiroides; cáncer pancreático, que incluyen aunque sin limitarse a, insulinoma, gastrinoma, glucagonoma, vipoma, tumor secretor de somatostatina, y tumor de células carcinoides o islote; cánceres pituitarios que incluyen aunque sin limitarse a, enfermedad de Cushing, tumor secretor de prolactina, acromegalia, y diabetes insipidus; cánceres de ojos que incluyen aunque sin limitarse a, melanoma ocular tales como melanoma de iris, melanoma coroidal, y melanoma del cuerpo ciliar, y retinoblastoma; cánceres vaginales, que incluyen aunque sin limitarse a, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, y melanoma; cáncer vulvar, que incluyen aunque sin limitarse a, carcinoma de células escamosas, melanoma, adenocarcinoma, carcinoma de células básales, sarcoma, y enfermedad de Paget; cánceres cervicales que incluyen aunque sin limitarse a, carcinoma de células escamosas, y adenocarcinoma; cánceres de útero que incluyen aunque sin limitarse a, carcinoma de endometrio y sarcoma de útero; cánceres de ovario que incluyen aunque sin limitarse a, carcinoma epitelial de ovario, tumor de borderline, tumor de células germinales, y tumor estromal; cánceres de esófago que incluyen aunque sin limitarse a, cáncer escamoso, adenocarcinoma, carcinoma cíctio adenoide, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoescamoso, sarcoma, melanoma, plasmacitoma, carcinoma verrucoso, y carcinoma de célula cebada (célula pequeña); cánceres de estómago que incluyen aunque sin limitarse a, adenocarcinoma, fiingico (polipoide), ulcerante, de contagio superficial, de contagio difuso, linfoma maligno, liposarcoma, fibrosarcoma, y carcinosarcoma; cánceres de colon; cánceres rectales; cánceres de hígado que incluyen aunque sin limitarse a carcinoma hepatocelular y hepatoblastoma, cánceres de vesícula biliar que incluyen aunque sin limitarse a, adenocarcinoma; colangiocarcinomas que incluyen aunque sin limitarse a, papilares, nodulares y difusos; cánceres de pulmón que incluyen aunque sin limitarse a, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermoide), adenocarcinoma, carcinoma de células grandes, y cáncer de pulmón de células pequeñas; cánceres de testículos que incluyen aunque sin limitarse a, tumor germinal, seminoma, anaplásico, clásico (típico), espermatocítico, no seminoma, carcinoma embrional, carcinoma teratoma, coriocarcinoma (tumor de saco gestacional), cánceres de próstata que incluyen aunque sin limitarse a, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, y rabdomiosarcoma; cánceres penales; cánceres orales que incluyen aunque sin limitarse a, carcinoma de células escamosas; cánceres básales; cánceres de la glándula salival que incluyen aunque sin limitarse a, adenocarcinoma, carcinoma mucoepidermoide, y carcinoma adenoidquístico; cánceres de faringe que incluyen aunque sin limitarse a, cáncer de células escamosas, y verrucosas; cánceres cutáneos que incluyen aunque sin limitarse a, carcinoma de células básales, carcinoma de células escamosas y melanoma, melanoma de contagio superficial, melanoma nodular, melanoma maligno de lentigo, melanoma lentiginoso acral; cánceres de riñon que incluyen aunque sin limitarse a, cánceres de células renales, adenocarcinoma, hipernefroma, fibrosarcoma, cáncer de células transicionales (pelvis renal y/o uretra); rumor de Wilms; cánceres de vesícula que incluyen aunque sin limitarse a, carinoma de células transicionales, cáncer de células escamosas, adenocarcinoma, carcinosarcoma. Además, los cánceres incluyen mixosarcoma, sarcoma osteogénico, endoteliosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, mesotelioma, sinovioma, hemangioblastoma, carcinoma epitelial, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas cebáceas, carcinoma papilar adenocarcinomas papilares (para obtener una revisión de dichos trastornos, véase Fishman et al. (1985) Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia; y Murphy et al. (1997) Informed Decisions: The Complete Book of Cáncer Diagnosis, Treatmen and Recoverv, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).
De acuerdo con lo anterior, los métodos y composiciones de la invención también son útiles en el tratamiento o prevención de una variedad de cánceres u otras enfermedades proliferativas anormales, que incluyen (aunque sin limitarse a) los siguientes: carcinoma, que incluyen el de la vesícula, mama, colon, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, próstata, cuello de útero, tiroides y piel; que incluyen carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, que incluyen leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, que incluyen leucemias mielagenosas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, que incluyen melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwannomas; tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosafcoma, rabdomiosarcoma, y osteosarcoma; y other tumores, que incluyen melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma. Se contempla además que los cánceres causados por aberraciones en la apoptosis también se tratarían por los métodos y composiciones de la invención. Dichos cánceres pueden incluir aunque no se limitan a linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53, tumores de la mama, próstata y ovario que dependen de las hormonas, y lesiones precancerosas tales como poliposis adenomatosa familiar, y síndromes mielodisplásicos. En realizaciones específicas, los cambios de la enfermedad o disproliferativos (tales como metaplasias y displasias), o trastornos hiperproliferativos, se tratan o se previenen por los métodos y composiciones de la invención en el ovario, vesícula, mama, colon, pulmón, piel, páncreas, o útero. En otras realizaciones específicas, el sarcoma, melanoma, o la leucemia se trata o se previene por los métodos y composiciones de la invención.
En una realización específica, una molécula de la invención (por ej., un diacuerpo que comprende múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, y dominio Fe (o porción de los anteriores)) inhibe o reduce el crecimiento de células cancerosas en por lo menos 99%, por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 60%, por lo menos 50%, por lo menos 45%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 35%, por lo menos 30%, por lo menos 25%, por lo menos 20%, o por lo menos 10% con relación al crecimiento de células cancerosas en ausencia de dicha molécula de la invención.
En una realización específica, una molécula de la invención {por ej., un diacuerpo que comprende múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, y dominio Fe (o porción de los anteriores)) mata células o inhibe o reduce el crecimiento de células cancerosas por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 100% mejor que la molécula de origen. 5.5.2 ENFERMEDAD AUTOINMUNE Y ENFERMEDAD INFLAMATORIAS En algunas realizaciones, las moléculas de la invención comprenden un dominio de unión al epítope específica para FcyRIIB y/o un dominio Fe variante (o porción de los anteriores), diseñados de acuerdo con métodos de la invención, cuyo dominio Fe exhibe mayor afinidad por FcyRIIB y reducida afinidad por FcyRIIIA y/o FcyRIIA con relación a un dominio Fe tipo salvaje. Las moléculas de la invención con dichas características de unión son útiles en la regulación de la respuesta inmune, por ej., en la inhibición de la respuesta inmunológica en conexión con enfermedades autoinmunes o enfermedades inflamatorias. Aunque no se pretende obligarse a ningún mecanismo de acción, las moléculas de la invención con una afinidad por FcyRIIB y/o que comprende un dominio Fe con una mayor capacidad por FcyRIIB y una afinidad reducida por FcyRIIIA y/o FcyRIIA puede conducir a permeabilización de la respuesta de activación a FcyR e inhibición de la capaciad de respuesta celular, y de ete modo tienen eficacia terapéutica para el tratamiento de y/o prevención de un trastorno autoinmune.
La invención también proporciona métodos para prevenir, tratar o manejar uno o más síntomas asociados con un trastorno inflamatorio en un sujeto que comprende, además, administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva para terapia o profilaxis de uno o más agentes antiinflamatorios. La invención también proporciona métodos para prevenir, tratar o manejar uno o más síntomas asociados con an enfermedad autoinmune que comprende, además, administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva para terapia o profilaxis de uno o más agentes moduladores inmunológicos. La Sección 5.7 proporciona algunos ejemplos no limitativos de agentes antiinflamatorios and agente modulador inmunológicos.
Algunos ejemplos de trastornos autoinmunes que pueden tratarse administrando las moléculas de la presente invención incluyen, aunque no se limitan a, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad autoinmune de Addison, enfermedades autoinmunes de la glándula adrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis y orquitis autoinmune, trombocitopenia autoinmune, enfermedad de Behcet, penfigoide buloso, cardiomiopatía, dermatitis de enfermedad celíaca, síndrome de disfunción inmune de fatiga crónica (CFIDS), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, Síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad de aglutinina fría, enfermedad de Crohn, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura de trombocitopenia idiopática (ITP), neuropatía de IgA, artritis juvenil, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Méniére, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo 1 o mediada por el sistema inmunológico, miastenia grave, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliateritis nudosa, policrondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agamaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis soriática, fenómeno de Raynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjógren, síndrome de stiff-man, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso, takayasu arteritis, temporal arteristis/ giant cell arteritis, ulcerative colitis, uveitis, vasculitis tales como vasculitis con dermatitis herpetiformis, vitíligo, y granulomatosis de Wegener. Algunos ejemplos de trastornos inflamatorios incluyen, aunque no se limitan a, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad pulmonar obstuctiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, shock séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, arthritis, osteolisis inflamatoriae inflamación crónica que resulta de infecciones crónicas viales o bacterianas. Como se describe en este documento en la Sección 2.2.2, algunos trastornos autoinmunes están asociados con una afección inflamatoria. De este modo, hay una superposición entre lo que se considera un trastorno autoinmune y un trastorno inflamatorio. Por lo tanto, algunos trastornos autoinmunes pueden también caracterizarse como trastornos inflamatorios. Algunos ejemplos de trastornos inflamatorios que pueden prevenirse, tratarse o manejarse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, aunque no se limitan a, asma, encefalitis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad pulmonar obstuctiva crónica (EPOC), trastornos alérgicos, shock séptico, fibrosis pulmonar, espondiloartropatía no diferenciada, artropatía no diferenciada, arthritis, osteolisis inflamatoria, y inflamación crónica que resulta de infecciones crónicas viales o bacterianas.
Las moléculas de la invención que comprenden por lo menos un dominio de unión al epítope específica para FcyRIIB y/o un dominio Fe variante con una afinidad potenciada por FcyRIIB y una afinidad reducida por FcyRIIIA también pueden usarse para reducir la inflamación experimentada por animales, en particular mamíferos, con trastornos inflamatorios. En una realización específica, una molécula de la invención reduce la inflamación en un animal en por lo menos 99%, por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 60%, por lo menos 50%, por lo menos 45%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 35%, por lo menos 30%, por lo menos 25%, por lo menos 20%, o por lo menos 10% con relación a la inflamación en un animal, al que no se administra dicha molécula.
Las moléculas de la invención que comprenden por lo menos un dominio de unión al epítope específica para FcyRIIB y/o un dominio Fe variante con una afinidad potenciada por FcyRIIB y una afinidad reducida por FcyRJIIA también pueden usarse para prevenir el rechazo a los transplantes. 5.5.3 ENFERMEDAD INFECCIOSA La invención abarca, además, métodos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar una cantidad efectiva desde el punto de vista terapéutico o profiláctico de una o más moléculas de la invención que comprenden por lo menos un dominio de unión al epítope específico para un agente infeccioso asociado con dicha enfermedad infecciosa. En ciertas realizaciones, las moléculas de la invención son tóxicas para el agente infeccioso, potencian la respuesta inmunológica contra dicho agente o potencian la función efectora contra dicho agente, con relación a la respuesta inmunológica en ausencia de dicha molécula. Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse por las moléculas de la invención son causadas por agentes infecciosos que incluyen aunque sin limitarse a virus, bacterias, hongos, protozoarios y virus.
Las enfermedades virales que pueden tratarse o prevenirse con el uso de las moléculas de la invención en conjunción con los métodos de la presente invención incluyen, aunque no se limitan a, aquellas causadas por hepatitis tipo A, hepatitis tipo B, hepatitis tipo C, gripe, varicela, adenovirus, herpes simple tipo I (HSV-I), herpes simple tipo II (HSV-II), peste bovina, rinovirus, ecovirus, rotavirus, virus sincitial respiratorio, virus de papiloma, virus de papiloma, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, huntavirus, virus de coxsackie, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, virus de la polio, viruela, virus de Epstein Barr, virus de inmunodeficiencia humana tipo I (HIV-I), virus de inmunodeficiencia humana tipo II (HIV-II), y agentes de enfermedades virales tales como meningitis viral, encefalitis, dengue o viruela.
Las enfermedades bacterianas que pueden tratarse o prevenirse con el uso de las moléculas de la invención en conjunción con los métodos de la presente invención, que son causadas por bacterias incluyen, aunque no se limitan a, micobacteria rickettsia, micoplasma, neisseria, S. pneumonía, Borrelia burgdorferi (enfermedad de Lyme), Bacillus antracis (ántrax), tétano, estreptococo, estafilococo, micobacteria, tétano, pertusis, cólera, plaga, difteria, clamidia, S. aureus y Legionella.
Las enfermedades por protozoarios que pueden tratarse o prevenirse con el uso de las moléculas de la invención en conjunción con los métodos de la presente invención, que son causadas por protozoa incluyen, aunque no se limitan a, leishmania, kokzidioa, tripanosoma o malaria.
Las enfermedades parasíticas que pueden tratarse o prevenirse con el uso de las moléculas de la invención en conjunción con los métodos de la presente invención, que son causadas por parásitos incluyen, aunque no se limitan a, clamidia and rickettsia.
De acuerdo con un aspecto de la invención, las moléculas de la invención que comprenden por lo menos un dominio de unión al epítope específica para un agente infeccioso exhiben un anticuerpo función efectora hacia dicho agente, por ej., una proteína patogénica. Algunos ejemplos de infectious agents incluyen aunque no se limitan a bacterias (por ej., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphilococcus aureus, Enterococcus faecials, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphilococcus viridans, y Pseudomonas aeruginosa), un patógeno (por ej., papovavirus B-linfotrópico (LPV); Bordatella pertussis; virus de la Enfermedad de Borna (BDV); Coronavirus bovino; virus de Coriomeningitis; virus del Dengue; un virus, E. coli; Ebola; Eco virus 1; Ecovirus-11 (EV); Endotoxina (LPS); bacterias entéricas; virus Huérfano Entérico; Enterovirus; virus de leucemia de felinos; virus de la enfermedad de pie y boca; virus de leucemia de Gibbon ape (GALV); bacterias gram negativas; Heliobacter pylori; Virus de hepatitis B (HBV); Virus de herpes simple; HIV-1; Citomegalovirus humano; coronovirus humano; Gripe A, B & C ; Legionella; Leishmania mexicana; monocitogenes de Listeria; virus de paperas; Meningococo; Morbilivirus; virus de la hepatitis de ratón; Virus de leucemia de murino; herpes virus gamma murino; retrovirus murino; virus de la hepatitis de coronavirus murino de ratón; Micobacteria aviar-M; Neisseria gonorrhoeae; virus de enfermedad de Newcastle; Parvovirus B19; Plasmodium falciparum; Poxairus; Pseudomonas; Rotavirus; Samonella typhiurium; Shigella; Streptococci; virus linfocítico de células T 1 ; virus de vaccinia). 5.5.4 DESINTOXICACIÓN La invención abarca, además, métodos de desintoxicación en un sujeto expuesto a una toxina (por ej., una molécula tóxica del medicamento) que comprende administrar una cantidad efectiva desde el punto de vista terapéutico o profiláctico de una o más moléculas de la invención que comprenden por lo menos un dominio de unión al epítope específica para la molécula tóxica del medicamento. En ciertas realizaciones, la unión de una molécula de la invención a la toxina reduce o elimina el efecto fisiológico adverso de dicha toxina. Incluso, en otras realizaciones, la unión de un diacuerpo de la invención a la toxina aumenta o potencia la eliminación, degradación o neutralización de la toxina con relación a eliminación, degradación o neutralización en ausencia de dicho diacuerpo. La inmuno-toxicoterapia de acuerdo con los métodos de la invención pueden usarse para tratar sobresosis o exposición a fármacos que incluyen, aunque sin limitarse a, digixina, PCP, cocaína, colquicina, y antidepresivos tricíclicos.
TRATAMIENTO COMBINADO La invención abarca, además, administrar las moléculas de la invención en combinación con otros tratamientos conocidos por aquellos expertos en la materia para el tratamiento o prevención del cáncer, enfermedad autoinmune, enfermedad infecciosa o intoxicación, que incluyen aunque sin limitarse a, quimioterapias estándar y experimentales actuales, terapias hormonales, terapias biológicas, inmunoterapias, terapias con rayos, o cirugía. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención puede administrarse en combinación con una cantidad efectiva para terapia o profilaxis de una o más agents, anticuerpos terapéuticos o otros agentes conocidos por aquellos expertos en la materia para el tratamiento y/o prevención del cáncer, enfermedad autoinmune, enfermedad infecciosa o intoxicación.
En ciertas realizaciones, una o más moléculas de la invención se administra a un mamífero, con preferencia un humano, en forma concurrente con uno o más otros agentes terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer. El término "en forma concurrente" no se limita a la administración de agentes terapéuticos o profilácticos exactamente en el mismo momento, sino más bien se refiere a que una molécula de la invención y el otro agent se administran a un mamífero en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo de manera tal que la molécula de la invención puede actuar junto con el otro agente para proporcionar un mayor beneficio que si se administraran de otro modo. Por ejemplo, cada agente profiláctico o terapéutico (por ej., quimioterapia, terapia por rayos, terapia hormonal o terapia biológica) puede administrarse en el mismo momento o en forma consecutiva en cualquier orden en diferentes momentos; sin embargo, si no se administran en el mismo momento, deben administrarse lo suficientemente cerca en el tiempo con el fin de proveer el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada agente terapéutico puede administrarse por separado, en una forma apropiada y por cualquier vía apropiada. En varias realizaciones, los agentes terapéuticos o profilácticos se administran con menos de 1 hora de separación, a alrededor de 1 hora de separación, a alrededor de 1 hora hasta alrededor de 2 horas de separación, a alrededor de 2 horas hasta alrededor de 3 horas de separación, a alrededor de 3 horas hasta alrededor de 4 horas de separación, a alrededor de 4 horas hasta alrededor de 5 horas de separación, a alrededor de 5 horas hasta alrededor de 6 horas de separación, a alrededor de 6 horas hasta alrededor de 7 horas de separación, a alrededor de 7 horas hasta alrededor de 8 horas de separación, a alrededor de 8 horas hasta alrededor de 9 horas de separación, a alrededor de 9 horas hasta alrededor de 10 horas de separación, a alrededor de 10 horas hasta alrededor de 11 horas de separación, a alrededor de 11 horas hasta alrededor de 12 horas de separación, no más de 24 horas de separación o no más de 48 horas de separación. En realizaciones preferidas, dos o más components se administran dentro de la misma visita del paciente.
En otras realizaciones, los agentes terapéuticos o profilácticos se administran a alrededor de 2 a 4 días de separación, a alrededor de 4 a 6 días de separación, a alrededor de 1 semana de separación, a alrededor de 1 a 2 semanas de separación, o más de 2 semanas de separación. En realizaciones preferidas, los agentes terapéuticos o profilácticos se administran en un mismo marco donde ambos agentes aún están activos. Una persona con experiencia en la materia sería capaz de determinar dicho marco de tiempo por determinación de la vida media de los agentes administrados.
En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos o profilácticos de la invención se administran en forma cíclica a un sujeto. La terapia cíclica incluye la administración de un primer agente durante un período de tiempo, seguido de la administración de un segundo agente y/o tercer agente durante un período de tiempo y repetir esta administración secuencial. La terapia cíclica puede reducir el desarrollo de resistencia a una o más de las terapias, evitar o reducir los efectos colaterales de una o más terapias, y/o mejora la eficacia del tratamiento.
En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos o profilácticos se administran en un ciclo de menos de alrededor de 3 semanas, alrededor de una vez cada dos semanas, alrededor de una vez cada 10 días o alrededor de una vez cada semana. Un ciclo puede comprender la administración de un agente terapéutico o profiláctico por infusión durante alrededor de 90 minutos cada ciclo, alrededor de 1 hora cada ciclo, alrededor de 45 minutos cada ciclo. Cada ciclo puede comprender por lo menos 1 semana de descanso, por lo menos 2 semanas de descanso, por lo menos 3 semanas de descanso. La cantidad de ciclos administrados es desde alrededor de 1 hasta alrededor de 12 ciclos, más normalmente desde alrededor de 2 hasta alrededor de 10 ciclos, y más normalmente desde alrededor de 2 hasta alrededor de 8 ciclos.
Incluso, en otras realizaciones, los agentes terapéuticos y profilácticos de la invención se administran en regímenes de dosificación metronómicos, ya sea por infusión conitnua o administración frecuente sin períodos de descanso prolongados. Dicha administración metronómica puede incluir administración en intervalos constantes sin períodos de descanso. Normalmente los agentes terapéuticos, en particular agentes citotóxicos, se usan en dosis inferiores. Dichos regímenes de dosificación abarcan la administración diaria crónica de dosis relativamente bajas durante períodos prolongados de tiempo. En realizaciones preferidas, el uso de dosis más bajas puede minimizar los efectos colaterales tóxicos y eliminar períodos de descanso. En ciertas realizaciones, los agentes terapéuticos y profilácticos se administran por infusión continua o de baja dosis crónica que oscila desde alrededor de 24 horas hasta alrededor de 2 días, hasta alrededor de 1 semana, hasta alrededor de 2 semanas, hasta alrededor de 3 semanas hasta alrededor de 1 mes hasta alrededor de 2 meses, hasta alrededor de 3 meses, hasta alrededor de 4 meses, hasta alrededor de 5 meses, hasta alrededor de 6 meses. El cronograma de dichos regímenes de administración puede ser optimizado por el oncólogo experimentado.
En otras realizaciones, los cursos de tratamiento se administran en forma concurrente a un mamífero, es decir, dosis individuales de los agentes terapéuticos se administran por separado incluso dentro de un intervalo de tiempo de manera tal que moléculas de la invención puede funcionar junto con el otro agente o agentes. Por ejemplo, un componente puede administrarse una vez por semana en combinación con los otros componentes que pueden administrarse una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. En otras palabras, los regímenes de dosificación para los agentes terapéuticos se llevan a cabo en forma concurrente incluso si los agentes terapéuticos no se administran en forma simultánea o dentro de la misma visita del paciente.
Cuando se usan en combinación con otros agentes profilácticos y/o terapéuticos, las moléculas de la invención y el agente profiláctico y/o terapéutico puede actuar en forma agregada o, con mayor preferencia, sinérgica. En una realización, una molécula de la invención se administra en forma concurrente con uno o más agentes terapéuticos en la misma composición farmacéutica. En otra realización, una molécula de la invención se administra en forma concurrente con uno o más otros agentes terapéuticos en composiciones farmacéuticas separadas. Incluso en otra realización, una molécula de la invención se administra antes de o después de la administración de otro agente terapéutico o profiláctico. La invención contempla la administración de una molécula de la invención en combinación con otros agentes terapéuticos o profilácticos por la misma o diferentes vías de administración, por ej., oral y parenteral. En ciertas realizaciones, cuando una molécula de la invención se administra en forma concurrente con otro agente profiláctico o terapéutico que produce potencialmente efectos colaterales adversos que incluyen, aunque sin limitarse a, toxicidad, el agente terapéutico o profiláctico puede administrarse en forma ventajosa a una dosis que cae por debajo del umbral que se general el efecto colateral adverso.
Las cantidades de dosificación y frecuencias de administración provistas en este documento están abarcadas por los términos terapéuticamente efectiva y profilácticamente efectiva. La dosificación y frecuencia variarán además normalmente de acuerdo con factores específicos para cada paciente dependiente de los agentes profilácticos o terapéuticos específicos administrados, la severidad y el tipo de cáncer, la vía de administración, así como también edad, peso corporal, respuesta, y la historia clínica del paciente. Los regímenes apropiados pueden ser seleccionados por una persona con experiencia en la materia considerando tales factores y siguiendo, por ejemplo, las dosificaciones informadas en la literatura y recomendadas en el Physician's Desk Reference (56th ed., 2002). 5.5.5 AGENTES CONTRA EL CÁNCER En una realización específica, los métodos de la invención abarcan la administración de una o más moléculas de la invención con uno o más agentes terapéuticos usados para el tratamiento y/o prevención del cáncer. En una realización, los inhibidores de angiogénesis pueden administrarse en combinación con las moléculas de la invención. Los inhibidores de angiogénesis que pueden usarse en los métodos y composiciones de la invención incluyen aunque no se limitan a: Angiostatina (fragmento de plasminógeno); antitrombina antiangiogénica III; Angiozyme; ABT-627; Bay 12-9566; Benefin; Bevacizumab; BMS-275291 ; inhibidor derivado de cartílago (CDI); CAI; CD59 fragmento de complemento; CEP-7055; Col 3; Combretastatina A-4; Endostatina (fragmento de colágeno XVIII); Fragmento de Fibronectina; Gro-beta; Halofuginona; Heparinasas; fragmento de Heparina hexasacárido; HMV833; Gonadotropina coriónica humana (hCG); IM-862; Interferón alfa /beta/gamma; proteína inducible por interferón (IP-10); Interleucina-12; Kringle 5 (fragmento de plasminógeno); Marimastat; Inhibidores de Metaloproteinasa (TIMPs); 2-Metoxiestradiol; MMI 270 (CGS 27023A); MoAb IMC-1C11 ; Neovastat; NM-3; Panzem; PI-88; Inhibidor de la ribonucleasa placentaria; Inhibidor de activador de plasminógenos; factor-4 de plaquetas (PF4); Prinomastat; Fragmento de Prolactina de lókDa; Proteína relacionada con Proliferina (PRP); PT 787/ZK 222594; Retinoides; Solimastat; Squalamina; SS 3304; SU 5416; SU6668; SU11248; Tetrahidrocortisol-S; tetratiomolibdato; talidomida; Trombospondin-1 (TSP-1); TNP-470; Factor beta de crecimiento por transformación (TGF-b); Vasculostatina; Vasostatina (fragmento de calreticulina); ZD6126; ZD 6474; inhibidores de la farnesil transferasa (FTI); y bisfosfonatos.
Los agentes contra el cáncer que pueden usarse en combinación con las moléculas de la invención en las varias realizaciones de la invención, que incluyen composiciones farmacéuticas y formas de dosificación y kits de la invención, incluyen, aunque no se limitan a,: acivicina; aclarubicina; acodazol clorhidrato; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; ametantrona acetato; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlin; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; bisantreno clorhidrato; bisnafida dimesilato; bizelesina; bleomicina sulfato; brequinar de sodio; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; carubicin clorhidrato; carzelesin; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; crisnatol mesilato; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; daunorubicin clorhidrato; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; dezaguanina mesilato; diaziquona; docetaxel; doxorubicina; doxorubicina clorhidrato; droloxifeno; droloxifeno citrato; dromostanolona propionato; duazomicina; edatrexato; eflornitina clorhidrato; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; epirubicin clorhidrato; erbulozol; esorubicina clorhidrato; estramustina; estramustina fosfato de de sodio; etanidazol; etoposida; etoposide fosfato; etoprina; fadrozol clorhidrato; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fludarabina fosfato; fluorouracil; flurocitabina; fosquidona; fostriecin de sodio; gemcitabina; gemcitabina clorhidrato; hidroxiurea; idarubicina clorhidrato; ifosfamida; ilmofosina; interleucina II (que incluyen interleucina recombinante II, o rIL2), interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-nl ; interferón alfa-n3; interferón beta-I a; interferón gamma-I b; iproplatino; irinotecan clorhidrato; lanreotida acetato; letrozol; leuprolida acetato; liarozol clorhidrato; lometrexol de sodio; lomustina; losoxantrona clorhidrato; masoprocol; maytansina; mecloretamina clorhidrato; megestrol acetato; melengestrol acetato; melfalan; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato de sodio; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromin; mitogillin; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; mitoxantrona clorhidrato; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; omaplatino; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; peplomicina sulfato; perfosfamida; pipobroman; piposulfan; piroxantrona clorhidrato; plicamicina; plomestano; porfímero de sodio; porfiromicina; prednimustina; procarbazina clorhidrato; puromicina; puromicina clorhidrato; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; safingol clorhidrato; semustina; simtrazeno; esparfosato de sodio; sparsomicina; espirogermanio clorhidrato; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalan de sodio; tegafur; teloxantrona clorhidrato; temoporfin; teniposida; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurin; tirapazamina; toremifeno citrato; trestolona acetato; triciribina fosfato; trimetrexato; trimetrexato glucuronato; triptorelina; tubulozol clorhidrato; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfin; vinblastina sulfato; vincristina sulfato; vindesina; vindesina sulfato; vinepidina sulfato; vinglicinato sulfato; vinleurosina sulfato; vinorelbina tartrato; vinrosidina sulfato; vinzolidina sulfato; vorozol; zeniplatino; zinostatina; zorubicina clorhidrato. Otros fármacos contra el cáncer incluyen, aunque no se limitan a: 20-epi-l,25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesin; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; yrografolida; inhibidores de angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína -1 morfogenética anti dorsalizante; antiandrógeno, carcinoma de próstata; antiestrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladore de la apoptosis génica; reguladores de apoptosis; ácido apurínico; ara-CDP-DL-PTBA; desaminasa de arginina; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1 ; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxin; azatirosina; derivados de bacatin III; balanol; batimastat; antagonists de BCR/ABL; benzoclorinas; benzoilstaurosporina; derivados beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesin; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; canaripox IL-2; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de quinasa de caseína (ICOS); castanospermina; cecropin B; cetrorelix; clorlns; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados criptoficina A; curacin A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cypemicina; citarabina ocfosfato; cytolytic factor; cytostatin; dacliximab; decitabina; dehidrodidemnin B; deslorelina; dexamethasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diaziquona; didemnin B; didox; dietilnorspermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifiuridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornithina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógenos; antagonistas de estrógenos; etanidazol; etoposida fosfato; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; fínasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; fluorodaunorunicina clorhidrato; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; gadolinio texafirina; nitrato degallium; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; hexametilena bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunostimulante; inhibidor del receptor del factor- 1 de crecimiento símil insulina; agonistas de interferón; interferonas; interleucinas; iobenguano; iododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetron; jasplakinolida; kahalalida F; lamellarin-N triacetato; lanreotida; leinamicina; lenograstim; lentinan sulfato; leptolstatin; letrozol; factor de inhibidor de leucemia; interferón de leucocito alfa; leuprolida+estrógeno+progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido disacárido lipofílico; compuestos de platino lipofílicos; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecan; lutetium texafirina; lisofilina; péptidos Uticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspin; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelin; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; ARN de doble hebra sin equivalencias; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; saporina-factor de crecimiento de fibroblastos de mitotoxin; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotropina coriónica humana; sk de pared celular de miobacteria monofosforil lípida A+; mopidamol; inhibidor del gen de resistencia a múltiples fármacos; Terapia basada en el supresor -1 de tumor múltiple; agente anti cáncer de mostaza; micaperóxido B; extracto de la pared de células micobacterianas; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavin; nafterpin; nartograstim; nedaplatino; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; 06-bencilguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetron; ondansetron; oacina; inductor de citoquina oral; omaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactin; pazelliptina; pegaspargase; peldesina; pentosan polisulfato de sodio; pentostatin; pentrozol; perflubron; perfosfamida; perilil alcohol; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanil; pilocarpina clorhidrato; pirarubicina; piritrexim; placetin A; placetin B; inhibidor del activador de plasminógenos; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina; porfímero de sodio; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandin J2; inhibidores de proteasoma; modulador iranunológico basado en proteína A; inhibidor de la quinasa de proteína C; inhibidores de la quinasa de proteína, microalgal; inhibidores de fosfatasa de proteína tirosina; inhibidores de la fosforilasa de nucleósido de purina; purpurins; pirazoloacridina; conjugado piridoxilado de hemoglobina polioxietileno; antagonistas raf; raltitrexed; ramosetron; inhibidores de la ras farnesil proteína transferasa; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; retelliptina desmetilada; renio Re 186 etidronato; rizoxina; ribozimas; RII retinamida; rogletimida; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona Bl; ruboxilo; safingol; saintopin; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; Sdi 1 mimetics; semustina; inhibidor derivado de senescence 1; oligonucleótidos sentido; inhibidores de transducción de señal; moduladores de transducción de señal; proteína de unión al antígeno de cadena simple; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato de sodio; felacetato de sodio; solverol; proteína de unión a somatomedina; sonermin; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; esqualamina; inhibidor de mastocitos; inhibidores de la división de mastocitos; estipiamida; inhibidores estromelisina; sulfínosina; antagonista de péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustina; tamoxifeno metiodida; tauromustina; tazara teño; tecogalan de sodio; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfina; temozolomida; teniposida; tetraclorodecaoxida; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoietina; imigador de trombopoietina; timalfasin; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinan; hormona estimulante de tiroides; etiopurpurina de estaño etilo; tirapazamina; titanoceno biclorida; topsentin; toremifeno; factor de mastocitos totipotente; inhibidores de translación; tretinoin; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelin; tropisetron; turosterida; inhibidores de quinasa de la tirosina; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de uroquinasa; vapreotida; variolina B; sistema vector, terapia génica de eritrocitos; velaresol; veramina; verdins; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y zinostatina estimalámero. Los fármacos adicionales preferidos contra el cáncer 5-fluorouracilo y Leucovorina.
Algunos ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse en los métodos de la invención incluyen aunque no se limitan a ZENAPAX® (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suiza) que es un inmunosupresor, anticuerpo monoclonal anti-CD25 humanizado para la prevención del rechazo al aloinjerto renal agudo; PANOREX™ que es un anticuerpo IgG2a del antígeno de superficie celular de murino anti-17-?? (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 que es un anticuerpo anti-idiotipo murino (epítope GD3) de IgG (ImClone System); IMC-C225 que es un anticuerpo quimérico anti-EGFR de IgG (ImClone System); VITAXIN™ que es un anticuerpo humanizado de integrina anti-aV 3 (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); Smart MI 95 que es un anticuerpo humanizado anti-CD33 de IgG (Proteína Design Lab/Kanebo); LYMPHOCIDE™ que es un anticuerpo humanizado anti-CD22 de IgG (Immunomedics); ICM3 es un anticuerpo humanizado anti-ICAM3 (ICOS Pharm); IDEC-114 es un anticuerpo de rímate anti-CD80 (IDEC Pharm/Mitsubishi); IDEC-131 es un anticuerpo humanizdo anti-CD40L (IDEC/Eisai); IDEC-151 es un anticuerpo de primate anti-CD4 (IDEC); IDEC- 152 es un anticuerpo de primate anti-CD23 (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 es una IgG humanizada anti-CD3 (Proteína Design Lab); 5G1,1 es un anticuerpo humanizado del factor 5 anti complemento (C5) (Alexion Pharm); D2E7 es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a (CAT/BASF); CDP870 es un fragmento Fab humanizado anti-TNF-a (Celltech); IDEC-151 es un anticuerpo de primate anti-CD4 IgGl (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 es un anticuerpo humano anti-CD4 IgG (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 es un anticuerpo humanizado anti-TNF-a IgG4 (Celltech); LDP-02 es un anticuerpo humanizado anti-a4p7 (LeukoSite/Genentech); othoClone OKT4A es un anticuerpo humanizado anti-CD4 IgG (Ortho Biotech); ANTOVA™ es un anticuerpo humanizado anti-CD40L IgG (Biogen); ANTEGREN™ es un anticuerpo humanizado anti-VLA-4 IgG (Elan); y CAT-152 es un anticuerpo humano anti-TGF- 2 (Cambridge Ab Tech). Algunos otros ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse de acuerdo con la invención se presentan en la Tabla 8.
Tabla 8: Anticuerpos terapéuticos contra el cáncer Empresa Producto Enfermedad Blanco Abgenix ABX-EGF Cáncer Receptor de EGF AltaRex OvaRex cáncer de ovario antígeno tumoral CA125 BravaRex cánceres antígeno tumoral metastáticos MUC1 Antisoma Theragyn cáncer de ovario Antígeno PEM (pemtumomabytrrium-90) Therex cáncer de mama Antígeno PEM Boehringer Blvatuzumab cáncer de cabeza CD44 Ingelheim y cuello Centocor/J&J Panorex Cáncer coló rectal 17-1A ReoPro PTCA gp IlIb/IIIa ReoPro MI agudo gp nib/IIIa ReoPro ACV isquémico gp Hlb/HIa Corixa Bexocar NHL CD20 CRC Technology MAb, 105AD7 idiotípico vacuna para el gp72 cáncer coló rectal Crucell Anti-EpCAM cáncer Ep-CAM Cytoclonal MAb, cáncer de pulmón cáncer de pulmón NA de células no pequeñas Genentech Herceptin cáncer de mama HER-2 metastático Herceptin cáncer de mama HER-2 en etapa inicial Rituxan NHL folicular o CD20 de bajo grado con recaída/refractario Rituxan HNL intermedio y CD20 de alto grado MAb-VEGF NSCLC, VEGF metastático MAb-VEGF Cáncer coló VEGF rectal, metastático AMD Fab degeneración CD18 macular relacionada con la edad E-26 (2da gen. IgE) asma alérgica y IgE Empresa Producto Enfermedad Blanco rinitis IDEC Zevalin (Rituxan + NHL refractario a CD20 yttrium-90) RItuximab y NHL de células B, CD20 positivo, refractario o con recaída, de bajo grado folicular ImClone Cetuximab + innotecan carcinoma colo- Receptor de EGF rectal refractario Cetuximab + cisplatino & cáncer de cabeza Receptor de EGF radiación y cuellorecientemen te diagnosticado o recurrente Cetuximab + gemcitabina carcinoma de Receptor de EGF páncreas recientemente diagnosticado metastático Cetuximab + cisplatino + cáncer de cabeza Receptor de EGF 5FU o Taxol y cuello recurrente o metastático Cetuximab + carboplatin + carcinoma de Receptor de EGF paclitaxel pulmón de células no pequeñas recientemente diagnosticado Cetuximab + cisplatino cáncer de cabeza Receptor de EGF y cuello (enfermedad y metástasis distante regional-local incurable extensiva) Cetuximab + radiación carcinoma de Receptor de EGF cabeza y cuello avanzado en forma local BEC2 + Bacillus Calmette carcinoma de mimics Guerin pulmón de células ganglioside GD3 pequeñas BEC2 + Bacillus Calmette melanoma mimics Guerin ganglioside GD3 IMC-1C11 cáncer coló rectal VEGF-receptor con metástasis hepática ImmonoGen nuC242-DMl Colorectal, nuC242 gastric, y pancreatic cáncer ImmunoMedics LymphoCide Linfoma no de CD22 Empresa Producto Enfermedad Blanco Hodgkins LymphoCide Y-90 Linfoma no de CD22 Hodgkins CEA-Cide tumores CEA metastáticos sólidos CEA-Cide Y-90 tumores CEA metastáticos sólidos CEA-Scan (Arcitumomab cáncer coló rectal CEA rotulado Tc-99m) (radioimaging) CEA-Scan (Arcitumomab Cáncer de mama CEA rotulado Tc-99m) (radioimágen) CEA-Scan (Arcitumomab cáncer de pulmón CEA rotulado Tc-99m) (radioimágen) CEA-Scan (Arcitumomab tumores CEA rotulado Tc-99m) intraoperativos (radio imagen) LeukoScan (Tc-99m- soft tissue CEA labeled sulesomab) infection (radio imagen) LymphoScan (Tc-99m- linfomas (radio CD22 labeled) imagen) AFP-Scan (Tc-99m- cáncer de células AFP labeled) cebada 7 de hígado (radio imagen) Intracel HumaRAD-HN (+ cáncer de cabeza NA yttrium-90) y cuello HumaSPECT imagen coló rectal NA Medarex MDX-101 (CTLA-4) Próstata y otros CTLA-4 cánceres MDX-210 (sobre- Cáncer de próstata HER-2 expresión her-2) MDX-210/MAK Cáncer HER-2 edlmmune Vitaxin Cáncer a?ß3 Merck KGaA MAb 425 Varios cánceres Receptor de EGF IS-IL-2 Varios cánceres Ep-CAM Millenniura Campath (alemtuzumab) leucemia CD52 linfocítica crónica NeoRx CD20-streptavidin (+ Linfoma no de CD20 biotin-yttrium 90) Hodgkins Avidicin (albúmina + cáncer metastático NA N LU13) Peregrine Oncolym (+ yodo-131) Linfoma no de HLA-DR 10 beta Hodgkins Cotara (+ yodo-131) glioma maligno Proteínas no extirpable asociadas con ADN Pharmacia C215 (+ staphylococcal cáncer de NA Corporation enterotoxin) páncreas Empresa Producto Enfermedad Blanco MAb, cáncer de cáncer de pulmón NA pulmón/rión y riñon nacolomab tafenatox colon & cáncer de NA (C242 + enterotoxina de páncreas estafdococo) Proteína Design Nuvion Enfermedades de CD3 Labs células T SMART MI 95 AML CD33 SMART 1D10 NHL Antígeno HLA- DR Titán CEAVac cáncer coló rectal, CEA avanzado TriGem cáncer de pulmón GD2-gangliosida de células pequeñas y melanoma metastático TriAb cáncer metastático MUC-1 de mama Trilex CEAVac cáncer coló rectal, CEA avanzado TriGem cáncer de pulmón GD2-gangliosida de células pequeñas y melanoma metastático TriAb cáncer metastático MUC-1 de mama Viventía Biotech NovoMAb-G2 Linfoma no de NA radiomarcado Hodgkins Monopharm C colorectal & SK-1 antigen pancreatic carcinoma GlioMAb-H (+ toxina glioma, melanoma NA gelonina) & neuroblastoma Xoma Rituxan NHL folicular o CD20 de bajo grado con recaída/refractario Rituxan HNL intermedio y CD20 de alto grado ING-1 adenomcarcinoma Ep-CAM 5.5.6 AGENTES MODULADORES INMUNOLÓGICOS Y AGENTES ANTIINFL AMATORIOS La presente invención proporciona métodos de tratamiento para enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias que comprende administration de las moléculas de la invención en conjunción con otros agentes de tratamiento. Algunos ejemplos de agentes moduladores inmunológicos incluyen, aunque no se limitan a, metotrexato, ENBREL, REMICADE™, leflunomida, ciclofosfamida, ciclosporina A, y antibióticos macrólidos (por ej., FK506 (tacrolimo)), metilprednisolona (MP), corticosteroides, esteriodes, micofenolato mofetilo, rapamicina (sirolimo), mizoribina, desoxispergualina, brequinar, malononitriloamindes (por ej., leflunamida), moduladores del receptor de células T, y moduladores del receptor de citoquina.
Los agentes antiinflamatorios han exhibido éxito en el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios y actualmente son un tratamiento estándar y común para dichos trastornos. Cualquier agente anti-inflamatorio conocido para una persona con experiencia en la materia puede ser utilizado en los métodos de la invención. Algunos ejemplos no limitativos de agentes antiinflamatorios incluyen fármacos antiinfiamatorios no esteroides (AINE), fármacos antiinflamatorios esteroides, beta-agonistas, agentes anticolinérgicos, y metil xantinas. Algunos ejemplos de AINE incluyen, aunque no se limitan a, aspirina, ibuprofeno, celecoxib (CELEBREX™), diclofenac (VOLTAREN™), etodolac (LODINE™), fenoprofeno (NALFON™), indometacina (INDOCIN™), ketoralac (TORADOL™), oxaprozin (DAYPRO™), nabumentona (RELAFEN™), sulindac (CLINORIL™), tolmentin (TOLECTIN™), rofecoxib (VIOXX™), naproxen (ALEVE™, NAPROSYN™), ketoprofeno (ACTRON™) y nabumetona (RELAFEN™). Dichos AINE funcionan mediante la inhibición de una enzima ciclooxgenasa (por ej., COX-1 y/o COX-2). Algunos ejemplos de fármacos antiinflamatorios esteroides incluyen, aunque no se limitan a, glucocorticoides, dexametasona (DECADRON™), cortisona, hidrocortisona, prednisona (DELTASONE™), prednisolona, triamcinolona, azulfidina, y eicosanoides tales como prostaglandinas, tromboxanos, y leucotrienos.
Un ejemplo no limitativo de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de trastornos inflamatorios en conjunción con las moléculas de la invención se presenta en la Tabla 9, y un ejemplo no limitativo de los anticuerpos que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de trastorno autoinmune se presenta en la Tabla 10.
Table 9: Anticuerpos terapéuticos para el tratamiento of enfermedades inflamatorias Tabla 10: Anticuerpos terapéuticos para el tratamiento of trastornos autoinmunes 5.5.7 AGENTES PARA USAR EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD INFECCIOSA En algunas realizaciones, las moléculas de la invención puede administrarse en combinación con una cantidad efectiva para terapia o profilaxis de uno o varios agentes terapéuticos conocidos por aquellos expertos en la materia para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad infecciosa. La invención contempla el uso de las moléculas de la invención en combinación con antibióticos conocidos por aquellos expertos en la materia para el tratamiento y/ o prevención de una enfermedad infecciosa. Los antibióticos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la invención incluyen, aunque no se limitan a, macrólida (por ej., tobramicina (Tobi®)), una cefalosporina (por ej., cefalexina (Keflex®), cefradina (Velosef®), cefuroxima (Ceftin®), cefprozil (Cefzil®), cefaclor (Ceclor®), cefixima (Suprax®) o cefadroxil (Duricef®)), una clarihromicina (por ej., claritromicina (Biaxin®)), una eritromicina (por ej., eritromicina (EMicina®)), una penicilina (por ej., penicilina V (V-Cillin K® o Pen Vee K®)) o una quinolona (por ej., ofloxacina (Floxin®), ciprofloxacina (Cipro®) o norfloxacina ( oroxin®)), antibióticos de aminoglicósidos (por ej., apramicina, arbekacin, bambermicinas, butirosin, dibekacin, neomicina, neomicina, undecilenato, netilmicin, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, y espectinomicina), antibiótico de anfenicol (por ej., azidamfenicol, cloranfenicol, florfenicol, y tiamfenicol), antibióticos de ansamicina (por ej., rifamida y rifampina), carbacefemos (por ej., loracarbef), carbapenems (por ej., biapenem e imipenem), cefalosporinas (por ej., cefaclor, cefadroxil, cefamandole, cefatrizine, cefazedona, cefozopran, cefpimizol, cefpiramida, y cefpiroma), cefamicinas (por ej., cefbuperazona, cefmetazol, y cefminox), monobactamas (por ej., aztreonam, carumonam, y tigemonam), oxacefems (por ej., flomoxef, y moxalactam), penicilinas (por ej., amdinocilina, amdinocilina pivoxil, amoxicilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilínico, bencilpenicilina de sodio, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamccilina, penetamato yodhidrato, penicilina o-benetamina, penicilina 0, penicilina V, penicilina V benzatina, penicilina V hidrabamina, penimepiciclina, y fencihicilina de potasio), lincosamidas (por ej., clindamicina, y lincomicina), amfomicina, bacitracina, capreomicina, colistina, enduracidina, enviomicina, tetraciclinas (por ej., apiciclina, clortetraciclina, clomociclina, y demeclociclina), 2,4-diaminopirimidinas (por ej., brodimoprim), nitrofuranos (por ej., furaltadone, y cloruro de furazolio), quinolonas y sus análogos (por ej., cinoxacina, clinafloxacina, flumequina, y grepagloxacina), sulfonamidas (por ej., acetil sulfametoxipirazina, bencilsulfamida, noprilsulfamida, ftalilsulfacetamida, sulfacrisoidina, y sulfacitina), sulfonas (por ej., diatimosulfona, glucosulfona de sodio, y solasulfona), cicloserina, mupirocina y tuberina.
En ciertas realizaciones, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad efectiva para terapia o profilaxis de una o más agentes antifúngicos. Los agentes antifúngicos que pueden usarse en combinación con las moléculas de la invención incluyen aunque no se limitan a anfotericina B, itraconazol, ketoconazol, fluconazol, intratecal, flucitosina, miconazol, butoconazol, clotrimazol, nistatin, terconazol, tioconazol, ciclopirox, econazol, haloprogrin, naftifina, terbinafina, undecilenato, y gríseo fuldina.
En algunas realizaciones, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad efectiva para terapia o profilaxis de uno o más agente antiviral. Los agentes antivirales útiles que pueden usarse en combinación con las moléculas de la invención incluyen, aunque no se limitan a, inhibidores de proteasa, inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido, inhibidores de transcriptasa inveresa no nucleóxidos y análogos de nucleósidos. Algunos ejemplos de agentes antivirales incluyen aunque no se limitan a zidovudina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridine, trifluridina, y ribavirina, así como también foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, los alfa -interferones; adefovir, clevadina, entecavir, pleconaril. 5.6 TERAPIA DE VACUNACIÓN La invención abarca, además, con el uso de una composición de la invención para inducir una respuesta inmunológica contra un agente antigénico o agente inmunogénico, que incluyen aunque sin limitarse un antígenos del cáncer y antígenos de una enfermedad infecciosa (algunos ejemplos de los cuales se divulgan más abajo). Las composiciones de las vacunas de la invención comprenden one o más agentes antigénicos o inmunogénicos para los cuales se desea una respuesta inmunológica, en donde el o los agentes antigénicos o inmunogénicos se recubre con un anticuerpo variante de la invención que tiene una potenciada afinidad por FcyRIIIA. Las composiciones de las vacunas de la invención son particularente efectivas en generar una respuesta inmunol'gica, con preferencia una respuesta inmunológica contra el agente antigénico inmunogénico.
En algunas realizaciones, the agente antigénico inmunogénico en las composiciones de las vacunas de la invención comprende un virus contra el cual se desea una respuesta inmunológica. Los virus pueden ser recombinantes o quiméricos y con preferencia están atenuados. La producción de virus recombinantes, quiméricos y atenuados puede realizarse con el uso de métodos estándar conocidos por los expertos en el arte. La invención abarca una vacuna viral recombinante viva o una vacuna viral recombinante inactivada que se formulará de acuerdo con la invención. Puede preferirse una vacuna viva debido a que la multiplicación en el huésped conduce a un estímulo prolongado de clase similar y magnitud que el que ocurre en las infecciones naturales, y por lo tanto, confiere inmunidad duradera, sustancial. La producción de dichas formulaciones de vacuna de virus recombinante vivo puede lograrse con el uso de métodos convencionales que incluyen la propagación del virus en el cultivo celular o en el alantoide de embriones de pollo eguido de purificación.
En una realización específica, el virus recombinante es no patogénico para el sujeto a quien se administra. En este aspecto, el uso virus diseñados genéticamente para fines de vacunación puede requerir la presencia de características de atenuación en estas cepas. La introducción de mutaciones apropiadas (por ej., eliminaciones) en los patrones usados para transfección pueden proveer a los novedosos virus las características de atenuación. Por ejemplo, las mutaciones específicas de sentido equivocado que están asociadas con sensibilidad a la temperatura o adaptación al frío pueden convertiré en mutaciones por eliminación. Estas mutaciones deben ser más estables que las mutaciones puntuales asociadas con imitantes sensibles al frío y la temperatura y las frecuencias de revisión deben ser extremadamente bajas. Las tecnologías de ADN recombinantes para diseñar virus recombinantes se conocen en la materia y se abarcan en la invención. Por ejemplo, las técnicas para modificar virus de ARN de hebra negativa se conocen en la materia, véase, por ej., Patente de los EE UU Nro. 5,166,057, que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
En forma alternativa, los virus quiméricos con características "suicidas" pueden construirse para usar en las formulaciones de vacunas transdérmicas de la invención. Dichos virus atravesarían sólo uno o algunos ciclos de replicación dentro del huésped. Cuando se usa como vacuna, el virus recombinante sufriría limitado(s) ciclo(s) de recplicación e induciría un nivel suficiente de respuesta inmune pero avanzaría además en el huésped humano y causaría enfermedad. En forma alternativa, el virus inactivado (muerto) puede formularse de acuerdo con la invención. Las formulaciones de vacunas inactivadas pueden prepararse con el uso de técnicas convencionales para "matar" los virus quiméricos. Las vacunas inactivadas están "muertas" en el sentido que su capacidad de infección se ha destruido. En forma ideal, la capacidad de infección del virus se destruye sin afectar su inmunogenicidad. Con el fin de preparar las vacunas inactivadas, el virus quimérico puede cultivarse en cultivo celular o en el alantoide del embrión de pollo, purificado por ultracentrifugado zonal, inactivado por formaldehído o ß-propiolactona, y agrupado.
En ciertas realizaciones, epítopes completamente extraños, que incluyen antígenos derivados de otros patógenos no virales o virales pueden diseñarse en el virus para usar en las formulaciones de vacunas transdérmicas de la invención. Por ejemplo, los antígenos de virus no relacionados tales como antígenos de parásitos del VIH (gplóO, gpl20, gp41) (por ej., malaria), antígenos bacterianos o fúngicos o antígenos tumorales pueden diseñarse en la cepa atenuada.
Virtualmente cualquier secuencia génica heteróloga puede construirse en los virus quiméricos de la invención para usar en las formulaciones de vacunas intradérmicas. Con preferencia, las secuencias génicas heterólogas son restos y péptidos que actúan como modificadores de la respuesta biológica. Con preferencia, los epítopes que inducen una respuesta inmunológica protectora a cualquiera de una variedad de patógenos, o antígenos que se unen a anticuerpos neutralizantes pueden ser expresados por o como parte de los virus quiméricos. Por ejemplo, las secuencias génicas heterólogas que pueden construirse en los virus quiméricos de la invención incluyen, aunque no se limitan a, heuraminidasa de hemaglutinina de gripe y pseudogripe y glicoproteínas de fusión tales como los genes HN y F de PIV3 humano. Incluso en otra realización, las secuencias génicas heterólogas que pueden diseñarse en los virus quiméricos incluyen aquellas que codifican proteínas con actividades inmuno moduladoras. Algunos ejemplos de proteínas inmuno moduladoras incluyen, aunque no se limitan a, citoquinas, interferón tipo 1 , interferón gamma, factores estimulantes de colonias, interleucina -1, -2, -4, -5, -6, -12, y antagonistas de estos agentes.
Incluso, en otras realizaciones, la invención abarca células o virus patogénicos, con preferencia virus atenuado, que expresan el anticuerpo variante sobre su superficie.
En realizaciones alternativas, las composiciones de las vacunas de la invención comprenden un polipéptido de fusión en donde un agente antigénico o inmunogénico está ligado en forma operativa a un anticuerpo variante de la invención que tiene una afinidad potenciada por FcyRIIIA. El diseño de los polipéptidos de fusión para usar en las composiciones de las vacunas de la invención se realiza con el uso de métodos de rutina de tecnología de ADN recombinante está dentro del nivel de habilidad común.
La invención abarca, además, métodos para inducir tolerancia en un sujeto por la administración de una composición de la invención. Con preferencia una composición apropiada para inducir tolerancia en un sujeto comprende un agente antigénico o inmunogénico recubierto con un anticuerpo variante de la invención, en donde el anticuerpo variante tiene mayor afinidad por FcyRIIB. Aunque sin intención de ligarse a un mecanismo de acción particular, dichas composiciones son efectivas en la inducción de tolerancia por la activación de la vía inhibidora mediada por FcyRIIB. 5.7 COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN La invención proporciona métodos y composiciones farmacéuticas que comprenden moléculas de la invención (es decir, diacuerpos) que comprende múltiples dominios de unión al epítope y, en forma opcional, un dominio Fe (o porción de los anteriores). La invención también proporciona métodos de tratamiento, profilaxis y alivio de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección por la administración de a un sujeto una cantidad efectiva de una proteína de fusión o una molécula conjugada de la invención, o una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión o una molécula conjugada de la invención. En un aspecto preferido, un anticuerpo, una proteína de fusión, o una molécula conjugada, es en forma sustancial purificada (es decir, en forma sustancial libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos colaterales no deseados). En una realización específica, el sujeto es un animal, con preferencia un mamífero tales como no primate (por ej., vacas, cerdos caballos perros, ratas etc.) y un primate (por ej., mono tales como, un mono macaco y un humano). En una realización preferida, el sujeto es un humano. Incluso en otra realización preferida, el anticuerpo de la invención es de la misma especie que el sujeto.
Varios sistemas de administración se conocen y pueden usarse para administrar una composición que comprende moléculas de la invención, por ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o la proteína de fusión, endocitosis mediada por el receptor (Véase, por ej., Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, " J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de administración de una molécula de la invención incluyen, aunque no se limitan a, administración parenteral (por ej., intradérmica, intramuscular, intraperitoneana, intravenosa y subcutánea), epidural, y mucosa (por ej., vías intranasal y oral). En una realización específica, las moléculas de la invención se administran por vía intramuscular, vía intravenosa, o vía subcutánea. Las composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ej., mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistéimica o local. Además, también puede emplearse administración pulmonar, por ej., por medio del uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente vaporizador. Véase, por ej., Patentes de EE UU Nros. 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; y 4,880,078; y Publicaciones por PCT Nros. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
La invención también proporciona que las moléculas de la invención se envasen en un recipiente sellado herméticamente tales como una ampolla o sachét que indica la cantidad de anticuerpo. En una realización, las moléculas de la invención se suministran como un polvo esterilizado liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente y puede reconstituirse, por ej., con agua o solución salina hasta la concentración apropiada para administración a un sujeto. Con preferencia, las moléculas de la invención se suministran como un polvo liofilizado estéril anhidro en un recipiente sellado herméticamente en una unidad de dosificación de por lo menos 5 mg, con mayor preferencia por lo menos 10 mg, por lo menos 15 mg, por lo menos 25 mg, por lo menos 35 mg, por lo menos 45 mg, por lo menos 50 mg, o por lo menos 75 mg. Las moléculas liofilizadas de la invención deben almacenarse a entre 2 y 8°C en su envase original y las moléculas deben administrarse dentro de 12 horas, con preferencia dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas, o dentro de 1 hora después de haberse reconstituido. En una realización alternativa, las moléculas de la invención se suministran en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente lo que indica la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión, o molécula conjugada. Con preferencia, la forma líquida de las moléculas de la invención se suministra en un recipiente sellado herméticamente por lo menos 1 mg/ml, con mayor preferencia por lo menos 2,5 mg/ml, por lo menos 5 mg/ml, por lo menos 8 mg/ml, por lo menos 10 mg/ml, por lo menos 15 mg/kg, por lo menos 25 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 100 mg/ml, por lo menos 150 mg/ml, por lo menos 200 mg/ml de las moléculas.
La cantidad de la composición de la invención que será efectiva en el tratamiento, prevención o alivio de uno o más síntomas asociados con un trastorno puede determinarse por técnicas clínicas estándar. La dosis precisa que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la seriedad de la afección, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del practicante y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de análisis de modelos in vitro o animales.
Para los diacuerpos abarcados por la invención, la dosificación administrada a un paciente es normalmente 0,0001 mg/kg hasta 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Con preferencia, la dosificación administrada a un paciente es entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0,0001 y 2 mg/kg, 0,0001 y 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg hasta 0,25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg o 0,01 a 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosificación y frecuencia de administración de los diacuerpos de la invención puede reducirse o alterarse potenciando la captación y penetración al tejido de los diacuerpos por modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.
En una realización, la dosificación de las moléculas de la invención administrada a un paciente puede ser desde 0,01 mg hasta 1000 mg/día cuando se usa como terapia con agente simple. En otra realización las moléculas de la invención se usan en combinación con otras composiciones terapéuticas y la dosificación administrada a un paciente son menores que cuando dicha moléculas se usan como terapia con un agente único.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención en forma local al área que necesita de tratamiento; esto puede lograrse por, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local, por inyeccón, o por medio de un implante, dicho implante es un material gelatinoso no poroso o poroso, que incluye membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Con preferencia, cuando se administra una molécula de la invención, debe tenerse cuidado de usar materiales a los cuales la molécula no se absorba.
En otra realización, las composiciones pueden administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (Véase Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery, " Science 249:1527-1533); Treat et al, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327; véase en general ibid.).
Incluso en otra realización, las composiciones pueden administrarse en un sistema de liberación controlada o de liberación prolongada. Cualquier técnica conocida para una persona con experiencia en la materia puede usarse para producir formulaciones de liberación prolongada que comprenden una o más moléculas de la invención. Véase, por ej., Patente de los EE UU Nro. 4,526,938; Publicación por PCT WO 91/05548; Publicación por PCT WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cáncer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, " Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Efnulsions, " PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, " Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, " Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad. En una realización, puede usarse una bomba en un sistema de liberación controlada (Véase Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps, " CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusión Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, " Cirugía 88:507-516; y Saudek et al. (1989) "A Preliminary Triol Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery, " N. Engl. J. Med. 321 :574-579). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos para lograr la liberación controlada de los anticuerpos (véase por ej., Medical Applications of Controlled Reléase. Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Diseño y Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Vahes By Local Controlled-Release Diphosponate, " Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Reléase Of Dopamine From A Polimeric Brain Implant: In Vivo Caracterization, " Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Ratas With Lesion-Induced Memory Déficits, " J. Neurosurg. 7(1):105-1 12); Patente de los EE UU Nro. 5,679,377; Patente de los EE UU Nro. 5,916,597; Patente de los EE UU Nro. 5,912,015; Patente de los EE UU Nro. 5,989,463; Patente de los EE UU Nro. 5,128,326; Publicación por PCT Nro. WO 99/15154; y Publicación por PCT Nro. WO 99/20253). Algunos ejemplos de polímeros usados en las formulaciones de liberación prolongada incluyen, aunque no se limitan a, poli(2-hidroxi etil metacrilato), poli(metil metacrilato), poli(ácido acrílico), poli(co-vinil acetato de etileno), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(vinyl alcohol), poliacrilamida, poli(etilene glicol), poliláctidos (PLA), poli(láctido-co-glicólidos) (PLGA), y poliortoésteres. Incluso en otra realización, un sistema de liberación controlada puede ubicarse en proximidad del agente terapéutico (por ej., los pulmones), de este modo sólo se requiere una fracción de la dosis sistémica (véase, por ej., Goodson, in Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). En otra realización, las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada se usan de acuerdo con Dunn et al. (Véase U.S. 5,945,155). Este método particular se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo del sistema polimérico. La implantación puede ocurrir en general en cualquier parte dentro del cuerpo del paciente que necesita de tratamiento terapéutico. En otra realización, se usa un sistema de administración prolongada no polimérica, por el cual un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto se usa como sistema de administración de medicamento. Luego del implante en el cuerpo, el solvente orgánico del implante se disipará, dispersará o filtrará de la composición en el líquido del tejido circundante, y el material no polimérico se coagulará gradualmente o precipitará para formar una matriz microporosa sólida (Véase U.S. 5,888,533).
Los sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión realizada por Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery, " Science 249:1527-1533). Cualquier técnica conocida para una persona con experiencia en la materia puede usarse para producir formulaciones de liberación prolongada que comprende uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véase, por ej., Patente de los EE UU Nro. 4,526,938; Publicaciones Internacionales Nros. WO 91/05548 and WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cáncer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, " Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, " PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polimeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, " Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, " Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760, cada una de las cuales se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad.
En una realización específica donde la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un diacuerpo de la invención, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su diacuerpo codificado, al construirlo como parte de un vector apropiado de expresión del ácido nucleico y administrarlo de modo tal que se torne intracelular, por ej., por el uso de un vector retroviral (Véase Patente de los EE UU Nro. 4,980,286), o por inyección directa, o por el uso de bombardeo de micropartículas (por ej., una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o genes de transfección, o por la administración de éste junto con un péptido símil homeobox que se conoce por ingresar al núcleo (Véase por ej., Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. En forma alternativa, un ácido nucleico puede introducirse en forma intracelular e incorporarse dentro de ADN de célula huésped para expresión por recombinación homologa.
El tratamiento de un sujeto con una cantidad efectiva para terapia o profilaxis de moléculas de la invención puede incluir un tratamiento simple o, con preferencia, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con moléculas de la invención en el rango de entre alrededor de 0,1 a 30 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante entre alrededor de 1 a 10 semanas, con preferencia entre 2 a 8 semanas, con mayor preferencia entre alrededor de 3 a 7 semanas, y incluso con mayor preferencia durante alrededor de 4, 5, o 6 semanas. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran una vez por día, dos veces por día, o tres veces por día. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran una vez por semana, dos veces por semana, una vez cada dos semanas, una vez por mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces por año o una vez por año. Se apreciará además que la dosificación efectiva de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentar o reducirse con el transcurso de un tratamiento particular. 5.7.1 COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Las composiciones de la invención incluyen composiciones de medicamentos a granel útiles en la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ej., composiciones no estériles o impuras) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que son apropiadas para administración a un sujeto o paciene) que pueden usarse en la preparación de formas de dosificación unitarias. Dichas composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de un agente profiláctico y/o terapéutico divulgado en este documento o una combinación de esos agentes y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Con preferencia, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una o más moléculas de la invención y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
La invención abarca, además, composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula del diacuerpo de la invención y un anticuerpo treapéutico (por ej., anticuerpo monoclonal específico del tumor) that es específico para a particular cáncer antigen, y a pharmaceutically acceptable carrier.
En una realización específica, el término "aceptables desde el punto de vista farmacéutico" significa aprobado por una agencia regulatoria del gobierno federal o estatal o enumerado en la farmacopea de los EE UU u otra farmacopea generalmente reconocida para usar en animales, y más particularmente en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante (por ej., adyuvante de Freund (completo o incompleto), excipiente o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es el vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse solucioes salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, en particular para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos apropiados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pildoras, cápsulas, polvos, formulacines de liberación prolongada y similares.
En general, los ingedientes de las composiciones de la invención se suministran ya sea separados o mezclados juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente tales como una ampolla o sachét que indica la cantidad de principio activo. Donde la composición pretende administrarse por infusión, puede dispensarse con un frasco para infusión que contiene agua estéril grado farmacéutico o solución salina. Donde la composición se administra por inyeccón, una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina puede proporcionarse de modo tal que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.
Las composiciones de la invención pueden formularse como formas de sales o neutras. Las sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluyen, aunque no se limitan a, aquellas formadas con aniones tales como aquellos derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calbio, hidróxidos de hierro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. 5.7.2 TERAPIA GÉNICA En una realización específica, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican las moléculas de la invención se administran para tratar, prevenir o aliviar uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno, o infección, por medio de terapia génica. Terapia génica se refiere una terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o susceptible de expresarse. En esta realización de la invención, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo codificado o proteína de fusión que media un efecto terapéutico o profiláctico.
Cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles en la materia puede usarse de acuerdo con la presente invención. Los métodos ejemplificativos se describen a continuación.
Para obtener revisiones generales de los métodos de terapia génica, véase Goldspiel et al. (1993) "Human Gene Therapy, " Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu et al. (1991) "Delivery Systems For Gene Therapy, " Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993,) "Gene Therapy, Concepts, Current Triáis And Future Directions, " Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) "The Basic Science Of Gene Therapy, " Science 260:926-932; y Morgan et al. (1993) "Human Gene Therapy, " Ann. Rev. Biochem. 62:191-217. Los métodos comúnmente conocidos en la materia de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratorv Manual, Stockton Press, NY (1990).
En un aspecto preferido, una composición de la invención comprende ácidos nucleicos que codifican un diacuerpo de la invención, dichos ácidos nucleicos son parte de un vector de expresión que expresa el anticuerpo en un huésped apropiado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, con preferencia promotores heterólogos, ligados en forma operativa a la región de codificación del anticuerpo, dicho promotor es inducible o constitutivo, y, en forma opcional, específico del tejido. En otra realización particular, se usan las moléculas de ácido nucleico en las cuales la secuencia de codificación del anticuerpos y cualquier otra secuencia deseada están rodeadas por regiones que promueven la recombinación homologa en el sitio deseado del genoma, suministrando de este modo la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells, " Nature 342:435-438).
En otro aspecto preferido, una composición de la invención comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión, dichos ácidos nucleicos son parte de un vector de expresión que expresa la proteína de fusión en un huésped apropiado. En particular, dichos ácidos nucleicos tienen promotores, con preferencia promotores heterólogos, ligada en forma operativa a la región de codificación de una proteína de fusión, dicho promotor es inducible o constitutivo, y en forma opcional, específico del tejido. En otra realización particular, las moléculas de ácido nucleico se usan en la cual la secuencia de codificación de la proteína de fusión y cualquier otra secuencia deseada están rodeadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en el sitio deseado del genoma, suministrando de este modo la expresión intracromosómica de la proteína de fusión.
La administración de los ácidos nucleicos en un sujeto puede ser indistintamente directa, en cuyo caso el sujeto se expone directamente al ácido nucleico o vectores que transportan ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, primero se transforman las células con los ácidos nucleicos in vitro, luego se transplantan en el sujeto. Estos dos métodos se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.
En una realización específica, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, donde se expresa para producir el producto codificado. Esto puede lograrse por cualquiera de numerosos métodos conocidos en la materia, por ej., by al construirlos como parte de un vector apropiado de expresión del ácido nucleico y administrarlo de modo tal que se torne intracelular, por ej., por infección con el uso de vectores defectuosos o retrovirales atenuados u otros vectores virales (Véase Patente de los EE UU Nro. 4,980,286), o por inyección directa de ADN purificado, o por el uso de bombardeo de micropartículas {por ej., una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o genes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas, o por la administración de los mismos en relación a un péptido que se conoce por ingresar al núcleo, por la administración del mismo con relación a un antígeno sujeto a endocitosis mediada por el receptor (Véase, por ej., Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, " J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (que pueden usarse para dirigir Tipo de Células que específicamente expresan los receptores), etc. En otra realización, los complejos de ácido nucleico pueden formarse en los cuales el antígeno comprende un péptido viral fusogénico para interrumpir los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. Incluso en otra realización, el ácido nucleico puede dirigirse in vivo para captación y expresión específica de las células, orientando un receptor específico (Véase, por ej., Publicaciones por PCT WO 92/06180; WO 92/22635; W092/20316; W093/14188; WO 93/20221). En forma alternativa, el ácido nucleico puede introducirse en forma intracelular e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para expresión, por recombinación homologa (Koller et al. (1989) "Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination, " Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; y Zijlstra et al. (1989) "Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells, " Nature 342:435-438).
En una realización específica, se usan los vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican una molécula de la invención (por ej., un diacuerpo o una proteína de fusión). Por ejemplo, un vector retroviral puede usarse (Véase Miller et al. (1993) "Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression, " Meth. Enzymol. 217:581-599). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto envasado del genoma viral y la integración en el ADN de la célula huésped. La secuencia de ácido nucleicos que codifican el anticuerpo o una proteína de fusión que se usará en terapia génica se clonan en uno o más vectores, lo que facilita la administración de la secuencia de nucleótidos en un sujeto. Mas detalles sobre los vectores retrovirales pueden encontrarse en Boesen et al. (1993) "Circumvention Of Quimioterapia-Induced Myelosuppression By Transfer OfThe Mdrl Gene, " Biotherapy 6:291-302), que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdr 1 a mastocitos hematopoyéticos con el fin de hacer que los mastocitos sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al. (1994) "Long-Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes, " J. Clin. Invest. 93:644-651; Keim et al. (1994) "Retrovirus-Mediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells, " Blood 83:1467-1473; Salmons et al. (1993) "Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy, " Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman et al. (1993) "Retroviruses: Delivery Vehicle To The Liver, " Curr. Opin. Genetics and Devel. 3:110-114.
Los adeno virus son otros vectores virales que pueden usarse en terapia génica. Los adenoviruses son vehículos especialmente atractivos para administrar genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan naturalmente los epitelios respiratorios donde causan una enfermedad leve. Otros blancos para los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculos. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar de células no divisorias. Kozarsky et al. (1993, "Gene Therapy: Adenovirus Vectors, " Current Opinión in Genetics and Development 3:499-503) presenta una revisión de terapia génica basada en adenovirus. Bout et al. (1994, "Lung Gene Therapy: In Vivo Adenovirus-Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium, " Human Gene Therapy, 5:3-10) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Otras instancias del término uso de adenoviruses en terapia génica puede encontrarse en Rosenfeld et al. (1991) "Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alfa 1-Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo, " Science 252:431-434; Rosenfeld et al. (1992) "In Vivo Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium, " Cell 68:143-155; Mastrangeli et al. (1993) "Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For In Vivo Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer, " J. Clin. Invest. 91 :225-234; Publicación por PCTW094/12649; y Wang et al. (1995) "A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Dos Lethal Gene-Region Deletions, " Gene Therapy 2:775-783. En una realización preferida, se usan vectores de adenovirus.
El virus adeno asociado (AAV) también se ha propuesto para usar en terapia génica (véase, por ej., Walsh et al. (1993) "Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies, " Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 y Patente de los EE UU Nro. 5,436,146).
Otro enfoque para la terapia génica incluye transferir un gen a las células en el cultivo de tejido por dichos métodos as electroporación, lipofection, calcium phosphate mediated transfection, o viral infection. Usualmente, el método of transfer incluye the transfer of un marcador seleccionable a las células. The cells are then placed under selection to isolate those cells that have taken up and are expressing the transferred gene. Those cells are then delivered a un sujeto.
En esta realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Dicha introducción puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la materia, que incluyen aunque sin limitarse a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago, que contiene la secuencia de ácido nucleicos, fusión celular, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas, fusión de esferoplatos, etc. Numerosas técnicas se conocen en la materia para la introducción de genes extranjeros en las células (Véase, por ej., Loeffler et al. (1993) "Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines Con Lipopolyamine-Coated DNA, " Meth. Enzymol. 217:599-618, Corten et al. (1993) "Receptor-Mediated Transport Of DNA Into Eukariotic Cells, " Meth. Enzymol. 217:618-644) y pueden usarse de acuerdo con la presente invención, siempre que no se interrumpan las funciones fisiológicas y de desearrollo necesarias de la células receptoras. La técnica demostraría la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo tal que el ácido nucleico es susceptible de expresarse en la célula y con preferencia capaz de heredarse y expresarse por su progenie celular.
Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un sujeto por varios métodos conocidos en la materia. Las células sanguíneas recombinantes (por ej., células progenitoras o cebada hematopoyéticas) con preferencia se administran por vía intravenosa. La cantidad de células contempladas para usar depende del efecto deseado, el estado del paciente, etc., y puede ser determinada por una persona con experiencia en la materia.
Las células en las cuales un ácido nucleico puede introducirse para los fines terapia génica abarcan cualquier tipo de célula apropiada disponible, e incluyen aunque no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células de la sangre tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; varias células cebada o progenitoras, en particular células cebada o progenitoras hematopoyéticas, por ej., obtenidas de la médula ósea, de la sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.
En una realización preferida, la célula usada para terapia génica es autóloga al sujeto.
En una realización en la cual las células recombinantes se usan en terapia génica, las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o una proteína de fusión se introducen en las células de manera tal que sean susceptibles de ser expresadas por las células o su progenie, y las células recombinantes luego se administra in vivo para lograr el efecto terapéutico. En una realización específica, se usan células progenitoras o cebada.
Cualquier céllula cebada y/o progenitora que puede aislarse y mantenerse in vitro puede usarse potencialmente de acuerdo con esta realización de la presente invención (Véase por ej., Publicación por PCTWO 94/08598; Stemple et al. (1992) "Isolating A Stem Cell For Neurons And Glia From The Mammalian Neural Crest, " Cell 7 1 :973-985; R einwald (1980) "Serial Cultivation Of Normal Human Epidermal Keratinocytes, " Meth. Cell Bio. 21A:229-254; y Pittelkow et al. (1986) "New Techniques For The In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients With Extensive Burns, " Mayo Clinic Proc. 61 :771-777).
En una realización específica, el ácido nucleico que se introducirá para los fines terapia génica comprende un promotor susceptible de inducirse ligado en forma operativa a la región de codificación, de manera tal que expression del ácido nucleico es controlable por el control de la presencia o ausencia del inductor apropiado de transcripción. 5.7.3 KITS La invención proporciona un pack o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con las moléculas de la invención. En forma adicional, uno o más otros agentes terapéuticos o profilácticos útiles para el tratamiento de una enfermedad también pueden incluirse en el pack o kit farmacéutico. La invención también proporciona un pack o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingedientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. En forma opcional asociados con dicho(s) recipiente(s) puede(n) ser una nota en la forma indicada por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, cuya nota refleja la aprobación de parte de la agencia regulatoria de la fabricación, el uso o la venta para administración a los humanos.
La presente invención proporciona kits que pueden usarse en los métodos anteriores. En una realización, un kit comprende una o más moléculas de la invención. En otra realización, un kit comprende, en forma adicional, uno o más otros agentes terapéuticos o profilácticos útiles para el tratamiento del cáncer, en uno o más recipientes. En otra realización, un kit comprende, en forma adicional, uno o más anticuerpos citotóxicos que se unen a uno o más antígenos del cáncer asociados con cáncer. En ciertas realizaciones, el otro agente profiláctico o terapéutico es un agente quimioterapéutico. En otras realizaciones, el agente terapéutico o profiláctico es un agente terapéutico biológico u hormonal. 5.8 CARACTERIZACIÓN Y DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD TERAPÉUTICA Varios aspects de las composiciones farmacéuticas, los agentes terapéuticos o profilácticos de la invención se analizan con preferencia in vitro, en un sistema de cultivo celular, y en un organismo animal modelo, tales como un sistema modelo animal de roedor, para evaluar la actividad terapéutica deseada antes del uso en humanos. Por ejemplo, los ensayos que pueden usarse para determinar si se desea la administración de una composición farmacéutica específica, incluyen ensayos de cultivo celular en los cuales una muestra de tejido de un paciente se cultiva en cultivo, y se expone a o se hace contactar de otro modo con una composición farmacéutica de la invención, y el efecto de dicha composición sobre la muestra de tejido se observa. La muestra de tejido puede obtenerse por biopsia del paciente. Este análisis permite la identificación de la(s) molécula(s) profilácticas o terapéuticas más terapéuticamente efectivas para cada paciente individual. En varias realizaciones específicas, los ensayos in vitro pueden llevarse a cabo con tipos de células reprsentativas involucrados en un trastorno inflamatorio o autoinmune (por ej., células T), para determinar si una composición farmacéutica de la invención tiene un efecto sobre dicho tipo de células.
Las combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden evaluarse en sistemas de modelos de animales apropiados antes de usar en humanos. Dichos modelos en animales incluyen, aunque no se limitan a, ratas, ratones, pollo, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Cualquier sistema animal conocido en la materia puede utilizarse. En una realización específica de la invención, las combinaciones de agentes profilácticos y/o terapéuticos se analizan en un sistema de modelo de ratón. Dichos sistemas modelo se utilizan ampliamente y son muy conocidos para el artesano experimentado. Los agentes profilácticos y/o terapéuticos pueden administrarse en forma reiterada. Varios aspectos del procedimiento pueden variar. Dichos aspectos incluyen el régimen temporal de administrar los agentes profilácticos y/o terapéuticos, y si dichos agentes se administran en forma separada o como una mezcla.
Los modelos animales preferidos para usar en los métodos de la invención son, por ejemplo, ratones transgénicos que expresan FcyR humanos sobre células efectoras de ratón, por ej., cualquier modelo animal descrito en U.S. 5,877,396 (que se incorpora en este documento a modo de referencia en su totalidad) puede usarse en la presente invención.
Los ratones transgénicos para usar en los métodos de la invención incluyen, aunque no se limitan a, ratones que llevan FcyRIIIA humano; ratones que llevan FcyRIIA humano; ratones que llevan FcyRIIB humano y FcyRIIA humano; ratones que llevan FcyRIIB humano y FcyRIIA humano. Con preferencia, las mutaciones que muestran los niveles más altos de actividad en los ensayos funcionales descritos con anterioridad se evaluarán para usar en estudios en modelos animales antes de usar en humanos. Pueden prepararse cantidades suficientes de los anticuerpos para usar en modelos animales con el uso de métodos descritos con anterioridad, por ejemplo con el uso de sistemas de expresión de mamíferos y métodos de purificación descritos y ejemplificados en este documento.
Los modelos de xenoinjerto de ratón pueden usarse para examinar la eficacia de anticuerpos de ratón generados contra un blanco específico del tumor basado en la afinidad y especificidad de los dominios de unión al epítope de la molécula de diacuerpo de la invención h la habilidad del diacuerpo de generar una respuesta inmunológica (Wu et al. (2001) "Mouse Models For Multistep Tumorigenesis, " Trends Cell Biol. 1 1 : S2-9). Los FcyR humanos que expresan ratones transgénicos sobre células efectoras de ratón son únicos y son modelos personalizados de animales para analizar la eficacia de interacciones Fc-FcyR humano. Los pares de líneas celulares de ratón transgénico FcyRIIIA, FcyRIIIB y FcyRIIA generadas en el laboratorio del Dr. Jeffrey Ravetch (A través de un contrato de licencia con Rockefeller University y el Sloan Kettering Cáncer Center) puede usarse tales como se enumeran en la Tabla li a continuación.
Tabla 11: Cepas de ratones La actividad antiinflamatoria de las terapias combinadas de la invenciónpueden determinarse por medio del uso de varios modelos animales experimentales de artritis inflamatoria conocidos en la materia y descritos en Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animáis ", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatologv, McCarty et a/.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993). Los modelos animales experimentales y espontáneos de artritis inflamatoria y enfermedades reumáticas autoinmunes también pueden usarse para evaluarla actividad antiinflamatoria de las terapias combinadas de la invención. Los siguientes son algunos ensayos provistos como ejemplos, y no como limitación.
Los principales modelos animales para artritis o enfermedad inflamatoria se conocidos en la materia y usados ampliamente incluyen: modelos de rata con artritis inducido por adyuvante, modelos de ratón y rata de artritis inducida por colágeno y modelos de conejo y hámster inducido por colágeno, todos descritos en Crofford L.J. and Wilder R.L., "Arthritis and Autoimmunity in Animáis ", in Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatologv. McCarty et a/.(eds.), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993), incorporados en este documento a modo de referencia en su totalidad.
La actividad antiinflamatoria de las terapias combinadas de la invención puede evaluarse con el uso de un modelo de artritis de rata inducido por carragenina. La artritis inducida por carragenina también se ha usado en el conejo, perro y cerdo en estudios de artritis crónica o inflamación. La evaluación histomorfométrica cuantitativa se usa para determinar la eficacia terapéutica. Los métodos para usar dicho modelo de artritis inducida por carragenina se describen en Hansra P. et al. (2000) "Carrageenan induced arthritis In The Rat, " Inflamación, 24(2): 141-155. También se usan comúnmente los modelos animales de inflamación inducida por zymosan como se onoce y se describe en la la materia.
La actividad antiinflamatoria de las terapias combinadas de la invención también puede analizarse midiendo la inhibición de edema de la pata inducido por carragenina en la rata, con el uso de una modificación del término método que se describe en Winter C. A. et al. (1962) "Carrageenan-Induced Edema In Hind Paw Of The Rat As An Assay For Anti-Inflammatory Drugs " Proc. Soc. Exp. Biol Med. 11 1, 544-547. Este ensayo se ha usado como selección primaria in vivo para determinar la actividad antiinflamatoria de la mayoría de los AINE, y se considera predictivo de la eficacia humana. La actividad antiinflamatoria de los agentes terapéuticos o profilácticos de prueba se expresa como porcentaje de inhibición del aumento del peso de la pata trasera del grupo de prueba con relación al grupo de control que recibió vehículo.
En forma adicional, los modelos animales para enfermedad inflamatoria intestinal también pueden usarse para evaluar la eficacia de las terapias combinadas de la invención (Kim et al. (1 92) "Experimental Colitis In Animal Models, " Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537; Strober (1985) "Animal Models of Intestinal Inflammatory Disease —An Overview, " Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S). La colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn son efermedades inflamatorias intestinales humanas que pueden inducirse en animales, Los polisacáridos sulfatados que incluyen, aunque sin limitarse a amilopectina, carragenina, amilopectina sulfato, y dextran sulfato o irritantes químicos que incluyen aunque sin limitarse a ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) y ácido acético pueden administrarse a los animales por vía oral para inducir enfermedades inflamatorias intestinales.
Los modelos animales para trastornos autoinmunes también pueden usarse para evaluar la eficacia de las terapias combinadas de la invención. Los modelos animales for trastornos autoinmunes tales como diabetes tipo 1, inmunidad de tiroides, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis se han desarrollado (Flanders et al. (1999) "Prevention Of Typo 1 Diabetes From Laboratory To Public Health, " Autoimmunity 29:235-246; Rasmussen et al. (1999) "Models To Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity, " Biochimie 81 :511-515; Foster (1999) "Relevance Of Systemic Erithematous Lupus Nephritis Animal Models To Human Disease, " Semin. Nephrol. 19: 12-24).
Además, cualquier ensayo conocido por aquellas personas expertas en la materia puede usarse para evaluar la utilidad terapéutica y/o profiláctica de las terapias de combinación divulgadas en este documento para determinar enfermedades inflamatorias y/o autoinmunes.
La toxicidad y eficacia de los protocolos profilácticos y/o terapéuticos de la presente invención pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estañar en cultivos celulares o animales experimentales, por ej., para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de la dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Los agentes profilácticos y/o terapéuticos que exhiben grandes índices terapéuticos son los preferidos. Mientras que los agentes profilácticos y/o terapéuticos que exhiben efectos colaterales tóxicos pueden usarse, debe tenerse cuidado de diseñar un sistema de administración que diriga dichos agentes al sitio de tejido afectado para minizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos colaterales.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse en la formulación de un rango de dosificación de los agentes profilácticos y/o terapéuticos para usar en humanos. La dosificación de dichos agentes yace con preferencia dentro de un rango de concentraciones en la circulación que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango que depende de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier agente usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos. Una dosis puede formularse en modelos animales para lograr un rango de concentración de plasma en circulación que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media máxima de los síntomas) como se determina en el cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar en forma más precisa las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por cromatografía de alta resolución.
La actividad contra el cáncer de las terapias usadas de acuerdo con la presente invención también pueden determinarse por medio del uso de varios modelos animales experimentales para el estudio del cáncer tales como el modelo de SCID de ratón o ratones transgénicos o ratones lampiños con xenoinjertos humanos, modelos animales, tales como hámsteres, conejos, etc. conocidos en la materia y desctitos en Relevance of Tumor Models or Anticancer Drug Development (1999, eds. Fiebig and Burger); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, eds. Boven and Winograd); y Anticancer Drug Development Guide (1997 ed. Teicher), incorporadas en este documento a modo de referencia en sus totalidades.
Los modelos animales preferidos para determinar la eficacia terapéutica de las moléculas de la invención son los modelos de xenoinjerto de ratón. Las líneas celulares de tumor que pueden usarse como fuente de tumores de xenoinjerto incluyen aunque no se limitan a, células SKBR3 y MCF7, que pueden derivar de pacientes con adenocarcinoma de mama. Estas células tienen ambos receptores erbB2 y prolactina. Las células SKBR3 se han usado como rutina en en la materia como ADCC y modelos de tumor para xenoinjerto. En forma alternativa, células OVCAR3 derivadas de un adenocarcinoma de ovario humano pueden usarse como fuente de tumores de xenoinjerto.
Los protocolos y composiciones de la invención se analizan con preferencia in vitro, y luego in vivo, para determinar la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de usar en humanos. Los agentes terapéuticos y métodos pueden seleccionarse con el uso de células de una línea celular maligna o de tumor. Muchos ensayos estándar pueden usarse para evaluar dicha supervivencia y/o crecimiento; por ejemplo, la proliferación celular puede evaluarse midiendo la incorporación de 3H-timidina, por recuento directo de células, por detección de cambios en la actividad de transcripción de genes conocidos tales como proto-oncógenos {por ej., fos, myc) o marcadores del ciclo celular; la viabilidad celular puede evaluarse por tintura de azul de tripan, la diferenciación puede evaluarse visualmente en base a los cambios en la morfología, reducción del crecimiento y/o formación de colonias en agar suave o formación de nedosrk tubular en la membrana de base tridimensional o la preparación de la matriz extracelular, etc.
Los compuestos para usar en terapia pueden evaluarse en sistemas de modelos de animales apropiados antes de analizar en humanos, que incluyen aunque sin limitarse a, en ratas, ratones, pollo, vacas, monos, conejos, hámsteres, etc., por ejemplo, los modelos animales descritos con anterioridad. Los compuestos pueden usarse luego en ensayos clínicos apropiados.
Además, cualquier ensayo conocidos por aquellas personas expertas en la materia puede usarse para evaluar la utilidad terapéutica y/o profiláctica de las terapias combinadas divulgadas en este documento para el tratamiento o prevención del cáncer, trastorno inflamatorio, o enfermedad autoinmune. 6. EJEMPLOS 6.1 DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DE DIACUERPOS BIESPECÍFICOS COVALENTES Un diacuerpo covalente monoespecífico y un diacuerpo covalente biespecífico se construyeron para evaluar la producción recombinante, características de purificación y unión de cada uno. Las moléculas de diacuerpo purificadas or afinidad que se produjeron por los sistemas de expresión recombinantes descritos en este documento se encontraron por SDS-PAGE y análisis SEC que consisten en una sola especie dimérica. El ELISA y el análisis SPR revelaron en forma adicional que el diacuerpo biespecífico covalente exhibió afinidad por ambos antígenos de destino y podría unirse a ambos antígenos en forma simultánea.
Materiales y métodos and Métodos: Construcción y diseño de las moléculas de polipéptido: Los vectores de expresión de ácidos nucleicos se diseñaron para producir cuatro construcciones de polipéptidos, representadas en forma esquemática en la FIG. 2 . La construcción 1 (SEC ID NRO.: 9) comprendía el dominio VL de anticuerpo 2B6 humanizado, que reconoce FcyRIIB, y el dominio VH de anticuerpo 3G8 humanizado, que reconoce FcyRIIIA. La construcción 2 (SEC ID NRO.: 11) comprendía el dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu2B6. La construcción 3 (SEC ID NRO.: 12) comprendía el dominio VL de Hu3G8 y el dominio VH de Hu3G8. La construcción 4 (SEC ID NRO.: 13) comprendía el dominio VL de Hu2B6 y el dominio VH de Hu2B6.
PCR y Construcción del Vector de expresión: Las secuencias de codificación de los dominios VL o VH se amplificaron a partir del ADN patrón con el uso de cebadores de avance e inversos diseñados de manera tal que los productos de PCR iniciales contendrían secuencias de superposición, permitiendo que la PCR superpuesta genere las secuencias de codificación de las construcciones de polipéptidos deseadas.
Amplificación de PCR inicial del ADN patrón: Aproximadamente 35 ng del ADN patrón, por ej. cadena liviana y cadena pesada del anticuerpo de interés; 1 ul de cebadores de avance e inversos 10 µ?; 2,5 ul de lOx pfuUltra buffer (Stratagene, Inc.); 1 ul de 10 mM dNTP; 1 ul de 2,5 unidades/ul de pfuUltra ADN polimerasa (Stratagene, Inc.); y agua destilada hasta 25 ul de volumen total se mezclaron suavemente en tubo micrófugo y se centrifugó en forma sintética en un microcentrífugo para recolectar la mezcla de reacción en la parte inferior del tubo. Las reacciones por PCR reactions se realizaron con el uso de GeneAmp PCR System 9700 (PE Applied Biosystem) y las siguientes configuraciones: 94°C, 2 minutos; 25 ciclos de 94°C, cada 15 segundos; 58°C, 30 segundos; y 72°C, 1 minuto.
El VL de Hu2B6 se amplificó a partir de la cadena liviana de Hu2B6 con el uso de cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 56, respectivamente. El VH de Hu2B6 se amplificó a partir de la cadena pesada de Hu2B6 con el uso de cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 57 y SEC ID NRO.: 58, respectivamente.
El VL de Hu3G8 se amplificó a partir de la cadena liviana de Hu3G8 con el uso de cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 59, respectivamente. El VH de Hu3G8 se amplificó a partir de la cadena pesada de Hu3G8 con el uso de cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 60 y SEC ID NRO.: 61, respectivamente.
Los productos de PCR se sometieron a electro foresis sobre 1% gel de agarosa durante 30 minutos a 120 voltios. Los productos de PCR se cortaron del gel y se purificaron con el Kit de Extracción MinElute GE1 (Qiagen, Inc.).
PCR por superposición: Los productos de PCR iniciales se combinaron como se describe a continuación y se amplificaron con el uso de las mismas condiciones de PCR descritas para la amplificación inicial del patrón de ADN. Los productos de PCR por superposición también se purificaron como se describió con anterioridad.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 1, SEC ID NRO.: 9 (se muestra esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó por combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de VL Hu2B6 y VH Hu3G8, y cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 61, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 2, SEC ID NRO.: 11 (se muestra esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó por combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de VL Hu3G8 y VH Hu2B6, y cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 58, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 3, SEC ID NRO.: 12 (se muestra esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó por combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de VL Hu3G8 y VH Hu3G8, y cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 61, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 4, SEC ID NRO.: 13 (se muestra esquemáticamente en la FIG. 2), se amplificó por combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de VL Hu2B6 y VH Hu2B6, y cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 58, respectivamente.
Los cebadores de avance de los dominios VL (es decir, SEC ID NRO.: 55) y cebadores inversos de los dominios VH (es decir, SEC ID NRO.: 58 y SEC ID NRO.: 61) contenían sitios de restricción únicos para permitir la clonación del producto final en un vector de expresión. Los productos purificados superpuestos de PCR se digirieron con endonucleasas de restricción Nhe I y EcoR I, y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pCIneo (Promega, Inc.). Los plásmidos que codifican construcciones se diseñaron como se identificó en la Tabla 12: Tabla 12. CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDOS Expresión de polipéptido/diacuerpo: pMGX0669, que codifica la construcción l,was cotransfected con pMGX0667, que codifica la construcción 2, en las células HEK-293 con el uso de Lipofectamina 2000 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). La co-transfección de estos dos plásmidos se diseñó para conducir a la expresión de un diacuerpo biespecífico covalente (CBD) immunoespecífica para ambos FcyRIIB y FcyRIIIA (el diacuerpo h2B6-h3G8). pMGX0666 y pMGX0668, construcciones de codificación 3 y 4, respectivamente, se transfectaron en forma separada en células HEK-293 para determinar la expresión de un diacuerpo monoespecífico covalente (CMD), immunoespecífica para FcyRIIIA (diacuerpo h3G8) y FcyRIIB (diacuerpo h2B6), respectivamente. Luego de tres días en cultivo, los productos secretados se purificaron de los medios acondicionados.
Purificación: Los diacuerpos se capturaron del medio acondicionado con el uso de los antígenos relevantes acoplados a Sepharose 4B activado con CNBr. La resina por afinidad Sepharose se equilibró en 20 mM Tris/HCl, pH 8,0 antes de cargar. Después de cargar, la resina se lavó con buffer de equilibrio antes de la elución. Los diacuerpos se eluyeron de la resina lavada con el uso de 50 mM Glicina pH 3,0. Los diacuerpos eluidos se neutralizaron inmediatamente con 1M Tris/HCl pH 8,0 y se concentraron con el uso de un concentrador del tipo de centrifugado. Los diacuerpos concentrados se purificaron en forma adicional cromatografía por exlcusión de tamaño con el uso de una columna Superdex 200 equilibrada en PBS.
SEC: Se usó cromatografía por exclusión de tamaño para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de los diacuerpos eluidos de la columna. El análisis SEC se realizó en una columna GE healthcare Superdex 200HR 10/30 equilibrada con PBS. La comparación con los perfiles de elución de una IgG de longitud completa (~150 kDa), un fragmento Fab (-50 kDa) y un Fv de cadena simple (-30 kDa) se usaron como controles).
ELISA: La unión de diacuerpos eluidos y purificados se caracterizó por ensayo ELISA, como se describe en la 5.4.2. 50 ul/pocillo de una solución a 2 µg/ml de sCD32B-Ig se recubrió en placa Maxisorp de 96 pocilios en buffer de carbonato a 4°C hasta la mañana siguiente. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, 0,1% Tween 20) y se bloqueo por 0,5% BSA en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, h2B6-h3G8 CBD, h2B6 CMD, o h3G8 CMD se diluyeron en el buffer de bloqueo en una dilución serial en dos veces para generar un rango de concentraciones de diacuerpo, desde 0,5 µg/ml hasta 0,001 µg/ml. La placa se incubó a continuación a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, 50 ul/pocillo de 0,2 ug/ml sCD16A-Biotin se agregó a cada pocilio. La placa se incubó nuevamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, 50 ul/pocillo de una dilución 1 :5000 de Estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) se usó para detección. La HRP-estreptavidina se dejó incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con el uso de 80 ul/pocillo de sustrato de TMB. Después de una incubación de 10 minutos, la reacción de HRP -TMB se detuvo por el agregado de 40 ul/pocillo de 1% H2S04. El OD450 nm se leyó por medio del uso de un lector de placas de 96 pocilios y software SOFT max, y los resultados se graficaron con el uso de software GraphPadPrism 3.03.
Ensayo BIAcore: Los parámetros cinéticos de la unión de diacuerpos eluidos y purificados se analizaron con el uso de un ensayo BIAcore (BIAcore instrument 1000, BIAcore Inc., Piscataway, N.J.) y el software asociado como se describe en la Sección 5.4.3. sCD16A, sCD32B o sCD32A (control negativo) se inmovilizaron sobre una de las cuatro células de flujo (célula de flujo 2) de una superficie del chip sensor a través de química de acoplamiento de amina (por modificación de los grupos carboximetilo con mezcla de NHS/EDC) de manera tal que alrededor de 1000 unidades de respuesta (RU) de cualquiera de receptor se inmovilizó sobre la superficie. Luego de esto, los ésteres activos no reaccionados se "destaparon" con una inyección de 1M Et-NH2. Una vez que la superficie apropiada se preparó, losdiacuerpos biespecíficos covalentes (h2B6-h3G8 CBD) o diacuerpos monoespecíficos covalentes (h2B6 CMD o h3G8 CMB) se pasaron sobre la superficie por inyecciones de 180 segundos de una solución 6,25-200nM a un caudal de flujo de 70 mL/min. h3G8 scFV también se evaluó por comparación.
Una vez recolectados los datos completos, las curvas de unión resultantes se adaptaron en forma global con el uso de algoritmos para computadoras provistos por el fabricante, BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ). Estos algoritmos calculan ambos el Ko„ y off, a partir de los cuales la constante de unión en equilibrio aparente, KD se deduce como la proporción de las dos constantes de velocidad (es decir, Koff/Kon). Los tratamientos más detallados de cómo derivan las constantes de índice individual pueden encontrarse en el BIAevaluaion Software Handbook (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).
Las fases de asociación y disociación se adaptaron por separado. La constante del índice de disociación se obtuvo para el intervalo 32-34 seg de la fase de disociación de 180 seg; la curva de la fase de disociación se obtuvo por un modelo de 1 : 1 Langmuir y el accesorio de la base se seleccionó en base los criterios de Rmax y chi2 para los diacuerpos biespecíficos y scFv; La curva del analito bivalente se usó para unión a CMD.
Resultados El análisis por SDS-PAGE en condiciones no reducidas reveló que el producto purificado de los sistemas de expresión h3G8 CMD, h2B6 CMD y h2B6-h3G8 CBD eran cada uno una sola especie con un peso molecular estimado de aproximadamente 50 kDa (FIG. 3, hileras 4, 5 y 6, respectivamente). En condiciones de reducción, el producto purificado de cualquiera de los sistemas de expresión de CMD corridos como un único por (hileras 1 y 2), mientras que el producto purificado del sistema h2B6-h3G8 CBD se reveló que era 2 proteínas separadas (FIG. 3, hilera 3). Todos los polipéptidos separados del sistema de expresión y visualizados por SDS-PAGE en condiciones de reducción migraron a aproximadamente 28 kDa.
El análisis SEC de cada uno de los productos del sistema de expresión también revelaron una sola especie molecular (FIG. 4B), cada uno de los cuales eluyó al mismo tiempo aproximado que un fragmento Fab de IgG (~50kDa) (FIG. 4A). El producto indica que el producto purificado por afinidad fue un homodímero covalente homogéneo para el caso del sistema de expresión CMD y un heterodímero covalente homogéneo para el caso de h2B6-h3G8 CBD.
Un ensayo ELISA sándwich se usó para evaluar la unión de h2B6-h3G8 CBD para especificidad con cualquiera o ambos de CD32B y/o CD16A (FIG. 5). CD32B sirvió como el antígeno de destino y CD16A se usó como la sonda secundaria. La señal positiva en el ELISA reveló que el h2B6-h3G8 CBD heterodimérico tenía especificidad por ambos antígenos. El análisis similar del h3G8 CMD (que no se unió a CD32B) showed no signal.
El análisis por SPR indicó que h3G8 CMD reconoció en forma inmunoespecífica a sCDló pero no sCD32B, que h2B6 CMD reconoció en forma inmunoespecífica a sCD32B pero no sCDló, y que h2B6-h3G8 CBD reconoció en forma inmunoespecífica a both sCDló y sCD32B (FIGS. 6A-B). Ninguno de los diacuerpos analizados se unió al receptor de control, sCD32A (FIG. 6C).
El análisis por SPR se usó además para estimar la cinética y las constantes de equilibrio de CMDs y h2B6-h3G8 CBD para sCDló y/o sCD32B. Los resultados se compararon con las mismas constantes calculadas para un h3G8 scFV. Las FIGS. 7A-E muestran los resultados gráficos del análisis SPR. La cinética de los índices on y off, así como también la constante de equilibrio, calculada a partir de los resultados mostrados en la FIG. 7 se presentan en en la Tabla 13.
Tabla 13. Constantes de cinética y equilibrio calculadas a partir de los datos BIAcore.
Acoplados con los resultados del análisis ELISA, los estudios confirman que el heterodímero covalente h2B6-h3G8 retuvo especificidad por ambos CD32B y CD16, y era capaz de unir ambos antígenos en forma simultánea. La molécula está representa en forma esquemática en la FIG. 8. 6.2 DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DE DIACUERPOS BIESPECÍFICOS COVALENTES QUE COMPRENDEN DOMINIOS Fe In en un esfuerzo de crear una molécula con aspecto de, es decir, que comprende un dominio Fe, uno de los polipéptidos que comprenden la molécula heterodimérica presentada en el Ejemplo 6.1 se modificó para comprender en forma adicional un dominio Fe (creando una cadena 'más pesada' y 'más liviana', análoga a una cadena liviana y pesada del anticuerpo). La molécula biespecífica heterodimérica contendrían entonces un dominio Fe que se dimerizará con una molécula homologa, formando una molécula tetramérica con estructura de IgG con tetravalencia (es decir, formada por dimerización por medio de los dominios Fe de las las moléculas biespecíficas heterodiméricas). En forma interesante, dichas moléculas tetraméricas no se detectaron en los medios acondicionados de sistemas de expresión recombinantes con el uso de ensayos funcionales, por ej. , análisis de los medios acondicionados para unir en forma inmunoespecífica un antígeno de destinos. En su lugar, sólo una molécula dimérica, que comprende monómeros que consisten en un dominio VL, VH y Fe, se detectaron en dichos ensayos funcionales. Para analizar si la estabilidad de la estructura tetramérica teórica estaba en juego, se diseñaron polipéptidos que comprenden el dominio Fe para comprender en forma adicional a región de bisagra mientras que los polipéptidos que comprenden la cadena 'más liviana' se diseñaron para comprender en forma adicional los 6 aminoácidos de extremo terminal C del dominio constante de la cadena liviana kappa humana. Cuando dichas cadenas re-diseñadas 'más pesada' y 'más liviana se co-expresaron en los sistemas de expresión recombinantes, ensayos funcionales detectados en las moléculas de diacuerpo que fueron capaces de unirse inmunológicamente en forma específica a ambos los antígenos de destino y los anticuerpos anti-Fc.
Materiales y Métodos Construcción y diseño de las moléculas de polipéptido Los vectores de expresión de ácidos nucleicos se diseñaron para producir versiones modificadas de construcciones 1 y 2 presentada en el Ejemplo 6.1. La construcción 5 (SEC ID NRO.: 14) y 6 (SEC ID NRO.: 15), se crearon diseñando la construcción 1 y 2, respectivamente para comprender en forma adicional un dominio Fe. La construcción 7 (SEC ID NRO.: 16) se creó diseñando la construcción 1 para comprender en forma adicional la secuencia FNRGEC (SEC ID NRO.: 23) en su extremo terminal C. La construcción 8 (SEC ID NRO.: 18) se creó diseñando la construcción 2 para comprender en forma adicional una región de bisagra un dominio Fe (que comprende la mutación V215A). La representación esquemática de construcciones 5-8 se muestra en la FIG. 9.
PCR y Construcción del Vector de expresión: Todos los protocolos de PCR y purificación del producto por PCR fueron como se describe en el Ejemplo 6.1 Plasmids pMGX0669 y pMGX0667 sirvieron como patrones para las secuencias de codificación de las construcciones 1 y 2, respectivamente. Las secuencias de codificación para el dominio Fe HuIgG y/o dominio de bisagra fueron SEC ID NRO.: 5 o SEC ID NRO.: 1 y SEC ID NRO.: 5, respectivamente. Las secuencias de codificación de los ADN patrón se amplificaron con el uso de cebadores de avance e inversos de manera tal que los productos de PCR contendrían secuencias de superposición, permitiendo que la PCR superpuesta genere las secuencias de codificación de los productos deseados.
La secuencia de codificación de la construcción 1 se amplificó a partir de pMGX0669 con el uso de cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 62, respectivamente. La secuencia de codificación de la construcción 2 se amplificó a partir de pMGX0667 con el uso de cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 63, respectivamente. HuIgG hinge-Fc se amplificó con el uso de cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 65 y SEC ID NRO.: 66, respectivamente. La construcción 7 (SEC ID NRO.: 16) se amplificó a partir de pMGX0669 con el uso de cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 67.
PCR por superposición: Los productos iniciales de PCR se combinaron como se describe a continuación, se amplificaron y se purificaron como se describe en el Ejemplo 6.1.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 5, SEC ID NRO.: 14 (se muestra esquemáticamente en la FIG. 9), se amplificó por combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de la construcción 1 y HuIgG Fe, y cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 64, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 6, SEC ID NRO.: 15 (se muestra esquemáticamente en la FIG. 9), se amplificó por combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de la construcción 2 y HuIgG Fe, y cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 66, respectivamente. La secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción 8, SEC ID NRO.: 18 (se muestra esquemáticamente en la FIG. 9), se amplificó por combinación de los productos de PCR de las amplificaciones de la construcción 2 y HuIgG hinge-Fc, y cebadores de avance e inversos SEC ID NRO.: 55 y SEC ID NRO.: 66, respectivamente.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión pCIneo de mamífero(Promega, Inc.) como se describió con anterioridad. Las construcciones de plásmidos de codificación se diseñaron como se identificó en la Tabla 14: Tabla 14. CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDOS Expresión de polipéptido/diacuerpo: Cuatro co-transfecciones separadas en en las células HEK-293 con el uso de Lipofectamina 2000, como se describe en la Sección 6,1, se realizaron: pMGX0669 y pMGX0674, construcciones de codificación 1 y 6, respectivamente; pMGX0667 y pMGX0676, construcciones de codificación 2 y 5, respectivamente; y pMGX0677 y pMGX0678, construcciones de codificación 7 y 8, respectivamente.
La co-transfección de estos plásmidos se diseñó para conducir a la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con estructura similar a IgG, immunoespecífica para ambos FcyRIIB y FcyRIIIA. También se realizó una transfección adicional: pMGX0674 y pMGX0676, construcciones de codificación 6 y 5, respectivamente. Luego de tres días en cultivo, se cosechó el medio acondicionado. La cantidad de producto secretado en el medio acondicionado se cuantificó por anti IgG Fe ELISA con el uso de Fe purificado como estándar. Las concentraciones de producto en las muestras se normalizó a continuación en base a la cuantificación, y las muestras normalizadas se usaron para los ensayos restantes.
ELISA: La unión de moléculas de diacuerpo secretadas en el medio se analizó por ELISA sándwich como se describió, supra. Salvo que se indique, CD32B se usó para recubrir la placa, es decir, como proteína blanco, y CD16 conjugado con HRP se usó como sonda.
Resultados Un ensayo ELISA se usó para analizar las muestras normalizadas de los sistemas de expresión recombinantes que comprenden las construcciones 1 y 6 (pMGX669-pMGX674), construcciones 2 y 5 (pMGX667-pNGX676) y construcciones 5 y 6 (pMGX674-pMGX676) para determinar la expresión de moléculas de diacuerpo capaces de unión simultánea a CD32B y CD16A (FIG. 10). Los datos de ELISA indicaron que la co-transfección con construcciones 1 y 6 o co-transfección con construcciones 2 y 5 no lograron elaborar un producto que pudiera unirse a cualquiera o ambos antígenos (FIG. 10, ? y A, respectivamente). Sin embargo, la co-transfección construcciones 5 y 6 conduce a la secreción de un producto capaz de unirse a ambos antígenos CD32B y CD16. El último producto era un dimero de construcciones 5 y 6, que contienen un sitio de unión para cada antígeno con una estructura que se muestra en forma esquemática en la FIG. 11.
Con el fin de conducir la formación de una estructura heterotetramérica con estructura de IgG, la secuencia de codificación para seis aminoácidos adicionales se anexó al extremo terminal C de la construcción 1, generando la construcción 7 (SEC ID NRO.: 16 y se muestra esquemáticamente en la FIG. 9). Los seis aminoácidos adicionales, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23), derivaron del extremo terminal C de la cadena liviana Kappa y normalmente interactúan con el dominio superior de bisagra de la cadena pesada en una molécula de IgG. Un dominio de bisagra se diseñó luego en la construcción 6, generando la construcción 8 (SEC ID NRO.: 18 and FIG. 9). La construcción 8 en forma adicional comprendía una mutación de aminoácidos en la regón superior de bisagra, A215V. La construcción de codificación de plásmidos de expresión 7 y la construcción 8, pMGX677 y pMGX678, respectivamente, luego se co-transfectaron en células HEK-293 y se expresan como se describió.
Las moléculas del diacuerpo producido del sistema de expresión recombinante que comprende construcciones 7 y 8 (pMGX0677 + pMGX0678), se compararon en un ensayo ELISA para determinar la unión de CD32B y CD16A a moléculas de diacuerpo producidas a partir de los sistemas de expresión que comprenden las construcciones 1 y 6 (pMGX669 + pMGX674), construcciones 2 y 8 (pMGX669 + pMGX678), y construcciones 6 y 7 (pMGX677 + pMGX674) (FIG. 12).
Como antes, la molécula produced por el sistema de expresión que comprende construcciones 1 y 6 (pMGX669 + pMGX674) demostraron que son incapaces de unirse tanto a CD32A como CD16A (FIG. 10 y FIG. 12). En contraste, el producto de la coexpresión de cualquiera de construcciones 7 y 6 (pMGX0677 + pMGX0674) o de la coexpresión de las construcciones 7 y 8 (pMGX0677-pMGX0678) fueron incapaces de unirse a ambos CD32B y CD16 (FIG. 12). Se observa que la construcción 7 es análoga para construir 1, con excepción de que la construcción 7 comprende la secuencia de extremo terminal C FNRGEC (SEC ID NO:23); y que la construcción 8 es análoga a la construcción 6, excepto que la construcción 8 comprende un dominio de bisagra y la mutación A215V. Los datos indican que la incorporación de los 6 aminoácidos extra del extremo terminal C de la cadena liviana C-kappa (FNRGEC; SEC ID NRO.: 23) a la cadena 'más liviana' que no lleva Fe ayudó a estabilizar la formación de las moléculas de diacuerpo con estructura de IgG tetraméricas, sin importar si la correspondiente cadena más pesada comprendía un dominio de bisagra (es decir, pMGX0677 + pMGX0674 y pMGX0677-pMGX0678, FIG. 12). El agregado del término dominio de bisagra al Fe que lleva polipéptido 'más pesado', sin el agregado de FNRGEC (SEC ID NRO.: 23) de la secuencia de extremo terminal C a la correspondiente cadena 'más liviana', fue aparentemente incapaz de efectuar estabilización similar (es decir, la falta de unión del producto de la co-transfección de las construcciones 2 y 8 (pMGX669 + pMGX678)). La estructura de la molécula tetramérica del diacuerpo está representada en forma esquemática en la FIG. 13. 6.3 EFECTO DE ORDEN DE DOMINIO Y LOS ENLACES ADICIONALES DE DISULFURO SOBRE LA FORMACIÓN DE DIACUERPO TETRAMÉRICO CON ESTRUCTURA DE IgG El efecto de la estabilización adicional entre las cadenas de polipéptidos más "livianas" y "pesadas" del molécula tetramérica con estructura de IgG del diacuerpo se investigó por sustitución de los residuos seleccionados sobre las cadenas de polipéptidos con cisteínas. The additional cisteína residues proveen los enlaces adicionales de disulfuro entre las cadenas 'más pesada' y 'más liviana'. En forma adicional, el orden de dominio sobre la actividad de unión se investigó por movimiento del dominio Fe o el dominio Fe de bisagra del extremo terminal C de la cadena de polipeptido al extremo terminal N. Aunque la actividad de unión de la molécula que comprende los enlaces de disulfuro adicionales no se alteró con relación a las moléculas construidas anteriormente de diacuerpo con dichos enlaces, la transferencia del dominio Fe o dominio Fe de bisagra al extremo terminal N de la cadena de polipeptido 'más pesada' que comprende el diacuerpo mejoró en forma sorprendente la afinidad de unión y/o avidez de la molécula biespecífica a uno o ambos de sus antígenos de destino.
Materiales y métodos Construcción y diseño de las moléculas de polipeptido: Los vectores de expresión de ácidos nucleicos se diseñaron para producir versiones modificadas de construcciones 5, 6 y 8 presentadas en el Ejemplo 6.2. La construcción 9 (SEC ID NRO.: 19) y la construcción 10 (SEC ID NRO.: 20) (ambas se muestran esquemáticamente en la FIG. 13) fueron análogos a las construcciones 8 y 6, con excepción de que el dominio Fe o dominio de bisagra Fe, respectivamente, se conmutó del extremo terminal C del polipeptido al extremo terminal N. En forma adicional todos los dominios Fe usados fueron dominios Fe tipo salvaje de IgGl . La construcción 11, SEC ID NRO.: 21, (se muestra esquemáticamente en la FIG. 14) fue análoga a la construcción 2 del Ejemplo 6.1 excepto que el extremo terminal C se diseñó para comprender en forma adicional la secuencia FNRGEC (SEC ID NRO.: 23). La construcción 12, SEC ID NRO.: 22 (se muestra esquemáticamente en la FIG. 14) fue análoga a la construcción 5 del Ejemplo 6.2 excepto que el dominio Fe además comprendía a región de bisagra. Además, para las construcciones 1 1 y 12, el dominio 2B6 VL y dominio 2B6 VH comprendía una modificación simple de la cadena de aminoácidos (G105C y G44C, respectivamente) de manera tal que una glicina en cada dominio se reemplazó por cisteína.
PCR y Construcción del Vector de expresión: Todos los protocolos de PCR y purificación del producto por PCR fueron como se describe en el Ejemplo 6.1 y 6,2 PCR por superposición: Los productos finales se construyeron, se amplificaron y se purificaron con el uso de métodos descritos in Ejemplo 6.1 y Ejemplo 6.2.
Los productos finales se clonaron en el vector de expresión pCIneo de mamífero(Promega, Inc.) como se describió con anterioridad. Las construcciones de plásmidos de codificación se diseñaron como se identificó en la Tabla 15: Tabla 15. CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDOS Expresión de polipéptido/diacnerpo: Tres co-transfecciones separadas en las células HEK-293 con el uso de Lipofectamina 2000, como se describe en la Sección 6,1, se realizaron: pMGX0669 y pMGX0719, construcciones de codificación 1 y 9, respectivamente; pMGX0669 y pMGX0718, construcciones de codificación 1 y 10, respectivamente; y pMGX0617 y pMGX0717, construcciones de codificación 11 y 12, respectivamente. La co-transfección de estos plásmidos se diseñó para conducir a la expresión de un diacuerpo biespecífico (CBD) de tetravalencia con estructura similar a IgG, immunoespecífica para ambos FcyRIIB y FcyRIIIA. Luego de tres días en cultivo, se cosechó el medio acondicionado. La cantidad de producto secretado en el medio acondicionado se cuantificó por anti IgG Fe ELISA con el uso de Fe purificado como estándar. Las concentraciones de producto en las muestras luego se normalizaron en base a la cuantifícación, y las muestras normalizadas se usaron para los ensayos restantes.
ELISA: La unión de moléculas de diacuerpo secretadas en el medio se analizó por ELISA sándwich como se describió, supra. Salvo que se indique, CD32B se usó para recubrir la placa, es decir, como proteína blanco, y CD16 conjugado con HRP se usó como sonda.
Transferencia Western: Aproximadamente 15 mi del medio acondicionado de las tres co-transfecciones descritas con anterioridad se analizaron por SDS-PAGE en condiciones no reducidas. Se tiñó un gel con Simply Blue Safestain (Invitrogen) and un gel idéntico se transfirió a membrana de PVDF (Invitrogen) con el uso de métodos de transferencia estándar. Después de la transferencia, la membrana se bloqueó con 5% leche descremada en polvo en IX PBS. La membrana luego se incubó en 10 mi de 1 :8.000 IgGl H+L anti humano de Cabra conjugado con HRP diluido en 2% leche descremada en polvo lXPBS/0,1% Tween 20 a temperatura ambiente durante 1 hr con suave agitación. Luego de un lavado con IX PBS/0,3% Tween 20, 2X 5 min each, luego 20 min a temperatura ambiente, la membrana se desarrolló con el sistema de detección de Transferencia Western ECL (Amersham Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La película se desarrolló en el procesador de rayos X.
Resultados Los medios acondicionados de los sistemas de expresión recombinantes que comprenden las construcciones 1 y 9; construcciones 1 y 10; y construcciones 11 y 12 se analizaron por análisis SDS-PAGE (en condiciones no reductoras) y transferencia Western (usando un anti-IgG como sonda). La transferencia Western reveló que el producto de los sistemas que comprenden las construcciones 11 y 12 o que comprenden las construcciones 9 y 1 formaron de manera predominante una especie simple de molécula de aproximadamente 150 kDa (FIG. 14, hileras 3 y 2, respectivamente). Ambos de estos productos tienen enlaces de disulfuro internos diseñados entre las cadenas 'más liviana' y 'más pesada' que comprende el diacuerpo. En contraste, la molécula sin los enlaces de disulfuro internos diseñados entre las cadenas 'más liviana' y 'más pesada', formados a partir de las construcciones 10 y 1, formaron por lo menos dos especies moleculares de pesos moleculares -75 y ~100 kDa (FIG. 14, hilera 1).
A pesar de los resultados de la transferencia Western, cada uno de los tres productos se encontró capaz de unirse a ambos CD32A y CD16 (FIG. 15). En forma sorprendente, con relación al producto que comprende un dominio Fe de bisagra de extremo terminal C (formado por las construcciones 11 y 12), el producto de ambos sistemas en donde el dominio Fe (o bisagra -Fe) estaba en el término amino de la cadena de polipéptidos que contiene Fe (es decir, la cadena 'más pesada' chain) (construcciones 9+1 y construcciones 10+1) demostraron afinidad potenciada y/o avidez por uno o ambos de sus péptidos de destino (es decir CD32B y/o CD16). 6.4 EFECTO DEL SITIO DE DISOCIACIÓN INTERNA/EXTERNA SOBRE EL PROCESAMIENTO DEL PRECURSOR DE POLIPROTEÍNAS Y EXPRESIÓN DE DIACUERPO COVALENTE BIESPECÍFICO; DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DE DIACUERPO BIESPECÍ FICO QUE COMPRENDE PORCIONES DE IgG HUMANA DE CADENA LAMBDA Y DOMINIO DE BISAGRA Como se describió en este documento, las cadenas de polipéptidos individuales del diacuerpo o molécula del diacuerpo de la invención puede expresarse como una molécula individual del precursor de poliproteínas. La capacidad de los sistemas recombinantes descritos en los Ejemplos 6,1-6,3 para procesar y expresar apropiadamente un CBD funcional de dicho precursor de poliproteínas se analizó por diseño de un ácido nucleico para codificar, tanto la primera como la segunda cadena de polipéptidos de un CBD separado por un sitio de disociación interno, en particular, un sitio de separación de furina. El CBD funcional se aisló del sistema recombinante que comprende la molécula precursora de poliproteínas.
Como se discute en el Ejemplo 6.3, se encontró que el agregado de los 6 aminoácidos del extremo terminal C de la cadena liviana kappa humana, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23), estabiliza la formulación de diacuerpos— supuestamente a través de la potenciada interacción entre cadenas entre los dominios que comprenden la SEC ID NRO.: 23 y aquellos dominios que comprenden un dominio Fe o un dominio Fc-bisagra. El efecto de estabilización de esta interacción similar a la cadena lambda/Fc se analizó en CBD en donde ninguna cadena de polipéptido comprendía un dominio Fe. Una cadena de polipéptido del diacuerpo se diseñó para comprender SEC ID NRO.: 23 en su extremo terminal C; la cadena de polipéptido socia se diseñó para comprender la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEC ID NRO.: 77), que derivó del dominio de bisagra de un IgG. La comparación de este CBD con el que comprendía las construcciones 1 y 2 (del Ejemplo 6.1) reveló que el CBD que comprende los dominios derivados de dominio de bisagra y cadena lambda exhibieron afinidad levemente superior por uno o ambos de sus epítopes de destino.
Materiales y métodos Construcción y diseño de las moléculas de polipéptido: Precursor de poliproteínas: Los vectores de expresión de ácidos nucleicos se diseñaron para producir 2 poyproteína precursor moléculas, ambos representados esquemáticamente en la FIG. 17. La construcción 13 (SEC ID NRO.: 95) comprendía del extremo terminal N de la cadena de polipéptidos, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2,4G2 (que se une mCD32B), un sitio de separación de furina, el dominio VL de 2,4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótidos construcción de codificación 13 se proporciona en la SEC ID NRO.: 96. La construcción 14 (SEC ID NRO.: 97) (FIG. 17), comprendía del extremo terminal N de la cadena de polipéptidos, el dominio VL de 3G8, el dominio VH de 2,4G2 (que se une a mCD32B), un sitio de separación de furina, un sitio de FMD (Proteasa del Virus de la Enfermedad de Pies y Boca C3), el dominio VL de 2,4G2 y el dominio VH de 3G8. La secuencia de nucleótidos construcción de codificación 14 se proporciona en la SEC ID NRO.: 98.
Los vectores de expresión de ácidos nucleicos se diseñaron para producir versiones modificadas de construcciones 1 y 2 presentada en el Ejemplo 6.1. La construcción 15 (SEC ID NRO.: 99) (FIG,17) fue análoga a la construcción 1 (SEC ID NRO.: 9), presentada en el Ejemplo 6.1, con excepción de que el extremo terminal C de la construcción 15 comprendía la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEC ID NRO.: 23). La secuencia de ácido nucleico construcción de codificación 1 se proporciona en la SEC ID NRO.: 100. La construcción 16 (SEC ID NRO.: 101) (FIG. 17) fue análoga a la construcción 2, presentada en el Ejemplo 6.1, con excepción de que el extremo terminal C de la construcción 16 comprendía la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEC ID NRO.: 77). La secuencia de ácido nucleico construcción de codificaciónló se proporciona en la SEC ID NRO.: 102.
PCR y Construcción del Vector de expresión: Todos los protocolos de PCR y purificación del producto por PCR fueron como se describe en el Ejemplo 6.1 y 6,2 PCR por superposición: Los productos finales se construyeron, se amplificaron y se purificaron con el uso de métodos descritos en el Ejemplo 6.1 y Ejemplo 6.2 con los cebadores apropiados Los productos finales se clonaron en el vector de expresión pCIneo de mamífero(Promega, Inc.) como se describió con anterioridad. Las construcciones de plásmidos de codificación se diseñaron como se identificó en la Tabla 16: Tabla 16. CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDOS Expresión de polipéptido/diacuerpo: Una transfección y una co-transfección en las células HEK-293 con el uso de Lipofectamina 2000, como se describe en la Sección 6,1, se realizaron: simple: pMGX0750, construcción de codificaciónl3; y co-transfección: pMGX0752 y pMGX0753, construcciones de codificación 15 y 16, respectivamente. Luego de tres días en cultivo, se cosechó el medio acondicionado, y producto secretado affinity purified as described.
ELISA: La unión de moléculas de diacuerpo secretadas en el medio se analizó por ELISA sandwich como se describió, supra. Se usó CD32B Murino para recubrir la placa, es decir, como proteína blanco, y CD16 conjugado con HRPA se usó como sonda para el producto de la co-transfección de construcciones 15 y 16. mCD32B se usó como la proteína de destino y CD16A conjugado con biotina se usó como sonda para el sistema recombinante que comprende la construcción 13.
Resultados Los medios acondicionados de los sistemas de expresión recombinantes que comprenden las construcciones 13 se analizó por ELISA sándwich. El ensayo ELISA analizó la unión de CBD para especificidad con cualquiera o ambos de mCD32B y/o CD16 (FIG. 18). CD32B sirvió como el antígeno de destino y CD16A se usó como la sonda secundaria. La señal positiva en el ELISA reveló que el CDB h2,4G2-h3G8 heterodimérico producido del precursor de poliproteínas tenía especificidad por ambos antígenos.
En forma similar, el producto purificado generado por co-transfección de las construcciones de codificación de los vectores 15 y 16 se analizó en un ensayo ELISA y se comparó con el producto formado por las construcciones 1 y 2 (Ejemplo 6.1). CD32B sirvió como el antígeno de destino y CD16A se usó como la sonda secundaria. Como ocurrió con el producto formado por las construcciones 1 y 2, el producto de construcciones 15 y 16 se encontró que es capaz de unirse simultáneamente a CD32B y CD16A. De hecho, el producto de construcciones 15 y 16 mostró afinidad levemente potenciada por uno o ambos de los antígenos de destino, es decir CD32B o CD16A. Esto quizás se debe al aumento en la estabilidad y/o fidelidad (con relación a la interacción del dominio VH-VL tipo salvaje) de la asociación entre cadenas enfrentada por la interacción de región de cadena lambda, FNRGEC (SEC ID NRO.: 23) y región de bisagra VEPKSC (SEC ID NRO.: 77), que está ausente en el producto formado por las construcciones 1 y 2. 6.5 USO DE REACTIVOS DE REORIENTACIÓN DE AFINIDAD DUAL ("DARTs") PARA LIGAR MÚLTIPLES AFINIDADES ENTRE SÍ Un aspecto de la presente invención se refiere a nuevos reactivos de reorientación de afinidad dual ("DARTs") así como también nuevos modos de ligar entre sí múltiples afinidades. Los "DARTS" pueden ser monoespecíficos, biespecífico, triespecíficos, etc., de este modo siendo capaz de unirse en forma simultánea a uno, dos, tres o más epítopes (que pueden ser de iguales o diferentes antígenos). Los "DARTS" pueden en forma adicional ser monovalentes, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes, hexavalentes, etc., siendo capaces de este modo de unirse a una, dos, tres, four, cinco, seis o más moléculas. Como se muestra en la Figura 35, estos dos atributos de DARTS pueden combinarse, por ejemplo para producir anticuerpos biespecíficos que son tetravalentes, etc.
Un avance es el desarrollo de un DART que tiene afinidad por un receptor inmunológico prototípico, huCD32B, así como también afinidad por un hapteno, fluoresceína. Este DART, denominado "2B6/4420," sirve como adaptador universal, capaz de co-ligarse a huCD32B con moléculas que interactúan con conjugado con pares de unión a fluoresceína. CD32B es un receptor de Fe que tiene la capacidad de desactivar señales en virtud de la formación de familia génica con complejos inmunes de señalización por activación En su implementación inicial, esta tecnología permite la rápida selección de varios blancos biológicos para agrupar con huCD32B sin la necesidad de generar nuevas construcciones DART construcciones. El 2B6/4420 puede simplemente mezclarse con anticuerpo fluoresceinado contra un receptor de la superficie celular y por lo tanto imitar la de un DART con afinidad por ese receptor (FIG. 20). Además, este reactivo permite la unión de reactivos por afinidad que no se expresan o se producen fácilmente, permitiendo que uno supre las limitaciones técnicas. Los DART que contienen 2B6/4420 son claramente útiles como herramientas de investigación y también como candidatos clínicos. 2B6/4420 producido a partir de células HEK293 puede unirse en forma simultánea a CD32B y fluoresceína en un ensayo ELISA. En forma adicional, puede inhibir la proliferación celular al reclutar CD32B al complejo BCR por medio de co-ligación con CD79. La rama 2B6 del DART puede reemplazarse con un a secuencia de anticuerpo diferente o una secuencia de unión que tiene otra especificidad relevante.
Materiales y métodos: Construcciones de plásmidos'. 2B6/4420 deriva de secuencias de 2B6 MAb humanizado (hu2B6, MGA321) y una versión de Fe humano/Fv de ratón quimérico del MAb anti-fiuoresceína, 4420. El DART completamente armado consiste en dos polipéptidos, lo que produce ligadura covalente de dos regiones de Fv. El primer polipéptido consiste en una secuencia de señal de secreción de hu2B6VL producido como una proteína de fusión con 4420VH separado por una ligadura que consiste en los residuos de aminoácidos GGGSGGGG. La secuencia FNRGEC, derivada del extremo terminal C de la cadena liviana kappa, se anexa al extremo terminal C de este polipéptido. El otro polipéptido consiste en la secuencia de señal -4420VL-GGGSGGGG-hu2B6VH, con la secuencia VEPKSC, derivada del fragmento Fd del extremo terminal C de la IgGl humana, anexado al extremo terminal C. Las cisternas en las dos cadenas forman una unión de disulfuro, que une en forma covalente los dos polipéptidos juntos (FIG. 20). Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos descritos se amplificaron por PCR a partir de plásmidos existentes, combinados por PCR por superposición y clonados en pCIneo (Promega) entre los sitios Nhe I y EcoR I. Finalmente, un DART con afinidad por huCD32B y huCD16 (2B6/3G8) que se ha construido previamente con el uso de métodos similares a los que se describió con anterioridad, se usó como control.
Anticuerpos: Los anticuerpos monoclonales de murino anti-humanos CD79b, CB3.1 y CB3.2 (hibridomas) se obtuvieron de Dr. Cooper MD, University of Alabama en Birmingham, Birmingham AL. CB3.1 y CB3.2 se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) siguiendo las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford IL). El fragmento F(ab')2 de un IgG (GAM) anti-ratón de cabra, específica del fragmento Fe, (GAM) se obtuvo de Jackson Laboratories (West Grove, PA). El MAb Anti-huCD32B de ratón, 3H7, se produjo y se purificó en el laboratorio. El anti-2B6Fv de cabra fue producido por inmunización de cabras con anticuerpo completo hu2B6 y purificación por afinidad contra la región Fv de hu2B6. Las IgG HuIgG, FITC-huIgG, y HRP-anti-ratón se obtuvieron de Jackson Immunoresearch. La HRP-anti-cabra se obtuvo de Southern Biotech.
Expresión de DART Los plásmidos que codifican cada cadena se co-transfectaron en células 293H (Invitrogen) con el uso de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína secretada se cosechó 3-4 en intervalos de 3 días y se purificó por cromatografía líquida contra una forma soluble inmovilizada de CD32B.
ELISA-, los DARTs 2B6/4420 o 2B6/3G8 se captuaron en placas MaxiSorp plates (Nalge Nunc) recubiertas con proteína S marcada con FITC (Novagen), IgG humana, o FITC-huIgG. La detección procedió por unión de un ectodominio CD32B soluble, seguido de 3H7 (un anticuerpo monoclonal de ratón específica para CD32B), y finalmente anti-ratón-HRP. En forma alternativa, la detección se realizó por recubrimiento de antisuero purificado por afinidad policlonal Fv anti-2B6 de cabra seguido de anti-cabra-HRP. La actividad de HRP se detectó con el uso de un sustrato colorimétrico de TMB (BioFX) y se leyó sobre un lector de placas VersaMax para ELISA.
Ensayo de Purificación y Proliferación de Células B: Se separaron células mononuclearse de sangre periférica por un método gradiente Ficoll/Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, UK) con el uso de sangre de donantes sanos. Se aislaron linfocitos B con el uso del Dynal B Cell Negative Isolation Kit (Dynal Biotechnology Inc., NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las células B aisladas (CD20+) fue de más del 90% según se estimó por análisis FACS. Para el ensayo de proliferación, las células B purificadas se sembraron en medio RPMI 1640 completo en placas de microtitulación de 96 pocilios de base plana a una densidad celular de lxl 05 células por pocilio en un volumen final de 200 µ? y se incubaron durante 48 hrs en presencia o ausencia de los anticuerpos y diacuerpos a 37°C en 5% C02. 1 µ^ ?a??? de [3H]timidina (Perkin Elmer, Wellesley, MA) se agregó luego y la incubación continuó durante un adicional de 16-18h antes de cosechar. La incorporación de [ HJtimidina se midió por recuento de centelleo líquido.
Resultadoss Con el fin de demostrar que 2B6/4420 DART era activo y específico, se condujeron dos experimentos ELISA. Primero, 2B6/4420 o 2B6/3G8 (como control negativo) se unió a una proteína conjugada con fluoresceína (proteína S) que se había recubierto sobre placas de ELISA. A continuación, la rama de 2B6 del DART se complementó con CD32B soluble. La unión se detectó con otro anticuerpo a CD32B con un epítope que no superpone el de 2B6 seguido de un anticuerpo secundario conjugado con HRP. Mientras que 2B6/4420 DART es capaz de unirse simultáneamente a fluoresceína y CD32B, 2B6/3G8 no lo es (FIG 21, Panel A). Cuando los DARTs se capturan en placas recubiertas con CD32B soluble y se detecta la unión por un anticuerpo específico para hu2B6 Fv, ambos DARTS muestran buena unión. Para demostrar que el DART 2B6/4420 era capaz de unirse a la fluoresceína conjugada con IgG humana (dado que este es el contexto de la implementación inicial de este reactivo), HuIgG, no marcado o marcado con fluoresceína, se unió a placas de ELISA y se usó para capturar 2B6/4420. Nuevamente, 2B6/3G8 se usó como control negativo. Se detectó la unión con el uso de un anticuerpo específico para Hu2B6 Fv. El DART 2B6/4420 claramente se une a FITC-HuIgG, pero no se une a HuIgG no marcado, lo que demuestra que este DART es capaz de unirse a la fluoresceína conjugada con un anticuerpo y que no hay unión significativa al anticuerpo solo. Como se esperó, no se detectó unión por DART 2B6/3G8 en cualquiera de los contextos.
Los experimentos se condujeron para demostrar que el DART 2B6/4420 era capaz de funcionar como reactivo de afinidad dual que podría tener un efecto sobre la señalización en el contexto de un ensayo basado en células. La co-agregación de CD32B con con el BCR ha demostrado que inhibe la activación de células B. Se exploró la capacidad de el DART 2B6/4420 para co-encastrar CD32B con el BCR recubierto con aCD79b anticuerpos marcados con fluoresceína y desencadenar la inhibición de proliferación celular. Las células B se seleccionaron negativamente de sangre humana y se activa a través del tratamiento con concentraciones crecientes de anti-human-CD79b FITC-marcado de ratón, clones CB3.1 y CB3.2, y por el agregado de un fragmento F(ab')2 de un GAM específico de Fe GAM como reactivo secundario para entrecruzar el BCR, junto con una concentración fija (5 µ¾/???) de 2B6/4420 DART o una cantidad equivalente de 2B6/3G8 DART, una molécula que no apunta a la fluoresceína, usada de este modo como control. La proliferación celular, medida como incorporación de [3H]-timidina, aumentada con concentraciones crecientes del activador monoclonal anti-CD79b-FITC en ausencia de DARTS o en la presencia del DART de control 2B6/3G8. La presencia de DART 2B6/4420 condujo a una reducción profunda en la proliferación de células B en todas las concentraciones de CD79b-FITC anti-humano (FIG 22, Paneles A y B and FIG. 23, Panel A) .
La inhibición de la proliferación no se observó cuando las células B recubiertas con CB3.2 no marcado y activadas con el uso de las mismas condiciones experimentales se trataron con 2B6/4420 DART que demuestra su especificidad de destino (FIG. 23, Panel B) . Estos datos demuestran que el DART 2B6/4420 es capaz de entrecruzarse con CD32B y el BCR y administrar una señal inhibidora capaz de bloquear la activación celular inducida por el receptor antigénico. 6.6 DART INMUNOTERAPÉUTICO CONTRA CD32B QUE EXPRESA ENFERMEDADES DE LAS CÉLULAS B En forma concurrente, las enfermedades de células B se tratan con el uso de anticuerpo anti-CD20Rituxan®. Algunas enfermedades de las células B, sin embargo no expresan CD20 o se tornan resistentes a Rituxan. Los DARTs de la presente invención proveen un agente inmunoterapéutico alternativo capaz de superar los problemas asociados con anticuerpo anti-CD20Rituxan®.
MGD261 es una molécula de redireccionamiento de afinidad dual (DART) que se une a hCD32B (a través del anticuerpo h2B6) y hCD16A y hCD16B (a través del anticuerpo h3G8).
La eficacia (depleción de células B) y seguridad de MGD261 se analizó en mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/- hCD32B+ C57B1/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6. En este experimento de dosis reiteradas, se administró a los ratones 6 inyecciones IV (dos veces por semana durante 3 semanas). La depleción de células B se monitoreó por FACS. La seguridad se monitoreó por observación junto a la jaula.
Los datos indican que MGD261 es capaz de eliminar células B en ratones doble transgénicos sin inducir ningún efecto colateral significativo.
Datos: Los ratones mCD32-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD32-/- hCD32B+ C57B1/6 y mCD32-/- hCD16A+ hCD32B+ C57B1/6 de la colonia de reproducción MacroGenics recibieron dosis IV en los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17 con MGD261 (10, 3, 1 o 0,3 mg/kg), o un anticuerpo irrelevante (hE16 10mg kg). Se tomaron muestras de sangre en los días -19 (antes del sangrado), 4, 11, 18, 25 y 32 para análisis de FACS. Se registró la salud y la actividad del animal tres veces por semana.
Diseño: Método de análisis FACS: Se recolectaron muestras de sangre completa a los 18 días antes de la administración de h2B6-h3G8 y 4, 11, 18, 25 y 32 días después del tratamiento. Las muestras de sangre se analizaron para determinar el efecto de h2B6-h3G8 sobre los recuentos de células B por un ensayo basado en FACS. Se usó un protocolo sin lavar se usó para recuento de células B, células T y pMN por medio del uso de perlas FlowCount, obtenidas de Beckman Coulter. El panel de los anticuerpos usados en el análisis fue 1A8-FITC para PMN, CD3-PE para células T, CD19-APC para células B y CD45-PerCP para leucocitos totales.
Resultados Los ratones tratados con hE16 o MGD261 (a cualquier concentración) no mostraron ningún signo de malestar en ningún momento durante el tiempo que duró la experimentación.
Se observó depleción de células B en ratones doble transgénicos hCDlóA y hCD32B. El diacuerpo h2B6-3G8 se une a células efectoras que expresan hCDlóA y hCD32B que expresa células B; los encastres se requirieron para la matanza de células B. La depleción de células B no se observó en ratones transgénicos simples (FIG. 24). No hubo cambios significativos para el nivel de células T y pMN durante el estudio.
Como se demostró en forma adicional en los inmunoterapéuticos alternativos de la presente invención, un sustituto de MGD261, llamado "2,4G2-3G8 DB," se construyó. 2,4G2-3G8 DB es una molécula de redireccionamiento de afinidad dual (DART) que se une a mCD32B (a través del anticuerpo 2,4G2) y hCDlóA y hCD16B (a través del anticuerpo h3G8).
La eficacia (depleción de células B) y seguridad de 2,4G2-3G8 DB se analizó en ratones mCD16-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/- hCD16B+ y mCDló-/-hCD16A+ hCD16B+. En este experimento de dosis repetida, los ratones recibieron 9 inyecciones IP (tres veces por semana durante 3 semanas). La depleción de células B se monitoreó por FACS. La seguridad se monitoreó por observación junto a la jaula.
Los datos indican que 2,4G2-3G8 DB es capaz de eliminar células B en ratones transgénicos hCDló sin inducir ningún efecto colateral significativo.
Dato: Los ratones mCDló-/-, mCD16-/- hCD16A+ C57B1/6, mCD16-/-hCD16B+ y mCDló-/- hCD16A+ hCD16B+ de la colonia de reproducción MacroGenics se inyectaron IP en los días 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16 y 18 con 2,4G2-3G8 DB (75ug/ratón), o PBS. Se tomaron muestras de sangre en los días -10 (antes del sangrado), 4, 11 y 18 para análisis de FACS. Se registró la salud y la actividad del animal tres veces por semana.
Método de análisis FACS: Se recolectaron muestras de sangre completa 10 días antes de la administración de 2,4G2-3G8 y 4, 11 y 18 días después del inicio del tratamiento. Las muestras de sangre se analizaron para determinar el efecto de 2,4G2-3G8 sobre los recuentos de células B por un ensayo basado en FACS. Se usó un protocolo sin lavar se usó para recuento de células B, células T y pMN por medio del uso de tubos TruCOU T, obtenidos de BD Immunocytometry System. El panel de los anticuerpos usados en el análisis fue 1A8-FITC para PMN, CD3-PE para células T, CD19-APC para células B y CD45-PerCP para leucocitos totales.
Resultados Los ratones tratados con hE16 o 2,4G2-3G8 DB no mostraron ningún signo de malestar en ningún momento mientras duró la experimentación.
La depleción de células B se observando en mCD16-/- hCD16A+ o mCD16-/-hCD16A+ hCD16B+ pero no en ratones mCD16-/-. Estos datos indican que las células efectoras que llevan hCDlóA se requirieron para la matanza de células B (FIG. 25). No hubo cambios significativos para el nivel de células células T y pMN durante el estudio.
Modelo Intravenoso (IV): La actividad anti-tumoral de MGD261 se analizó con el uso de un modelo intravenoso (IV) de la línea celular RAJI de tumor humano. Raji es una línea celular de linfoma de Burkitt humano que expresa hCD32B. Cuando se inyecta por vía intravenosa en ratones mCD16-/-, hCD16A+, RAGl-/-, las células tumorales se ubcan en la médula y producen parálisis de la pata trasera.
Los datos indican que MGD261 es capaz de bloquear el crecimiento de células tumorales Raji in vivo en ratones mCDló-/-, hCD16A+, RAGl-/-. Los datos indican que MGD261 puede usarse en el tratamiento de CD32B expressing enfermedades de las células B en el humano.
Datos: Ratones mCDló-/-, hCD16A+, RAGl-/- C57B1/6 de doce- veinte semanas de vida de la colonia de reproducción MacroGenics se inyectaron IV el día 0 con 5x106 células Raji. En los días 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27 y 30 los ratones también recibieron tratamiento por vía intraperitoneana (IP) con 250, 25 o 2,5ug MGD261 o con PBS (control negativo). Los ratones se observaron todos los días y el peso del cuerpo se registró dos veces por semana. Los ratones que desarrollaron parálisis de las patas posteriores se sacrificaron.
Resultados: Los ratones tratados con PBS murieron entre el día 25 y el día 50. Los ratones tratados con con MGD261 sobrevivieron por lo menos hasta el día 90 (FIG. 26). El aumento de la supervivencia es estadísticamente significativo. Una comparación de las curvas de suprvi vencía con el uso de un Test de Logrank dio u ?2 of 96,46 (df 9; valor P < 0,0001). 6.7 EXPRESIÓN DE DART EN PROCARIOTAS Se condujeron experimentos para demostrar la capacidad para producir DARTs en huéspedes no mamíferos. De acuerdo con lo anterior, la Escherichia coli se transformó con un plásmido que expresa DART, y la expresión de DART se monitoreó.
Materiales y métodos: Construcción de plásmidos: 3G8 es un anticuerpo humanizado monoclonal contra HuCD16. El DART descrito aquí consiste en dos cadena ligadas en forma covalente, cada una de las cuales tiene un VL seguido de un separador, luego un VH seguido de un Cys en un buen contexto para formar una unión de disulfuro a la cadena opuesta. La secuencia DART que codifica 3G8VL-GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly (SEC ID NRO.: 10)-3G8VH-LeuGlyGlyCys se amplificó por PCR a partir de una construcción eucariótica existente y se digirió con Neo I y EcoR I. El vector de destino fue pET25b (+) (Novagen), que contiene una secuencia líder pelB para secreción en E. coli. Antes de la inserción of las secuencias DART 3G8/3G8, el vector se modificó como sigue: Primero, el promotor T7 se reemplazó por el promotor de menor actividad lac con el fin de favorecer la expresión soluble, aunque de nivel inferior de las proteínas bajo su control. En forma adicional, se introdujeron dos mutaciones puntuales para eliminar dos internal codones Met presentes en el comienzo del sitio de clonación múltiple (MCS) con el fin de favorecer el inicio del Met presente en el comienzo del pelB líder. El DART que se produce por esta construcción consiste en dos ramas de la región V que tienen la misma especificidad, es decir HuCDló.
Expresión'. Células BL21DE3 (Novagen) se transformaron con el plásmido pET25b(+) T7-lac+ 3G8/3G8 de una colonia resistente a amp se usó para sembrar el cutivo del caldo. Cuando el cultivo alcanzó 0,5 OD600 unidades, 0,5mM IPTG se agregó para inducir la expresión. El cultivo se desarrolló a 30°C durante 2 horas y se recolectó el medio libre de células.
Purificación: El DART 3G8/3G8 se purificó en un proceso de dos pasos utilizando cromatografía por exclusión de tamaño y afinidad. El DART se capturó del medio acondicionado con el uso de cromatografía por afinidad. Específicamente, CD16A acoplado a Sepharose 4B activada con CNBr (GE Healthcare). La resina CD16A-Sepharose se equilibró en 20 mM Tris/HCl, pH 8,0 antes de cargar. Luego de la compleción de la carga, la resina se lavó con buffer de equilibrio antes de la elución del DART unido con 50 mM Glicina pH 3,0. El DART eluyente se neutralizó inmediatamente con 1M Tris/HCl pH 8,0 y se concentró con el uso de un concentrador del tipo centrifugado (Vivaspin 20, 10k MWCO PES, VivaScience Inc.). El DART concentrado se purificó en forma adicional por cromatografía por exlcusión de tamaño con el uso de una columna Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada en PBS.
Resultados 1,7 litros de medio acondicionado cultivado de E coli se procesó a través de la columna CD16A. El rendimiento de DART fue 0,12 mg. El análisis del DART purificado por SDS-PAGE y SEC demostró comparabilidad con el DART de control expresado en células de mamíferos (CHO) (FIG. 27).
ELISA de unión de DART h3G8-h3G8 exprsado en E.colii La expresión de DART h3G8-h3G8 en E.coli se midió con el uso de an ELISA. 50 µ?/pocillo de 2 g/ml de anticuerpo anti-h3G8 específico de Fv 2C11 se recubrió en placa Maxisorp de 96 pocilios en buffer de carbonato a 4°C hasta la mañana siguiente. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, 0,1% Tween 20) y luego se bloqueó por 0,5% BSA en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de agregar DART de prueba. Durante el bloqueo, E.coli expresó DART h3G8-h3G8, DART h2B6-h3G8, y DART h2B6-h2B6 (control negativo) diluidos en 1 µg/ml, y 0,3 µg/ml en PBST/BSA. 50 µ?/pocillo de DARTs diluidos se agregaron a cada pocilio. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, 50 µ?/pocillo de 0,1 ^??? de fusión sCD16-Fc biotinilada se agregó a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, 50 µ?/pocillo de una dilución 1 :5000 de Estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) se usó para detección y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con el uso de 80 ul/pocillo de sustrato de TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se interrumpió por 40 µ?/pocillo de 1% H2SO4. El OD450 nm se leyó por medio del uso de un lector de placas de 96 pocilios y software SOFT max. La lectura obtenida se gráfico con el uso de software GraphPadPrism 3.03 (FIG. 28). 6.8 MUERTE DE CÉLULAS B HUMANAS INDUCIDAS POR DART Se incubaron PBMC humanas durante la noche con: CD16-CD32B - hu3G8-hu2b6 (se describió con anterioridad); ch2B6-aglyc - anticuerpo aglicosilado quimérico 2B6 (descrito en la Solicitud de Patente de EE UU con Nro. de Serie presentada junto con esta 11/108,135, publicada como US2005/0260213, incorporada en este documento a modo de referencia) y CD16-CD79. El ADN y las secuencias de proteína codificadas de CD16-CD79 son como sigue: H3G8VL-CB3.1VH Secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 226): gacatcgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga 50 gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100 atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150 ctcatctata ctacatccaa tctagaatct ggggtcccag acaggtttag 200 tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg 250 ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggagg 350 cggaggccag gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg 400 gggcttcagt gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc 450 tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacaaggcc ttgaatggat 500 tggtatggtt gatccttcag acagtgaaac tcactacaat caaatgttca 550 aggacaaggc cacattgact gttgacaaat cctccagcac agcctacatg 600 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag 650 agctatgggc tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcagttg 700 agcccaaatc ttgt 714 Secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 227): DIV TQSPDS LAVSLGERAT INC ASQSVD FDGDSFMN Y QQKPGQPPKL 50 LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQQSNEDPY 100 TFGQGTKLEI KGGGSGGGGQ VQLQQPGAEL VRPGASVKLS CKASGYTFTS 150 YWMNWVKQRP GQGLEWIGMV DPSDSETHYN QMFKDKATLT VDKSSSTAYM 200 QLSSLTSEDS AVYYCARAMG YWGQGTSVTV SSVEPKSC 238 CB3.1VL-h3G8VH Secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 228): gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc caggttaccc tgagagagtc tggccctgcg ctggtgaagc 400 ccacacagac cctcacactg acttgtacct tctctgggtt ttcactgagc 450 acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt cagcctcccg ggaaggctct 500 agagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgacaagcgc tataatccag 550 ccctgaagag ccgactgaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggta 600 gtcctcacaa tgaccaacat ggaccctgtg gatactgcca catactactg 650 tgctcaaata aaccccgcct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg 700 tcactgtgag ctcattcaac aggggagagt gt 732 Secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 229): DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS 150 TSGMGVGWIR QPPGKALEWL AHI WDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSKNQV 200 VLTMTNMDPV DTATYYCAQI NPAWFAYWGQ GTLVTVSSFN RGEC 244 Se analizó la apoptosis por análisis FACS como porcentaje de población de PI+Annexin-V+ de células B (Células CD20+) sobre el total de la población FSC/SSC sin compuertas (FIG. 29). 6.9 DART 8B5-CB3.1 8B5VL-CB3.1VH-VEPKSC 8B5VL se amplificó por medio del uso de H9 y Lgh630R como cebadores, ch8B5Lc como patrón. CB3.1VH se amplificó por medio del uso de lgh628F y Lgh629R como cebadores, ch8B5Hc como patrón. La secuencia de ligadura se incorporó en los cebadores lgh630R y Lgh628F. La ligadura del extremo terminal C y el codón de detención se incorporó en cebador lgh629R. Los productos de PCR se purificaron con gel y se mezclaron juntos en igual proporción, luego se amplificaron por medio del uso de H9 y Lgh629R como cebadores. El producto de PCR superpuesto se digirió luego con Nhel/EcoRI endonucleasas de restricción, y se clonó en el vector pCIneo.
CB3.1VL-8B5VH-FNRGEC CB3.1VL se amplificó por medio del uso de H9 y Lgh630R, que compartió la misma secuencia que 8B5VL en FR4, como cebadores, y chCB3.1Lc como patrón. 8B5VH se amplificó por medio del uso de lgh631F y Lgh640R como cebadores, y ch8B5Hc como patrón. La secuencia de ligadura se incorporó en los cebadores lgh630R y Lgh631F. La ligadura del extremo terminal C y el codón de detención se incorporó en el cebador lgh640R. Los productos de PCR se purificaron con gel y se mezclaron juntos en igual proporción, luego se amplificaron por medio del uso de H9 y Lgh640R como cebadores. El producto de PCR superpuesto se digirió luego con Nhel/EcoRI endonucleasas de restricción, y se clonó en el vector pCIneo.
Marca Anti-Flag -8B5VL-CB3.1VH- VEPKSC La arca Anti-Flag se insertó entre la secuencia de señal y 8B5VL por PCR por superposición. La secuencia de señal y la marca Flag se amplificó por medio del uso de H9 y Lgh647R como cebadores y ch8B5Lc como patrón. 8B5VL-CB3.1VH- VEPKSC se re-amplificó por medio del uso de lgh647F y Lgh629R como cebadores y 8B5VL-CB3.1VH- VEPKSC como patrón. Los productos de PCR se purificaron con gel y se mezclaron juntos en igual proporción, luego se amplificaron por medio del uso de H9 y Lgh629R como cebadores. El producto de PCR superpuesto se digirió luego con Nhel/EcoRI endonucleasas de restricción, y se clonó en el vector pCIneo. 8B5VL-CB3.1VH-LGGC Para generar una ligadura diferente de extremo terminal C en la construcción 8B5VL-CB3.1VH -VEPKSC, la construcción se re-amplificó por medio del uso de H9 y Lgh646R como cebadores. La ligadura de extremo terminal C LGGC se integró en el cebador lgh646R. El producto por PCR se digirió luego con Nhel/EcoRI endonucleasas de restricción, y se clonó en el vector pCIneo.
CB3.1VL-8B5VH-LGGC La misma estrategia se usó para crear CB3.1VL-8B5VH-LGGC. La ligadura de extremo terminal C LGGC se integró en cebado lgh648R y CB3.1 VL-8B5VH-FNRGEC se usó como patrón. El producto por PCR se digirió luego con Nhel/EcoRI endonucleasas de restricción, y se clonó en el vector pCIneo.
Marca Anti-Flag -8B5 VL-CB3.1 VH-LGGC La misma estrategia se usó también para crear Marca Anti-Flag -8B5VL-CB3.1 VH-LGGC. La ligadura de extremo terminal C LGGC se integró en cebador lgh648R y la Marca Anti-Flag -8B5VL-CB3.1VH- VEPKSC se usó como patrón. El producto por PCR se digirió luego con Nhel/EcoRI endonucleasas de restricción, y se clonó en el vector pCIneo. 8B5-CB3.1-VEPKSC Secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 230): gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50 aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagttgag cccaaatctt 700 gt 702 8B5-CB3.1-VEPKSC Secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 231): DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50 ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100 GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVKQRPGQGL EWIGMVDPSD SETHYNQMFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200 LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSVE PKSC 234 CB3.1-8B5-FNRGEC Secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 232): gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgtt caacagggga gagtgt 726 CB3.1-8B5-FNRGEC Secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 233): DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLN LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150 DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200 VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSFNRG EC 242 8B5VL-CB3.1VH-LGGC 8B5VL se amplificó por medio del uso de H9 y Lgh694R como cebadores, ch8B5Lc como patrón. 8B5VH se amplificó por medio del uso de lgh695F y Lgh696R como cebadores, ch8B5Hc como patrón. La secuencia de ligadura se incorporó en los cebadores lgh694R y Lgh695F. HuIgGlFc se amplificó por medio del uso de lgh355F y Lgh366R como cebadores, ch8B5Hc como patrón. Los productos de PCR se purificaron con gel y se mezclaron juntos en igual proporción, luego se amplificaron por medio del uso de H9 y Lgh366R como cebadores. El producto de PCR superpuesto se digirió luego con Nhel/EcoRI endonucleasas de restricción, y se clonó en el vector pCIneo. 8B5VL-CB3.1VH-LGGC Secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 234): gacattcaga tgacacagtc tccatcctcc ctacttgcgg cgctgggaga 50 aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggcttca gcagaaacca gatggaacta ttaaacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggtcagat tattctctca ccatcagcag tcttgagtct gaagattttg 250 cagactatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 ccaactgcag cagcctgggg ctgagctggt gaggcctggg gcttcagtga 400 agctgtcctg caaggcttct ggctacacct tcaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgaagc agaggcctgg acaaggcctt gaatggattg gtatggttga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacaaggcca 550 cattgactgt tgacaaatcc tccagcacag cctacatgca gctcagcagc 600 ctgacatctg aggactctgc ggtctattac tgtgcaagag ctatgggcta 650 ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 8B5VL-CB3.1VH-LGGC Secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 235): DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA 50 ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA 100 GTKLELKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVKQRPGQGL E IGMVDPSD SETHYNQMF DKATLTVDKS SSTAYMQLSS 200 LTSEDSAVYY CARAMGYWGQ GTSVTVSSLG GC 232 CB3.1-8B5-LGGC Secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 236): gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta acattggaca 50 accagcctcc atctcttgta agtcaagtca gagcctctta gatactgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaac 150 cgcctaatct atctggtgtc taaactggac tctggagtcc ctgacaggtt 200 cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc agcagagtgg 250 aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 CB3.1-8B5-LGGC Secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 237): DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS ISCKSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFTGS GSGTDFTL I SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP 100 .
LTFGAGTKLE LKGGGSGGGG EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS 150 DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS 200 VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA LGLDYWGQGT TLTVSSLGGC 240 Cebadores: Lgh628F (SEC ID NRO.: 238): ggaggcggat ccggaggcgg aggccaggtc caactgcagc agcctgg 47 Lgh629R (SEC ID NRO.: 239): tttgaattct aacaagattt gggctcaact gaggagacgg tgactgagg 49 Lgh630R (SEC ID NRO.: 240): gcctccgcct ccggatccgc ctcctttcag ctccagcttg gtccc 45 Lgh631F (SEC ID NRO.: 241): ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg aagcttgagg agtctgg 47 Lgh640R (SEC ID NRO.: 242): tttgaattct aacactctcc cctgttgaac gaggagactg tgagagtgg 49 Lgh644R (SEC ID NRO.: 243): tttgtcgtca tcatcgtctt tgtagtcgga gtggacacct gtggagag 48 Lgh646R (SEC ID NRO.: 244): tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgactg ag 42 Lgh647F (SEC ID NRO.: 245): caaagacgat gatgacgaca aagacattca gatgacacag tctcc 45 Lgh648R (SEC ID NRO.: 246): tttgaattct agcagcctcc cagcgaggag actgtgagag tgg 43 Expresión: La construcción 5 y 6, o 6 y 7, o 8 y 9, o 9 y 10, que codificó los plásmidos de expresión (FIG. 30) se co-transfectaron en células HEK-293 para expresar 8B5-CB3.1 DART con o sin marca anti bandera con el uso de Lipofectamina 2000 (Invitrogen). El medio acondicionado se cosechó en cada tres días durante tres veces. El medio acondicionado se purificó a continuación con el uso de columna por afinidad CD32B.
ELISA: Los ELISA se condujeron de la siguiente manera: 50 µ?/pocillo de 2 ug/ml de CD32B-Fc se recubrió en placa Maxisorp de 96 pocilios en buffer de carbonato a 4°C hasta la mañana siguiente. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, 0,1% Tween 20) y luego se bloqueó por 0,5% BSA en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes agregar proteína de fusión Fe de cadena simple de prueba. Durante el bloqueo, 8B5-CB3.1 DART se diluyó en una dilución serial de dos partes comenzando con 2 µg/ml. 25 µ?/pocillo de DART diluido mezclado con 25 µ?/pocillo de 50 ng/ml ch8B5 se transfirió de la placa de dilución a la placa de ELISA. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, 50 µ?/pocillo de 1 :10.000 F(ab')2 de cabra anti humano IgG F(ab')2 diluido conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) se agregó a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 µ?/pocillo de sustrato de TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se interrumpió por 40 µ?/pocillo de 1% H2S04. El OD450 nm se leyó con el uso de un lector de placas de 96 pocilios y software SOFT max. La lectura obtenida se gráfico con el uso de software GraphPadPrism 3.03 (FIG. 31). 6.10 DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DE DART TETRAVALENTE CON ESTRUCTURA DE Ig Cuatro cadenas de potipéptidos se emplearon para producir una especie de DART con estructura de Ig que tiene sitios de unión al antígeno tetravalentes (Figura 32; Figura 33). La especie DART con estructura de Ig tiene propiedades únicas, ya que sus dominios pueden diseñarse para unirse al mismo epítope (para formar a DART con estructura Ig específicos, mono epítope, tetravalentes capaces de unir cuatro moléculas de antígeno idénticas), o a antígenos o epítopes diferentes Por ejemplo, sus dominios pueden diseñarse para unirse a dos epí topes del mismo antígeno (con el objetivo de formar un DART con estructura de Ig específico bi-epítope, específico mono-antígeno, tetravalente), o a epítopes de diferentes moléculas de antígeno con el objetivo de formar un DART tetravalente con estructura de Ig que tiene un par de sitios de unión específicos para un primer antígeno y un segundo par of sitios de unión específicos para un segundo antígeno). Las moléculas híbridas que tienen combinaciones de dichos atributos pueden producirse fácilmente.
Para ilustrar las características de dicha especie DART con estructura de Ig, una especie DART con estructura de Ig ejemplificativa tetravalente se produjo que tiene un par de sitios de unión específicos para CD32 y un segundo de sitios de unión específicos de CD16A. Esta especie DART con estructura de Ig se produjo con el uso de las siguientes cuatro cadenas de polipéptidos: 2,4G2-3G8-hKappa Secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 247): gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga 50 aagtgtttcc atcaattgca aggcaagtga gagcattagc aagtatttag 100 cctggtatct acagaaacct gggaaagcaa ataagcttct tatgtacgat 150 gggtcaactt tgcaatctgg aattccatcg aggttcagtg gcagtggatc 200 tggtacagat ttcactctca ccatcagaag cctggagcct gaagattttg 250 gactctatta ctgtcaacag cattatgaat atccagccac gttcggttct 300 gggaccaagc tggagatcaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 taccctgaaa gagtctggcc ctgggatatt gcagccctcc cagaccctca 400 gtctgacttg ttctttctct gggttttcac tgaggacttc tggtatgggt 450 gtaggctgga ttcgtcagcc ttcagggaag ggtctagagt ggctggcaca 500 catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac 550 tgacaatctc caaggatacc tccagcaacc aggtattcct caaaatcgcc 600 agtgtggaca ctgcagatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc 650 cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctcac 700 tgggaggctg cggcggaggg agccgtacgg tggctgcacc atcggtcttc 750 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt 800 gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg 850 tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 900 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa 950 agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1000 gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 1044 2,4G2-3G8-hKappa Secuencia de aminoácidos codificada (SEC ID NRO.: 248): DVQMTQSPSN LAASPGESVS INCKASESIS KYLAWYLQKP GKANKLLMYD 50 GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTIRSLEP EDFGLYYCQQ HYEYPATFGS 100 GTKLEIKGGG SGGGGQVTLK ESGPGILQPS QTLSLTCSFS GFSLRTSGMG 150 VG IRQPSGK GLEWLAHIWW DDDKRYNPAL KSRLTISKDT SSNQVFLKIA 200 SVDTADTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSLGGCGGG SRTVAAPSVF 250 IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ 300 DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 350 3G8-2,4G2-hGl Secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 249): gacactgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca 50 gagggccacc atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tttgatggtg 100 atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc 150 ctcatctata ctacatccaa tctagaatct gggatcccag ccaggtttag 200 tgccagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg 250 aggaggatac tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggaggcg gatccggagg 350 cggaggcgag gtggagctag tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg 400 gaaggtccct gaaactctcg tgtgcagcct caggattcac tttcagtgac 450 tattacatgg cctgggtccg gcaggctcca acgacgggtc tggagtgggt 500 cgcatccatt agttatgatg gtggtgacac tcactatcga gactccgtga 550 agggccgatt tactatttcc agagataatg caaaaagcag cctatacctg 600 caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtgcaac 650 agagactacg ggaataccta caggtgttat ggatgcctgg ggtcaaggag 700 tttcagtcac tgtctcctca ctgggaggct gcggcggagg gagcgcctcc 750 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc 800 tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac 850 cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 900 ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 950 gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 1000 atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 1050 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg 1100 gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 1150 tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1200 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1250 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 1300 tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1350 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 1400 ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 1450 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1500 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1550 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct 1600 ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1650 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1700 cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1734 3G8-2,4G2-hGl Secuencia de aminoácidos codificada (SEC ID NRO.: 250): DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 50 LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY 100 TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VELVESGGGL VQPGRSLKLS CAASGFTFSD 150 YYMAWVRQAP TTGLEWVASI SYDGGDTHYR DSVKGRFTIS RDNA SSLYL 200 QMDSLRSEDT ATYYCATETT GIPTGVMDAW GQGVSVTVSS LGGCGGGSAS 250 TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT 300 FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS 350 CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE 400 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YR VSVLTVL HQDWLNGKEY 450 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV 500 KGFYPSDIAV E ESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 550 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 578 Las preparaciones de ls moléculas DART con estructura de Ig que tienen las secuencias anteriores se obtuvieron de diferentes aislados de plásmidos y se denominaron "Ig DART 1" y "Ig DART 2." La capacidad de estas especies DART con estructura de Ig de unirse a mCD32-hCD16A en un ELISA se comparó con la del medio solo, un DART que tiene un único sitio de unión CD32 y uno CD16A ("DART"), y control anti-ch-mCD32 mAb (Figura 34). El DART con estructura de Ig de la presente invención se encontró que tiene mucho mayor afinidad de unión al antígeno que cualquiera de DART o el anticuerpo de control. 6.11 DISEÑO Y CARACTERIZACIÓN DE DIACUERPOS BIESPECÍFICOS CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2 Los genes que codifican CD79VL-CD32BVH (Secuencia 1), CD32BVL-CD79VH-1 (Secuencia 2), y CD32BVL-CD79VH-2 (Secuencia 3) se clonaron en el vector de expresión pEE13 lo que produce construcciones de expresión 1, 2, y 3 respectivamente. El plásmido de expresión de la construcción 1 se co-transfectó junto con el plásmido de expresión 2 o 3 en células HEK-293 para hacer diacuerpos biespecíficos CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2, respectivamente. El medio acondicionado se cosechó en cada tres días durante tres veces. El medio acondicionado se purificó a continuación con el uso de columna por afinidad CD32B.
Los ELISA se condujeron de la siguiente manera: 50 µ?/pocillo de 2 µg/ml de CD32B-Fc se recubrió en placa Maxisorp de 96 pocilios en buffer de carbonato a 4o C hasta la mañana siguiente. La placa se lavó tres veces con PBS-T (PBS, 0,1% Tween 20) y luego se bloqueó por 0,5% BSA en PBS-T durante 30 minutos a temperatura ambiente antes agregar proteína de fusión Fe de cadena simple de prueba. Durante el bloqueo, el diacuerpo específico CD32B-CD79-1 o CD32B-CD79-2 se diluyó en una dilución serial de dos partes comenzando con 2 µg/ml. 25 µ?/pocillo de diacuerpo biespecífico diluido se mezcló con 25 µ?/pocillo de 50 ng/ml de anticuerpo anti-CD32B y se agregan a una placa de ELISA. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado con PBS-T tres veces, 50 µ?/pocillo de 1 :10.000 diluido conjugado con HRP F(ab')2 IgG anti humana de cabra F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch) se agregó a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó con PBS-T tres veces y se desarrolló con 80 µ?/pocillo de sustrato de TMB. Después de 5 minutos de incubación, la reacción se interrumpió por 40 µ?/pocillo de 1% H2S04. El OD450 nm se leyó con el uso de un lector de placas de 96 pocilios y software SOFT max. La lectura obtenida se gráfico con el uso de software GraphPadPrism 3.03. El experimento reveló que los diacuerpos biespecíficos CD32B-CD79-1 y CD32B-CD79-2 fueron capaces de unión inmunoespecífica a CD32-Fc con una afinidad equivalente a la del anticuerpo anti-CD32B control. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificadas de las construcciones descritas con anterioridad se proporcionan a continuación: Secuencia 1 - CD79VL-CD32BVH secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 251): gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagectetta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttteageaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactget ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 Secuencia 2 - CD79VL-CD32BVH secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 252): DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240 Sequence 3 - CD32BVL-CD79VH-1 secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 253): gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 Secuencia 4 - CD32BVL-CD79VH-1 secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 254): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232 Secuencia 5 - CD32BVL-CD79VH-2 secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 255): gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 Secuencia 6 - CD32BVL-CD79VH-2 secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 256): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232 6,12 CONSTRUCCIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE DIACUERPOS BI- FUNCIONALES H8B5-HBCRC Se construyó un diacuerpo que contiene regiones variables de unirse a CD32 ycomplejo receptor de células B ("BCRC").
Clonación. Las construcciones se construyeron con el uso de PCR/PCR por superposición estándar: h8B5VL-G3SG4-hBCRCVH M48I-LGGC: Un VL 8B5 totalmente humanizado (que reconoce CD32) se amplificó por medio del uso de lgh321F y Lgh788R como cebadores. hBCRCVH M48I se amplificó por medio del uso de lgh784F y Lgh386R como cebadores. Los productos de PCR se purificaron con gel and mix together y se amplificaron por medio del uso de lgh321F y Lgh386R. El fragmento de PCR por superposición luego se clonó en pEE6 en el sitio Xbal-EcoRI. "G3SG4" es una ligadura que tiene la secuencia: GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10). hBCRCVL R45N-G3SG4-h8B5VH -LGGC El hBCRCVL R45N se amplificó por medio del uso de lgh321F y Lgh785R como cebadores. El h8B5VH se amplificó por medio del uso de lgh787F y Lgh786R como cebadores. Los productos de PCR se purificaron con gel y se mezclaron juntos y se amplificaron por medio del uso de lgh321F y Lgh786R. El fragmento de PCR por superposición luego se clonó en pEE13 en el sitio Xbal-EcoRI Construcción del vector simple. El pEEóhHBCRCVL R45N-h8B5VH se digirió en los sitios Bgl II-Sal I y un fragmento de 3,3kb se purificó y se insertó en pEE13 hHBCRCVL 45N-h8B5VH en los sitios BamHI-SalI. El Bgl II y BamH I comparten extremos cohesivos compatibles. La secuencia del DART y los cebadores usados para construir el DART se muestran a continuación: hHBCRCVL. R45N-h8B5VH-LGGC secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 257): gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc catgaaactc tcttgtgaag cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcagtct ccagagaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 600 gtctacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg gcatttatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag 700 tctcctcgct gggaggctgc 720 hHBCRCVL. R45N-h8B5VH-LGGC secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 258): DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMD VRQA PGKGLEWVAE IRNKAK HAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC 240 H8B5VL-hHBCRCVH M48I-LGGC secuencia de nucleótidos (SEC ID NRO.: 259): gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caacctatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccagcta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aatgttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgc 696 H8B5VL-HBCRCVH M48I-LGGC secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 260): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQMFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GC 232 Cebadores: Cebador Lgh321F (SEC ID NRO.: 261): cgagctagct ctagatgaga tcacagttct ctctac 36 Cebador Lgh386R (SEC ID NRO.: 262): tttgaattct agcagcctcc cagtgaggag acggtgaccg tggtc 45 Cebador Lgh784F (SEC ID NRO.: 263): ggcggatccg gaggcggagg ccaggttcag ctggtgcag 39 Cebador Lgh785R (SEC ID NRO.: 264): cctccggatc cgcctccttt gatctcaagc ttggtccc 38 Cebador Lgh786R (SEC ID NRO.: 265): tttgaattct agcagcctcc caggctggag acggtcacca gg 42 Cebador Lgh787F (SEC ID NRO.: 266): ggaggcggat ccggaggcgg aggcgaagtg cagcttgtgg agtc 44 El plásmido de expresión Hu3G8VL l-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC se co-transfectó junto con Hu2B6VL 5-G3SG4- Hu3G8VH 5-LGGC en células HEK-293 para hacer que el diacuerpo bioespecífico Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1 reconozca CD32 y CD79. En el mismo momento, Hu2B6VL 5-G3SG4-Hu2B6VH 4-LGGC y Hu3G8VL 1-G3SG4-Hu3G8VH 5-LGGC se transfectaron en forma individual en células HEK-293 para hacer el diacuerpo Hu2B6 4.5 y Hu3G8 5.1. Después de tres días en cultivo, los medios acondicionados se cosecharon caracterizaron por ELISA de unión. El resultado de este exerimento se muestra en la Figura 36.
Diseño experimental: 100 ng/pocillo de FcRIIb-G2-Agly soluble se recubrió en placa Maxisorp de 96 pocilios en buffer de carbonato a 40° C durante toda la noche. Píate se lavó tres veces con PBS/0,1% Tween20 y luego se bloqueo por 0,5% BSA en PBS/0,l%Tween 20 durnante 30 mins a temperatura ambiente antes agregar los diacuerpos. Una dilución serial a la mitad del medio acondicionado de diacuerpo bioespecífico Hu2B6 4.5-Hu3G8 5.1, diacuerpo Hu2B6 4.5, y diacuerpo Hu3G8 5.1 comenzando con 25ng/pocillo se agregó a cada pocilio. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se lavó con PBS/0,1% Tween20 tres veces, lOng/pocillo de FcRIIIa-G2-Biotin se agregó a la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se lavó con PBS/0,1% Tween20 tres veces, 50 ul de 1 :5000 dilution de Estreptavidina conjugada con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) se usó para detección. Luego de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó con PBS/0,1% Tween20 tres veces y se desarrolló con el uso de sustrato de TMB. Después de 10 minutos de incubación, la reacción se interrumpió por 1% H2S04. El OD450 nm se leyó por el programa SOFTmax. La lectura obtenida se gráfico con el uso de software GraphPadPrism 3.03. 6,13 CONSTRUCCIÓN DE DIACUERPOS DART Ig Los diacuerpos DART Ig se construyeron that contain regiones variables de unirse a CD32 y complejo receptor de células B ("BCRC"). El primer diacuerpo empleó una ligadura LGGCGGGS (SEC ID NRO.: 267) entre las secuencias VH y las secuencias Fe de la molécula. El segundo diacuerpo empleó en forma indistinta una LEIK ligadura que tiene la secuencia: LEIK (SEC ID NRO.: 268) o una ligadura TVSS que tiene la secuencia TVSS (SEC ID NRO.: 269). Las secuencias de la cadenas de estos diacuerpos y polinucleótidos de codificación se muestran a continuación: H8B5VL-hBCRCVH M48I, M62K_LGGCG3S_hKappa (SEC ID NRO.: 270): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLI A 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMN 150 WVRQAPGQGL EWIGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAY ELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVTVSSLG GCGGGSRTVA APSVFIFPPS 250 DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS 300 TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC 343 Las secuencias H8B5VL se fusionan a las secuencias hBCRCVH por la ligadura GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) ubicada en la posición 108-115. Las secuencias hBCRCVH se fusionan a las secuencias Fe por la ligadura LGGCGGGS ( SEC ID NRO.: 267) ubicada en la posición 229-236 (ambas se mostraron anteriormente subrayadas). El polinucleótido que codifica la secuencia H8B5VL-hBCRCVH M48I, M62K LGGCG3 S hKappa es: (SEC ID NRO.: 271): gacatecaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caaectatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccageta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcactggga ggctgcggcg 700 gagggagcc aactgtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct 750 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa 800 cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc 850 aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 900 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 1000 acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg 1050 tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 1082 donde las secuencias que codifican las ligaduras: GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) y LGGCGGGS (SEC ID NRO.: 267) están ubicadas en la posición 322-345 y 685-708, respectivamente (ambas se mostraron anteriormente subrayadas).
HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hGl (SEC ID NRO.: 272): DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDG TYLN FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DA MDWVRQA PGKGLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSLGGC GGGSASTKGP 250 SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 300 LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNT VDK RVEPKSCDKT 350 HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV 400 KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQD LNGKEYKCKV 450 SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY 500 PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSR QQGNVF 550 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 574 Las secuencias hBCRCVL se : fusionan a las secuencias H8B5VH por la ligadura GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) ubicada en la posición 113-120. Las H8B5VH secuencias se fusionan a las secuencias Fe por la ligadura LGGCGGGS ( SEC ID NRO.: 267) ubicada en la posición 237-244 (ambas se mostraron anteriormente subrayadas). El polinucleótido que codifica la secuencia HBCRCVL R45N-h8B5VH_LGGCGGGS-hGl es: (SEC ID NRO.: 273): gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagectetta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg tttcagcaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactgct ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa tcatgcaaca tactatgctg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgacgc caaaaacagt 600 ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700 tctccagcct gggaggctgc ggcggaggga gcgcctccac caagggccca 750 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc 800 ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt 850 cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 900 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc 950 cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1000 gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1050 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt 1100 cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 1150 ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 1250 gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1300 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1350 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa 1400 agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 1450 agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1550 ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1600 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1650 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag 1700 cctctccctg tctccgggta aa 1722 donde las secuencias que codifican las ligaduras: GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) y LGGCGGGS ( SEC ID NRO.: 267) están ubicadas en la posición 337-360 y 709-732, respectivamente (ambas se mostraron anteriormente subrayadas).
H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa (SEC ID NRO.: 274): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQEIS GYLSWLQQKP GKAPRRLIYA 50 ASTLDSGVPS RFSGSESGTE FTLTISSLQP EDFATYYCLQ YFSYPLTFGG 100 GTKVEIKGGG S6GGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYW N 150 WVRQAPGQGL E IGMIDPSD SETHYNQKFK DRVTMTTDTS TSTAYMELRS 200 LRSDDTAVYY CARAMGYWGQ GTTVLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 250 ASVVCLLNNF YPREA VQW VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 300 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC 335 Las secuencias H8B5VL se fusionan a las secuencias HBCRCVH por la ligadura GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) located en la posición 108-115. Las secuencias HBCRCVH se fusionan a las secuencias Fe por la ligadura LEIK ( SEC ID NRO.: 268) located en la posición 225-228 (ambas se mostraron anteriormente subrayadas). El polinucleótido que codifica la secuencia H8B5VL-HBCRCVH M48I, M62K_(-4)LEIK_hKappa es: (SEC ID NRO.: 275): gacatecaga tgacccagtc tccatcctcc ttatctgcct ctgtgggaga 50 tagagtcacc atcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt ggttacttaa 100 gctggctgca gcagaaacca ggcaaggccc ctagacgcct gatctacgcc 150 gcatccactt tagattctgg tgtcccatcc aggttcagtg gcagtgagtc 200 tgggaccgag ttcaccctca ccatcagcag ccttcagcct gaagattttg 250 caaectatta ctgtctacaa tattttagtt atccgctcac gttcggaggg 300 gggaccaagg tggaaataaa aggaggcgga tccggaggcg gaggccaggt 350 tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggc gcctcagtga 400 aggtctcctg caaggcttct ggttacacct ttaccageta ctggatgaac 450 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gaatgattga 500 tccttcagac agtgaaactc actacaatca aaagttcaag gacagagtca 550 ccatgaccac agacacatcc acgagcacag cctacatgga gctgaggagc 600 ctgagatctg acgacacggc cgtgtattac tgtgcgagag ctatgggcta 650 ctgggggcaa gggaccacgg tcctggagat caagcgaact gtggctgcac 700 catcggtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 750 gcctctgttg tgtgcctgct gaataaette tateccagag aggccaaagt 800 acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg 850 teacagagea ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 900 acgctgagca aageagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt 950 cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagette aacaggggag 1000 agtgt 1005 donde las secuencias que codifican las ligaduras: GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) y LEIK (SEC ID NRO.: 268) están ubicadas en la posición 322-345 y 673-684, respectivamente (ambas se mostraron anteriormente subrayadas).
HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hGl = HBCRCVL R45N-h8B5VH_-hGl (SEC ID NRO.: 276): DVVMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCKSSQSLL DSDGKTYLNW FQQRPGQSPN 50 RLIYLVSKLD SGVPDRFSGS GSGTDFTL I SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP 100 LTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS 150 DAWMDWVRQA PG GLEWVAE IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDAKNS 200 LYLQMNSLRA EDTAVYYCGA LGLDYWGQGT LVTVSSASTK GPSVFPLAPS 250 SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS 300 LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA 350 PELLGGPSVF LFPP PKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG 400 VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP 450 IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 500 ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 550 LHNHYTQKSL SLSPGK 566 Las secuencias HBCRCVL se fusionan a las secuencias h8B5VH por la ligadura GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) ubicadas en la posición 113-120. Las secuencias h8B5VH se fusionan a las secuencias Fe por la ligadura TVSS ( SEC ID NRO.: 269) ubicadas en la posición 233-236 (ambas se mostraron anteriormente subrayadas). El polinucleótido que codifica HBCRCVL R45N-h8B5VH_(-4)TVSS-hGl es: (SEC ID NRO.: 277): gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca 50 gccggcctcc atctcctgca agtcaagtca gagectetta gatagtgatg 100 gaaagacata tttgaattgg ttteageaga ggccaggcca atctccaaac 150 cgcctaattt atctggtgtc taaactggac tctggggtcc cagacagatt 200 cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc agcagggtgg 250 aggctgagga tgttggggtt tattactget ggcaaggtac acattttccg 300 ctcacgttcg gcggagggac caagcttgag atcaaaggag gcggatccgg 350 aggcggaggc gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac 400 ctggaggatc cctgagactc tcttgtgccg cctctggatt cacttttagt 450 gacgcctgga tggactgggt ccgtcaggcc ccaggcaagg ggcttgagtg 500 ggttgctgaa attagaaaca aagctaaaaa teatgeaaca tactatgetg 550 agtctgtgat agggaggttc accatctcaa gagatgaege caaaaacagt 600 ctgtacctgc aaatgaacag cttaagagct gaagacactg ccgtgtatta 650 ctgtggggct ctgggccttg actactgggg ccaaggcacc ctggtgaccg 700 tctccagcgc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 750 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga 800 ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca 850 gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 900 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta 950 catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag 1000 ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1050 cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa 1100 ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1150 acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1200 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 1250 cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga 1300 atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1350 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt 1400 gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc 1450 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1500 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 1550 ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 1600 gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1650 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1698 donde las secuencias que codifican las ligaduras: GGGSGGGG (SEC ID NRO.: 10) y TVSS (SEC ID NRO.: 269) están ubicadas en la posición 337-360 y 697-708, respectivamente (ambas se mostraron anteriormente subrayadas). 6,14 OPTIMIZACIÓN DE LIGADURAS Como se discutió con anterioridad, los diacuerpos DART Ig de la presente invención con preferencia contienen ligaduras entre las secuencias VH y las secuencias Fe de la molécula. Se condujeron experimentos para optimizar las ligaduras con el fin de maixmizar el rendimiento y la actividad. Se emplearon las siguientes ligaduras.
Las ligaduras anteriores se introdujeron en los plásmidos con el fin de producir un conjunto de diacuerpos DART Ig que tienen diferentes combinaciones de ligaduras: Las propiedades de agregación de los DARTS Ig producidos se determinó.
Los datos mostraron inesperadamente que las construcciones que tienen ligaduras, tales como las empleadas en 901A/901B; 903A/903B; y 908A/908B dieron resultados drásticamente superiores (menos oligomerización y/o menos producción de fragmentos) que las construcciones que tienen ligaduras, tales como 910A/ 1 IB. 6,15 DARTS E-COIL / K-COIL Como se apreciará en vista de lo que antecede, los polipéptidos individuales de un DART biespecífico pueden formar dos species de homodímeros y una especie de heterodímero. En una realización de la presente invención, un polipéptido cargado puede agregarse al extremo terminal C de uno, o con mayor preferencia, ambos polipéptidos DART. Al seleccionar los polipéptidos cargados de carga opuesta para los polipéptidos individuales del DART biespecífico, la inclusión de dichos polipéptidos cargados favorece la formación de heterodímeros y disminuye la formación de homodímeros. Con preferencia, un polipéptido con carga positiva contendrá un contenido sustancial de arginina, glutamina, histidina y/o Usina (o mezclas de dichos aminoácidos) y un polipéptido de carga negativa contendrá un contenido sustancial de aspartato o glutamato (o una mezcla de dichos aminoácidos). Los polipéptidos con carga negativa que contienen un contenido sustancial de lisina y los polipéptidos con carga negativa que contienen un contenido sustancial de glutamato se prefieren en particular. Con el fin de maximizar la atracción electrostática de dichos polipéptidos con cargas opuestas, se prefiere emplear polipéptidos capaces de asumir espontáneamente una conformación helicoidal.
De este modo, en una realización preferida, un "E-coil" con carga negativa se anexará a uno de los polipéptidos que se usan para formar un DART biespecífico y un "K-coil" con carga negativa se anexará al segundo de los polipéptidos DART (Figura 37).
Un E-coil particularmente preferido tendrá la secuencia: (EVAALEK)4: SEC ID NRO.: 299 EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK Un K-coil particularmente preferido tendrá la secuencia: (KVAALKE)4: SEC ID NRO.: 300 KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE Un polipéptido DART preferido que posee dicho E-coil tendrá la secuencia general: [Dominio VL]—[GGGSGGGG]—[Dominio VH]—[(EVAALEK)4]—GGGNS, donde VL es el dominio Ig liviano variable del DART, GGGSGGGG es SEC ID NRO.: 10, VH es el dominio Ig pesado variable del DART, (EVAALEK)4 es SEC ID NRO.: 299, y GGGNS es SEC ID NRO.: 301. Un polipéptido DART preferido que posee dicho K-coil tendrá la secuencia general: [Dominio VL]—[GGGSGGGG]— [Dominio VH]— [(KVAALKE)4]—GGGNS, donde VL es el dominio Ig liviano variable del DART, GGGSGGGG es SEC ID NRO.: 10, VH es el dominio Ig pesado variable del DART, (KVAALKE)4 es SEC ID NRO.: 300, y GGGNS es SEC ID NRO.: 301. 6,16 DARTS QUE CONTIENEN FC DE E-COIL / K-COIL En una realización adicional, las regiones Fe pueden ligarse a los circuitos DARTs E y/o K de E-coil o K-coil.
Siguiendo la separación entre las regiones Fe y el dominio VH DART de un DART que contiene Fe se desea en casos en los cuales una disposición menos separada de dichos dominios produce reducida interacción entre dichos dominios y sus ligandos de unión o interfiere de otro modo con el montaje de DART. Aunque los separadores de cualquier secuencia de aminoácidos puede emplearse, se prefiere emplear separadores que forman bucles de hélice a, con el fin de extender en forma máxima y proyectar el dominio Fe alejándolo de los dominios variables (Figura 37). Debido a los polipéptidos en bucle descritos con anterioridad de carga opuesta en forma adicional funcionan para promover la formación de heterodímeros, dichas moléculas son separadores particularmente preferidos. Dichas moléculas que contienen moléculas Fc-DART proveen benéficos similares a los de Fc-DARTS, que incluyen mejorada vida media sérica y reclutamiento de la función efectora. The above-described E-coil and K-coil polipéptidos are en particular preferred for this purpose.
De este modo, en una realización preferida, el DART de E-coil que contiene Fe DART tendrá la secuencia general: [Dominio VL]— [GGGSGGGG]— [Dominio VH]— [(EVAALEK)4]— GGG— dominio Fe comenzando con D234 (Numeración según Kabat), donde VL es el dominio Ig liviano variable del DART, GGGSGGGG es SEC ID NRO.: 10, VH es el dominio Ig pesado variable del DART y (EVAALEK)4 es SEC ID NRO.: 299.
En forma similar, en una realización preferida, el DART que contiene Fe de K-coil tendrá la secuencia general: [Dominio VL]— [GGGSGGGG]— [Dominio VH]— [(KVAALKE)4]— GGG— Fe dominio comenzando con D234 (Numeración según Kabat), donde VL es el dominio Ig liviano variable del DART, GGGSGGGG es SEC ID NRO.: 10, VH es el dominio Ig pesado variable del DART y (KVAALKE)4 iess SEC ID NRO.: 300.
Como se indicó con anterioridad, una molécula DART que contiene bucle o una molécula DART que contiene Fe que contiene bucle puede contener sólo uno de sus separadores únicos de bucle, o pueden contener más de uno de dichos separadores (por ej., dos separadores, con preferencia de carga opuesta, de los cuales uno está ligado al dominio VH de los polipéptidos DART). Al ligar la región Fe con dicha(s) molécula(s) separadoras, la capacidad de producir versiones bivalentes, tetravalentes, etc. de las moléculas DART Fe por intercambio de cadena se potencia (Figura 39). Como se muestra en la Figura 39, las moléculas Fc-DART pueden producirse para formar monómeros o dímeros dependientes de si el dominio Fe está ligado a uno o ambos de los dominios DART VH. 6.17 ACTIVIDAD FUNCIONAL DE DARTS QUE CONTIENEN FC DE E- COIL / K-COIL Las especies de DART de Fe de E-coil y/o K-coil se produjeron a partir de moléculas DART bi-específicas que tienen: (1) las regiones variables liviana y pesada del anticuerpo reactivo CD79b (complejo BCR), CB3 y (2) las regiones variables liviana y pesada de una variante de baja afinidad (denominada variante "YA") del anticuerpo reactivo CD32B, 2B6. Esta región variable de cadena liviana de este anticuerpo difiere de la del anticuerpo 2B6 en contener las mutaciones: N50Y and V51A. De este modo, el anticuerpo YA2B6 tiene una secuencia de región variable de cadena liviana: EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRTSQSIGT IHWYQQKPDQSPKLLIKYASES ISGVPS FSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQSNT PFTFGGGT VEIK (SEC ID NRO.: 302).
La secuencia de la región variable de cadena pesada de este anticuerpo es: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC ASGYTFTNYWIHWVRQAPGQGLEWMGVIDPS DTYPNYNKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARNGDSDYYSGM DYWGQGTTVTVS s (SEC ID NRO.: 303); o El anticuerpo de baja afinidad se seleccionó ya que se unirá en forma preferencial a CD32B in cis en células que expresan CD79b (Células B). Así, la configuración disminuirá la interacción con otras células que expresan CD32B (monocitos, células endoteliales, hígado) así como también la trans-interacción indeseable Los derivados E-coil y/o K-coil y derivados que contienen Fe- de E-coil y/o K-coil de dichos h2B6YAhCB3 DARTS se realizaron. Se usó cromatografía por exclusión de tamaño para analizar el tamaño aproximado y la heterogeneidad de las moléculas producidas. Como se muestra en la Figura 40, se formaron dímeros a partir de E-coil / K-coil DARTS que tienen una región Fe de ligadura simple unida a un dominio K-coil así como también a DARTS E-coil / K-coil que tienen una región Fe de ligadura simple ligada a un dominio E-coil. El monómero deseado, así como también las moléculas de dímero se recuperaron de las preparaciones en las cuales las regiones Fe se ligaron a ambos E y coils de la misma molécula DART, con donde el monómero es el producto mayoritario formado. La Figura 41 muestra la posible estructura de las moléculas de dímeros producidos.
La cromatografía por exclusión de tamaño y fracciones se analizaron con el uso de SDS-electroforesis con gel de poliacrilamida para analizar en forma adicional las estructuras de las moléculas producidas (Figura 42). Los derivados de DART E-coil / K-coil (sin región Fe) migraron como dos bandas predominantes cada una de aproximadamente 28 kD (correspondiente al polipéptido que contiene KFc y el polipéptido levemente menor que contiene EFc) y una banda menos prominente a aproximadamente 49 kD (correspondiente al DART de E-coil / K-coil). La fracción de monómeros de los derivados DART que contienen Fe de E-coil / K-coil (EFc/K o E/KFc) de la cromatografía por exclusión de tamaño y sólo mostraron la banda de peso molecular mayor o menor a aproximadamente 28 kD (correspondiente a si el DART era el DART que contiene (banda de peso molecular más grande) o el DART que contiene EFc (banda de peso molecular más pequeño). El material migró en forma predominante a aproximadamente 49 kD (correspondiente al DART de E-coil / K-coil). Se observaron además bandas de peso molecular superior.
Un ELISA de unión bíespecífica se realizó para caracterizar las moléculas producidas. CD79 se colocó en una placa de ELISA. Los DARTs luego se unieron a la placa. La unión de DART se detectó con el uso de sCD32B-biotina seguido de incubación con estreptavidina-HRP. Como se muestra en la Figura 43, los derivados de DART de E-coil / K-coil que contienen Fe h2B6YAhCB3 (EFc/K o E/KFc) mostraron potenciación significativa de la unión con relación a un DART h2B6YAhCB3, o a un derivado DART EFc/KFc h2B6YAhCB3.
El entrecruzamiento de anticuerpos que se han unido a CD79b conduce a activación de células B (Van Kooten, C. et al. (1997) "Cross-Linking Of Antigen Receptor By Ig-B (B29, CD79b) Can Induce Both Positive And Negative Signáis In CD40-Activated Human B Cells," Clin. Exp. Immunol. 110:509-515). Dado que las moléculas DART h2B6YAhCB3 moléculas son capaces de unirse a ambos CD79b y el receptor inhibidor de CD32B, tienen la la capacidad de "reclutar" CD32B a los sitios de unión a CD79b, y de este modo bloquear proliferación de las células B. Para demostrar esta capacidad, los DARTS se incubaron con células B que se habían expuesto a anticuerpos capaces de entrecruzar los anticuerpos anti-CD79b adheridos. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 44. Los resultados muestran que los anticuerpos dirigidos solamente contra CD79b o CD32B (Ch2B6N297Q y ChCB3.1N297Q, respectivamente) no lograron inhibir la proliferación de las células B. Los derivados DART EFc/KFc h2B6YA x hCB3 fueon en forma sustancial más efectivos en la inhibición de proliferación de las células B, como lo fue el DART h2B6YA x hCB3 mismo y el control h2B6YA x hCB3 VF. Los DARTS E-coil / K-coil que tienen una única región de Fe relacionada (derivados DART E/KFc h2B6YA x hCB3 y derivados DART EFc/K h2B6YA x hCB3) se encontró que ejercen la mayor inhibición sobre la proliferación de las células B. 6.18 MODIFICACIONES DE DART PARA ALTERAR LA VIDA MEDIA SÉRICA IN VIVO Como se discutió con anterioridad, las moléculas de anticuerpo recombinante pequeñas tales como moléculas de cadena simple biespecíficas (por ej., que poseen una masa molecular de aproximadamente 55 kDa) se limpian rápidamente de la circulación. Los estudios de farmacocinética in vivo de moléculas DART en ratones mostraron la vida media terminal corta esperada de aproximadamente 2 horas.
En algunas realizaciones, tales como en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria aguda, dicha vida media corta se desea, sin embargo, en otras realizaciones tales como en el tratamiento del cáncer y enfermedades y afecciones crónicas, se prefiere que las DART de la presente invención inhiban vidas medias superiores.
Con el fin de mejorar las propiedades farmacocinéticas in vivo de las moléculas DART para dichos usos, las moléculas DART pueden modificarse para contener una porción de polipéptido de una proteína que se une al suero en uno o más de los términos de la molécula DART. Con mayor preferencia, dicha porción de polipéptidos de una proteína que se une al suero se instalará en el extremo terminal C de la molécula DART. Una porción de polipéptido particularmente preferida de una proteína que se une al suero para este fin es el dominio que se une a la albúmina (ABD) de la proteína G de estreptococo. El dominio que se une a la albúmina 3 (ABD3) de la cepa de la Proteína G de Estreptococo G 148 se prefiere en particular.
El dominio que se une a la albúmina 3 (ABD3) de la cepa de la Proteína G de Estreptococo G148 consiste en 46 residuos de aminoácidos que forman un manojo de hélice y tiene amplia especificidad de unión a la albúmina (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, and Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules " J. Biol. Chem. 277(10):81 14-8120). La albúmina es la proteína más abundante en plasma y tiene una vida media de 19 días en humanos. La albúmina posee varios sitios pequeños de unión a la molécula que le permiten unirse en forma no covalente a otras proteínas y por lo tanto extender sus vidas medias séricas.
Para demostrar la capacidad de una porción de polipéptido de una proteína del suero de extender la vida media de un DART, el dominio de proteína de estreptococo G ABD3 se fusionó a un DART biespecífico recombinante (inmuno reactivo con los antígenos hCD16 y hCD32B antigens) para generar una molécula de anticuerpo recombinante, ABD-DART hCD16-hCD32B (Figura 45). Esta ABD-DART mostró unión específica a ambos antígenos así como también con albúmina de suero humano (HSA) y fue capaz de redirigir células efectoras in vitro. Cuando se comara con el DART de control, este ABD-DART mostró un fuerte aumento de la media sérica en ratone. Este método puede usarse como una vía viable para aumentar la vida media de productos farmacéuticos potencialmente importantes como DART hasta más del 90 minutos, más de 2 horas, más de 5 horas, más de 10 horas, más de 20 horas, y con mayor preferencia, más de 30 horas.
MATERIALES Y MÉTODOS: Diseño y Construcción de ABD DART: hCD16-hCD32B ABD DART se hizo con el uso de la cadena 1 : hCD16VL-G3SG4-hCD32BVH-K coil [(KVAALKE)4] donde CD16VL denota el 3G8 CD16VL, G3SG4 denota SEC ID NRO.: 10, hCD32BVH denota el 2B6 CD32BVH, y (KVAAL E)4 denota SEC ID NRO.: 300; y como cadena 2: hCD32BVL-G3SG4 -hCD16VH-GGCGGG-E coil [(EVAALEK)4]-GGGNS- ABD donde CD32BVL denota CD32BVL, G3 SG4 denota SEC ID NRO.: 10, hCD 16VH denota CD16VH, GGCGGG son los residuos 2-7 of SEC ID NRO.: 267, E coil [(EVAALEK)4] es SEC ID NRO.: 299, GGGNS is SEC ID NRO.: 301, y ABD es: LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE ILAALP (SEC ID NRO.: 304) De acuerdo con lo anterior, la secuencia de la cadena 1 (h3G8VLl-G3SG4-h2B6VH4-Kcoil-GGGNS) es: DIVMTQS PDS LAVSLGERAT INCKASQSVD FDGDSFM WY QQKPGQ PPKL LIYTTSNLES GVPDRFSGSG SGTDFTLT I S SLQAE DVAVY YCQQSNED PY FGQGT KLE I KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYT FTM YW IHWVRQAP GQGLEWI GVI DPS D P YN KKFKGRVTMT VVV3T STAYM ELRSLRS DDT A YYCARNG D S DYYSGMDYW GQGTTVTVS S GGCGGGKVAA LKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKEGGGNS (SEC ID NRO.: 305) A una cadena preferida que codifica los polinucleótidos 1 (h3G8VLl-G3SG4-h2B6VH4-Kcoil-GGGNS) es: gacatcgtga tgacccaatc tccagactct. ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc atcaactgca aggccagcca aagtgttga tttgatggtg atagttttat gaactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctata ctacatccaa tctagaatct. ggggtcccag acaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc agcctgcagg ctgaggatgt ggcagtttat tactgtcagc aaagtaatga agatccgtac acg tcggac aggggaccaa gcttgagatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggccag gttcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt ctggttacac ctttaccaac tactggatac actgggtgcg acaggcccct. ggacaagggc ttgagtggat tggagtga t gatccttctg atactt.at.cc aaattacaat aaaaaqttca agggcagagt caccatgacc gtagtcgtat ccacgagcac agcctacatg gagctgagga gcctgagatc tgacg cacg gccgtgtatt actgtgcgag aaacggtgat tccgattatt actctggtat gcjactactgg gggcaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggaggatgtg gcggtgga a agtggccgca ctgaaggaga aagttgctgc tttgaaagag aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag agggcggcgg gaattct (SEC ID NRO.: 306) De acuerdo con lo anterior, la secuencia de la cadena 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-Ecoil-GGGNS-ABD) es: EIVLTQSPDF QSVTP EKVT FTCRTSQSIG TNIHWYQQKP DQSPKLLIKE VSESISGVPS RFSG3GSGTD FTLTI SLEA EDAATYYCQQ SNTWPF FGG GTKVEIKGGG SGGGGQVTLR ESGPALVKPT QTLTLTCTFS GFSLSTSG G VGWIRQPPGK ALEWLAHIWW DDDKRYNPAL SRLTISKDT SKNQVVLTMT NMDPVDTATY YCAQINPAWF AYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LE EVAALEK EVAALEKGGG MSLAEAKVLA NRELD YGVS DYYKNLINNA KTVEGVKALI DEILAALP (SEC ID NRO.: 307) Una cadena preferida que codifica los polinucleótidos 2 (h2B6VL5-G3SG4-h3G8VH5-Ecoil-GGGNS-ABD) es: gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc ttcacctgca ggaccagtca gagcattggc acaaacata actggtacca gcagaaacca gatcagtctc caaagctcct catcaaggag gtttctgagt ctatctctgg agtcccatcg aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaceetea cca caatag cctggaagct gaagatgctg caacgtatta ctgtcaacaa agtaatacct ggccgttcac gttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt taccctgaga gagt.ct.ggcc ctgcgctggt gaagcccaca cagaccctca cactgacttg taccttctct gggttttcac tgagcacttc tggtatgggt gtaggctgga ttcgtcagcc cccgggaag gctctagagt ggctggcaca catttggtgg gatgatgaca agcgctataa tccagccctg aagagccgac tgacaatctc caaggatacc tccaaaaacc aggtagtcct cacaatgacc aacatggacc ctgtggatac tgccacatac tactgtgctc aaataaaccc cgcctggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtgagctccg gaggatgtgg cggtggagaa gtggccgcac tggagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa aggcggcggg aattctctgg ccgaagcaaa agtgctggcc aaccgcgaac tggataaata tggcgtgagc gattattata agaacctgat taacaacgca aagaccgtgg aaggcgtgaa. agcactgatt gatgaaattc tggccgccct gcct (SEC ID NRO.: 308) Cada segmento de VL y VH se amplificó por PCR con el uso de DART hCD16-hCD32B como patrón. Para la cadena 2, las secuencias de nucleótidos que contienen E coil y ABD se formaron por el primer dímero y luego se subclonaron en el extremo terminal C de la región VH de hCDló con el uso de digestión por restriccón y Ligación. Ambas cadenas se clonaron en vector pCIneo (Promega, inc.) en los sitios Nhel-NotlI. Los plásmidos individuales que rodean la respectiva cadena 1 digerida en NgoMIV-Nhel y los casetes de expresión de cadena 2 digeridos en BstBI-Pmel se clonaron a continuación en un plásmido individual para transfección en células CHO para generar líneas celulares estables.
Expresión y Purificación de proteína: Para la transfección estable, se transfectaron células CHO-S con plásmido de ADN de hCD16-hCD32B EK ABD-DART. La proteína ABD-DART se purificó por cromatografía por afinidad con el uso de la versión soluble del antígeno FcRIIB acoplado a Sepharose 4B activado por CNBr. La proteína purificada se purificó en forma adicional por cromatografía por exlcusión de tamaño con el uso de Superdex 200HR 10/30.
Ensayo de unión por ELISA: Para la captura basada en CD-16, se recubrieron placas con antígeno FcRIIB a una concentración de 2ug/mL a 4°C durante durante toda la noche. Luego se bloquearon las placas con 0,5% Peptona en PBS-T. Las proteínas purificadas diluidas en una dilución serial de unieron en la placa durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, la detección se realizó con el uso de CD32B biotinilado (50 ng/mL) seguido de Estreptavidina conjugada con HRP (1/1000, BD-Pharm). La actividad de HRP se midió por el agregado de TMB y la placa se leyó en un lector de placa a OD 450nm.
Para la captura de albúmina de suero humano (HSA), las placas se recubrieron con HSA a una concentración de 2ug/mL a 4°C durante durante toda la noche. Luego de eso se siguieron los mismos procedimientos para realizar el ELISA por afinidad dual.
Ensayo ADCC mediado por células mononucleares de sangre periférica ADCC: La citotoxicidad se midió por ensayo de liberación de LDH. Se purificaron Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre humana completa (Lonza Walkersville, Inc, Gaithersburg, MD) por centrifugado gradiente por densidad Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) siguiendo la instrucción del fabricante. 2 x 104 células de destino se colocan en placas en cada pocilio de una placa para cultivo de tejidos de 96 pocilios de base redonda. Una dilución serial de uno a cuatro de diferentes moléculas DART o anticuerpo se agrega a las células en la placa. Luego de eso, 6 x 105 PBMCs se agregan a los mismos pocilios. Luego se incuba la placa durante toda la noche a 37 °C e incubador de 5% C02. La placa luego se centrifuga a 1200 rpm durante 5 minutos, 50 µ? del sobrenadante se transfieren a una placa ELISA de base plana. 50 µ? de la solución de sustrato de LDH (Promega) se agrega a cada pocilio, y la placa se incuba durante for 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Luego 50 µ? de solución de inactivación se agrega a cada pocilio, y la placa se lee a 490 nm dentro de una hora. El porcentaje de citotoxicidad de cada pocilio se calcula con lectura O.D como (Muestra - AICC)/(Máx de destino- Blanco espontáneo) x 100 donde AICC es la citotoxicidad celular que depende del anticuerpo. La curva de dosis respuesta se genera con el uso de software Prism.
Estudio de farmacocinética: Los ratones C57B1/6 recibieron con una inyección intravenosa única de hCD16-hCD32B DART a 5mg/kg. Se recolectó el suero de ratón antes de la dosis, 2, 30 min; 1, 3, 6, 24 y 72 h. La concentración de DART hCD16-hCD32B en el suero se cuantificó. Los cálculos de farmacocinética de DART hCD16-hCD32B se realizaron por medio del paquete de software de farmacocinética WinNonlin Professional 5.1 (Pharsight Corporation, USA). Los parámetros se determinaron por análisis no compartimental (NCA). El análisis no compartimental se basó en un modelo (Model 201) que requiere una inyección intravenosa del medicamento. El método trapezoidal linealse usó para cálculo de los parámetros.
RESULTADOS Estudio de expresión y unión por ELISA. El ABD-DART hCD16-hCD32B se expresó en forma eficiencte a una concentración de 6,5 mg por litro en células CHO-S de mamíferos CHO-S. La actividad de unión de la proteína ABD-DART purificada a los antígenos respectivos se evaluó por ELISA. Los resultados mostraron que ABD-DART hCD16-hCD32B se une en forma simultánea con ambos de los antígenos, CD16 así como también con CD32B (Figura 46A). El perfil de unión coincide con la unión de la proteína de control DART hCD16-hCD32B. La afinidad del ABD-DART hCD16-hCD32B purificado a la albúmina de suero humano (HSA) también se demostró por ELISA (Figura 46B). El resultado mostró fuerte unión fusión de ABD DART a HSA, mientras que no se observó unión con DART hCD16-hCD32B de control. Para demostrar que la molécula ABD-DART era capaz de unión simultánea a CD32B, CD16A y HSA, a una inyección de ABD-DART sobre la superficie con HSA inmovilizado le siguieron inyecciones consecuentes de 200nM CD32B y 200nM CD16A(F158) (Figura 46C, línea sólida). En el experimento de control (Figura 46C, línea punteada) los antígenos se reemplazaron con buffer. Los resultados muestran que la molécula ABD-DART era capaz de unión simultánea a CD32B, CD16A y HSA.
El ABD-DART hCD16-hCD32B y su derivado de fusión ABD se encontraron que exhiben unión equivalente a CD32B soluble (sCD32B) y a CD16A(158F) soluble (sCD16A); los DARTs podrían distingirse por la capacidad de la fusión de DART ABD de unirse a la albúmina de suero humano (HSA); (Figuras 46D-46I). Los DARTs se incubaron en placas recubiertas por CD16A y la unión se detectó con el uso de sCD32B biotinilado en la presencia o ausencia de 3 mg/ml HSA (el bloqueo se realizó con 0,5% peptona en PBS-T). La fusión DART ABD se encontró que retiene la unión bi- específica del DART de origen, y exhibe la unión a sCD16A y CD32B que no se vio afectada por la presencia de albúmina de suero humano (Figura 46 J).
Citotoxicidad In vitro de ABD-DART. Con el fin de demostrar la unión simultánea de este ABD-DART biespecífico a dos antígenos, uno sobre la célula generadora de respuesta uno sobre una célula blanco, el ensayo de matanza redirigida se realizó, con el uso de PBMC humanas como células efectoras, ABD-DART hCD16-hCD32B indujo potente citotoxicdad, dependiente de la dosis contra líneas de células B positivas de CD32B, Daudi (Figura 47A). El resultado muestra que la potencia de ABD- DART fue equivalente a la del DART de origen. El DART CD16xCD32B puede unirse a células efectoras que expresan CD16B y por lo tanto reclutar dichas para matar (por matanza redirigida) células que expresan CD32B. El DART CD16xCD32B se encontró de este modo que muestra potente matanza contra células Raji (Figura 47B).
Propiedades de Farmacocinética de ABD-DART: Las propiedades de farmacocinética de ABD-DART hCD16-hCD32B se analizaron por ELISA de las muestras de suero desués de una dosis única i.v. injection en ratones C57B1/6 (Figura 48). Ambas de las proteínas, DART y ABD-DART mostraron eliminación bifásica de la circulación. El estudio de P de ABD-DART mostró un tiempo de circulación prolongado, con un aumento de la vida media terminal de 35,1 h cuando se compara con 1,2 h para el DART regular (Figura 48, Tabla 17). La mejora de las propiedades de farmacocinética también se demostró por comparación del área bajo la curva (AUC). Para la construcción ABD-DART el AUC aumentó por un factor de casi 30 después de la fusión a ABD (Tabla 17).
Actividad biológica in vivo del ABD-DART: Con el fin de demostrar que el ABD- DART hCD16-hCD32B mantuvo actividad biológica in vivo, una dosis única del ABD- DART o su DART de origen se administraron a los ratones Tg (mCD16-/-hCD16A+32B+) y las concentraciones de células B, células T y células PM se monitorearon. Esto indica que los DARTs fueron capaces de reducir las concentraciones de células B (Figura 49 A) y se interpretan como indicativas de que una matanza dirigida específicamente de células B se logró in vivo hasta que los DARTs se retiraron de la circulación. Las concentraciones de células T (Figura 49B) y células PM (Figura 49C) no se redujeron por los DARTs, lo que confirma su especificidad.
En suma, una proteína DART fusionada a un dominio de unión de albúmina (denominado ABD-DART) se diseñó exitosamente y se produjo. El ABD-DART hCDló- hCD32B se encontró que retiene las especificidades por sus dos determinantes antigénicos reconocidos: CD16 y CD32B. ABD-DART se encontró que muestra alta afinidad por albúmina de suero humano. La fusión de ABD no redujo la actividad biológica (es decir, la potencia del DART para redirigir la matanza de células tumorales). La fusión de la molécula DART a ABD condujo a la mejora sustancial (aumento) en su vida media in vivo, y logró este objetivo sin un aumento drástico de tamaño. La capacidad de retener un tamaño pequeño es significativa y ventajosa ya que facilita la habilidad del DART de difundirse en los tejidos tumorales. 6,19 DARTS RECEPTORES DE CÉLULAS B / Her2 Se construyó un diacuerpo DART Ig que contenía regiones variables de unión a Her2/neu y al receptor de células T ("TCR").
Como se discutió con anterioridad, el TCR se expresa en forma negativa por células T CD4+ o CD8+, y permiten que dichas células reconozcan péptidos antigénicos que se unen y se presentan por proteínas MHC de clase I o clase II de células que presentan antígenos. El reconocimiento del complejo pMHC (péptido-MHC) por medio de un TCR inicia la propagación de una respuesta inmune celular que conduce a la producción de citoquinas y la lisis de la célula que presenta antígenos. HER2/neu, un miembro importante de la familia ErbB, se ha investigado extensivamene debido a su función en varios carcinomas humanos y desarrollo de mamíferos. (Hynes and Stern (1994) Biochim. et Biophys. Acta 1198: 165-184; y Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398). El gen humano HER2/neu y la proteína HER2/neu se describen en Semba et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501 y Yamamoto et al. (1986) Nature 319:230-234, y la secuencia está disponible en el GenBank como número de acceso X03363. HER2/neu comprende cuatro dominios: un dominio extracelular al cual se une el ligando; un dominio de transmembrana lipofílica; un dominio conservdo intracelular de quinasa de tirosina; y un dominio de señalización terminal de carboxilo que rodea varios residuos de tirosina que pueden ser fosforilados. (Plowman et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750). La secuencia del dominio extracelular HER2/neu (ECD) se describió en Franklin et al. (2004) Cáncer Cell. 5(4):317-328, y está disponible en Protein DataBank Record 1 S78 (2004).
HER2/neu funciona como receptor del factor de crecimiento y con frecuencia se expresa por tumores tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de células de vesícula, cáncer de ovario y cáncer de pulmón. HER2/neu se sobre expresa en 25-30% de cánceres de mama y ovario humanos, y está asociado con la progresión clínica agresiva y pronóstico deficiente en estos pacientes. (Slamon et al. (1987) Science 235:177-182; Slamon et al. (1989) Science 244:707-712). La sobre-expresión de HER2/neu se ha observado además en otros carcinomas que incluyen carcinomas del estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroide, páncreas y vesícula. (Véase, por ej., King et al. (1985) Science 229:974; McCann et al. (1990) Cáncer 65:88-92; Yonemura et al. (1991) Cáncer Research 51 :1034).
Una cantidad de anticuerpos monoclonales e inhibidores de moléculas pequeñas de quinasa de la tirosina que se orientan a HER-1 o HER2/neu se han desarrollado, que incluyen, en particular, una variante humanizada de un anticuerpo monoclonal murino conocido como 4D5 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc.) que reconoce un epítope extracelular (aminoácidos 529 to 627) en el dominio rico en cisteína II de HER2/neu, que reside muy cerca de la región de membrana de la proteína. Los estudios han demostrado que en las células de cáncer de mama que sobre-expresan HER2/neu, el tratamiento con anticuerpos específicos parao HER2/neu en combinación con agentes quimioterapéuticos (por ej., cisplatino, doxoubicina, taxol) generan una mayor respuesta citotóxica que el tratamiento con quimioterapia sola. (Hancock et al. (1991) Cáncer Res. 51 :4575-4580; Arteaga et al. (1994) Cáncer 54:3758-3765; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838). Un posible mecanismo por el cual los anticuerpos HER2/neu podrían potenciar la respuesta a agentes quimioterapéuticos es a través de la modulación de la expresión de proteína HER2/neu o por interferencia con la reparación de ADN. (Stancovski et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacus et al. (1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411 ; Bacus et al. (1993) Cáncer Res. 53:5251-5261; Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109; Klapper et al. (2000) Cáncer Res. 60:3384-3388; Arteaga et al. (2001) J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s. Aunque en ciertos casos, los anticuerpos anti-HER2/neu tales como HERCEPTIN® proveen beneficio terapéutico a los pacientes, la mayoría de cáncre de mama y otros pacientes exhiben respuestas refractarias a dichos anticuerpos. Estas respuestas reflejan, en parte, diferencias en el grado de sobre-expresión de HER2/neu por las células cancerosas del paciente.
Como consecuencia de contener regiones variables de unión a Her2/neu y al receptor de células T ("TCR"), elDART tiene la capacidad unirse a células que expresan HER2 y or lo tanto de unirse a dichas células en el dominio capaz de unirse al receptor de células T. Cuando dichas células T se unen a este dominio, se activan para iniciar una respuesta inmunológica que conduce a la matanza de células que expresan HER2.
Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para dicho DART se proporcionan a continuación, con las secuencias VL y VH mostradas en texto plano, la ligadura VL-VH ligadura que se muestra en el texto subrayado, y la secuencia que codifica el motivo de heterodimerización del extremo terminal C (SEC ID NRO.: 313: GFNRGEC o SEC ID NRO.: 314: GVEPKSC) que se muestra en negrita y cursiva.
TCRVL-HER2VH secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 315) EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ SGPELV PGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDY GQGASV TVSSGíTiRGE C TCRVL-HER2VH-que codifica la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NRO.: 316) gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gccaggttca gctgcagcag tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggattcaa caggggagag tgt HER2VL-TCRVH secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 317) DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAY ELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGVEP se HER2VL-TCRVH-que codifica la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NRO.: 318) gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga gctccggagt tgagcccaaa tcttgt En una realización preferida, dichas construcciones se modifican para contener un dominio E coil o coil que facilita la formación de heterodímeros (es decir, dímeros TCRVL-HER2VH x HER2VL-TCRVH). Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para dicho DART se proporcionan a continuación, las secuencias de VL y VH que se muestran en texto plano, la ligadura VL-VH se muestra en texto subrayado, y la secuencia que codifica la ligadura que contiene Cys para dimerización (GGCGGG; residuos 2-7 de SEC ID NRO.: 267) que se muestra en cursiva. El dominio de heterodimerización de E coil de K coil tiene doble subrayado (la secuencia "E-coil" preferida es de 4 repeticiones heptaméricas de EVAALEK; SEC ID NRO.: 299; la secuencia "K-coil" preferida es de 4 repeticiones heptaméricas de KVAALKE (SEC ID NRO.: 300). La secuencia que sigue el E coil o el K coil no tiene función asignada.
TCRVL-HER2VH-E coil secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 319) EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ SGPELVKPGA SLKLSCTASG FNIKDTYIHW VKQRPEQGLE WIGRIYPTNG YTRYDPKFQD KATITADTSS NTAYLQVSRL TSEDTAVYYC SRWGGDGFYA MDYWGQGASV TVSSGGCGGG EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GNS TCRVL-HER2VH-E coü-que codifica la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NRO.: 320) gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag cjccaggttca gctgcagcag tctgggccag agcttgtgaa gccaggggcc tcactcaagt tgtcctgtac agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatacactgg gtgaaacaga ggcctgaaca gggcctggaa tggattggaa ggatttatcc tacgaatggt tatactagat atgacccgaa gttccaggac aaggccacta taacagcaga cacatcctcc aacacagcct acctgcaggt cagccgcctg acatctgagg acactgccgt ctattattgt tctagatggg gaggggacgg cttctatgct atggactact ggggtcaagg agcctcggtc accgtgagct ccggaggatg tggcggtgga qaagtggccg cactgqaqaa aqaqqttqct qctttgqaqa aqqaq tcqc tqcacttqaa aaqqaq tcq caqccctqqa gaaaggcggc gggaattct HER2VL-TCRVH-K coil secuencia de aminoácidos (SEC ID NRO.: 321) DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GHSPKLLIYS ASFRYTGVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYCQQ HYTTPPTFGG GTKVEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYV H WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAY ELSS LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKEG GGNS HER2VL-TCRVH-K coil-que codifica la secuencia de ácido nucleico (SEC ID NRO.: 322) gacatcgtga tgacccagtc ccacaagttc atgtccacct ctgtgggcga tagggtcagc atcacctgca aggccagcca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca gcagaaacca ggacattctc ccaaactgct gatttactcc gcatccttcc ggtacactgg agtccctgat cgcttcactg gcagcagatc tgggacagat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatacta cacctcccac cttcggaggg ggtaccaagg tggagatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga qctccggagg atgtggcggt ggaaaaqtqq ccqcactqaa qqaaaaaqtt gctgctttqa aaqagaaqqt cgccgcactt aaqqaaaaqq tcqcaqccct qaaa aqggc ggcgggaatt ct Las moléculas DART que tienen dominios de unión al receptor de Her2 y células T (TCR) se analizaron para determinar su capacidad de mediar la citotoxicidad en múltiples líneas celulares de cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de vesícula que se habían caracterizado previamente como que exhiben bajos niveles de expresión de HER2 (y de este modo se hace refractario al tratamiento con el anticuerpo anti-Her2/neu, Herceptin®. Las líneas celulares de cáncer de mama analizadas son ZR75-1 (HER2 2+) (Figura 50 A), MCF-7 (HER2 1+) (Figura 50B) y MDA-MB468 (HER2-ve) (Figura 50C). Las líneas celulares que no son de cáncer de mama analizadas son HT-29 (línea celular de cáncer de colon) (Figura 50D) y SW780 (línea celular de cáncer de vesícula) (Figura 50E). Como se muestra en la FIG,49A-E, dichas moléculas DART fueron sustancialmente más efectivas que HERCEPTIN® al mediar la citotoxicidad de líneas celulares derivadas de tumor, ambos en términos de concentracines requeridas para lograr la citotoxicidad equivalente, y en términos de los niveles máximos de citotoxicidad observada. 6.20 FUSIÓN DE DART In vitro CON ABD A TRAVÉS DE E Y K COILS Como se discutió con anterioridad, las moléculas DART de la presente invención pueden diseñarse para exhibir unión biespecífica al receptor NKG2D como afinidad por un hapteno, fluoresceína, de manera tal que pueden servir como adaptadores universales, capaces de co-ligar el receptor NKG2D con moléculas que interactúan con conjugado con patrones de unión a fluoresceína. Para demostrar en forma adicional el uso de ABDs, se construyó un DART con el uso de las cadenas de polipéptidos: (1) KYK2VL-4420VH-GFNRGEC (SEC ID NRO.: 313) - Ecoil: Este polipéptido se construyó con el uso del dominio VL del anticuerpo antes mencionado KYK 2.0 (Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maduration and Characterization of A Human Anti-NKG2D human Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156; y PCT US09/54911) y el dominio VH del MAb anti-fluoresceína descrito anteriormente, 4420. (2) 4420VL-KYK2VH-GVEPKSC (SEC ID NRO.: 314): Este polipéptido se construyó con el uso del dominio VL del MAb anti-fluoresceína descrito anteriormente, 4420 y el dominio VH del anticuerpo KYK 2.0. "Ecoil" denota la secuencia de aminoácidos E coil de 4 repeticiones heptaméncas de EVAALEK; SEC ID NRO.: 299.
Los polipéptidos YK2VL-4420VH-GFNRGEC (SEC ID NRO.: 313) - E coil y 4420VL-KYK2VH-GVEPKSC (SEC ID NRO.: 314) se transfectaron en células CHO para expresar un DART diseñado como "KYK2 4420 VF Ecoil." La purificación de estas moléculas se muestra en la Figuras 51A y 51B. La afinidad del DART KYK2 4420 VF Ecoil se determinó por deteccón NKG2D Fe 012210 de la unión del DART al antígeno FITC capturado. Los resultados del experimento demuestran que el DART fue capaz de unirse a ambas moléculas (Figura 52).
En forma adicional, se hizo una fusión de Kcoil - GGGNS (SEC ID NRO.: 301) - ABD, donde "Kcoil" denota la secuencia de aminoácidos de K coil de 4 repeticiones heptaméricas de KVAALKE (SEC ID NRO.: 300). La Figura 53 proporciona un mapa de restricción del plásmido pPAL7, y muestra la construcciónion del plásmido pPAL7 Kcoil ABD, que expresa la fusión de Kcoil-ABD con el uso de una marca PROFINITY EXACT™ (Bio-Rad, Hercules, CA) para facilitar la purificación. El vector pPAL7 Kcoil ABD se transformó en células de E. coli BL21DE3. La expresión de Kcoil ABD marcado se indujo por el agregado de 2 mM IPTG durante 4 horas. La expresión de proteína se verificó por SDS-PAGE o por Transferencia Western. En síntesis, el sistema de marca de fusión PROFINITY EXACT™ incluye mediar la lisis de las células, unión de las proteínas liberadas a una columna de afinidad de subtilisina inmovilizada, lavado de la columna para eluir las proteínas no unidas, aplicando un buffer de elución que contiene flúor para hacer que la subtilisina rápidamente y en forma precisa separe el rótulo de la proteína de fusión después de la secuencia de reconocimiento de la separación, lavado la proteína libre de marca de la columna después de cada separación, y dializar la proteína eluida en PBS. La Figura 54 muestra un análisis por transferencia Western de proteína ABD K coil purificada por la resina de purificación PROFINITY EXACT™ (pequeña escala de 10 mi de cultivo).
La proteína Kcoil-AFD obtenida de la resina de purificación PROFINITY EXACT™ PURIFICACIÓN RESIN se purificó en forma adicional con el uso de SDS-PAGE (Figura 55). El cultivo de 250 mi E. coli produjo 6,523 mg de proteína purificada (Tabla 18).
El DART KYK2 4420 VF E coil y la proteína coil ABD se incubaron en PBS durante 30 min a temperatura ambiente para formar un ABD DART E Coil - K Coil que tiene propiedades mejoradas. Los resultados de ELISA muestran que todos los dominios en el complejo son capaces de unirse a sus respectivos ligandos (Figuras 56A-56C). Si se desea, la purificación adicional del complejo KYK2 4420 VF E coil y K-ABD puede lograrse con el uso de una columna anti-E .
Dado que la formación del complejo es independiente de los dominios articulares de unión del DART, el método anterior puede usarse para generar E Coil - K Coil DARTS ABD que tienen otras especificidades (por ejemplo, por formación de complejo de CD32B (por ej., anticuerpo 2B6) / CD16A (por ej., anticuerpo 3G8) VF E DART con un ABD K Coil).
De este modo, como se indicó con anterioridad, en una realización de la invención, ambos dominios de unión antígeno que se une a los polipéptidos del DART pueden comprender una secuencia adicional que sirve para conducir la formacón de heterodímero (por ej., un K coil o un E coil) y en forma opcional uno de dichos polipéptidos puede contener una porción de polipéptido de una proteína que se une al suero capaz de unirse a la proteína sérica (por ej., Figura 45). En una realización alternativa, uno, y con preferencia sólo uno, de los polipéptidos que contienen dominio que se une al antígeno del DART pueden comprender dicha secuencia adicional para conducir la formación de heterodímero (por ej., cualquiera de un K coil o un E coil) y el DART puede comprender un complejo con un polipéptido adicional (por ej., tercero) que no contiene un sitio que se une al antígeno, pero que comprende un polipéptido que tiene una secuencia complementaria para conducir la formación de heterodímero (por ej., un K coil donde el polipéptido que contiene el dominio de unión al antígeno del DART comprende un E coil; o un E coil donde el polipéptido que contiene el dominio que se une al antígeno del DART comprende un K coil) y en forma opcional una porción de polipéptido de una proteína que se une al suero capaz de unirse a la proteína sérica. La porción del polipéptido de dicha proteína que se une al suero de dicho polipéptido adicional (por ej. tercero) puedeubicarse N-terminal o C- terminal al polipéptido que tiene dicha secuencia complementaria. 6,21 DESINMUNIZACIÓN DEL DOMINIO QUE SE UNE A LA ALBÚMINA Como se discutió con anterioridad, las moléculas DART de la presente invención pueden diseñarse para comprender un dominio de unión a la albúmina (ABD) tales como el ABD de la proteína G de estreptococo, y con mayor preferencia el dominio que se une a la albúmina 3 (ABD3) de la cepa de la Proteína G de Estreptococo G148.
Con el fin de decrease la inmunogenicidad del ABD, las modificaciones de aminoácidos se introdujeron en residuos 60-79 de la secuencia de aminoácidos de ABD3: (SEC ID NRO.: 304): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE ILAALP 41 50 50 70 80 86 y se midió el efecto de dichas variaciones sobre la unión de HSA (Tabla 19).
Para mejorar en forma adicional los ABDs, fue deseable atenuar o eliminar la unión de MHC clase II. Los péptidos de Y60 y Y61 comparten un residuo de bolsillo común en N66 (P6/P7) y también L64 y 165 comparten un residuo de bolsillo P6/P7 en T70. La mutación de N66 a D o E en combinación con T70D se postuló por lo tanto porque tiene la capacidad de eliminar en forma efectiva la unión de MHC clase II. En forma alternativa, se postuló que la unión de MHC clase II podría eliminarse dirigiendo las cuatro anclas pl Y60, Y61, L64 y 165. De acuerdo con lo anterior se condujo un análisis de proceso de mutación de dos ciclos. La Tabla 20 muestra el resultado del primer ciclo de análisis mutacional.
Los resultados muestran que la mutación del ancla pl V71 en A fue la opción más efectiva, y sugiere una combinación (1+3) o combinación (2+3). Todas las combinaciones analizadas funcionaron excepto T70D y Y60G.
Los resultados del segundo ciclo de análisis de mutación se muestran en la Tabla Tabla 22.
La Tabla 23 proporciona un resumen de los resultados obtenidos de los dos ciclos de análisis de mutación.
En base a resultados de mutación por combinación, las siguientes combinaciones de sustituciones se consideran sustituciones preferidas para formar un dominio de unión a la albúmina desinmunizada: 66S/70S +71 A; 66S/70S +7 A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64 A/65 A/79 A+66E. El asterisco ("*") denota la posición 71? Pl y la posición 79? P9.
Como se muestra en la Figura 57, las variantes ABD que tienen las modificaciones L64A, I65A and D79A o las modificaciones N66S, T70S y D79A: LAEAKVLANR ELDKYGVS DY YKNA6 A65NNAKT VEGVKALIA79E I LAALP (SEC ID NRO.: 323), LAEAKVLANR ELDKYGVS DY YKNLI S66NAKS70 VEGVKALIA79E I LAALP (SEC ID NRO.: 324), exhibieron unión sustancialmente de tipo salvaje.
Las variantes ABD 61 A/65 A, 61A/66D, 64 A/65 A* y 64A/66D se evaluaron junto con el tipo salvaje para determinar su capacidad de unirse a la albúmina. Los resultados de dichos ensayos se muestran en Figura 58. Las variantes ABD 64G/66D, 65A 66D, 66S/70S* y 61A/66S/70S se evaluaron junto con el tipo salvaje para determinar su capacidad de unirse a la albúmina. Los resultados de dichos ensayos se muestran en Figura 59. La Figura 60 muestra los resultados de ensayos de unión a la albúmina para las variantes ABD Y60A/Y61A, Y60T/Y61A, I65A/N66D/V71A, Y61A/I65A/V71A, L64A/N66D/V71A y para el tipo salvaje (SEC ID NRO.: 304). La Figura 61 muestra los resultados de ensayos de unión a la albúmina para las variantes ABD Y60A/Y61A/V71A, Y60T/Y61A/V71A, L64A/I65A/V71A y para el tipo salvaje. La Figura 62 muestra los resultados de ensayos de unión a la albúmina para las variantes ABD L64G/I65A/V71A, L64G/N66D V71A, Y61A/T70S, N66S, T70S, Y61A/N66S, L64A/I65A y para el tipo salvaje. 6.22 EVIDENCIA DE DESINMUNIZACIÓN DE DOMINIO QUE SE UNE A LA ALBÚMINA Las variantes ABD, que incluyen en particular variantes en la posición V71 (por ej., V71A) exhiben una menor inmunogenicidad. Para demostrar dicha desinmunización, tres muestras de péptidos se evaluaron para determinar el potencial inmunogénico con el uso de ensayos de células T en el tiempo EpiScreen™. Las muestras evaluadas fueron fregmentos 21-mer (Y60-E80) ) del péptido tipo salvaje ABD (SEC ID NRO.: 304): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE 41 50 60 70 80 ABD Y60-E80 wt ("Muestra 1") (SEC ID NRO.: 325): Y YKNLINNAKT VEGVKALIDE ABD Y60-E80 Variante N66D/T70S/V71A ("Muestra 2") (SEC ID NRO.: 326): Y YKNLID66NAKS7o A71EGVKAL I DE y ABD Y60-E80 Variante L64 A/165 A/V71 A ("Muestra 3") (SEC ID NRO.: 327): Y YKNA64A65NNAKT A71EGVKAL I DE Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de capas leuco plaquetanas de donantes comunitarios sanos (de sangre extraída dentro de 24 horas). Se aislaron PBMC de capas leuco plaquetanas por centrifugado por densidad Lymphoprep™ (Axis-shield, Dundee, UK) y células T CD8+ se eliminaron con el uso de CD8+ RosetteSep™ (StemCell Technologies Inc, London, UK). Los donantes se caracterizaron por identificación de haplotipos HLA-DR con el uso de un kit para tipificación de tejidos basado en HLA SSP-PCR (Biotest, Solihull, UK). Las respuestas de las células T al control de antígenos (Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), [Pierce (Perbio), Cramlington, UK)] así como también péptidos derivados de Gripe A y virus de Epstein Barres también se determinaron. Las PBMC se congelaron y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta que se requirió. Se empleó un cohorte de 50 donantes, cuyos alotipos indicaron que la cobertura de > 80% de los alotipos mundiales se había logrado y que los alotipos HLA-DR mayores (alotipos individuáis con una frecuencia de >5% expresados en la población mundial) fueron bien representados.
Las PBMCs de cada donante se descongelaron, re realizó el recuento y se evaluó la viabilidad. Las células se revivieron a temperatura ambiente en medio de cultivo AIM-V®, se lavaron y se re-suspendieron en AIM-V® hasta 4-6 x 106 PBMC/ml. Para cada donante, los cultivos celulares se establecieron en los cuales se agregó lml de stock de células de proliferación a los pocilios aproximados de una placa de 24 pocilios. Se agregaron medio de cultivo (0,5 mi) y péptido de análisis (0,5 mi) al PBMC para dar una concentración final de 5 µ?. Para cada donante, un control de reproducibilidad (células incubadas con 100 µg/ml KLH), y un pocilio de "sólo medio de cultivo" también se incluyeron. Se incubaron los cultivos durante un total de 8 días a 37°C con 5% C02. En los días 5, 6, 7 y 8, las células en cada pocilio se re-suspendieron suavemente y se transfirieron 3 alícuotas de 100 µ? a cada pocilio de una placa de 96 pocilios de base redonda. Los cultivos se pulsaron con 0,75 µ??' [ H]-Timidina (Perkin Elmer®, Beaconsfield, UK) en 100 µ? de medio de cultivo y se incubaron durante un adicional de 18 horas antes de cosechar sobre placas de filtro (Perkin Elmer) con el uso de un cosechador de células TomTec Mach III™. Los recuentos por minuto (cpm) para cada pocilio se determinaron por recuento por centelleo con Meltilex™ (Perkin Elmer®) en un 1450 Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter (Perkin Elmer®) en recuento de fondo bajo paralux.
Con el fin de evaluar el efecto de dicho tratamiento sobre la viabilidad celular, el día 7, los cultivos a granel pueden re-suspenderse suavemente y 20 µ? de cada muestra se retiraron de todos los donantes y se mezclaron con 20 µ? de azul trypan. Estas muestras luego pueden evaluarse para determinar la viabilidad con el uso de exclusión con colorante azul de tripan on un Countess® Automated Cell Counter (Invitrogen). La viabilidad con preferencia se expresa como porcentaje de azul de tripan excluido / total de recuento celular. En experimentos conducidos con la muestra 1 (tipo salvaje), y con varios péptidos de prueba distintos de la muestra 2 o muestra 3, se encontró que las células cultivadas permanecieron por sobre el promedio 87% de viabilidad para todos los donantes evaluados. La viabilidad promedio de las células incubadas con medios solos se calculó en un 90% mientras que las viabilidades promedio de células incubadas con péptidos de prueba fueron de 88, 88 y 87% respectivamente. La viabilidad de las células tratadas con KLH fue de 83% lo que no es significativamente diferente a la viabilidad de las células tratadas con péptido. Por lo tanto se concluyó que la incubación de las células (PBMC) con los péptidos no produjo toxicidad obvia durante el período de cultivo celular.
Los donantes idénticos a los usados en el ensayo de proliferación también se usaron para el ensayo IL-2 ELISpot™. Las células se descongelaron y se revivieron ocmo se describió con anterioridad. Las placas ELISpot (Millipore, Watford, UK) se mojaron previamente y se recubrieron durante toda la noche con 100 µ?/pocillo de anticuerpo de captura IL-2 (R&D Systems, Abingdon, UK) en PBS. Luego se lavaron las placas 3 veces en PBS, se incubaron durante toda la noche en buffer de bloqueo (1% BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma) en PBS) y se lavaron en medio AIM-V®. La densidad celular para cada donante se ajustó hasta 4-6 x 106 PBMC/ml en medio de cultivo AIM V® y 100 µ? de células se agregaron a cada pocilio. 50 µ? del péptido de prueba y los controles se agregaron a los pocilios apropiados.
Los péptidos (ABD Y60-E80 ("Muestra 1"), ABD Y60-E80 Variante N66D/T70S/V71A ("Muestra 2") (SEC ID NRO.: 326) o ABD Y60-E80 Variante L64A/I65A/V71A ("Muestra 3") (SEC ID NRO.: 327) se agregaron a los cultivos a granel de PBMC desprovistas de CD8+. Después de la incubación con las muestras, la proliferación de céluloas T CD4+ se midió por incorporación de [3H]-timidina en varios momentos de medición con medición paralela adicional de la secreción de con el uso de ELISpot™ (el ensayo IL-2 ELISpot™ comprende una membrana pre-recubierta con anticuerpo de captura que se une a la citoquina secretada). Los péptidos se diluyeron en medio de cultivo AIM-V® (Invitrogen, Paisley, UK) inmediatamente antes de usar y la concentración del ensayo final fue 5µ?. KLH se usó como control de reproducibilidad y se almacenó a -20°C como 10 mg/ml de solución stock en agua. Para los estudios, una alícuota de KLH se descongeló antes de diluir inmediatamente a 400 µg/ml en AIM-V® (concentración final 100 µg/ml). Se usó fitohemaglutinina (PHA, Sigma, Poole, UK) como control positivo en el ELISpot™ y un stock de 1 mg/ml se almacenó a -20°C antes de diluir hasta una concentración final de 2,5 µg/ml en cultivos celulares.
Los péptidos de análisis se evaluaron en cultivos por sextuplicado y, para cada donante, un control negativo (AIM-V® de medio solo), ningún control celular y un control positivo de mitógeno (PHA at 2,5 µ©??1 - usado como análisis interno ELISpot™ para la función y viabilidad ceular, Sigma) también se incubaron en cada placa. Luego de un período de incubación de 8 días, las placas ELISpot™ se desarrollaron por lavado secuencial en dH20 y PBS (x3) antes de el agregado de 100 µ? de anticuerpo de detección biotinilado, filtrado (R&D Systems) en PBS / 1% BSA. Luego de la incubación a 37°C durante 1,5 horas, las placas se lavaron en forma adicional en PBS (x3) y 100 µ? estreptavidina-AP filtrada (R&D Systems) en PBS / 1% BSA se agregó durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La etreptavidina-AP se descartó y las placas se lavaron en PBS (x4). Se agregó sustrato BCIP/NBT (R&D Systems) (100 µ?) a cada pocilio y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. El desarrollo de manchas se detuvo por lavado de los pocilios y las partes traseras de los mismos tres veces con dH20. Las placas secas se escanearon en un Analizador Immunoscan® y se determinaron las manchas por pocilio (spw) con el uso de software Immunoscan® Versión 4.
Para los ensayos de proliferación y IL-2 ELISpot™, las muestras que inducen respuestas iguales a o de más del doble del umbral empírico de un índice de estimulación (SI) (SI > 2,00) se consideraron positivas. Para ambos datos de grupos de proliferación (n=3) e IL-2 ELISpot (n=6), las respuestas positivas se definieron por umrales estadísticos y empíricos: La importancia (p < 0,05) de la respuesta por comparación de cpm o spw de los pocilios de prueba contra pocilios de control de medio con el uso de test-t de Student de dos muestras no equivalentes; índice de estimulación de más de o igual que 2 (SI>2,00), donde SI = promedio de los pocilios de prueba (cpm o spw) / datos iniciales (cpm o spw). Los datos presentados de este modo se indican como SI > 2,00, p < 0,05. Además, se analizó una variación dentro del ensayo mediante el cálculo del coeficiente de varianza y la desviación estándar (SD) de la materia prima de cultivos replicados.
Se encontró que el péptido tipo salvaje induce las respuestas de proliferación positivas en el enayo de proliferación de células T con el tierno EpiScreen™ de las respuestas de células CD4+ T con un SI >2,00 (p < 0,05) en siete donantes que incluyen una respuesta de frontera (SI > 1,90 (p < 0,05)) lo que da una frecuencia de respuesta del 14%. La magnitud promedio (SI) de las respuestas positivas de proliferación de células T (S I> 2,00 p< 0,05) contra el péptido tipo salvaje fue SI 2,55, lo que fue levemente superior a los dos péptidos desinmunizados (Tabla 24). La Tabla 24 proporciona un resumen de magnitud (± SD) de respuestas positivas de proliferación de células T contra los péptidos de análisis y KLH. El SI promedio se calculó a partir del promedio de todas las respuestas de donantes positivas observadas durante el transcurso de tiempo completo (SI>1,90), p<0,05).
De este modo, del ensayo de proliferación, la magnitud (SI) de la respuesta de células T junto con la frecuencia (%) de donantes que responden en el cohorte del estudio indica que el potencial inmunogénico del péptido tipo salvaje se consideró moderada, mientras que el potencial inmunogénico de los péptidos desinmunizados se consideró bajo. Estos datos justifican el hecho de que la eliminación de epítopes de células T específicas tipo salvaje fue exitosa por las mutaciones en N66D/T70S/V71 A y L64A/I65A/V71 A.
Los tiempos generales de las respuestas proliferativas pueden proporcionar una indicación respecto de la potencial respuesta de las células T (naive o recaída). La proliferación máxima de células T detectadas el día 5 indica que las frecuencias existentes del precursor de células T son altas mientras que la proliferación máxima el día 8 indica una baja frecuencia de precursor existente de células T. Un alto potencial inmunogénico sería concordante con la estimulación de células T durante la fase inicial del transcurso del tiempo. El péptido de prueba ABD Y60-E80 Variante N66D/T70S/V71A ("Muestra 2") (SEC ID NRO.: 326) dio 1, 0, 1, y 1 respuesta los días 5, 6, 7, y 8, respectivamente. El péptido de prueba ABD Y60-E80 Variante L64A/I65A/V71A ("Muestra 3") (SEC ID NRO.: 327) dio 0, 1, 2, y 1 respuesta los días 5, 6, 7, y 8, respectivamente. La baja cantidad de donantes que responden observados contra N66D/T70S/V71 A y L64 A/165 A V71 A hace que este tipo de análisis de cinética de la respuesta de proliferación de células T sea difícil de interpretar aunque las pocas respuestas que se observaron contra estas muestras ocurrieron en la última etapa y justifican la noción de que los individuos sanos no se ceban contra epítopes de células T en estas secuencias.
Similar a lo que ocurre en el ensayo de proliferación, se registraron respuestas positivas en donantes que produjeron un S I> 2,00 con una diferencia significativa (p < 0,05) observada entre los antecedentes y spw de prueba (control de medio sin tratar). El péptido N66D/T70S/V71A indujo al 6% de los donantes a responder positivamente en el ensayo IL-2 ELISpot y el péptido L64A/I65A/V71A indujo 4% respuestas positivas. Esto ocurre en contraste con los resultados observados para la secuencia tipo salvaje en la cual se detectaron respuestas positivas IL-2 ELISpot en el 20% del cohorte de donantes. La magnitud promedio de respuestas positivas de las células T de ambos péptidos desinmunizados fue baja a 2,02 y 2,43 (Tabla 25) respectivamente, y esto fue similar a lo observado para el péptido tipo salvaje. La Tabla 25 proporciona un resumen de la magnitud (±SD) de respuestas positivas a la secreción de IL-2 de células T (SI>2,00, p<0,05) contra los péptidos de prueba y KLH. El SI promedio se calculó a partir del promedio de todas las respuestas positivas observadas de donantes. Los datos incluyen respuestas de proliferación del límite (SI>1 ,90, p<0,05).
Para los dos péptidos de prueba, la correlación general entre los datos del ensayo de proliferación y IL-2 ELISpot™ fue alta donde el 100% y 67% de los donantes que respondieron positivamente en el ensayo de proliferación también respondieron en el ensayo de IL-2 ELISpot. Esta alta correlación entre los dos ensayos también se observó en el KLH de control de reproducibilidad donde 98% de los donantes que respondieron en el ensayo de proliferación también produjeron respuestas en el ensayo de IL-2 ELISpot™ (rango típico 85-100% para el enayo de células T con el transcurso del tiempo EpiScreen™). De este modo, para ambos ensayos de proliferación y de IL-2 ELISpot™, la frecuencia y la magnitud de las respuestas de células T contra los péptidos N66D/T70S/V71 A y L64A/I65A/V71A sugieren que puede considerarse que ambos tienen un bajo potencial de inmunogenicidad clínica, cuando se compara con el alto riesgo de inmunogenicidad clínica del péptido tipo salvaje.
Los datos del ensayo de proliferación y de IL-2 ELISpot muestran que se detectaron respuestas positivas de las células T contra los péptidos de análisis en una cantidad de los donantes. La correlación general entre los ensayos de proliferación e IL-2 ELISpot fue del 98% para KLH, 70% para el péptido tipo salvaje, y 100% y 67% para N66D/T70S/V74A y L64A/I65A/V74A respectivamente. Por lo tanto, los donantes que responden se definieron como aquellos que montaron una respuesta positiva a cada muestra en ambos ensayos de proliferación y de IL-2 ELISpot. Todos los donantes produjeron una respuesta positiva de las células T contra PHA lo que indica que las células en los cultivos ex vivo fueron funcionales. El análisis de los conjuntos de datos combinados de estos dos ensayos indicó que la frecuencia general y la magnitud de las respuestas en ambos ensayos de proliferación y ELISpot era baja para los dos péptidos desinmunizados con 4% de los donantes que respondieron contra ambos N66D/T70S/V71A y L64A/I65A/V71A. Esto ocurre en contraste con los resultados del estudio obtenidos para el péptido tipo salvaje (que tenía una cantidad significativamente superior de respuestas positivas (14% de los donantes respondieron en ambos ensayos de proliferación y de IL-2 ELISpot)). No se llevaron a cabo análisis de ya que las respuestas a los dos péptidos de prueba fueron por debajo del umbral mínimo para este tipo de análisis.
En suma, el ensayo de células T con el paso del tiempo EpiScreen™ se usó para determinar el potencial de inmunogenicidad clínica de dos péptidos de prueba. La capacidad de los péptidos para inducir respuestas de células T CD4+ medidas por proliferación y IL-2 ELISpot se analizó contra un panel de 50 donantes clasificados como HLA. Los datos del estudio del péptido tipo salvaje habían indicado que el riesgo potencial de inmunogenicidad para el péptido tipo salvaje cue moderado ya que la frecuencia combinada de respuestas de proliferación e IL-2 respuestas fue del 14% en estudio de cohorte. Sin embargo la frecuencia combinada de respuestas de proliferación e IL-2 a los dos péptidos desinmunizados en este estudio fue baja donde 4% de los donantes respondieron contra N66D/T70S/V71A y 6% de los donantes respondieron contra L64A/I65A/V71A.
Los ensayos de células con el transcurso del tiempo EpiScreen™ de múltiples productos biológicos comerciales han demostrado una clara correlación entre el porcentaje de respuestas de células T de donantes en el ensayo EpiScreen™ y el nivel de inmunogenicidad (respuestas del anticuerpo terapéutico anti-proteína) observado en la clínica. Se observaron respuestas de donantes de alta frecuencia en los ensayos EpiScreen™ para anticuerpos inmunogénicos tales como Campath, mientras que se observaron respuestas de donantes de frecuencia relativamente baja para anticuerpos no inmunogénicos tales como Xolair y Herceptina. En general, los productos terapéuticos con proteínas que inducen >10% de respuestas positivas en el ensayo EpiScreen™ están asociados con un riesgo significativo de inmunogenicidad en la clínica. En comparación con productos terapéuticos analizados en ensayos EpiScreen™, los datos muestran que los péptidos desinmunizados N66D/T70S/V71 A y L64A/I65A/V71A dan respuestas de células T CD4+ que caen dentro del mismo rango que Xolair, Herceptin y Avastin, y se consideraría que tienen un bajo riesgo potencial de inmunogenicidad. Por lo tanto, se concluye que los péptidos desinmunizados exhiben un perfil de inmunogenicidad favorable en el ensayo de inmunogenicidad EpiScreen™. 6.23 PROPIEDADES FARMACOCINÉTICAS MEJORADAS in vivo DE ABD-DARTS Como se discutió con anterioridad, el dominio que se une a la albúmina (ABD) de la proteína G de estreptococo se fusionó con el extremo terminal C de un DART (lejos de los sitios de unión al antígeno) ("ABD-DART") con el fin de mejorar las propiedades de farmacocinética in vivo del DART. El estudio de farmacocinética de dichos ABD-DARTs mostraron un tiempo de circulación prolongado, con un aumento de la vida media terminal de 35,1 h cuando se compara con 1,2 h para DARTs regulares (que carece de ABD). El análisis In silico reveló que hay cinco posiciones de ancla pl con alto potencial de unión a MHC clase II en la secuencia de ABD. Con el fin de producir versión desinmunizada de ABD, mutaciones orientadas al sitio se realizaron en base a la predicción provista por el análisis in silico. Luego de varios ciclos de mutaciones simples y combinadas, dos variantes ABD, "ABD (AAA)" y "ABD (DSA)" se obtuvieron con afinidad similar o menor con relación a la del ABD tipo salvaje con albúmina de suero.
L64 A/165 A/V71 A ("ABD (AAA)") (SEC ID NRO.: 328): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT A71EGVKALIDE ILAALP N66D/T70S/V71 A ("ABD (DSA)") (SEC ID NRO.: 329): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS7o A71EGVKALI DE ILAALP Estas dos variantes mostraron mayor reducción en el puntaje de unión con péptidos MHC clase II (Tabla 26).
Para observar la vida media sérica de estas dos variantes ABD, se condujo el estudio in vivo de PK en ratones C57B1/6 con una sola inyección IV de las proteínas a 5 mg/kg. El estudio de PK mostró un tiempo de circulación prolongado similar del ABD muíante (DSA) al ABD tipo salvaje (Figura 63). El otro mutaníe, hCD16xhCD32B ABD (AAA) DART permaneció algunas horas más en el suero que el hCD16xhCD32B EK DART básico. El estudio demuestra de este modo que a pesar de la menor afinidad con albúmina; la fusión de la versión desinmunizada de ABD, (es decir, ABD (DSA)) aumenla drásticamente la vida media sérica de Proteínas DART. Dicha mayor vida media sérica puede ser ventajosa para usar este ABD-DART menos inmunogénico como potencial candidato terapéutico, en especial con dosis menos frecuente y/o más baja. Los perfiles de PK de hCD16xhCD32B DARTS ABD se muestran en Tabla 27.
Tabla 27: Perfiles de PK de hCD16xhCD32B DARTS ABD (cantidad de concentración con el tiempo está en Cmax); AUC (Área bajo la curva (el valor es proporcional a la cantidad total en la sangre del paciente) 6.24 EFECTO DEL AUMENTO DE LA VALENCIA DE ABD SOBRE LA VIDA MEDIA IN VIVO DE ABD-DARTS RECOMBI ANTES Se construyeron diferente Proteínas ABD DART, ya sea por fusión de ABD al final de ambas cadenas (Figura 64A) o por fusión de ABDs en tánden al final de una cadena (Figura 64B). Una construcción también se hizo por fusión de ABD(AAA) en el extremo terminal C de ambase cadenas. En este estudio hCD16xhCD32B Fe DART se generó para comparar la vida media sérica, todas las variantes de ABD mostraron unión biespecífica con ambos de los antígenos (Figura 65). Para observar la vida media sérica de todos estos DARTS ABD y DARTS Fe, se condujo un estudio de PK in vivo en ratones C57B1/6 con una única inyección IV de las proteínas a 5 mg/kg. El resultado muestra que la propiedad de extender la vida media de ABD recibe la influencia de la valencia de unión a la albúmina (Figura 66). La vida media terminal de DART fusionado con dos ABDs es inesperadamente tres veces mayor que la de DART con un ABD (Tabla 28).
Muchas modificaciones y variaciones de esta invención pueden realizarse sin alejarse de su espíritu y alcance, como resultará obvio para aquellos con experiencia en la materia. Las realizaciones específicas descritas en este documento se ofrecen por medio de ejemplo solamente, y la invención se limitará solamente por los términos de las reivindicciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los cuales se refieren las reivindicaciones. Dichas modificaciones pretenden caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias, patentes y no patentes, citadas en este documento se incorporan en este documento a modo de referencia en sus totalidades y para todos los fines hasta el mismo punto que si cada publicación individual o patente o solicitud de patente se incorporara a modo de referencia en su totalidad para todos los fines.

Claims (24)

REIVINDICACIONES:
1 - Un polipéptido que comprende una porción de una proteína desinmunizada que se une al suero capaz de unirse a dicha pro teína del suero; en donde dicha porción de la proteína que se une al suero extiende la vida media sérica de dicho polipéptido, con relación a la vida media sérica de dicho polipéptido si carece de dicha porción de dicha proteína desinmunizada que se une al suero.
2 - El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende una porción adicional de una proteína desinmunizada que se une al suero, en donde dichas porciones de dicha proteína desinmunizada que se une al suero son ambas capaces de unirse a dicha proteína del suero.
3 - El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha porción de dicha proteína desinmunizada que se une al suero es una porción de un dominio de unión a la albúmina desinmunizada (ABD) de una Proteína G de Estreptococo, o una de sus variantes que se unen a la albúmina.
4 - El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho dominio de unión a la albúmina (ABD) de dicha Proteína G de estreptococo es un dominio que se une a la albúmina 3 (ABD3) de la cepa de la Proteína G de Estreptococo G148.
5 - El polipéptido de la reivindicación 4, en donde dicho dominio de unión a la albúmina comprende: (A) una variación de valina a alanina en la posición 71, en la posición 74, o en la posición 79; (B) una variación de leucina a alanina en la posición 64, variación de isoleucina a alanina en la posición 65, y variación de valina a alanina en la posición 71 ; o (C) una variación de asparagina a ácido aspártico en la posición 66, una sustitución de treonina a serina en la posición 70, y una variación de valina a alanina en la posición 71.
6 - El polipéptido de la reivindicación 4, en donde dicho dominio de unión a la albúmina tiene la secuencia de la SEC ID NRO.: 304, SEC ID NRO.: 323, SEC ID NRO.: 324, SEC ID NRO.: 325, SEC ID NRO.: 326, SEC ID NRO.: 327, SEC ID NRO.: 328, o SEC ID NRO.: 329.
7 - El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho polipéptido comprende una molécula que se une a los antígenos.
8 - La molécula que se une al antígeno de la reivindicación 7, en donde dicha molécula es un diacuerpo compuesto por lo menos por una primera y una segunda cadena de polipéptidos las cuales interactúan entre sí para formar dos sitios que se unen al antígeno, en donde por lo menos one de dicha cadena de polipéptidos comprende dicha segunda porción del polipéptido que comprende dicha porción de dicha proteína desinmunizada que se une al suero que es capaz de unirse a dicha proteína del suero.
9 - El diacuerpo de la reivindicación 7, en donde ambas de dicha primera y segunda cadenas de polipéptidos comprenden segundas porciones de polipéptidos que comprenden dicha porción de dicha proteína desinmunizada que se une al suero capaz de unirse a dicha proteína del suero.
10 - El diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en donde dicha primera y dicha segunda cadenas de polipéptidos se unen en forma covalente entre sí.
11 - El diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde dicho diacuerpo se une a: (A) el receptor del Grupo 2D Asesino Natural o el receptor de células T (TCR); y (B) un antígeno asociado con el tumor.
12 - La molécula que se une al antígeno de la reivindicación 7, o la molécula de diacuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde said antigen is un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de ovarios, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de cáncer de cuello de útero, un antígeno de cáncer de páncreas, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de vesícula, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer de testículos, un antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una enfermedad de las células B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no de Hodgkins, o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.
13 - El uso de una porción de polipéptido de una proteína desinmunizada que se une al suero para extender la vida media sérica de un polipéptido ligado en forma covalente, dicha extensión de la vida media sérica es con relación a la vida media sérica de dicha molécula que se une al antígeno si carece de dicha proteína que se une a la albúmina.
14 - El uso de reivindicación 13, en donde dicho polipéptido comprende una porción adicional de una proteína desinmunizada que se une al suero, en donde dichas porciones de dicha proteína desinmunizada que se une al suero son ambas capaces de unirse a dicha proteína del suero.
15 - El uso de cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en donde dicha porción de dicha proteína desinmunizada que se une al suero es una porción de an albúmina-dominio de unión (ABD) de una Proteína G de Estreptococo, o una de sus variantes que se unen a la albúmina.
16 - El uso de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicho dominio de unión a la albúmina (ABD) de dicha Proteína G de estreptococo es un dominio que se une a la albúmina 3 (ABD3) de la cepa de la Proteína G de Estreptococo G148.
17 - El uso de reivindicación 16, en donde dicho dominio de unión a la albúmina comprende: (A) una variación de valina a alanina en la posición 71, en la posición 74, o en la posición 79; (B) una variación de leucina a alanina en la posición 64, variación de isoleucina a alanina en la posición 65, y variación de valina a alanina en la posición 71 ; o (C) una variación de asparagina a ácido aspártico en la posición 66, una sustitución de treonina a serina en la posición 70, y una variación de valina a alanina en la posición 71.
18 - El uso de reivindicación 16, en donde dicho dominio de unión a la albúmina tiene la secuencia de la SEC ID NRO.: 304, SEC ID NRO.: 323, SEC ID NRO.: 324, SEC ID NRO.: 325, SEC ID NRO.: 326, SEC ID NRO.: 327, SEC ID NRO.: 328, o SEC ID NRO.: 329.
19 - El uso de cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en donde dicho polipéptido comprende una molécula que se une a los antígenos.
20 - El uso de reivindicación 19, en donde dicha molécula que se une al antígeno es un diacuerpo compuesto por lo menos por una primera y una segunda cadena de polipéptidos las cuales interactúan entre sí para formar dos sitios que se unen al antígeno, en donde por lo menos one de dicha cadena de polipéptidos comprende dicha segunda porción del polipéptido que comprende dicha porción de dicha proteína desinmunizada que se une al suero que es capaz de unirse a dicha proteína del suero.
21 - El uso reivindicación 20, en donde ambas de dicha primera y segunda cadenas de polipéptidos comprenden segundas porciones de polipéptidos que comprenden dicha porción de dicha proteína desinmunizada que se une al suero capaz de unirse a dicha proteína del suero.
22 - El uso de cualquiera de las reivindicaciones 20-21, en donde dicha primera y dicha segunda cadenas de polipéptidos se unen en forma covalente entre sí.
23 - El uso de cualquiera de las reivindicaciones 20-22, en donde dicho diacuerpo se une a: (A) el receptor del Grupo 2D Asesino Natural o el receptor de células T (TCR); y (B) un antígeno asociado con el tumor.
24 - El uso de cualquiera de las reivindicaciones 19-23, en donde dicho antígeno es un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de ovarios, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de cáncer de cuello de útero, un antígeno de cáncer de páncreas, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de vesícula, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer de testículos, un antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una enfermedad de las células B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con linfoma no de Hodgkins, o un antígeno asociado con leucemia linfocítica crónica.
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