CN110769898A - 使用嵌合抗原受体工程化自然杀伤细胞作为化学治疗药物运载体的联合癌症疗法 - Google Patents

使用嵌合抗原受体工程化自然杀伤细胞作为化学治疗药物运载体的联合癌症疗法 Download PDF

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Abstract

提供了组合物，所述组合物包含表达对CD19和Her2具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)的NK细胞、以及多个细胞表面结合的多层脂质体囊泡，所述多层脂质体囊泡载有用于抑制或杀伤肿瘤细胞而不对所述NK细胞产生毒性的有效量的一种或多种的抗癌治疗剂。还提供了使用这些组合物治疗患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的CAR工程化NK细胞，其中，以结合至这些CAR工程化NK细胞的表面上的颗粒(例如，交联的多层脂质体囊泡)递送有效量的抗肿瘤治疗剂，而不会对运载体NK细胞产生毒性。

Description

使用嵌合抗原受体工程化自然杀伤细胞作为化学治疗药物运 载体的联合癌症疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月22日提交的美国临时申请no.62/523,401(以引用的方式在此处将其公开内容整体并入本文)的优先权和权益。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的Grant No.AI068978的政府支持下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本文描述了用于治疗癌症的组合物和方法。
背景技术
将本文中的所有出版物以引用的方式并入，其程度如同将每个单独的出版物或专利申请具体且单独地指示为以引用的方式并入一样。下面的描述包括对于理解本发明可能有用的信息。这并不是承认本文提供的任何信息都是现有技术或者与目前所请求保护的发明相关，或者任何明确或隐含地引用的出版物都是现有技术。
常规化学治疗药物的治疗局限包括化疗耐药性、肿瘤复发和转移。已经出现了许多基于纳米颗粒的主动靶向方法以增强肿瘤细胞中药物的细胞内浓度。然而，将这些系统有效递送至肿瘤部位同时使健康组织免受伤害仍然难以达到。
近来，由于免疫细胞可运输至肿瘤和炎性部位，因此对人免疫细胞定向的纳米颗粒药物递送给予了很多关注。自然杀伤细胞是在癌症免疫监视中起重要作用的细胞毒性淋巴细胞的亚组。将人自然杀伤细胞系NK92工程化成表达嵌合抗原受体来重定向它们的抗肿瘤特异性已显示出重大的前景。
因此，本发明的目的是提供将基于细胞的免疫疗法与化学治疗剂相结合来增强抗癌疗法的递送、功效和特异性的组合物和/或递送系统。
本发明的另一目的是提供通过利用免疫疗法和化学疗法来治疗患有肿瘤的受试者的方法。
发明内容
结合系统、组合物和方法对如下实施方式及其方面进行描述和说明，其意在示例和说明，而并不对范围进行限制。
提供了嵌合抗原受体(CAR)工程化免疫效应细胞来改善肿瘤靶向递送和功效，其中，所述CAR包含细胞外抗原特异性结构域，并且所述细胞表面结合有包含有效量的活性剂(例如化学治疗剂)的多个纳米颗粒或微米颗粒，以对靶细胞有功效而对运载体(CAR工程化免疫效应细胞)不具有细胞毒性。各种实施方式提供了所述免疫效应细胞为自然杀伤(NK)细胞。CAR工程化NK细胞具有编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸或在表面上表达CAR的多核苷酸。通常，结合的颗粒不被CAR工程化NK细胞内吞或内化，即使NK细胞具有吞噬能力。在一些方面，CAR工程化NK细胞携带有效量的活性剂(例如，化学治疗剂)来杀伤靶细胞，而不使它们自身屈服(succumbing)于化学治疗剂诱导的毒性。例如，在工程化免疫效应细胞:表达抗原的靶肿瘤细胞的细胞数比为1:1到10:1之间(例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1)时，每个CAR工程化NK细胞递送的抗肿瘤治疗剂的平均有效量导致至少10％、20％、30％、40％、50％或60％的所靶向的表达抗原的肿瘤细胞被抑制或杀伤，但不会使所述CAR工程化NK细胞产生多于1％、3％、5％、7％、10％或15％的细胞死亡或细胞毒性。其它实施方式提供了，工程化免疫效应细胞:表达抗原的靶肿瘤细胞的细胞数比大于10:1(例如11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、25:1)，这导致至少10％、20％、30％、40％、50％或60％的所靶向的表达抗原的肿瘤细胞被抑制或杀伤。通常，在体内(in vivo)模型中，通过缀合至NK细胞表面的纳米颗粒递送的化学治疗试剂获得抑制肿瘤生长和减小肿瘤尺寸所需的剂量可比游离的化学治疗试剂(无NK细胞)达到类似抑制或减小功效所需的剂量少至少8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍或200倍。
在各种实施方式中，与缺乏表面结合的载有活性剂的颗粒的CAR工程化NK细胞(无论这些细胞是单独给予还是以与游离、未结合的载有活性剂的颗粒的混合物给予)相比，给药后在表面上结合多个载有活性剂的颗粒的CAR工程化NK细胞在肿瘤环境中积聚并具有较高的浓度，并且使抗肿瘤功效增强。
与和不含抗原的靶细胞一起培养的CAR工程化NK细胞相比，当CAR工程化NK细胞与具有(所述CAR识别的)同源抗原的靶细胞一起培养时，所述颗粒与CAR工程化NK细胞表面的缀合增加了II型干扰素(IFN-γ)的释放。释放的IFN-γ使肿瘤细胞对NK细胞毒性敏感，并引发广泛的适应性免疫应答和先天免疫应答。
在一些实施方式中，CAR工程化NK92细胞优选于CAR工程化T细胞。相比T细胞，NK92细胞在更短的时间跨度内增殖，并且与亲代细胞系相同，从而使供体变异性的问题最小化。辐照后的NK92细胞通常对于在临床使用是安全的，与CAR工程化T细胞相比降低了脱靶效应的风险。如本文所公开的，包含CAR工程化和颗粒缀合的基于同种异体NK92细胞的疗法通常比基于自体CAR工程化T细胞的类似疗法便宜。
在一个实施方式中，CAR结合CD19。在另一实施方式中，CAR结合Her2。在进一步的实施方式中，所述细胞包含结合CD19和Her2的双特异性CAR。在一些实施方式中，所述细胞包含核酸，其中，所述核酸编码结合CD19和Her2的CAR。
在一些实施方式中，结合至CAR工程化NK细胞表面的颗粒是平均直径在1nm至1,000nm之间的纳米颗粒。在其它实施方式中，结合至CAR工程化NK细胞表面的颗粒是微米颗粒。示例性的颗粒包括脂质体或替代的脂质体制剂，例如交联的多层脂质体(cMLV)和受控释放聚合物纳米颗粒。在一些方面，cMLV作为活性剂运载体结合至表达CAR的NK细胞的表面，其中，interlipid双层在脂质体中交联，从而产生稳健的多层结构。在其它方面，聚合物纳米颗粒是活性剂运载体并结合至表达CAR的NK细胞的表面。取决于掺入的活性剂的溶解度，可选择疏水性聚合物或嵌段共聚物(例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或它们的共聚物)来形成用于活性剂从中受控释放的纳米颗粒。在一个实施方式中，将cMLV与CAR工程化NK细胞以大于500:1(例如约1,000:1或2,000:1)的数量比进行孵育，来产生每CAR工程化NK细胞约100-150个cMLV的缀合比。在其它实施方式中，取决于尺寸、化学构成和键合官能团，每CAR工程化NK细胞的缀合纳米颗粒数量为400-350、350-300、300-250、250-200、200-150或150-100。示例性的缀合化学过程在颗粒上官能化的马来酰亚胺基团与免疫效应细胞上的游离硫醇之间进行。任选地，存在颗粒与细胞表面之间的接头(例如通过聚乙二醇)。
示例性活性剂包括肿瘤治疗剂(例如紫杉醇和SN-38)、促炎细胞因子(例如白介素(IL)-15和IL-21)、检查点抑制剂(例如PD-1抑制剂，包括针对PD-1的抗体)以及免疫调节剂。在一个实施方式中，化学治疗试剂为紫杉醇。在另一实施方式中，将两种以上化学治疗试剂(例如紫杉醇和多柔比星)以结合至一种表达CAR的NK细胞表面的单独的纳米颗粒或同一纳米颗粒中递送。
还提供了包含NK细胞和药学上可接受的运载体的药物组合物，所述NK细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中，所述细胞进一步包含在表面上结合的封装有化学治疗试剂的交联多层脂质体囊泡(cMLV)。
本文进一步提供了治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的本文所述的细胞和/或药物组合物。
还提供了治疗患有肿瘤的受试者的方法，其中，向所述受试者给予包含具有表面结合的纳米颗粒的CAR工程化NK细胞(例如NK92细胞)的组合物，所述纳米颗粒包含抗癌治疗剂，以增强治疗剂的递送和功效并减少对正常组织的脱靶毒性。通常，CAR被设计成结合被给予组合物的受试者的癌细胞抗原。例如，在NK细胞中表达抗CD19 CAR、抗Her2CAR或二者皆有。
附图说明
在参考的附图中对示例性的实施方式进行说明。本文公开的实施方式和附图意图被视为说明性的、而非限制性的。
图1A-图1D描绘了NK92细胞与马来酰亚胺官能化的cMLV的缀合。图1A示出了与载有PTX的cMLV缀合的CAR.NK细胞的示意图。CAR衍生自抗体的单链可变片段(scFv)和T细胞受体信号传导复合物。可将CAR转导到NK92细胞中，而cMLV可通过与游离硫醇相互作用缀合至细胞表面。图1B示出了以不同的cMLV:细胞比例缀合至NK细胞表面的cMLV。将含有荧光染料DiD的cMLV与NK细胞在一定数量比范围内共同孵育。通过分析DiD荧光来计算每个细胞表面上的cMLV的数量。1000:1的比例提供了每细胞最大的cMLV量，并用于进一步的实验中。图1C示出了缀合载有DiD的cMLV(cMLV(DiD))的CAR.NK细胞的共聚焦显微镜图像。在与cMLV(DiD)缀合之前，用1μM CFSE标记CAR.NK细胞并用PBS洗涤。使用共聚焦显微镜使CAR.NK细胞表面上的cMLV可视化。图1D示出了缀合的cMLV的内化分析(internalization assay)。将CAR.NK细胞与羧基荧光素标签的马来酰亚胺标记的cMLV缀合。缀合后2小时，通过台盼蓝对细胞外缀合进行淬灭来区分表面结合的cMLV和内化的cMLV。cMLV附着到CAR.NK细胞没有触发细胞内化颗粒。汇总的统计数据在图表中示出(n＝3，平均值±SEM；NS，不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图1E描绘了转导的NK细胞中的CAR表达。未转导的NK细胞用作阴性对照(灰色阴影的峰)。在用FITC缀合的链霉亲和素与生物素化的蛋白L标记后，使用流式细胞术检测抗CD19 CAR。在用rhHer2-Fc嵌合体和PE标记的山羊抗人Fc标记后，用流式细胞术检测抗Her2CAR.NK细胞。
图1F描绘了缀合载有DiD的cMLV(cMLV(DiD))的CAR.NK细胞的共聚焦显微检查——3D和Z堆叠图像。在与cMLV(DiD)缀合之前，用1μM CFSE标记CAR.NK细胞，并用PBS洗涤。
图2A-图2B描述了CAR.NK细胞针对CD19+或Her2+靶细胞的细胞毒性。图2A示出了抗CD19 CAR.NK细胞的细胞毒性。将抗CD19CAR.NK细胞与CD19-SKOV3细胞或CD19+SKOV.CD19细胞以1:1、5:1或10:1的效应物-靶标比例共培养24小时，并测量细胞毒性。图2B示出了抗Her2 CAR.NK细胞的细胞毒性。将抗Her2 CAR.NK细胞与Her2-MDA.MB.468细胞或Her2+SKOV3细胞以1:1、5:1或10:1的效应物-靶标比例共培养24小时，并测量细胞毒性。汇总的统计数据在图表中显示(n＝3，平均值±SEM；NS，不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图2C描绘了经辐照(5Gy)的CAR.NK细胞和未经辐照的CAR.NK细胞之间的细胞毒性比较。将NK或CAR.NK细胞与SKOV.CD19细胞以1:1、5:1或10:1的效应物-靶标比例共培养24小时，并测量细胞毒性。
图2D描绘了暴露于PTX的SKOV3细胞和NK细胞的细胞活力分析。将细胞与各种浓度的cMLV(PTX)孵育。通过从处理的孔中获得的吸光度值减去从仅培养基的孔中获得的吸光度值，然后通过无药物但含有细胞的对照孔进行归一化，来测定细胞活力百分比。
图2E描绘了由游离cMLV和CAR.NK.cMLV而来的PTX释放动力学。为了获得细胞缀合之前和之后cMLV的PTX释放动力学，将cMLV(PTX)和CAR.NK.cMLV(PTX)在含10％FBS的培养基中于37℃下孵育，并且每天旋转沉降(spun down)并用新鲜培养基重悬。每天通过HPLC从移除的培养基中对PTX进行定量。
图3A-图3E描绘了当与cMLV缀合时CAR.NK细胞因子的释放和迁移。图3A和图3B示出了IFNγ染色分析。在具有布雷菲德菌素A蛋白转运抑制剂的情况下，将抗CD19(图3A)或抗Her2(图3B)的CAR.NK细胞与多种靶细胞共培养6小时，以检测IFNγ的释放。将未刺激的CAR.NK细胞作为阴性对照。CAR.NK细胞是未缀合的细胞或者缀合有空cMLV(CAR.NK.cMLV(空)，CAR.NK.cMLV(EMPTY))或载有PTX的cMLV(CAR.NK.cMLV(PTX))。用细胞内染色对IFNγ进行测量。图3C和图3D示出了细胞毒性分析。将抗CD19(图3C)或抗Her2(图3D)的CAR.NK细胞与多种靶细胞以1:1的比例共培养24小时，并对细胞毒性进行测量。CAR.NK细胞是未缀合的细胞或者缀合有空cMLV(CAR.NK.cMLV(空))或载有PTX的cMLV(CAR.NK.cMLV(PTX))。图3E示出了迁移分析。将未缀合的NK或与cMLV(空)缀合的NK铺在Transwell板的上室中。在下部孔中的阴性对照具有空白培养基(plain media)，CXCL9在非对照组的下部孔中用作化学引诱物。孵育6小时后，收集来自下室的培养基并对NK细胞进行计数。汇总的统计数据在图表中显示(n＝3，平均值±SEM；NS，不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图4A-图4F描绘了游离cMLV(DiD)和缀合的CAR.NK.cMLV(DiD)的生物分布。静脉注射后24小时(图4A和4B)、48小时(图4C和图4D)或72小时(图4E和图4F)的生物分布数据。向携带有皮下SKOV3.CD19肿瘤的NOD/scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠静脉注射2×107个缀合DiD标记的cMLV的CAR.NK细胞或单独的同等数量的DiD标记的cMLV(每组每时间点n＝3)。在24小时、48小时和72小时后，用剪刀将指定组织移出、称重并浸渍。使用IVIS光谱成像系统对每个器官的特异性DiD组织荧光进行量化，并计算每克组织注射剂量的平均百分比(％ID/g)作为最终读出。汇总的统计数据在图表中显示(n＝3，平均值±SEM；NS，不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图5描述了CAR.NK.cMLV(PTX)在实体瘤异种移植模型中的抗肿瘤功效。肿瘤生长曲线。在第0天，将SKOV.CD19细胞皮下注射到NSG小鼠的右侧胁腹。将小鼠随机分为六组(每组n＝5)，并根据它们的组描述，通过尾静脉注射间隔3-4天进行共四次处理。使用精细卡尺测量肿瘤尺寸(n＝5，平均值±SEM；NS，不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图6A-图6C描绘了CAR.NK.cMLV(PTX)处理的离体(ex vivo)分析。图6A示出了瘤内PTX浓度。将解冻的肿瘤样品均质化并使用HPLC分析PTX浓度(n＝3，平均值±SEM；NS，不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。图6B示出了固定的冷冻肿瘤切片的TUNEL分析。根据制造商的说明，使用TUNEL试剂盒对肿瘤切片进行染色，并用共聚焦显微术成像。本文示出了代表性图像。图6C示出了关于心脏毒性的组织学分析。将心脏组织固定并冷冻，并将切片安装在玻璃载片上。将冷冻切片用苏木精和伊红染色。通过光学显微术对组织病理学样本进行检查。本文示出了代表性图像。
具体实施方式
本文引用的所有参考文献都以引用的方式以其整体并入，如同进行了完全阐述一样。除非另外定义，本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Allen等,Remington:The Science and Practice ofPharmacy 22nd ed.,Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等,Introductionto Nanoscience and Nanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed.,revised ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2006)；Smith,March's Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 7th ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；Singleton,Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed.,Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 4th ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2012)为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般性指导。关于如何制备抗体的参考文献，参见Greenfield,Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor NY,2013)；
Figure BDA0002325899000000081
和Milstein,Derivation of specificantibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976Jul,6(7):511-9；Queen和Selick,Humanized immunoglobulins,美国专利No.5,585,089(1996Dec)；以及Riechmann等,Reshaping human antibodies fortherapy,Nature 1988Mar 24,332(6162):323-7。
本领域技术人员将认识到许多可用于本发明的实践中的与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料。通过与附图(其通过示例的方式说明了本发明的实施方式的各种特征)结合的以下详细描述，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。为方便起见，在此收集了本文在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。
除非另有说明或上下文有所暗示，以下术语和短语包括下面提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中显而易见，下面的术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域中已获得的含义。提供定义来帮助描述具体实施方式，并不旨在限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
如本文所使用的术语“包含/包括(comprising/comprises)”用于提及在实施方式中有用的组合物、方法及它们各自的组成部分，仍对包含未指明的要素(无论是否有用)保持开放。本领域技术人员将理解，总体而言，本文使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”、术语“具有”应解释为“至少具有”、术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”等)。
除非另有说明，在描述本申请的具体实施方式的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述”以及类似的用法可被解释为涵盖单数和复数两者。本文中对数值范围的列举仅旨在用作分别提及落入该范围内的每个单独的值的速记方法。除非本文另有指定，将每个单独的值并入说明书，如同其在本文中被单独列举一样。除非本文另有指定或上下文有明显矛盾，本文所述的所有方法均能够以任意合适的顺序进行。针对本文的某些实施方式提供的任意的和所有的实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明本申请，而非对另外要求保护的本申请的范围构成限制。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁文“exempli gratia”，在本文中用于指定非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与“例如(for example)”是同义词。不应将说明书中的任何语言解释为指定对本申请的实践必要的任何未要求保护的要素。
如本文所使用的术语“约”指可测量的值(如量、持续时间等)，并且涵盖给定值的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化。
本文所使用的“嵌合抗原受体”或“CAR/CARs”指将抗原特异性移植至细胞(例如NK细胞)上的工程化受体。CAR也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。在各种实施方式中，CAR为重组多肽，其包含抗原特异性结构域(ASD)、铰链区(HR)、跨膜结构域(TMD)、共刺激结构域(CSD)和细胞内信号传导结构域(ISD)。
“效应物功能”指分化细胞的特化功能。T细胞的效应物功能例如可为细胞溶解/细胞毒性活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。
如本文所使用的“基因修饰细胞所靶向的疾病”涵盖通过本发明的基因修饰细胞以任何方式参与任何疾病的任何细胞的靶向，而不考虑所述基因修饰细胞靶向患病细胞还是健康细胞来实现治疗上有益的结果。基因修饰细胞包括但不限于基因修饰T细胞、NK细胞、造血干细胞、多能胚胎干细胞或胚胎干细胞。本文所述的基因修饰细胞表达靶向特定抗原的CAR并以组合的方式用作化学治疗药物的递送运载体。可被靶向的抗原的实例包括但不限于在B细胞上表达的抗原；在癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤上表达的抗原；在各种免疫细胞上表达的抗原；以及在与各种血液疾病、自身免疫疾病和/或炎性疾病相关的细胞上表达的抗原。可被靶向的其它抗原对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可被本发明的CAR连同其替代实施方式靶向。
本文所使用的“自体”细胞指如下细胞：所述细胞衍生自与随后该细胞被返回给予的个体相同的个体。
本文所使用的“基因修饰细胞”、“重定向细胞”、“基因工程化细胞”、“工程化细胞”或“修饰细胞”指表达抗原特异性CAR并进一步具有携带治疗剂(例如化学治疗试剂)的颗粒的细胞，所述颗粒优选纳米颗粒如纳米级脂质体(例如多层脂质体囊泡)，其中，所述颗粒结合至所述细胞表面。在一些实施方式中，基因修饰细胞表达靶向特定抗原的CAR，并以组合的方式用作化学治疗药物递送运载体。
本文所使用的“免疫细胞”指哺乳动物免疫系统的细胞，包括但不限于抗原呈递细胞、B细胞、嗜碱性粒细胞、细胞毒性T细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、辅助T细胞、白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、记忆细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、吞噬细胞、浆细胞和T细胞。
包含CAR的细胞的术语“免疫效应功能”指受到刺激分子刺激后的表达CAR的细胞显示出的任何活性。免疫效应功能(例如在CAR-T细胞中)的实例包括细胞溶解活性和辅助活性(包括细胞因子的分泌)。
本文使用的“免疫效应细胞”包括T细胞和自然杀伤(NK)细胞。
如本文所使用的“免疫应答”指免疫(immunities)，包括但不限于先天免疫、体液免疫、细胞免疫、免疫、炎症应答、获得性(适应性)免疫、自身免疫和/或过度活跃的免疫。
如本文所使用的“CD4淋巴细胞”指表达CD4的淋巴细胞，即CD4+淋巴细胞。CD4淋巴细胞可为表达CD4的T细胞。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中是可互换的并且同义地使用。实例包括但不限于初始T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞或它们的组合。
如本文所使用的术语“抗体”指具有Fc(可结晶的片段)区域或Fc区域的FcRn结合片段(在本文中称为“Fc片段”或“Fc结构域”)的单克隆或多克隆抗原结合片段或完整的免疫球蛋白。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生抗原结合片段。抗原结合片段尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双抗体(diabodies)以及多肽(该多肽含有足以向该多肽赋予特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分)。Fc结构域包含有助于两类或三类抗体的两条重链的部分。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促切割(例如木瓜蛋白酶切割)或经由完整抗体的化学切割来产生Fc结构域。
本文所使用的术语“抗体片段”指仅包含完整抗体的一部分的蛋白片段，通常包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。由本定义涵盖的抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab'片段，其为在CH1结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward等，Nature 341，544-546(1989))，其由VH结构域构成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，其为包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)(Bird等，Science 242：423-426(1988)；以及Huston等，PNAS(USA)85:5879-5883(1988))；(x)带有两个抗原结合位点的“双抗体”，其包含与相同多肽链中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)(参见，例如，EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，所述Fd区段与互补轻链多肽一起形成抗原结合区域对(Zapata等，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)；以及U.S.Pat.No.5,641,870)。
本文所使用的“单链可变片段”、“单链抗体可变片段”或“scFv”抗体是指包含通过接头肽相接的仅重链(VH)和轻链(VL)的可变区的抗体形式。scFv能够作为单链多肽表达。scFv保留了其衍生自的完整抗体的特异性。只要保留了scFv对靶标抗原的特异性，轻链和重链可为任何顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH。
如本文所使用的“互补决定区”(CDR)指抗体可变区中的氨基酸序列，该区域赋予特异性和结合亲和力。通常，每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，每个重链可变区中有三个CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)。CDR的边界可以使用本领域公知的方法来确定，包括“Kabat”编号方案和/或“Chothia”编号方案(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，Public Health Services，美国国立卫生研究院，Bethesda，MD；Al-Lazikani等，(1997)JMB 273,927-948)。
本文所使用的术语“特异性结合”是指抗体与抗原之间至少10-6M结合亲和力的接触。在某些方面，抗体以至少约10-7M的亲和力结合，并优选10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-2M的亲和力。
如本文所使用的“治疗剂”指用于例如治疗、抑制、预防、减轻疾病作用、降低疾病严重性、降低发展出疾病的可能性、减缓疾病进展和/或治愈疾病的药剂。治疗剂所靶向的疾病包括但不限于传染病，癌症(包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤)，在各种免疫细胞上表达的抗原，和在与各种血液疾病相关的细胞上表达的抗原，和/或炎性疾病。
“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。术语“癌症”意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或侵袭阶段。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤(例如肉瘤、腺癌和癌)，如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮细胞)、前列腺和咽的实体瘤。腺癌包括恶性肿瘤，如多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一个实施方式中，癌症为黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。使用本发明的方法和组合物也可治疗或预防上述癌症的转移性病变。可治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物(neoplasm)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管新生、脊髓轴(spinal axis)肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的癌症)以及所述癌症的组合。可以使用本文所述的抗体分子影响转移性癌症(例如表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等(2005)Int.Immunol.17：133-144))的治疗。
如本文所使用的“多核苷酸”包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。
本文所使用的术语“分离的”是指基本上不含其它材料的分子或生物制品或细胞材料。在一个方面，术语“分离的”是指分别与存在于天然来源中的其它DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离的核酸(例如DNA或RNA)、或蛋白或多肽(例如抗体或其衍生物)、或细胞或细胞器、或组织或器官。术语“分离的”还指在通过重组DNA技术产生时基本不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或者在化学合成时基本不含化学前体或其它化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括不以片段的形式天然存在并且不会在天然状态发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还用于指与其它细胞蛋白分离的多肽，并且意在包括纯化的多肽和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还用于指与其它细胞或组织分离的细胞或组织，并且意在包括培养的细胞或组织和工程化的细胞或组织。
如本文所使用的“裸DNA”是指以适宜的方向克隆在合适的表达载体中用以表达的编码CAR的DNA。可使用的病毒载体包括但不限于SIN慢病毒载体、逆转录病毒载体、泡沫病毒载体(foamy virus vectors)、腺相关病毒(AAV)载体、杂合载体和/或质粒转座子(例如睡美人转座子系统)或基于整合酶的载体系统。可以与本发明的替代实施方式结合使用的其它载体对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
本文所使用的“靶细胞”是指疾病中所涉及的并且可由本发明的基因修饰细胞(包括但不限于基因修饰的T细胞、NK细胞、造血干细胞、多能干细胞和胚胎干细胞)靶向的细胞。其它靶细胞对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可以与本发明的替代实施方式结合使用。
如本文所使用的“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可通过其将多核苷酸序列(例如外源基因)导入宿主细胞以转化该宿主并促进所导入的序列表达(例如转录和翻译)的运载体。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。
如本文所使用的术语“给予/给药/施用”指通过导致药剂至少部分定位在期望部位的方法或途径将本文公开的药剂置于受试者中。
“有益结果”可包括但决不限于减弱或缓和疾病病情的严重性、防止疾病病情恶化、治愈疾病病情、防止疾病病情发展、降低患者发展出疾病病情的机会以及延长患者的寿命或预期寿命。作为非限制性实例，“有益结果”或“期望结果”可为一种或多种症状的缓和、缺陷程度的缩减、癌症进展的稳定(即不恶化)状态、转移或侵袭的延迟或减缓以及与癌症相关的症状的改善或减弱。
如本文所使用的术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善”指治疗性治疗，其中目的是逆转、缓和、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症有关的病情的进展或严重性。术语“治疗”包括减轻或缓和病情、疾病或病症(例如癌症)的至少一种不利作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，则治疗是大体上“有效的”。或者，如果疾病进展减少或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括在无治疗的情况下预期会出现的症状的进展或恶化的中止(或至少减缓)。有益或期望的临床结果包括但不限于可检测或不可检测的一种或多种症状的缓和、疾病程度的缩减、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减弱以及缓解(无论部分还是全部)。术语疾病的“治疗”还包括提供疾病的症状或副作用的缓和(包括姑息治疗)。在一些实施方式中，癌症的治疗包括减小肿瘤体积、减少癌细胞数量、抑制癌症转移、增加预期寿命、降低癌细胞增殖、降低癌细胞存活或改善与癌性病情相关的各种生理症状。
如本文所使用的“病情(conditions)”和“疾病病情”可包括癌症、肿瘤或传染病。在示例性实施方式中，病情包括但决不限于任何形式的恶性赘生细胞增殖性(malignantneoplastic cell proliferative)病症或疾病。在示例性实施方式中，病情包括以下病情中的任一种或多种：肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌、结肠癌或膀胱癌。
如本文所使用的术语“有效量”或“治疗有效量”指用以减少疾病或病症的至少一种或更多症状的包含本文公开的一种或多种肽或其突变体、变体、类似物或衍生物的药物组合物的量，并涉及用以提供期望效果的药理组合物的足够量。如本文所使用的短语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理的收益/风险比治疗病症的组合物的足够量。
治疗上或预防上显著的症状减少为例如与对照或未治疗的受试者或者给予本文所述的寡肽之前的受试者状态相比较，在测量的参数中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或更多的减少。测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物(例如生物标志物升高或降低的水平)以及与糖尿病的症状或标志物的临床上接受的量表相关的参数。然而，应理解的是，本文公开的组合物和制剂的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。所需的确切量将根据诸如所治疗疾病的类型以及受试者的性别、年龄和体重等因素而变化。
短语“第一线”或“第二线”或“第三线”指患者接受治疗的顺序。第一线疗法方案是首先给予的治疗，第二线疗法或第三线疗法分别在第一线疗法后或第二线疗法后给予。美国国家癌症研究所将第一线疗法定义为“对疾病给予的第一治疗”，这通常是一套标准治疗的一部分。当单独使用时，第一线疗法是所认为的最佳疗法。如果它未治愈疾病或者它引起严重的副作用，可增加其它治疗或使用其它治疗替代。其也被称为诱导疗法(inductiontherapy)、主要疗法(primary therapy)和主要治疗(primary treatment)。参见美国国家癌症研究所的网站，于2018年6月8日最新访问。通常，由于患者对第一线治疗未表现出阳性的临床响应或亚临床响应、或者第一线治疗已停止，向患者给予后续的化疗方案。
如本文所使用的“哺乳动物”指哺乳动物(Mammalia)纲的任何成员，包括但不限于人和非人灵长类动物(如黑猩猩以及其它猿和猴物种)；农场动物(如牛、绵羊、猪、山羊和马)；家养哺乳动物(如犬和猫)；实验室动物(包括啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠)等。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年受试者和新生受试者以及胎儿(无论雄性/男性或雌性/女性)都旨在包括在该术语的范围内。
如本文所使用的“颗粒”指各种尺寸和任何形状的微粒物质。如本领域技术人员根据本文公开的教导将能够理解的，合适的粒度可基于以下因素而变化：用于制造颗粒的材料；其中携带的活性剂或治疗剂；以及与免疫效应细胞缀合所涉及的官能团和化学过程。例如，颗粒可为具有1nm～1,000nm的平均直径的纳米颗粒，或具有大于1μm但比颗粒缀合的免疫效应细胞小约至少一个数量级的平均直径的微米颗粒。例如，在一些实施方式中，颗粒的直径为约1nm～约1000nm、或约25nm～约750nm、或约50nm～约500nm、或约100nm～约300nm。在一些实施方式中，平均粒度可为约1nm、约10nm、约50nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm、约850nm、约900nm、约950nm、或约1000nm、或约2,000nm、或约5,000nm、或约6,000nm、或约10,000nm。在一些实施方式中，如这些术语在本文中所定义的，颗粒可为纳米颗粒或微米颗粒。颗粒可全部为纳米颗粒、全部为微米颗粒或为纳米颗粒和微米颗粒的组合。在一些实施方式中，颗粒为脂质体。在其它实施方式中，颗粒为由可生物相容的和/或可生物降解的聚合物形成的聚合物颗粒。在一些实施方式中，颗粒含有核。在一些实施方式中，颗粒含有涂层(coating)。
如本文所使用的“可生物降解的聚合物”可含有合成聚合物，但也可使用天然聚合物。聚合物可为例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚苯乙烯或它们的组合。聚苯乙烯例如可用羧基修饰。可生物降解的聚合物的其它实例包括聚(羟基酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基(polyalkylenes)、聚乙烯、聚丙烯、聚亚烷基二醇、聚(乙二醇)、聚亚烷基氧化物、聚(环氧乙烷)、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚(氯乙烯)、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚(乙烯醇)、聚(醋酸乙烯酯)、聚氨酯、聚氨酯的共聚物、衍生化纤维素、烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、纤维素乙酸酯、纤维素丙酸酯、纤维素乙酸丁酸酯、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、纤维素三乙酸酯、纤维素硫酸钠盐、丙烯酸的聚合物、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸的衍生物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、聚(丙交酯-共-己内酯)的共聚物、聚(丙交酯-共-己内酯)的共混物、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)，以及任何前述聚合物中的一种或多种的组合、共聚物和/或混合物。此外，如本领域普通技术人员将理解的，上面列为“可生物相容的”的一些聚合物也可被认为是可生物降解的，无论其是否包括在上面的代表性可生物降解聚合物的列表中。如本文所使用的“衍生物”包括具有化学基团的取代、添加以及本领域技术人员常规进行的其它修饰的聚合物。
“细胞毒性”指试剂对细胞有毒性，其可量化为在与细胞的一段孵育时间内的细胞死亡程度(例如，死亡细胞的数量占与该试剂孵育之前的原始细胞数量的百分比)。例如，将细胞毒性量化为死亡细胞的数量占将试剂与细胞孵育24小时之前的原始细胞数量的百分比。
不受特定理论的束缚，如本发明中所述当将肿瘤特异性自然杀伤(NK)细胞用作运载体以递送载有药物的纳米颗粒时，化学疗法的功效被增强。在一些实施方式中，肿瘤特异性NK细胞(CAR.NK)包含嵌合抗原受体和封装有紫杉醇(PTX)的交联多层脂质体囊泡(cMLV)。在各个方面，这些cMLV为用硫醇反应性马来酰亚胺头基所官能化的脂质体，这使它们能够稳定地缀合至富含硫醇的NK细胞表面。该组合物和/或递送系统使得能够通过将化学治疗剂和免疫效应细胞共定位于单个位点(紧密接近)来进行组合药物递送，从而在体外和体内诱导协同的抗肿瘤作用。本文描述了免疫疗法和化学治疗药物递送的组合，该组合通过利用CAR.NK细胞作为载有PTX的交联多层脂质体囊泡(cMLV(PTX))的运载体来增强在过表达Her2和CD19的癌症模型中的抗肿瘤功效(图1A)。
组合物
在本发明的一些实施方式中，本文提供了基因工程化的细胞，所述基因工程化的细胞包含表达抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)的载体，并且进一步包含结合至细胞表面的载药颗粒。在一些实施方式中，所述颗粒是载有化学治疗试剂的脂质体(例如交联多层囊泡)。在一些实施方式中，所述CAR靶向一种抗原。在另一实施方式中，所述CAR是双特异性CAR并靶向两种不同的抗原。双特异性CAR可以靶向相同类型的靶细胞或不同细胞上的抗原。
在各种实施方式中，表达抗原特异性CAR且表面缀合有载有治疗剂的脂质体的基因工程化细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在一个实施方式中，表达CAR且表面缀合有载有治疗剂的脂质体的基因工程化细胞是基因工程化的NK细胞。
在各种实施方式中，所述脂质体为多层囊泡(具有数个层状相脂质双层)、小的单层脂质体囊泡(具有一个脂质双层)、大的单层囊泡或蜗形(cochleate)囊泡。
在一些实施方式中，当在本文所述的细胞(例如NK细胞)中表达时，CAR可靶向的抗原包括但不限于以下中的任一种或多种：CD19、CD22、CD23、MPL、CD123、CD32、CD138、CD200R、CD276、CD324、CD30、CD32、FcRH5、CD99、组织因子、淀粉样蛋白、免疫球蛋白的Fc区域、CD171、CS-1、CLL-1(CLECL1)、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL11Ra、间皮素、PSCA、VEGFR2、Lewis Y、CD24、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLea、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、TCR-β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγ-δ、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、legumain、HPV E6、E7、HTLV1-Tax、KSHV K8.1蛋白、EBBgp350、HIV1-包膜糖蛋白gp120、MAGE-A1、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、DLL3、TROP2、PTK7、GCC、AFP、肉瘤易位断裂点(sarcoma translocation breakpoints)、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、FITC、促黄体生成激素受体(Leutenizing hormone receptor，LHR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4或它们的组合。
在各种实施方式中，可用脂质体或聚合物颗粒封装或以其它方式递送的化学治疗试剂包括但不限于以下中的任一种或多种：替莫唑胺、放线菌素、阿利维A酸、全反式维A酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、贝伐单抗、贝沙托汀(Bexatotene)、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、西妥昔单抗、顺铂、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星(Doxorubicin)、脂质体封装的多柔比星(如Doxil(PEG化形式)、Myocet(非PEG化形式)和Caelyx)、表柔比星、埃博霉素、厄洛替尼、依托泊苷、氟尿嘧啶、亚叶酸、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊匹单抗(Ipilimumab)、伊立替康、纳米脂质体伊立替康(Nal-IRI)、氮芥(Mechlorethamine)、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥沙利铂、紫杉醇、Taxol、Abraxane、Genexol、蛋白结合型紫杉醇、Nab-Paclitaxel、帕尼单抗(Panitumab)、培美曲塞、利妥昔单抗、Tafluposide、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、维甲酸(Tretinoin)、戊柔比星、维罗非尼(Vemurafenib)、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他、罗米地辛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、克拉屈滨、氯法拉滨、氟尿苷、氟达拉滨、喷司他丁、丝裂霉素、伊沙匹隆、雌莫司汀、泼尼松、甲基强的松龙、地塞米松或它们的组合。
在各种实施方式中，化学治疗试剂是铂基抗肿瘤剂。铂基抗肿瘤剂的实例包括但不限于奥沙利铂、顺铂、lipoplatin(顺铂的脂质体版本)、卡铂、赛特铂(satraplatin)、picoplatin、奈达铂和triplatin，以及它们的功能等同物、类似物、衍生物、变体或盐。
通常，颗粒以不负面改变细胞功能但又高至足以递送每细胞高载量活性剂的比例与每个细胞缀合。例如，每细胞的缀合纳米颗粒(例如，cMLV)的数量为150至100、200至150、250至200、300至250、350至300、或400至350。
在一些实施方式中，将颗粒中的活性剂(例如化学治疗剂)以在给予后不对工程化NK细胞造成细胞毒性但又高至足以在体外和体内抑制或杀伤肿瘤细胞的量进行递送。在其它实施方式中，在表达CAR的免疫效应细胞上的颗粒中以对少于5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的正常细胞造成细胞毒性但又高至足以抑制或杀伤多于10％、15％或20％的肿瘤细胞的量携带所述活性剂(例如化学治疗剂)。在又一实施方式中，在表达CAR的免疫效应细胞上的颗粒中以对工程化NK细胞群的少于5％、6％、7％、8％、9％、或10％造成细胞毒性(例如死亡)但又高至足以抑制或杀伤多于10％、15％或20％的肿瘤细胞的量携带所述活性剂(例如，化学治疗剂)。
在一些实施方式中，提供了包含基因工程化NK细胞的组合物，其中所述NK细胞表达一种或多种CAR并且具有在表面上结合的交联多层脂质体囊泡(cMLV)，所述交联多层脂质体囊泡封装有化学治疗试剂。在一些实施方式中，提供了包含基因工程化NK细胞的组合物，其中所述NK细胞表达靶向Her2的CAR，并且在表面上化学键合有多个cMLV，所述cMLV封装有化学治疗试剂。在一些实施方式中，本文提供了包含基因工程化NK细胞的组合物，其中所述NK细胞表达靶向CD19的CAR，并且在表面上化学键合有多个cMLV，所述cMLV封装有化学治疗试剂。在一些实施方式中，本文提供了包含基因工程化NK细胞的组合物，其中所述NK细胞表达靶向CD19和Her2的CAR，并且在表面上化学键合有多个cMLV，所述cMLV封装有化学治疗试剂。
在一些实施方式中，本文提供了包含基因工程化NK细胞的组合物，其中所述NK细胞表达一种或多种CAR，并且在表面上化学键合有多个cMLV，所述cMLV封装有紫杉醇。在一些实施方式中，本文提供了包含基因工程化NK细胞的组合物，其中所述NK细胞表达靶向Her2的CAR，并且在表面上化学键合有多个cMLV，所述cMLV封装有紫杉醇。在一些实施方式中，本文提供了包含基因工程化NK细胞的组合物，其中所述NK细胞表达靶向CD19的CAR，并且在表面上化学键合有多个cMLV，所述cMLV封装有紫杉醇。在一些实施方式中，本文提供了包含基因工程化NK细胞的组合物，其中所述NK细胞表达靶向CD19和Her2的CAR，并且在表面上化学键合有多个cMLV，所述cMLV封装有紫杉醇。
各种实施方式提供了交联多层脂质体作为活性剂运载体，所述交联多层脂质体结合至免疫效应细胞的表面。交联多层脂质体具有外表面和内表面，所述内表面定义了中央脂质体腔。多层脂质体至少包括第一脂质双层和第二脂质双层，所述第一脂质双层共价键合至所述第二脂质双层。在一个方面，所述脂质双层通过醚键和/或硫醚键共价键合。通常，多层脂质体包括至少一个额外的脂质双层，例如与第二脂质双层共价键合的第三脂质双层。在一实施方式中，多层脂质体平均包含2至10个脂质双层。在另一实施方式中，多层脂质体平均包含3至9个脂质双层。在另一实施方式中，多层脂质体平均包含3至6个脂质双层。在一些变型中，将聚(亚烷基二醇)基团(例如聚(乙二醇))共价键合至脂质体的外表面来改善水溶性。例如，聚(乙二醇)基团具有约400至2500道尔顿的重均分子量。在另一改进中，聚(乙二醇)基团包含9至45个-OCH2CH2-重复单元。
可以采用多种化学和/或物理相互作用将多个纳米颗粒(例如cMLV)结合至免疫效应细胞的表面。在各种实施方式中，将携带活性剂的纳米颗粒化学键合至细胞表面。在一个实施方式中，在纳米颗粒上使马来酰亚胺基团官能化，其可与免疫效应细胞上的游离硫醇化学键合。任选地，存在纳米颗粒和细胞表面之间的接头，例如通过聚乙二醇。各种实施方式提供了NK细胞表面上的结合cMLV不被NK细胞内化或吞噬。
各种实施方式提供了至少一种活性剂(例如抗癌化合物)，该活性剂由多层脂质体通过物理封装、包裹(entrapment)或化学键合来携带。在一个实施方式中，可将活性剂置于交联多层脂质体的腔内。在另一实施方式中，将活性剂置于脂质双层以及任何其它脂质层内。
治疗方法
本文提供了在有需要的受试者中治疗癌症、抑制癌症、预防癌症转移和/或减少癌症的严重程度的方法。该方法包括向受试者给予有效量的本文所述的组合物。
在一些实施方式中，本文提供了在有需要的受试者中治疗癌症、抑制癌症、预防癌症转移和/或减少癌症的严重程度的方法，所述方法通过向所述受试者给予有效量的包含基因工程化NK细胞的组合物进行，所述NK细胞表达CAR并且在表面上化学键合有封装有化学治疗试剂的多个颗粒。
在本文所述的治疗方法的一些实施方式中，当在本文所述的细胞(例如NK细胞)中表达时，CAR可靶向的抗原包括但不限于以下中的任一种或多种：CD19、CD22、CD23、MPL、CD123、CD32、CD138、CD200R、CD276、CD324、CD30、CD32、FcRH5、CD99、组织因子、淀粉样蛋白、免疫球蛋白的Fc区、CD171、CS-1、CLL-1(CLECL1)、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、IL11Ra、间皮素、PSCA、VEGFR2、Lewis Y、CD24、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLea、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、TCR-β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγ-δ、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、legumain、HPV E6、E7、HTLV1-Tax、KSHV K8.1蛋白、EBB gp350、HIV1-包膜糖蛋白gp120、MAGE-A1、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、DLL3、TROP2、PTK7、GCC、AFP、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、RU1、RU2、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、FITC、促黄体生成激素受体、卵泡刺激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4、FITC、促黄体生成激素受体(LHR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CCR4、GD3、SLAMF6、SLAMF4或它们的组合。
在本文所述的治疗方法的各种实施方式中，可用多层脂质体囊泡封装或以其它方式递送(例如，包括化学键合)的化学治疗试剂(任选地与其它类型的化合物组合)包括但不限于以下中的任一种或多种：替莫唑胺、放线菌素、阿利维A酸、全反式维A酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、贝伐单抗、贝沙托汀、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、西妥昔单抗、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、脂质体封装的多柔比星(如Doxil(PEG化形式)、Myocet(非PEG化形式)和Caelyx)、表柔比星、埃博霉素、厄洛替尼、依托泊苷、氟尿嘧啶、亚叶酸、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊匹单抗、伊立替康、纳米脂质体伊立替康(Nal-IRI)、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥沙利铂、紫杉醇、Taxol、Abraxane、Genexol、蛋白结合型紫杉醇、Nab-Paclitaxel、帕尼单抗、培美曲塞、利妥昔单抗、Tafluposide、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、维甲酸、戊柔比星、维罗非尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他、罗米地辛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、克拉屈滨、氯法拉滨、氟尿苷、氟达拉滨、喷司他丁、丝裂霉素、伊沙匹隆、雌莫司汀、泼尼松、甲基强的松龙、地塞米松或它们的组合。
在一个实施方式中，癌症特异性抗原在正常细胞和癌细胞上均表达，但是在正常细胞上以较低的水平表达。在一个实施方式中，所述方法进一步包括选择以允许抗原特异性CAR结合并杀伤癌细胞的亲和力结合感兴趣的癌症特异性抗原的CAR。在一些实施方式中，抗原特异性CAR杀伤癌细胞，但是杀伤少于30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的表达该癌症抗原的正常细胞。在示例性实施方式中，可使用本文所述的细胞死亡分析来确定被抗原特异性CAR杀伤的细胞的百分比。
在一些实施方式中，本文提供了在有需要的受试者中治疗癌症、抑制癌症、预防癌症转移和/或减少癌症的严重程度的方法，所述方法通过向所述受试者给予有效量的组合物来进行，所述组合物包含表达靶向CD19的CAR的NK细胞，所述NK细胞在表面上化学键合有封装有化学治疗试剂(例如，紫杉醇)的多个cMLV。
在一些实施方式中，本文提供了在有需要的受试者中治疗癌症、抑制癌症、预防癌症转移和/或减少癌症的严重程度的方法，所述方法通过向所述受试者给予有效量的组合物来进行，所述组合物包含表达靶向Her2的CAR的NK细胞，所述NK细胞在表面上化学键合有封装有化学治疗试剂(例如，紫杉醇)的多个cMLV。
在一些实施方式中，本文提供了在有需要的受试者中治疗癌症、抑制癌症、预防癌症转移和/或减少癌症的严重程度的方法，该方法包括向所述受试者给予有效量的组合物，所述组合物包含表达靶向CD19和Her2的CAR的NK细胞，所述NK细胞在表面上化学键合有封装有化学治疗试剂(例如，紫杉醇)的多个cMLV。
其生长可被抑制的示例性癌症包括通常对免疫疗法有响应的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实例包括黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。另外，可使用本文所述的组合物治疗难治性或复发性恶性肿瘤。在一个实施方式中，将本文所述的工程化免疫效应细胞用于治疗患有卵巢肿瘤的受试者。在另一实施方式中，将本文所述的工程化免疫效应细胞用于治疗患有黑色素瘤的受试者。在又一实施方式中，将本文所述的工程化免疫效应细胞用于治疗患有肾癌的受试者。另一实施方式提供了将本文所述的工程化免疫效应细胞用于治疗患有前列腺癌的受试者。本文所述的工程化免疫效应细胞也可用于治疗患有乳腺癌、肺癌或二者皆有的受试者。另一实施方式提供了将本文所述的工程化免疫效应细胞用于治疗患有白血病的受试者。
在示例性实施方式中，通过本文所述方法治疗的癌症包括各种器官系统的实体瘤(例如肉瘤、腺癌和癌)，如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮细胞)、前列腺和咽的实体瘤。腺癌包括恶性肿瘤，如多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一个实施方式中，癌症是黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。使用本发明的方法和组合物也可治疗或预防上述癌症的转移性病变。
可治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区域癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管新生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱导的癌症)、以及所述癌症的组合。转移性癌症(例如表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等(2005)Int.Immunol.17:133-144))的治疗可使用本文所述的抗体分子来产生。进一步，与本文所述的癌症相关抗原的表达有关的疾病包括但不限于例如与本文所述的癌症相关抗原表达有关的增殖性疾病、非典型和/或非典型癌症、恶性肿瘤或癌前病症。在一些实施方式中，相对于阴性对照，在患有与如本文所述的癌症相关抗原相关的血液学癌症或另一种癌症的受试者中，本文所述的表达CAR的T细胞或NK细胞使表达细胞和/或癌细胞的量、数目、数量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个实施方式中，所述受试者是人。
在一些实施方式中，本文所述的基因修饰细胞(例如，表达CAR并且进一步在表面上化学键合有多个封装有化学治疗试剂的颗粒的NK细胞)的治疗有效量以104个细胞/kg体重至109个细胞/kg体重的剂量给予，在一些情况下以105个细胞/kg体重至106个细胞/kg体重的剂量给予(包括这些范围内的所有整数值)。在其它情况下，每注射向人受试者给予约0.1×109个至0.5×109个之间、约0.5×109个至1.0×109个之间或约1.0×109个至5.0×109个之间的工程化免疫效应细胞。各种实施方式提供了将免疫效应细胞给予一次或多次。后续的给药通常以每周、每两周、每三周、每月、每季度或每年的间隔进行或者以上述频率的组合进行。T细胞组合物也能够以这些剂量多次给予。可通过使用在免疫疗法中公知的输注技术(参见，例如，Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)给予细胞。可以通过注射到病变部位(例如，瘤内注射)来给予细胞。
在一些实施方式中，本文所述的治疗方法进一步包括顺序或同时向受试者给予现有疗法。现有癌症治疗的实例包括但不限于主动监测、观察、手术干预、化学疗法、免疫疗法、放射疗法(例如外照射、立体定向放射外科手术(伽玛刀)和分次立体定向放射疗法(FSR))、局灶疗法、全身疗法、疫苗疗法、病毒疗法、分子靶向疗法或它们的组合。
本文还提供了制备基因工程化细胞的方法，所述方法包括用包含编码本文所述CAR的核酸的载体转染细胞。在一些实施方式中，所述细胞是免疫效应细胞(例如人T细胞或人NK细胞)或产生免疫效应细胞的干细胞。在一些实施方式中，所述细胞是自体人T细胞或自体人NK细胞或自体人干细胞。在一些实施方式中，所述细胞是同种异体人T细胞或同种异体人NK细胞或同种异体人干细胞。
在一些实施方式中，用于制备基因修饰细胞的方法包括获得细胞群并选择表达CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和/或CD45RO中任一种或多种的细胞。在某些实施方式中，提供的免疫效应细胞群是CD3+和/或CD28+。
在一个实施方式中，用于制备基因修饰细胞的方法包括获得细胞群并通过例如使用对于CD25具有特异性的抗体来富集CD25+ T调节性细胞。从细胞群富集CD25+ T调节性细胞的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。在一些实施方式中，富含Treg的细胞包含少于30％、20％、10％、5％或更少的非Treg细胞。在一些实施方式中，将编码本文所述的CAR的载体转染到富含Treg的细胞中。表达CAR的富含Treg的细胞可用于诱导对CAR靶向的抗原的耐受。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在将包含编码本文所述的CAR的核酸的载体转染到细胞中之后，使细胞群扩增。在实施方式中，使细胞群扩增8天或更短的时段。在某些实施方式中，使细胞群在培养中扩增5天，并且所得的细胞比在相同培养条件下培养9天所扩增的相同细胞更有效力。在其它实施方式中，与在相同培养条件下培养9天所扩增的相同细胞相比，培养5天所扩增的细胞群在抗原刺激后显示出至少一倍、两倍、三倍或四倍的细胞倍增增加。在一些实施方式中，使细胞群在包括一种或多种白介素的恰当的培养基中扩增，导致在14天的扩增时段中细胞增加至少200倍、250倍、300倍或350倍(通过流式细胞术测量)。
在各种实施方式中，如本文所述，扩增的细胞包含一种或多种CAR，并且进一步包含与化学治疗试剂缀合的脂质体(例如，多层脂质体囊泡)。在一些实施方式中，扩增的细胞包含一种CAR，所述CAR具有一种、两种、三种或更多种ASD。在一些实施方式中，扩增的细胞进一步包含本文所述的治疗性控制和辅助模块(accessory modules)。
联用疗法
本文所述的治疗方法包括使用具有基因修饰的细胞的组合物，所述细胞包含编码CAR的核酸，并且表面键合有多个载有化学治疗试剂的颗粒。在各种实施方式中，本文所述的治疗方法可以与现有的疗法和试剂联用。将本文所述的治疗组合物(例如含有编码CAR的核酸并且表面键合有多个载有化学治疗试剂的颗粒的基因修饰细胞)与至少一种其它的已知疗法或治疗试剂一起给予受试者。在一些实施方式中，将本文所述的组合物与其它疗法或治疗试剂顺序给予。在一些实施方案中，将本文所述的组合物与其它疗法或治疗试剂同时给予。给予本文所述的组合物和现有疗法的最佳顺序对于本领域技术人员(例如医师)而言将是显而易见的。
如本文所述的在表面上进一步包含多个载有化学治疗试剂的纳米颗粒的基因工程化的表达CAR的细胞和至少一种其它治疗剂可在相同的组合物或分开的组合物中同时或顺序给予。对于顺序给药，可以首先给予本文所述的细胞，然后可以给予其它试剂，或者给予顺序可颠倒。
可以在疾病持续时间内向受试者给予联用疗法。疾病的持续时间包括从诊断到治疗结束，其中，所述治疗使得症状减轻和/或症状消除。在各种实施方式中，两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可如此进行：当递送第二治疗时，所递送的第一治疗的效果仍可检测出。
使用本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的纳米颗粒的NK细胞)和/或其它治疗试剂、程序或方式的疗法可以在活跃病症期间进行给予，或者在缓解或较不活跃疾病期间进行给予。使用本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)的疗法可以在其它治疗之前给予、与该治疗同时给予、在治疗后给予或在病症缓解期间给予。
当组合给予时，使用本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)和其它试剂(例如，第二试剂或第三试剂)或全部的疗法可以比单独使用(例如作为单一疗法)每种试剂的量或剂量更高、更低或相同的量或剂量进行给予。在某些实施方式中，使用本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)、其它试剂(例如，第二试剂或第三种试剂)或全部的疗法的给药量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)每种试剂的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其它实施方式中，使用本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)、其它试剂(例如，第二试剂或第三试剂)或全部的疗法产生期望效果(例如治疗癌症)的量或剂量比单独使用(例如作为单一疗法)每种试剂获得相同的治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、低至少30％、低至少40％或低至少50％)。
进一步的方法方面涉及向受试者给予有效量的本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)，任选地与增加免疫细胞的功效和/或安全性的试剂组合。在进一步的方面，增加免疫细胞的功效和/或安全性的试剂为以下种的一种或多种：(i)蛋白磷酸酶抑制剂；(ii)激酶抑制剂；(iii)细胞因子；(iv)免疫抑制分子的抑制剂；或(v)降低TREG细胞水平或活性的试剂；vi)增加CAR修饰的细胞增殖和/或持续留存(persistence)的试剂；vii)趋化因子；viii)增加CAR表达的试剂；ix)允许调控CAR表达或活性的试剂；x)允许控制CAR修饰的细胞的存活和/或持续留存的试剂；xi)控制CAR修饰的细胞的副作用的试剂；xii)Brd4抑制剂；xiii)向疾病部位递送治疗试剂(例如sHVEM)或预防试剂的试剂；xiv)增加CAR所针对的靶抗原的表达的试剂；xv)腺苷A2a受体拮抗剂。
在一些实施方式中，本文所述的基因修饰的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)可以与以下组合用于治疗方案：手术，化学疗法，放射，免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯(mycophenolate)和FK506)，抗体，或其它免疫清除剂(例如CAMPATH、抗CD3抗体或其它抗体疗法)，细胞毒素，氟达拉滨，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228，细胞因子，以及辐照，肽疫苗，例如Izumoto等2008J Neurosurg 108:963-971中所描述的。在一个实施方式中，本文所述的表达CAR的细胞可以与化学治疗试剂组合使用。示例性化学治疗试剂包括蒽环霉素(anthracycline)(例如多柔比星(如脂质体多柔比星))，长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)，烷化剂(例如环磷酰胺、氮烯咪胺(decarbazine)、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)，免疫细胞抗体(例如阿仑单抗(alemtuzamab)、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab))，抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))，mTOR抑制剂，TNFR糖皮质激素诱导TNFR相关蛋白(GITR)激动剂，蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)，免疫调节剂(如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺))。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与环磷酰胺和氟达拉滨组合给予受试者。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与苯达莫司汀和利妥昔单抗组合给予受试者。在实施方式中，所述受试者患有CLL。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和/或糖皮质激素(例如泼尼松)组合给予受试者。在实施方式中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松(R-CHOP)组合给予受试者。在实施方式中，所述受试者患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和/或利妥昔单抗组合给予受试者。在实施方式中，将本文所述的表达CAR的细胞与依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、多柔比星和利妥昔单抗(EPOCH-R)组合给予受试者。在实施方式中，将本文所述的表达CAR的细胞与剂量调节的EPOCH-R(DA-EPOCH-R)组合给予受试者。在实施方式中，所述受试者患有B细胞淋巴瘤，例如Myc重排侵袭性B细胞淋巴瘤。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与本妥昔单抗组合给予受试者。本妥昔单抗是抗CD30抗体和单甲基auristatin E的抗体-药物缀合物。在实施方式中，所述受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)，例如复发性或难治性HL。在实施方式中，所述受试者含有CD30+HL。在实施方式中，所述受试者已经经受了自体干细胞移植(ASCT)。
在一些实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与CD20抑制剂(例如抗-CD20抗体(如，抗CD20单特异性或双特异性抗体)或其片段)组合给予受试者。
在一个实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与mTOR抑制剂(例如，本文所述的mTOR抑制剂，如rapalog(如伊维莫司))组合给予受试者。在一个实施方式中，在表达CAR的细胞之前给予mTOR抑制剂。例如，在一个实施方式中，可在细胞单采之前给予mTOR抑制剂。在一个实施方式中，所述受试者患有CLL。
在一个实施方式中，本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)可以与激酶抑制剂组合使用。在一个实施方式中，所述激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如本文所述的CDK4抑制剂，如CD4/6抑制剂，如6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮，盐酸盐(也称为palbociclib或PD0332991)。在一个实施方式中，所述激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如本文所述的BTK抑制剂，如依鲁替尼。在一些实施方式中，以约300-600mg/天的剂量(例如，约300-350mg/天、350-400mg/天、400-450mg/天、450-500mg/天、500-550mg/天或550-600mg/天，例如约420mg/天或约560mg/天)例如口服给予依鲁替尼。在实施方案中，以约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(如250mg、420mg或560mg)的剂量每日给予依鲁替尼一段时间，例如以21天的周期每日给予或以28天的周期每日给予。在一个实施方案中，给予1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多个周期的依鲁替尼。不受理论束缚，认为依鲁替尼的添加增强了T细胞的增殖应答，并且可使T细胞从T-辅助-2(Th2)转变为T-辅助-1(Th1)表型。Th1和Th2是辅助T细胞的表型，Th1和Th2指导着不同的免疫应答途径。Th1表型与促炎应答相关，例如用于杀伤细胞，如细胞内病原体/病毒或癌细胞、或使自身免疫应答延续。Th2表型与嗜酸性粒细胞积累和抗炎应答有关。在一个实施方式中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如本文所述的mTOR抑制剂，如例如雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文所述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施方式中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如本文所述的MNK抑制剂，例如4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以是例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。在一个实施方式中，激酶抑制剂是本文所述的PI3K/mTOR双重抑制剂，例如PF-04695102。在一个实施方式中，激酶抑制剂是Src激酶抑制剂。在一个实施方式中，激酶抑制剂是达沙替尼。在一个实施方式中，在给予表达CAR的细胞后，向患者给予Src激酶抑制剂来控制或终止表达CAR的细胞的活性。在一个实施方式中，在给予表达CAR的细胞后，向患者给予达沙替尼来控制或终止表达CAR的细胞的活性。在一个实施方式中，达沙替尼以至少10mg/天、20mg/天、40mg/天、60mg/天、70mg/天、90mg/天、100mg/天、140mg/天、180mg/天或210mg/天的剂量口服给予。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂组合给予受试者。示例性的ALK激酶包括但不限于克唑替尼(Pfizer)、色瑞替尼(Novartis)、艾乐替尼(Chugai)、brigatinib(也称为AP26113；Ariad)、恩曲替尼(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、TSR-011(Tesaro)(参见例如临床试验识别号NCT02048488)、CEP-3744(Teva)和X-396(Xcovery)。在一些实施方式中，所述受试者具有实体癌，例如本文所述的实体癌，例如肺癌。
也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶神经钙蛋白的药物(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶的药物(雷帕霉素)。在进一步的方面，本发明的细胞组合物可以与骨髓移植术、使用化学治疗试剂(如氟达拉滨)的T细胞消融疗法、外部射束放射治疗(XRT)、环磷酰胺和/或抗体(例如OKT3或CAMP ATH)联合(例如，在之前、同时或之后)给予患者。在一方面，本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法后进行给予，例如与CD20反应的试剂(例如Rituxan)。例如，在一个实施方式中，受试者可以经受高剂量化学疗法然后进行外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方式中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在另一实施方式中，在手术之前或之后给予扩增的细胞。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与自体干细胞移植、同种异体干细胞移植、自体骨髓移植或同种异体骨髓移植组合给予受试者。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与微移植或HLA错配的同种异体细胞疗法组合给予受试者。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如，表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂组合给予受试者。
在实施方式中，将本文所述的细胞(例如表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与髓系来源抑制性细胞(MDSC)的调节剂组合给予受试者。MDSC在许多实体瘤的周围和肿瘤部位积累。这些细胞阻抑T细胞应答，从而妨碍表达CAR的细胞疗法的功效。不受理论束缚，认为给予MDSC调节剂增强了本文所述的表达CAR的细胞的功效。在一个实施方式中，所述受试者具有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如胶质母细胞瘤。示例性的MDSC调节剂包括但不限于MCSllO和BLZ945。MCSllO是针对巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的单克隆抗体(mAb)。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。在实施方式中，将本文所述的细胞(例如表达CAR并进一步在表面上包含多个载化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与Brd4或BET(溴区结构域和超末端基序(extra-terminalmotif))抑制剂组合给予受试者。BET蛋白BRD4直接调控CD8+ T细胞中转录因子BATF的表达，这与T细胞分化为效应记忆表型有关。溴区结构域和超末端基序(BET)蛋白的抑制剂JQ1维持CD8+ T细胞的干细胞样和中央记忆T细胞的功能特性。可与表达CAR的细胞组合给予的示例性Brd4抑制剂包括但不限于如US 20140256706 A1中所述的Brd4抑制剂和JQ1、MS417、OTXO15、LY 303511及任何它们的类似物。
在一些实施方式中，将本文所述的细胞(例如表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的cMLV的NK细胞)与白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Rα)多肽、或IL-15多肽和IL-15Rα多肽二者的组合(例如hetiL-15(Admune Therapeutics，LLC))组合给予受试者。hetiL-15是IL-15和IL-15Rα的异二聚体非共价复合物。hetiL-15描述于例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413和U.S.201110081311中。在实施方式中，将het-IL-15皮下给予。在实施方式中，所述受试者患有癌症，例如实体癌，例如黑色素瘤或结肠癌。在实施方式中，所述受试者患有转移性癌症。
在一个实施方式中，可向受试者给予减轻或改善与表达CAR的细胞给予相关的副作用的试剂。与表达CAR的细胞给予相关的副作用包括但不限于CRS、以及噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH)(也称为巨噬细胞激活综合征(MAS))。CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。CRS可包括临床全身性体征和症状，例如发烧、疲劳、厌食、肌痛、关节痛、恶心、呕吐和头痛。CRS可包括临床皮肤体征和症状，例如皮疹。CRS可包括临床胃肠体征和症状，例如恶心、呕吐和腹泻。CRS可包括临床呼吸系统体征和症状，例如呼吸急促和低氧血症。CRS可包括临床心血管疾病的体征和症状，例如心动过速、脉压增宽、低血压、心输出量增加(早期)和潜在的心输出量减少(晚期)。CRS可包括临床凝血体征和症状，例如d-二聚体升高、伴有或不伴有出血的低纤维蛋白原血症。CRS可包括临床肾体征和症状，例如氮质血症。CRS可包括临床肝脏体征和症状，例如转氨酶升高和高胆红素血。CRS可包括临床神经体征和症状，例如头痛、精神状态改变、混乱、谵妄、寻词困难或明显失语、幻觉、震颤、辨距障碍(dymetria)、步态改变和癫痫发作。
因此，本文所述的方法可包括向受试者给予本文所述的细胞(例如表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的纳米颗粒(如cMLV)的NK细胞)，并进一步给予一种或多种药物来管理因用表达CAR的细胞治疗而产生的可溶性因子水平升高。在一个实施方式中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-y、TNFα、IL-2和IL-6中的一种或多种。在实施方式中，受试者中升高的因子是IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和fraktalkine中的一种或多种。因此，给予以治疗该副作用的试剂可为中和这些可溶性因子中的一种或多种的试剂。在一个实施方式中，中和这些可溶形式中的一种或多种的试剂为抗体或其抗原结合片段。此类试剂的实例包括但不限于类固醇(例如糖皮质固醇)、Src抑制剂(例如达沙替尼)、TNFα抑制剂和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的实例为抗TNFα抗体分子(例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、certolizumab pegol和戈利木单抗)。TNFα抑制剂的另一实例为融合蛋白(例如entanercept)。IL-6抑制剂的实例为抗IL-6抗体分子或抗IL-6受体抗体分子，例如托珠单抗(toe)、sarilumab、elsilimomab、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301和FM101。在一个实施方式中，抗IL-6受体抗体分子是托珠单抗。在一个实施方式中，IL-6抑制剂是结合至IL6R和人血清白蛋白的骆驼科双特异性抗体(例如，IL6R-304-Alb8)(SEQ ID NO：2649)。基于IL-1R的抑制剂的实例是阿那白滞素(anakinra)。在一个实施方式中，用于治疗表达CAR的细胞的副作用的试剂是Src抑制剂(例如达沙替尼)。在一个实施方式中，给予以治疗表达CAR的细胞的副作用的试剂是Src抑制剂达沙替尼。在实施方式中，以约10mg/天至240mg/天的剂量(例如10mg/天、20mg/天、40mg/天、50mg/天、70mg/天、80mg/天、100mg/天、110mg/天、120mg/天、140mg/天、180mg/天、210mg/天、240mg/天或300mg/天)给予达沙替尼。
在一个实施方式中，可向受试者给予增强本文所述的细胞(例如表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的纳米颗粒(如cMLV)的NK细胞)的活性的试剂。例如，在一个实施方式中，所述试剂可为抑制抑制性分子的试剂。在一些实施方式中，抑制性分子(例如程序性死亡1(PD-1))可降低表达CAR的细胞增加免疫效应应答的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PDL1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA或蛋白水平的抑制)可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方式中，抑制性核酸(例如抑制性核酸，如dsRNA，如siRNA或shRNA)、成簇的规则间隔短回文重复(CRISPR)、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)，例如如本文所述可用于抑制表达CAR的细胞中抑制性分子的表达。在实施方式中，所述抑制剂为shRNA。在实施方式中，所述抑制性分子在表达CAR的细胞内被抑制。在这些实施方式中，对抑制性分子的表达进行抑制的dsRNA分子连接至编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸。在一个实施方式中，抑制性信号的抑制剂可为例如结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，所述试剂可为结合至PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段(例如，伊匹单抗(也称为MDX-010和MDX-101，并且以
Figure BDA0002325899000000371
Bristol-Myers Squibb出售；Tremelimumab(可从Pfizer获得的IgG2单克隆抗体，先前称为ticilimumab，CP-675,206))。在实施方式中，所述试剂为结合TIM3的抗体或抗体片段。在实施方式中，所述试剂为结合CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)的抗体或抗体片段。在实施方式中，所述试剂为结合LAG3的抗体或抗体片段。
PD-1为受体CD28家族的抑制性成员，所述受体CD28家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在激活的B细胞、T细胞和髓系细胞上表达。已经证实PD-1的两个配体PD-L1和PD-L2在结合至PD-1后下调T细胞的激活。PD-L1在人癌症中是丰富的。可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转免疫抑制。PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体、抗体片段和其它抑制剂在本领域中是可获得的，并且可与本文所述的本发明的CAR组合使用。例如，nivolumab(也称为BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是一种特异性阻断PD-1的完全人IgG4单克隆抗体。Nivolumab(克隆5C4)和特异结合PD-1的其它人单克隆抗体在US 8,008,449和WO2006/121168中公开。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是结合PD-1的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其它人源化抗PD-1单克隆抗体在WO2009/101611中公开。Pembrolizumab(以前称为lambrolizumab，也称为MK03475；Merck)是结合PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。Pembrolizumab和其它人源化抗PD-1抗体在US 8,354,509和WO2009/114335中公开。MEDI4736(Medimmune)是结合PDL1并抑制该配体与PD1相互作用的人单克隆抗体。MDPL3280A(Genentech I Roche)是结合PD-L1的人Fe优化IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和关于PD-L1的其它人单克隆抗体在美国专利号：7,943,743和美国公开号：20120039906中公开。在其它实施方式中，增强表达CAR的细胞的活性的试剂是CEACAM抑制剂(例如CEACAM-1抑制剂、CEACAM-3抑制剂和/或CEACAM-5抑制剂)。
在一个实施方式中，增强本文所述的细胞(例如表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的纳米颗粒(如cMLV)的NK细胞)的活性的试剂是增加CAR所针对的靶标抗原的表达的另一试剂。可向接受本文所述的表达CAR的细胞的受试者给予的试剂包括：三氧化二砷，ATRA(全反式维A酸)，化合物27、化合物40、化合物49，IDH2抑制剂(例如AG-221)或其组合。在实施方式中，在给予表达CAR的细胞之前、同时或之后给予所述试剂。在优选的实施方式中，在给予表达CAR的细胞之前给予这些试剂。在优选的实施方式中，与上述试剂一起给予的表达CAR的细胞靶向B细胞抗原(例如CD19、CD20或CD22等)。
可向接受本文所述的细胞(例如表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的纳米颗粒(如cMLV)的NK细胞)的受试者给予的细胞因子包括：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、LIGHT和IL-21、或它们的组合。在优选的实施方式中，给予的细胞因子是IL-7、IL-15、或IL-21、IL12F或它们的组合。细胞因子可每天给予一次或每天给予一次以上，例如一天两次、一天三次或一天四次。可给予细胞因子多于一天，例如给予细胞因子2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。例如，可每天一次地给予细胞因子，共给予7天。向对表达CAR的细胞疗法具有次优响应的受试者给予细胞因子改善表达CAR的细胞功效或抗癌活性。在优选的实施方式中，在给予表达CAR的细胞后给予的细胞因子是IL-7。
在一个实施方式中，增强本文所述的细胞(例如表达CAR并进一步在表面上包含多个载有化学治疗试剂的纳米颗粒(如cMLV)的NK细胞)的活性的试剂是Brd4抑制剂或靶向BRD4的shRNA或siRNA。
药物组合物
在各种实施方式中，本发明提供药物组合物。所述药物组合物包含基因修饰细胞和任何药学上可接受的赋形剂，所述细胞表达抗原特异性CAR，并且所述细胞具有结合在细胞表面上的多个脂质体(例如多层脂质体囊泡)或其它纳米颗粒，所述脂质体或纳米颗粒封装或以其它方式携带有一种或多种化学治疗试剂。在示例性实施方式中，所述基因修饰细胞是NK细胞，所述NK细胞表达对Her2和/或CD19具有特异性的CAR，并且表面键合有封装有紫杉醇的多个纳米颗粒(例如多层脂质体囊泡)。
“药学上可接受的赋形剂”意指在制备通常安全、无毒和期望的药物组合物中有用的赋形剂，并且包括对于兽医学用途以及对于人制药用途而言可接受的赋形剂。此类赋形剂可为固体、液体、半固体，或在气溶胶组合物的情况下可为气态的。赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、着色剂、脱模剂、包被剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、增塑剂、胶凝剂、增稠剂、硬化剂、凝固剂、悬浮剂、表面活性剂、湿润剂、运载体、稳定剂及它们的组合。
在各种实施方式中，根据本发明的药物组合物可被配制为用于经由任何给予途径递送。“给予途径”可指本领域已知的任何给予途径，包括但不限于气溶胶、经鼻、经口、经粘膜、透皮、肠胃外或肠内。“肠胃外”指通常与注射相关的给予途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。经由肠胃外途径，组合物可处于用于输注或用于注射的溶液或悬浮液的形式，或者作为冻干粉末。经由肠胃外途径，组合物可处于用于输注或用于注射的溶液或悬浮液的形式。经由肠内途径，药物组合物可处于允许受控释放的片剂、凝胶胶囊、糖衣片剂、糖浆、悬浮液、溶液、粉末、颗粒、乳剂、微球或纳米球或脂质囊泡或聚合物囊泡的形式。通常，通过注射给予组合物。用于此类给予的方法是本领域技术人员已知的。
根据本发明的药物组合物可含有任何药学上可接受的载体。如本文所使用的“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组合物或媒介物(vehicle)，其涉及将感兴趣的化合物从身体的一个组织、器官或部分携带或运输到身体的另一组织、器官或部分。例如，载体可为液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或它们的组合。载体的每种组分必须为“药学上可接受的”，因为其必须与制剂的其它成分相容。载体也必须适合用于与任何可能与之接触的组织或器官接触，这意味着其必须不能携带毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或任何其它过度超过其治疗益处的并发症的风险。
还可将根据本发明的药物组合物包封、压片或者制备成乳剂或糖浆，用于口服给予。可加入药学上可接受的固体运载体或液体运载体以增强或稳定组合物或促进组合物的制备。液体运载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇和水。固体运载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。运载体还可包括单独或含蜡的持续释放材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
按照常规药学技术制造药物制剂，对于片剂形式根据需要涉及研磨、混合、制粒和压制；或对于硬明胶胶囊形式涉及研磨、混合和填充。当使用液体运载体时，制剂将处于糖浆、酏剂、乳剂或者水性或非水性悬浮液的形式。可直接口服或填充至软明胶胶囊来给予此类液体制剂。
可将根据本发明的药物组合物以治疗有效量递送。精确的治疗有效量是在给定受试者的治疗功效方面将产生最有效结果的组合物的量。该量将依赖于多种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效学以及生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的响应性以及药物类型)、制剂中药学上可接受的运载体的性质以及给予途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，例如通过对受试者对给予化合物的响应进行监测并相应地调整剂量。有关其它指导，请参阅Remington：The Science and Practiceof Pharmacy(Gennaro ed.，第20版，Williams&Wilkins PA，美国)(2000)。
在向患者给予前，可将助剂(formulants)添加至工程化免疫效应细胞、或包含多个工程化免疫效应细胞的细胞群。液体制剂可能是优选的。例如，此类助剂可包括油、聚合物、维生素、碳水化合物、氨基酸、盐、缓冲剂、白蛋白、表面活性剂、膨松剂(bulking agent)或它们的组合。
碳水化合物助剂包括糖或糖醇，如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖类或葡聚糖可包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、普鲁兰多糖、糊精、α和β环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素或它们的混合物。“糖醇”定义为具有-OH基团的C4-C8烃，包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油和阿拉伯糖醇。可单独使用或组合使用上述这些糖或糖醇。只要糖或糖醇可溶于含水制剂中，对使用量无固定限制。在一个实施方式中，糖或糖醇浓度为1.0w/v％-7.0w/v％，更优选2.0w/v％-6.0w/v％。
氨基酸助剂包括左旋(L)形式的肉毒碱、精氨酸和甜菜碱；但也可加入其它氨基酸。
在一些实施方式中，作为助剂的聚合物包括具有2,000-3,000的平均分子量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或具有3,000-5,000的平均分子量的聚乙二醇(PEG)。
还优选在组合物中使用缓冲剂以使冻干前或复溶后溶液中的pH改变最小化。可使用大多数的任何生理缓冲剂，包括但不限于柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和谷氨酸盐缓冲剂或它们的混合物。在一些实施方式中，浓度为0.01摩尔-0.3摩尔。在EP No.270,799和EPNo.268,110中示出了可加入至制剂中的表面活性剂。
用于增加循环半衰期的另一药物递送系统是脂质体。Gabizon等，CancerResearch(1982)42:4734；Cafiso，Biochem Biophys Acta(1981)649:129；以及Szoka，AnnRev Biophys Eng(1980)9:467中讨论了制备脂质体递送系统的方法。其它药物递送系统是本领域已知的，并且在例如Poznansky等，DRUG DELIVERY SYSTEMS(R.L.Juliano、ed.，Oxford，N.Y.1980)，pp.253-315；M.L.Poznansky，Pharm Revs(1984)36:277中进行了描述。
试剂盒
在各种实施方式中，本发明提供了包含本文所述的药物组合物的试剂盒。
试剂盒是材料或组分的集合，包含至少一种本发明的载体和组合物。因此，在一些实施方式中，所述试剂盒包含如上所述的组合物，所述组合物具有基因修饰的细胞，素数基因修饰的细胞表达抗原特异性CAR并且具有在细胞表面上结合的多个脂质体(例如多层脂质体囊泡)或其它纳米颗粒，所述脂质体或纳米颗粒封装有或以其它方式携带有一种或多种化学治疗试剂。
本发明的试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期目的。在一个实施方式中，该试剂盒为人受试者而特别配置。在进一步的实施方式中，该试剂盒为兽医学应用而配置，以治疗例如但不限于农场动物、家养动物和实验动物的受试者。
所述试剂盒中可包含使用说明。“使用说明”通常包含描述在使用试剂盒的组分以实现期望的结果(例如在受试者中治疗癌症、减轻癌症的严重程度、抑制癌症或预防癌症)中所采用的技术的有形表达。任选地，所述试剂盒还包含其它有用的组分，例如，测量工具、稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的运载体、注射器或本领域技术人员将容易认识到的其它有用的用具。
可将以任何用于保持其可操作性和实用性的方便且适当的方式存储的试剂盒中组装的材料或组件提供给从业者。例如，组分可以是溶解形式、脱水形式或冻干形式；它们可以室温温度、冷藏温度或冷冻温度提供。组分通常包含在合适的包装材料中。如本文所使用的短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物(例如本发明的组合物等)的一种或多种物理结构体。包装材料通过公知的方法构建，优选提供无菌、无污染物的环境。如本文所使用的术语“包装”是指能够承装单个试剂盒组分的合适的固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是用于容纳适当量的组合物的玻璃小瓶。包装材料通常具有指示试剂盒和/或其组分的内容物和/或目的的外部标签。
实施例
以下实施例不旨在将权利要求的范围限制于本发明，而是旨在作为某些实施方式的示例。本领域技术人员想到的示例性方法的任何变化均旨在落入本发明的范围内。
实施例1
实验方法
细胞系和试剂：在5％CO2环境中将MDA.MB.468(ATCC HTB-132)和SKOV3(ATCCHTB-77)肿瘤细胞系维持在补充有10％FBS、1％pen-strep和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Gibco)培养基中。将NK92细胞(Jihane Khalife博士，洛杉矶儿童医院，ATCC CRL-2407)维持在补充有10％FBS、10％马血清、1％NEAA、1％pen-strep、1％丙酮酸钠、0.1mM 2-β巯基乙醇、0.2mM肌醇和2.5μM叶酸的MEM-α(Gibco)中。通过用含有CD19 cDNA的慢病毒转导SKOV3细胞并用荧光激活细胞分选术(FACS)分选CD19+细胞，生成CD19+SKOV3(SKOV.CD19)细胞。
PTX购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。所有脂质均购自NOF公司(日本)：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-(10-rac-甘油)(DOPG)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺(马来酰亚胺头基脂质，MPB-PE)。
纳米颗粒的合成：基于常规的脱水-再水化方法(Joo,K,等(2013).Crosslinkedmultilamellar liposomes for controlled delivery of anticancerdrugs.Biomaterials 34:3098-3109；Moon,J,等(2011).Interbilayer-crosslinkedmultilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellularimmune responses.Nat Mater 10:243-251)制备脂质体。从在氯仿中混合的1.5μmol脂质DOPC:DOPG:MPE-PE＝40:10:50制备cMLV，并在氩气下蒸发，然后真空下干燥过夜，以形成干燥的脂质膜。将脂质膜在pH 7.0的10mM Bis-Tris丙烷中下再水化。在通过每10分钟剧烈涡旋将脂质混合1小时后，使它们经历15秒超声处理(Misonix Microson XL2000，Farmingdale，NY)的三个循环，并在每个循环后以1分钟的间隔静置于冰上。加入终浓度为10mM的MgCl2来诱导二价触发的囊泡融合。多层囊泡(cMLV)的交联通过在37℃下以1.5mM的终浓度添加二硫苏糖醇(DTT，Sigma-Aldrich)进行1小时。通过以14,000g离心5分钟收集cMLV，并用PBS洗涤两次。在进行分析前，将颗粒悬浮在过滤的水中，涡旋并进行超声处理。进行囊泡的多层结构的形态学分析，并通过冷冻电子显微镜进行确认，如Joo,K.等先前研究的。cMLV的流体动力学大小通过动态光散射(Wyatt Technology，Santa Barbara，CA)进行测量。
体外药物封装和释放：通过C-18反相高效液相色谱法(RPHPLC)(BeckmanCoulter，Brea，CA)测定cMLV(PTX)中紫杉醇的并入量。通过添加水和乙腈将cMLV(PTX)悬浮液稀释至0.5mL的总体积。通过加入5mL叔丁基甲基醚并将样品涡旋混合1min来完成紫杉醇的萃取。将混合物离心，并将有机层转移至玻璃管中并在氩下蒸发。使用缓冲液A(95％的水、5％的乙腈)使玻璃管再水化。为了测试PTX浓度，将1mL溶液注入C18柱，并在227nm(流速1mL/min)下检测紫杉醇。为了获得细胞缀合前后由cMLV而来的PTX释放动力学，将cMLV(PTX)和CAR.NK.cMLV(PTX)在含10％FBS的培养基中于37℃孵育，并且每日旋转沉降(spindown)并重悬于新鲜培养基中。每天通过HPLC从移除的培养基中定量PTX。
纳米粒子与细胞的缀合和原位PEG化：cMLV与细胞的化学缀合基于先前研究提供的方法(Huang,B等(2015)，Active targeting of chemotherapy to disseminatedtumors using nanoparticle-carrying T cells.Sci Transl Med 77:291ra294；Stephan,M等(2010)，Therapeutic cell engineering with surface-conjugatedsynthetic nanoparticles.Nature Med16：1035-1041)而进行。我们在无血清MEM-α(Gibco)培养基中重悬10×106细胞/mL。将等体积的纳米颗粒以不同的cMLV比NK细胞的缀合比例重悬于无核酸酶的水中，并在37℃下孵育。每10分钟对细胞和纳米颗粒进行混合持续30分钟。在PBS洗涤以从细胞中移除未结合的cMLV之后，将细胞进一步与1mg/ml巯基封端的2-kDa PEG在37℃下在培养基中孵育30分钟以淬灭结合细胞的颗粒上的残留马来酰亚胺基团。我们进行了两次PBS洗涤来移除未结合的PEG。为了定量结合细胞的颗粒，用脂质样荧光染料DiD(Invitrogen)对颗粒进行荧光标记。用流式细胞术和荧光酶标仪对颗粒荧光进行检测。用脂质样染料DiD对cMLV进行标记，并用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Invitrogen)对CAR.NK细胞进行染色，这使cMLV与NK细胞的缀合能够容易地使用共聚焦显微术进行检测。
慢病毒和逆转录病毒产生和NK92细胞的转导：我们的抗Her2 CAR构建体(Zhao,Y等(2009).A Herceptin-based chimeric antigen receptor with modified signalingdomains leads to enhanced survival of transduced T lymphocytes and antitumoractivity.J Immunol 183:5563-5574)与额外的WRE转录后调控区克隆到慢病毒pCCW载体(pCCL载体(Haas,D等(2003).The moloney murine leukemia virus repressor bindingsite represses expression in murine and human hematopoietic stem cells.JVirol77:9439-9450；Dull，T等(1998).A third-generation lentivirus vector with aconditional packaging system.J Virol 72:8463-8471；Logan,A等(2004)Factorsinfluencing the titer and infectivity of lentiviral vectors.Hum Gene Ther 15:976-988))中。CAR由抗Her2 scFv 4D5、CD8铰链和跨膜区域、和CD28、4-1BB、和CD3ζ细胞质区域组成。将我们的抗CD19 CAR构建体克隆到MP-71逆转录病毒载体骨架(Engels,B等(2003)Retroviral vectors for high-level transgene expression in Tlymphocytes.HumGene Ther 14：1155-1168)中，并且其包含抗CD19 scFv、CD8铰链和跨膜区域、以及CD28和CD3ζ细胞质区域。将这些质粒用于使用CaCl2沉淀法在30mL平板中转染HEK 293T细胞。初次转染后4小时，将新鲜培养基(补充有10％FBS和1％pen-strep的高葡萄糖DMEM)铺到细胞上。在48小时后收获上清液并过滤(0.45μm)。用新鲜的逆转录病毒对NK92细胞进行转导。将慢病毒上清液浓缩(在4℃下以25,000rpm进行90分钟)，重悬于HBSS中，并在-80℃冷冻直至以后使用。用浓缩的慢病毒以MOI 40对NK92细胞进行转导；滴度以293T细胞的转导为基础。
T细胞表面上的CAR检测：转导后三天，在4℃下在PBS+4％FBS中将抗CD19 CAR.NK细胞(1×105)与生物素化蛋白L(Peprotech)以1:50的体积比孵育45分钟，并用PBS漂洗。随后，在4℃下在PBS+4％FBS中将细胞与缀合至FITC(Biolegend)的链霉亲和素以1:500的体积比孵育10分钟，漂洗两次，并使用流式细胞术进行读取。在4℃下在PBS中将抗-Her2CAR.NK细胞(1×105)与rhHer2-Fc嵌合体(Peprotech)以1:50(2μg/mL)的体积比孵育30分钟，并用PBS漂洗。随后，在4℃下在PBS中将细胞与PE标记的山羊抗人Fc(JacksonImmunoResearch)以1:150的体积比孵育10分钟，漂洗，并使用流式细胞术进行读取。未转导的NK细胞用作阴性对照。
内化分析：基于先前描述的方法(Huang,B等(2015).Active targeting ofchemotherapy to disseminated tumors using nanoparticle-carrying T cells.SciTransl Med 77:291ra294；Stephan,M等(2010).Therapeutic cell engineering withsurface-conjugated synthetic nanoparticles.Nature Med 16:1035-1041)，对细胞cMLV内化进行定量。将NK细胞和CAR.NK细胞与5摩尔％的18:1PE CF(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(羧基荧光素)(铵盐)(Avanti，极性脂质))-标记的脂质体缀合。在2次PBS洗涤之后，将细胞转移到纤连蛋白(10μg/ml)包被的96孔板中。在2小时的孵育时间后，将一半的孔用100μl HBSS中的台盼蓝(0.25mg/mL)(一种细胞外荧光淬灭染料)处理1分钟，以区分结合膜的脂质体和内化的脂质体。通过轻轻的真空抽吸移除台盼蓝，并通过荧光板阅读器对脂质体的细胞摄取进行定量。
细胞因子释放分析：在37℃下将NK细胞(每孔1×105)与靶细胞以1:1的比例在96孔板中共孵育6小时。向每个孔中加入1μg布雷菲德菌素A(Sigma)来防止蛋白转运。在孵育结束时，使用CytoFix/CytoPerm试剂盒(BD Biosciences)对细胞进行透化，并使用缀合Pacific Blue的抗人CD8(Biolegend)和缀合PE的抗人IFN-γ(Biolegend)对CD8和IFN-γ进行染色。未刺激的细胞充当阴性对照。使用流式细胞术读取结果。
细胞毒性分析：如先前所述(Han,X等(2017).Masked chimeric antigenreceptor for tumor-specific activation.Molecular Therapy 25:274-284)，将靶细胞(1×104)用5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Life Technologies)进行标记，并在96孔板中与NK细胞以各种比例于37℃共孵育24小时。然后在室温下将细胞在处于PBS中的7-AAD(Life Technologies)(1:1000稀释度)中孵育10分钟，并通过流式细胞术进行分析。按照[CFSE+7-AAD+细胞/(CFSE+7-AAD-+CFSE+7-AAD+)]细胞计算被杀伤细胞的百分比，并具有基于靶细胞的对照孔的存活细胞/死亡细胞门控(gates)以说明自发性细胞死亡。
在96孔板中将NK92细胞和SKOV3细胞以每孔2×104个细胞接种在含10％FBS的培养基中，并在37℃、5％CO2存在下生长6小时。如先前所述(Liu,Y等(2014).Codelivery ofdoxorubicin and paclitaxel by cross-linked multilamellar liposome enablessynergistic antitumor activity.Mol Pharm 11:1651-1661)，将细胞与各种浓度的cMLV(PTX)孵育，并根据制造商的说明，使用来自Roche Applied Science(Indianapolis,IN)的细胞增殖试剂盒II(XTT分析)对细胞活力进行评价。通过从处理的孔中获得的吸光度值中减去仅培养基的孔中获得的吸光度值，然后通过不含药物但含细胞的对照孔进行归一化来确定细胞活力百分比。
侵袭迁移(Transmigration)分析：在24mm直径、3μm孔径的Transwell板(Costar)中进行NK细胞的侵袭迁移分析。将与cMLV缀合或未缀合cMLV的NK细胞铺在上部孔中，并将培养基添加至下部孔中。将化学引诱物CXCL9(0.1mg/ml，Peprotech)添加至下部孔中。在37℃下孵育6小时后，对已经迁移到下室中的NK细胞进行计数。
体内生物分布研究：6-10周龄的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIL2Rγtm1Wj1/SZ(NSG)小鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。在南加州大学(Los Angeles,CA,USA)的动物设施中，将所有小鼠饲养在特定病原体减少的条件下。按照美国国立卫生研究院和南加州大学动物护理和使用的指南进行所有实验。在第-14天，将总计3.5×106个SKOV3.CD19细胞皮下接种到NOD/scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠的胁腹，并允许肿瘤生长直至它们达到100mm3。在第0天，通过尾静脉给小鼠静脉注射cMLV(DiD)或CAR.NK.cMLV(DiD)。注射后24小时、48小时和72小时，处死小鼠并就荧光强度对器官进行分析。使用IVIS Spectrum成像系统对每个器官的DiD组织荧光进行定量，并计算每克组织的注射剂量百分比(％ID/g)。
异种移植肿瘤模型：在第-14天，将总计3.5×106个SKOV3.CD19细胞皮下接种到NSG小鼠的胁腹，并允许肿瘤生长到70mm3-100mm3。将小鼠随机分为六组，每组五只小鼠。在第0天、第4天、第7天和第11天，通过尾静脉给小鼠静脉注射PBS、仅cMLV(PTX)、仅未转导的NK细胞、仅CAR.NK细胞、没有缀合在一起的混合的CAR.NK+cMLV(PTX)、或者缀合的CAR.NK.cMLV(PTX)。在给予NK细胞的组中，每次注射每小鼠5×106个细胞。记录小鼠的体重和肿瘤生长直至处死。用精细卡尺测量肿瘤的长度和宽度，并按照1/2×(长度)×(宽度)2来计算肿瘤体积。
瘤内PTX浓度的离体(ex vivo)测量：使用高效液相色谱法(HPLC)，如先前所详细描述(Liu,Y等(2014).Codelivery of chemotherapeutics via crosslinkedmultilamellar liposomal vesicles to overcome multidrug resistance intumor.PLoS ONE 9:e110611)，对冷冻肿瘤组织中的PTX的浓度进行定量。简单来说，将解冻的肿瘤组织切碎并在乙酸乙酯中匀质化，向每个样品中添加已知浓度的多西他赛作为内标。将样品离心并将有机层转移至干净的管中。在氩气流下蒸发有机层，并在稀乙腈中再水化。在HPLC上运行样品后，分析峰高度以测定瘤内PTX浓度。
肿瘤免疫组织化学、心脏毒性和共聚焦成像：将肿瘤切离、固定、冷冻、冷冻切片并安装在玻璃载片上。对冷冻切片进行固定并用冷PBS漂洗。封闭并透化后，将载片用PBS洗涤，并与末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)反应混合物(Roche，Indianapolis，Indiana)孵育1小时，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen，Carlsbad，CA)复染。使用Nikon Eclipse Ti-E显微镜通过Yokogawa转盘式共聚焦扫描系统(Solamere Technology Group，Salt Lake City，UT)对荧光图像进行采集。405nm、491nm、561nm和640nm固态激光线的照明功率由AOTF(声光可调滤波器)控制的激光合并系统(laser-merge system)提供，对于每个激光为50mW。使用Nikon NIS-Elements软件对所有图像进行分析。为了量化TUNEL阳性细胞，以10倍放大倍率每图像随机选择四个感兴趣的区域(ROI)。在一个区域内，通过Nikon NIS-Element软件对TUNEL阳性细胞核的面积和细胞核染色的面积进行计数，数据表示为区域内TUNEL染色的总细胞核面积％。关于心脏毒性，在最后一次注射后2天收获心脏组织，并用4％甲醛固定。将组织冷冻，然后切成切片并安装在玻璃载片上。将冷冻切片用苏木精和伊红进行染色。通过EVOS光学显微术对组织病理学标本进行检查。
统计学：用学生t检验对两组之间的差异进行确定。用单向方差分析(ANOVA)对三组或更多组之间的差异进行确定。
实施例2
抗CD19 CAR和抗Her2 CAR在NK92细胞中表达
我们确认了NK92细胞表达抗CD19 CAR和抗Her2 CAR的能力，该CAR由scFv衍生的抗原结合结构域、CD8铰链和跨膜区域、CD28和/或4-1BB共刺激结构域、以及CD3ζ信号传导结构域组成。使用由Wolfgang Uckert博士慷慨提供的先前报道的MP71载体，用逆转录病毒转导产生抗CD19 CAR.NK细胞。使用在pCCW载体中的先前描述的曲妥珠单抗衍生的CAR，用慢病毒转导生成抗Her2 CAR.NK细胞，所述载体基于pCCL载体43-45并带有添加的WRE转录后调控区。使用荧光激活细胞分选法对转导的细胞进行分选，以进一步增加CAR+细胞的百分比(图1E)。在初始转导和分选后数月，CAR表达稳定。
cMLV稳定地缀合到NK细胞表面
先前的研究证明，交联的多层脂质体囊泡(cMLV)成功囊括有疏水性药物和亲水性药物二者。使用常规的脱水-再水化方法，通过将相邻脂质双层的官能化头基共价交联来合成这些囊泡。合成的cMLV纳米颗粒由脂质双层表面上存在的硫醇反应性马来酰亚胺头基稳定缀合至存在于NK细胞表面上的还原的硫醇基团上。在淋巴细胞表面检测到高水平的游离硫醇。所述缀合以两步进行。首先，将NK细胞和cMLV共孵育以诱导颗粒偶联至细胞表面上的游离硫醇。初始反应后，使缀合cMLV的细胞经受原位PEG化反应以淬灭残留的硫醇反应基团。为了确定每NK细胞可缀合的最大颗粒数，我们进行了以不同的荧光标记cMLV对细胞的比例(2000:1、1000:1、500:1、100:1和10:1)的一系列稀释进行缀合。在2000:1至1000:1的缀合比例，每细胞缀合脂质体数开始进入平台，并显示出每细胞平均约150个纳米颗粒的缀合(图1B)。根据这些数据，我们确定使用的最佳比例为1000:1，因为进一步增加它不会增加细胞表面上缀合的cMLV的数量。我们将这个比例用于所有后续实验。将共聚焦成像用于对cMLV缀合至NK细胞表面进行确认和可视化(图1C、图1F)。
在运载体细胞表面上纳米颗粒的延长的表面保留的主要优点如下：(1)防止由于内化进入降解性细胞内区室而引起的立即的颗粒降解，以及(2)从缀合颗粒的细胞中持续释放药物，从而允许药物有效地靶向至肿瘤细胞。纳米颗粒可被多种细胞内吞，包括内皮细胞和巨噬细胞。但是，对于我们的研究而言，cMLV在NK细胞表面上保留是关键。为了解决这一点，我们进行了实验以测定缀合后这些颗粒的内化。为了确定这些NK细胞是否还可能触发脂质体的内吞作用，我们将NK细胞与标签有PE CF荧光素染料的cMLV缀合，然后使细胞升温至37℃并随时间评价与细胞相关的荧光。cMLV附着至NK细胞并没有触发这些颗粒的细胞摄取，并且结合至NK细胞的颗粒保持在细胞表面，如图1D所示。
CAR.NK细胞在体外对表达抗原的靶细胞具有较大的细胞毒性作用并对PTX的敏感性较低
通过将未转导的NK细胞或CAR.NK细胞与多种靶细胞系共孵育并用流式细胞术读取结果，我们对CAR.NK细胞触发针对适当的表达抗原的靶细胞的细胞毒性作用的能力进行了评价。我们使用慢病毒来转导SKOV3细胞来表达CD19(SKOV.CD19)，用以充当用于我们的抗CD19CAR.NK细胞的靶细胞。与未转导的NK细胞或与未表达同源抗原的靶细胞(分别为SKOV3和MDA.MB.468)共孵育的CAR.NK细胞相比，靶向CD19和靶向Her2的CAR.NK细胞均对表达抗原的靶细胞(分别为SKOV.CD19和SKOV3，图2A，图2B)表现出更大的细胞毒性。这些趋势在所有效应物-靶标比例下均观察到(对于1:1和10:1，p<0.01，对于5:1，p<0.001)，表明CAR介导的细胞杀伤。
由于NK92细胞起源于患有NK细胞淋巴瘤的患者，因此在临床使用之前对这些同种异体细胞进行辐照以防止它们在体内增殖。辐照不影响我们的CAR.NK细胞的细胞毒性能力(图2C)。我们还进行了细胞活力分析来证明相比NK细胞，SKOV3细胞对PTX更敏感(图2D)。这确保了NK细胞可携带足够的PTX来杀伤靶细胞，而不会使自身屈服于PTX诱导的毒性。缀合至NK细胞的cMLV到第3天也释放了其中大部分的PTX有效载荷(图2E)。
CAR.NK功能在体外不受cMLV缀合的影响，并在具有cMLV(PTX)缀合时增强
我们确保cMLV缀合至CAR.NK细胞表面不影响CAR.NK细胞本身的功能。为了检测抗原结合后的NK细胞激活，我们将多种靶细胞系与具有或不具有cMLV缀合的NK细胞共培养，进行了IFN-γ释放分析。当单独孵育或与不具有同源抗原的靶细胞共培养时，CAR.NK细胞均无反应，但与表达正确抗原的靶细胞共孵育导致来自抗CD19 CAR.NK细胞系和抗Her2CAR.NK细胞系的IFN-γ+细胞百分比显著较高(p<0.05)，证明了对适当TAA的特异性。当将CAR.NK细胞与不含药物的空cMLV(CAR.NK.cMLV(空))或载有PTX的cMLV(CAR.NK.cMLV(PTX))缀合时，IFN-γ释放与未缀合的CAR.NK细胞的IFN-γ释放没有显著差异(图3A、图3B)。
我们用未缀合的CAR.NK细胞、缀合空cMLV的CAR.NK细胞(CAR.NK.cMLV(空))或缀合载有PTX的cMLV的CAR.NK细胞(CAR.NK.cMLV(PTX))，以效应物-靶标比例为1:1重复了细胞毒性分析。CAR.NK.cMLV(空)不具有显著受影响的细胞杀伤，但用CAR.NK.cMLV(PTX)对靶细胞的细胞毒性显著增加(图3C、图3D)。这些数据表明，尽管空的cMLV不影响CAR.NK功能，但在靶细胞附近从cMLV中释放的PTX可进一步助推细胞毒性作用。
最后，我们监测了具有或不具有cMLV缀合的NK迁移。为了影响抗肿瘤响应，NK细胞必须响应化学引诱物渗入肿瘤部位并在肿瘤部位内迁移。为了确保cMLV与NK表面的缀合不影响细胞迁移，我们进行了NK细胞侵袭迁移分析。将化学引诱物CXCL9用于促进NK细胞迁移至孔的下室。与空白培养基对照相比，当将CXCL9用作引诱物时，下室中有显著较多的迁移的NK细胞(p<0.05)，但是在缀合组和未缀合组之间没有显著差异，表明cMLV缀合至细胞表面不影响NK的迁移能力(图3E)。
CAR.NK.cMLV增强cMLV向肿瘤部位的递送
在体外确认了我们的缀合cMLV(PTX)的CAR.NK细胞的功能之后，我们进行了生物分布研究来确定CAR.NK细胞是否增强了cMLV归巢(homing)至肿瘤部位。将荧光染料DiD用于标签cMLV(cMLV(DiD))并对它们在各种器官中的存在进行跟踪。对NSG小鼠皮下注射SKOV.CD19细胞。肿瘤接种后两周，向小鼠静脉注射cMLV(DiD)或缀合的CAR.NK.cMLV(DiD)。在不同时间点，将小鼠处死并就荧光信号对器官进行分析。在24小时时(图4A、图4B)，两组中的大多数cMLV仍在血液中循环。CAR.NK.cMLV(DiD)组在血液(p<0.001)、淋巴结(p<0.05)和肿瘤(p<0.01)中具有显著较多的cMLV，cMLV(DiD)组在肝中具有显著较多的积聚(p<0.001)。在48小时时(图4C、图4D)，大多数cMLV(DiD)组积聚在肝中，但CAR.NK.cMLV(DiD)组在血液、淋巴结、脾和肿瘤中具有显著较多的cMLV(p<0.001)。到72小时(图4E、图4F)，大多数cMLV(DiD)信号消失，仅在肝、血液和肿瘤中可检测到少量。相比之下，CAR.NK.cMLV(DiD)组在血液、淋巴结、脾和肿瘤中具有显著较多的cMLV(p<0.001)。总体而言，没有细胞充当伴侣的cMLV(DiD)可能被肝清除，因为肝清除充当着对于太大而无法由肾清除的颗粒的主要清除途径。相反，缀合至CAR.NK细胞的cMLV(DiD)能够归巢至肿瘤部位。
CAR.NK.cMLV(PTX)在体内增强抗肿瘤功效
我们建立了小鼠异种移植模型来观测抗CD19 CAR.NK细胞在体内的作用。对NSG小鼠皮下注射SKOV.CD19细胞。肿瘤接种后两周，将小鼠随机分为六组，并通过尾静脉(静脉)注射(1)PBS，作为对照；(2)仅cMLV(PTX)，没有任何细胞成分；(3)仅未转导的NK细胞；(4)仅CAR.NK细胞；(5)混合的cMLV(PTX)+CAR.NK，对其进行了共注射，但未进行缀合；以及(6)缀合的CAR.NK.cMLV(PTX)细胞。在组(6)中，每小鼠注射0.1mg PTX。对于20g小鼠，每注射给予5百万个细胞，总共四次注射。与PBS组、cMLV(PTX)组和NK组相比，用CAR.NK.cMLV(PTX)处理的小鼠具有显著减缓的肿瘤生长(p<0.001)，并且与CAR.NK组和CAR.NK+cMLV(PTX)组相比也具有显著减缓的肿瘤生长(p<0.01，图5)。这些数据支持以下假设：来自NK细胞的免疫治疗作用和来自PTX的化学治疗作用均在杀伤肿瘤细胞中发挥作用，因为单独使用这两种组分其一的效果均没有将两者结合时有效。此外，即使用CAR.NK+cMLV(PTX)处理的小鼠也没有如用CAR.NK.cMLV(PTX)处理的小鼠那样大的抗肿瘤响应。这表明药物与NK细胞之间的缀合对于获得治疗系统的完全的益处是关键，以及CAR.NK细胞促进PTX传递至肿瘤部位从而增强了抗癌作用。
CAR.NK.cMLV(PTX)增强PTX递送进肿瘤部位
我们进行了小鼠异种移植肿瘤模型的离体分析来支持我们的的以下假设：CAR.NK细胞促进PTX递送进肿瘤部位。使用高效液相色谱法(HPLC)，我们对用PTX处理的小鼠的瘤内PTX浓度进行了定量，包括cMLV(PTX)组、CAR.NK+cMLV(PTX)组和CAR.NK.cMLV(PTX)组。与cMLV(PTX)或CAR.NK+cMLV(PTX)相比，缀合组CAR.NK.cMLV(PTX)在肿瘤组织内具有显著较高的PTX浓度(分别为p<0.01和p<0.001，图6A)。
我们还使用共聚焦成像来将固定在玻璃载片上的肿瘤组织中的凋亡细胞可视化。如图6B所示，相比对照组或NK细胞组，用CAR.NK细胞处理的组中有较多的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)+细胞，表明由CAR.NK细胞而来的细胞杀伤较高。当与仅cMLV(PTX)处理相比时，在用CAR.NK+cMLV(PTX)处理的组中观测到较高的细胞凋亡水平，但与CAR.NK处理相比，细胞凋亡的程度相似。值得注意的是，CAR.NK.cMLV(PTX)处理的肿瘤具有最大程度的细胞凋亡，表明药物和CAR.NK细胞的共定位递送诱导了协同功效。
最后，由于PTX的治疗作用受限于其心脏毒性，因此用光学显微术对用苏木精和伊红染色的固定的心脏组织切片进行成像。将心脏毒性定义为肌原纤维丧失和紊乱以及胞浆空泡化。我们在任何处理组中均未观测到对心脏组织的损害(图6C)。由于我们的递送是靶向的，因此与传统的基于PTX的治疗57-59相比，我们能够使用非常低剂量的PTX(0.5mg/kg)，从而使心脏毒性最小化。
我们的系统将基于纳米颗粒的药物递送与免疫疗法相结合来产生细胞介导的主动靶向策略。在体外，我们证明了即使NK细胞具有吞噬能力，缀合至NK细胞的cMLV并没有触发内吞作用。可能部分地由于cMLV的大小，颗粒保持在NK细胞表面上—先前的研究已证实，直径大于50nm的表面缀合颗粒不被有效地内化。此外，已经证实马来酰亚胺官能化的cMLV与免疫细胞表面上的游离硫醇的共价连接在初始缀合后甚至在细胞分裂后稳定数天。尽管这种延长的表面保留的确切机制仍有待发现，但是已证实马来酰亚胺-硫醇缀合策略是免疫细胞表面工程化的一种有前景的方法。
我们还在体外证明了CAR.NK细胞可特异性杀伤表达抗原的癌细胞、cMLV的缀合并未不利地影响NK细胞的功能、以及cMLV(PTX)与CAR.NK的缀合可进一步增大细胞毒性。尽管对CAR.NK细胞的许多研究都包括来自细胞毒性分析的结果而未包括来自细胞因子释放分析的结果，但是我们证实CAR.NK细胞响应于TAA+靶细胞而释放IFN-γ。与TAA-靶细胞共孵育的CAR.NK细胞以及与任何靶细胞共孵育的未转导NK细胞均不释放IFN-γ。这些结果表明，CAR.NK细胞增强的细胞毒性伴随着IFN-γ释放增加。除了使肿瘤细胞对NK细胞毒性敏感之外，由原代NK细胞和NK细胞系而来的IFN-γ释放向周围的免疫细胞(包括T细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞)发出信号，引发更广泛的适应性免疫应答和先天免疫应答。
我们的体内生物分布研究进一步支持了CAR.NK细胞增强了肿瘤部位内的纳米颗粒积聚。用无细胞伴侣的cMLV(DiD)处理的小鼠在肝中具有显著较多的cMLV积聚，这可能表明如用较大的脂质体通常所观测到的肝清除。然而，CAR.NK.cMLV(DiD)处理的小鼠在肿瘤部位具有显著较大的cMLV积聚。此外，在NK细胞天然归巢的器官(如脾和淋巴结)中观测到显著较高的信号。我们的体内和离体数据提供了证据表明相比任何其它治疗组(包括共同给予但未缀合的CAR.NK和cMLV(PTX))，CAR.NK细胞更有效地促进化学治疗药物PTX递送至肿瘤部位、减缓肿瘤生长并提高瘤内PTX浓度。最后，我们能够使用低剂量的PTX，并且没有观测到任何心脏毒性。
我们发现一定剂量的PTX可杀伤肿瘤细胞但并不杀伤NK92细胞，从而创造了我们可以在其中使用NK92细胞来递送该化学治疗药物来杀伤肿瘤细胞而不杀伤运载体细胞的治疗窗口。但是，我们相信该系统不局限于PTX递送。例如，已经证实在体内鼠T细胞使用缀合至细胞表面的载有药物的纳米胶囊将抗癌药物SN-38递送至淋巴瘤部位。SN-38有效地杀伤淋巴瘤细胞，但对T细胞运载体无毒性。另一项研究表明，使用携带促炎细胞因子IL-15和IL-21的表面缀合脂质体，原代人T细胞可增强抗肿瘤免疫应答。免疫细胞的表面工程化已允许将多种药物或佐剂递送至肿瘤部位。据我们所知，我们提出了表面工程化NK细胞的首次研究，以及将CAR.NK细胞用于肿瘤靶向药物递送的首次研究。我们相信，我们的CAR.NK介导的药物递送系统可扩展至不仅包括传统化学治疗试剂的递送，而且还包括其它抗癌治疗(例如免疫调节剂和影响肿瘤微环境的小分子)的递送。
作为化学疗法的替代或补充，癌症免疫疗法已经吸引了许多关注，并且目前一些临床试验正在使用CAR工程化T(CAR-T)细胞来靶向患有复发性实体癌(例如胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌)的患者。但是，CAR-T疗法依赖于患者自体T细胞的离体扩增，这提出了运筹问题，并在细胞的准备时延迟了治疗的开始(通常需要2-3周来扩增用于临床使用的CAR工程化免疫细胞)。这些问题可通过使用同种异体细胞系代替自体细胞来部分改善；虽然几乎没有可用的功能性细胞毒性T细胞系，但有若干种功能性、永生性NK细胞系。在这些NK细胞系中，NK92是最有前景的，并且是临床试验中使用的唯一NK细胞系。
使用CAR工程化NK92细胞相比CAR-T细胞有多种潜在的益处。CAR工程化NK92细胞可为基于CAR的疗法提供替代的“现成(off-the-shelf)”媒介物，并通过表面工程化向肿瘤部位提供更多的靶向药物递送。NK92细胞每2-4天翻倍，允许在良好生产规范(GMP)条件下轻松扩增、修饰和储存。NK92细胞与亲本细胞系相同，消除了供体变异性的问题。自体免疫细胞的离体扩增和修饰将无需延迟时间，这在患有侵袭性癌症的患者中尤为关键，在这种情况下几天或几周的治疗延迟可能会影响结果。如果经辐照(防止增殖)，NK92细胞可安全用于临床。与CAR-T细胞相比，这降低了脱靶效应的风险。可将短寿命的CAR工程化NK92细胞视为“活药物(living drug)”，并根据需要再次给药。最后，基于同种异体NK92细胞的疗法比自体CAR-T细胞疗法便宜—一个团体估计，每个CAR-T方案花费在每患者250,000美元以上，但临床中使用的NK92细胞的费用为每位患者约20,000美元。
我们已经证明缀合载有PTX的cMLV的CAR.NK细胞提供靶向药物递送和改善的抗肿瘤功效。我们认为使用表面工程化CAR.NK细胞的靶向药物递送是广泛适用的，因为CAR靶标和药物有效载荷均可以改变，以治疗多种癌症。总的来说，本研究示出了用于增强肿瘤治疗的有前景的免疫疗法和药物递送的组合。
上述多种方法和技术提供了实施该申请的多种方式。当然，应当理解的是，根据本文所述的任何特定实施方式，所述的所有目标和优点未必都能实现。因此，例如，本领域技术人员将认识到，可通过实现或优化如本文教导的一个优点或一组优点而不必实现如本文教导或建议的其它目标或优点的方式来实施本方法。本文提及了多种替代方式。应当理解的是，一些优选的实施方式具体包括一种、另一种或多种特征，而其它的实施方式则具体地排除一种、另一种或多种特征，然而还有其它实施方式通过包括一种、另一种或多种有利特征而缓和特定的特征。
此外，技术人员将认识到来自不同实施方式的多种特征的适用性。相似地，本领域的普通技术人员能够以多种组合采用上述公开的多种要素、特征和步骤以及各此类要素、特征或步骤的其它已知等同物，以根据本文所述的原理实施方法。在多种要素、特征和步骤之中，一些将被具体地包括在不同的实施方式之中，而其它的则被具体地排除在不同的实施方式之外。
虽然本申请已在一些实施方式和实施例的上下文中进行了公开，但是本领域的技术人员将会理解的是，本申请的实施方式延伸到具体公开的实施方式之外，并延伸至其它替代性实施方式和/或用途以及其修改物和等同物。
本文对这一申请的优选实施方式进行了描述，包括本发明人已知的用于实施本申请的最佳模式。在本领域的普通技术人员阅读上述说明时，这些优选实施方式的变型将变得显而易见。在考虑之列的是，技术人员可在适当时采用此类变型，并且本申请可按本文具体描述之外的方式加以实践。因此，如可适用的法律所允许的，这一申请的许多实施方式包括所附权利要求书中列出的主题的所有修改物和等同物。此外，除非在本文中另外指明，或除非与上下文明显冲突，本申请涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。
除了如下，将本文中参考的所有专利、专利申请、专利申请的公开文本以及其它材料(诸如文章、书籍、说明书、出版物、文件、事物和/或类似物)由此都以此种引用方式整体并入本文，用于所有目的：与相同材料相关的任何审查文件历史、与本文件不一致或冲突的任何相同材料、或可能对当前或随后与本文件相关的权利要求书的最广范围具有限制作用的任何相同材料。举例来说，如果与任何并入的材料相关的术语的描述、定义和/或用途同与本文件相关的术语的描述、定义和/或用途之间存在任何不一致或冲突，应以本文件中的术语的描述、定义和/或用途为准。
应当理解的是，本文所公开的申请的实施方式是对本申请实施方式的原理的说明。可采用的其它修改形式可在本申请的范围内。因此，举例来说，而非加以限制，本申请的实施方式的替代构造可根据本文的教导而使用。因此，本申请的实施方式不限于如精确地示出和描述的内容。
在上面的详细说明中描述了本发明的多个实施方式。虽然这些描述直接描述上面的实施方式，但是应该理解，本领域技术人员可对本文示出和描述的特定的实施方式构想出修改和/或变化。落入本说明书范围内的任何此类修改或变化也意图包括在其中。除非特别指出，否则，本发明人的意图是说明书和权利要求书中的词汇和短语都被赋予对于适用领域的普通技术人员而言的普通含义和惯用含义。
已经给出了本申请人在提交申请时所知道的本发明的多个实施方式的前述描述，并意在用于说明和描述的目的。本描述并不意在详尽无遗，也并不意在将本发明限于所公开的精确形式，并且根据上述教导，许多修改和变化都是可能的。所描述的实施方式是用来解释本发明的原理及其实际应用，并用来使本领域其他技术人员能够按多种实施方式及适合于所预期的特定用途的多种修改来利用本发明。因此，并不意在将本发明限制至所公开的用于实施本发明的特定实施方式。
虽然已经示出和描述本发明的特定实施方式，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，根据本文中的教导，在不背离本发明及其较宽泛的方面的情况下可以作出改变和修改，并且因此，所附权利要求书将在它们的范围内涵盖所有此类落在本发明的真正精神和范围内的改变和修改。

Claims (16)

1.一种工程化的免疫效应细胞，所述工程化的免疫效应细胞包含：
自然杀伤(NK)细胞；以及
结合至所述NK细胞表面的多个纳米颗粒，
其中，所述NK细胞含有编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述CAR包含细胞外抗原特异性结构域，并且
其中，所述多个纳米颗粒封装有对NK细胞群不引起细胞毒性或引起小于15％的细胞毒性的量的化学治疗试剂。
2.一种细胞群，所述细胞群包含多个如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞，
其中，每个工程化的免疫效应细胞包含：
a.天然杀伤(NK)细胞，所述NK细胞进一步包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述CAR包含细胞外抗原特异性结构域；以及
b.结合至所述NK细胞表面的多个纳米颗粒，至少一个纳米颗粒封装有化学治疗试剂；
其中，所述细胞群具有总量对所述多个工程化的免疫效应细胞不产生细胞毒性或产生小于15％的细胞毒性、但对抑制或杀伤肿瘤细胞有效的所述化学治疗试剂。
3.如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞，其中，所述纳米颗粒为脂质体，所述脂质体包括交联的多层脂质体囊泡(cMLV)。
4.如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞，其中，所述CAR结合CD19。
5.如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞，其中，所述CAR结合Her2。
6.如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞，其中，所述CAR为双特异性CAR并且结合CD19和Her2。
7.如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞，其中，所述纳米颗粒为cMLV，并且所述化学治疗试剂为紫杉醇。
8.如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞，其中，所述纳米颗粒为cMLV，并且所述cMLV以100:1至150:1之间的数量比化学键合至所述NK细胞的表面。
9.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的运载体。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求2所述的细胞群和药学上可接受的运载体。
11.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的如权利要求1所述的工程化的免疫效应细胞。
12.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的如权利要求10所述的药物组合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述药物组合物通过静脉输注进行给予。
14.如权利要求12所述的方法，其中，在给予所述药物组合物之前，所述受试者已经经历了全身辐照(TBI)、IgG1抗体给予、或二者皆有。
15.如权利要求12所述的方法，所述方法进一步包括以每周、每两周、每三周、每月、每季度或每年的间隔一次或多次后续给予所述药物组合物。
16.如权利要求12所述的方法，其中，所述受试者患有选自于由以下所组成的组中的一种或多种癌症：白血病、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌。
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