MXPA05014030A - Composiciones de anticuerpo pro 104 y metodos de uso. - Google Patents

Composiciones de anticuerpo pro 104 y metodos de uso.

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MXPA05014030A
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Glenn Pilkington
Gilbert-Andre Keller
Wenlu Li
Laura Corral
Iris Simon
Muriel Kmet
Jianwen Tang
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Diadexus Inc
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Abstract

La invencion proporciona anticuerpos de antigeno (Pro 104) de cancer anti-ovarico, pulmon o mama que se unen a Pro 104 en una celula de mamifero in vivo. La invencion tambien comprende composiciones que comprenden un anticuerpo anti-Pro 104 y un vehiculo. Estas composiciones pueden proporcionarse en un articulo de elaboracion o un equipo. Otro aspecto de la invencion es un acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-Pro 104, asi como tambien un vector de expresion que comprende el acido nucleico aislado `1. Tambien se proporcionan las celulas que producen los anticuerpos anti-Pro 104. La invencion comprende un metodo para producir los anticuerpos anti-Pro 104. Otros aspectos de la invencion son un metodo para matar una celula cancerigena que expresa Pro 104, comprendiendo contactar la celula cancerigena con un anticuerpo anti-Pro 104 y un metodo para aminorar o tratar un cancer que expresa Pro 104 en un mamifero, comprendiendo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo anti-Pro 104 al mamifero.

Description

COMPOSICIONES DE ANTICUERPO Pro 104 Y MÉTODOS DE USO Esta solicitud reivindica la prioridad del beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Patente de EE.UU. No. 60/523,271 , presentada el 17 de Noviembre de 2003 y la Solicitud Provisional de Patente de EE.UU No. 60/485,436, presentada el 27 de Junio de 2003, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones de anticuerpo anti-Pro104 y métodos para detectar cánceres que expresan Pro104 y que eliminan las células cancerígenas de pulmón, pancreáticas, ováricas y de mama que expresan Pro104. Además, esta invención se refiere a métodos para modular o eliminar la célula que expresa Pro104 al administrar una cantidad eficaz de un compuesto capaz de modular la función de Pro104.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cáncer de Mama Cáncer de mama, también referido como cáncer de tumor de mama, es el segundo cáncer más común entre mujeres, contándose por un tercio de los cánceres diagnosticados en los Estados Unidos. Una en nueve mujeres desarrollará cáncer de mama en su tiempo de vida y aproximadamente 192,000 casos de cáncer de mama se diagnostican anualmente con aproximadamente 42,000 muertes. Bevers, Primary Prevention of Breast Cáncer, in Breast Cáncer. 20-54 (Kelly K Hunt et ai, ed. , 2001 ); Kochanek eí al., 49 Nat'l. Vital Statistics Reports 1 , 14 (2001 ). El cáncer de mama es extremadamente raro en mujeres más jóvenes de 20 y es muy raron en mujeres abajo de 30. La incidencia de cáncer de mama se eleva con la edad y llega a ser importante por la edad de 50. Las mujeres no hispánicas blancas tienen la tasa de incidencia más alta para el cáncer de mama y las mujeres coreanas tienen la más baja. La prevalencia aumentada de las mutaciones genéticas BRCA1 y BRCA2 que promueven el cáncer de mama y otros cánceres se encuentran en Ashkenazi Jews. Las mujeres americanas africanas tienen la tasa de mortalidad más alta para el cáncer de mama entre estos mismos grupos (31 por 100,000) mientras qué las mujeres chinas tienen la más baja en 1 1 por 100,000. A pesar de que los hombres pueden adquirir cáncer de mama, esto es extremadamente raro. En los Estados Unidos se estima que existirán 217,440 nuevos casos de cáncer de mama y 40,580 muertes debido al cáncer de mama en el 2004. (ACS Website: cáncer con la extensión .org de la red mundial.). Con la excepción de aquellos casos con factores genéticos asociados, se desconocen las causas precisas de cáncer de mama. En el tratamiento de cáncer de mama, existe considerable énfasis en la detección y valoración de riesgo debido a que el avance gradual temprano y exacto del cáncer de mama tiene un impacto importante en la supervivencia. Por ejemplo, el cáncer de mama detectado en una etapa temprana (etapa T0, abajo discutida) tiene una tasa de supervivencia de cinco años de 92%. De manera inversa, si el cáncer no se detecta hasta una etapa tardía (es decir, etapa T4 (IV)), la tasa de supervivencia de cinco años se reduce a 13%. AJCC Cáncer Staging Handbook pp. 164-65 (Irvin D. Fleming et al. eds. , 5th ed. 1998). Algunas técnicas de detección, tales como mamografía y biopsia, incluyen incomodidad aumentada, gasto, y/o radiación, y solamente se prescriben de manera única a pacientes con un riesgo aumentado de cáncer de mama. Los métodos actuales para pronosticar o detectar el riesgo de cáncer de mama no son óptimos. Un método para pronosticar el riesgo relativo de cáncer de mama es mediante la evaluación de los factores de riesgo del paciente y los regímenes de tratamiento y de diagnóstico agresivos concernientes para los pacientes de alto riesgo. El riesgo de cáncer de mama de un paciente se ha asociado positivamente con el aumento de la edad, nulíparo, historia de la familia de cáncer de mama, historia personal de cáncer de mama, menarquía temprana, menopausia tardía, última edad del primer embarazo a largo plazo, enfermedad de mama proliferativa anterior, irradiación de la mama a una edad temprana y una historia de enfermedad personal. Los factores de estilo de vida tales como consumo de grasa, consumo de alcohol, educación, y status socioeconómico, también se han asociado con una incidencia aumentada de cáncer de mama a pesar de que una causa directa y relación de efecto no se ha establecido. Mientras que estos factores de riesgo son estadísticamente importantes, su asociación débil con el cáncer de mama limitó su utilidad. La mayoría de las mujeres quienes desarrollaron cáncer de mama no tuvieron ninguno de los factores de riesgo enlistados anteriormente, diferente al riesgo que viene con el envejecimiento. Publicación NIH No. 00-1556 (2000). Los métodos de selección actuales para detectar cáncer, tal como autoexamen de mama, ultrasonido, y mamografía tienen desventajas que reducen su efectividad o previenen su adopción amplia. Los autoexamenes de mama, mientras son útiles, son desconfiables para la detección de cáncer de mama en las etapas iniciales en donde el tumor es pequeño y difícil de detectar por palpación. Las medidas de ultrasonido requieren operadores expertos a un costo elevado. La mamografía, mientras es sensible, se somete a más diagnóstico en la detección de lesiones que tienen potencial maligno cuestionable. También existe el medio de la radiación utilizada en la mamografía debido a que la radiación de pecho anterior es un factor asociado con una incidencia de aumento de cáncer de mama. En este momento, no existen métodos adecuados de la prevención de cáncer de mama. Los métodos actuales de la prevención de cáncer de mama incluyen mastectomía profiláctica (mastectomía realizada antes del diagnóstico de cáncer) y quimioprevención (quimioterapia antes del diagnóstico de cáncer) las cuales son medidas drásticas que limitan su adopción aún entre mujeres con riesgo aumentado de cáncer de mama. Bevers, supra. Un número de marcadores genéticos se han asociado con el cáncer de mama. Los ejemplos de estos marcadores incluyen antígeno carcinoembriónico (CEA) (Mughal et al., JAMA 249:1881 (1983)), MUC-1 (Frische y Liu, J. Clin. Ligand 22:320 (2000)), HER-2/neu (Haris et al. , Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 15:A96 (1996)), uPA, PAI-1 , LPA, LPC, RAK y BRCA (Esteva y Fritsche, Serum y Tissue Markers for Breast Cáncer, in Breast Cáncer, 286-308 (2001 )). Estos marcadores tienen problemas con la sensibilidad limitada, baja correlación, y falsas negativas que limitan su uso para el diagnóstico inicial. Por ejemplo, mientras que la mutación de gen BRCA1 es útil como un indicador de un riesgo aumentado del cáncer de mama, tiene uso limitado en el diagnóstico de cáncer debido a que solamente 6.2% de cánceres de mama son BRCA1 positivos. Malone eí al., JAMA 279:922 (1998). Véase también, Mewman ef al., JAMA 279:915 (1998) (correlación de solamente 3.3%). Existen cuatro clasificaciones primarias de cáncer de mama que varían por el sitio de origen y el grado de desarrollo de la enfermedad. I. Carcinoma ducta in situ (DCIS): Transformación maligna de las células epiteliales ductales que permanecen en su posición normal. DCIS es una enfermedad puramente localizada, incapaz de metástasis. II. Carcinoma ductal invasivo (IDC): Malignidad de las células epiteliales ductales que se rompen a través de la membrana basal y hacia el tejido de soporte de la mama. IDC puede esparcirse eventualmente en cualquier parte en el cuerpo.
III. Carcinoma lobular in situ (LCIS): Malignidad que se origina en un lóbulo único de la mama que falla en extenderse a través de la pared lobular, generalmente permanece ubicado. IV. Carcinoma lobular infiltrante (ILC): Malignidad que se origina en un lóbulo único de la mama y que invade directamente a través de la pared lobular en tejidos adyacentes. Por virtud de esta invasión más allá de la pared lobular, ILC puede penetrar los linfáticos y vasos sanguíneos y esparcirse a sitios distantes. Para propósito determinar la prognosis y tratamiento, estos cuatro tipos de cáncer de mama han avanzado gradualmente de acuerdo al tamaño del tumor primario (T), la inclusión de nudos linfáticos (N), y la presencia de metástasis (M). A pesar de que DCIS por definición representa la enfermedad etapa I localizada, las otras formas de cáncer de mama pueden variar de la etapa II a la etapa IV. Existen factores de prognosis adicionales que sirven además para guiar la intervención quirúrgica y médica. Los más comunes son un número total de nudos linfáticos incluidos, status ER (receptor de estrógeno), status de receptor Her2/neu y grados histológicos. Los cánceres de mama se diagnostican en las categorías de etapa adecuadas que reconocen que diferentes tratamientos son más eficaces para diferentes etapas de cáncer. La etapa TX indica que el tumor primario no puede valorarse (es decir, el tumor se removió o el tejido de mama se removió). La etapa TO se caracteriza por anormalías tales como hiperplasia pero sin evidencia de tumor primario. La etapa Tis se caracteriza por carcinoma in situ, carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ, o enfermedad de Paget del pezón sin tumor. La etapa T1 (I) se caracteriza como que tiene un tumor de 2 cm o menos en la dimensión más grande. Dentro de la etapa T1 , Tmic indica la microinvasión de 0.1 cm o menos, T1 a indica un tumor de entre 0.1 a 0.5 cm, T1 b indica un tumor de entre 0.5 a 1 cm, y T1 c indica tumores de entre 1 cm a 2 cm. La etapa T2 (II) se caracteriza por tumores de 2 cm a 5 cm en la dimensión más grande. Los tumores mayores a 5 cm en tamaño se clasifican como la etapa T3 (lll). La etapa T4 (IV) indica un tumor de cualquier tamaño con extensión de la pared de pecho o piel. Dentro de la etapa T4, T4a indica la extensión del tunmor a la pared del pecho, T4b indica el edema o ulceración de la piel de la mama o nodulos de piel satélite confinados hacia la misma mama, T4c indica una combinación de T4a y T4b, y T4d indica el carcinoma inflamatorio. AJCC Cáncer Staging Handbook pp. 159-70 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed. 1998). Además del avance gradual estándar, los tumors de mama pueden clasificarse de acuerdo a su status de receptor de estrógeno y proteína de receptor de progesterone. Fisher eí al., Breast Cáncer Research y Treatment 7: 147 (1986). El status patológico adicional, tal como el status HER2/neu, también puede ser útil. Thor eí al., J. Nat'l. Cáncer Inst. 90: 1346 (1998); Paik ef al., J. Nat'l. Cáncer Inst. 90: 1361 (1998); Hutchins et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 17:A2 (1998).; y Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000). Además del avance gradual del tumor primario, las metastasas de cáncer de mama a los nudos linfáticos regionales, pueden graduarse. La etapa NX indica que los nudos linfáticos no pueden valorarse (por ejemplo, removerse previamente). La etpa NO indica que no hay metástasis de nudo linfático regional. La etapa N1 indica la metástasis para los nudos linfáticos axilares ipsilaterales móviles. La etapa N2 indica la metástasis para los nudos linfáticos axilares ipsilaterales fijos entre sí u a otras estructuras. La etapa N3 indica la metástasis a los nudos linfáticos mamarios internos ipsilaterales. Id. La determinación gradual tiene valor prognóstico potencial y proporciona criterios para designer la terapia óptima. Simpson eí al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000). Generalmente, el avance gradual patológico de cáncer de mama es preferable para el avance gradual clínico debido a que el formador brinda una prognosis más exacta. Sin embargo, el avance gradual clínico podría preferirse si fuera tan exacto como el avance gradual patológico debido a que no depende de un procedimiento invasivo para obtener el tejido para evaluación patológica. El avance gradual de cáncer de mama podría mejorarse al detectar nuevos marcadores en células, tejidos, o fluidos corporales que podrían diferenciarse entre las diferentes etapas de invasión. El avance en este campo permitirá el método más rápido y más confiable para tratar los pacientes con cáncer de mama. El tratamiento de cáncer de mama se decide generalmente después de un avance gradual exacto del tumor primario. Las opciones de tratamiento primario incluyen terapia de conservación de mama (lumpectomía, irradiación de mama, y avance gradual quirúrgico de la axila), y mastectomía radical modificada. Los tratamientos adicionales incluyen quimioterapia, irradiación regional, y, en casos extremos, terminación de producción de estrógenos mediante ablation ovárico. Hasta ahora, el tratamiento normal para todo el cáncer de mama fue la mastectomía. Fonseca eí al., Annals of Internal Medicine 127: 1013 (1997). Sin embargo, recientes datos indicant que menos procedimientos radicáis pueden ser igualmente eficaces, en términos de supervivencia, para el cáncer de mama de etapa temprana. Fisher eí al., J. of Clinical Oncology 16:441 (1998). Las opciones de tratamiento para un paciente con cáncer de mama de etapa temprana (es decir, etapa Tis) puede ser cirugía breast-sparing seguida por terapia de radiación localizada en la mama. Alternativamente, la mastectomía opcionalmente acoplada con radiación o reconstrucción de mama, puede emplearse. Estos métodos de tratamiento son igualmente eficaces en las etapas tempranas de cáncer de mama. Los pacientes con cáncer de mama etapa I y etapa II requirien de cirugía con quimioterapia y/o terapia hormonal. La cirugía es de uso limitado en los pacientes de Etapa lll y Etapa IV. De esta manera, estos pacientes son mejores candidatos para la quimioterapia y terapia de radiación con cirugía limitada a biopsia para permitir el avance gradual inicial o reavance gradual subsecuente debido a que el cáncer es raramente curativo en esta etapa de la enfermedad. AJCC Cáncer Staging Handbook 84, 164-65 (Irvin D. Fleming ef al. eds. , 5th ed.1998).
En un esfuerzo de proporcionar más opciones de tratamiento a pacientes, los esfuerzos se superan para definir una etapa más temprana de cáncer de mama con baja recurrencia el cual podría tratarse con lumpectomía sin tratamiento de radiación post-operativa. Mientras un número de intentos se han hecho para clasificar el cáncer de mama de etapa temprana, ninguna recomendación de consenso en tratamiento de radiación post-operativa se ha obtenido de estos estudios. Page ef al., Cáncer 75:1219 (1995); Fisher et al., Cáncer 75: 1223 (1995); Silverstein ef al., Cáncer 77:2267 (1996).
Cáncer Ovárico El cáncer de los ovarios es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en mujeres en los Estados Unidos, con más de 23,000 nuevos casos y rigurosamente 14,000 muertes pronosticadas para el año 2001. Shridhar, V. ef al. , Cáncer Res. 61 (15): 5895-904 (2001); Memarzadeh, S. & Berek, J. S., J. Reprod. Med. 46(7): 621 -29 (2001 ). La Sociedad Americana de Cáncer estima que existirán aproximadamente 25,580 nuevos casos de cáncer ovárico en el 2004 sólo en los Estados Unidos. El cáncer ovárico originará aproximadamente 16,090 muertes en los Estados Unidos. ACS Website: cáncer con la extensión .org de la red mundial.. La incidencia de cáncer ovárico es de interés serio a nivel mundial, con un estimado de 191 ,000 nuevos casos pronosticados anualmente. Runnebaum, I. B. & Stickeler, E., J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 127(2): 73-79 (2001). Desafortunadamente, las mujeres con cáncer ovárico son típicamente asimtomáticos hasta que la enfermedad se ha metastasizado. Debido a que la selección eficaz de cáncer ovárico no se encuentra disponible, rigurosamente 70% de mujeres diagnosticadas tienen una etapa avanzada del cáncer con una tasa de supervivencia de cinco años de aproximadamente 25-30%. Memarzadeh, S. & Berek, J. S., supra; Nunns, D. eí al., Obstet. Gynecol. Surv. 55(12): 746-51. De manera inversa, las mujeres diagnosticadas con cáncer ovárico de etapa temperana disfrutan considerablemente de tasas de supervivencia más altas. Werness, B. A. & Eltabbakh, G. H., Infl. J. Gynecol. Pathol. 20(1 ): 48-63 (2001). A pesar de que nuestro entendimiento de la etiología de cáncer ovárico es incompleto, los resultados de investigación extensiva en este punto de área señalan a factores de edad, genética, reproductivos, y dietéticos/ambientales. La edad es un factor de riesgo clave en el desarrollo de cáncer ovárico: mientras que el riesgo para desarrollar el cáncer ovárico antes de la edad de 30 es ligero, la incidencia de cáncer ovárico se eleva linealmente entre las edades 30 a 50, aumentándose de allí a una tasa más lenta, con la incidencia más alta encontrándose entre mujeres septagenarias. Jeanne M. Schilder ef al. , Hereditary Ovarían Cáncer: Clinical Syndromes y Management, in Ovarían Cáncer 182 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001 ). Con respecto a factores genéticos, un historial de familia de cáncer ovárico es el factor de riesgo más importante en el deesarrrollo de la enfermedad, con ese riesgo dependiendo del número de miembros de familia afectados, el grado de su relación hacia la mujer, y cuyos parientes de primer grado particulares se afectan por la enfermedad. Id. Las mutaciones en varios genes se han asociado con el cáncer ovárico, incluyendo BRCA1 y BRCA2, ambos juegan un papel principal en el desarrollo de cáncer d emama, así como también hMSH2 y hMLH 1 , ambos se asocian con cáncer de colon no poliposis hereditario. Katherine Y. Look, Epidemiology, Etiology, y Screening of Ovarían Cáncer, in Ovarían Cáncer 169, 171 -73 (Stephen C. Rubín & Gregory P. Sutton eds. , 2d ed. 2001 ). BRCA1 , buciado en el cromosoma 17, y BRCA2, ubicado en el cromosoma 1 3, son genes supresores de tumor implicados en la reparación de ADN; las mutaciones en estos genes se une a rigurosamente 10% de cánceres ováricos. Id. en 171-72; Schilder eí al. , supra at 1 85-86. hMSH2 y hMLH1 se con la reparación de desequilibrio de ADN, y se ubican en los cromosomas 2 y 3, respectivamente; esto ha reportado que rigurosamente 3% de carcinomas ováricos hereditarios se deben a mutaciones en estos genes. Véase, supra en 173; Schilder eí al. , supra at 184, 188-89. Los factores reproductivos también se han asociado con un riesgo reducido o aumentado de cáncer ovárico. La menopausia tardía, nulíparo, y monarquía temprana, todas se han unido con un elevado riesgo de cáncer ovárico. Schilder ef al. , supra at 182. Una teoría da como hipótesis que estos factores aumenten el número de ciclos ovulatorios durante el curso de la vida de una mujer, conduciendo a la "ovulación incesante", la cual se cree que es la causa principal de mutaciones para el epitelio ovárico. Id.; Laura J. Havrilesky & Andrew Berchuck, Molecular Alterations in Sporadic Ovarían Cáncer, in Ovarían Cáncer 25 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001 ). Las mutaciones pueden explicarse por el hecho de que la ovulación da como resultado la destrucción y reparación de ese epitelio, necesitando división celular aumentada, aumentando de tal modo la posibilidad de que una mutación no detectada se presentará. Id. El soporte para esta teoría puede encontrarse en el hecho de que el embarazo, lactancia, y el uso de anticonceptivos orales, todos los cuales suprimen la ovulación, confieren un efecto protector con respecto a desarrollar cáncer ovárico. Id. Entre los factores dietéticos/ambientales, podría parecer que existe una asociación entre la toma alta de grasa de animal o carne roja y cáncer ovárico, mientras que el antioxidante vitamina A, el cual previene la libre formación de radicales y también ayuda a mantener la diferenciación celular normal puede ofrecer un efecto protector. Véase, supra at 169. Los reportes también han asociados asbestos y trisilicato magnesio hidroso (talco), el último de los cuales puede presentarse en diafragmas y toallas sanitarias. Id. en 169-70. Los procedimientos de selección actuales para el cáncer ovárico, mientras son de cierta utilidad, son muy limitados en su habilidad de diagnóstico, un problema que es particularmente agudo en etapas tempranas de avance de cáncer cuando la enfermedad es típicamente asintomática todaví aes más fácil de tratar. Walter J. Burdette, Cáncer: Etiology, Diagnosis, v Treatment 166 (1998); Memarzadeh & Berek, supra; Runnebaum & Stickeler, supra; Werness & Eltabbakh, supra. Las pruebas comúnmente utilizadas incluyen evaluación pélvica rectovaginal biannual, radioinmunoensayo para detectar el marcador de tumor de suero CA-125, y ultrasonografía transvaginal. Burdette, supra en 166. La evaluación pélvida ha fallado en producir números adecuados de diagnósticos tempranos, y los otros métodos no son suficientemente exactos. Id. Un estudio reportó que solamente 15% de pacientes quienes padecieron de cáncer ovárico se diagnosticaron con la enfermedad al momento de su evaluación pélvica. Véase, supra en 174. Además, la prueba CA-125 es propensa a dar falsos positivos en las mujeres pre-menopáusicas y se ha reportado que es de bajo valor predictivo en mujeres post-menopáusicas. Id. en 174-75. A pesar de que la ultrasonografía transvaginal ahora es el procedimiento preferido para seleccionar el cáncer ovárico, es incapaz de distinguir confiablemente entre tumores malignos y benignos, y tampocoo puede ubicar las malignidades perifonéales primarias o cáncer ovárico si el tamaño del ovario es normal. Schilder eí al. , supra at 194-95. Mientras que la prueba genética para mutaciones de los genes BRCA1 , BRCA2, hMSH2, y hMLH1 ahora se encuentra disponible, estas pruebas pueden ser demasiado costosas para algunos pacientes y pueden también producir resultados indeterminados o negativos falsos. Schilder ef al., supra at 191-94.
Otros marcadores de interés son HE4 y mesotelina. Véase Urban et al. Ovarían cáncer screening Hematol Oncol Clin North Am. 2003 Aug; 17(4):989-1005; Hellstrom eí al. The HE4 (WFDC2) protein is a biomarker for ovarían carcinoma, Cáncer Res. 2003 Jul 1 ;63(13):3695-700; Ordonez, Application of mesothelin immunostaining in tumor diagnosis, Am J Surg Pathol. 2003 Nov;27(11 ): 1418-28. El avance gradual de cáncer ovárico, el cual se logra a través de la exploración quirúrgica, es crucial en la determinación del curso de tratamiento y manejo de la enfermedad. AJCC Cáncer Staging Handbook 187 (Irvin D. Fleming eí al. eds., 5th ed. 1998); Burdette, supra at 170; Memarzadeh & Berek, supra; Shridhar eí al., supra. El avance gradual se realize para referencia al sistema de clasificación desarrollado por la Federación Internacional de Ginelocogía y Obstreticia. David H. Moore, Primary Surgical Management of Early Epithellal Ovarían Carcinoma, in Ovarían Cáncer 203 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001); Fleming ef al. eds. , supra at 188. El cáncer ovárico etapa I se caracteriza por el crecimiento de tumor que se limita a los ovaries y se comprende de tres sub-etapas. Id. En la sub-etapa IA, el crecimiento de tumor se limita a un ovario, no existe tumor en la superficie externa del ovario, la cápsula ovárica está intacta, y no se presentan células malignas en ascitis o lavados peritoneales. Id. La sub-etapa IB es idéntica a IA, excepto que el crecimiento de tumor se limita a ambos ovarios. Id. La sub-etapa IC se refiere a la presencia de crecimiento de tumor limitado a uno o ambos ovarios, y también incluye una o más de las siguientes características: ruptura de cápsula, crecimiento de tumor en la superficie de uno o ambos ovarios, y células malignas presentes en ascitis o lavados peritoneales. Id. El cáncer ovárico de etapa II se refiere al crecimiento de tumor que incluye uno o ambos ovarios, juno con la extensión pélvica. Id. La sub-etapa HA incluye la extensión y/o implantes en el útero y/o trompas de Falopio, sin células malignas en ascitis o lavados peritoneales, mientras que la sub-etapa IIB incluye la extensión en otros órganos pélvicos y tejidos, nuevamente sin células malignas en ascitis o lavados peritoneales. Id. El cáncer ovárico de sub-etapa lll incluye la extensión pélvica coom en NA o IIB, pero con células malignas en ascitis o lavados peritoneales. Id. El cáncer ovárico de etapa lll incluye crecimiento de tumor en uno o ambos ovarios, con metástasis peritoneal más allá de la pelvis confirmada por microscopio y/o metástasis en los nudos linfáticos regionales. Id. La sub-etapa IIIA se caracteriza por metástasis peritoneal microscópica fuera de la pelvis, con la etapa IIIB incluyendo metástasis peritoneal macroscópica fuera de la pelvis 2 cm. o menos en la dimensión más grande. Id. La sub-etapa 111 es idéntica a la IIIB, excepto que la metástasis es mayor a 2 cm en la dimensión más grande y puede incluir metástasis de nudo linfático regional. Id. Por último, la etapa IV se refiere a la metástasis distante de presencia, excluyendo la metástasis peritoneal. id.
Mientras que el avance gradual quirúrgico es actualmente el punto de referencia para valorar el manejo y tratamiento de cáncer ovárico, este padece de desventajas considerables, incluyendo lo invasivo del procedimiento, el potencial para complicaciones, así como también el potencial para inexactitud. Moore, supra at 206-208, 213. En vista de estas limitaciones, se ha girado atención para desarrollar metodologías de avance gradual alternativas a través del entendimiento de la expresión de gen diferencial en varias etapas de cáncer ovárico y al obtenerse diversos biomarcadores para ayudar a valorar mejor el avance de la enfermedad. Vartainen, J. ef al., Int'l J. Cáncer, 95(5): 313-16 (2001); Shridhar ef al. supra; Baekelandt, M. ef al., J. Clin. Oncol. 18(22): 3775-81. El tratamiento de cáncer ovárico típicamente incluye un ataque de múltiples bifurcaciones, con intervención quirúgica que sirve como la fundación de tratamiento. Dennis S. Chi & William J. Hoskins, Primary Surgical Management of Advanced Epithelial Ovarían Cáncer, Jn Ovarían Cáncer 241 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001). Por ejemplo, en el caso de cáncer ovárico epithelial, que cuenta para aproximadamente 90% de casos de cáncer ovárico, incluyendo histerectomía abdominal total, salpingo-oforectomía bilateral, omentectomía y linfadenectomía, segdo por (2) quimioterapia adyuvante con paclitaxel y ya sea cisplatin o carboplatin. Eltabbakh, G.H. & Awtrey, C.S., Expert Op.
Pharmacother. 2(10): 109-24. A pesar de una tasa de respuesta clínica de 80% a la terapia adyuvante, la mayoría de los pacientes experimentan recurrencia de tumor dentro de tres años de tratamiento. Id. Ciertos pacientes pueden superar una segunda cirugía citoreductiva y/o quimioterapia en segundo grado. Memarzadeh & Berek, supra. De lo precedente, queda claro que los procedimientos utilizados para detectar, diagnosticar, monitorear, avanzar, prognosticar, y prevenir la recurrencia de cáncer ovárico son de importancia crítica para el resultado del paciente. Además, los procedimientos actuales, mientras son útiles en cada uno de estos análisis, se limitan por su especificidad, sensibilidad, invasividad, y/o su costo. Como tales, los procedimientos altamente específicos y sensibles que podrían operar a manera de detección de nuevos marcadores en células, tejidos, o fluidos corporales, con invasividad mínima y un costo razonable, podrían ser altamente deseables. De acuerdo con lo anterir, existe una gran necesidad de métoos más sensibles y exactos para pronosticar si una persona es probable que desarrole cáncer ovárico, para diagnosticar cáncer ovárico, para monitorear el avance de la enfermedad, para graduar el cáncer ovárico, para determinar si el cáncer ovárico se ha metastasizado, y para representar por imágenes el cáncer ovárico. Existe también la necesidad de un mejor tratamiento de cáncer ovárico.
Cáncer Pancreático El cáncer pancreático es la treceava causa más común y octava causa más común de muerte por cáncer a nivel mundial. Donghui Li, Molecular Epidemiology, in Pancreatic Cáncer 3 (Douglas B. Evans eí al. eds., 2002). En los Estados Unidos, el cáncer de páncreas es la cuarta causa más común de cáncer tanto en hombres como en mujeres, contándose para cinco por ciento de muertes por cáncer y casi 30,000 muertes en total. Id. Las tasas de cáncer pancreático son más altas en hombres que en mujeres y más altas en africanoamericanos según se opone a los caucásicos. Id. en 9. El predictor más importante de cáncer pancreático es la edad del paciente, entre los caucásicos, la incidencia relacionada a la edad de cáncer pancreático aumenta continuamente, a pesar de que la categoría entre 85 y más avanzada. Id. en 3. Aproximadamente 80% d ecasos se presentan en el rango de edad de 60 a 80, con aquellos en los 80 experimentando un riesgo de adquirir la enfermedad 40 veces a aquellos en los 40. Id. Además, la Sociedad Americana de Cáncer estima que existirán aproximadamente 31 ,800 nuevos casos de cáncer pancreático en el 2004 y en los Estados Unidos únicamente. El cáncer pancreático presentará aproximadamente 31 ,200 muertes en los Estados Unidos en el mismo año. ACS Website: cáncer con la extensión .org de la red mundial. A pesar de los esfuerzos de los investigadores y médicos en contemplar tratamientos para el cáncer pancreático, permanece casi universalmente fatal. James R. Howe, Molecular Markers as a Tool for the Early Diagnosis of Pancreatic Cáncer, in Pancreatic Cáncer 29 (Douglas B. Evans ef al. eds., 2002).
Aparte de la edad, un número de factores de riesgo de cáncer pancreático, se han identificado, incluyendo el fumar, la dieta, ocupación, ciertas condiciones médicas, herencia, y biología molecular. El fumar es el factor de riesgo más importante para adquirir la enfermedad, con el enlace entre el fumar y el cáncer pancreático estableciédose en numerosos estudios. Li, supra at 3. Las cantidades de riesgo relatives a al menos 1.5, aumentando con el nivel del fumar a una proporción de riesgo externo de 10 veces, id. El siguiente factor más importante podría parecer que es la dietea, con riesgo aumentado asociado con la toma de frutas y vegetales. Id. en 3-4. Así como para ocupaciones particulares, las tasas excesivas de cáncer pancreático se han asociado con los trabajadores en química, exploración de gas y carbono, la industria del metal, estanación de plomo, textiles, mezclado de aluminio, y transporación. id en 4. Un número de condiciones médicas también se han asociado con una incidencia aumentada de cáncer pancreático, incluyendo diabetes, pancreatitis crónica, gastrectomía, y colecistectomía, a pesar de que la relación de causa y efecto entre estas condiciones y cáncer pancreático no se ha establecido. Id. Los factores genéticos hereditarios comprenden menos del 10% de carga del cáncer pancreático, con asociaciones documentadas con pancreatitis hereditaria, así como también mutaciones de línea de germen en genes de síndrome de cáncer familiar tal como hMSH2 y hMLH1 (cáncer de colon de no poliposis hereditario), p 16 (mole-melanoma múltiple atípica familial) y BRCA 1/BRCA2 (cáncer ovárico y de mama). Id. at 3. Mientras que ningún otro órgano tiene una base heredada más alta para cáncer que el páncreas, los investigadores han sido incapaces de señalar el (los) defecto (s) genético (s) particulares que contribuyen a la susceptibilidad de uno a cáncer pancreático. David H. Berger & William E. Fisher, Inherited Pancreatic Cáncer Syndromes, in Pancreatic Cáncer 73 (Douglas B. Evans et al. eds. , 2002). Desde el punto de vista de biología molecular, el investigador ha revelado una asociación entre el cáncer pancreático y un número de mutaciones genéticas, incluyendo la activación del proto-oncógeno K-ras y la inactivación de los genes supresores de tumor p53, p16, y DPC4. Marina E. Jean ef al. , The Molecular Biology of Pancreatic Cáncer, in Pancreatic Cáncer 15 (Douglas B. Evans ef al. eds. , 2002). En un estudio de adenocarcinomas pancreáticos, 83%» poseyó activación K-ras junto con la inactivación de p16 y p53. Id. Las mutaciones se encuentran en 80 a 95% de adenocarcinomas pancreáticos, con genes fip53, p16, y DPC4 siendo los genes de supresor de tumor más frecuentemente retardados en cáncer del páncreas. Howe, supra at 29. Las supresiones homocigosas, hipermetilación, y mutaciones del gen p 16 se han descubierto en 85 a 98% de adenocarcinomas del páncreas. Id. Como podría esperarse por el papel de alteraciones en los genes K-ras, p53, p16, y DPC4, la pérdida de regulación del ciclo celular podría parecer que es clave para la tumorigenesis en el páncreas, y puede explicar por qué este cáncer es demasiado agresivo. Jean, supra at 15. La búsqueda tamién ha revelado un enlace entre este cáncer y la regulación anormal de ciertos factores de crecmiento y receptores de factor de crecimiento, así como también una regulación de metaloproteinasas de aglomerante y reguladores de angiogénesis de tumor. Id. El factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento de fibroblasto, factor-ß de crecimiento de transformación, factor de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de hepatocitos, y factor de crecimiento endotelial vascular pueden jugar varios papeles en cáncer pancreático, a pesar de que tales papeles no se han producido. Id. en 1 8-22. El desarrollo de técnicas de selección para detectar la presencia de cáncer pancreático es particularmente esencial para este cáncer mortal, a medida que la mayoría de los pacientes fallan en presentarse hasta sus tumores pancreáticos obstruyen el ducto biliar o inducen el dolor, en cuyo punto los tumores han invadido los vasos linfáticos y capilares que rodean el páncreas, Howe, supra en 29; desafortunadamente, los pacientes con la forma metastástica de la enfermedad típicamente sobreviven menos de un año después del diagnóstico, Jean ef al. , supra en 15. Mientras la tomografía computarizada (CT) y colangiopancreatografía regrógada endoscópica (ERCP) puede ayudar en el diagnóstico de pacientes sintomáticos, actualmente no es una herramienta para seleccionar los tumores pancreáticos que podrían permitir su descubrimiento temprano, en cuyo punto pueden ser curables. Howe, supra at 29. Los marcadores tales como antígeno carcinoembriónico, y los anticuerpos generados contra las estirpes de célula de cáncer colónico humano (CA 19-9 y CA 195), cáncer ovárico humano (CA 125), y cáncer pancreático humano (SPAN-1 y DUPAN-2) pueden elevarse en el suero de pacientes con cáncer pancreático, pero estos marcadores no son suficientemente confiables para servir como herramientas de selección debido a su falta de especificidad y apariencia después en la enfermedad. Walter J. Burdette, Cáncer: Etiology, Diagnosis, v Treatment 99 (1998); Hasholzner, U. ef al. , Anticancer Res. 19(4A): 2477-80 (1999). Debido a la falta actual de métodos de selección adecuados, los médicos han cambiado en aumento a las técnicas que emplean métodos de biología molecular como los medios más prometedores para diagnóstico temprano de la enfermedad. Howe, supra en 30. En la actualidad, no existe alta sensibilidad, el marcador de alta especificidad permite la detección de cáncer pancreático en individuos asintomáticos, pero varios marcadores biológicos se encuentran bajo investigación. Id. Los esfuerzos considerables se enfocan recientemente en K-ras, con investigadores que buscan técnicas para seleccionar muestras de jugo pancreático, bilis, jugo duodenal, o cepillados ERCP para detectar las mutaciones K-ras. Id. Debido a que la colección de estas muestras es invasivo y no es particularmente útil en la selección de aquellas que son asintomáticas, los investigadores también han cambiado a suero y análisis de cepa brotada para mutaciones K-ras, con el formador siendo el más prometedor, a medida que el último se obstaculiza por la complejidad del material de recurso. Id. en 35-38, 42. Además, debido a que los niveles de suero de la proteína de factor de transcripción p53 puede paralelizar el avance de cáncer, es posible que p53 se estudie como marcador de tumor posible. Id. en 37; Jean et al. , supra at 17. Una vez que el cáncer pancreático se ha diagnosticado, las decisiones de tratamiento se elaboran en referencia a la etapa de avance de cáncer. Un número de técnicas de representación por imágenes se emplean para graduar el cáncer pancreático, con tomografía computadirazada (CT) siendo el método actual de elección, Harmeet Kaur ef al. , Pancreatic Cáncer: Radiologic Staging, in Pancreatic Cáncer 86 (Douglas B. Evans ef al. eds. , 2002); Ishiguchi, T. ef al. , Hepatogastroenterology 48(40): 923-27 (2001 ), en lugar del hecho de que frecuentemente se sobreestima el grado del cáncer, a medida que las metastasas de pequeño volumen frecuentemente van más allá de la resolución de CT, H. J. Kim & K. C. Conlon, Laparascopic Staging, in Pancreatic Cáncer 15 (Douglas B. Evans ef al. eds. , 2002). MRI también puede ser en cierto punto CT suplente en vista de, entre otras cosas, su habilidad para (1 ) contrastar entre diversos tejidos, (2) modificar secuencias de pulso para mejorar la visualización de lesiones y minimizar artefactos, (3) realizar la representación por imágenes mientras que se limita la exposición a un paciente para ionizar la radiación, y (4) visualizar los vasos sin utilizar reactivos de contraste yodados IV. Kaur ef al. , supra at 87. Sin embargo, en la actualidad, MRI no ha demostrado una clara ventaja sobre CT. Kim & Conlon, supra at 1 16. Una variedad de técnicas ultrasónicas también se emplean actualmente en avance gradual, incluyendo ultrasonido transabdominal (TUS), ultrasonido endoscópico (EUS), y ultrasonido intraoperativo (IUS), con EUS siendo uno de los más prometedores. Kaur ef al. , supra at 86; Richard A. Erickson, Endoscopio Diagnosis y Staging: Endoscopio Ultrasound, Endoscopio Retrograde Cholangiopancreatography, in Pancreatic Cáncer 97-106 (Douglas B. Evans ef al. eds. , 2002). Sin embargo, estas técnicas se han limitado cada una por una variedad de factores: TUS se obstaculiza por gas en el tracto gastrointestinal y grasa en el peritoneo, EUS require experiencia considerable en ultrasonografía y endoscopía y puede no encontrarse ampliamente disponible, y IUS puede utilizarse solamente intraoperativamente. Kaur ef al. , supra en 86. A pesar de que en sus etapas nacientes, la búsqueda de marcadores ayudarán en la graduación del cáncer pancreático ha encontrado varias direcciones. Por ejemplo, el investigador ha revelado que dos genes supresores de metástasis, nm23-H1 y KAI1, se expresan diferencialmente dependiendo de la etapa de cáncer pancreático, con su expresión regulándose hacia arriba en etapas tempranas y regulándose hacia abajo en las últimas etapas de la enfermedad. Friess, H. ef al. , J. Clin. Oncol. 19(9): 2422-32 (2001 ). Los investigadores se han enfocado en avance gradual de nudo linfático genético, particularmente la investigación de mutaciones en el proto-oncógeno K-ras, Yamada, T. et al. , Int'l J. Oncol. 16(6): 1 165-71 (2000). De igual forma, la investigación ha identificado que la presencia de secuencias K-ras mutadas en plasma/suero se asocia con el cáncer pancreático en última etapa, a pesar de que la presencia del cáncer pancreático de etapa temprana puede detectarse de esta manera así también. Sorenson, G.D. , Clin. Cáncer Res. 6(6): 2129-37 (2000). Una técnica de avance gradual prometedor que utilize un ensayo de reacción en cadena de transcriptasa-polimerasa inversa multimarcadora ha distinguido exitosamente las etapas de cáncer pancreático al ensayar la sangre y muestras de tejido para la expresión de mARN de los siguientes marcadores de tumor: el gen gonadotropina crónica ß-humano, el gen de receptor de factor de crecimiento de hepatocito c-met, y el gen ß-1 ,4-N-acetil-galactosaminil-transferasa. Bilchik, A. ef al. , Cáncer 88(5): 1037-44 (2000). Un sistema de clasificación comúnmente utilizado para graduar el cáncer pancreático es el sistema TNM contemplado por el Centro de Unión Internacional de Cáncer. AJCC Cáncer Staging Handbook 3 (Irvin D. Fleming ef al. eds. , 5th ed. 1 998). Este sistema se divide en varias etapas, cada una de las cuales evalúa el grado de crecimiento de cáncer con respecto al tumor primario (T), nudos linfáticos regionales (N), y metástasis distante (M). Id. La etapa 0 se caracteriza por carcinoma in situ (Tis), sin metástasis de nudo linfático regional (NO) y metástasis no distante (M0). id en 1 13. Las etapas I y II difieren de la etapa 0 solamente en términos de categoría de tumor: la etapa I incluye un tumor limitado solamente para el páncreas que es ya sea (1 ) de 2 cm o menos en la dimensión más grande (T1 ) o (2) más de 2 cm en la dimensión más grande (T2), mientras que la etapa II incluye un tumor que se extiende directamente hacia el duodeno, ducto biliar, o tejidos peripancreáticos (T3). Id. La etapa lll incluye la categoría de tumor T1 , T2, o T3, metástasis de nudo linfático regional (N1 ), el cual incluye ya sea un nudo linfático único (pN1 a) o múltiples nudos linfáticos (pN1 b); y metástasis no distante (MO). La etapa IVA se caracteriza por la extensión de tumor directamente hacia el estómago, bazo, colon, o vasos grandes adyacentes (T4); y categoría N; y metástasis no distante (MO). Por último, la etapa IVB se caracteriza por cualquier categoría T, cualquier categoría N, y metástasis distante (M1 ).. id. Una vez que el cáncer se ha graduado, el único tratamiento consistentemente eficaz para la enfermedad es la cirugía, y con solamente diez a quince por ciento de pacientes siendo capaces de superar la resección potencialmente curativa. Jean eí al. , supra at 15; Fleming ef al. eds., supra at 111 ; William F. Regine, Postoperative Adjuvant Therapy: Past, Present, y Future Trial Development, in Pancreatic Cáncer 235 (Douglas B. Evans ef al. eds., 2002). Además, la supervivencia de cinco años de aquellos pacientes que superan la resección se encuentra abajo del veinte por ciento. Regine, supra at 235. Mientras que los agentes quimioterapéutico tales como gemcitabine y 5-fluorouracil han mostrado cierta efectividad contra los carcinomas pancreáticos, la realidad es que la quimioterapia ha mostrado poco impacto en la supervivencia de cáncer pancreático. Burdette, supra at 101. La terapia de radiación ha proporcionado resultados conflictivos con respecto a su eficacia, id., a pesar de que la radiación en combinación con 5-fluoroacil ha mostrado cierta promesa. Regine, supra at 235. En vista de la falla de técnicas convencionales en el tratamiento de cáncer pancreático, un número de nuevos procedimientos empleando las técnicas de biología molecular, se han investigado. Se ha realizado una investigación considerable en el área de terapia de gen, incluyendo tecnología anti-sentido, estrategias de activación de profármaco dirigida por gen, y terapias virales oncolíticas. Eugene A. Choi & Francis R. Spitz, Strategies for Gene Therapy, in Pancreatic Cáncer 331 (Douglas B. Evans ef al. eds., 2002); Kasuya, H. eí al. , Hepatogastroenterology 48(40): 957-61 (2001 ). Otros procedimientos recientes se han enfocado en la inhibición de metaloproteinasas de aglomerante, las enzimas que facilitan la metástasis e invasión de células de tumor a través de su degradación de membranas básicas, y su papel en degradación estromal peritumoral y angiogenesis. Alexander S. Rosemurgy, II & Mahmudul Haq, Role of Matrix Metalloproteinase Inhibition in the Treatment of Pancreatic Cáncer, in Pancreatic Cáncer 369 (Douglas B. Evans ef al. eds. , 2002). De lo precedente, queda claro que los procedimientos utilizados para detector, diagnosticar, monitorear, graduar, pronosticar, y prevenir la recurrencia de cáncer pancreático son de importancia crítica para el resultado del paciente. Además, los procedimientos actuales, mientras son útiles en cada uno de estos análisis, se limitan por su especificidad, sensibilidad, invasividad, y/o su costo. Como tales, los procedimientos altamente específicos y sensibles que podrían operar a manera de detección de nuevos marcadores en células, tejidos, o fluidos corporales, con invasividad mínima y un costo razonable, podrían ser altamente deseables.
Cáncer Pulmonar A lo largo de los últimos cien años, la incidencia de cáncer pulmonar ha aumentado, de modo que ahora en varios países, es el cáncer más común. De hecho, el cáncer pulmonar es el segundo tipo de cáncer más prevalerte tanto para hombres como mujeres en los Estados Unidos y es la causa más común de muerte por cáncer en ambos sexos. Las muertes por cáncer pulmonar ha aumentado diez veces tanto en hombres como mujeres desde 1930, principalmente debido a un aumento en el fumar de cigarros, sino también debido a una exposición aumentada a éteres arsénicos, asbestos, cromatos, clorometilo, níquel, hidrocarburos aromáticos policíclicos y otros agentes Véase Scott, Lung Cáncer: A Guide to Diagnosis y Treatment, Addicus Books (2000) y Alberg eí al. , in Kane ef al. (eds.) Biology of Lung Cáncer, pp. 1 1 -52, Marcel Dekker, Inc. (1998). La Sociedad Americana de Cáncer estima que habrá más de 173,550 nuevos casos de cáncer pulmonar en 2004. Adicionalmente, existirá un estimado de 160,440 muertes de cáncer pulmonar en 2004.
ACS Website: cáncer con la extensión .org de la red mundial. El cáncer pulmonar puede darse como resultado un tumor primario que origina en el pulmón o un tumor secundario que se ha esparcido desde otro órgano tal como el intestino o mama. A pesar de que existen más de docenas de tipos de cáncer pulmonar, más de 90% caen en dos categorías: cáncer pulmonar de célula pequeña (SCLC) y cáncer pulmonar de célula no pequeña (NSCLC). Véase Scott, supra. Aproximadamente 20-25% de todos los canceres pulmonares se caracterizan como SCLC, mientras que 70-80% se diagnostican como NSCLC. Id. Un tipo raro de cáncer pulmonar es mesotelioma, el cual se origina generalmente por exposición a asbestos, y que afecta la pleura del pulmón. El cáncer pulmonar usualmente se diagnostica o se selecciona para rayos x de mama, exploraciones CAT, exploraciones PET, o por citología esputo. Un diagnóstico de cáncer pulmonar se confirma usualmente por biopsia del tejido. Id. Los tumores SCLC son altamente metastáticos y crecen rápidamente. Por el momento, un paciente ha sido diagnosticado con SCLC, el cáncer se ha esparcido usualmente ya a otras partes del cuerpo, incluyendo nudos linfáticos, adrenales, hígado, hueso, cerebro, y médula ósea. Véase Scott, supra; Van Houtte ef al. (eds.), Progress v Perspective in the Treatment of Lung Cáncer. Springer-Verlag (1999). Debido a que la enfermedad se ha esparcido usualmente a tal grado que la cirugía no es una opción, el tratamiento actual de elección es la quimioterapia más la irradiación de mama.
Véase Véase Van Houtte, supra. La etapa de la enfermedad es un predictor principal de supervivencia a largo plazo. Menos del 5% de pacientes con enfermedad extensiva que se ha esparcido más allá de un pulmón y que rodea los nudos linfáticos, viven más de dos años. Id. Sin embargo, la probabilidad de la supervivencia de cinco años es tres a cuatro veces mayor si la enfermedad se diagnostica y se trata cuando todavía se encuentra en una etapa limitada, es decir, que no se ha esparcido más allá de un pulmón. Id. NSCLC se divide generalmente en tres tipos: carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma y carcinoma de célula grande. Tanto el cáncer de célula escamosa como adenocarcinoma se desarrollan de las células que marcan las vías respiratorias; sin embargo el adenocarcinoma se desarrolla de las células de globo que produce el moco. El cáncer pulmonar de célula grande se ha nombrado de esta manera debido a que las células buscan grandes y redondas cuando se observan microscópicamente, y generalmente se consideran relativamente no diferenciadas. Véase Yesner, Atlas of Lung Cáncer, Lippincott-Raven (1998). El cáncer pulmonar secundario es un cáncer iniciado en cualquier parte del cuerpo que se ha esparcido hacia los pulmones. Los cánceres que metastizan al pulmón incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, melanoma, cáncer de colon y linfoma de Hodgkin. El tratamiento para el cáncer pulmonar secundario puede depender de la fuente del cáncer original. En otras palabras, un cáncer pulmonar que se originó de cáncer de mama puede ser más responsivo a tratamientos de cáncer de mama y un cáncer pulmonar que se origino del cáncer de colon puede ser más responsivo a los tratamientos de cáncer de colon. La etapa de un cáncer indica qué tanto se ha esparcido y es un indicador importante de ia prognosis. Además, el avance gradual es importante debido a que el tratamiento se decide frecuentemente de acuerdo a la etapa de un cáncer. SCLC se divide en dos etapas: enfermedad limitada, es decir, cáncer que puede solamente puede observarse en un pulmón y en nudos linfáticos cercanos; y enfermedad extensiva, es decir, cáncer que se ha esparcido fuera del pulmón hacia el pecho o a otras partes del cuerpo. Para la mayoría de los pacientes con SCLC, la enfermedad ya ha avanzado a los nudos linfáticos o en cualquier parte en el cuerpo al momento de las exploraciones, es probable que ciertas células cancerígenas puedan haberse esparcido lejos y viajado a través de la corriente sanguínea o sistema linfático. En general, la quimioterapia con o sin radioterapia es frecuentemente el tratamiento preferido. Las exploraciones iniciales y pruebas hechas a la primera se utilizarán posteriormente para ver que también está respondiendo el paciente al tratamiento. En contraste, el cáncer de célula no pequeña puede dividirse en cuatro etapas. La etapa I es cáncer altamente localizado sin cáncer en los nudos linfáticos. El cáncer de etapa II se ha esparcido cerca de cualquier cáncer iniciado. Esto puede ser hacia la pared del pecho, la cubierta del pulmón (pleura), la parte media del pecho (mediastino) u otros nudos linfáticos. El cáncer de etapa IV se ha esparcido a otra parte del cuerpo. El cáncer de etapa l-lll se trata usualmente con cirugía, con o sin quimioterapia. El cáncer de etapa IV se trata usualmente con quimioterapia y/o cuidado curativo. Un número de anormalidades genéticas y cromosómicas se han observado en el cáncer pulmonar. En NSCLC, las aberraciones cromosómicas se han descrito en 3p, 9p, 1 1 p, 15p y 17p, y las supresiones cromosómicas se han observado en los cromosomas 7, 1 1 , 13 y 19. Véase Skarin (ed.), Multimodalitv Treatment of Lung Cáncer, Marcel Dekker, Inc. (2000); Gemmill et al. , pp. 465-502, in Kane, supra; Bailey-Wilson ef al. , pp. 53-98, in Kane, supra. Las anormalidades cromosómicas se han descrito en 1 p, 3p, 5q, 6q, 8q, 13q y 17p en SCLC. Id. Además, la pérdida del brazo corto del cromosoma 3p también se ha observado. Véase mayor 90% de tumores SCLC y aproximadamente 50% de tumores NSCLC. Id. Un número de encógenos y genes supresores de tumor se han implicado en cáncer pulmonar. Véase Mabry, pp. 391-412, in Kane, supra y Sclafani eí al. , pp. 295-316, in Kane, supra. Tanto en SCLC como NSCLC, el gen supresor de tumor p53 se muta en más del 50% de cánceres pulmonares. Véase Yesner, supra. Otro gen supresor de tumor, FHIT, que se encuentra en el cromosoma 3p, se muta por el humo del tabaco. Id.; Skarin, supra. Además, más del 95% de SCLCs y aproximadamente 20-60% de NSCLSs tienen una proteína de retinoblastoma normal o ausente (Rb), otro gen supresor de tumor. El oncógeno ras (particularmente K-ras) se muta en 20-0% de especímenes NSCLC y el oncógeno c-erbB2 se expresa en 18% de la etapa 2 NSCLC y 60% de especímenes NSCLC etapa 4. Véase Van Houtte, supra. Otros genes supresores de tumor que se encuentran en una región de cromosoma 9, específicamente en la región de 9p21 , se suprimen en varias células cancerígenas, incluyendo p'\ QINK4A y p15 ?/ ?s. Véase Bailey-Wilson, supra; Sclafani et al. , supra. estos genes supresores de tumor también pueden implicarse en la patogénesis de cáncer de pulmón. Además, varias células de cáncer pulmoonar producen factores de crecimiento que pueden actuar en una forma paracrina o autocrina en células de cáncer pulmonar. Véase Siegfried eí al. , pp. 317-336, in Kane, supra; Moody, pp. 337-370, in Kane, supra y Heasley ef al. , 371 -390, in Kane, supra. En SCLC, varias células de tumor producen peptide liberador de gastrina (GRP), el cual es un factor de crecimiento proliferativo para estas células. Véase Skarin, supra. Varios tumors NSCLC expresan receptores de factor de crecimiento epidérmico (EGF), permitiendo a las células NSCLC proliferar en respuesta a EGF. El factor de crecimiento tipo insulina (IGF-I) se eleva en más del 95% de SCLC y más de 80% de tumores NSCLC, se cree que funciona como un factor de crecimiento autócrino. Id. Finalmente, el factor de célula germinal (SCF, también conocido como factor de acero o ligante equipo) y c-Kit (un receptor de quinasa tirosina proto-oncoproteína para SCF) ambos se expresan en altos niveles en SCLC, y de esta manera pueden formar un ciclo autócrino que aumenta la proliferación. Id.
A pesar de que la mayoría de los casos de cáncer pulmonar son atribuibles al humo del cigarro, la mayoría de los fumadores no desarrollan cáncer pulmonar. Evidencia epidemológica ha sugerido que la susceptibilidad al cáncer pulmonar puede heredarse en una forma Mendelian, y de esta forma tener un componente genético hereditario. Bailey-Wilson, supra. De esta manera, se cree que ciertas variants alélicas en ciertos sitios genéticos pueden afectar la susceptibilidad al cáncer pulmonar. Id. Una manera de identificar cuáles variantes alélicas son probables de incluirse en la susceptibilidad de cáncer pulmonar, así como también la susceptibilidad a otras enfermedades, es observar a las variantes alélicas de genes que se expresan altamente en el pulmón. El pulmón es susceptible a un número de otras enfermedades debilitantes así también, incluyendo, sin limitación, enfisema, neumonía, fibrosis cística y asma. Véase Stockley (ed.), Molecular Biology of the Lung, Volume I : Emphvsema v Infection. Birkhauser Verlag (1999), hereafter Stockley I, y Stockley (ed.), Molecular Biology of the Lung, Volume I I: Asthma v Cáncer, Birkhauser Verlag (1 999), de allí Stockley l l. La causa de varios de estos desórdenes todavía no se entiende bien y son pocas, si las hubiere, opciones de tratamiento buenas para varios de estos desórdenes de pulmón no cancerosos. De esta manera, permanece la necesidad de entender varios desórdenes de pulmón no cancerosos e identificar los tratamientos para estas enfermedades. El desarrollo y diferenciación de tejido pulmonary durante el desarrollo embriónico también es muy importante. Todas las células epiteliales del tracto respiratorio, incluyendo aquellas del pulmón y bronquio, se derivan de las células endodérmicas primitivas que marcan la bolsa embriónica. Véase Yesner, supra. Durante el desarrollo embriónico, las células germinales endodérmicas multipotentes se diferencian en varios tipos diferentes de células especializadas, que incluyen células ciliadas para mover las partículas inhalad, células de globo para producir moco, células Kulchitsky para función endocrina, y células Clara y neumocitos tipo II para secretar la proteína tensoactiva. Id. El desarrollo inadecuado y diferenciación puede originar los desórdenes y transtornos respiratorios en infants, particularmente en infantes prematuros, cuyos pulmones no pueden producer suficiente agente tensoactivo cuando nacen. Además, algunas células de cáncer pulmonar, particularmente carcinomas de célula pequeña, son plásticas y pueden alterar su fenotipo en un número de tipos de célula, incluyendo carcinoma de célula grande, adenocarcinoma y carcinoma de célula escamosa, id. De esta manera, un mejor entendimiento de desarrollo pulmonar y diferenciación puede ayudar a facilitar el entendimiento de avance e inicio de cáncer pulmonar. Las pruebas de selección más comunes para el cáncer pulmonar son rayos X de pecho y citología esputo. Los ensayos controlados al azar no han demostrado una reducción en la mortalidad de cáncer pulmonar dando como resultado la selección con rayos X de mama y/o citología de esputo. Adicionalmente, la citología esputo no se ha mostrado que sea eficaz cuando se utiliza como un adjunto a los rayos x de pecho anuales. La selección de rayos x de pecho más citología de esputo parece que detectar el cáncer pulmonar en una etapa temprana, pero esto podría esperarse en una prueba de selección si o no fue eficaz al reducir la mortalidad. Ya que la detección temprana por métodos de selección actuales falla en reducir la mortalidad en pacientes con cáncer pulmonar, los métodos de selección de cáncer pulmonar actuales son inadecuados. Existen dos riesgos potenciales importantes asociados con la selección de radiografía de pecho. Primero, los faltos resultados de prueba positivos pueden conducirse a un procedimiento invasivo no necesario, tal como bioposia de aguja percutánea o toracotomía. Estos procedimientos son costosos y debido a su naturaleza invasiva lleva riesgos de su totalidad. El segundo riesgo con la selección de radiografía de pecho es el sobre diagnostico. El sobrediagnóstico es el diagnóstico de un tumor pequeño o crecimiento lento que podría no haber llegado a ser importante clínicamente si no se hubiera detectado por la selección. A pesar de que el sobrediagnóstico es casi imposible de documentar en un individuo viviente, los estudios de autopsia sugieren que varios individuos mueran con cáncer pulmonar en lugar de el. Adicionalmente, el espectro de tipo de cáncer pulmonar ha cambiado durante las dos últimas décadas. Mientras que el tipo más común utilizado por ser cáncer de célula escamosa (usualmente centralmente ubicada), el tipo más común ahora es adenocarcinoma (usualmente periféricamente ubicado). Ei último puede ser más manejable para la detección temprana por rayos X de pecho, las limitaciones de las cuales se describen anteriormente. En contraste, citología de esputo, es más sensible en la detección de cáncer de célula escamosa que en la detección de adenocarcinoma, y por lo tanto, carece de utilidad en la detección de los adenocarcinomas más comunes. Claramente, los nuevos métodos no invasivos y altamente sensibles para detectar el cáncer pulmonar, son necesarios. Existen esfuerzos intensivos para mejorar la selección de cáncer pulmonar con tecnologías más nuevas, incluyendo tomografía computarizada helicoidal de baja dosis (LDCT) y técnicas moleculares. LDCT es más sensible que la radiografía de pecho. En un estudio de selección reciente, CT detectó casi 6 veces tantos cánceres pulmonares etapa I que la radiografía de pecho y la mayoría de estos tumores fueron 1 cm o menos en diámetro. Sin embargo, la efectividad de selección con LDCT no se ha evaluado todavía en un ensayo clínico controlado. Existen dos riesgos potenciales que deben considerarse contra cualquier beneficio potencial de selección con LDCT. El riesgo más común y familiar es el resultado de prueba falsa positivo, que puede conducir a ansiedad y procedimientos de diagnóstico invasivo. Un riego menos familiar es el sobrediagnóstico, el diagnóstico de una condición que podría no llegar a ser clínicamente importante si no se hubiera detectado por selección. En el caso de selección con LDCT, el sobrediagnóstico podría conducir a diagnóstico innecesario de cáncer pulmonar requiriendo cierta combinación de cirugía, por ejemplo, lobectomía, quimioterapia y terapia de radiación. Según se señala anteriormente, el sobrediagnóstico es casi imposible de documentar en un individuo viviente. En un estudio grande, aproximadamente uno de seis de todos los cánceres pulmonares encontrados en autopsia se habían reconocido clínicamente antes de la muerte. Además, la autopsia probablemente falla en detectar varios cánceres pulmonares pequeños que son detectables por CT. Las terapias actuales para el cáncer pulmonar se limitan. Generalmente, las opciones del paciente comprenden cirugía, terapia de radiación, y quimioterapia. Dependiendo del tipo y etapa de un cáncer pulmonar, la cirugía puede utilizarse para remover el tumor junto con el tejido pulmonar circundante. Una lobectomía se refiere a un lóbulo (sección) del pulmón que se remueve. Si el pulmón entero se remueve, la cirugía se llama una neumonectomía. Removiendo solamente parte de un lóbulo se conoce como una segmentectomía o resección acuñada. Si el cáncer se ha esparcido al cerebro, el beneficio puede ganarse de la remoción de las metástasis de cerebro. Esto incluye una craneotomía (cirugía a través de un agujero en el cerebelo). Para la terapia de radiación existen varios métodos. La terapia de radiación de haz externa utiliza la radiación suministrada de fuera del cuerpo que se enfoca en el cáncer. Este tipo de terapia de radiación se utiliza más frecuentemente para tratar un cáncer pulmonar primario o su metástasis a otros órganos. La braquiterapia utiliza una pequeña pastilla de material radioactivo colocado directamente en el tejido cancerosos o en la vía respiratoria enseguida al cáncer. La terapia de radiación algunas veces se utiliza como el tratamiento principal (primario) de cáncer pulmonar, especialmente si la salud en general del paciente es demasiado escasa para superar la cirugía. La braquiterapia también puede utilizarse para ayudar a aminorar el bloqueo de las vías respiratorias por cáncer. Adicionalmente, la terapia de radiación puede utilizarse como un tratamiento post quirúrgico para matar depósitos muy pequeños de cáncer que pueden no observarse o removerse durante la cirugía. La terapia de radiación puede también utilizarse para aminorar (disminuir) los síntomas de cáncer pulmonar tal como el dolor, sangrado, dificultad para tragar, y problemas originados por metástasis cerebral. Para quimioterapia, cispiatin o un fármaco relacionado, carboplatin, son los agentes quimioterapéuticos frecuentemente más utilizados en el tratamiento de NSCLC. Recientes estudios encontraron que la combinación ya sea de estos con fármacos tales como gemcitabine, paclitaxel, docetaxel, etoposide, o vinorelbine parecen ser más eficaces en el tratamiento de NSCLC. Recientemente, la Red Comprensiva Nacional de Cáncer (NCCN; nccn con la extensión .org de la red mundial), una alianza de diecinueve de los centros de cáncer líder a nivel mundia, anuncia una mayor actualización de las Directrices de Práctica Clínica para Cáncer Pulmonar de Célula No Pequeña NCCN. La NCCn se reconoce ampliamente como un estándar para la política clínica en oncología. La terapia recientemente aprobada objetvo, gefitinib (Iressa®, AstraZeneca Pharmaceuticals LP) ahora se recomienda como terapia de tercera línea y como segunda línea solamente si la combinación de platino/docetaxel se utilizó como una terapia de primera línea. Las directrices de Cáncer Pulmonar de Célula No Pequeña (NSCLC) contienen recomendaciones para la administración de quimioterapia a los pacientes con esta enfmedad incluyen criterio de selección de paciente y definición de los agentes y combinaciones de primera-, segunda-, y tercera-línea. Los agentes terapéuticos se especifican como regímenes de dos agentes para la terapia de primera línea, regímenes de dos agentes o agentes únicos para la terapia de segunda línea, y un agente único para la terapia de tercera línea. Los agentes utilizados en la terapia, primera y segunda, son: cisplatin (Platinol®, Bristol-Myers Squibb Company), carboplatin (Paraplatin®, Bristol-Myers Squibb Company), paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Company), docetaxel (Taxotere®, Aventis Pharmaceuticals Inc.), vinorelbine (Navelbine®, GlaxoSmithKIine), gemcitabine (Gemzar®, Eli Lilly y Company), etoposide (Toposar®, Pfizer, Inc. ; VePesid®, Bristol-Myers Squibb Company; Etopophos®, Bristol-Myers Squibb Company), irinotecan (Camptosar®, Pfizer, Inc.), vinblastine (Velban®, Eli Lilly y Company), mitomycin (Mutamycin®, Bristol-Myers Squibb Company), y ifosfamide (Ifex®, Bristol-Myers Squibb Company). Algunas de las combinaciones de quimioterapia usual utilizadas para pacientes con SCLC incluyen: EP (etoposide y cisplatin); ET (etoposide y carboplatin); ICE (ifosfamide, carboplatin, y etoposide); y CAV (cyclophosphamide, doxorubicin, y vincristine). Nuevos fármacos tales como gemcitabine, paclitaxel, vinorelbine, topotecan, y teniposide han mostrado resultados prometedores en algunos estudios SCLC. Los factores de crecimiento pueden darse junto con agentes quimioterapéuticos si la salud del paciente es buena. La administración de los factores de crecimiento ayudan a prevenir los efectos secundarios de la médula ósea. Los ensayos terapéuticos recientemente completados o en funcionamiento para varios compuestos a fin de tratar el cáncer pulmonar incluyen alitretinoin (Panretin®, Ligand Pharmaceuticals), topotecan HCl (Hycamtin® GlaxoSmithKIine), liposomal ether lipid (Elan Pharmaceutical), cantuzumab mertansine (ImmunoGen), Gavax® (Cell Genesys), vincristine (Onco TCS ®, Inex Pharmaceuticals), Neovastat® (AEterna Laboratories), squalamine (Genaera), mirostipen (Human Genome Sciences Inc.), Advexin® (Introgen Therapeutics), biricodar dicitrate (Incel®, Vértex Pharmaceuticals), flavopiridol (Aventis), Affintac® (Eli Lilly y Company), pivaloyloxymethylbutyrate (Pivanex®, Titán Pharmaceuticals), tirapazamine (Tirazone®, Sanofi-Synthelabo Pharmaceuticals), irinotecan (Camptosar®, Pharmacia), tezacitabine (Chiron), cisplatin/vinblastine/amifostine (Medlmmune), paclitaxel/carboplatin/amifostine (Medlmmune), Oncomyc-NG® (AVI BioPharma), exisulind/vinorelbine (Aptosyn®/Navelbine®, Cell Pathyways), tariquidar (QLT), Xyotax® (Celi Therapeutics), PEG-camptothecin (Prothecan®, Enzon), decitabine (SuperGen), Tarceva® (OSI Pharmaceuticals), ABX-EGF (Abgenix), Tocosol Paclitaxel® (Sonus Pharmaceuticals), TheraFab® (Antisoma), minodronate (Yamanouchí Pharmaceutical), exisulind/docetaxel/carboplatin (Aptosyn®/Taxotere®/Paraplatin®, Cell Pathways), exisulind/gemcitabine HCl (Aptosyn®/Gemzar®, Cell Pathways), IMC-C225/carboplatin/paclitaxel (Erbitux®/carboplatin®/pacIitaxel®, ImClone Systems), y vinorelbine (Navelbine®, GlaxoSmíthKIine). Según se indica anteriormente, varios terapéuticos se recomiendan para utilizarse en combinación como una terapia de primera línea o solamente si otros terapéuticos han fallado como agentes de segunda y tercera línea. Mientras que existen varios compuestos en los ensayos terapéuticos recientemente completados o en funcionamiento, existe la gran necesidad de compuestos terapéuticos adicionales capaces de tratar el cáncer pulmonar metastatizado, avanzado o de etapa temprana. De acuerdo con lo anterior, existe una gran necesidad de métodos más sensibles y exactos para pronosticar si una persona es probable que desarrolle cáncer pulmonar, para diagnosticar el cáncer pulmonar, para monitorear el avance de la enfermedad, para graduar el cáncer pulmonar, para determinar si el cáncer pulmonar se ha metastatizado y para representar por imágenes el cáncer pulmonar. Existe también la necesidad de mejor tratamiento de cáncer pulmonar. Además, existe una gran necesidad de diagnosticar y tratar los desórdenes de pulmón no cancerosos tales como enfisema, neumonía, infección pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis cística y asma. Existe también la necesidad de composiciones y métodos para utilizar estas composiciones a fin de identificar el tejido de pulmón para propósitos de forense y para determinar si una célula particular o tejido muestra las características específicas de pulmón. Según se discute anteriormente, cada uno de los métodos para diagnosticar y graduar el cáncer pulmonar, pancreático ovárico y de mama se limita por la tecnología empleada. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de marcadores y reactivos celulares y moleculares sensibles para la detección de cáncer pulmonar, ovárico, pancreático y de mama incluyendo cáncer metastático. Existe la necesidad de marcadores y reactivos moleculares para la graduación exacta, incluyendo graduación clínica y patológica de cánceres pulmonares, de mama, ovárico y pancreático para optimizar los métodos de tratamiento. Finalmente, existe la necesidad de marcadores y reactivos celulares y moleculares sensibles para monitorear el avance de tratamientos de cáncer, incluyendo marcadores que pueden detectar la recurrencia de cánceres de mama, ovárico, pancreático y pulmonar siguiente la remisión. La presente invención proporciona reactivos y métodos alternativos para tratar el cáncer pulmonar, de mama, ovárico, y pancreático que superan las limitaciones de métodos terapéuticos convencionales así como también ofrecen ventajas adicionales que serán aparentes de la descripción detallada de abajo.
Angiogénesis en Cáncer El crecimiento y la metástasis de tumores sólidos también dependen de la angiogénesis. Foikman, J. , 1986, Cáncer Research, 46, 467-473; Folkman, J. , 1989, Journal of the National Cáncer Institute, 82, 4-6. Se ha mostrado, por ejemplo, que los tumors que alargan a más de 2 mm deben obtener su propio suministro sanguíneo y al hacerlo así al inducir el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares. Una vez que estos nuevos vasos sanguíneos llegan a incluirse en ei tumor, proporcionan un medio para las células tumorales a fin de que ingresen la circulación y metasticen a sitios distantes tales como el hígado, pulmón o hueso. Weidner, N. , et al. , 1991 , The New England Journal of Medicine, 324(1 ), 1 -8. Angiogénesis, definida como el crecimiento o brote de nuevos vasos sanguíneos de vasos existentes, es un proceso complejo que principalmente ocurre durante el desarrollo embriónico. El proceso es distinto de vasculogénesis, porque las nuevas células endoteliales que marcan el vaso se originan de la proliferación de células existentes, en lugar de diferenciarse de las células germinales. El proceso es invasivo y depende de la proteólisis dei aglomerante extracelular (ECM), migración de nuevas células endoteliales, y síntesis de nuevo desarrollo del sistema circulatorio, sin embargo, en humanos adultos, la angiogénesis puede solamente ocurrir como una respuesta a una condición patológica (excepto durante el ciclo reproductivo en mujeres). Bajo condiciones fisiológicas normales en adultos, la angiogenesis tiene Ilugar solamente en situaciones muy restringidas, tales como el crecimiento del cabello y cicatrización de heridas. Auerbach, W. y Auerbach, R., 1994, Pharmacol Ther. 63(3):265-3 11 ; Ribatti ef al., 1991 , Haematologica 76(4):3 11 -20; Risau, 1997, Nature 386(6626):67 1 -4. La angiogenesis avanza por un estímulo que da como resultado la formación de una columna migratoria de células endoteliales. La actividad proteolítica se enfoca en avanzar la punta de este "brote vascular", que rompe el ECM lo suficiente para permitir que la columna de las células se infiltre y migre. Además de la parte frontal en movimiento, las células endoteliales se diferencian y comienzan a adherirse entre sí, formando de esta manera una nueva membrana básica. Las células cesan así la proliferación y finalmente definen un lumen para la nueva arteria o capilar. La angiogénesis no regulada se ha reconocido gradualmente que es responsable de un amplio rango de desórdenes, incluyendo, pero no limitándose a, cáncer, enfermedad cardiovascular, artritis reumatoide, psoriasis y retinopatía diabética. Folkman, 1995, Nat Med 1 (1 ):27-31 ; Isner, 1999, Circulation 99(13): 1653-5; Koch, 1998, Arthritis Rheum 41 (6):951 -62; Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 38(2): 103-12; Ware y Simons, 1997, Nat Med 3(2): 158-64.
De particular interés es la observación de que la angiogenesis se requiere por tumores sólidos para su crecimiento y metástasis. Folkman, 1986 supra; Folkman 1990, J Nati. Cáncer Inst. , 82(1) 4-6; Folkman, 1992, Semin Cáncer Biol 3(2):65-71 ; Zetter, 1998, Annu Rev Med 49:407-24. Un tumor usualmente ocmienza como una célula aberrante única que puede proliferar solamente a un tamaño de pocos milímetros cúbicos debido a la distancia de las perlas capilares disponibles, y puede permanecer "dormido" sin crecer más y la diseminación por un largo período de tiempo. Algunas células tumorales cambian así al fenotipo angiogénico para activar las células endoteliales, las cuales proliferan y maduran en nuevos vasos sanguíneos capilares. Estos vasos sanguíneos recientemente formados no solamente permiten el crecimiento continúo del tumor principal, sino también la diseminación y recolonización de células de tumor metastático. Los mecanismos precisos que controlan el cambio angiogénico no se entiende bien, pero se cree que la neovascularización de masa tumora da como rsultado el balance neto de una multitud de estimuladores e inhibidores de angiogénesis Folkman, 1995, supra. Uno de los inhibidores de angiogenesis más potente es endostatin identificada por O'Reilly y Folkman. O'Reilly ef al. , 1997, Cell 88(2):277-85; O'Reilly et al. , 1994, Cell 79(2):3 15-28. Su descubrimiento se baso en el fenómeno de que ciertos tumores primarios pueden inhibir el crecimiento de las metástasis distantes. O'Reilly y Folkman dieron la hipótesis de que un tumor primario inicia la angiogenesis al generar estimuladores angiogénicos en exceso de inhibidores. Sin embargo, los inhibidores angiogénicos, por virtud de su vida media más duradera en la circulación, alcanzan el sitio d eun tumor secundario en exceso de los estimuladores. El resultado neto es el crecimiento de tumor primario y la inhibición de tumor secundario. Endostatin es una de una lista de tales inhibidores de angiogenesis producidos por los tumores primarios. Es un fragmento proteolítico de una proteína más grande: endostatin es un fragmento 20 kDa de colágeno XVIII (aminoácido H1 132-K1315 en colágeno murino XVI I I). Se mostrado que la endostatin inhibe específicamente la proliferación de célula endotelial in vivo y bloquea la angiogenesis en vivo. De manera más importante, la administración de endostatin a los ratones que llevan tumor conduce al avance de tumor importante, y se ha observado la no toxicidad o resistencia al fármaco aún después de los múltiples ciclos de tratamiento. Boehm ef al. , 1997, Nature 390(6658):404-407. El hecho de que la endostatina tiene como objetivo las células endoteliales genéticamente estables e inhibe una variedad de tumores sólidos la hace un candidato muy atractivo para la terapia anticáncer. Fidler y Ellis, 1994, Cell 79(2): 185-8; Gastl et al. , 1997, Oncology 54(3): 177-84; Hinsbergh eí al. , 1999, Ann Oncol 10 Suppl 4:60-3. Además, los inhibidores de angiogenesis se ha mostrado que son más eficaces cuando se combinan con radiación y agentes quimioterapéuticos. Klement, 2000, J. Clin Invest, 105(8) R15-24. Browder, 2000, Cáncer Res. 6-(7) 1878-86, Arap eí al. , 1998, Science 279(5349):377-80; Mauceri eí al. , 1998, Nature 394(6690):287-91 . La presente invención proporciona métodos alternatios para tratar el cáncer pulmonar, de mama, ovárico, y pancreático que superen las limitaciones de métodos convencionales así como también ofrezcan ventajas adicionales que serán aparentes de la descripción detallada de abajo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se dirige a un anticuerpo Pro104 aislado que se une a Pro104 en una célula de mamífero in vivo. La invención se dirige además a un anticuerpo Pro104 aislado que se interna en la unión a Pro104 en una célula de mamífero in vivo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Alternativamente, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo humanizado o quimérico. El anticuerpo monoclonal puede producirse por un hibridoma seleccionado del grupo de hibridomas depositado bajo el número de acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. El anticuerpo puede competir por la unión al mismo epítopo como el epítopo unido por el anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo de hibridomas depositado bajo el número de acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. La invención también se dirige a anticuerpos conjugados. Pueden conjugarse para un agente inhibidor de crecimiento o un agente citotóxico. El agente citotóxico puede seleccionarse del grup que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas y toxinas. Los ejemplos de toxinas incluyen, pero no se limitan a, maytansin, maytansinoids, saporin, gelonin, ricin or caliqueamicin. La célula de mamífero puede ser una célula cancerígena. Preferentemente, el anticuerpo monoclonal anti-Pro104 inhibe el crecimiento de células cancerígenas que expresan Pro104 in vivo. El anticuerpo puede producirse en bacterias. Alternativamente, el anticuerpo puede ser una forma humanizada de un anticuerpo anti-Pro104 producido por un hibridoma seleccionado del grupo de hibridomas que tiene número de acceso ATCC PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. Preferentemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, ovárico, pancreático y pulmonar. La invención también se dirige a un método para producir los anticuerpos que comprenden cultivar una célula adecuada y recuperar el anticuerpo del cultivo celular. La invención también se dirige a composiciones que comprenden los anticuerpos y un vehículo. El anticuerpo puede conjugarse en un agente citotóxico. El agente citotóxico puede ser un isótopo radioactivo u otro agente quimioterapéutico. La invención también se dirige a un método para matar una célula cancerígena que expresa Pro1 04, comprendiendo contactar la célula cancerígena con los anticuerpos de esta invención, matando de tal modo la célula cancerígena. La célula cancerígena puede seleccionarse del grupo que consiste de células de cáncer de mama, ovárico, pancreático y pulmonar. El cáncer ovárico puede ser adenocarcinoma ceroso ovárico. El cáncer de mama puede ser carcinoma ductal que infiltra la mama. El cáncer de mama, ovárico, pancreático y pulmonar también puede ser metastático. La invención también se dirige a un método para aminorar un cáncer que expresa Pro104 en un mamífero, comprendiendo administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos a un mamífero. Además, la invención se dirige a un artículo de elaboración que comprende un contenedor y una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un anticuerpo según se describe en la presente. El artículo de elaboración también puede comprender un componente adicional, por ejemplo, un inserto de envase indicando que la composición puede utilizarse para tratar el cáncer ovárico o pancreático.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1 muestra que Pro104. D1 16.1 MAb se une a células 293F transitoriamente transfectadas con Pro104.
FIGURA 2 muestra que Pro104. D1 18.1 MAb se une a células 293F transitoriamente transfectadas con Pro104. FIGURA 3 muestra que Pro104.C1 9.1 se une a células cancerígenas HeLa vivas que expresan Pro104. FIGURA 4 muestra que Cy3-Pro104.C25.1 se une a células cancerígenas HeLa vivas que expresan Pro104. FIGURA 5 muestra que Cy3-Pro104.C25.1 se une a y se interna en células cancerígenas HeLa vivas que expresan Pro104. FIGURA 6 muestra que Cy3-Pro104.C19.1 se une a y se interna en células cancerígenas pancreáticas que expresan Pro104. FIGURA 7 muestra que Cy3-Pro104.C55.1 se une a y se interna en células cancerígenas pancreáticas que expresan Pro104. FIGURA 8 muestra que Pro1 04.C25.1 se une a Pro104 en células cancerígenas en tumores ováricos. FIGURA 9 muestra que Pro104.C25.1 se une a Pro104 en la membrana celular de células cancerígenas ováricas. FIGURA 10 muestra que Pro1 04.D9 se une a Pro104 en la membrana celular de células cancerígenas ováricas. FIGURA 1 1 muestra que Pro104. D133 se une a Pro104 en la membrana celular de células cancerígenas ovárica cerosas. FIGURA 12 muestra que Pro104.C25.1 se une a Pro104 en células cancerígenas en tumores pancreáticos. FIGURA 13 muestra controles que demuestran la especificidad de inmunomarcado Pro1 04 MAb . FIGURA 14 muestra un mapa epítopo de Pro104 MAbs.
FIGURA 15 muestra un western blot que muestra la detección de proteína Pro104 en mARN+estirpes de célula y tejido de tumor ovárico (T) pero no tejido adyacente normal (N). FIGURA 16 muestra que la sobreexpresión de Pro104 conduce a fosforilación de Receptor EGF FIGURA 17 muestra que la proteína Pro104 se glicosilata y se une por GPI . FIGURA 18 muestra la biotinilación de superficie de Pro104 nativo en estirpes de célula. FIGURA 19 muestra la sobreexpresión mediada retroviral de proteína Pro104 en células RK3E. FIGURA 20 muestra la sobreexpresión mediada retroviral de proteína Pro104 en células SKOV3. FIGURA 21 muestra siARN media la regulación específica de ia proteína Pro104 en células HeLa. FIGURA 22 muestra siARN media la regulación hacia debajo de la proteína Pro10 en células CaOV3. FIGURA 23 muestra Pro 104 siARN rupture específica de Pro104 mARN en células CaOV3. FIGURA 24 muestra Pro104 siARN rupture específica de Pro1 04 mARN en células HeLa. FIGURA 25 muestra Pro104 siARN ruptura específica de Pro104 mARN en células HeLa, en comparación a un control positive. FIGURA 26 muestra diferentes Pro104 siARNs que inducen la rupture mARN específica y apoptosis en células HeLa.
FIGURA 27 muestra ruptura específica de Pro104 mARN en células HeLa que inducen la muerte celular. FIGURA 28 muestra la rupture específica mARN Pro104 siARN que induce la apoptosis en células HeLa. FIGURA 29 muestra ruptura específica de Pro104 mARN en células CaOV3 induciendo la apoptosis. FIGURA 30 muestra Pro104 siARN que no tiene efecto en apoptosis en células sin Pro104 mARN. FIGURA 31 muestra la sobreexpresión de Pro104 que induce el crecimiento celular en ágar suave. FIGURA 32 muestra la actividad de protease de Pro104 se require para crecimiento celular. FIGURA 33 muestra la rupture de Pro104 mARN por siARN que inhibe el crecimiento de células HeLa cells en ágar suave. FIGURA 34 muestra la ruptura de Pro104 mARN por siARN que inhibe el crecimiento de células HeLa en ágar suave. FIGURA 35 muestra el crecimiento aumentado de células de tumor humanas que sobreexpresan Pro104.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones y Técnicas Generales "Pro104" humano según se utiliza en la presente, se refiere a una proteína de 314 aminoácidos que se expresa en la superficie celular como una glicoproteína. Las secuencias de nucleótido y aminoácido de Pro104 se han descrito, por ejemplo, WO200016805-A1 PA (DIAD-) gen específico de cáncer humano DIADEXUS, Pro104; WO9836054-A1 PA (AMRA-) AMRAD secuencia deNucleótido de isoforma corta de HELA2; y J. D. Hooper ef al. Testisin, una nueva protease serina human expresada por células de germen testicular premeiótico y pérdida en tumores de célula germinal testicular. Cáncer Research 59:3199-3205 (1999)). Pro104 también se hadescrito en la base de datos REFSEQ como: NM_006799.2 (Gl: 21614534) proteasa homosapientes, serina, 21 (testisin) (PRSS21), variante de transcripción 1 , mARN. RefSeq da el siguiente resumen de PRSS21 (Pro104): Este gen codifca una protease de serina alargada por superficie celular, que es un miembro de la familia tripsina de proteasas de serina. Se predice que es activa en enlaces de péptido incluyendo el grupo carboxilo de lisina o arginina. La proteína se localiza en el citoplasma y la membrana de plasma de células germinales testiculares premeyóticas y puede incluirse en avance de tumores testiculares de origen de célula germinal. La división alternativa de este gen da como resultado las tres variantes de transcripción que codifican tres diferentes isoformas. Los aminoácidos de Pro104 se ubican presuntamente en la superficie celular. Pro104 según se utiliza en la presente incluyen variantes alélicas y mutantes de sustitución conservadora de la proteína qu tienen actividad biológica Pro104. Adicionalmente, las variantes de división pueden tener actividad biológica Pro104. Los accesos RefSeq para las variantes de división referidas anteriormente incluyen: NM_144956.1 (Gl: 21614530) Proteasa homo sapiens, serina, 21 (testisin) (PRSS21 ), variante de transcripción 2, mARN; y NM_144957 (Gl: 21614532) Proteasa homo sapiens, serina, 21 (testisin) (PRSS21 ), variante de transcripción 3, mARN. Nuestros descubrimientos de que Pro104 se asocia aparentemente con los cánceres de mama, ováricos, pancreáticos y pulmonares, más agresivos ,hace este antígeno de superficie celular un objetivo atractivo para inmunoterapia de estos y posiblemente otros tipos tumorales. El térmno "anticuerpo" (Ab) según se utilize en la presente incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos bi-específicos), y fragmentos de anticuerpo, mientras que muestran la actividad biológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se utiliza intercambiablemente con "anticuerpo" en el mismo. Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. Preferentemente, el anticuerpo se purificará (1 ) a más del 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método Lowry, y más preferentemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de N-terminal o secuencia de aminoácido interna por uso de una secuenciador de copa giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul coomasie, o preferentemente, tinte plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo en sitio dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se presentará. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará al menos por una etapa de purificación. La unidad de anticuerpo de cadena 4 básica es una glicoprotéina heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H) (un anticuerpo IgM consiste de 5 de las unidades de heterotetrámero básico junto con un polipéptido adicional llamado cadena J , y por lo tanto contiene 10 sitios de unión de antígeno, mientras que se secretan anticuerpos IgA pueden polimerizarse para formar ensambes polivalentes comprendiendo 2-5 de las unidades de cadena 4 básicas junto con cadena J). En el caso de IgGs, la unidad de cadena 4 es generalmente aproximadamente 150,000 daltonas. Cada cadena L se une a una cadena H por un enlace de disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se unen entre sí por uno o más enlaces de disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes de disulfuro entre cadenas regularmente separados. Cada cadena H tiene en la N-terminal, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas a, d y ? y cuatro dominios CH para isotipos µ y e. Cada cadena L tiene en la N-terminal, un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante (CL) en su otro extremo. El VL se alinea con el VH y el CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CHI). Los residuos de aminoácido particulares se cree que forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y la cadena pesada. El emparejado de un VH y VL junto forma un sitio de antígeno único. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic y Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I . Teff y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 y Chapter 6. La cadena L de cualquier especie de vertebrados puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, basados en las secuencias de aminoácido de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, que tienen cadenas pesadas designadas, a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las clases ? y a se dividen además en sub-clases en la base de diferencias relativamente menores en secuencia Ch y función, por ejemplo, humanos expresan las siguientes subclases: lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgAI, y lgA2. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la unión de antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye ocasionalmente a través del giro 1 -10 aminoácidos de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten de tensiones relativamente invariantes llamadas regiones de estructura (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema llamada "regiones hipervariable" que son cada una de 9-12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas nativas cada una comprenden cuatro FRs, adoptando mayormente una configuración P-Iámina, conectada por tres regiones hipervariables, que forma ciclos de conexión, y en algunos casos formando parte de la estructura de P-lámina. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por los FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a laf ormación del sitio de unión de antígeno de anticuerpos (véase Kabat eí al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )). Los dominios constantes no se incluyen directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). El término "región hipervariabe" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión de antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, aproximadamente alrededor de residuos 24-34 (Ll), 5056 (L2) y 89-97 (L3) en el VL, y aproximadamente alrededor de 1 -35 (Hl), 50-65 (H2) y 95-102 (113) en el VH; Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )) y/o aquellos residuos de un "ciclo hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91 -96 (U) en el VL, y 26-32 (Hl), 53-55 (1 -12) y 96-101 (H3) en el VH; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987)). El término "anticuerpo monoclonal" según se utilize en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las mutaciones que posiblemente se presentan naturalmente que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamante específicos, dirigiéndose contra un sitio antigénico único. Además, en contraste a preparaciones de anticuerpo policlonal que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra las determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una determinante única en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse no contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no se interpretará como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse por la metodología de hidridoma descrita primero por Kohler ef al. , Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse utilizando los métodos de ADN recombinante en células bacterianas, animales eucarióticas o de planta (véase, por ejemplo, or may be made using recombinant DNA methods in bacterial, eukaryotic animal or plant cells (véase, e.g., Patente de EE.UU. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson ef al. , Nature, 352:624-628 (1991 ) y Marks ef al. , J. Mol. Biol. , 222:581 -597 (1 991 ), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o sub-clase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la (s) cadena (s) es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o sub-clase de anticuerpo, así como también fragmntos de tales anticuerpos, mientras que muestren la actividad biológica deseada (véase Patente de EE.UU. No. 4,816,567; y Morrison ef al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851 -6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "cebadores" que comprenden secuencias de unión de antígeno de dominio variable derivadas de un primate de no humano (por ejemplo, Oíd World Monkey, Ape etc), y secuecias de región de constante humana. Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión de antígeno así como también CL y al menos dominios constantes de cadena pesada, CHI, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variante de secuencia de aminoácido del mismo. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene uno o más funciones efectoras. Un "fragmento de anticuerpo" comprende una parte de un anticuerpo inacto, preferentemente la unión de antígeno o región variable de un anticuerpo intacto, preferentemente la unión de antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales (véase US patent 5,641 ,870, Ejemplo 2; Zapata eí al. , Protein Eng. 8(10): 1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única, y anticuerpos múltiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. La digestión de papaina de anticuerpos produce dos fragmentos de unión de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fe" residual, una designación que refleja la habilidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste de una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH), y el primer dominio constante de una cadena pesada (CHI). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión de antígeno, es decir, tiene un sitio de unión de antígeno único. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un fragmento F(ab')2 grande único que corresponde rigurosamente a dos fragmentos de Fab unidos de disulfuro que tienen actividad de antígeno-unión divalente y todavía es capaz de degradar el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab al tener pocos residuos adicionales en la terminal carboxi del dominio CHI incluyendo uno o más cisternas de la región obstaculizada de anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de 8 fragmentos Fab' que tienen cisteínas obstaculizadas entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo, también se conocen. El fragmento Fe comprende las partes de terminal carboxi de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fe, cuya región también es parte reconocida por receptores Fe (FcR) encontrados en ciertos tipos de célula. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero de un dominio de región variable de cadena ligera y una pesada en asociación no covalente, estrecha.
Del pliegue de estos dos dominios emanan seis ciclos hipervariables (3 ciclos cada uno de la cadena H y L) que contribuyen los residuos de aminoácido para la unión de antígeno y confieren la especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable único (o la mitadad de un Fv que comprenden solamente tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y unir el antígeno, a pesar de una afinidad inferior al sitio de unión completo. "Fv de cadena única" también abreviados como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una cadena de poiipéptido única. Preferentemente, el polipéptido sFv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluekthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg y Moore eds. , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra. El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo preparados al construir los fragmentos sFv (véase párrafo precedente) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL de tal forma que el emparejado entre cadena pero no intra-cadena de los dominios V se logra, dando como resultado un fragmento divalente, es decir, fragmento que tiene dos sitios de uniónd e antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "cruzados" en los cuales los dominios VH y VL de los dos anticuerpos se presentan en diferentes cadenas de polipéptido. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/1 1 161 ; y Hollinger ef al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Un polipéptido de "secuencia native" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácido como un polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) derivado de lo natural. Tales polipéptidos de secuencia nativa pueden aislarse de lo natural o pueden producirse por medios sintéticos o recombinantes. De esta manera, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácido de un polipéptido humano que se presenta naturalmente, polipéptido murino, o polipéptido de cualquier otra especie de mamífero. El término "variante de secuencia de aminoácido" se refiere a un polipéptido que tiene secuencias de aminoácido que difieren a cierto grado de un polipéptido de secuencia nativa. Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoácido de Pro104 poseerán al menos aproximadamente 70% de homología con la secuencia nativa Pro1 04, preferentemente, al menos aproximadamente 80%, más preferentemente al menos aproximamaente 85%, aún más preferentemente al menos aproximadamente 90% de homología, y más preferentemente al menos 95%. Las variantes de secuencia de aminoácido pueden poseer sustituciones, supresiones, y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácido de la secuencia de aminoácido nativa.
La frase "fragmento funcional o análogo" de un anticuerpo es un compuesto que tiene actividad biológica cualitativaen común con un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento funcional o análogo de un anticuerpo anti-IgE es uno que puede unirse a una inmunoglobulina IgE de tal manera a fin de prevenir o sustancialment reducid la habilidad de tal molécula de tener la habilidad de unirse al receptor de alta afinidad, FceRI. "Homología" se define como el porcentaje de residuos en la variante de secuencia de aminoácido que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir aberturas, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología. Los métodos y programas de computadora para la alineación, se conocen bien en la materia. La similitud de secuencia puede medirse por cualquier algoritmo de análisis de secuencia común, tal como GAP o BESTFIT u otra alineación de variación Smith-Waterman. Véase, T. F. Smith y M. S. Waterman, J. Mol. Biol. 147: 195-1 97 (1981 ) y W.R. Pearson, Genomics 1 1 :635-650 (1991 ). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en los cuales los residuos de una región hipervariable del recipiente se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano que tiene el anticuerpo deseado, especificidad, afinidad, y capacidad. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de la inmoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo o al menos, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los ciclos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y cualquiera o sustancialmente todos los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones ef al. , Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann ef al. , Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Según se utilize en la presente, un anticuerpo anti-Pro104 que "interna" es uno que se toma por (es decir, ingresa) la célula en la unión de Pro104 en una célula de mamífero (es decir, superficie celular Pro104). El anticuerpo de internado por supuesto incluirá fragmentos de anticuerpo, anticuerpo humano o humanizado, y conjugado de anticuerpo. Para aplicaciones terapéuticas, la internalización in vivo se contempla. El número de moléculas de anticuerpo internas será suficiente o adecuado para eliminar una célula que expresa Pro104, especialmente una célula cancerígena que expresa Pro104. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la toma de una molécula de anticuerpo único en la célula es suficiente para eliminar la célula objetivo a la cual se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son altamente potentes en eliminar de tal forma la internalización de una molécula de la toxina conjugada para el anticuerpo es suficiente para eliminar la célula tumoral. Si un anticuerpo anti-Pro104 se interna en la unión de Pro104 en una célula de mamífero puede determinarse por varios ensayos incluyendo aquellos descritos en los ejemplos experimentales de abajo. Por ejemplo, para probar la internalización in vivo, el anticuerpo de prueba se marca y se introduce en un animal conocido por tener Pro104 expresado en la superficie de ciertas células. El anticuerpo puede radiomarcarse o etiquetarse con partículas de oro o fluorescentes, por ejemplo. Los animales adecuados para este ensayo incluyen un mamífero tal como un ratón de nudo NCR que contiene un xenoinjerto o transplante de tumor que expresa Pro104 humano, o un ratón en el cual las células transfectadas con Pro104 humano se han introducido, o un ratón transgénico que expresa el transgen de Pro104 humano. Los controles adecuados incluyen animales que no recibieron el anticuerpo de prueba o que recibieron un anticuerpo no relacionado, y los animales que recibieron un anticuerpo para otro antígeno en las células de interés, cuyo anticuerpo se conocer por internarse en la unión al antígeno. El anticuerpo puede administrarse al animal, por ejemplo, por inyección intravenosa. En los intervalos de tiempo adecuados, las secciones de tejido del animal pueden prepararse utilizando métodos conocidos o según se decribe en los ejemplos experimentales de abajo, y analizarse por microscopía de luz o microscopía electrónica, para internalización así como también la ubicación del anticuerpo internalizado en la célula. Para internalización in vivo, las células pueden incubarse en platos de cultivo de tejido en la presencia o ausencia de los anticuerpos relevantes agregados al medio de cultivo y procesados de análisis microscópico en puntos de tiempo deseados. La presencia de un anticuerpo marcado, internalizado en las células puede dirigirse visualmente por microscopía o por autoradiografía si se utiliza el anticuerpo radiomarcado. Alternativamente, en un ensayo bioquímico cuantitativo, una población de células que comprende células que expresan Pro104 (si se contactan in Vitro o in vivo, las células se aislan así después de una cantidad adecuada de tiempo) se tratan con una proteasa o se somenten a un lavado ácido para remover el anticuerpo no internalizado en ia superficie celular. Las células se trituran y la cantidad de proteasa resistente, conteos radioactivos por minuto (cpm) asociados con cada grupo de células se mide al pasar el homogenado a través de un contador de escintilación. En base a la actividad específica conocida del anticuerpo radiomarcado, el número de moléculas de anticuerpo internalizadas por célula puede deducirse de los conteos de escintilación de las células trituradas. Las células se "contactan" con el anticuerpo in Vitro kpreferentemente en forma de solución tal como al agregar las células al medio de cultivo celular en el plato o matraz de cultivo y mezclar el anticuerpo bien con el medi para asegurar la exposición uniforme de las células al anticuerpo. En lugar de agregarse al medio de cultivo, las células pueden contactarse con el anticuerpo de prueba en una solución isotónica tal como PBS en un tubo de prueba por el período de tiempo deseado. In vivo, las células se contactan con el anticuerpo mediante cualquier método adecuado para administrar el anticuerpo de prueba tal como los métodos de administración abajo descritos cuando se administran a un paciente. Mientras más rápida sea la tasa de internalización del anticuerpo en la unión a la célula que expresa Pro104 in vivo, más rápida será la eliminación deseada o efecto inhibidor de crecimiento en la célula que expresa Pro104 puede lograrse, por ejemplo, por inmunoconjugado citotóxico. Preferentemente, la cinética de internalización de los anticuerpos anti-Pro104 son de tai forma que favorecen la rápida eliminación de la célula objetivo que expresa Pro104. Por lo tanto, es deseable que el anticuerpo anti-Pro104 muestre una rápida tasa de internalización preferentemente, dentro de ias 24 horas de administración del anticuero in vivo, más preferentement dentro de aproximadamente 12 horas, aún más preferentemente dentro de aproximadamente 30 minutos a 1 hora, y más preferentemente, dentro de aproximadmente 30 minutos. La presente invención proporción anticuerpos que se internan tan rápido como aproximadamente 1 5 minutos del tiempo de introducción del anticuerpo anti-Pro104 in vivo. El anticuerpo preferentemente se internará en la célula dentro de pocas horas en la unión a Pro104 en la superficie celular, preferentemente dentro de 1 hora, aún más preferentemente dentro de 15-30 minutos. Para determinar si un anticuerpo de prueba puede competr por la unión al mismo epítopo unido por los anticuerpos anti-Pro2104 de la presente invención incluyendo los anticuerpos producidos por los hibridomas depositados con el ATCC, un ensayo de degradación, por ejemplo, un ensayo ELISA competitivo, puede realizarse. En un ensayo ELISA competitivo ejemplar, las cavidades revestidas con Pro104 de una placa de microconcentración, o perlas de sefarosa revestidas con Pro104, se pre-incuban con o sin anticuerpo de competencia candidato y después un anticuerpo anti-Pro104 marcado con biotin se agrega. La cantidad de anticuerpo anti-pro104 marcado unido al antígeno Pro104 en las cavidades o en las perlas se mide utilizando conjugado de avidin-peroxidasa y sustrato adecuado. Alternativamente, el anticuerpo anti-Pro104 puede marcarse, por ejemplo, con una etiqueta fluorescente o radioactiva o alguna otra etiqueta medible y detectable. La cantidad de anticuerpo anti-pro104 marcado que se une al antígeno tendrá una correlación inversa a la habilidad del anticuerpo competidor candidato (anticuerpo de prueba) para competir por unión al mismo epítopo en el antígeno, es decir, mientras más grande sea la afinidad del anticuerpo de prueba para el mismo epítopo, menos anticuerpo anti-Pro104 marcado se unirá a las cavidades revestidas por antígeno. Un anticuerpo de competencia candidato se considera un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo o que compite para unirse al mismo epítopo como un anticuerpo anti-Pro104 de la invención si el anticuerpo competidor candidato puede bloquear la unión del anticuerpo anti-Pro104 por al menos 20%, preferentemente por al menos 20-50%, aún más preferentemente, por al menos 50% según se compara a un control realizado en paralelo en la ausencia del anticuerpo competidor candidato (pero puede encontrarse en la presencia de un anticuerpo no competidor conocido). Se entenderá que las variaciones de este ensayo pueden realizarse para llegar al mismo valor cuantitativo. Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado, tal como cualquiera de los anticuerpos monoclonales Pro104.C1 , Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C17, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C24, Pro104.C25, Pro104.C27, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C46, Pro104.C48, Pro104.C49, Pro104.C50, Pro104.C53, Pro104.C54, Pro104.C55, Pro104.C57, Pro104.C60, Pro104.C66, Pro104.C75, Pro104.C84, Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104.D12, Pro104.D14, Pro104. D18, Pro104.D19, Pro104.D20, Pro104.D21 , Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31 , Pro104. D43, Pro104. D47, Pro104. D51 , Pro 104.D55, Pro104.D56, Pro104. D58, Pro104. D62, Pro 104. D63, Pro104. D64, Pro104. D68, Pro104. D69, Pro104. D75, Pro 104. D81 , Pro104.D85, Pro104. D88, Pro104. D91 , Pro104. D94, Pro104. D102, Pro104.D106, , Pro104.D111, Pro104.D112, Pro104.D113, Pro104.D114, Pro104.D115, Pro104.D116, Pro104.D117, Pro104.D118, Pro104.D119, Pro104.D120, Pro104.D121, Pro104.D122, Pro104.D123, Pro104.D, Pro104.D124, Pro104.D125, Pro104.D126, Pro104.D127, Pro104.D, Pro104.D128, Pro104.D129, Pro104.D130, Pro104.D131, Pro104.D132, Pro104.D133, Pro104.D134, Pro104.D135, Pro104.D136, Pro104.D137, Pro104.D138, Pro104.D139, Pro104.K14, Pro104.K15, Pro104.K16, Pro104.K47, Pro104.K71, Pro104.K72, Pro104.K74, Pro104.K75, Pro104.K76, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K87, Pro104.K88, Pro104.K89, Pro104.K155, Pro104.K156, Pro104.K157, Pro104.K158, Pro104.K159, Pro104.K160, Pro104.K163, Pro104.K164, Pro104.K176, Pro104.K217, Pro104.K226, Pro104.K227, Pro104.K240, Pro104.K274, Pro104.K264, Pro104.K281, Pro104.K358 o Pro104.K362, es uno que posee una o más de las características biológicas que se unen al mismo antígeno, Pro104.C1, Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C17, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C24, Pro104.C25, Pro104.C27, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C46, Pro104.C48, Pro104.C49, Pro104.C50, Pro104.C53, Pro104.C54, Pro104.C55, Pro104.C57, Pro104.C60, Pro104.C66, Pro104.C75, Pro104.C84, Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104.D12, Pro104.D14, Pro104.D18, Pro104.D19, Pro104.D20, Pro104.D21, Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31, Pro104.D43, Pro104.D47, Pro104.D51, Pro104.D55, Pro104.D56, Pro104.D58, Pro104.D62, Pro104.D63, Pro104.D64, Pro104.D68, Pro104.D69, Pro104.D75, Pro104.D81, Pro104.D85, Pro104.D88, Pro104.D91, Pro104.D94, Pro104.D102, Pro104.D106,, Pro104.D111, Pro104.D112, Pro104.D113, Pro104.D114, Pro104.D115, Pro104.D116, Pro104.D117, Pro104.D118, Pro104.D119, Pro104.D120, Pro104.D121, Pro104.D122, Pro104.D123, Pro104.D, Pro104.D124, Pro104.D125, Pro104.D126, Pro104.D127, Pro104.D, Pro104.D128, Pro104.D129, Pro104.D130, Pro104.D131, Pro104.D132, Pro104.D133, Pro104.D134, Pro104.D135, Pro104.D136, Pro104.D137, Pro104.D138, Pro104.D139, Pro104.K14, Pro104.K15, Pro104.K16, Pro104.K47, Pro104.K71, Pro104.K72, Pro104.K74, Pro104.K75, Pro104.K76, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K87, Pro104.K88, Pro104.K89, Pro104.K155, Pro104.K156, Pro104.K157, Pro104.K158, Pro104.K159, Pro104.K160, Pro104.K163, Pro104.K164, Pro104.K176, Pro104.K217, Pro104.K226, Pro104.K227, Pro104.K240, Pro104.K274, Pro104.K264, Pro104.K281, Pro104.K358 or Pro104.K362 unirá al mismo epítopo que aquel unido por Pro104.C1, Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C17, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C24, Pro104.C25, Pro104.C27, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C46, Pro104.C48, Pro104.C49, Pro104.C50, Pro104.C53, Pro104.C54, Pro104.C55, Pro104.C57, Pro104.C60, Pro104.C66, Pro104.C75, Pro104.C84, Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104.D12, Pro104.D14, Pro104.D18, Pro104.D19, Pro104.D20, Pro104.D21, Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31, Pro104.D43, Pro104.D47, Pro104.D51, Pro104.D55, Pro104.D56, Pro104.D58, Pro104.D62, Pro104.D63, Pro104.D64, Pro104.D68, Pro104.D69, Pro104.D75, Pro104.D81, Pro104.D85, Pro104.D88, Pro104.D91, Pro104.D94, Pro104.D102, Pro104.D106,, Pro104.D111, Pro104.D112, Pro104.D113, Pro104.D114, Pro104.D115, Pro104.D116, Pro104.D117, Pro104.D118, Pro104.D119, Pro104.D120, Pro104.D121, Pro104.D122, Pro104.D123, Pro104.D, Pro104.D124, Pro104.D125, Pro104.D126, Pro104.D127, Pro104.D, Pro104.D128, Pro104.D129, Pro104.D130, Pro104.D131, Pro104.D132, Pro104.D133, Pro104.D134, Pro104.D135, Pro104.D136, Pro104.D137, Pro104.D138, Pro104.D139, Pro104.K14, Pro104.K15, Pro104.K16, Pro104.K47, Pro104.K71, Pro104.K72, Pro104.K74, Pro104.K75, Pro104.K76, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K87, Pro104.K88, Pro104.K89, Pro104.K155, Pro104.K156, Pro104.K157, Pro104.K158, Pro104.K159, Pro104.K160, Pro104.K163, Pro104.K164, Pro104.K176, Pro104.K217, Pro104.K226, Pro104.K227, Pro104.K240, Pro104.K274, Pro104.K264, Pro104.K281, Pro104.K358 or Pro104.K362 (por ejemplo, que compite por unión o unión de bloques de anticuerpo monoclonal Pro104.C1, Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C17, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C24, Pro104.C25, Pro104.C27, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C46, Pro104.C48, Pro104.C49, Pro104.C50, Pro104.C53, Pro104.C54, Pro104.C55, Pro104.C57, Pro104.C60, Pro104.C66, Pro104.C75, Pro104.C84, Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104.D12, Pro104.D14, Pro104.D18, Pro104.D19, Pro104.D20, Pro104.D21, Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31, Pro104.D43, Pro104.D47, Pro104.D51, Pro104.D55, Pro104.D56, Pro104.D58, Pro104.D62, Pro104.D63, Pro104.D64, Pro104.D68, Pro104.D69, Pro104.D75, Pro104.D81, Pro104.D85, Pro104.D88, Pro104.D91, Pro104.D94, Pro104.D102, Pro104.D106,, Pro104.D111, Pro104.D112, Pro104.D113, Pro104.D114, Pro104.D115, Pro104.D116, Pro104.D117, Pro104.D118, Pro104.D119, Pro104.D120, Pro104.D121, Pro104.D122, Pro104.D123, Pro104.D, Pro104.D124, Pro104.D125, Pro104.D126, Pro104.D127, Pro104.D, Pro104.D128, Pro104.D129, Pro104.D130, Pro104.D131, Pro104.D132, Pro104.D133, Pro104.D134, Pro104.D135, Pro104.D136, Pro104.D137, Pro104.D138, Pro104.D139, Pro104.K14, Pro104.K15, Pro104.K16, Pro104.K47, Pro104.K71, Pro104.K72, Pro104.K74, Pro104.K75, Pro104.K76, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K87, Pro104.K88, Pro104.K89, Pro104.K155, Pro104.K156, Pro104.K157, Pro104.K158, Pro104.K159, Pro104.K160, Pro104.K163, Pro104.K164, Pro104.K176, Pro104.K217, Pro104.K226, Pro104.K227, Pro104.K240, Pro104.K274, Pro104.K264, Pro104.K281, Pro104.K358 or Pro104.K362 a Pro104), son capaces de tener como objetivo una célula de tumor que expresa Pro104 y se unirán a Pro104 en una célula de mamífero in vivo. Además, un anticuerpo con la característica biológica de anticuerpo Pro104.C1, Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C17, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C24, Pro104.C25, Pro104.C27, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C46, Pro104.C48, Pro104.C49, Pro104.C50, Pro104.C53, Pro104.C54, Pro104.C55, Pro104.C57, Pro104.C60, Pro104.C66, Pro104.C75, Pro104.C84, Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104.D12, Pro104.D14, Pro104.D18, Pro104.D19, Pro104.D20, Pro104.D21, Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31, Pro104.D43, Pro104.D47, Pro104.D51, Pro104.D55, Pro104.D56, Pro104.D58, Pro104.D62, Pro104.D63, Pro104.D64, Pro104.D68, Pro104.D69, Pro104.D75, Pro104.D81, Pro104.D85, Pro104.D88, Pro104.D91, Pro104.D94, Pro104.D102, Pro104.D106,, Pro104.D111, Pro104.D112, Pro104.D113, Pro104.D114, Pro104.D115, Pro104.D116, Pro104.D117, Pro104.D118, Pro104.D119, Pro104.D120, Pro104.D121, Pro104.D122, Pro104.D123, Pro104.D, Pro104.D124, Pro104.D125, Pro104.D126, Pro104.D127, Pro104.D, Pro104.D128, Pro104.D129, Pro104.D130, Pro104.D131, Pro104.D132, Pro104.D133, Pro104.D134, Pro104.D135, Pro104.D136, Pro104.D137, Pro104.D138, Pro104.D139, Pro104.K14, Pro104.K15, Pro104.K16, Pro104.K47, Pro104.K71, Pro104.K72, Pro104.K74, Pro104.K75, Pro104.K76, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K87, Pro104.K88, Pro104.K89, Pro104.K155, Pro104.K156, Pro104.K157, Pro104.K158, Pro104.K159, Pro104.K160, Pro104.K163, Pro104.K164, Pro104.K176, Pro104.K217, Pro104.K226, Pro104.K227, Pro104.K240, Pro104.K274, Pro104.K264, Pro104.K281, Pro104.K358 or Pro104.K362 se internará en la unión a Pro104 en una célula de mamífero, in vivo. De igual forma, un anticuerpo con la característica biológica del anticuerpo Pro104.C1, Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C17, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C24, Pro104.C25, Pro104.C27, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C46, Pro104.C48, Pro104.C49, Pro104.C50, Pro104.C53, Pro104.C54, Pro104.C55, Pro104.C57, Pro104.C60, Pro104.C66, Pro104.C75, Pro104.C84, Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104.D12, Pro104.D14, Pro104.D18, Pro104.D19, Pro104.D20, Pro104.D21, Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31, Pro104.D43, Pro104.D47, Pro104.D51, Pro104.D55, Pro104.D56, Pro104.D58, Pro104.D62, Pro104.D63, Pro104.D64, Pro104.D68, Pro104.D69, Pro104.D75, Pro104.D81, Pro104.D85, Pro104.D88, Pro104.D91, Pro104.D94, Pro104.D102, Pro104.D106,, Pro104.D111, Pro104.D112, Pro104.D113, Pro104.D114, Pro104.D115, Pro104.D116, Pro104.D117, Pro104.D118, Pro104.D119, Pro104.D120, Pro104.D121, Pro104.D122, Pro104.D123, Pro104.D, Pro104.D124, Pro104.D125, Pro104.D126, Pro104.D127, Pro104.D, Pro104.D128, Pro104.D129, Pro104.D130, Pro104.D131, Pro104.D132, Pro104.D133, Pro104.D134, Pro104.D135, Pro104.D136, Pro104.D137, Pro104.D138, Pro104.D139, Pro104.K14, Pro104.K15, Pro104.K16, Pro104.K47, Pro104.K71, Pro104.K72, Pro104.K74, Pro104.K75, Pro104.K76, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K87, Pro104.K88, Pro104.K89, Pro104.K155, Pro104.K156, Pro104.K157, Pro104.K158, Pro104.K159, Pro104.K160, Pro104.K163, Pro104.K164, Pro104.K176, Pro104.K217, Pro104.K226, Pro104.K227, Pro104.K240, Pro104.K274, Pro104.K264, Pro104.K281, Pro104.K358 or Pro104.K362 tendrá la mismas propiedades de unión, objetivo, internalización, inhibidor de crecimiento tumoral y citotóxicas de epítopo del anticuerpo. El término anticuerpo "antagonista" se utilize en el sengido más amplio, e incluye un anticuerpo que bloquea parcial o completamente, inhibe, o neutraliza una actividad biológica de una proteína Pro104 nativa descrita en la presente. Los métodos para idenficiar los antagonistas de un polipéptido Pro104 puede comprender contactar un polipéptido Pro104 o una célula que expresa Pro104 en la superficie celular, con un anticuerpo antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido Pro104. Un "anticuerpo que inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan Pro104" o un anticuerpo "inhibidor de crecimiento" es uno que se une a y da como resultado la inhibición de crecimiento medible de células cancerígenas que expresan o sobreexpresan Pro104. Los anticuerpos anti-Pro104 inhibidores de crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan Pro104 por ejemplo, células de cáncer de mama, ovárico, pancreático y pulmonar) por más de 20%, preferentemente de aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, y aún más preferentemente, por más de 50% (por ejemplo, de aproximdamente 50% a aproximadamente 100%) según se compara al control adecuado, el control típicamente siendo células tumorales no tratadas con el anticuerpo que se prueba. La inhibición de crecimiento puede medirse en una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.1 a 30 pg/ml o aproximadamnte 0.5 nM a 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición de crecimiento se determina 1 -10 días después de la exposición a las células tumorales al anticuerpo. La inhibición de crecimiento de células tumorales in vivo puede determinarse en varias maneras tal como se describe en los Ejemplos Experimentales de la sección de abajo. El anticuerpo es inhibidor de creciimento in vivo si la administración del anticuerpo anti-Pro104 a aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da como resultado la reducción de tamaño de tumor o proliferación de célula tumoral dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses de la primera administración del anticuerpo, preferentemente dentro de aproximadamente 5 a 30 días. Caliqueamicin Otros inmunoconjugados de interés comprenden un anticuerpo anti-Pro1 04 conjugado con una o más moléculas de caliqueamicin. La familia de caliqueamicin de antibióticos son capaces de producir ADN de doble filamento que se interrumpe en concentraciones sub-picomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de caliqueamicin, ver Patentes de EE. UU. 5,712,374, 5,714,586, 5,739, 1 16, 5,767,285, 5,770,701 , 5,770,710, 5,773,001 , 5,877,296 (todas las para American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de caliqueamicin que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, y- , a2', a3', N-acetil-? PSAG and ? (Hinman eí al. Cáncer Research 53: 3336 (1993), Lode eí al. Cáncer Research 5 8: 2925-2928 (1998) y las Patentes de EE.UU. arriba mencionadas para American Cyanamid). Otro fármaco anti-tumor con el que el anticuerpo puede conjugarse es QFA que es antifolato. Tanto caliqueamicin como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la toma celular de estos agentes a través de internalización mediada por anticuerpo mejora sus efectos citotóxicos. Otros Agentes Citotóxicos Otros agentes antitumor que pueden conjugarse con los anticuerpos anti-Pro104 de la invención incluyen BCNU, estreptozoicin, vincristina and 5-fIuorouracil, la familia de agentes conocidos colectivamente como LL-E33288 descritos en las Patentes de EE.UU. 5,053,394, 5,770,710, así como también esperamicinas (Patente de EE.UU. 5,877,296). Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión 1 5 de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricino A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas americanas de Phytolaca (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de carantia momordica, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Ver, por ejemplo, WO 93/21232 publicada el 28 de Octubre de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleotílica (por ejemplo, una ribonucleasa o una end?nucleasa de ADN como una deoxiribonucleasa; DNase). Para destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Una variedad de isótopos altamente radioactivos está disponible para la producción de anticuerpos anti-Pro1 04 radioconjugados. Ejemplos incluyen At211 , I131 , I125, ln1 1 1 ,Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado es utilizado para diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo de estudios escintigráficos, por ejemplo, Tc99M o I123, o una etiqueta de giro para formación de imágenes por resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida como formación de imágenes por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123, yodo-131 , indio-1 1 1 , flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las radio- u otras etiquetas pueden incorporarse en el conjugado en maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse por síntesis de aminoácido químico utilizando precursores de aminoácido adecuados incluyendo, por ejemplo, flúor-1 9 en lugar de hidrógeno. Las etiquetas tales como Tc99M, I123, ln1 1 1 , Re186, Re188, pueden unirse a través de un residuo de cisteína en el péptido. ltrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 puede utilizarse para incorporar yodo "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle. Los conjugados del anticuerpos y agente citotóxico pueden hacerse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil (2-piridiiditio) propionato (SPDP), succinimidil (N-maleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como HCL de adipimidato de dimetilo), esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehiídos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolieno 2,6diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede prepararse como se describe en Vitetta ef al. Science 238: 1098 (1987). El ácido triaminapentaacético de metildietileno 1 -isotiocianatobencilo (MX-DTPA) es un agente de quelación ejemplificativo para conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO 94/1 1 026. El enlazador puede ser un "enlazador separable" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador lábil de ácido, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari ef al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992); Patente de EE. UU. No. 5,208,020) puede utilizarse. Alternativamente, una proteína de fusión comprendiendo el anticuerpo anti-Pro104 y el agente citotóxico puede hacerse, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican dos porciones del conjugado ya sea adyacente una a otra o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. Además, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal estreptavidin) para uso en pre-objetivo de tumor en donde el conjugado de anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por el retiro de conjugados sin unir de la circulación utilizando un agente de despejo y después la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, radionucleótido). Terapia de Profármaco Mediado por Enzima Dependiente de Anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención también pueden utilizase en ADEPT al conjugar el anticuerpo con una enzima que activa el profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver WO 88/07378 y Patente de EE.UU. No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco en tal manera para convertirlo en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; deaminasa de citosina útil para convertir fluorocitosina no tóxica en fármaco anti-cáncer, 5-fiuorouracil; proteasas, tales como portease de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptido en fármacos libres; D-alanlIcarboxIpeptidasas, útiles para convertir los profármacos que contienen substituyentes de D-aminoácidos, enzimas de separación de carbohidrato tales como O-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir los profármacos glicosilados en fármacos libres; P-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con P-lactamos en fármacos libres; y amidasas de penicilina, tal como amidasa de penicilina V o amidasa de penicilina G, útil para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo y fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la materia como "abzimas", pueden utilizarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe en la presente para suministro de la abisma a una población de célula de tumor. Las enzimas de esta invención pueden unirse covalentemente a los anticuerpos anti-Pro104 por técnicas bien conocidas en la materia tales como el uso de los reactivos de degradación heterobifuncionales tratados arriba. Alternativamente, las proteínas de fusión comprendiendo al menos la región de unión de antígeno de un anticuerpo de la invención enlazada a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención puede construirse utilizando técnicas de ADN recombinantes bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Neuberger eí al. , Nature, 312: 604-608 (1984). Otras Modificaciones de Anticuerpo Otras modificaciones del anticuerpo se contemplan en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazarse a uno de una variedad de polímeros noproteínicos, por ejemplo, glicol de polietileno, glicol de polipropileno, polioxialcaquileno, o copolímeros de glicol de polietileno y glicol de polipropileno. El anticuerpo también puede atraparse en microcápsulas preparadas, pro ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato) microcápsulas, respectivamente), en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed. , (1980). Los anticuerpos anti-Pro104 descritos en la presente también pueden formularse como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agente tensoactivo que es útil para suministrar un fármaco al mamífero. Los componentes del liposoma se instalan comúnmente en una formación bicapa, similar a la instalación de lípido de membranas biológicas. Los liposomas conteniendo el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la materia, tal como se describe en Epstein ef al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang ef al. , Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); Pats. de EE.UU. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicada el 23 de Octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de EE.UU. No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípído que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin ef al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico se contiene opcionalmente dentro del liposoma. Ver, Gabizon ef al. J. National Cáncer Inst.81 (19) 1484 (1989). Vectores, Células Huésped y Métodos Recombinantes La invención también proporciona molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo anti-Pro104 humanizado, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo. Para producción recombinante del anticuerpo, la molécula de ácido nucleico de codificación se aisla e inserta en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o se inserta en un vector en enlace operable con un promotor para la expresión. ADN codificando el anticuerpo monoclonal se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Muchos vectores se encuentran disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, una o más de las siguientes: una secuencia de señal, un origen de réplica, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. Componente de Secuencia de Señal El anticuerpo anti-Pro104 de esta invención puede producirse recombinantemente no solamente directamente, sino que también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia de señales u otro polipéptido teniendo un sitio de separación específico en el término N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se separa por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal del anticuerpo anti-Pro104, la secuencia de señal se substituye por una secuencia de señal procariótica, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o conductores de enterotoxina I I estable en calor. Para secreción de levadura la secuencia de señal nativa puede substituirse, por ejemplo, por el conducto de invertasa de levadura, o factor conductor (incluyendo co-factores conductores de Saccharomyces y Kluyveromyces), o conductor de fosfatasa acida, el conductor de glucoamilasa de C albicans, o la señal descrita en WO 90/13646. En la expresión de la célula de mamífero, las secuencias de señal de mamífero así como también los conductores secretarios virales, por ejemplo, la señal gD simple de herpes, están disponibles. El ADN para tal región precursora se liga en la estructura de lectura a ADN que codifica el anticuerpo anti-Pro104. Origen de Réplica Tanto los vectores de expresión como de expresión contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de réplica y secuencias de réplica autónomas. Tales secuencias se conocen para una variedad de bacterias, levadura, y virus. El origen de réplica del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias de gramnegativo, el origen de plásmido de 2µ es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polooma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen del componente de réplica no es necesario para vectores de expresión de mamífero (el origen SV40 típicamente puede utilizarse solamente debido a que contiene el promotor temprano). Componente de Gen de Selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable.
Los genes de selección típicos codifican las proteínas que (a) confieren resistencias a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotrópicas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifican la racemasa de D-alanina para Bacilos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman exitosamente con un procedimiento de gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y de esta manera sobreviven el régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos de neomicina, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células que compiten para tomar el anticuerpo anti-Pro104 de ácido nucleico, tal como DHFR, quinasa timidina, metalotioneina-l, y -1 1 , preferentemente genes de metalotioneina de primate, deaminasa de adenosina, decarboxilasa de ornitina, etc. Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero al cultivar todos los transformadores en un medio de cultivo que contiene metotrexato (MTx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando el DHFR de tipo salvaje se emplea es la estirpe de célula de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096). Alternativamente, las células huésped (particularmente los huéspedes tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN codificando anticuerpo anti-Pro104, proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse por crecimiento celular en medio conteniendo un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico de aminoglucosídico, por ejemplo, kanamycina, neomicina, o G418. Ver Patente de EE. UU. No. 4,965, 199. Un gen de selección adecuado para utilizarse en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb ef al. , Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad para desarrollarse en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4 Jones, Genetics, 85: 12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de célula huésped de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en la ausencia de triptofan. De manera similar, las cepas de levadura deficiente de Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se contemplan por plásmidos conocidos que comparten el gen Leu2. Además, los vectores derivados del plásmido pKD1 circular pueden utilizarse para transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, un sistema de expresión para producción a gran escala de quimosina bovina recombinante se reporta para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990). Los vectores de expresión multicopia estables para secreción de albúmina de suero de humano recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces también se han descrito. Fleer ef al. , Bio/Technology, 9:968-975 (1 991 ). Componente Promotor Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se enlaza operablemente al ácido nucleico de anticuerpo anti-Pro104. Los promotores adecuados para utilizarse con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, P-lactamasa y sistemas promotores de lactosa, promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptofan (trp), y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Los promotores para utilizarse en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S. D.) operablemente enlazada al ADN que codifica el anticuerpo anti-Pro104. Las secuencias promotoras se conocen para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente 25 a 30 bases aguas arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontró 70 a 80 bases aguas arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser un nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de las células eucarióticas es una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la parte posterior poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en vectores de expresión eucarióticos. Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizarse con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, dehidrogenasa de fosfato de gliceraldehído, hexoquinasa, decarboxilasa de piruvato, fosfofructoquinasa, isomerasa de fosfato glucosa, 3-fosfoglicerato mutasa, quinsa de piruvato, isomerasa de triosefosfato, isomersa de fosfoglucosa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles teniendo la ventaja adicional de transcripción controladada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para dehidrogenasa-2 de alcohol, isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas de degradación asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, dehidrogenasa de fosfato de gliceraldehído, y enzimas responsables de uso de maltosa y galactosa. Los vectores adecuados y promotores para utilizarse en la expresión de levadura se describen además en EP 73,657. Los mejoradores de levadura también se utilizan ventajosamente con promotores de levadura. La transcripción del anticuerpo anti-Pro1 04 de los vectores en las células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus polioma, virus viruela, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y más preferentemente virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, proporcionando tales promotores que son compatibles con los sistemas de célula huésped. Los promotores tempranos y posteriores del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen viral SV40 de réplica. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como el fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos utilizando el virus de papiloma bovino como un vector se describe en la Patente de EE.UU. No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de EE. UU. No. 4,601 ,978. Véase también Reyes eí al., Nature 297:598-601 (1982) en expresión de cADN de interferón P de humano en células de ratón bajo el control de un promotor de quinasa timidina de virus simple de herpes. Alternativamente, la larga repetición terminal del virus de Sarcoma Rous puede utilizarse como el promotor. Componente del Elemento Mejorador La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-Pro104 de esta invención por eucariotas altas con frecuencia se incrementa al insertar una secuencia mejoradora en el vector. Muchas secuencias mejoradoras se conocen ahora para genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina). Típicamente, sin embargo, alguien utilizaría un mejorador de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado lateral del origen de réplica (bp 100-270), el mejorador promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador de polioma en el lado lateral del origen de réplica, y los mejoradores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1 982) acerca de elementos mejoradores para la activación de promotores eucarióticos. El mejorador puede cortarse en el vector en la posición 5' o 3' para la secuencia de codificación de anticuerpo anti-Pro104, pero es preferentemente ubicado en el sitio 5' del promotor.
Componente de Terminación de Transcripción Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas (células de levadura, hongos, insectos, planta, animales, humanos o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el mARN. Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin transladar 5', ocasionalmente 3' de ADNs virales o eucarióticos o cADNs. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin transladar del anticuerpo anti-Pro104. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de hornoma de crecimiento bovina. Ver WO 94/1 1026 y el vector de expresión descrito en la presente.
Selección y Transformación de Células Huésped. Las células huésped adecuadas para clonar y expresar el ADN en los vectores en la presente son las células procariotas, levadura o eucarióticas más altas descritas arriba. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacteria, tales como organismos de gramnegativo o grampositivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Kiebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigeila, así como también Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación preferido de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31 ,446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 ,537), y E. coli W31 10 (ATCC 27,325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. El anticuerpo de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, y proteínas de fusión de anticuerpo pueden producirse en bacterias, en particular cuando la glucosilación y función del efectuador Fe no se necesitan, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra la efectividad en la destrucción de la célula de tumor. Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor vida media en circulación. La producción de E. coli es más rápida y más eficiente en costo. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, U.S. 5,648,237 (Cárter et. al.), U.S. 5,789, 199 (Joly ef al.), y U.S. 5,840,523 (Simmons ef al.) que describe la región de inicio de traslación (TI R) y las secuencias de señal para optimizar la expresión y secreción, estas patentes se incorporan en ia presente para referencia. Después de la expresión, el anticuerpo se aisla de la pasta de célula E. coli en una fracción soluble y puede purificarse a través de, por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final puede llevarse a cabo similar a los procesos para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO. Además de las procariotas, los microbios eucarióticos tales como levadura u hongos filamentosos son huéspedes de expresión o clonación adecuadas para vectores de codificación de anticuerpo anti-Pro104. Saccharomyces cerevisiae, o levadura para hornear común, es la más utilizada entre los microorganismos de célula eucariótica inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies, y cepas están comúnmente disponibles y útiles en la presente, ver Schizosaccharomyces pombe; huéspedes Kiuyveromyces tal como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24, 178), K. waltii (ATCC 56, 500), K. drosophilarum (ATCC 36, 906), K . termotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occídentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, huéspedes Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus tal como A. nidulans y A. niger. Las células huésped para la expresión de anticuerpo anti-Pro104 se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de insecto y planta. Numerosas cepas baculovirales y variantes y células huésped de insecto permisibles de huéspedes tales como Spodopterafrugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta), and Bombyx mori se han identificado. Una variedad de cepas virales para transfección están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante L-1 de Autógrafa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden utilizarse como el virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células Spodoptera frugiperda. Los cultivos de célula vegetal de algodón, maíz, papa, semilla de soya, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco, también pueden utilizarse como huéspedes. Los vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en el cultivo celular de vegetal se conocen por aquellos expertos en la materia. Ver, por ejemplo, Hiatt et al. , Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko ef al. (1995) The Plant J 8: 745-750, and Fecker ef al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986. Sin embargo, se ha generado interés en células vertebradas, y la propagación de células vertebradas en cultivo (cultivo celular) se ha vuelto un procedimiento de rutina. Ejemplos de estirpes de célula huésped de mamífero son línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651 ); línea de riñon embriónico de humano (293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en cultivo celular, Graham ef al. , J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebe (BHK, ATCC CCL 10); células ováricas de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de ratón (TM4, Mater, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon caninos (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humanas (Hep G2, 1413 8065); tumor de mamífero de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1 ); células TRl (Mater ef al. , Annals N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humana (Hep G2). Las células huésped se transforman con la expresión arriba descrita o vectores de clonación para anticuerpo anti-Pro104 y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como apropiados para inducir promotores, seleccionar transformadores, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Cultivo de Células Huésped Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo anti-Pro104 de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma), Medio Esencial Mínimo (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)(Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham ef al. , Met. Enz. 58:44 (1979), Barnes ef al. , Anal. Biochem.102:255 (1980), Pats. de EE.UU. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5, 122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de EE.UU. Re. 30,985 puede utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferina, factr de crecimiento epidérmico), sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), reguladores (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tal como fármaco GENTAMYCI N™), elementos indicadores (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en las concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también puede incluirse en concentraciones apropaidas que sería conocido por aquellos expertos en la materia. Las condiciones del cultivo, tal como temperatura, pH y lo similar, son aquellos previamente utilizados con la célula huésped seleccionada para expresión, y será aparente para el experto ordinariamente experto. Purificación de anticuerpo anti-Pro104 Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o se secreta directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primer etapa, ios residuos particulados, ya sea células huésped o fragmentos lisados, se remueven, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiitración. Cárter et al. , Bio/Technology 1 0: 163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E coli. Brevemente, la pasta celular se enfría en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilcioruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos celulares pueden removerse por centrifugación. Donde el anticuerpo se secreta en el medio, sobrenadantes de tales sistemas de expresión se concentran primero generalmente utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, un Amicón o una unidad de ultrafiltración de Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteoliosis y antibióticos que pueden incluirse para prevenir el crecimiento de contaminantes advenciosos. La composición de anticuerpo preparada de las células pueden purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, con cromatografía de afinidad siendo la técnica de purificación preferida. La adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La Proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas de humano ?1 , ?2, o ?4 (Lindmark ef al. , J. Immunol. Met. 62: 1 -13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 de humano (Guss et al. , EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad se une es mas frecuentemente agarosa, pero otras matrices están disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que pueden lograrse con agarosa. Donde el anticuerpo comprende un domino CH3, la resina Bakerbond ABX™resin (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tal como fraccionamiento en una columna de intercambio de ion, precipitación de etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™ o una resina de intercambio de catión o anión (tai como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SI DS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también se encuentran disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperarse. Siguiendo cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla comprendiendo el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando un regulador de elusión a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0.25M sal). Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de los anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenamiento al mezclar un anticuerpo teniendo el grado deseado de pureza con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizadores (Remington's Farmaceutical Sciences 16t edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos aceptables, excipientes, o estabilizadores son no tóxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyenr reguladores tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tal como cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzotonio, fenol, butilo, o alcohol de bencilo; parabenos de alquilo tales como metilo o parabeno de propilo; catecol; resorcinoi; ciclohexanol; 3-pentanol, y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 15 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpilolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagine, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mannosa, o dextrinas; agentes de quelación tales como EDTA; tonificadores tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; agente tensoactivo tal como polisorbato; contraiones formadores de sal; trehalosa o sorbitol; agentes tensoactivos tales como polisorbato; contraiones formadores de sal tal como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn); y/o agentes tensoactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o glicol de polietileno (PEG). El anticuerpo preferentemente comprende el anticuerpo en una concentración de entre 5-200 mg/mi, preferentemente entre 10-100 mg/ml. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquella con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, además del anticuerpo anti-Pro104 que se internaliza, puede ser deseable incluir en una formulación, un anticuerpo adicional, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-Pro104 que se une a diferentes epítopos en Pro104, o un anticuerpo para algún otro objetivo tal como un factor de crecimiento que afecta el crecimiento del cáncer particular. Alternativamente, o adicionalmente, la composicición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citoquina, agente inhibidor de crecimiento, agente antihormonal, y/o cardioprotector. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de gelatina o hidroximetilceluloa y microcápsulas de poli- (metilmetacilato), respectivamente, en sistemas suministro de fármaco individual (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Farmaceutical Sciences 16t edition, Osol, A. Ed. (1980). Las preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos conteniendo el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Pat. de EE. UU. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradable tal como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectables compuestas de copolímero de ácido láctico-pacido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)hidroxibutírico. Las formulaciones pueden utilizarse en administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles. Métodos y tratamientos que utilizan anticuerpos anti-Pro104 De acuerdo a la presente invención, el anticuerpo anti-Pro104 que se interna en la unión de Pro104 en una superficie celular se utiliza para tratar un sujeto en necesidad del mismo teniendo un cáncer caracterizado por células de cáncer que expresan Pro104, en particular, cáncer ovárico, pancreático, pulmonar o de mama, tal como adenocarcinomas serosos ováricos y cáncer de carcionoma ductal infiltrante de mama, y metástasis asociada. El cáncer generalmente comprenderá células que expresan Pro104, de tal manera que el anticuerpo anti-Pro104 está disponible para unirse a la misma. Aunque el cáncer puede caracterizarse por sobreexpresión de la molécula Pro104, la presente solicitud proporciona además un método para tratar cáncer que no se considera que es un cáncer que sobreexpresa Pro104. Esta invención también se refiere a métodos para detectar células que sobreexpresan Pro104 y a equipos de diagnóstico útiles para detectar células que expresan Pro104-o en detección de Pro104 en suero de un paciente. Los métodos pueden comprender combinar una muestra de prueba que contiene célula con un anticuerpo de esta invención, analizar la muestra prueba para unión de anticuerpo a células en la muestra prueba y comparar el nivel de anticuerpo de unión en la muestra prueba con el nivel de anticuerpo de unión en una muestra de control de células. Un control adecuado es, por ejemplo, una muestra de células normales del mismo tipo que la muestra prueba o una muestra celular conocida por estar libre de células que sobreexpresan Pro104. Un nivel de unión Pro104 más alta que aquella de una muestra de control sería indicativa de la muestra de prueba conteniendo células que sobreexpresan Pro104. Alternativamente, el control puede ser una muestra de células conocidas por contener células que sobreexpresan Pro1 04. En tal caso, un nivel de anticuerpo Pro104 de unión en la muestra prueba que es similar , o en exceso de, que la muestra de control sería indicativa de la muestra prueba conteniendo células que sobreexpresan Pro104. La sobrexpresión de Pro104 puede detectarse con un análisis de diagnóstico diverso. Por ejemplo, la sobreexpresión de Pro104 puede analizarse por inmunohistoquímica (I HC). Las secciones de tejido incrustadas en parafina de una biopsia de tumor pueden someterse al análisis IHC y acordó una criterio de intensidad de coloración de proteína Pro104 como sigue. La puntuación 0 sin coloración se observa o coloración de membrana se observa en menos del 10% de las células de tumor. La puntuación 1 + una coloración de membrana débil/casi perceptible se detecta en más del 1 0% de las células de tumor. Las células se colorean solamente en parte de sus membranas. Puntuación 2+ una coloración de membrana completa débil a moderada se observa en más del 10% de las células del tumor. Puntuación 3+ una coloración de membrana completa de moderada a fuerte se observa en más del 10% de las células de tumor. Aquellos tumores con puntuaciones 0 o 1 + para expresión Pro104 pueden caracterizarse como no sobreexpresando Pro104, mientras que aquellos tumores con puntuaciones 2+ o 3+ pueden caracterizarse como sobreexpresando Pro104.
Alternativamente, o adicionalmente, en análisis FISH tal como INFORM™ (vendido por Ventana, Arizona) o PATVISION™ (VySiS, Illinois) puede llevarse a cabo en tejido de tumor incrustado de parafina, fijo en formalina para determinar el grado (si lo hay) de sobreexpresión de Pro104 en el tumor. La sobreexpresión de Pro104 o amplificación puede evaluarse utilizando un análisis de diagnóstico in vivo, por ejemplo, al administrar una molécula (tal como un anticuerpo de esta invención) que une Pro1 04 y que se marca con una etiqueta detectable (por ejemplo, un isótopo radioactivo o una etiqueta fluorescente) y explorando externamente al paciente para ubicación de la etiqueta. Una muestra sospechada que contiene células que expresas o sobreexpresan Pro104 se combina con los anticuerpos de esta invención bajo condiciones adecuadas para la unión específica de los anticuerpos a Pro1 04. La unión y/o internalización de los anticuerpos Pro1 04 de esta invención es indicativa de las células que expresan Pro 104. El nivel de unión puede determinarse y compararse con un control adecuado, en donde una temperatura elevada de Pro104 unido en comparación con el control es indicativa de la sobreexpresión de Pro1 04. La muestra esperada que contiene células que sobreexpresan Pro104 puede ser una muestra de célula de cáncer, particularmente una muestra de un cáncer ovárico, por ejemplo, adenocarcinoma seroso ovárico, o un cáncer de mama, por ejemplo, un carcinoma ductal infiltrante de mama. Una muestra de suero de un sujeto también puede analizarse para niveles de Pro104 al combinar una muestra de suero de un sujeto con un anticuerpo Pro104 de esta invención, determinando ei nivel de Pro104 unido al anticuerpo y comparando el nivel con un control, en donde el nivel elevado de Pro104 en el suero del paciente en comparación con un control es indicativo de sobreexpresión de Pro104 por células en el paciente. El sujeto puede tener un cáncer tal como por ejemplo, un cáncer ovárico, por ejemplo, adenocarcinoma seroso ovárico, o un cáncer de mama, por ejemplo, un carcinoma ductal infiltrante de mama. Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, el tratamiento de cáncer ovárico, pancreático, pulmonar o de mama incluye una o una combinación de las siguientes terapias: cirugía para remover el tejido canceroso, terapia de radiación, privación de andrógeno (por ejemplo, terapia) o quimioterapia. La terapia de anticuerpo anti-Pro1 04 puede ser especialmente deseable en pacientes mayores quienes no toleran la toxicidad y efectos secundarios de la quimioterapia, en enfermedad metastática donde la terapia de radiación tiene utilidad limitada, y para el manejo de carcinoma prostático que es resistente al tratamiento de privación de andrógeno. El tumor que tiene como objetivo y se internaliza en anticuerpos anti-Pro104 de la invención son útiles para aliviar los cánceres que expresan Pro1 04, por ejemplo, cánceres ováricos, pancreáticos, pulmonar o de mama en el diagnóstico inicial de la enfermedad o durante el relapso. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-Pro1 04 puede utilizarse solo, o en terapia de combinación, con por ejemplo, hormonas, antiangionenes, o compuestos radiomarcados, o con cirugía, crioterapía, y/o radioterapia, notablemente para cánceres ovárico, pancreático, pulmonar o de mama, también particularmente donde las células no pueden alcanzarse. El tratamiento de anticuerpo anti-Pro104 puede administrarse junto con otras formas de terapia convencional, ya sea consecutivamente con, terapia pre o post-convencional, fármacos qumioterapéuticos tal como Taxotere® (docetaxel), Taxol® (paclitaxel), estramustina y mitoxantrona se utilizan para tratar cáncer ovárico, pancreático, pulmonar o de mama refractario de hormona y metastático, en particular, en pacientes en buen riesgo. En el presente método de la invención para tratar o aliviar cáncer, en particular, cáncer ovárico, pancreático, pulmonar o mama independiente de andrógeno y/o metastático, al paciente con cáncer puede administrarse anticuerpo anti-Pro104 junto con tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapéuticos. En particular, la terapia de combinación con palictaxel y derivados modificados (ver, por ejemplo, EP0600517) se contempla. El anticuerpo anti-Pro104 se administrará junto con quimioterapia para aumentar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, por ejemplo, paclitaxel. La referencia de Escritorio de Médicos (PDR) describe las dosificaciones de estos agentes que se han utilizado en el tratamiento de diversos cánceres. El régimen de dosificación y dosificaciones de estos fármacos quimioterapéuticos arriba mencionados que son terapéuticamente efectivos dependerá del cáncer particular que se trata, el grado de la enfermedad y otros factores familiares para el médico de experiencia en la materia y puede determinarse por el médico. Particularmente, un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo anti-Pro104 conjugado con un agente citotóxico puede administrarse al paciente. Preferentemente, el inmunoconjugado unido a la proteína Pro104 se internaliza por la célula, resultando en eficacia terapéutica incrementada para el inmunoconjugado para matar la célula de cáncer a la cual se une. Preferentemente, el agente citotóxico tiene como objetivo o interfiere con el ácido nucleico en la célula de cáncer. Ejemplos de tales agentes citotóxicos se describen arriba e incluyen maitansina, maitansinoides, saporina, gelonina, ricino, caliqueamicina, ribonucleasas y endonucleasas de ADN. Los anticuerpos anti-Pro104 o inmunoconjugados se administrar a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutáneo, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalación. Los anticuerpos o inmunoconjugados pueden inyectarse directamente en la masa del tumor. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo se prefiere. Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración del anticuerpo anti-Pro104. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única y administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente existe un periodo de tiempo mientras ambos (o todos) los agentes activos simultáneamente ejercen sus actividades biológicas. Preferentemente cada terapia combinada resulta en un efecto terapéutico sinergístico. También puede ser deseable combinar la administración del anticuerpo anti-Pro104 o anticuerpos, con administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno de tumor asociado con el cáncer particular. Como tal, esta invención también se dirige a un anticuerpo "cocktail" que comprende uno o más anticuerpos de esta invención y al menos otro anticuerpo que se une a otro antígeno de tumor asociado con las células de tumor que expresan Pro104. El coctaii puede también comprender anticuerpos que se dirigen a otros epítopos de Pro1 04. Preferentemente los otros anticuerpos no interfieren con la unión y o internalización de los anticuerpos de esta invención. El método de tratamiento terapéutico de anticuerpo de la presente invención puede incluir la administración combinada de un anticuerpo anti-Pro1 04 (o anticuerpos) y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores de crecimiento, incluyendo co-administración de cocktailes de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, por ejemplo, fosfato de estramustina, prednimustina, cisplatina, 5-fluorouracil, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tal como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La programación de dosificación y preparación para tales agentes quimioterapúeticos pueden utilizarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el practicante experto. La preparación y programación de dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemoterapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El anticuerpo puede combinarse con el compuesto antihormonal, por ejemplo, un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen; un anti-progesterona tal como onapristona (ver, EP 616 812); o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosificaciones conocidas para tales moléculas. Donde el cáncer a tratarse es cáncer independiente de andrógeno, el paciente puede previamente haberse sometido a terapia anti-andrógeno, y después de que el cáncer se vuelve independiente de andrógeno, el anticuerpo anti-Pro104 (y opcionalmente otros agentes como se describe en la presente) puede administrarse al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico también co-administrar un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfunción miocardial asociada con la terapia) o una o más citoquinas al paciente. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a remoción quirúrgica de células de cáncer y/o terapia de radiación, antes, simultáneamente con, o después de la terapia de anticuerpo. Las dosificaciones adecuadas para cualquiera de los agentes co-administrados anteriores son aquellos actualmente utilizados para disminuirse bajo la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo anti-Pro104. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación y modo de administración se elegirá por el médico de acuerdo con el criterio conocido. La dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, como se define arriba, la severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en un tiempo o durante una serie de tratamientos. Preferentemente, el anticuerpo se administra por infusión intravenosa o por inyecciones subcutáneas. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0.1 - 15 mg/kg/dosis) de anticuerpo puede ser una dosificación de candidata inicial para administración al paciente, si, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por una dosis débilmente de mantenimiento de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-Pro104. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. Una dosificación diaria típica puede variar de aproximadamente 1 pg/kg a 1 00 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arribas. Para administraciones repetidas con varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que la supresión deseada de síntomas de enfermedad ocurre. El progreso de esta terapia puede monitorearse por métodos convencionales y análisis y en base a los criterios conocidos por el médico u otras personas de experiencia en la materia. Además de la administración de la proteína de anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo por terapia genética. Tal administración de una molécula de ácido nucleico codificando el anticuerpo se comprende por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo". Ver, por ejemplo, WO 96/07321 publicado el 14 de Marzo de 1996, que concierne el uso de terapia genética para generar anticuerpos intracelulares. Existen dos planteamientos principales para introducir la molécula de ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para suministro in vivo la molécula de ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, usualmente en el sitio donde el anticuerpo se requiere. Para tratamiento ex vivo, las células de paciente se remueven, la molécula de ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsularse dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente (ver, por ejemplo, Patentes de EE.UU. Nos. 4,892,538 y 5,283, 187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir moléculas de ácido nucleico en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si la molécula de ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, o in vivo las células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, dextran DEAE, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente utilizado para suministro ex vivo del gen es un vector retroviral Las técnicas de transferencia de molécula de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simple I, o adenovirus asociado) y sistemas a base de lípido (lípidos útiles para transferencia mediada de lípido del gene son DOTMA, DOPE y DC-Cho1 , por ejemplo). Para revisión del marcado genético actualmente conocido y procedimientos de terapia de gel ver Anderson et at., Science 256:808-813 (1 992). Véase también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma.
Artículos de Fabricación y Eguipos La invención también se refiere a un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para la detección de células que sobreexpresan Pro104 y/o el tratamiento de cáncer que expresa Pro104, en cáncer particular de mama, ovárico, pancreático y pulmonar. El artículo de la fabricación comprende un contenedor y una composición contenida en el mismo comprendiendo un anticuerpo de esta invención. La composición puede comprender además un vehículo. El artículo de fabricación también puede comprender una etiqueta o inserción de paquete o asociarse con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor mantiene una composición que es efectiva para detectar las células que expresan Pro104 y/o tratar una condición de cáncer y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor para ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco teniendo un detenedor perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-Pro104 de la invención. La etiqueta o inserción de paquete indica que al composición se utiliza para detectar células que expresan Pro104 y/o para tratar cáncer de mama, ovárico, pancreático y pulmonar, o más específicamente adenocarcinoma seroso ovárico, carcinoma ductal infiltrante de mama, adenocarcinoma de próstata, carcinomas de célula renal, adenocarcinomas colorectales, adenocarcinoma de pulmón, carcinomas de célula escamosa pulmonar, y mesotelioma pleural, en un paciente en necesidad del mismo. El cáncer de mama puede ser cáncer de mama HER-2 negativo o positivo. Los cánceres comprenden cánceres metastáticos de cualquiera de lo anterior, por ejemplo, metástasis de cáncer de mama, ovárico, pancreático y pulmonar. La etiqueta o inserción de paquete puede comprender además instrucciones para administrar la composición de anticuerpo a un paciente con cáncer. Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor que comprende una substancia que detecta el anticuerpo de esta invención, por ejemplo, un segundo anticuerpo que se une a los anticuerpos de esta invención. La substancia peude marcarse con una marca detectable tal como aquellas descritas en la presente. El segundo contenedor puede contener, por ejemplo, un regulador farmacéuticamente aceptable, tal como agua de bacterioestado para inyección (BWFI), salina regulada por fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. El artículo de fabricación puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista del usuario y comercial incluyendo otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas. También se proporcionan equipos que son putiles para varios propósitos, por ejemplo, para ensayos de eliminación de célula Pro104, para purificación e ¡nmunoprecipitación de Pro104 de las céluas o la detección de la presencia de Pro104 en una muestra de suero o detección de la presencia de células que expresan Pro104 en una muestra de célula. Para aislamiento y purificación de Pro104, el equipo puede contener un anticuerpo anti-Pro104 acoplado a un soporte sólido, por ejempo, una placa de cultivo de tejido para detección y cuantificación de Pro104 in vivo, por ejemplo, en una ELISA o un Western Blot. Así como en el artículo de elaboración, el equipo comprende un contenedor y una composición contenida en el mismo comprendiendo un anticuerpo de esta invención. El equipo puede además comprender componentes adicionales, por ejemplo, diluyentes y reguladores, sustancias que se unen a los anticuerpos de esta invención, por ejemplo, un segundo anticuerpo que puede comprender una etiqueta tal como aquellos descritos en la presente, por ejemlo, una radioeetiqueta, etiqueta fluorescente, o enzima, o el equipo puede también comprender anticuerpos de control. Los componentes adicionales pueden encontrarse dentor de contenedores separados dentro del equipo. El inserto de envasamiento o etiqueta puede proporcionar una descripción de la composición así como también instrucciones para el uso de diagnóstico o pretendido in vivo.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Producción y aislamiento de Hibridomas que producen Anticuerpo Monoclonal Los siguientes MAb/hibridomas de la presente invención se describen abajo: Pro104.C1 , Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C17, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C24, Pro104.C25, Pro104.C27, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C46, Pro104.C48, Pro104.C49, Pro104.C50, Pro104.C53, Pro104.C54, Pro104.C55, Pro104.C57, Pro104.C60, Pro104.C66, Pro104.C75, Pro104.C84, Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104. D9, Pro104. D12, Pro104. D14, Pro104.D18, Pro104. D19, Pro1 04. D20, Pro104.D21 , Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31 , Pro104.D43, Pro104. D47, Pro104.D51 , Pro104.D55, Pro104.D56, Pro104.D58, Pro104.D62, Pro104.D63, Pro104.D64, Pro104.D68, Pro104. D69, Pro104.D75, Pro104.D81 , Pro104.D85, Pro104. D88, Pro104. D91 , Pro104. D94, Pro104.D102, Pro104.D106, , Pro104. D1 1 1 , Pro104. D1 12, Pro104.D1 13, Pro104.D1 14, Pro104.D115, Pro104.D116, Pro104.D117, Pro104.D118, Pro104.D119, Pro104.D120, Pro104.D121, Pro104.D122, Pro104.D123, Pro104.D, Pro104.D124, Pro104.D125, Pro104.D126, Pro104.D127, Pro104.D, Pro104.D128, Pro104.D129, Pro104.D130, Pro104.D131, Pro104.D132, Pro104.D133, Pro104.D134, Pro104.D135, Pro104.D136, Pro104.D137, Pro104.D138, Pro104.D139, Pro104.K14, Pro104.K15, Pro104.K16, Pro104.K47, Pro104.K71, Pro104.K72, Pro104.K74, Pro104.K75, Pro104.K76, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K87, Pro104.K88, Pro104.K89, Pro104.K155, Pro104.K156, Pro104.K157, Pro104.K158, Pro104.K159, Pro104.K160, Pro104.K163, Pro104.K164, Pro104.K176, Pro104.K217, Pro104.K226, Pro104.K227, Pro104.K240, Pro104.K274, Pro104.K264, Pro104.K281, Pro104.K358 or Pro104.K362. Si el MAb se ha clonado, se obtendrá la nomenclatura "X.1", por ejemplo, el primer clon a A7 se referirá como A7.1, el segundo clon de A7 se referirá como A7.2, etc. Para los propósitos de esta invención, una referencia a A7 incluirá todos los clones A7.1, A7.2, etc.
Inmunógenos y Antígenos (Recombinant Proteins, HA & His Tags & Transfected Cells) Pro104 (Testisin) de Longitud Completa, Producción de Secuencia yProteína Expresada por fragmento de E. coli. Para la inmunización de ratones y la producción de la serie C de MAbs, una construcción Pro1 04 codificadora de una región de Pro104 de Lys20 a Trp297 se introdujo en un vector de expresión E. coli estándar por medio de sitios de enzima de restricción. La construcción se clonó en estructura a la C-terminal de una etiqueta de seis histidina de tal forma que la construcción Pro104 podría expresarse como una proteína etiquetada con seis histidinas de 288 aminoácidos. El plásmido recombinante se utilizó para transformar las células E. col! competentes y la expresión de Pro104 se realizó en matraces de agitación. La pasta bacteriana, colectada después de la inducción con I PTG, se utilizó para purificación de Pro104 por medio de una cromatografía de columna Ni-NTA. Secuencia de aminoácido expresado Pro104 (Lys20 (subrayado-Trp297) (la letra negrita representa la etiqueta hexa-histidina) (SEQ I D NO. 1 ) MAKPESQEAAPLSGPCGRRVITSRIVGGEDAELGRWPWQGSLRLWDSHVCG VSLLSHRWALTAAHCFETYSDLSDPSGWMVQFGQ TSMPSFWSLQAYYTRY FVSNIYLSPRYLGNSPYDIALVKLSAPVTYTKHIQPICLQASTFEFENRTD CWVTGWGYIKEDEALPSPHTLQEVQVAIINNSMCNHLFLKYSFRKDIFGD VCAGNAQGGKDACFGDSGGPLACNKNGLWYQIGVVSWGVGCGRPNRPGVYT NISHHFEWIQKLMAQSGMSQPDPS LEHHHHHH Producción de Proteína y Secuencia Expresada de Célula Insecto Pro104 (Testisin) Para inmunización de ratones y producción de la serie D de MAbs, una construcción de P104 que codifica una señal de secreción melletin de abeja de miel, una región de pro104 de Ile2 a Trp207 y una etiqueta de seis histidinas se clonó y se expresó utilizando técnicas estándares. Pro104 se purificó utilizando la resina Ni-NTA. Secuencia de aminoácido expresado Pro104 (Ile42-Trp297) (parte subrayada representa la señal de secreción melletin y el tipo letras en negrita representa la etiqueta hexa histidina) (SEQ ID NO. 2) MKFLVNVALVFMVVYISYIYADPMAIVGGEDAELGRWPWQGSLRLWDSHVC GVSLLSHRWALTAAHCFETYSDLSDPSGWMVQFGQLTSMPSFWSLQAYYTR YFVSNIYLSPRYLGNSPYDIALVKLSAPVTYTKHIQPICLQASTFEFENRT DCWVTGWGYIKEDEALPSPHTLQEVQVAIINNSMCNHLFLKYSFRKDIFGD MVCAGNAQGGKDACFGDSGGPLACNKNGLWYQIGVVSWGVGCGRPNRPGVY TNISHHFE IQKLMAQSGMSQPDPS HHHHHH Producción y Secuencias Expresadas de Célula LMTK & 293t de Pro104 (Testisin) Para seleccionar MAbs de Pro104 tanto de serie C como D, la proteína Pro1 04 de longitud completa (Met1 -Val314) se expresó tanto con o sin una etiqueta HA (negrita) y separador (subrayado) indicado en la C-terminal, río abajo del sitio de recombinación (Mayúsculas), utlizando técnicas de expresión de mamífero estándar. Secuencia de aminoácido de célula LMTK de ratón y 293T de humano transfectado de Pro104 (SEQ ID NO. 3) MGARGALLLALLLARAGLRKPESQEAAPLSGPCGRRVITSRIVGGEDAELGR WP QGSLRL DSHVCGVSLLSHR ALTAAHCFETYSDLSDPSGWMVQFGQLT SMPSFWSLQAYYTRYFVSNIYLSPRYLGNSPYDIALVKLSAPVTYTKHIQPI CLQASTFEFENRTDC VTG GYIKEDEALPSPHTLQEVQVAIINNSMCNHLF LKYSFRKDIFGD VCAGNAQGGKDACFGDSGGPLACNKNGLWYQIGVVSWGV GCGRPNRPGVYTNISHHFEWIQKLMAQSGMSQPDPSWPL FFPL WALPL G PVDPAFLYKVT SRMASYPYDVPDYASL Producción de Proteína y Secuencias Expresadas de Célula CHO de Pro104 (Testisin) Para inmunización de ratones y producción de los MAbs de Pro104 serie K, la proteína Pro104 de longitud completa (Met1 -VaI314) se expresó sin una etiqueta utilizando técnicas de expresión de mamífero estándar. Las células CHO de hámster se transfectaron establemente con Receptor Tetraciclina (TR) utilizando las células CHO-TR se cultivaron en medio HAM F12 con 10% de suero de bovino fetal (FBS). Un vector que codifica la proteína Pro1 04 de longitud completa (Met1 -Val314) se transfectó en las células CHO. Los transfectantes estables se seleccionaron en medio HAM F12 con 10% de FBS con Hidrocimicina B a 300 ug/ml, por 15 días. Las células resistentes a Hidromicina B se revisaron para expresión de Pro104 por western blot utilizando el anticuerpo monoclonal diaDexus Pro104. C25.1 después de la estimulación de 16-20 hrs de estimulación con 1 ug/ml de Tetraciclina Las células se expandieron, se clasificaron y se crioconservaron en FBS con 10% de DMSO y se almacenaron en nitrógeno líquido a -196°C para asegurar el mantenimiento de cultivos de clon viables. Secuencia de amino'caido de célula CHO de hámster transfectado Pro104 (SEQ I D NO. 4) GARGALLLALLLARAGLRKPESQEAAPLSGPCGRRVITSRIVGGEDAELG RWPWQGSLRLWDSHVCGVSLLSHR ALTAAHCFETYSDLSDPSG MVQFGQ LTSMPSFWSLQAYYTRYFVSNIYLSPRYLGNSPYDIALVKLSAPVTYTKHI QPICLQASTFEFENRTDCWVTGWGYIKEDEALPSPHTLQEVQVAIINNSMC NHLFLKYSFRKDIFGDMVCAGNAQGGKDACFGDSGGPLACNKNGLWYQIGV VS GVGCGRPNRPGVYTNISHHFE IQKLMAQSGMSQPDPSWPLLFFPLLW ALPLLGPV Producción de Proteína y Secuencia de Dominio de Proteasa Serina Ovr115 Ovr1 15 (TMPRSS4) se utilizó para seleccionar los clones de hibridoma de reacción cruzada, ya que este antígeno se reguló también en cánceres ováricos y pancreáticos y ya que este también contuvo un dominio de proteasa serina de reacción cruzada potencialmente. Una construcción Ovr1 15 que codifica un sitio de reconocimiento de proteasa virus (TEV) de tabaco y el dominio de proteasa serina de Ovr1 15 de Val203 a Leu435 se clonó en estructura a la C-terminal de glutationa s-transferasa (GST) de tal forma que la construcción Ovr1 15 se expresó como una proteína de fusión GST de 486 aminoácidos utilizando técnicas estándares. La purificación de Ovr1 15 se completó por medio de columna de sefarosa glutationa. Secuencia de aminoácido de construcción de dominio de proteasa serina Ovr115 (la secuencia GST se subraya, secuencia TEV se encuentra en mayúsculas y secuencia tag se encuentra en el tipo negrito) (SEQ ID NO.5).
MAPILGYWKIKGLVQPTR LLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFP NLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHN LGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGV SRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLK FEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDAL DVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQG QATFGG GDHPPKS DLVPRHNQT SLYKKAGF£NL y.FQGVVGGEEASVDSWPWQVS I QYDK QHVCGGSILDPH VLTAAHCFRKHTDVFNWKVRAGSD LGSFPSLAVAKIIII EFNPMYPKDNDIALMKLQFPLTFSGTVRPICLPFFDEELTPATPLWIIGWGFT KQNGGK SDILLQASVQVIDSTRCNADDAYQGEVTEKM CAGIPEGGVDTCQG DSGGPLMYQSDQWHVVGIVSWGYGCGGPSTPGVYTKVSAY NWIYNVWKAELS Producción de Proteína & Secuencia de Fragmento NWSHPQFEK Extracelular Ovr115 Una construcción Ovr1 15 (TMPRSS4) codificadora de una región de Ovr1 15 de Lys52 a Leu435, la cual constituyó solamente la parte extracelular pronosticada de la molécula, se clonó con una etiqueta de seis histidina inmediatamente río debajo de codón Leu435. Ovr1 15 se purificó utilizando la resina Ni-NTA. Secuencia de aminoácido de construcción extracelular Ovr115 (Ovr1 15 Lys52 (subryaados)-Leu435) (SEQ ID NO. 6) MKVILDKYYFLCGQPLHFIPRKQLCDGELDCPLGEDEEHCVKSFPEGPA VAVRLSKDRSTLQVLDSATGNWFSACFDNFTEALAETACRQMGYSSKPT FRAVEIGPDQDLDVVEITENSQELRMRNSSGPCLSGSLVSLHCLACGKS LKTPRVVGGEEASVDS PWQVSIQYDKQHVCGGSILDPHWVLTAAHCFR KHTDVFNWKVRAGSDKLGSFPSLAVAKIIIIEFNPMYPKDNDIALMKLQ FPLTFSGTVRPICLPFFDEELTPATPLWIIGWGFTKQNGGKMSDILLQA SVQVIDSTRCNADDAYQGEVTEKMMCAGIPEGGVDTCQGDSGGPLMYQS DQWHVVGIVSWGYGCGGPSTPGVYTKVSAYLN IYNV KAELHHHHHH Generación de Estirpes de Célula de Ratón Ovr115 Estable LMTK. Ovr1 1 5 etiquetado HA de longitud completa (Met1 - Leu435) (subrayado) se transfectó en células LMTK de ratón después de clonares en un vector de expresión de mamífero con una etiqueta HA. Los clones individuales se revisaron para la expresión de Ovr1 15 por western blot utitilzando anticuerpo anti-HA (Covance, Richmond, CA) después de 1 semana en cultivo. Secuencia de aminoácido LMTK transfectado Ovr1 15 (SEQ ID NO. 7) DPDSDQPLNS DVKP RKPRIPMETFRKVGIPIIIALLSLASIIIV LIK VILDKYYFLCGQP HFIPRKQLCDGELDCPLGEDEEHCVKSFPEGPAVAVRL SKDRSTLQV DSATGN FSACFDNFTEALAETACRQMGYSSKPTFRAVEIGP DQD DWEITENSQELRMRNSSGPCLSGSLVSLHCLACGKSLKTPRWGGEE ASVDS PWQVSIQYDKQHVCGGSILDPH VLTAAHCFRKHTDVFNWKVRAGS DKLGSFPS AVAKIIIIEFNPMYPKDNDIA MKLQFP TFSGTVRPICLPFF DEELTPATP WIIGWGFTKQNGGKMSDILLQASVQVIDSTRCNADDAYQGEV TEKMMCAGIPEGGVDTCQGDSGGPL YQSDQ HWGIVSWGYGCGGPSTPGV YTKVSAYLNWIYNVWKAE DPAFLYKVVRSR ASYPYDVPDYASL Inmunizaciones Para la generación de MAbs de serie C se inmunizaron ratones con proteína recombinante Pro 104 expresada E. coli, codificando una región de Pro104 de Lys20 a Trp297 de la proteína de longitud compelta. Los grupos de 8 BALB/c ratones se inmunizaron transdérmicamente en ambas patas traseras. Todas las inyecciones fueron 25 uL por pie. La primera inyección (día 1 ) de 10 ug de antígeno por ratón fue en salina regulada por fosfato Dulbecco (DPBS) mezclada en volumen igual a proporción de volumen con adyuvante de oro Titermax (Sigma, Saint Louis, MS). Las inyecciones subsecuentes de 1 0 ug de antígeno por ratón originó en los días 5, 9, 12, 16, 19, 23, 26, 29, 30 y consistió de antígeno en 20 ul de DPBS tal como 5 uL de adyuvante Adiu-phos (Accurate Chemical & Scientific Corp. , Westbury, NY) por ratón. La primera inyección de refuerzo en el día 33 consistió de antígeno diuido en DPBS solo. La fusión ocurrió en el Día 37. Para la generación de MAbs de serie D se inmunizaron ratones según anteriormente con proteína recombinante Pro104 expresada de célula de insecto soluble, que correspondió a una región de Ile42 a Trp297 de la proteína de longitud completa. Para MAbs de serie K los ratones se inmunizaron con una estirpe de célula CHO establemente transfectada exprsando Pro104 en la superficie celular. La expresión de superficie celular de Pro104 varió de 1 3.3 a 97.0% en las primeras dos inyecciones, los ratones se inmunizaron con 1 .25X106 células/ratón, en inyecciones 3-9, los ratones se inyectaron con 3.75x106 células/ratón. Los ratones se les dio una inyección final de 2.5x106 células. Las células completas en HBSS (Solución de Sal Balanceado Hanks) sin adyuvantes se utilizaron a lo largo de la serie de inmunización. El horario de inmunización de serie K fue el mismo utilizado para la serie C y D anterior.
Fusiones de Hibridoma Los ratones se sacrificaron al completarse el protocolo de inmunización y el drenado del tejido de nudo linfático (popliteal) se colectó por la disección estéril. Las células de nudo linfático se dispesarsaron utilizando un triturador de tejido Tenbroeck (Wheaton #357426, VWR, Brisbane, CA) seguido por presión a través de una criba 40 uM estéril (VWR) en DMEM y removiendo las células T por medio de anti-CD90 (Thy1 .2) perlas magnéticas revestidas (Miltenyl Biotech, Baraisch-GIadbach, Germany). Estas células de nudo linfático enriquecidas con célula B primarias se inmortalizaron así por fusión electro-célula (BTX, San Diego, CA) con la estirpe de célula de mieloma continua P3x63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. , J. Immunology 123: 1548-1550, 1979). Las células exitosamente fusionadas se seleccionaron ai cultivar en medio que contiene hipoxantina estándar Azaserine (HA) (Sigma, St. Louis, MO) (DMEM/15% FBS/0.5 ng/mL rlL-6 (Sigma, Saint Louis, MS)/10% P388D! (ATCC, Manassas, VA) medio acondicionado). Estos cultivos de fusión se distribuyeron inmediatamente, 2 millones de células por placa, en cavidades de placas de cultivo de 96 cavidades (Costar Cat. # 3585, VWR). La distribución del cultivo en placas de cultivo de 96 cavidades, inmeditamente siguiente a la fusión, facilitó la selección de una gran diversidad de clones de hibridoma produciendo anticuerpos específicos, únicos. Los sobrenadantes de cavidades se seleccionaron por ELISA, para reactividad contra proteína expresada E. coli Pro104, proteína expresada de insecto Pro1 04 y para reactividad no cruzada con el dominio extracelular Ovr1 15 de protesasa serina (insecto expresado). Los cultivos monoclonales, consistentes de la progenie genéticamente uniforme de las células únicas, se establecieron después del procedimiento de selección anterior, al limitar la dilución (Coller, H y Coller, B. Hybridoma 2: 91 -6, 1983), o sorteo de célula de células viables únicas en cavidades de placas de 96 cavidades (VWR), utilizando citometría de flujo (Coulter Élite, Beckman Coulter, Miami, FL). Los cultivos de hibridoma de célulal B murino resultantes se expandieron utilizando ias técnicas de cultivo de tejido estándar. Los hibridomas seleccionados se crioconservaron en suero de bovino fetal (FBS) con 1 0% de DMSO y se almacenaron en nitrógeno líquido a -196°C para asegurar el mantenimiento de cultivos de clon viables.
Selección y Elección de Hibridomas Productores de Anticuerpo Las estirpes de célula de hibridoma se seleccionaron para la producción de anticuerpo específico Pro104 por inmunoensayo de fase sólida enlazado por enzima (ELISA). Las proteínas Pro104 o Ovr1 151 se absorbieron de manera no específica a las cavidades de placas EIA de poliestireno de 96 cavidades (VWR). Cien uL de volúmenes de proteínas Pro104 o Ovr1 15 a aproximadamente 1 ug/mL en (DPBS) se incubaron durante la noche a 4°C en cavidades de placas EIA de poliestireno de 96 cavidades. Las placas se lavaron dos veces con salina regulada por Tris con 0.05% de Tween 20, pH 7.4 (TBST). Las cavidades de placa se vaciaron así y la capacidad no específica de unión se bioquó al llenar completamente las cavidades de ensayo con TBST/0.5% de albúmina de suero de bovino (TBST/BSA) y se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Las cavidades de placa se vaciaron así, 100 uL de muestras de medio de cultivo se diluyeron 1 : 1 con TBST/BSA se agregó así a cada cavidad y se incubó por 1 hora a RT. Las cavidades se lavaron así 3 veces con TBST. 100 uL de para-nitrofenilfosfato de sustrato de fosfatasa alcalina (pNPP) (Sigma, Saint Louis, MS) a 1 mg/mL en 1 M de regulador dietanolamina pH 8.9 (Pierce, Rockford, IL) se agregó así a cada cavidad y se incubó por 20 min. a TA. El desarrollo de color se detuvo por adición de 50 uL de 2N de NaOH(cavidad. La actividad de fosfatasa alcalina unida se indicó por el desarrollo de un color amarillo visible. La reacción enzimática se cuantificó al medir la absorción de solución a 405 nm de longitud de onda. Los cultivos que producen los valores de absorción se seleccionaron para expansión y además evaluación. Los cultivos positivos ELISA seleccionados de las placas de 96 cavidades se transfirieron a nuevas placas de cultivo de tejido de 96 cavidades (VWR).
Selección ELISA de MAbs Pro104 Los hibridomas se volvieron a probar para confirmar la producción continua de MAbs específicos de Pro104. Los cultivos de hibridoma con sobrenadantes que producen valores de absorción ELISA de más de 1 .0 con Pro104 y menos de 0.2 con Ovr1 15 se expandieron en cultivo de tejido y se crioconservaron, según se describe anteriormente. Los cultivos específicos de Pro104 seleccionados se subclonaron al limitar la dilución o sorteo de célula única (Coulter Élite) para asegurar la progeny genéticamente estable y uniforme.
Resultados de Selección ELISA de MAbs Pro1 04 Clonados Los clones Pro104.C13, Pro104.C18, Pro104.C25 y Pro104.C55 de la primera inmunización con Pro104 expresado E. coli fueron positivos por ELISA con Pro104 expresado E. coli, Pro104 expresado de insecto, Pro 104 expresado de célula 293T humana con y sin la etiqueta HA (Tabla 1 de abajo) y no reaccionó con las otras proteasas serina humanas tripsina, triptasa de pulmón, y kallikrein (Cal Biochem, San Diego, CA) no plasmina or uroquiinasa (American Diagnostics, Greenwich, CT). Pro1 04.C1 3, Pro1 04.C18, Pro104.C19, Pro104.C25 y Pro104.C55 se subclonaron y se clasificaron por western blot, inmunohistoquímica e inmunofluorescencía. MAbs Pro104.C37 y Pro1 04.C48 se degradaron con uroquinasa humana y no se valuaron más por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Los clones Pro104. D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104. D14, Pro1 04.D18, Pro1 04. D19, Pro104. D31 , Pro104.D43, Pro104. D47, Pro1 04. D51 , Pro1 04. D56, Pro104. D58, Pro104.D64, Pro104. D81 , Pro1 04. D88, Pro104. D91 y Pro104.D94 de la inmunización con el Pro104 expresado de insecto, fueron positivos por ELISA con Pro104 expresado E. coli, Pro104 expresado de insecto, Pro104 expresado de célula 293T humana con y sin la etiqueta HA (Tabla 2) y no reaccionó con las otras proteasas serina humanas tripsina, triptasa de plumón, y kallikrein, plasmina or uroquiinasa véase tabla 2 abajo. Los clones Pro104.D12, Pro104.D15, Pro104.D55, Pro104.D62, Pro104.D68 y Pro104.D106 fueron positivas por ELISA con Pro104 expresado E. coli, Pro104 expresado de insecto y fueron más débilmente reactivos (ELISA OD 405 nm de 0.3-0.8) con Pro104 expresada de célula 293T humana (datos no mostrados), pero no reaccionaron con tripsina pancreática, triptasa de pulón y kallikrein, plasmina o uroquinasa (Tabla 2). Pro104.D20 y Pro104.D21 fueron positivos solamente con proteína Pro104 (293T) de mamífero. Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104.D12, Pro104.D14, Pro104.D18, Pro104.D19, Pro104.D20, Pro104.D21, Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31, Pro104.D43, Pro104.D47, Pro104.D51, Pro104.D55, Pro104.D56, Pro104.D58, Pro104.D62, Pro104.D63, Pro104.D64, Pro104.D68, Pro104.D69, Pro104.D75, Pro104.D81, Pro104.D85, Pro104.D88, Pro104.D91, Pro104.D94, Pro104.D102 y Pro104.D106 se subclonaron y se clasificaron por western blot, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. MAbs Pro104 que se degradaron con uroquinasa humana (Pro104-D29 & Pro104-D31) no se valuaron más por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia.
Selección FACS para Unión de Superficie Celular de MAbs de Serie C Pro1 04 CAOV3 (RT-PCR positive para Pro104) y SKOV3 (RT-PCR negative para Pro104) estirpes de célula de carcinoma ovárico (ATCC) crecieron en DMEM/10% FBS. Antes de la tintación, las células se lavaron una vez con 10 ml de DPBS libre Ca+2/Mg+2 free DPBS y después 7 mi de Celltripper caliente (37°C) (Mediatech, Herndon, VA) se agregó 150 cm2 por matraz. Las células se incubaron así por 5 min. a 37°C tapando el matraz para remover las células estrechamente unidas. Las células se removieron y se pipetaron varias veces para romper agregados, después inmediatamente se colocaron en DMEM/10% de FBS. Las células se centrifugaron por 5 minutos a 1300 rpm y se volvieron a suspender en DMEM/10% de FBS. Las células se incubaron así a 37°C por un período de recuperación de 30 min. Antes de la tintación, la viabilidad de las células se midió utilizando Guava Viacount (Guava Cytometers, Hayward, CA) y si > 90% viable se distribuyeron en placas con fondo en v de 96 cavidades (VWR) para tintación con MAbs. Las células se alicuotaron a 0.5-1 .0x106 células/cavidad en placas con fondo en v de 96 cavidades y se centrifugaron por 22 minutos a 1 500 rpm. Los sobrenadantes se aspiraron y las placas se agitan en resumen en un mezclador de remolino para volver a suspender las células, después un volumen de 200 ul de DPBS/3% FBS/0.01 % Na Azide (FACS buffer) se agregó a cada cavidad. La centrifugación y aspiración se repitió, después 25 ul de volúmenes de sobrenante de hibridoma de MAb purificado se agregaron a las céulas.
Las placas se arremolinaron para volver a suspender las células, se almacenaron en hielo por 1 5 min. , después se lavaron en 200 uL de regulador FACS y se centrifugaron como anteriormente. Este procedimiento de lavado se repitió unas dos veces y después 25 uL de volúmenes de anticuerpo IgG Fe anti-ratón mono conjugado ficoeritrina (PE) (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA) se agregaron a las células. Después de 15 minutos en hielo las células se lavaron una vez, como anteriormente y después se volvieron a suspender en 250 uL de regulador FACS para análisis en el clasificador de célula o citómetro de flujo. En ciertos casos, para almacenamiento durante la noche a 4°C antes del análisis, 133 ul de volúmenes de regulador FACS y 67 uL de 1 % de paraformaldehído/DPBS se agregaron a las cavidades, para fijación, después los volúmenes se aumentaron a 250 uL con DPBS. Las células tintadas se analizaron en un clasificador de célula activada fluorescente Élite (FACS) (Beckman-Coulter, Miami, FL). Los resultados que demuestran la unión de superficie celular de varias de los MAbs de serie C por FACS inmunofluorescente y análisis microscópico, se resumen en la Tabla 1 . Además, los datos de microscopía de inmunoflouorescencia con estirpes de célula tumoral humana se presentna abajo. Los isotipos de los MAbs de serie C se determinaron utilizando equipos de prueba de inmunoensayo de isotipo de anticuerpo monoclonal de ratón comercialmente disponible (IsoStrip, Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN). Los resultados de isotipo se enlistan en la Tabla 1 .
TABLA 1 : ISOTIPO, ELISA, INMUNOFLUORESCENCIA FACS & RESULTADOS DE MICROSCOPÍA DE MAbs SERIE C Pro104 *4=Fuerte co-localización con HA sin tintación de antecedente de células 293T no transfectadas, 3=fuerte localización con HA y tintación de antecedente de células 293T no transfectadas, 2=Co-localización parcial con HA y tintación de anteceente de células 293T no transfectadas, 1 =tintación HA débil (posiblemente bloqueada por MAb de prueba) & tintación de antecedente alta de células 293T no transfectadas.
TABLA 2: RESULTADOS DE SELECCIÓN ELISA DE LOS MAbs de Serie D Pro1 04 Selección FACS para Unión de Superficie Celular de MAbs Serie D v K Pro104 Cincuenta millones de células 293F se transfectaron por una preparación de complejos de ADN lípidos al realizar una dilución de 50 µg de ADN de plásmido en medio de suero reducido Opti-MEM I (GIBCO) a un volumen total de 1 .5 ml seguido por mezclado suave. Una dilución de 75 µl de 293 Fectina (Invitrogen) en Opti-MEM I a un volumen total de 1 .5 ml se mezcló suavemente y se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente. Después la incubación de 5 minutos, el ADN diluido se mezcló con la 293fectina diluida. Esta mezcla se dejó incubar por 20-30 minutos a temperatura ambiente para permitir que los complejos de ADN-293fectina. Mientras que los complejos de ADN-293fectina se incubaron, una alícuota de 50 ml de suspensión celular (1 E6 células viables/ml) se colocó en un matraz desechable, estéril. Después de que la incubación de complejo ADN-293fetina se completó, estos se transfirieron a cada matraz de células. Los matraces se incubaron en una incubadora de 37°C con agitación a 120 rpm. Las células se utilizaron para experimentos de tintación a aproximadamente 48 horas de post-transfección. La secuencia de ADN utilizada para transfectar las células 293F fue secuencia Pro104 de longitud completa (met1 a val314), sin etiquetas, véase SEQ ID NO:3 anterior. Antes de la tintación, la viabilidad de las células de control y 293F se midió utilizando Guava Viacount (Guava Technologies, Hayward, CA) y si >9% fueran viables, se distribuyeron en placas con fondo en v de 96 cavidades (VWR) para tintación con MAbs. Las células se alicuotaron a 0.5-1 .0x106 células/cavidad en placas con fondo en v de 96 cavidades y se centrifugaron por 2 minutos a 1500 rpm. Los sobrenadantes se aspiraron y las placas se agitaron brevemente en un mezclador de remolino para volver a suspender las células, después 200 ul de DPBS/3% FBS/0.01 % Na Azide (regulador FACS) se agregó a cada cavidad. La centrifugación y aspiración se repitió, después 25 ul de sobrenadante de hibridoma de 1 ug/millón de células de MAb purificado se agregó a las células. Las placas se almacenaron en hielo por 15 min. , después se lavaron y se centrifugaron según anteriormente, en 200 ul de regulador FACS. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces y después 25 uL de anticuerpo conjugado por biotina de Ig anti-ratón de cabra (H+L) (Caltag Laboratories, Burlingame, CA) se agregó a las cavidades por 15 minutos y se lavó según anteriormente. 25 ul de Streptavidina ficoeritrina (PESA) se agregó a las células. Después de 15 minutos en hielo, las células se lavaron dos veces, según anteriormente y después se volvieron a suspender en 250 uL de regulador FACS para análisis en el clasificador de célula o citómetro de flujo. Las células tintadas se analizaron en un clasificador de célula activada por fluorescencia Élite (Beckman-Coulter, Miami, FL). Los resultados que demuestran la unión de superficie celular de varios MAbs de serie D y serie K por análisis FACS, se enlistan en las Tablas 3A, 3B, y 3C de abajo. Los resultados de experimentos representativos que demuestran la expresión de superficie celular por análisis FACS se representan en la Figura 1 (A y B) y Figura 2 (A y B). Específicamente, la Figura 1 A demuestra la unión de superficie celular del anticuerpo Pro104. D1 16.1 a células 293F transitoriamente transfectadas en comparación a un anticuerpo de control (Ovr1 10.A57.1 ). La Figura 1 B indica la unión observada en la Figura 1A es específica para Pro104. Además, la Figura 2A demuestra la unión de superficie celular del anticuerpo Pro104.D1 18.1 a las células 293F transitoriamente transfectadas en comparación a un anticuerpo de control (Ovr1 1 0.A57.1 ). La Figura 2B indica la unión observada en la Figura 2A es específica para Pro104. La unión de MAb Pro1 04. D1 16.1 dio como resultado 85% de células 293F humanas transfectadas Pro1 04 siendo positivas, con una MFI (intensidad de fluorescencia promedio) 9 veces más alta que las células tintadas con un anticuerpo de control solo (Ovr110.A57.1). La unión de Pro104.D118.1 dio como resultado la distribución bimodal con 70% de las células siendo positivas para Pro104 y una intensidad de fluorescencia promedio 22 veces más alta que el anticuerpo de control. Los otros anticuerpos de Serie D que se unen significativamente a las células transfectadas Pro104-293F y no a las células no transfectadas 293F fueron Pro104.D9.1, Pro104.D112.1 Pro104.D113.1, Pro104.D114.1 , Pro104.D115.1, Pro104.D119.1 Pro104.D120.1 Pro104.D121.1, Pro104.D122.1 Pro104.D123.1 Pro104.D124.1 Pro104.D125.1, Pro104.D126.1 Pro104.D127.1 Pro104.D129.1 Pro104.D130.1, Pro104.D131.1 Pro104.D132.1 Pro104.D133.1 Pro104.D134.1, Pro104.D135.1 Pro104.D136.1 Pro104.D137.1 Pro104.D138.1, y Pro104.D139.1 (véase tabla 3A de abajo).
Tabla 3A. Unión de Superficie Celular de MAbs de Serie D Pro104 a Células 293F Transfectadas Pro104 El anticuerpo Pro104. K81 (de la serie K) también se une a 293F transitoriamente transfectadas con Pro1 04. Aproximadamente 54% de las células fueron positivas con una intensidad de fluorescencia promedio de 1.69 que fue 3 veces más que el anticuerpote control negativo. Los otros anticuerpos de Serie K que se unen significativamente a células transfectadas Pro104-293F y no a células no transfectadas 293F fueron Pro104.K72, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K88, Pro104.K156, Pro104.K159, Pro104.K164 y Pro104.K176 (véase Tabla 3B de abajo).
Tabla 3B. Unión de Superficie Celular de MAbs de Serie K Pro104 a Células 293F Transfectadas Pro104 Los anticuerpos de serie D y serie K Pro104 también se probaron en estirpes de célula que fueron QPCR positivos para transcripción Pro104 (HeLa) y QPCR negativos para transcrición Pro104 (HCT1 16). Pro104.K81 unido a 97% de HeLa y a 9% de células HCT1 16, con un cambio de 8 veces más en intensidad de fluorescencia promedio (véase tabla 3C de abajo).
Tabla 3C. Unión de Superficie Celular de MAbs de Serie D y Serie K Pro104 para Estirpe de Célula de QPCR Positivo de Pro104 HeLa Estos resultados indicant que los anticuerpos en las Tablas 3A, 3B y 3C y, en particular, MAb Pro104. K81 son adecuados para la inmunoterapia de tumors con o sin fármacos conjugados, toxinas, enzimas, moléculas activadoras de profármaco o isótopos.
Análisis de Afinidad Mab Pro 104 Las cinéticas de unión y constantes de afinidad se calcularon de mediciones de resonancia de plasmón de superficie utilizando un instrumento BIACORE 3000 (Biacore, Piscataway, NJ). Los experimentos se diseñaron para generar valores en tasa, fuera de tasa, y afinidad para los MAbs Pro104. La proteína Pro1 04 # de lote 060402 (diaDexus) se inmovilizó en célula de flujo 2 de un chip sensor CM5 (Biacore) mediante acoplamiento de amina estándar (Biacore). La célula de flujo 1 se utilizó como una superficie blanca para sustracciones de referencia, y se activó y después se inactivo con etanolamina. Los MAbs Pro1 04 se diluyeron en regulador HBS EP (Biacore) y pasaron sobre células de flujo 1 y 2 en serie. Los MAbs se inyectaron en duplicado, secuencialmente, para cada una de las cinco concentraciones: 200, 1 00, 50, 25, 12.5ug/mL. Asumiendo un peso molecular para los MAbs de 158,000 kDa, las concentraciones respectivas en nM se calculó que fueran: 1266, 633, 317, 158 y 79. Los MAbs se inyectaron por 3 minutos a 30 uL/min seguido por un tiempo de disociación de 12 minutos. La regeneración de la superficie de chip, o remoción de Mab entre ciclos, se realizó al pasar dos inyecciones de 100 mM de Glicina pH 1 .5 a través de las células de flujo primeramente por 30 segundos y después por 12 segundos, ambos en 100 uL/minuto. El procedimiento anterior se realizó al utilizar el análisis cinético Biacore incluido en el software de control Biacore. Los sensogramas resultantes se fijaron automáticamente, asumiendo un modelo de unión 1 : 1 Langmuri. Los resultados presentados en la Tabla 4 de abajo se calcularon utilizando la función de procesamiento de datos inteligente. Las afinidades calculadas en la Tabla 3 se encontraron todas en el rango 10"9M excepto por Pro104.C34 y de allí fueron lo suficientemente altas para lograr una dosis terapéutica in vivo al menos de o igual a 10 mg/kg , exceptuando por Pro1 04.C34.
TABLA 4: Afinidades de Mab Serie C de Pro104 Western Blots Los extractos de proteína para el análisis western blot se prepararon en regulador de lisis de célula (1 % de NP-40/10 mM Fosfato de sodio pH 7.2/ 150 mM cloruro sódico) de estirpes de célula transfectantes transitorias y adenocarcinoma de mamífero de Pro104- 293T. Las proteínas se separaron por electroforesis en NuPAGE 4- 12% geles Bis-Tris (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) bajo condiciones de desnaturalización en aparato de célula Novex-XCell II Minicell (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) y subsecuentemente se transfiere a membranas PVDF utilizando un Módulo blot Xcell II (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Siguiente a la transferencia de proteínas, las membranas se bloquearon en 1 % de reactivo de bloqueo (Cat. #1 096 176, Roche Diagnostic Corp. , Indianapolis, IN) y se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primaries purificados Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C25, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C48, Pro104.C55, Pro104.C60 or Pro104.C66, y después IgG anti-ratón de cabra conjugado por peroxidasa de rábano picante (Cat. #1 15-036-062, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.). Las marcas se visualizaron por quimioluminescencia utilizando un equipo de detección western blot de avance ECL (Cat. #RPN2135, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Los experimentos de deglicosilación se realizaron en extractos de proteína de transfectantes Pro104-293T, estirpes de célula de adenocarcinoma de mamífero y testículos humanos normales al tratar con péptido N-glicosidasa F (PNGaseF, Cat. #P0704S, New England Biolabs, I nc, Beverly, MA) según se dirige por el fabricante. Las muestras deglicosiladas se analizaron así por western blot según se describe anteriormente. En resumen, 100 ug de volúmenes de extractos de proteína se desnaturalizaron en regulador de desnaturalización de glicoproteína (0.5% de SDS/ 1 % de beta-mercaptoetanol), a 100°C por 10 minutos. Esto se siguió por la adición de reguladores de reacción en equipo (New England Biolabs) a una concentración final de 1 % de NP-40 y 50 mM de fosfato de sodio, adición de 100 unidades de PNGase F y incubación a 37°C por 4 horas.
TABLA 5: RESULTADOS DE WESTERN BLOTS UTILIZANDO MABS PRO104 CON EXTRACTOS DE CÉLULAS 293T TRANSFECTADAS & ESTIRPES DE CÉLU LA ADENOCARCINOMA HUMANO.
Los resultados de los experimentos western blot se resumen en la Tabla 5 anterior. En listados de célula total de transfectantes Pro104-293T, los MAbs Pro1 04.C4, Pro104.C13, Pro104.C18, Pro 1 04.C19, Pro1 04.C25, Pro1 04.C34, Pro1 04.C37, Pro104.C48, Pro104. C55 y Pro1 04.C60 reaccionaron específicamente con varias bandas de proteína de aproximadamente 35 kDa a 40 kDa, los cuales fueron consistentes con formas glicosilatados de Pro104 formados después del procesamiento de Pro104/testisin de longitud completa. Estas marcas se encontraron ausentes en la muestra de estirpe de célula 293T no transfectada. Pro1 04 MAb-C66 no fue reactivo por análisis western blot y por lo tanto se eliminó de estudios adicionales. Una marca de proteína a aproximadamente 38 kDa se detectó por MAbs Pro104.C25, Pro104.C55 y Pro104.C37 en lisados de estirpes de célula de cáncer positivos de mARN Pro104 (RT-PCR+) HeLa y CaOv3 (ATCC), pero fue ausente según se espera, en lisados de la estirpe de célula de cáncer ovárico negativo RT-PCR SkOv3 (ATCC). De igual forma, los MAbs Pro104.C25 y Pro104.C55 detectaron una banda del peso molecular pronosticado (38 kDa), en lisado de testículos humanos normales (datos no mostrados). MAbs Pro104.C25 y Pro104.C55 también reaccionaron con testisín de ratón nativo y recombinante (datos no mostrados), en western blots. En western blots en deglicosilatadolisados de transfectantes Pro1 04, las estirpes de célula positivas RT-PCR y testículos humanos normales, la migración de la proteína Pro104 egún se detecta por Pro104.C25, se cambió de aproximadamente 38-40 kDa (glicosilado) a aproximadamente 30 kDa (no glicosilado). Esta reducción en peso molecular de Pro104 es consistente con la predicción de tres sitios N-glicosilación en la sub-unidad catalítica de proteína Pro104.
Ejemplo 2: Unión de superficie celular de MAbs Pro104 en Células Cancerígenas Vivas Demostrada por Inmunofluorescencia Las siguientes estirpes de célula de cáncer se utilizaron en este estudio y se obtuvieron de ATCC: Cervical (HeLa), Ovárico (Tov-1 12D, Tov-21 G, CaOV-3 y SKOV-3), colon (HCT1 16) así como también el pancreático (MÍA Paca-2 y AsPC). Las estirpes de célula HeLa, CaOV-3 expresan ARN Pro104 según se determina por QPCR. Las células de control HCT1 16 y SKOV-3 no expresan ARN Pro104. Las estirpes de célula anteriores se cultivaron en portaobjetos de vidrio de 1 8 mm estériles y cultivados a 37°C en DMEM/10% de FBS con penicilina y estreptomicina por 48 h antes del tratamiento con los anticuerpos primarios (Pro104 MAbs). Los MAbs Pro104.C1 9.1 , Pro104. C25.1 , Pro104.C55.1 y Pro104. D9 se probaron para microscopía de inmunofluorescencia para determinar cuáles de anticuerpos se unen específicamente a la superficie celular de células cancerígenas que expresan Pro104. Los MAbs primarios se agregaron al medio a una concentración final de 10 ug/ml y se incubaron por una hora a 37°C. Siguiente a la fijación con 3% de formaldehído en Salina Regulada por Fosfato (PBS), las células se incubaron con un anti-ratón de mono marcado Cy3 secundario (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) a una concentración de 5ug/ml for 30 min. Siguiente al lavado, las células se montan en Vectastain (Vector, Burlingame, CA), un medio que contiene DAPI para visualizar los núcleos de célula y observarse en un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiophot (Cari Zeiss, Thornwood, NY) equipado con los filtros fluorescentes adecuados. Las micrografías se registraron utilizando una cámara CCD. Pro104.C19.1 , Pro104.C25.1 , Pro104.C55.1 y Pro104.D9 todos se unen a células que expresan Pro1 04. Las Figuras 3A y 3B demuestran la unión de células HeLa Pro104.C19.1 (Fig. 3A). La mayoría de las células en el campo mostró marcado para Pro104. Pro104.C19.1 podría claramente observarse decorando la membrana celular de las células (flechas). Sin embargo, Pro104.C19.1 no se unen a las células de control negativo (Fig . 3B, N indica la posición del núcleo celular).
Unión e Internalización en Células Cancerígenas Vivas por Anticuerpos Conjugados Cy3 Este estudio se realizó utilizando anticuerpos fluorescentes directamente conjugados (MAbs). Al utilizar anticuerpos directamente conjugados con el tinte fluorescente Cy3, la unión de anticuerpo e internalización puede visualizarse por microscopía de fluorescencia. Esta tecnología se conoce bien en la materia. Las células SKOV-3 que no expresan Pro104 (QPCR negativo) se utilizaron como controles negativos. Conjugación Cy3 Los MAbs se conjugaron cada uno a Cy3. La conjugación Cy3 se llevó a cabo de acuerdo a los procedimientos estándares en las directrices del fabricante (Pierce). En resumen, 1 mg de anticuerpo se dializó contra 0.1 M de regulador de bicarbonato (pH 9.3) por 60 min, se mezcló con tinte Cy3 y se incubó a RT por 2 h, después se transfirió a un cásete de Diálisis Slide-A lyzer (Pierce) y se dializó en 2 litros de PBS por 6 hr. a 4°C. El regulador de diálisis se reemplazó y la diálisis se repitió 6 veces. Los anticuerpos conjugados Cy3 se recuperaron y la concentración se midió en un espectrómetro a 280 nm.
Etiquetado de Célula Los MAbs Cy3-Pro104.C1 9.1 , Cy3-Pro104.C25.1 y Cy3-Pro104.A55.1 se incubaron con las células a una concentración de 10 ug/ml a 37°C en cámaras de agua por 60 min. y después los portaobjetos con células se lavaron en PBS y las células se fijaron con 3% de formaldehído en PBS por 1 0 min. Siguiente a la fijación, los portaobjetos con las células se montaron en un medio que contiene DAPI (Vectastain) para visualizar el núcleo celular y las células observadas utilizando un microscopio de Fluorescencia Zeiss Axiophot equipado con los filtrados fluorescentes adecuados. Las micrografías se obtuvieron con una cámara CCD.
Resultados La microscopía de inmunofluorescencia de células cancerígenas tratadas con Cy3-Pro104.C19.1 , Cy3-Pro1 04.C25.1 y Cy3-Pro104.A55.1 indicó que las células cancerígenas pancreáticas y ováricas que expresan Pro104 fueron capaces de unirse e internarse en los anticuerpos fluorescentes. La Figura 4A muestra la unión de Cy3-Pro1 04.C25.1 a la superficie celular de células HeLa (flechas), una estirpe de célula que expresa Pro104. El anticuerpo Cy3-Pro104.C25.1 no se unión alas células de control SKOV-3 que no expresan Pro104. Véase Figura 4B, N indica los núcleos de varias células no marcadas. La Figura 5 demuestra que, siguiente a la unión a la membrane celular, Cy3-Pro104.C25.1 se internó en células HeLa vivas y que las vesículas de internalización podrían observarse en el citoplasma de estas células. En particular, las vesículas podrían visualizarse frecuentemente en proximidad cercana al núcleo celular (N) (flecha). Las Figuras 6A y Figuras 7A muestran la unión e internalización de Cy3-Pro1 04.19.1 y Cy3-Pro104.C55.1 en células MIA-PaCa-2, respectivamente. Las células MIA-PaCa-2 son una estirpe de célula pancreática que expresan Pro104. El patrón de internalización se caracterizó por la presencia de vesículas perinucleares que probablemente corresponden a endosomas ubicados en la proximidad del aparato Golgi (flechas). Cy3-Pro104.C19.1 y Cy3-Pro104.C55.1 no se unen a las células de la estirpe de célula de control HCT-1 1 6 que no expresa Pro104 (Figuras 6B y 7B). Los MAbs MAbs Pro104. C19.1 , Pro104.C25.1 y Pro104.A55.1 conjugados por Cys todos se internaron en la unión a la superficie celular de células cancerígenas que expresan, in vivo. Estos resultados indican anticuerpos anti-Pro104, y en particular, los MAbs Pro104.C1 9.1 , Pro104.C25.1 y Pro1 04.A55.1 MAbs son adecuados para inmunoterapia de tumores con o sin fármacos conjugados, enzimas, moléculas activadoras de profármaco o isótopos.
Distribución de Pro104 en Tumores v Tejidos Normales Por Inmunohistoquimica (IHC) Los bloques incluidos de parafina fija de formalina de cáncer pancreático y ovárico y tejidos normales adyacentes se obtuvieron del Intercambio de Investigación de Enfermedad Nacional (Filadelfia, PA). Bloques incluidos de OCT de órganos normales se obtuvieron de Zoion (Hawthorne, NY).
Tintación inmunohistoquímica para secciones incluidas de parafina fija formalina Seis µm de secciones gruesas cortadas de bloques incluidos de parafina fija formalina se calientan a 45°C por 15 min, se desparafinizan en Histoclear (National Diagnostics, Atlanta, GA), se vuelven a rehidratar a través de una serie de concentraciones de etanoi reductoras a PBS. La recuperación de antígeno se realizó al hervir las cubiertas de sección en 10 mM de regulador de citrato de sodio (pH 6.0), a 120°C, 1 5-17 PSI en una cámara de desrecubrimiento (Biocare, Walnut Creek, CA) por 1 0 min. La actividad de peroxidasa endógena se enfrió rápidamente al tratar las secciones con 3% de solución de peróxido de hidrógeno por 15 min. Las cubiertas se incubaron con 1 % de BSA para bloquear la unión de anticuerpo no específico y después reaccionaron con los MAbs Pro 104 primaros utilizados en una concentración de 10 ug/ml por 1 hora a temperatura ambiente en un auto-tintador DAKO (Dako Co., Carpintería, CA). Después de lavarse en Salina Regulada por Tris (TBS) con 0.5% de Tween 20, las cubiertas se incubaron así con IgG anti-ratón conjugado para peroxidasa de rábano picante (HRP) (Immunovision technologies, Daly City, CA). Después de lavarse en TBS con 0.5% de Tween-20, las secciones se trataron por cromagen 3,3'-diaminobenzidina por 2-5 minutos (Immunovision Technologies) y se contratintaron con hematoxilina antes de montarse en medio Permount (American Master Tech Scientific, Inc, Lodi, CA) después de la deshidratación. El IgG de ratón normal en la misma concentración como el anticuerpo primario, sirvió como un control negativo para la especificidad de inmunomarcado. Además de los experimentos de control, los MAbs Pro104 se incubaron con el antígeno Pro104 antes de aplicarse a las secciones histológicas.
Tintación Inmunohistoquímica para secciones no fijas congeladas incluidas por OCT Las cubiertas se cortaron en la criocámara a 5-8 um a una temperatura adecuada, se secaron por aire por un mínimo de treinta minutos a temperatura ambiente. En resumen, las cubiertas se enjuagaron en TBS para remover OCT y se incubaron a temperatura ambiente. I HC se realizó utilizando el Equipo Immunovision Powervision (Immunovision Technologies, Co. Daly City, CA). En resumen, las cubiertas se enjuagaron en TBS-T para remover el OCT y se incubaron con anticuerpos primaries Pro104 por 1 hora a temperature ambiente. Se post-fijaron así en 4% de paraformaldehído fijador por 1 0 min a temperatura ambiente y se trataron según se describe anteriormente.
Resultados Pro104.C25.1 , Pro1 04.A55.1 , Pro104.D9 y Pro104. D133 se utilizaron para inmunomarcar las secciones de cáncer ovárico y pancreático. Las células epiteliales en los tumores pancreáticos y ováricos pero no en ovario y páncreas normales se marcaron. Pro104.C25.1 marcó la superficie celular de 1 0 fuera de 17 (58%) de cáncer ovárico seroso y 1 1 /1 1 (1 00%) de muestras clínicas de cáncer pancreático. Pro104.C55.1 marcó la superficie celular de 6 fuera de 8 (75%) cáncer ovárico y 3/3 (100%) de muestras clínicas de cáncer pancreático. Pro 104. D9 marcó la superficie celular en 1/4 de cáncer ovárico (25%). Las Figuras 8A, 8B, 8C y 8D ilustran los resultados ICH obtenidos con Pro1 04.C25.1 en dos muestras clínicas de cáncer ovárico (Figuras 8A y 8C). Los ovarios normales de control no se marcaron por el MAb Pro104.C25.1 (Figuras 8B y 8D). La Figura 9 muestra una magnificación mayor de una sección histológica de cáncer ovárico marcada con Pro104.C25.1 . El marcado claramente ubicado en la membrana celular de las células epiteliales (flechas). La Figura 1 0 demuestra que Pro1 04. D9 marcó la superficie celular de células cancerígenas ováricas (flecha). Adicionalmente la Figura 1 1 muestra que Pro104.D133 marcó la superficie celular de células cancerígenas ováricas cerosas. Las Figuras 12A y 12C ilustran el modele de inmunomarcado obtenio con Pro104.C25.1 en muestras clínicas de adenocarcinoma. El marcado Pro1 04 se restringió mayormente a la superficie celular de células epiteliales (flechas) con marcado citoplásmico ocasional (Figura 12C). Las células pancreáticas normales se evitan mayormente de marcado específico (Figuras 12B y 12D). Adicionalmente, la Figura 13 muestra que no se observó marcado específico cuando el IgG de ratón normal se utilizó en lugar de Pro104.C25 (Figura 13A) o cuando Pro1 04.C25.1 se absorbió con antígeno Pro1 04 antes del procesamiento para IHC (Figura 13B). La expresión de Pro104 también se analizó en órganos normales. ICH en secciones congeladas OCT no mostraron marcado detectable en la superficie celular en las células de corazón normal, hígado, riñon, cerebro, colon, estómago, pulmón, próstata, ovario, páncreas, y mama. Sin embargo, la membrana de las células germinales en los testículos mostró fuerte inmunomarcado Pro104. Este resultado se esperó de los datos publicados en la literatura científica (J. D. Hooper et al. Testisin, un anueva protease serina humana expresada por células germinales testitulares premeyóticas y pérdidas en tumores de célula germinal testicular. Cáncer Research 59:3199-3205 (1999)). Véase table 6 de abajo para resumen.
TABLA 6: Resumen de los Resultados ICH para MAbs de Serie D de Pro104 Resultados de Inmunoquímica de MAb D Pro104 mAb Dilución OCT no fijo Formalina fija Clon (ug/ml) (FFPE) Órganos vitales normales incluyen corazón, hígado y riñon. Los resultados de inmunoquímica anteriormente demuestran que Pro104 se expresa en un alto porcentaje de casos de cáncer pancreático y ovárico. El hecho de que Pro104 se expresa en la superficie celular de células cancerígenas lo hace un objetivo ideal para terapia basada en anticuerpos. Adicionalmente, la unión de los anticuerpos anti-Pro 104 a células cancerígenas ováricas y pancreáticas demostradas por I HC indica los anticuerpos anti-Pro104, y en particular, los MAbs Pro1 04.C25.1 , Pro104. D9 y Pro1 04.D133 MAbs son adecuados para inmunoterapia de turmores con o sin fármacos conjugados, toxinas, enzimas, moléculas moduladoras de profármaco o isótopos.
Ejemplo 3: Detección de Pro104 por ELISA Intercalado Monoclonal de Ratón Tablero Competitivo Pro1 04 ELISA Las placas de poliestireno (Corning Life Sciences (MA)) se revistieron durante la noche a 4°C con 1 µg/cavidad de anti-Pro104 MAb. La solución de revestimiento se aspiró y los sitios de unión libre se bloquearon al agregar 300 µl/cavidad deSuperblock-TBS (Pierce Biotechnology, Illinois) por 1 hora a RT. Después d elavarse dos veces con regulador de Lavado (1 x TBS/0.05%Tween20), 100 µl de volúmenes de antígeno Pro104 se agregaron a cada cavidad. Cada par se probó con 100 ng/ml y 0 ng/ml de proteína expresada E. coli Pro1 04 recombinante diluida en Regulador de Ensayo (1 XTBS, 1 % BSA/ 1 % Suero de ratón/ 1 % Suero de cabra/ 0.1 % Tween20). Después de la adición, las placas se incubaron por 1 hora a RT con agitación, y se lavaron 4 x con 360 µl de Regulador de Lavado. Después 50 µl de volúmenes de MAb de detección biotintada se agregaron a cada cavidad y las placas se incubaron por 1 hora a RT, con agitación. Después de lavarse, 1 00 µl de volúmenes de estraptividina conjugada por fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, dilución 1 :2000) se agregaron a las cavidades y las placas se incubaron por 30 min. a RT, con agitación. Después de lavarse, la placa se desarrolló así utilizando el sustrato pNPP en el regulador 1 X DEA (Pierce Biotechnology, Illinois) por 30 min. a RT. La reacción se detuvo al agregar 100 µl/cavidad de 1 N NaOH, y las placas se leyeron a 405 nm utilizando un lector de placas Spectramax 190 (Molecular Devices, CA). Las lecturas OD a 405 nm se utilizaron para calcular la proporción de señal a ruido (OD a 100 ng/mL dividido por OD a 0 ng/mL) de cada uno de los pares Ab. Los resultados del tablero ELISA prueban que 13 MAb se muestran en la Tabla 7 de abajo. Cada anticuerpo se utilizó como un revestimiento así como también para detectar un anticuerpo en posibles combinaciones. Todos los pares se probaron en duplicado en 100 y 0 ng de proteína E. coli Pro104 en regulador de ensayo (conteniendo suero de ratón, suero de cabra y BSA a utilizarse como blanco). Los resultados se muestran como proporción de señal/ruido (solo regulador de ensayo). Durante la incubación con el anticuerpo de detección, una concentración de 10 veces más de anticuerpo de revestimiento se agregó a las cavidades para prevenir el auto-emparejado. El auto-emparejado puede observarse cuando los antígenos se multimerizan parcialmente y pueden confundir los resultados de emparejado MAb. Al realizar el ensayo ELISA bajo condiciones competitivas se asegura que los anticuerpos no pueden unirse a los mismos o próximos epítopos cuando el antígeno se agrega. Los datos sugieren un mínimo de cinco epítopos que se hayan identificado ya que el obstáculo estérico también puede ser un factor de contribución para el no emparejado de MAbs. El mapa de epítopo de los MAbs Pro14 derivado de los resultados en la Tabla 7 se muestra en la Figura 14. Más del 50% de anticuerpos monoclonales (Pro104.C4, Pro104.C1 8, Pro104.C25, Pro104.C37, Pro104.C48 y Pro 1 04.C60) reaccionan con un epítopo o epítopos próximos suficientes para originar el obstáculo estérico y así bloquear el emparejado MAb en este ensayo. Los MAbs Pro104.C34 y Pro1 04.C13 ambos reaccionan con epítopos que fueron distintos de entre sí y distintos de otros epítopos de grupos MAb. Los MAbs Pro104.C55 y Pro104.C1 9 reaccionaron con un epítopo o dos epítopos próximos que estuvieron lo suficientemente cerca al epítopo identificado por Pro104.C66 para originar el bloqueo parcial. Los MAbs Pro1 04.C55 y Pro104.C19 también reaccionaron con un epítopo o epítopos que estuvieron lo suficientemente cercanos al epítopo o epítopos identificados por el grupo MAb Pro1 04.C4, Pro104.C18, Pro104.C25, Pro104.C37, Pro1 04.C48 y Pro104.C60 para originar el bloqueo parcial. Sin embargo, MAb Pro1 04. C66 reaccionó con un epítopo que estuvo lo suficientemente distante del epítopo o epítopos identificados por Pro104. C4, Pro104. C18, Pro104. C25, Pro104. C37, Pro1 04.C48 y Pro1 04.C60 para permitir el emparejado con MAbs de este grupo. Varias combinaciones de MAb diferentes se prueba que establecen un ensayo ELISA intercalado para la detección de Pro104 nativo de medio o lisados de estirpes de célula cancerígena, estirpes de célula transfectadas y tejidos cancerosos. Los pares Pro104.C19/ C48 y Pro1 04.C55/C34 se realizaron mejor en ELISA intercalado con una sensibilidad para pro104 recombinante a aproximadamente 1 ng/ml. Pro1 04 se detectó por ELISA intercalado en lisados de detergente CHAPS (Pierce) de células cancerígenas ováricas CaOV3 positivas por RT-PCR, células cancerígenas cervicales HeLa positivas por RT-PCR y en lisados de células LMTK y 293T transfectadas por Pro104, 48 horas de post transfección. Pro1 04 no se detectó en lisados de la estirpe de célula de cáncer de próstata PC3 (ATCC) ni de la estirpe de cáncer de colon HT29 (ATCC), que son Pro104 negativos por RT-PCR. Estos resultaods también fueron de acuerdo con los datos de inmunofluorescencia. Sin embargo, la proteína Pro1 04 podría no detectarse en el medio de cultivo de tejido de cualquiera de estas estirpes de célula cancerígena, o en el medio de células transfectadas por Pro1 04, en 48 horas de post-transfección.
TABLA 7: Identificación de Pares MAb ELISA de Pro104 por ELISA competencia *Proporción de señal a ruido (OD a 100 ng/mL divido por OD a 0 ng/mL (solo regulador de ensayo)).
Ejemplo 4: Detección de Proteína Pro104 y Fosforilación de Receptor EGF Detección de Proteína Pro104 en Estirpes de Célula y Tumores Ováricos por Western Blot Las estirpes de célula Rk3E, HeLa, AsPC1 y HT29 cells se evaluaron para la expresión de Pro1 04. Las estirpes de célula RK3E y HT29 son negativos para mARN Pro104. Como un control RK3E se transfectó con Pro104 (RK3E-104) utilizando métodos conocidos en la materia. Como un adicional, las células de control RK3E también se transfectaron con Fosfatasa Alcalina (RK3E-AP). HeLa y AsPC1 son positivos para mARN Pro1 04. Además de las estirpes de célula, el tejido adyacente normal y tumoral ovárico al tumor se evaluó por la presencia de Pro104. Los extractos celulares se prepararon en hielo utiliando regulador RI PA modificado (1 % NP40, 1 0mM Na2PO4, 0.15M NaCl) más un cocktail inhibidor de proetasa (Roche Inc.). Entre 20 y 50 ug de extracto de proteína se utilizaron para cada línea de gel; las concentraciones equivalentes de proteína se evaluaron para comparaciones de nivel de proteína en el mismo gel. Los extractos clarificados se mezclaron con un volumen igual de 2x de regulador de muestra Laemmli concentrado (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), se calentó a 70°C por 10 minutos y después se analizó utilizando pre-fusión 4-12% de minigeles poliacrilamida-SDS (Nupage; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) con regulador de ejecución MES (Nupage; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) . Los geles se transfirieron a membranas PVDF Immovilon-P con un tamaño de poro de 0.45 µm (I nvitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) utilizando un regulador de transferencia 1 X más 10 % de metanol. Las membranas se enjuagaron y se bloquearon por 1 hora a temperatura ambiente utilizando 5% de leche láctea no grasosa en PBS con 0.05% de Tween 20. Un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra Pro104 se produjo en alojamiento utilizando proteína Pro104 bacteriana recombinante. El anticuerpo monoclonal Pro104 se diluyó 1 : 1000 para una concentración final de 1 ug/ml y un anticuerpo monoclonal de ratón contra GAPDH (Chemicon Inc. , Temecula, CA) se diluyó a 1 :5000 (por una concentración final de 0.2 ug/ml). Siguiendo la incubación de anticuerpo primario, las membranas se lavaron cuatro veces a temperatura ambiente por 1 0 min. cada una en 1 XPBS con 0.05% de Tween-20. La inmunoglobulina anti-ratón de cabra unido por peroxidasa de rábano picante (Jackson Lab Inc. , Bar Harbor, ME) se utilizó (1 : 10,000 de dilución) en 5% de leche seca sin grasa en PBS más 0.05% de Tween-20 por 1 hora a temperatura ambiente para detectar el anticuerpo monoclonal primario. Las membranas se lavaron finalmente cuatro veces por 10 min. en 1 X de PBS más 0.05% de Tween-20 seguido por detección utilizando quimioluminescencia mejorada (ECL) reactivo para direcciones de fabricante (Amersham, Piscataway, NJ) y exposición a la película rayos X (Kodak, Rochester, NY). Para el experimento de Western inmunomanchado en comparación a las células RK3D infectadas con un retrovirus que expresa AP (fosfatasa alcalina) con las mismas células con un retrovirus que expresa Pro104, las células se laminaron en medio de crecimiento conteniendo ya sea 1 % o 1 0% de FBS por 48 horas. Los extractos de célula se prepararon utilizando el regulador RIPA modificado que incluye inhibidor cocktail (Calbiochem) y 25 ug de extracto clarificado evaluado por SDS-PAGE y Western Inmunomancha con un anticuerpo policlonale specífico para el receptor EGF fosforilado (BioSource International, Camarillo, CA). La figura 15A demuestra por western blot que la proteína Pro140 se detecta en estirpes de células transfectadas Pro104 (RK3E-104) y estirpes de células nativamente expresando Pro104 (HeLa y AsPC1 ). La proteína Pro104 no se detecta en estirpes de célula transfectadas AP (Rk3E-AP) y estirpes de célula negativa mARN (HT29). Adicionalmente, la Figura 15B ¡lustra la detección de la proteína Pro1 04 por western blot en tejidos de tumor ovárico pero no en tejidos adyacentes normales. El hecho de que Pro104 es detectable en estirpes de célula de cáncer y tejido de tumor ovárico hace un objetivo ideal para terapia a base de anticuerpo. Anticuerpos anti-Pro104 son adecuados para inmunoterapia de tumores con o sin fármacos conjugados, toxinas, enzimas, moléculas que activan profármaco o isótopos. Fosforilación de Receptor EGF Las estirpes de célula transfectadas RK3E Pro104 (RK3E-Pro104) se evaluaron para fosforilación del Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF). Como un control de células RK3E de control también se transfectan con Fosftasa Alcalina (RK3E-AP). Usando métodos conocidos en la materia, la fosforilación del receptor EGF se evalúa con 1 0% y 1 % de suero de células RK3E-Pro104 y RK3E-AP. La sobreexpresión de Pro104 se encuentra que conduce a fosforilación de receptor EGF. La figura 16 es es una inmunomancha western contra receptor EGF fosforilado que demuestra ceptor EGF se fosforila de sobreexpresión de Pro104 en comparación con controles AP. Ejemplo 5: Glicosilación, Enlace GPI y Biotinilación de Proteína Pro104 Glicosilación Pro104 Los experimentos de deglicosilación se realizan en extractos de proteína de la estirpe de célula HeLa (Pro104 mARN positiva) y muestras de tumor de cáncer ovárico utilizando Péptido N-Glicosidasa F (PNGaseF, Cat#P0704S, New England Biolabs, Inc, Beverly, MA) como por las direcciones proporcionadas por el fabricante. Las muestras deglicosiladas se analizaron entonces por western blotting como se describe arriba. Brevemente, 100ug de extracto de proteína se desnaturaliza en regulador de desnaturalización de glicoproteína/0.5% SDS/1 % beta-mercaptoetanol, a 100°C por 1 0 minutos. Esto se siguió por la adición de reguladores de la reacción del equipo (New England Biolabs) en la concentración final de 1 % NP-40 and 50 mM fosfato de sodio antes de la adición de 1 00unidades de PNGase e incuban a 37°C por 4 horas. La figura 17A ilustra un cambio en la migración de la proteína Pro1 04 de tanto la estirpe de célula HeLa como las muestras de cáncer ovárico cuando se tratan con Pangs. Estos resultados demuestran no solamente que Pro104 se glicosila, sino que los anticuerpos anti-Pro1 04 son capaces dedetectar tanto formas glicosiladas como desglicosiladas de Pro1 04 nativo. Caracterización de Ennlace Pro104 GPl por PI-PLC Las células HeLa se colocan en placas de 6 cavidades, 48 horas después, a 90% de confluencia, los medios se reemplazan con 1 ml de medio de crecimiento frescto, con o sin una unidad 0.5 de fosfolipasa específica de fosfatidilinositol (PI-PLC, Sigma). Después de una hora de incubación a 37°C, los medios se recolectan y brevemente se microfugan. 1 5 µl de medios sin concentrar se analizan por SDS-PAGE. Las células se solubilizan para análisis de inmunomancha como se describe arriba. Ya que el Pro104 de humano se predice para ser una proteína enlazada GPI , esto se probó al tratar células HeLa vivas con fosfatidilinositol-fosfolipasa específica C (PI-PLC) como se describe arriba. PI-PLC separa la sujeción de membrana de proteínas enlazadas GPl y libera la proteína en el medio. La figura 17B que no qdemostró proteína Pro104 se corta en el medio de células HeLa sin tratar, sin embargo, el tratamiento con PI-PLC liberó Pro104 en el medio donde podría detectar la inmunomancha. El tratamiento PI-PLC no liberó otras proteínas de embrana no enlazadas a GPl indicando que la liberación de Pro1 04 se debe a separación específica del sujetador GPl por PI-PLC. Este experimento muestra que Pro104 se ubica en la superficie de células de tumor a través de enlace GPl. Biotinilación Pro1 04 Células Anexas Caco2, CaOV3, o células HeLa se remueven de un incubador a 37°C, se colocan en hielo y permanecen en hielo para duración del experimento. Las células se enjuagan 3 veces con hielo frío PBS (10 mM Na-P) a pH 7.4. El reactivo de biotinilación (Sulfo-NHS-SS-Biotin; Pierce, Rockford, I L) se disuelve en PBS frío a la concentración final de 0.5 mg/ml se agrega para cubrir las células completamente (aproximadamente 200µl) y se incuban en hielo por 30 minutos. El reactivo de biotinilación se remueve y las células se enjuagan con 1 x PBS + 25mM Tris una vez seguido por tres enjuagues con PBS. Frío. 500µl de Regulador Lisis (1 x PBS + 1 .0% Tritón) con 1 x de inhibidores de proteasa se agrega a ias células e incuba en hielo por 10 minutos. El listato resultante se transfiere en un tubo de microcentrifuga y se gira por 2 minutos a 14,000rpm a 4°C. 50µl de sobrenadanete se guardan para correr en geles como extracto de proteína total, mientras que el volumen restante del sobrenadante se inmunoprecipita con 20µl de perlas de Agarosa Sptreptavidin (Pierce). Después de la ¡nmunoprecipitación, las perlas se enjuagan tres veces con regulador de lisis celular (1 x PBS + 1 .0% Tritón). 10Oµl de 1 x LDS Regulador de Muestra (NuPage; Invitrogen) y 1 x Agente Reductor de Muestra (NuPage; Invitrogen) se agregan para cada muestra y se incuban a 70°C por 1 0 minutos antes de pasar en el gel. Un western blot estándar se realiza entonces como se describe arriba.
Células Separadas Las células Caco2, CaOV3, o HeLa se remueven de un incubador a 37°C, se colocan en hielo, y permanecen en hielo por duración del experimento. Las células se separan y se enjuagan 3 veces con PBS frío (1 0mM Na-P) a pH 7.4 y se resuspende en 500µl PBS. El reactivo de biotinilación (Sulfo-NHS-SS-Biotin; Pierce, Rockford, IL) disuelto en PBS frío con una concentración de 1.0 mg/ml se agrega a las células para una concentración final de 0.5 mg/ml y se incuba en hielo por 30 minutos. Las células se giran a 2000rpm por 5 minutos. El reactivo de biotinilación se remueve y las células se enjuagan con 1 x PBS + 25mM Tris una vez seguida por tres enjuagues con PBS frío. Las células se giran a 2000rpm por 5 minutes entre enjuagues para remover el regulador. 500µl de Regulador de Lisis (1 x PBS + 1 .0% Tritón) con 1 x inhibidores de proteasa se agrega a las células y se incuban en hielo por 10 minutos. El lisato resultante se transfiere en un tubo microcentrifuga y se gira por 2 minutos a 14,000rpm a 4°C. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo microcentrifugo y la concentración de proteína se determina utilizando el análisis BCA (Pierce). 50µl de sobrenadanete se guarda para correr en geles como extracto de proteína total, mientras el volumen resínate de sobrenadante se inmunoprecipita con 20µl de perlas de Agarosa Streptatividin (Pierce). Después de la inmunoprecipitación, las perlas se enjuagan tres veces con regulador de lisis celular (1 x PBS + 1 .0% Tritón). 1 0Oµl de 1 x LDS Regulador de Muestra (NuPage; Invitrogen) y 1 x Agente Reductor de Muestra (NuPage; Invitrogen) se agregan a cada muestra e incuban a 70°C por 10 minutos antes de la corrida en gel. Un western blot estándar se realiza entonces como se describe arriba. La figura 1 8 demuestra el Pro104 nativo se biotinilia en la superficie celular en comparación con NaK-ATPase (control positivo) y GAPDH (control negativo). El hecho de que Pro1 04 se ubica en la superficie celular a través del Enlace GPl las estirpes de célula lo hace un objetivo ideal para terapia a base de anticuerpo. Además, la unión de anticuerpos anti-Pro1 04 son adecuados para inmunoterapia de tumores con o sin fármacos conjugados, toxinas, enzimas, moléculas que activan el profármaco o isótopos. Ejemplo 6: Generación de Estirpes de Célula que Expresan Pro104 Células y Cultivos Celulares Las estirpes de célula SKOV3, RK3E, 293T, HeLa, CaOV3, NCI H522 y HCT1 16 se compran de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se desarrollan en DMEM (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) con L-glutamina más 4.5g/L glucosa y se complementa con 10% FBS y 100U/mL de Penicilina/Estreptomicina (Cellgro, Herndon, VA). Todas las células se mantienen en incubador a 37°C humectado con 5% CO2. Construcción de vector de expresión Como una fuente para clonar Pro104, el cADN de cáncer ovárico humano se prepara de poly-A+mARN utilizando un equipo de síntesis de cADN BD SMART PCR (BD Bioscience/Clontech, Palo Alto, CA). Para la construcción de un vector de expresión retroviral que codifica Pro104 (pLXSN-Pro1 04), Pro1 04 cADN se sintetiza por reacción PCR utilizando cáncer ovárico cADN listo 5'-RACE como templado y los siguientes cebadores específicos de gen: 5'-extremo:5'-ATGGGCGCGCGCGGGGCGCTGCTGCTG-3' (SEQ ID NO: 8) 3'-extremo:5'-TTATCAGACCGGCCCCAGGAGTGGGAGAGCCCA-3' (SEQ I D NO: 9) El fragmento PCR se clona en el sitio de clonación Hpa I del vector pLXSN (BD Bioscience/Clontech) y se verifica la secuencia. El acceso Genbank para vector es #M28248. Para construcción de un vector de expresión retroviral codificando Pro1 04 con una etiqueta de hemaglutina terminal COOH en estructura (pLXSN-Pro1 04HA), el mismo procedimiento se utiliza excepto que el cebador 3' usado fue: 3'-extremo (HA etiqueta está en negritas): 5'- TTATCACGCGTAGTCCGGCACGTCGTACGGGTAGCCGACCGGCCCC AGGAGTGGGAGAGCCCA-3' (SEQ I D NO: 10) El vector de retrovirus pLXSN utiliza un 5'Mo-MuSV (Virus de Sarcoma de Murino Moloney) LTR y 3'Mo-MuLV (Virus de Leucemia de Murino Moloney) LTR para accionar la expresión del cADN de clon en el sitio de clonación múltiple y un promotor SV40 accionando la expresión de un gen Neor que codifica la resistencia de G418. pLAPSN, un vector de expresión retroviral que codifica la fosfatasa de alcalina (AP), se compra de BD Bioscience/Clontech (referida como pLXSN-AP). Producción de Virus El virus ecotrópico se utiliza para infectar las células RK3E y virus anfotrópico para infectar las células SKOV3. Para empaque de virus ecotrópico, un día antes de transfección, las células 293T se colocan en las placas revestidas (BD). Las células se transfectan con ADN de plásmido purificado utilizando Lipofectamina con la adición de reactivo PLUS (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Por cavidad de células 0.8µg ADN de plásmido de virus: pLXSN-Pro104, pLXSN-Pro1 04HA o pLXSN-AP más 0.8µg pVpack-ECO y 0.8µg pVpackGP (Stratagene, La Jolla, CA) se agregan a una reserva de 125µL DMEM sin suero y 10µL de reactivo PLUS seguido por la incubación por 15 minutos a temperatura ambiente. Subsecuentemente, 8µL de lipofectamina diluida en 125µL de medio DMEM se agregan a la mezcla de reactivo de ADN/PLUS y se incuban por 15 minutos a temperatura ambiente. Un ml de DMEM se agerga a la mezcla de lipofectamina/ADN final y se aplica en la monocapa celular, conteniendo ya 1 ml DMEM sin suero, seguido por incubación a 37°C por 3 horas. Un mL de DMEM conteniendo 20% FBS se agrega a la mezcla de transfección después de 3h incubación y se desarrolla durante la noche. Finalmente, el medio se cambia a DMEM complementado con 1 0%FBS + 1 00 U/mL Pen/Strep para colección de virus. Los medios conteniendo de virus se recolectan por 24 hroas después y se filtra a través de filtro polisulfónico de 0.45µm. Para empaque de virus anfotrópico el mismo procedimiento se seguie excepto que el plásmido pVpack Ampho (Stratagene) se utiliza en su lugar del plásmido pVpack Eco plasmid. Selección e Infección de Virus Polibreno (Bromurod e hexadimetrina; Sigma, Saint Louis, MS) se agfrea a medio que contiene virus fresco a una concentración final de 4 µg/ml. Células RK3E o SKOV3, colocadas el día antes a una densidad de 3X105 células por 100mm2 plato, se enjuagan una vez con salina regulada de fosfato incluyendo Ca2+ y Mg2+ (Cellgro). La solución de virus (6 ml por 1 00mm2 plato) se aplica directamente a las células y después se incuba por 3 horas en un incubador a 37°C con 5% CO2 con ondulación ocasional. El medio conteniendo el virus se recoloca por medio de crecimiento fresco y las células se incuban a 37°C por 60-72 horas punto en el cual la concentración final de 350ug/mL de sulfato G41 8 (Cellgro) se incluye en el medio de crecimiento para seleccionar las células infectadas por virus. Las células se mantienen entre 70-80% de confluencia y medios conteniendo G418 se cambia cada 2 días. Después de la selección de G418, los grupos de células se utilizan para experimentos subsiguientes incluyendo verificación de expresión de proteína Pro104 por análisis Western inmunomancha donde las células se extraen y se analizan como se describe arriba. La expresiónde de AP por monocapas de célula infectada se monitorea al colorear mediante los cuales las monocapas de células donde se fijan por 10 minutos a temperatura ambiente con una solución de 0.5% de glutaraldehído, enjuagado con PBS, se calentó a 65°C por 30mlnutos y AP se visualizó por incubación con substrato líquido BCI P/NBT (Sigma, Saint Louis, MS) por 2-3 hours. Resultados de Selección e Infección de Virus de Estirpe de Célula Estirpes de célula SKOV3, RK3E, 293T, HeLa, CaOV3, NCIH522 y HCT1 16 experimentan infección de virus y la selección para sobreexpresar Pro1 04. La sobreexpresión mediada por retroviral de proteína Pro104 en células RK3E cells se confirma por Western Inmunomancha. La figura 19 es una western inmunomancha que demuestra la expresión de proteína Pro104 en estirpes de célula de empaque retroviral y células RK3E infectadas por virus. La sobreexpresión mediada por retroviral de proteína Pro104 en células SKOV3 se confirma por Western inmunomancha.
La figura 20 es una inmunomancha western que demuestra la expresión de proteína Pro1 04 en estirpes de célula de empaque retroviral y células SKOV3 infectadas por virus. Ejemplo 7: Transfección y Generación de siARN Preparación v Diseño de Oliaonucleótido de siARN Para diseñar las moléculas de siARN específicas de Pro104, las secuencias se seleccionan de las estructuras de lectura abierta del mARN Pro104 en base a los métodos previamente descritos (Elbashir et al. , 2001 , Nature 41 1 :494-498a) la seucneica de siARN "mezclada" aleatoria que no debe generar la eliminación de cualquier mARN celular conocido se utiliza como un control negativo. Como un control negativo adicional una Emerin objetivo siARN se utiliza para demostrar que la eliminación de un mARN no esencial no afecta los niveles de Pro104 ni puntos finales biológicas estudiados. Como un control positivo para elominación de un mARN que conduce a la inducción de apoptosis, un siARN objetivo ya sea DAXX o OPA1 se utiliza, en base a los datos publicados. Michaelson et al., 2002, Journal of Cell Science, 1 16:345-352; Olichen et al. , 2003, J Biol Chem. , 278(10):7743-6. Una investigación BLAST contra el genoma de humano se realiza con cada secuencia siARN seleccionada para asegurar que el siARN fue específico para objetivo y no funcionaría para eliminar otras secuencias. Las secuencias siARN utilizadas para eliminar Emmwerin y DAXX se obtienen de papeles documentados. Michaelson et al. , 2002; Harbort et al. , 2001 , Journal of Cell Science, 1 14:4557-4565. Todas las moléculas de siARN (grado purificado HPP) se sintetiza químicamente por Xeragon Inc. (Germantown, MD). siARN's se disuelven en regulador estéril, calientan a 90°C por 1 minuto y después se incuban a 37°C por 1 hora antes de uos. Los oligonucleótidos siARN con dos residuos de timidina (dTdT) en el extremo 3' de la secuencia consitió de las siguientes secuencias específicas de ARN: Pro104 #56: sentido 5'-CACAUCCAGCCCAUCUGUC-3' (SEQ ID NO: 1 1 ) Pro104 #79: sentido 5'-GAGGAUGAGGCACUGCCAU-3' (SEQ ID NO: 12) Pro104 #80: sentido 5'-CUCUAUGUGCAACCACCUC-3' (SEQ ID NO: 13) Pro104 #81: sentido 5'-GUACAGUUUCCGCAAGGAC-3' (SEQ ID NO: 14) Mezicada: sentido 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3' (SEQ ID NO: 15) Emerin: sentido 5'-CCGUGCUCCUGGGGCUGGG-3' (SEQ ID NO: 16) DAXX: sentido 5'-GGAGUUGGAUCUCUCAGAA-3' (SEQ ID NO: 17) OPAI sentido 5' -GUUAUCAGUCUGAGCCAGG-3' (SEQ ID NO: 18) Oligonucleótidos de siARN adicionales específicos para Pro104 con dos residuos de timidina (dTdT) y el extremo 3' de la secuencia consistipo de las siguientes secuencias de ARN específicas: Prol04_siARN#l : gccggagucgcaggaggcg (SEQ ID NO: 19) Prol04_siARN#2 : cucgggcguuggccguggc (SEQ ID NO: 20) Prol04_siARN#3 : accuauagugacc uagug (SEQ ID NO: 21) Prol04_siARN#4 : ccuauagugaccuuaguga (SEQ ID NO: 22) Prol04_siARN#5 : uucacccuaugacauugcc (SEQ ID NO: 23) Prol04_si RN# 6: gcugucugcaccugucacc (SEQ ID NO: 24) Prol04_siARN#7 : ccggacagacugcugggug (SEQ ID NO: 25) Prol04_siARN#8 : agaggaugaggcacugcca (SEQ ID NO: 26) Prol04_siARN#9 : guucaggucgccaucauaa (SEQ ID NO: 27) Prol04_siARN#10 : ggacaucuuuggagacaug (SEQ ID NO: 28) Prol04_siARN#ll : caagaauggacugugguau (SEQ ID NO: 29) Prol04_siARN#12 : gaauggactigugguaucag (SEQ ID NO: 30) Prol04_siARN#13 : uggacuguggua cagauu (SEQ ID NO: 31) Prol04_siARN#14 : ucggcccggugucuacacc (SEQ ID NO: 32) Prol04_siARN#15 : uaucagccaccacuuugag (SEQ ID NO: 33) Prol04_siARN#l 6: gucaggcccugguucucuu (SEQ ID NO: 34) Prol04_siARN#17 : uaaacaca uccaguugau (SEQ ID NO: 35) Prol04_siARN#18 : uaaacacauuccaguugau (SEQ ID NO: 36) Prol04_siARN#19 : acacauuccaguugaugcc (SEQ ID NO: 37) Prol04_siARN#20 : cacauuccaguugaugccu (SEQ ID NO: 38) Transfección con Oligonucleótidos siARN Células HeLa (4x104 células) y CaOV3 6X104 células) expresando Pro104 se colocan en placas de 12 cavidades por 18-24 horas antes de la transfección. La transfección transitoria se lleva a cabo utilizando el reactivo de Oligofectamina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo al procedimiento del fabricante. Una concentración final de 1 00nM siARN (excepto DAXX siARN que fue 200nM) y 1 .5ul Oligofectamina se utilizaron por cavidad de células. Pro1 04, Mezclada, DAXX y Emerin siARN's se transfectaron por triplicado para todos los experimentos. Las cavidades paralelas de células se evaluaron 72 horas después de la transfección para cambios en niveles de mARN por RT-PCR (QPCR), en tiempo real, cambios en niveles de proteína por Western immunomancha y cambios en apoptosis por dos sistemas de ensayo diferentes (ver abajo). Todos los descubrimientos se fonriman con almenos 2 experimentos adicionales.
Ejemplo 8: Análisis Western Inmunomancha y SDS-PAGE 72 hrs después de la transfección con siARN, los extractos de célula se prepararon en hielo utilizando regulador IPA modificado (1 % NP40, 10mM Na2PO4, 0.15M NaCl) más un coctail inhibidor de proteasa (Roche Inc.) . Entre 20 y 50 ug de extracto de proteína se utilizaron para cada línea de gel, las concentraciones equivalentes de proteína se evaluaron por comparaciones de nivel del mismo gel. Los extractos clarificados se mezclaron con un volumen igual de 2x de regulador de muestra Laemli concentrado ((Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), calentado a 70°C por 10 minutos y después se analizó utilizando 4-12% de minigeles de SDS-poliacrilamida (Nupage; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) con MES (Nupage; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los geles se transfirieron a membranas Immobilon-P PVDF con un tamaño de poro de 0.45µm (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) utilizando regulador de transferencia 1 X Nupage más 10 % de Metanol. Las membranas se enjuagaron y se bloquearon por 1 hora a temperatura ambiente utilizando 5% de leche seca sin grasa en PBS con 0.05% de Tween 20. Las membranas se incubaron con anticuerpo primario durante la noche en 5% de leche seca sin grasa en PBS con 0.05% de Tween-20. Un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra Pro104 se produjo en hogar utilizando la proteína pro104 bacteriana recombinante. El anticuerpo monoclonal Pro104 se diluyó 1 : 1000 para una concentración final de 1 ug/ml de un anticuerpo de ratón monoclonal contra GAPDH (Chemicon Inc. , Temecula, CA) se diluyó 1 :5000 (por una concentración final 0.2 ug/ml). Siguiente a la incubación de anticuerpo primario, las membranas se lavaron cuatro veces a temperatura ambiente por 10 min. cada uno en 1 XPBS con 0.05% de Tween 20. La inmunoglobulina anti-ratón de cabra ligada a peróxidasa de rábano picante (Jackson Lab Inc. , Bar Harbor, ME) se utilizó (1 : 10,000 dilución) en 5% de leche seca sin grasa más PBS 0.05% Tween-20 por 1 hora a temperatura ambiente para detectar el anticuerpo monoclonal primario. Las membranas se lavaron finalmente cuatro veces por 10 min. en 1 X pBS más 0.05% de Tween-20 seguido por detección utilizando reactivo de quimioluminescencia mejorada (ECL) por direcciones del fabricante (Amersham, Piscataway, NJ) y exposición a película de rayos X (Kodak, Rochester, NY). Para el experimento western inmunoblot que compara las céluLas RK3E infectadas con un retrovirus que expresa AP(fosfatasa alcalina) con las mismas células infectadas con un retrovirus que expresa pro1 04, las células se laminaron en medio de crecimiento conteniendo ya sea 1 % o 1 0% de FBS por 48 horas. Los extractos de célula se prepararon utilizando regulador RIPA moficiado incluyendo un cocktail de inhibidor de fosfatasa (Calbiochem) y 25 ug de extracto clarificado se evaluaron por SDS-PAGE y Western immunoblot con un anticuerpo policlonal específico para el receptor EGF fosforilatado (BioSource International, Camarillo, CA). Los efectos de siARN específicos de Pro1 04 en proteína Pro104 se determinó por western immunoblot. La Figura 21 muestra la regulación hacia abajo específica por mediados de siarn de proteína Pro104 en células HeLa Cells. Un 60% de rupture (?CT= 1 .3) de Proteína Pro1 04 se observó. Estos resultado no se confinaron a un tipo de célula único. La Figura 22 muestra la Regulación Baja Específica Mediados de siARN en células CaOV3 Cells. Una 55% de ruptura (?CT= 1 .2) de proteína Pro1 04 se observó.
Ejemplo 9: RT-PCR de Tiempo Real Cuantitativo (QPCR) Un equipo RT-PCR Verde QuantiTech SYBR de Qiagen Inc. se utilizó para evaluación QPCR. El volumen de reacción final fue 20 ul de cebador inverso (5 uM), QuantiTect RT mix 0.2ul y agua libre de RNasa. Entre 20 y 40 ng de ARN templado se utilizó por reacción. QPCR se realizó utilizando un sistema de detección de secuencia Taqman 7700 Sequence Detection system (Applied Bíosystem I nc.) con las siguientes condiciones de ciclo: 50°C por 30 min., 95°C por 1 5 min. , 40 cycles at 94 °C por 15s, 55 °C por 30s, 72°C por 30s, después se mantuvo a 72°C por 2 min. El ensayo QPCR se utilizó para determinar el efecto de síARN Pro104 en niveles de transcripción de gen. Los ensayos QPCR demostraron siARN Pro104 siRNA específicamente la ruptura de mARN Pro104 en células CaOV3. La Figura 23A muestra que siARN Pro104 no rompe el mARN Pro104 (GAPDH) en comparación a los controles negativos en células CaOV3. La Figura 23B demuesra la rupture de siARN Pro104 de mARN Pro104 en comparación a los controles negativos en células CaOV3. La especificidad de siARN Pro1 04 no se limitó por el tipo de célula. Los ensayos QPCR además demostraron siARN Pro104 específicamente ruptura mARN Pro104 en células HeLa. La Figura 24A muestra que siARN Pro104 no rompe mARN non-Pro104 (GAPDH) en comparación a los controles negativos en células HeLa. La Figura 24B demuestra ruptura siARN Pro1 04 siRNA de mARN Pro104 mRNA en comparación a los controles negativos de células HeLa. A 75% de ruptura (?CT= 2) de Pro104 se observó en células HeLa. La ruptpura de mARN esencial tal como DAXX conduce a la inducción de apoptosis. Michaelson 2002 supra; Olichen 2002, supra.. Los experimentos de QPCR demostraron que la ruptura de mARN Pro1 04 puede conducir así también a la inducción de apoptosis. La Figura 24 muestra la ruptura siARN Pro104 de mARN Pro104 en células HeLa en comparación a un control positivo para inducción de apoptosis (DAXX). Además, el análisis QPCR confirmó que difrentes mARN Pro104 de eliminación de siARN Pro104 en células HeLa. La figura 26b demuestra que Pro1 04 en siARNs #56 (SEQ I D NO: 10), #79 (SEQ ID NO: 1 1 ) , #80 (SEQ ID NO: 12) y #81 (SEQ ID NO: 13). mARN Pro104 eliminado en comparación con el control negativo (siARN mezclado). La elminación de mARN Pro1 04 por cuatro diferentes siARN diseña específicanMente mARN Pro104 que es indicativa de que siARN se diseña para interferir con mARN Pro104 puede eliminarse por mARN Pro1 04 y expresión de proteína.
Ejemplo 10: Ensayos de Apoptósis Dos diferentes equipos de análisis, Análisis de anexina V y análisis de caspasas, se utilizan para evaluar los efectos de siARN en apoptosis. Con el equipo de "Apo-One "Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay" (Promega Inc. , Madison, Wl) las últimas pruebas se solubilizaron directmente en la placa de cultivo y la actividad de caspasa, reflejada como una lectura fluorescente, se mide de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Con el segundo equipo, "Guava Nexin V-PE Kit" (Guava Technologies Inc.), las células tratadas se recolectaron por tripsinzación y se enjuagaronm y aproximadamente 105 células se resuspenden en 40ul de regulador y 5 ul de Anexina V (+) y 7-AAD(-) se agregaron. Después de 20 minutos de incubación en hielo, las células se analizan utilizando la máquina Guava PCA de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los resultados del análisis de anexina V demuestran que diferentes siARN Pro1 04 #56 (SEQ I D NO: 10), #79 (SEQ ID NO: 1 1 ), #80 (SEQ I D NO: 12) y #81 (SEQ I D NO: 13) o DAXX siARn inducen la apoptosis en comparación con siARN mezclado (control negativo) en células HeLa. Los resultados del análisis de Anexina V también demuestran eliminación específica de mARN Pro104 con siARN Pro104 induciendo la muerte celular. La figura 27A muestra un mayor porcentaje de células HeLa que son temperanamente apoptóticas cuando se transfectan con siARN Pro1 04 en comparación con controles negativos (no siARN, ARN mezclado). Adicionalmente, la figura 27B muestra un mayor porcentaje de células HeLa que son necróticas cuando se transfectan con siARN Pro104 en comparación con los controles negativos (no si ARN, y siARN mezclado). La inducción de apoptosis por eliminación de Pro104 mARN por Pro 1 04 siARN se demuestra por el análisis de anexina V, y el análisis de caspasa. Los resultados del análisis de Andexina V en la figura 28A muestran un mayor porcentaje de células HeLa que son apoptpticas cuando se transfectan con Pro1 04 siARN, o DAXX siARN (control positivo) . Los resultados del análisis de caspasa en la figura 28B muestran un mayor porcentaje de las células heLa que son apoptóticas cuando se transfectan con Pro104 siARN, o DAXX siARN (control positivo) en comparación con siARN mezclado (control negativo). La inducción de apoptosis por eliminación de mARN Pro 104 por siARN Pro1 04 no se limita por el tipo celular. Los resultandos del análisis de Anexina V en la figura 29 muestran un mayor porcentaje de células CaOV3 que son apoptóticas cuando se transfectan con siARN Pro 104, o siARN OPAI (control positivo) en comparación con siARN mezclado (control negativo) y no siARN (control negativo). La inducción de apoptosis por eliminación de mARN Pro104 se debe a la pérdida de función Pro1 04. siARN Pro104 no induce la apoptosis en células que no expresan Pro104. La figura 30A demuestra los niveles de eliminación de mARN Pro104, Emerin mARN (control positivo, no esencial) y mARN (control positivo, esencial) in células que no expresan Pro104 mARN. No existe diferencia entre los niveles de eliminación de Pro1 04 mARN debido a si ARN mezclado y Pro1 04 específico de siARN mientras ios niveles de Emerin DAXX mARN se eliminan, 50% y 65% respectivamente, por siARN en comparación con siARN mezclado. Los resultados de un análisis de Caspasa en la figura 30B demuestran que las células SKB3 que no expresan Pro104 mARN no experimentan apoptosis cuando se transfectan con ProsiARN mientras que apoptosis se induce por transección de DAXX siARN (control positivo). Además, las células SKBR3 que no expresan Pro104 mARN no experimental apoptosis cuando se transectan con siARN emerin (no esencial) o siARN mezclado (control negativo). Los resultados de las figuras 30A y 30B sirven como un control negativo para mostrar que la transfección de Pro104 siARN induce la apoptosis por eliminación específica de Pro104 y subregulación de la proteína Pro1 04. Además, se muestra que Pro104 es esencial para la supervivencia de la célula. Las Figuras 30A y 30B demuestran que la rupture de mARN no esencial (Emerin) no induce la apoptosis en comparación a siARN mezclado (control negativo). Solamente la ruptura de mARN esencial tal como DAXX (control positivo) y Pro104 inducirá a la apoptosis.
Ejemplo 11 : Ensayo Ágar Suave Los ensayos de ágar suave se condujeron utilizando las placas de 6 cavidades (Corning , VWR). La capa de base ágar de fondo inferior de 2ml de 0.8% de ágar, 10% de FBS en medio Iscove's (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Las células tripsinizadas en 0.4% de ágar, 10% de FBS en medio Iscove's y se aplicó en un volumen final de 5 ml en la parte superior de la capa de base solidificada. Tres diferentes numerosos de célula viable, las células 1 05, 1 04 y 5X103, se cultivaron en ágar por 6 cm2 de cavidad en duplicado. Una capa final de 2 ml consistente de 0.8% de ágar, 10% de FBS en medio Iscove se aplicó en la parte superior de la capa de célula solidificada. Las placas de ágar se incubaron así en una incubadora de 37°C humidificada con 5% de CO2 por aproximadamente 2 semanas antes de que las colonias aparecieran. El agar suave se mantuve por alimentaciones semanales con medio de crecimiento. Las colonias se contaron entre 2 y 4 semanas. 24 a 36 horas después de transfección de siARN, las células HeLa se tripsinizaron y se laminaron en ágar suave a una densidad de 104 células por cavidad según se describe anteriormente. Los ensayos de ágar suave se condujeron para evaluar los efectos de sobre expresión de Pro1 04, la actividad de proteasa Pro104 y ruptura de células Pro104. La Figura 31 demuestra la sobre expresión de Pro104 induce el crecimiento celular en placas de ágar suave para cada tipo de célula en la Figura 31 .
TABLA 8: Número de Colonias en Placas de Ágar Suave Los anticuerpos Anti-pro104 pueden utilizarse en combinación con los anticuerpos contra los complejos VEGF:VEGFR para disminuir, detener, avanzar, inverter, o inhibir el crecimiento de metástasis de tumores que expresan Pro104. Los ejemplos de anticuerpos incluyen pero no se limitan a anti-Pro104, Pro104.C1, Pro104.C4, Pro104.C13, Pro104.C17, Pro104.C18, Pro104.C19, Pro104.C24, Pro104.C25, Pro104.C27, Pro104.C34, Pro104.C37, Pro104.C46, Pro104.C48, Pro104.C49, Pro104.C50, Pro104.C53, Pro104.C54, Pro104.C55, Pro104.C57, Pro104.C60, Pro104.C66, Pro104.C75, Pro104.C84, Pro104.D4, Pro104.D6, Pro104.D9, Pro104.D12, Pro104.D14, Pro104.D18, Pro104.D19, Pro104.D20, Pro104.D21, Pro104.D26, Pro104.D29, Pro104.D31, Pro104.D43, Pro104.D47, Pro104.D51, Pro104.D55, Pro104.D56, Pro104.D58, Pro104.D62, Pro104.D63, Pro104.D64, Pro104.D68, Pro104.D69, Pro104.D75, Pro104.D81, Pro104.D85, Pro104.D88, Pro104.D91, Pro104.D94, Pro104.D102, Pro104.D106,, Pro104.D111, Pro104.D112, Pro104.D113, Pro104.D114, Pro104.D115, Pro104.D116, Pro104.D117, Pro104.D118, Pro104.D119, Pro104.D120, Pro104.D121, Pro104.D122, Pro104.D123, Pro104.D, Pro104.D124, Pro104.D125, Pro104.D126, Pro104.D127, Pro104.D, Pro104.D128, Pro104.D129, Pro104.D130, Pro104.D131, Pro104.D132, Pro104.D133, Pro104.D134, Pro104.D135, Pro104.D136, Pro104.D137, Pro104.D138, Pro104.D139, Pro104.K14, Pro104.K15, Pro104.K16, Pro104.K47, Pro104.K71, Pro104.K72, Pro104.K74, Pro104.K75, Pro104.K76, Pro104.K78, Pro104.K81, Pro104.K87, Pro104.K88, Pro104.K89, Pro104.K155, Pro104.K156, Pro104.K157, Pro104.K158, Pro104.K159, Pro104.K160, Pro104.K163, Pro104.K164, Pro104.K176, Pro104.K217, Pro104.K226, Pro104.K227, Pro104.K240, Pro104.K274, Pro104.K264, Pro104.K281, Pro104.K358 or Pro104.K362; anti-VEGF, bevacizumab (Avastin; Genentech Inc., South San Francisco, CA; Rini et al. Clin Cáncer Res. 2004 Apr 15;10(8):2584-6), infliximab (Cañete et al. Arthritis Rheum. 2004 May;50(5):1636-41, Klimiuk ef al. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2004 Jan-Feb;52(1):36-42); anti-VEGF-R, vatalanib (Manley et al. Biochim Biophys Acta. 2004 Mar 11 ;1697(1 -2):17-27); anti-VEGF-R2, DC101 (Tong ef al. Cáncer Res. 2004 Jun 1;64(11):3731-6, Kiessling et al. Neoplasia. 2004 May-Jun;6(3):213-23); anti-VEGF-3, hF4-3C5 (Persaud ef al. J Cell Sci.2004 Jun 1;117(Pt 13):2745-56). Además, la terapia de combinación para EGFR puede utilizar por ejemplo, anti-EGFR, cetuximab, C225 (Andre et al. Bull Cáncer. 2004 Jan;91(1):75-80), gefitinib, ZD1839(Ciardiello et al. Clin Cáncer Res.2004 Jan 15;10(2):784-93).
Ejemplo 14: Depósito de Estirpes de célula por ADN Las estirpes de célula se depositaron con la colección de cultivo tipo americano (ATCC) ubicado en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S. A., de acuerdo a los números de acceso.
Las siguientes estirpes de célula de hibridoma se depositaron con ATCC, Pro 104.C55.1 , Pro104.C25.1 , Pro104. D9.1 y Pro104. K81 .1 5. Los nombres de las estirpes de célula depositadas anteriormente pueden acortarse para conveniencia de referencia. Por ejemplo, A01 .1 corresponde a Pro1 04.A01 .1 . Adicionalmente, los nombres de las estirpes de célula de hibridoma depositados pueden o no pueden contener el signo de puntuación de punto separando "Pro104" del clon de hibridioma. Por ejemplo, Pro104 C55.1 corresponde a Pro1 04. C55.1 . Estos hibridomas corresponden a los clones (con sus nombres completos) depositados con ATCC. La tabla 10 enlista el clon de hibrídoma depositado con el ATCC, el número de acceso ATCC acordado, y la fecha de depósito.
Tabla 10: Depósitos ATCC Estos depósitos se hicieron bajo las condiciones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patentes y las Regulaciones bajo la que existen (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables por 30 años de la fecha de depósito. Los organismos se harán disponiles por ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y someterse a un acuerdo entre diaDexus, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad no restringida y permanente de la progenie a los cultivos para el púbilco en cesión de la patente de EE. UU. pertinente o en abierto al público de cualquier solicitud de patente extranjera o de EE. UU, lo que venga primero, y asegura la disponibilidad de la progenia a una determinada por el Comisionario de Estados Unidos de Marcas y Patentes a titularse de acuerdo a 35 USC §122 y las reglas en cuanto al Comisionario respecto a la misma (incluyendo 3 7 CFR §1 .14 con referencia particular a 886 OG 638). El cesionario de la presente solicitud ha acortado que si los cultivos en el depósito deberían eliminarse, perderse o destruirse cuado se cultivan en condiciones adecuadas, se reemplazarán de manera inmediata con aviso de un espécimen viable del mismo cultivo. La disponibilidad de las cepas depositadas no se interpretará como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente. La elaboración de estos depósitos no es por medio de una admisión que requieran depósitos para permitir la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Un anticuerpo Pro104 aislado que se une a Pro104 en una célula de mamífero in vivo. 2. El anticuerpo según la reivindicación 0 el cual se interna en la unión a Pro1 04 en una célula de mamífero in vivo. 3. El anticuerpo según la reivindicación 0 o la reivindicación 0 el cual es un anticuerpo monoclonal. 4. El anticuerpo según la reivindicación 0 o la reivindicación 0 el cual es un fragmento de anticuerpo. 5. El anticuerpo según la reivindicación 0 o la reivindicación 0 el cual es un anticuerpo humanizado o quimérico. 6. El anticuerpo según la reivindicación 0 el cual se produce por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de Número de acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. 7. El anticuerpo según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo compite para la unión al mismo epítopo como el epítopo unido por el anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de Número de acceso ATCC PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. 8. El anticuerpo según la reivindicación 0 el cual se conjuga para un agente inhibidor de crecimiento. 9. El anticuerpo según la reivindicación 0 el cual se conjuga para un agente citotóxico. 1 0. El anticuerpo según la reivindicación 0 en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas. 1 1 . El anticuerpo según la reivindicación 0 en donde el agente citotóxico es una toxina. 12. El anticuerpo según la reivindicación 0, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de ricín, saponin, maytansinoid y caliqueamicina. 1 3. El anticuerpo según la reivindicación 0, en donde la toxina es un maytansinoid. 14. El anticuerpo según la reivindicación 0, en donde la célula de mamífero es una célula cancerígena. 15. Un anticuerpo monoclonal anti-Pro104 que se une selectivamente a una célula que expresa Pro1 04. 16. Un anticuerpo monoclonal anti-Pro104 que inhibe el crecimiento de las células cancerígenas que expresan Pro104 in vivo. 1 7. El anticuerpo según la reivindicación 0 el cual es un anticuerpo humano o humanizado. 1 8. El anticuerpo según la reivindicación 0 el cual se produce en bacteria. 19. El anticuerpo según la reivindicación 0, el cual es una forma humanizada de un anticuerpo anti-Pro1 04 producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de Número de acceso ATCC PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. 20. El anticuerpo según la reivindicación 0, en donde las células cancerígenas son de un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de pulmón, ovárico, pancreático y pulmonar. 21 . El anticuerpo según la reivindicación 0, en donde la célula cancerígena son células cancerígenas pancreáticas u ováricas. 22. Una célula que produce el anticuerpo según la reivindicación 0. 23. La célula según la reivindicación 0, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste de células de hibridoma depositadas bajo el Número de acceso de la Colección de Cultivo Tipo Americano PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. 24. Un método para producir el anticuerpo según la reivindicación 0 comprendiendo cultivar una célula adecuada y recuperar el anticuerpo del cultivo celular. 25. Una composición que comprende el anticuerpo según la reivindicación 0 o la reivindicación 0, y un vehículo. 26. La composición según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo se conjuga para un agente citotóxico. 27. La composición según la reivindicación 0, en donde el agente citotóxico es un maytansinoid. 28. La composición según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado y el vehículo es un portador farmacéutico. 29. La composición según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo humanizado es una forma humanizada de un anticuerpo anti-Pro104 producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de Número de acceso ATCC PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. 30. Un método para eliminar la célula cancerígena que expresa Pro1 04, comprendiendo contactar la célula cancerígena con el anticuerpo según la reivindicación 0 o la reivindicación 0, de tal modo eliminando la célula cancerígena. 31 . El método según la reivindicación 0, en donde la célula cancerígena se selecciona del grupo que consiste de célula de cáncer de mama, ovárico, pancreático y pulmonar. 32. El método según la reivindicación 0, en donde la célula cancerígena es una célula cancerígena ovárica o pancreática. 33. El método según la reivindicación 31 , en donde el cáncer ovárico es adenocarcinoma ceroso ovárico o el cáncer de mama es carcinoma ductal que infiltra la mama. 34. El método según la reivindicación 0, en donde la célula cancerígena es de cáncer de mama, ovárico, pancreático y pulmonar metastático. 35. El método según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 36. El método según la reivindicación 0 en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. 37. El método según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo se conjuga para un agente citotóxico. 38. El método según la reivindicación 0, en donde el agente citotóxico es una toxina seleccionada del grupo que consiste de maytansinoid, ricin, saporin y caliqueamicina. 39. El método según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo es una forma humanizada del anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de Número de acceso ATCC PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. 40. El método según la reivindicación 0, en donde el agente citotóxico es un isótopo radioactivo. 41 . Un método para aminorar un cáncer que expresa Pro104 en un mamífero, comprendiendo administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo según la reivindicación 0 al mamífero. 42. El método según la reivindicación 0, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, ováríco, pancreático y pulmonar. 43. El método según la reivindicación 0 en donde el cáncer ovárico es adenocarcinoma ceroso ovárico o el cáncer de mama es carcinoma ductal que infiltra la mama. 44. El método según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. 45. El método según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo se conjuga para un agente citotóxico. 46. El método según la reivindicación 0, en donde el agente citotóxico es un maytansinoid. 47. El método según la reivindicación 0, en donde el anticuerpo se administra junto con ai menos un agente quimioterapéutico. 48. El método según la reivindicación 0 en donde e agente quimioterapéutico es paclitaxel o derivados del mismo. 49. Un artículo de elaboración comprendiendo un contenedor y una composición en el mismo, en donde la composición comprende un anticuerpo de la reivindicación 3. 50. El artículo de elaboración según la reivindicación 0 comprendiendo además un inserto de envase que indica que la composición puede utilizarse para tratar el cáncer de mama, ovárico, pancreático o pulmonar. 51 . Un método para determinar si las células en una muestra expresan Pro1 04 comprendiendo: (a) contactar una muestra de células con un anticuerpo Pro104 de la reivindicación 3 bajo condiciones adecuadas para la unión específica del anticuerpo Pro1 04 a Pro1 04 y (b) determinar el nivel de unión del anticuerpo a las células en la muestra, o ei nivel de internalización de anticuerpo Po104 por las células en dicha muestra, en donde la unión del anticuerpo Pro1 04 a las células en la muestra o la internalización del anticuerpo Pro104 por las células en la muestra indican que las células en la muestra expresan Pro104. 52. El método según la reivindicación 0 en donde dicha muestra de células se contactan con un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de Número de acceso ATCC PTA-5277, 6076, 6077 y 6078. 53. El método según la reivindicación 0 en donde dicha muestra de células es de un sujeto quien tiene cáncer, se sospecha que tiene un cáncer o quién puede tener una predisposición para desarrollar el cáncer. 54. El método según la reivindicación 0 en donde el cáncer es cáncer de mama, ovárico, pancreático o pulmonar. 55. El método según la reivindicación 0 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo marcado. 56. Un método para detector la sobreexpresión de Pro104 en una muestra de célula de prueba, comprendiendo: (a) combinar una muestra de célula de prueba con un anticuerpo Pro 1 04 de la reivindicación 3 bajo condiciones adecuadas para la unión específica de Pro 104 a Pro1 04 expresado por células en dicha muestra de prueba. (b) determinar el nivel de unión del anticuerpo Pro104 a las células en la muestra de prueba, (c) comparar el nivel de unión del anticuerpo Pro104 unido a las células en la etapa (b) al nivel de unión de anticuerpo Pro104 a las células en una muestra de célula de control, en donde un aumento en la unión del anticuerpo Pro104 en la muestra de célula de prueba según se compara al control es indicativo de la sobreexresión Pro1 04 por células en la muestra de célula de prueba. 57. El método según la reivindicación 0 en donde la muestra de célula de prueba es una muestra de célula cancerígena. 58. El método según la reivindicación 0 en donde la muestra de célula cancerígena es de cáncer de mama, ovárico, pancreático o pulmonar. 59. El método según la reivindicación 0 en donde el cáncer ovárico es adenocarcinoma ceroso ovárico o el cáncer de mama es carcinoma ductal que infiltra la mama. 60. El método según la reivindicación 0 en donde el control es una muestra de tejido normal adyacente. 61 . Un método para detectar la sobreexpresión de Pro104 en un sujeto en necesidad del mismo comprendiendo: (a) combinar una muestra de suero de un sujeto con un anticuerpo Pro104 de la reivindicación 3 bajo condiciones adecuadas para la unión específica de! anticuerpo Pro104 a Pro104 en dicha muestra de suero. (b) determinar el nivel de Pro104 en la muestra de suero, (c) comparar el nivel de Pro1 04 determinado en la etapa b al nivel de Pro 1 04 en un control, en donde un aumento en el nivel de Pro104 en la muestra de suero del sujeto según se compara al control es indicativo de la sobreexpresión de Pro1 04 en el sujeto. 62. El método según la reivindicación 0 en donde el sujeto tiene cáncer. 63. El método según la reivindicación 0 en donde el sujeto tiene cáncer de mama, ovárico, pancreático o pulmonar o un cáncer metastático del mismo. 64. El método según la reivindicación 0 en donde la célula ovárica es un adenocarcinoma cerosa ovárica o el cáncer de mama es carcinoma ductal que infiltra la mama. 65. El método según la reivindicación 0 en donde el control es una muestra de suero de un sujeto sin un cáncer que sobreexprese pro1 04. 66. Un método de selección de anticuerpos que se unen a un epítopo que se une por un anticuerpo según la reivindicación 3 comprendiendo, (a) combinar una muestra que contiene Pro104 con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo de la reivindicación 3 para formar una mezcla, (b) determinar el nivel de anticuerpo Pro104 unido a Pro104 en la mezcla y (c) comparar el nivel de anticuerpo Pro104 en la mezcla de la etapa (a) a una mezcla de control, en donde el nivel de la unión de anticuerpo Pro104 a Pro104 en la mezcla según se compara al control es indicativo de la unión de anticuerpo de la prueba a un epítopo que se une por el anticuerpo anti-Pro 1 04 de la reivindicación 3. 67. El método de selección según la reivindicación 0 en donde el nivel del anticuerpo Pro104 unido a Pro104 se determina por ELISA. 68. El método de selección según la reivindicación 0 en donde el control es una mezcla de Pro104, el anticuerpo Pro104 de la reivindicación 3 y un anticuerpo conocido por unir el epítopo unido por el anticuerpo Pro 1 04 de la reivindicación 3. 69. El método de selección según la reivindicación 0 en donde el anticuerpo anti-Pro1 04 se etiqueta. 70. El método de selección según la reivindicación 0 en donde el Pro 1 04 se une a un soporte sólido. 71 . El método de selección según la reivindicación 0 en donde el soporte sólido es una perla sefarosa.
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