CN1833020A - Pro104抗体组合物及其使用方法 - Google Patents

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艾里斯·西蒙
穆里尔·克迈特
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Abstract

发明提供了与哺乳动物细胞上Pro104体内结合的分离的抗卵巢，胰腺，肺或者乳癌抗原(Pro104)抗体。本发明还包括含有抗－Pro104抗体以及载体的组合物。这种组合物可以制品或者试剂盒的形式提供。发明的另一方面是编码抗Pro104抗体的分离的核酸以及包含分离的核酸的表达载体。本发明还提供了产生抗Pro104抗体的细胞。本发明包含产生抗Pro104抗体的方法。本发明的另一方面是杀伤表达Pro104的癌细胞的方法，包括将癌细胞与抗Pro104抗体接触以及减轻或者治疗哺乳动物Pro104－表达癌症的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗Pro104抗体。

Description

Pro104抗体组合物及其使用方法
本专利申请要求2003年11月17日申请的美国临时专利申请60/523,271以及2003年6月27日申请的美国临时专利申请60/485,346的优先权，其在这里整体引入作为参考。
发明领域
本发明涉及抗-Pro104抗体组合物以及检测表达Pro104的癌症和杀伤表达Pro104的乳房，卵巢，胰腺以及肺癌细胞的方法。此外，本发明涉及通过施用有效量的能调节Pro104功能的化合物来调节或杀伤表达Pro104的细胞的方法。
发明背景
乳腺癌
乳腺癌，也称为乳房肿瘤癌，是妇女中第二常见的癌，据统计在美国在确诊的癌中占三分之一。九分之一的妇女在她的一生中会发展为乳腺癌且每年确诊的约192,000新的乳腺癌病例中约42,000人死亡。Bevers，Primary Prevention of Breast Cancer，in  Breast Cancer，20-54(Kelly K Hunt et a1.，ed.，2001)；Kochanek et al.，49 Nat’l.Vital StatisticsReports 1，14(2001)。在小于20岁的妇女中乳腺癌极端地稀少并且在30岁以下的妇女中也是非常的稀少。乳腺癌的发生率随着年龄的增长而提高并且50多岁时愈发显著。非-西班牙裔白种人妇女乳腺癌的发病率最高，朝鲜妇女发病率最低。Ashkenazi Jews发现促进乳房及其它癌症的遗传突变BRCA1以及BRCA2发病率的增加。非洲裔美国妇女在相同的群体乳腺癌的死亡率最高(每100,000人31人死亡)，而中国妇女的死亡率最低，每100,000人11人死亡。尽管男性可以患乳腺癌，但是极其稀少。在美国，据估计2004年将有217,440个新的乳腺癌病例并且有40,580人死于乳腺癌。(美国癌症学会网址：cancer withthe extension.org)。除与遗传因素相关的病例外，还不知道乳腺癌的准确原因。
在乳腺癌的治疗中，非常需要强调检测以及危险估计的重要性，因为乳腺癌早期以及准确的阶段划分对存活率有显著的影响。例如，早期(T0阶段，如下所述)检测的乳腺癌具有92％.的五年存活率。相反，如果直至晚期还没有检测出癌症(即，T4阶段(IV))，五年存活率减少到13％。AJCC Cancer Staging Handbook 164-65页(Irvin D.Fleming等，第5版，1998)。一些检测技术，诸如乳房造影术以及活体检查，引起不适，费用和/或放射的增加，并且仅仅被指定用于乳腺癌危险增加的患者。
目前预测或者检测乳腺癌危险的方法并不是最佳的。用于预测乳腺癌相对危险性的一个方法是检验患者的危险因素以及追踪主动诊断以及高风险患者的治疗方案。患者患乳腺癌的危险与年龄的增加，从未生育过，乳腺癌的家族史，乳腺癌的个人史，较早的经初期，较晚的绝经期，较大年龄的第一次妊娠足月怀孕，在前的增生性的乳房疾病，很小年龄时乳房的辐照以及恶性肿瘤的个人史相关。诸如脂肪消耗，酒精消耗，教育以及社会经济状况的生活方式因素也与乳腺癌的发生率的增加相关，尽管尚未建立直接原因以及影响的关系。虽然这些危险因素是统计上显著的，但是它们与乳腺癌相关性较小限制了它们的应用。大多数发展成乳腺癌的妇女不具有上述的危险因素，除了随着年龄增长的危险。NIH公开号00-1556(2000)。
目前用于检测癌症的筛选方法，诸如乳房自我检验，超声波以及乳房造影术的缺点降低了效果或者阻止了它们的广泛应用。虽然乳房自我检验是有用的但是对于检测初期的乳腺癌是不可靠的，其中肿瘤太小难以通过触诊进行检测。超声波测定需要熟练的操作者并且费用较高。乳房造影术虽然灵敏但是在检测怀疑恶性的病变中需要过多的诊断。而且还担忧乳房造影术中使用的放射线因为胸透是与乳腺癌发病率增加相关的因素。
目前，还没有乳腺癌预防的恰当方法。目前预防乳腺癌的方法包括预防性的乳房切除术(癌症诊断之前进行乳房切除术)以及预防性化疗(癌症诊断之前化疗)，均是极端的方法，限制了它们在患乳腺癌危险性增加的妇女中的应用，Bevers，如上所述。
大量遗传标志与乳腺癌相关。这些标记的实例包含癌胚抗原(CEA)(Mughal等，JAMA 249：1881(1983))，MUC-1(Frische以及Liu，J.Clin.Ligand 22：320(2000))，HER-2/neu(Haris等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncology15：A96(1996))，uPA，PAI-1，LPA，LPC，RAK以及BRCA(Esteva以及Fritsche，Serum and Tissue Markers for Breast Cancer，BreastCancer，286-308(2001))。这些标记的问题在于灵敏度，弱相关以及假阴性的限制，限制了其在早期诊断中的应用。例如，虽然BRCA1基因突变可用作乳腺癌危险性增加的指示，但是在癌症诊断中的限制在与仅仅6.2％的乳腺癌是BRCA1阳性的。Malone等，JAMA 279：922(1998)。参见，Mewman等，JAMA 279：915(1998)(仅仅3.3％相关)。
有4种变化在于位点的来源以及病情发展程度的最初分类的乳腺癌。
I.原位腺管癌(DCIS)：保留在正常位置的腺管上皮细胞的恶性转化。DCIS纯粹是定位的疾病，不能转移。
II.侵入性恶性腺管癌(IDC)：穿透基膜以及进入乳房的支撑组织的腺管上皮细胞的恶性肿瘤。IDC可以最终扩散到身体的其它地方。
III.小叶原位癌(LCIS)：乳房单个小叶中增生的恶性肿瘤不能扩散穿过小叶壁，通常保留在原位。
IV.浸润的小叶恶性肿瘤(ILC)：乳房单个小叶中增生并且直接侵入小叶壁到邻近组织的恶性肿瘤。由于其侵入穿过小叶壁，ILC可以穿透淋巴管以及血管并且蔓延到远距离位点。
为了确定预后以及治疗，这4种乳腺癌类型根据原发肿瘤(T)的大小，参与的淋巴结(N)以及转移(M)的存在划分阶段。尽管DCIS根据定义表示定位的I阶段的疾病，其它形式的乳腺癌可以为从II阶段到IV阶段。有另外的预测因素，进一步用来指导手术以及药物干预。最普遍的因素是所包括的淋巴结的总数，ER(雌激素受体)状况，Her2/neu受体状况以及组织等级。
乳腺癌被确诊为合适的阶段类别，对不同阶段的癌症进行不同的治疗会更有效。TX阶段显示原发肿瘤不能被评价(即，除去肿瘤或者除去乳房组织)。T0阶段特征在于诸如增生的异常但是没有明显的原发肿瘤。Tis阶段的特征在于原位癌，腺管内的恶性肿瘤，小叶原位癌，或者没有肿瘤的乳头的Paget’s疾病。T1(I)阶段特征在于具有最大尺寸2厘米或者更小的肿瘤。T1阶段内，Tmic显示0.1cm或者更少的微侵入，T1a显示0.1到0.5cm之间的肿瘤，T1b显示0.5到1cm之间的肿瘤，并且T1c显示1cm到2cm的肿瘤。T2阶段(II)特征在于最大尺寸2cm到5cm的肿瘤。大小大于5cm的肿瘤被划分到T3阶段(III)。T4阶段(IV)显示扩散到胸壁或者皮肤的任意大小的肿瘤。T4阶段内，T4a显示肿瘤扩散到胸壁，T4b显示乳房皮肤的浮肿或者溃疡或者限于相同乳房的小卫星皮肤瘤，T4c显示T4a和T4b的组合，并且T4d显示炎性癌。 AJCC Cancer Staging Handbook pp.159-70(IrvinD.Fleming等编辑，第五版，1998)。除标准的划分阶段之外，乳房肿瘤可以依照雌激素受体以及孕酮受体蛋白状况进行分类。Fisher等，Breast Cancer Research and Treatment 7：147(1986)。另外的病理状况，诸如HER2/neu状况也是有用的。Thor等，J.Nat’l.Cancer Inst.90：1346(1998)；Paik等，J.Nat’l.Cancer Inst.90：1361(1998)；Hutchins等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncology 17：A2(1998)；以及Simpson等，J.Clin.Oncology 18：2059(2000)。
除原发肿瘤的阶段划分之外，也可以对转移到局部淋巴结的乳腺癌划分阶段。NX阶段显示淋巴结不能用于评价(例如，之前被去除)。N0阶段显示没有局部淋巴结转移转移。N1阶段显示转移到活动的同侧腋淋巴结。N2阶段显示向彼此或者固定到其它结构的同侧腋淋巴结的转移。N3阶段显示向同侧乳内淋巴结的转移。
阶段确定具有潜在的预后价值并且提供了设计最佳治疗的标准。Simpson等，J.Clin.Oncology 18：2059(2000)。通常，乳腺癌的病理阶段划分优于临床阶段划分，因为前者产生更准确的预后。然而如果和病理阶段划分一样准确将优选临床阶段划分，因为它不依靠于侵入方法获得用于病理评价的组织。乳腺癌的阶段划分将通过检测细胞，组织或者体液中的新的标记得以改进，所述新的标记将区分不同的侵入阶段。该领域的进展将可以发展出更快速以及可靠的用于治疗乳腺癌患者的方法。
乳腺癌的治疗通常在对原发肿瘤的准确阶段划分后确定。初级治疗选择包含乳房保守治疗(乳房肿瘤切除术，乳房放疗，以及腋窝的手术阶段划分)以及改良的根治性乳房切除术。附加处理包含化疗，局部放疗以及在极个别情况下通过切除卵巢终止雌激素产生。
直到最近，所有乳腺癌的常用治疗是乳房切除术。Fonseca等，Annals of 127：1013(1997)。然而，最近的数据显示不根除的方法在提高早期乳腺癌的存活率方面同样有效。Fisher等，J.of Clinical Oncology16：441(1998)。早期乳腺癌(即Tis阶段)的患者的治疗可以选择在保留乳房手术后可以在乳房定位放疗。或者，任选可以采用乳房切除术连同放疗或者乳房重建。这些治疗方法在乳腺癌的早期阶段同样有效。
I阶段和II阶段乳腺癌的患者需要伴随化疗和/或激素治疗的手术。手术限于III阶段以及IV阶段患者。由此，这些患者是化疗以及放疗的较好的候选者，手术限于活体检查可以进行最初的阶段划分或者随后的再次阶段划分，因为在疾病的这个阶段癌症很少被治愈。 AJCC Cancer Staging Handbook 84，164-65 Irvin D.Fleming等编辑，第五版1998)。
为了给患者提供更多的治疗选择，正在努力将早期乳腺癌限制在低复发，其不经手术后的放疗用乳房肿瘤切除术进行治疗。虽然对早期乳腺癌的分类进行了大量尝试，从这些研究尚未获得手术后放疗的一致同意的建议。Page等，Cancer 75：1219(1995)；Fisher等，Cancer75：1223(1995)；Silverstein等，Cancer 77：2267(1996)。
卵巢癌
卵巢癌是美国妇女第四-常见的癌症死亡的病因，预计2001年有超过23,000个新病例并且大约14,000人死亡。Shridhar，V等，CancerRes.61(15)：5895-904(2001)；Memarzadeh，S.& Berek，J.S.，J.Reprod.Med.46(7)：：621-292001)。美国癌症学会估计只在美国2004年就会有约25,580个新的卵巢癌症病例。卵巢癌将引起美国约16,090人死亡。ACS网址：cancer with the extension.org。卵巢癌症的发病率是全世界关注的严重问题，据估计每年有191,000个新病例。Runnebaum，I.B.& Stickeler，E.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.127(2)：73-79(2001)。不幸的是，卵巢癌妇女通常无征状直至疾病开始转移。因为不可能进行卵巢癌的有效筛检，约70％确诊的妇女患有25-30％五年存活率的晚期癌症。Memarzadeh，S.&，J.S.，上述；Nunns，D.等，Obstet.Gynecol.Surv.55(12)：746-51。相反，确诊早期卵巢癌症的妇女具有相当高的存活率。Werness，B.A.& Eltabbakh，G.H.，Int′l.J.Gynecol.Pathol.20(1)：48-63(2001)。尽管我们未完全了解卵巢癌的病因，这个领域的广泛研究结果表明是年龄，遗传学，生殖以及饮食/环境因素的组合。年龄是卵巢癌症发展中的关键危险因素：虽然30岁之前发展卵巢癌症很少见，卵巢癌的发生率线性存在于30到50岁的妇女中，此后速率减慢，最高发生率是在septagenarian妇女中。Jeanne M.Schilder等，Hereditary Ovarian Cancer：Clinical Syndromes and Management，Ovarian Cancer 182(Stephen C.Rubin & Gregory P.Sutton编辑，第2版，2001)。
就遗传因素而言，卵巢癌的家族史是疾病发展中的最显著的危险因素，也就是取决于染病的家族成员的数目，他们与所述妇女的血缘关系，以及哪一特定第一级的亲属受到疾病的影响。同上。几个基因的突变与卵巢癌相关，包含BRCA1以及BRCA2，其中两者都在乳腺癌的发展中起关键的作用，以及hMSH2和hMLH1，其中两者都与遗传性的非-息肉性结肠癌相关。Katherine Y.Look，Epidemiology，Etiology，以及Screening of Ovarian Cancer，Ovarian Cancer 169，171-73(Stephen C.Rubin & Gregory P.Sutton编辑，第2版2001。位于染色体17上的BRCA1，以及位于染色体13上的BRCA2是与DNA修复相关的肿瘤抑制基因；这些基因中的突变与大约10％的卵巢癌相关。同上171-72；Schilder等，上述185-86。hMSH2和hMLH1与DNA错配修复有关，并且分别位于染色体2和3上；已经报道约3％的遗传性卵巢恶性肿瘤起因于这些基因中的突变，参见，上述173；Schilder等，上述184，188-89。
生殖因素也与卵巢癌危险性的增加或者降低有关。晚绝经，从未生育过，以及较早的经初期均与卵巢癌危险性的增加有关。Schilder等，上述182。一个理论假设这些因素增加了妇女生命过程中排卵周期的数目，引起“不断的排卵”其被认为卵巢上皮突变的根本原因，同上；Laura J.Havrilesky & Andrew Berchuck，Molecular Alterations inSporadic Ovarian Cancer， Ovarian Cancer 25(Stephen C.Rubin &Gregory P.Sutton编辑，第2版，2001)。突变可以由排卵导致上皮破坏和修复，迫使细胞分裂增加，由此提高没有被发现的突变发生的可能性的事实得以解释。对这个理论的支持可以在抑制排卵的怀孕，哺乳和使用口服避孕药可以对发展卵巢癌赋予保护作用的事实中发现。同前。
在饮食/环境因素中，似乎高水平摄入动物脂肪或者红肉和卵巢癌之间有关联，而阻止自由基形成以及参与保持正常细胞分化的抗氧化剂维生素A可能提供保护作用，参见上述169。报道也涉及石棉以及含水的三硅酸镁(滑石)，其中后者可存在于子宫帽以及卫生月经带中，同上169-70。
目前用于卵巢癌的方法虽然有一些用途，但是相当限制其诊断能力，当疾病通常无征状时在癌症进展早期特别急性的问题最容易治疗。Walter J.Burdette，Cancer：Etiology，Diagnosis，and Treatment 166(1998)；Memarzadeh & Berek，上述；Runnebaum & Stickeler，上述；Werness & Eltabbakh，上述。通常使用的筛选试验包含每年两次直肠阴道骨盆检验，检测CA-125血清肿瘤标记物的放射免疫分析以及经阴道的超声波扫描术。Burdette，上述166。
骨盆检查未能产生充分数量早期诊断，并且其它方法并不十分准确，同上。一个研究报道仅仅15％患卵巢癌的患者在骨盆检查中被诊断有疾病。参见，上述的174。此外，CA-125试验倾向于引起预绝经妇女的假阳性并且已经报道在绝经后妇女中的预测价值很低，同上174-75。尽管经阴道的超声波扫描术现在是卵巢癌筛选的优选方法，但是不能可靠鉴别良性和恶性肿瘤，并且如果卵巢大小正常的话也不能定位初级腹膜恶性肿瘤或者卵巢癌症。Schilder等，上述194-95。虽然现在可以进行BRCA1，BRCA2，hMSH2以及hMLH1基因突变的遗传试验，但是这些试验对于一些患者来说太贵并且可能同时产生假阴性或者不确定的结果。Schilder等，上述191-94。
其它目的标记物是HE4以及间皮素。参见Urban等的Ovariancancer screening Hematol Oncol Clin North Am.2003 Aug；17(4)：989-1005；Hellstrom等。HE4(WFDC2)蛋白是卵巢恶性肿瘤的生物标志物，Cancer Res.2003 Jul 1；63(13)：3695-700；Ordonez，Application ofmesothelin immunostaining in tumor diagnosis，Am J Surg Pathol.2003Nov；27(11)：1418-28。
通过手术探测完成的卵巢癌症的阶段划分是确定疾病治疗以及控制过程的重要因素。 AJCC Cancer Staging Handbook 187(Irvin D.Fleming等编辑，第5版1998)；Burdette，上述170；Memarzadeh &Berek，上述；Shridhar等，上述。参考国际妇产科联盟开发的分类系统进行阶段划分。David H.Moore，Primary Surgical Management of EarlyEpithelial Ovarian Carcinoma，Ovarian Cancer 203(Stephen C.Rubin &Gregory P.Sutton编辑。第2版2001)；Fleming等编辑，上述188。I阶段卵巢癌症的特征在于肿瘤生长限于卵巢并且由3个亚阶段组成，同上。在IA亚阶段，肿瘤生长限于一个卵巢，在卵巢的外表面没有肿瘤，卵巢囊是完整的，并且没有恶性细胞存在于腹水或者腹膜洗涤物中，同上。IB亚阶段与IA相同，除了肿瘤生长限于两个卵巢，同上。IC亚阶段是指肿瘤生长的存在限于一个或者两个卵巢，并且还包含一种或多种以下特性：包膜破裂，一个或者两个卵巢表面上肿瘤的生长，以及恶性细胞存在于腹水或者腹膜洗液中，同前。
II阶段卵巢癌症是指设计一个或者两个卵巢的肿瘤生长，连同骨盆扩散，同上。IIA亚阶段包括子宫和/或输卵管上的扩散和/或植入，腹水或者腹膜洗涤物中没有恶性细胞，而IIB亚阶段包括扩散进入其它盆腔内的器官以及组织中，在腹水或者腹膜洗涤物中也没有恶性细胞，同上。IIC亚阶段包括IIA或者IIB的骨盆扩散，但是在腹水或者腹膜洗涤物中具有恶性细胞，同前。
III阶段卵巢癌症包括一个或者两个卵巢中的肿瘤生长，由显微镜和/或局部淋巴结中转移证实的超过骨盆的腹膜转移，同上。IIIA亚阶段的特征在于由显微观察到的向骨盆外部腹膜的转移，IIIB亚阶段包括向骨盆外部宏观腹膜转移最大2厘米或者更小的尺寸。IIIC亚阶段与IIIB相同，除了转移的最大尺寸大于2cm并且可以包含局部淋巴结转移，同上。最后，IV阶段是指存在远距离的转移，除了腹膜转移，同前。
虽然手术的阶段划分目前是评价卵巢癌症的控制以及治疗的基准，但是其重要缺点包含方法的侵入性，可能的并发症，以及可能的误差。Moore，上述206-208，213。考虑到这些限制，通过理解多种卵巢癌症阶段中不同的基因表达以及通过获得多种生物标志物已经将关注转向可选择的阶段划分方法的发展从而更好评价疾病的进展。Vartainen，J.等，Int′l J.Cancer，95(5)：313-16(2001)；Shridhar等上述；Baekelandt，M.等，J.Clin.Oncol.18(22)：3775-81。
卵巢癌症的治疗通常包括多倾向攻击，外科手术用作治疗的基础。Dennis S.Chi & William J.Hoskins，Primary Surgical Management ofAdvanced Epithelial Ovarian Cancer，Ovarian Cancer 241(Stephen C.Rubin & Gregory P.Sutton编辑，第2版2001)。例如，就占卵巢癌症病例约90％的上皮卵巢癌症来说，治疗通常包含：(1)细胞减灭术，包含经腹部子宫全切除术，两侧的输卵管卵巢切除术，网膜切除术以及淋巴结切除术，继之以(2)用太平洋紫杉醇以及顺氯氨铂或者卡铂的辅助化疗。Eltabbakh，G.H.& Awtrey，C.S.，Expert Op.Pharmacother.2(10)：109-24。尽管对辅助治疗有80％的临床反应率，大多数患者在治疗3年内经历肿瘤复发。某些患者可能经受第二次细胞减灭术和/或第二次的化疗。Memarzadeh & Berek，上述。
从上文，很明显被用来检测，诊断，监控，阶段划分，预后以及阻止卵巢癌症复发的方法对患者的结果是非常重要的。此外，当前的方法虽然有助于每一的这些分析，当受限于其特异性，灵敏度，侵略性和/或其成本。因而，经由检测细胞，组织或者体液中新标记起作用的最小侵入性以及合理成本的高度特异性以及灵敏的方法是非常合乎需要的。
因此，用于预测人是否可能发展卵巢癌症，用于诊断卵巢癌症，用于监控疾病的进展，用于对卵巢癌进行阶段划分，用于确定卵巢癌是否已经转移，以及用于对卵巢癌显影的更灵敏以及准确的方法是非常需要的。
胰腺癌
胰腺癌是第十三位的最常见的癌症以及全世界癌症第八位的死亡原因。Donghui Li，Molecular Epidemiology，Pancreatic Cancer 3(DouglasB.Evans等eds.，2002)。在美国，胰腺癌是男性以及妇女第四常见的癌症，占癌症死亡的5％以及总共死亡接近30,000人。胰腺癌在男性中的发病率比妇女高并且与白种人相比在非洲裔美国人中更高，同上9。胰腺癌最显著的预测因素是患者的年龄；白种人中，胰腺癌与年龄有关的发病率不断地增加，甚至直到85以及更年长的范畴，同上3。约80％的案例发生在60到80的年龄范围，经历患有所述疾病的危险的80多岁的人比40多岁的人多40倍，同上。此外，美国癌症学会估计只在美国2004年将有约31,800个新的病例。胰腺癌同年将引起美国约31,200人死亡。ACS网址；cancer with extension.org。尽管研究人员以及医生进行了很多努力研究胰腺癌治疗，但仍然几乎全部致死。James R.Howe，Molecular Markers as a Tool for the EarlyDiagnosis of Pancreatic Cancer，Pancreatic Cancer 29(Douglas B.Evans等编辑，2002)。
除了年龄，已经鉴定了胰腺癌的大量危险因素，包含吸烟，膳食，职业，某些医疗条件，遗传性以及分子生物学。吸烟是获得疾病的最重要的危险因素，在大量研究中建立了吸烟和胰腺癌之间的联系，Li上述3。相对危险等于至少1.5，随吸烟水平的而增加而增加超过10-倍的危险比例，同上。其次的最主要因素似乎是膳食，摄取动物性蛋白质以及脂肪危险增加，摄取水果以及蔬菜危险降低，同上3-4。对于特定的职业而言，胰腺癌的过高患病率与化学，煤以及气体探测，金属工业，鞣革，纺织，铝碾磨以及运输的工人有联系。大量医学条件也与胰腺癌发病率的提高有关，包含糖尿病，慢性胰腺炎，胃切除术以及胆囊切除术，尽管没有建立的病因以及这些条件和胰腺癌之间的影响关系，Id。
遗传性遗传因素包含小于10％的胰腺癌肿瘤与遗传性胰腺炎以及家族癌症综合症基因诸如hMSH2和hMLH1(遗传性的nonpolyposis结肠癌)，p16(家族非典型的多mole-黑色素瘤)和BRCA1/BRCA2(乳房和卵巢癌)中的家系突变相关，同上3。虽然没有其它器官比胰腺具有更高的癌症遗传基础，研究人员已经不能精确定位对胰腺癌的易感性起决定因素的特定遗传缺陷。David H.Berger & William E.Fisher，Inherited Pancreatic Cancer Syndromes，Pancreatic Cancer 73(Douglas B.Evans等编辑，2002)。
根据分子生物学的观点，研究已经揭示了胰腺癌和大量遗传突变之间的关联，包含原癌基因K-ras的激活和肿瘤抑制基因p53，p16和DPC4的失活。Marina E.Jean等，The Molecular Biology of PancreaticCancer，Pancreatic Cancer 15(Douglas B.Evans等，2002)。
在胰腺癌的一个研究中，83％具有K-ras激活连同p16和p53的失活。在80到95％胰腺癌中发现K-ras突变，p53，p16和DPC4基因是胰腺癌中必须频繁缺失的肿瘤抑制基因。Howe，上述29。p16基因的纯合缺失，高度甲基化和突变已经发现存在于85到98％的胰腺癌中。正如所料通过K-ras，p53，p16和DPC4基因中改变的作用，细胞周期调控的缺失好象是胰腺肿瘤发生中的关键并且可以解释为什么癌症具有如此的侵袭性。Jean，上述15。研究还揭示了这种癌和某些生长因子和生长因子受体异常调控，基质金属蛋白酶和肿瘤血管生成调节因子的上调之间的联系。表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，转化生长因子-β，胰岛素样生长因子，肝细胞生长因子和血管内皮生长因子可能在胰腺癌中扮演各种作用，尽管这种作用还没有阐明同上18-22。
检测胰腺癌存在的筛选技术的发展对这种致死癌症是不可缺少的，因为大多数患者没有能表现，直至他们的胰腺肿瘤阻塞胆管或者诱导疼痛，在那个点肿瘤已经侵入胰腺周围的毛细管和淋巴脉管，Howe，上述29；令人遗憾地，患疾病转移形式的患者通常在诊断后成活小于1年，Jean等，上述15。虽然计算断层分析(CT)以及内窥镜逆行性胆胰管造影(ERCP)可能有助于有症状患者的诊断，目前没有筛选胰腺肿瘤的手段可以在早期发现，在早期可以被治愈，Howe，上述29。诸如癌胚抗原，以及针对人结肠癌(CA 19-9和CA 195)，人卵巢癌(CA 125)以及人胰腺癌(SPAN-1和DUPAN-2)的细胞系产生的抗体在胰腺癌患者的血清中的增加，但是这些标记不能足以作为可靠的筛选手段，由于他们缺少特异性并且在疾病晚期表现出来。Walter J.Burdette，Cancer：Etiology，Diagnosis，and Treatment 99(1998)；Hasholzner，U.等，Anticancer Res.19(4A)：2477-80(1999)。
由于目前缺乏恰当的筛选法，医生逐渐转向采用分子生物学方法作为疾病早期诊断最有前途方法的技术，Howe，上述30。目前，没有能够检测无征状个体胰腺癌的高灵敏性，高特异性标记，但是几个生物标志物正在研究之中，同上。目前重要的努力集中在K-ras，研究人员正在研究筛选胰液，胆汁，十二指肠液或者ERCP刷的样品的技术来检测K-ras突变，同上。因为这些样品的集合是侵入性的，并不特别有助于筛选无征状的患者，所以研究人员也已经转向分析血清和粪便的K-ras突变，前者最有前途，因为后者受到原始资料复杂性的阻碍，Id.35 38，42。此外，因为转录因子蛋白p53的血清水平可能与癌症的进展相关，p53同样作为可能的肿瘤标记物进行研究，同上37；Jean等，上述17。
一旦确诊了胰腺癌，根据癌症的阶段制定治疗策略。采用大量映象技术对胰腺癌划分阶段，计算断层照相术(CT)是目前选择的方法，Harmeet Kaur等，Pancreatic Cancer：Radiologic，Pancreatic Cancer 86(Douglas B.Evans等编辑，2002)；Ishiguchi，T.等，Hepatogastroenterology48(40)：923-27(2001)，尽管常常低估癌症的程度，因为小-体积转移常常超过CT的分辨率，H.J.Kim & K.C.Conlon，LaparascopicStaging，Pancreatic Cancer 15(Douglas B.Evans等编辑，2002)。MRI可以在某些点取代CT，因为其能够(1)在多种组织中对比，(2)修饰脉冲序列提高病变的目测和使矫作物最小化，(3)进行成像同时限制患者暴露于电离辐射，和(4)无需使用IV碘化的造影剂就可以对脉管显象，考尔等，上述87。然而，目前MRI尚未显示出超过CT清晰度的优点。
目前多种的超声技术也用于阶段划分，包含经腹壁的超声波(TUS)，内窥镜检查的超声波(EUS)以及手术中的超声波(IUS)，EUS是最有前途的一种，Kaur等，上述86；Richard A.Erickson，EndoscopicDiagnosis and Staging：Endoscopic Ultrasound，内窥镜逆行性胆胰管造影，Pancreatic Cancer 97-106(Douglas B.Evans等，2002)。然而，这些技术受限于多种因素：TUS由胃肠道内的气体和腹膜中的脂肪防碍，EUS需要超声波扫描术和内窥镜检查中相当的经验以及不能广泛应用，并且IUS只可以手术中应用，Kaur等，上述86。
尽管在初期的阶段，将参与胰腺癌阶段划分的标记的检索已经发现了某些可能的线索。例如，研究已经揭示两个转移-抑制基因，nm23-H1和KAI1取决于胰腺癌的阶段差异表达，在疾病的早期表达上调在晚期下调。Friess，H.等，J.Clin.Oncol.19(9)：2422-32(2001)。研究人员还集中于遗传淋巴结的阶段划分，尤其是探求K-ras原癌基因中的突变。Yamada T.等，Int’l J.Oncol.16(6)：1165-71(2000)。同样地，研究已经鉴定了突变的K-ras序列在血浆/血清中的存在与晚期胰腺癌有关，尽管早期胰腺癌的存在也可以用这种方法检测，G.D.，Clin.Cancer Res.6(6)：2129-37(2000)。利用多标记逆转录酶-聚合酶链式反应分析的有前途的阶段划分技术已经通过分析血液以及组织样品表达以下肿瘤标记物的mRNA成功鉴别了胰腺癌的阶段：β-人绒毛膜促性腺激素基因，肝细胞生长因子受体基因c-met，以及β-1，4-N-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶基因，Bilchik，A.等，Cancer 88(5)：1037-44(2000)。
通常用于对胰腺癌划分阶段的一个分类系统是由UnionInternationale Contre le Cancer设计的TNM系统.AJCC Cancer StagingHandbook 3(Irvin D.Fleming等，第5版1998)。这个系统被分成几个阶段，每个评价原发肿瘤(T)，局部淋巴结(N)以及远距离的转移(M)的癌症生长的程度，上文。
0阶段特征在于原位癌(Tis)，没有局部的淋巴结转移(N0)并且没有远距离的转移(M0)同上113。I以及II阶段与0阶段的差别在于肿瘤的类别：I阶段包括仅仅限于胰腺的肿瘤也就是说(1)最大尺寸(T1)2厘米或者更少或者(2)最大尺寸(T2)超过2cm，而II阶段包括直接扩散进入十二指肠，胆管或者胰周组织的肿瘤(T3)同上。III阶段包括T1，T2或者T3的肿瘤；包括单个淋巴结(pN1a)或者多个淋巴结(pN1b)的局部的淋巴结转移(N1)；并且没有远距离的转移(M0)。IVA阶段特征在于肿瘤直接扩散进入胃，脾脏，结肠或者邻近的大脉管(T4)；任意N类别；以及没有远距离的转移(M0)。最后，IVB阶段的特征在于任意T类别，任意N类别，以及远距离的转移(M1)。同前。
一旦癌症划分了阶段，该疾病的唯一公认的有效治疗是手术，并且仅仅百分之十到十五的患者能够经受可能的治愈切除术，Jean等，上述15；Fleming等，上述111；William F.Regine，Adjuvant：Past，Present，and Future Development，Pancreatic Cancer 235(Douglas B.Evans et al.，2002)。此外，那些经受切除术患者的5年存活率低于百分20。Regine，上述235。虽然诸如吉西他汀以及5-氟尿嘧啶的放疗已经显示了抗胰腺恶性肿瘤的某些有效性，事实是化疗对胰腺癌的存活率具有很少的影响，Burdette，上述101。放疗已经提供了相对其效力的矛盾结果，同上，尽管与5-氟尿嘧啶结合的放射已经显示了某些希望，Regine，上述235。
考虑到传统方法在治疗胰腺癌中的失败，已经研究了大量使用分子生物学技术的新方法。在基因治疗领域已经进行了重要的研究，包含反义技术，基因指导的潜药激活策略，启动子基因策略，以及肿瘤消解病毒治疗。Eugene A.Choi & Francis R.Spitz，Strategies for GeneTherapy，Pancreatic Cancer 331(Douglas B.Evans等，2002)；Kasuya，H.等，Hepatogastroenterology 48(40)：957-61(2001)。其它新近的方法已经集中于通过基底膜的降解及其在肿瘤周围基质降解以及血管生成中的作用促进肿瘤细胞转移并且侵入肿瘤细胞的基质金属蛋白酶的抑制。Alexander S.Rosemurgy，II & Mahmudul Haq，Role of MatrixMetalloproteinase Inhibition in the Treatment of Pancreatic Cancer，Pancreatic Cancer 369(Douglas B.Evans等，2002)。
从上文，很明显被用来检测，诊断，监控，阶段划分，预后以及阻止胰腺癌复发的方法对患者的结果是非常重要的。此外，当前的方法虽然有助于每一分析，当受限于其特异性，灵敏度，侵略性和/或其成本。因而，经由检测细胞，组织或者体液中新标记起作用，最小侵入性以及合理成本的高度特异性以及灵敏的方法是非常合乎需要的。
肺癌
几百年来，肺癌的发病率稳定提高，以致于现在许多国家是最普通的癌症。事实上，肺癌是美国男性以及妇女第二常见的癌症类型并且是这两类人最常见的癌症死亡的原因。肺癌死亡率自从1930以来在男性以及妇女中增加了十倍，主要是由于吸香烟人的增加，而且也是由于暴露于砷，石棉，铬酸盐，氯甲醚，镍，多环芳香烃及其它试剂的增加。参见Scott，Lung Cancer：A Guide to Diagnosis andTreatment，Addicus Books(2000)以及Alberg等，Kane等(编辑)Biologyof Lung Cancer，11-52页，Marcel Dekker Inc.(1998)。美国癌症学会估计在2004年将有超过173,550个新病例。另外，在2004年估计将有160,440例死亡。ACS网址：cancer with the extension.org。
肺癌源于发生于肺中的原发肿瘤或者从另一器官诸如肠或者乳房扩散的继发瘤。尽管有超过一打的肺癌类型，超过90％都属于两个类别：小细胞肺癌(SCLC)以及非小细胞肺癌(NSCLC)。参见Scott，上述。所有肺癌的约20-25％被鉴定为SCLC，而70-80％被诊断为NSCLC，同上。很少类型的肺癌是间皮瘤，其通常由暴露于石棉引起，并且影响肺的胸膜。肺癌通常由胸X射线，CAT扫描，PET扫描或者由唾液细胞学进行确诊或者筛选。肺癌的诊断通常由组织的活体检查得以证实，同前。
SCLC肿瘤是高度转移性的并且生长快速。等到患者已经确诊为SCLC，癌症通常已经扩散到身体的其它部分，包含淋巴结，肾上腺，肝脏，骨，大脑以及骨髓。参见，Scott，上述；Van Houtte等(编辑)，Progress and Perspective in the Treatment of Lung Cancer，Springer-Verlag(1999)。因为疾病通常扩散到不能选择手术的程度，当前选择的治疗是化疗加胸放疗，参见Van Houtte，上述。疾病的阶段是长期存活率的主要预测因子。小于5％的已经广泛扩散超过一个肺以及周围淋巴结的疾病的患者存活超过2年。然而，如果疾病仍然在限制阶段，也就是还没有扩散超过一个肺时确诊并治疗疾病5-年存活率可能高3到4倍。
NSCLC通常分成3种类型：鳞状细胞性癌，腺癌以及大细胞恶性肿瘤。鳞状上皮细胞癌症以及腺癌都从气道细胞系产生；然而腺癌由产生粘液的杯状细胞产生。大细胞肺癌被由此命名因为当显微观察时细胞大并且圆，并且通常被认为是相对未分化的。参见Yesner，Atlasof Lung Cancer，Lippincott-Raven(1998)。
次级肺癌是在身体其它地方开始已经扩散到肺的癌症。转移到肺的癌症包含但不限于乳腺癌，黑色素瘤，结肠癌以及Hodgkin’s淋巴瘤。次级肺癌的治疗可能取决于癌症的最初来源。换句话说，源于乳腺癌的肺癌可能对乳腺癌治疗更敏感并且源于结肠癌的肺癌可能对结肠癌治疗更敏感。
癌症的阶段显示其已经扩散多远以及是预后的重要指标。此外，阶段划分的重要性在于治疗常常根据癌症的阶段进行确定。SCLC被分成两阶段：受限的疾病，即癌症只在一个肺中以及附近的淋巴结中可见；扩散疾病，即癌症已经扩散到肺外部到胸部或者身体的其它部分。对于患SCLC的大多数患者，疾病在诊断的时候已经发展到淋巴结或者身体内的其它地方，参见Scott，上述。即使在扫描时扩散不明显，很可能某些癌症已经扩散离开并且穿过血液或者淋巴系统。通常，有或者没有放疗的化疗常常是优选的治疗。最初进行的扫描以及试验可在后来使用来观察患者是否良好应答治疗。
相反，非小细胞癌症可以分成4个阶段。I阶段是高度定位癌症，淋巴结中没有癌症。II阶段癌症已经扩散到感染的肺顶部的淋巴结。III阶段癌症已经扩散到癌症开始的附近。可以是胸壁，肺的覆盖物(胸膜)，胸部的中间(纵隔)或者其它淋巴结。IV阶段癌症已经蔓延到身体的另一个部分。I-III阶段癌症通常用手术治疗，有或者没有化疗。IV阶段癌症通常用化疗和/或缓和护理进行治疗。
已经在肺癌中观察到大量染色体以及遗传异常。NSCLC中，染色体畸变已经描述在3p，9p，11p，15p以及17p上，染色体缺失已经发现在染色体7，11，13以及19上。参见Skarin(编辑.)， Multimodality Treatment of Lung Cancer，Marcel Dekker Inc.(2000)；Gemmill等，465-502页，Kane，上述；Bailey-Wilson等，53-98页，Kane，上述。染色体异常已经描述SCLC中的1p，3p，5q，6q，8q，13q以及17p上。此外，染色体3p短臂的缺失也已经在大于90％的SCLC肿瘤以及约50％的NSCLC肿瘤中发现，Id。
大量致癌基因以及肿瘤抑制基因与肺癌有关，参见Mabry，391-412页，Kane，上述以及Sclafani等，295-316页，Kane，上述。在SCLC和NSCLC中，p53肿瘤抑制基因突变超过肺癌的50％。参见Yesner，上述。染色体3p上发现的另一肿瘤抑制基因FHIT由烟草烟雾突变，同上；Skarin，上述。此外，超过95％的SCLCs以及约20-60％的NSCLCs不存在另一个肿瘤抑制因子基因，成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白或者异常。ras致癌基因(尤其是K-ras)在20-30％的NSCLC样品中突变并且c-erbB2致癌基因在18％的2阶段NSCLC以及60％的4阶段NSCLC样本中表达。参见Van Houtte，上述。其它染色体9区，具体9p21区域中发现的肿瘤抑制基因在许多癌症细胞中缺失，包含p16INK4A以及p15INK4B。参见Bailey-Wilson，上述；Sclafani等，上述。这些肿瘤抑制基因也可能参与肺癌的发病机理。
此外，许多肺癌细胞产生可能在肺癌细胞上以自分泌或者旁泌性方式起作用的生长因子。参见Siegfried等，317-336页，Kane，上述；Moody，337-370页，Kane，上述以及Heasley等，371-390，Kane，上述。在SCLC中，许多肿瘤细胞产生胃分泌素-释放肽(GRP)，其是这些细胞的增殖生长因子。参见Skarin，上述。许多NSCLC肿瘤表达表皮生长因子(EGF)受体，使NSCLC细胞响应EGF增殖。胰岛素样生长因子(IGF-I)在大于95％的SCLC中增加以及大于80％的NSCLC肿瘤中增加；它被认为是起自分泌生长因子的起作用，同上。最后，干细胞因子(SCF，又名青灰因子(steel factor)或者kit配体)以及c-Kit(SCF的原癌蛋白酪氨酸激酶受体)两个都在SCLC中高水平表达，并且由此可以形式促进增殖的自分泌环同前。
尽管大多数肺癌病例可归因于吸香烟，大多数吸烟者并不发展肺癌。流行病学的证据已经表明肺癌的易感性可能以Mendelian方式遗传，并且因此具有遗传的遗传组分。Bailey-Wilson，上述。因此，人们认为某些基因位点的某些等位基因的变体可能影响对肺癌的易感性，同上。鉴定那个等位基因的变体可能与肺癌易感性，以及对其它疾病的易感性相关的方法就是考虑肺中高度表达的基因的等位基因的变体。
肺对大量其它使人虚弱的疾病易感，包含，但不限于肺气肿，肺炎，囊性纤维化以及哮喘。参见Stockley编辑) Molecular Biology of the Lung，I卷：Emphysema and Infection，Birkhauser Verlag(1999)，以下Stockley I，以及Stockley(编辑)，Molecular Biology of the Lung，II卷：Asthma and Cancer Birkhauser Verlag(1999)以下Stockley II。许多这些失调的病因尚未理解，如果存在的话有几个对于许多这些非癌性肺失调的良好的治疗选择。因此，还有对理解多种非癌性肺失调以及鉴定这些疾病的治疗的需要。
胚胎发育期间肺组织的发育以及分化也非常重要。呼吸道的所有上皮细胞，包含肺以及支气管的上皮细胞来源于决定胚胎发育的原始内胚层细胞，参见Yesner，上述。胚胎发育期间，多能内胚层干细胞分化成许多不同类型的特化细胞，其包含移动吸入粒子的纤毛细胞，用于产生粘液的杯状细胞，用于内分泌功能的Kulchitsky’s细胞以及用于分泌表面活性剂蛋白的Clara细胞以及II型肺细胞，同上。不适当的发育以及分化可能引起孕妇，尤其是早期孕妇的呼吸障碍以及抑郁，当生产时其肺不能产生充分的表面活化剂。此外，某些肺癌细胞，尤其是小细胞恶性肿瘤是塑性的并且可以将其表型改变成多种细胞类型，包含大细胞恶性肿瘤，腺癌以及鳞状细胞性癌，同上。因此，更透彻理解肺发育以及分化可以有助于对肺癌的起源以及进展的理解。
最普遍的肺癌筛选试验为胸部X-射线和唾液细胞学试验。随机对照试验没有证明肺癌死亡率由于用胸部X-射线和/或唾液细胞学筛选而减少。另外，当唾液细胞学用作每年进行胸部X-射线的辅助试验时没有证明是有效的。用胸部X-射线加唾液细胞学筛选用于在早期检测肺癌，但其也被期望在筛选试验中试验是否有效的降低死亡率。由于通过目前的筛选法未能降低肺癌患者的死亡率，因此目前的肺癌筛选法是不充分的。
使用胸部放射显影筛选有两种重要的潜在危险。首先，假阳性测定结果可导致不必要的侵入措施，诸如透皮穿刺活检或胸廓切开术。这些措施是昂贵的并由于它们侵入特性带来一些危险。使用胸部放射显影筛选的第二种危险是过度诊断。过度诊断是没有变成临床上显著的小或慢慢生长的肿瘤其没有通过筛选被检测到的诊断。尽管过度诊断几乎不可能记录在活个体中，但活体检查研究表明许多患有肺癌个体的死亡不是因为肺癌。
另外，肺癌类型的分布在最近的二十年发生变化。尽管过去最普遍的类型是鳞状上皮细胞癌(通常位于中心)，而现在最普遍的类型是腺癌(通常位于外围)。后者通过胸部X-射线更能在早期检测，其局限性如上所述。相反，唾液细胞学在鳞状上皮细胞癌检测中比在腺癌检测中更敏感，因此缺少对更普遍的腺癌的有用检测。显然，需要新的高灵敏度的非-侵入检测肺癌的方法。
已经进行了充分的努力来提高具有更新技术的肺癌筛选方法，包括低-剂量螺旋式计算断层分析(LDCT)和分子技术。LDCT比胸部放射显影法更为敏感。在最近的筛选研究中，在很多I期肺癌中CT检测几乎是胸部放射显影法的6倍且这些肿瘤大多数的直径为1cm或更小。然而，用LDCT进行的有效筛选还没有在对照临床试验中评价。
有两种抗任意用LDCT筛选的潜在益处的潜在危险必须被考虑。更普遍的和熟悉的危险为假阳性试验结果，其可导致焦虑和侵入诊断程序。更少的熟悉的危险为过度诊断，没有变成临床显著的病症的诊断使其不能通过筛选被检测到。在用LDCT筛选的情况下，过度诊断可导致不必要的需要一些外科手术例如，叶切除术，化疗和放疗组合的肺癌诊断。如上所述，过度诊断几乎不可能在活个体中记录。在一个大规模的研究中，活体检查中发现的约所有肺癌的六分之一在死亡之前没有临床确认。此外，活体检查可能不能检测许多可通过CT检测的小肺癌。
目前用于肺癌的治疗是相当有限的。通常，患者的选择包括外科手术，放疗，和化疗。
取决于肺癌的类型和阶段，可通过外科手术除去肿瘤与周围的一些肺组织。叶切除术是指除去肺的肺叶(部分)。如果除去全部的肺，外科手术被称为肺切除术。仅仅除去部分肺叶被称为分段切除术或楔形切除术。
如果癌症扩散到大脑，由去除脑转移可获得益处。这包括颅骨切开术(通过在颅骨中的洞进行外科手术)。
放疗存在若干方法。体外束放疗利用聚焦于癌症的从体外传输的射线。此类放疗最常用于治疗原发肺癌或者转移到其它器官的肺癌。
短距离放疗利用直接放置到癌性组织中或放置到邻近癌的气道中的放射性物质的小球。有时放疗用作肺癌的主要(初期)治疗方法，尤其是如果患者的常规健康状态太弱以至于不能进行手术时。短距离放疗还可以用于帮助减轻由于癌症导致的大气道的堵塞。
另外，放疗可用作外科治疗后的方法来杀伤在外科手术过程中不能看见或除去的剩余的非常小的肿瘤。放疗还可以用于缓解(减轻)肺癌的症状诸如疼痛，出血，吞咽困难，以及由脑转移所引起的问题。
对于化疗而言，顺氯氨铂或有关的药物，卡铂，是治疗NSCLC中最常使用的化疗剂。最近的研究发现任一这些药物诸如吉西他汀(吉西他汀)，太平洋紫杉醇，多西他赛(docetaxel)，鬼臼亚乙苷，或长春瑞宾(vinorelbine)的组合在治疗NSCLC中好象更有效。
最近，国家综合肿瘤网(NCCN；nccn with the extension.org)，十九个世界先进肿瘤中心的联盟，宣布了NCCN非-小细胞肺癌临床实践原则的主要更新。NCCN被广泛地公认为肿瘤学临床政策的标准。
最近批准的靶向治疗，gefitinib(Iressa，AstraZenecaPharmaceuticals LP)现在被推荐为第三选择治疗且只有当铂/多西他赛组合被用作第一选择时才作为第二选择。
NCCN的非-小细胞肺癌(NSCLC)指导包括向具有此病的患者施用化疗的建议包括患者选择原则以及第一-，第二-，以及第三-选择药物及其组合的限定。
化疗药物被规定作为两-药物方式用于第一选择治疗，两剂方式或单一剂用于第二选择治疗，且一个单一剂用于第三-选择治疗。用于第一-和第二选择治疗的药物为：顺氯氨铂(Platinol，Bristol-MyersSquibb Company)，卡铂(Paraplatin，Bristol-Myers Squibb Company)，太平洋紫杉醇(Taxol，Bristol-Myers Squibb Company)，多西他赛(Taxotere，Aventis Pharmaceuticals Inc.)，长春瑞宾(Navelbine，GlaxoSmithKline)，吉西他汀(Gemzar，Eli Lilly and Company)，鬼臼亚乙苷(Toposar，Pfizer，Inc.；VePesid，Bristol-Myers Squibb Company；Etopophos，Bristol-Myers Squibb Company)，依立替康(Camptosar，Pfizer，Inc.)，长春花碱(Velban，Eli Lilly and Company)，丝裂霉素(Mutamycin，Bristol-Myers Squibb Company)和异环磷酰胺(Ifex，Bristol-Myers Squibb Company).
用于SCLC患者的某些常规化疗组合包括：EP(鬼臼亚乙苷和顺氯氨铂)；ET(鬼臼亚乙苷和卡铂)；ICE(异环磷酰胺，卡铂和鬼臼亚乙苷)；以及CAV(环磷酰胺，阿霉素和长春新碱)。
在一些SCLC研究中新药诸如吉西他汀，太平洋紫杉醇，长春瑞宾，topotecan，以及表鬼臼毒噻吩糖苷显示出有潜力的结果。如果患者健康状态良好，生长因子可以与化疗药物一起结合使用。施用生长因子有助于预防骨髓副作用。
正在进行的或最近完成的肺癌治疗试验中所用的各种化合物包括alitretinoin(Panretin，Ligand Pharmaceuticals)，topotecan HCl(HycamtinGlaxoSmithKline)，脂质体醚脂类(Elan Pharmaceutical)，cantuzumab mertansine(ImmunoGen)，Gavax(Cell Genesys)，长春新碱(Onco TCS，Inex Pharmaceuticals)，Neovastat(AEterna Laboratories)，squalamine(Genaera)，mirostipen(Human Genome Sciences Inc.)，Advexin(Introgen Therapeutics)，biricodar dicitrate(Incel，VertexPharmaceuticals)，黄酮吡醇(Aventis)，Affintac(Eli Lilly andCompany)，特戊酰羟甲氧基甲基丁酸盐(Pivanex，TitanPharmaceuticals)，替拉扎明(Tirazone，Sanofi-SynthelaboPharmaceuticals)，依立替康(Camptosar，Pharmacia)，tezacitabine(Chiron)，cisplatin/vinblastine/amifostine(MedImmune)，太平洋紫杉醇/卡铂/氨磷汀(MedImmune)，Oncomyc-NG(AVI BioPharma)，exisulind/长春瑞宾(Aptosyn/Navelbine，Cell Pathyways)，tariquidar(QLT)，Xyotax(Cell Therapeutics)，PEG-camptothecin(Prothecan，Enzon)，地西他滨(SuperGen)，Tarceva(OSI Pharmaceuticals)，ABX-EGF(Abgenix)，Tocosol Paclitaxel(Sonus Pharmaceuticals)，TheraFab(Antisoma)，minodronate(Yamanouchi Pharmaceutical)，exisulind/多西他赛/卡铂(Aptosyn/Taxotere/Paraplatin，Cell Pathways)，exisulind/吉西他汀HCl(Aptosyn/Gemzar，Cell Pathways)，IMC-C225/卡铂/太平洋紫杉醇(Erbitux/carboplatin/paclitaxel，ImClone Systems)，和长春瑞宾(Navelbine，GlaxoSmithKline)。
如上所述，许多疗法被推荐用于组合作为第一选择或如果其它的疗法不能用作第二和第三选择的药物。虽然在正在进行的或最近完成的治疗试验中有许多化合物，但仍然对能够治疗早期和严重的或转移的肺癌的其它治疗化合物有大的需求。
因此，仍需要预计人是否可能发展为肺癌，确诊肺癌，监控疾病进展，对肺癌进行阶段划分，以及确定肺癌是否已经转移以及肺癌造影的更敏感和精确的方法。还需要对肺癌的更好的治疗。此外，对诊断和治疗非癌性肺失调诸如气肿，肺炎，肺感染，肺纤维化，囊状纤维化和哮喘有强烈的需要。仍需要组合物以及利用这些组合物来用于法医目的的肺组织鉴定以及确定特定的细胞或组织是否显示出肺-特异性特征。
正如以上所讨论的，每一用于诊断和对乳房，卵巢胰腺和肺癌阶段划分的方法受所用技术的限制。因此，需要对检测乳房，卵巢，胰腺和肺癌包括转移性肿瘤敏感的分子和细胞标记和试剂。因此，需要用于精确阶段划分包括乳房，卵巢，胰腺和肺癌的临床和病理学阶段划分的分子标记和试剂，来优化治疗的方法。最后，需要敏感的分子和细胞标记和试剂来监控肿瘤进展，包括可检测症状缓解之后乳房，卵巢，胰腺和肺癌复发的标记。
本发明提供了用于治疗乳房，卵巢，胰腺和肺癌的任选的试剂和方法，其克服了常规治疗方法的局限性并且提供了下面具体描述的其它优点。
肿瘤中的血管生成
实体肿瘤的生长和转移也依赖于血管生成。Folkman，J.，1986，Cancer Research，46，467-473；Folkman，J.，1989，Journal of the NationalCancer Institute，82，4-6。其已经显示，例如，扩大至大于2mm的肿瘤必须获得其自己的血液供给且其通过诱导新毛细血管的生长来实现。一旦这些新血管嵌入肿瘤中，它们将提供肿瘤细胞进入循环以及转移至远距离位点诸如肝脏，肺或骨的途径。Weidner，N.，等，1991，TheNew England Journal of Medicine，324(1)，1-8。
血管生成，定义为新血管由存在的血管的生长或萌芽，是一个主要在胚胎发育过程中出现的复杂过程。该过程不同于血管发生，因为血管内的内皮细胞来源于已存在细胞的增殖，而不是由干细胞分化而来。该过程是侵入性的且依赖于胞外基质(ECM)的蛋白酶解，新内皮细胞的迁移，以及新基质成分的合成。血管生成发生在循环系统的胚胎发育过程中；然而，在成年人中，血管生成仅仅以对病理学病症应答的形式出现(除在女性生殖周期过程中)。
在成人的正常生理条件下，血管生成仅仅在非常有限的情况中发生诸如毛发生长和伤口治愈。Auerbach，W.和Auerbach，R.，1994，Pharmacol Ther.63(3)：265-311；Ribatti等，1991，Haematologica 76(4)：311-20；Risau，1997，Nature 386(6626)：671-4。通过血管生成由导致内皮细胞迁移柱形成的刺激而进行。蛋白质分解活性集中在这些“血管萌芽”的高级末端，其充分破坏ECM以允许细胞柱渗透和迁移。在推进前缘的后面，内皮细胞分化并开始彼此粘附，由此形成新的基底膜。细胞则停止增殖且最后形成新的小动脉或毛细血管的内腔。
未调节的血管生成逐步被识别用于负责各种各样的失调，包括但不限于，肿瘤，心血管疾病，风湿性关节炎，牛皮癣和糖尿病性视网膜病。Folkman，1995，Nat Med 1(1)：27-31；Isner，1999，Circulation 99(13)：1653-5；Koch，1998，Arthritis Rheum 41(6)：951-62；Walsh，1999，Rheumatology(Oxford)38(2)：103-12；Ware and Simons，1997，Nat Med3(2)：158-64。
特别有意义地观察到血管生成是实体肿瘤的生长和转移所需要的。Folkman，1986 supra；Folkman 1990，J Natl.Cancer Inst.，82(1)4-6；Folkman，1992，Semin Cancer Biol 3(2)：65-71；Zetter，1998，Annu RevMed 49：407-24。肿瘤通常以一个单的异常细胞开始，其取决于与可利用的毛细血管床的距离可仅增殖到几立方毫米的大小，且其可长时间保持`休眠`不进一步生长和扩散。一些肿瘤细胞则转换到为血管生成表型来激活内皮细胞，其增殖和成熟为新的毛细血管。这些新形成的血管不但允许原发肿瘤的继续生长，而且用于转移性肿瘤细胞的扩散和再定殖。控制血管生成转换的精确的机制现在仍没有较好的了解，但人们相信肿瘤块的新血管化是由于大量血管生成刺激物和抑制因子的净平衡导致的，Folkman，1995，见上文。
由O′Reilly和Folkman.O′Reilly等，1997，Cell 88(2)：277-85；O′Reilly等，1994，Cell 79(2)：315-28鉴定的最有效的血管生成抑制因子之一为血管内皮抑素(Endostatin)。该发现基于特定的原发肿瘤可抑制远距离转移的生长。O′areilly和Folkman推测原发肿瘤通过产生超过抑制因子的血管生成刺激物激发血管生成，然而，血管生成抑制因子，依靠它们的在循环中比较久的半衰期，达到多于刺激物的继发瘤的位点。净结果是原发肿瘤的生长和继发瘤的抑制。血管内皮抑素是由原发肿瘤产生的这种血管生成抑制因子的一种。其是较大蛋白的蛋白水解的片段：血管内皮抑素(Endostatin)为胶原蛋白XVIII(鼠胶原蛋白XVIII的氨基酸H1132-K1315)的20kDa的片段。血管内皮抑素(Endostatin)已显示出特异性抑制内皮细胞体外增殖以及阻断体内血管生成。更重要地，将血管内皮抑素施用于具有肿瘤的小鼠导致显著的肿瘤衰退，并且甚至在多次治疗周期之后观察到无毒性或耐药性。Boehm等，1997，Nature 390(6658)：404-407。血管内皮抑素靶向遗传稳定的内皮细胞并抑制各种实体肿瘤的事实使其成为非常有魅力的抗癌治疗候选物。Fidler和Ellis，1994，Cell 79(2)：185-8；Gastl等，1997，Oncology 54(3)：177-84；Hinsbergh等，1999，Ann Oncol 10 Suppl 4：60-3。此外，血管生成抑制因子已被证明当与放疗和化疗药物结合时更有效。Klement，2000，J.Clin Invest，105(8)R15-24.Browder，2000，Cancer Res.6-(7)1878-86，Arap等，1998，Science 279(5349)：377-80；Mauceri等，1998，Nature 394(6690)：287-91。
本发明提供了用于治疗乳腺，卵巢，胰腺和肺癌的任选的方法，其克服了常规治疗方法的局限性以及提供下面具体描述的其它优点。
发明概述
本发明涉及体内结合于哺乳动物细胞上Pro104的分离的Pro104抗体。本发明更进一步涉及在与哺乳动物细胞上Pro104体内结合后内在化的分离的Pro104抗体。抗体可以是单克隆抗体。或者，抗体是抗体片段或者嵌合或者人源化的抗体。所述单克隆抗体可以由选自美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生。
抗体与美国典型培养物保藏中心以保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体竞争结合相同的表位。
本发明还涉及结合的抗体。它们可结合于生长抑制剂或者细胞毒剂。细胞毒剂可选自毒素，抗生素，放射性同位素以及核酸降解酶以及毒素。毒素的实例包括但是不局限于，maytansin maytansinoids，皂草素，gelonin，蓖麻毒或者卡奇霉素。
哺乳动物细胞可以是癌细胞。优选地，抗Pro104单克隆抗体抑制表达Pro104的癌细胞的体内生长。
抗体可在细菌中产生。或者，抗体可以是由选自ATCC保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生的抗Pro104抗体的人源化形式。
优选地，癌症选自乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌。本发明还涉及制备抗体的方法，包括培养合适的细胞以及从细胞培养物回收抗体。
本发明还涉及含有抗体以及载体的组合物。抗体可以结合于细胞毒剂。细胞毒剂可以是放射性同位素或者另一种化疗剂。
本发明还涉及杀伤表达Pro104的癌细胞的方法，包括将癌细胞与本发明的抗体接触，由此杀伤癌细胞。癌细胞可以选自乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌细胞。
卵巢癌可以是卵巢浆液腺癌。
乳腺癌可以是浸润性乳腺管癌。
乳腺，卵巢，胰腺或者肺癌还可以是转移性的。
本发明还涉及减缓哺乳动物表达Pro104的癌症的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的抗体。
此外，本发明涉及包括容器以及在其中容纳组合物的制品，其中的组合物包括如本发明所述的抗体。制品还可以包括另外的组分，例如标明该组合物可用于治疗卵巢或者胰腺癌的包装说明书。
附图说明
图1显示Pro104.D116.1MAb与用Pro104瞬间转染的293F细胞结合。
图2显示Pro104.D118.1MAb与用Pro104瞬间转染的293F细胞结合。
图3显示Pro104.C19.1与表达Pro104的活HeLa癌细胞结合。
图4显示Cy3-Pro104.C25.1与表达Pro104的活HeLa癌细胞结合。
图5显示Cy3-Pro105.C25.1与表达Pro105的活HeLa癌细胞结合并在其中内在化。
图6显示Cy3-Pro104.C19.1与表达Pro104的胰腺癌细胞结合并在其中内在化。
图7显示Cy3-Pro104.C55.1与表达Pro104的胰腺癌细胞结合并在其中内在化。
图8显示Pro104.C25.1与卵巢肿瘤中的癌细胞上的Pro104结合。
图9显示Pro104.C25.1与卵巢癌细胞膜上的Pro104结合。
图10显示Pro104.D9与卵巢癌细胞膜上的Pro104结合。
图11显示Pro104.D133与卵巢浆液化癌细胞膜上的Pro104结合。
图12显示Pro104.C25.1与胰腺肿瘤中的癌细胞上的Pro104结合。
图13显示证实Pro104 MAb免疫标记的特异性对照。
图14显示了Pro104 MAbs的表位图谱。
图15显示了显示在mRNA+细胞系以及卵巢肿瘤组织(T)而非正常相邻组织(N)中检测到Pro104蛋白的Western印迹。
图16显示Pro104的超量表达引起EGF受体的磷酸化。
图17显示Pro104蛋白被糖基化并且连接GPI。
图18显示细胞系中天然Pro104的表面生物素酰化。
图19显示RK3E细胞中Pro104蛋白的逆转录病毒介导的超量表达。
图20显示SKOV3细胞中逆转录病毒介导的Pro104蛋白的超量表达。
图21显示HeLa细胞中siRNA介导Pro104蛋白的特异性下调。
图22显示CaOV3细胞中siRNA介导Pro104蛋白的特异性下调。
图23显示CaOV3细胞中Pro104 mRNA的Pro104 siRNA特异性敲除。
图24显示HeLa细胞中Pro104 mRNA的Pro104 siRNA特异性敲除。
图25显示与阳性对照相比HeLa细胞中的Pro104 mRNA的Pro104siRNA特异性敲除。
图26显示诱导HeLa细胞中特异性mRNA敲除以及细胞程序性死亡的不同的Pro104 siRNAs。
图27显示诱导细胞死亡的HeLa细胞中Pro104 siRNA的特异性敲除。
图28显示胞程序性死亡的HeLa细胞中Pro104 siRNA的特异性mRNA敲除诱导细。
图29显示诱导细胞程序性死亡的CaOV3细胞中Pro104 mRNA的特异性敲除。
图30显示Pro104 siRNA对不含有Pro104 mRNA的细胞的程序性死亡没有影响。
图31显示在软琼脂中诱导细胞生长的Pro104的超量表达。
图32显示Pro104蛋白酶活性是细胞生长所需的。
图33显示由抑制HeLa细胞在软琼脂中生长的siRNA引起Pro104 mRNA的敲除。
图34显示由抑制HeLa细胞在软琼脂中生长的siRNA敲除的Pro104 mRNA。
图35显示过量表达Pro104的人肿瘤细胞生长的增长。
发明详述
定义以及常规技术
在这里使用的人“Pro104”是指作为糖蛋白在细胞表面上表达的314个氨基酸的蛋白。Pro104的核苷酸以及氨基酸序列公开在例如WO200016805-A1 PA(DIAD-)DIADEXUS人癌-特异性基因，Pro104；WO9836054-A1 PA(AMRA-)AMRAD HELA2短同种型的核苷酸序列；以及J.D.Hooper等，Testisin，一种新的人丝氨酸蛋白酶由减数分裂前的睾丸精子细胞表达并且在睾丸精子细胞肿瘤中丧失。CancerResearch 59：3199-3205(1999)。Pro104还公开在REFSEQ数据库中，如：NM_006799.2 GI：21614534)人类蛋白酶，丝氨酸，21(testisin)(PRSS21)，转录本变体1，mRNA。RefSeq给出了下列PRSS21(Pro104)的摘要信息：
该基因编码细胞表面锚定的丝氨酸蛋白酶，其是丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶家族的成员。据预测其在包括赖氨酸或者精氨酸的羧基的肽键上是活化的。该蛋白位于减数分裂前睾丸精子细胞的细胞质以及质膜上，可能参与精子细胞来源的睾丸肿瘤的进展。该基因的选择性剪接产生编码3个不同同种型的3个转录本的变体。
Pro104的氨基酸大概位于细胞表面上。在这里使用的Pro104包括具有Pro104生物活性的蛋白的等位基因变体或者保守取代的突变体。另外，剪接变体可能具有Pro104生物活性。以上参考的剪接变体的RefSeq登录号包括：NM_144956.1(GI：21614530)人类蛋白酶，丝氨酸，21(testisin)(PRSS21)，转录本变体2，mRNA；以及NM_144957(GI：21614532)人类蛋白酶，丝氨酸，21(testisin)(PRSS21)，转录本变体3，mRNA。
我们发现Pro104显然与多种侵入性的乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌相关使得这种细胞表面抗原成为这些以及其它肿瘤类型的免疫疗法引人注目的目标。
在这里使用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们显示出所希望的生物活性。在本发明中术语“免疫球蛋白”(Ig)可以与“抗体”交替使用。
“分离的抗体”是已经从其自然环境的组分鉴定和分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分是将干扰抗体诊断或者治疗应用的物质，可以包括酶，激素，及其它蛋白质的或者非蛋白溶质。优选地，抗体可以被纯化成(1)由Lowry法确定的按重量计大于抗体的95％，并且最优选地按重量计超过99％，(2)通过利用旋转杯测序仪足以获得至少15个N-末端或者内部氨基酸序列的残基水平，或者(3)利用考马斯蓝或者优选银染鉴定的还原或者非还原条件的SDS-PAGE的均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体因为不会存在抗体自然环境的至少一种组分。然而，通常，分离的抗体可以通过至少一个纯化步骤制备。
碱性4-链抗体单位是由2个相同的轻(L)链以及2个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白(包括5个碱性异四聚体单位连同附加的称作J链的多肽的IgM抗体，因此包含10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合形成包括2-5个碱性4-链单位连同J链的多价聚集物)。就IgGs来说，4-链单元通常为约150,000道尔顿。每一L链由一种共价二硫键连接于H链，而2条H链由取决于H链同种型的一或者多个二硫键彼此连接。每一H以及L链同样具有有规则间隔的链内二硫键。每一H链在N-末端具有可变结构域(VH)，对于每一α，β以及γ链继之以3个保守结构域(CH)以及μ以及ε同种型4个CH结构域。每一L链在N-末端具有可变域(VL)在其另一末端继之以保守结构域(CL)。
VL与VH排成直线并且CL与重链的第一保守结构域(CHI)排成直线。特定的氨基酸残基被认为是形成轻链和重链可变域之间的界面。一对VH和VL合起来形成单个抗原结合位点。对于不同种类的抗体的结构和特性而言，例如参见Basic and Clinical Immunology，8th版，Daniel P.Stites，Abba I.Teff和Tristram G.Parslow(eds.)，Appleton& Lange，Norwalk，CT，1994，第71页以及第6章。
任一脊椎动物物种来源的L链可以根据保守结构域的氨基酸序列被指定为2中不同类型中的一种，称作κ以及λ。取决于重链(CH)保守结构域的氨基酸序列，可以被归纳为不同的种类或者同种型。有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG以及IgM，分别具有称为α，δ，ε，γ以及μ的重链。γ以及α类根据CH序列与功能的相对微小的差异更进一步分到亚类，例如，人表达下列亚类：IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1以及IgA2。
术语“可变的”是指可变域的某些部分在抗体之间序列上显著不同。V结构域介导抗原结合并且决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性在可变域的1-10个氨基酸跨度并不均匀分布。反而，V区包含相对不变的称作15-30氨基酸的构架区(FRs)的范围，所述氨基酸由极端变异性的每个9-12个氨基酸长的称作“高变区”的较短区域分隔。天然重链以及轻链的可变域包括4个FRs，基本上采用P-薄片构型，由3个高变区连接形成环连接，并且有时形成部分P-片状结构的一部分。每一链中的高变区在附近由FRs与另一个链的高变区结合在一起，促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，5th版本Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。保守结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出不同的效应子功能，诸如抗体参与抗体的依赖细胞细胞毒性(ADCC)。
在此处使用的“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补决定区”或者“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中残基约24-34(LI)，50-56(L2)以及89-97(L3)，以及VH中大约1-35(HI)，50-65(H2)以及95-102(113)；Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第五版本Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自“高变的环”(例如VL中残基26-32(LI)，50-52(L2)以及91-96(U)，VH中26-32(HI)，53-55(1-12)以及96-101(H3)；Chothia以及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
在这里使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的抗体群获得抗体，即包括除了以微小量存在的可能天然存在突变外相同群的个体抗体。单克隆抗体高度特异性，抗单个抗原的位点。此外，和包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每一单克隆抗体针对的是抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的优点在于合成的抗体没有其它抗体的杂质。改性剂“单克隆”不能认为是需要由任一特定的方法产生抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以由首先在Kohler等，Nature，256：495(1975)中描述的杂交瘤方法制备，或者可以利用重组DNA方法在细菌，真核动物或者植物细胞中进行制备(参见，例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可以利用例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)以及Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)描述的技术从噬菌体抗体文库进行分离。
在这里的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与来源于特定物种的抗体中的相应的序列相同或者同源或者属于特定的抗体种类或者亚类，而链其余的部分与来源于另一物种的抗体中的相应的序列相同或者同源或者属于另一抗体种类或者亚类，以及这种抗体的片段，只要它们显示出期望的生物活性(参见美国专利4,816,567；以及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。在这里使用的嵌合抗体包括“灵长目化”的抗体，包括来源于非人灵长类动物(例如旧时代猴，猿等等)的可变域抗原-结合序列以及人保守区序列。
“完整的”抗体包括抗原结合位点以及CL以及至少重链保守结构域，CHI，CH2以及CH3。保守结构域可以是天然序列保守结构域(例如人天然的序列保守结构域)或者其氨基酸序列变体。优选地，完整的抗体具有一或者多种效应子功能。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或者可变区。抗体片段的实例Fab，Fab′，F(ab′)2，以及Fv片段；双链抗体；线性抗体(参见US专利5,641,870，实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单-链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生2个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，以及残留的“Fc”片段，反映易结晶能力的指示。Fab片段包含全部L链连同H链的可变区结构域(VH)，以及一条重链的第一保守结构域(CHI)。每一Fab片段就抗原结合而论是单价的，即它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab′)2片段，其大致相当于具有二价抗原-结合活性的两个二硫化物连接的Fab片段并且仍然能够交联抗原。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在包括一或者多个来自抗体绞链区的半胱氨酸的CHI结构域的羧基末端具有附加的结合残基。Fab′-SH在这里是指Fab′的保守结构域的半胱氨酸残基具有一个游离的硫醇基。F(ab′)2抗体片段最初产生为一对8Fab′片段，在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。
Fc片段包括由二硫化物结合在一起的两个H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区域中的序列决定，该区域也是由某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是包含完全抗原-识别以及-结合位点的最小抗体片段。该片段包含一条重链以及一条轻链可变区结构域紧密非共价结合的二聚体。从这两个结构域的折叠发出6个用于抗原结合的氨基酸残基以及给抗原赋予对抗体结合特异性的高变环(每一H以及L链3环)。然而，即使单个可变域(或者只包括对于抗原的3个特异性CDRs的Fv的一半)也具有识别以及结合抗原的能力，虽然比全部结合位点的亲合性降低。
也缩写为“sFv”或者“scFv”的“单链Fv”是包含连接到单多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽更进一步包括VH和VL结构域之间能够使sFv形成抗原结合所需结构的多肽接头。关于sFv的评论，参见Pluckthun的The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，卷113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，纽约，pp.269-315(1994)；Borrebaeck 1995，下文。
术语“双链抗体”是指通过用VH和VL结构域之间的短接头(“大约5-10个残基)构建sFv片段(参见前段)从而获得V结构域的链间而非链内配对产生的二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段制备小的抗体片段。双特异性双链抗体是两个“交迭”sFv片段的杂二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同多肽链上。双链抗体更全面描述于例如，EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中。
“天然序列”多肽是与天然来源的多肽(例如抗体)具有相同氨基酸顺序的多肽。这种天然序列多肽可以分离自自然或者可以由重组体或者合成的方法产生。如此，天然序列的多肽可以具有天然存在的人多肽，鼠科多肽，或者任何其它的哺乳动物物种的多肽的氨基酸顺序。
术语“氨基酸序列变体”是指具有在某种程度上与天然序列的多肽不同氨基酸序列的多肽。通常，Pro104的氨基酸序列变体将与天然序列的Pro104具有至少大约70％，优选至少大约80％，更优选至少大约85％，更优选至少大约90％同源性，并且最优选至少95％的同源性。氨基酸序列变体可在天然氨基酸序列的氨基酸序列内具有某些位点的取代，删除和/或插入。
短语抗体的“功能性片段或者类似物”是指化合物具有和全长的抗体一样的定性的生物活性。例如，抗IgE抗体的功能性片段或者类似物是以阻止或者显著减少这种分子结合高亲合力受体FcεRI的能力的方式结合IgE免疫球蛋白的分子。
“同源性”被定义为在与序列比对后氨基酸序列变体中相同的残基的百分比并且如有必要引入缺口实现最大百分比的同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域已知的。序列相似性可以通过任意的共有序列分析算法，例如GAP或者BESTFIT或者其它的Smith-Waterman比对的改变进行测定。参见，T.F.Smith和M.S.Waterman，J.Mol.Biol.147：195-197(1981)和W.R.Pearson，Genomics 11：635-650(1991)。
非人(例如，啮齿动物)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠，大鼠，兔或者具有所需抗体的特异性、亲合性和能力的非人灵长类动物的高变区的残基取代。在有些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的人残基取代。此外，人源化抗体可以包含未在受体抗体或者供体抗体中发现的残基。这些修饰被用于更进一步地改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个，并且典型地两个可变域，其中全部的或者基本上所有超变环相应于非人免疫球蛋白并且所有的或者基本上所有的FRs是人免疫球蛋白序列的那些FRs。人源化抗体任选地也包含至少一部分免疫球蛋白保守区(Fc)，通常人免疫球蛋白的保守区。欲知详情，参见Jones等人，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
在这里使用的“内在化”抗Pro104抗体是指所述抗体在与哺乳动物细胞上的Pro104(即细胞表面Pro104)结合后被细胞吸收(即进入)。当然内在化抗体包括抗体片段，人或者人源化抗体以及抗体共轭物。对治疗学应用而言，包括体内内在化。内在化的抗体分子的数目将足以杀伤表达Pro104的细胞，尤其是表达Pro104的癌细胞。取决于抗体或者抗体共轭物的效价，在有些情况下，细胞中吸收单个抗体分子就足以杀伤结合抗体的靶细胞。例如，某些毒素对于杀伤非常有效因此结合抗体的毒素的一个分子的内在化就足以杀伤肿瘤细胞。
结合哺乳动物细胞上的Pro104后抗Pro104抗体是否内在化可由多种试验包括以下实验例中所述的实验进行确定。例如，为了试验体内内在化，标记该试验抗体并引入已知在某些细胞表面上表达Pro104的动物中。抗体可以用例如荧光或者金颗粒放射性标记或者标记。适于该试验的动物包括哺乳动物诸如包含人表达Pro104肿瘤移植物或者异体移植物的NCR裸鼠或者已经导入了人Pro104转染的细胞的小鼠，表达人Pro104转基因的转基因小鼠。合适的对照包括没有接受试验抗体或者接受无关抗体的动物以及接受目的细胞上另一抗原的抗体的动物，该抗体已知在与抗原结合后被内在化。抗体可以例如经静脉注射施用于动物。在合适的时间间隔，动物的组织切片可以使用已知的方法或者以下实验例所述进行制备，并且经光学显微术或者电子显微术分析内在化以及细胞中内在化抗体的位点。对于体外内在化而言，可将细胞温育在存在或者不存在向培养基中添加的有关抗体的组织培养皿中并且在所需的时间点进行加工用于显微分析。细胞中内在化标记抗体的存在可以由显微术或者如果使用放射性标记的抗体由放射自显影直接进行观察。或者，在定量生物化学的试验中，包括表达Pro104的细胞的细胞群体外或者体内与放射性标记的试验抗体接触并且用蛋白酶处理细胞(如果体内接触，然后合适量的时间后分离细胞)或者进行酸洗除去细胞表面上未内在化的抗体。研磨细胞并且经将匀浆通过闪烁计数器测定与每批细胞相关的每分钟放射性的计数(cpm)。基于放射性标记抗体的已知比放射性，每一细胞内在化的抗体分子的数目可以由研磨的细胞的闪烁计数推断出来。细胞与优选溶液形式的抗体体外“接触”由此通过在培养皿中或者烧瓶的细胞培养基中添加细胞并且将抗体与培养基充分混合确保细胞暴露于抗体的均一性。如果不添加到培养基中，细胞可以与等渗溶液中的实验抗体诸如试管中的PBS接触所需的时间段。当体内施用于患者时，细胞与抗体通过施用试验抗体的方法诸如如下所述的使用方法进行接触。
与表达Pro104的细胞体内结合后抗体的内在化速率越快，就可以越快实现靶表达Pro104的细胞上所需的杀伤或者生长抑制的效果，例如通过细胞毒性免疫结合。优选地，抗-Pro104抗体的内在化的动力学可以有助于快速杀伤表达Pro104的靶细胞。因此，需要抗-Pro104抗体显示出快速的内在化优选地，从体内抗体施用的24小时内，更优选约12小时内，更优选30分钟到1小时内，最优选约30分钟内。本发明提供了从体内引入抗-Pro104抗体约15分钟快速内在化的抗体。抗体优选将在结合于细胞表面上Pro104几小时内内在化到细胞中，优选地1小时内，更优选15-30分钟内。
为了确定试验抗体是否可以竞争由本发明的抗-Pro104抗体包含ATCC保藏的杂交瘤产生抗体结合的相同的表位，可以进行交叉阻断试验例如，竞争性ELISA分析。在典型的竞争性ELISA分析中，微量滴定板的Pro104-涂布的微孔，或Pro104-涂布的琼脂糖磁珠在存在或者不存在竞争抗体的候选物时预温育然后添加本发明的生物素标记的抗-Pro104抗体。结合于微孔中或磁珠上Pro104抗原的标记抗-Pro104抗体的量利用抗生物素蛋白-过氧化物酶共轭物以及合适的底物进行测定。
或者，可例如用放射性或荧光标记或其它可检测的以及可测量的标记标记抗-Pro104抗体。结合于抗原的标记的抗-Pro104抗体的量将与竞争与抗原上的相同的表位结合的候选竞争抗体(试验抗体)的能力负相关，即试验抗体对于相同表位的亲合性越大，结合于抗原涂布微孔的抗-Pro104抗体将越少。候选竞争抗体被认为是如果与缺乏候选竞争抗体的情况下(但是可以存在已知的非竞争的抗体)并行进行的对照相比候选竞争抗体可阻断抗-Pro104抗体结合的至少20％，优选至少20-50％，更优选至少50％基本上结合于相同的表位或争夺结合于本发明的抗-Pro104抗体相同的表位的抗体。
具有指定抗体，诸如如下所述任一单克隆抗体的“生物学特征”的抗体：Pro104.C1，Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C17，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C24，Pro104.C25，Pro104.C27，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C46，Pro104.C48，Pro104.C49，Pro104.C50，Pro104.C53，Pro104.C54，Pro104.C55，Pro104.C57，Pro104.C60，Pro104.C66，Pro104.C75，Pro104.C84，Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102，Pro104.D106，，Pro104.D111，Pro104.D112，Pro104.D113，Pro104.D114，Pro104.D115，Pro104.D116，Pro104.D117，Pro104.D118，Pro104.D119，Pro104.D120，Pro104.D121，Pro104.D122，Pro104.D123，Pro104.D，Pro104.D124，Pro104.D125，Pro104.D126，Pro104.D127，Pro104.D，Pro104.D128，Pro104.D129，Pro104.D130，Pro104.D131，Pro104.D132，Pro104.D133，Pro104.D134，Pro104.D135，Pro104.D136，Pro104.D137，Pro104.D138，Pro104.D139，Pro104.K14，Pro104.K15，Pro104.K16，Pro104.K47，Pro104.K71，Pro104.K72，Pro104.K74，Pro104.K75，Pro104.K76，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K87，Pro104.K88，Pro104.K89，Pro104.K155，Pro104.K156，Pro104.K157，Pro104.K158，Pro104.K159，Pro104.K160，Pro104.K163，Pro104.K164，Pro104.K176，Pro104.K217，Pro104.K226，Pro104.K227，Pro104.K240，Pro104.K274，Pro104.K264，Pro104.K281，Pro104.K358或Pro104.K362，是具有与将其与其它结合相同抗原的其它如下抗体区分开来的一种或多种生物学特性的抗体：Pro104.C1，Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C17，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C24，Pro104.C25，Pro104.C27，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C46，Pro104.C48，Pro104.C49，Pro104.C50，Pro104.C53，Pro104.C54，Pro104.C55，Pro104.C57，Pro104.C60，Pro104.C66，Pro104.C75，Pro104.C84，Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102，Pro104.D106，，Pro104.D111，Pro104.D112，Pro104.D113，Pro104.D114，Pro104.D115，Pro104.D116，Pro104.D117，Pro104.D118，Pro104.D119，Pro104.D120，Pro104.D121，Pro104.D122，Pro104.D123，Pro104.D，Pro104.D124，Pro104.D125，Pro104.D126，Pro104.D127，Pro104.D，Pro104.D128，Pro104.D129，Pro104.D130，Pro104.D131，Pro104.D132，Pro104.D133，Pro104.D134，Pro104.D135，Pro104.D136，Pro104.D137，Pro104.D138，Pro104.D139，Pro104.K14，Pro104.K15，Pro104.K16，Pro104.K47，Pro104.K71，Pro104.K72，Pro104.K74，Pro104.K75，Pro104.K76，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K87，Pro104.K88，Pro104.K89，Pro104.K155，Pro104.K156，Pro104.K157，Pro104.K158，Pro104.K159，Pro104.K160，Pro104.K163，Pro104.K164，Pro104.K176，Pro104.K217，Pro104.K226，Pro104.K227，Pro104.K240，Pro104.K274，Pro104.K264，Pro104.K281，Pro104.K358或Pro104.K362将结合如下所述抗体结合的相同的表位：Pro104.C1，Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C17，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C24，Pro104.C25，Pro104.C27，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C46，Pro104.C48，Pro104.C49，Pro104.C50，Pro104.C53，Pro104.C54，Pro104.C55，Pro104.C57，Pro104.C60，Pro104.C66，Pro104.C75，Pro104.C84，Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102，Pro104.D106，，Pro104.D111，Pro104.D112，Pro104.D113，Pro104.D114，Pro104.D115，Pro104.D116，Pro104.D117，Pro104.D118，Pro104.D119，Pro104.D120，Pro104.D121，Pro104.D122，Pro104.D123，Pro104.D，Pro104.D124，Pro104.D125，Pro104.D126，Pro104.D127，Pro104.D，Pro104.D128，Pro104.D129，Pro104.D130，Pro104.D131，Pro104.D132，Pro104.D133，Pro104.D134，Pro104.D135，Pro104.D136，Pro104.D137，Pro104.D138，Pro104.D139，Pro104.K14，Pro104.K15，Pro104.K16，Pro104.K47，Pro104.K71，Pro104.K72，Pro104.K74，Pro104.K75，Pro104.K76，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K87，Pro104.K88，Pro104.K89，Pro104.K155，Pro104.K156，Pro104.K157，Pro104.K158，Pro104.K159，Pro104.K160，Pro104.K163，Pro104.K164，Pro104.K176，Pro104.K217，Pro104.K226，Pro104.K227，Pro104.K240，Pro104.K274，Pro104.K264，Pro104.K281，Pro104.K358或Pro104.K362(例如竞争结合或阻断如下单克隆抗体的结合：Pro104.C1，Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C17，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C24，Pro104.C25，Pro104.C27，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C46，Pro104.C48，Pro104.C49，Pro104.C50，Pro104.C53，Pro104.C54，Pro104.C55，Pro104.C57，Pro104.C60，Pro104.C66，Pro104.C75，Pro104.C84，Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102，Pro104.D106，，Pro104.D111，Pro104.D112，Pro104.D113，Pro104.D114，Pro104.D115，Pro104.D116，Pro104.D117，Pro104.D118，Pro104.D119，Pro104.D120，Pro104.D121，Pro104.D122，Pro104.D123，Pro104.D，Pro104.D124，Pro104.D125，Pro104.D126，Pro104.D127，Pro104.D，Pro104.D128，Pro104.D129，Pro104.D130，Pro104.D131，Pro104.D132，Pro104.D133，Pro104.D134，Pro104.D135，Pro104.D136，Pro104.D137，Pro104.D138，Pro104.D139，Pro104.K14，Pro104.K15，Pro104.K16，Pro104.K47，Pro104.K71，Pro104.K72，Pro104.K74，Pro104.K75，Pro104.K76，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K87，Pro104.K88，Pro104.K89，Pro104.K155，Pro104.K156，Pro104.K157，Pro104.K158，Pro104.K159，Pro104.K160，Pro104.K163，Pro104.K164，Pro104.K176，Pro104.K217，Pro104.K226，Pro104.K227，Pro104.K240，Pro104.K274，Pro104.K264，Pro104.K281，Pro104.K358或Pro104.K362对Pro104)，能够靶向体内表达Pro104的肿瘤细胞并且将体内结合于哺乳动物细胞上的Pro104。
此外，具有如下抗体的生物学特征的抗体：Pro104.C1，Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C17，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C24，Pro104.C25，Pro104.C27，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C46，Pro104.C48，Pro104.C49，Pro104.C50，Pro104.C53，Pro104.C54，Pro104.C55，Pro104.C57，Pro104.C60，Pro104.C66，Pro104.C75，Pro104.C84，Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102，Pro104.D106，，Pro104.D111，Pro104.D112，Pro104.D113，Pro104.D114，Pro104.D115，Pro104.D116，Pro104.D117，Pro104.D118，Pro104.D119，Pro104.D120，Pro104.D121，Pro104.D122，Pro104.D123，Pro104.D，Pro104.D124，Pro104.D125，Pro104.D126，Pro104.D127，Pro104.D，Pro104.D128，Pro104.D129，Pro104.D130，Pro104.D131，Pro104.D132，Pro104.D133，Pro104.D134，Pro104.D135，Pro104.D136，Pro104.D137，Pro104.D138，Pro104.D139，Pro104.K14，Pro104.K15，Pro104.K16，Pro104.K47，Pro104.K71，Pro104.K72，Pro104.K74，Pro104.K75，Pro104.K76，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K87，Pro104.K88，Pro104.K89，Pro104.K155，Pro104.K156，Pro104.K157，Pro104.K158，Pro104.K159，Pro104.K160，Pro104.K163，Pro104.K164，Pro104.K176，Pro104.K217，Pro104.K226，Pro104.K227，Pro104.K240，Pro104.K274，Pro104.K264，Pro104.K281，Pro104.K358或Pro104.K362抗体将在体内结合于哺乳动物细胞上的Pro104后内在化。
同样地，具有如下抗体的生物学特征的抗体：Pro104.C1，Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C17，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C24，Pro104.C25，Pro104.C27，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C46，Pro104.C48，Pro104.C49，Pro104.C50，Pro104.C53，Pro104.C54，Pro104.C55，Pro104.C57，Pro104.C60，Pro104.C66，Pro104.C75，Pro104.C84，Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102，Pro104.D106，，Pro104.D111，Pro104.D112，Pro104.D113，Pro104.D114，Pro104.D115，Pro104.D116，Pro104.D117，Pro104.D118，Pro104.D119，Pro104.D120，Pro104.D121，Pro104.D122，Pro104.D123，Pro104.D，Pro104.D124，Pro104.D125，Pro104.D126，Pro104.D127，Pro104.D，Pro104.D128，Pro104.D129，Pro104.D130，Pro104.D131，Pro104.D132，Pro104.D133，Pro104.D134，Pro104.D135，Pro104.D136，Pro104.D137，Pro104.D138，Pro104.D139，Pro104.K14，Pro104.K15，Pro104.K16，Pro104.K47，Pro104.K71，Pro104.K72，Pro104.K74，Pro104.K75，Pro104.K76，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K87，Pro104.K88，Pro104.K89，Pro104.K155，Pro104.K156，Pro104.K157，Pro104.K158，Pro104.K159，Pro104.K160，Pro104.K163，Pro104.K164，Pro104.K176，Pro104.K217，Pro104.K226，Pro104.K227，Pro104.K240，Pro104.K274，Pro104.K264，Pro104.K281，Pro104.K358或Pro104.K362抗体将具有抗体结合，靶向，内在化，肿瘤生长抑制以及细胞毒特性的相同的表位。
术语″拮抗剂″抗体广义的使用，并且包含部分或完全阻断、抑制或中和本发明公开的天然Pro104蛋白的生物活性的抗体。鉴定Pro104多肽的拮抗剂的方法可以包括将Pro104多肽或细胞表面上表达Pro104的细胞与候选拮抗剂抗体接触以及测定通常与Pro104多肽相关的一或多种生物学活性的可检测的改变。
“抑制表达Pro104的肿瘤生长的抗体”或“生长抑制的”抗体是结合于并且产生可测量的表达或过量表达Pro104的癌细胞的生长抑制的抗体。优选的生长抑制的抗-Pro104抗体与合适的对照相比抑制表达Pro104的肿瘤细胞，例如，乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌细胞的生长大于20％，优选从约20％到约50％，更优选大于50％(例如从约50％到约100％)，所述对照通常为未用实验抗体处理的肿瘤细胞。生长抑制可以在细胞培养物中约0.1到30pg/ml或约0.5nM到200nM的抗体浓度测定生长抑制，其中生长抑制为在将肿瘤细胞暴露于抗体后测定的。肿瘤细胞的体内生长抑制可以多种方式进行测定，诸如以下实验实施例部分所述的方式。如果在大约1pg/kg到约100mg/kg体重施用抗-Pro104抗体在首次施用抗体的约5天到3月内，优选约5到30天内引起肿瘤大小或肿瘤细胞增殖，那么抗体就可以作为生长抑制剂。
“诱导细胞程序性死亡”的抗体是诱导通过膜联蛋白V的结合，DNA的片段化，细胞收缩，内质网的膨胀，细胞片段化和/或膜囊(称作细胞程序性死亡体)的形成测定的抗体。细胞通常为过量表达Pro104的细胞。优选地细胞是肿瘤细胞，例如乳腺，卵巢，胰腺以及肺细胞。多种方法可用于评价与细胞程序性死亡相关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)易位可通过膜联蛋白结合测定；DNA片段化可通过DNA梯评价；并且伴随DNA片段化的核/染色质凝聚可通过亚二倍体细胞的增加评价。优选地，诱导细胞程序性死亡的抗体是在膜联蛋白结合分析中与未处理的细胞相比产生约2到50倍，优选地约5到50倍，以及最优选地约10到50倍的膜联蛋白结合的抗体。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区域(天然的序列Fc区域或氨基酸序列变体Fc区域)的生物学活性，并且随抗体同种型的改变而变化。抗体效应子功能的实例包含C1q结合以及依赖于补体的细胞毒性；Fc受体结合；依赖于抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞激活。
“依赖抗体的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中结合于某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤细胞(NK细胞，嗜中性粒细胞以及巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)的分泌型Ig能够使这些细胞毒效应细胞特异性结合具有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀伤靶细胞的细胞毒性的形式。抗体“装备”细胞毒细胞并且是杀伤绝对需要的。调节ADCC的初级细胞，NK细胞仅仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII以及FcγRIII。造血细胞上FcR的表达概括在Ravetch以及Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的464页的表3中。为了评价所需分子的ADCC活性，可以进行美国专利5,500,362或5,821,337所述的体外ADCC分析。这种分析有用的效应细胞包含外周血单核细胞(PBMC)以及自然杀伤细胞(NK)。或者，可以体内评价目的分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)所公开的动物模型中进行。
“Fc受体”或“FcR”描述结合于抗体的Fc区域的受体。优选的FcR是天然的序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)以及包含FcγRI，FcγRII，以及FcγRIII亚类的受体，包含这些受体的等位基因变体以及剪接形式。FcγRII受体包含具有类似的氨基酸序列区别仅在于其细胞质的功能域的FcγRIIA(“激活受体”)以及FcγRIIB(“抑制受体”)。激活受体FcγRIIA在其细胞质的功能域含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRI1B在其细胞质的功能域含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.in Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcRs综述在Ravetch以及Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；以及deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126.330-41(1995)。其它包含将来鉴定的FcRs也包括在本发明的术语“FcR”的范围内。该术语还包含新受体FcRn，其负责母体的IgGs向胎儿的转移(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)以及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。
“人效应细胞”是表达一或多种FcRs并且实施效应因子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包含外周血单核细胞(PBMC)，自然杀伤细胞(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞以及嗜中性粒细胞；优选PBMCs以及NK细胞。效应细胞可以分离自天然来源，例如血液。
“依赖于补体的细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下裂解靶细胞。经典补体激活途径起源于补体系统(C1q)的第一组分与抗体(合适的亚类)的结合，所述抗体结合于其同源的抗原。为了评价补体激活，进行例如Gazzano Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)所述的CDC分析。
术语“癌症”以及“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理条件，其典型特征在于未调节的细胞生长。癌症的实例包含，但不限于恶性肿瘤，淋巴瘤，胚细胞瘤，肉瘤以及血癌或淋巴恶性肿瘤。这种癌症更特定的实例包含鳞状上皮细胞癌(例如上皮鳞状上皮细胞癌)，肺癌包含小细胞肺癌，非-小细胞肺癌，肺的腺癌以及肺的鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，包含胃肠道癌的胃或胃癌，胰腺癌，恶性胶质瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，尿道癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫恶性肿瘤，唾液腺恶性肿瘤，肾脏或肾癌，前列腺癌，阴护癌，甲状腺癌，肝癌，肛门恶性肿瘤，阴茎恶性肿瘤，黑色素瘤，多发性骨髓瘤以及B-细胞淋巴瘤，大脑，以及头部和颈部癌以及相关的转移。
“表达Pro104的细胞”是在细胞表面上表达内源性或者转染的Pro104的细胞。“表达Pro104的癌症”是包括细胞表面存在Pro104蛋白的细胞的癌症。“表达Pro104的癌症”在其细胞表面上产生充分水平的Pro104，由此用以结合抗Pro104抗体并且具有针对癌症的治疗效果。“过量表达”Pro104的癌症是在其细胞表面与相同组织类型的非癌症性细胞相比具有显著较高水平Pro104的癌症。这种过量表达可能由基因扩增或者转录或者翻译的增加所引起的。Pro104过量表达可以通过评价细胞表面上存在的Pro104蛋白的水平的增加的诊断或者预后分析确定Pro104的过量表达。或者，或另外，人们可以例如通过原位杂交的荧光强度测定细胞中编码Pro104的核酸或者mRNA的水平；(FISH；参见WO98/45479公开在1998年10月)，Southern印迹法，Northern印迹，或者聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如快速定量PCR(RT-PCR)。人们还可以通过测定诸如血清的生物流体中脱落抗原，例如利用基于抗体的分析研究Pro104过量表达(参见，例如，1990年6月12日授权的美国专利4,933,294；公开日1991年4月18日的WO91/05264；1995年3月28日授权的美国专利5,401,638；以及Sias等人J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。除上述分析以外，本领域技术人员可以采用多种体内分析。例如，可以将患者体内的细胞暴露于任选标记有可检测的标记例如放射性同位素的抗体，并且可以例如通过外部扫描放射性强度或者通过分析先前暴露于抗体的患者采集的活组织来评价抗体与患者体内细胞的结合。表达Pro104的癌症包括卵巢，胰腺，肺或者乳腺癌。
用于癌症治疗或者癌症症状缓解的“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括-人，驯养以及农用畜，以及动物园，娱乐或者宠物动物，诸如狗，猫，牛，马，绵羊，猪，山羊，兔等等。优选地，哺乳动物是人。
“治疗”或者“处理”或者“缓解”是指治疗以及预防或者预防措施，其中目的是预防或者减慢(缩小)目标病理情况或者失调。需要处理的那些包括已经失调以及那些倾于失调或者防止失调的那些。如果患者接受治疗量的本发明的方法的抗Pro104抗体后显示一种或者多种下列特征可观测和/或可测量的减少或者缺失受试者或者哺乳动物就被成功“治疗”了表达Pro104的癌症：癌细胞数目减少或者癌细胞的缺失；肿瘤大小减少；抑制(即，在某种程度上减慢以及优选阻止)癌细胞浸润到外周的器官包括癌症扩散到软骨组织以及骨内；抑制(即，在某种程度上减缓以及优选阻止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解一种或者多种与特异性癌症相关的症状；减少病征以及死亡率，以及改善生命质量。对于抗Pro104抗体可能阻止存在的癌细胞生长和/或将其杀伤的水平，可能是抑制细胞的和/或细胞毒的。这些病征或者症状的减轻也可以被患者感受到。
评价疾病成功治疗以及改进的上述参数可以通过医生熟悉的常规程序很容易地进行测定。就癌症治疗而言，可以例如通过评价疾病进展的时间(TTP)和/或确定反应率(RR)来测定效力。
术语“治疗有效量”是指抗体或者药物可以有效“治疗”受试者或者哺乳动物的疾病或者失调的量。就癌症来说，治疗有效量的药物可以减少癌细胞的数目；缩小肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上减缓优选终止)癌细胞浸润到外周器官；抑制(即，在某种程度上减缓以及优选终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻与癌症相关的一种或者多种症状。参见前面定义的“治疗”。可能阻止生长和/或杀伤存在的癌细胞的药物的水平可能是抑制细胞的和/或细胞毒的。
“慢性”施用是指与急性方式相反以连续方式施用药剂，以便将最初的治疗效果(活性)保持较长的时间段。
“间歇”施用是没有中断的非连续而是实质上周期性的治疗。
“与一或者多种其它的治疗剂结合”的施用包括同时(同时发生的)以及以任何顺序连续施用。
在这里使用的“载体”包括在所采用的剂量以及浓度对细胞或者暴露于其的哺乳动物无毒性的药用载体，赋形剂，或者稳定剂。
通常，生理可以接受的载体是水性pH缓冲溶液。生理可以接受载体的实例包括诸如磷酸，柠檬酸及其它有机酸的生理可以接受的载体；包括抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白，诸如血清清蛋白，凝胶或者免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天门冬酰胺，精氨酸或者赖氨酸；单糖，二糖，及其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或者糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露糖醇或者山梨糖醇；形成盐的平衡离子诸如钠；和/或非离子型表面活性剂诸如TWEENTM，聚乙二醇(PEG)以及PLURONICSTM。
在这里使用的术语“细胞毒剂”是指抑制或者阻止细胞的功能和/或引起细胞破裂的物质。该术语包括放射性同位素(例如，At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，以及Lu的放射性同位素)，化疗剂例如氨甲喋呤，adriamicin，长春花碱(长春新碱，长春花碱，etoposide)，阿霉素，苯丙氨酸氮芥，丝裂霉素C，苯丁酸氮芥，柔红霉素或者其它的嵌入剂，诸如核酸降解酶的酶以及其片段，抗生素以及毒素诸如小分子毒素或者酶促活性的细菌，真菌，植物或者动物来源的毒素，包括其片段和/或变体，例如gelonin，蓖麻毒，皂草素以及以下公开的多种抗肿瘤或者抗癌剂。其它的细胞毒剂描述如下。杀肿瘤的药剂引起肿瘤细胞的破裂。
在这里使用的“生长抑制剂”是指体外或者体内抑制细胞生长，尤其是表达Pro104的癌细胞生长的化合物或者组合物。因此，生长抑制剂可以显著降低S期表达Pro104细胞的百分比。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(除了S期的位置)，诸如诱导GI停滞以及M-期停滞的试剂。经典的M-期阻断剂包括长春花(长春新碱以及长春花碱)，taxanes以及拓扑异构酶II抑制剂诸如阿霉素，表柔比星，柔红霉素，鬼臼亚乙苷以及博莱霉素。停滞GI的那些药剂还溢出到S期停滞，例如DNA烷化剂诸如三苯氧胺，强的松，氮烯唑胺，二氯甲二乙胺，顺氯氨铂，氨甲喋呤，5-氟尿嘧啶以及阿糖胞苷。在MolecularBasis of Cancer，Mendelsohn以及Israel，eds.，第1章名为Murakami等人的“Cell cycle egulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”(WBSaunders：Philadelphia，1995)中，尤其是第13页可以发现详细的信息。taxanes(太平洋紫杉醇以及docetaxel)都是来源于紫杉树的抗癌药。来源于欧洲紫杉的Docetaxel(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer)是太平洋紫杉醇的半合成类似物(TAXOL，Bristol-Myers Squibb。太平洋紫杉醇以及docetaxel促进从微管蛋白二聚体组装微管以及通过阻止解聚作用稳定微管，导致细胞中有丝分裂的抑制。
在这里使用的“标记”是指直接或间接结合于抗体以便产生″标记”抗体的可检测的化合物或者组合物。标记自身是可以检测的(例如放射性同位素标记或者荧光标记)或者，就酶标记来说可以催化可检测的底物化合物或者组合物的化学改变。
在这里使用的术语“标记表位”是指包括融合于“标记多肽”的抗Pro104抗体多肽的嵌合多肽。标记多肽具有足以提供可以产生抗其抗体的表位，然而足以短到使其不干扰其融合的Ig多肽活性的残基。标记多肽优选还相当地独特使得抗体基本上不与其它表位进行交叉反应。通常适合的标记多肽具有至少6个氨基酸残基并且通常约8以及50之间的氨基酸残基(优选地，约10和20个氨基酸残基之间)。
在这里限定的“小分子”具有低于约500道尔顿的分子量。
术语“包装说明书”用来指通常治疗产品的商业包装中包含的说明书，包含关于有关这种治疗产品使用的适应症，用途，剂量，施用，禁忌症和/或警告的信息。
“分离的核酸分子”是例如RNA，DNA或者混合聚合物的核酸分子，其基本上与其它的基因组DNA序列以及蛋白或者诸如核糖体和聚合酶的复合物分离，其天然伴随天然的序列。该术语包含已经从其天然存在环境取出的核酸分子，并且包括重组体或者克隆DNA分离物以及化学上合成的类似物或者通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸分子包括核酸分子的分离形式。
“载体”包括穿梭载体以及表达载体并且包括例如，质粒，粘粒或者噬菌粒。通常质粒构建物还包括用于细菌中质粒复制以及选择的复制起点(例如，ColE1复制起点)以及选择性标记(例如，氨苄青霉素或者四环素抗性)。“表达载体”是指包含包括本发明的抗体片段的抗体在原核，例如细菌或者真核细胞中表达的必要的控制序列或者调控元件的载体。适合的载体公开如下。
产生本发明抗Pro104抗体的细胞将包括母体杂交瘤细胞例如，ATCC保藏的杂交瘤，以及已经引入编码抗体的核酸的细菌以及真核寄主细胞。适合的宿主细胞公开如下。
RNA干扰是指由短干扰RNAs(siRNA)介导的动物体内序列特异性转录后基因沉默的加工(Fire等，1998，Nature，391，806)。植物体内的相应加工通常是指转录后的基因沉默或RNA沉默并且也指真菌内的沉默。转录后基因沉默被认为用于防止异体基因表达的进化保守的细胞防卫机制，所述异体基因由多种群以及门共享(Fire等，1999，Trends Genet.，15，358)。这种防止异体基因表达可能由响应双链RNAs(dsRNA)的产生演化而来，所述双链RNAs(dsRNA)获自病毒感染或转座子元件通过特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA的细胞应答整合到宿主基因组中。dsRNA在细胞中的存在引发RNAi应答尽管其特征尚未被完全表征。该机制似乎不同于源于dsRNA介导的蛋白激酶PKR以及由核糖核酸酶L产生非特异性的mRNA裂解的2′，5′-寡腺苷合成酶的激活的干扰素应答。
细胞中长dsRNAs的存在刺激称为dicer的核糖核酸酶III酶的活性。Dicer参与dsRNA加工成被称为短干扰RNAs(siRNA)的dsRNA的短片段(Berstein等，2001，Nature，409，363)。来源于dicer活性的短干扰RNAs通常为约21-23个核苷酸长并且包括约19个碱基对双链。Dicer还参与来自保守结构的前体RNA的21以及22个核苷酸小瞬间RNAs(stRNA)的切除，所述保守结构参与翻译控制(Hutvagner等，2001，Science，293，834)。RNAi应答还具有含有siRNA的核酸内切酶复合物，通常称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的特征，所述RNA-诱导的沉默复合物介导具有siRNA双链体的反义链互补序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解发生在siRNA双链体的反义链互补区域中间(Elbashir等，2001，Genes Dev.，15，188)。
短干扰RNA介导的RNAi已经在多种系统中得以研究。Fire等，1998，Nature，391，806，最先在C.Elegans.中观察到RNAi。Wianny以及Goetz，1999，Nature Cell Biol.，2，70描述了小鼠胚胎中dsRNA介导的RNAi。Hammond等，2000，Nature，404，293，描述了dsRNA.转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashir等，2001，Nature，411，494，描述了在培养的包含人胚肾以及HeLa细胞的哺乳动物细胞中由导入合成的21-核苷酸的双链体诱导的RNAi。果蝇胚胎裂解物中的研究(Elbashir等，2001，EMBO J.，20，6877)已经揭示了对siRNA的长度，结构，化学成分以及对介导有效的RNAi活性不可缺少的序列的特定要求。这些研究已经表明当含有两个核苷酸3′-突出端时，21个核苷酸的siRNA双链体是最具活性的。此外，用2’-脱氧(2’-H)或2’-O-甲基核苷酸完全取代一或两条siRNA链将消除RNAi的活性，而用脱氧核苷酸(2′-H)取代3’-末端siRNA突出端核苷酸被证明是可以耐受的。siRNA双链体中心单一的错配序列还显示出可以消除RNAi的活性。此外，这些研究还显示靶RNA中切割位点的位置被限定在siRNA指导序列的5′-末端而非3’-末端(Elbashir等，2001，EMBO J.，20，6877)。其它研究已经表明siRNA双链体的靶-互补链上的5’-磷酸也是siRNA活性所需的而且ATP被用于在siRNA上保持5’-磷酸部分(Nykanen等，2001，Cell，107，309)。
研究表明用脱氧核苷酸取代具有2个核苷酸3’突出端的21-聚体siRNA双链体的3’-突出端片段对RNAi活性不具有副作用。用脱氧核糖核苷酸取代每个末端高达4个核苷酸已经报道是可以允许的而用脱氧核糖核苷酸完全取代将不产生RNAi活性(Elbashir等，2001，EMBO J.，20，6877)。此外，上述的Elbashir等还报道用2′-O-甲基核苷酸取代siRNA完全消除了RNAi活性。Li等，国际PCT公开WO00/44914，以及Beach等，国际PCT公开WO 01/68836都表明siRNA“可能包含磷酸-糖主链或核苷的修饰以便包含至少一个氮或硫杂原子”，然而这两个申请都没有教导这些修饰达到什么程度在siRNA中是允许的，也没有提供任何这种修饰siRNA.的实例。Kreutzer以及Limmer，加拿大专利申请2,359,180还描述了用于dsRNA构建体以便抵消双链-RNA-依赖的蛋白激酶PKR，具体为2′-氨基或2′-氧-甲基核苷酸，以及含有2′-O或者4′-C亚甲桥的核苷酸的激活的某些化学修饰。然而，Kreutzer以及Limmer类似地没能显示这些修饰达到什么程度在siRNA分子中是允许的也没有提供任何这种修饰siRNA的实例。
Parrish等，2000，Molecular Cell，6，1977-1087利用长(＞25nt)siRNA转录本试验了C.elegans中靶向unc-22基因某些化学修饰。作者描述了将硫代磷酸残基通过用T7以及T3核糖核酸聚合酶插入硫代磷酸核苷酸类似物导入这些siRNA转录本中并且观察到“具有两个(硫代磷酸)修饰碱基的RNAs和RNAi引发同样显著降低了有效性(数据未显示)；超过两个残基的(硫代磷酸)修饰使RNAs体外被大大稳定化并且我们不能分析干扰活性”同上1081。作者还试验长siRNA转录本中核苷酸糖的2′-位置的某些修饰并且观察到将脱氧核苷酸取代为核糖核苷酸“产生干扰活性的显著下降”，特别是在尿苷取代为胸腺嘧啶和/或胞嘧啶取代为脱氧胞嘧啶的情况下，同上。此外，作者试验了某些碱基修饰，包含在siRNA的正义以及反义链中用尿嘧啶取代4-硫尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-碘代尿嘧啶，3-(氨基烯丙基)尿嘧啶，以及鸟苷肌苷，并且发现4-硫尿嘧啶以及5-溴尿嘧啶均被允许，当将肌苷掺入任一链时“产生干扰活性的显著降低”。5-碘代尿嘧啶以及3-(氨基烯丙基)尿嘧啶掺入反义链也引起RNAi活性的显著降低。
Beach等在国际PCT公开WO 01/68836描述了利用内源来源的dsRNA减少基因表达的特异性方法。Tuschl等在国际PCT公开WO01/75164描述了果蝇的体外系统以及通过利用某些功能性基因组的特异性siRNA分子以及某些治疗的应用；尽管Tuschl，2001，Chem.Biochem.，2，239-245怀疑RNAi由于“激活干扰素应答”可用于医治遗传性疾病或病毒感染。Li等，国际PCT公开WO 00/44914，描述了通过利用特异性dsRNAs用于减少某些靶基因的表达。Zernicka-Goetz等，国际PCT公开WO 01/36646描述了利用某些dsRNA分子抑制哺乳动物细胞中特定的基因的表达的方法。Fire等，国际PCT公开WO99/32619描述了将某些dsRNA分子引入细胞用于抑制基因表达的特定方法。Plaetinck等，国际PCT公开WO 00/01846描述了利用特异性dsRNA分子鉴定赋予细胞特定表型的特异基因的某些方法。Mello等，国际PCT公开WO 01/29058，描述了参与dsRNA介导的RNAi的特异基因的鉴定。Deschamps Depaillette等，国际PCT公开WO99/07409描述了包含与某些抗-病毒剂组合使用的特定的dsRNA分子的特异性组合物。Driscoll等，国际PCT公开WO 01/49844描述了用于促进靶生物体内基因沉默的特异性DNA构建体。Parrish等，2000，Molecular Cell，6，1977-1087描述了靶向C.elegans.的unc-22基因的特异性化学修饰的siRNA构建体。Tuschl等，国际PCT公开WO02/44321描述了某些合成的siRNA构建体。
本发明的组合物以及方法
本发明提供了抗-Pro104抗体。优选地，抗-Pro104抗体在结合于哺乳动物细胞上的细胞表面Pro104后被内在化。抗-Pro104抗体也可以破坏或导致具有Pro104的肿瘤细胞的破坏。
很明显Pro104不具有内在化的能力。此外，抗体内在化的能力取决于包含亲合性，亲合力以及抗体的同种型，及其结合表位的几个因素。我们已经在这里证明细胞表面Pro104在由本发明的抗-Pro104抗体结合后具有内在化的能力。另外，据证实本发明的抗-Pro104抗体可以特异性体内靶向表达pro104的肿瘤细胞以及抑制或杀伤这些细胞。抗-Pro104抗体的这些体内靶向肿瘤，内在化并且生长抑制的特性使得这些抗体非常适于治疗应用，例如治疗包含乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌的多种癌症。例如，如果抗体或抗体共轭物具有作用的胞内位点并且如果抗体的细胞毒剂共轭物不容易穿过原生质膜(例如，毒素)则抗-Pro104抗体的内在化是优选的。如果抗体或结合抗体的因子不具有作用的胞内位点，例如，如果抗体可通过ADCC或其它的机制杀伤肿瘤细胞则内在化就不是必需的。
本发明的抗-Pro104抗体也具有多种非-治疗学的应用。本发明的抗-Pro104抗体可用于诊断以及判断表达Pro104癌症的阶段(例如，在放射性显影中)。它们可以单独使用或与包括但不限于如下的其它卵巢癌症标记结合使用：CA125，HE4以及mesothelin。抗体还可用于从细胞纯化或免疫沉淀Pro104，用于例如在ELISA或Western印迹中检测以及体外定量Pro104，作为纯化其它细胞的步骤从混合细胞群杀伤以及除去表达Pro104的细胞。本发明的内在化抗-Pro104抗体可以是在这里限定的“抗体”所包括的不同形式。因此，抗体包含全长或完整的抗体，抗体片段，天然的序列抗体或氨基酸变体，人源化，嵌合或融合抗体，免疫结合，及其功能性片段。在融合抗体中，抗体序列融合到异源多肽序列上。抗体可以在Fc区域进行修饰来提供期望的效应子的功能。如以下部分更详细论述的，结合于细胞表面的裸抗体的合适的Fc区域可以例如通过抗体-依赖的细胞毒性诱导(ADCC)或通过在依赖于补体的细胞毒性中补充补体，或其它的机制诱导细胞毒性。或者，当需要除去或降低效应子功能以便使副作用最小化或治疗复杂化时，可以使用某些其它的Fc区域。
抗体可以争夺结合，或基本上结合被本发明抗体结合的相同表位。也包括具有本发明的抗-Pro104抗体的生物学特性的抗体，例如，具有由ATCC保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生的单克隆抗体的生物学特性的抗-Pro104抗体，特异性包含体内肿瘤靶向，内在化以及任意细胞增殖抑制或细胞毒特性。具体提供的是结合于存在如下氨基酸中的表位的抗-Pro104抗体：人Pro104的1-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-110，110-120，120-130，130-140，140-150，150-160，160-170，170-180，180-190，190-200，200-210，210-220，220-230，230-240，240-250，250-260，260-270，270-280，280-290，290-300，300-310，310-314。
制备上述抗体的方法详细描述如下。
本发明的抗-Pro104抗体可用于治疗表达Pro104的癌症或减轻哺乳动物癌症的一或多种症状。这种癌症包含卵巢以及胰腺癌，尿道癌，前列腺癌，乳腺癌，结肠癌以及肺癌。这种癌症更具体地包含卵巢浆液腺癌，渗透性乳腺管恶性肿瘤，前列腺癌，肾细胞恶性肿瘤，结肠直肠腺癌，肺腺癌，肺鳞状细胞癌以及胸膜间皮瘤。乳腺癌可以是HER-2阴性或阳性的乳腺癌。癌症包括任一上述的例如，乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌的转移性的癌。抗体能够结合于哺乳动物中表达Pro104的癌症细胞的至少一部分并且优选地不诱导或最小化HAMA应答。优选地，抗体在结合于细胞上的Pro104后可体外或体内有效破坏或杀伤Pro104的肿瘤细胞或抑制这种肿瘤细胞的生长。这种抗体包含裸抗-Pro104抗体(未结合任意因子)。具有体内肿瘤生长抑制特性的裸抗-Pro104抗体包含以下实验实施例中描述的抗体。具有细胞毒或细胞生长抑制特性的裸抗体可以与细胞毒剂进一步结合以使它们更有效破坏肿瘤细胞。可以通过例如抗体与细胞毒剂结合形式如下所述的免疫结合物给抗-Pro104抗体赋予细胞毒特性。细胞毒剂或生长抑制因子优选为小分子。优选诸如maytansin，maytansinoids，皂草素，gelonin，蓖麻毒或卡奇霉素及其类似物或衍生物。
本发明提供了含有本发明的抗-Pro104抗体，以及载体的组合物。用于治疗癌症的目的，组合物可以施用于需要这种治疗的患者，其中组合物可以包含以免疫结合物存在或作为裸抗体的一或多种抗-Pro104抗体。此外，组合物可以包括与其它治疗剂诸如细胞毒或生长抑制剂，包含化疗剂结合的这些抗体。本发明还提供了含有本发明的抗-Pro104抗体以及载体的制剂。该制剂可以是含有药用载体的治疗制剂。
本发明的另一方面是编码内在化抗-Pro104抗体的分离的核酸。包括编码H以及L链尤其高变区残基，编码天然序列的抗体以及抗体的变体，修饰以及人源化形式的核酸。
本发明还提供用于治疗表达Pro104癌症或缓解哺乳动物癌症的一或多种症状的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的内在化抗-Pro104抗体。该抗体治疗组合物可以根据医生的指导短期(急性的)或慢性或间歇的施用。本发明还提供了抑制表达Pro104的细胞生长以及将其杀伤的方法。最后，本发明还提供了至少含有一种本发明的抗体优选地至少一种体内结合于哺乳动物细胞上Pro104的抗-Pro104抗体或至少一种本发明的内在化抗-Pro104抗体的试剂盒以及制品。含有抗-Pro104抗体的试剂盒可用于检测Pro104表达或治疗或诊断分析，例如用于Pro104细胞杀伤分析或用于从细胞纯化和/或免疫沉淀Pro104。例如，为了分离以及纯化Pro104，试剂盒可以含有与固相支持体例如组织培养微孔板或磁珠(例如，琼脂糖磁珠)结合的抗-Pro104抗体。提供的试剂盒含有例如在ELISA或Western印迹中对Pro104进行体外检测以及定量的抗体。这种用于检测的抗体可提供有诸如荧光或放射性标记的标记。
抗-Pro104抗体的制备
以下描述了制备用于本发明的抗体的典型的技术。一些技术进一步描述在实施例1中。用于产生抗体的Pro104抗原可以是例如全长多肽或其部分，包含缺少跨膜序列的Pro104的可溶形式，或选择的部分蛋白的合成肽。
或者，在其细胞表面表达Pro104的细胞(例如转化的过量表达Pro104的CHO或NIH-3T3细胞)，或从这种细胞制备的膜可用于产生抗体。人以及鼠科Pro104的核苷酸以及氨基酸序列有效提供如上。Pro104可以从原核细胞，例如细菌细胞，或真核细胞利用标准的重组DNA方法重组产生或者分离。Pro104可以表达为标记(例如，表位标记)或其它的融合蛋白以促进其在多种分析中的分离以及鉴定。
抗体或结合于多种标记以及融合序列的结合蛋白可以如下所述精心制成。可用于产生抗体的Pro104的其它形式对于本领域技术人员是显而易见的。
标记
多种标记多肽及其相应的抗体是本领域公知的。实例包含聚组氨酸(聚组氨酸)或聚组氨酸-甘氨酸(聚his-gly)标记；流感HA标记多肽及其抗体12CA5(Field等，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988))；c-myc标记以及8F9，3C7，6E10，G4，B7以及9E10抗体(Evan等，Molecularand Cellular Biology，5：3610-3616(1985))；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标记及其抗体(Paborsky等，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990))。FLAG-肽(Hopp等，BioTechnology，6：1204-1210(1988))由抗-FLAG M2单克隆抗体识别(Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)。含有FLAG肽的蛋白的纯化可以通过利用包括共价连接于琼脂糖的抗-FLAG M2单克隆抗体的亲合基质的免疫亲和层析来进行(EastmanKodak Co.，New Haven，CT)。其它的标记多肽包含KT3表位肽(Martin等，Science，255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽(Skinner等，J.Biol.Chenz.，266：15163-15166(1991))；以及T7基因蛋白肽标记(Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990))。
多克隆抗体
多克隆抗体优选在动物体内，优选非-人动物体内通过多重皮下(sc)或腹膜内(ip)注射有关的抗原以及佐剂来产生。其可用于将有关的抗原(尤其是当使用合成肽时)与待免疫的物种的免疫原性的蛋白结合。例如，抗原可以利用双功能或衍生剂，例如顺丁烯亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基团，结合于钥孔血兰素(KLH)，血清，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。结合物也可以重组细胞培养物作为蛋白融合物产生。
用抗原，免疫原性结合物或衍生物通过将例如5-100pg的蛋白或结合物(分别为兔或小鼠)与3体积的完全佐剂混合以及将溶液皮层内注射多个位点进行免疫动物。一个月以后，动物通过多个位点皮下注射加强免疫1/5到1/10最初量的Freund完全佐剂中的结合物。7到14天后，对动物取血并且分析血清的抗体滴度。加强免疫动物直至滴度达到平稳状态。同样，聚集剂诸如明矾也可用于增强免疫应答。
单克隆抗体
单克隆抗体可以利用杂交瘤方法制备，所述杂交瘤方法首先由Kohler等，Nature，256：495(1975)描述，或单克隆抗体可以通过重组DNA法(美国专利4,816,567)进行制备。在杂交瘤方法中，小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠如上所述进行免疫以引发产生或能够产生特异性结合于用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以体外免疫。免疫后，分离淋巴细胞然后与“融合部分”，例如利用合适的融合剂，诸如聚乙二醇融合形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies.Principles and Practice，pp 103(Academic Press，1986))。
接种由此制备的杂交瘤细胞并且培养在合适的培养基中，所述培养基优选含有一或多种抑制未融合的，融合的配偶体，例如亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择性培养基通常包含次黄嘌呤，氨基蝶呤以及胸腺嘧啶(HAT培养基)，所述物质阻止HGPRT-缺陷细胞的生长。
优选的融合配体骨髓瘤细胞是通过产生选择的抗体的细胞有效融合，支持稳定高水平产生抗体以及对选择未融合的亲本细胞的选择培养基敏感的细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠科骨髓瘤系，诸如来源于Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA获得的MOPC-21以及MPC-II小鼠肿瘤以及美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA获得的SP-2以及例如，X63-Ag8-653细胞的衍生物。人骨髓瘤以及异源小鼠-人3骨髓瘤细胞系已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；以及Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
分析其中生长杂交瘤细胞的培养基产生的针对抗原的单克隆抗体。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过或通过体外结合分析，诸如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)进行确定。
单克隆抗体的结合亲合性例如可以通过Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)描述的Scatchard分析进行确定。一旦鉴定了产生所需特异性，亲合性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，克隆可以通过有限稀释方法进行亚克隆并且通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，103页(AcademicPress，1986))。用于这种目的的合适的培养基包含例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤体内在动物体内生长，例如通过将细胞i.p.注射到小鼠中。
由亚克隆分泌的单克隆抗体可以适当地从培养基，腹水或血清通过常规抗体纯化方法诸如，例如，亲和层析(例如，利用蛋白A或G蛋白-琼脂糖)或离子交换层析，羟磷灰石色谱层析，凝胶电泳，透析等等分离得到。
编码单克隆抗体的DNA可以利用常规程序(例如，通过利用能够特异性结合到编码鼠科抗体的重链以及轻链的基因的寡核苷酸探针)很容易分离并且测序。杂交瘤细胞用作这种DNA的优选的来源。一旦分离，可将DNA置入表达载体，然后转化或转染到不产生抗体蛋白质的原核或真核生物宿主细胞，诸如，例如E.coli细胞，猿COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或骨髓瘤细胞中来在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。重组体在编码抗体的DNA的细菌中的表达的综述包含Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)以及Phickthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。
此外，单克隆抗体或抗体片段可以分离自利用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)所述技术产生的抗体噬菌体文库。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)以及Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了利用噬菌体文库分离的鼠科以及人抗体。随后的公开描述了通过链改组产生高亲合性(nM范围)的人抗体(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及感染以及体内重组的组合作为构建体非常大量的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统的单克隆抗体杂交瘤技术的可行的备选方案。
编码抗体的DNA可以例如，通过将人重链以及轻链保守功能域(CH以及CL)序列取代同源鼠科序列(U.S.专利4,816,567；以及Morrison，等Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过免疫球蛋白编码序列与编码非-免疫球蛋白多肽(异源的多肽)的所有或部分融合进行修饰产生嵌合或融合的抗体多肽。非免疫球蛋白多肽序列可以取代抗体的保守结构域，或它们可以用抗体的保守结构域取代，或者它们可以用抗体的一个抗原结合位点的可变域取代产生包括一个具有抗原特异性的抗原-结合位点以及具有不同抗原的特异性的另一抗原-结合位点的嵌合二价抗体。
人源化抗体
用于人源化非-人抗体的方法已描述在现有技术中。优选地，人源化抗体具有在其中导入的一或多个非人类来源的氨基酸残基。这些非-人氨基酸残基常常称为“输入的”残基，其通常获自“输入的”可变域。人源化可以基本上沿用Winter及其同事的方法(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))通过用高变区序列取代人抗体的相应序列来进行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合的抗体(美国专利4,816,567)其中基本上小于完整的人可变域已经被非-人物种的相应序列取代。在应用中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基以及可能的一些残基被来自啮齿动物抗体中的类似的位点的残基取代。
当抗体是用于人治疗应用时，用于人源化抗体产生的轻以及重的人可变域的选择对于减少抗原性以及HAMA应答(人抗鼠抗体)是非常重要的。根据所谓的“最适”方法，啮齿动物抗体可变域的序列可以从已知人可变域序列的全部文库进行筛选。鉴定接近啮齿动物V结构域序列的人V结构域序列以及其中接受人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一方法使用特定来源于特定的轻或者重链的所有人抗体的特定框架区。相同的框架可用于几个不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
更重要的是抗体为保持对抗原的高度结合亲合性及其它良好的生物学特性的人源化抗体。为实现该目标，根据优选的方法，通过利用亲本以及人源化序列的三维模型分析亲本序列以及多种设想的人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是本领域技术人员可以获得并且熟知的。
可利用说明以及显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构型结构的计算机程序。这些显示的检查可以分析残基在候选免疫球蛋白序列中发挥功能的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力。以这种方法，FR残基可以选自受体以及输入序列及其组合，从而实现期望的抗体特性，诸如对靶抗原亲合性的增加。通常，高变区残基直接并且基本上参与影响抗原结合。
可以考虑多种形式的人源化抗-Pro104抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，其任选地与一或多种细胞毒剂结合以便产生免疫结合物。或者，人源化抗体可以是完整的抗体诸如完整的IgG1抗体。
人抗体
作为人源化的替代物，可以产生人抗体。例如，现在可以在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生在能够免疫后产生完整人抗体集合的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了抗体重链连接区(JH)基因在嵌合以及细菌-系突变体小鼠中的纯合缺失产生内源抗体产生的完全抑制。将人细菌-系免疫球蛋白基因阵列转移到这种细菌-系突变小鼠中将在抗原攻击后产生人抗体。参见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；美国Patent5,545,806，5,569,825，5,591,669(均为GenPharm所有)；5,545,807；以及或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))可用于从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因在体外产生人抗体以及抗体片段。依据这种技术，将抗体V结构域基因框架内克隆到丝状噬菌体，诸如M13或者fd的主要或者次要外壳蛋白基因中，并且显示为噬菌体粒子表面上的功能性抗体片段。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性的选择还产生编码显示出那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟B-细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，参见例如，Johnson，Kevin S.以及Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。几个V-基因片段来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)从来源于免疫老鼠的脾V基因的小随机组合文库集合中分离了多种抗-恶唑酮抗体系列。可以构建来源于未免疫的人供体V基因的集合，并且多种抗原系列(包含自身抗原)的抗体可以大体上沿用Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，或者Griffith等，EMBOJ.12：725-734(1993)描述的技术进行分离。参见，美国专利5,565,332以及5,573,905。如上所述，人抗体还可以通过体外激活B细胞产生(参见美国专利5,567,610以及5,229,275)。
抗体片段
在某些条件下，有利用抗体片段而不是全部抗体的优点。较小大小的片段可以快速的清除，并且可以提高对实体肿瘤的进入。已经发展了产生抗体片段的多种技术。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解降解衍生而来(参见，例如Morimoto等，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24：107-117(1992)；以及Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，这些片段现在可以直接通过重组体宿主细胞产生。Fab，Fv以及ScFv抗体片段全部能够表达在E.coli中并从E.coli分泌出来，因此可以很容易大量地产生这些片段。抗体片段可以分离自如上所述的抗体噬菌体文库。或者，Fab′-SH片段可以直接回收自E.coli并且化学结合形成F(ab)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，F(ab)2片段可以直接分离自重组宿主细胞培养物。包括结合表位的回收受体的体内半衰期增加的Fab以及F(ab)2片段描述在美国专利5,869,046中。其它产生抗体片段的技术对于本领域技术人员是显而易见的。选择的抗体还可能是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利5,571,894；以及美国专利5,587,458。Fv以及sFv是唯一具有完整的缺乏保守区的结合位点；因此它们适于在体内应用期间降低非特异性的结合。可以构建sFv融合蛋白产生效应物蛋白在sFv.氨基或者羧基末端的效应蛋白。参见Antibody Engineering，ed.Borrebaeck，同上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利5,641,870所述的。这种线性抗体片段可以是单特异性的或者双特异性的。
双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。典型的双特异性抗体可以结合于Pro104蛋白的两个不同表位。其它的这种抗体可以将Pro104结合部位与另一蛋白的结合位点组合。或者，抗-Pro104.臂可以与白细胞上的活化分子结合的臂组合，所述活化分子为诸如T细胞受体分子(例如C133)，或者IgG(FcγR)的Fc受体，诸如FcγRI(CD64)，FcγRlI(CD32)以及FcγRIII(CD16)，以便将细胞防卫机制聚焦并且定位到表达Pro104的细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒剂定位到表达Pro104的细胞。这些抗体具有Pro104-结合臂并且结合细胞毒剂(例如皂草素，抗-干扰素-α，长春花生物碱，蓖麻毒A链，氨甲喋呤或者放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可以制备为全长抗体或者抗体片段(例如F(ab)2双特异性抗体)。WO96/16673描述了双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRIII抗体以及美国专利5,837,234公开了了双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRI抗体。双特异性抗-ErbB2/Fcα抗体显示于WO98/02463。美国专利5,821,337教导了双特异性抗-ErbB2/抗-CD3抗体。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统产生全长双特异性抗体是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。因为免疫球蛋白重以及轻链的随机组合，这些杂交瘤(quadromas)产生10种不同抗体分子的可能混合，其中仅仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，并且产品产率较低。类似的方法公开在WO 93/08829以及Traunecker等的EMBO J.，10：3655-3659(1991)中。
根据不同的方法，具有期望结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)融合到免疫球蛋白保守结构域序列。优选地，融合Ig重链保守结构域，包括至少部分铰链，CH2以及CH3区域。优选具有存在于至少一个融合子中含有轻链结合所需的位点的第一重链保守区(CHI)。将编码免疫球蛋白重链融合子以及如果需要免疫球蛋白轻链的DNAs插入分离表达载体中，并且被共转染到合适的宿主细胞中。当在构建中使用的不相等比例的三个多肽链提供期望双特异性抗体的最适产量的实施方案中在调整三个多肽片段的相互比例中提供了更大的灵活性。然而当至少相等比例的两个多肽链的表达高产率产生或者当比例对期望的链结合的产量没有显著影响时，可以将两个或者所有三个多肽链的编码序列插入到单个表达载体中。
优选地，该方法中的双特异性抗体由一个臂中第一结合特异性的杂交体免疫球蛋白重链，以及其它臂中杂交体免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。已经发现这种不对称的结构促进了期望的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链结合分离开来，因为免疫球蛋白轻链在仅仅一半的双特异性分子中的存在提供了容易的分离方式。这种方法公开在WO 94/04690中。产生双特异性抗体的更详细的描述例如参见Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
根据美国专利5,731,168描述的另一方法，一对抗体分子之间的界面可以被工程化使异源二聚体百分比最佳化，所述异源二聚体回收自重组细胞培养物。优选的界面包括至少一部分CH3结构域。在该方法中，来自第一抗体分子界面的一或多条小氨基酸侧链用较大的侧链(例如酪氨酸或者色氨酸)取代。大侧链的互补的相同或者类似大小的互补“腔”在第二抗体分子的界面上通过用较小氨基酸(例如丙氨酸或者苏氨酸)取代大氨基酸侧链产生。这提供了增加超过不需要的诸如同型二聚体制成品的杂二聚物的产量的机制。
双特异性抗体包含交联的或者“杂结合物”抗体。例如，杂结合物中的一种抗体可以与除生物素外的抗生物素蛋白结合。这种抗体已经例如建议将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373以及EP 03089)。可以利用任意适当的交联方法制备杂结合物抗体。合适的交联剂是本领域已知的，并且连同多种交联技术公开在美国专利4,676,980中。
从抗体片段产生双特异性抗体的技术已描述在文献中。例如，可以利用化学键制备双特异性抗体。Brennan等，Science，229：81(1985)描述了一种方法，其中完整的抗体被蛋白降解产生F(ab′)2片段、这些片段在二硫络合剂，亚砷酸钠存在时还原以稳定附近的双硫醇并且防止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab′片段转化为thionitrobenzoate(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将一种Fab′-TNB衍生物再转变为Fab′-硫醇并且与等摩尔量的其它Fab′-TNB衍生物混合来双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定的试剂。
新近进展已经促进了从E.coli直接回收Fab’-SH片段，其可以化学连接形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了产生完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子。每一Fab′片段单独分泌自E.coli并且用于体外直接化学偶合形式双特异性抗体。由此形式的双特异性抗体可以结合过量表达ErbB2受体的细胞以及正常人的T细胞，以及引发人细胞毒素淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶的分解活性。直接从重组细胞培养物制备以及分离双特异性抗体片段的各种技术也已经得以描述。例如，双特异性抗体已经利用白氨酸拉链产生。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos以及Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接于两个不同抗体的Fab′部分。在绞链区还原抗体同源二聚体形成单体然后再氧化形式抗体异源二聚体。这个方法还可以用于产生抗体同源二聚体。
Hollinger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“二链抗体”技术已经提供了产生双特异性抗体片段的其它机制。该片段包含通过短到可以连接在相同链上的两个结构域之间配对的接头连接到VL的VH。因此，一个片段的VH以及VL结构域被迫与另一个片段的VL以及VH结构域互补，由此形成两个抗原-结合位点。还报道了利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。也考虑超过两个效价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等J.Immunol.147：60(1991)。
多价抗体
多价抗体通过表达结合抗体的抗原的细胞可以比二价抗体更快的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多抗原结合位点的多价抗体(其不同于IgM类)(例如四价抗体)，其可以通过重组表达编码抗体多肽链的核酸很容易地制备。多价抗体可以包括二聚化功能域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚化功能域包括(或包含)Fc区域或绞链区。在此方案中，抗体包括Fc区域和三个或更多个Fc区域氨基-末端的抗原结合位点。在这里优选的多价抗体包括(或包含)三个至约八个，但是优选四个抗原结合位点。多价抗体包括至少一个多肽链(且优选两个多肽链)，其中多肽链包括两个或更多个可变区。例如，多肽链可包括VD1(X1n-VD2-(X2)n-Fc，其中VDI是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区域的一个多肽链，XI和X2表示氨基酸或多肽，且n为0或1。例如，多肽链可包括：VH-CHI-柔性接头-VH-CHI-Fc区域链；或VH-CHI-VH-CHI-Fc区域链。在这里多价抗体优选地进一步包括至少两个(且优选四个)轻链可变区多肽。在这里多价抗体可例如，包括从约两个到约八个轻链可变区多肽。轻链可变区多肽在这里包括一个轻链可变区以及，任选地，进一步包括一个CL功能域。
其它的氨基酸序列修饰
在这里描述的抗-Pro104抗体氨基酸序列修饰被考虑。例如，其可以是理想地用于提高结合抗体的亲合性和/或其它生物学特性。通过向抗-Pro104抗体核酸中引入合适的核苷酸变化，或通过肽合成来制备抗-Pro104抗体的氨基酸序列变体。
这种修饰包括，例如抗-Pro104抗体氨基酸序列内残基的缺失，和/或插入，和/或取代。进行缺失，插入以及取代的任意组合来获得最终的构建体，条件是最终的构建体具有目的特性。氨基酸变化也可以改变抗-Pro104抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
用于鉴定抗-Pro104抗体的特定残基或区域也即突变形成的优选位置的有用的方法称作“丙氨酸扫描突变形成”，如Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中所描述的。在这里，抗-Pro104抗体内目的残基或目的残基的组被鉴定(例如，带电荷的残基诸如arg，asp，his，lys，和glu)以及通过中性或带负电荷的氨基酸(最优选地为丙氨酸或聚丙氨酸)替代来影响氨基酸与Pro104抗原的相互作用。
然后，证明对取代的功能性敏感性的氨基酸定位被通过在或用于取代的位点导入进一步的或其它的变体被精细确定。由此，当用于导入氨基酸序列变化的位点预先确定时，突变本身的特性不必预先确定。例如，为分析突变在所给位点的表现，在目的密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变并且筛选目的活性的表达的抗-Pro104抗体变体。
氨基酸序列插入包括由一个残基到含有一百或更多个残基长的多肽的氨基-和/或羧基-末端的融合，以及单个或多氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗-Pro104抗体或抗体融合于细胞毒性多肽。抗-Pro104抗体的其它插入变体包括抗-Pro104抗体的N-或C末端融合于酶(例如ADEPT)或融合于增加抗体的血清半衰期的多肽。
变体的另一类型为氨基酸取代变体。这些变体用不同残基取代抗-Pro104抗体分子中的至少一个氨基酸残基。用于取代突变形成的最有意义的位点包括高变区，但是FR改变也被预期。保守取代显示为表I的表头为“优选取代”的下面。如果这种取代导致生物活性的变化，然后更多基本上的改变，命名为表1中的“典型的取代”，或如下进一步所述的氨基酸类型，可被导入并且筛选具有目的特性的产物。
表I氨基酸取代
  原始的残基  典型的取代   优选的取代
  Ala(A)  val；leu；ile   Val
  Arg(R)  lys；gln；asn   lys
  Asn(N)  gln；his；asp，lys；arg   gln
  Asp(D)  glu；asn   glu
  Cys(C)  ser；ala   ser
  Gln(Q)  asn；glu   asn
  Glu(E)  asp；gln   asp
  Gly(G)  ala   ala
  His(H)  asn；gln；lys；arg   arg
  Ile(I)  leu；val；met；ala；phe；norleucine   leu
  Leu(L)  norleucine；ile；val；met；ala；   ile
  Lys(K)  arg；gin；asn   arg
  Met(M)  leu；phe；ile   leu
  Phe(F)  leu；val；ile；ala；tyr   tyr
  Pro(P)  ala   ala
  Ser(S)  thr   thr
  Thr(T)  ser   ser
  Trp(W)  tyr；phe   tyr
  Tyr(Y)  trp；phe；thr；ser   Phe
  Val(V)  ile；leu；met；phe；ala；norleucine   leu
抗体生物学特性中的基本上的修饰同时伴随它们对维持(a)取代区域内多肽主链的结构，例如，片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积，的作用具有显著差异的选择性取代。天然存在的残基被基于共同的侧-链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性亲水性的：cys，ser，thr；(3)酸性的：asp，glu；(4)碱性的：asn，gin，his，lys，arg；(5)影响链取向的残基：gly，pro；以及(6)芳香族的：trp，tyr，phe。
非-保守取代需要将此类型的一个成员交换为另一类型的。与维持抗-Pro104抗体的正确构象没有关系的任意半胱氨酸残基通常可被用丝氨酸取代，来提高分子的抗氧化性以及防止异常的交联。相反，半胱氨酸键可被添加给抗体来提高其稳定性(尤其是其中抗体为抗体片段诸如Fv片段)。
取代变体尤其优选的类型包括取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一或多个高变区残基。通常，进一步发展选择产生的变体相对于其亲本抗体具有提高的生物学特性。产生这种取代变体的适当方式包括利用噬菌体展示进行亲合性突变。简而言之，突变几个高变区位点(例如6-7个位点)来在各位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体展现出来自丝状噬菌体粒子的单价方式如融合于各粒子内包装的M13的基因III产物。然后如在这里公开的，筛选噬菌体-显示的变体的生物活性(例如结合亲合性)。为鉴定用于修饰候选的高变区位点，可进行丙氨酸扫描突变形成来鉴定显著有助于抗原结合的高变区残基。任选地，或另外地，其可有益于分析抗原抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和人Pro104之间的接触点。这种接触残基和邻接残基为用于按照在这里详细描述的技术的取代候选物。一旦产生这种变体，如在这里描述的筛选变体组以及可选择在一或多种相关测定中具有优良特性的抗体用于进一步的改进。
抗体氨基酸变体的另一类型改变了抗体的原始糖基化模式。改变是指缺失一或多个在抗体中发现的碳水化合物部分，和/或添加一或多个在抗体不存在的糖基化位点。抗体的糖基化为典型地N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸，为用于酶促连接碳水化物部分与天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中任何一个这些三肽序列的存在产生了潜在糖基化位点。O-糖基化是指连接糖N-乙酰基半乳糖胺，半乳糖，或木糖与羟氨基酸，最通常地为丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列使得其含有一个或多个上述三肽序列(用于N-糖基化位点)很方便地实现将糖基化位点添加给抗体。通过添加，取代原始抗体(用于O-糖基化位点)的序列的一或多个丝氨酸或苏氨酸也可进行改变。
通过本领域已知的各种方法制备编码抗-Pro104抗体氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，由天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况下)或通过寡核苷酸-介导(或位点-直接)的突变形成来制备，PCR突变形成，和较早制备的编码抗-Pro104抗体的变体或非-变体形式核酸分子的盒式突变形成。
可理想地来修饰本发明抗体的效应子功能，例如增强抗体的抗原-依赖的细胞-介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。此可通过在抗体的Fc区域导入一或多个氨基酸取代来获得。任选地或另外地，半胱氨酸残基可在Fc区域导入，由此允许在此区域形成链间二硫键。由此产生的同源二聚抗体可具有提高的内在化能力和/或增加的补体-介导的细胞杀伤和抗体-依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗-肿瘤活性的同源二聚抗体也可利用异双功能交叉-连接来制备，如Wolff等，Cancer Research53：2560-2565(1993)所述。任选地，抗体可被工程改造具有双重的Fc区域且可由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
为增加抗体的血清半衰期，如例如美国专利5,739,277所述可插入一个援救受体结合表位到抗体(尤其抗体片段)中。此处所述的术语“援救受体结合表位”是指抗体的Fc区域的表位。
筛选具有目的特性的抗体
用于产生抗体的技术如上所述。如需要，可进一步选择具有特定生物学特性的抗体。
本发明抗-Pro104抗体的生长抑制作用可用本领域已知的方法进行评价，例如，利用表达内源性或Pro104基因感染后的Pro104的细胞。例如，在下述实施例1中提供的肿瘤细胞系和Pro104感染的细胞可用各种浓度的本发明抗-Pro104单克隆抗体处理几天(例如，2-7)时间，并且用结晶紫或MTT染色或通过其它的比色测定进行分析。测定增殖的另一方法为通过比较用在本发明抗-Pro104抗体存在或缺乏的条件下处理的细胞对3H胸腺嘧啶的吸收。抗体处理后，收集细胞并且在闪烁计数器中定量测定插入到DNA中的放射性的量。合适的阳性对照包括用已知抑制细胞系生长的生长抑制抗体处理所选择的细胞系。可通过诸如在下述实验实施例部分描述的多种方式测定体内肿瘤细胞的生长抑制。优选地，肿瘤细胞为过量表达Pro104的。优选地，与未处理的肿瘤细胞相比，在抗体浓度约0.5至30μg/ml时，抗-Pro104抗体将体外或体内抑制表达Pro104的肿瘤细胞的细胞增殖约25-100％，更优选地，约30-100％，且更优选地约50-100％或70-100％。可在抗体浓度为约0.5至30μg/ml或在细胞培养物中约0.5nM至200nM时测定生长抑制，其中在将肿瘤细胞暴露于抗体后1-10天测定生长抑制。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用抗-Pro104抗体导致由首次施用抗体约5天至3个月内，优选约5至30天减少了肿瘤大小或肿瘤细胞增殖，则抗体是体内生长抑制的。
为选择诱导细胞死亡的抗体，可评价通过例如碘化丙啶(PI)，台盼蓝或7AAD吸收显示的膜完整性相对于对照的降低。PI吸收测定可在缺乏补体和免疫效应细胞的情况下进行。表达Pro104的肿瘤细胞与单独培养基或含有合适的例如约10μg/ml单克隆抗体的培养基一起温育。细胞被温育3天时间。处理之后，冲洗细胞并等分到35mm滤网-加盖12x 75管(1ml每管，每试验组3个管)中用于去除细胞块。管然后接受PI(10μg/ml)。可利用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。可选择通过PI吸收测定具有诱导细胞死亡的统计显著水平的那些抗体作为细胞死亡-诱导抗体。
为筛选结合于被目的抗体例如本发明的pro104抗体结合的Pro104上表位的抗体，可进行诸如在Antibodies，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中描述的常规交叉阻断测定。此测定可用于测定是否试验抗体结合与本发明的抗-Pro104抗体结合的相同位点或表位。任选地，或另外地，可通过本领域已知的方法进行表位绘图。例如，可诸如通过丙氨酸扫描突变抗体的序列来鉴定接触残基。最初测定突变体抗体与多克隆抗体的结合来确定正确的折叠。在不同的方法中，对应于Pro104的不同区域的肽可用于与测定抗体或与试验抗体以及抗体与鉴定的或已知表位的竞争测定。
例如，筛选结合于被本发明抗体结合的表位的抗体的方法可包括结合含Pro104样品与试验抗体以及本发明的抗体来形成混合物，然后测定混合物中结合于Pro104的Pro104抗体的水平并比较结合于混合物与结合于对照混合物的Pro104抗体的水平，其中结合于混合物中Pro104的Pro104抗体的水平与对照相比为结合于被本发明的抗-Pro104抗体结合的表位的试验抗体的指示。通过ELISA测定Pro104抗体结合Pro104的水平。对照可以是阳性的或阴性对照或二者。例如，对照可以是Pro104，本发明的Pro104抗体以及已知结合本发明Pro104抗体结合的表位的抗体的混合物。用诸如在这里公开公开那些标记来标记抗-Pro104抗体。Pro104可以结合固相支持体，例如，组织培养微孔板或结合于磁珠，例如，琼脂糖磁珠。
免疫结合物
本发明也涉及用包括与抗-癌药物诸如细胞毒性剂或生长抑制剂结合的抗体的免疫结合物进行的治疗。
对产生这种免疫结合物的化疗剂已经在上面描述。抗体和一或多种小分子毒素，诸如卡奇霉素(Calicheamicin)，美登素类，单端孢菌素以及CC1065，和这些毒素的具有毒素活性的衍生物的结合物，在这里也被考虑。
美登素和美登素类化合物
优选地，本发明的抗-Pro104抗体(全长或片段)结合于一或多个美登素类分子。
美登素类为通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。美登素首次由脱皮非洲灌木Maytenus serrata(美国专利3,896,111)中分离。随后，人们发现特定的微生物也产生美登素类化合物，诸如美登素醇和C-3美登素醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登素醇及其衍生物和类似物公开在，例如，美国专利Nos 4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中，其内容在此引入作为参考。
美登素类-抗体结合物
为提高它们的治疗指数，美登素和美登素类化合物已被结合于特异性结合于肿瘤细胞抗原的抗体。含有美登素类化合物的免疫结合物及其治疗用途公开在，例如，美国专利Nos 5,208,020，5,416,064以及欧洲专利EP 0 425 235 B1中，其内容在此引入作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述了包括称为DMI的美登素类化合物的免疫结合物连接于直接抗人结肠直肠癌的单克隆抗体C242。结合物被发现对培养的结肠癌细胞是高度细胞毒性的，且体内肿瘤生长测定中显示出抗癌活性。Chari等Cancer Research 52：127-131(1992)描述了免疫结合物，其中美登素类化合物通过二硫化物接头结合于与人结肠癌细胞系上抗原结合的鼠抗体A7，或结合于结合HER-2/neu致癌基因的另一鼠单克隆抗体TA.1。体外测定TA.1-美登素类结合物的细胞毒性对每细胞表达3×10 5HER-2表面抗原的人乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性。药物结合物获得类似于游离美登素类药物的细胞毒性的程度，其可通过增加每抗体分子的美登素类分子的数目来增加。A7美登素类结合物在小鼠中显示出低的系统性细胞毒性。
抗-Pro104抗体-美登素类结合物(免疫结合物)
通过化学连接抗-Pro104抗体与美登素类分子没有显著地减少抗体或美登素类化合物分子的生物活性来制备抗-Pro104抗体-美登素类结合物。每抗体分子平均3-4个美登素类分子结合物在增强靶细胞的细胞毒性方面显示出效力而没有负面影响抗体的功能或可溶性，尽管甚至一分子的毒素/抗体被期望超过利用裸抗体来增强细胞毒性。美登素类化合物是本领域公知的且可通过已知的技术合成或由天然来源分离。合适的化合物公开在，例如，美国专利No.5,208,020以及上文所述的其它专利和非专利出版物中。优选的化合物为在美登素醇分子诸如各种美登素醇酯的芳香环或其它位置修饰的美登素醇和美登素醇类似物。
有许多本领域已知的用于制备抗体-化合物结合物的连接基团，包括，例如，在美国专利No.5,208,020或EP专利0 425 235 B1，以及Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫基，硫醚基，酸不稳定基团，光不稳定基团，肽酶不稳定基团，或酯酶不稳定基团，如上述专利所公开的，二硫化物和硫醚基为优选的。利用各种诸如下述的双功能蛋白偶联剂可制备抗体和化合物的结合物：N-琥珀酰基(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰基-(N-maleimidomethyl)-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基adipimidate HCL)，活性的酯(诸如disuccinimidyl辛二酸)，醛(诸如戊二醛)，二-叠氮基化合物(诸如his(p-azidobenzoyl)已二胺)，二-重氮衍生物(诸如二-(p-diazoniumbenzoyl)-乙二胺)，二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)，以及二-活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括用于提供二硫键的N-琥珀酰(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737[1978])以及N-琥珀酰基(2-吡啶基硫)戊酸酯(SPP)。
接头可取决于连接的类型在不同位置连接于化合物分子。例如，酯键可以通过与羟基利用常规的偶联技术反应来形成。反应可发生在具有羟基的C-3位置，用羟甲基修饰的C-14位置，用羟基修饰的C-15位置，以及具有羟基的C-20位置。优选地，连接在美登素醇或美登素醇类似物的C-3位置处形成。
卡奇霉素(Calicheamicin)
另外的目的免疫结合物包括与一或多个卡奇霉素分子结合的抗-Pro104抗体。抗生素卡奇霉素家族能够以亚皮摩尔浓度断裂产生的双链DNA。为制备卡奇霉素家族的结合物，参见美国专利5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，5,877,296(均属于American Cyanamid公司)。可使用的卡奇霉素的结构类似物包括，但不限于，γ1 I，α2 I，α3 I，N-乙酰基-γ1 I，PSAG和θ1 I，(Hinman等Cancer Research 53：3336(1993)，Lode等CancerResearch 58：2925-2928(1998)以及上述的American Cyanamid的美国专利)。其它抗体结合的抗-肿瘤药物为抗叶酸酯-QFA。卡奇霉素和QFA二者具有作用的胞内位点且不容易穿过原生质膜。因此，细胞通过抗体介导的内在化对这些药物的吸收大大增强了它们的细胞毒性作用。
其它细胞毒性剂
其它可结合于本发明的抗-Pro104抗体抗肿瘤剂包括BCNU，链脲霉素，长春新碱和5-氟尿嘧啶，描述在美国专利5,053,394，5,770,710中的公知的LL-E33288复合物的药物家族，以及esperamicins(美国专利5,877,296)。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链，白喉毒素的15非结合活性片段，外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)，篦麻毒素A链，相思豆毒素A链，蒴莲素A链，α-帚曲菌素，油桐蛋白，康乃馨蛋白，商陆蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒素，sapaonaria officinalis抑制剂，gelonin，mitogellin，局限曲菌素，酚霉素，伊诺霉素和单端孢霉菌烯醇。参见，例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。本发明进一步考虑抗体和具有溶核活性的化合物之间形成的免疫结合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNase)。
为选择性破坏肿瘤，抗体可包括高度放射性原子。各种各样的放射性同位素可用于制备放射结合的抗-Pro104抗体。实例包括At211，I131，I125，In111，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，以及Lu的放射性同位素。当结合物用于诊断时，其可包括用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如Tc99M或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
放射的或其它标记可以以已知的方式混入结合物中。例如，肽可以是生物合成的或通过利用合适的氨基酸前体包括，例如，氟-19替换氢进行化学氨基酸合成。标记诸如Tc99M，I123，In111，Re186，Re188，可通过肽中的半胱氨酸残基被连接。钇-90可通过赖氨酸残基连接。IODOGEN方法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可用于插入碘，″Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy″(Chatal，CRC Press 1989)具体描述了其它的方法。
利用各种诸如下述的双功能蛋白偶联剂可制备抗体和细胞毒性剂的结合物：N-琥珀酰基(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰基-(N-maleimidomethyl)-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基adipimidate HCL)，活性的酯(诸如disuccinimidyl辛二酸)，醛(诸如戊二醛)，二-叠氮基化合物(诸如his(p-azidobenzoyl)已二胺)，二-重氮衍生物(诸如二-(p-diazoniumbenzoyl)-乙二胺)，二异氰酸酯(诸如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，以及二-活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所描述的来制备篦麻毒素免疫毒素。碳标记的1-异硫代氰基苯甲基甲基二乙烯基三胺五乙酸(MX-DTPA)为典型的用于放射性核苷酸与抗体结合的螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞中细胞毒性药物释放的“可裂解的接头”。例如，可使用酸-不稳定接头，肽酶-敏感的接头，光不稳定的接头，二甲基接头或含有二硫化物的接头(Chari等Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
任选地，可例如通过重组技术或肽合成制备含有抗-Pro104抗体以及细胞毒性剂的融合蛋白。DNA的长度可包括编码彼此邻近或通过编码不破坏结合物的目的特性的接头肽分开的两部分结合物的相应区域。
此外，抗体可结合于用于肿瘤预靶向的“受体”(诸如链霉亲和素)，其中抗体-受体结合物被施用于患者然后利用清除剂由循环中去除未结合的结合物然后施用结合于细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
抗体依赖酶介导的潜药治疗(ADEPT)
本发明的抗体也可用在ADEPT中通过结合抗体与将潜药(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转变为活性的抗-癌药物的潜药-激活酶。参见，例如，WO 88/07378和美国专利No.4,975,278。
可用于ADEPT的免疫结合物的酶组分包括能够以此种方式作用于潜药将其转化为更具活性、细胞毒性形式的任意酶。可用于本发明的酶包括，但不限于，可用于将含磷酸酯潜药转化为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸盐的潜药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒的氟代胞核嘧啶转化为抗-癌药物的胞嘧啶脱氨酶；蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧基肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含肽潜药转化成游离药物；D-丙氨酰基羧基肽酶，可转化含有D-氨基酸取代基的潜药的；碳水化合物裂解酶诸如可用于将糖基化潜药转化成游离药物的O-半乳糖苷酶和神经氨糖酸苷酶；可用于将具有P-内酰胺的衍生药物转化成游离药物的P-内酰胺酶；以及氨基酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，可用于将具有苯氧基乙酰基或苯乙酰基团的胺氮的衍生药物分别转化成游离药物的。任选地，具有酶活性的抗体，在本领域已知称为“抗体酶”，可用于将本发明的潜药转化成游离的活性药物(参见，例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如在这里描述的制备抗体-抗体酶结合物来用于将抗体酶递送给肿瘤细胞群体。本发明的酶可通过本领域众所周知的技术诸如通过上述的利用异双功能交联试剂共价结合于抗-Pro104抗体。
任选地，可利用本领域众所周知的重组DNA技术构建含有至少本发明抗体的抗原结合区域连接于至少本发明酶的功能活性部分的融合蛋白(参见，例如，Neuberger等，Nature，312：604-608(1984)。
其它的抗体修饰
抗体的其它修饰被在这里考虑。例如，抗体可连接各种非蛋白质聚合物中的一种，例如，聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体可被截留在通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲脂)微胶囊)中，胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳-粒子和纳微胶囊)中，或截留在巨乳化液中。此技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)中。
在这里公开的抗-Pro104抗体可配制为免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的脂类，磷脂和/或用于递送药物至哺乳动物的表面活性剂组成的小囊。脂质体的组分通常排列成双分子层形式，类似于生物膜的脂类排列。通过已知的方法制备含有抗体的脂质体，诸如描述在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；US Pat.Nos.4,485,045和4,544,545；以及1997年10月23日公开的WO97/38731中的方法。具有增强的循环时间的脂质体公开在美国专利No.5,013,556中。可通过用含有卵磷脂，胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)进行的反相蒸发法来产生尤其有用的脂质体。通过规定孔径的过滤器挤压来产生具有目的直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)所述通过二硫化物互换作用结合于脂质体。化疗剂任选地包含在脂质体内。参见Gabizon等J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989).
载体，宿主细胞，和重组方法
本发明也提供了编码人源化抗-Pro104抗体的分离的核酸分子，含有核酸的载体和宿主细胞，以及用于制备抗体的重组技术。为重组制备抗体，分离编码抗体的核酸分子并插入可复制的载体中用于进一步的克隆(DNA的扩增)或插入与用于表达的启动子可操作连接的载体中。很容易地分离编码单克隆抗体的DNA并利用常规方法测序(例如，通过利用能够特异性结合于编码抗体的重链和轻链的寡核苷酸探针)。许多载体可以被利用。载体组分通常包括，但不限于，一个或多个下述的：一个信号序列，一个复制起点，一或多个标记基因，一个增强子元件，一个启动子，以及一个转录终止序列。
信号序列组分
本发明的抗-Pro104抗体不仅可直接重组制备，而且作为与异源多肽的融合多肽，其是优选的信号序列或其它在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特异性切割位点的多肽。选择的异源信号序列优选地是被宿主细胞识别和加工(即，通过信号肽酶裂解)。对于不识别和加工天然的抗-Pro104抗体信号序列的原核宿主细胞而言，信号序列被选择的，例如，来自碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp或热稳定的肠毒素II引导序列的原核信号序列取代。对于酵母分泌而言，天然的信号序列可被例如，酵母转化酶前导序列，oc因子前导序列(包括酵母属和克卢费氏酵母cc-因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，C.albicans葡糖淀粉酶前导序列，WO 90/13646中描述的信号所取代。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌的前导序列，例如，单纯性疱疹gD信号，是可利用的。这种前体区域的DNA被连接在编码抗-Pro104抗体的DNA的阅读框架中。
复制起点
表达和克隆载体包含能使载体在一或多个所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中此序列是能使载体独立复制宿主染色体DNA的序列，且包含复制起点或自主复制序列。各种细菌，酵母和病毒的这种序列是公知的。来自质粒pBR322的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适于酵母，且不同的病毒起点(SV40，多形瘤，腺病毒，或BPV)对于哺乳动物细胞中的克隆载体是有用的。通常，复制起点组分不是哺乳动物表达载体所需要的(典型地SV40起点可以被使用仅仅是因为其包含早期启动子)。
选择基因组分
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择性标记。典型的选择基因编码(a)赋予对抗生素例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素或其它毒素的抗性；(b)补体营养缺陷的；或(c)供给不能获自复合培养基的关键养分，的蛋白，例如，编码芽孢杆菌属的D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个实例利用药物阻止宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生赋予耐药性的蛋白且由此使得此选择方式被采用。这种主要选择的实例使用药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。
哺乳动物细胞的合适选择性标记的其它实例为能识别细胞感受态来吸收抗-Pro104抗体核酸的那些，诸如DHFR，胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-11，优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等等。例如，通过在包含氨甲喋呤(Mtx)，DHFR的抗代谢物的培养基中培养所有的转化体首先鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当利用野生型DHFR时，合适的宿主细胞为缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
任选地，用编码抗-Pro104抗体，野生型DHFR蛋白和其它选择性标记诸如氨基苷3’-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共-转化的宿主细胞(尤其是包含内源DHFR的野生型宿主)，可通过在包含选择性标记诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的选择剂的培养基中培养细胞来筛选。参见美国专利No.4,965,199。
用于酵母的合适的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。trp1基因提供了用于缺少在色氨酸中生长的能力的酵母突变株44076或PEP4例如ATCCNo.44076的选择标记或Jones，Genetics，85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中trp1损坏的存在则提供了通过在缺乏色氨酸的情况下培养检测转化的有效环境。类似地，Leu2-缺乏的酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)被通过具有Leu2基因的已知质粒补充。
此外，获自1.6pm循环质粒pKDI的载体可用于克卢费氏酵母的转化。任选地，大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统被报道在K.lactis.Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)中。本发明也公开了工业菌株的用于分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多-拷贝表达载体。Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
启动子组分
表达和克隆载体通常包含一个由宿主生物识别以及可操作地连接于抗-Pro104抗体核酸的启动子。适用于原核宿主的启动子包含phoA启动子，P-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶启动子，色氨酸(trp)启动子系统，以及杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子为合适的。用于细菌系统的启动子也包含与编码抗-Pro104抗体的DNA可操作相连的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有真核基因具有位于激发转录的位点的上游约25到30碱基的富含AT的区域。被发现距离许多基因的转录起始的上游70到80碱基处的其它序列为CNCAAT区域，其中N可以是核苷酸。大多数真核类基因的3’末端可以作为添加poly A尾至编码序列的3’末端的信号的AATAAA序列。所有这些序列被合适地插入真核生物的表达载体中。用于酵母宿主的合适启动子序列的实例包括用于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖解酶，诸如烯醇酶，磷酸甘油醛脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，磷酸葡糖异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶的启动子。
其它的酵母启动子，其为具有通过生长条件控制转录的其它优点的诱导型启动子，用于乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶与氮素代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、磷酸甘油醛脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达的合适的载体和启动子进一步描述在EP 73,657中。酵母增强子也有益地与酵母启动子一起使用。
哺乳动物宿主细胞中载体的抗-Pro104抗体转录被调控，例如，通过获自病毒诸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒且最优选为猿猴病毒40(SV40)的基因组的启动子，来自异源哺乳动物的启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，热-休克启动子，只要这种启动子与宿主细胞系统是相容的。
SV40病毒的早期和晚期启动子被方便地获得作为也包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片断。人巨细胞病毒的立即早期启动子被方便地获得作为HindIll E限制性片断。在哺乳动物宿主中利用牛乳头瘤病毒作为载体表达DNA的系统公开在美国专利No.4,419,446中。此系统的修饰描述在美国专利No.4,601,978中。也参见Reyes等，Nature 297：598-601(1982)小鼠细胞中人P-干扰素cDNA在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子调控下的表达。任选地，劳氏肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。
增强子元件组分
高等真核生物对编码本发明的抗-Pro104抗体的DNA的转录往往通过插入增强子序列到载体中被加强了。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白，弹性酶，白蛋白，α-胎蛋白和胰岛素)。典型地，然而，人们使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起点(bp 100-270)的后侧的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，位于复制起点的后侧的多形瘤增强子，以及腺病毒增强子。也参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)用于激活真核生物启动子的增强元件。增强子可被剪接到载体中在抗-Pro104抗体-编码序列的位置5’或3’，但优选地位于启动子的位点5’处。
转录终止组分
用于真核生物宿主细胞(酵母，真菌，昆虫，植物，动物，人或来自其它多细胞生物的有核细胞)中的表达载体也包含转录终止以及稳定化mRNA所必需的序列。这种序列通常获自获自真核生物或病毒DNAs或cDNAs的5’且，有时候3’非翻译区。这些区域包含在编码抗-Pro104抗体的mRNA的未翻译部分中作为聚腺苷化片段转录的核苷酸片段。一个有用的转录终止元件为牛生长素聚腺苷酸化区域。参见WO 94/11026以及在其中公开的表达载体。
宿主细胞的选择和转化
用于在载体克隆或表达DNA的合适宿主细胞为原核生物，酵母或如上所述的高等真核生物的细胞。用于此目的合适原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或格兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科诸如埃希氏杆菌属，例如，E.coli，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷伯氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，例如，鼠伤寒沙门氏菌，沙雷菌属，例如，粘质沙雷氏菌，和志贺氏菌属，以及芽孢杆菌属诸如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如，在1989年4月12日公开的DD 266,710中的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属诸如绿脓杆菌，和链霉菌属。优选的E.coli克隆宿主为E.coli 294(ATCC 31,446)，尽管其它的菌株诸如E.coli B，E.coliX1776(ATCC 31,537)和E.coli W31 10(ATCC 27,325)是合适的。这些实例是说明性的而不是限制性的。
全长抗体，抗体片段，以及抗体融合蛋白可在细菌中产生，尤其是当不需要糖基化作用和Fc效应功能时，诸如当治疗抗体结合于细胞毒性剂(例如，毒素)时且免疫结合物自身在肿瘤细胞破坏中显示出有效性。全长抗体在循环中具有更大的半衰期。在E.coli中的制备更快且成本更为有效。为在细菌中表达抗体片段和多肽，参见，例如，US5,648,237(Carter等)，US 5,789,199(Joly等)，以及US5,840,523(Simmons等)其描述了优化表达和分泌的翻译起始区域(TIR)和信号序列，这些专利在此引入作为参考。表达后，由在可溶组分中的E.coli细胞糊状物分离抗体且可通过，例如，依赖同种型的蛋白A或G柱进行纯化。可进行类似于加工的最终纯化来纯化例如在CHO细胞中表达的抗体。
除原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是抗-Pro104抗体-编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母，或常见的面包酵母，是低等真核宿主微生物中最通常使用的。然而，大量的其它属、种和菌株通常是可利用的且在这里是有用的，诸如裂殖酵母；克卢费氏酵母宿主诸如，例如，乳酸克鲁维酵母，脆壁克鲁维酵母(ATCC12,424)，K.bulgaricus(ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC 36,906)，K.thermotolerans，和K.marxianus；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德毕赤氏酵母(EP 183,070)；念珠菌属；里氏木霉(EP 244,234)；粗糙链孢霉；Schwanniomyces诸如许旺酵母；以及丝状真菌诸如，例如，脉孢菌，青霉属，Tolypocladium，以及曲霉宿主诸如构巢曲霉和黑曲霉。
用于表达糖基化的抗-Pro104抗体的合适宿主细胞获自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。很多的杆状病毒菌株和变体以及相应随意的昆虫宿主细胞来自宿主诸如草地夜蛾(毛履虫)，埃及伊蚊(蚊子)，白纹伊蚊(蚊子)，黑腹果蝇(果蝇)，以及家蚕已被鉴定。各种用于感染的病毒株是公众可得到的，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的L-1变体以及家蚕NPV的Bm-5菌株，且此病毒可用作本发明的相关病毒，尤其用于草地夜蛾细胞的感染。
棉花，谷物，土豆，大豆，矮牵牛花，番茄，拟南芥以及烟草的植物细胞培养物也可以用于宿主。植物细胞培养物中用于制备蛋白的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如Hiatt等，Nature(1989)342：76-78，Owen等(1992)Bio/Technology 10：790-794，Artsaenko等(1995)The Plant J 8：745-750，以及Fecker等(1996)PlantMol Biol 32：979-986。
然而，脊椎动物细胞是最优选的，且脊椎动物细胞在培养物(组织培养)中的增殖已成为常用方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是通过SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾脏CV1系；人胚肾系(悬浮培养物中培养亚克隆的293或293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼儿仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝细胞瘤系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化用于抗-Pro104抗体制备的宿主细胞并培养在常规的适于诱导启动子的修饰培养基中，选择转化体，或扩增编码目的序列的基因。
培养宿主细胞
用于产生本发明抗-Pro104抗体的宿主细胞可培养在各种培养基中。市售的培养基诸如Ham′s FIO(Sigma)，最低必需培养基(MEM)(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，以及Dulbecco修饰的Eagle′s培养基(DMEM)(Sigma)适于培养宿主细胞。此外，任一描述在Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，USPat.Nos.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或US Patent Re.30,985中的培养基可用作宿主细胞的培养基。任意的这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素，转铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁，以及磷酸酯)，缓冲液(诸如HEPES)，核苷酸(诸如腺嘌呤核苷以及胸腺嘧啶)，抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)，痕量元素(限定为通常以微摩尔终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或相当的能源。任意其它的必要补充也可以以本领域技术人员公知的合适浓度被包括在内。培养条件，诸如温度，pH等等，是之前选择表达的宿主细胞所使用的，且对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
抗-Pro104抗体的纯化
当利用重组技术时，抗体可在胞内的周质间隙中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体胞内产生，作为第一步骤，例如通过离心或超滤除去微粒碎片，或宿主细胞或溶解的片段。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分离分泌到E.coli周质间隙中的抗体。简而言之，细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA和苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)存在下解冻超过约30min。可通过离心除去细胞碎片。其中抗体分泌到介质中，来自此表达系统的上清液通常首先利用市售的蛋白浓缩过滤器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置进行浓缩。蛋白酶抑制剂诸如PMSF可被包括在任一上述步骤内来抑制蛋白酶解且抗生素可被包括在内来防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗体组合物可利用，例如，羟磷灰石色谱层析，凝胶电泳，透析和亲和层析进行纯化，亲和层析是优选的纯化技术。作为亲和配体的蛋白A的适合性依赖存在于抗体中的任意免疫球蛋白Fc功能域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2，或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。G蛋白被推荐用于所有的小鼠同种型和用于人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体所连接的基质最常常的为琼脂糖，但可利用其它的基质。机械稳定矩阵诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯联乙烯)苯比用琼脂糖可允许更快的流量和更短的处理时间。其中抗体含有CH3功能域，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。其它用于蛋白纯化的技术诸如离子交换柱分馏法，乙醇沉淀法，反相HPLC，硅石色谱层析，肝素SEPHAROSETM色谱层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)色谱层析，层析聚焦，SIDS-PAGE，和硫酸铵沉淀也可依赖待回收的抗体被使用。
任意的初步纯化步骤之后，含有目的抗体和污染物的混合物可利用约pH2.5-4.5的洗脱缓冲液进行低pH疏水作用层析，优选地以低盐浓度进行(例如，从约0-0.25M盐)。
药物制剂
通过混合具有目的纯度的抗体与任选的药用载体，赋形剂或稳定剂制备用于本发明的抗体的药物制剂并储存，以冷冻干燥制剂或水溶液的形式。可接受的载体，赋形剂，或稳定剂在所用的剂量和浓度对受众是无毒的，且包括缓冲液诸如乙酸盐，Tris，磷酸酯，柠檬酸盐，及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六烃季铵；杀藻铵，氯化苄乙氧铵；苯酚，丁基或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸诸如甲基或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇，和mcresol)；低分子量(小于约10残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白，凝胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖，及其它碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂诸如EDTA；tonicifiers诸如海藻糖和氯化钠；糖诸如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂诸如聚山梨酸酯；盐-形式的反离子诸如；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂诸如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。抗体优选地含有5-200mg/ml优选10-100mg/ml浓度的抗体。
在这里制剂也可包含超过一种被处理的特定指示所必需的活性物质，优选地具有彼此无不利影响的互补活性。例如，除内在化抗-Pro104抗体之外，其理想的包括一种制剂，一种其它的抗体，例如结合Pro104上不同表位的第二抗-Pro104抗体，或影响特定癌的发展的其它目的抗体诸如生长因子。任选地，或另外地，组合物可进一步包括化疗剂，细胞毒性剂，细胞因子，生长抑制剂，抗-激素剂，和/或cardioprotectant。这种分子以用于预定目标的有效量适当地存在于组合中。
活性成分可被截留在通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲脂)微胶囊)，胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳-粒子和纳微胶囊)中，或截留在巨乳化液中。此技术公开于Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
可制备持续-释放的制剂。持续-释放制剂的合适的实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，其中基质为产品形状的形式，例如膜，或微胶囊。持续-释放基质的实例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸盐)，或聚(乙烯基醇))，聚交酯(美国专利No.3,773,919)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯组成可注射微球体)，和聚-D-(-)羟丁酸。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这些通过无菌过滤膜过滤很容易实现。
利用抗-Pro104抗体的方法和治疗
根据本发明，通过在细胞表面上结合Pro104内在化的抗-Pro104抗体用于治疗需治疗的患有以Pro104-表达癌细胞为特征的癌的受试者，尤其是，卵巢，胰腺，肺或乳腺癌，诸如卵巢浆液腺癌或乳房渗透导管癌，以及相关的转移。
癌通常包括Pro104-表达细胞，因此抗-Pro104抗体能够在该处结合。尽管癌具有过量表达Pro104分子的特征，本申请进一步提供了用于治疗没有Pro104-过量表达的癌的方法。
本发明也涉及了检测过量表达Pro104的细胞的方法以及用于检测表达Pro104的细胞或检测患者血清中Pro104的诊断试剂盒。方法可包括结合含细胞的试验样品与本发明抗体，测定试验样品的结合于试验样品中细胞的抗体以及比较试验样品中抗体结合的水平与细胞的对照样品中抗体结合的水平。合适的对照为，例如，与试验样品相同类型的正常细胞样品或已知无Pro104过量表达细胞的细胞样品。对照样品高的Pro104结合的水平将作为细胞试验样品包含过量表达Pro104的的指示。任选地，对照可以是已知包含过量表达Pro104的细胞的细胞样品。在这种情况下，试验样品中类似于或超过对照样品的Pro104抗体结合的水平将作为试验样品包含过量表达Pro104的细胞的指示。
可利用各种诊断测定检测Pro104过量表达。例如，可通过免疫组织化学(IHC)测定Pro104的过量表达。来自肿瘤活体解剖的石蜡包埋组织切片可用于IHC测定且符合如下Pro104蛋白染色强度原则。
没有观察到染色或在小于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色计0分。
检测中发现超过10％的肿瘤细胞为微弱的/依稀可辨的膜染色计得分1+。细胞仅仅在它们的膜的一部分被染色。
检测中观察到超过10％的肿瘤细胞为微弱的到中等的完全膜染色计得分2+。
检测中观察到超过10％的肿瘤细胞为中等的到强完全性的膜染色计得分3+。
那些具有0或1+的Pro104表达得分的肿瘤称为没有过量表达Pro104，而具有2+或3+得分的肿瘤称为过量表达Pro104。
任选地，或另外地，可在福尔马林-固定的，石蜡-包埋肿瘤组织上进行FISH测定诸如INFORMTM(Ventana，Arizona出售)或PATHVISIONTM(VySiS，Illinois)来测定肿瘤中Pro104过量表达的程度(如果有)。可利用体内诊断测定评价Pro104过量表达或扩增，例如通过施用结合Pro104且用可检测的标记(例如放射性同位素或荧光标记)标记的分子(诸如本发明的抗体)以及外部扫描患者的标记定位。
怀疑包含表达或过量表达pro104的细胞的样品与本发明的抗体在适于抗体与Pro104特异性结合的条件下结合。本发明Pro104抗体的结合和/或内在化是表达Pro104的细胞的指示。可测定结合的水平并与合适的对照比较，其中与对照相比增加的结合Pro104水平是Pro104过量表达的指示。怀疑包含过量表达Pro104的细胞的样品可以是癌细胞样品，尤其是卵巢癌的样品，例如卵巢浆液腺癌，或乳腺癌，例如，乳房渗透导管癌。也可测定受试者的血清样品的Pro104水平，通过结合受试者的血清样品与本发明Pro104抗体，测定结合于抗体的Pro104水平并与对照水平比较，其中患者与对照相比血清中Pro104水平的增加是患者细胞过量表达Pro104的指示。受试者可患有癌诸如例如，卵巢癌，例如卵巢浆液腺癌，或乳腺癌，例如，乳房渗透导管癌。
目前，取决于癌，卵巢，胰腺，肺或乳腺的癌的阶段，治疗包括一种或下列治疗的组合：外科手术除去癌组织，放疗，雄激素丧失(例如，激素疗法)，以及化疗。抗-Pro104抗体疗法对不耐受毒性以及化疗副作用较好的老年患者以及在其中放疗具有有限用途的转移疾病，以及用于对雄激素丧失治疗有耐性的前列腺癌的控制中是尤其理想的。本发明的靶向肿瘤以及内在化抗-Pro104抗体可用于在疾病的最初诊断时或复发期间减轻表达Pro104的癌，例如，卵巢，胰腺，肺或乳腺癌。为应用治疗，可使用单独的抗-Pro104，或与例如激素、抗血管再生或放射性标记的化合物，或与外科手术、冷冻疗法和/或放射线疗法联合治疗，特别是用于卵巢，胰腺，肺或乳腺癌，也尤其是当其中脱落的细胞不能到达时。抗-Pro104抗体治疗可与其它形式的常规疗法结合施用，连续地和，在常规的疗法之前或之后，化疗的药物诸如Taxotere(docetaxel)，紫杉酚(paclitaxel)，雌氮芥和米托蒽醌用于治疗转移性的和耐激素的卵巢，胰腺，肺或乳腺癌，尤其是，用于处于非常危险的病人中。在本发明治疗或缓和癌的方法中，尤其是，雄激素无关的和/或转移性的卵巢，胰腺，肺或乳腺癌，癌患者可被施用抗-Pro104抗体以及与一或多种前述的化疗剂结合施用。尤其是，可考虑采用与palictaxel和修饰的衍生物联合治疗(参见，例如，EP0600517)。抗-Pro104抗体与治疗有效量的化疗剂一起施用。抗-Pro104抗体也可和化疗一起施用来增强化疗剂的活性和效力，例如，paclitaxel。Physicians′Desk Reference(PDR)公开了这些药物已用于治疗各种癌的剂量。这些上述化疗药物治疗有效的配量方式和剂量取决于所治疗的特定的癌，疾病的程度及医生熟知且可确定的其它因素。
尤其地，含有与细胞毒性剂结合的抗-Pro104抗体的免疫结合物可施用于患者。优选地，结合于Pro104蛋白的免疫结合物被细胞内在化，导致免疫结合物杀伤与其结合的癌细胞的治疗效力的增加。优选地，细胞毒性药物靶向或与癌细胞中的核酸冲突。此种细胞毒性剂的实例如上所述且包括美登素，美登素类化合物，皂草素，gelonin，篦麻毒素，卡奇霉素，核糖酶和DNA内切酶。
按照已知的方法将抗-Pro104抗体或免疫结合物施用于人患者，诸如静脉内施用，例如，作为丸剂或在一段时间内连续输注，通过肌内注射，腹膜内，脑脊髓内，皮下注射，关节内，滑膜内，鞘内，口服，局部的，或吸入途径。抗体或免疫结合物可直接注射到肿瘤块中。静脉内或皮下注射施用抗体是优选的。其它的治疗方式可与施用抗-Pro104抗体相结合。
结合的施用包括共-施用，利用分离的制剂或单一的药物制剂，顺序连续的施用，其中优选地在同一时间内两种(或者所有的)活性剂同时发挥它们的生物学活性。优选地这种结合疗法产生协同的治疗作用。
理想地施用抗-Pro104抗体或抗体，与直接抗与特定癌有关的其它肿瘤抗原抗体的施用相结合。因而，本发明也提供了含有一或多个本发明的抗体和至少一种其它结合与Pro104表达肿瘤细胞有关的肿瘤抗原的抗体的“混合物”。混合物也可包括靶向Pro104的其它表位的抗体。优选地，其它抗体与本发明抗体的结合和或内在化不冲突。
本发明的抗体治疗方法可包括抗-Pro104抗体(或抗体)和一或多种化疗药物的联合施用，包括不同化疗药物混合物的共-施用。化疗药物包括，例如，雌氮芥磷酸酯，松龙苯芥，顺氯氨铂，5-氟尿嘧啶，苯丙氨酸氮芥，环磷酰胺，羟基脲和hydroxyureataxanes(诸如太平洋紫杉醇和doxetaxel)和/或蒽环类抗生素。此种化疗药物的制备和配制程序可使用生产商的教导技术人员凭经验确定的。此种化疗的制剂和配制程序也描述在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams &Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
抗体可与抗-激素化合物相结合；例如，抗-雌激素化合物诸如三苯氧胺；抗-黄体酮诸如欧那司酮(onapristone)(参见，EP 616 812)；或抗-雄激素诸如氟他胺，以这种分子的已知剂量。当待治疗的癌是雄激素无关的癌时，患者可能以前已进行抗-雄激素治疗且，癌变成雄激素无关的之后，可将抗-Pro104抗体(和在这里描述的其它任选的药物)施用于患者。
有时，将cardioprotectant(来预防或降低与治疗有关的心肌功能紊乱)或一或多种细胞因子共-施用于患者是有益的。除上述的治疗方式外，患者可在抗体治疗之前，同时，或之后进行外科手术去除癌细胞和/或进行放疗。任一上述共-施用药物的合适剂量为目前使用的且可取决于药物和抗-Pro104抗体的联合作用(协同作用)来降低。
为预防或治疗疾病，医生将根据已知的原则选择施用的剂量和模式。抗体的合适剂量取决于待治疗疾病的类型，如上面定义规定，疾病的严重性和进程，施用抗体是用于预防还是治疗的目的，先前的治疗方法，患者的病史以及对抗体的应答，以及主治医师的判断。抗体被适当地一次或经过一系列治疗施用于患者。优选地，抗体通过静脉内输注或通过皮下注射施用。取决于疾病的类型和严重性，施用于患者的最初候选物剂量可以是约1pg/kg至约50mg/kg体重的抗体(例如约0.1-15mg/kg/剂量)，无论通过一或多次单独施用或通过连续输注。配量方式可包括施用约4mg/kg的最初负载剂量，然后一周一次约2mg/kg的抗-Pro104抗体的维持剂量。然而，可使用其它的给药方案。典型的日剂量从约1pg/kg到100mg/kg或更多，取决于上述的因素。取决于病症，在几天或更长时间内重复给药，持续治疗直至病征出现目的抑制。可通过常规方法容易地监控此治疗的进展并基于医生或其它本领域技术人员已知的原则进行测定。
除了将抗体蛋白质施用于患者外，本申请考虑通过基因治疗施用抗体。施用编码抗体的核酸分子包括表达“施用治疗有效量的抗体”。参见，例如，1996年3月14日公开的WO96/07321涉及利用基因治疗来产生胞内抗体。
有两种主要的将核酸分子(任选地包含在载体中)导入到患者的细胞中的方法，体内和离体。为体内递送，将核酸分子直接注射到患者中，通常在需要抗体的位点。为进行离体治疗，切除患者的细胞，将核酸分子导入到这些分离的细胞中并且将修饰的细胞直接或例如密封在植入多孔膜内施用于患者(参见，例如美国专利Nos.4,892,538和5,283,187)。有各种可用于将核酸分子导入活细胞中的技术。技术可取决于核酸是转移到体外培养细胞中，还是体内转移到目的宿主的细胞中进行变化。适于将核酸体外转移到哺乳动物细胞中的技术包括利用脂质体，电穿孔，显微注射，细胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸钙沉淀方法等等。通常使用的离体递送基因的载体为逆转录病毒载体。
目前优选的体内核酸分子转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒，单纯性疱疹I病毒，或腺病毒-相关病毒)以及基于脂类的系统(用于脂类-介导转移基因的有用的脂类为DOTMA，DOPE和DC-Chol，例如)感染。综述目前已知的基因标记和基因治疗方案，参见Anderson等，Science 256：808-813(1992)。也参见WO 93/25673以及在其中引用的参考文献。
产品和试剂盒
本发明也涉及包含可用于检测Pro104过量表达细胞和/或治疗表达Pro104的癌尤其是乳房，卵巢，胰腺和肺癌的物质的产品。产品包括容器和含有本发明抗体的组合物。组合物可进一步包括载体。产品也可包括在容器上的标签或与容器相关的包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶，小瓶，注射器等等。容器可由各种物质诸如玻璃或塑料制成。容器容纳有效用于检测表达Pro104的细胞和/或治疗癌症的组合物和可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的塞子)。组合物中至少一种活性剂为本发明的抗-Pro104抗体。标记或包装说明书表明组合物用于检测表达Pro104的细胞和/或用于治疗所需治疗患者的乳房，卵巢，胰腺和肺癌，或更具体地为卵巢浆液腺癌，乳房渗透导管癌，前列腺癌，肾细胞癌，结肠直肠腺癌，肺腺癌，肺鳞状细胞性癌，和胸膜间皮瘤。乳腺癌可以是HER-2阴性的或阳性的乳腺癌。癌包括任一前述的转移性癌，例如，乳房，卵巢胰腺和肺癌转移。标记或包装说明书可进一步包括施用抗体组合物至癌患者的教导。另外，产品可进一步包括包括检测本发明抗体的第二容器，例如，结合于本发明抗体的第二抗体。物质可以用诸如在这里公开的可检测的标记进行标记。第二容器可包含例如，药用缓冲液，诸如抑菌的注射用水(BWFI)，磷酸缓冲盐水，生理盐水和右旋糖溶液。产品可进一步包括来自商用和用户立场的其它物质，包括其它的缓冲液，稀释剂，过滤器，针，和注射器。
本发明也提供了用于各种目的的试剂盒，例如，用于杀伤Pro104细胞的测定，用于由细胞纯化或免疫沉淀Pro104或用于检测血清样品中Pro104的存在或检测细胞样品中Pro104-表达细胞的存在。对于Pro104的分离和纯化而言，试剂盒可含有与固相支持体例如组织培养微孔板或磁珠(例如，琼脂糖磁珠)相结合的抗-Pro104抗体。可提供含有用于例如在ELISA或Western印迹中体外检测和定量测定Pro104的抗体的试剂盒。作为生产的产品，试剂盒包含容器以及含有本发明抗体的组合物。此外试剂盒可包含标签或与容器相关的包装说明书。试剂盒可包含其它的组分，例如，稀释剂和缓冲液，以及结合于本发明抗体的物质，例如包括诸如在这里公开的标记例如放射性同位素、荧光标记或酶的第二抗体，或者试剂盒也可包含对照抗体。其它的组分可置于试剂盒中的单独的容器内。标签或包装说明书可提供对组合物的描述以及对预定的体外或者诊断应用的说明。
实施例
实施例1：产生单克隆抗体的杂交瘤的制备和分离
本发明的下列MAb/杂交瘤描述如下：
Pro104.C1，Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C17，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C24，Pro104.C25，Pro104.C27，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C46，Pro104.C48，Pro104.C49，Pro104.C50，Pro104.C53，Pro104.C54，Pro104.C55，Pro104.C57，Pro104.C60，Pro104.C66，Pro104.C75，Pro104.C84，Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102，Pro104.D106，，Pro104.D111，Pro104.D112，Pro104.D113，Pro104.D114，Pro104.D115，Pro104.D116，Pro104.D117，Pro104.D118，Pro104.D119，Pro104.D120，Pro104.D121，Pro104.D122，Pro104.D123，Pro104.D，Pro104.D124，Pro104.D125，Pro104.D126，Pro104.D127，Pro104.D，Pro104.D128，Pro104.D129，Pro104.D130，Pro104.D131，Pro104.D132，Pro104.D133，Pro104.D134，Pro104.D135，Pro104.D136，Pro104.D137，Pro104.D138，Pro104.D139，Pro104.K14，Pro104.K15，Pro104.K16，Pro104.K47，Pro104.K71，Pro104.K72，Pro104.K74，Pro104.K75，Pro104.K76，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K87，Pro104.K88，Pro104.K89，Pro104.K155，Pro104.K156，Pro104.K157，Pro104.K158，Pro104.K159，Pro104.K160，Pro104.K163，Pro 104.K164，Pro104.K176，Pro104.K217，Pro104.K226，Pro104.K227，Pro104.K240，Pro104.K274，Pro104.K264，Pro104.K281，Pro104.K358或Pro104.K362。
如果MAb已克隆，其将被命名为“X.1，”例如，A7的第一个克隆称为A7.1，A7的第二个克隆称为A7.2，等等。对于本发明目的而言，A7将包括所有的克隆，例如，A7.1，A7.2等等。
免疫原和抗原(重组蛋白，HA & His标记&转染的细胞)
Pro104(Testisin)全长，片段大肠杆菌表达的序列&蛋白质制备
为免疫小鼠和制备C系列的Mabs，将编码Pro104的Lys20到Trp297区域的Pro104构建体通过限制性酶位点导入到标准的E.coli表达载体中。将构建体克隆在六个-组氨酸标记的C-末端的框内使得Pro104构建体被表达为288个氨基酸的6-组氨酸标记的蛋白。重组质粒用于转化感受态E.coli细胞并在振荡摇瓶中进行Pro104表达。用IPTG诱导后收集的细菌糊状物通过Ni-NTA柱层析用于纯化Pro104。
Pro104(Lys20(加下划线)-Trp297)表达的氨基酸序列(黑体表示6组氨酸标记)(SEQ ID NO.1)
MAKPESQEAAPLSGPCGRRVITSRIVGGEDAELGRWPWQGSLRLWDSHVCGVSLLSHRWALTAAHCFETYSDLSDPSGWMVQFGQLTSMPSFWSLQAYYTRYFVSNIYLSPRYLGNSPYDIALVKLSAPVTYTKHIQPICLQASTFEFENRTDCWVTGWGYIKEDEALPSPHTLQEVQVAIINNSMCNHLFLKYSFRKDIFGDMVCAGNAQGGKDACFGDSGGPLACNKNGLWYQIGVVSWGVGCGRPNRPGVYTNISHHFEWIQKLMAQSGMSQPDPSWLEHHHHHH
Pro104(Testisin)昆虫细胞表达的序列&蛋白质制备
为免疫小鼠以及制备D系列MAbs，利用标准技术克隆和表达编码蜜蜂产蜜分泌信号、Pro104的Ile42到Trp297区域以及6组氨酸标记的Pro104构建体。利用Ni-NTA树脂纯化Pro104。
Pro104(Ile42-Trp297)表达的氨基酸序列(加下划线部分表示蜜蜂产蜜分泌信号并黑体字表示6组氨酸标记)(SEQ ID NO.2)
MKFLVNVALVFMVVYISYIYADPMAIVGGEDAELGRWPWQGSLRLWDSHVCGVSLLSHRWALTAAHCFETYSDLSDPSGWMVQFGQLTSMPSFWSLQAYYTRYFVSNIYLSPRYLGNSPYDIALVKLSAPVTYTKHIQPICLQASTFEFENRTDCWVTGWGYIKEDEALPSPHTLQEVQVAIINNSMCNHLFLKYSFRKDIFGDMVCAGNAQGGKDACFGDSGGPLACNKNGLWYQIGVVSWGVGCGRPNRPGVYTNISHHFEWIQKLMAQSGMSQPDPSWHHHHHH
Pro104(Testisin)293T & LMTK细胞表达的序列&蛋白质制备
为筛选C和D系列两种Pro104 MAbs，利用标准哺乳动物表达方法表达具有和不具有位于重组位点(斜体)下游的C-末端的HA标记(粗体)和间隔基(加下划线)的全长Pro104蛋白(Met1-Val314)。
Pro104转染的人293T和小鼠LMTK细胞氨基酸序列(SEQ ID NO.3)
MGARGALLLALLLARAGLRKPESQEAAPLSGPCGRRVITSRIVGGEDAELGRWPWQGSLRLWDSHVCGVSLLSHRWALTAAHCFETYSDLSDPSGWMVQFGQLTSMPSFWSLQAYYTRYFVSNIYLSPRYLGNSPYDIALVKLSAPVTYTKHIQPICLQASTFEFENRTDCWVTGWGYIKEDEALPSPHTLQEVQVAIINNSMCNHLFLKYSFRKDIFGDMVCAGNAQGGKDACFGDSGGPLACNKNGLWYQIGVVSWGVGCGRPNRPGVYTNISHHFEWIQKLMAQSGMSQPDPSWPLLFFPLLWALPLLGPVDPAFLYKVVR SRMASYPYDVPDYASL
Pro104(Testisin)CHO细胞表达的序列&蛋白质制备
为免疫小鼠和制备K系列Pro104 MAbs，利用标准哺乳动物表达方法表达没有标记的全长Pro104蛋白(Met1-Val314)。
利用标准重组技术用四环素受体(TR)稳定地转染仓鼠CHO细胞。在Pro104转染之前，将CHO-TR细胞培养在具有10％胎牛血清(FBS)的HAM F12培养基中。将编码全长Pro104蛋白(Met1-Val314)的载体转染到CHO细胞中。在具有10％FBS的HAM F12培养基中用300ug/ml的潮霉素B持续15天时间来选择稳定的转染子。用1ug/ml四环素刺激16-20小时后利用diaDexus Pro104.C25.1单克隆抗体通过Western印迹检验潮霉素B-抗性细胞对Pro104的表达。细胞在具有10％DMSO的FBS中扩大、增殖和冷冻保存以及-196℃液氮保存来确保维持活性克隆培养。
pro104转染的仓鼠CHO细胞氨基酸序列(SEQ ID NO.4)
MGARGALLLALLLARAGLRKPESQEAAPLSGPCGRRVITSRIVGGEDAELGRWPWQGSLRLWDSHVCGVSLLSHRWALTAAHCFETYSDLSDPSGWMVQFGQLTSMPSFWSLQAYYTRYFVSNIYLSPRYLGNSPYDIALVKLSAPVTYTKHIQPICLQASTFEFENRTDCWVTGWGYIKEDEALPSPHTLQEVQVAIINNSMCNHLFLKYSFRKDIFGDMVCAGNAQGGKDACFGDSGGPLACNKNGLWYQIGVVSWGVGCGRPNRPGVYTNISHHFEWIQKLMAQSGMSQPDPSWPLLFFPLLWALPLLGPV
Ovr115丝氨酸蛋白酶功能域序列&蛋白质制备
Ovr115(TMPRSS4)用于筛选交叉活性的杂交瘤克隆，因为此抗原也在卵巢和胰腺癌中上调并且因为其也含有潜在交叉反应的丝氨酸蛋白酶功能域。
利用标准技术将编码烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)识别位点和由Val203到Leu435的Ovr115的丝氨酸蛋白酶功能域的Ovr115构建体框内克隆到谷胱甘肤S-转移酶(GST)的C-末端，使得Ovr115构建体被表达为486个氨基酸的GST-融合蛋白。通过谷胱甘肽琼脂糖柱纯化Ovr115。
Ovr115丝氨酸蛋白酶功能域构建体的氨基酸序列(GST序列加下划线，TEV序列为斜体且标记序列用黑体表示)(SEQ ID NO.5)
MAPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWR NKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKER AEISMLEGAVLDIRVGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDR LCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFK KRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLVPRHNQ TSLYKKAGFENLYFQGVVGGEEASVDSWPWQVSIQYDKQHVCGGSILDPHWVLTAAHCFRKHTDVFNWKVRAGSDKLGSFPSLAVAKUIIEFNPMYPKDNDIALMKLQFPLTFSGTVRPICLPFFDEELTPATPLWIIGWGFTKQNGGKMSDILLQASVQVIDSTRCNADDAYQGEVTEKMMCAGIPEGGVDTCQGDSGGPLMYQSDQWHVVGIVSWGYGCGGPSTPGVYTKVSAYLNWIYNVWKAELSNWSHPQFEK
Ovr115胞外的片段序列&蛋白质制备
克隆编码Ovr115的仅仅构成分子的预计的胞外部分的Lys52到Leu435区域的Ovr115(TMPRSS4)构建体，使其在密码子Leu435的邻接下游具有6-组氨酸标记。利用Ni-NTA树脂纯化Ovr115。
Ovr115胞外的构建体(Ovr115 Lys52(加下划线)-Leu435)的氨基酸序列(6组氨酸标记序列用黑体表示)(SEQ ID NO.6)
M KVILDKYYFLCGQPLHFIPRKQLCDGELDCPLGEDEEHCVKSFPEGPAVAVRLSKDRSTLQVLDSATGNWFSACFDNFTEALAETACRQMGYSSKPTFRAVEIGPDQDLDVVEITENSQELRMRNSSGPCLSGSLVSLHCLACGKSLKTPRVVGGEEASVDSWPWQVSIQYDKQHVCGGSILDPHWVLTAAHCFRKHTDVFNWKVRAGSDKLGSFPSLAVAKIIIIEFNPMYPKDNDIALMKLQFPLTFSGTVRPICLPFFDEELTPATPLWIIGWGFTKQNGGKMSDILLQASVQVIDSTRCNADDAYQGEVTEKMMCAGIPEGGVDTCQGDSGGPLMYQSDQWHVVGIVSWGYGCGGPSTPGVYTKVSAYLNWIYNVWKAELHHHHHH
稳定的Ovr115 LMTK小鼠细胞系的产生
在克隆到具有HA标记的哺乳动物表达载体中之后，全长HA-标记的Ovr115(Met1-Leu435)(加下划线)被转染到小鼠LMTK细胞中。培养一周后，通过Western印迹利用抗-HA抗体(Covance，Richmond，CA)检验个体克隆的Ovr115的表达。
Ovr115转染的LMTK氨基酸序列(SEQ ID NO.7)
MDPDSDQPLNSLDVKPLRKPRIPMETFRKVGIPIIIALLSLASIIIVVVLIKVILDKYYFLCGQPLHFIPRKQLCDGELDCPLGEDEEHCVKSFPEGPAVAVRLSKDRSTLQVLDSATGNWFSACFDNFTEALAETACRQMGYSSKPTFRAVEIGPDQDLDVVEITENSQELRMRNSSGPCLSGSLVSLHCLACGKSLKTPRVVGGEEASVDSWPWQVSIQYDKQHVCGGSILDPHWVLTAAHCFRKHTDVFNWKVRAGSDKLGSFPSLAVAKIIIIEFNPMYPKDNDIALMKLQFPLTFSGTVRPICLPFFDEELTPATPLWIIGWGFTKQNGGKMSDILLQASVQVIDSTRCNADDAYQGEVTEKMMCAGIPEGGVDTCQGDSGGPLMYQSDQWHVVGIVSWGYGCGGPSTPGVYTKVSAYLNWIYNVWKAE LDPAFLYKVVRSRMASYPYDVPDYASL
免疫
为产生C系列MAbs，用表达Pro104重组蛋白的可溶E coli免疫小鼠，所述Pro104重组蛋白编码全长蛋白的Pro104的Lys20到Trp297的区域。在个后部脚垫皮层内免疫8BALB/c小鼠的组。所有注射为每只脚25uL。首次注射(第1天)10ug抗原/小鼠的抗原为在与Titermax金佐剂(Sigma，Saint Louis，MS)等体积混合的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。随后在第5，9，12，16，19，23，26，29，30天用10ug的抗原对每小鼠进行注射且包括在20uL DPBS加上5uL Adju-光佐剂(Accurate Chemical & Scientific Corp.，Westbury，NY)每小鼠的抗原。在第33天进行的最后加强注射包括在单独DPBS中稀释的抗原。在第37天发生融合。
为产生D系列MAbs，用表达Pro104重组蛋白的可溶昆虫细胞如上免疫小鼠，所述Pro104重组蛋白其相当于全长蛋白的Ile42到Trp297区域。
为制备K系列MAbs，用在细胞表面上表达Pro104的稳定转染的CHO细胞系免疫小鼠。Pro104的细胞表面表达的范围从13.3到97.0％。在开始的两次注射中，用1.25×106细胞/小鼠免疫小鼠，在3-9次注射中，用3.75×106细胞/小鼠注射小鼠。对小鼠进行2.5×106细胞的最终注射。在免疫系列的自始至终使用无佐剂的全部细胞的HBSS(Hanks平衡盐溶液)溶液。K系列免疫时间表与上述C和D系列所用的相同。
杂交瘤融合
在免疫程序结束时处死小鼠并通过无菌解剖收集引流淋巴节(draining lymph node)(腿弯部的)的组织。利用Tenbroeck组织研磨器(Wheaton #_357426，VWR，Brisbane，CA)切碎淋巴结细胞，然后通过无菌40uM筛(VWR)压至DMEM中并通过抗-CD90(Thy1.2)包被的磁珠(Miltenyl Biotech，Baraisch Gladbach，德国)除去T-细胞。
然后通过电细胞融合(BTX，San Diego，CA)用连续的骨髓瘤细胞系P3×63Ag8.653对这些初级的富含B细胞的淋巴结细胞进行灭菌(Kearney，J.F.等，J.Immunology 123：1548-1550，1979)。通过在标准的含有次黄嘌呤，重氮丝氨酸(HA)(Sigma，St.Louis，MO)的选择培养基(DMEM/15％FBS/0.5ng/mL rIL-6(Sigma，Saint Louis，MS)/10％P388D1(ATCC，Manassas，VA)条件培养基)中筛选成功融合的细胞。立即将这些融合培养物以二百万细胞/微孔板分配到96孔培养微孔板的微孔中(Costar Cat.# 3585，VWR)。融合后立即在96孔培养平板中分配培养物，有助于筛选大量不同的产生单一的、特异性抗体的杂交瘤克隆。通过ELISA筛选来自微孔的上清液，检测其抗Pro104 E.coli表达蛋白，Pro104昆虫表达蛋白的活性，以及与丝氨酸蛋白酶Ovr115胞外功能域(昆虫表达的)没有交叉-反应性。
通过有限稀释(Coller，H和Coller，B.Hybridoma 2：91-6，1983)，或将单一活细胞细胞分选到两个96孔微孔板(VWR)的微孔中，利用流式细胞术(Coulter Elite，Beckman Coulter，Miami，FL)，在上述筛选程序后建立含有来自单一细胞的遗传均一子代的单克隆培养物。利用标准组织培养技术扩大培养产生的鼠科B-细胞杂交瘤培养物。筛选的杂交瘤在具有10％DMSO的胎牛血清(FBS)中冷冻保存并在-196℃液氮保存来确保维持活性克隆培养物。
产生抗体的杂交瘤的筛选&选择
通过酶联免疫吸附(ELISA)选择产生Pro104特异性抗体的杂交瘤细胞系。Pro104或Ovr115蛋白被非特异性吸附到96孔聚苯乙烯EIA微孔板(VWR)的微孔中。将100uL体积的约1ug/mL的Pro104或Ovr115蛋白的(DPBS)溶液在96孔聚苯乙烯EIA微孔板的微孔中4℃温育过夜。用Tris缓冲液与0.05％吐温20，pH 7.4(TBST)冲洗微孔板两次。然后倒空微孔板微孔并且通过用TBST/0.5％牛血清蛋白(TBST/BSA)完全填满测定微孔并且在室温(RT)下温育30分钟来阻断非特异性结合量。然后倒空微孔板微孔，100uL的用TBST/BSA 1∶1稀释的杂交瘤样品添加于微孔并且在RT温育1小时。然后用(TBST)冲洗微孔3次。然后，将100uL的在TBST/BSA中1∶5000稀释的碱性磷酸酶结合的的山羊抗-小鼠IgG(Fc)(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)添加至各孔中并在RT温育1小时。然后用TBST冲洗微孔3次。然后将100uL的1mg/mL浓度的碱性磷酸酶底物对硝基苯磷酸盐(pNPP)(Sigma，Saint Louis，MS)的1M二乙醇胺缓冲液pH 8.9(Pierce，Rockford，IL)溶液添加至各微孔并在RT温育20分钟。通过添加50uL的2NNaOH/孔终止显色。通过可见的黄色颜色的显色显示结合碱性磷酸酶活性。通过测定405nm波长处溶液的吸光度定量测定酶促反应。选择产生最高吸光度值的培养物用于扩大培养和进一步的评价。将由最初的96孔微孔板选择的ELISA阳性培养物转入新的96孔组织培养微孔板(VWR)中。
Pro104 MAbs的ELISA筛洗
重复测定杂交瘤以证实Pro104特异性MAbs的持续产生。如上所述，将具有产生大于1.0Pro104和小于0.2Ovr115的ELISA吸光度值的上清液的杂交瘤培养物在组织培养基中扩大培养和冷冻保存。通过有限稀释或单细胞分选(Coulter Elite)亚克隆选择的Pro104特异性培养物来确保获得遗传稳定和均一的子代。
ELISA筛洗克隆的Pro104 MAbs的结果
来自用E coli表达的Pro104首次免疫的克隆Pro104.C13，Pro104.C18，Pro104.C25和Pro104.C55通过用E coli表达的Pro104，昆虫表达的Pro104，人293T细胞表达的有和没有HA标记(下表1)的Pro104进行ELISA为阳性，并且不与其它的人丝氨酸蛋白酶，胰腺胰蛋白酶，肺类胰蛋白酶和激肽释放酶(Cal Biochem，San Diego，CA)反应，也不与纤溶酶或尿激酶(American Diagnostics，Greenwich，CT)反应。Pro104.C13，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C25和Pro104.C55被亚克隆和扩大培养用于通过Western印迹，免疫组织化学和免疫荧光法的进一步鉴定。MAbs Pro104.C37和Pro104.C48与人尿激酶交叉-反应并且不进一步通过免疫组织化学或免疫荧光法进行评价。
来自用昆虫表达的Pro104免疫的克隆Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D64，Pro104.D81，Pro104.D88，Pro104.D91和Pro104.D94，通过用E coli表达的Pro104，昆虫表达的Pro104，人293T细胞表达的有和没有HA标记的Pro104进行ELISA为阳性的并且不与其它的人丝氨酸蛋白酶，胰腺胰蛋白酶，肺类胰蛋白酶，激肽释放酶，纤溶酶以及尿激酶反应，参见下表2。克隆Pro104.D12，Pro104.D15，Pro104.D55，Pro104.D62，Pro104.D68和Pro104.D106通过用E.coli表达的Pro104，昆虫表达的Pro104进行的ELISA为阳性的并且与人293T细胞表达的Pro104(数据未显示)更微弱地反应(ELISA OD 405nm为0.3-0.8)，但是不与胰蛋白酶，肺类胰蛋白酶和激肽释放酶，纤溶酶或尿激酶反应(表2)。Pro104.D20和Pro104.D21仅仅与哺乳动物(293T)Pro104蛋白呈阳性。Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102和Pro104.D106被亚克隆并扩大培养用于通过Western印迹，免疫组织化学和免疫荧光法进一步进行鉴定。未进一步通过免疫组织化学或免疫荧光法评价与其它的人丝氨酸蛋白酶交叉-反应的Pro104MAbs(Pro104.D29 & Pro104.D31)。
筛选细胞表面结合的Pro104C-系列MAbs的FACS
将CAOV3(Pro104的RT-PCR阳性)和SKOV3(Pro104的RT-PCR阴性)卵巢癌细胞系(ATCC)培养在DMEM/10％FBS中。在染色之前，用10ml无Ca+2/Mg+2的DPBS冲洗细胞一次然后每150cm2的摇瓶添加7ml温热(37℃)Cellstripper(Mediatech，Herndon，VA)。然后在37℃温育细胞5分钟，由摇瓶导出液体来除去紧紧贴壁的细胞。取出细胞并吸取几次来打破聚集，然后立即置入DMEM/10％FBS中。然后以1300rpm离心细胞5分钟并再悬浮在DMEM/10％FBS中。然后37℃温育细胞30分钟。回收期间。染色之前，利用Guava Viacount(Guava细胞计数器，Hayward，CA)测定细胞的活力并且如果＞90％是有活力的，将它们分配到96-孔V-形底微孔板(VWR)上用MAbs进行染色。将细胞以0.5-1.0×106细胞/孔等分在96-孔V-形底微孔板中并且以1500rpm离心2分钟。吸出上清液并且在涡流搅拌器上简短地振荡微孔板来再悬浮细胞，然后将200ul体积的DPBS/3％FBS/0.01％叠氮化钠(FACS缓冲液)添加到各孔中。重复离心和吸出，然后将25uL体积的杂交瘤上清液或纯化的MAb添加给细胞。涡旋微孔板再悬浮细胞，在冰上储存15分钟，然后在200uL的FACS缓冲液中冲洗并如上所述进行离心。重复此冲洗过程两次然后将25uL体积的藻红蛋白(PE)结合的驴抗-小鼠IgG Fc抗体(Jackson Immunoresearch LaboratoriesInc.，West Grove，PA)添加给细胞。在冰上15分钟后如上所述冲洗细胞两次，然后再悬浮在250uL的FACS缓冲液中用于通过细胞分选仪或流式细胞仪进行分析。在某些情况下，在分析之前4℃储存过夜，将133ul体积的FACS缓冲液和67uL的1％仲甲醛/DPBS添加于微孔，用于固定，然后用DPBS将体积增至250uL。在Elite激发荧光细胞分离器(FACS)(Beckman-Coulter，Miami，FL)上分析染色的细胞。
通过免疫荧光FACS和显微分析证明几个C系列MAbs的细胞表面结合的结果概括在表1中。人肿瘤细胞系的进一步免疫荧光显微数据显示如下。利用市售的小鼠单克隆抗体同种型免疫分析测定试剂盒(IsoStrip，Roche Diagnostic Corp.，Indianapolis，IN)测定C系列MAbs的同种型。同种型的结果列于表1中。
表1：Pro104C系列MAbs的同种型，ELISA，免疫荧光FACS &显微镜检查结果
Pro104MAb克隆 同种型                            直接ELISA         FACS   显微镜检查
  纯化的E.coli表达的全长Pro104   纯化的昆虫表达的Pro104   昆虫Pro104粗溶解产物   FLPro104293T溶解产物 Pro104-HA 293T溶解产物 CaOv-3(RT-PCR+) SkOv-3(RT-PCR-)   与HA共定位于Pro104-HA转染的293T细胞上
  C4   IgG1 k   +   +   +   +   +   -   -   4*
  C13   IgG1 k   +   +   -   +   +   +   -   3
  C18   IgG1 k   +   +   +   +   +   -   -   3
  C19   IgG1 k   +   +   +   -   -   -   -   4
  C25   IgG1 k   +   +   +   +   +   +   +   3
  C34   IgG1 k   +   +   +   -   -   -   -   4
  C37   IgG1 k   +   +   +   +   +   +   3
  C46   IgG2b k   +   +   -   -   -   -   -   2
  C48   IgG1 k   +   +   -   +   +   +   -   3
  C50   IgG2b k   +   +   -   -   -   -   -   3
  C53   IgG2b k   +   +   -   -   -   -   -   3
  C54   IgG2b k   +   +   +   -   -   -   -   4
  C55   IgG1 k   +   +   +   +   -   -   -   4
  C57   IgG2b k   +   +   -   -   -   +   -   2
  C60   IgG1 k   +   +   +   -   -   +   -   4
  C66   IgG1 k   +   +   -   -   -   -   -   1
  C84   IgG1 k   +   -   +   +   +   -   -   1
  C1   IgG2b k   +   -   -   -   -   +   +   2
  C17   IgG2b k   +   -   -   -   -   +   +   2
  C24   IgG2a k   +   -   -   -   -   +   -   2
  C27   IgG3 k   +   -   -   -   -   +   -   3
  C49   IgG2a k   +   +   -   -   -   +   -   2
  C75   IgG3 k   +   +   -   -   -   +   -   3
*4＝HA强烈共定位且没有非-转染的293T细胞的背景染色，3＝与HA强烈共定位且具有非-转染的293T细胞的背景染色，2＝与HA部分共定位且具有非-转染的293T细胞的背景染色，1＝微弱的HA染色(可能被试验MAb阻断)且具有非-转染293T细胞的高度背景染色。
表2：Pro104D系列MAbs的ELISA筛选的结果
  Pro104MAb克隆 Pro104(昆虫) Pro104(E-coli) Ovr115LMTK 尿激酶 纤溶酶 类胰蛋白酶 激肽释放酶 胰蛋白酶   Pro104293T溶解产物
  D4   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D6   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D9   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D12   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D14   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D15   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D18   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D19   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D20   -   -   -   -   -   -   -   -   +
  D21   -   -   -   -   -   -   -   -   +
  D26   +   +   -   +
  D29   +   -   -   -   +   -   -   -   +
  D31   +   +   -   -   +   -   -   -   +
  D43   +   +   -   +
  D47   +   +   -   +
  D51   +   +   -   +
  D55   +   -   -   -   -   -   -   -   +
  D56   +   +   -   +
  D58   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D62   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D63   +   +   -   +
  D64   +   +   -   +
  D68   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D69   +   +   -   +
  D75   -   -   -   +
  D81   +   +   -   +
  D85   +   +   -   +
  D88   +   +   -   -   -   -   -   -   +
  D91   +   +   -   +
  D94   +   +   -   +
  D102   +   +   -   +
  D106   +   +   -   -   -   -   -   -   +
筛选细胞表面结合的Pro104D-系列和K-系列MAbs的FACS
通过在Opti-MEM I降低的血清培养基中稀释50μg的质粒DNA至总体积1.5ml然后轻轻地混合制备的脂类-DNA复合物转染五千万的293F细胞。在Opti-MEM中稀释75μl的293Fectin(Invitrogen)至总体积1.5ml，轻轻地混合并在室温下温育5分钟。温育5分钟后，稀释的DNA与稀释的293fectin混合。这些混合物在室温下温育20-30分钟来允许形成DNA-293fectin复合物。当温育DNA-293fectin复合物时，将50ml等分的细胞悬液(1E6活细胞/ml)置入无菌的一次性摇瓶中。DNA-293fectin复合物温育完成后，将它们转入各摇瓶的细胞中。在37℃恒温箱中以120rpm振荡温育摇瓶。在转染后约48小时将细胞用于染色实验。
用于转染293F细胞的DNA序列为全长Pro104序列(met1至val314)，没有标记，参见上述的SEQ ID NO：3。
染色之前，利用Guava Viacount(Guava Technologies，Hayward，CA)测定293F和对照细胞的活力并且如果＞90％是有活力的，将它们分配到96-孔V-形底微孔板(VWR)上用MAbs进行染色。
将细胞以0.5-1.0×106细胞/孔等分在96-孔V-形底微孔板中并且以1500rpm离心2分钟。吸出上清液并且在涡流搅拌器上简短地振荡微孔板来再悬浮细胞，然后将200ul的DPBS/3％FBS/0.01％叠氮化钠(FACS缓冲液)添加到各孔中。重复离心和吸出，然后将25uL的杂交瘤上清液或1ug/百万细胞的纯化MAb添加给细胞。微孔板储存在冰上15分钟，然后如上所述在200uL的FACS缓冲液中进行冲洗和离心。重复此冲洗程序两次然后将25uL的山羊抗-小鼠Ig(H+L)生物素结合的抗体(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)添加于微孔15分钟并如上所述进行冲洗。将25ul的藻红蛋白链霉亲和素(PESA)添加给细胞。在冰上15分钟后如上所述冲洗细胞两次，然后再悬浮在250uL的FACS缓冲液中用于通过细胞分选仪或流式细胞仪进行分析。通过Elite荧光激发的细胞分选器(Beckman-Coulter，Miami，FL)分析染色的细胞。
通过FACS分析证明许多D-系列和K-系列MAbs的细胞表面结合的结果列于下述表3A，3B和3C中。通过FACS分析证明细胞表面表达的典型实验的结果描述在图1(A和B)和2(A和B)中。
具体地，图1A证明了Pro104.D116.1抗体与对照抗体(Ovr110.A57.1)相比和瞬时转染的293F细胞的细胞表面结合。图1B显示图1A中观察到的结合对Pro104是特异性的。此外，图2A证明了Pro104.D118.1抗体与对照抗体(Ovr110.A57.1)相比和瞬时转染的293F细胞的细胞表面结合。图2B显示图2A中观察到的结合对Pro104是特异性的。
MAb Pro104.D116.1的结合导致85％的Pro104转染的人293F细胞是阳性的，比用单独对照抗体(Ovr110.A57.1)细胞染色具有高9-倍的MFI(平均荧光强度)。细胞的双峰分布中Pro104.D118.1的结合导致70％的对Pro104是阳性的，并且比对照抗体具有高22-倍的平均荧光强度。
显著结合于Pro104-293F转染的细胞且不结合于非转染的293F细胞的其它的D-系列抗体为Pro104.D9.1，Pro104.D112.1，Pro104.D113.1，Pro104.D114.1，Pro104.D115.1，Pro104.D119.1，Pro104.D120.1，Pro104.D121.1，Pro104.D122.1，Pro104.D123.1，Pro104.D124.1，Pro104.D125.1，Pro104.D126.1，Pro104.D127.1，Pro104.D129.1，Pro104.D130.1，Pro104.D131.1，Pro104.D132.1，Pro104.D133.1，Pro104.D134.1，Pro104.D135.1，Pro104.D136.1，Pro104.D137.1，Pro104.D138.1，和Pro104.D139.1(参见下表3A)。
表3A.Pro104 D-系列MAbs与Pro104转染的293F细胞的细胞表面结合
     Pro104-转染的293F细胞       未转染的293F细胞
  样品   阳性细胞％   MFI   阳性细胞％   MFI
  没有染色   1.6   0.429   1.5   0.465
  GAMBio SAPE   4.5   0.421   1.7   0.538
  单独SAPE   3.8   0.411   1.4   0.511
  Ovr110.A57.1(阴性对照) 3.1 0.372 1.6 0.504
  5E9C11(阳性对照)   80.7   25   99.2   18.1
  Pro104.D9.1   38   2.63   9.2   0.802
  Pro104.D111.1   5.2   0.593   1.2   0.479
  Pro104.D112.1   28.7   2.38   1.4   0.515
  Pro104.D113.1   68.7   6.2   1.8   0.571
  Pro104.D114.1   51.5   4.18   1.7   0.509
  Pro104.D115.1   28.3   2.25   3.9   0.672
  Pro104.D116.1   84.8   3.88   1.9   0.594
  Pro104.D117.1   1.5   2.04   1.2   0.524
  Pro104.D118.1   69.9   9.01   1.6   0.524
  Pro104.D119.1   83.4   3.96   1.2   0.503
  Pro104.D120.1   36.4   2.68   1.8   0.531
  Pro104.D121.1   76.3   7.58   1.9   0.545
  Pro104.D122.1   21.3   2.41   1.3   0.513
  Pro104.D123.1   63   3.12   1.3   0.475
  Pro104.D124.1   74.5   3.41   2   0.595
  Pro104.D125.1   65.1   6.62   3   0.609
  Pro104.D126.1   62.5   3.16   1.5   0.483
  Pro104.D127.1   66.3   3.39   1.4   0.514
  Pro104.D128.1   1.9   2.06   1.3   0.504
  Pro104.D129.1   72.5   3.33   2.9   0.59
  Pro104.D130.1   56.7   6.26   3.7   0.65
  Pro104.D131.1   31.2   2.58   9.7   0.822
  Pro104.D132.1   61.2   3.1   2.4   0.614
  Pro104.D133.1   55   2.99   2.1   0.511
  Pro104.D134.1   14.2   2.19   2.3   0.561
  Pro104.D135.1   53.3   5.87   2.7   0.538
  Pro104.D136.1   40.2   2.52   2.3   0.52
  Pro104.D137.1   56.3   5.86   2.9   0.646
  Pro104.D138.1   68.3   6.23   3.1   0.624
  Pro104.D139.1   59.4   5.98   2.7   0.633
Pro104.K81(来自K系列)抗体也结合于用Pro104瞬时转染的293F。约54％的细胞为阳性的，其具有超过阴性对照抗体3-倍的平均荧光强度1.69。
显著地结合于Pro104-293F转染的细胞且不结合未转染的293F细胞的其它K-系列抗体为Pro104.K72，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K88，Pro104.K156，Pro104.K159，Pro104.K164和Pro104.K176(参见下述表3B)。
表3B.Pro104 K-系列MAbs与Pro104转染的293F细胞的细胞表面结合
  Pro104-转染的293F细胞   未转染的293F细胞
  样品   阳性细胞百分比   MFI   阳性细胞百分比   MFI
  没有染色   1.1   0.41   0.8   0.456
  GAMBio SAPE   1.8   0.428   1.5   0.482
  SAPE   1.4   0.397   0.8   0.459
  Pro104.D9.1   70.3   3   1.7   0.482
  Cln242.B53.1(阴性对照) 3.6 0.544 1.4 0.535
  Pro104.K15   18.1   0.919   3.2   0.557
  Pro104.K47   16.2   0.901   11.7   0.824
  Pro104.K71   18.1   0.963   1.8   0.479
  Pro104.K72   19.7   1.03   1.5   0.475
  Pro104.K75   99.2   15.5   13.4   0.816
  Pro104.K78   99   17.2   2.7   0.495
  Pro104.K81   54.2   1.69   3.1   0.56
  Pro104.K88   55.5   1.95   1.9   0.51
  Pro104.K156   98.7   18.7   7.7   0.907
  Pro104.K159   39.1   1.34   1.9   0.488
  Pro104.K164   81.8   3.75   4.2   0.581
  Pro104.K176   81.1   3.23   2.4   0.546
Pro104 D-系列和K-系列抗体同样也在对Pro104转录本(HeLa)为QPCR阳性以及对Pro104转录本(HCT116)为QPCR阴性的细胞系上进行试验。Pro104.K81结合于97％的HeLa以及结合于9％的HCT116细胞，具有8-倍高于平均荧光强度的变化。(参见下表3C)。
表3C.Pro104 D-系列和K-系列MAbs与Pro104 QPCR阳性细胞系HeLa的细胞表面结合
         HeLa细胞           HCT116细胞
  样品   阳性细胞％   MFI   阳性细胞％   MFI
  没有染色   1.3   0.339   1.6   0.332
  GAMBio SAPE   1.4   0.38   1.25   0.48
  SAPE   1.3   0.333   1.4   0.423
  Ovr110.A57.1(阴性对照) 1.3 0.375 1.3 0.522
  抗-CD71(阳性对照)   99.8   49.6   99.9   38.9
  Pro104.D4.1   2   0.425   0.7   0.447
  Pro104.6.1   4.4   0.692   1.5   0.448
  Pro104.D9.1   3.3   0.694   0.5   0.408
  Pro104.D14.1   2.2   0.428   1   0.404
  Pro104.D18.1   2.3   0.486   1   0.421
  Pro104.D19.1   2.1   0.506   1.1   0.421
  Pro104.D31.1   6.9   0.634   3.6   0.527
  Pro104.D58.1   2   0.441   0.5   0.421
  Pro104.D116.1   5.5   0.738   0.6   0.428
  Pro104.D118.1   2   0.478   1.1   0.449
  Pro104.D119.1   6.3   0.801   0.8   0.425
  Pro104.D121.1   4.1   0.656   1   0.432
  Pro104.D123.1   3.8   0.696   0.6   0.416
  Pro104.D124.1   5.3   0.746   0.7   0.418
  Pro104.D126.1   4.6   0.711   0.8   0.428
  Pro104.D132.1   4.6   0.689   1.2   0.431
  Pro104.D133.1   5.2   0.706   0.8   0.408
  Pro104.K14   2.3   0.472   1   0.538
  Pro104.K15   92.6   5.84   80.2   3.29
  Pro104.K16   2.8   0.455   1.9   0.505
  Pro104.K47   51.8   1.6   69.5   2.09
  Pro104.K71   10.9   0.744   8.9   0.776
  Pro104.K72   10.4   0.769   8.3   0.719
  Pro104.K74   1.6   0.442   0.2   0.465
  Pro104.K75   98.8   14.5   93   7.62
  Pro104.K76   2.2   0.42   1.3   0.485
  Pro104.K78   2.7   0.409   1   0.444
  Pro104.K81   96.9   6.51   8.9   0.772
  Pro104.K87   3.3   0.531   3.9   0.641
  Pro104.K88   99.3   10.2   96.7   10.1
  Pro104.K89   99.6   19.1   43.7   1.34
  Pro104.K155   1.5   0.413   0.4   0.468
  Pro104.K156   2.4   0.491   1.1   0.505
  Pro104.K157   97.4   10.3   92.9   6.47
  Pro104.K158   2.3   0.454   2.4   0.519
  Pro104.K159   15.8   0.87   22.3   0.908
  Pro104.K160   36.7   1.3   29   1.08
  Pro104.K163   4.1   0.49   13.9   0.751
  Pro104.K176   31.7   1.18   47   1.29
  Pro104.K217   11.9   0.767   25.4   0.949
  Pro104.K226   9.6   0.736   11.4   0.75
  Pro104.K227   42.4   1.42   65.5   2.19
  Pro104.K240   97.5   8   95.8   15.2
  Pro104.K274   23   0.923   15.1   0.622
  Pro104.K264   3.6   0.497   1.5   0.53
  Pro104.K281   55.2   2.08   70.7   3
  Pro104.K358   3.8   0.539   4.1   0.625
  Pro104.K362   3.9   0.534   3.2   0.61
这些结果表明在表3A，3B和中的抗体且尤其是，Pro104.K81 Mab适于与或不与药物，毒素，酶，潜药激活分子或同位素结合的肿瘤进行的免疫治疗。
Pro104 MAb亲合性分析
利用BIACORE 3000装置(Biacore，Piscataway，NJ)根据表面细胞质基因组谐振测量法计算结合动力学和亲合性常数。设计实验来同时产生Pro104 MAbs的接通速率，关闭速率和亲合性值。
通过标准的胺结合(Biacore)将Pro104蛋白lot# 060402(diaDexus)固定在CM5传感器芯片(Biacore)的流动细胞2上。流动细胞1被用作空白表面用于扣除参照，且被激活然后用乙醇胺灭活。Pro104 MAbs稀释在HBS EP缓冲液(Biacore)中并且依次流经细胞1和2。注射MAbs一式两份，顺序地，分别为五个浓度：200，100，50，25，12.5ug/mL。假定MAbs分子量为158,000kDa，nM表示的相应浓度很可能为：1266，633，317，158和79。以30uL/分钟注射MAbs 3分钟然后12分钟的分解时间。芯片表面的再生，或循环之间去除MAb，通过流动细胞首先30秒然后12秒的100mM甘氨酸pH 1.5的两次注射来进行，两者均为100uL/分钟的流速。
通过利用包含在Biacore控制软件内的Biacore’s动力学分析向导进行上述方法。产生的传感系统自动地吻合，假定1∶1的Langmuir结合模型。利用向导数据处理功能计算下表4所示的结果。表3所示计算的亲合性除Pro104.C34之外全部在10-9M的范围内，且因此除了Pro104.C34外足以高到获得小于或等于10mg/kg的体内治疗剂量。
表4：Pro104C系列MAb亲合性
                            Pro104 Biacore亲合性鉴定
 抗-Pro104抗体克隆   KA   KD   ka   Kd
 C4   3.5E+08   2.9E-09   2.6E+04   7.4E-05
 C18   3.4E+08   2.9E-09   2.6E+04   7.5E-05
 C25   3.5E+08   2.8E-09   3.0E+04   8.5E-05
 C37   5.5E+08   1.8E-09   5.4E+45   9.7E-05
 C48   3.6E+08   2.8E-09   4.0E+04   1.1E-04
 C60   1.6E+08   6.4E-09   3.0E+04   1.9E-04
 C19   1.9E+08   5.2E-09   3.8E+04   2.0E-04
 C34   3.2E+08   3.0E-05   2.0E+01   6.2E-04
 C54   5.5E+08   1.8E-09   3.7E+04   6.7E-05
 C55   1.0E+08   9.8E-09   1.6E+04   1.5E-04
Western印迹
在细胞溶解缓冲液(1％NP-40/10mM磷酸钠pH 7.2/150mM氯化钠)中由Pro104-293T/瞬时转染子和哺乳动物腺癌细胞系制备用于Western印迹分析的蛋白提取物。在Novex XCell II Minicell凝胶装置(InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA)中通过NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)在变性条件下进行电泳来分离蛋白以及随后利用XCell II Blot模件(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)转至PVDF膜。蛋白转移之后，在1％阻断试剂(Cat.#_1 096 176，Roche Diagnostic Corp.，Indianapolis，IN)中阻断膜并且与纯化的初级抗体Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C25，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C48，Pro104.C55，Pro104.C60或Pro104.C66一起4℃温育过夜，然后与辣根-过氧化物酶结合的山羊抗-小鼠IgG(Cat.#_115-036-062，JacksonImmunoresearch Laboratories，Inc.)一起温育。利用ECL高级Western印迹检测试剂盒通过化学发光法观察条带(Cat.#RPN2135，AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。
按照生产商的建议对用肽N-糖苷酶F(PNGaseF，Cat.#_P0704S，New England Biolabs，Inc，Beverly，MA)处理的由Pro104-293T转染子，哺乳动物腺癌细胞系以及正常人睾丸提取的蛋白进行去糖基化实验。然后通过如上所述的蛋白质印迹分析去糖基化样品。简而言之，将100ug体积的蛋白提取物在糖蛋白变性缓冲液(0.5％ SDS/1％β-巯基乙醇)中100℃变性10分钟。然后添加试剂盒反应缓冲液(New EnglandBiolabs)至终浓度1％NP-40和50mM磷酸钠，添加100单位的PNGase F并在37℃温育4小时。
表5：利用PRO104 MABS与来自转染的293T细胞与人腺癌细胞系的提取物进行Western印迹的结果
  Pro104MAb   Pro104-293T   去糖基化Pro104-293T   HeLa &CaOv3(RT-PCR+)   去糖基化HeLa &CaOv3   SkOv3(RT-PCR-)
  C4   +多条带35-40kDa
  C13   +多条带35-40kDa
  C18   +多条带35-40kDa
  C19   +多条带35-40kDa
  C25   +多条带35-40kDa   约30kDa   约38kDa   约30kDa   -
  C34   +多条带35-40kDa
  C37   +多条带35-40kDa   约38kDa   -
  C48   +多条带35-40kDa
  C55   +多条带35-40kDa   约38kDa   -
  C60   +多条带35-40kDa
  C66   -
Western印迹实验的结果概括在上述表5中。在来自Pro104-293T转染子的全部细胞溶解产物中，MAbs Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C25，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C48，Pro104.C55和Pro104.C60与来自约35kDa到40kDa的几个蛋白条带特异性反应，这与全长Pro104 testisin的加工后形成的Pro104的糖基化形式相符。这些在非-转染的293T细胞系样品中不存在。Pro10 4MAb-C66通过Western印迹分析没有活性且因此不进行进一步地研究。通过MAbsPro104.C25，Pro104.C55和Pro104.C37在来自Pro104 mRNA阳性(RT-PCR+)癌细胞系HeLa和CaOv3(ATCC)的溶解产物中检测到约38kDa的蛋白条带，但是如所预料的在来自RT-PCR阴性的卵巢细胞系SkOv3(ATCC)中不存在。类似地，MAbs Pro104.C25和Pro104.C55在来自正常人睾丸的溶解产物中检测到预计分子量(38kDa)的条带(数据未显示)。MAbs Pro104.C25和Pro104.C55同样与重组的和天然的小鼠testisin在Western印迹中起反应(数据未显示)。
对来自Pro104转染子，RT-PCR阳性的细胞系和正常人睾丸的去糖基化溶解产物进行的Western印迹中，通过Pro104.C25检测的Pro104蛋白的迁移，由约38-40kDa(糖基化的)变化为约30kDa(非-糖基化的)。Pro104分子量的减少与预测Pro104蛋白的催化亚单位上存在三个N-糖基化位点相符合。
实施例2：通过免疫荧光证明的活癌细胞中Pro104 MAbs的细胞表面结合
下列癌细胞系被用在这些研究中以及获自ATCC：颈(HeLa)，卵巢(Tov-112D，Tov-21G，CaOV-3和SKOV-3)，结肠(HCT116以及胰腺(MIA Paca 2和AsPC)。如通过QPCR测定的HeLa，CaOV-3细胞系表达Pro104 RNA。对照的HCT116和SKOV-3细胞不表达Pro104 RNA。
将上述细胞系接种到无菌的18mm玻璃盖玻片上并在用初级抗体(Pro104 MAbs)处理之前在具有青霉素和链霉素的DMEM/10％FBS中37℃培养48小时。通过免疫荧光显微术检验MAbs Pro104.C19.1，Pro104.C25.1，Pro104.C55.1和Pro104.D9来测定这些抗体中哪些与表达Pro104的癌细胞的细胞表面的特异性结合。将初级MAbs以终浓度10ug/ml添加于培养基中并在37℃温育一小时。用3％甲醛的磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液固定之后，细胞与5ug/ml浓度的次级Cy3-标记的驴抗-小鼠(Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA)一起温育30分钟。冲洗之后，将细胞装在Vectastain(Vector，Burlingame，CA)，一种含有DAPI的介质中来观察细胞核并在配备合适荧光过滤器的Zeiss Axiophot荧光显微镜(Carl Zeiss，Thornwood，NY)中观察。利用CCD照相机记录显微照片。
Pro104.C19.1，Pro104.C25.1，Pro104.C55.1和Pro104.D9全部结合于表达Pro104的细胞。图3A和3B证明了Pro104.C19.1与HeLa细胞的结合(图3A)。其中的大多数细胞显示出用于Pro104的标记。可清楚地看到Pro104.C19.1修饰了细胞的细胞膜(箭头)。然而，Pro104.C19.1不结合于阴性对照(QPCR)SKOV-3癌细胞(图3B，N表示细胞核位置)。
活癌细胞中Cy3结合抗体的结合和内在化
利用直接结合的荧光抗体(MAbs)进行此研究。利用与荧光染料Cy3直接结合的抗体，抗体结合和内在化可通过荧光显微术进行观察。这些技术是本领域公知的。不表达Pro104(QPCR阴性的)的SKOV 3细胞被用作阴性对照。
Cy3结合
Pro104.C19.1，Pro104.C25.1和Pro104.A55.1MAbs各自结合于Cy3。根据标准方法按照厂商说明书(Pierce)进行Cy3结合。简而言之，1mg的抗体抗0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.3)透析60分钟，与Cy3染料混合并在RT温育2小时，然后转入Slide-A Lyzer盒(Pierce)以及在2升的PBS中4℃透析6小时。更换透析缓冲液并重复透析6次。回收Cy3结合的抗体并在280nm用分光计测定其浓度。
细胞标记
Cy3-Pro104.C19.1，Cy3-Pro104.C25.1和Cy3-Pro104.A55.1MAbs与细胞一起以10ug/ml的浓度在37℃水箱中温育60分钟，然后将具有细胞的盖玻片在PBS中冲洗并且用3％甲醛的PBS溶液固定细胞10分钟。固定之后，将具有细胞的盖玻片装在含有DAPI的介质(Vectastain)中来观察细胞核并利用配备合适荧光过滤器的Zeiss荧光显微镜Axiophot观察细胞。利用CCD照相机获得显微照片。
结果
用Cy3-Pro104.C19.1，Cy3 Pro104.C25.1以及Cy3-Pro104.A55.1处理的癌细胞的免疫荧光显微术显示表达Pro104的卵巢的和胰腺癌的细胞能够结合和内在化荧光抗体。图4A显示了Cy3-Pro104.C25.1与表达Pro104的细胞系HeLa细胞的细胞表面的结合(箭头)。Cy3-Pro104.C25.1抗体不结合不表达Pro104的对照细胞SKOV-3。参见图4B，N表示几个未标记细胞的核。图5证明了，结合于细胞膜之后，Cy3-Pro104.C25.1被内在化在HeLa细胞中而且内在化的囊泡可在这些细胞的细胞质中观察到。尤其是，囊泡往往可在非常接近于细胞核(N)(箭头)的地方观察到。图6A和图7A分别显示了MIA-PaCa-2细胞中Cy3-Pro104.19.1和Cy3-Pro104.C55.1的结合和内在化。MIA-PaCa-2细胞是表达Pro104的胰腺细胞系。内在化模式的特征为存在可能相当于位于接近高尔基体(箭头)处的内涵体的核周的囊泡。Cy3-Pro104.C19.1和Cy3-Pro104.C55.1不结合不表达Pro104的对照细胞系HCT-116(图6B和7B)。
当在体外结合于表达Pro104的癌细胞的细胞表面后，Cy3结合的MAbs Pro104.C19.1，Pro104.C25.1和Pro104.A55.1全部被内在化。这些结果表明抗-Pro104抗体，且尤其是，Pro104.C19.1，Pro104.C25.1和Pro104.A55.1MAbs适于与或不与药物，毒素，酶，潜药激活分子或同位素结合进行的肿瘤的免疫治疗。
通过免疫组织化学(IHC)测定肿瘤和正常组织中Pro104的分布
卵巢的和胰腺癌以及正常邻近组织的福尔马林固定的石蜡埋块获自国家疾病研究中心(National Disease Research Interchange，Philadelphia，PA)。正常器官的OCT埋块获自Zoion(Hawthorne，NY)。
对福尔马林固定的石蜡包埋切片进行的免疫组织化学染色
将由福尔马林固定的石蜡埋块切取的6μm厚的切片在45℃加热15分钟，在Histoclear(National Diagnostics，Atlanta，GA)中脱蜡，在Histoclear中脱蜡和通过系列降低PBS中的乙醇浓度进行再水合。在脱覆盖物(decloaking)室(Biocare，Walnut Creek，CA)中10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中120℃，15-17PSI煮沸玻片10分钟时间进行抗原回收。通过用3％过氧化氢溶液处理切片15分钟来抑制内源过氧化物酶活性。用1％BSA温育玻片来阻断非特异性的抗体结合然后在DAKO自动染色仪(Dako Co.，Carpinteria，CA)中与10ug/ml浓度的初级Pro104MAbs在室温下反应1小时。在具有0.5％吐温-20的Tris-缓冲盐(TBS)溶液中冲洗后，然后将玻片与结合于辣根过氧化物酶(HRP)(Immunovisiontechnologies，Daly City，CA)的抗-小鼠IgG一起温育。在具有0.5％吐温-20的TBS中冲洗后，切片用3，3′-二氨基联苯胺色原体处理2-5分钟(Immunovision Technologies)以及脱水后在装至Permount介质(AmericanMaster Tech Scientific，Inc，Lodi，CA)上之前用苏木精进行复染。与初级抗体相同浓度的正常小鼠IgG用作免疫标记特异性的阴性对照。在其它的对照实验中，在用于组织切片之前Pro104MAbs与抗原Pro104一起温育。
OCT包埋的冷冻未固定切片的免疫组织化学染色
在低温室中在合适的温度将玻片切割为5-8um，室温下风干至少30分钟。简而言之，在TBS中冲洗玻片来除去OCT并在室温下温育。利用Immunovision Powervision试剂盒(Immunovision Technologies，Co.Daly City，CA)进行IHC。简而言之，在TBS-T冲洗玻片来除去OCT并在室温下与Pro104初级抗体一起温育1小时。然后将它们在4％仲甲醛固定剂中室温下再固定10分钟并且如上所述进行处理。
结果
Pro104.C25.1，Pro104.A55.1，Pro104.D9和Pro104.D133用于卵巢和胰腺癌的免疫标记切片。标记卵巢和胰腺肿瘤中的上皮细胞，但不标记正常的卵巢和胰腺中的上皮细胞。10/17(58％)的浆液卵巢癌和11/11(100％)的胰腺癌临床样品的细胞表面被Pro104.C25.1标记。6/8(75％)的卵巢癌和3/3(100％)的胰腺癌临床样品的细胞表面被Pro104.C55.1标记。1/4卵巢癌(25％)的细胞表面被Pro104.D9标记。图8A，8B，8C和8D说明了两个卵巢癌临床样品中用Pro104.C25.1获得的IHC结果(图8A和8C)。对照正常卵巢未被Pro104.C25.1MAb标记(图8B和8D)。图9显示了用Pro104.C25.1标记的卵巢癌组织切片的高倍放大。标记清楚地定位于肿瘤上皮细胞的细胞膜(箭头)。
图10证明Pro104.D9标记了卵巢癌细胞的细胞表面(箭头)。另外，图11表明Pro104.D133标记了浆液卵巢癌细胞的细胞表面。
图12A和12C说明利用Pro104.C25.1在胰腺癌临床样品中获得的免疫标记模式。Pro104标记主要局限于上皮细胞的细胞表面(箭头)偶尔标记细胞质(图12C)。正常的胰腺细胞大部分缺乏定位标记(图12B和12D)。另外，图13表明当使用正常小鼠IgG而不是Pro104.C25(图13A)时或当Pro104.C25.1在加工用于IHC之前被Pro104抗原吸附时(图13B)没有观察到定位标记。
同样分析正常器官中的Pro104表达。对OCT冷冻切片的IHC显示在正常心脏，肝脏，肾脏，脑，结肠，胃，肺，前列腺，卵巢，胰腺和乳房的细胞中的细胞表面上没有检测到标记。然而，睾丸中精子细胞的膜显示出强烈的Pro104免疫标记。这些结果预计来自科学文献(J.D.Hooper等，Testisin，a new human serine protease expressed by premeiotictesticular germ cells and lost in testicular germ cell tumors，CancerResearch 59：3199-3205(1999))中所公开的数据。参见所归纳的下表6。
表6：Pro104 D-系列MAbs的IHC结果的归纳
                                       Pro104 D MAb免疫组织化学结果
  MAb克隆   稀释(ug/ml)                               未固定的OCT       福尔马林固定的(FFPE)
              睾丸   正常的生命器官*   卵巢癌(no.阳性的/no.检验的   睾丸   卵巢癌(阳性/测试的比)
  精子细胞  基质(细胞)   平滑肌   其它的
  IgG1   10ug/ml   -   -   -   -
  抗-角蛋白   3+(5/5) 3+(2/2)
  D9   5ug/ml   3+   -   -   -   -   3+(2/3)   3+
  D116   10ug/ml   3+   -   -   -   -   1+(3/5)
  D119   10ug/ml   3+   -   -   -   -   1+(3/5)
  D121   10ug/ml   3+   -   -   -   3+(all 3)   1+(4/5)   2+(3/3)
  D124   10ug/ml   3+   -   -   -   -   1+(3/5)
  D123   10ug/ml   3+   -   -   -   -   2+(2/5)   3+   2+(2/2)
  D126   10ug/ml   3+   -   -   -   +/-   2+(1/5)   3+   1+(2/2)
  D132   10ug/ml   3+   -   -   -   -   2+(1/5)   3+   2+(5/5)
  D133   10ug/ml   3+   -   -   -   -   2+(1/5)   3+   2+(2/2)
*正常的生命器官包括心脏，肝脏和肾脏。
上述的免疫组织化学结果证明Pro104在很高百分率的卵巢和胰腺癌个案中表达。Pro104在癌细胞的细胞表面上表达的事实使得其成为基于抗体治疗的理想目标。另外，通过IHC证明的抗-Pro104抗体与卵巢和胰腺癌细胞的结合表明抗-Pro104抗体，且尤其是，Pro104.C25.1，Pro104.D9和Pro104.D133 MAbs适于与或不与药物，毒素，酶，潜药激活分子或同位素结合进行的肿瘤的免疫治疗。
实施例3：Pro104的小鼠单克隆夹心ELISA检测
Pro104竞争性方格盘ELISA
高结合聚苯乙烯(Corning Life Sciences(MA))用1μg/孔的抗-Pro104 MAb包被4℃过夜。对包被溶液抽气并且通过添加300μL/孔的超级阻断-TBS(Pierce Biotechnology，Illinois)在RT阻断无结合的位点1小时。用冲洗缓冲液(1x TBS/0.05％Tween20)冲洗两次后，向各孔中添加100μL体积的Pro104抗原。用100ng/ml和0ng/ml的在测定缓冲液(1XTBS，1％BSA/1％小鼠血清/1％小牛血清/0.1％Tween20)中稀释的重组Pro104E coli表达的蛋白检验各配对。添加后，在RT振荡温育微孔板1小时，并用360μl的冲洗缓冲液冲洗4x。然后添加50μL体积在测定缓冲液中为20μg/ml的未标记的涂布MAb，并且在RT振荡温育10分钟。然后，向各孔中添加50μL体积的生物素酰化的检测MAb(2μg/ml)并且在RT振荡温育微孔板1小时。冲洗后，向微孔中添加100μL体积的碱性磷酸酶结合的链霉亲和素(JacksonImmunoResearch Laboratories，PA，1∶2000稀释)并且在RT振荡温育微孔板30分钟。冲洗后，然后利用pNPP底物的1x DEA缓冲液(PierceBiotechnology，Illinois)在RT展开微孔板30分钟。通过添加100μL/孔的1N NaOH终止反应，并且利用Spectramax 190微孔板读数器(Molecular Devices，CA)在405nm处对微孔板进行读数。405nm处的OD值用于计算各Ab配对的信噪比(100ng/mL处的OD除以0ng/mL处的OD)。
方格盘ELISA检验13MAb的结果显示于下表7中。各抗体以及所有可能组合中的检测抗体被用作包被。对100和0ng的Pro104 E.coli蛋白的测定缓冲液(含有小鼠血清，小牛血清和用作空白的BSA)的所有配对试验一式两份。结果显示为特异性信号/噪音(单独测定缓冲液)比。在与检测抗体温育过程中将10-倍高浓度的包被抗体添加至微孔中来防止自我配对。当抗原部分地聚合时可观察到自我配对并且可混淆MAb配对结果。在竞争性条件下进行ELISA测定确保当抗原聚集时抗体不能结合相同或近似的表位。
数据表明至少五个表位已被鉴定因为位阻可能对非-配对MAbs而言是有影响的因素。获自表7结果的Pro104MAbs的表位图绘显示于图14中。超过50％的单克隆抗体(Pro104.C4，Pro104.C18，Pro104.C25，Pro104.C37，Pro104.C48和Pro104.C60)与一个表位或近似的足以引起位阻且因此在测定中阻断MAb配对的表位反应。MAbs Pro104.C34和Pro104.C13两者都与彼此不相同和与其它的表位或MAb组不相同的表位反应。MAbs Pro104.C55和Pro104.C19与表位或充分地临近于被Pro104.C66识别来引起部分阻断的表位的两个近似表位反应。MAbsPro104.C55和Pro104.C19同样与表位或其充分临近该表位的表位或被MAb组Pro104.C4，Pro104.C18，Pro104.C25，Pro104.C37，Pro104.C48和Pro104.C60识别引起部分阻断的表位反应。然而，MAb Pro104.C66与充分远离该表位的表位或被MAb组Pro104.C4，Pro104.C18，Pro104.C25，Pro104.C37，Pro104.C48和Pro104.C60识别来允许与此组的MAbs配对的表位反应。
测定几个不同MAb组合来建立用于检测来自癌细胞系，转染的细胞系和癌组织的介质或溶解产物的天然Pro104的夹心ELISA测定。在对约1ng/ml的重组Pro104具有灵敏度的夹心ELISA中较好的进行Pro104.C19/C48和Pro104.C55/C34配对。转染48小时后，通过对来自RT-PCR阳性的CaOV3卵巢癌细胞，RT-PCR阳性的HeLa颈癌细胞的CHAPS(Pierce)去垢剂溶解产物以及来自Pro104转染的293T和LMTK细胞的溶解产物进行夹心ELISA来检测Pro104。在来自前列腺癌细胞系PC3(ATCC)和结肠癌细胞系HT29(ATCC)的溶解产物中未检测到Pro104，其RT-PCR是Pro104阴性的。这些结果同样与免疫荧光数据相符合。然而，在转染48小时后，没有在来自任何癌细胞系的组织培养介质中，或来自Pro104转染的细胞的介质中检测到Pro104蛋白。
表77：通过竞争ELISA进行的Pro104ELISA MAb配对的鉴定
                                                 检测抗体
  C4   C13   C18   C25   C37   C48   C60   C66   C19   C34   C55
  包被抗体   C4   4.3*   50   4   5.3   4.7   5.1   2.1   12
  C13   33   5.3   40   32   26.7   32   28   8.3   17   9   16
  C18   3.2   43   2.7   3.1   3.6   3.9   1.54   10
  C25   4   47   4.3   5   5.6   5.1   1.67   1.3
  C37   4.2   46   4   4.3   4.4   4.9   2.3   13
  C48   3   50   3.7   3.9   3.7   3.8   1.9   14.7   1.3   19.5   1
C60 22 46 21 19 18 25 4.38 7.8
C66 31 30 34 23 19 22 13 2 12 11 10
  B8   22.8   22.4   21/40   16   13   17   7.8   2.6   26   15.6   27
  B11   17   14   9.7   7.9   11   5.3   1.4
  C19   34   33   34   14   1.6   31   11
  C34   8.7   7.7   5.6   1.9   4.3   1.4   4.3
  C55   38   7.8   13.4   13.6   3   27   2.3
*信噪比(100ng/mL处的OD除以0ng/mL处(单独测定缓冲液)的OD)。
实施例4：Pro104蛋白的检测以及EGF受体的磷酸化
通过Western印迹检测细胞系和卵巢肿瘤中的Pro104蛋白
评价Rk3E，HeLa，AsPC1和HT29细胞系的Pro104的表达。RK3E和HT29细胞系对于Pro104 mRNA是阴性的。利用本领域已知的方法用Pro104(RK3E-104)转染RK3E作为对照。同样用碱性磷酸酶(RK3E-AP)转染RK3E细胞作为其它的对照。HeLa和AsPC1对于Pro104mRNA是阳性的。除细胞系之外，评价卵巢肿瘤和邻近肿瘤的正常组织中Pro104的存在。
在冰上利用修饰的RIPA缓冲液(1％NP40，10mM Na2PO4，0.15MNaCl)加蛋白酶抑制剂混合物(Roche Inc.)制备细胞提取物。20和50ug之间的蛋白质提取物用于各凝胶泳道；评价蛋白质当量浓度用于在相同凝胶上比较蛋白水平。澄清的提取物与等体积的2x浓缩的Laemmli样品缓冲液(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)混合，加热到70℃10分钟然后利用预-配制的4-12％SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶(Nupage；Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)与MES运行缓冲液(Nupage；Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)进行分析。利用1X Nupage转移缓冲液加10％甲醇将凝胶转至0.45μm孔径的止动剂-P PVDF膜(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)。冲洗膜并在室温下利用5％脱脂奶粉的PBS与0.05％吐温-20溶液阻断1小时。膜与初级抗体在5％脱脂奶粉的PBS与0.05％吐温-20溶液中温育过夜。利用重组的细菌Pro104蛋白自身产生直接抗Pro104的小鼠单克隆抗体。Pro104单克隆抗体以1∶1000稀释为终浓度1ug/ml且抗GAPDH的小鼠单克隆抗体(Chemicon Inc.，Temecula，CA)以1∶5000稀释(终浓度为0.2ug/ml)。温育初级抗体之后，在室温下冲洗膜4次10分钟时间。各自在具有0.05％吐温-20的1XPBS中。辣根过氧化酶连接的山羊抗-小鼠免疫球蛋白(Jackson Lab Inc.，Bar Harbor，ME)(1∶10,000稀释)用于5％脱脂奶粉的PBS加0.05％吐温20的溶液中在室温下1小时来检测初级单克隆抗体。最后冲洗膜4次持续10分钟时间。在1X PBS加0.05％吐温-20中然后利用增强化学发光(ECL)试剂根据生产商的建议(Amersham，Piscataway，NJ)进行检测并且曝光于X射线底片(Kodak，Rochester，NY)。为比较用AP(碱性磷酸酶)-表达的逆转录病毒感染的RK3E细胞与用Pro104表达逆转录病毒感染的相同细胞的Western免疫印迹实验，将细胞铺板在含有1％或10％FBS的生长培养基中48小时。利用包括磷酸酶抑制剂混合物(Calbiochem)的修饰RIPA缓冲液制备细胞提取物并且通过用对磷酸化EGF受体(BioSource International，Camarillo，CA)特异的多克隆抗体进行的SDS-PAGE和Western免疫印迹评价澄清的提取物。
图15A通过Western印迹证明在Pro104转染的细胞系(RK3E-104)和天然表达Pro104的细胞系(HeLa和AsPC1)中检测到Pro104。在AP转染的细胞系(Rk3E-AP)和mRNA阴性的细胞系(HT29)中未检测出Pro104蛋白。另外，图15B说明了通过Western印迹在卵巢肿瘤组织而并非在正常邻近的组织中检测到Pro104蛋白。
Pro104在癌细胞系和卵巢肿瘤组织中可检测到的事实使得其成为基于抗体治疗的理想目标。抗-Pro104抗体适于与或不与药物，毒素，酶，潜药激活分子或同位素结合的肿瘤的免疫治疗。
EGF受体的磷酸化
评价RK3E转染的过量表达Pro104的细胞系(RK3E-Pro104)的表皮生长因子(EGF)受体的磷酸化。同样用碱性磷酸酶转染的RK3E细胞(RK3E-AP)作为对照。利用本领域已知的方法，用来自-Pro104和RK3E AP细胞的10％和1％血清评价EGF受体的磷酸化。
Pro104的过量表达被发现导致EGF受体的磷酸化。图16是抗磷酸化EGF受体的western免疫印迹，其证明与AP对照相比EGF受体由于Pro104的过量表达被磷酸化。
实施例5：Pro104蛋白的糖基化作用，GPI-连接和生物素酰化
Pro104糖基化作用
利用肽N-糖苷酶F(PNGaseF，Cat#_P0704S，New England Biolabs，Inc，Beverly，MA)按照生产商提供的用法对来自HeLa细胞系(Pro104mRNA阳性的)和卵巢癌肿瘤样品的蛋白质提取物进行去糖基化实验。然后通过如上所述的蛋白质印迹分析去糖基化样品。简而言之，在糖蛋白变性缓冲液/0.5％SDS/1％β-巯基乙醇中，在100℃将100ug的蛋白质提取物变性10分钟。在添加100单位的PNGase F之前添加终浓度为1％NP-40和50mM磷酸钠的试剂盒反应缓冲液(New England Biolabs)并且在37℃温育4小时。
图17A说明当用Pangs处理时来自HeLa细胞系和卵巢癌样品二者的Pro104蛋白迁移的变化。这些结果证明不仅Pro104是糖基化的，而且抗-Pro104抗体能够检测天然Pro104的糖基化和去糖基化两种形式。
通过PI-PLC鉴定Pro104 GPI-连接
将HeLa细胞接种在6孔微孔板中。48小时后，在90％铺满时，用1ml新鲜的有和没有0.5单位磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C(PI-PLC，Sigma)的生长培养基替换培养基。37℃温育-小时后，收集培养基并简要地微离心。通过SDS-PAGE分析15μl未浓缩的培养基。溶解细胞用于如上所述的免疫印迹分析。
由于Pro104被推测为GPI-连接的蛋白，其通过用磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C(PI PLC)如上所述处理活的HeLa细胞来进行测定。PI-PLC裂解来自GPI-连接的蛋白的膜锚并释放蛋白到培养基中。图17B证明没有Pro104蛋白流入到未处理的HeLa细胞的培养基中，然而，用PI-PLC处理的释放Pro104到培养基中，其可通过免疫印迹被检测。PI-PLC处理不释放其它的非-GPI-连接的膜蛋白表明Pro104的释放取决于通过PI-PLC进行的对GPI-锚的特异性裂解。此实验表明Pro104通过GPI-连接定位于肿瘤细胞的表面。
Pro104生物素酰化
附着细胞
由37℃恒温箱移取Caco2，CaOV3，或HeLa细胞，置于冰上，并且在实验持续期间保持在冰上。用pH 7.4的冰冷PBS(10mM Na-P)冲洗细胞3次。添加溶于冰冷的PBS至终浓度为0.5mg/ml的生物素酰化试剂(硫代-NHS-SS-生物素；Pierce，Rockford，IL)完全地覆盖细胞(约200μl)并且在冰上温育30分钟。除去生物素酰化试剂并且用1xPBS+25mM Tris冲洗细胞一次然后用冰冷的PBS冲洗三次。将500μl的裂解缓冲液(1x PBS+1.0％Triton)用1x蛋白酶抑制剂添加于细胞并且在冰上温育10分钟。产生的溶解产物转移到微量离心管中并在4℃以14,000rpm旋转2分钟。收集50μl的上清液作为总蛋白提取物用于凝胶电泳，而残余体积的上清液用20μl的链霉亲和素琼脂糖磁珠(Pierce)免疫沉淀。免疫沉淀后用细胞溶解缓冲液(1x PBS+1.0％Triton)冲洗磁珠三次。将100μl的1x LDS样品缓冲液(NuPage；Invitrogen)和1x样品还原剂(NuPage；Invitrogen)添加于各样品并在凝胶上电泳之前在70℃温育10分钟。然后如上所述进行标准的Western印迹。
分离细胞
由37℃恒温箱移取Caco2，CaOV3，或HeLa细胞，置于冰上，并且在实验持续期间保持在冰上。分离细胞并用pH 7.4的冰冷PBS(10mM Na-P)冲洗细胞3次并再悬浮在500μl PBS中。将1.0mg/ml浓度的溶于冰冷PBS的生物素酰化试剂(硫代-NHS-SS-生物素；Pierce，Rockford，IL)添加于细胞至终浓度0.5mg/ml和在冰上温育30分钟。以2000rpm旋转离心细胞5分钟。除去生物素酰化试剂并且用1x PBS+25mM Tris冲洗细胞一次然后用冰冷的PBS冲洗三次。各次冲洗之间以2000rpm旋转离心细胞5分钟来除去缓冲液。将500μl的裂解缓冲液(1x PBS+1.0％Triton)与1x蛋白酶抑制剂添加于细胞并在冰上温育10分钟。产生的溶解产物转移到微量离心管中并在4℃以14,000rpm旋转2分钟。上清液转入新的微量离心管并利用BCA测定(Pierce)测定蛋白浓度。收集50μl的上清液作为总蛋白提取物用于凝胶电泳，而残余体积的上清液用20μl的链霉亲和素琼脂糖磁珠(Pierce)免疫沉淀。免疫沉淀后用细胞溶解缓冲液(1x PBS+1.0％Triton)冲洗磁珠三次。将100μl的1x LDS样品缓冲液(NuPage；Invitrogen)和1x样品还原剂(NuPage；Invitrogen)添加于各样品并在凝胶上运行之前在70℃温育10分钟。然后如上所述进行标准的Western印迹。
图18证明天然的Pro104与NaK-ATPase(阳性对照)和GAPDH(阴性对照)相比在细胞表面上被生物素酰化。
Pro104在细胞系中通过GPI-连接位于细胞表面上的事实使得其成为基于抗体的治疗的理想目标。此外，抗-Pro104抗体与的糖基化和去糖基化Pro104在细胞系和卵巢癌细胞上的结合表明抗-Pro104抗体适于与或不与药物，毒素，酶，潜药激活分子或同位素结合的肿瘤的免疫治疗。
实施例6：表达Pro104的细胞系的产生
细胞和细胞培养物
SKOV3，RK3E，293T，HeLa，CaOV3，NCIH522和HCT116细胞系购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。细胞培养在具有L-谷氨酰胺加4.5g/L葡萄糖并补充10％FBS和100U/mL青霉素/链霉素(Cellgro，Herndon，VA)的DMEM(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中。所有细胞维持在具有5％CO2的湿润37℃恒温箱中。
表达载体构建
作为Pro104克隆的来源，利用BD SMART PCR cDNA合成试剂盒(BD Bioscience/Clontech，Palo Alto，CA)由聚A+mRNA制备人卵巢癌cDNA。为构建编码未标记的Pro104(pLXSN-Pro104)的逆转录病毒表达载体，通过利用卵巢癌5’-RACE-ready cDNA作为模板以及下述的基因特异性引物的PCR反应合成Pro104 cDNA：
5’-末端：5’-ATGGGCGCGCGCGGGGCGCTGCTGCTG-3’(SEQID NO：8)
3’-末端：5’TTATCA GACCGGCCCCAGGAGTGGGAGAGCCCA- 3’(SEQ ID NO：9)
将PCR片段克隆到pLXSN载体(BD Bioscience/Clontech)的Hpa I克隆位点中并进行序列验证。pLXSN载体的Genbank登录号为#_M28248。
为构建编码具有框架内COOH-末端血球凝集素标记(pLXSN-Pro104HA)的逆转录病毒表达载体，除了下述3′引物外使用相同的方法：
3’-末端(HA标记为黑体)：5’-TTATCACGCGTAGTCCGGCACGTCGTACGGGTAGCC GACCGGC CCCAGGAGTGGGAGAGCCCA-3’(SEQ ID NO：10)
pLXSN反向病毒载体利用推动克隆到多克隆位点中的cDNA′s表达的5’MO-MuSV(Moloney鼠肉瘤病毒)LTR和3’MO-MuLV(Moloney鼠白血病病毒)LTR及其推动编码G418抗性的Neor基因表达的SV40启动子。pLAPSN，一种编码碱性磷酸酶(AP)的逆转录病毒表达载体，购自BD Bioscience Clontech(称为pLXSN-AP)。
病毒制备
Ecotropic病毒用于感染RK3E细胞且双向性病毒用于感染SKOV3细胞。为包装亲嗜性病毒，在转染前一天，以8×105细胞每孔的密度将293T细胞接种在Biocoat胶原蛋白包被的微孔板(BD)的6孔平皿上。利用Lipofectamine在添加PLUS试剂(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)的情况下用纯化质粒DNA转染细胞。每孔细胞0.8μg的病毒质粒DNA：pLXSN-Pro104，pLXSN-Pro104HA或pLXSN-AP加0.8μg的pVpack-ECO和0.8μg pVpackGP(Stratagene，La Jolla，CA)添加于125μl无血清DMEM和10μl的PLUS试剂的母液然后在室温下温育15分钟。随后，8μl的lipofectamine稀释到125μl的DMEM培养基添加于DNA/PLUS试剂混合物并且室温下温育15分钟。一毫升的DMEM添加于最后的Lipofectamine/DNA混合物并应用于细胞单细胞层，其已含有1ml无血清的DMEM，然后在37℃温育3小时。温育3h后将1mL含有20％FBS的DMEM添加于转染混合物并且过夜培养。最后，培养基换成补充10％FBS+100U/mL Pen/Strep的DMEM用于病毒收集。24小时后收集含有病毒的培养基并通过0.45μm聚磺酸基过滤器进行过滤。
对于双向性病毒包装，除了使用pVpack Ampho质粒(Stratagene)而不是pVpack Eco质粒之外采用相同的方法。
病毒感染和选择
聚凝胺(Hexadimethrine Bromide；Sigma，Saint Louis，MS)添加于新鲜的终浓度为4μg/ml的含病毒培养基。以3×105细胞每100mm2平皿密度之前一天进行铺板的RK3E或SKOV3细胞，用包含Ca2+和Mg2+的磷酸缓冲盐水(Cellgro)冲洗一次。病毒溶液(6ml每100mm2平皿)直接施加于细胞然后在具有5％CO2的湿润37℃恒温箱中间或旋动温育3小时。用新鲜的生长培养基替换含病毒培养基并将细胞在37℃温育60-72小时使得生长培养基包含终浓度为350ug/mL的G418硫酸盐(Cellgro)来选择病毒-感染的细胞。细胞保持在70-80％铺满之间并且每两天替换一次含G418的培养基。选择G418之后，细胞集合用于随后的实验包括通过Western免疫印迹验证Pro104蛋白表达，其中的Pro104蛋白由细胞提取并如上所述进行分析。通过染色监控受感染细胞单细胞层的AP的表达，其中单细胞层在室温下用0.5％戊二醛溶液固定10分钟，用PBS冲洗，加热到65℃30分钟以及通过用BCIP/NBT液体底物(Sigma，Saint Louis MS)温育2-3小时进行AP观察。
病毒感染细胞系的产生以及选择
对SKOV3，RK3E，293T，HeLa，CaOV3，NCIH522和HCT116细胞系进行病毒感染并筛选来过量表达Pro104。
通过Western免疫印迹证实逆转录病毒-介导的Pro104蛋白在RK3E细胞中的过量表达。图19为证明逆转录病毒包装细胞系和病毒感染的RK3E细胞中Pro104蛋白表达的western免疫印迹。
通过Western免疫印迹证实逆转录病毒-介导的Pro104蛋白在SKOV3细胞中的过量表达。图20为证明逆转录病毒包装细胞系和病毒感染的SKOV3细胞中Pro104蛋白表达的western免疫印迹。
实施例7：siRNA产生和转染
siRNA寡核苷酸设计和制备
为设计Pro104特异性siRNA分子，基于以前描述的方法(elbashir等，2001，Nature 411：494-498)由Pro104 mRNA的开放阅读框架选择序列。不产生任意已知细胞mRNA的敲除的随机“干扰”siRNA序列被用作阴性对照。作为其它阴性对照靶向伊默菌素(Emerin)的siRNA用于证明非必要mRNA的敲除不影响Pro104水平也不影响任意的生物学终点研究。作为导致细胞程序性死亡诱导的mRNA敲除的阳性对照，基于公开的数据，使用靶向DAXX或OPA1的siRNA。Michaelson等，2002，Journal of Cell Science，116：345-352；Olichen等，2003，J BiolChem.，278(10)：7743-6。用各选择的siRNA序列进行对比人基因组的BLAST检索来确保siRNA是靶-特异性的且不具有敲除其它序列的功能。用于敲除Emerin和DAXX的siRNA序列获自公开的论文。Michaelson等，2002；Harborth等，2001，Journal of Cell Science，114：4557-4565。
所有的siRNA分子(HPP纯化级)由Xeragon公司化学合成。(Germantown，MD)。siRNA’s溶于无菌缓冲液，在90℃加热1分钟然后在使用之前37℃温育1小时。在序列的3’末端具有两个胸腺嘧啶残基(dTdT)的siRNA寡核苷酸包含如下特异性RNA序列：
Pro104 #56：正义5’-CACAUCCAGCCCAUCUGUC-3’(SEQ IDNO：11)
Pro104 #79：正义5’-GAGGAUGAGGCACUGCCAU-3’(SEQ IDNO：12)
Pro104 #80：正义5’-CUCUAUGUGCAACCACCUC-3’(SEQ IDNO：13)
Pro104 #81：正义5’-GUACAGUUUCCGCAAGGAC-3’(SEQ IDNO：14)
干扰的：正义5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO：15)
伊默菌素：正义5’-CCGUGCUCCUGGGGCUGGG-3’(SEQ IDNO：16)
DAXX：正义5’-GGAGUUGGAUCUCUCAGAA-3’(SEQ ID NO：17)
OPAI正义5’-GUUAUCAGUCUGAGCCAGG-3’(SEQ ID NO：18)
对在序列的3’末端具有两个胸腺嘧啶残基(dTdT)的Pro104具有特异性的其它siRNA寡核苷酸包含下列特异性RNA序列：
Pro104_siRNA#1：gccggagucgcaggaggcg(SEQ ID NO：19)
Pro104_siRNA#2：cucgggcguuggccguggc(SEQ ID NO：20)
Pro104_siRNA#3：accuauagugaccuuagug(SEQ ID NO：21)
Pro104_siRNA#4：ccuauagugaccuuaguga(SEQ ID NO：22)
Pro104_siRNA#5：uucacccuaugacauugcc(SEQ ID NO：23)
Pro104_siRNA#6：gcugucugcaccugucacc(SEQ ID NO：24)
Pro104_siRNA#7：ccggacagacugcugggug(SEQ ID NO：25)
Pro104_siRNA#8：agaggaugaggcacugcca(SEQ ID NO：26)
Pro104_siRNA#9：guucaggucgccaucauaa(SEQ ID NO：27)
Pro104_siRNA#10：ggacaucuuuggagacaug(SEQ ID NO：28)
Pro104_siRNA#11：caagaauggacugugguau(SEQ ID NO：29)
Pro104_siRNA#12：gaauggacugugguaucag(SEQ ID NO：30)
Pro104_siRNA#13：uggacugugguaucagauu(SEQ ID NO：31)
Pro104_siRNA#14：ucggcccggugucuacacc(SEQ ID NO：32)
Pro104_siRNA#15：uaucagccaccacuuugag(SEQ ID NO：33)
Pro104_siRNA#16：gucaggcccugguucucuu(SEQ ID NO：34)
Pro104_siRNA#17：uaaacacauuccaguugau(SEQ ID NO：35)
Pro104_siRNA#18：uaaacacauuccaguugau(SEQ ID NO：36)
Pro104_siRNA#19：acacauuccaguugaugcc(SEQ ID NO：37)
Pro104_siRNA#20：cacauuccaguugaugccu(SEQ ID NO：38)
用siRNA寡核苷酸进行的转染
在转染之前18-24小时将表达Pro104的HeLa(4×104细胞)和CaOV3(6×104细胞)细胞接种在12-孔微孔板中。利用Oligofectamine试剂(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)按照生产商的方案进行瞬时转染。每孔细胞使用终浓度100nM的siRNA(除DAXX siRNA为200nM外)和1.5ul Oligofectamine。所有实验转染Pro104，干扰的DAXX和Emerin siRNA一式三份。转染后72小时通过定量实时RT-PCR(QPCR)评价平行微孔的细胞的mRNA水平的变化，通过Western免疫印迹评价蛋白水平的变化以及通过两个不同的测定系统评价细胞程序性死亡的变化(参见下文)。所有发现用至少2个其它的实验证实。
实施例8：SDS-PAGE和Western免疫印迹分析
用siRNA转染72小时后，在冰上利用修饰的RIPA缓冲液(1％NP40，10mM Na2PO4，0.15M NaCl)加蛋白酶抑制剂混合物(Roche Inc.)制备细胞提取物。20和50ug之间的蛋白质提取物用于各凝胶泳道；评价蛋白质当量浓度用于在相同凝胶上比较蛋白水平。澄清的提取物与等体积的2x浓缩的Laemmli样品缓冲液(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)混合，加热到70℃10分钟然后利用预-配制的4-12％SDS-聚丙烯酰胺微型凝胶(Nupage；Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)与MES电泳缓冲液(Nupage；Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)进行分析。利用1X Nupage转移缓冲液加10％甲醇将凝胶转入具有0.45μm孔径的止动剂-P PVDF膜(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)。冲洗膜并在室温下利用5％脱脂奶粉的PBS与0.05％吐温-20溶液阻断1小时。膜与初级抗体在5％脱脂奶粉的PBS与0.05％吐温-20溶液中温育过夜。利用重组的细菌Pro104蛋白自身产生直接抗Pro104的小鼠单克隆抗体。Pro104单克隆抗体以1∶1000稀释为终浓度1ug/ml且抗GAPDH的小鼠单克隆抗体(ChemiconInc.，Temecula，CA)以1∶5000稀释(终浓度为0.2ug/ml)。温育初级抗体之后，在室温下冲洗膜4次10分钟时间。各自在具有0.05％吐温-20的1XPBS中。辣根过氧化酶连接的山羊抗-小鼠免疫球蛋白(Jackson LabInc.，Bar Harbor，ME)(1∶10,000稀释)用于5％脱脂奶粉的PBS加0.05％吐温20的溶液中在室温下1小时来检测初级单克隆抗体。最后冲洗膜4次持续10分钟时间。在1X PBS加0.05％吐温-20中然后利用增强化学发光(ECL)试剂根据生产商的建议(Amersham，Piscataway，NJ)进行检测并且暴露于X射线底片(Kodak，Rochester，NY)。为进行比较用AP(碱性磷酸酶)-表达的逆转录病毒感染的RK3E细胞与用Pro104表达逆转录病毒感染的相同细胞的Western免疫印迹实验，将细胞铺板在含有1％或10％FBS的生长培养基中48小时。利用包括磷酸酶抑制剂混合物(Calbiochem)的修饰RIPA缓冲液制备细胞提取物并且通过用对磷酸化EGF受体(BioSource International，Camarillo，CA)特异的多克隆抗体进行的SDS-PAGE和Western免疫印迹评价澄清的提取物。
通过western免疫印迹测定Pro104特异性siRNA对Pro104蛋白的作用。图21显示了HeLa细胞中siRNA介导Pro104蛋白的特异性下调。观察到Pro104蛋白的60％敲除(ΔCT＝1.3)。这些结果不限于单细胞类型。图22显示了CaOV3细胞中siRNA介导Pro104蛋白的特异性下调。观察到Pro104蛋白的55％的敲除(ΔCT＝1.2)。
实施例9：定量实时RT-PCR(QPCR)
来自Qiagen Inc.的QuantiTech SYBR Green RT-PCR试剂盒用于QPCR评价。最终的反应体积为20ul，包括10ul RT-PCR Master混合物，2ul正向引物(5uM)，2ul反向引物(5uM)，QuantiTect RT混合物0.2ul以及无水RNase。每一反应使用20-40ng的模板RNA。利用Taqman 7700序列检测系统(Applied Biosystem Inc.)进行具有下述循环条件的QPCR：50℃30分钟，95℃15分钟，40个循环的94℃15s，55℃30s，72℃30s，然后保持在72℃2分钟。
QPCR测定用于测定Pro104 siRNA对基因转录水平的作用。
QPCR测定证明siRNA特异性敲除CaOV3细胞中的Pro104mRNA。图23A表明Pro104 siRNA与阴性对照相比在CaOV3细胞中不敲除非-Pro104 mRNA(GAPDH)。图23b证明Pro104 siRNA与阴性对照相比在CaOV3细胞中敲除Pro104 mRNA。
Pro104 siRNA的特异性不受细胞类型的限制。QPCR测定进一步证明了siRNA特异性敲除HeLa细胞中的Pro104 mRNA。图24A表明Pro104 siRNA与阴性对照相比在HeLa细胞中不敲除非-Pro104mRNA(GAPDH)。图24B证明Pro104 siRNA与阴性对照相比在HeLa细胞中敲除Pro104 mRNA。在HeLa细胞中观察到Pro104 75％的敲除(ΔCT＝2)。
必要的mRNA诸如DAXX的敲除导致细胞程序性死亡诱导。Michaelson 2002 supra；Olichen 2002，supra..QPCR实验证明Pro104mRNA的敲除也可导致细胞程序性死亡诱导。图25显示了与阳性对照相比Pro104 mRNA的Pro104 siRNA敲除在HeLa细胞诱导细胞程序性死亡(DAXX)。
此外，QPCR测定证实HeLa细胞中不同的Pro104 siRNA敲除Pro104 mRNA。图26B证明Pro104 siRNAs #56(SEQ ID NO：10)，#79(SEQ ID NO：11)，#80(SEQ ID NO：12)和#81(SEQ ID NO：13)与阴性对照(干扰的siRNA)相比敲除Pro104 mRNA。Pro104 mRNA通过针对Pro104 mRNA特异性设计的四个不同siRNA进行的敲除显示设计干扰Pro104 mRNA的siRNA可敲除Pro104 mRNA和蛋白表达。
实施例10：细胞程序性死亡分析
两个不同的测定试剂盒，膜联蛋白V分析和Caspase分析用于评价siRNA对细胞程序性死亡的作用。
利用“Apo-ONE均一的Caspase-3/7分析”试剂盒(Promega Inc.，Madison，WI)将测试细胞直接溶解在培养平板中且，按照生产商的指导测定反映为荧光读数的Caspase活性。
利用第二试剂盒，“Guava Nexin V-PE试剂盒”(Guava TechnologiesInc.)，通过胰酶消化收集处理的细胞并冲洗以及将约105细胞再悬浮在40ul的缓冲液中并且各添加5ul的膜联蛋白V(+)和7-AAD(-)。在冰上温育20分钟之后，利用Guava PCA机器按照生产商的教导分析细胞。
膜联蛋白V分析结果证明敲除Pro104 mRNA的不同Pro104siRNA诱导细胞程序性死亡。图26A表明Pro104 siRNAs #56(SEQ IDNO：10)，#79(SEQ ID NO：11)，#80(SEQ ID NO：12)和#81(SEQ IDNO：13)或DAXX siRNA与干扰的siRNA(阴性对照)相比在HeLa细胞中诱导细胞程序性死亡。
膜联蛋白V分析结果同样证明具有Pro104 siRNA的Pro104mRNA的特异性敲除诱导细胞死亡。图27A显示了当用Pro104 siRNA转染时与阴性对照(无siRNA，和干扰的siRNA)相比更大百分比的HeLa细胞早期就程序性死亡。另外，图27B显示了当用Pro104 siRNA转染时与阴性对照(无siRNA，和干扰的siRNA)相比更大百分比的HeLa细胞坏死。
通过膜联蛋白V测定，和Caspase测定证明了通过Pro104 siRNA的Pro104 mRNA的敲除诱导的细胞程序性死亡。图28A中膜联蛋白V测定的结果显示了当用Pro104 siRNA，或DAXX siRNA(阳性对照)转染时与干扰的(阴性对照)相比更大百分比的HeLa细胞程序性死亡性死亡。图28A中Caspase测定的结果显示了当用Pro104 siRNA，或DAXX siRNA(阳性对照)转染时与干扰的(阴性对照)相比更大百分比的HeLa细胞程序性死亡。
通过Pro104 siRNA的Pro104 mRNA敲除诱导的细胞程序性死亡不受细胞类型的限制。图29中膜联蛋白V测定的结果显示了当用Pro104 siRNA，或OPAI siRNA(阳性对照)转染时与干扰的(阴性对照)和无siRNA(阴性对照)相比更大百分比的CaOV3细胞程序性死亡。
通过Pro104 mRNA诱导的细胞程序性死亡取决于Pro104功能的丧失。Pro104 siRNA不诱导不表达Pro104的细胞中的细胞程序性死亡。图30A证明了不表达Pro104 mRNA的SKBR3细胞中的Pro104mRNA，Emerin mRNA(阳性对照，非必要的)和DAXX mRNA(阳性对照，必要的)的敲除水平。由于干扰siRNA和Pro104特异性siRNA在Pro104 mRNA的敲除水平没有差异，而与干扰siRNA相比特异性siRNA分别敲除50％和65％的伊默菌素和DAXX mRNA水平。
图30B中Caspase测定的结果证明当用Pro104 siRNA转染时不表达Pro104 mRNA的SKBR3细胞不进行细胞程序性死亡，而通过DAXX siRNA(阳性对照)的转染诱导细胞程序性死亡。此外，当用Emerin siRNA(非必要的)或干扰siRNA(阴性对照)转染时不表达Pro104mRNA的SKBR3细胞不进行细胞程序性死亡。
的图30A和30B的结果用作阴性对照显示Pro104 siRNA转染通过特异性敲除Pro104 mRNA和下调Pro104蛋白诱导细胞程序性死亡。
此外，Pro104被证明对于细胞存活是必要的。图30A和30B证明与干扰siRNA(阴性对照)相比非必要mRNA(Emerin)的敲除不诱导细胞程序性死亡。仅仅敲除必要的mRNA诸如DAXX(阳性对照)和Pro104将诱导细胞程序性死亡。
实施例11：软琼脂测定
利用6-微孔板(Corning，VWR)进行软琼脂测定。2ml的底部琼脂基层在Iscove培养基(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中包含0.8％的琼脂，10％FBS。将胰蛋白酶化细胞悬浮在0.4％琼脂，10％FBS的Iscove’s培养基中并在固化基体层上部施加5ml终体积。将三种不同的活细胞数的105，104和5×103细胞一式两份接种在每一6cm2孔琼脂中。将最终2ml包含0.8％琼脂，10％FBS的Iscove’s培养基的层施加在固化细胞层上。然后在克隆出现之前在具有5％CO2的恒温箱中37℃温育琼脂平板约2周时间。通过一周一次进料生长培养基来维持软琼脂。2和4周之间计算克隆数。siRNA转染后24-36小时，HeLa细胞被胰蛋白酶化并如上所述以每孔104细胞的密度铺板在软琼脂中。
进行软琼脂测定来评价Pro104过量表达，Pro104蛋白酶活性以及Pro104的敲除对细胞的影响。
图31证明Pro104的过量表达在软琼脂中诱导细胞生长。下表8显示图31中在软琼脂微孔板中观察到的各细胞类型的克隆数。
表8.软琼脂微孔板中的克隆数
  图   细胞类型   克隆数
  31A   RK3E-AP   0
  31B   RK3E-Pro104   60
  31C   RK3E-Pro104-HA   68
  31D   NCIH522(-control)   0
  31E   HCT116(+control)   ＞200
细胞生长所需的Pro104蛋白酶活性
用表达野生型Pro104蛋白(Pro104)有和没有C-末端血球凝集素标记(HA)的逆转录病毒载体感染RK3E细胞。另外，用在催化三价基(Pro104-mut)或碱性磷酸酶(AP-对照)内具有点突变表达缺少酶活的Pro104蛋白的逆转录病毒载体感染RK3E细胞。逆转录病毒感染后通过G418选择感染的细胞。
通过用直接抗Pro104的单克隆抗体的免疫印迹证明了Pro104蛋白在G418-选择的细胞集合中的表达，图32A。通过染色细胞单层评价AP在G418-选择的细胞中的表达，表明基本上所有细胞的AP活性为阳性(图32B)且，因此，大多数的G418-选择的细胞表达目的基因。然后将病毒-感染的，选择的细胞铺板在软琼脂中并监控克隆形成。亲本的RK3E细胞在测定条件下不形成任何克隆也不形成AP-表达细胞(图32C，32D)。然而，表达HA-标记(Pro104-HA)的细胞或证明蛋白异位表达的形成未标记的Pro104蛋白的克隆可促进转化(图32C，32D)。突变体Pro104(Pro104-mut)蛋白不能诱导RK3E细胞的软琼脂生长(图32C，32D)表明Pro104的催化功能是转化所需要的。
通过siRNA敲除Pro104 mRNA抑制细胞生长
如上所述，HeLa细胞中Pro104 mRNA和蛋白的特异性敲除导致细胞程序性死亡的增加，通过两种不同的方法测定。我们然后研究了Pro104的敲除是否可影响HeLa细胞在中形成克隆的能力。用干扰的Pro104-或DAXX-特异性siRNA处理HeLa细胞且随后铺板在软琼脂中来评价克隆形成。干扰siRNA用作诱导细胞程序性死亡的阴性对照而DAXX-特异性siRNA用作阳性对照。HeLa细胞在琼脂中形成大量的克隆并且如图33C和33F所证明的未受干扰siRNA的影响。相反，Pro104-和DAXX-特异性siRNA′s二者分别抑制约88％和80％所形成克隆的数目(分别见图33A和33B)。此外，用Pro104-和DAXX特异性siRNAs处理形成的克隆的大小和形态较小和有限(分别见图33D和33E)。
用siRNA转染后进行的QPCR表明与用干扰siRNA转染相比Pro104，DAXX和Emerin mRNA的水平降低了(图34A)。在此实验中，Pro104和DAXX siRNA′s能再次诱导Caspase活性而干扰和Emerin-特异性siRNA不能(图34B)。抗伊默菌素的siRNA对HeLa细胞形成克隆的能力没有影响。
结果
这些测定证明Pro104对细胞存活是必要的并且过量表达诱导细胞生长(图31)。通过siRNA进行的Pro104 mRNA的敲除(图23-26)降低诱导细胞程序性死亡(图27-30)的蛋白的表达(图21，22)。这些依次在软琼脂中产生较少的显示细胞程序性死亡的克隆和克隆大小和形态学(图33)。缺少蛋白酶活性的突变Pro104不诱导细胞生长证明Pro104活性是细胞生长必不可少的(图32)。
实施例12：肿瘤异体移植实验
为进一步评价Pro104的转化能力，将表达Pro104或AP的RK3E细胞皮下移植到裸的或SCID/Beige小鼠中并且监控肿瘤形成。
裸鼠中过量表达Pro104的卵巢肿瘤细胞的增加的生长
逆转录病毒-感染的，表达AP或Pro104的SKOV3或RK3E细胞的G418-选择的集合被皮下注射到裸鼠中。亲本的SKOV3细胞也被用作比较。对于SKOV3细胞而言，107的各类型与matrigel一起移植到6只小鼠中。对于RK3E细胞而言，5×106细胞移植到8只小鼠中，没有matrigel。通过触诊和卡钳测定监控肿瘤形成，其中可能4周时间内每4天进行一次。
动物模型证明了过量表达Pro104的人卵巢肿瘤细胞的生长。过量表达Pro104的SKOV3细胞与亲本SKOV3细胞(对照)或表达AP的SKOV3细胞(非-生长诱导对照)相比体积增加了。
另外，下述表9显示Pro104的过量表达促进裸鼠中皮下细胞异体移植的肿瘤形成。
表9.皮下细胞异体移植中的肿瘤形成
                          RK3E细胞系
  5×106移植的细胞   通过4周具有小瘤*或肿瘤**的小鼠数#
  AP(阴性对照)   0/8
  Pro104   8/8*
  V-Ras(阳性对照)   8/8**
这些动物模型证明Pro104过量表达的细胞生长和形成小瘤。
SCID小鼠中过量表达Pro104的卵巢肿瘤细胞生长的增加
逆转录病毒-感染的，表达AP或Pro104的SKOV3或RK3E细胞的G418-选择的集合被皮下注射到SCID/Beige小鼠(Charles RiverLaboratories)中。如所显示的使用九只或十只小鼠。对于SKOV3细胞而言，在100ul PBS中的107细胞与matrigel一起移植，且对于RK3E细胞而言，移植5×106的100μl PBS溶液中的细胞，没有利用matrigel。通过触诊和卡钳测定监控肿瘤形成并利用公式：(长度×宽度2)/2计算肿瘤体积。图36A和36C的图示显示了随着时间的平均组肿瘤体积。所有动物试验完全遵从学会原则来进行。
为研究SKOV3异体移植，进行单因子ANOVA来测定在最后一天测定的对照和Pro104组之间的肿瘤体积是否有差别。结果表明两个组不具有相同肿瘤体积的概率＞99.0％。此外，进行成对两-样品t-检验假定不等方差与Bonferroni校正分析比较SKOV3-testisin肿瘤与SKOV3-对照肿瘤。最后一天测定数据的分析揭示SKOV3-Pro104肿瘤比SKOV3-对照肿瘤具有99.0％置信水平的显著较大的体积。
KR3E-Pro104肿瘤细胞生长
用表达Pro104的RK3E细胞移植的九只小鼠中的九只产生大的肿瘤而用AP-表达细胞移植的小鼠均没有形成肿瘤(图35A)。异体移植研究结束时获取肿瘤并通过免疫印迹评价Pro104的存在。肿瘤以在植入之前的感染RK3E细胞中观察到的类似水平维持Pro104蛋白的表达。
SKOV3-Pro104肿瘤细胞生长
我们然后通过人SKOV3卵巢癌细胞系评价异位Pro104表达对肿瘤形成的影响，人SKOV3卵巢癌细胞系的选择是基于其不表达内源Pro104 mRNA也不表达Pro104蛋白的目的(通过免疫印迹评价-图35D)。用表达Pro104的逆转录病毒或AP对照感染SKOV3细胞然后进行G418-选择。通过免疫印迹证明所选择细胞中Pro104蛋白的表达(图35D)。AP对照和表达Pro104的SKOV3细胞皮下移植到SCID/Beige小鼠中并监控肿瘤形成。已知如SKOV3癌细胞作为异体移植物在小鼠中形成肿瘤。如所预料的，AP对照-表达SKOV3细胞作为异体移植物时也能够生长，其中10小鼠中全部形成肿瘤(图35C)。然而，在与AP-对照细胞相比时，表达异位Pro104蛋白的细胞在整个过程中自始至终形成较大的肿瘤(图35C)。数据统计分析表明SKOV3-Pro104肿瘤增加的大小与AP对照-SKOV3肿瘤相比是显著的。
实施例13：抗-Pro104分子与抗-血管生成和抗-血管分子组合
血管生成在许多生理过程诸如胚胎发生，伤口愈合，和月经中以及在特定的病理事件诸如实体肿瘤生长和转移，关节炎，牛皮癣，和糖尿病视网膜病中起关键的作用。
另外，血管靶向剂，其选择性地破坏肿瘤血管，可以是对于治疗实体肿瘤的有前景的药物。它们不同于抗-血管生成剂，因为它们靶向肿瘤成熟的血液-导管。它们最适合用于其中较小发生血管生成的较大的肿瘤。血管靶向剂包括结合于特异性靶或复合物的抗体。为应用于人，在肿瘤的血管内皮选择性表达的靶分子是所需要的
除靶向Pro104调节表达Pro104的肿瘤的生长之外，靶向血管生成相关分子或血管相关分子以及复合物可用来增强抗-Pro104治疗。具体而言，抗-Pro104抗体可以与特异性靶向血管生成相关分子或血管相关分子以及复合物减慢、终止、复原、反转或抑制表达Pro104的肿瘤的生长或转移的抗体结合使用。
参见Feng D.，等.J Histochem Cytochem.2000 Apr；48(4)：545-56；Brekken RA.，等l.Cancer Res.2000 Sep 15；60(18)：5117-24；BrekkenRA.，等，Anticancer Res.2001 Nov-Dec；21(6B)：4221-9；and Brekken RA.，等Int J Cancer.2002 Jul 10；100(2)：123-30.
抗-Pro104抗体与抗-VEGF抗体组合
血管通透因子/血管内皮生长因子(VPF/VEGF)是一种能使血浆蛋白质透过血管内皮以及改编内皮细胞基因表达来诱导血管生成的有效的多功能细胞因子。VPF/VEGF由许多肿瘤以及活性巨噬细胞、角质细胞、滑膜细胞、各种胚细胞以及培养上皮和间质细胞系分泌。有至少五种VEGF的剪接变体，编码121，145，165，189和206个氨基酸的蛋白。具有121，145或165个氨基酸的较小形式由细胞分泌。分泌的VEGF是Mr 38,000-Mr 46,000的专性二聚体，其中单体通过两个二硫键连接。VEGF二聚体结合于两个已较好鉴定的受体，VEGFR1(FLT-1)和VEGFR2(KDR/Flk-1)中的一个，VEGFR1(FLT-1)和VEGFR2(KDR/Flk-1)在内皮细胞上选择性表达。最近鉴定的第三细胞表面蛋白，neuropilin-1，结合具有高亲合性的VEGF165。VPF/VEGF结合于这些在血管内皮中选择性表达的受体诱导其生物效应。
抗-Pro104抗体可以与抗-VEGF抗体结合使用来减慢、终止、复原、反转或抑制表达Pro104的肿瘤的生长或转移。
抗-Pro104抗体与抗-VEGF受体抗体相组合
VEGFR1和VEGFR2为III型受体酪氨酸激酶家族的成员，其特征为具有七个胞外IgG类重复，一个单跨膜结构域，以及一个胞内分裂的酪氨酸激酶功能域。两种受体在过量表达VPF/VEGF的肿瘤，伤口，以及在特定类型的炎症(例如，风湿性关节炎，牛皮癣)中被显著地上调。在分泌VPF/VEGF的肿瘤及其受体之间形成的复合物已被公认作为有前景的潜在靶用于抗血管生成治疗。VEGF结合于分别具有15-100pM和400-800pM的Kd(解离常数)的高亲合性VEGFR1和VEGFR2。VEGFR2好象是VEGF-诱导的有丝分裂和渗透中的主要信号受体。
通过原位杂交VEGFR-1和VEGFR-2二者的表达已被定位于正常肾脏的微脉管内皮和肿瘤，治愈伤口以及炎性位点。VEGFR-2也被通过光显微免疫组织化学鉴定存在于人胎盘，乳腺癌，以及胃癌的血管中。参见
抗-Pro104抗体可以与抗-VEGF-1，VEGFR-2或neuropilin-1的抗体组合使用来减慢、终止、复原、反转或抑制表达Pro104的肿瘤的生长或转移。
抗-Pro104抗体与抗-血管靶向抗体相组合
血管靶向抗体特异性结合于血管相关标记。这种标记包括当血管内皮生长因子(VEGF)结合于其受体(VEGFR)时形成的复合物。通过肿瘤细胞制备的VEGF被通过致癌基因突变以及通过肿瘤块内的低氧条件进行诱导。受体，VEGFR1(FLT-1)和VEGFR2(KDR/Flk-1)，被通过低氧以及通过增加VEGF的局部浓度在肿瘤血管内皮细胞上进行上调。因此，在肿瘤血管内皮上有高浓度的受体。
具有结合于VEGF:VEGFR复合物的靶向血管的单克隆抗体以及它们作为肿瘤血管靶向剂的用途是本领域技术人员公知的。阻断VEGF结合于VEGFR2而不是VEGFR1的抗体可能具有作为通过抑制VEGFR2活性的抗-血管生成剂以及作为选择性递送药物到肿瘤脉管的血管靶向药物的双重活性。
抗-Pro104抗体可以与抗VEGF:VEGFR复合物的抗体结合使用来减慢、终止、复原、反转或抑制表达Pro104的肿瘤的生长或转移。抗体的实例包括但不限于抗-Pro104，Pro104.C1，Pro104.C4，Pro104.C13，Pro104.C17，Pro104.C18，Pro104.C19，Pro104.C24，Pro104.C25，Pro104.C27，Pro104.C34，Pro104.C37，Pro104.C46，Pro104.C48，Pro104.C49，Pro104.C50，Pro104.C53，Pro104.C54，Pro104.C55，Pro104.C57，Pro104.C60，Pro104.C66，Pro104.C75，Pro104.C84，Pro104.D4，Pro104.D6，Pro104.D9，Pro104.D12，Pro104.D14，Pro104.D18，Pro104.D19，Pro104.D20，Pro104.D21，Pro104.D26，Pro104.D29，Pro104.D31，Pro104.D43，Pro104.D47，Pro104.D51，Pro104.D55，Pro104.D56，Pro104.D58，Pro104.D62，Pro104.D63，Pro104.D64，Pro104.D68，Pro104.D69，Pro104.D75，Pro104.D81，Pro104.D85，Pro104.D88，Pro104.D91，Pro104.D94，Pro104.D102，Pro104.D106，，Pro104.D111，Pro104.D112，Pro104.D113，Pro104.D114，Pro104.D115，Pro104.D116，Pro104.D117，Pro104.D118，Pro104.D119，Pro104.D120，Pro104.D121，Pro104.D122，Pro104.D123，Pro104.D，Pro104.D124，Pro104.D125，Pro104.D126，Pro104.D127，Pro104.D，Pro104.D128，Pro104.D129，Pro104.D130，Pro104.D131，Pro104.D132，Pro104.D133，Pro104.D134，Pro104.D135，Pro104.D136，Pro104.D137，Pro104.D138，Pro104.D139，Pro104.K14，Pro104.K15，Pro104.K16，Pro104.K47，Pro104.K71，Pro104.K72，Pro104.K74，Pro104.K75，Pro104.K76，Pro104.K78，Pro104.K81，Pro104.K87，Pro104.K88，Pro104.K89，Pro104.K155，Pro104.K156，Pro104.K157，Pro104.K158，Pro104.K159，Pro104.K160，Pro104.K163，Pro104.K164，Pro104.K176，Pro104.K217，Pro104.K226，Pro104.K227，Pro104.K240，Pro104.K274，Pro104.K264，Pro104.K281，Pro104.K358或Pro104.K362；抗-VEGF，bevacizumab(Avastin；Genentech Inc.，SouthSan Francisco，CA；Rini等，Clin Cancer Res.2004 Apr 15；10(8)：2584-6)，infliximab(Canete等，Arthritis Rheum.2004 May；50(5)：1636-41，Klimiuk等，Arch Immunol Ther Exp(Warsz).2004 Jan-Feb；52(1)：36-42)；抗-VEGF-R，vatalanib(Manley等，Biochim Biophys Acta.2004 Mar11；1697(1-2)：17-27)；抗-VEGF-R2，DC101(Tong等，Cancer Res.2004Jun 1；64(11)：3731-6，Kiessling等，Neoplasia.2004 May-Jun；6(3)：213-23)；抗-VEGF-3，hF4-3C5(Persaud等，J Cell Sci.2004 Jun 1；117(Pt13)：2745-56)。此外，可使用EGFR的联合治疗例如，抗-EGFR，cetuximab，C225(Andre等，Bull Cancer.2004 Jan；91(1)：75-80)，gefitinib，ZD1839(Ciardiello等，Clin Cancer Res.2004 Jan 15；10(2)：784-93)。
实施例14：细胞系和DNA的保藏
杂交瘤细胞系保藏在位于10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A的美国典型培养物保藏中心(ATCC)，且获得了保藏号。
下列杂交瘤细胞系保藏在ATCC：pro104.c55.1，Pro104.C25.1，Pro104.D9.1和Pro104.K81.15。为了方便起见，可缩短上述保藏的杂交瘤细胞系的名称。例如A01.1相当于Pro104.A01.1。另外，保藏的杂交瘤细胞系的名字可能含有或可能不含有由杂交瘤克隆分离“Pro104”的时间标记。例如Pro104 C55.1相当于Pro104.C55.1。这些杂交瘤相当于保藏在ATCC的克隆(具有其全名)。表10列举保藏在ATCC的杂交瘤克隆，所给予的ATCC保藏号，以及保藏的日期。
表1010：ATCC保藏
  杂交瘤   ATCC登记号No.   保藏日期
  Pro104.C55.1   PTA-5277   2003年6月23
  Pro104.C25.1   PTA-6076   2004年6月15  24
  Pro104.D9.1   PTA-6077   2004年6月15  24
  Pro104.K81.15   PTA-6078   12004年6月15  24
依据布达佩斯条约，按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏以及在其管理下(布达佩斯条约)进行这些保藏。此确保由保藏日期起30年内维持活体培养。通过ATCC按照布达佩斯条约条款以及diaDexus公司与ATCC之间的协议可获得该生物，其确保当颁布相关美国专利或将任何美国或外国专利申请公布于时无论哪个首先出现，公众都可稳定的和无限制的利用培养的子代，以及确保美国专利与商标局局长按照35USC§122和专利局长章程(包括37CFR§1.14，具体参照886 OG 638)授权时可以获得子代。
本申请的受让人同意在适宜条件下培养时如果保藏的培养物死亡或丢失或破坏，它们将在被通知时用有活性的相同培养物的样品迅速地更换。保藏株的的可获得性不应被理解为违反在任何政府机构根据其专利法授予的权利的情况下的实施许可。这些保藏的进行决不是承认保藏是进行本发明所必需的。
                                序列表
<110>迪亚德科瑟斯公司(diaDexus，Inc.)
<120>Pro104抗体组合物及其使用方法(Pro104 Antibody Compositions and Methodsof Use)
<130>SCT055763-66
<150>US 60/523,271
<151>2003-11-17
<150>US 60/485,346
<151>2003-06-27
<160>38
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>288
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Met Ala Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ser Gly Pro Cys
1               5                   10                  15
Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly Glu Asp Ala Glu
            20                  25                  30
Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ser His
        35                  40                  45
Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala Leu Thr Ala Ala
    50                  55                  60
His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro Ser Gly Trp Met
65                  70                  75                  80
Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe Trp Ser Leu Gln
                85                  90                  95
Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr Leu Ser Pro Arg
            100                 105                 110
Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val Lys Leu Ser Ala
        115                 120                 125
Pro Val Thr Tyr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys Leu Gln Ala Ser
    130                 135                 140
Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val Thr Gly Trp Gly
145                 150                 155                 160
Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His Thr Leu Gln Glu
                165                 170                 175
Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn His Leu Phe Leu
            180                 185                 190
Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met Val Cys Ala Gly
        195                 200                 205
Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly Pro
    210                 215                 220
Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Val Val Ser
225                 230                 235                 240
Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Thr Asn
                245                 250                 255
Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met Ala Gln Ser Gly
            260                 265                 270
Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Leu Glu His His His His His His
        275                 280                 285
<210>2
<211>287
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1               5                   10                  15
Ser Tyr Ile Tyr Ala Asp Pro Met Ala Ile Val Gly Gly Glu Asp Ala
            20                  25                  30
Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ser
        35                  40                  45
His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala Leu Thr Ala
    50                  55                  60
Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro Ser Gly Trp
65                  70                  75                  80
Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe Trp Ser Leu
                85                  90                  95
Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr Leu Ser Pro
            100                 105                 110
Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val Lys Leu Ser
        115                 120                 125
Ala Pro Val Thr Tyr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys Leu Gln Ala
    130                 135                 140
Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val Thr Gly Trp
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His Thr Leu Gln
                165                 170                 175
Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn His Leu Phe
            180                 185                 190
Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met Val Cys Ala
        195                 200                 205
Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly
    210                 215                 220
Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Val Val
225                 230                 235                 240
Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Thr
                245                 250                 255
Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met Ala Gln Ser
            260                 265                 270
Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp His His His His His His
        275                 280                 285
<210>3
<211>340
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala Arg Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ser Gly Pro
            20                  25                  30
Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly Glu Asp Ala
        35                  40                  45
Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ser
    50                  55                  60
His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala Leu Thr Ala
65                  70                  75                  80
Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro Ser Gly Trp
                85                  90                  95
Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe Trp Ser Leu
            100                 105                 110
Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr Leu Ser Pro
        115                 120                 125
Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val Lys Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Pro Val Thr Tyr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys Leu Gln Ala
145                 150                 155                 160
Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val Thr Gly Trp
                165                 170                 175
Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His Thr Leu Gln
            180                 185                 190
Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn His Leu Phe
        195                 200                 205
Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met Val Cys Ala
    210                 215                 220
Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Val Val
                245                 250                 255
Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Thr
            260                 265                 270
Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met Ala Gln Ser
        275                 280                 285
Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu Phe Phe Pro Leu
    290                 295                 300
Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val Asp Pro Ala Phe Leu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Val Val Arg Ser Arg Met Ala Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
                325                 330                 335
Tyr Ala Ser Leu
            340
<210>4
<211>314
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala Arg Ala
1               5                   10                  15
Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ser Gly Pro
            20                  25                  30
Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly Glu Asp Ala
        35                  40                  45
Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ser
    50                  55                  60
His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala Leu Thr Ala
65                  70                  75                  80
Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro Ser Gly Trp
                85                  90                  95
Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe Trp Ser Leu
            100                 105                 110
Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr Leu Ser Pro
         115                120                 125
Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val Lys Leu Ser
    130                 135                 140
Ala Pro Val Thr Tyr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys Leu Gln Ala
145                 150                 155                 160
Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val Thr Gly Trp
                165                 170                 175
Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His Thr Leu Gln
            180                 185                 190
Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn His Leu Phe
        195                 200                 205
Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met Val Cys Ala
    210                 215                 220
Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Val Val
                245                 250                 255
Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Thr
            260                 265                 270
Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met Ala Gln Ser
        275                 280                 285
Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu Phe Phe Pro Leu
    290                 295                 300
Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val
305                 310
<210>5
<211>486
<212>PRT
<213> Homo sapiens
<400>5
Met Ala Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
    210                 215                 220
His Asn Gln Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Phe Glu Asn Leu Tyr
225                 230                 235                 240
Phe Gln Gly Val Val Gly Gly Glu Glu Ala Ser Val Asp Ser Trp Pro
                245                 250                 255
Trp Gln Val Ser Ile Gln Tyr Asp Lys Gln His Val Cys Gly Gly Ser
            260                 265                 270
Ile Leu Asp Pro His Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Arg Lys
        275                 280                 285
His Thr Asp Val Phe Asn Trp Lys Val Arg AIa Gly Ser Asp Lys Leu
    290                 295                 300
Gly Ser Phe Pro Ser Leu Ala Val Ala Lys Ile Ile Ile Ile Glu Phe
305                 310                 315                 320
Asn Pro Met Tyr Pro Lys Asp Asn Asp Ile Ala Leu Met Lys Leu Gln
                325                 330                 335
Phe Pro Leu Thr Phe Ser Gly Thr Val Arg Pro Ile Cys Leu Pro Phe
            340                 345                 350
Phe Asp Glu Glu Leu Thr Pro Ala Thr Pro Leu Trp Ile Ile Gly Trp
        355                 360                 365
Gly Phe Thr Lys Gln Asn Gly Gly Lys Met Ser Asp Ile Leu Leu Gln
    370                 375                 380
Ala Ser Val Gln Val Ile Asp Ser Thr Arg Cys Asn Ala Asp Asp Ala
385                 390                 395                 400
Tyr Gln Gly Glu Val Thr Glu Lys Met Met Cys Ala Gly Ile Pro Glu
                405                 410                 415
Gly Gly Val Asp Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Tyr
            420                 425                 430
Gln Ser Asp Gln Trp His Val Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly
        435                 440                 445
Cys Gly Gly Pro Ser Thr Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Ala Tyr
    450                 455                 460
Leu Asn Trp Ile Tyr Asn Val Trp Lys Ala Glu Leu Ser Asn Trp Ser
465                 470                 475                 480
His Pro Gln Phe Glu Lys
                485
<210>6
<211>391
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
Met Lys Val Ile Leu Asp Lys Tyr Tyr Phe Leu Cys Gly Gln Pro Leu
1               5                   10                  15
His Phe Ile Pro Arg Lys Gln Leu Cys Asp Gly Glu Leu Asp Cys Pro
            20                  25                  30
Leu Gly Glu Asp Glu Glu His Cys Val Lys Ser Phe Pro Glu Gly Pro
        35                  40                  45
Ala Val Ala Val Arg Leu Ser Lys Asp Arg Ser Thr Leu Gln Val Leu
    50                  55                  60
Asp Ser Ala Thr Gly Asn Trp Phe Ser Ala Cys Phe Asp Asn Phe Thr
65                  70                  75                  80
Glu Ala Leu Ala Glu Thr Ala Cys Arg Gln Met Gly Tyr Ser Ser Lys
                85                  90                  95
Pro Thr Phe Arg Ala Val Glu Ile Gly Pro Asp Gln Asp Leu Asp Val
            100                 105                 110
Val Glu Ile Thr Glu Asn Ser Gln Glu Leu Arg Met Arg Asn Ser Ser
        115                 120                 125
Gly Pro Cys Leu Ser Gly Ser Leu Val Ser Leu His Cys Leu Ala Cys
    130                 135                 140
Gly Lys Ser Leu Lys Thr Pro Arg Val Val Gly Gly Glu Glu Ala Ser
145                 150                 155                 160
Val Asp Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Ile Gln Tyr Asp Lys Gln His
                165                 170                 175
Val Cys Gly Gly Ser Ile Leu Asp Pro His Trp Val Leu Thr Ala Ala
            180                 185                 190
His Cys Phe Arg Lys His Thr Asp Val Phe Asn Trp Lys Val Arg Ala
        195                 200                 205
Gly Ser Asp Lys Leu Gly Ser Phe Pro Ser Leu Ala Val Ala Lys Ile
    210                 215                 220
Ile Ile Ile Glu Phe Asn Pro Met Tyr Pro Lys Asp Asn Asp Ile Ala
225                 230                 235                 240
Leu Met Lys Leu Gln Phe Pro Leu Thr Phe Ser Gly Thr Val Arg Pro
                245                 250                 255
Ile Cys Leu Pro Phe Phe Asp Glu Glu Leu Thr Pro Ala Thr Pro Leu
            260                 265                 270
Trp Ile Ile Gly Trp Gly Phe Thr Lys Gln Asn Gly Gly Lys Met Ser
        275                 280                 285
Asp Ile Leu Leu Gln Ala Ser Val Gln Val Ile Asp Ser Thr Arg Cys
    290                 295                 300
Asn Ala Asp Asp Ala Tyr Gln Gly Glu Val Thr Glu Lys Met Met Cys
305                 310                 315                 320
Ala Gly Ile Pro Glu Gly Gly Val Asp Thr Cys Gln Gly Asp Ser Gly
                325                 330                 335
Gly Pro Leu Met Tyr Gln Ser Asp Gln Trp His Val Val Gly Ile Val
            340                 345                 350
Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Gly Gly Pro Ser Thr Pro Gly Val Tyr Thr
        355                 360                 365
Lys Val Ser Ala Tyr Leu Asn Trp Ile Tyr Asn Val Trp Lys Ala Glu
    370                 375                 380
Leu His His His His His His
385                 390
<210>7
<211>461
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
Met Asp Pro Asp Ser Asp Gln Pro Leu Asn Ser Leu Asp Val Lys Pro
1               5                   10                  15
Leu Arg Lys Pro Arg Ile Pro Met Glu Thr Phe Arg Lys Val Gly Ile
            20                  25                  30
Pro Ile Ile Ile Ala Leu Leu Ser Leu Ala Ser Ile Ile Ile Val Val
        35                  40                  45
Val Leu Ile Lys Val Ile Leu Asp Lys Tyr Tyr Phe Leu Cys Gly Gln
    50                  55                  60
Pro Leu His Phe Ile Pro Arg Lys Gln Leu Cys Asp Gly Glu Leu Asp
65                  70                  75                  80
Cys Pro Leu Gly Glu Asp Glu Glu His Cys Val Lys Ser Phe Pro Glu
                85                  90                  95
Gly Pro Ala Val Ala Val Arg Leu Ser Lys Asp Arg Ser Thr Leu Gln
            100                 105                 110
Val Leu Asp Ser Ala Thr Gly Asn Trp Phe Ser Ala Cys Phe Asp Asn
        115                 120                 125
Phe Thr Glu Ala Leu Ala Glu Thr Ala Cys Arg Gln Met Gly Tyr Ser
    130                 135                 140
Ser Lys Pro Thr Phe Arg Ala Val Glu Ile Gly Pro Asp Gln Asp Leu
145                 150                 155                 160
Asp Val Val Glu Ile Thr Glu Asn Ser Gln Glu Leu Arg Met Arg Asn
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Pro Cys Leu Ser Gly Ser Leu Val Ser Leu His Cys Leu
            180                 185                 190
Ala Cys Gly Lys Ser Leu Lys Thr Pro Arg Val Val Gly Gly Glu Glu
        195                 200                 205
Ala Ser Val Asp Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Ile Gln Tyr Asp Lys
    210                 215                 220
Gln His Val Cys Gly Gly Ser Ile Leu Asp Pro His Trp Val Leu Thr
225                 230                 235                 240
Ala Ala His Cys Phe Arg Lys His Thr Asp Val Phe Asn Trp Lys Val
                245                 250                 255
Arg Ala Gly Ser Asp Lys Leu Gly Ser Phe Pro Ser Leu Ala Val Ala
            260                 265                 270
Lys Ile Ile Ile Ile Glu Phe Asn Pro Met Tyr Pro Lys Asp Asn Asp
        275                 280                 285
Ile Ala Leu Met Lys Leu Gln Phe Pro Leu Thr Phe Ser Gly Thr Val
    290                 295                 300
Arg Pro Ile Cys Leu Pro Phe Phe Asp Glu Glu Leu Thr Pro Ala Thr
305                 310                 315                 320
Pro Leu Trp Ile Ile Gly Trp Gly Phe Thr Lys Gln Asn Gly Gly Lys
                325                 330                 335
Met Ser Asp Ile Leu Leu Gln Ala Ser Val Gln Val Ile Asp Ser Thr
            340                 345                 350
Arg Cys Asn Ala Asp Asp Ala Tyr Gln Gly Glu Val Thr Glu Lys Met
        355                 360                 365
Met Cys Ala Gly Ile Pro Glu Gly Gly Val Asp Thr Cys Gln Gly Asp
    370                 375                 380
Ser Gly Gly Pro Leu Met Tyr Gln Ser Asp Gln Trp His Val Val Gly
385                 390                 395                 400
Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Gly Gly Pro Ser Thr Pro Gly Val
                405                 410                 415
Tyr Thr Lys Val Ser Ala Tyr Leu Asn Trp Ile Tyr Asn Val Trp Lys
            420                 425                 430
Ala Glu Leu Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val Arg Ser Arg Met
        435                 440                 445
Ala Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu
    450                 455                 460
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>8
atgggcgcgc gcggggcgct gctgctg                                         27
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>9
ttatcagacc ggccccagga gtgggagagc cca                                  33
<210>10
<211>63
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>10
ttatcacgcg tagtccggca cgtcgtacgg gtagccgacc ggccccagga gtgggagagc     60
cca                                                                   63
<210>11
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>11
cacauccagc ccaucuguc                                                  19
<210>12
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>12
gaggaugagg cacugccau                                                  19
<210>13
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>13
cucuaugugc aaccaccuc                                                  19
<210>14
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>14
guacaguuuc cgcaaggac                                                  19
<210>15
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>15
uucuccgaac gugucacgu                                                  19
<210>16
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>16
ccgugcuccu ggggcuggg                                                  19
<210>17
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>17
ggaguuggau cucucagaa                                                  19
<210>18
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>18
guuaucaguc ugagccagg                                                  19
<210>19
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>19
gccggagucg caggaggcg                                                  19
<210>20
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>20
cucgggcguu ggccguggc                                                  19
<210>21
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>21
accuauagug accuuagug                                                  19
<210>22
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>22
ccuauaguga ccuuaguga                                                  19
<210>23
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>23
uucacccuau gacauugcc                                                  19
<210>24
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>24
gcugucugca ccugucacc                                                  19
<210>25
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>25
ccggacagac ugcugggug                                                  19
<210>26
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>26
agaggaugag gcacugcca                                                  19
<210>27
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>27
guucaggucg ccaucauaa                                                  19
<210>28
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>28
ggacaucuuu ggagacaug                                                  19
<210>29
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>29
caagaaugga cugugguau                                                  19
<210>30
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>30
gaauggacug ugguaucag                                                  19
<210>31
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>31
uggacugugg uaucagauu                                                  19
<210>32
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>32
ucggcccggu gucuacacc                                                  19
<210>33
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>33
uaucagccac cacuuugag                                                  19
<210>34
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>34
gucaggcccu gguucucuu                                                  19
<210>35
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>35
uaaacacauu ccaguugau                                                  19
<210>36
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>36
uaaacacauu ccaguugau                                                  19
<210>37
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>37
acacauucca guugaugcc                                                  19
<210>38
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic
<400>38
cacauuccag uugaugccu                                                  19

Claims (71)

1.分离的Pro104抗体，体内结合在哺乳动物细胞Pro104上。
2.权利要求1的抗体，其在体内结合于哺乳动物细胞上Pro104后被内在化。
3.权利要求1或者2的抗体，其为单克隆抗体。
4.权利要求1或者2的抗体，其为抗体片段。
5.权利要求1或者2的抗体，其为嵌合或人源化抗体。
6.权利要求3的抗体，其由选自美国典型培养物保藏中心保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生。
7.权利要求3的抗体，其中抗体竞争结合与由选自ATCC保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生的单克隆抗体结合的相同的表位。
8.权利要求3的抗体，其结合于生长抑制剂。
9.权利要求3的抗体，其结合于细胞毒剂。
10.权利要求9的抗体，其中所述细胞毒剂选自毒素，抗生素，放射性同位素以及核酸降解酶。
11.权利要求10的抗体，其中的细胞毒剂是毒素。
12.权利要求11的抗体，其中的毒素选自蓖麻毒，皂苷，maytansinoid以及卡奇霉素。
13.权利要求12的抗体，其中的细胞毒剂是maytansinoid。
14.权利要求3的抗体，其中的细胞哺乳动物是癌细胞。
15.抗Pro104单克隆抗体，其选择性结合于表达Pro104的细胞。
16.抗Pro104单克隆抗体，其抑制表达Pro104的癌细胞的体内生长。
17.权利要求16的抗体，其是人源化或者人的抗体。
18.权利要求17的抗体，其在细菌中产生。
19.权利要求15的抗体，其是由选自ATCC保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生的抗Pro104抗体的人源化形式。
20.权利要求16的抗体，其中的癌细胞来自于选自乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌的癌症。
21.权利要求20的抗体，其中的癌细胞是卵巢或胰腺癌细胞。
22.产生权利要求3的抗体的细胞。
23.权利要求22的细胞，其中的细胞选自美国典型培养物保藏中心登录号PTA-5277，6076，6077以及6078保藏的杂交瘤细胞。
24.产生权利要求3的抗体的方法，包括培养合适的细胞以及从细胞培养物回收抗体。
25.包括权利要求3或权利要求15的抗体以及载体的组合物。
26.权利要求25的组合物，其中的抗体结合于细胞毒剂。
27.权利要求26的组合物，其中的细胞毒剂是maytansinoid。
28.权利要求25的组合物，其中的抗体是人或人源化抗体并且载体是药物载体。
29.权利要求28的组合物，其中的人源化抗体是由选自ATCC保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生的抗Pro104抗体的人源化形式。
30.杀伤表达Pro104的癌细胞的方法，包括将癌细胞与权利要求1或权利要求2的抗体接触，由此杀伤癌细胞。
31.权利要求30的方法，其中的癌细胞来自于选自乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌的癌症。
32.权利要求31的方法，其中的癌细胞是卵巢或胰腺癌细胞。
33.权利要求31的方法，其中卵巢癌是卵巢浆液腺癌或者乳腺癌是浸润性乳腺管癌。
34.权利要求31的方法，其中的癌细胞来自于转移性的乳腺，卵巢，胰腺或者肺癌。
35.权利要求30的方法，其中的抗体是抗体片段。
36.权利要求30的方法，其中的抗体是人源化抗体。
37.权利要求30的方法，其中的抗体结合于细胞毒剂。
38.权利要求37的方法，其中的细胞毒剂是选自maytansinoid，蓖麻毒，皂草素以及卡奇霉素的毒素。
39.权利要求30的方法，其中的抗体是由选自ATCC保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生的抗体的人源化形式。
40.权利要求37的方法，其中的细胞毒剂是放射性同位素。
41.缓解哺乳动物表达Pro104的癌症的方法，包括给哺乳动物施用治疗有效量的权利要求15的抗体。
42.权利要求41的方法，其中的癌症选自乳腺，卵巢，胰腺以及肺癌。
43.权利要求42的方法，其中卵巢癌是卵巢浆液腺癌或者乳腺癌是浸润性乳腺管癌。
44.权利要求41的方法，其中的抗体是人源化抗体。
45.权利要求41的方法，其中的抗体结合于细胞毒剂。
46.权利要求40的方法，其中的细胞毒剂是maytansinoid。
47.权利要求46的方法，其中的抗体连同至少一种化疗剂一起施用。
48.权利要求47的方法，其中的化疗剂是太平洋紫杉醇或者其衍生物。
49.制品，包括容器以及容纳于其中的组合物，其中组合物包括权利要求3的抗体。
50.权利要求49的制品，进一步包括指明组合物可用于治疗乳腺，卵巢，胰腺或者肺癌的包装说明书。
51.确定样品中的细胞是否表达Pro104的方法，包括
(a)将细胞的样品与权利要求3的Pro104抗体在适合于Pro104抗体与Pro104特异性结合的条件下接触以及
(b)确定样品中抗体与细胞的结合水平，或者所述样品中细胞内在化Pro104抗体的水平，
其中Pro104抗体与样品中的细胞结合或者Pro104抗体由样品中的细胞内在化显示样品中的细胞表达Pro104。
52.权利要求51的方法，其中所述的细胞样品与由选自ATCC保藏号PTA-5277，6076，6077以及6078的杂交瘤产生的抗体接触。
53.权利要求51的方法，其中所述细胞的样品来自于患有癌症，怀疑患有癌症或者具有发展癌症的倾向的受试者。
54.权利要求53的方法，其中的癌症是乳腺，卵巢，胰腺或者肺癌。
55.权利要求51的方法，其中所述抗体是标记的抗体。
56.检测试验细胞样品中Pro104超量表达的方法，包括：
(a)将试验细胞样品与权利要求3的Pro104抗体在适合于Pro104与所述试验样品中表达Pro104的细胞特异性结合的条件下接触
(b)确定pro104抗体与试验样品中细胞结合的水平，
(c)将与步骤(b)中的细胞结合的Pro104抗体的水平与对照细胞样品中细胞结合的Pro104抗体的水平进行比较，
其中与对照相比试验细胞样品中Pro104抗体结合的增加显示试验细胞样品中细胞超量表达Pro104。
57.权利要求56的方法，其中的试验细胞样品是癌细胞样品。
58.权利要求57的方法，其中的癌细胞样品为乳腺，卵巢，胰腺或者肺癌。
59.权利要求58的方法，其中卵巢癌是卵巢浆液腺癌或者乳腺癌是浸润性乳腺管癌。
60.权利要求57的方法，其中的试验是相邻正常组织的样品。
61.检测需要的受试者Pro104超量表达的方法，包括：
(a)将受试者的血清样品与权利要求3的Pro104抗体在适合于Pro104抗体与所述血清样品中Pro104特异性结合的条件下组合
(b)确定血清样品中Pro104的水平，
(c)将步骤b中确定的Pro104的水平与对照中Pro104的水平相比较，
其中与对照相比受试者血清样品中Pro104的水平的增加显示受试者Pro104的超量表达。
62.权利要求61的方法，其中的受试者患有癌症。
63.权利要求62的方法，其中受试者患有乳腺，卵巢，胰腺或者肺癌或者其转移性的癌症。
64.权利要求63的方法，其中卵巢癌是卵巢浆液腺癌或者乳腺癌是浸润性乳腺管癌。
65.权利要求61的方法，其中对照是来自未患有超量表达Pro104的癌症的受试者。
66.筛选与权利要求3的抗体结合的表位结合的抗体的方法，包括
(a)将含Pro104样品与试验抗体以及权利要求3的抗体组合形成混合物，
(b)确定混合物中与Pro104结合的Pro104抗体的水平以及
(c)将步骤(a)的混合物中结合的Pro104抗体的水平与对照混合物相比较，
其中与对照相比结合于混合物中Pro104的Pro104抗体的水平显示试验抗体与表位结合，所述表位由权利要求3的抗Pro104抗体结合。
67.权利要求66的筛选方法，其中由ELISA确定与Pro104结合的Pro104抗体的水平。
68.权利要求66的筛选方法，其中对照是Pro104，权利要求3的Pro104抗体以及已知与由权利要求3的Pro104抗体结合的表位结合的抗体的混合物。
69.权利要求66的筛选方法，其中抗pro104抗体是标记的。
70.权利要求69的筛选方法，其中Pro104与固相支持物结合。
71.权利要求70的筛选方法，其中的固相支持物是琼脂糖凝胶珠。
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