JP2024516118A - γδ Ｔ細胞のウイルス形質導入の安定性を改善する方法及びその応用 - Google Patents
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Abstract
ウイルスベクターでγδ Ｔ細胞を形質導入する方法が提供される。この方法は、γδ Ｔ細胞を、ｉ）ウイルスベクター、及びｉｉ）γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤と接触させることを含む。また、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を調製する方法も提供される。この方法は、γδ Ｔ細胞を提供するステップ１）と、γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤の存在下で、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターでγδ Ｔ細胞を形質導入するステップ２）とを含む。本明細書で提供されるγδ Ｔ細胞を形質導入する方法は、その後の細胞増殖プロセス中に形質導入率を増加させ、及び／又は形質導入率の低下を防止することができる。
Description
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年４月６日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８５６１９の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年４月６日に出願されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８５６１９の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、γδ Ｔ細胞を形質導入する方法に関する。本開示はまた、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を調製する方法、及びＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を含む調製物に関する。
ガンマデルタＴ細胞（γδ Ｔ細胞）は、適応免疫応答と自然免疫応答の両方の特徴を示す特殊な種類の免疫細胞である。γδ Ｔ細胞は、γ鎖及びδ鎖のＴＣＲタイプとＮＫＧ２Ｄ（ＮＫ細胞上に発現する主要な機能受容体の１つ）を共発現するため、γδ Ｔ細胞はＴ細胞とＮＫ細胞の両方の機能を模倣することができる。α鎖とβ鎖のＴＣＲを持ち、ＭＨＣ分子（ヒトではヒト白血球抗原［ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＬＡ］と呼ばれる）によって提示される抗原由来ペプチドを認識する従来のαβ Ｔ細胞とは対照的に、γδ Ｔ細胞は、ＭＨＣとは独立して病原体を認識して殺すことができる（ＭＨＣ非拘束性）。同時に、γδ Ｔ細胞は様々な種類のサイトカインを放出して、ＮＫ、マクロファージ、及びＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球などの他の免疫細胞を活性化する（１）。特に、血液Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（末梢血中の主要なγδ Ｔ細胞サブセット）は、微生物、腫瘍、並びに分化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞のクラスターに応答することができる（２）。γδ Ｔ細胞はまた、抗原提示能を示す。多くの研究により、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞が広範な腫瘍殺傷能力を有することが示されている。したがって、型破りな免疫細胞として、γδ Ｔ細胞は自然免疫応答と適応免疫応答の「架け橋」として機能した。
ＭＨＣ依存性抗原認識モードは、ＧｖＨＤのリスクがあるため、同種異系療法におけるαβ Ｔ細胞の応用を制限した。ＭＨＣ非拘束性γδ Ｔ細胞は、ＧｖＨＤの懸念なしに同種移植に使用できるため、腫瘍免疫療法の優れた候補であると考えられている。過去１０年間、多くの研究者は、腫瘍治療におけるγδ Ｔ細胞の臨床応用を研究し始めた。γδ Ｔ細胞の自己療法又は同種異系療法の安全性と効率は、事前に証明されている（３）。
αβ Ｔ細胞とγδ Ｔ細胞のインビトロ培養及び増殖方法は全く異なる。αβ Ｔ細胞の場合、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を通常、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法を使用して単離し、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激した。一部の実験では、ＣＤ４／ＣＤ８又はＣＤ３正の選択によってＴ細胞を濃縮した。しかし、γδ２細胞はＰＢＭＣの５％未満を構成しており、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激すると、γδ２ Ｔ細胞の増殖はほとんど起こらない。代わりに、γ９δ２ Ｔ細胞は、ゾレドロネート（ＺＯＬ）などのビスホスホネート、イソペンテニルピロリン酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＩＰＰ）、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢ－ＰＰ）又は合成リン酸化抗原ブロモヒドリンピロリン酸（ＢｒＨＰＰ）などのリン酸化抗原によって活性化することができる（４）。
いくつかの前臨床研究によると、古典的なキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－Ｔ）と比較して、「ＣＡＲ」修飾γδ Ｔ細胞（ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞）はより良好に機能するようであった（５，６）。しかし、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を臨床応用する際には課題が残っている。ペイロードの大きいレンチウイルスベクターによる初代γδ Ｔ細胞の形質導入効率は非常に低い。更に、γδ Ｔの増殖に伴ってＣＡＲ陽性率が継続的に低下するため、形質導入の安定性を確保することができず、これはＣＡＲ－αβ Ｔ細胞の作製プロセスでは観察されない。
一態様では、本開示は、ウイルスベクターでγδ Ｔ細胞を形質導入する方法を提供し、この方法は、γδ Ｔ細胞を、ｉ）ウイルスベクター、及びｉｉ）γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤と接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞はδ１、δ２、又はδ３ Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞はγ９δ２ Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路に作用する。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＩκＢキナーゼ、ＴＢＫ１、ＰＫＤ１、ＮＦ－κＢ、Ａｋｔ、ＰＫＲ、ＴＡＫ１、ＩＲＡＫ１／４又はプロテアソームの阻害剤である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、１）ＩκＢαのリン酸化を阻害し、２）ＩκＢキナーゼの機能を阻害し、３）Ａｋｔの機能を阻害し、又は４）ＮＦ－κＢ、ｐ３８及びＪＮＫシグナル伝達の機能を阻害することができる。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＢＸ７９５、ＢＡＹ１１－７０８２、クルクミン、デキサメタゾン、２－アミノプリン、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノール、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉ、及びボルテゾミブからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤はＢＸ７９５である。
いくつかの実施形態では、ＢＸ７９５は、０．０２μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．２μＭ～６μＭ、最も好ましくは０．４μＭ～２μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ＢＸ７９５は、２μＭ以下の濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ＢＸ７９５は、０．２μＭ～０．６μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ＢＡＹ１１－７０８２は、０．１μＭ～２０００μＭ、より好ましくは０．５μＭ～２００μＭ、最も好ましくは５μＭ～１００μＭの濃度で使用され、又は、ＢＡＹ１１－７０８２は、０．５μＭ～５０μＭ、より好ましくは５μＭ～５０μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、クルクミンは、０．１μＭ～５００μＭ、より好ましくは１μＭ～１００μＭ、最も好ましくは２μＭ～２０μＭの濃度で使用され、又は、クルクミンは、１μＭ～１００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１００μＭ若しくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、デキサメタゾンは、０．０１μＭ～５００μＭ、より好ましくは０．１μＭ～５０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用され、又は、デキサメタゾンは、０．０６４μＭ～６．４μＭ、より好ましくは０．６４μＭ～６．４μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、２－アミノプリンは、０．５μＭ～５０００μＭ、より好ましくは５μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用され、又は、２－アミノプリンは、５μＭ～５００μＭ、より好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールは、０．０１μＭ～６００μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６０μＭ、最も好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用され、又は、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールは、０．６μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉは、０．０１μＭ～３００μＭ、より好ましくは０．０３μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用され、又は、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉは、０．０３μＭ～３μＭ、より好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ボルテゾミブは、０．００２μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．０１μＭ～４μＭ、最も好ましくは０．０１μＭ～０．４μＭの濃度で使用され、又は、ボルテゾミブは、０．０４μＭ～４μＭ、例えば０．０４μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、この方法は、形質導入されたγδ Ｔ細胞を、γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤を含まない培地中で培養することを更に含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む。
別の態様では、本開示は、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を調製する方法を提供し、この方法は、
γδ Ｔ細胞を提供するステップ１）と、
γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤の存在下で、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターでγδ Ｔ細胞を形質導入するステップ２）とを含む。
γδ Ｔ細胞を提供するステップ１）と、
γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤の存在下で、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターでγδ Ｔ細胞を形質導入するステップ２）とを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ１）は、ＩＬ－２及びＺＯＬを補充した培地中で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養することを含む。
いくつかの実施形態では、この方法は、形質導入されたγδ Ｔ細胞を、γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤を含まない培地中で培養するステップ３）を更に含む。
いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞はδ１、δ２、又はδ３ Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞はγ９δ２ Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路に作用する。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＩκＢキナーゼ、ＴＢＫ１、ＰＫＤ１、ＮＦ－κＢ、Ａｋｔ、ＰＫＲ、ＴＡＫ１、ＩＲＡＫ１／４又はプロテアソームの阻害剤である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、１）ＩκＢαのリン酸化を阻害し、２）ＩκＢキナーゼの機能を阻害し、３）Ａｋｔの機能を阻害し、又は４）ＮＦ－κＢ、ｐ３８及びＪＮＫシグナル伝達の機能を阻害することができる。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＢＸ７９５、ＢＡＹ１１－７０８２、クルクミン、デキサメタゾン、２－アミノプリン、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノール、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉ、及びボルテゾミブからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤はＢＸ７９５である。
いくつかの実施形態では、ＢＸ７９５は、０．０２μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．２μＭ～６μＭ、最も好ましくは０．４μＭ～２μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ＢＸ７９５は、２μＭ以下の濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ＢＸ７９５は、０．２μＭ～０．６μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ＢＡＹ１１－７０８２は、０．１μＭ～２０００μＭ、より好ましくは０．５μＭ～２００μＭ、最も好ましくは５μＭ～１００μＭの濃度で使用され、又は、ＢＡＹ１１－７０８２は、０．５μＭ～５０μＭ、より好ましくは５μＭ～５０μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、クルクミンは、０．１μＭ～５００μＭ、より好ましくは１μＭ～１００μＭ、最も好ましくは２μＭ～２０μＭの濃度で使用され、又は、クルクミンは、１μＭ～１００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１００μＭ若しくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、デキサメタゾンは、０．０１μＭ～５００μＭ、より好ましくは０．１μＭ～５０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用され、又は、デキサメタゾンは、０．０６４μＭ～６．４μＭ、より好ましくは０．６４μＭ～６．４μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、２－アミノプリンは、０．５μＭ～５０００μＭ、より好ましくは５μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用され、又は、２－アミノプリンは、５μＭ～５００μＭ、より好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールは、０．０１μＭ～６００μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６０μＭ、最も好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用され、又は、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールは、０．６μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉは、０．０１μＭ～３００μＭ、より好ましくは０．０３μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用され、又は、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉは、０．０３μＭ～３μＭ、より好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用される。
いくつかの実施形態では、ボルテゾミブは、０．００２μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．０１μＭ～４μＭ、最も好ましくは０．０１μＭ～０．４μＭの濃度で使用され、又は、ボルテゾミブは、０．０４μＭ～４μＭ、例えば０．０４μＭの濃度で使用される。
別の態様では、本開示は、上記の方法によって調製されたＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を含む調製物を提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞は、ＣＤ４又はＢ７Ｈ３を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する。
別の態様では、本開示は、腫瘍の治療に使用するための医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、調製物と、薬学的に許容される担体とを含む、。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、前立腺腫瘍、Ｔ細胞白血病、又は卵巣癌である。
別の態様では、本開示は、被験者の腫瘍を治療するための方法を提供し、この方法は、被験者に、治療有効量の調製物、又は治療有効量の医薬組成物を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、腫瘍は、前立腺腫瘍、Ｔ細胞白血病、又は卵巣癌である。
本明細書で提供されるγδ Ｔ細胞を形質導入する方法は、その後の細胞増殖プロセス中に形質導入率を増加させ、及び／又は形質導入率の低下を防止することができる。この方法は、腫瘍治療用のＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を調製するために使用することができる。これらの小分子阻害剤を使用しないと、ＣＡＲ－γδ Ｔの陽性率は非常に低くなり、その臨床応用が阻害されるであろう。十分なＣＡＲ陽性γδ Ｔ細胞を得るには、より多くの細胞を調製し、より多くの細胞を患者に注入する必要があり、これはより多くの製造コストとより多くの手術リスクをもたらすであろう。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の任意の方法、装置及び材料を本発明の実施に使用することができる。以下の定義は、本明細書で使用される特定の用語の理解を容易にするために提供されるものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
文脈上別段の解釈が必要でない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という語、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、指定された整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップのグループを含むことを意味するが、他の整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップのグループを除外することを意味するものではないと理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」若しくは「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」という用語で置き換えることができ、又は、本明細書で使用される場合には、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」という用語で置き換えることもできる。
特に明記しない限り、本明細書に記載の濃度又は濃度範囲などの任意の数値は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、数値は典型的には、列挙された値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬを含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用には、文脈で明確に別段の指示がない限り、すべての可能な部分範囲、その範囲内のすべての個々の数値（そのような範囲内の整数や値の分数を含む）が明示的に含まれる。
本明細書で使用される「生来の抗ウイルス活性」という用語は、宿主細胞におけるウイルスの複製及び／又はウイルスの遺伝子の発現を抑制する宿主細胞の自然免疫系の活性を指す。サイトゾル中のｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡセンサー（例えば、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ）がウイルス核酸を認識し、Ｉ型インターフェロン応答を誘導することによって宿主細胞を抗ウイルス状態に誘導できることは、当技術分野において周知である。したがって、「生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤」とは、宿主における抗ウイルス状態の進行を妨げることができる阻害剤を指す。非限定的な例では、薬剤は、ＩｋＢキナーゼ（ＩＫＫε）及び／又はＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＡＮＫ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ１、ＴＢＫ１）の阻害剤、例えば、ＢＸ７９５である。別の非限定的な例では、ＢＡＹ１１－７０８２、クルクミン、デキサメタゾン、２－アミノプリン、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノール、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉ、及びボルテゾミブなどの阻害剤を使用して、生来の抗ウイルス活性を阻害することができる。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、組換え又は合成によって生成された核酸構築物又は配列を指し、宿主細胞における別の外来又は異種核酸の転写及び／又は発現を可能にする特定の核酸エレメントを有する。ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸フラグメントであり得る。ベクターは、それが宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含むことができる。ベクターはまた、１つ以上の選択マーカー遺伝子及び他の遺伝要素を含むことができる。ベクターは、挿入された１つ又は複数の標的遺伝子の転写及び／又は翻訳を可能にするのに必要な調節配列を含む発現ベクターであり得る。いくつかの非限定的な例では、ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。γδ Ｔ細胞への遺伝子送達に適したウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びレンチウイルスベクターが挙げられる。本明細書に開示される非限定的な例では、γδ Ｔ細胞は、１つ以上の標的タンパク質（例えば、ＧＦＰ又はＣＡＲ）をコードする１つ以上の異種核酸を含むレンチウイルスベクターで形質導入される。
「ｔｒａｎｓｄｕｃｅ（形質導入する）」、「ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ（形質導入する）」又は「ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（形質導入）」という用語は、異種核酸を宿主細胞に導入することなど、核酸を宿主細胞に導入することを指す。本明細書で使用される場合、この用語には、核酸を細胞に導入するすべての技術が含まれ、これらの技術には、プラスミドベクターによる形質転換、ウイルスベクター又はウイルス粒子による感染、及びエレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、又はパーティクルガンによる裸のＤＮＡの導入が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ（シュードタイピング）」又は「ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ（シュードタイプ化）」という用語は、エンベロープを有する他のウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質を有するベクター粒子を指す。非限定的な例では、γδ Ｔ細胞を形質導入するために使用されるレンチウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターである。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、免疫細胞、特にＴ細胞の表面に発現し、免疫細胞に標的細胞（例えば、腫瘍細胞）上の特定の抗原（例えば、腫瘍特異的抗原）を標的とする新たな能力を与えることを目的とした人工受容体タンパク質を指す。この受容体は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を１つの受容体に結合しているため、「キメラ」である。通常の形式では、キメラ抗原受容体はモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に移植する。ＣＡＲがＴ細胞内で発現すると、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ又はＣＡＲ－Ｔ細胞）は、抗原特異的認識、抗腫瘍反応性、及び増殖などのいくつかの特性を獲得し、したがって標的の腫瘍細胞を根絶する「生きた薬物」として作用することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、自己抗原に対する耐性を無効にし、患者のＭＨＣ状態に依存しない治療を提供することができる。ＣＡＲは、抗原特異的結合部位、膜貫通領域、及びシグナル伝達細胞質ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ鎖）を含む膜貫通タンパク質として発現する。抗原特異的結合部位は通常、柔軟なリンカーによって結合された重鎖と軽鎖からなるモノクローナル抗体由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）である。最近、インビボでのＴ細胞の生存を高めるために、ＣＡＲ構築物には、ＣＤ２８又は４－１ ＢＢなどの共刺激分子からの追加の細胞質ドメインが組み込まれている。ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、及び細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域を更に含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合要素（抗原認識ドメイン又は抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む。細胞内ドメイン、又は細胞質ドメインは、多くの場合、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ ζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。ＣＡＲ分子による抗原認識又は抗原標的化には、最も一般的には、抗体又は抗体フラグメントの使用が含まれる。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ４又はＢ７Ｈ３に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである。
本明細書で使用される「ＮＦ－κＢシグナル伝達経路」という用語は、ＮＦ－κＢ転写因子の活性化又は不活性化をもたらすシグナル伝達経路を指す。ＮＦ－κＢ転写因子は、免疫、ストレス応答、アポトーシス、及び分化の重要な調節因子である。哺乳動物には、転写因子ＮＦ－κＢファミリーの５つのメンバー、すなわち、ＲＥＬＡ（ｐ６５）、ＲＥＬＢ、ｃ－ＲＥＬ、前駆体タンパク質ＮＦ－κＢ１（ｐ１０５）及びＮＦ－κＢ２（ｐ１００）が存在する。ＮＦ－κＢ転写因子は、様々な遺伝子のプロモーター及びエンハンサーのκＢ部位に二量体として結合し、転写を誘導又は抑制する。ＮＦ－κＢの活性化は、２つの主要なシグナル伝達経路、すなわち標準ＮＦ－κＢシグナル伝達経路と非標準ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を介して起こる。標準ＮＦ－κＢ経路は、ＴＮＦＲ、ＴＬＲ、及びＩＬ－１Ｒなど、ＴＡＫ１を活性化する多種多様な免疫受容体からのシグナルによってトリガーされる。次に、ＴＡＫ１は、ＩＫＫβのリン酸化を介して、触媒（ＩＫＫα及びＩＫＫβ）サブユニットと調節（ＮＥＭＯ）サブユニットで構成されるＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体を活性化する。刺激を受けると、ＩＫＫ複合体は主にＩＫＫβを介して、ＩκＢαやＩκＢ様分子ｐ１０５などのκＢ阻害剤（ＩκＢ）ファミリーのメンバーをリン酸化し、ＮＦ－κＢメンバーを細胞質に隔離する。ＩκＢαはｐ５０の二量体及びＲＥＬファミリーのメンバー（ＲＥＬＡ又はｃ－ＲＥＬ）と会合するのに対し、ｐ１０５はｐ５０又はＲＥＬ（ＲＥＬＡ又はｃ－ＲＥＬ）と会合する。ＩＫＫによってリン酸化されると、ＩκＢαとｐ１０５はプロテアソーム内で分解され、その結果、標準ＮＦ－κＢファミリーメンバーが核移行し、ＲＥＬＡ－ｐ５０、ｃ－ＲＥＬ－ｐ５０、及びｐ５０－ｐ５０を含む様々な二量体複合体の形で特定のＤＮＡエレメントに結合する。非定型なＩＫＫ非依存性ＮＦ－κＢ誘導経路はまた、低酸素、ＵＶ、及び遺伝毒性ストレスなど、ＮＦ－κＢ活性を増加させるための並行シグナル伝達経路を統合するメカニズムを提供する。非標準ＮＦ－κＢ経路は、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ、及びリンホトキシン－β（ＬＴ－β）などの特定のＴＮＦスーパーファミリーメンバーによって誘導され、受容体複合体へのＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ｃＩＡＰ１／２の動員を刺激する。活性化されたｃＩＡＰは、Ｋ４８のユビキチン化とＴＲＡＦ３のプロテアソーム分解を媒介し、ＮＦ－κＢ誘導キナーゼ（ＮＦ－κＢ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ、ＮＩＫ）の安定化と蓄積をもたらす。ＮＩＫはＩＫＫαをリン酸化して活性化し、次にＩＫＫαは、ｐ１００をリン酸化してｐ１００プロセシングを引き起こし、ｐ５２の生成とｐ５２及びＲＥＬＢの核移行を引き起こす。
「医薬組成物」という用語は、活性成分と、活性成分の生物学的活性を有効にするような形態である生理学的に許容される賦形剤とを含む調製物を指す。本明細書で使用される場合、「生理学的に許容される賦形剤」には、限定されないが、ヒト又は家畜での使用が許容される任意の補助剤、担体、希釈剤、保存剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、又は乳化剤が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞又はそれを含む医薬組成物は、被験者の腫瘍（又は癌）を治療するために使用される。
本明細書で使用される場合、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」又は「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療する）」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果には、限定されないが、疾患に起因する１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の軽減、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化を予防又は遅らせること）、疾患の広がり（例えば、転移など）を予防又は遅らせること、疾患の再発を予防又は遅らせること、疾患の進行を遅らせること、疾患状態の改善、疾患の（部分的又は完全な）寛解、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量の減少、疾患の進行を遅らせること、生活の質の向上、及び／又は生存期間の延長のうちの１つ以上が含まれる。また、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」には、疾患の病理学的帰結の軽減も含まれる。本発明の方法は、治療のこれらの側面のいずれか１つ以上を企図する。
「治療有効量」という用語は、被験者を「治療する」のに有効な量を含み得る。治療量が示される場合、特定の実施形態において企図される正確な投与量は、被験者の状態を考慮して医師によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「被験者」という用語は、本発明のＣＡＲ γδ Ｔ細胞又はＣＡＲ γδ Ｔ細胞を含む組成物が投与される生物を指す。好ましくは、被験者は、哺乳動物、例えばヒトである。
本明細書で使用される場合、「調製物」という用語は、本発明の方法によって調製されたＣＡＲ γδ Ｔ細胞を含む製品又は製造物を指す。非限定的な例として、調製物は、溶液、懸濁液などの形態であってもよい。
ＢＸ７９５は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）及びＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）の阻害剤である。その式は次のとおりである（ＣＡＳアクセッション番号：７０２６７５－７４－９）。
本発明で使用される他の阻害剤は、以下の式を有する。
ＢＡＹ１１－７０８２（ＣＡＳ番号：１９５４２－６７－７）
クルクミン（ＣＡＳ番号：４５８－３７－７）
２－アミノプリン（ＣＡＳ番号：４５２－０６－２）
デキサメタゾン（ＣＡＳ番号：５０－０２－２）
（５Ｚ）－７－オキソゼアエノール（ＣＡＳ番号：２５３８６３－１９－３）
ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉ（ＣＡＳ番号：５０９０９３－４７－４）
ボルテゾミブ（ＣＡＳ番号：１７９３２４－６９－７）
本発明者らは、γδ Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入すると、形質導入後４～８日間に形質導入率が著しく低下する可能性があることを見出した。一般に、ウイルスベクターは、宿主細胞において発現する少なくとも１つの標的遺伝子を含む。したがって、形質導入率の変化は、フローサイトメトリーによって陽性細胞（すなわち、標的遺伝子を発現する細胞）の百分率を測定することによって監視することができる。
γδ Ｔ細胞を、γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤（以下、「生来の抗ウイルス活性阻害剤」と呼ぶ）、例えばＢＸ７９５の存在下でウイルスベクターで形質導入すると、その後、γδ Ｔ細胞が生来の抗ウイルス活性阻害剤（例えば、ＢＸ７９５）を補充しない培地で培養された場合でも、導入されたウイルスベクターは、γδ Ｔ細胞内に安定して残存できることを、本発明者らは意外にも見出した。細胞中のベクターの維持は、フローサイトメトリーなどによって検出することもできる。これは、腫瘍治療のためにＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を患者に戻す場合、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞にとって非常に重要である。治療前に十分な数のＣＡＲ陽性γδ Ｔ細胞を用意する必要がある。γδ Ｔ細胞のインビトロ増殖中に陽性率が徐々に低下すると、臨床応用に十分な量の陽性細胞を得ることは不可能である。更に、陽性率の継続的な低下は、再注入後の細胞がインビボでＣＡＲを失い、したがって治療効果が失われる可能性があることを示す。
阻害剤（例えば、ＢＸ７９５）を適切な濃度で使用すると、形質導入率を改善及び／又は維持しながら、γδ Ｔ細胞の細胞増殖及び拡大を損なわないことを、本発明者らは更に見出した。いくつかの実施形態では、ＢＸ７９５は、０．０２μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．２μＭ～６μＭ、最も好ましくは０．４μＭ～２μＭの濃度で使用される。他の実施形態では、ＢＸ７９５は、０．２μＭ～６μＭ、例えば、０．２μＭ～０．６μＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＢＸ７９５は、２μＭ以下、例えば０．２μＭ～２μＭの濃度で使用される。いくつかの好ましい実施形態では、ＢＸ７９５は、０．２μＭ～０．６μＭ、例えば０．３、０．４、０．５又は０．６μＭの濃度で使用される。より好ましい実施形態では、ＢＸ７９５は０．６μＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＢＡＹ１１－７０８２は、０．１μＭ～２０００μＭ、より好ましくは０．５μＭ～２００μＭ、最も好ましくは５μＭ～１００μＭの濃度で使用される。他の実施形態では、ＢＡＹ１１－７０８２は、０．５μＭ～５０μＭ、例えば、５μＭ～５０μＭの濃度で使用される。非限定的な例では、ＢＡＹ１１－７０８２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、又は５０μＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、クルクミンは、０．１μＭ～５００μＭ、より好ましくは１μＭ～１００μＭ、最も好ましくは２μＭ～２０μＭの濃度で使用される。他の実施形態では、クルクミンは、１μＭ～１００μＭ、例えば、１０μＭ～１００μＭ又は１μＭ～１０μＭの濃度で使用される。非限定的な例では、クルクミンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００μＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、デキサメタゾンは、０．０１μＭ～５００μＭ、より好ましくは０．１μＭ～５０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用される。他の実施形態では、デキサメタゾンは、０．０６４μＭ～６．４μＭ、例えば０．６４μＭ～６．４μＭの濃度で使用される。非限定的な例では、デキサメタゾンは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、又は６μＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、２－アミノプリンは、０．５μＭ～５０００μＭ、より好ましくは５μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用される。他の実施形態では、２－アミノプリンは、５μＭ～５００μＭ、例えば５０μＭ～５００μＭの濃度で使用される。非限定的な例では、２－アミノプリンは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、又は５００μＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールは、０．０１μＭ～６００μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６０μＭ、最も好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用される。他の実施形態では、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールは、０．６μＭ～６０μＭ、例えば０．６μＭ～６μＭの濃度で使用される。非限定的な例では、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールは、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、又は６．０μＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉは、０．０１μＭ～３００μＭ、より好ましくは０．０３μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用される。他の実施形態では、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉは、０．０３μＭ～３μＭ、例えば０．３μＭ～３μＭの濃度で使用される。非限定的な例では、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉは、０．０５、０．０８、０．１、０．５、０．８、１．０、１．２、１．６、１．８、２．０、２．３、２．５又は３．０μＭの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ボルテゾミブは、０．００２μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．０１μＭ～４μＭ、最も好ましくは０．０１μＭ～０．４μＭの濃度で使用される。他の実施形態では、ボルテゾミブは、０．０４μＭ～４μＭ、例えば０．０４μＭの濃度で使用される。上記の範囲を超える濃度の阻害剤が形質導入率を向上させることができ（形質導入率を増加及び／又は維持する）、γδ Ｔ細胞の増殖及び拡大を著しく損なわない限り、この濃度も本発明で使用することができる。
したがって、本開示は、生来の抗ウイルス活性阻害剤（例えば、ＢＸ７９５）の存在下でγδ Ｔ細胞をウイルスベクターで形質導入する方法を提供する。阻害剤を使用することは、形質導入率を向上させ、形質導入プロセス後のウイルスベクターの損失を防止することができる。本開示はまた、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を調製する方法を提供し、この方法は、生来の抗ウイルス活性阻害剤（例えば、ＢＸ７９５）の存在下で、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターでγδ Ｔ細胞を形質導入することを含む。生来の抗ウイルス活性阻害剤（例えば、ＢＸ７９５）の使用は、γδ Ｔ細胞又はＣＡＲ－γδ Ｔ細胞の生存率及び殺傷活性に不利な影響を与えることはない。
実施例
実施例
本発明の主な目的は、γδ Ｔ細胞のウイルス形質導入効率を安定化及び改善することであり、これは更に、γδ Ｔ細胞を発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞）の構築に適用することができる。本発明者らが得たデータによると、抗ウイルス阻害剤の非存在下では、αβ Ｔ細胞のウイルス形質導入効率は約６０％と非常に高く、形質導入率は、インビトロ培養条件下で、少なくとも２週間安定したままであった。しかし、γδ Ｔ細胞の場合、形質導入率は、インビトロ培養の４日目（ウイルス形質導入後４８時間）から８日目にかけて８０％から２０％に急激に減少した。ＢＸ７９５（最終濃度は０．６μＭ）を添加することにより、形質導入率の低下を抑制することができ、最終的な形質導入効率を６５％に維持することができた。一方、ＢＸ７９５はγδ Ｔ細胞に損傷を与えず、採取したγδ Ｔ細胞をその後の機能実験に使用することができた。他の小分子阻害剤を使用して得られた実験結果も提供した。したがって、本発明は、γδ Ｔ細胞のウイルス形質導入における形質導入率の低下の問題を解決し、ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞の発生など、γδ Ｔ細胞の遺伝子編集に更に使用することができた。
細胞株
細胞株
２９３Ｔ細胞及びＳＫＯＶ３細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び６ｍＭのＬ－グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸及び６ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。
レンチウイルスベクターの産生
レンチウイルスベクターの産生
この方法でＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターを適用した。１ｘ１０＾７個の２９３Ｔ細胞を、ポリ－Ｄ－リジンでコーティングした１００ｍｍディッシュにプレーティングした。翌日、細胞を、３０ｕｇのＰＥＩトランスフェクション試薬を用いて、６μｇのｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ｃｏｐＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃７２２６３）又はｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－ｃｏｐＧＦＰから改変されたｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ｃｏｐＧＦＰプラスミド、４μｇのｐｓｐＡｘ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃１２２６０）、２μｇのｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃８４５４）でトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、細胞培養培地を交換した。４８時間後及び７２時間後に上清を回収した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ）でウイルスを濃縮し、２９３Ｔ細胞の形質導入によってウイルス力価を監視し、更なる使用まで濃縮ウイルスを－８０℃で保存した。
初代細胞培養
初代細胞培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した勾配遠心分離によって単離し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞数と生存率をＡＯ／ＰＩ染色によって評価した。γδ２ Ｔ細胞増幅の場合：ＰＢＭＣを２ｘ１０＾６細胞／ｍｌの濃度で、１０００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ－２及び５μＭのＺＯＬを補充した無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。γδ１ Ｔ細胞増幅の場合：ＰＢＭＣを、精製ＴＳ－１モノクローナル抗体（ＮＯＶＵＳ、ＮＢＰ２－２２４８８）で予めコーティングし、１０００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を補充した培養プレート中で１ｘ１０＾６細胞／ｍｌの濃度で無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。従来のαβＴ細胞増幅の場合、ＰＢＭＣを、精製抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体及び抗ヒトＣＤ２８モノクローナル抗体で予めコーティングし、１０００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を補充した培養プレート中で、２×１０＾６細胞／ｍｌの濃度で無血清培地中で培養した。
αβ Ｔ又はγδ Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
αβ Ｔ又はγδ Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入
レンチウイルス形質導入では、２００μｌのＰＢＳで希釈した１ｘ１０＾７ＣＦＵのレンチウイルスを、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ試薬（Ｔａｋａｒａ）で予めコーティングした２４ウェルプレートに添加し、２，０００ｇ、３２℃で２時間遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、プレートをＰＢＳで３回軽く洗浄した。
αβ Ｔ細胞のウイルス形質導入では、１ｘ１０＾６個のＰＢＭＣを、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ試薬で予めコーティングしたプレートに播種し、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８モノクローナル抗体によってインビトロで４８時間刺激した。細胞を８００ｇ、３２℃で１０分間濃縮した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。
γδ２ Ｔ細胞のウイルス形質導入では、１ｘ１０＾６のＰＢＭＣを播種し、４８時間後に上記のγδ２ Ｔ細胞培養培地（ｒｈＩＬ－２及びＺＯＬを含むＧｉｂｃｏ無血清培地）中でインビトロ培養した。小分子阻害剤を添加又は添加せず、よく混合し、細胞を８００ｇ、３２℃で１０分間濃縮した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。２４時間後に細胞培養培地を交換することにより、小分子阻害剤試薬を廃棄した。
γδ１ Ｔ細胞のウイルス形質導入では、１ｘ１０＾６個のＰＢＭＣを播種し、４８時間後に上記のγδ１ Ｔ細胞培養培地中でインビトロ培養した（ｒｈＩＬ－２及びＰＢＭＣを含むＧｉｂｃｏ無血清培地を、ＴＳ－１モノクローナル抗体によって事前刺激した）。小分子阻害剤を添加又は添加せず、よく混合し、細胞を８００ｇ、３２℃で１０分間濃縮した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。２４時間後に細胞培養培地を交換することにより、小分子阻害剤試薬を廃棄した。
自動セルカウンターで細胞数を計算し、２～３日ごとにフローサイトメトリーにより形質導入率（ＧＦＰ陽性率）を分析した。γδ２又はγδ１ Ｔ細胞のゲートで形質導入率を監視した。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー
細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次に、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋２．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈した抗体で４℃で３０分間染色した。２ｘ１０＾５個の細胞の場合、インキュベートした緩衝液の一般的な容量は５０μＬであった。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次に細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってデータを計算した。γδ２ Ｔ細胞に使用した抗体は、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３００４１２）、ＢＶ４２１抗ヒトＴＣＲ Ｖδ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３１４２８）であった。
インビトロ細胞毒性アッセイ
インビトロ細胞毒性アッセイ
ホタルルシフェラーゼを安定して発現したエフェクターＴ細胞及び腫瘍細胞を、新鮮な無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）で再懸濁した。細胞密度を変更し、エフェクターＴ細胞と腫瘍細胞をエフェクターＴ細胞対腫瘍細胞の異なる比率で９６ウェルプレートに播種した。各ウェルの最終容量は１００μｌであり、腫瘍細胞の細胞数は１０，０００個であった。
細胞混合物を３７℃、５％ＣＯ2で１２時間培養し、細胞を完全に混合し、５０μｌの細胞を別の９６ウェルプレートに取り、キット（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ１５００）の説明書に従ってルシフェラーゼ基質を添加した。ルミノメーターでプレートを読み取った。
マウス実験
マウス実験
インビボ有効性研究では、７～９週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、１×１０6個のＪｕｒｋａｔ Ｔを尾静脈内注射（ｉ．ｖ．）又は１×１０6個のＳＫＯＶ３細胞を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって移植した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とＳＫＯＶ３細胞は両方とも、ホタルルシフェラーゼを安定して発現した（０日目）。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ ＣＤＸモデルについては、５×１０6個のγδ Ｔ細胞を５日目、８日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に担癌マウスに注射し（ｉ．ｖ．）、ＳＫＯＶ３ ＣＤＸモデルについては、５×１０6個のγδ Ｔ細胞を５日目、８日目、及び１１日目に担癌マウスに注射した（ｉ．ｐ．）。腫瘍体積をＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＬＴシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により測定した。
実施例１。従来のＴ細胞（αβＴ細胞）のレンチウイルス形質導入効率
実施例１。従来のＴ細胞（αβＴ細胞）のレンチウイルス形質導入効率
従来のＴ細胞のレンチウイルス形質導入を、２日目（インビトロ培養の４８時間後）に適用した。形質導入効率を、４日目から１６日目まで２日又は３日ごとに監視した（図１）。図１からわかるように、形質導入率は約６０％であり、培養の全過程で安定したままであった。Ｔ細胞を２人の異なるドナーから得た。
実施例２。ＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入効率を改善することができ、高用量のＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞の細胞増殖を阻害した
実施例２。ＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入効率を改善することができ、高用量のＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞の細胞増殖を阻害した
γδ２ Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入を２日目（インビトロ培養の４８時間後）に適用した。形質導入効率を２２日目まで２日ごとに監視し、総細胞数とγδ２ Ｔ細胞の百分率を計算した（図２）。図２Ａ及び図２Ｂからわかるように、２μＭ又は６μＭのＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞の細胞増殖を阻害し、総生存細胞数（図２Ａ）及びγδ２ Ｔ細胞の百分率（図２Ｂ）はＢＸ７９５を含まない対照群よりも劇的に低かった。
一方、対照群では、ウイルス形質導入率は４日目から８日目にかけて８０％から２０％に急激に減少し、その後は安定したままであった（図２Ｃ）。形質導入過程中にＢＸ７９５が追加されるにつれて、ウイルス形質導入効率は最終的に約４０％に留まり、これは対照群よりも有意に高かった（図２Ｃ）。ＢＸ７９５適用群の形質導入率は高いにもかかわらず、形質導入されたγδ２ Ｔ細胞の細胞数は対照群よりも低かった（図２Ｄ）。これは、高用量のＢＸ７９５による細胞増殖阻害が原因であった。
したがって、レンチウイルス形質導入過程におけるＢＸ７９５の適用は、形質導入効率を向上させることができるが、γδ２ Ｔ細胞の細胞増殖を阻害する可能性がある。ＢＸ７９５の用量を減らすと形質導入効率が向上する可能性があるが、γδ２ Ｔ細胞の増殖には影響しない。
実施例３。低用量のＢＸ７９５は、γδ２ Ｔ細胞の細胞増殖に影響を与えることなく、γδ２ Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入を改善した
実施例３。低用量のＢＸ７９５は、γδ２ Ｔ細胞の細胞増殖に影響を与えることなく、γδ２ Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入を改善した
γδ２ Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入におけるＢＸ７９５の使用を更に研究するために、０．２μＭから２μＭまでのＢＸ７９５の機能を比較した（図３）。２μＭのＢＸ７９５は、対照群と比較して、総細胞数及びγδ２ Ｔ細胞百分率を有意に減少させた（図３Ａ及び図３Ｂ）。しかし、低用量のＢＸ７９５（０．２μＭ又は０．６μＭ）では、γδ２ Ｔ細胞の増殖は有意な影響を受けなかった。
形質導入効率に関しては、０．２μＭのＢＸ７９５では、形質導入効率が約２０％から４０％以上に向上し、０．６μＭのＢＸ７９５では最終的な形質導入率が約６５％に達したが、これは２μＭのＢＸ７９５では有意ではなかった（図３Ｃ）。０．２μＭ又は０．６μＭのＢＸ７９５を適用すると、総陽性形質導入γδ２ Ｔ細胞も大幅に増加した（図３Ｄ）。
データは、レンチウイルス形質導入の過程中に０．２μＭ又は０．６μＭのＢＸ７９５を添加すると、両方ともレンチウイルス形質導入を効率的に改善するのに役立つことができることを明らかにした。
実施例４。ＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞の細胞毒性に有意な影響を及ぼさなかった
実施例４。ＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞の細胞毒性に有意な影響を及ぼさなかった
ＢＸ７９５がγδ２ Ｔ細胞の腫瘍細胞殺傷能力に影響を与えるか否かを評価するために、γδ２ Ｔ細胞を０．２又は０．６μＭのＢＸ７９５で培養し、ＰＣ３腫瘍細胞（１つのヒト前立腺腫瘍細胞株）に対する細胞毒性効率を試験した（図４）。γδ２ Ｔ細胞とＰＣ３細胞の細胞数比は３：１であり、殺傷時間は２４時間であった。ＢＸ７９５なしで培養した対照γδ２ Ｔ細胞は７３．２％の細胞殺傷効率を有していたことがわかる。０．６μＭ及び０．２μＭのＢＸ７９５で培養したγδ２ Ｔ細胞の細胞毒性は、それぞれ７３．６％及び６８．４％であった。したがって、ＢＸ７９５は、γδ２ Ｔ細胞の細胞毒性に有意な影響を及ぼさなかった。
実施例５。ＢＸ７９５は、ＰＢＭＣから産生された最終的なγδ Ｔ細胞産物の細胞型に有意な影響を及ぼさなかった
実施例５。ＢＸ７９５は、ＰＢＭＣから産生された最終的なγδ Ｔ細胞産物の細胞型に有意な影響を及ぼさなかった
０．６μＭのＢＸ７９５の存在下又は非存在下で、ＰＢＭＣから培養した最終的なγδ Ｔ細胞産物（インビトロ培養１２日後）の細胞型を評価した。データを表１に示した。計算した細胞型には、γδ２ Ｔ、γδ２ ＣＤ５６＋ Ｔ、γδ１ Ｔ、αβＴ、ＮＫＴ、ヘルパーＴ、細胞傷害性Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞が含まれていた。ＢＸ７９５を適用した培養条件では、対照群と同等の細胞型が得られたことがわかる。
表１は、ＢＸ７９５の存在下／非存在下で培養した最終的なγδ Ｔ細胞産物の細胞型を明らかにした。この分析を適用して、培養過程における全細胞分化に対するＢＸ７９５の効果を研究した。γδ２ Ｔ、γδ２ ＣＤ５６＋ Ｔ、γδ１ Ｔ、αβＴ、ＮＫＴ、ヘルパーＴ、細胞傷害性Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞を含む様々な細胞型を評価した。
実施例６。ＢＸ７９５はＰＢＭＣから産生されたγδ２ Ｔ細胞の分化に有意な影響を及ぼさなかった
実施例６。ＢＸ７９５はＰＢＭＣから産生されたγδ２ Ｔ細胞の分化に有意な影響を及ぼさなかった
γδ２ Ｔ細胞の分化をＢＸ７９５処理と比較し、ＣＤ２２６陽性γδ２ Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ｄ陽性γδ２ Ｔ細胞、ナイーブγδ２ Ｔ細胞、セントラルメモリーγδ２ Ｔ細胞、エフェクターγδ２ Ｔ細胞、及びターミネーターγδ２ Ｔ細胞を含む様々なγδ２ Ｔサブタイプを算出した。有意な変化は見られなかった（表２）。セントラルメモリーγδ２ Ｔ細胞の場合、ＢＸ７９５を追加すると、百分率は１．８６５％から４．２２５％に向上することができた。一方、ターミネーターγδ２ Ｔ細胞の百分率は２．５９５％から約２％に減少した。
表２は、ＢＸ７９５の存在下又は非存在下で培養したγδ２ Ｔ細胞の分化を明らかにした。この分析を適用して、培養過程におけるγδ２ Ｔ細胞の分化に対するＢＸ７９５の効果を研究した。ＣＤ２２６＋ γδ２ Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ｄ＋ γδ２ Ｔ細胞、ナイーブγδ２ Ｔ細胞、セントラルメモリーγδ２ Ｔ細胞、エフェクターγδ２ Ｔ細胞及びターミネーターγδ２ Ｔ細胞を含む様々なγδ２ Ｔ細胞サブタイプを評価した。
実施例７。ＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞の枯渇した遺伝子発現をわずかに増加させた
実施例７。ＢＸ７９５はγδ２ Ｔ細胞の枯渇した遺伝子発現をわずかに増加させた
ＢＸ７９５がγδ２ Ｔ細胞の枯渇に影響を与えるか否かを計算するために、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ－３を含めて、γδ２ Ｔ細胞上に発現するいくつかの古典的な枯渇遺伝子を調べた（表３）。データは、ＢＸ７９５処理により、すべての枯渇した細胞型の細胞百分率がわずかに向上したことを明らかにした。
表３は、ＢＸ７９５の存在下又は非存在下で培養したγδ２ Ｔ細胞の枯渇マーカーの発現レベルを明らかにした。ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ３などの枯渇遺伝子を計算した。
実施例８。ＢＸ７９５は、γδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例８。ＢＸ７９５は、γδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
レンチウイルス形質導入におけるＢＸ７９５の適用を更に試験するために、γδ２ Ｔ細胞を、ＣＡＲ（Ｂ７Ｈ３分子を認識するｓｃＦｖドメイン、ＣＤ８ヒンジ／膜貫通、ＣＤ２８及びＣＤ１３７共刺激ドメイン、並びにＣＤ３ζ活性化ドメインを含む）関連レンチウイルスで形質導入した。図５Ａに示すように、対照群の形質導入率は５日目から８日目まで急速に低下し、１０％未満であった。ＢＸ７９５（０．６ｕＭ）では、形質導入率は１０日目でも約４０％で安定したままであった。上述のデータのように、ＢＸ７９５の添加はγδ２ Ｔの細胞増殖に影響を与えなかった（図５Ｂ）。
実施例９。ＢＡＹ１１－７０８２は、γδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例９。ＢＡＹ１１－７０８２は、γδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
対照群の形質導入率は、５日目から１０日目まで連続的に低下し、約５％であった。ＢＡＹ１１－７０８２は、０．５μＭから５０μＭまで用量依存的に形質導入率を高めることができた（図６Ａ）。５０μＭの用量では、形質導入率は７０％より高かった。ＢＡＹ１１－７０８２を添加すると、用量依存的に細胞増殖が損なわれ、より高い用量では総細胞数が減少した（図６Ｂ）。
実施例１０。クルクミンはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例１０。クルクミンはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
対照群の形質導入率は、５日目から１０日目まで連続的に低下し、約５％であった。クルクミン（１０ｕＭ）を使用すると、形質導入率は１０日目でも２０％を超えるままであったが（図７Ａ）、この用量のクルクミンは細胞増殖をわずかに阻害した（図７Ｂ）。１ｕＭという低用量のクルクミンは形質導入率を高めなかったが、細胞増殖を促進した。最高用量の１００ｕＭでは、形質導入率はわずかに向上することができたが、細胞増殖は著しく損なわれた。
実施例１１。デキサメタゾンはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例１１。デキサメタゾンはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
対照群の形質導入率は、５日目から１０日目まで連続的に低下し、約５％であった。デキサメタゾンは、０．０６４μＭから６．４μＭまで用量依存的に形質導入率を高めることができた（図８Ａ）。６．４μＭの用量では、形質導入率は２５％より高かった。デキサメタゾンを添加しても細胞増殖は損なわれなかった（図８Ｂ）。
実施例１２。２－アミノプリンはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例１２。２－アミノプリンはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
対照群の形質導入率は、５日目から１０日目まで連続的に低下し、約５％であった。２－アミノプリンは、５μＭから５００μＭまで用量依存的に形質導入率を高めることができた（図９Ａ）。５００μＭの用量では、形質導入率は約６０％であった。２－アミノプリンを添加しても細胞増殖は損なわれなかった（図９Ｂ）。
実施例１３。（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例１３。（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
対照群の形質導入率は、５日目から１０日目まで連続的に低下し、約５％であった。０．６μＭの（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールによる形質導入率は２０％より高く、用量が６ｕＭに達すると形質導入率は３０％より高かった（図１０Ａ）。６０μＭのより高い用量では、形質導入率の向上には効果がなかったが、６μＭの用量の場合よりも細胞増殖は損なわれた（図１０Ｂ）。（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールを０．６ｕＭ及び６ｕＭの用量で適用しても、細胞増殖に影響を与えなかった。
実施例１４。ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例１４。ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
対照群の形質導入率は、５日目から１０日目まで連続的に低下し、約５％であった。ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉは、０．０３μＭから３μＭまで用量依存的に形質導入率を高めることができた（図１１Ａ）。３μＭの用量では、形質導入率は３５％より高かった。ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉを添加しても細胞増殖は損なわれなかった（図１１Ｂ）。
実施例１５。ボルテゾミブはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例１５。ボルテゾミブはγδ２ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
対照群の形質導入率は、５日目から１０日目まで連続的に低下し、約５％であった。ボルテゾミブは、０．０４μＭの用量で形質導入率を高めることができ（約５０％であった）（図１２Ａ）、より高い用量（０．４ｕＭ及び４ｕＭ）のボルテゾミブも形質導入率を改善することができた（２０％より高かった）。ボルテゾミブの添加は用量依存的に細胞増殖を阻害し、０．４μＭ及び４μＭの用量では細胞数が大幅に減少した（図１２Ｂ）。
実施例１６。小分子阻害剤はγδ１ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
実施例１６。小分子阻害剤はγδ１ Ｔ細胞のＣＡＲ関連レンチウイルス形質導入を改善した
γδ１ Ｔ細胞の形質導入率の改善におけるこれらの小分子阻害剤の適用を試験するために、異なる用量の小分子阻害剤の存在下／非存在下でγδ１ Ｔ細胞の形質導入率を評価した。図１３から分かるように、対照群の形質導入率は５日目から１０日目にかけて劇的に減少し、最終的には約２％となった。ボルテゾミブを除くすべての分子は、ＢＸ７９５－０．０６ｕＭ、ＢＡＹ１１－７０８２－５０ｕＭ、クルクミン－１０ｕＭ、デキサメタゾン－６．４ｕＭ、２－アミノプリン－５００ｕＭ、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノール－６ｕＭ、及びＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉ－０．３ｕＭなどの特定の濃度下で形質導入率を向上させることができた。
実施例１７。ＣＤ４を標的とするＣＡＲ γδ２ Ｔの構築及びそれらのインビトロでの腫瘍細胞殺傷効率。
実施例１７。ＣＤ４を標的とするＣＡＲ γδ２ Ｔの構築及びそれらのインビトロでの腫瘍細胞殺傷効率。
ＣＤ４を標的とするＣＡＲ γδ２ Ｔを構築し、それらの腫瘍細胞殺傷効率をインビトロで計算した。未修飾γδ２ Ｔ細胞（γδ２ Ｔ対照）は、Ｅ：Ｔ比依存的にＣＤ４陽性腫瘍細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ－ｌｕｃ、ヒトＴ細胞白血病細胞、及びホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞）に対して細胞毒性を示し、ＣＡＲ γδ Ｔ細胞（γδ２ Ｔ－ＣＡＲ ＣＤ４）は、より良好に機能した（図１４Ａ）。細胞毒性試験後、２つの殺傷サイトカインを監視した。ＣＡＲ γδ２ Ｔ細胞は、未修飾γδ２ Ｔ細胞よりもはるかに多くのＩＦＮγ及びＴＮＦαを分泌した（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）。
実施例１８。ＣＤ４を標的とするＣＡＲ γδ２ Ｔは、インビボで腫瘍増殖を阻害した。
実施例１８。ＣＤ４を標的とするＣＡＲ γδ２ Ｔは、インビボで腫瘍増殖を阻害した。
Ｊｕｒｋａｔ Ｔを使用して、インビボでのＣＡＲ－ＣＤ４ γδ２ Ｔの腫瘍阻害を研究した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ－ｌｕｃ腫瘍細胞を静脈内注射（ｉ．ｖ．）によって免疫不全マウスに移植し、０日目に各マウスに１．０ｘ１０＾６個の腫瘍細胞を投与した。２日目、５日目、８日目、１１日目、及び１４日目にそれぞれ２×１０＾６個のＣＡＲ陽性ＣＡＲ－γδ２ Ｔ（ＣＡＲ－ＣＤ４）を投与した。ＣＡＲ－γδ２ Ｔ療法は腫瘍増殖を著しく阻害し（図１５Ａ及び図１５Ｂ）、腫瘍露出マウスの寿命を延長することができた（図１５Ｃ）ことが分かる。
実施例１９。Ｂ７Ｈ３を標的とするＣＡＲ γδ２ Ｔは、インビボで腫瘍増殖を阻害した。
実施例１９。Ｂ７Ｈ３を標的とするＣＡＲ γδ２ Ｔは、インビボで腫瘍増殖を阻害した。
ヒト卵巣癌であるＳＫＯＶ３を使用して、インビボでのＣＡＲ γδ２ Ｔ細胞の腫瘍阻害能力を試験した。ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ腫瘍細胞を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって免疫不全マウスに移植し、ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ細胞をホタルルシフェラーゼで安定して発現させ、０日目に１．５ｘ１０＾６個の腫瘍細胞を各マウスに投与した。γδ２ Ｔ（ＮＴＤ）又はＣＡＲ－γδ２ Ｔ（ＣＡＲ－Ｂ７Ｈ３）細胞をそれぞれ６日目、９日目、１２日目に投与（ｉ．ｐ．）し、毎回２ｘ１０＾６個のγδ Ｔ細胞を注射した。図１６に示すように、γδ２Ｔ療法はＳＫＯＶ３腫瘍の増殖を阻害することができ、ＣＡＲ－γδ２Ｔはより良好に機能した。
ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）とＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）が、ＩＲＦ３の活性化と１型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を調節して、ウイルス感染時に抗ウイルス応答を引き起こすことは、よく研究されている（７）。化合物ＢＸ７９５は、Ｓ６Ｋ１、Ａｋｔ、ＰＫＣδ、及びＧＳＫ３βのリン酸化をブロックする、ＰＤＫ１の強力かつ選択的な阻害剤である（ＩＣ50は６ｎＭである）ことが判明した。また、ＴＢＫ１及びＩＫＫα複合体の強力かつ比較的特異的な阻害剤としても報告されており、ＩＣ50はそれぞれ６ｎＭ及び４１ｎＭである。ＢＸ７９５は、単純ヘルペスウイルス１（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－１、ＨＶＳ－１）感染を効率的にブロックすることがわかっている（８，９）。更に、ＴＢＫ１とＩＫＫαは、ＮＦ－κＢ応答を媒介して、様々なサイトカインの放出を調節することも判明した（１０）。
ＮＦ－κＢ経路は、抗ウイルス免疫応答の調節において重要な役割を果たす。ＮＦ－κＢシグナル伝達の活性化は、様々なシグナルによって媒介される。不活性化されたＮＦ－κＢは、ＮＦ－κＢの活性化を阻害するＩκＢαと結合してサイトゾルに存在する。刺激シグナルの下で、酵素ＩκＢキナーゼ（ｅｎｚｙｍｅ ＩκＢ ｋｉｎａｓｅ、ＩＫＫ）が活性化され、次にＩκＢαタンパク質がリン酸化され、その結果、ＩκＢαがユビキチン化されてＮＦ－κＢから解離し、ＮＦ－κＢが活性化される。
ＢＡＹ １１－７０８２（カタログ番号Ｓ２９１３、同義語：ＢＡＹ １１－７８２１）は、ＮＦ－κＢ阻害剤であり、ＴＮＦα誘導性ＩκＢαリン酸化を阻害する（１１）。ＢＡＹ １１－７０８２はまた、ユビキチン特異的プロテアーゼＵＳＰ７及びＵＳＰ２１をそれぞれ０．１９μＭ及び０．９６μＭのＩＣ５０で阻害する。ＢＡＹ １１－７０８２は、胃癌細胞のアポトーシスとＳ期停止を誘導する。クルクミン（ジフェルロイルメタン）は、ウコン種の植物によって生成される明るい黄色の化学物質である。ＮＦ－κＢが主要な役割を果たす多くの反応をブロックすることが示されており、抗炎症、抗菌／真菌／ウイルス、抗癌、及び抗酸化活性の両方の特性を示した。更に、クルクミンは、ＩκＢαタンパク質のリン酸化をブロックするＩＫＫの活性化を阻害することにより、ＮＦ－κＢシグナル伝達を損なうことが判明した（１２，１３）。
Ａｋｔ（ＰＫＢ／Ａｋｔ）又はプロテインキナーゼＢはセリン／スレオニンキナーゼであり、哺乳動物ではＰＫＢα（Ａｋｔ１）、ＰＫＢβ（Ａｋｔ２）、及びＰＫＢγ（Ａｋｔ３）として知られる３つの高度に相同なメンバーを含む。Ａｋｔは、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３－ｋｉｎａｓｅ、ＰＩ３Ｋ）の脂質産物によって活性化される。Ａｋｔは、自然免疫応答／適応免疫応答、代謝、アポトーシス、及び増殖などの過程に関与する多くの細胞タンパク質をリン酸化し、それらの機能を調節する。Ａｋｔはリン酸化を誘導し、ＩκＢの分解を引き起こしてＮＦ－κＢの活性化を調節することができる（１４）。デキサメタゾンは、リウマチ性疾患、重度のアレルギー、喘息、及びクループなど、様々な種類の免疫疾患の治療に適用されている糖質コルチコイド薬である。デキサメタゾンの分子機構は、Ａｋｔ活性の低下を誘導し、ＮＦ－κＢシグナル伝達を阻害することが十分に明らかにされている（１５－１７）。
多くの場合、免疫刺激下では、ＪＮＫ及びｐ３８シグナル伝達はＮＦ－κＢと協働して免疫応答を調節し、これら３つの経路はすべて、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）カスケードによって調節される（１８，１９）。ＪＮＫ（ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）は、Ｓｅｒ上のｃＪｕｎに結合してリン酸化するキナーゼの一種で、ＭＡＰＫファミリーに属し、様々なストレス刺激に応答して炎症の活性化を調節する。それらはまた、Ｔ細胞の分化及び細胞のアポトーシス経路の調節にも関与する。ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼもＭＡＰＫファミリーのメンバーであり、サイトカインやＵＶ曝露などのストレス刺激に応答し、また、細胞分化、アポトーシス、及びオートファジーにも関与する。
プロテインキナーゼＲ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｒ、ＰＫＲ）はセリン－スレオニンキナーゼであり、ｍＲＮＡの翻訳、転写制御、アポトーシスの調節、及び増殖などの主要な細胞過程において主要な役割を果たす。ＰＫＲの調節不全は、癌、神経変性、代謝、及び炎症性疾患で見られた。これは、ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）の作用中に関与するシグナル伝達カスケードの活性化因子として作用する。これは、ＩＬ－１やＴＮＦ－αなどのいくつかのサイトカイン及び多くの他の成分に応答してＪＮＫ、ｐ３８、及びＮＦ－κＢの活性化の上流に位置している（２０）。グアニンとアデニンのプリン類似体である２－アミノプリンは、ＰＫＲ阻害剤として使用される（２１）。マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ７（ＭＡＰ３Ｋ７）としても知られるＴＡＫ１は、ＭＡＰ３Ｋファミリーの進化的に保存されたキナーゼであり、チロシン様キナーゼファミリー及び無菌キナーゼファミリーとクラスターを形成する。ＴＡＫ１は、ＴＧＦｂｅｔａ及び骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）によって誘導することができ、転写制御とアポトーシスの機能を媒介する。ＴＡＫ１は、細胞内及び細胞外刺激の両方で細胞死を媒介することが証明されている。これらの複数の機構によって活性化されたＴＡＫ１は、ＮＦ－κＢ及びＭＡＰキナーゼ（ＪＮＫ及びｐ３８）経路の活性化を通じて、ＮＦ－κＢ及びＡＰ－１依存性遺伝子発現を上方制御する（２２）。（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールは、強力かつ選択的なＴＡＫ１阻害剤として作用する真菌由来のレゾルシルラクトンである（２３）。ＩＲＡＫ－１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １、インターロイキン１受容体関連キナーゼ１）は、ＩＲＡＫ－１、ＩＲＡＫ－２、ＩＲＡＫ－３、及びＩＲＡＫ－４からなるＩＲＡＫファミリーに属するキナーゼ酵素であり、炎症分子によって活性化される。ＩＲＡＫ１は、ＩＫＫ複合体の活性化を媒介するＥ３ユビキチンリガーゼであるＴＲＡＦ６と協調してＩＫＫ複合体の活性化を媒介し、その結果、ＮＦ－κＢシグナル伝達が活性化される。一方、ＩＲＡＫ１／ＴＲＡＦ６複合体は、触媒的に活性なＴＡＢ２－ＴＡＢ３－ＴＡＫ１複合体の集合を通じてＪＮＫ及びｐ３８シグナル伝達を活性化することもできる（２４）。
上記のすべての小分子阻害剤に加えて、ボルテゾミブはＮＦ－κＢシグナル伝達を阻害することができるもう１つの阻害剤である（２５）。ボルテゾミブは標的療法であり、プロテアソーム阻害剤として分類される。これは、多発性骨髄腫やマントル細胞リンパ腫の治療に使用される抗癌剤である。
したがって、本発明者らは、ＮＦ－κＢ経路に関連する自然免疫及び抗ウイルス活性を様々な種類の小分子阻害剤で阻害することで、インターフェロンの誘導を防ぎ、宿主応答を低下させ、γδ Ｔ細胞におけるウイルス形質導入を安定化できるか否かを検証した。ここでの小分子阻害剤は、以下のいくつかのグループに分けることができる：１．ＢＡＹ１１－７０８２など、ＩκＢαのリン酸化を直接阻害するもの。２．クルクミンなど、ＩｋＢキナーゼの機能を阻害するもの。３．ＢＸ７９５など、ＮＦ－κＢ経路の上流キナーゼであるＴＢＫ１の機能を阻害するもの。４．デキサメタゾンなど、ＮＦ－κＢ経路の上流キナーゼであるＡＫＴの機能を阻害するもの。５．ＰＫＲ、ＴＡＫ１及びＩＲＡＫ１のキナーゼをそれぞれ調節する２－アミノプリン、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノール及びＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉなど、ＮＦ－κＢの機能並びにｐ３８及びＪＮＫシグナル伝達を阻害するもの。６．ボルテゾミブなど、機序不明であるがＮＦ－κＢ活性化を阻害するもの。
これらの実験結果は、これらの阻害剤を使用すると形質導入率が増加し、その後の細胞培養及び増殖中にも高い形質導入率が維持されることを示した。
本開示は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、記載されたものに加えて、本明細書で提供される主題の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかとなるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの開示内容はその全体が参照により組み込まれる。
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13.Shishodia, S., Potdar P Fau - Gairola, C. G., Gairola Cg Fau - Aggarwal, B. B., and Aggarwal, B. B. Curcumin (diferuloylmethane) down-regulates cigarette smoke-induced NF-kappaB activation through inhibition of IkappaBalpha kinase in human lung epithelial cells: correlation with suppression of COX-2, MMP-9 and cyclin D1.
14.Bai, D., Ueno, L., and Vogt, P. K. (2009) Akt-mediated regulation of NFkappaB and the essentialness of NFkappaB for the oncogenicity of PI3K and Akt. International journal of cancer 125, 2863-2870
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16.Kim, J., Park, M. Y., Kim, H. K., Park, Y., and Whang, K.-Y. (2016) Cortisone and dexamethasone inhibit myogenesis by modulating the AKT/mTOR signaling pathway in C2C12. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 80, 2093-2099
17.Ribeiro, S. B., de Araujo, A. A., Araujo Junior, R. F. d., Brito, G. A. d. C., Leitao, R. C., Barbosa, M. M., Garcia, V. B., Medeiros, A. C., and Medeiros, C. A. C. X. d. (2017) Protective effect of dexamethasone on 5-FU-induced oral mucositis in hamsters. PLOS ONE 12, e0186511
18.Huang, G., Shi, L. Z., and Chi, H. (2009) Regulation of JNK and p38 MAPK in the immune system: signal integration, propagation and termination. Cytokine 48, 161-169
19.Jeong, Y. E., and Lee, M.-Y. (2018) Anti-Inflammatory Activity of Populus deltoides Leaf Extract via Modulating NF-κB and p38/JNK Pathways. International Journal of Molecular Sciences 19
20.Garcia, M. A., Gil, J., Ventoso, I., Guerra, S., Domingo, E., Rivas, C., and Esteban, M. (2006) Impact of protein kinase PKR in cell biology: from antiviral to antiproliferative action. Microbiol Mol Biol Rev 70, 1032-1060
21.Velloso, L. A. (2014) Turning Off a Viral/Lipid Sensor Improves Type 2 Diabetes. Diabetes 63, 393-395
22.Hirata, Y., Takahashi, M., Morishita, T., Noguchi, T., and Matsuzawa, A. Post-Translational Modifications of the TAK1-TAB Complex. LID - 10.3390/ijms18010205 [doi] LID - 205.
23.Ninomiya-Tsuji, J., Kajino T Fau - Ono, K., Ono K Fau - Ohtomo, T., Ohtomo T Fau - Matsumoto, M., Matsumoto M Fau - Shiina, M., Shiina M Fau - Mihara, M., Mihara M Fau - Tsuchiya, M., Tsuchiya M Fau - Matsumoto, K., and Matsumoto, K. A resorcylic acid lactone, 5Z-7-oxozeaenol, prevents inflammation by inhibiting the catalytic activity of TAK1 MAPK kinase kinase.
24.Rhyasen, G. W., and Starczynowski, D. T. (2015) IRAK signalling in cancer. British Journal of Cancer 112, 232-237
25.Paramore, A., and Frantz, S. (2003) Bortezomib. Nature Reviews Drug Discovery 2, 611-612
Claims (52)
- ウイルスベクターでγδ Ｔ細胞を形質導入する方法であって、前記γδ Ｔ細胞を、
ｉ）前記ウイルスベクター、及び
ｉｉ）前記γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤と接触させることを含む、方法。 - 前記γδ Ｔ細胞がδ１、δ２、又はδ３ Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記γδ Ｔ細胞がγ９δ２ Ｔ細胞である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤がＮＦ－κＢシグナル伝達経路に作用する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤が、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＩκＢキナーゼ、ＴＢＫ１、ＰＫＤ１、ＮＦ－κＢ、Ａｋｔ、ＰＫＲ、ＴＡＫ１、ＩＲＡＫ１／４又はプロテアソームの阻害剤である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤が、
１）ＩκＢαのリン酸化を阻害し、
２）ＩκＢキナーゼの機能を阻害し、
３）Ａｋｔの機能を阻害し、又は
４）ＮＦ－κＢ、ｐ３８及びＪＮＫシグナル伝達の機能を阻害することができる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記薬剤が、ＢＸ７９５、ＢＡＹ１１－７０８２、クルクミン、デキサメタゾン、２－アミノプリン、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノール、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉ、及びボルテゾミブからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる前記薬剤がＢＸ７９５である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＸ７９５が、０．０２μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．２μＭ～６μＭ、最も好ましくは０．４μＭ～２μＭの濃度で使用される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＸ７９５が２μＭ以下の濃度で使用される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＸ７９５が０．２μＭ～０．６μＭの濃度で使用される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- ＢＡＹ１１－７０８２が、０．１μＭ～２０００μＭ、より好ましくは０．５μＭ～２００μＭ、最も好ましくは５μＭ～１００μＭの濃度で使用され、又は、ＢＡＹ１１－７０８２が、０．５μＭ～５０μＭ、より好ましくは５μＭ～５０μＭの濃度で使用される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- クルクミンが、０．１μＭ～５００μＭ、より好ましくは１μＭ～１００μＭ、最も好ましくは２μＭ～２０μＭの濃度で使用され、又は、クルクミンが、１μＭ～１００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１００μＭ若しくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
- デキサメタゾンが、０．０１μＭ～５００μＭ、より好ましくは０．１μＭ～５０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用され、又は、デキサメタゾンが、０．０６４μＭ～６．４μＭ、より好ましくは０．６４μＭ～６．４μＭの濃度で使用される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- ２－アミノプリンが、０．５μＭ～５０００μＭ、より好ましくは５μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用され、又は、２－アミノプリンが、５μＭ～５００μＭ、より好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- （５Ｚ）－７－オキソゼアエノールが、０．０１μＭ～６００μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６０μＭ、最も好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用され、又は、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールが、０．６μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉが、０．０１μＭ～３００μＭ、より好ましくは０．０３μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用され、又は、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉが、０．０３μＭ～３μＭ、より好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
- ボルテゾミブが、０．００２μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．０１μＭ～４μＭ、最も好ましくは０．０１μＭ～０．４μＭの濃度で使用され、又は、ボルテゾミブが、０．０４μＭ～４μＭ、例えば０．０４μＭの濃度で使用される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 形質導入された前記γδ Ｔ細胞を、前記γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤を含まない培地中で培養することを更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
- ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を調製する方法であって、
γδ Ｔ細胞を提供するステップ１）と、
前記γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤の存在下で、キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで前記γδ Ｔ細胞を形質導入するステップ２）とを含む、方法。 - ステップ１）が、ＩＬ－２及びＺＯＬを補充した培地中で末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養することを含む、請求項２４に記載の方法。
- 形質導入された前記γδ Ｔ細胞を、前記γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる薬剤を含まない培地中で培養するステップ３）を更に含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
- 前記γδ Ｔ細胞がδ１、δ２、又はδ３ Ｔ細胞である、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記γδ Ｔ細胞がγ９δ２ Ｔ細胞である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤がＮＦ－κＢシグナル伝達経路に作用する、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤が、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫε、ＩκＢキナーゼ、ＴＢＫ１、ＰＫＤ１、ＮＦ－κＢ、Ａｋｔ、ＰＫＲ、ＴＡＫ１、ＩＲＡＫ１／４又はプロテアソームの阻害剤である、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤が、
１）ＩκＢαのリン酸化を阻害し、
２）ＩκＢキナーゼの機能を阻害し、
３）Ａｋｔの機能を阻害し、又は
４）ＮＦ－κＢ、ｐ３８及びＪＮＫシグナル伝達の機能を阻害することができる、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の方法。 - 前記薬剤が、ＢＸ７９５、ＢＡＹ１１－７０８２、クルクミン、デキサメタゾン、２－アミノプリン、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノール、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉ、及びボルテゾミブからなる群から選択される、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化レンチウイルスベクターである、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記γδ Ｔ細胞の生来の抗ウイルス活性を阻害できる前記薬剤がＢＸ７９５である、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＸ７９５が、０．０２μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．２μＭ～６μＭ、最も好ましくは０．４μＭ～２μＭの濃度で使用される、請求項２４～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＸ７９５が２μＭ以下の濃度で使用される、請求項２４～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＢＸ７９５が０．２μＭ～０．６μＭの濃度で使用される、請求項２４～３８のいずれか一項に記載の方法。
- ＢＡＹ１１－７０８２が、０．１μＭ～２０００μＭ、より好ましくは０．５μＭ～２００μＭ、最も好ましくは５μＭ～１００μＭの濃度で使用され、又は、ＢＡＹ１１－７０８２が、０．５μＭ～５０μＭ、より好ましくは５μＭ～５０μＭの濃度で使用される、請求項２４～３９のいずれか一項に記載の方法。
- クルクミンが、０．１μＭ～５００μＭ、より好ましくは１μＭ～１００μＭ、最も好ましくは２μＭ～２０μＭの濃度で使用され、又は、クルクミンが、１μＭ～１００μＭ、より好ましくは１０μＭ～１００μＭ若しくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用される、請求項２４～４０のいずれか一項に記載の方法。
- デキサメタゾンが、０．０１μＭ～５００μＭ、より好ましくは０．１μＭ～５０μＭ、最も好ましくは１μＭ～１０μＭの濃度で使用され、又は、デキサメタゾンが、０．０６４μＭ～６．４μＭ、より好ましくは０．６４μＭ～６．４μＭの濃度で使用される、請求項２４～４１のいずれか一項に記載の方法。
- ２－アミノプリンが、０．５μＭ～５０００μＭ、より好ましくは５μＭ～１０００μＭ、最も好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用され、又は、２－アミノプリンが、５μＭ～５００μＭ、より好ましくは５０μＭ～５００μＭの濃度で使用される、請求項２４～４２のいずれか一項に記載の方法。
- （５Ｚ）－７－オキソゼアエノールが、０．０１μＭ～６００μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６０μＭ、最も好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用され、又は、（５Ｚ）－７－オキソゼアエノールが、０．６μＭ～６０μＭ、より好ましくは０．６μＭ～６μＭの濃度で使用される、請求項２４～４３のいずれか一項に記載の方法。
- ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉが、０．０１μＭ～３００μＭ、より好ましくは０．０３μＭ～３０μＭ、最も好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用され、又は、ＩＲＡＫ１／４阻害剤Ｉが、０．０３μＭ～３μＭ、より好ましくは０．３μＭ～３μＭの濃度で使用される、請求項２４～４４のいずれか一項に記載の方法。
- ボルテゾミブが、０．００２μＭ～４０μＭ、より好ましくは０．０１μＭ～４μＭ、最も好ましくは０．０１μＭ～０．４μＭの濃度で使用され、又は、ボルテゾミブが、０．０４μＭ～４μＭ、例えば０．０４μＭの濃度で使用される、請求項２４～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項２４～４６のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＣＡＲ－γδ Ｔ細胞を含む調製物。
- 前記ＣＡＲ－γδ Ｔ細胞が、ＣＤ４又はＢ７Ｈ３を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する、請求項４７に記載の調製物。
- 請求項４７に記載の調製物と、薬学的に許容される担体とを含む、腫瘍の治療に使用するための医薬組成物。
- 前記腫瘍が、前立腺腫瘍、Ｔ細胞白血病、又は卵巣癌である、請求項４９に記載の医薬組成物。
- 被験者の腫瘍を治療するための方法であって、前記被験者に、治療有効量の請求項４７に記載の調製物、又は治療有効量の請求項４９若しくは５０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
- 前記腫瘍が、前立腺腫瘍、Ｔ細胞白血病、又は卵巣癌である、請求項５１に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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