KR20230167384A - γδ T 세포의 바이러스 형질 도입의 안정성을 개선하기 위한 방법 및 이의 응용 - Google Patents

γδ T 세포의 바이러스 형질 도입의 안정성을 개선하기 위한 방법 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

바이러스 벡터를 사용하여 γδ T 세포를 형질도입하는 방법이 제공되며, 이는 상기 γδ T 세포를 i) 상기 바이러스 벡터; 및 ii) 상기 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제와 접촉하게 하는 단계를 포함한다. 또한, CAR-γδ T 세포를 제조하는 방법이 제공되며, 이는 1) γδ T 세포를 제공하는 단계; 및 2) γδ T 세포를 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제의 존재 하에서 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하는 단계를 포함한다. 본원에서 제공되는 γδ T 세포를 형질도입하는 방법은 후속적인 세포 확장 과정 동안 형질도입율을 상승시킬 수 있고/있거나 형질도입율의 감소를 방지할 수 있다.

Description

γδ T 세포의 바이러스 형질 도입의 안정성을 개선하기 위한 방법 및 이의 응용
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 4월 6일자로 제출된 PCT 국제 출원 제PCT/CN2021/085619호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 전문이 참조에 의해 본원에 원용된다.
본 개시내용은 γδ T 세포를 형질도입하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한 본 개시내용은 CAR-γδ T 세포 또는 CAR-γδ T 세포를 포함하는 제조물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
감마 델타 T 세포(γδ T 세포)는 후천적 및 선천적 면역 반응 특징을 모두 나타내는 특수한 유형의 면역 세포이다. γδ T 세포는 γ 사슬 및 δ 사슬의 TCR 유형 및 NKG2D(NK 세포상에서 발현되는 주요 기능 수용체 중 하나)를 공동발현하며, 따라서, 이는 γδ T 세포가 T 세포 및 NK 세포 기능 모두를 모방할 수 있도록 한다. α 사슬 및 β 사슬의 TCR을 보유하며 MHC 분자(인체에서, 인간 백혈구 항원[HLA]으로 지칭됨)에 의해 제시되는 항원 유래 펩타이드를 인식하는 기존의 αβ 세포와 대조적으로, γδ T 세포는 MHC와 독립적으로(MHC 비제한된) 병원체를 인식하고 사멸시킬 수 있다. 그리고 동시에, γδ T 세포는 다양한 종류의 사이토카인을 방출하여 다른 면역 세포, 예컨대, NK, 대식세포 및 CD8+ 세포독성 림프구를 활성화한다(1). 특히, 혈액 Vγ9Vδ2 T 세포(말초 혈액에 있는 주요 γδ T 세포 아집합)는 미생물, 종양 및 분화 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 군락에 반응할 수 있다(2). 또한, γδ T 세포는 항원-제시 능력을 나타낸다. 많은 연구는 Vγ9Vδ2 T 세포가 광범위하게 종양 사멸 능력을 보유한다는 점을 나타내었다. 따라서, 비기존 면역 세포로서, γδ T 세포는 선천적 및 후천적 면역 반응의 “가교”로서 작용한다.
MHC 의존 항원 인식 모드는 GvHD의 위험으로서 동종이계 치료에서 αβ T 세포의 응용분야를 제한한다. MHC 비제한 γδ T 세포는 GvHD의 우려 없이 동종이계 전달을 위해 사용될 수 있기 때문에 종양 면역요법의 훌륭한 후보로 간주된다. 지난 10년 동안, 많은 연구자들이 종양 치료에서 γδ T 세포의 임상적 응용분야를 조사하기 시작하였다. γδ T 세포의 자가유래 또는 동종이계 요법의 안전성 및 효율성은 예비 승인되었다(3).
αβ T 세포 및 γδ T 세포의 시험관내(in vitro) 배양 및 확장 방법은 완전히 상이하다. αβ T 세포의 경우, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 종종 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리 방법으로 단리되고 CD3/CD28 Dynabeads를 사용하여 자극되었다. 일부 실험에서, T 세포는 CD4/CD8 또는 CD3 양성 선택에 의해 농축되었다. 그러나, γδ2 세포는 PBMC의 5% 미만을 구성하며 CD3/CD28 Dynabeads를 사용한 자극은 γδ2 T 세포 확장을 거의 초래하지 않았다. 대신, γ9δ2 T 세포는 비스포스포네이트, 예컨대, 졸레드로네이트(ZOL), 인항원, 예컨대, 이소펜테닐 피로포스페이트(IPP), (E)-4-히드록시-3-메틸-부트-2-엔일 피로포스페이트(HMB-PP) 또는 합성 인항원 브로모히드린 피로포스페이트(BrHPP) 등에 의해 활성화될 수 있다. (4).
고전적인 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T)와 비교하여, “CAR” 변형 γδ T 세포(CAR-γδ T 세포)는 일부 전임상 연구에 따르면 더 우수한 성능을 발휘하는 것으로 나타났다(5,6). 그러나, CAR-γδ T 세포의 형질전환을 임상 응용분야로 전환하는 데에는 과제가 남아 있다. 대형 페이로드 렌티바이러스 벡터를 갖는 1차 γδ T 세포의 형질도입 효율성은 매우 낮다. 또한 CAR-αβ T 세포 제조 과정에서는 관찰되지 않는 γδ T 확장과 함께 CAR 양성 비율이 지속적으로 감소하기 때문에 형질 도입 안정성을 보장할 수 없다.
일 양태에서, 본 개시내용은 바이러스 벡터를 사용하여 γδ T 세포를 형질도입하는 방법을 제공하며, 이는 γδ T 세포를 i) 바이러스 벡터; 및 ii) γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제와 접촉하게 하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, γδ T 세포는 δ1, δ2 또는 δ3 T 세포이다.
일부 실시양태에서, γδ T 세포는 γ9δ2 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 VSV-G 위형화 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 작용제는 NF-κB 신호전달 경로에 작용한다.
일부 실시양태에서, 작용제는 IKKα, IKKβ, IKKε, IκB 키나아제, TBK1, PKD1, NF-κB, Akt, PKR, TAK1, IRAK1/4 또는 프로테아좀의 억제제이다.
일부 실시양태에서, 작용제는 1) IκBα의 인산화를 억제할 수 있거나; 2) IκB 키나아제의 기능을 억제할 수 있거나; 3) Akt의 기능을 억제할 수 있거나; 또는 4) NF-κB, p38 및 JNK 신호전달의 기능을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 작용제는 BX795, BAY11-7082, 커큐민, 덱사메타손, 2-아미노퓨린, (5Z)-7-옥소제아에놀, IRAK1/4 억제제 I 및 보르테조밉으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제는 BX795이다.
일부 실시양태에서, BX795는 0.02 μM 내지 60 μM, 더 바람직하게는 0.2 μM 내지 6 μM 및 가장 바람직하게는 0.4 μM 내지 2 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, BX795는 2 μM 이하의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, BX795는 0.2 μM 내지 0.6 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, BAY11-7082는 0.1 μM 내지 2000 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM 내지 200 μM 및 가장 바람직하게는 5 μM 내지 100 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 BAY11-7082는 0.5 μM 내지 50 μM 및 더 바람직하게는 5 μM 내지 50 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 커큐민은 0.1 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 1 μM 내지 100 μM 및 가장 바람직하게는 2 μM 내지 20 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 커큐민은 1 μM 내지 100 μM 및 더 바람직하게는 10 μM 내지 100 μM 또는 1 μM 내지 10 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 덱사메타손은 0.01 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 0.1 μM 내지 50 μM 및 가장 바람직하게는 1 μM 내지 10 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 덱사메타손은 0.064 μM 내지 6.4 μM 및 가장 바람직하게는 0.64 μM 내지 6.4 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 2-아미노퓨린은 0.5 μM 내지 5000 μM, 더 바람직하게는 5 μM 내지 1000 μM 및 가장 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 2-아미노퓨린은 5 μM 내지 500 μM 및 더 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.01 μM 내지 600 μM, 더 바람직하게는 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, IRAK1/4 억제제 I은 0.01 μM 내지 300 μM, 더 바람직하게는 0.03 μM 내지 30 μM 가장 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 IRAK1/4 억제제 I은 0.03 μM 내지 3 μM 및 더 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 보르테조밉은 0.002 μM 내지 40 μM, 더 바람직하게는 0.01 μM 내지 4 μM 및 가장 바람직하게는 0.01 μM 내지 0.4 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 보르테조밉은 0.04 μM 내지 4 μM 사이, 예컨대, 0.04 μM의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 방법은 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제 없이 배지에서 형질도입되는 γδ T 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 CAR-γδ T 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 이는
1) γδ T 세포를 제공하는 단계; 및
2) γδ T 세포를 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제의 존재 하에서 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 1)은 IL-2 및 ZOL로 보충되는 배지에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 3) γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제 없이 배지에서 형질도입된 γδ T 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시양태에서, γδ T 세포는 δ1, δ2 또는 δ3 T 세포이다.
일부 실시양태에서, γδ T 세포는 γ9δ2 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, 작용제는 NF-κB 신호전달 경로에 작용한다.
일부 실시양태에서, 작용제는 IKKα, IKKβ, IKKε, IκB 키나아제, TBK1, PKD1, NF-κB, Akt, PKR, TAK1, IRAK1/4 또는 프로테아좀의 억제제이다.
일부 실시양태에서, 작용제는 1) IκBα의 인산화를 억제할 수 있거나; 2) IκB 키나아제의 기능을 억제할 수 있거나; 3) Akt의 기능을 억제할 수 있거나; 또는 4) NF-κB, p38 및 JNK 신호전달의 기능을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 작용제는 BX795, BAY11-7082, 커큐민, 덱사메타손, 2-아미노퓨린, (5Z)-7-옥소제아에놀, IRAK1/4 억제제 I 및 보르테조밉으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 VSV-G 위형화 렌티바이러스 벡터이다.
일부 실시양태에서, γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제는 BX795이다.
일부 실시양태에서, BX795는 0.02 μM 내지 60 μM, 더 바람직하게는 0.2 μM 내지 6 μM 및 가장 바람직하게는 0.4 μM 내지 2 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, BX795는 2 μM 이하의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, BX795는 0.2 μM 내지 0.6 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, BAY11-7082는 0.1 μM 내지 2000 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM 내지 200 μM 및 가장 바람직하게는 5 μM 내지 100 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 BAY11-7082는 0.5 μM 내지 50 μM 및 더 바람직하게는 5 μM 내지 50 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 커큐민은 0.1 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 1 μM 내지 100 μM 및 가장 바람직하게는 2 μM 내지 20 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 커큐민은 1 μM 내지 100 μM 및 더 바람직하게는 10 μM 내지 100 μM 또는 1 μM 내지 10 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 덱사메타손은 0.01 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 0.1 μM 내지 50 μM 및 가장 바람직하게는 1 μM 내지 10 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 덱사메타손은 0.064 μM 내지 6.4 μM 및 가장 바람직하게는 0.64 μM 내지 6.4 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 2-아미노퓨린은 0.5 μM 내지 5000 μM, 더 바람직하게는 5 μM 내지 1000 μM 및 가장 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 2-아미노퓨린은 5 μM 내지 500 μM 및 더 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.01 μM 내지 600 μM, 더 바람직하게는 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, IRAK1/4 억제제 I은 0.01 μM 내지 300 μM, 더 바람직하게는 0.03 μM 내지 30 μM 가장 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 IRAK1/4 억제제 I은 0.03 μM 내지 3 μM 및 더 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM 사이의 농도로 사용된다.
일부 실시양태에서, 보르테조밉은 0.002 μM 내지 40 μM, 더 바람직하게는 0.01 μM 내지 4 μM 및 가장 바람직하게는 0.01 μM 내지 0.4 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 보르테조밉은 0.04 μM 내지 4 μM 사이, 예컨대, 0.04 μM의 농도로 사용된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 위에서 설명되는 방법에 의해 제조되는 CAR-γδ T 세포를 포함하는 제조물을 제공한다.
일부 실시양태에서, CAR-γδ T 세포는 CD4 또는 B7H3을 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 제조물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 종양의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 종양은 전립선 종양, T 세포 백혈병 또는 난소암이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 종양을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 이는 대상체에 치료적 유효량의 제조물 또는 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양은 전립선 종양, T 세포 백혈병 또는 난소암이다.
본원에서 제공되는 γδ T 세포를 형질도입하는 방법은 후속적인 세포 확장 과정 동안 형질도입율을 증가시킬 수 있고/있거나 형질도입율의 감소를 방지할 수 있다. 방법은 종양 치료를 위한 CAR-γδ T 세포를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 소분자 억제제의 사용 없이, CAR-γδ T의 양성 비율은 상당히 낮고, 이는 임상적 응용분야에서 이의 응용분야인 충분한 CAR 양성 γδ T 세포를 수득하는 것을 억제할 수 있으며, 더 많은 세포가 제조되어야 하고, 더 많은 세포가 환자로 주입되어야 하며, 이는 더 많은 제조 비용 및 더 높은 수술 위험을 가져올 수 있다.
도 1은 2개의 공여체로부터 유래한 기존의 αβ T 세포의 렌티바이러스 형질도입 효율성을 나타내었다. 형질도입 치료는 αβ T 세포가 48시간 동안 시험관내(in vitro)에서 자극된 후 적용되었다. 또한, 본 발명자들은 16일 동안 세포 배양 진행 동안 형질도입율의 변화를 계산하였다.
도 2는 2μM/6μM BX795를 사용하였거나 사용하지 않은 γδ2 T 세포의 렌티바이러스 형질도입을 나타낸 4개의 그래프를 포함하였다. 도 2a는 배양 진행 동안 총 생존 세포 수를 나타내며, 본 발명자들은 4일차 내지 22일차까지 2일마다 데이터를 모니터링하였다. 도 2b는 4일차부터 22일차까지 세포 배양 시간 동안 총 세포 중 γδ2 T 세포 백분율을 나타내었다. 도 2c는 4일차부터 22일차까지 γδ2 T 세포의 형질도입 효율성을 나타내며 도 2d는 4일차부터 22일차까지 세포 배양 시간 동안 양성 형질도입 γδ2 T 세포의 세포 수를 나타내었다.
도 3은 상이한 농도(0.2μM, 0.6μM 또는 2μM)로 BX795를 사용하였거나 사용하지 않은 γδ2 T 세포의 렌티바이러스 형질도입을 나타내는 4개의 그래프를 포함하였다. 도 3a는 배양 진행 동안 총 생존 세포 수를 나타내며, 본 발명자들은 5일차 내지 15일차까지 2일마다 데이터를 모니터링하였다. 도 3b는 5일차부터 15일차까지 세포 배양 시간 동안 총 세포 중 γδ2 T 세포 백분율을 나타내었다. 도 3c는 5일차부터 15일차까지 γδ2 T 세포의 형질도입 효율성을 나타내며 도 3d는 5일차부터 15일차까지 세포 배양 시간 동안 양성 형질도입 γδ2 T 세포의 세포 수를 나타내었다.
도 4는 γδ2 T 세포의 인간 전립선 종양 세포(PC3)에 대한 세포독성을 나타내었다. γδ2 T 세포는 0.2 μM 또는 0.6 μM의 BX795를 사용하거나 사용하지 않고 배양되었다. γδ2 T 세포 대 종양 세포의 비율은 3:1이었으며 세포 혼합물은 세포독성 효율성의 분석 전 24시간 동안 일반 세포 배양 조건에서 배양되었다.
도 5는 0.6 μM의 BX-975의 존재 또는 부재 하에서 γδ2 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다. (A) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 형질도입율; (B) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 생존 세포 수.
도 6은 BAY11-7082(0.5 μM, 5μM 또는 50 μM)의 존재 또는 부재 하에서 γδ2 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다. (A) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 형질도입율; (B) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 생존 세포 수.
도 7은 커큐민(1 μM, 10 μM 또는 100 μM)의 존재 또는 부재 하에서 γδ2 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다. (A) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 형질도입율; (B) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 생존 세포 수.
도 8은 덱사메타손(0.064 μM, 0.64 μM 또는 6.4 μM)의 존재 또는 부재 하에서 γδ2 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다. (A) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 형질도입율; (B) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 생존 세포 수.
도 9는 2-아미노퓨린(5 μM, 50 μM 또는 500 μM)의 존재 또는 부재 하에서 γδ2 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다. (A) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 형질도입율; (B) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 생존 세포 수.
도 10은 (5Z)-7-옥소제아에놀(0.6 μM, 6 μM 또는 60 μM)의 존재 또는 부재 하에서 γδ2 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다. (A) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 형질도입율; (B) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 생존 세포 수.
도 11은 IRAK1/4 억제제 I(0.03 μM, 0.3 μM 또는 3 μM)의 존재 또는 부재 하에서 γδ2 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다. (A) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 형질도입율; (B) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 생존 세포 수.
도 12는 보르테조밉(0.04 μM, 0.4 μM 또는 4 μM)의 존재 또는 부재 하에서 γδ2 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다. (A) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 형질도입율; (B) 5일차, 8일차 및 10일차에서의 생존 세포 수.
도 13은 BX795(0.06 μM, 0.6 μM 또는 6 μM), BAY11-7082(0.5 μM, 5 μM 또는 50 μM), 커큐민(1 μM, 10 μM 또는 100 μM), 덱사메타손(0.064 μM, 0.64 μM 또는 6.4 μM), 2-아미노퓨린(5 μM, 50 μM 또는 500 μM), (5Z)-7-옥소제아에놀(0.6 μM, 6 μM 또는 60 μM), IRAK1/4 억제제 I(0.03 μM, 0.3 μM 또는3 μM) 및 보르테조밉(0.04 μM, 0.4 μM 또는 4 μM)을 포함하는 상이한 투여량 하의 저분자 억제제의 존재 또는 부재 하에서 γδ1 T 세포의 형질도입의 결과를 나타내었다.
도 14는 CAR γδ2 T 세포의 CD4 양성 종양 세포에 대한 사멸 활성을 나타내었다. (A) CD4 양성 종양 세포에 대한 세포독성; (B) 분비된 IFNγ; (C) 분비된 TNFα.
도 15는 CAR γδ2 T 세포의 생체내(in vivo) 저카트(Jurkat) T-luc 종양 세포에 대한 종양 억제 활성을 나타내었다. (A) 표시된 일차에 촬영한 생체발광　영상화 사진; (B) 총 생체발광 강도의 변화; (C) 생존 곡선.
도 16은 CAR γδ2 T 세포의 생체내(in vivo) SKOV3-luc 종양 세포에 대한 종양 억제 활성을 나타내었다. (A) 표시된 일차에 촬영한 생체발광　영상화 사진; (B) 총 생체발광 강도의 변화.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명하는 바와 유사하거나 동일한 임의의 방법, 장치 또는 물질을 본 발명의 실시에서 사용할 수 있다. 다음의 정의는 본원에서 사용하는 특정 용어의 이해를 촉진하기 위해 제공되며 본 개시내용의 범위를 제한하는 의도가 아니다.
단수 표현은 본원에서 문법적 객체의 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, “요소”는 하나의 요소 또는 하나보다 많은 요소를 의미한다.
문맥상 달리 요구하지 않는 한, 용어 “포함” 및 “포함하다” 및 “포함하는”과 같은 변형은 언급하는 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 포함한다는 의미이며 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제한다는 의미가 아니다. 본원에서 사용되는 경우 용어 “포함”은 용어 “함유” 또는 “포함”으로 때때로 본원에서 사용되는 경우 용어 “갖는”으로 대체될 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 설명되는 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치는 용어“약”에 의해 모든 경우에서 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 수치는 전형적으로 인용되는 값의 ± 10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도 범위는 0.9 mg/mL 내지 11 mg/mL를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 범위의 사용은 문맥상 달리 명시적으로 나타내지 않는 한 이러한 범위 내의 정수 및 값의 분수를 포함하여 모든 가능한 하위 범위, 해당 범위 내의 모든 개별 수치를 명시적으로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “선천적 항바이러스 활성”은 숙주 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 바이러스의 유전자의 발현을 억제하는 숙주 세포의 선천적 면역계의 활성을 지칭한다. 사이토졸에 있는 dsRNA 또는 dsDNA 검열체(censor)(예를 들어, 레티노산 유도성 유전자 I(RIG-I), 고리형 GMP-AMP 합성효소)는 바이러스 핵산을 인식할 수 있으며 제I형 인터페론 반응을 유도하여 숙주 세포를 항바이러스 상태로 촉발할 수 있다. 따라서, “선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제”는 숙주에서 항바이러스 상태의 발달을 방지할 수 있는 억제제를 지칭한다. 비제한적 예에서, 작용제는 IkB 키나아제(IKKε) 및/또는 TANK-결합 키나아제 1(TBK1) 억제제, 예를 들어, BX795이다. 다른 비제한적 예에서, 억제제, 예컨대, BAY11-7082, 커큐민, 덱사메타손, 2-아미노퓨린, (5Z)-7-옥소제아에놀, IRAK1/4 억제제 I 및 보르테조밉은 선천적 항바이러스 활성을 억제하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “벡터”는 숙주 세포에서 다른 외래 또는 이종 핵산의 전사 및/또는 발현을 허용하는 특정한 핵산 요소를 갖는, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는, 핵산 구조체 또는 서열을 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편일 수 있다. 벡터는 복제 기점과 같이 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 표지자 유전자 및 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 삽입되는 표적 유전자 또는 유전자들의 전사 및/또는 번역을 허용하는 필요한 조절 서열을 함유하는 발현 벡터일 수 있다. 일부 비제한적 예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터이다. γδ T 세포에 대한 유전자 전달에 적합한 바이러스 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 백시니아바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 본원에서 개시되는 비제한적 예에서, γδ T 세포는 하나 이상의 표적 단백질(예를 들어, GFP 또는 CAR)을 인코딩하는 하나 이상의 이종 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입된다.
용어 “형질도입하다”, “형질도입하는” 또는 “형질도입”은 핵산을 숙주 세포로 전달하는 과정, 예컨대, 이종 핵산을 숙주 세포로 전달하는 과정을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 해당 용어는 핵산이 세포에 도입되는 모든 기법을 포함하며, 이는 플라스미드 벡터를 사용하는 형질전환, 바이러스 벡터 또는 바이러스 입자를 사용하는 감염 및 전기천공, 뉴클레오펙션(nucleofection), 리포펙션(lipofection) 또는 입자 총에 의한 네이키드 DNA(naked DNA)의 도입을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 “위형화” 또는 “위형화된”은 외피를 갖는 다른 바이러스로부터 유래하는 외피 당단백질을 보유하는 벡터 입자를 지칭한다. 비제한적 예에서, γδ T 세포를 형질도입하기 위해 사용되는 렌티바이러스 벡터는 VSV-G 위형화 렌티바이러스 벡터이다.
본원에서 사용되는 용어 “키메라 항원 수용체(CAR)”는 인공 수용체 단백질을 지칭하며, 이는 면역 세포, 특히, T 세포의 표면상에서 발현되고 면역 세포에 표적 세포(예를 들어, 종양 특이적 항원)상의 특정 항원(예를 들어, 종양 특이적 항원)을 표적화할 수 있는 신규 능력을 부여하도록 의도된다. 수용체는 항원 결합 및 T 세포 활성화 기능을 단일 수용체로 조합할 수 있기 때문에 “키메라”이다. 일반적인 형태에서, 키메라 항원 수용체는 단일클론 항체(mAb)의 특이성을 T 세포의 효과기 기능에 이식시킨다. CAR가 T 세포에서 발현되면, CAR 변형 T 세포(CAR-T 또는 CAR-T 세포)는 항원 특이적 인식, 항종양 반응성 및 증식과 같은 일부 특성을 획득하며, 따라서, "살아있는 약물"로 작용하여 표적 종양 세포를 근절할 수 있다. CAR-T 세포 치료는 자가 항원에 대한 내성을 무효화할 수 있으며 환자의 MHC 상태에 의존하지 않는 치료를 제공할 수 있다. CAR은 항원 특이적 결합 부위, 막횡단 영역 및 신호전달 세포질 도메인(예를 들어, CD3ζ 사슬)을 포함하는 막횡단 단백질로서 발현된다. 항원 특이적 결합 부위는 일반적으로 가요성 링커로 연결되는 중쇄 및 경쇄로 구성되는 단일클론 항체 유래 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 최근 CAR 구조체는 생체내(in vivo)에서 T 세포 생존을 향상시키기 위해 CD28 또는 4-1 BB와 같은 공동 자극 분자로부터 추가 세포질 도메인을 통합하였다. CAR은 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR은 N-말단에서 신호전달 펩타이드 및 세포외 도메인 및 막횡단 도메인 사이에서 힌지 영역을 더 포함한다. 세포외 도메인은 표적 특이적 결합 요소(또한, 항원 인식 도메인 또는 항원 결합 도메인으로 지칭됨)를 포함한다. 세포내 도메인 또는 그렇지 않으면 세포질 도메인은 보통 하나 이상의 공동 자극 신호전달 도메인 CD3 ζ 사슬 부분을 포함한다. 공동 자극 신호전달 도메인은 공동 자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. CAR 분자에 의한 항원 인식 또는 항원 표적화는 가장 일반적으로 항체 또는 항체 단편의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 CD4 또는 B7H3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
본원에서 사용되는 용어 “NF-κB 신호전달 경로”는 NF-κB 전사 인자의 활성화 또는 비활성화를 유도하는 신호전달 경로를 지칭한다. NF-κB 전사 인자는 면역, 스트레스 반응, 세포자멸사 및 분화의 중요한 조절자이다. 포유동물에서, 전사 인자 NF-κB 패밀리(family)의 5개의 구성원인 RELA (p65), RELB 및 c-REL, 및 전구체 단백질 NF-κB1 (p105) 및 NF-κB2 (p100)가 있다. NF-κB 전사 인자는 다양한 유전자의 프로모터 및 인핸서에 있는 κB 부위에 이량체로서 결합하여 전사를 유도하거나 억제한다. NF-κB 활성화는 2개의 주요 신호전달 경로인 정형적(canonical) 및 비정형적 NF-κB 신호전달 경로를 통해 발생한다. 정형적 NF-κB 경로는 다양한 면역 수용체, 예컨대, TNFR, TLR 및 IL-1R로부터 유래한 신호에 의해 촉발되며, 이는 TAK1를 활성화한다. 이후, TAK1은 IKKβ의 인산화를 통해, 촉매성(IKKα 및 IKKβ) 및 조절(NEMO) 하위단위로 구성되는, IκB 키나아제(IKK) 복합체를 활성화한다. 자극 시, IKK 복합체는, 주로 IKKβ를 통해, κB 패밀리 억제제(IκB)의 구성원, 예컨대, IκBα 및 IκB 유사 분자 p105를 인산화하며, 이는 세포질에서 NF-κB 구성원을 격리한다. IκBα는 p50 및 REL 패밀리(RELA 또는 c-REL)의 구성원의 이량체와 연관이 있는 반면 p105는 p50 또는 REL(RELA 또는 c-REL)과 연관이 있다. IKK에 의한 인산화 시, IκBα 및 p105는 프로테아좀에서 분해되고, 이는 정형적 NF-κB 패밀리 구성원의 핵 전위(nuclear translocation)를 초래하며, 이는 RELA-p50, c-REL-p50 및 p50-p50를 포함하는, 다양한 이량체 복합체 형태인, 특정한 DNA 요소에 결합한다. 또한, NF-κB 도입의 비전형적 IKK 독립적 경로는 저산소증, UV 유전자독성 스트레스와 같은 NF-κB 활성을 증가시키기 위해 병렬 신호전달 경로를 통합하는 기전을 제공한다. 비정형적 NF-κB 경로는 특정 TNF 수퍼패밀리(superfamily) 구성원, 예컨대, CD40L, BAFF 및 림포톡신(lymphotoxin)-β(LT-β)에 의해 유도되며, 이는 TRAF2, TRAF3, cIAP1/2가 수용체 복합체로 동원되도록 자극한다. 활성화 cIAP는 K48 유비퀴틴화 및 TRAF3의 프로테아좀 분해를 매개하며, 이는 NF-κB 유도 키나아제(NIK)의 안정화 및 축적을 초래한다. NIK는 IKKα를 인산화하고 활성화하며, 이는 차례로 p100을 인산화하고 p100 처리를 촉발하며 p52의 생성 및 p52 및 RELB의 핵 전위를 유도한다.
용어 “약제학적 조성물”은 활성 성분 및 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태의 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 제조물을 지칭한다. 본원에서 사용되는 “생리학적으로　허용 가능한 부형제”는 인간 또는 가축에게 사용하는 것이 허용 가능한 임의의 보조제(adjuvant), 담체, 희석제, 보존제, 분산제, 현탁제, 활성화제, 등장제, 용매, 계면활성제 또는 유화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 CAR-T 세포 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 종양(또는 암)을 치료하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 “치료” 또는 “치료하다”는 임상적 결과를 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적에 대해, 유익하거나 원하는 임상적 결과는 질환으로부터 초래되는 하나 이상의 증상의 완화, 질환 정도의 약화, 질환의 안정화(예를 들어, 질환 악화 방지 또는 지연), 질환 확산(예를 들어, 전이) 방지 또는 지연, 질환 재발 방지 또는 지연, 질환 상태의 호전, 질환의 (부분적 또는 전체적) 차도 제공, 질환을 치료하는 데 필요한 하나 이상의 다른 약제의 용량 감소, 질환 진행 지연, 삶의 질 향상 및/또는 생존 연장 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, "치료"는 질환의 병리학적 결과의 감소를 포괄한다. 본 발명의 방법은 이러한 치료 양태 중 하나 이상을 고려한다.
용어 “치료적 유효량”은 대상체를 “치료”하는 데 효과적인 양을 포함할 수 있다. 치료량을 나타내는 경우, 특정 실시양태에서 고려되는 투여될 정밀한 양은 대상체의 병태를 고려하여 의료 전문가에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 “용어 대상체”는 본 발명의 CAR γδ T 세포 또는 CAR γδ T 세포를 포함하는 조성물이 투여될 유기체를 지칭한다. 바람직하게는, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 “제조물”은 본 발명의 방법에 의해 제조되는 CAR γδ T 세포를 포함하는 생성물 또는 제품을 지칭한다. 비제한적 예로서, 제조물은 용액, 현탁액 등의 형태일 수 있다.
BX795는 TANK 결합 키나아제 1(TBK1) 및 IκB 키나아제 ε(IKKε)의 억제제이다. 이의 식은 다음과 같다(CAS 위탁 번호 제 702675-74-9호):
본 발명에서 사용되는 다른 억제제는 다음과 같은 식을 갖는다.
BAY 11-7082(CAS 번호 제 19542-67-7호)
커큐민(CAS 번호 제 458-37-7호)
2-아미노퓨린(CAS 번호 제 452-06-2호)
덱사메타손(CAS 번호 제 50-02-2호)
(5Z)-7-옥소제아에놀(CAS 번호 제 253863-19-3호)
IRAK1/4 억제제 I(CAS 번호 제 509093-47-4호)
보르테조밉(CAS 번호 제 179324-69-7호)
본 발명의 발명자들은 γδ T 세포가 바이러스 벡터를 사용하여 형질도입되는 경우, 형질도입율이 형질도입 후 4일 내지 8일 동안 유의하게 감소할 수 있다는 것을 발견하였다. 일반적으로, 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 발현될 적어도 하나의 표적 유전자를 함유한다. 따라서, 형질도입율의 변화는 유세포분석을 통해 양성 세포(즉, 표적 유전자를 발현하는 세포)의 백분율을 측정하여 모니터링될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 γδ T 세포가 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제(이하 본원에서 “선천적 항바이러스 활성 억제제”로 지칭됨), 예컨대, BX795의 존재 하에서 바이러스 벡터를 사용하여 형질도입되는 경우, 이후 γδ T세포를 선천적 항바이러스 활성 억제제(예를 들어, BX795)의 보충 없이 배지에서 배양하더라도, 전달되는 바이러스 벡터가 γδ T 세포에서 안정적으로 잔류할 수 있다는 것을 예기치 못하게 발견하였다. 또한, 세포에서 벡터의 유지는 예컨대, 유세포분석에 의해 검출될 수 있다. 이는 CAR-γδ T 세포가 종양 치료를 위해 환자에게 반환될 경우 중요하다. 치료 전, 충분한 수의 CAR 양성 γδ T 세포를 제조하여야 한다. 양성 비율이 γδ T 세포의 시험관내(in vitro) 확장 동안 점차적으로 감소하는 경우, 임상적 응용분야를 위해 충분한 양의 양성 세포를 수득할 수 없다. 또한, 지속적인 양성 비율 감소는 재주입 후 세포가 생체내(in vivo)에서 CAR을 상실하여 치료 효과를 상실할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 억제제(예를 들어, BX795)가 적합한 농도로 사용되는 경우, 형질도입율을 개선하고/하거나 유지하면서 γδ T 세포의 세포 성장 및 확장을 손상시키지 않는다는 것을 더 발견하였다. 일부 실시양태에서, BX795는 0.02 μM 내지 60 μM, 더 바람직하게는 0.2 μM 내지 6 μM 및 가장 바람직하게는 0.4 μM 내지 2 μM의 농도로 사용된다. 다른 실시양태에서, BX795는 0.2 μM 내지 6 μM, 예컨대, 0.2 μM 내지 0.6μM의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, BX795는 2 μM 이하, 예컨대, 0.2 μM 내지 2 μM의 농도로 사용된다. 일부 바람직한 실시양태에서, BX795는 0.2 μM 내지 0.6 μM, 예컨대, 0.3, 0.4, 0.5 또는 0.6 μM의 농도로 사용된다. 더 바람직한 실시양태에서, BX795는 0.6 μM의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, BAY11-7082는 0.1 μM 내지 2000 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM 내지 200 μM 및 가장 바람직하게는 5 μM 내지 100 μM 사이의 농도로 사용된다. 다른 실시양태에서, BAY11-7082는 0.5 μM 내지 50 μM, 예컨대, 5 μM 내지 50 μM의 농도로 사용된다. 비제한적 예에서, BAY11-7082는 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50 μM의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, 커큐민은 0.1 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 1 μM 내지 100 μM 및 가장 바람직하게는 2 μM 내지 20 μM의 농도로 사용된다. 다른 실시양태에서, 커큐민은 1 μM 내지 100 μM, 예컨대, 10 μM 내지 100 μM 또는 1 μM 내지 10 μM의 농도로 사용된다. 비제한적 예에서, 커큐민은 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 μM의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, 덱사메타손은 0.01 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 0.1 μM 내지 50 μM 및 가장 바람직하게는 1 μM 내지 10 μM의 농도로 사용된다. 다른 실시양태에서, 덱사메타손은 0.064 μM 내지 6.4 μM, 예컨대, 0.64 μM 내지 6.4 μM의 농도로 사용된다. 비제한적 예에서, 덱사메타손은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 μM의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, 2-아미노퓨린은 0.5 μM 내지 5000 μM, 더 바람직하게는 5 μM 내지 1000 μM 및 가장 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM의 농도로 사용된다. 다른 실시양태에서, 2-아미노퓨린 은 5 μM 내지 500 μM, 예컨대, 50 μM 내지 500 μM의 농도로 사용된다. 비제한적 예에서, 2-아미노퓨린은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 또는 500 μM의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.01 μM 내지 600 μM, 더 바람직하게는 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용된다. 다른 실시양태에서, (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.6 μM 내지 60 μM, 예컨대, 0.6 μM 내지 6 μM의 농도로 사용된다. 비제한적 예에서, (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 또는 6.0 μM의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, IRAK1/4 억제제 I은 0.01 μM 내지 300 μM, 더 바람직하게는 0.03 μM 내지 30 μM 및 가장 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM의 농도로 사용된다. 다른 실시양태에서, IRAK1/4 억제제 I은 0.03 μM 내지 3 μM, 예컨대, 0.3 μM 내지 3 μM의 농도로 사용된다. 비제한적 예에서, IRAK1/4 억제제 I은 0.05, 0.08, 0.1, 0.5, 0.8, 1.0, 1.2, 1.6, 1.8, 2.0, 2.3, 2.5 또는 3.0 μM의 농도로 사용된다. 일부 실시양태에서, 보르테조밉은 0.002 μM 내지 40 μM, 더 바람직하게는 0.01 μM 내지 4 μM 및 가장 바람직하게는 0.01 μM 내지 0.4 μM 사이의 농도로 사용된다. 다른 실시양태에서, 보르테조밉은 0.04 μM 내지 4 μM, 예컨대, 0.04 μM의 농도로 사용된다. 위에서 설명되는 범위를 초과하는 농도는 이러한 농도의 억제제가 형질도입율을 개선(형질도입율을 증가시키고/시키거나 유지)할 수 있고 γδ T 세포의 세포 성장 및 확장을 유의하게 손상시키지 않는다면 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
따라서 본 개시내용은 선천적 항바이러스 활성 억제제(예를 들어, BX795)의 존재 하에서 바이러스 벡터를 사용하여 γδ T 세포를 형질도입하는 방법을 제공한다. 억제제의 사용은 형질도입 과정 후 형질도입율을 개선할 수 있고 바이러스 벡터의 손실을 방지할 수 있다. 또한, 본 개시내용은 CAR-γδ T 세포를 제조하기 위한 방법을 제공하며, 이는 선천적 항바이러스 활성 억제제(예를 들어, BX795)의 존재 하에서 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 γδ T 세포를 형질도입하는 단계를 포함한다. 선천적 항바이러스 활성 억제제(예를 들어, BX795)의 사용은 γδ T 세포 또는 CAR-γδ T 세포의 생존율 및 사멸 활성에 불리한 영향을 미치지 않는다.
실시예
본 발명의 주요 목표는 γδ T 세포의 바이러스 형질도입 효율성을 안정화하고 개선하는 것이며, 이는 키메라 항원 수용체 발현 γδ T 세포(CAR-γδ T 세포)를 구조체화하는 데 더 적용될 수 있다. 본 발명자들이 취득한 데이터에 따르면, 항바이러스 억제제의 부재 하에서, αβ T 세포의 바이러스 형질도입 효율성은 약 60%로 매우 높았으며, 형질도입율이 시험관내(in vitro) 배양 조건 동안 적어도 2주 동안 안정적으로 유지되었다. 그러나, γδ T 세포의 경우, 형질도입율이 시험관내(in vitro) 배양 4일차(바이러스 형질도입 48시간 후) 내지 8일차까지 80%부터 20%까지 급격히 감소하였다. BX795(최종 농도는 0.6 μM였음)를 첨가하면 형질도입율의 감소를 억제할 수 있었으며 최종 형질도입 효율성은 65%로 유지되었다. 반면, BX795는 γδ T 세포에 손상을 주지 않았으며, 채취된 γδ T 세포는 후속 기능 실험을 수행하기 위해 사용될 수 있었다. 또한, 다른 저분자 억제제를 사용하여 수득된 실험 결과가 제공되었다. 따라서, 본 발명자들의 발명은 바이러스 형질도입에서 형질도입율 감소 문제를 해결하였으며, 이는 CAR-γδ T 세포 발달과 같은 γδ T 세포 유전자 편집을 위해 더 사용될 수 있었다.
세포주
293T 세포 및 SKOV3 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS) (GIBCO), 0.1 mM의 비필수 아미노산 및 6 mM의 L-글루타민을 보충한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco)에서 유지하였다.
저카트(Jurkat) T 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)(GIBCO), 0.1 mM의 비필수 아미노산 및 6 mM L-글루타민을 보충한 RPMI-1640 배지(Gibco)에서 유지하였다.
렌티바이러스 벡터의 생성
VSV-G 위형화 렌티바이러스 벡터를 이러한 방법에서 적용하였다. 1x10^7 293T 세포를 폴리-D-리신으로 코팅된 100 mm 디쉬에 플레이팅하였다. 다음 날, 세포가 30ug PEI의 형질감염 시약을 사용하는 6 μg의 pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP 플라스미드(Addgene, Plasmid #72263) 또는 pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP로부터 변형된 pCDH-EF1-CAR-T2A-copGFP, 4 μg의 pspAx2(Addgene, Plasmid #12260), 2 μg의 pCMV-VSV-G (Addgene, Plasmid #8454)를 사용하여 형질감염되었다. 형질감염 8시간 후, 세포 배양 배지를 교체하였다. 상층액을 48시간 및 72시간 후 수집하였다. 바이러스는 Lenti-X™ 농축기(Takara)를 사용하여 농축하였고 293T 세포의 형질도입에 의해 바이러스 역가를 모니터링하였으며 추가 사용 시까지 -80°C에서 농축된 바이러스를 보관하였다.
1차 세포 배양
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)를 사용하는 구배 원심분리로 단리하였으며 인산 완충 생리식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 세포 수 및 생존율을 AO/PI 염색으로 평가하였다. γδ2 T 세포 증폭의 경우: PBMC를 2x10^6 세포/ml의 농도로 무혈청 배지(Gibco)에서 배양하였으며, 1000 U/ml의 rhIL-2 및 5μM의 ZOL로 보충하였다. γδ1 T 세포 증폭의 경우: PBMC를 정제 TS-1 단일클론 항체(NOVUS, NBP2-22488)로 사전코팅된 배양 플레이트에서 1x10^6 세포/ml의 농도로 무혈청 배지(Gibco)에서 배양하였으며, 1000 U/ml의 rhIL-2로 보충하였다. 기존 αβT 세포 증폭의 경우, PBMC를 정제 항인간 CD3 및 항인간 CD28 단일클론 항체로 사전코팅된 배양 플레이트에서 2x10^6 세포/ml의 농도로 무혈청 배지에서 배양하였으며, 1000 U/ml의 rhIL-2로 보충하였다.
αβ T 세포 또는 γδ T 세포의 렌티바이러스 형질도입
렌티바이러스 형질도입의 경우, 200ul PBS에 희석한 1x10^7 CFU의 렌티바이러스를 RetroNectin 시약(Takara)으로 사전코팅된 24웰 플레이트에 첨가하였으며 32℃에서 2시간 동안 2,000g까지 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액이 제거되었으며 플레이트를 PBS를 사용하여 3회 가볍게 세척하였다.
αβ T 세포의 바이러스 형질도입의 경우, 1x10^6 PBMC를 시험관내(in vitro)에서 48시간 동안 항인간 CD3/CD28 단일클론 항체로 자극한 RetroNectin 시약으로 사전코팅된 플레이트에 시딩하였다. 세포를 32℃에서 10분 동안 800g까지 농축하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2로 배양하였다.
γδ2 T 세포의 바이러스 형질도입의 경우, 위에서 언급한 γδ2 T 세포 배양 배지(rhIL-2 및 ZOL이 있는 Gibco 무혈청 배지)에서 48시간 후 시험관내(in vitro)에서 배양된 1x10^6 PBMC를 시딩하였다. 저분자 억제제를 첨가하거나 첨가하지 않았고 웰을 혼합하였으며 32℃로 10분 동안800g까지 세포를 농축하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2로 배양하였다. 24시간 후 세포 배양 배지를 교체하여 저분자 억제제 시약을 폐기하였다.
γδ1 T 세포의 바이러스 형질도입의 경우, 위에서 언급한 γδ1 T 세포 배양 배지(rhIL-2 및 PBMC가 있는 Gibco 무혈청 배지를 TS-1 단일클론 항체로 사전자극하였다)에서 48시간 후 시험관내(in vitro) 배양한 1x10^6 PBMC를 시딩하였다. 저분자 억제제를 첨가하거나 첨가하지 않았고 웰을 혼합하였으며 세포를 32℃에서 10분 동안 800g까지 농축하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2로 배양하였다. 24시간 후 세포 배양 배지를 교체하여 저분자 억제제 시약을 폐기하였다.
2일 내지 3일마다 자동화 세포 계수기로 세포 수를 계산하였으며 형질도입율(GFP 양성 비율)을 유세포분석으로 분석하였다. 형질도입율을 γδ2 또는 γδ1 T 세포의 게이트에서 모니터링하였다.
유세포분석
세포를 PBS를 사용하여 1회 세척한 후 세척을 30분 동안 4℃로 FACS 완충제(PBS+1% FBS+2.5mM EDTA)에 희석한 항체를 사용하여 염색하였다. 배양한 완충액의 일반적인 부피는 2x10^5 세포에 대해 50 μL였다. 배양 후, 세포를 FACS 완충제를 사용하여 2회 세척한 후, 세포를 200ul의 FACS 완충제에 재현탁하였으며 FACSCalibur(BD Biosciences)에 의한 데이터로 계산하였다. γδ2 T 세포에 대해 사용된 항체는: APC 항인간 CD3(Biolegend, 300412), BV421 항인간 TCR Vδ2(Biolegend, 331428)였다.
시험관내 세포독성 검정
신선한 무혈청 배지(Gibco)로 반딧불이 루시퍼라제를 안정적으로 발현한 효과기 T 세포 및 종양 세포를 재현탁하였다. 세포 밀도를 변형하고 효과기 T 세포 및 종양 세포를 96 웰 플레이트에 효과기 T 세포 대 종양 세포의 상이한 비율로 시딩한다. 각각의 웰의 최종 부피는 100ul이며 종양 세포의 세포 수는 1만이었다.
세포 혼합물을 12시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였고 세포를 완전히 혼합하였으며, 50ul의 세포를 다른 96 웰 플레이트에 배치하였고 키트(Luciferase Assay System, Promega, 카탈로그 번호 제 E1500호)의 지시에 따라 루시퍼라제 기질을 첨가하였다. 광도계로 플레이트를 판독하였다.
마우스 실험
생체내 효능 연구의 경우, 7주령 내지 9주령 암컷 NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스를 1×106 저카트 T 세포를 사용한 꼬리 정맥내 주사(i.v.) 또는 1×106 SKOV3 세포를 사용한 복강내 주사(i.p.)로 이식하였다. 저카트 T 세포 및 SKOV3 세포는 모두 반딧불이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하였다(0일차). 5×106 γδ T 세포를 5일차, 8일차, 11일차, 14일차 및 17일차에 저카트 T CDX 모델(i.v.)을 위해 종양 보유 마우스에 주사하였으며 5×106 γδ T세포를 5일차, 8일차 및 11일차에 SKOV3 CDX 모델(i.p.)을 위해 종양 보유 마우스에 주사하였다. 종양 부피를 IVIS Lumina LT 시스템(PerkinElmer)으로 측정하였다.
실시예 1. 기존 T 세포(αβ T 세포)의 렌티바이러스 형질도입 효율성
기존 T 세포의 렌티바이러스 형질도입을 2일차(시험관내(in vitro) 배양 48시간 후)에 적용하였다. 형질도입 효율성을 4일차부터 16일차까지 2일 또는 3일마다 모니터링하였다(도 1). 이는 도 1에서 확인할 수 있으며, 형질도입율은 대략 60%였으며 전체 배양 진행에서 안정적으로 유지되었다. T 세포를 2개의 상이한 공여체로부터 수득하였다.
실시예 2. γδ2 T 세포의 렌티바이러스 형질도입 효율성을 BX795로 개선할 수 있었으며 고투여량의 BX795는 γδ2 T 세포의 세포 성장을 손상시켰다
γδ2 T 세포의 렌티바이러스 형질도입을 2일차(시험관내(in vitro) 배양 48시간 후)에 적용하였다. 형질도입 효율성을 22일차까지 2일마다 모니터링하였으며 총 세포 수 및 γδ2 T 세포 백분율을 각각 계산하였다(도 2). 도 2a 및 도 2b에서 확인할 수 있듯이, 2μM 또는 6μM의 BX795는 γδ2 T 세포의 세포 성장을 손상시켰으며, 총 생존 세포 수(도 2a) 및 γδ2 T 세포 백분율(도 2b)는 BX795를 사용하지 않은 대조군보다 극적으로 낮았다.
반면, 대조군의 경우, 바이러스 형질도입율은 4일차에서 8일차까지 80%에서 20%로 급격히 감소하였으며, 그 후, 안정적으로 유지되었다(도 2c). BX795를 형질도입 진행 동안 첨가함에 따라, 바이러스 형질도입 효율성은 최종적으로 40%까지 유지되었으며 이는 대조군보다 유의하게 높았다(도 2c). BX795 적용군의 형질도입율이 더 높음에도 불구하고, 형질도입된 γδ2 T 세포의 세포 수는 고투여량에서 BX795의 세포 성장 억제로 인해 대조군(도 2d)보다 낮았다.
따라서, 렌티바이러스 형질도입 진행에서 BX795 적용은 형질도입 효율성을 향상시킬 수 있었으나 γδ2 T 세포의 세포 성장을 억제시킬 수 있었다. BX795 투여량의 감소는 형질도입 효율성을 개선할 수 있으나 γδ2 T 세포 성장에 영향을 미치지 않는다.
실시예 3. 저투여량의 BX795는 γδ2 T 세포의 세포 성장에 영향을 미치지 않고 γδ2 T 세포의 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
γδ2 T 세포의 렌티바이러스 형질도입에 대한 BX795 사용을 더 연구하기 위해, 본 발명자들은 0.2μM부터 2μM까지의 BX795의 기능을 비교하였다(도 3). 2μM의 BX795는 대조군과 비교하여 총 세포 수 및 γδ2 T 세포 백분율을 유의하게 감소시켰다(도 3a 및 3b). 그러나, 저투여량의 BX795(0.2 μM 또는 0.6μM)하에서, γδ2 T 세포 성장을 유의하게 영향을 받지 않았다.
전달 효능 측면에서 0.2μM BX795는 전달 효율성을 약 20%에서 40% 이상으로 향상시켰으며 0.6μM의 BX795는 최종 형질도입율이 대략 65%에 도달하였으며 이는 2μM의 BX795에서는 유의하지 않았다(도 3c). 또한, 총 양성 형질도입된 γδ2 T 세포는 0.2μM 또는 0.6uM의 BX795가 적용됨에 따라 크게 증가하였다(도 3d).
데이터는 렌티바이러스 형질도입 진행 동안 0.2μM 또는 0.6μM의 BX795를 첨가하면 모두 렌티바이러스 형질도입을 효율적으로 개선하는 데 도움이 될 수 있다는 점을 나타내었다.
실시예 4. BX795는 γδ2 T 세포의 세포독성에 대해 유의한 영향을 미치지 않았다
BX795가 γδ2 T 세포의 종양 세포 사멸 활성 능력에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하기 위해, γδ2 T 세포를 0.2 또는 0.6μM의 BX795를 사용하여 배양하였으며 PC3 종양 세포(하나의 인간 전립선 종양 세포주)에 대한 세포독성 효율성을 시험하였다(도 4). γδ2 T 세포 대 PC3 세포의 세포 수 비율은 3:1이었으며 사멸 시간은 24시간이었다. BX795를 사용하지 않고 배양한 대조군 γδ2 T 세포가 73.2%의 세포 사멸 효율성을 보유하였다는 점이 확인되었다. 0.6μM 및 0.2μM의 BX795를 사용하여 배양된 γδ2 T 세포의 세포독성은 각각 73.6% 및 68.4%였다. 따라서, BX795는 γδ2 T 세포의 세포 세포독성에 유의한 영향을 미치지 않았다.
실시예 5. BX795는 PBMC로부터 발달된 최종 γδ T 세포 생성물의 세포 유형에 유의한 영향을 미치지 않았다
본 발명자들은 0.6μM의 BX795를 사용하거나 사용하지 않는 PBMC로부터 배양한 최종 γδ T 세포 생성물의 세포 유형을 (시험관내 배양 12일차 후) 평가하였다. 데이터를 표 1에 나타내었다. 계산된 세포 유형은 γδ2 T, γδ2 CD56+ T, γδ1 T, αβT, NKT, T 보조, 세포독성 T, B 및 NK 세포를 포함하였다. BX795를 적용한 배양 조건이 대조군과 유사한 세포 유형을 나타낸다는 점을 확인할 수 있다.
표 1은 BX795를 사용하거나 사용하지 않고 배양된 최종 γδ T 세포 생성물의 세포 유형을 나타내었다. 이러한 분석은 배양 진행에서 총 세포 분화에 대한 BX795의 효과를 연구하기 위해 적용되었다. γδ2 T, γδ2 CD56+ T, γδ1 T, αβT, NKT, T 보조, 세포독성 T, B 및 NK 세포를 포함하는 상이한 세포 유형을 평가하였다.
실시예 6. BX795는 PBMC로부터 발달된 γδ2 T 세포 분화에 유의한 영향을 미치지 않았다
본 발명자들은 BX795 처리를 사용한 γδ2 T 세포의 분화를 비교하였으며, CD226 양성 γδ2 T 세포, NKG2D 양성 γδ2 T 세포, 미감작(nave) γδ2 T 세포, 중추 기억 γδ2 T 세포, 효과기 γδ2 T 세포 및 종결자 γδ2 T 세포를 포함하는 다양한 γδ2 T 하위유형이 계산되었다. 유의한 변화가 발견되지 않았다(표 2). 중추 기억 γδ2 T 세포의 경우, BX795를 첨가하면 백분율을 1.865%로부터 4.225%까지 개선할 수 있었다. 반면, 종결자 γδ2 T 세포 백분율은 2.595%로부터 대략 2%까지 감소하였다.
표 2는 BX795를 사용하거나 사용하지 않고 배양한 γδ2 T 세포의 분화를 나타내었다. 이러한 분석은 배양 진행에서 γδ2 T 세포 분화에 대한 BX795의 효과를 연구하기 위해 적용되었다. CD226+ γδ2 T 세포, NKG2D+ γδ2 T 세포, 미감작 γδ2 T 세포, 중추 기억 γδ2 T 세포, 효과기 γδ2 T 세포 및 종결자 γδ2 T 세포를 포함하는 상이한 γδ2 T 세포 하위유형을 평가하였다.
실시예 7. BX795는 γδ2 T 세포의 소진된 유전자 발현을 다소 증가시켰다
BX795가 γδ2 T 세포의 소진에 영향을 미치는지 여부를 계산하기 위해, 본 발명자들은 PD-1, LAG-3, TIGIT 및 TIM-3을 포함하는 γδ2 T 세포상에서 발현되는 일부 고전적인 소진된 유전자를 확인하였다(표 3). 데이터는 BX795 처리가 모든 소진된 세포 유형의 세포 백분율을 다소 개선하였다는 점을 나타내었다.
표 3은 BX795를 사용하거나 사용하지 않고 배양한 γδ2 T 세포의 소진 표지자의 발현 수준을 나타내었다. PD-1, LAG-3, TIGIT 및 TIM3을 포함한 소진 유전자를 계산하였다.
실시예 8. BX795는 γδ2 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
렌티바이러스 형질도입에 대한 BX795의 적용을 더 시험하기 위해, 본 발명자들은 CAR(B7H3 분자를 인식하는 scFv 도메인, CD8 힌지/막횡단, CD28 및 CD137 공동 자극 도메인 및 CD3ζ 활성화 도메인 포함) 관련 렌티바이러스를 사용하여 γδ2 T 세포를 형질도입하였다. 도 5a에서 나타낸 바와 같이, 대조군의 형질도입율은 5일차부터 8일차까지 10% 미만으로 빠르게 감소하였다. BX795(0.6uM)를 사용하여, 형질도입율은 10일차에 대략 40%를 안정적으로 유지되었다. 위에서 언급한 데이터와 같이, BX795의 첨가는 γδ2 T의 세포 성장에 영향을 미치지 않았다(도 5b).
실시예 9. BAY11-7082는 γδ2 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
대조군의 형질도입율은 5일차부터 10일차까지 대략 5%로 지속적으로 감소하였다. BAY11-7082는 0.5uM로부터 50uM까지 투여량 의존 방식으로 형질도입율을 향상시킬 수 있었다(도 6a). 50uM의 투여량으로, 형질도입율이 70%보다 높았다. BAY11-7082를 첨가하면 투여량 의존 방식으로 세포 성장이 손상되었으며 용량이 높을수록 총 세포 수가 감소하였다(도 6b).
실시예 10. 커큐민은 γδ2 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
대조군의 형질도입율은 5일차부터 10일차까지 대략 5%로 지속적으로 감소하였다. 커큐민(10uM)을 사용하여, 형질도입율은 10일차에 20%보다 높게 유지되었으나(도 7a), 이러한 투여량의 커큐민은 세포 성장을 다소 억제하였다(도 7b). 1uM의 저투여량의 커큐민은 형질도입율을 향상시키지 않았으나 세포 성장은 향상되었다. 100uM의 최고투여량은 형질도입율을 다소 향상시켰으나 세포 성장을 유의하게 손상시켰다.
실시예 11. 덱사메타손은 γδ2 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
대조군의 형질도입율은 5일차부터 10일차까지 대략 5%로 지속적으로 감소하였다. 덱사메타손은 0.064uM로부터 6.4uM까지 투여량 의존 방식으로 형질도입율을 향상시킬 수 있었다(도 8a). 6.4uM의 투여량으로, 형질도입율이 25%보다 높았다. 덱사메타손의 첨가는 세포 성장을 손상시키지 않았다(도 8a).
실시예 12. 2-아미노퓨린은 γδ2 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
대조군의 형질도입율은 5일차부터 10일차까지 대략 5%로 지속적으로 감소하였다. 2-아미노퓨린은 5uM로부터 500uM까지 투여량 의존 방식으로 형질도입율을 향상시킬 수 있었다(도 9A). 500uM의 투여량으로, 형질도입율은 대략 60%였다. 2-아미노퓨린의 첨가는 세포 성장을 손상시키지 않았다(도 9a).
실시예 13. (5Z)-7-옥소제아에놀은 γδ2 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
대조군의 형질도입율은 5일차부터 10일차까지 대략 5%로 지속적으로 감소하였다. 0.6uM의 (5Z)-7-옥소제아에놀을 사용한 형질도입율은 20%보다 높았으며 투여량이 6uM에 도달함에 따라 30%보다 높았다(도 10a). 60uM의 더 높은 투여량은 6uM의 투여량보다 형질도입율을 개선시키는 데 더 우수한 성능을 발휘하지 않았으나 세포 성장을 손상시켰다(도 10b). 0.6uM 및 6uM의 투여량의 (5Z)-7-옥소제아에놀의 적용은 세포 성장에 영향을 미치지 않았다.
실시예 14. IRAK1/4 억제제 I은 γδ2 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
대조군의 형질도입율은 5일차부터 10일차까지 대략 5%로 지속적으로 감소하였다. IRAK1/4 억제제 I은 0.03uM로부터 3uM까지 투여량 의존 방식으로 형질도입율을 향상시킬 수 있었다(도 11A). 3uM의 투여량으로, 형질도입율이 35%보다 높았다. IRAK1/4 억제제 I의 첨가는 세포 성장을 손상시키지 않았다(도 11b).
실시예 15. 보르테조밉은 γδ2 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
대조군의 형질도입율은 5일차부터 10일차까지 대략 5%로 지속적으로 감소하였다. 0.04uM의 투여량의 보르테조밉은 대략 50%로 형질도입율을 개선시킬 수 있었으나(도 12a), 더 높은 투여량(0.4uM 및 4uM)의 보르테조밉은 형질도입율 또한 20%보다 높게 향상시킬 수 있었다. 보르테조밉을 첨가하면 투여량 의존 방식으로 세포 성장이 손상되었으며 0.4uM 및 4uM의 용량은 세포 수 손실을 유의하게 초래하였다(도 12b).
실시예 16. 저분자 억제제는 γδ1 T 세포의 CAR 관련 렌티바이러스 형질도입을 개선하였다
γδ1 T 세포의 형질도입율 개선에 대해 이러한 저분자 억제제의 적용을 시험하기 위해, 본 발명자들은 상이한 투여량의 저분자 억제제를 사용하거나 사용하지 않고 γδ1 T 세포의 형질도입율을 평가하였다. 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군의 형질도입율은 5일차부터 10일차까지 최종적으로 대략 2%로 극적으로 감소하였다. 보르테조밉을 제외한 모든 분자는 특정 농도, 예컨대, BX795-0.06uM, BAY11-7082-50uM, 커큐민-10uM, 덱사메타손-6.4uM, 2-아미노퓨린-500uM, (5Z)-7-옥소제아에놀-6uM 및 IRAK1/4 억제제 I-0.3uM 하에서 형질도입율을 개선할 수 있었다.
실시예 17. CD4를 표적으로 하는 CAR γδ2 T의 구조 및 이들의 시험관내(in vitro) 종양 세포 사멸 효율성.
CD4를 표적으로 하는 CAR γδ2 T를 구조화하고 이들의 종양 세포 사멸 효율성을 시험관내(in vitro)에서 계산하였다. 미변형 γδ2 T 세포(γδ2 T 대조군)는 CD4 양성 종양 세포(저카트 T-luc, 인간 T 세포 백혈병 세포 및 반딧불이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 세포)에 대해 E:T 비율 의존 방식으로 세포독성을 가졌으며, CAR γδ T 세포(γδ2 T-CAR CD4)는 더 우수한 성능을 발휘하였다(도 14a). 2개의 사멸 사이토카인을 세포독성 시험 후 모니터링하였다. CAR γδ2 T 세포는 미변형 γδ2 T 세포보다 더 많은 IFNγ 및 TNFa를 분비하였다(도 14b 및 도 14c).
실시예 18. CD4를 표적으로 하는 CAR γδ2 T는 생체내(in vivo) 종양 성장을 억제하였다.
본 발명자들은 생체내(in vivo) CAR-CD4 γδ2 T의 종양 억제를 연구하기 위해 저카트 T를 사용하였다. 저카트 T-luc 종양 세포를 정맥내 주사(i.v.)로 면역 결핍 마우스에 이식하였으며 1.0×10^6개의 종양 세포가 0일차에 각각의 마우스에 제공되었다. 2일차, 5일차, 8일차, 11일차 및 14일차에, 2×10^6 CAR 양성 CAR-γδ2 T (CAR-CD4)가 각각 제공되었다. CAR-γδ2 T 치료가 종양 성장 유의하게 손상시킬 수 있었으며(도 15a 및 도 15b) 종양 보유 마우스의 생존 시간을 연장하였다(도 15c)는 점이 확인되었다.
실시예 19. B7H3를 표적으로 하는 CAR γδ2 T는 생체내(in vivo)에서 종양 성장을 억제하였다.
SKOV3, 인간 난소암을 생체내(in vivo) CAR γδ2 T 세포의 종양 억제 능력을 시험하기 위해 사용하였다. SKOV3-luc 종양 세포가 복강내 주사(i.p.)로 면역 결핍 마우스에 이식되었고, SKOV3-luc 세포가 반딧불이 루시퍼라제를 안정적으로 발현하였으며, 1.5×10^6 종양 세포가 0일차에 각각의 마우스에게 제공되었다. γδ2 T(NTD) 또는 CAR-γδ2 T(CAR-B7H3) 세포는 각각 6일차, 9일차 및 12일차에 제공(i.p.)되었으며, 2×10^6 γδ T 세포는 각각의 시간에 주사되었다. 도 16에서 나타낸 바와 같이, γδ2 T 치료는 SKOV3 종양의 성장을 억제할 수 있었으며 CAR-γδ2 T는 더 우수한 성능을 발휘하였다.
TANK 결합 키나아제 1(TBK1) 및 IκB 키나아제 ε(IKKε)가 바이러스 감염 동안 항바이러스 반응을 촉발하는 IRF3의 활성화 및 제1형 인터페론(IFN)의 생성을 조절한다는 사실은 잘 연구되어 있다(7). 화합물 BX795는 S6K1, Akt, PKCδ 및 GSK3β의 인산화를 차단하는 6 nM의 IC50을 갖는 PDK1의 강력하고 선택적인 억제제인 것으로 발견되었다. 또한, 이는 TBK1 및 IKKε 복합체의 강력하고 상대적으로 특이적인 억제제로 보고되었으며, IC50은 각각 6 nM 및 41 nM이다. BX795는 단순포진 바이러스-1(HVS-1) 감염을 효율적으로 차단하는 것으로 밝혀졌다(8,9). 또한, TBK1 및 IKKε는 상이한 사이토카인의 방출을 조절하는 NF-κB 반응을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
NF-κB 경로는 항바이러스 면역 반응을 조절하는 데 핵심적인 역할을 한다. NF-κB 신호전달의 활성화는 다양한 신호에 의해 매개된다. 비활성화 NF-κB는 NF-κB의 활성화를 억제하는 IκBα와 결합하는 사이토졸에 위치된다. 자극 신호 하에서, 효소 IκB 키나아제(IKK)가 활성화되어 차례로 IκBα 단백질을 인산화하고 NF-κB로부터 IκBα의 유비퀴틴화 및 해리를 초래하며 NF-κB의 활성화를 초래한다.
BAY 11-7082(카탈로그 번호 제S2913호, 동의어: BAY 11-7821)는 NF-κB 억제제이며, 이는 TNFα에 의해 유도된 IκBα 인산화를 억제한다(11). 또한, BAY 11-7082는 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP7 및 USP21을 각각 0.19 μM 및 0.96 μM의 IC50으로 억제한다. BAY 11-7082는 위암 세포에 세포자멸사 및 S기 정지를 유도한다. 커큐민(디페룰로일메탄)은 울금(Curcuma longa)종의 식물에 의해 생성되는 연황색 화학물질이다. 이는 NF-κB가 주요 역할을 하는 많은 반응을 차단하고 항염증, 항박테리아/진균/바이러스, 항암 및 항산화 활성 특성을 모두 나타내는 것으로 나타났다. 또한, 커큐민은 IκBα 단백질의 인산화를 차단하는 IKK의 활성화를 억제하여 NF-κB 신호전달을 손상시키는 것으로 밝혀졌다(12,13).
Akt(PKB/Akt) 또는 단백질 키나아제 B는 세린/트레오닌 키나아제이며, 포유동물에서 PKBα(Akt1), PKBβ(Akt2) 및 PKBγ(Akt3)로 알려진 3개의 고상동성 구성원을 포함한다. Akt는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K)의 지질 생성물에 의해 활성화된다. Akt는 선천적/후천적 면역 반응, 대사, 세포자멸사 및 증식을 포함하는 과정에 관여하는 많은 세포 단백질의 기능을 인산화하고 조절한다. Akt는 인산화를 유도할 수 있으며 IκB의 분해를 유도하여 NF-κB 활성화를 조절할 수 있다. 덱사메타손은 류마티스 문제, 중증 알레르기, 천식 및 크루프(croup) 등과 같은 상이한 종류의 면역 장애 질환을 치료하는 데 응용되는 글루코코르티코이드 약제이다. 덱사메타손의 분자 기전은 Akt 활성의 감소를 유도하여 NF-κB 신호전달을 억제한다는 것이 잘 정의되어 있다(15-17).
많은 경우, 면역 자극 하에서, JNK 및 p38 신호전달은 NF-κB와 함께 작용하여 면역 반응을 조절하며, 이러한 세 가지 경로는 모두 MAPK(미토겐 활성화 단백질 키나아제) 캐스케이드에 의해 조절된다(18,19). JNK(c-Jun N-말단 키나아제)는 Ser의 cJun상에 결합하고 인산염을 생성하는 일종의 키나아제였고 MAPK 패밀리에 속하며 상이한 스트레스 자극에 반응하여 염증 활성화를 조절한다. 또한, 이들은 T 세포 분화 및 세포자멸사 경로의 조절에 참여한다. 또한, p38 미토겐 활성화 단백질 키나아제는 MAPK 패밀리 구성원이고 사이토카인 및 UV 노출과 같은 스트레스 자극에 반응하며, 세포 분화, 세포자멸사 및 자가포식에도 관여한다.
단백질 키나아제R(PKR)은 mRNA 번역, 전사 조절, 세포자멸사 조절 및 증식과 같은 중추 세포 과정에서 주요 역할을 하는 세린-트레오닌 키나아제이다. PKR의 조절장애는 암, 신경변성, 대사 및 염증성 장애에서 발견되었다. 이는 스트레스 활성화 단백질 키나아제(SAPK) 작용 동안 관여된 신호전달 캐스케이드에 대한 활성화제로서 작용한다. 이는 IL-1 및 TNF-α와 같은 여러 사이토카인 및 많은 다른 성분에 반응하여 JNK, p38 및 NF-κB 활성화의 업스트림에 위치한다(20). 구아닌 및 아데닌의 퓨린 유사체인 2-아미노퓨린은 PKR 억제제로 사용된다. 미토겐 활성화 단백질 키나아제 키나아제 키나아제 7(MAP3K7)로도 알려진 TAK1은 MAP3K 패밀리에서 진화적으로 보존된 키나아제이며 티로신 유사 및 멸균 키나아제 패밀리과 집락화되어 있다. TAK1은 전사 조절 및 세포자멸사에서 기능을 매개하는 TGF베타 및 골형성 단백질(BMP)에 의해 유도될 수 있다. TAK1은 세포내 및 세포외 자극 모두에서 세포 사멸을 매개하는 것으로 증명되었다. 이러한 다중 기전에 의해 활성화된 TAK1은 NF-κB 및 MAP 키나아제(JNK 및 p38) 경로 활성화를 통해 NF-κB 및 AP-1 의존 유전자 발현을 상향조절한다(22). (5Z)-7-옥소제아에놀은 강력하고 선택적인 TAK1 억제제 역할을 하는 진균 기원의 레조사이클릭(resorcyclic) 락톤이다(23). IRAK-1(인터류킨-1 수용체 연관 키나아제 1)은 IRAK-1, IRAK-2, IRAK-3 및 IRAK-4로 구성되는 IRAK 패밀리에 속하는 키나아제 효소이며 염증 분자에 의해 활성화된다. IRAK1은 IKK 복합체의 활성화를 매개하는 E3 유비퀴틴 리가제 TRAF6과 협력하여 IKK 복합체의 활성화를 매개하여 NF-κB 신호 전달의 활성화를 초래한다. 반면, IRAK1/TRAF6 복합체는 촉매 활성 TAB2-TAB3-TAK1 복합체 조립을 통해 JNK 및 p38 신호전달을 활성화할 수도 있다(24).
위에서 언급한 모든 저분자 억제제 외에도, 보르테조밉은 NF-κB 신호전달을 억제할 수 있는 다른 하나의 저분자 억제제이다(25). 보르테조밉은 표적 치료제이며 프로테아좀 억제제로 분류된다. 이는 다발성 골수종과 외투 세포 림프종을 치료하는 데 사용되는 항암 약제이다.
따라서, 본 발명자들은 상이한 종류의 저분자 억제제에 의한 선천적 면역 및 항바이러스 활성과 관련된 NF-κB 경로를 차단하면 γδ T 세포에서 인터페론 유도를 방지하고, 숙주 반응을 감소시키며, 바이러스 형질도입을 안정화시킬 수 있는지 시험하였다. 본원에서 저분자 억제제는 여러 군으로 구분될 수 있다: 1. BAY11-7082를 포함한 IκBα의 인산화를 직접적으로 억제하는 저분자 억제제; 2. 커큐민과 같은 IkB 키나아제의 기능을 억제하는 저분자 억제제; 3. BX795와 같은 NF-κB 경로의 업스트림 키나아제인 TBK1의 기능을 억제하는 저분자 억제제; 4. 덱사메타손과 같은 NF-κB 경로의 업스트림 키나아제인 AKT의 기능을 억제하는 저분자 억제제; 5. PKR, TAK1 및 IRAK1의 키나아제를 각각 조절하는 2-아미노퓨린, (5Z)-7-옥소제아에놀 및 IRAK1/4 억제제 I을 포함하는 p38 및 JNK 신호 전달 및 NF-κB의 기능을 억제하는 저분자 억제제; 6. 보르테조밉과 같이 알려지지 않은 기전으로 NF-κB 활성화를 손상시키는 저분자 억제제.
이러한 실험 결과는 이러한 억제제의 사용이 형질도입율을 증가시키고 후속 세포 배양 및 확장 동안 높은 형질도입율을 유지한다는 점을 입증하였다.
본 개시내용은 본원에서 설명되는 특정한 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 설명된 바에 추가하여, 본원에서 제공되는 특허 대상의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하도록 의도된다. 다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되어 있으며, 이들의 개시 내용은 전문이 참조에 의해 원용된다.
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Claims (52)

  1. 바이러스 벡터를 사용하여 γδ T 세포를 형질도입하는 방법으로서, 상기 γδ T 세포를
    i) 상기 바이러스 벡터; 및
    ii) 상기 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제와 접촉하게 하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 γδ T 세포는 δ1, δ2 또는 δ3 T 세포인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 γδ T 세포는 γ9δ2 T 세포인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 VSV-G 위형화 렌티바이러스 벡터인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 NF-κB 신호전달 경로에 작용하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 IKKα, IKKβ, IKKε, IκB 키나아제, TBK1, PKD1, NF-κB, Akt, PKR, TAK1, IRAK1/4 또는 프로테아좀의 억제제인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는
    1) IκBα의 인산화를 억제할 수 있거나;
    2) IκB 키나아제의 기능을 억제할 수 있거나;
    3) Akt의 기능을 억제할 수 있거나; 또는
    4) NF-κB, p38 및 JNK 신호전달의 기능을 억제할 수 있는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 BX795, BAY11-7082, 커큐민, 덱사메타손, 2-아미노퓨린, (5Z)-7-옥소제아에놀, IRAK1/4 억제제 I 및 보르테조밉으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제는 BX795인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BX795는 0.02 μM 내지 60 μM, 더 바람직하게는 0.2 μM 내지 6 μM 및 가장 바람직하게는 0.4 μM 내지 2 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BX795는 2 μM 이하의 농도로 사용되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BX795는 0.2 μM 내지 0.6 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BAY11-7082는 0.1 μM 내지 2000 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM 내지 200 μM 및 가장 바람직하게는 5 μM 내지 100 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 BAY11-7082는 0.5 μM 내지 50 μM 및 더 바람직하게는 5 μM 내지 50 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 커큐민은 0.1 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 1 μM 내지 100 μM 및 가장 바람직하게는 2 μM 내지 20 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 커큐민은 1 μM 내지 100 μM 및 더 바람직하게는 10 μM 내지 100 μM 또는 1 μM 내지 10 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덱사메타손은 0.01 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 0.1 μM 내지 50 μM 및 가장 바람직하게는 1 μM 내지 10 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 덱사메타손은 0.064 μM 내지 6.4 μM 및 가장 바람직하게는 0.64 μM 내지 6.4 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-아미노퓨린은 0.5 μM 내지 5000 μM, 더 바람직하게는 5 μM 내지 1000 μM 및 가장 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 2-아미노퓨린은 5 μM 내지 500 μM 및 더 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.01 μM 내지 600 μM, 더 바람직하게는 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IRAK1/4 억제제 I은 0.01 μM 내지 300 μM, 더 바람직하게는 0.03 μM 내지 30 μM 가장 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 IRAK1/4 억제제 I은 0.03 μM 내지 3 μM 및 더 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보르테조밉은 0.002 μM 내지 40 μM, 더 바람직하게는 0.01 μM 내지 4 μM 및 가장 바람직하게는 0.01 μM 내지 0.4 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 보르테조밉은 0.04 μM 내지 4 μM 사이, 예컨대, 0.04 μM의 농도로 사용되는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제 없이 배지에서 상기 형질도입되는 γδ T 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  24. CAR-γδ T 세포를 제조하는 방법에 있어서,
    1) γδ T 세포를 제공하는 단계; 및
    2) 상기 γδ T 세포를 상기 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제의 존재 하에서 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 단계 1)은 IL-2 및 ZOL로 보충되는 배지에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 3) 상기 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제 없이 배지에서 상기 형질도입된 γδ T 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γδ T 세포는 δ1, δ2 또는 δ3 T 세포인 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γδ T 세포는 γ9δ2 T 세포인 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 NF-κB 신호전달 경로에 작용하는 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 IKKα, IKKβ, IKKε, IκB 키나아제, TBK1, PKD1, NF-κB, Akt, PKR, TAK1, IRAK1/4 또는 프로테아좀의 억제제인 방법.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는
    1) IκBα의 인산화를 억제할 수 있거나;
    2) IκB 키나아제의 기능을 억제할 수 있거나;
    3) Akt의 기능을 억제할 수 있거나; 또는
    4) NF-κB, p38 및 JNK 신호전달의 기능을 억제할 수 있는 방법.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 BX795, BAY11-7082, 커큐민, 덱사메타손, 2-아미노퓨린, (5Z)-7-옥소제아에놀, IRAK1/4 억제제 I 및 보르테조밉으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 VSV-G 위형화 렌티바이러스 벡터인 방법.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 γδ T 세포의 선천적 항바이러스 활성을 억제할 수 있는 작용제는 BX795인 방법.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BX795는 0.02 μM 내지 60 μM, 더 바람직하게는 0.2 μM 내지 6 μM 및 가장 바람직하게는 0.4 μM 내지 2 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BX795는 2 μM 이하의 농도로 사용되는 방법.
  39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BX795는 0.2 μM 내지 0.6 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  40. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BAY11-7082는 0.1 μM 내지 2000 μM, 더 바람직하게는 0.5 μM 내지 200 μM 및 가장 바람직하게는 5 μM 내지 100 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 BAY11-7082는 0.5 μM 내지 50 μM 및 더 바람직하게는 5 μM 내지 50 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  41. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 커큐민은 0.1 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 1 μM 내지 100 μM 및 가장 바람직하게는 2 μM 내지 20 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 커큐민은 1 μM 내지 100 μM 및 더 바람직하게는 10 μM 내지 100 μM 또는 1 μM 내지 10 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  42. 제24항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 덱사메타손은 0.01 μM 내지 500 μM, 더 바람직하게는 0.1 μM 내지 50 μM 및 가장 바람직하게는 1 μM 내지 10 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 덱사메타손은 0.064 μM 내지 6.4 μM 및 가장 바람직하게는 0.64 μM 내지 6.4 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  43. 제24항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2-아미노퓨린은 0.5 μM 내지 5000 μM, 더 바람직하게는 5 μM 내지 1000 μM 및 가장 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 2-아미노퓨린은 5 μM 내지 500 μM 및 더 바람직하게는 50 μM 내지 500 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  44. 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.01 μM 내지 600 μM, 더 바람직하게는 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 (5Z)-7-옥소제아에놀은 0.6 μM 내지 60 μM 및 가장 바람직하게는 0.6 μM 내지 6 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  45. 제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IRAK1/4 억제제 I은 0.01 μM 내지 300 μM, 더 바람직하게는 0.03 μM 내지 30 μM 가장 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 IRAK1/4 억제제 I은 0.03 μM 내지 3 μM 및 더 바람직하게는 0.3 μM 내지 3 μM 사이의 농도로 사용되는 방법.
  46. 제24항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보르테조밉은 0.002 μM 내지 40 μM, 더 바람직하게는 0.01 μM 내지 4 μM 및 가장 바람직하게는 0.01 μM 내지 0.4 μM 사이의 농도로 사용되거나; 또는 상기 보르테조밉은 0.04 μM 내지 4 μM 사이, 예컨대, 0.04 μM의 농도로 사용되는 방법.
  47. 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 CAR-γδ T 세포를 포함하는 제조물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 CAR-γδ T 세포는 CD4 또는 B7H3을 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제조물.
  49. 제47항에 따른 제조물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 종양의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 종양은 전립선 종양, T 세포 백혈병 또는 난소암인 약제학적 조성물.
  51. 대상체에서 종양을 치료하기 위한 방법에 있어서, 상기 대상체에 치료적 유효량의 제47항의 제조물 또는 치료적 유효량의 제49항 또는 제50항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 종양은 전립선 종양, T 세포 백혈병 또는 난소암인 방법.
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