CN111100952A - 一种检测car病毒相关滴度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测CAR相关病毒表达的方法，包括两种方式检测CAR的表达。本发明可计算CAR相关病毒的表达，计算方法简便，且精确度高，便于实际操作。
Description
技术领域
本发明属于嵌合抗原受体领域，具体用流式细胞仪方法检测CAR表达。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。
嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。
随着嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T) 技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为四代。
第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single chain fragment variable，scFV)、跨膜区(transmembrane region，TM)和胞内信号区- 免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接： scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代 CAR-T细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持久的抗肿瘤效应〔，Cancer Res.2007，67(22)：11029-11036〕。
第二代CAR-T细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是研究的热点。 T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第二代CAR(J Immunol.1998；161(6)：2791-7)。第2代CAR在胞内信号肽区添加了一个协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CAR-T细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖， IL-2的合成和表达以及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了CD134(OX40) 和41BB(4-1BB)等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T 细胞应答，延长T细胞存活时间等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达90％以上。
第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一代的 CAR可获得更强的抗肿瘤应答(Mol Ther.2005，12(5)：933-941)。最典型的就是U Pen Carl June在CD28刺激因子的作用下又加了一个41BB的刺激因子。
第四代的CAR-T细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12，其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用〔Expert Opin Biol Ther.2015；15(8)：1145-54〕。
当CAR-T细胞输注体内之后，CAR基因能否表达、CAR表达效率的高低、 CAR-T细胞的活性和纯度以及CAR-T细胞在体内存活的长短都会直接影响 CAR-T细胞对癌细胞的清除效率。临床研究证明，CAR-T细胞回输后在患者外周血中的增殖能力和其在外周血存续的时间与疗效具有很强的相关性 (Science Translational Medicine.2015；7:303)。
本发明的亮点是用两种细胞来评估CAR病毒的滴度，方法简单但计算结果精确，病毒滴度计算会更加准确的指导用于生产CART细胞的临床用量。
发明内容
发明内容一提供了一种用于检测CAR相关病毒的方法包括PBMC细胞检测法和293T细胞检测法。
发明内容二PBMC细胞检测法，其特征在于：包括如下步骤：
1)从-80℃冰箱中取出待测滴度的病毒溶液，让其在室温自然融化，从4℃冰箱中取出培养基，恢复到室温，检查补充所需耗材，准备垃圾袋。消毒双手后擦拭生物安全柜台面，准备离心管。
2)取出预先培养好的PBMC细胞，取样计数，离心后用培养基重悬调整细胞浓度为2×10^6/ml。
3)取一个no-treated的24孔培养板，按照每个病毒4个梯度的稀释度做滴度实验，3倍稀释，每组病毒24孔板中按列排布，每孔依次加入的病毒量为：1ml， 333ul，111ul，37ul。病毒加样完毕后，将每孔中的悬液用培养基补足至1ml。
4)取调整好浓度为2×10^6/ml的PBMC细胞，每孔中添加100ul的细胞悬液。
5)取出4℃冰箱中储存浓度为8mg/ml的polybrene溶液，每孔中分别添加，使polybrene的终浓度为8ug/ml。
6)用1ml的枪头将每孔中的细胞及添加物等吹打均匀。30℃，2500rpm，离心90min。
7)离心完毕后，吸弃每孔中的病毒悬液，小心不要将细胞吸掉。后每孔中添加 1ml培养基，并用1ml的枪头吹打均匀，放入CO2培养箱中培养，培养2天后，取出，进行流式染色检测每个样品的每个病毒稀释度感染的PBMC细胞的CAR表达。
发明内容三293T细胞检测法，其特征在于：包括如下步骤：
1)从-80℃冰箱中取出待测滴度的病毒溶液，让其在室温自然融化，从4℃冰箱中取出培养基，恢复到室温，检查补充所需耗材，准备垃圾袋。消毒双手后擦拭生物安全柜台面，准备离心管。
2)取出预先培养好的293T细胞，取样计数，离心后用培养基重悬调整细胞浓度为2×10^6/ml。
3)取一个no-treated的24孔培养板，按照每个病毒4个梯度的稀释度做滴度实验，3倍稀释，每组病毒24孔板中按列排布，每孔依次加入的病毒量为：1ml， 333ul，111ul，37ul。病毒加样完毕后，将每孔中的悬液用培养基补足至1ml。
4)取调整好浓度为2×10^6/ml的293T细胞，每孔中添加100ul的细胞悬液。
5)取出4℃冰箱中储存浓度为8mg/ml的polybrene溶液，每孔中分别添加，使polybrene的终浓度为8ug/ml。
6)用1ml的枪头将每孔中的细胞及添加物等吹打均匀。30℃，2500rpm，离心90min。
7)离心完毕后，吸弃每孔中的病毒悬液，小心不要将细胞吸掉。后每孔中添加 1ml培养基，并用1ml的枪头吹打均匀，放入CO2培养箱中培养，培养2天后，取出，进行流式染色检测每个样品的每个病毒稀释度感染的293T细胞的CAR表达。
发明内容四病毒感染后的细胞用流式细胞仪检测CAR表达情况。
发明内容五权利要求2和权利要求3病毒感染后滴度计算为滴度(Tu/ml)＝细胞数×流式检测CAR表达比例/病毒液体积×106
附图说明
图1CAR病毒感染梯度稀释示意图
具体实施方式
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1病毒感染PBMC/293T细胞
1.紫外线消毒30min，进入实验室，开启生物安全柜照明灯及风机。
2.从-80℃冰箱中取出待测滴度的病毒溶液，让其在室温自然融化，从 4℃冰箱中取出培养基，恢复到室温，检查补充所需耗材，准备垃圾袋。消毒双手后擦拭生物安全柜台面，准备离心管。
3.取出预先培养好的PBMC/293T细胞，取样计数，离心后用培养基重悬调整细胞浓度为2×10^6/ml。
4.取一个no-treated的24孔培养板，按照每个病毒4个梯度的稀释度做滴度实验，3倍稀释，每组病毒24孔板中按列排布，每孔依次加入的病毒量为：1ml，333ul，111ul，37ul。病毒加样完毕后，将每孔中的悬液用培养基补足至1ml。
5.取调整好浓度为2×10^6/ml的PBMC/293T细胞，每孔中添加100ul 的细胞悬液。
6.取出4℃冰箱中储存浓度为8mg/ml的polybrene溶液，每孔中分别添加，使polybrene的终浓度为8ug/ml。
7.用1ml的枪头将每孔中的细胞及添加物等吹打均匀。30℃，2500rpm，离心90min。
8.离心完毕后，吸弃每孔中的病毒悬液，小心不要将细胞吸掉。后每孔中添加1ml培养基，并用1ml的枪头吹打均匀，放入CO2培养箱中培养，培养2天后，取出，进行流式染色检测每个样品的每个病毒稀释度感染的PBMC细胞的CAR表达。
实施例2病毒感染后，培养2天，进行CAR-T感染效率的流式检测
1.取感染和未感染的所有细胞，将细胞悬液离心去除培养基，PBS 洗细胞两次，300g，4℃离心5分钟。弃上清，细胞重悬于PBS中，置于流式上样管中，并做好标记，每个样品约100μl细胞悬液。
2.每管加入适量相应抗体，冰上避光孵育15-20分钟。
3.用每管1ml的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟，仔细吸去上清。
4.轻拍试管混匀细胞，100-200μl PBS重悬细胞。
5.上流式细胞仪检测并分析数据。
滴度计算公式：
滴度(Tu/ml)＝细胞数×流式检测CAR表达比例/病毒液体积×106。
Claims (5)
1.一种用于检测CAR相关病毒的方法包括PBMC细胞检测法和293T细胞检测法。
2.权利要求1所述的PBMC细胞检测法，其特征在于：包括如下步骤：
1)从-80℃冰箱中取出待测滴度的病毒溶液，让其在室温自然融化，从4℃冰箱中取出培养基，恢复到室温，检查补充所需耗材，准备垃圾袋。消毒双手后擦拭生物安全柜台面，准备离心管。
2)取出预先培养好的PBMC细胞，取样计数，离心后用培养基重悬调整细胞浓度为2×10^6/ml。
3)取一个no-treated的24孔培养板，按照每个病毒4个梯度的稀释度做滴度实验，3倍稀释，每组病毒24孔板中按列排布，每孔依次加入的病毒量为：1ml，333ul，111ul，37ul。病毒加样完毕后，将每孔中的悬液用培养基补足至1ml。
4)取调整好浓度为2×10^6/ml的PBMC细胞，每孔中添加100ul的细胞悬液。
5)取出4℃冰箱中储存浓度为8mg/ml的polybrene溶液，每孔中分别添加，使polybrene的终浓度为8ug/ml。
6)用1ml的枪头将每孔中的细胞及添加物等吹打均匀。30℃，2500rpm，离心90min。
7)离心完毕后，吸弃每孔中的病毒悬液，小心不要将细胞吸掉。后每孔中添加1ml培养基，并用1ml的枪头吹打均匀，放入CO2培养箱中培养，培养2天后，取出，进行流式染色检测每个样品的每个病毒稀释度感染的PBMC细胞的CAR表达。
3.权利要求1所述的293T细胞检测法，其特征在于：包括如下步骤：
1)从-80℃冰箱中取出待测滴度的病毒溶液，让其在室温自然融化，从4℃冰箱中取出培养基，恢复到室温，检查补充所需耗材，准备垃圾袋。消毒双手后擦拭生物安全柜台面，准备离心管。
2)取出预先培养好的293T细胞，取样计数，离心后用培养基重悬调整细胞浓度为2×10^6/ml。
3)取一个no-treated的24孔培养板，按照每个病毒4个梯度的稀释度做滴度实验，3倍稀释，每组病毒24孔板中按列排布，每孔依次加入的病毒量为：1ml，333ul，111ul，37ul。病毒加样完毕后，将每孔中的悬液用培养基补足至1ml。
4)取调整好浓度为2×10^6/ml的293T细胞，每孔中添加100ul的细胞悬液。
5)取出4℃冰箱中储存浓度为8mg/ml的polybrene溶液，每孔中分别添加，使polybrene的终浓度为8ug/ml。
6)用1ml的枪头将每孔中的细胞及添加物等吹打均匀。30℃，2500rpm，离心90min。
7)离心完毕后，吸弃每孔中的病毒悬液，小心不要将细胞吸掉。后每孔中添加1ml培养基，并用1ml的枪头吹打均匀，放入CO2培养箱中培养，培养2天后，取出，进行流式染色检测每个样品的每个病毒稀释度感染的293T细胞的CAR表达。
4.权利要求2和权利要求3病毒感染后的细胞用流式细胞仪检测CAR表达情况。
5.权利要求2和权利要求3病毒感染后滴度计算为滴度(Tu/ml)＝细胞数×流式检测CAR表达比例/病毒液体积×106。
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