CN105734015A - Dc-ctl细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞生物学领域，公开了一种DC?CTL细胞的培养方法。本发明所述DC?CTL细胞的培养方法将单个核细胞接种X?VIVO15无血清培养基培养后分别收集贴壁细胞和未贴壁细胞；贴壁细胞接种含细胞因子的X?VIVO15无血清培养基培养，肿瘤抗原致敏，得到致敏的DC细胞；未贴壁细胞接种含胶原?海藻酸钠?羟基磷灰石支架材料及细胞因子的X?VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养得到DC?CTL细胞。本发明所述培养方法在细胞培养中形成三维培养模型，使CTL细胞在三维空间内增殖，培养得到的DC?CTL细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，杀伤效果好。

Description

DC-CTL细胞的培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种DC-CTL细胞的培养方法，尤其是DC-CTL细胞的三维培养方法。
背景技术
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。
传统的肿瘤治疗方法有手术治疗、放疗和化疗。目前的肿瘤治疗中，手术和放化疗等局部治疗对局限性肿瘤有较好的疗效，而对于全身性、转移性或局部治疗后的微小病灶则主要依靠免疫疗法进行系统性治疗。根据每个肿瘤病人的特点，采取局部治疗结合免疫细胞治疗不仅可以消除局部病灶肿瘤，还可以控制肿瘤的复发、转移生长等，提高病人的生存期和生活质量。
细胞免疫治疗是一种新兴的治疗技术。细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成百倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。细胞免疫治疗可以恢复与增强肿瘤患者自身的免疫监测和杀瘤功能，有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强、副作用轻等优点。
CTL细胞是肿瘤抗原浸润过的T细胞群，在经DC细胞提呈刺激后可获得具有高效杀伤特定的一种或几种肿瘤细胞的CTL细胞，在临床免疫细胞治疗中具有非常重要的作用。在CTL细胞常规培养中，主要是利用DC细胞培养、肿瘤抗原刺激DC细胞成熟，混合培养DC和CTL细胞，得到特异性杀伤一种或几种肿瘤的免疫细胞。已有的发明中DC-CTL细胞的培养方案如下：
1.外周血单个核细胞分离采集；
2.DC和T细胞的分离培养，单个核细胞接种T175培养瓶30-60min，贴壁的即为DC细胞，未贴壁的即为外周血总T细胞；
3.DC细胞培养至第6天加入特定肿瘤相关抗原，培养至第8天，收集DC疫苗，用于CTL培养；
4.外周血总T细胞培养CIK，至第8天，CIK细胞半量与DC细胞混合获得CTL细胞，半量继续培养CIK。
5.培养至14天收集所有细胞获得DC-CIK-CTL细胞。
然而传统培养瓶培养，当细胞增殖培养时，大量的成团细胞很容易沉于底部，与营养液接触面积少，不利于细胞的快速增殖。而且在第8天DC细胞与CIK细胞混合后，因细胞成团沉于底部，与DC细胞不能充分接触混匀，DC细胞的抗原提呈效果不够。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种DC-CTL细胞的培养方法。本发明所述培养方法利用胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料的多孔性、组织相容性和稳定性，在细胞培养中形成三维培养模型，以解决CTL细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部而无法很好的接触培养液以及与DC细胞不能充分接触混匀的问题。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种DC-CTL细胞的培养方法，包括
步骤1、单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基培养后分别收集贴壁细胞和未贴壁细胞；
步骤2、贴壁细胞接种含细胞因子的X-VIVO15无血清培养基培养，肿瘤抗原致敏，得到致敏的DC细胞；
步骤3、未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及细胞因子的X-VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；
步骤4、将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养得到DC-CTL细胞。
海藻酸钠是一种酸性的多聚糖，具有良好的生物相容性，目前已经被广泛应用于化学、生物、医药、食品等领域。本发明所述培养方法通过机械混合、冷冻干燥制备得到的胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料具有多孔性、组织相容性和稳定性。在体外细胞培养中，将圆柱体胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料浸没于培养基中，将生长状态良好的细胞接种于培养液中，细胞在三维空间内增殖，空间更大、接触到的培养液面积更充足，避免细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部，不能很好的继续增殖。
其中，在一些实施方案中，所述DC-CTL细胞的培养方法中所述胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料完全浸没于X-VIVO15无血清培养基中。
在一些实施方案中，所述胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料的制备方法为动物胶原溶解于酸性溶液溶解得到浓度为5mg/mL的酸性胶原溶液，依次加入0.3mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液和2％海藻酸钠溶液混合，调节pH至9.0，加入羟基磷灰石混匀后倒入模具成型，升温至25℃凝胶后，低温预冻后冻干；其中所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为(40％-50％):(30％-40％):(20％-30％)。
在一些具体实施例中，所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为40％:40％:20％。在一些具体实施例中，所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为30％:50％:20％。在一些具体实施例中，所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为30％:40％:30％。
在一些实施方案中，所述DC-CTL细胞的培养方法中所述单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基的接种量为2×106个/mL-8×106个/mL。
在一些实施方案中，本发明所述培养方法所述步骤2具体为贴壁细胞接种含IL-4和GM-SCF的X-VIVO15无血清培养基，3天后补加GM-SCF和IL-4，培养至4-6天后添加新鲜的X-VIVO15无血清培养基，同时添加GM-SCF、IL-4、TNF-α和肿瘤抗原得到致敏的DC细胞。
在一些优选实施方案中，步骤2中接种时所述IL-4和GM-SCF的终浓度均为100-1000U/mL。即接种时所述IL-4的终浓度优选为100-1000U/mL、GM-SCF的终浓度优选为100-1000U/mL。
在一些优选实施方案中，步骤2中3天后补加时所述IL-4和GM-SCF的终浓度均为100-1000U/mL。即3天后补加时所述IL-4的终浓度优选为100-1000U/mL、GM-SCF的终浓度优选为100-1000U/mL；
在一些优选实施方案中，步骤2中培养4-6天后添加的IL-4和GM-SCF的终浓度均为50-500U/mL。即培养4-6天后添加的IL-4的终浓度优选为50-500U/mL、GM-SCF的终浓度优选为50-500U/mL。
在一些优选实施方案中，步骤2中所述TNF-α的终浓度为100-1000U/mL。
本领域技术人员可以理解本发明所述培养方法中所述肿瘤抗原可以为HER2、TRP-2、gp100、K562或HL60。
在一些实施方案中，所述所述肿瘤抗原为K562细胞。
在一些实施方案中，本发明所述培养方法中步骤3具体为未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及细胞因子INF-γ的X-VIVO15无血清培养基，第2天添加细胞因子OKT-3、IL-1α和IL-2；从第一天开始每隔3天补加X-VIVO15无血清培养基，维持细胞密度5-20×105/mL，并添加IL-2。
在一些优选实施方案中，步骤3中细胞因子INF-γ的终浓度为500-2000U/mL。
在一些优选实施方案中，步骤3中第2天添加OKT-3的终浓度为10-100U/mL、IL-1α的终浓度为50-200U/mL、IL-2的终浓度为100-500U/mL。
在一些优选实施方案中，步骤3中每隔3天补加IL-2的终浓度为100-500U/mL。
本发明所述培养方法步骤3所述培养CIK细胞的培养时间优选为7天。
本发明所述培养方法步骤4所述混合培养的培养时间优选为7天。即培养至第14天。
本发明所述培养方法中所述单个核细胞可以由外周血或脐带血分离得到。
在一些实施方案中，所述单个核细胞的制备方法为外周血或脐带血加入生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500-800g离心20-30min。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种DC-CTL细胞的培养方法，单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基培养后分别收集贴壁细胞和未贴壁细胞；贴壁细胞接种含细胞因子的X-VIVO15无血清培养基培养，肿瘤抗原致敏，得到致敏的DC细胞；未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及细胞因子的X-VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养得到DC-CTL细胞。本发明所述培养方法利用胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料的多孔性、组织相容性和稳定性，在细胞培养中形成三维培养模型，使CTL细胞在三维空间内增殖，空间更大、接触到的培养液面积更充足，避免CTL细胞在增殖过程中成团细胞堆积底部，不能很好的继续增殖。实验结果显示采用本发明所述DC-CTL细胞的培养方法培养DC-CTL细胞，细胞状态好、增殖速度快、增殖倍数高，得到的DC-CTL细胞杀伤效果也明显高于常规的培养方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示试验例1各组增殖曲线，其中示对比例1培养得到的细胞、示实施例4培养得到的细胞、示实施例5培养得到的细胞、实施例6培养得到的细胞；
图2示试验例1中实施例6在培养14天时DC-CTL显微观察的细胞形态图，放大倍数为40倍；
图3示试验例1中对比例1在培养14天时DC-CTL显微观察的细胞形态图，放大倍数为40倍；
图4示试验例1中实施例6和对比例1培养14天后的细胞对K562细胞的杀伤能力检测图，其中示对比例1培养得到的细胞、示实施例6培养得到的细胞。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中所述羟丙基甲基纤维素(HPMC)购自山东苏诺克化工有限公司；
实施例1：单个核细胞的分离
采集外周血20mL，加入10mL生理盐水稀释，缓慢加入到含淋巴细胞分离液15mL的离心管中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层清晰，500g-800g离心力，升降速为0，离心20-30min，提取中间白膜层细胞，即得单个核细胞，加生理盐水清洗两遍，计数，细胞量为2×107个-4×107个。
实施例2、胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料制备
1.pH2的盐酸溶解动物胶原配制浓度为5mg/mL的酸性胶原溶液；
2.维持搅拌依次加入0.3mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液和2％海藻酸钠溶液，形成均匀的混合液；
3.用2mol/L的NaOH溶液将溶液pH值控制在9.0，然后加入羟基磷灰石浆料，混合分散均匀；
4.溶胶倒入模具成型，25℃凝胶固化，再低温预冻后冻干，得到复合支架材料。其中所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为(40％-50％):(30％-40％):(20％-30％)。
实施例3、肿瘤抗原制备
1.从患者手术切除的肿瘤组织分离培养肿瘤细胞(包括HER2、TRP-2、gp100、K562、HL60等肿瘤细胞中的一种或多种)，5％胎牛血清的1640培养基培养肿瘤细胞；
2.收集细胞于-196℃液氮快速冻10min,取出于常温缓慢解冻1-2h，反复冻融4-5次；
3.最后一次解冻后，于400g离心20min，收取上清，经0.22μm一次性滤器过滤除菌后备用。
实施例4、本发明所述DC-CTL细胞的培养方法
1、获取单个核细胞(PBMC)2-4×107个，按2-8×106/mL加入X-VIVO15无血清培养基接种T75培养瓶中1-2h，上清液及未贴壁细胞转移至另一T75培养瓶中培养CIK细胞，贴壁细胞培养DC细胞；
2、贴壁细胞加入含IL-4和GM-SCF的X-VIVO15无血清培养基，IL-4终浓度为100U/mL，GM-SCF终浓度为100U/mL；3天后补加GM-SCF和IL-4，GM-SCF终浓度为100U/mL，IL-4终浓度为100U/mL；培养至4-6天后添加新鲜的X-VIVO15无血清培养基，同时添加GM-SCF、IL-4、TNF-α和肿瘤抗原培养得到致敏的DC细胞，所述GM-SCF终浓度为50U/mL，IL-4终浓度为50U/mL、肿瘤抗原为K562，TNF-α终浓度为100U/mL。
3、未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及500U/mL细胞因子INF-γ的X-VIVO15无血清培养基，诱导培养CIK细胞，所述胶原：海藻酸钠：羟基磷灰石质量比为40:40:20；第2天添加细胞因子OKT-3、IL-1α和IL-2，OKT-3终浓度为10ng/mL、IL-1α终浓度为50U/mL、IL-2终浓度为100U/mL；从第一天开始每隔3天补加X-VIVO15无血清培养基，维持细胞密度5-20×105/mL，并添加IL-2，IL-2的终浓度为100U/mL；
4、CIK细胞培养第7天时将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养，培养至第14天得到DC-CTL细胞。
实施例5、本发明所述DC-CTL细胞的培养方法
1、获取单个核细胞(PBMC)2-4×107个，按2-8×106/mL加入X-VIVO15无血清培养基接种T75培养瓶中1-2h，上清液及未贴壁细胞转移至另一T75培养瓶中培养CIK细胞，贴壁细胞培养DC细胞；
2、贴壁细胞加入含IL-4和GM-SCF的X-VIVO15无血清培养基，IL-4终浓度为1000U/mL，GM-SCF终浓度为1000U/mL；3天后补加GM-SCF和IL-4，GM-SCF终浓度为1000U/mL，IL-4终浓度为1000U/mL；培养至4-6天后添加新鲜的X-VIVO15无血清培养基，同时添加GM-SCF、IL-4、TNF-α和肿瘤抗原培养得到致敏的DC细胞，所述GM-SCF终浓度为500U/mL，IL-4终浓度为500U/mL、肿瘤抗原为K562，TNF-α终浓度为1000U/mL。
3、未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及2000U/mL细胞因子INF-γ的X-VIVO15无血清培养基，诱导培养CIK细胞，所述胶原：海藻酸钠：羟基磷灰石质量比为30:50:20；第2天添加细胞因子OKT-3、IL-1α和IL-2，OKT-3终浓度为100ng/mL、IL-1α终浓度为200U/mL、IL-2终浓度为500U/mL；从第一天开始每隔3天补加X-VIVO15无血清培养基，维持细胞密度5-20×105/mL，并添加IL-2，IL-2的终浓度为500U/mL；
4、CIK细胞培养第7天时将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养，培养至第14天得到DC-CTL细胞。
实施例6、本发明所述DC-CTL细胞的培养方法
1、获取单个核细胞(PBMC)2-4×107个，按2-8×106/mL加入X-VIVO15无血清培养基接种T75培养瓶中1-2h，上清液及未贴壁细胞转移至另一T75培养瓶中培养CIK细胞，贴壁细胞培养DC细胞；
2、贴壁细胞加入含IL-4和GM-SCF的X-VIVO15无血清培养基，IL-4终浓度为500U/mL，GM-SCF终浓度为500U/mL；3天后补加GM-SCF和IL-4，GM-SCF终浓度为500U/mL，IL-4终浓度为500U/mL；培养至4-6天后添加新鲜的X-VIVO15无血清培养基，同时添加GM-SCF、IL-4、TNF-α和肿瘤抗原培养得到致敏的DC细胞，所述GM-SCF终浓度为200U/mL，IL-4终浓度为200U/mL、肿瘤抗原为K562，TNF-α终浓度为500U/mL。
3、未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及1000U/mL细胞因子INF-γ的X-VIVO15无血清培养基，诱导培养CIK细胞，所述胶原：海藻酸钠：羟基磷灰石质量比为30:40:30；第2天添加细胞因子OKT-3、IL-1α和IL-2，OKT-3终浓度为50ng/mL、IL-1α终浓度为100U/mL、IL-2终浓度为300U/mL；从第一天开始每隔3天补加X-VIVO15无血清培养基，维持细胞密度5-20×105/mL，并添加IL-2，IL-2的终浓度为300U/mL；
4、CIK细胞培养第7天时将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养，培养至第14天得到DC-CTL细胞。
对比例1、
1.外周血单个核细胞分离采集；
2.DC和T细胞的分离培养，单个核细胞接种T175培养瓶30-60min，贴壁的即为DC细胞，未贴壁的即为外周血总T细胞；
3.DC细胞培养至第6天加入肿瘤抗原K562细胞，培养至第8天，收集DC疫苗，用于CTL培养；
4.外周血总T细胞培养CIK，至第8天，CIK细胞半量与DC细胞混合获得CTL细胞，半量继续培养CIK。
5.培养至14天收集所有细胞获得DC-CIK-CTL细胞。
试验例1、效果实验
分别取实施例4-6及对比例1培养至14天的细胞，分别进行计数，并进行流式细胞检测和杀伤实验。
统计各组培养至14天的细胞量、增殖情况及活率结果如表1所示。各组增殖曲线如图1所示。
表1各组培养14天后的细胞量、增殖情况及活率
组别 接种细胞量 培养后总细胞量 增殖倍数 活率
实施例4 2×107 1.85×1010 925 98.5％
实施例5 2×107 2.08×1010 1040 99.3％
实施例6 2×107 2.05×1010 1025 98.8％
对比例1 2×107 6.13×109 306 98.9％
由上述结果可见，实施例4-6细胞增殖倍数和增殖速度明显高于对比例1。
对实施例6和对比例1培养14天时的细胞形态进行显微观察，结果如图2-3所示。
结果显示实施例6培养方法培养的DC-CTL细胞是致密生长，很好的利用培养瓶的立体空间增殖；而对比例1培养方法出现细胞成团严重，不均匀，团块内部的细胞易死亡。
实施例4和实施例5培养方法培养的DC-CTL细胞形态与实施例6相似，均为致密生长，
对实施例6和对比例1培养14天后的细胞对K562细胞的杀伤能力进行检测，结果如表2及图4所示。
表2实施例6和对比例1培养的DC-CTL细胞对K562细胞的杀伤实验结果
效靶比 40:1 20:1 10:1
实施例6 0.976 0.902 0.765
对比例1 0.926 0.758 0.569
由表2结果可见，实施例6培养方法得到的DC-CTL细胞杀伤效果明显优于对比例1。
实施例4和实施例5培养方法培养得到的DC-CTL细胞杀伤效果也明显高于对比例1。

Claims (10)

1.一种DC-CTL细胞的培养方法，其特征在于，包括
步骤1、单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基培养后分别收集贴壁细胞和未贴壁细胞；
步骤2、贴壁细胞接种含细胞因子的X-VIVO15无血清培养基培养，肿瘤抗原致敏，得到致敏的DC细胞；
步骤3、未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及细胞因子的X-VIVO15无血清培养基诱导培养CIK细胞；
步骤4、将致敏的DC细胞和CIK细胞混合培养得到DC-CTL细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料完全浸没于X-VIVO15无血清培养基中。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料的制备方法为动物胶原溶解于酸性溶液溶解得到浓度为5mg/mL的酸性胶原溶液，依次加入0.3mol/L的Na2HPO4·12H2O溶液和2％海藻酸钠溶液混合，调节pH至9.0，加入羟基磷灰石混匀后倒入模具成型，升温至25℃凝胶后，低温预冻后冻干；其中所述羟基磷灰石：胶原：海藻酸钠的质量百分比为(40％-50％):(30％-40％):(20％-30％)。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的培养方法，其特征在于，所述单个核细胞接种X-VIVO15无血清培养基的接种量为2×106个/mL-8×106个/mL。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的培养方法，其特征在于，步骤2具体为贴壁细胞接种含IL-4和GM-SCF的X-VIVO15无血清培养基，3天后补加GM-SCF和IL-4，培养至4-6天后添加新鲜的X-VIVO15无血清培养基，同时添加GM-SCF、IL-4、TNF-α和肿瘤抗原得到致敏的DC细胞。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，接种时所述IL-4和GM-SCF的终浓度均为100-1000U/mL；3天后补加时所述IL-4和GM-SCF的终浓度均为100-1000U/mL；培养4-6天后添加的IL-4和GM-SCF的终浓度均为50-500U/mL；TNF-α的终浓度为100-1000U/mL。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的培养方法，其特征在于，步骤3具体为未贴壁细胞接种含胶原-海藻酸钠-羟基磷灰石支架材料及细胞因子INF-γ的X-VIVO15无血清培养基，第2天添加细胞因子OKT-3、IL-1α和IL-2；从第一天开始每隔3天补加X-VIVO15无血清培养基，维持细胞密度5-20×105/ml，并添加IL-2。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，细胞因子INF-γ的终浓度为500-2000U/ml；第2天添加OKT-3的终浓度为10-100U/mL、IL-1α的终浓度为50-200U/mL、IL-2的终浓度为100-500U/mL；每隔3天补加IL-2的终浓度为100-500U/mL。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的培养方法，其特征在于，步骤3所述培养CIK细胞的培养时间为7天。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的培养方法，其特征在于，步骤4所述混合培养的培养时间为7天。
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