JP2020520951A - 骨髄異形成症候群の治療のためのインスリン様増殖因子−化学療法剤結合体 - Google Patents

骨髄異形成症候群の治療のためのインスリン様増殖因子−化学療法剤結合体 Download PDF

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Abstract

７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ及び他のＩＧＦ受容体標的薬を用いる、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）、又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の治療法、並びに、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ及び他のＩＧＦ受容体標的薬を患者に送達するための製剤、が提供される。また、ＭＤＳ、Ｏ−ＡＭＬ、及びＣＭＭＬの治療に用いられる医薬組成物も提供される。
【選択図】図１３

Description

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、多能性前駆細胞の異常を原因とする造血障害であり、造血不全、骨髄機能不全、末梢血中の血球減少、及び生存率の減少を特徴とする。
ＭＤＳは亜型として慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を含み、多くの場合、乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）へと進行する。ＭＤＳ、ＣＭＭＬ、及びＯ−ＡＭＬは骨髄増殖性疾患の一種とみなすことができる。また、ＣＭＭＬ及びＯ−ＡＭＬは、ＭＤＳと密接に関連したＭＤＳ亜型疾患とみなすことができる。[Schanz J, Tuchler H, Sole F, et al. New comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes (MDS) and oligoblastic acute myeloid leukemia after MDS derived from an international database merge. J Clin Oncol 2012; 30:820-829. http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/hematology-oncology/myelodysplastic-syndromes/]
米国において、ＭＤＳの治療薬は３つしか承認されていない。そのうち主要なものは、脱メチル化剤である、アザシチジン（５−ＡＺＡ、ＶＩＤＡＺＡ）及びデシタビン（ＤＡＣＯＧＥＮ）の２つである。これらのメチル化阻害剤は、真偽は定かではないが、腫瘍抑制遺伝子の再活性化と、直接的な細胞毒性機序とを通じて働くとされており、造血前駆細胞の分化を誘導する場合がある。高リスク患者における最近の第ＩＩＩ相試験においておよそ５０％の患者に反応が認められ、アザシチジンを投与された患者では、ベストサポーティブケア又は化学療法を含む従来療法で治療された患者と比較して、経過観察２年目の生存率は２倍となった。多施設第ＩＩＩ相試験でデシタビンが試験されたが、奏功が達成されたのは患者の３０％で、完全及び部分寛解率は１７％であり、ベストサポーティブケアとの比較でも全生存における優位性は示されていない。サリドマイドの関連物質であるレナリドマイド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ）もＭＤＳ用に承認されており、全てではないがいくつかのＭＤＳ病型で有効性を示している。
ＤＮＡ複製を何らかの形で妨げる標準的な化学療法剤は通常ＭＤＳに使用されないが、それは、そのような化学療法剤が血球数を減少させて血球減少を引き起こすためであり、ＭＤＳ患者が疾患の結果として既に血球を減少させていてさらなる血球数の減少に耐えることができないためである。レナリドマイドにも血球減少を引き起こす副作用があり、ＭＤＳにおけるその有用性は限定されている。
ＭＤＳ、Ｏ−ＡＭＬ、及びＣＭＭＬに対する既存薬は効果が不十分である。
ＭＤＳと診断された際の平均余命は未だに４〜８５か月間であり、中央値は約２４か月である（Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes. Br J Haematol 1982; 51:189-199. http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/hematology-oncology/myelodysplastic-syndromes/）。ＭＤＳ、Ｏ−ＡＭＬ、及びＣＭＭＬに対する新たな薬剤及び治療法が必要とされている。
メトトレキサート（ＭＴＸ）に共有結合した、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１又はＩＧＦ）又は７６５ＩＧＦなどのＩＧＦバリアントの結合体（ＩＧＦ−ＭＴＸ）について以下に説明する。この結合体は、メトトレキサートと同様に、インビトロにおいてがん細胞に対して細胞毒性を示す。ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体は、ＭＴＸと同様に、ジヒドロ葉酸還元酵素を阻害する。ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体は、インビトロにおけるがん細胞の増殖阻害のＩＣ５０（５０％阻害剤濃度）が、ＭＴＸ単独よりも高い。しかし、マウスモデルにおけるインビボ腫瘍増殖阻害では、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体はＭＴＸと比較して６倍超の有効性を有する。すなわち、ＩＧＦ−ＭＴＸは、１ｋｇ当たりに投与されたＭＴＸ基のモル数に換算して、１／６倍という低用量であっても、ＭＴＸより高い有効性を有する。
ヒト臨床試験において、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸが、０．２μＥｑ／ｋｇという驚くほど低い用量で一部の固形腫瘍患者の腫瘍成長を有効に遅延したことを以下に示す。１人の再発性ホジキンリンパ腫患者が、０．２μＥｑ／ｋｇの７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによる週１回の治療の後に、がんのない状態になったことも分かった。この臨床試験では、０．８μＥｑ／ｋｇまで、ヒトにおける用量制限毒性は見られなかった。この臨床試験では、試験された最大用量の０．８μＥｑ／ｋｇも含むどの用量においても、血球減少は全く見られなかった。対照的に、メトトレキサートによる治療では、血球減少が例外なく起こり、メトトレキサートを用いた場合に観察されるおそらくは最も重篤な共通の有害事象となる。
０．５、２．０、及び４．０μＥｑ／ｋｇの７６５ＩＧＦ−ＭＴＸを週１回、５週間投与するイヌにおける反復投与試験では、正常域を下回るレベルまでではないが、赤血球質量に僅かな減少が見られたが、リンパ球にも好中球にも減少は見られなかった。０．５、５、又は８μＥｑ／ｋｇを週１回、６週間投与するラットにおける反復投与試験では、０．５μＥｑ／ｋｇでは血球減少は見られず、５μＥｑ／ｋｇでは赤血球質量及び白血球にほんの僅かな減少が見られたが、３週間の回復期の後には正常値まで戻った。
ＩＧＦ−ＭＴＸを用いたヒト毒性試験及び動物毒性試験において血球減少が生じなかったことから、ＩＧＦ−ＭＴＸは、疾患の帰結として血球減少が生じる白血病、特に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）をはじめとする骨髄性白血病の治療において、関心を集めている。ＩＧＦ−ＭＴＸを用いたヒト毒性試験及び動物毒性試験において血球減少が生じなかったことから、ＩＧＦ−ＭＴＸは、骨髄における骨髄系クローンの増殖により、他の血液細胞の産生を押しやられ、強力な血球減少が生じ、患者が輸血依存となることを特徴とする、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（密接に関連した疾患である乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）及び慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を含む）の治療において、特に関心を集めている。
１種のＭＤＳ細胞株及び３種のＡＭＬ細胞株が全て、ＭＣＦ７とおよそ同じ濃度で、インビトロにおいて７６５ＩＧＦ−ＭＴＸに対して感受性であり、また、インビボにおいてはＩＧＦ−ＭＴＸに対して感受性であることを、以下で示す。また、このＭＤＳ細胞株が、ＭＣＦ７と同様、高レベルで１型ＩＧＦ膜受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）を発現していることも示す。このことは、ヒトにおけるＭＤＳがＩＧＦ−ＭＴＸに対して感受性であること、さらには、有効であるが血球減少を引き起こさない用量のＩＧＦ−ＭＴＸでＭＤＳ患者を治療できること、を示唆している。
すなわち、本発明の１つの実施形態では、乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の患者を治療する方法であって、Ｏ−ＡＭＬ、ＭＤＳ、又はＣＭＭＬの治療の必要性が認められる患者に、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−抗がん化学療法薬結合体を含む薬剤を投与することを含む方法が提供される。Ｏ−ＡＭＬ及びＭＤＳは、ＭＤＳに非常に似た疾患として認識されている。
別の実施形態では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｏ−ＡＭＬ、ＣＭＭＬ、又はＭＤＳの患者を治療する方法であって、ＡＭＬ、ＣＭＬ、Ｏ−ＡＭＬ、ＣＭＭＬ、又はＭＤＳの治療の必要性が認められる患者に、（ａ）メチル化阻害剤（例えば、アザシチジン又はデシタビン）、及び（ｂ）インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−メトトレキサート結合体を含む薬剤を投与することを含み、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンである方法が提供される。
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ、インスリン−ＭＴＸ、及び長鎖型Ｒ３ＩＧＦ−ＭＴＸはそれぞれ、リン酸緩衝生理食塩水中、又は塩（例えば約５０ｍＭ超のＮａＣｌ）を含有するあらゆる中性ｐＨ溶液中で、難溶解性の傾向を示すことが分かっている。故に、現在では、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸは１０ｍＭのＨＣｌ中４ｍＥｑ／Ｌの溶液として保存される。患者への注入のために、２５０ｍＬの５％ブドウ糖水溶液又は１０％ブドウ糖水溶液に希釈される。ＩＧＦ−ＭＴＸは低血糖症を引き起こすため、５％ブドウ糖に含まれた状態の点滴としてＩＧＦ−ＭＴＸを送達することには、ブドウ糖の投与により、予想される軽度低血糖症が相殺されるという利点がある。また、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸはあらゆる濃度のブドウ糖水溶液に完全に溶解するが、中性ｐＨの約１５０ｍＭのＮａＣｌにおいては沈殿する傾向がある。
このことから、本発明の別の実施形態では、点滴用の溶液である医薬組成物であって、前記医薬組成物は、（ａ）ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤を含み、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンであり、前記医薬組成物は（ｂ）１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖水溶液中に溶解されており、前記組成物は５ｍＭ以上のＮａＣｌ又は２ｍＭ以上のリン酸塩を含まず、前記溶液は輸液バッグ内に含まれ、１００ｍＬ〜１Ｌの体積を有する、医薬組成物が提供される。
別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒリガンドがインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンである、ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤を投与する方法であって、前記薬剤を、体積１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％ブドウ糖（ｗ／ｖ）水溶液から実質的になる希釈液中に希釈することで、前記希釈液中の前記薬剤の溶液を作製すること、及び、前記溶液を患者に注入すること、を含む、前記方法が提供される。前記注入は３０分間〜２時間の時間をかけて行われることが好ましい。
別の実施形態では、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−抗がん化学療法薬結合体、を含む薬剤、を含む組成物であって、乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を治療する方法で使用される組成物が提供される。
別の実施形態では、（ａ）最大１００ｍＬ〜２Ｌの体積を保有できる輸液バッグに入った、（ｂ）５％又は１０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖溶液、及び前記溶液に溶解された（ｃ）ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤と、を含むデバイスであって、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンであり、前記溶液は１００ｍＬ〜１Ｌ（より好ましくは１００ｍＬ〜５００ｍＬ、１５０ｍＬ〜５００ｍＬ、又は約２５０ｍＬ）の体積を有する、デバイスが提供される。
Ｉ−１２５標識ＩＧＦ１と比較した場合の、ＭＣＦ７細胞上のＩＧＦ１Ｒに対する、７６５ＩＧＦ及び長鎖型Ｒ３−ＩＧＦの競合結合アッセイ。 Ｉ−１２５標識ＩＧＦ１と比較した場合の、ＭＣＦ７細胞上のＩＧＦ１Ｒに対する、７６５ＩＧＦの競合結合アッセイ。 増殖阻害に対する７６５ＩＧＦ−ＭＴＸのＩＣ５０を求めるために用いた、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによるＭＣＦ７細胞の増殖阻害のプロット。 ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の阻害アッセイの結果。 Ｉ−１２５標識ＩＧＦ１と比較した場合の、ＭＣＦ７細胞上のＩＧＦ１Ｒに対する、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの競合結合アッセイ。 ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによるＭＤＳ−Ｌ細胞の増殖阻害のプロット。 ＭＣＦ７（左２つの染色レーン）及びＭＤＳ−Ｌ（右の染色レーン）のウエスタンブロット。 ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによるＭＣＦ７細胞の増殖阻害。 ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＭＣＦ７腫瘍のＩＧＦ−ＭＴＸ及びＭＴＸ単独によるインビボ腫瘍増殖阻害。 ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＭＣＦ７−Ｌ腫瘍のＩＧＦ−ＭＴＸ及びＭＴＸ単独によるインビボ腫瘍増殖阻害。 ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＬＮＣａＰ腫瘍のＩＧＦ−ＭＴＸ及びＭＴＸ単独によるインビボ腫瘍増殖阻害。 健常人由来の溶血後血液のフローサイトメトリーにおける、ＣＤ３４及びＩＧＦ１Ｒ（ＣＤ２２１）の検出。 １０μＬの１×１０６／ｍＬ ＭＤＳ−Ｌ細胞と混合した、健常人由来の溶血後血液（１００μＬ）のフローサイトメトリーにおける、ＣＤ３４及びＩＧＦ１Ｒ（ＣＤ２２１）の検出。 ＭＤＳ−Ｌ細胞（１×１０６／ｍＬ）のフローサイトメトリーにおける、ＣＤ３４及びＩＧＦ１Ｒ（ＣＤ２２１）の検出。
定義：
用語「抗がん化学療法剤」は、酵素ではなく、かつがん細胞を死滅させるかまたはがん細胞の増殖を阻害するが、非がん性細胞にはより少ない効果を有する合成、生物学的、または半合成化合物を指す。
用語「がんを治療すること」は、たとえば、転移を予防すること、がんの増殖を阻害すること、がんの増殖を停止させること、またはがんの細胞を死滅させることを含む。
特定の受容体に対するリガンドの「結合親和性」という用語は、結合定数ＫＡ（解離定数ＫＤの反対）またはその実験的に決定された近似値を指す。
用語「代謝拮抗物質」は、天然に存在する物質と構造的な類似性を持ち、阻害剤または基質として、酵素と相互作用し、細胞のプロセスに干渉する抗がん化学療法剤を指す。例として、メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、アザシチジン、クラドリビン、およびペントスタチンを含む。
「ＩＧＦ−１受容体」はまた、１型ＩＧＦ受容体としても文献において知られている。
本明細書において使用される「含有する」は、オープンエンド（ｏｐｅｎ ｅｎｄｅｄ）である、すなわち、「含有する」は、他の不特定のエレメントの包含を可能にし、「含む」と同じ意味を有する。
本明細書において使用される「リーダー配列」は、タンパク質のN末端のアミノ酸配列を指す。リーダー配列はタンパク質の合成後に切断されず、成熟タンパク質の一部である。
本発明の１つの実施形態では、乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の患者を治療する方法であって、Ｏ−ＡＭＬ、ＭＤＳ、又はＣＭＭＬの治療の必要性が認められる患者に、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−抗がん化学療法薬結合体を含む薬剤を投与することを含む、前記方法が提供される。Ｏ−ＡＭＬ及びＣＭＭＬは、ＭＤＳに非常に似た疾患として認識されている。
別の実施形態では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又はＯ−ＡＭＬ、又はＣＭＭＬ、又はＭＤＳの患者を治療する方法であって、ＡＭＬ、ＣＭＬ、Ｏ−ＡＭＬ、ＣＭＭＬ、又はＭＤＳの治療の必要性が認められる患者に、（ａ）メチル化阻害剤（例えば、アザシチジン又はデシタビン）、及び（ｂ）インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−メトトレキサート結合体を含む薬剤を投与することを含み、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンである、前記方法が提供される。通常、前記メチル化阻害剤、及びＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート結合体を含む前記薬剤は、同日に投与される。
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ、インスリン−ＭＴＸ、及び長鎖型Ｒ３ＩＧＦ−ＭＴＸはそれぞれ、リン酸緩衝生理食塩水中、又は塩（例えば約５０ｍＭ超のＮａＣｌ）を含有するあらゆる中性ｐＨ溶液中で、難溶解性の傾向を示すことが分かっている。故に、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸは現在、１０ｍＭのＨＣｌ中４ｍＥｑ／Ｌの溶液として保存される。患者への注入のために、２５０ｍＬの５％ブドウ糖水溶液又は１０％ブドウ糖水溶液に希釈される。ＩＧＦ−ＭＴＸは低血糖症を引き起こすため、５％ブドウ糖に含まれた状態の点滴としてＩＧＦ−ＭＴＸを送達することには、ブドウ糖の投与により、予想される軽度低血糖症が相殺されるという利点がある。また、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸはあらゆる濃度のブドウ糖水溶液に完全に溶解するが、中性ｐＨの約１５０ｍＭのＮａＣｌにおいては沈殿する傾向がある。
このことから、本発明の別の実施形態では、注射用の溶液である医薬組成物であって、前記医薬組成物は、（ａ）ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤を含み、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンであり、前記医薬組成物は（ｂ）１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖水溶液中に溶解されており、前記組成物は５ｍＭ以上のＮａＣｌ又は２ｍＭ以上のリン酸塩を含まず、前記溶液は輸液バッグ内に含まれ、１００ｍＬ〜１Ｌの体積を有する、前記医薬組成物が提供される。
別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒリガンドがインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンである、ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤を投与する方法であって、前記薬剤を、体積１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％ブドウ糖（ｗ／ｖ）水溶液から実質的になる希釈液中に希釈することで、前記希釈液中の前記薬剤の溶液を作製すること、及び、前記溶液を患者に注入すること、を含む、前記方法が提供される。前記注入は３０分間〜２時間の時間をかけて行われることが好ましい。
前記ＩＧＦ−１ＲリガンドはＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体であってもよい。他の実施形態では、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドは、インスリン、又はＩＧＦ−１（配列番号３）、又はＩＧＦ−１のバリアントである。具体的には、バリアントは７６５ＩＧＦ（配列番号２）が好ましい。
特定の実施形態では、前記抗がん化学療法薬はメトトレキサート、クロラムブシル、又はベンダムスチンである。特定の実施形態では、前記抗がん化学療法薬はメトトレキサートである。
特定の実施形態では、前記化学療法薬は、遊離カルボキシル基を含む、非タンパク質性又は非ペプチド性の、小分子（２０００Ｄａ未満の分子量）である。これらの化学療法薬はＥＤＣを用いた反応によりタンパク質のＩＧＦ−１Ｒリガンドに結合し、これにより前記カルボキシル基が前記タンパク質のアミノ基に結合し得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載される患者の治療法は、患者の体重１ｋｇ当たり０．１〜２．５μＥｑの用量における、ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート結合体、好ましくは７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの投与を含む。他の実施形態では、前記用量は、０．２〜２．５μＥｑ／ｋｇ、０．４〜２．５μＥｑ／ｋｇ、又は０．４〜１．６μＥｑ／ｋｇ、約０．２μＥｑ／ｋｇ、約０．４μＥｑ／ｋｇ、約０．８μＥｑ／ｋｇ、約１．６μＥｑ／ｋｇ、又は約２．５μＥｑ／ｋｇである。投与は週１回が好ましいが、週２回でも、２週間に１回でも、３週間に１回でもよい。１つの実施形態では、投与は、週１回を３週間と、その後の１週間の休薬で、２８日間のサイクルで行われる。投与は静脈（ｉｎｔｒａｖｅｎｅｏｕｓ）注射による投与が好ましい。１つの実施形態では、前記結合体（ＩＧＦ−１Ｒリガンド−抗がん化学療法薬結合体）は、体積１００ｍＬ〜１Ｌ（より好ましくは約２００ｍＬ〜約５００ｍＬ、他の実施形態では１００〜５００ｍＬ、１５０〜５００ｍＬ、２００〜５００ｍＬ、又は約２５０ｍＬ、又は約５００ｍＬ）の５％〜１０％ブドウ糖に含まれた状態で、点滴静注により投与される。
いくつかの実施形態では、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドは、前記化学療法薬に共有結合によって結合している。他の実施形態では、非共有結合による結合体であってもよく、例えば、アブラキサンが、パクリタキセルがアルブミンと結合しているナノ粒子であるのと同様に、化学療法薬及びＩＧＦ−１Ｒリガンドをナノ粒子内に一緒に埋め込むことによる結合体であってもよい。
特定の実施形態では、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドは、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、又はそのバリアント、又はインスリンである。前記ＩＧＦ−１のバリアントは、天然ＩＧＦ−１と比較して、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性が減少していることが好ましい。可溶性ＩＧＦ結合タンパク質は、血液中に存在する、ＩＧＦ−１に結合する可溶性タンパク質であり、それに対し、ＩＧＦ−１Ｒ膜受容体は膜タンパク質であり、これを通じてＩＧＦ−１はその生物学的作用を発揮する。生体内のＩＧＦ−１の９９％もが可溶性ＩＧＦ結合タンパク質と結合しており、ＩＧＦ−１は可溶性ＩＧＦ結合タンパク質と結合すると、ＩＧＦ−１Ｒに結合できなくなる。以下、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性が減少した特定のＩＧＦ−１バリアント、並びに、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性を測定するためのアッセイを説明する。
大腸菌内で、組換えベクターから、Ｔ７プロモーターによる発現制御及びＩＰＴＧでの発現誘導下で、配列番号２の配列を有する融合タンパク質を発現させた。このタンパク質は、そのＮ末端に配列番号１の配列を有し、この配列は、精製用のポリＨｉｓタグと数個の追加のリジン残基とを与えている。このタンパク質のＣ末端は、１９番目から８８番目までの残基であり、Ｒ３−ＩＧＦと一致しており、Ｒ３−ＩＧＦは、野生型ＩＧＦ−１（配列番号３）の第３残基の天然グルタミン酸が配列番号２の第２１残基のアルギニンと置き換わっているヒト野生型ＩＧＦ−１の配列である。
Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）は、以下に説明されるような、ＩＧＦ−１バリアントである。
Ｎ末端配列としての配列番号１と、それに続いてＲ３−ＩＧＦを含む７６５ＩＧＦ（配列番号２）は、高収率で発現され、異なるリーダー配列を含む他のＩＧＦ融合タンパク質コンストラクトよりも高い収率で精製される。７６５ＩＧＦは、別のＩＧＦ−１バリアントであるＩＧＦ１３２よりも保存安定性が高かった。また、７６５ＩＧＦはリフォールディングによりほぼ１００％の収率で活性型であり、別のＩＧＦ−１バリアントである長鎖型Ｒ３−ＩＧＦよりも多くの野生型ＩＧＦ−１を、ＭＣＦ７細胞上のＩＧＦ−１受容体から立ち退かせた。
配列番号１のリーダーはまた、５個のリジン残基を規定している。７６５ＩＧＦ−メトトレキサート結合体は、メトトレキサートのカルボキシル基の１つを介して、アミド結合により、７６５ＩＧＦのアミノ基にメトトレキサートを共有結合させることによって作製された。７６５ＩＧＦは、８個のリジン側鎖（８個のうち５個は配列番号１のリーダーに存在する）とアミノ末端のα−アミノ基とを含む、９個のアミノ基を有する。７６５ＩＧＦ−ＭＴＸでは、ＩＧＦ単量体１個当たり平均して約８個のメトトレキサート基が結合している。長鎖型Ｒ３−ＩＧＦへの結合体及びＩＧＦ１３２への結合体では、ＩＧＦ単量体１個当たりのメトトレキサート基はより少なかった。すなわち、これが、配列番号１のリーダーのもう１つの優位性である。
Ｒ３−ＩＧＦは、配列番号２内の、配列番号１を含む融合タンパク質の中の、ＩＧＦ−１バリアントである。Ｒ３−ＩＧＦは、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）を活性化するが、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性が減少（野生型ＩＧＦ−１との比較）した、バリアントである（Francis, G.L., et al.1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223; Tomas, F.M. et al., 1993, J. Endocrinol. 137:413-421）。可溶性ＩＧＦ結合タンパク質は、ＩＧＦ−１に結合し、血流中でＩＧＦ−１を保持し、ＩＧＦ−１の生物学的半減期を延長する、天然の血清タンパク質である。しかし、ＩＧＦ−１は、ＩＧＦ結合タンパク質に結合すると、膜上のＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合できない。(Clemons, D.R., 1998, Mol. Cell. Endocrinol. 140:19-24)。この理由から、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質への結合性が減少したＩＧＦ−１バリアントは、野生型ＩＧＦ−１よりも生体内で活性が高く、より速くＩＧＦ受容体を標的とする。
ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性は、ラットＬ６筋芽細胞条件培地を用いて試験することができる。ラットＬ６筋芽細胞の増殖より得られた前記培地（０．２ｍＬ）を、０．２５％ウシアルブミン及び最終濃度０．１ｎＭ〜１μＭの競合性試験物質（野生型ＩＧＦ−１又はＩＧＦバリアント）を含む最終体積０．３ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５、）中の８，０００ｃｐｍの１２５Ｉ−ＩＧＦ−１（約０．０５μＣｉ）と、混合する。室温で９０分間インキュベートした後、結合体と遊離トレーサーを分離するため、０．２ｍｇ／ｍＬ硫酸プロタミンを含有するアッセイ緩衝液中５ｍｇ／ｍＬの氷冷急速撹拌炭懸濁液を前記試料に添加し、氷上で８分間放置後、この混合物を５，０００×ｇで２０分間遠心分離する。上清中の放射活性をγ線計数器で測定する。バリアントの結合親和性を野生型ＩＧＦの結合親和性と比較することで、バリアントの可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性が低下しているかどうかを判定することができる。
可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に対する結合親和性が低下している特定のＩＧＦ−１バリアントとしては、ＩＧＦ１３２（配列番号４）（米国特許第４，８７６，２４２号で開示）、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号５）、Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）、及び野生型ＩＧＦ−１の最初の３個の残基が欠失しているｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ１（配列番号７）が挙げられる。（長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ、及びｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ１については、Francis, G.L., et al.1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223; Tomas, F.M. et al., 1993, J. Endocrinol. 137:413-421で説明されている）。すなわち、特定の実施形態では、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合性が減少しているＩＧＦ−１バリアントであるポリペプチドは、配列番号４〜７のいずれか１つを含む。
ＩＧＦ受容体が、本明細書に記載の（ｂ）ＩＧＦ−１又はＩＧＦバリアントなどのＩＧＦ受容体リガンドと共有結合した（ａ）抗がん化学療法剤を含む結合体の、がんにおける標的となってもよい。インスリンはＩＧＦ−１Ｒに対する親和性を有するため、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリンであってもよい。
可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する親和性が減少した前記ＩＧＦ−１受容体リガンドは、野生型ＩＧＦ−１よりも、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合親和性が、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも１００倍低い。
可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合親和性は、Francis, G.L., et al.（1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223); Szabo, L. et al. （1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 151:207-214）；及びMartin, J.L. et al. （1986, J. Biol. Chem. 261:8754-8760）に記載されるように、精製後のＩＧＦ−１結合タンパク質の混合物又はラットＬ６筋芽細胞条件培地（天然に産生されるＩＧＦ−１結合タンパク質混合物）を用いて、標識ＩＧＦ−１（例えば、１２５Ｉ ＩＧＦ−１）に対しての競合結合アッセイによって、測定できる。
ＩＧＦ−１バリアントは、Ｌ６筋芽細胞条件培地中の可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合性についての、標識野生型ＩＧＦ−１に対する競合結合アッセイにおいて、１０ｎＭ超のＩＣ５０、より好ましくは１００ｎＭ超のＩＣ５０を有することが好ましい。
可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する親和性が減少したＩＧＦ−１バリアントなどの、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドは、野生型ＩＧＦ−１に近い、ＩＧＦ−１受容体に対する親和性を有することが好ましい（例えば、野生型ＩＧＦ−１よりも高いが３０倍未満である、より好ましくは、野生型ＩＧＦ−１よりも高いが１０倍未満である）。
特定の実施形態では、前記ＩＧＦ−１バリアントは、ＩＧＦ−１受容体（例えば、ＭＣＦ−７細胞上）に対する結合性についての標識野生型ＩＧＦ−１に対する競合結合アッセイにおいて、５０ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、さらにより好ましくは５ｎＭ未満、さらにより好ましくは３ｎＭ未満、のＫＤを有する。
このアッセイは、Ross, M. et al. (1989, Biochem. J. 258:267-272) and Francis, G.L., et al. (1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223)、及び本明細書の実施例４で説明されている。
本発明の特定の実施形態では、前記ＩＧＦ−１バリアントは、ＩＧＦ−１（配列番号３）を含むか、又は、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するセグメントを含む。
特定の実施形態では、前記抗がん化学療法剤は、メトトレキサート、クロラムブシル、又はベンダムスチンなどの、遊離カルボキシル基を有するものであってもよい。
特定の実施形態では、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドと結合する前記化学療法剤は、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトキサントロン、メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、アザシチジン、クラドリビン、ペントスタチン、シスプラチン、カルボプラチン、ミトタン、プロカルバジン、又はアムサクリンである。
本方法の特定の実施形態では、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドは、ＩＧＦ−１（配列番号３）ではなく、且つ、７６５ＩＧＦ（配列番号２）、ＩＧＦ１３２（配列番号４）、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号５）、Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）、若しくはｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ１（配列番号７）であるか、ＩＧＦ−１（配列番号３）ではなく、且つ、７６５ＩＧＦ（配列番号２）、ＩＧＦ１３２（配列番号４）、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号５）、Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）、若しくはｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ１（配列番号７）を含むか、又はＩＧＦ−１と少なくとも９０％の同一性を有するバリアントである。
他の実施形態では、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドは抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体である。
前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドがメトトレキサートと結合している特定の実施形態では、前記方法は、前記患者に、前記薬剤を、０．１〜２．５μＥｑ／ｋｇ、０．１〜２．５μＥｑ／ｋｇ、０．４〜２．５μＥｑ／ｋｇ、０．４〜１．６μＥｑ／ｋｇ、約０．２μＥｑ／ｋｇ、約０．４μＥｑ／ｋｇ、約０．８μＥｑ／ｋｇ、約１．６μＥｑ／ｋｇ、又は約２．５μＥｑ／ｋｇの用量で、投与することを含む。μＥｑとは、１μＭのメトトレキサート基（前記リガンドに結合）である。
メチル化阻害剤を投与することを含む前記方法では、前記メチル化阻害剤は、アザシチジン又はデシタビンであることが好ましく、アザシチジンであることがより好ましい。
１つの実施形態では、注射用の溶液である医薬組成物であって、前記医薬組成物は、（ａ）ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤を含み、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンであり、前記医薬組成物は（ｂ）１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖水溶液中に溶解されており、前記溶液は５ｍＭ以上のＮａＣｌ又は２ｍＭ以上のリン酸塩を含まず、前記溶液は輸液バッグ内に含まれ、１００ｍＬ〜１Ｌの体積を有する、医薬組成物が提供される。
より具体的な実施形態では、前記溶液は１００ｍＬ〜５００ｍＬ、１５０ｍＬ〜５００ｍＬ、２００ｍＬ〜５００ｍＬ、又は約２５０ｍＬ、又は約５００ｍＬの体積を有する。
特定の実施形態では、前記薬剤は７６５ＩＧＦ−ＭＴＸである。
より具体的な実施形態では、前記組成物は１ｍＭ未満のＮａＣｌ及び１ｍＭ未満のリン酸塩を含む。
別の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒリガンドがインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンである、ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤を投与する方法であって、前記薬剤を、体積１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％ブドウ糖（ｗ／ｖ）水溶液から実質的になる希釈液中に希釈することで、前記希釈液中の前記薬剤の溶液を作製すること、及び、前記溶液を患者に注入うすること、を含む、前記方法が提供される。
特定の実施形態では、前記溶液を患者に注入する工程は、２０分間〜２．５時間、又は３０分間〜２時間、又は４５分間〜１．５時間、又は１〜２時間の時間をかけて行われる。
別の実施形態では、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−抗がん化学療法薬結合体、を含む薬剤、を含む組成物であって、乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を治療する方法で使用される、前記組成物が提供される。
別の実施形態では、（ａ）最大１００ｍＬ〜２Ｌの体積を保有できる輸液バッグに入った、（ｂ）５％又は１０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖溶液、及び前記溶液に溶解された（ｃ）ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤と、を含むデバイスであって、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンであり、前記溶液は１００ｍＬ〜１Ｌ（より好ましくは１００ｍＬ〜５００ｍＬ、１５０ｍＬ〜５００ｍＬ、又は約２５０ｍＬ）の体積を有するデバイスが提供される。
前記デバイスは、（ｄ）前記輸液バッグに接続されたチューブ管と、（ｅ）前記チューブ管に接続された皮下用注射針と、をさらに含んでもよい。
１つの実施形態では、前記薬剤は７６５ＩＧＦ−ＭＴＸである。
前記デバイスの１つの実施形態では、前記溶液は１０μＥｑ以上２５０μＥｑ以下の前記薬剤を含む。
前記デバイスの特定の実施形態では、前記溶液は、５ｍＭ以下のＮａＣｌ（好ましくは１ｍＭ以下のＮａＣｌ）を含み、２ｍＭ以下のリン酸塩（好ましくは１ｍＭ以下のリン酸塩）を含む。
前記デバイスの特定の実施形態では、前記溶液は、５ｍＭ以下のＮａＣｌを含む（好ましくは１ｍＭ以下のＮａＣｌを含み、より好ましくはＮａＣｌを含まない）。
受容体リガンドに抗がん化学療法剤を結合するためのガイドライン
インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体の天然のリガンドは、タンパク質、すなわちインスリン、ＩＧＦ−１、およびＩＧＦ−２である。化学療法剤は、典型的に、タンパク質に存在する反応基によってタンパク質に結合させる。これらは、Ｎ−末端アルファアミノ基、Ｃ−末端アルファカルボキシル基、リジンの側鎖アミノ基、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖カルボキシル基、システインの側鎖チオール、ならびにアルギニンの側鎖を含む。タンパク質に見られる他の反応性の側鎖は、セリンおよびトレオニンの側鎖ヒドロキシル、チロシンのヒドロキシアリール、ヒスチジンのイミダゾール、ならびにメチオニン側鎖である。
同じ反応基の多くは、化学療法剤ならびにインスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体の非タンパク質性リガンドに見い出される。したがって、本明細書において議論されるタンパク質の修飾および架橋の原理の多くはまた、化学療法剤および非タンパク質性リガンドの修飾および架橋にも適用される。
タンパク質コンジュゲーションおよび架橋の化学および原理は、Ｗｏｎｇ，Ｓｈａｎ Ｓ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９１，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａにおいて記載される。この化学についての情報についての他のソースは、ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｃａｔａｌｏｇ；およびＧｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．，ａｎｄ Ｗｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびそこに引用される参考文献を含む。
アミノ酸側鎖の中で最も強い求核剤は、還元システイン側鎖のチオールである。チオールは、ほとんどのタンパク質修飾試薬と反応する。アルファ−ハロアセトアミドおよびマレイミドは、システイン残基と、特にｐＨ７．０以下で特異的に反応すると考えられる。チオールは、ジスルフィド交換によってジスルフィド試薬とも反応する。
アミノ基は、タンパク質に見出されるれる次に強い求核剤である。アルデヒドは、アミノ基と反応し、シッフ塩基を形成する。シッフ塩基は加水分解可能であり、これは本発明において利点となり得る。リガンド−化学療法剤コンジュゲートのがん細胞の中への取込みと共に、いくつかのケースでは、化学療法剤が活性となるためにコンジュゲートから化学療法剤を切断する必要がある。化学療法剤が加水分解可能な連結などのような切断可能な連結によってリガンドに連結される場合、これはより良好に達成される。切断可能な連結は、自然にまたは細胞の酵素によって切断することができる。たとえば、アミド結合は、プロテアーゼを含むいくつかの酵素によって切断される。シッフ塩基の結合は、かなりの割合で自然に加水分解する。ジスルフィドの結合は、がん細胞の細胞内還元的環境において還元的に切断されることが期待される。
アルデヒドとのアミノ基の反応によって形成されるシッフ塩基は、たとえば水素化ホウ素ナトリウムまたはピリジンボランによる還元によって安定化することができる。ピリジンボランは、インスリン、ＩＧＦ−１、およびＩＧＦ−２において見られ、それらのタンパク質の構造にとって不可欠であるジスルフィドを還元しないという利点を有する。
いくつかの化学療法剤において見られる、隣接する炭素上にヒドロキシル基を有する糖または他の成分は、たとえば過ヨウ素酸塩により糖を酸化することによって、アミノ基と反応するように修飾することができる。これは、炭素間を切断し、ジアルデヒドを産生する。アルデヒド基がアミノ基と反応する。
グルタルアルデヒドなどのようなジアルデヒドは、アミノ基を有する２つの分子を架橋するであろう。
他のアミノ試薬は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、または酸無水物（たとえば無水コハク酸）などのような活性化カルボニルを含む。
アミノ基は、ハロゲン化スルホニルおよびハロゲン化アリール（たとえば２，４−ジニトロフルオロベンゼン）とも反応する。
アミノ基はまた、イソシアネートおよびイソチオシアネートと反応し、尿素またはチオ尿素誘導体を形成する。
イミドエステルは、アミノ基に対する最も特異的なアシル化剤である。イミドエステルは、約７〜１０のｐＨで、アミンと特異的に反応し、イミドアミドを形成する。この反応は、もとのアミノ基で、正に荷電している基、イミドアミドを生成することによって電荷安定性を維持するという利点を有する。イミドアミドはまた、中性を超えるｐＨでゆっくりと加水分解し、これはまた、加水分解によりがん細胞において遊離化学療法剤を放出することができるという点で利点ともなり得る。
カルボキシル基は、穏やかな酸性条件、たとえばｐＨ５下で、ジアゾアセテートおよびジアゾアセトアミドと特異的に反応する。
カルボキシルの中で最も重要な化学修飾は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）および３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのようなカルボジイミドを使用する。アミンの存在下において、カルボジイミドは、２ステップでカルボキシルにアミド結合を形成する。第１のステップにおいて、カルボキシル基は、カルボジイミドに追加され、Ｏ−アシルイソ尿素中間体が形成される。アミンとの続く反応により、対応するアミドがもたらされる。
特に重要なカルボジイミド反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによりカルボキシルを活性化し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成における使用である。
アルギニンは、グリオキサール、２，３−ブタンジオン、および１，２−シクロヘキサンジオンなどのような近接するジアルデヒドまたはジケトンと反応する。安定化が所望される場合、ホウ酸は付加物を安定化し得る。
反応基はまた、上記の反応のいくつかによって他の反応基と置換することができる。たとえば、無水コハク酸などのような酸無水物によるアミノ基の修飾は、正に荷電しているアミノ基を遊離カルボキシル基と置換する。同様に、カルボジイミドおよびエチレンジアミンなどのようなジアミンとのカルボキシル基の反応は、カルボキシル基を遊離アミノ基と置換する。
架橋：上記に記載される反応基のうちの２つ、たとえば２つのアミノ反応基またはアミノ反応基およびチオール反応基を含有する試薬は、適切な基のうちの一方を含有する化学療法剤を、他方の適切な基を含有するインスリン受容体リガンドまたはＩＧＦ−１受容体リガンドに架橋するために使用することができる。また、カルボジイミドまたはカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化されたカルボキシル（たとえば化学療法剤の）は、アミノ基（たとえばタンパク質リガンドの）と反応することができ、アミド結合架橋を形成する。
活性化されたカルボキシルは、単離するのに十分に安定しているが、次いで、アミノ基と容易に反応し、アミド結合を形成するであろう。
Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオナート（ＳＰＤＰ）などのようなスクシンイミドは、アミノ基を通して２つの化合物をつなぐために使用することができる。（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃａｔａｌｏｇおよびＴｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８．を参照されたい）
実施例１
大腸菌における発現について最適化されたヌクレオチド配列を有し、Ｔ７プロモーターのコントロール下にある、以下のタンパク質をコードするプラスミドは、ＤＮＡ２．０社（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって合成された。
コードされるタンパク質 説明 配列
４０３ＩＧＦ Ｈｉｓ６−ＩＧＦ 配列番号：８
７６４ＩＧＦ Ｈｉｓ６−Ｋ５−ＩＧＦ１３２ 配列番号：１１
７６５ＩＧＦ Ｈｉｓ６−Ｋ５−Ｒ３ＩＧＦ 配列番号：２
７８４ＩＧＦ ｍｕｔＴｒｘ−Ｒ３ＩＧＦ 配列番号：９
７８５ＩＧＦ ｍｕｔＴｒｘ−ＩＧＦ１３２ 配列番号：１０
大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を、それぞれのプラスミドで形質転換し、形質転換体を単離した。それぞれの１０ｍｌの形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物を、２Ｌバッフル付きフラスコ中５０ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５００ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ−ｋａｎ）に接種するために使用した。これらを、０．６のＯ．Ｄ．６００ｎｍで、最終０．４ｍＭＩＰＴＧにより誘導し、２５℃で一晩増殖させた。
細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０中に再懸濁し、凍結した。それらを解凍し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、細胞ペースト１ｇ当たり０．５ｍｇリゾチーム中、５％湿重量／容量の細胞重量で室温で３０分間インキュベートした。次いで、それらを超音波処理し、細胞を破壊した。ＭｇＣｌ２を３ｍＭの最終濃度で追加し、２５０μｌのＢＥＮＺＯＮＡＳＥを培養物１リットル当たりに追加した。これを室温でさらに１時間インキュベートした。
封入体を遠心分離によって単離した。可溶性画分を保存した。
封入体を、７Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ｐＨ７．８中で可溶化した。
可溶化した封入体を、カラム中１ｍｌのＮｉ−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂にロードした。カラムをＮｉ−Ａバッファーにより洗浄し、Ｎｉ−Ｂバッファーにより溶出した。
Ｎｉ−Ａ ６Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．３。
Ｎｉ−Ｂ ６Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．４Ｍイミダゾール、ｐＨ７．３。
タンパク質収量は以下のとおりであった。
４０３ＩＧＦ溶出物３．６ｍｇ
７６４ＩＧＦ溶出物１６ｍｇ
７６５ＩＧＦ溶出物２４ｍｇ
７８４ＩＧＦ溶出物６．７ｍｇ
７８５ＩＧＦ溶出物１．９ｍｇ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、溶出物ならびに粗不溶性画分および粗可溶性画分について実行した。７８４ＩＧＦおよび７８５ＩＧＦは、可溶性画分中にＩＧＦの約半分、不溶性画分中に半分を有したようであった。４０３ＩＧＦ、７６４ＩＧＦ、および７６５ＩＧＦは、不溶性画分中にＩＧＦのほぼすべてを有するようであった。
このデータから、収量は７６５ＩＧＦで最も良好であった。配列番号１リーダー配列を有するもの（７６４ＩＧＦおよび７６５ＩＧＦ）は、単純なＭｅｔ−Ｈｉｓ６リーダー（４０３ＩＧＦ）を有するもの、またはチオレドキシンリーダー配列（７８４ＩＧＦおよび７８５ＩＧＦ）を有するものよりも良好な収量をもたらした。また、ＩＧＦ部分についてＲ３ＩＧＦ変異を有するコンストラクト（７６５ＩＧＦおよび７８４ＩＧＦ）は、融合タンパク質のＩＧＦ部分についてＩＧＦ１３２変異を有する対応するコンストラクト（７６４ＩＧＦおよび７８５ＩＧＦ）よりも良好な収量をもたらした。
実施例２
リフォールディングおよび結合アッセイ
実施例１の各２ｍｌのもとのＮｉ溶出物を、およそ等容量の１００ｍＭグリシン、６Ｍ尿素、ｐＨ９．５と混合し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ ３ｋＤａフィルターユニットで限外濾過によって濃縮し、次いで、前記バッファー中に再び戻し、約４２０μｌまで濃縮した。次いで、それらを４０３ＩＧＦ、７６４ＩＧＦ、および７６５ＩＧＦについては２ｍｇ／ｍｌ、７８４ＩＧＦについては４ｍｇ／ｍｌ、７８５ＩＧＦについては２．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。
これらの各２００μｌを、１．８ｍｌのリフォールディングバッファーと急速に混合した。リフォールディングバッファーは、１．４Ｍ尿素、１００ｍＭグリシン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１９％エタノール、０．５ｍＭ ＧＳＳＧ、４ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ９．５とした。それらを３時間室温でリフォールディングし、次いで、Ｉ−１３２放射性野生型ＩＧＦ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）に対して、ＩＧＦ受容体への競合結合を結合アッセイで試験した。比較のために、市販のＬｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ（ＬＲ３ＩＧＦ）も試験した。
この実験においておよその結合定数（ＫＤ）は、以下のとおりであった。
ＬＲ３ＩＧＦ １ｎＭ
４０３ＩＧＦ ２ｎＭ
７６４ＩＧＦ １００ｎＭ
７６５ＩＧＦ １０ｎＭ
７８４ＩＧＦ ３ｎＭ
７８５ＩＧＦ ４０ｎＭ

Ｒ３ＩＧＦバリアント（ＬＲ３ＩＧＦ、７６５ＩＧＦ、および７８４ＩＧＦ）を含む融合タンパク質は、ＩＧＦ１３２バリアント（４０３ＩＧＦ、７６４ＩＧＦ、および７８５ＩＧＦ）を含むものよりもＫＤが低かった。
実施例３
７６５ＩＧＦの精製および収量
Ｔ７プロモーターのコントロール下に７６５ＩＧＦ遺伝子を有し、大腸菌についての最適化コドン使用頻度を有する７６５ＩＧＦをコードするプラスミドは、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって合成された。大腸菌Ｂ１２１株（ＤＥ３）を前記プラスミドにより形質転換し、ファーメンター培養において増殖させ、ＩＰＴＧにより誘導した。
７６５ＩＧＦは、イオン交換クロマトグラフィーおよびニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって変性条件下で精製した。精製７６５ＩＧＦの収量は、培養物１リットル当たり約６０ｍｇであった。
７６５ＩＧＦを、実施例２と同様の手順によってリフォールディングし、次いで、リフォールディングしたタンパク質を、ＤＥＡＥ樹脂によるイオン交換クロマトグラフィーおよびニッケル樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
実施例４
ＩＧＦ−１受容体への７６５ＩＧＦ結合アッセイ
方法：
アッセイの理論：放射性１２５Ｉ標識インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）は、インビトロにおいて、ＭＣＦ７細胞（ヒト乳がん細胞株）上に豊富な１型ＩＧＦ受容体への結合について試験リガンドと競合する。試験するリガンドは、本発明者らのインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）の７６５ＩＧＦバリアント、および７６５ＩＧＦと結合した葉酸代謝拮抗剤メトトレキサートを含有する本発明者らの新規な共有結合コンジュゲート、ならびに比較およびポジティブコントロールとしての市販で入手可能なｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ−１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を含む。
ＭＣＦ７細胞培地：５００ｍＬ ＭＥＭ、０．０１ｍｇ／ｍＬウシインスリン；５ｍＬピルビン酸ナトリウム、５ｍＬ非必須アミノ酸、１０ｍＬ炭酸水素ナトリウム、１０ｍＬウシ胎児血清、５ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン。
ＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）を、４８ウェル組織培養プレート（平底、低蒸発蓋を有り）に０．５ｍＬ／ウェルの容量でウェル当たり２０，０００細胞でまき、５％ＣＯ２、３７℃に設定した細胞培養インキュベーター中に置いた。培養の２〜３日後、プレートを、ウェル当たり０．５ｍＬの冷結合アッセイバッファー（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．２；１２０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４；０．１％ＢＳＡ）により２×洗浄した。最終の洗浄の後に、０．５ｍＬの結合アッセイバッファーをそれぞれのウェルに追加し、プレートを２〜６時間４℃で置いた。
試験リガンドは、２００ｕｌの容量で５ｍＭ ＨＣｌ中１０マイクロモル（ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ）または２０マイクロモル（７６５ＩＧＦおよびＩＧＦ−ＭＴＸ）の濃度で調製した。濃度を決定するために、７６５ＩＧＦ（９７４２ダルトン）およびｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦ（９１１１ダルトン）の分子量を使用する。ｌｏｎｇ−Ｒ３については、凍結乾燥した市販の物質を、１０ｍＭ ＨＣｌ中に１．０ｍｇ／ｍｌで溶解し、これを、９１ｕｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、１０ｕＭ溶液にする。
７６５ＩＧＦおよびｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦは、２０００ｎＭ〜１ｎＭの濃度でウェルにおいて結合バッファー中に希釈した。
次に、Ｉ−１２５ＩＧＦの２５ｕＣｉロット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を、１ｍｌの水中に溶解した。結合バッファー中への適切な希釈液を作製し、次いで、５０ｕｌの希釈放射性ＩＧＦをそれぞれのウェルに加えてウェル当たり０．０３ｕＣｉ以上を加えた。新鮮なＩ−１２５ＩＧＦについて、使用するプレート当たり、Ｉ−１２５ＩＧＦの１ｍｌの水溶液のうちの１００ｕｌを、使用するプレート当たり２．６ｍｌの結合バッファーに追加することができ、５０ｕｌをウェルに追加する。
次いで、プレートを４℃で一晩インキュベートした。次いで、液体を、マイクロピペッターによりそれぞれのウェルから取り出し、ウェルを、結合バッファーで２度洗浄した。細胞を、０．５ｍＬ ３００ｍＭ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳにより溶解し、溶解物をガンマカウンターで数えた。
結果：
７６５ＩＧＦおよび市販のｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦについてのＩＧＦ−１受容体結合アッセイの結果を図１に示す。高濃度で、７６５ＩＧＦは、一貫してｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦよりも多くの放射活性を減少させ、ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦが結合しない膜上のＩＧＦ−１結合部位に７６５ＩＧＦが結合するかもしれないことを示唆する。このアッセイにおける７６５ＩＧＦのＫＤは１ｎＭ未満であったが、ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦのＫＤは約３ｎＭであった。
実施例５
７６５ＩＧＦへのメトトレキサートのコンジュゲーション
タンパク質を、ｐＨ７．３コンジュゲーションバッファーにバッファー交換し、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調節した。
ｐＨ７．３コンジュゲーションバッファー：２５ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、ｐＨ７．３。
ｐＨ６．３コンジュゲーションバッファーは、ｐＨ６．３の同じバッファーとする。
メトトレキサートを、２０ｍｇ／ｍｌでｐＨ６．３コンジュゲーションバッファーに溶解し、ｐＨをＮａＯＨによりｐＨ６．３に調節した。
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を、７５ｍｇ／ｍｌでｐＨ６．３コンジュゲーションバッファーに新たに溶解した。
１容量のＥＤＣ溶液を１容量のＭＴＸ溶液に追加し、室温で３０秒間インキュベートし、次いで、この混合物を、ｐＨ７．３コンジュゲーションバッファー中８容量の２．５ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液に追加した。
混合物を混合し、次いで、室温で一晩反応させた。次いで、６Ｍ ＨＣｌを最終濃度６０ｍＭで反応混合物に追加した。次いで、反応混合物を１０ｍＭ ＨＣｌにバッファー交換した。
結果：
タンパク質１モル当たりにコンジュゲートされたメトトレキサートの量は、１ｍＭ当たり２１．６のメトトレキサート基のモル吸光係数を使用し、１００ｍＭ ＨＣｌにおいて３０５ｎｍでのコンジュゲートの吸光度を測定することによって決定した（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，１９７６，５：２８３−３０６．）タンパク質濃度は、定量的アミノ酸分析によって決定した。これによって、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸコンジュゲートにおけるＩＧＦに対するＭＴＸ基のモル比は、およそ８となった。
実施例６
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸインビトロ細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイ．この効力アッセイは、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸとのインキュベーションによるインビトロにおけるＭＣＦ−７腫瘍細胞の増殖阻害アッセイである。
方法
０日目．０日目に、１ウェルにつき５０００のＭＣＦ７細胞を、１００ｕｌの富栄養培地に９６ウェル試験プレートにまいた。
１日目．シャドウプレート（ｓｈａｄｏｗ ｐｌａｔｅ）を、それぞれの試験プレートについて作製し、シャドウプレートのそれぞれのウェルは、それぞれのウェルにおいて培地または３×の予定最終濃度の試験薬剤を培地中に含有した。ネガティブコントロールとして、培地を使用する。ポジティブコントロールとして、３ｕＭのフリーのメトトレキサートを使用する。
シャドウプレートを作製した後、５０ｕｌを、シャドウプレートのそれぞれのウェルから試験プレートの対応するウェルに移し、試験プレートのウェルにおいて最終濃度の試験薬剤を生成した。
５日目．細胞増殖は、メーカーの指示に従って、Ｄｏｊｉｎｄｏ ＣＣＫ−８試薬を追加し、インキュベートし、色素の吸光度を測定することによって決定する。
結果：
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸによる代表的な細胞傷害性アッセイの結果を図３に示す。７６５ＩＧＦ−ＭＴＸのＩＣ５０（細胞増殖の５０％の阻害に必要とされる濃度）は、１Ｌ当たり２４９ｎ当量であった。（ナノ当量は、７６５ＩＧＦにコンジュゲートされたメトトレキサート基のナノモルである。）比較のために、同じアッセイにおいて、フリーのメトトレキサートのＩＣ５０を測定し、８８ｎＭとなった。
比較のために、ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸコンジュゲート（ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦにコンジュゲートされたメトトレキサート）は、約４００ｎＥｑ／ＬのＩＣ５０を有した（ＭｃＴａｖｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５３：２７５−２８２）。
実施例７
メトトレキサートおよびＩＧＦ−メトトレキサートコンジュゲートによるジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害
方法：
実験は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）のジヒドロ葉酸レダクターゼアッセイキットによりメーカーの指示に従って、行った。アッセイにおいて、ジヒドロ葉酸レダクターゼをｐＨ７．５バッファーと混合する。次に、阻害剤−メトトレキサートまたはＩＧＦ−メトトレキサートコンジュゲート−を追加し、溶液を混合する。それを、３０秒間インキュベートして阻害剤を結合させた。次いで、ＮＡＤＰＨを５０ｕＭ最終濃度５０ｕＭで追加し、次いで、ジヒドロ葉酸を最終濃度６０ｕＭで追加する。反応を、３４０ｎｍで吸光度を測定することによってモニターする。
結果：
試験したコンジュゲートは、以下のとおりであった。
実施例４において記載されるように調製した７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ。７６５ＩＧＦは、メトトレキサートにコンジュゲートするのに利用可能な９つのアミノ基（８つのリジンおよびＮ−末端アミノ基）を有する。このバッチは、７．５のＭＴＸ：タンパク質モル比を有した。
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ １／３。このコンジュゲートは、コンジュゲーション反応において、通常の濃度の１／３のＭＴＸおよびＥＤＣにより調製した。これにより、１．２のＭＴＸ：タンパク質モル比を有するコンジュゲートを産生した。
ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸ。この場合、ＩＧＦのバージョンは、ｌｏｎｇ−Ｒ３−ＩＧＦである。これは、コンジュゲーションについて４つの利用可能なアミノ基（３つのリジン側鎖およびＮ−末端アミノ基）を有する。このコンジュゲートは、２．８のＭＴＸ：タンパク質比を有した。
加えて、フリーのメトトレキサートを試験した。
コンジュゲートは、阻害アッセイにおけるそれらの使用の前に、フリーのメトトレキサートを完全に除去するために徹底的に限外濾過した。
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸについての阻害データのプロットを図４に示す。
メトトレキサートおよびコンジュゲートのＩＣ５０は、このとおりであった。
競合相手 ＩＣ ５０ ＭＴＸ：ＩＧＦ比
メトトレキサート ５．３ｎＭ Ｎ．Ａ．
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ ９５ｎＥｑ／Ｌ ７．５
１／３ ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ ９０ １．２
ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸ ９９ ２．８
ｎＥｑ／ＬでのＩＣ５０は、ＩＧＦタンパク質単量体当たりにコンジュゲートされたＭＴＸ基の数が異なったにもかかわらず、３つすべてのＩＧＦ−ＭＴＸコンジュゲートについてほぼ同じであった。これは、それぞれのコンジュゲートされたメトトレキサート基が、独立した酵素の阻害剤として作用することを示す。一度、１つの基がＤＨＦＲ酵素に結合したら、コンジュゲート単量体上のさらなるメトトレキサート基が立体的にＤＨＦＲ酵素に結合することができず、阻害できないならば、コンジュゲートのＩＣ５０は、観察されるように、ｎＥｑ／Ｌ ＭＴＸ基濃度の点から同じとなる代わりに、コンジュゲートそれぞれのタンパク質濃度ｎＭについて同じとなるであろうということが期待されるであろう。阻害がＭＴＸ基に比例するので、より高度なＭＴＸ積載を有する７６５ＩＧＦ−ＭＴＸは、１３ｎＭのタンパク質濃度の阻害定数を有し（９５ｎＥｑ／ＬをＩＧＦ当たり７．５ＭＴＸで割ると１３ｎＭ ＩＧＦとなる）、それに対して、ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸは、３５ｎＭのタンパク質濃度の阻害定数を有する。したがって、ＭＴＸのより高度な積載により、ＤＨＦＲの同じ阻害、また推測では同じレベルの腫瘍細胞の死滅を実現するために使用される７６５ＩＧＦタンパク質はより少量しか必要とされない。
データは、タンパク質コンジュゲートＭＴＸ基がＤＨＦＲを阻害するが、フリーＭＴＸと比較して、より高い濃度が阻害に必要とされることを示す。
実施例８
ＭＣＦ７細胞上のＩＧＦ−１Ｒに対する７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの結合
実施例４に記載されたように、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の競合結合アッセイを、ＭＣＦ７を用いて、放射性標識ＩＧＦ−１に対して、いくつか行った。その結果、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸのＫＤは約２０ｎＭである。（説明すると、これは、前記タンパク質結合体のｎＭであって、ＭＴＸ基のｎＥｑ／Ｌではない。１つの７６５ＩＧＦ当たり約８個のＭＴＸが存在するため、２０ｎＭの７６５ＩＧＦ−ＭＴＸは約１６０ｎＥｑ／Ｌの７６５ＩＧＦ−ＭＴＸとなる）図５に示される特定の結合アッセイでは、ＫＤは１３．４ｎＭであった。
実施例９
インビボ毒性試験
ＭＴＤは非げっ歯類試験及びげっ歯類試験の両方に基づくものである。正式なＧＬＰ毒性インビボ試験をラット及びビーグル犬において完了させ、その試験では、イヌについて表１に示されるように、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体を、静脈内に、単回で３０分間かけて、試験１日目及び８日目に、点滴投与した。

臨床所見、連続血糖測定値、及び臨床病理を含む、得られた全てのデータの解析から、５％ブドウ糖中、０．２μＥｑ／ｋｇ及び０．５μＥｑ／ｋｇの７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の点滴静注で治療されたイヌにおいて、薬剤／治療に関連した有意な毒性はないことが分かった。０．２μＥｑ／ｋｇの群で目立ったものは一過性の呼吸困難及び不活動だけであったが、一方、０．５μＥｑ／ｋｇで処置された動物では、嘔吐及び下痢の単一エピソードが見られ、雌イヌの頭の皮膚には軽度の発赤及び腫脹も生じた。これら２群のイヌの治療は耐容性良好であり、治療に対するいずれの反応も一過性であり、自然に解消した。
２μＥｑ／ｋｇを投与された動物では、治療に対する反応には、軽度から中等度のアナフィラキシー様反応及びじん麻疹型反応、一過性の食欲不振及び体重減少、並びに低血糖症が含まれる。６μＥｑ／ｋｇを投与されたイヌにおける治療に対する反応は、２μｍｏｌ／ｋｇにおける反応と同様であったが、より重篤でより長く持続した。すなわち、本試験から、ビーグル犬における７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体のＭＴＤは、３０分間かけた単回の点滴では、６μＥｑ／ｋｇであるとみなすことができる。
２μＥｑ／ｋｇを投与された雌イヌ及び６μＥｑ／ｋｇを投与された両方の動物における、アナフィラキシー様反応及び低血糖症からの回復は、ジフェンヒドラミン及びブドウ糖を用いた治療により補助された。
より高い用量群での低血糖症は、ＩＧＦの過剰な薬理作用であり、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の送達用ビヒクルとして５％ブドウ糖を用いることにより緩和された。アナフィラキシー様反応の原因ははっきりしていないが、メトトレキサートか、ＩＧＦか、あるいはその組み合わせによって引き起こされたのかもしれない。嘔吐、下痢、食欲不振及び体重減少はメトトレキサートに対する反応として知られている。
ビーグル犬における重篤な毒性が発現しない最大用量は、０．５μＥｑ／ｋｇであった。イヌ用量（μＥｑ／ｋｇ単位）から等価なヒト用量（μＥｑ／ｋｇ）への変換を用いると、イヌでの０．５μＥｑ／ｋｇに等価なヒト用量は、ヒトでの０．２７μＥｑ／ｋｇである。
ＩＧＦ−ＭＴＸは有意な血球減少を引き起こさない
ＭＤＳ、ＣＭＭＬ、及びＯ−ＡＭＬにおいては、これらの疾患の主な続発症となるという理由で、特に血球減少が懸念事項となる。ラット及びイヌの両方の反復投与ＧＬＰ毒性試験において、ＩＧＦ−ＭＴＸは、試験された最高用量でも、血球減少をほとんど引き起こさなかった。ラット及びイヌの両方の毒性試験においてＩＧＦ−ＭＴＸは、用量依存的な赤血球質量の減少をわずかに引き起こしたが、最高試験用量でも赤血球質量は正常範囲内であった。ラットにおいて、好中球もＩＧＦ−ＭＴＸによってわずかに減少したが、最高用量でも正常範囲内であり、イヌにおいては好中球はＩＧＦ−ＭＴＸによって減少しなかった。他のいかなる血液学的パラメーターもＩＧＦ−ＭＴＸによって影響を受けなかった。
ヒト固形腫瘍患者における完全な第Ｉ相用量漸増試験では、０．８μＥｑ／ｋｇの用量が重篤有害事象もなく耐容性であることが分かった。ＭＤＳ患者は固形腫瘍患者よりも血球減少の程度が大きいため、またＭＤＳ患者の安全性のために、この試験の新たな用量漸増を、０．２μＥｑ／ｋｇの用量レベルから開始して、１日目、８日目、及び１５日目に投与して、実施している。用量漸増の概要については６ページの概要を参照されたい。
実施例１０
スプラーグドーリーラットにＩＧＦ−メトトレキサート結合体を週１回、６週間、静脈内投与した後、１４日間の回復期をおく、毒性試験
この反復投与試験により、７６５ＩＧＦと命名されたインスリン様増殖因子のバリアントとメトトレキサート（ＭＴＸ）との結合体である７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの、全身毒性、及び毒性の標的器官を調べた。このＩＧＦ−ＭＴＸ結合体を、週１回、６週間、静脈内低速ボーラス投与で投与した。３群のスプラーグドーリーラットに、０．５、２及び５μＥｑ／ｋｇ（１μＥｑは１μｍｏｌのメトトレキサート基である）の用量レベルで、２回、静脈内投与した。高用量群で毒性が認められなかったため、３回目の投与から、中用量群の用量レベルを２から５μＥｑ／ｋｇに増加し、これを治療の終わりまで続けた（すなわち、動物は５μＥｑ／ｋｇの投与を計４回受けた）。高用量群では、用量をまず５から１０μＥｑ／ｋｇに増加し（３回目の投与）、その後、重篤な毒性が見られたため、残りの３回の投与については用量レベルを８μＥｑ／ｋｇに調整した。ラットの対照群には、ＩＧＦ−ＭＴＸ調製の希釈液として使用された５％ブドウ糖注射液（ＵＳＰ）（Ｄ５Ｗ）を投与した。
この試験では４群のラットを用いた（対照群として１群、試験群として３群）。本試験用の試験群及び対照群はそれぞれ、１０匹の雄ラット［系統：Ｃｒｌ：ＣＤ（登録商標）（ＳＤ）ＢＲ−Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系（チャールスリバーカナダ社、カナダ）］から構成された。また、対照群、中用量群及び高用量群の回復群には雌雄毎に５匹のラットが含まれ、ＣＢＣ／グルコース亜群には雌雄毎に３匹のラット（対照）及び雌雄毎、群毎に６匹のラット（試験群）が含まれた。毒物動態試験のための血液採取用に、さらに、雌雄毎に３匹のラットが対照群に割り当てられ、雌雄毎に９匹のラットが各試験群に割り当てられた。
投与体積は、対照群を含む全ての群で４ｍＬ／ｋｇであった。本報告のために用量レベルをいくらか調整しているが、本報告で使用された用量は０．５、５及び８μＥｑ／ｋｇとなる。
全動物の検査には、毎日の臨床観察、並びに食物及び水の毎日のモニタリングが含まれた。動物には詳細な理学的検査も週１回の頻度で行った。初日、７、１４、２１、２８、３５及び４１日目、並びに４２日目の剖検前（本試験用動物）、加えて、３７、４２、及び４９日目、並びに５０日目の剖検前（回復用動物）に、体重を記録した。摂食量は毎週記録した。２回目の投与の２４時間前、及びその後の各投与の２４時間前に、全血球計算（ＣＢＣ）を実施した。本試験期及び回復期の最後に、徹底的な臨床病理検査を実施した。
検眼鏡検査を最初（治療開始前）、及び本試験の最後に実施した。
毒物動態検査用にプロトコルのスケジュールに従って血液試料も採取したが、この試料の解析は行わなかった。６回目の投与が終了した６日後に、各群から雌雄各１０匹の本試験用動物を、安楽死させ、肉眼的剖検及び組織病理学的検査にかけた。対照群、５μＥｑ／ｋｇ投与群及び８μＥｑ／ｋｇ投与群の残りの雌雄各５匹の回復用ラットを、最後の投与の１４日後に安楽死させ、剖検及び組織病理学的検査にかけた。
高用量群では、３匹のラットが死亡及び／又は安楽死した。用量が５μＥｑ／ｋｇから１０μＥｑ／ｋｇに増加した１５日目（３回目の投与）に、１匹の雄（ＴＫ群）及び１匹の雌（本試験群）が投与完了直後に死亡した。
被験物質の低ｐＨ（ｐＨ２．３程度）が、用量レベルが１０μＥｑ／ｋｇに増加された後の代謝性アシドーシスを引き起こしたかもしれず、さらに／又は、被験物質が静脈内で沈殿した、という疑いがあった。組織病理学的評価によって、多数の、大きさの一定しない、丸い、緑色がかった灰色の、無定形の粒子が見つかり、いくつかは、急性に死亡した両方の動物の肺に中心密度を有した。これらのラットのうちの１匹は、これらの粒子を心臓にも有した。また、両方の動物で、肺における急性血栓塞栓症、及び心臓における急性静脈内凝固が見られた。注射された物質が沈殿し、微小血管の微小な塞栓及び閉塞を伴って血管内血小板凝集を惹起したと考えられる。
２４日目に安楽死させた第三のラットでは、虚血性壊死及び実質萎縮を伴う上行性腎盂腎炎が見られた。これらの変化は重篤であり、臨床的悪化を説明するものであった。この病態は偶発的であり、被験物質による治療とは関係がないと考えた。
死亡したラットを除いて、全ての群の他の全てのラットは、特定の治療を受け、予定された安楽死及び剖検の日まで生存した。
０．５μＥｑ／ｋｇのＩＧＸ−ＭＴＸ結合体で治療されたいかなるラットにも、又は、２μＥｑ／ｋｇ投与（最初の２回の投与）、その後５μＥｑ／ｋｇ投与（残り４回の投与）を受けたラットにおいて、治療に関連した全身性毒作用は見られなかった。
高用量群において、用量が１０μＥｑ／ｋｇに増加された後、投与後１時間以内に、一部のラットで血尿が時折観察された。これは、試験製剤の低ｐＨ（ｐＨ＝約２．３）によるものとされた。
眼科学的検査の結果からはいかなる異常所見も認められず、試験群と対照群との間には摂食量増加及び体重増加の有意差は認められなかった。
５μＥｑ／ｋｇ投与群及び８μＥｑ／ｋｇ投与群において最も治療に関連していそうであるが、ＭＴＸ投与に対する有害反応としては予想され一般的なものである、以下の病理学的所見が得られた。
試験時にモニタリングされたＣＢＣパラメーターにおける一般的な傾向として、赤血球質量（赤血球（ＲＢＣ）数、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ヘマトクリット（Ｈｃｔ））の用量依存的な僅かな減少と、それを補うための網状赤血球の増加があった。６回目の投与の前に、５μＥｑ／ｋｇ治療群の赤血球質量は約８〜１５％（雄雌合わせて）減少し、８μＥｑ／ｋｇ投与群では約１５〜１９％減少した。同時に、網状赤血球数が、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の５μＥｑ／ｋｇ投与群及び８μＥｑ／ｋｇ投与群において、それぞれ、４７〜１０２％及び２．２〜２．４倍（雄雌合わせて）増加した。好中球数もこれらの両方の群で減少した。
また、本試験の終わりに、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体による５μＥｑ／ｋｇ治療群及び８μＥｑ／ｋｇ治療群の雌雄両方の動物において、赤血球質量の減少が観察された（５μＥｑ／ｋｇ投与群及び８μＥｑ／ｋｇ投与群のそれぞれで、平均６〜７％の減少、及び平均１０〜１４％の減少）。それを補うための網状赤血球増加がこれらの群の両方で見られた。
白血球（ＷＢＣ）数もこれらの２群で減少していた（好中球、リンパ球及び単球が全て影響を受けた）。全ての細胞型がほぼ等しく影響を受けたように見えた。対照と比較したとき、好中球の減少は、５μＥｑ／ｋｇ治療群では約５〜３５％（雄雌合わせて）であり、８μＥｑ／ｋｇ投与群では５０〜５７％の範囲内であった。血小板も、８μＥｑ／ｋｇを投与された雌では有意に減少した（対照群の雌と比較して約３８％の減少）。回復用動物においては、これらの全てのパラメーターが、正常に戻るか、又は、回復を表す正常化の傾向を示した。
５μＥｑ／ｋｇ投与群及び８μＥｑ／ｋｇ投与群の雄雌の両方において、脾臓の平均重量が増加した。この増加は、対照群ラットの脾臓の平均重量と比較して、平均して１７〜３８％の範囲内であった。
治療群で観察され、治療に関連すると考えられたものとして、以下の変化が見られたが、これらはＩＧＦの予想された過大な薬理作用であった。
０．５μＥｑ／ｋｇ投与群（雄雌合わせて）では、投与後に平均血糖値が増加した。この増加は、６回の投与に亘って、０．３±０．５〜４．０±５．０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内であった。時折、この群の一部の動物で、血糖値の減少が観察された。
５μＥｑ／ｋｇ投与群では、６回の投与に亘る血糖値の平均増加又は平均減少は−１．８±７〜７．５±３．４ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内であり、８μＥｑ／ｋｇ投与群では、前記増加／減少は−２．１±１．３〜２．６±３．１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内であった。ある場合（３回目の投与−１０μＥｑ／ｋｇ）に、一部の動物の血糖値が２．８ｍｍｏｌ／Ｌ未満に減少したため、この群の全ての動物に、ラット当たり２ｍＬの１０％ブドウ糖を腹腔内投与した。なお、血糖値の減少は用量依存的であるように思われた。
組織病理学的評価により、８μＥｑ／ｋｇ投与群の動物の肺において、毒性学的に重要である可能性のある、いくつかの変化が確認された。これらは以下の通りである。
この試験の多くの動物の肺で、微小血管隆起の増加と、血管周囲の間質への顆粒球及びリンパ球の浸潤が見られた。これらの血管周囲への炎症性細胞の浸潤は、本試験における、対照群の５／２０匹の動物及び８μＥｑ／ｋｇ投与群の１９／１９匹の動物において観察された。この反応の重症度は８μＥｑ／ｋｇ投与群でより高かった。この反応は、回復群では、対照群の４／１０匹の動物及び高用量群の０／１０匹の動物において観察された。
高用量回復群の１匹の動物で、虚血性梗塞と合致する、置換性線維形成による、楔状の実質領域の喪失が見られた。これらは初期の局所的虚血イベントの副産物である。このような変化はプロトコルとは無関係の孤発性の病態として生じ得るものであるため、このような梗塞が本治療に関連しているかどうかは不明である。
結論として、臨床所見、眼科学的検査、肉眼的剖検及び組織病理学的検査を含む、全ての得られたデータの解析により、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体を、０．５μＥｇ／ｋｇ及び５μＥｇ／ｋｇで、週１回、６週間静脈内投与されたラットにおいて、薬剤／治療に関連する有意な毒性はないことが明らかとなった。これらの２つの用量レベルでは、動物は前記治療に良好な耐容性を示した。
０．５μＥｇ／ｋｇの用量レベルにおいて、単なる、一部のラットで時折確認された所見であるが、血糖値のごく僅かな減少が見られた。この所見はＩＧＦの予測される薬理作用であるため、本実験の条件下では、本試験の無作用量（ＮＯＥＬ）は、０．５μＥｑ／ｋｇを週１回、６週間、に等しいと見なした。
５μＥｑ／ｋｇの用量レベルでは、０．５μＥｇ／ｋｇ投与群の動物でより明白である血糖値の減少に加えて、赤血球質量のごく僅かな減少（６回目の投与前で約８〜１５％、本試験終了時で約６〜７％）も見られた。この群では、本試験終了時に、ＷＢＣもごく僅かに減少していた（約５〜３５％）。回復の終了時、この群のＲＢＣ及びＷＢＣは共に正常範囲内であったが、これは、これらの変化が可逆的であることを示している。この群では、脾臓重量のごく僅かな増加も見られ、これは、回復用動物における正常化の傾向を示すものである。これらの所見は、造血に対するＭＴＸの既知の作用であった。従って、本実験の条件下では、本試験における無作用量（ＮＯＡＥＬ）は、５μＥｇ／ｋｇに等しいと見なした。
実施例１１
ビーグル犬にＩＧＦ−メトトレキサート結合体を週１回、５週間、点滴静注した後、２１日間の回復期をおく、毒性試験
この反復投与試験により、７６５ＩＧＦと命名されたインスリン様増殖因子のバリアントとメトトレキサート（ＭＴＸ）との結合体である７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの、全身毒性、及び毒性の標的器官を調べた。このＩＧＦ−ＭＴＸ結合体を、週１回、５週間、静脈（ＩＶ）点滴で投与した。３群のビーグル犬に、５％ブドウ糖（Ｄ５Ｗ）中、０．５、２及び４μＥｑ／ｋｇ（１μＥｑは１μｍｏｌのメトトレキサート基である）の用量レベルで、静脈内投与した。４群目のイヌ対照群には、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体調製の希釈液として使用されたＤ５Ｗを投与した。
この試験では４群のイヌを用いた（対照群として１群、試験群として３群）。対照群、中用量群及び高用量群は１０匹のイヌ（雄５匹、雌５匹）から構成され、低用量群は６匹のイヌ（雄３匹、雌３匹）から構成され、品種はビーグル（リッジラン・ファームズ社）であった。試験物質及び対照物質はＩＶ点滴で５ｍＬ／ｋｇ／時の投与体積で１時間かけて投与した。
全動物の検査には、毎日の臨床観察、並びに食物及び水の毎日のモニタリングが含まれた。動物には詳細な理学的検査も週１回の頻度で行った。初日、８、１５、２２、２９及び３４日目、並びに３５日目の剖検前（本試験用動物）、加えて、３０、３７、４４、及び４９日目、並びに５０日目の剖検前（回復用動物）に、体重を記録した。摂食量は毎日記録した。初回投与の２４時間後、及びその後の各投与の前に、全血球計算（ＣＢＣ）を実施した。試験開始前、本試験期終了時及び回復期終了時に、徹底的な臨床病理検査を実施した。
全ての動物は０．５〜４μＥｑ／ｋｇの用量の指定の治療を受け、治療に関連した死亡は無かった。
眼科学的検査及び心電図（ＥＣＧ）（ＱＴを含む）の所見は、全ての試験群で、正常な生理学的限界内であることが分かった。
０．５μＥｑ／ｋｇ投与群では、治療に対する臨床反応は、１匹の雄イヌでの軽度から中等度の不活動及び強膜充血、２匹の雌イヌでの嘔吐、並びに別の雌イヌでの軽度の呼吸困難からなり、軽度であった。また、１匹の雌の動物には、目の周辺の軽度の浮腫が見られた。上記所見は全て単一の臨床イベントであり、５回の投与が行われた期間中に１回のみ起こり、一過性であり、自然に解消した。これらの動物における投与後の血糖値の減少は全て無視できるものであった。試験終了時、赤血球質量の極めて僅かな減少がこの群で見られた（対照と比較して約１０％の減少）。しかし、この群の赤血球（ＲＢＣ）、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）及びヘモグロビン（Ｈｂ）は、十分に、正常の範囲内であった。これらの所見は、規模が小さく、一過性で、自然に解消し、メトトレキサート治療の予測される副作用であったため、臨床的に関連があるものとみなさなかった。
２μＥｑ／ｋｇ投与群及び４μＥｑ／ｋｇ投与群で治療関連性があるが、ＭＴＸ投与に対する有害反応としては予想され一般的なものである、以下の臨床所見、臨床病理学的検査、及び肉眼的剖検が得られた。
投与後に食欲不振が全てのイヌで見られ、その後、体重の減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）、及び／又は体重減少（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）が見られた。２μＥｑ／ｋｇ投与群のイヌでは、各投与後の２日目に食欲不振が常に観察され、２〜３日間継続したはずであるが、次の投与までには動物は完全に又は部分的に回復したはずである。本試験の終わりまで、これらのイヌの体重増加は無視できるものであり、３４日間の期間をかけて、雄の動物は対照群の雄イヌの８．４％と比較して約１．２％のみの増加であり、雌は対照群の雌の１１．１％と比較して２．８％の増加であった。この群の摂食量は対照群のイヌの摂食量よりも約２２％低かった（雄雌合わせて）。
４μＥｑ／ｋｇ投与群の動物では、２μＥｑ／ｋｇ投与群のイヌにおけるよりも、食欲不振がより重篤であった。これは、治療期間に亘って、対照と比較して約３６〜３８％の摂食量減少をもたらし、イヌにおける総平均体重減少は雄で１．３ｋｇ、雌で０．９ｋｇであった。３週間の回復期の間に、この群のイヌは体重を回復させ、これは体重減少が可逆的であることを示している。
２μＥｑ／ｋｇ投与群の一部の動物及び４μＥｑ／ｋｇ投与群の全てのイヌで、悪心（レッチング）、下痢及び嘔吐が時折見られた。これらは投与が実施された日には常に観察された。
赤血球質量（ＲＢＣ、Ｈｂ、Ｈｃｔ）の減少及び赤血球大小不同症／大赤血球症は本試験の終了時まで軽度であった。この減少は、２μＥｑ／ｋｇ投与群及び４μＥｑ／ｋｇ投与群のイヌで、対照群のイヌと比較したとき、それぞれ約１３％及び約１５％であった。回復期の終了時にも尚、これらの２つの群の赤血球質量は試験前レベルを下回っていた。しかし、ＲＢＣ、Ｈｂ及びＨｃｔのレベルの減少は正常範囲の下限を一度も越えなかった。
平均総タンパク質量及びアルブミン値は、４μＥｑ／ｋｇ投与群の動物において、正常範囲の限界値の僅かに下まで減少した。回復期の後、これらの値は正常範囲内にあった。アルブミン値の減少は、最も高い可能性として、これらのイヌで報告された食欲不振及び体重減少の結果であろう。
２μＥｑ／ｋｇ投与群の１０匹中２匹のイヌにおいて、ＡＬＴ活性が正常範囲の上限を上回って僅かに増加した（平均１１％の増加）。４μＥｑ／ｋｇ投与群のイヌでは、４匹のイヌが影響を受けて、増加は、平均して、雄で約１倍、雌で約５２％であった。肝細胞障害の指標となる組織病理学的所見が見られない場合、このＡＬＴの増加は、最も高い可能性として、肝細胞透過性の変化による亜致死性傷害、及びＡＬＴの増加、を表すものであった。
２μＥｑ／ｋｇ投与群で、血糖値減少（初期血糖値−点滴終了直後の血糖値）は、−２．５±１．３〜−０．７±１．３ｍｍｏｌ／Ｌ（５回の投与に亘っての雄雌合わせた平均減少）の範囲内であった。４μＥｑ／ｋｇ投与群では、この減少は−３．９±１．７〜−１．６±０．６ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内であった。この血糖値減少はＩＧＦの予想される薬理作用であった。
２μＥｑ／ｋｇ投与群及び４μＥｑ／ｋｇ投与群における、投与及び治療に関連すると考えられ、臨床的に意義があり、毒性学的に重要な、臨床所見及び病理学的所見を以下に記載する。なお、以下の有害反応はあまり一般的ではないが、様々な条件でＭＴＸを投与されたヒトにおける、公知の報告された反応である。しかし、ＩＧＦの存在によって以下の反応が促進されていないと、断言することはできない。これらの反応としては以下のものがある。
頭部（眼、唇、耳の周辺）、咽頭、頸部及び前肢の皮膚の腫脹（浮腫）及び発赤（紅斑）として現れる反応の種類である、アナフィラキシー様反応（血管浮腫）が、主に点滴時に見られた。投与時にこれらの反応を見せたイヌの総数（全群合わせて）は、５匹（初回投与）、３匹（２回目の投与）、４匹（３回目の投与）、１４匹（４回目の投与）、及び、６匹（５回目の投与）であった。なお、４回目の投与日に、これらの反応を見せたイヌの数及びこれらの反応の重症度が急に増加したが、後の投与（５回目の投与）時には、これらの反応は１日目、２日目及び３日目の投与で見られた反応と同等のものになった。
ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の２μＥｑ／ｋｇ投与群と４μＥｑ／ｋｇ投与群との間で、アナフィラキシー様反応に違い（定性的にも定量的にも）は無いように思われた。
２μＥｑ／ｋｇ投与群の２匹のイヌが、１匹の雄イヌにおける２回目の投与時の癲癇と、１匹の雌イヌにおける３回目の投与時の一過性の意識消失及び姿勢緊張とからなる、神経性反応を見せた。これらの動物は共に、さらなる神経学的な事象を起こすことなく、後の治療を受けた。
１匹のイヌにおける癲癇に対する１つの妥当な説明としては、次のようなものがある。炎症性メディエーターの放出による血液脳関門（ＢＢＢ）の破綻（癲癇が始まる前、この動物は治療に対して中等度のアナフィラキシー様反応を見せ、抗ヒスタミン剤で治療する必要があった）、且つ／又は、このイヌの組織学的検査により判明した、脈絡叢における髄外造血によるＢＢＢの破綻。後者はイヌにおける癲癇の素因的状態として報告されている。軽症の神経学的事象を見せた前記２匹目のイヌでも、脈絡叢における髄外造血が見られた。２つ目の説明として、この癲癇を起こしたイヌでは、点滴中に血液中のＭＴＸが不意に急増した。１日目のこのイヌのＭＴＸレベルは、２μＥｑ／ｋｇ投与群の他のイヌよりも少なくとも２〜７倍高く、４μＥｑ／ｋｇ被験物質投与群のイヌよりも少なくとも２倍高かった。すなわち、この動物における癲癇に対する最も可能性の高い説明としては、ＢＢＢの破綻が有望であり、さらに、血液中のＭＴＸの急増も考えられた。
組織病理学的検査では、毒性学的に重要な可能性がある、以下のような、いくつかの所見が見られた。
数匹のイヌにおいて、皮質内及び髄質内のリンパ球の枯渇による胸腺萎縮が生じ、治療の用量とともに頻度及び重症度が増加した。胸腺萎縮は、明白なものであり、０．５〜４．０μＥｑ／ｋｇ／週の用量範囲内で用量関連性があり、且つ、回復期を通じても持続した。これは、本被験物質の増殖中の胸腺内リンパ球に対する直接的な作用として生じたものと考えることもできるが、間接的なストレス応答が胸腺萎縮の最良の説明である。ヒトにおいては、胸腺萎縮はＭＴＸ化学療法の反応として報告されている。
２μＥｑ／ｋｇ投与群の癲癇を示した前記動物は、本試験の他の動物では見られなかったいくつかの所見を示した。これらの所見としては、盲腸及び直腸の表面粘膜におけるリンパ球浸潤の増加、一方の副腎の皮髄領域の一側性の限局的な変性及び石灰化、並びに、気管及び主気管支の呼吸上皮における混合白血球浸潤に伴う顕著な肥厚化が含まれる。
遊離型ＭＴＸの毒物動態学的（ＴＫ）パラメーターを、低い（０．５μＥｑ／ｋｇ）、中間（２．０μＥｑ／ｋｇ）及び高い（４．０μＥｑ／ｋｇ）ＭＴＸ等価用量レベルのインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）ＭＴＸ結合体による、５回の投与からなる週１回点滴静注試験から得られた血漿中濃度−時間データから、評価した。性別の異なる動物の間でＭＴＸの血漿レベルに一貫性のある差異は確認されなかったため、雄のデータと雌のデータは合わせた。ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の１時間の点滴静注の間及び後の両方で、ＭＴＸの血漿レベルは時間とともに増加した。１日目、６〜１０匹のイヌの平均血漿中濃度に基づくと、最高血中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、全ての用量レベルで、点滴開始から２時間であった。最高血中濃度（Ｃｍａｘ）の値は７１．６〜５１１．９ｎｇ／ｍＬの範囲内であった。無限時間までの血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ∞）及びＣｍａｘの値は共に用量に比例した。ＭＴＸの血漿中の終末相半減期及び平均滞留時間はそれぞれ、４．６〜５．５時間、６．１〜７．６時間の範囲内であり、見かけのクリアランス（結合体からの遊離型ＭＴＸの遊離に基づく）は０．３４〜０．４６Ｌ／時／ｋｇと低く、見かけの分布容積は２．２４〜２．８１Ｌ／ｋｇと広かった。２９日目の投与の後のＭＴＸの薬物動態は、１日目の投与の後のＭＴＸの薬物動態と類似していた。
これらの所見は、結合体の代謝により遊離型ＭＴＸが時間依存的に遊離することを示唆している。すなわち、得られるＭＴＸのＴＫは、経時的な、結合体からのＭＴＸの遊離及び遊離型ＭＴＸの排除の両方に依存する。
ビーグル犬に０．５〜４．０μＥｑ／ｋｇの用量範囲内でＩＧＦ−ＭＴＸ結合体を静脈内投与した後、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の血清中濃度は、急速に減少した。性差による偏りはなく、１日目と比較して、血清暴露量の増加が２９日目において観察された。０．０２〜０．０５Ｌ／ｋｇ／時と小さい値であったＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の見かけのクリアランスは、１日目との比較で２９日目では２５〜５０％減少し、一方、０．０７〜０．２０Ｌ／ｋｇと小さい値であった、見かけの分布容積は、いかなる傾向も示さなかった。２．５〜４．６時間の範囲内であったＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の終末相半減期は、１日目との比較で２９日目ではごく僅かに延長し、一方、１．４〜５．３時間の範囲内であった平均滞留時間は、いかなる傾向も示さなかった。まとめると、これらの所見からは、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体が、静脈内投与後、その大きな分子サイズと矛盾無く、低クリアランスで、狭い分布容積から、排出されることが示唆される。このＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の排出は、一連の投与に伴い、僅かによりゆっくりとなっていき、血漿中暴露が増加されることとなる。ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の排出は最大ＭＴＸ濃度の発生よりも先に起こった。
結論として、臨床所見、眼科学的検査、心電図検査、肉眼的剖検及び組織病理学的検査を含む、全ての得られたデータの解析により、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体を、０．５μＥｇ／ｋｇで、週１回、５週間静脈内投与されたイヌにおいて、薬剤／治療に関連する有意な毒性はないことが明らかとなった。
この０．５μＥｑ／ｋｇという用量レベルでは、治療関連性が最も高そうな所見は、１匹の動物での軽度〜中等度の不活動及び強膜充血、２匹のイヌでの嘔吐、及び別のイヌでの軽度の呼吸困難だけであった。また、１匹のイヌにおいては、眼の周辺に軽度の浮腫が見られた。試験終了時には、軽度の赤血球減少（対照群に対して約１０％の減少）も見られた。これらの所見は、規模が小さく、一過性で、自然に解消し、メトトレキサート治療の予測される副作用であったため、臨床的に関連があるものとみなさなかった。
従って、本実験の条件下では、本試験における無作用量（ＮＯＡＥＬ）は、０．５μＥｇ／ｋｇを週１回、５週間、に等しいと見なした。
２μＥｑ／ｋｇ投与群及び４μＥｑ／ｋｇ投与群で、ＭＴＸ投与と関連した副作用には、体重増加又は体重減少の低下を伴う食欲不振、時折の下痢及び嘔吐が含まれた。また、軽度の赤血球質量減少（１３〜１５％程度）、及びアルブミン値の低下、及びＡＬＴ活性の僅かな増加も見られた。これらの所見は用量依存的であると思われ、ＲＢＣ減少を除いて、全ての動物が回復期の最後までに完全に回復した。これら２つの群では、組織病理学的検査において、胸腺萎縮及び十二指腸での壊死細胞数の増加が見られた。
また、本試験では、望ましくないが、ＭＴＸ投与に対する有害反応として報告されていたため多少は予期されていた、２種類の有害反応が見られた。２μＥｑ／ｋｇ投与群では、２匹のイヌにおいて、神経性の事象が生じた。１匹目のイヌは２回目の投与時に癲癇を起こした。この動物において、この癲癇は、炎症性メディエーター及び／又は髄外造血によって誘発された血液脳関門の破綻、並びに遊離型ＭＴＸの急増、の結果であり得るとされた。２匹目のイヌでは、一過性の意識消失及び姿勢緊張が見られた。２μＥｑ／ｋｇ投与群及び４μＥｑ／ｋｇ投与群で、アナフィラキシー様反応の発生が見られた。
これらの神経性反応及びアナフィラキシー様反応について、ＭＴＸによって誘発されたものである可能性が最も高いが、ＩＧＦがこれらの事象に全く関与していないと断言することはできない。これらの有害反応の両方が、初期に、適切な治療（抗ヒスタミン剤及びジアゼパム）によって調節されたことを留意されたい。
実施例１２
ＩＧＦ−１Ｒを発現する進行性腫瘍の治療におけるＩＧＦ−メトトレキサート結合体の第Ｉ相試験
本試験の主目的は、ＩＧＦ−１Ｒを発現する、進行性の、以前に治療された悪性腫瘍の治療の際の毒性評価により、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの最大耐用量（ＭＴＤ）を求めることである。１つの選択基準は、被験者の腫瘍（組織、骨髄、又は血液）がＩＧＦ−１Ｒを発現していなければならない、というものであり、免疫組織化学（ＩＨＣ）で１０％以上の腫瘍細胞がＩＧＦ−１Ｒを発現していることと定められた。固形腫瘍又はリンパ腫を有する患者が組入れられた。
この用量漸増試験には１９人の被験者が組入れられた。７６５ＩＧＦ−ＭＴＸを、２８日間サイクルの１日目、８日目及び１５日目に、２５０ｍＬの５％ブドウ糖中、又は医師の判断により１０％ブドウ糖中で、１時間かけてＩＶ点滴投与した。疾患増悪、容認できない毒性、又は患者による拒否が無い限り治療は継続された。サイクル２終了時±７日、その後は２サイクル毎に行った画像診断により、反応を評価した。下記の表は、試験された各用量レベルについて、試験された被験者、被験者が有した悪性腫瘍の種類、被験者が完了したサイクル数、被験者が用量制限毒性（ＤＬＴ）を発現したか、及び、該当する場合は、試験中止の理由、を示している。用量レベル３の１人のホジキンリンパ腫患者は２２回の投与治療を受け、ＣＴスキャンによる見かけの病態は安定していたが、リンパ節生検でがんのエビデンスが示されなかった際に治療を中止した。
有害事象
固形腫瘍患者が先行の固形腫瘍第Ｉ相の際に経験した、試験薬に関連しているかもしれない、又は関連している可能性が高いと判断された有害事象を、以下の表に示す。
全ての被験者で観察された、あるいは、単一の被験者における全ての薬剤投与で観察された、有害事象はなかった。最もよく見られた有害事象は、低血糖症（試験薬の予想される結果）、悪寒、及び発熱であった。これらの有害事象は、発生した場合、点滴終了後２時間以内には解消した。１人の被験者で、点滴によりグレード２の発熱が生じ、一晩継続した。１人の被験者で、点滴中にグレード３の低血圧が生じ、一晩継続した。悪心及び嘔吐はよく見られたが、点滴中に生じ、化学療法では典型的な数時間の遅れはなかった。いずれの場合も、これらの有害事象は、点滴終了後１時間以内には解消した。腹痛又は筋けいれんもよく見られたが、大腸癌患者に限定されているように思われ、そのため、試験薬の腫瘍組織に対する結合性と標的化に関連していたのかもしれない。１例の癲癇が、１人の被験者で、０．４μＥｑ／ｋｇの用量レベルの、サイクル５の１日目の点滴中（その患者の１６回目の薬剤投与）に生じたが、２分後には解消した。この患者はグレード３の低血圧イベントも同時に発現し、そのために一晩入院した。
血球減少の不発生
治療を受けたいずれの被験者にも血球減少のエビデンスが無かったことは、注目すべきことである。
実施例１３
ＭＤＳ細胞株及びＡＭＬ細胞株に対するインビトロ細胞傷害性、並びにアザシチジンとの相乗作用
ＩＧＦ−ＭＴＸはＭＤＳ細胞株に対しインビトロで細胞傷害性を有する
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸを、インビトロのトリチウム取り込みアッセイで試験した。ＭＤＳ−Ｌ細胞株は、川崎医科大学（日本）の通山薫博士から使用許諾を得たものである。１日目に、細胞を９６ウェルプレート内に１５０μＬの培地中、１５，０００細胞／ウェルで播種した。２日目、７８ｎＥｑ／Ｌ〜１５μＥｑ／Ｌの範囲内の濃度のＩＧＦ−ＭＴＸを添加した。６日目、１μＣｉのトリチウム標識チミジンを１ウェル毎に加え、６時間時間後、各ウェルから回収とカウントを行った。結果を図６に示す。ＩＣ５０は３５９ｎＥｑ／Ｌであった。１ｎＥｑは１ｎｍｏｌのＭＴＸ基と定義される。１個の７６５ＩＧＦにつき約８個のＭＴＸ基が存在する。
ＩＧＦ−ＭＴＸは骨髄系がん細胞株に対しインビトロで細胞傷害性であり、アザシチジンと相乗的である
ＩＧＦ−ＭＴＸに対する感受性について、３種のＡＭＬ細胞株を実験室にて試験した。これらの３種類の細胞株はＨＬ−６０、ＨＬ−６０／Ｓ４、及びＫａｓｕｍｉ−１である。３種とも全て、ＩＧＦ−ＭＴＸに対して感受性を有し、ＩＣ５０は４５８〜６６８ｎＥｑ／Ｌ（ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体内のメトトレキサート基のｎＭ）であった。これは、マウス異種移植片においてＩＧＦ−ＭＴＸに対し感受性を有するＭＣＦ７乳がん細胞株及びＬＮＣａＰ前立腺がん細胞株に対してのＩＣ５０とほぼ同じである。
ＩＧＦ−ＭＴＸの効果は、少なくともＫａｓｕｍｉ−１細胞株及びＨＬ−６０細胞株に対して、アザシチジンと相加的又は相乗的であった（ＨＬ−６０／Ｓ４に対する併用は試験されなかった）。ＩＣ５０の約１／３の濃度のアザシチジンの存在下で、ＩＧＦ−ＭＴＸのＩＣ５０は、Ｋａｓｕｍｉ−１細胞株では６６８ｎＥｑ／Ｌから３９８ｎＥｑ／Ｌに減少し、ＨＬ−６０細胞株では４６６ｎＥｑ／Ｌから４０９ｎＥｑ／Ｌに減少した。
実施例１４
ＭＤＳ細胞株は高レベルのＩＧＦ−１Ｒを有する
ＭＤＳ−Ｌ細胞を、１０％ウシ胎仔血清、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３、５０μＭのβ−メルカプトエタノールを添加したＲＭＰＭ１６４０中で増殖させた。約５×１０５細胞／ｍＬの密度になったときに細胞を回収し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）中、２０×１０６細胞／ｍＬに再懸濁し、タンパク質を０．５ｍｇ／ｍＬにした。
ＭＣＦ７を、１０％ＦＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬヒトインスリンを添加したイーグル最小必須培地中で増殖させた。対数期にＭＣＦ７をＴＢＳ中に回収し、タンパク質を１．０ｍｇ／ｍＬとした。
４〜２０％トリス−グリシンＷｅｄｇｅゲル上の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
試料を４×ＬＤＳで希釈した（６５μＬの試料、２０μＬのＬＤＳ緩衝液）。
レーン
１：マーカー、８μＬのＮＥＢ社製Ｐ７７１０ｓ、プレステインド
２、３：ブランク
４：１５μＬのＭＣＦ７試料（１２μｇ）
５：３．７５μＬのＭＣＦ７試料（３μｇ）
６：ブランク
７：２０μＬのＭＤＳ試料（８μｇ）
このゲルを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン、０．１％ＳＤＳ、２０％メタノール（ｖ／ｖ）を含む転写用緩衝液中で、０．２μｍＰＶＤＦ膜（インビトロジェン社製ＬＣ２００２）上に、電気的に転写した。
この膜を、ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）＋５％ドライミルク中、２３℃で、 時間ブロッキングし、その後、０．２μｇ／ｍＬのビオチン化マウス抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体ＢＡＦ３９１（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）中、４℃で一晩プロービングした。翌日、膜をＴＢＳＴで３回、各々１２分間洗浄し、その後、３０ｍＬのＴＢＳＴ＋５％ミルクで１／２，０００希釈したＰｉｅｒｃｅ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社カタログ番号２１１３０）中で、インキュベートした。Ｔｔを前記ＴＢＳＴ中、室温で６０分間振盪した。その後、ＩをＴＢＳＴで２回簡単にすすいだ後、ＴＢＳＴ中で１２分間、３回、振盪した。
その後、メンブレンをＥＣＬ Ｐｒｉｍｅウエスタンブロット試薬中に５分間、振盪なしで置いて、カメラシステムに入れ、１０分間検出した。
結果：
ウエスタンブロットの結果を図７に示す。バンドが見える左側の２本のレーンがＭＣＦ７であり、ロードされた総タンパク質量はそれぞれ１２μｇ、３μｇであった（レーン４及びレーン５）。その右側の染まりのあるレーンはＭＤＳ−Ｌ（レーン７）であり、タンパク質測定ではロードされたタンパク質は８μｇであった。しかし、並行して泳動されたゲルのクマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色では、レーン４のＭＣＦ７は、レーン７のＭＤＳ−Ｌのおよそ半分のタンパク質を実際には含んでいるように見えた。レーン７（ＭＤＳ−Ｌ）の染色されたＩＧＦ−１Ｒバンドは約２００ｋＤａの位置に泳動している。ＭＣＦ７レーンの２本の染色バンドの泳動位置は８０ｋＤａ〜１５０ｋＤａあたりである。ＩＧＦ−１Ｒは、予測分子量が２０５ｋＤの二量体であり、各単量体は８１ｋＤａのポリペプチドと２０ｋＤａのポリペプチドとを含んでいる。そのため、ＭＤＳ−Ｌのバンドは２０５ｋＤａの二量体に相当し、ＭＣＦ７のバンドは８１ｋＤａのポリペプチドと１０２ｋＤａの単量体に相当する。
ＭＣＦ７は標準的なＩＧＦ−１Ｒ高発現細胞株であり、ＭＤＳ−Ｌはほぼ同量のＩＧＦ−１Ｒを有する。そのため、ＭＤＳ−ＬもＩＧＦ−１Ｒを高発現している。
実施例１５
ＩＧＦ−ＭＴＸは固形腫瘍由来の前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰ及び乳がん細胞株ＭＣＦ７の増殖を阻害する
インビトロ増殖アッセイ
ＬＮＣａＰ細胞を、グルタミン及び１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ培地１００μＬ中、５，０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレート内に播種した。２４時間後、薬剤を含有しない新鮮培地（対照）、指定濃度のＩＧＦ−ＭＴＸを含有する新鮮培地、又は指定濃度のＭＴＸを含有する新鮮培地を１００μＬ加えた。さらに４８時間インキュベートした後、製造業者の取扱説明書に従ってＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製、熊本、日本）を用いて細胞増殖アッセイを行った。
ＭＣＦ７を、０．０１ｍｇ／ｍＬヒト組換え型インスリン、１０％ウシ胎児血清、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するイーグル最小必須培地中で培養した。インビトロ増殖アッセイ用に、前記細胞を８，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート内に播種した。１日後、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ又はＭＴＸを指定濃度まで添加した。さらに５日後、ウェル毎に、５０μＬの新鮮培地中の１μＣｉのトリチウム標識チミジンを添加した。６時間後、細胞を回収し放射活性を求めた。
インビトロ腫瘍阻害
細胞増殖に対する効果を評価するため、インビトロにおいて、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体及び遊離型ＭＴＸを、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞とインキュベートした。未処理対照群の細胞との比較で、両方の薬剤がＬＮＣａＰ細胞の増殖を阻害した。最高試験濃度の２０００ｎＭでは、遊離型ＭＴＸはＩＧＦ−ＭＴＸよりも有意（Ｐ＝０．００３）に大きい阻害を引き起こした。５００ｎＭの遊離型ＭＴＸによる増殖阻害が、２０００ｎＭのＩＧＦ−ＭＴＸによる増殖阻害と、ほぼ変わらなかった。長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ−ＭＴＸのＩＣ５０は約１０００ｎＥｑ／Ｌ（１ｎＭのメトトレキサート基）（McTavish, H. et al., Translational Research 2009;153:275-282）であった。この場合では、結合体のＩＧＦ部分が長鎖型Ｒ３−ＩＧＦであった。
ＭＣＦ７細胞を用いた７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの増殖アッセイの結果を図８に示す。この場合、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸのＩＣ５０は７１５ｎＥｑ／ｍＬであった（図８）。並行して行ったアッセイにおいての、ＭＣＦ７に対する遊離型メトトレキサートのＩＣ５０は、１７ｎＭであった（データ未記載）。
実施例１６
ＩＧＦ−ＭＴＸはインビボのマウスにおける前立腺がん細胞株の腫瘍成長を、遊離型ＭＴＸと比較して、ＩＧＦ−ＭＴＸの用量が１／６の場合でも、よりも効果的に阻害する
ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の合成、分析及び定量化
長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ−１はノボザイムズＧｒｏＰｅｐ社（ノボザイムズ・バイオファーマ・ＡＵ社、スバートン、オーストラリア）から購入した。ＭＴＸはシグマ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ−１（２０ｍｇ）は３．０ｍＬの１０ｍＭ ＨＣｌに溶解させた。その溶液に、リン酸ナトリウム（２．５ｍＬ、２００ｍＭ、ｐＨ７．４）及び固体の尿素（１．６２５ｇ）を加えた。その溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＮａＣｌ、６．５Ｍ尿素（尿素透析用緩衝液）に対して、４℃で一晩透析した（分子量カットオフは３５００）。０．４ｍＬの尿素透析用緩衝液に溶解された１．４モル当量のＮａＯＨで中和されたＭＴＸ水和物（１４．８ｍｇ）を、透析袋内の上記の長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ溶液に加えた。１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）と共にインキュベートすることにより、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ−１及びＭＴＸを結合した。ＥＤＣは、タンパク質のアミン基とＭＴＸ上のカルボキシル基との間に直接的なアミド結合を生成するゼロレングスの架橋剤である。新たにＥＤＣ（６０ｍｇ）を尿素透析用緩衝液（０．６ｍＬ）に溶解し、前記透析袋に加え、密封し、ディッシュ内で室温で２時間保存した。反応を図１に模式的に示す。
２時間後、上記の袋を尿素透析用緩衝液中に入れ、４℃で３．５時間透析した。透析緩衝液を２ｍＭ ＨＣｌに交換し、透析を一晩続けた。長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ−１は、結合に利用可能な計４個のアミノ基のために、３個のリジン残基及びアミノ末端を有する。飽和度を求めるため、結合型の長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ−１タンパク質におけるＭＴＸ濃度を、ε３７２ｎｍ＝６．４７ｍＭ−１を用いて、ｐＨ１１における光吸収によって求めた。以後、この結合型タンパク質をＩＧＦ−ＭＴＸと呼ぶ（長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ−１−メトトレキサート）。
インビボ腫瘍成長アッセイ
ＭＣＦ７細胞（ヒト乳腺癌細胞株）を０．１ｍｇ／ｍＬインスリン及び１０％ＦＣＳを添加したイーグル最小必須培中で増殖させた。このエストロゲン依存性のＭＣＦ７−Ｌ細胞株は、ミネソタ大学のディーパリ・サクデフ（Ｄｅｅｐａｌｉ Ｓａｃｈｄｅｖ）氏から寄贈されたものである。ＭＣＦ７−Ｌ細胞を、０．１ｍｇ／ｍＬインスリンを添加した改変ＩＭＥＭ培地（インビトロジェン社製、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）中で増殖させた。ＬＮＣａＰ細胞（転移性のヒト前立腺腺癌）を、グルタミン及び１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ（インビトロジェン社製、カールズバッド、カリフォルニア、米国）中で増殖させた。細胞は３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気下で増殖させた。それぞれの場合で、細胞をコンフルエントの２／３程度にまで増殖させ、トリプシン処理で回収し、富栄養培地で洗浄した後にＰＢＳで２回洗浄し、ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｍａｔｒｉｘ（ベクトン・ディッキンソン社製、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）中のリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁した。細胞をマウスの背中に皮内注射した。エストロゲンペレット（０．５ｍｇのエストラジオール、６０日間放出型、イノベーティブ・リサーチ・オブ・アメリカ社製、サラソタ、フロリダ州、米国）を、ＭＣＦ７細胞及びＭＣＦ７−Ｌ細胞を移植する２日前に、肩甲骨の間の皮下に埋入した。ＭＣＦ７細胞及びＭＣＦ７−Ｌ細胞は８週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。ＬＮＣａＰ細胞は８週齢の雄ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体は２ｍＭ ＨＣｌ、１％グリセロールに含ませて投与した。ＭＴＸはＰＢＳに溶解させた。未処置のビヒクル対照群には２ｍＭ ＨＣｌ、１％グリセロールを投与した。薬剤は、マウス体重１ｇ当たり１２．５：Ｌの体積で、尾静脈注射により、静脈内投与した。全ての試験はミネソタ大学の動物実験委員会に承認され、関連する倫理指針に従った。
結果：マウスにおける異種移植片腫瘍増殖阻害
３つのインビボ試験を実施して、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ−１を有するＭＴＸの標的化を評価した。最初の予備的な試験では、ヌードマウスの背中に乳がんＭＣＦ７細胞を皮内移植した。１５匹のマウスで腫瘍が触知可能（約５×５ｍｍ）となったら、マウスを３つの群にランダムに分配した（１群あたりｎ＝５）。ランダム化の後、０日目、４日目及び８日目に、ビヒクル、４０ｎｍｏｌ／ｇの遊離型ＭＴＸ又は１０ｎｍｏｌ（ＭＴＸ）／ｇのＩＧＦ−ＭＴＸの尾静脈注射により、マウスを処置した。最初の処置の１日後になっても、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体処置群の腫瘍は他の群の腫瘍よりも小さかった（図９）。１２日間の観察の間、遊離型ＭＴＸ群及び無処置対照群では腫瘍は成長し続けたが、一方、ＩＧＦ−ＭＴＸで処置された腫瘍は概して腫瘍成長の徴候を示さなかった。１２日目になると、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体処置群とＭＴＸ処置群との間には、平均腫瘍体積に約８倍の差があり、これは統計的に有意であることが分かった（Ｐ＝０．０４８、対応のないｔ検定）。遊離型ＭＴＸの用量と比較して１／４のＭＴＸ用量で該結合体が使用された場合であっても、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体で処置されたマウスの腫瘍体積はより小さかった。これらのデータは、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体が、インビボでのＭＣＦ７腫瘍の成長の制御において、１／４の用量で使用された場合であっても、遊離型ＭＴＸよりも効果的であることを示すものである。
第２のインビボ試験を、エストロゲン依存性ＭＣＦ７株のＭＣＦ７−Ｌを用いて行った。腫瘍細胞を移植し、腫瘍成長についてマウスをモニタリングした。腫瘍移植の１９日後、可視サイズの腫瘍を有する１５匹のマウスを、平均腫瘍サイズが同じになるように３つの群に分けた。その後、０日目及び５日目に、ビヒクル、遊離型ＭＴＸ（４０ｎｍｏｌ／ｇ）又はＩＧＦ−ＭＴＸ結合体（１０ｎｍｏｌ（ＭＴＸ）／ｇ）をマウスに尾静脈注射した。２２日目、腫瘍成長はＩＧＦ−ＭＴＸ処置群の動物及び遊離型ＭＴＸ処置群の動物においておよそ等しく阻害された（図１０）。ただし、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の用量は遊離型ＭＴＸの用量の１／４であった。ＩＧＦ−ＭＴＸ群と無処置対照群の間の２２日目の腫瘍体積の差には有意性が認められた（Ｐ＝０．００８）。これらのデータにより、再度、より低用量のＩＧＦ−ＭＴＸがインビボ腫瘍増殖阻害においてより高用量の遊離型ＭＴＸと等しく効果的であることが、示唆される。
最後のインビボ試験では、前立腺がんＬＮＣａＰ細胞を０日目にマウスに皮内移植し、その後、マウスを異なる処置群に無作為に割り付けた。５日目（腫瘍が可視サイズになる前）に、種々の濃度のＭＴＸ又はＩＧＦ−ＭＴＸ結合体をマウスに単回尾静脈注射した（図１１）。８ｎｍｏｌ／ｇのＩＧＦ−ＭＴＸ結合体処置群及び３．２ｎｍｏｌ／ｇのＩＧＦ−ＭＴＸ結合体処置群（用量は各ＭＴＸ分子のモルとして表される）の腫瘍サイズは、より高用量（５０、２０及び８ｎｍｏｌ／ｇ）の遊離型ＭＴＸ処置群のマウスと比較して、ずっと小さくなった。ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体の最低試験用量である１．２８ｎｍｏｌ／ｇは、腫瘍成長を阻害しなかった。試験終了時（９８日目）、８ｎｍｏｌ／ｇのＩＧＦ−ＭＴＸ処置群と５０ｎｍｏｌ／ｇの遊離型ＭＴＸ処置群とを比較した場合の腫瘍成長の差には、有意性が認められた（Ｐ＝０．０４、両側ｔ検定）。高い方から２つのＩＧＦ−ＭＴＸ濃度（８ｎｍｏｌ／ｇ及び３．２ｎｍｏｌ／ｇ）の併合結果と、最も高い遊離型ＭＴＸ濃度（５０ｎｍｏｌ／ｇ）との間にも、有意差が認められた（Ｐ＝０．０１１）。さらに、高い方から２つのＩＧＦ−ＭＴＸ濃度（８ｎｍｏｌ／ｇ及び３．２ｎｍｏｌ／ｇ）の併合結果と、遊離型ＭＴＸ濃度（２０ｎｍｏｌ／ｇ及び５０ｎｍｏｌ／ｇ）の併合結果との間にも、有意差が認められた（Ｐ＝０．０２９）。これらのデータに基づくと、インビボ腫瘍成長に対して、１／６．２５の用量（５０ｎｍｏｌ／ｇＭＴＸに対して８ｎｍｏｌ／ｇのＩＧＦ−ＭＴＸ）であっても、ＩＧＦ−ＭＴＸ結合体が遊離型ＭＴＸよりも有効であると、合理的に結論付けることができる。
考察
ＬＮＣａＰモデルでの腫瘍増殖阻害において、ＩＧＦ−ＭＴＸ（ＬＲ３ＩＧＦ−ＭＴＸ）は遊離型ＭＴＸよりも少なくとも６倍効果的であった。これは、１／６倍モル用量のＩＧＦ−ＭＴＸ内メトトレキサート基（８ｎＥｑ／ｋｇ）が、６倍モル用量の遊離型ＭＴＸ（５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）よりも効果的であったという意味である。同様に、ＭＣＦ７モデルにおいても、ＩＧＦ−ＭＴＸは、ＩＧＦ−ＭＴＸのモル用量が遊離型ＭＴＸの１／４倍であっても、遊離型ＭＴＸと少なくとも同程度に有効であった。これは、ＭＣＦ−７細胞を用いた場合に、ＭＴＸのＩＣ５０がＩＧＦ−ＭＴＸのＩＣ５０の約１／５０倍（ＭＴＸが１７ｎＭであるのに対し、ＩＧＦ−ＭＴＸは７１５ｎＥｑ／Ｌ）であったインビトロの結果とは、対照的である。このことは、インビボにおけるＩＧＦ−ＭＴＸの前記腫瘍細胞に対するターゲティングが、途方もないものであることを示すものである。
実施例１７
血液細胞及びＭＤＳ−Ｌのフローサイトメトリーは、正常な血液細胞がＣＤ３４及びＩＧＦ−１Ｒをほぼ有しておらず、ＭＤＳ−Ｌ細胞が高レベルのＣＤ３４及びＩＧＦ−１Ｒを有していることを示す
血液幹細胞のマーカーであるＣＤ３４、及びＩＧＦ−１Ｒを検査するためのフローサイトメトリーアッセイを開発した。ＩＧＦ−１Ｒ（ＣＤ２２１と称する）は、ＢＤバイオサイエンス社製のＣＤ２２１クローン１Ｈ７で検出した。
健常ドナー由来の溶血させた全血、及び生存可能に凍結された各体積の１×１０６／ｍＬ ＭＤＳ−Ｌ細胞と混合された前記血液に対して、フローサイトメトリーを実施した。
全血単独の結果を図１２に示し、１０μＬのＭＤＳ−Ｌ細胞と混合された１００μＬの全血の結果を図１３に示し、７５μＬのＭＤＳ−Ｌ細胞単独の結果を図１４に示す。Ｑ１（ＣＤ２２１＋／ＣＤ３４−）に含まれる細胞の割合、Ｑ２（ＣＤ２２１＋／ＣＤ３４＋）に含まれる細胞の割合、及びＱ４（ＣＤ２２１−／ＣＤ３４＋）に含まれる細胞の割合を、表２にまとめる。

健常ドナーの血液中には、ＣＤ３４陽性の白血球も、ＩＧＦ１Ｒ（ＣＤ２２１）陽性の白血球も、ほぼ存在しなかった。ＭＤＳ−Ｌ細胞では、ほぼ全ての細胞がＣＤ３４とＩＧＦ１Ｒのいずれかに対して陽性であり、９．９％が両方に対して両性であった。このことは、ＭＤＳ細胞が、ＩＧＦ１Ｒ陽性又はＣＤ３４陽性又は両方に陽性である、血液中のほぼ唯一の細胞であることを示唆している。
実施例１８
ＡＭＬ−０３：骨髄異形成症候群、ＣＭＭＬ及び乏芽球性ＡＭＬの治療におけるＩＧＦ−メトトレキサート結合体の予備実験
概要
主目的：
本試験の主目的は、進行性の以前に治療された骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）及び乏芽球性急性骨髄性白血病（乏芽球性ＡＭＬ又はＯ−ＡＭＬ）の治療に対する、インスリン様増殖因子−１−メトトレキサート結合体、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの利用の、安全性及び忍容性を決定することであり、最大耐用量（ＭＴＤ）の決定も含む。
副次目的：
本試験の副次目的は、進行性の以前に治療されたＭＤＳ患者、ＣＭＭＬ患者、又はＯ−ＡＭＬ患者における奏功率、無増悪生存期間、及び全生存で評価される、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの臨床的利点を決定することである。
患者集団：
標準的治療に抵抗性又は不耐性であり、そのような治療に反応しそうにないという、ＭＤＳ、ＣＭＭＬ又はＯ−ＡＭＬの診断
患者は、試験へのエンロールより前の以前の抗がん治療の急性毒性作用（有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ．４．０でグレード１以下）からの回復を経験していなければならない
年齢は１８歳以上
ＥＣＯＧのパフォーマンスステータスが０、１、又は２（付録ＩＩＩ）
試験デザイン：
この予備試験は、進行性の以前に治療されたＭＤＳを有する患者、ＣＭＭＬ患者及びＯ−ＡＭＬ患者におけるＩＧＦ−メトトレキサート結合体（７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ）の使用を評価するものである。０．２０〜２．５μＥｑ／ｋｇの用量の７６５ＩＧＦ−ＭＴＸを、２８日間サイクルの１日目、８日目及び１５日目に、１．５時間かけて、ＩＶ点滴投与する。２サイクル後に評価される疾患増悪、容認できない毒性、又は患者による拒否が無い限り治療は継続された。反応の評価は、サイクル２、サイクル４、及びサイクル６の終了時（それぞれ＋／−３日）に実施される骨髄試験で確認する。
最終的な最大耐用量レベル（ＭＴＤ）が決定されたら、３人の患者における、そのＭＴＤの、サイクル１の１日目、２日目、１５日目、及び１６日目の、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの薬物動態（ＰＫ）を評価する。
試験概要
患者をスクリーニングし、試験に参加させた場合、２８日間サイクルの１日目、８日目、及び１５日目に治療を実施する。患者の治療は、疾患増悪、容認できない毒性、又は患者による中止の選択が無い限り実施する。初回投与前の２８日間以内、並びにサイクル２の後、サイクル４の後、及びサイクル６の後に骨髄試料を採取する。サイクル１の１日目、サイクル２の１日目及び１５日目、並びにその後のサイクルの１５日目に、薬力学試験用試料を採取する。前記最大耐用量では、サイクル１の１〜２日目及び１５〜１６日目に２日間に亘って薬力学試験用試料を採取する。

１． 目的
１．１． 主目的
主目的は、進行性の以前に治療されたＭＤＳ、ＣＭＭＬ又はＯ−ＡＭＬの治療に使用された場合の、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの安全性及び忍容性を決定することであり、ＩＧＦ−ＭＴＸのＭＴＤの決定も含む。
１．２．副次目的
２．２．１ 進行性の以前に治療されたＯ−ＡＭＬを有する患者、ＣＭＭＬ患者又はＭＤＳ患者における、全奏効率（ＯＲＲ；＝ＣＲ及びＰＲ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）、累積憎悪率（ＣＩＰ）、及び全生存率（ＯＳ）の評価により、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの臨床的利点を評価すること。
１．３． 相関性のある目的
１．３．１． ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ、７６５ＩＧＦ、メトトレキサート、及び７−ＯＨメトトレキサートの薬物動態（ＰＫ）の特徴付け
１．３．２． ＱＴ延長の可能性の評価
１．３．３． 可溶性ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１Ｒのレベルに対する７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの薬力学的（ＰＤ）効果の評価
１．３．４． ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸに対する抗体の形成の評価
１．３．５． 中和抗体の形成の評価
１．３．６． 異常細胞上のＩＧＦ−１Ｒの発現レベルの評価
２． エンドポイント
２．１． 主要エンドポイント
主要エンドポイントは７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの安全性及び忍容性である。これは、ＣＴＣＡＥｖ．４．０で定義される有害作用（ＡＥ）の評価により、評価される。
２．２． 副次エンドポイント
２．２．１． ＯＲＲ、ＰＦＳ、ＣＩＰ、ＯＳの評価による７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの臨床的利点の評価
２．２．２． 造血器腫瘍に対する以下の応答基準によって定義される、完全寛解（ＣＲ）、ＣＲｉ、ＰＲ（付録Ｉの表５及び表６、並びに付録ＩＩを参照）：
２．２．２．１． 急性白血病：２０１５ ＳＷＯＧ Ｍａｎｕａｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １１Ａ４４（付録Ｉ）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔの診断基準４５及び２００３ ＩＷＧの診断基準４６
２．２．２．２． ＭＤＳ：２００６ ＩＷＧの診断基準４７（付録ＩＩ）
２．３． 相関性のあるエンドポイント
３．３．１ ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ、７６５ＩＧＦ、メトトレキサート、及び７−ＯＨメトトレキサートの、点滴開始から最後の定量化可能な血漿中濃度の時点までのＡＵＣ、点滴開始から無限時間までのＡＵＣ、観察された最高の血漿中濃度、最高血漿中濃度の時点、遊離型ＭＴＸ及びＩＧＦ−ＭＴＸの両方の終末相の消失速度定数（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）によって定められる、薬物動態（ＰＫ）パラメーター。
３．３．２ ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸのＱＴ延長の可能性の評価
３．３．３ 血漿中ＩＧＦ−１濃度及び血漿中ＩＧＦ−１Ｒ濃度、並びに標準的治療の全身性ＰＤ変数（細胞数、差）によって定められる、薬力学的パラメーター（ＰＤ）
３．３．４ 血漿中７６５ＩＧＦレベル及び７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの毒性／反応
３．３．５ 血清中ＩＧＦ−１Ｒレベル及び血中ＩＧＦ−１Ｒレベル、並びに７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの毒性／反応
３．３．６ ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸに対する抗体の形成の評価
３．３．７ 中和抗体の形成の評価
３．３．８ ＩＨＣ、及びフローサイトメトリーで測定される、骨髄の患部組織におけるＩＧＦ−１Ｒの発現レベル、並びに、フローサイトメトリーで測定される、血液細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの発現レベル
３． 全体的な設計及び試験計画
この予備試験は、進行性の以前に治療されたＭＤＳを有する患者、ＣＭＭＬ患者及びＯ−ＡＭＬ患者における７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの安全性及び臨床的利点を評価するものである。７６５ＩＧＦ−ＭＴＸを、２８日間サイクルの１日目、８日目及び１５日目に、１．５時間かけて、ＩＶ点滴投与する。疾患増悪、容認できない毒性、又は患者による拒否が無い限り治療は継続する。反応の評価は、サイクル２の終了時、その後は８週間±７日間（２サイクル）毎にサイクル６の終了時まで、さらにその後は医師の判断で実施された、骨髄試験により確認する。
用量設定成分：最大で５つの用量レベルを試験する（ページ６の概要を参照）。最大耐用量（ＭＴＤ）を、０．３３で推定された用量制限毒性（ＤＬＴ）と、改変された毒性発現確率の区間に基づくデザイン（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｄｅｓｉｇｎ）を用いて、決定する。
改変には、初回量にサイズ１のコホートを用いること、が含まれ、これにより、該初回量レベルを通じて急速な増大が可能であり、また、試験薬に関連すると考えられるグレード２以上の毒性（脱毛、悪心、又は下痢は除く）が観察されたらサイズ３のコホートに拡大すること、が含まれる。追加の患者コホートは、１／１例（グレード２の毒性を示さない）、３／３例、５／６例、又は７／９例の患者が、現行の用量レベルで、ＤＬＴを発現しないで、計画されたサイクル１の治療の全て（７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの３回の投与と規定）を完了しない限りエンロールされず、２週間以内の遅延でサイクル２を開始することができる。試験責任医師の判断で、サイクル間の患者内用量漸増も許容されるが、１用量レベルで２サイクル後のみであり、患者内用量漸増を行われた患者が、より高い用量レベルで治療された唯一の患者になることはない。
用量漸増は、判明した改変された毒性発現確率の区間に基づくデザインに基づいて、試験統計家との協議の後、行われる。試験完了時に用量レベルがいずれも許容できない場合、最適用量レベルが特定されないということとなり、この薬剤のさらなる調査は保証されない。
薬物動態学（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）による最大耐用量（ＭＴＤ）コホート：ＭＴＤ：ＭＴＤは、治療された患者のうち３３％以下でＤＬＴを付随する最高用量と規定される。ＭＴＤを決定したら、合計９例の患者がそのＭＴＤに集められるまで、エンロールを継続する。この群では、サイクル１の１日目及び１５日目の薬剤投与の前及び投与後４８時間以内に、少なくとも３例の患者に対して、薬物動態試験を実施する。サイクル１の１日目、並びにサイクル２の１日目及び１５日目、７５６ＩＧＦ−ＭＴＸ点滴前に、薬力学試験用試料を評価し、各治療サイクルの第４週の中で１つの試料を採取する。
試験完了時に用量レベルがいずれも許容できない場合、最適用量レベルが特定されないということとなり、この薬剤のさらなる調査は保証されない。
患者の用量制限毒性（ＤＬＴ）は、サイクル１の間に以下の事象のうち１つが発生することと規定される：
治療の最初のサイクル（２８日間）の間の７日間を超えるグレード４以上の治療に関連した血液毒性
治療の最初のサイクル（２８日間）の間のグレード３以上の治療に関連した臨床的非血液毒性（最大限度の医療介入及び／又は予防が行われない場合の、グレード３以上の、悪心、嘔吐、又は下痢は除く）
治療の最初のサイクル（２８日間）の間の発熱性好中球減少
治療の最初のサイクル（２８日間）の間の、重大な出血による、血小板が１０×１０９／Ｌ未満となること
追加の患者コホートは、１／１例（グレード２の毒性を示さない）、３／３例、５／６例、又は７／９例の患者が、現行の用量レベルで、ＤＬＴを発現しないで、計画されたサイクル１の治療の全て（７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの３回の投与と規定）を完了しない限りエンロールされず、２週間以内の遅延でサイクル２を開始することができる。
ＭＴＤは、その用量レベルで治療された患者のうち、ＤＬＴを発現したのが３３％未満である用量レベルと規定される。
最低９例の患者を前記ＭＴＤで治療して安全性を確認しなければならず、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸをベースとした薬物動態試験を少なくとも計３例の患者に行う。
サイクル１の１日目（２４時間）及び１５日目（２４時間）の薬剤投与の前及び投与後２４時間以内に、薬物動態試験を実施する。サイクル１の１日目の投与前、サイクル２の１日目及び１５日目の投与前、並びにその後の全てのサイクルの１５日目の投与前の、薬力学試験用試料を評価する。
４． 患者の選択
試験のエントリーは性別や民族的背景を問わず１８歳以上の成人に開放することとする。女性や少数民族を求め含めるための最大限の努力を払うが、患者集団はメイヨークリニックで実施された他の試験の患者集団と何ら変わりがないと予想される。
４．１． 選択規準
５．１．１ 標準的治療に抵抗性又は不耐性であり、そのような治療（少なくとも１ラインの治療）に反応しそうにないという、Ｏ−ＡＭＬの診断；又は
標準的治療に抵抗性又は不耐性であり、そのような治療（少なくとも１ラインの治療）に反応しそうにないという、ＭＤＳ／ＣＭＭＬの診断
５．１．２ サイクル１開始前、試験エントリーの１４日間以内の骨髄生検及び骨髄穿刺液に対する組織学的診断が確認されていること
５．１．３ 血小板が１０×１０９／Ｌ超
５．１．４ 年齢が１８歳以上
５．１．５ ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０、１又は２（付録ＩＩＩ）
５．１．６ 全身化学療法歴、免疫療法歴、又は生物学的療法歴、放射線治療歴及び／又は外科手術歴は許容される。試験エントリーの１か月前までのメトトレキサート全身投与歴は許容される。治療前及び治療中のメトトレキサートのくも膜下腔内投与は試験責任医師の判断で許容される。
以前の治療から試験薬の初回投与までの時間：
以前の放射線照射、非細胞傷害性小分子薬剤、以前の大手術（患者の生命に対するリスクを含む外科手術と定義；具体的には、頭蓋、胸部、腹部、又は骨盤腔の臓器に対する手術）、以前のＦＤＡ認可全身治療から、少なくとも２週間経過
５．１．７ 患者は、試験ヘノエンロールより前の以前の抗がん治療の急性毒性作用（有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ．４．０でグレード１以下）からの回復を経験していなければならない；唯一の例外として、グレード２の神経障害は許容される
５．１．８ 試験登録の１４日間以内の適切な臓器機能は以下のように定められる：
５．１．９ 女性において尿又は血清妊娠検査が陰性であること
生殖能を有する男性及び女性の患者は、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの投与中、及び最後の投与から３か月間、適切であれば承認された避妊法（例えば、禁断、経口避妊薬、埋め込み型ホルモン避妊薬、又はダブルバリア法）を用いなければならない。
５．１．１０ 将来の医療を損なうことなくいつでも患者が同意を取り消すことができることを理解した上での、通常の医療の一部ではない試験に関連した手順を実施する前の、自発的な書面によるインフォームドコンセント。
６ 試験パラメーター
６．１ 治療手順の標準


６．２ 研究に関する手順
１ＭＴＤのＰＫ用患者でのみ実施。
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ点滴前（アム・ラブス（am labs）が７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ点滴の１時間以内の場合、アム・ラブス（am labs）の時点）、点滴が終了する５分前（＋／−５分）、及び以下の時点で注入：３０分（＋／−５分）、６０分（＋／−１５分）、２時間（＋／−１５分）、４時間（＋／−１５分）、６時間（＋／−１５分）、１０時間（＋／−２４時間１５分（＋／−２時間））。１０時間の時点は１日目には収集されるが、１５日目には収集さない。
２ＭＴＤのＰＫ用患者でのみ実施。７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ点滴前（＋／−５分）、及び点滴開始の３０分後（＋／−５分）、点滴完了後以下の時点：６０分（＋／−１５分）及び３時間（＋／−１５分）。全ての患者で、ＥＣＧはベースライン、１日目、サイクル１（点滴前）、及び最終投与の３０日後（±１週間）に実施される（セクション８．１を参照）。
３点滴前の採血
４骨髄生検及び骨髄穿刺液は、ベースライン及び２４週までの８週間（±１週）毎に、すなわち、サイクル２、サイクル４、及びサイクル６の後の、次のサイクルの最初の投与の前、に収集される。ある患者から、サイクル１の１日目より前の２８日間のベースライン期間に、フローサイトメトリー用に生存可能に凍結又は新鮮採取された骨髄穿刺液が得られない場合でも、その患者はエンロールしてよく、ベースライン試料のための新たな骨髄穿刺液は必要ない。
５ＥＤＴＡチューブへの全血採取
７ 相関試験
相関試験用の血液試料の採血に関する情報（使用する採血チューブ、採血体積、採血後処理、分注手順及び保存、並びに、特に、使用するアッセイ）は付録ＶＩＩに記載されている。
７．１ 薬物動態
７．１．１ 薬物動態試験用試料の採取
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの薬物動態を、サイクル１の１日目及び１５日目の投与後に調べる。上記の日の朝、７６５ＩＧＦ−メトトレキサートをセクション７．１．１に記載の通りに点滴する。研究チームは、点滴の開始時点及び終了時点、並びに点滴された７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ溶液の体積を記録する。全血（６ｍＬ）を、反対腕の挿入された翼状針から、又は患者が中心静脈カテーテルを有する場合は末梢部位から、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ点滴の直前、点滴終了の５分前、並びに、点滴完了から３０分後、６０分後、２時間後、４時間後、６時間後、１０時間後、及び２４時間後、に採取する（上記の研究に関する手順の表の脚注１の通りの時間帯）。１０時間の時点は、１日目に採取されるが１５日目には採取されない。ＩＧＦ−ＭＴＸ及びＩＧＦに結合していないＭＴＸの毒物動態学解析を行う。これらの時点はイヌにおける薬物動態に基づいている。ＰＫ用試料の採取手順については付録ＶＩＩを参照されたい。
７．１．２ 薬物動態試験用試料の処理
血液試料（６ｍＬ）は６ｍＬ ＥＤＴＡ入り（パープルトップ）チューブに採取する。抗凝固剤と完全に混ざるように、チューブを数回軽く反転させるべきである。試料採取の正確な回数を、チューブのラベルと、提供された薬物動態データフォームに記録すべきである。遠心分離まで、チューブは濡れた氷上に置くべきである。血液採取の１２０分間以内に、各血液試料を４℃で５〜１０分間、約３，０００×ｇで遠心分離する。それぞれ約０．５ｍＬの一定分量をピペット操作で４本の別々のプラスチック製遠心管に入れ、分析まで−８０℃で凍結する。ＰＫ用試料の採取手順については付録ＶＩＩを参照されたい。
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ、７６５ＩＧＦ、メトトレキサート及び７−ＯＨ−メトトレキサートの血漿中濃度は、イリノイ大学シカゴ校の毒性学研究所（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で、ＧＬＰ条件の下、有効な測定法を用いて測定する。
７．１．３ 薬物動態パラメーターの測定
７６５ＩＧＦ−メトトレキサート、７６５ＩＧＦ、メトトレキサート及び７−ＯＨ−メトトレキサートの薬物動態は、コンパートメントモデル及びノンコンパートメントモデルを用いたアプローチにより解析する。各目的化合物について、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ６．３（ファーサイト社（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）、セントルイス、ミズーリ州）を用いて、血漿中濃度−時間データのノンコンパートメント解析を行う。評価される薬物動態パラメーターには、１）点滴開始から最後の定量可能な血漿中濃度までの薬剤の血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、２）点滴開始から無限時間までのＡＵＣ（ＡＵＣ０−∞）、３）確認された最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、４）最大血漿中濃度の時間（最高血中濃度到達時間）、及び５）終末相の消失速度定数（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（λｚ）が含まれる。
目的化合物の血漿中濃度−時間データを、ＮＯＮＭＥＭ（バージョン７．３）に実装されている非線形混合効果モデリングを使用して、適切なモデルに個別かつ同時に適合する。データは、個人アプローチ及び集団アプローチでモデル化する。親及び代謝産物の性質を組み込んだ、１−コンパートメントモデル、２−コンパートメントモデル、及び３−コンパートメントモデルを評価する。最尤を推定するために、条件付一次近似法、モンテカルロ期待値最大化法、及びモンテカルロベイジアン法を検討する。
抗７６５ＩＧＦ抗体が一部又は全ての患者で検出された場合、これらの抗体の存在が薬物動態パラメーターに与える影響を調べる。これは、例えば、抗治療薬抗体が存在し得ない初回投与時の薬物動態パラメーターと、抗７６５ＩＧＦ抗体の発生が示された後の投与時のパラメーターとを比較することにより、また、抗７６５ＩＧＦ抗体を有する患者のパラメーターと、それを有さない患者のパラメーターを比較することにより、実施される。
７．１．４ 薬物動態の統計解析
７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ、７６５ＩＧＦ、メトトレキサート、及び７−ＯＨ−メトトレキサートの各パラメーターは、記述統計（幾何平均、中央値、標準偏差及び変動係数）によって表される。各化合物で調べられる主要な薬物動態パラメーターは、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−∞、Ｃｍａｘ及びλｚである。記述統計は人口統計的データに対し計算を行う。グラフと相関性を用い、値の分布と２変量の関連性を調べる。
７．２ 薬力学的評価
サイクル１の１日目、サイクル２の１日目及び１５日目、並びにその後の各サイクルの１５日目に薬力学試験用試料を評価する。
全身性反応は、全ての被験者で測定され、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸがこれらの生物学的マーカーの産生に影響を与えるか否かの評価に用いられる、ＩＧＦ−１の血漿中濃度、並びにＩＧＦ−１Ｒの血中濃度及び血清中濃度と定義される。毒性（例えば、ＷＢＣ数、細胞集団差異、血小板などの変化）の測定も全身性ＰＤ変数と見なされる。
最尤推定法を用いて、薬力学的データを適切なモデルに適合する。治療薬の全身作用とバイオマーカーとの間に関連性が存在するか否かを判定するため、個々のベースライン補正最大バイオマーカー濃度を、個々の７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ薬物動態値に対してプロットし、ピアソン相関係数を算出する。
７．３ ７６５ＩＧＦ−ＭＴＸのＱＴ延長の可能性の評価
ＱＴ評価を、ＰＫ用被験者で、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ点滴直前、点滴開始から３０分後、並びに点滴完了から６０分後及び３時間後のＥＣＧによって、ＰＫ採取時のみ実施する。全ての被験者で、ベースライン（エンロールの１４日間以内）、サイクル１の１日目（点滴前）及び７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの最終投与の３０日間（±１週間）後のＥＣＧにより、ＱＴ評価を実施する。
７．４ 血漿中ＩＧＦレベル及び７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの毒性／反応
治療前及び治療中の血漿中可溶性ＩＧＦ−１レベルが７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの毒性及び／又は反応と関連しているかどうかを確認するために、サイクル１の１日目の点滴前、並びにサイクル２の１日目及び１５日目の点滴前の血液試料を各患者から採取する。血漿中ＩＧＦ−１の定量化は、クエスト・ダイアグノスティクス社、テストコード１６２９３により、ＬＣ／ＭＳで実施する。臨床反応とマーカーレベルとの間の記述的解析を実施する。バイオマーカーの採取手順については付録ＶＩＩを参照されたい。
７．５ 血清中ＩＧＦ−１Ｒレベル及び血中ＩＧＦ−１Ｒレベル、並びに７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの毒性／反応
治療前及び治療中の血清中ＩＧＦ−１Ｒレベル及び血中ＩＧＦ−１Ｒレベルが７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの毒性及び／又は反応と関連しているかどうかを確認するために、サイクル１の１日目の点滴前、並びにサイクル２の１日目及び１５日目の点滴前の血清試料及び血液試料を各患者から採取する。血漿中ＩＧＦ−１Ｒの定量化は、ＩＧＦオンコロジー社（ＩＧＦ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）により、ウェスタンブロッティングを用いて実施される。臨床反応とマーカーレベルとの間の記述的解析を実施する。バイオマーカーの採取手順については付録ＶＩＩを参照されたい。
７．６ 抗７６５ＩＧ−ＭＴＸ抗体の形成
サイクル１の１日目の点滴前、並びにサイクル２の１日目及び１５日目の点滴前に各患者から血清試料を採取し、治験依頼者が前臨床試験のイヌ及びラットにおいて抗７６５ＩＧ−ＭＴＸ抗体の検出に用いたアッセイにより、抗治療薬抗体について分析する。このアッセイとはサンドイッチＥＬＩＳＡであり、この方法は９６ウェルプレートに血清を播き、プレートの各ウェルに治療薬を添加して該血清中に存在し得る抗治療薬抗体と結合させ、その後、結合型の７６５ＩＧＦ−ＭＴＸ治療薬をＲ＆Ｄシステムズ社製のヒトＩＧＦ−１ ＥＬＩＳＡキット、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅの抗ＩＧＦ−ＨＲＰ結合体抗体により検出することを含む。
上述のサンドイッチ型アッセイにより７６５ＩＧＦ−ＭＴＸに対する抗体が検出される。７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの代わりに７６５ＩＧＦタンパク質をプレートに添加して、同じアッセイを実施する。これにより７６５ＩＧＦタンパク質に対する抗体が検出される。
前記血清試料は、中和抗体の存在についても分析を行う。このアッセイでは、インビトロのヒトＭＣＦ７乳がん細胞の死滅アッセイで血清を７６５ＩＧＦ−ＭＴＸと混合することで、ＭＣＦ７細胞の増殖阻害において患者血清の添加が７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの最小発育阻止濃度に影響を与えるか否かを確認する。このアッセイは、サイクル２の１日目及び１５日目の治療前、並びにサイクル４及びサイクル６の１５日目の治療前に採取された同じ血清試料に対して実施する。バイオマーカーの採取手順については付録ＶＩＩを参照されたい。
リスク評価
抗７６５ＩＧＦ抗体についてアッセイを行うことから生じる患者へのリスクは、最小限であり、サイクル１の１日目の点滴前、並びにサイクル２の１日目及び１５日目の点滴前の、追加の採血のみから生じる。少量の血液（７．５ｍＬ／採血）を取っても、患者の健康には何の影響もない。抗７６５ＩＧＦ抗体を発現している可能性から生じる患者へのリスクも、小さいものであり、患者がこれらの抗体を発現しているか否かを知ることにより和らげられるであろう。第一に、いずれのイヌもいずれのラットも前臨床検査で抗治療薬抗体を発現していなかったことから、患者が抗７６５ＩＧＦ抗体を発現することはありそうにない。前記抗体を発現することから生じる患者へのリスクは、もしそれが起こった場合、前記抗体が、本治療薬の有効性を低減する可能性があると予想されることと、本治療薬の投与に対するアナフィラキシー反応のリスクを高めることであろう。アナフィラキシー反応は、リツキシマブなど、いくつかの生物学的医薬を用いた場合に生じ、通常はジフェンヒドラミンなどの抗ヒスタミン剤により対処できる。７６５ＩＧＦに対する抗体の形成は、高血糖症の発症可能性などの、ＩＧＦＲ１受容体に対する抗体と同様の副作用も引き起こし得る。本試験では、血糖レベルのモニタリングは定期的に実施される。
７．７ 中和抗体及び７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの毒性／反応
サイクル１の１日目の点滴前、サイクル２の１日目及び１５日目の点滴前、並びにサイクル４及びサイクル６の１５日目の点滴前に採取された血清試料を、中和抗体の存在について分析する。このアッセイでは、インビトロのヒトＭＣＦ７乳がん細胞の死滅アッセイで血清を７６５ＩＧＦ−ＭＴＸと混合することで、ＭＣＦ７細胞の増殖阻害において患者血清の添加が７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの最小発育阻止濃度に影響を与えるか否かを確認する。バイオマーカーの採取手順については付録ＶＩＩを参照されたい。中和抗体の存在又はレベルを、７６５ＩＧＦ−ＭＴＸに対する臨床反応及び７６５ＩＧＦ−ＭＴＸの毒性と関連付ける記述的解析を実施する。
７．８ ＩＨＣ及びフローサイトメトリーによる、骨髄穿刺液の異常細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ発現レベル
骨髄穿刺液を患者から採取した際、一部は凝固、固定、パラフィン包埋し、第２の一部は室温に保ち、同日に一晩輸送する。固定試料については病理報告を作成する。全ての試料は、メイヨ―クリニックに留め、試験終了時に、病理報告と共に、ＩＨＣによるＩＧＦ−１Ｒ発現レベル検査（テストコードは１９４２９Ｘ）のために、クエスト・ダイアグノスティクス社に一斉に輸送する。
新鮮生細胞（ｖｉａｂｌｅ）骨髄穿刺液を、フローサイトメトリーによるＩＧＦ−１Ｒ及びＣＤ３４の発現検査のために、その日のうちに一晩かけてチャールスリバー社に輸送する。このアッセイはHe et al.28のアッセイと同様である。
７．９ フローサイトメトリーによる全血の異常細胞のＩＧＦ−１Ｒ発現レベル
全血をＥＤＴＡ付チューブに採血し（６ｍＬ）、フローサイトメトリーによるＩＧＦ−１Ｒ及びＣＤ３４の発現検査のために、室温の断熱容器内で、その日のうちに一晩かけてチャールスリバー社に輸送する。このアッセイはＨｅ ｅｔ ａｌ．２８のアッセイと同様である。この採取及び検査は、ベースライン時と、治療開始後の８週間毎である。
結果：
現在までに、２例の被験者がエンロールされ、共にＯ−ＡＭＬと診断された。被験者１０１は以前にＭＤＳに罹患しＯ−ＡＭＬへと移行させたことがある。
治療前のベースライン時、及び８週間後の２サイクルの治療（６回の投与）後の、骨髄穿刺液中の芽球数及び全血球数における両被験者の差異を、表３に示す。共に用量レベル１（０．２μＥｑ／ｋｇ）を投与された。共に８０歳以上（８０歳及び８３歳）の男性であった。

骨髄内芽細胞割合は、ＭＤＳと、その関連疾患であるＯ−ＡＭＬ、及びＣＭＭＬの評価に用いられる重要なパラメーターである。骨髄内芽細胞割合は、被験者１０１では大幅に改善され、被験者１０２では安定している。次の重要な測定値は白血球であるが、これは両被験者で大幅に改善している。次の重要なパラメーターは好中球と血小板である。好中球は両方の被験者で大幅に改善しているが、血小板は被験者１０１では改善し、被験者１０２では悪化している。測定されたいずれの血液パラメーターも、被験者１０２の血小板を除いて、両方の被験者で向上したか安定であった。
８週間後の両被験者の臨床評価は安定病態であった。臨床試験の試験責任医師によるこれら被験者の両方の治療開始時の推定余命が僅か３か月であったことから、ほぼ全てのパラメーターの改善を伴う８週間の安定病態は有効性のエビデンスとなる。
配列
SEQ ID NO:1 MVKGKHHHHHHNGKGKSK

SEQ ID NO:2 (765IGF)
MVKGKHHHHH HNGKGKSKGP RTLCGAELVD ALQFVCGDRG FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG
IVDECCFRSC DLRRLEMYCA PLKPAKSA

SEQ ID NO:3 (human IGF-1)
GPETLCGAEL VDALQFVCGD RGFYFNKPTG YGSSSRRAPQ TGIVDECCFR SCDLRRLEMY
CAPLKPAKSA

SEQ ID NO:4 (IGF132)
FVNQHLCGSHLVEALYL VCGDRG FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG IVDECCFRSCDLRR LEMYCAPLKPAKSA

SEQ ID NO:5 (long-R3-IGF)
MFPAMPLSSLFVN GPRTL CGALVDALQ FVCGDRGFYF NKPTGYGSSS RRAPQTGIVD ECCFRSCDLR RLEMYCAPLK PAKSEA

SEQ ID NO:6 (R3-IGF)
GPRTLCGAELVD ALQFVCGDRG FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG
IVDECCFRSC DLRRLEMYCA PLKPAKSA

SEQ ID NO:7 des(1-3)IGF1
TLCGAELVD ALQFVCGDRG FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG
IVDECCFRSC DLRRLEMYCA PLKPAKSA

SEQ ID NO:8, 403IGF
MTSGHHHHHHSAGVNG FVNQHLCGSHL VEALYLVCGD RGFYFNKPTG YGSSSRRAPQ TGIVDECCFR SCDLRRLEMY CAPLKPAKSA

SEQ ID NO:9, 784IGF
MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGHCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLE
VDVDDSQDVASESEVKSMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVGSKSGHHHHHH
SAKGGPRTLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRR
LEMYCAPLKPAKSA

SEQ ID NO:10, 785IGF
MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGHCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLE
VDVDDSQDVASESEVKSMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVGSKSGHHHHHH
SAKGFVNQHLCGSHLVEALYLVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLR
RLEMYCAPLKPAKSA

SEQ ID NO:11, 764IGF
MVKGKHHHHHHNGKGKSKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRR
APQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
引用された特許、特許文献、および他の参照文献は、全て本明細書に援用される。

Claims (35)

  1. 骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）、又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の患者を治療する方法であって、
    ＭＳＤＳ、Ｏ−ＡＭＬ、又はＣＭＭＬの治療の必要性が認められる患者に、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−抗がん化学療法薬結合体を含む薬剤を投与すること、
    を含む、方法。
  2. 前記患者がＭＤＳの治療の必要性が認められる患者である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドが前記抗がん化学療法薬と共有結合している、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドが、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）若しくはそのバリアント又はインスリンである、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドが、ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合親和性がＩＧＦ−１と比較して減少しているＩＧＦ−１のバリアントである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドが、ＩＧＦ−１（配列番号３）ではなく、且つ、７６５ＩＧＦ（配列番号２）、ＩＧＦ１３２（配列番号４）、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号５）、Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）、若しくはｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ（配列番号７）であるか、７６５ＩＧＦ（配列番号２）、ＩＧＦ１３２（配列番号４）、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号５）、Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）、若しくはｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ（配列番号７）を含むか、又はＩＧＦ−１（配列番号３）と少なくとも９０％の同一性を有するバリアントである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドが抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記抗がん化学療法薬がメトトレキサート、ベンダムスチン、及びクロラムブシルからなる群から選択される、請求項４又は請求項１又は請求項６に記載の方法。
  9. 前記抗がん化学療法薬がメトトレキサートである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記抗がん化学療法薬がメトトレキサートであり、前記薬剤が、体積１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％ブドウ糖に溶解されて、患者の体重１ｋｇあたり０．１〜２．５（又は０．２〜２．５、又は０．４〜２．５、又は０．４〜１．６）μＥｑの用量で投与される、請求項４又は請求項６に記載の方法。
  11. 前記薬剤が７６５ＩＧＦ−ＭＴＸである、請求項１又は請求項１０に記載の方法。
  12. 前記体積が１００ｍＬ〜５００ｍＬ、１５０ｍＬ〜５００ｍＬ、２００ｍＬ〜５００ｍＬ、又は約２５０ｍＬである、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
  13. 前記患者に前記薬剤を０．２〜２．５μＥｑ／ｋｇの用量で投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記患者に、前記薬剤を、０．２〜２．５μＥｑ／ｋｇの用量で、週１回又は週２回（例えば、週１回を３週間、その後１週間休薬）、投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｏ−ＡＭＬ、ＣＭＭＬ、又はＭＤＳの患者を治療する方法であって、
    ＡＭＬ、ＣＭＬ、Ｏ−ＡＭＬ、ＣＭＭＬ、又はＭＤＳの治療の必要性が認められる患者に、
    （ａ）メチル化阻害剤（例えば、アザシチジン又はデシタビン）、及び
    （ｂ）インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−メトトレキサート結合体を含む薬剤、
    を投与することを含み、
    前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンである、
    方法。
  16. 前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドが、ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合親和性がＩＧＦ−１と比較して減少しているＩＧＦ−１のバリアントである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドが、ＩＧＦ−１（配列番号３）ではなく、且つ、７６５ＩＧＦ（配列番号２）、ＩＧＦ１３２（配列番号４）、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号５）、Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）、若しくはｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ（配列番号７）であるか、７６５ＩＧＦ（配列番号２）、ＩＧＦ１３２（配列番号４）、長鎖型Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号５）、Ｒ３−ＩＧＦ（配列番号６）、若しくはｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ（配列番号７）を含むか、又はＩＧＦ−１（配列番号３）と少なくとも９０％の同一性を有するバリアントである、請求項１５に記載の方法。
  18. ＭＤＳ、Ｏ−ＡＭＬ、又はＣＭＭＬの患者を治療する方法であり、前記患者がＭＤＳ、Ｏ−ＡＭＬ、又はＣＭＭＬの治療の必要性が認められる患者である、請求項１５に記載の方法。
  19. 前記メチル化阻害剤がアザシチジンである、請求項１５又は請求項１８に記載の方法。
  20. 前記薬剤が７６５ＩＧＦ−ＭＴＸである、請求項１５、請求項１８、又は請求項１９に記載の方法。
  21. アザシチジンで患者を処置することを含み、前記薬剤が７６５ＩＧＦ−ＭＴＸである、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記７６５ＩＧＦ−ＭＴＸが、体積１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％ブドウ糖に溶解されて、患者の体重１ｋｇあたり０．１〜２．５μＥｑの用量で投与される、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記体積が１００ｍＬ〜５００ｍＬ、１５０ｍＬ〜５００ｍＬ、２００ｍＬ〜５００ｍＬ、又は約２５０ｍＬである、請求項２２に記載の方法。
  24. 点滴用の溶液である医薬組成物であって、
    前記医薬組成物は、（ａ）メトトレキサート-ＩＧＦ−１Ｒリガンド共有結合体からなる薬剤を含み、前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンであり、
    前記医薬組成物は、（ｂ）１００ｍＬ〜１Ｌの５％〜１０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖水溶液中に溶解された溶液であり、
    前記溶液は５ｍＭ以上のＮａＣｌ又は２ｍＭ以上のリン酸塩を含まず、
    前記溶液は輸液バッグに入っており、１００ｍＬ〜１Ｌの体積を有する、
    医薬組成物。
  25. 溶液が、１００ｍＬ〜５００ｍＬ、１５０ｍＬ〜５００ｍＬ、２００ｍＬ〜５００ｍＬ、又は約２５０ｍＬの体積を有する、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 前記薬剤が７６５ＩＧＦ−ＭＴＸである、請求項２４に記載の医薬組成物。
  27. ＩＧＦ−１Ｒリガンドがインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）若しくはそのバリアント又はインスリンである、ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤を投与する方法であって、
    前記薬剤を、体積１００ｍＬ〜１Ｌの実質的に５％〜１０％ブドウ糖（ｗ／ｖ）水溶液からなる希釈液中に希釈することで、前記希釈液中の前記薬剤の溶液を作製すること、及び
    前記溶液を患者に注入すること、
    を含む、方法。
  28. 前記溶液を患者に注入する工程が、２０分間〜２．５時間、又は３０分間〜２時間、又は４５分間〜１．５時間、又は１〜２時間の時間をかけて行われる、請求項２７に記載の方法。
  29. インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）リガンド−抗がん化学療法薬結合体を含む薬剤、を含む組成物であって、
    乏芽球性急性骨髄性白血病（Ｏ−ＡＭＬ）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を治療する方法で使用される、
    組成物。
  30. （ａ）最大１００ｍＬ〜２Ｌの体積を保持できる輸液バッグに入った、
    （ｂ）５％又は１０％（ｗ／ｖ）ブドウ糖溶液、及び前記溶液に溶解された（ｃ）ＩＧＦ−１Ｒリガンド−メトトレキサート共有結合体からなる薬剤と、
    を含むデバイスであって、
    前記ＩＧＦ−１Ｒリガンドはインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）又はそのバリアント又はインスリンであり、
    前記溶液は１００ｍＬ〜１Ｌ（より好ましくは１００ｍＬ〜５００ｍＬ、１５０ｍＬ〜５００ｍＬ、又は約２５０ｍＬ）の体積を有する、
    デバイス。
  31. （ｄ）前記輸液バッグに接続されたチューブ管、及び
    （ｅ）前記チューブ管に接続された皮下用注射針、
    をさらに含む、請求項３０に記載のデバイス。
  32. 前記薬剤が７６５ＩＧＦ−ＭＴＸである、請求項３０に記載のデバイス。
  33. 前記溶液が１０μＥｑ以上２５０μＥｑ以下の前記薬剤を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のデバイス。
  34. 前記溶液が、５ｍＭ以下のＮａＣｌ（好ましくは１ｍＭ以下のＮａＣｌ）及び２ｍＭ以下のリン酸塩（好ましくは１ｍＭ以下のリン酸塩）を含む、請求項３０又は請求項３２に記載のデバイス。
  35. 前記溶液が５ｍＭ以下のＮａＣｌを含む（好ましくは１ｍＭ以下のＮａＣｌを含み、より好ましくはＮａＣｌを含まない）、請求項３０又は請求項３２に記載のデバイス。
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