CN114874298A

CN114874298A - 一种金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因及其应用

Info

Publication number: CN114874298A
Application number: CN202210466588.4A
Authority: CN
Inventors: 刘建雨; 尚晓冬; 李婧霆; 宋春艳; 王瑞娟; 陆欢; 李巧珍; 于海龙; 李玉; 周峰; 张丹; 杨慧
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2042-04-29
Also published as: CN114874298B

Abstract

本发明公开了一种金针菇蓝光受体蛋白FfCry‑DASH及其编码基因，以及金针菇蓝光受体蛋白FfCry‑DASH基因用于调控金针菇生长的应用。本发明的FfCry‑DASH基因是一种蓝光受体蛋白基因，其在金针菇中超量表达，可以显著抑制金针菇细胞伸长，因此其可在生产上调控金针菇菌柄伸长保持整齐度中应用。

Description

一种金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因及其应用

技术领域

本发明属于食用菌分子生物技术和基因工程领域，具体的说涉及一种金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因及其应用。

背景技术

金针菇(Flammulina filiformis)是最早实现工厂化生产的食用菌品种，也是历年来日产和年产量最大的工厂化品种。金针菇子实体分化需要光照刺激而菌柄伸长需要光照抑制。早在1990年我国就有利用光照调控金针菇出菇的报道，后经大量实践证明起重要作用的光质是蓝光。实践经验表明，蓝光对金针菇子实体发育及形态建成作用显著，主要表现在：黑暗条件下，在栽培瓶口长出的金针菇菌柄高矮参差不齐。若在一定发育阶段(一般在搔菌后9-25天)给予蓝光照射，生长较快处于上层的菇接收到蓝光则生长受到抑制，菌柄变短，而生长较慢处于下层的菇被遮蔽蓝光而正常生长，这样使得整把金针菇整齐度变好，产量提高。因此，生产上通过蓝光调控金针菇菌柄长度是确保金针菇商品性状的一个重要手段，是普遍采用的一项关键技术。了解蓝光调控金针菇菌柄伸长的机理就成为生产上实行蓝光精准调控技术的核心问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH，其氨基酸序列如SEQNO.2；

本发明还提供了编码上述金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH的基因，其核苷酸序列如SEQNO.1所示；

本发明还提供了含有上述金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因的表达载体。

采用Real-time PCR检测发现，随着蓝光照射时间的延长，FfCry-DASH基因表达量逐渐升高，关闭蓝光后，其表达量又逐步恢复到原来的水平，表明蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因的表达量受蓝光的调控。

利用双酶切方法把FfCry-DASH基因重组到pCAMBIA1300载体上，过表达FfCry-DASH基因的菌株菌丝生长速度减缓，菌丝尖端分支增多，分支弯曲，菌丝尖端细胞隔膜间距变短，细胞伸长受阻。

因此，本发明还提供了金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH的基因用于调控金针菇生长的应用。

本发明利用以小米粒为培养基质的农杆菌介导法获得了FfCry-DASH基因过表达的金针菇菌株，过表达转化子在蓝光照射条件下，菌丝的显微形态与对照差异明显。

本发明的金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因在生产上调控菌丝伸长方面可以发挥重要作用。具体的讲：黑暗条件下，在栽培瓶口长出的金针菇菌柄高矮参差不齐。若在一定发育阶段(一般在搔菌后9-25天)给予蓝光照射，生长较快处于上层的菇接收到蓝光则生长受到抑制，菌柄变短，而生长较慢处于下层的菇被遮蔽蓝光而正常生长，这样使得整把金针菇整齐度变好，产量提高。而作为接受蓝光信号的蓝光受体基因FfCry-DASH在本发明中被证明在蓝光照射后可抑制细胞伸长，在调控菌丝伸长(菌柄伸长)中起重要作用。另外，本发明提供的金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因还可以用于金针菇育种的遗传改良。

附图说明

图1金针菇FfCry-DASH基因受蓝光调控的表达量变化图

其中BL代表蓝光处理，DK代表黑暗处理；

图2过表达FfCry-DASH基因的金针菇菌丝尖端伸长受阻

(显微镜20×10倍镜头下观察)

图3过表达FfCry-DASH基因的金针菇细胞伸长受阻

(细胞壁染色后油镜下观察)

CK-黑暗表示对照菌丝在黑暗条件下培养，

CK-蓝光表示对照菌丝在蓝光条件下培养，

T10蓝光表示转化子菌丝在蓝光条件下培养。

图4转化子中FfCry-DASH基因的表达情况

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实施例中的核苷酸序列合成与测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例1：金针菇FfCry-DASH基因的分离与克隆

1，金针菇FfCry-DASH基因引物合成：利用金针菇基因组数据库中FfCry-DASH的序列信息，设计克隆FfCry-DASH基因的全长引物：

正向引物Ff-F:CGCGGATCCATGTACCTCATTTACATCCTC(SEQNO.3)；

反向引物Ff-R：CCGGAATTCCTACTTTCGACGTCTATCGTA(SEQNO.4)；

其中下划线的序列分别表示酶切位点BamH I和EcoR I。

2，金针菇菌丝总RNA提取及第一条cDNA链合成：利用植物RNA提取试剂盒(TakaraCodo no.9769)，根据试剂盒说明书提取金针菇菌丝总RNA。将质量检测合格的RNA用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara Codo no.RR047)试剂盒进行cDNA第一条链的合成，-20℃保存备用。

3，FfCry-DASH基因的扩增与检测：以金针菇菌丝cDNA为模板，利用SEQNO.3和SEQNO.4的FfCry-DASH基因的引物，采用

HS DNA Polymerase(Takara高保真酶，PCR扩增方法根据试剂盒说明书)扩增基因序列。电泳检测到目的条带后，回收PCR产物并连接至克隆载体(

-Blunt Cloning Vector,北京全式金生物技术股份有限公司)。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically CompetentCell，北京全式金生物技术股份有限公司)，检测到阳性菌落后进一步测序验证。

4,结果分析：测序结果显示，FfCry-DASH基因的cDNA序列如SEQNO.1所示，序列长度为1599bp；编码的氨基酸序列如SEQNO.2所示，序列长度为532aa。

实施例2：金针菇FfCry-DASH基因的表达分析

采用Real-time PCR的方法分别检测金针菇菌丝在不同强度蓝光下的FfCry-DASH基因的表达，具体步骤如下：

1，采集样品：研究所用的金针菇单核体菌株Dan3为来自于上海市农业科学院食用菌研究所。本试验光源采用人工培养气候箱内置蓝色LED灯，蓝光强度为5000lx。

将4℃保存的金针菇单核体菌株Dan3试管种置于22℃恒温培养箱复苏培养24h，切弃Dan3试管母种前端组织块(约50mm)，取一块0.5cm²菌种块接种至PDA平板培养基(PDA粉末购自美国BD公司，3.9克PDA粉末加100ml水配制成PDA培养基)中央，封口膜封口，22℃培养。培养7天后将培养箱中蓝光打开，每隔1h取样，直至10h后关闭蓝光，黑暗下再每隔1h取样。每种样品取3个重复，经液氮速冻后放置于-80℃超低温冰箱备用。

2，RNA的提取及反转录：对采集后的样品进行总RNA提取及第一条cDNA链合成，具体方法见实施例1。

3.Real-time PCR：荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，在ABIQuantStudio 6Flex system荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)上进行反应。Real-time PCR反应条件为：95℃预变性20s；95℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸15s，40个循环；72℃终延伸10min。Real-time PCR反应体系见如下表1，每组样品设置3个平行样品孔，将Ct值根据公式2^-△△Ct计算相对表达量，实验数据采用IBM SPSS Statistics 19.0进行单因素方差分析。其中正向引物和反向引物分别为实施例1中SEQNO.3和SEQNO.4的两条引物。

表1 Real-time PCR反应体系

4.结果分析：从图1可以看出：蓝光照射0-10h的实验时间内FfCry-DASH基因的相对表达量随蓝光照射时间延长而表达量上升，而在关闭蓝光后的黑暗条件下的相对表达量逐渐恢复，说明金针菇Ffcry-DASH基因受蓝光调控。

实施例3：金针菇FfCry-DASH基因的功能验证

1，载体构建

利用双酶切技术将FfCry-DASH基因重组到pCAMBIA1300载体(长沙赢润生物技术有限公司)上。

提取实施例1中测序正确的菌液质粒，利用BamH I和EcoR I限制性内切酶(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)分别酶切FfCry-DASH质粒和pCAMBIA1300载体，酶切片段通过T4连接酶(T4 DNA Ligase，北京全式金生物技术股份有限公司)连接，形成目的载体pCAMBIA1300-FfCry。

2，农杆菌侵染液制备

(1)目的载体pCAMBIA1300-FfCry在转化大肠杆菌感受态细胞中扩繁后，转至EHA105农杆菌(上海唯地生物技术有限公司)中。携带有目的载体的农杆菌接种于1mL LB(含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素)中，28℃，200r/min培养至OD600＝0.5-0.6。

LB培养基的配方:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。

(2)取200-500ul上述农杆菌菌液，接种于新的5ml LB(含50mg/L利福平，100mg/L卡那霉素)中，28℃，200r/min培养至OD600＝0.5-0.6；

(3)取步骤2中菌液2-3ml，3000rpm，离心1min，弃上清，将沉淀重悬于5mL添加了AS的诱导培养基中，28℃，200r/min培养至OD600＝0.5～0.6。制备好的农杆菌侵染液要立即用于转化。

其中诱导培养基的配方为：K-buffer 1ml；M-N solution 2ml；1％CaCl₂ 0.1ml；0.01％FeSO₄ 1ml；20％NH₄NO₃ 0.25ml；Spore elements 0.5ml；50％甘油1ml；1mol/LpH5.3MES(吗啉乙磺酸)4ml；2mol/L葡萄糖0.5ml；无菌ddH₂O定容至100ml。

K-buffer的组成为：K₂HPO₄ 20g，KH₂PO₄ 14.5g，用KOH调pH值至7.0，无菌ddH₂O定容至100ml。

M-N solution的组成为：MgSO₄.7H₂O 3g，NaCl 1.5g，无菌ddH₂O定容至100ml。

Spore elements的组成为：ZnSO₄.7H₂O 500mg/L，CuSO₄.5H₂O 500mg/L，H₃BO₃500mg/L，MnSO₄.H₂O 500mg/L，NaMoO₄.2H₂O 500mg/L，五种溶液等体积混匀，过滤除菌，4℃保存。

添加了AS的诱导培养基，是在诱导培养基中添加乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，AS的添加浓度为200μmol/L，现用现加，AS不能反复冻融，AS购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。

3，金针菇菌丝受体制备

3.1小米粒培养基的制备

(1)将小米(普通市售)清洗干净，用蒸馏水浸泡20分钟至小米微软，散开到干净的纱布上，吸干水分；

(2)称量30g，装入250ml的三角瓶中，高温高压灭菌(120℃，60分钟)。

3.2金针菇菌丝接种

(1)将在PDA培养基上培养7天的金针菇菌丝，带培养基(50mm×50mm)一起挑入均质仪中，加入100mlPDB培养基(PDB粉末购自美国BD公司，2.4g PDB粉末加100ml水配制成PDB培养基)，间歇打碎30s。

(2)将上述液体菌丝取8-12ml接入小米粒培养基中，25℃培养7-10天，期间每天摇三次(早午晚各一次每次10s)，培养至米粒表面长出金针菇菌丝，得到小米粒-金针菇菌丝复合体。

4，农杆菌侵染小米粒-金针菇菌丝基质

(1)取培养好的小米1g左右加入玻璃小试管(共10管)，加入诱导培养基1-1.5ml，用上海科导超声仪器有限公司的双频超声波清洗器超声1min(频率40KHz、功率160W)，静置10min，吸掉上清液；

(2)加入制备好的农杆菌浸染液1.5ml，用上海科导超声仪器有限公司的双频超声波清洗器超声10s(频率40KHz、功率160W)，静置侵染20min，吸掉多余菌液，25℃静置培养48-72小时，期间每天摇匀2次；

(3)将小米粒单粒转入PDA初筛培养基(PDA培养基中添加潮霉素Hyg 8mg/L，头孢噻肟钠cef 400mg/L)(潮霉素和头孢噻肟钠：生工生物工程(上海)股份有限公司)，每个平板接25粒，25℃培养10天；

(4)把小米粒周围长出的菌丝接种至PDA复筛培养基(PDA培养基中添加Hyg12mg/L，cef 400mg/L)(含Hyg 12mg/L，cef 400mg/L)上，平板中间设置未侵染的菌丝块作为对照，25℃培养；

(5)复筛培养基上能够长出菌丝的拟转化子接到PDB培养基中，23℃-25℃下避光摇瓶培养，3d-4d后收集菌丝；用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；对上述提取的DNA进行标记基因潮霉素Hyg的PCR扩增；

PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L Hyg正向引物和反向引物总体积各1μL，浓度20ng-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH₂O 11.4μL；

PCR反应条件：94℃5min；94℃30second，56℃40second，72℃30second，30个循环；72℃8min。所用潮霉素引物为：Hyg-F：GATGTTGGCGACCTCGTATT；Hyg-R：TCGTTATGTTTATCGGCACTTT；

PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证；

测序结果正确的转化子视为阳性转化子，命名为T1、T2、T3……。

将阳性转化子分别转接至新的PDA平板上，距离接种块1cm处斜插入盖玻片，平板置于蓝光培养箱中，25℃培养，待菌丝爬到盖玻片上后，在无菌条件下取出盖玻片在显微镜(20×10)下观察菌丝尖端生长情况(图2中显示转化子T10的情况)，在荧光显微镜下观察细胞壁染色情况，根据细胞壁间距推算细胞长度(图3中显示转化子T10的情况)。

收取蓝光照射后的阳性转化子菌丝样品，对采集后的样品进行总RNA提取及第一条cDNA链合成，具体方法见实施例1。Real-time PCR方法分析转化子中FfCry-DASH基因的表达情况(结果见图4)，具体方法见实施例2.

5，结果分析：

FfCry-DASH基因过表达的转化子中菌丝尖端分支增多，新生分支弯曲(图2)，细胞伸长受阻(图3)。说明FfCry-DASH基因在调控细胞伸长，控制菌丝尖端分支等方面起作用。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1599

<212> DNA

<213> 金针菇(Flammulina filiformis)

<400> 1

atgtacctca tttacatcct cagacatgac ctgcgcctag cagacaatcc aatctttcac 60

gccctctcgt cgcgctcagc gaacttcacg cacctcatcc ccgtctacgt tctcacgcca 120

caccaaattg aagtatccgg cctctcacaa tccaacatct cgccctatcc agaagctcgc 180

tcgagggtag ggaagttctg gcgatgcggt cctcatcgcg tcaagtttct ttctgaggcg 240

atttatgacc tcaaggatac tttacgggga ttaggaagcg acttgcttgt gcgcgttggg 300

ccactggaca cagtcgtcga tggtttactc aattcggagg cgttgaaagg aaaacgcggg 360

gctgtctgga tgtcgcgcga ctgggcgact gaagagatta ttgaagaggg caaagtacgg 420

cgagtggtac aaaacgcgaa ggtcgattgg aaagtctggg acgcggaaga tacacttatt 480

cacaacgacg atctgcctat gaagccgtcg gaccttccgg atgtattcac atcgtttcga 540

aagtcggtcg aaccgctacg tgacaatata cgcaagccat taccaccgtc ctctgggacc 600

cttccgccac ttcccgacga tctcccgcct caagaggctc ccttcgagat accctcatct 660

ttgccagagc tcacccaagc actactacgg cctttgggga tttcccctgc gctgtctccc 720

cagacggcac atcccttcat cggcggcgaa tctcatgctc gtacccgcct ccttcacctc 780

ctctcatcag gcgccatgac caaatacaaa gacactcgca acgagatgat cggagaggac 840

ttttcctcca agctctctgg ctaccttgct cttgggtgta tcacagcaag acagatcaac 900

cacatgatgg tggaattcga agaggtgtgc tggaacacag gcgagaacaa agggacggct 960

gcgatgcgct tcgagctctt gtggcgggac tatatgaagc tttgcgcgag aaagtatggt 1020

tcagcgttat tctcggtgca tgggttccgt ggggagcagg accacgggaa gcacacgaag 1080

atagagtgga aggcagccgc ggacgagcca aggaaggttg agcgcttctt ggccggtacg 1140

acggggattg ggctggtgga tgcgagcatg agagagcttg cagccactgg atatacttcg 1200

aatcgcgcgc gtcagaattg cgcctctttt ttggcgacat ggctcggtgt ggattggcgg 1260

ctgggagcgg agtggtatga gagcatgctg gttgactatg atgtggcgag taattggggc 1320

aactggcagt atgttgcggg ggtggggaat gatccaagag gcgatggcga gggtagggca 1380

aggagattca acccgatcaa gcaggcttgg gattatgata agaagggaga atatgtgagg 1440

atgtgggtgg acgaggtgaa ggagattgac gatttagacg tcgttttcca gtgttcgagg 1500

gggctccagg ggaagaagaa gtgtgctggg gccttaaagg acgttgaaat ggccagagat 1560

ccgttggttc ggatccagta cgatagacgt cgaaagtag 1599

<210> 2

<211> 532

<212> PRT

<213> 金针菇(Flammulina filiformis)

<400> 2

Met Tyr Leu Ile Tyr Ile Leu Arg His Asp Leu Arg Leu Ala Asp Asn

1 5 10 15

Pro Ile Phe His Ala Leu Ser Ser Arg Ser Ala Asn Phe Thr His Leu

20 25 30

Ile Pro Val Tyr Val Leu Thr Pro His Gln Ile Glu Val Ser Gly Leu

35 40 45

Ser Gln Ser Asn Ile Ser Pro Tyr Pro Glu Ala Arg Ser Arg Val Gly

50 55 60

Lys Phe Trp Arg Cys Gly Pro His Arg Val Lys Phe Leu Ser Glu Ala

65 70 75 80

Ile Tyr Asp Leu Lys Asp Thr Leu Arg Gly Leu Gly Ser Asp Leu Leu

85 90 95

Val Arg Val Gly Pro Leu Asp Thr Val Val Asp Gly Leu Leu Asn Ser

100 105 110

Glu Ala Leu Lys Gly Lys Arg Gly Ala Val Trp Met Ser Arg Asp Trp

115 120 125

Ala Thr Glu Glu Ile Ile Glu Glu Gly Lys Val Arg Arg Val Val Gln

130 135 140

Asn Ala Lys Val Asp Trp Lys Val Trp Asp Ala Glu Asp Thr Leu Ile

145 150 155 160

His Asn Asp Asp Leu Pro Met Lys Pro Ser Asp Leu Pro Asp Val Phe

165 170 175

Thr Ser Phe Arg Lys Ser Val Glu Pro Leu Arg Asp Asn Ile Arg Lys

180 185 190

Pro Leu Pro Pro Ser Ser Gly Thr Leu Pro Pro Leu Pro Asp Asp Leu

195 200 205

Pro Pro Gln Glu Ala Pro Phe Glu Ile Pro Ser Ser Leu Pro Glu Leu

210 215 220

Thr Gln Ala Leu Leu Arg Pro Leu Gly Ile Ser Pro Ala Leu Ser Pro

225 230 235 240

Gln Thr Ala His Pro Phe Ile Gly Gly Glu Ser His Ala Arg Thr Arg

245 250 255

Leu Leu His Leu Leu Ser Ser Gly Ala Met Thr Lys Tyr Lys Asp Thr

260 265 270

Arg Asn Glu Met Ile Gly Glu Asp Phe Ser Ser Lys Leu Ser Gly Tyr

275 280 285

Leu Ala Leu Gly Cys Ile Thr Ala Arg Gln Ile Asn His Met Met Val

290 295 300

Glu Phe Glu Glu Val Cys Trp Asn Thr Gly Glu Asn Lys Gly Thr Ala

305 310 315 320

Ala Met Arg Phe Glu Leu Leu Trp Arg Asp Tyr Met Lys Leu Cys Ala

325 330 335

Arg Lys Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Ser Val His Gly Phe Arg Gly Glu

340 345 350

Gln Asp His Gly Lys His Thr Lys Ile Glu Trp Lys Ala Ala Ala Asp

355 360 365

Glu Pro Arg Lys Val Glu Arg Phe Leu Ala Gly Thr Thr Gly Ile Gly

370 375 380

Leu Val Asp Ala Ser Met Arg Glu Leu Ala Ala Thr Gly Tyr Thr Ser

385 390 395 400

Asn Arg Ala Arg Gln Asn Cys Ala Ser Phe Leu Ala Thr Trp Leu Gly

405 410 415

Val Asp Trp Arg Leu Gly Ala Glu Trp Tyr Glu Ser Met Leu Val Asp

420 425 430

Tyr Asp Val Ala Ser Asn Trp Gly Asn Trp Gln Tyr Val Ala Gly Val

435 440 445

Gly Asn Asp Pro Arg Gly Asp Gly Glu Gly Arg Ala Arg Arg Phe Asn

450 455 460

Pro Ile Lys Gln Ala Trp Asp Tyr Asp Lys Lys Gly Glu Tyr Val Arg

465 470 475 480

Met Trp Val Asp Glu Val Lys Glu Ile Asp Asp Leu Asp Val Val Phe

485 490 495

Gln Cys Ser Arg Gly Leu Gln Gly Lys Lys Lys Cys Ala Gly Ala Leu

500 505 510

Lys Asp Val Glu Met Ala Arg Asp Pro Leu Val Arg Ile Gln Tyr Asp

515 520 525

Arg Arg Arg Lys

530

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca tgtacctcat ttacatcctc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggaattcc tactttcgac gtctatcgta 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgttggcg acctcgtatt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgttatgtt tatcggcact tt 22

Claims

1.一种金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH，其氨基酸序列如SEQNO.2。

2.编码权利要求1所述金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH的基因，其核苷酸序列如SEQNO.1。

3.含有权利要求2所述金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH基因的表达载体。

4.权利要求2所述金针菇蓝光受体蛋白FfCry-DASH的基因用于调控金针菇生长的应用。