CN117070496A - 一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种南极假丝酵母脂肪酶b突变体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体及其制备方法和应用。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。编码所述突变体的基因序列如SEQ ID NO.11所示。该突变体有更高的酯键水解催化活力、催化转酯的活力和热稳定性，可用于生物柴油生产、精细化工、药物合成。此外，该突变体在催化酯水解、酯交换、成酯等反应的活力的增加可能会引起产物立体特异性的变化，这些变化在药物中间体合成、精细化工等领域有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体及其制备方法和应用。
背景技术
巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）作为单细胞真菌，长期以来一直用于异源蛋白质生产，是近年来受到重视的一个高效的真核表达系统。该表达系统具有许多独特的优点，并己迅速发展成为重组蛋白生产的重要系统之一。毕赤酵母作为真核表达系统具有以下优势：（1）毕赤酵母生长迅速，在简单合成培养基中可实现高密度培养；（2）毕赤酵母具有精确调控的启动子，包括甲醇依赖型启动子或非甲醇依赖型组成型启动子，都可以高效表达目的外源蛋白；（3）外源蛋白表达效率高，而自身分泌蛋白少，其表达的外源蛋白可占总分泌表达蛋白的90%以上，有利于外源目的蛋白的分离纯化；（4）毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白翻译后修饰、折叠及高效分泌等功能，可以克服原核表达系统中存在的可溶性蛋白表达量低及目标蛋白（例如酶蛋白）因不能正确折叠和溶解以致功能降低甚至消失等缺陷。因此，毕赤酵母成为近年来表达外源目的蛋白最有前途的表达系统。
脂肪酶是一类可以水解甘油三酯产生不同链长游离脂肪酸和甘油的水解酶，在生物体内的脂代谢中起着重要作用。脂肪酶作为一种重要的工业用酶，可以催化酯水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应，因此在食品、皮革、饲料、洗涤、油脂、化工、医药、生物柴油等传统工业领域应用广泛。南极假丝酵母脂肪酶B（简称CalB）发现于1994年。由于具有良好的催化特性，CalB已经应用于精细化工、药物中间体合成、生物柴油生产等众多领域，是一种应用性广、具有重大经济价值的脂肪酶。但是由于CalB的表达量一般较低，因此应用成本较高。解决这一问题有两个途径，一方面可以通过增加表达效率降低酶的成本，但更为有效的方法是利用分子生物学技术，对一些可能影响该酶的表达效率、催化特点和稳定性的重要氨基酸位点进行突变，开发出表达效率更高、催化特性更好、更稳定的CalB突变体从而降低工业应用成本。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种南极假丝酵母脂肪酶B（CalB）突变体及其制备方法和应用，所述CalB突变体（mCalB）与野生型CalB相比，不但催化酯键水解反应的活力与转酯活力显著增加，热稳定性也有所提高，因此在应用中可以降低生产成本、提高生产效率。
本发明提供一种CalB突变体mCalB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
所述氨基酸序列由野生型CalB成熟肽上的11个关键氨基酸残基以特定氨基酸残基置换而成。所述11个关键氨基酸残基及特定氨基酸残基分别为：第92位氨基酸由丙氨酸置换为谷氨酸，第97位氨基酸由天冬酰胺置换为谷氨酰胺，第158位氨基酸由苏氨酸置换为丝氨酸，第162位氨基酸由丙氨酸置换为半胱氨酸，第219位氨基酸由亮氨酸置换为谷氨酰胺，第223位氨基酸由天冬氨酸置换为甘氨酸，第245位氨基酸由苏氨酸置换为丝氨酸，第265位氨基酸由天冬氨酸置换为谷氨酸，第278位氨基酸由亮氨酸置换为蛋氨酸，第281位氨基酸由丙氨酸置换为异亮氨酸，第308位氨基酸由赖氨酸置换为半胱氨酸。
本发明还提供所述CalB突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含如SEQ ID NO.11所示核苷酸序列。
本发明还提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌含有所述重组载体。
本发明还提供一种转基因细胞系，含有如SEQ ID NO.11所述核苷酸序列或所述重组载体。
本发明还提供一种CalB突变体的制备方法，包含以下步骤：
S1：将所述CalB突变体核苷酸序列插入载体质粒，获得重组质粒；
S2：将S1得到的重组质粒转化到感受态细胞中；
S3：S2所述宿主感受态细胞进行抗性培养，获得单克隆菌落，菌落扩繁；
S4：S3扩繁后的菌落进行发酵培养。
进一步地，步骤S1中所述载体质粒为pD915。
进一步地，步骤S2中所述感受态细胞为毕赤酵母属真菌、巴斯德毕赤酵母中的任意一种。
本发明还提供含有所述南极假丝酵母脂肪酶B突变体的食品、洗涤剂、皮革、纺织品和化妆品。
本发明还提供所述CalB突变体在生物柴油生产、精细化工、药物合成方面的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
（1）本发明的CalB突变体对酯键的水解反应的催化活力显著增加。
（2）本发明的CalB突变体对转酯反应的催化活力明显增加。
（3）本发明的CalB突变体热稳定性增加、耐碱性高。
（4）本发明的CalB突变体能够提高生物柴油生产效率，降低生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中含有三种不同前肽的CalB的示意图；
图2为本发明实施例3中CalB和mCalB催化酯键水解反应的活力的比较（C4~C16分别为不同长度酰基的对硝基苯酯）；
图3为本发明实施例4中CalB和mCalB催化转酯反应活力的比较；
图4为本发明实施例5中CalB和mCalB的热稳定性比较；
图5为本发明实施例6中CalB和mCalB的最佳反应pH比较。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1 带有不同前肽的脂肪酶CalB的制备
从NCBI网站上获取CalB的基因序列为SEQ ID NO.1（GeneBank Z30645.1），在其起始密码子ATG前增加13个碱基GAATTCCGAAACG（下划线所示为EcoRI酶切位点），在其终止密码子TGA后增加GGTGATATC（下划线所示为EcoRV酶切位点），然后将此序列交由GenScript公司根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，使用毕赤酵母密码子偏好性高的密码子替换偏好性低的密码子，简化mRNA的二级结构、尽量去除重复序列、消除限制性酶切位点、调整GC含量，以提高翻译效率，进而提高蛋白表达水平。优化后的基因序列为SEQ ID NO.2，并由该公司进行合成。
用限制性内切酶EcoRI和EcoRV（New England Biolabs）分别对脂肪酶CalB基因和含有组成型启动子GAP的酵母表达质粒（pD915，ATUM）毕赤酵母表达质粒进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（New England Biolabs）将上述两个酶切产物连接，将连接产物转化入TOP10大肠杆菌，将获取的单克隆菌落进行测序（委托Psomagen公司实施）。测序结果证实，本发明获得的DNA序列为SEQ ID NO.2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
使用质粒小量制备试剂盒（Zymgen公司）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得1个重组质粒，命名为wildSP-wildpro-CalB。
考虑到前肽的重要性，本发明以wildSP-wildpro-CalB序列（SEQ ID NO.2）的核苷酸片段为模板，采用基因合成的方式构建了用来自中华根霉脂肪酶（Rhizopus chinensislipase，RCL）的前肽区域替换CalB前肽区域的两种新的CalB，分别为afSP-RCLpro-CalB和afSP-RCLproKR-CalB（如图1所示）。
afSP-RCLpro-CalB是在a-因子信号肽（afSP）（SEQ ID NO.4）和CalB（SEQ IDNO.5）之间加入RCL的前肽区域（SEQ ID NO.6）。afSP-RCLpro-CalB在分泌过程中，RCL前肽区域（94个氨基酸）中间双碱性氨基酸即赖氨酸-精氨酸与第68个氨基酸天冬氨酸之间也会被切开，而分泌出来的则是RCL前肽区域C-末端的27个氨基酸（SEQ ID NO.7）与CalB的融合蛋白（SEQ ID NO.14）。
afSP-RCLproKR-CalB是在a-因子信号肽和CalB之间只加入RCL前肽区域N-末端的67个氨基酸（SEQ ID NO.8）。这样，afSP-RCLproKR-CalB在分泌过程中，RCL前肽区域（67个氨基酸）末端的双碱性氨基酸与CalB之间会被切开，而分泌出来的则是CalB成熟肽，不包含RCL前肽区域C-末端的27个氨基酸，采用RCLpro前肽替换野生型的前肽能够提高外源蛋白的分泌量。
提取上述菌株中经测序鉴定的质粒，以电击法将BamHI线性化的上述重组质粒转化野生型毕赤酵母宿主（DNA2.0，PPS-9010）或pep4/prb1双蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母（DNA2.0，PPS-9016）感受态细胞。转化后的细胞涂布于带有不同浓度（0.2 mg/mL-0.8 mg/mL）的博来霉素（zeocin）抗性的YPD平板，培养3-5天。每组挑取高浓度zeocin-YPD平板上生长良好的15个转化子单克隆菌落，接种于2 mL YPD培养液中，震荡培养（28℃，230 r/min）3天。离心收集上清液用于脂肪酶活力检测分析，比较哪一种前肽组成的脂肪酶活力更高。
所有挑选的克隆的上清液的脂肪酶活力测定使用96孔板高通量对硝基苯酚法（pNPP法），该方法用带有长度不同的碳链的对硝基苯酚酯（原液用异丙醇配制）为底物，底物中的酯键被脂肪酶水解后释放出游离的硝基苯酚（黄色）和对应的羧酸，因此脂肪酶的活力可在测得反应体系在一定反应时间的405 nm吸收值后利用硝基苯酚405 nm标准曲线确定。替换前肽区域后，在pNPP检测中，afSP-RCLpro-CalB和afSP-RCLproKR-CalB的水解活性分别比野生型前肽衍生的wildSP-wildpro-CalB高。而afSP-RCLpro-CalB的水解活力最高。因此，以下脂肪酶均采用afSP-RCLpro的前肽区域进行替换。
实施例2 脂肪酶CalB突变体mCalB的制备
为了获得催化效率更高，结构更稳定的CalB突变体，我们对一些可能与该脂肪酶的稳定性和活力相关的氨基酸位点进行了组合性改造，经过筛选，得到了最优的一个组合突变体（modified CalB，简称mCalB）。mCalB通过对CalB成熟肽的11个关键氨基酸位点进行氨基酸置换获得。若以CalB成熟肽N-端第一个氨基酸L的位置计为“1”的话，11个突变位点组合置换为：A92E，N97Q，T158S，A162C，L219Q，D223G，T245S，D265E，L278M，A281I和K308C，也就是脂肪酶突变体mCalB的第92位氨基酸由丙氨酸置换为谷氨酸，第97位氨基酸由天冬酰胺置换为谷氨酰胺，第158位氨基酸由苏氨酸置换为丝氨酸，第162位氨基酸由丙氨酸置换为半胱氨酸，第219位氨基酸由亮氨酸置换为谷氨酰胺，第223位氨基酸由天冬氨酸置换为甘氨酸，第245位氨基酸由苏氨酸置换为丝氨酸，第265位氨基酸由天冬氨酸置换为谷氨酸，第278位氨基酸由亮氨酸置换为蛋氨酸，第281位氨基酸由丙氨酸置换为异亮氨酸，第308位氨基酸由赖氨酸置换为半胱氨酸。
为构建表达afSP-RCLpro-mCalB的质粒，在RCL前肽区域前增加12个碱基CTCGAGAAGAGA（下划线所示为XhoI酶切位点），在mCalB成熟肽终止密码子TGA后增加GGAGATATC（下划线所示为EcoRV酶切位点），然后将突变了11个上述氨基酸的RCLpro-mCalB序列（基因序列SEQ ID NO.15）交由GenScript公司根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化（基因序列SEQ ID NO.16），并由该公司进行合成。
用限制性内切酶XhoI和EcoRV（New England Biolabs）分别对脂肪酶基因和含有组成型启动子GAP的酵母表达质粒（pD915，ATUM）毕赤酵母表达质粒进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（New England Biolabs）将上述两个酶切产物连接，将连接产物转化入TOP10大肠杆菌。为确保准确，对若干克隆进行测序（由Psomagen公司实施），测序结果证实，本发明获得的突变体mCalB的DNA序列为SEQ ID NO.11，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO.12。
使用质粒中量制备试剂盒（Zymgen），从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，获得1个重组质粒，命名为afSP-RCLpro-mCalB。
afSP-RCLpro-mCalB在分泌过程中，RCL前肽区域（94个氨基酸）中间双碱性氨基酸赖氨酸-精氨酸与第68个氨基酸天冬氨酸之间也会被切开，而分泌出来的则是RCL前肽区域C-末端的27个氨基酸与突变了11个上述氨基酸的mCalB的融合蛋白（SEQ ID NO.13）。
提取上述菌株中经测序鉴定的质粒，以电击法用BamHI线性化的上述重组质粒转化野生型毕赤酵母宿主（DNA2.0，PPS-9010）或pep4/prb1双蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母（DNA2.0，PPS-9016）感受态细胞。转化后的细胞涂布于带有不同浓度的（0.2 mg/mL~0.8mg/mL）zeocin抗性的YPD平板，培养3-5天，将高浓度zeocin-YPD平板上出现的转化子挑取单克隆，对单克隆进行小量发酵培养，检测酶活力，以获得新型高效的脂肪酶突变体mCalB的毕赤酵母工程菌。
实施例3 CalB和mCalB催化酯键水解反应活力检测
将实施例1获取的afSP-RCLpro-CalB和实施例2获取的afSP-RCLpro-mCalB进行脂肪酶水解活性检测，脂肪酶水解活性采用对硝基苯酚法测定（比色法405 nm）：以脂肪酶水解对硝基苯酚酯，每分钟释放1 μmol对硝基苯酚所需的酶量为一个脂肪酶活力单位（U）。分别将带有不同长度酰基的对硝基苯酚酯（C4～C16）作为底物测定CalB和mCalB对这些酯键的水解活力。酶蛋白质浓度的测定方法采用Bradford法，以牛血清蛋白为标准。
结果如图2所示，与CalB相比，mCalB的催化活性显著增加，增加幅度因底物而异，分别为CalB的3.2~4.9倍。
实施例4 CalB和mCalB的转酯活性检测
实验步骤：浓度为1 mg/mL的两种脂肪酶CalB和mCalB各取5 µL，分别加入到1.5mL Eppendorf小管中，这两个小管分别放到恒温混匀仪（Themo mixer 5436），打开管盖，在37℃下静置1~2小时，使其中的水分完全挥发。然后分别在两个小管中加入450 µL对硝基苯棕榈酸酯（pNPP）和庚烷（n-heptane）溶液，再向两个小管分别加入27 µL乙醇（终浓度为1M）。将混合物在40℃或70℃下摇动（Themo mixer 5436，Eppendorf，13500 rpm）孵育30分钟。从每种混合物中取出25 µL透明上清液，转移到空的Eppendorf管中，向管中加入975 µL乙醇。将200 μL混合溶液加入96孔微孔板中，读取310 nm处的吸收值（转酯产物棕榈酸乙酯在该波长有很高的光吸收值），并以此计算转酯反应效率。
检测结果如图3，为CalB和mCalB两种脂肪酶转酯后在310 nm处的吸收值。由上述实验结果得出，在40°C反应条件下，mCalB的转脂效率显著高于CalB，提升了2.21倍。
实施例5 温度对CalB和mCalB脂肪酶的稳定性的影响
分别将脂肪酶置于不同温度（25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃）下孵育1小时后按照常规方法（见实施例3）于37℃测定其剩余的脂肪酶活力比例，然后以处理后脂肪酶活力开始下降的临界温度和酶活力的下降程度作为评估酶热稳定性的指标。实验结果如图4所示，CalB和mCalB经热处理后酯键水解活力下降的临界温度分别为70℃和80℃，且mCalB的酶活力下降程度相较于CalB较低，说明mCalB的耐热性更好。
实施例6 pH对CalB和mCalB酶活的影响
在不同pH（6.5~11）的缓冲体系中分别测定CalB及mCalB脂肪酶的水解活力，以确定其最适pH。在此实施例中，底物pNPP用一系列不同pH值的缓冲液（pH 6.5：柠檬酸盐缓冲液；pH 7~7.5：磷酸盐缓冲液；pH 8：Tris-HCl缓冲液；pH 9~10.0：甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）配制，然后在这些不同的缓冲体系中进行酶促反应，测定酶活性，反应温度为37℃。
结果如图5所示，在pH 7~11，CalB和mCalB都有较高的酶活力，CalB的最适pH为9，而mCalB的最适pH为10。以上结果说明CalB和mCalB在中性和偏碱条件下有较高脂肪酶水解活性。
综合以上实施例，本发明提供了一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体及其制备方法和应用。所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。通过分子生物学方法将野生型CalB上的11个氨基酸残基进行置换。相对于野生型CalB，重组脂肪酶mCalB的催化水解活性和转酯活性显著提高，热稳定性也有提高。在生物柴油生产、精细化工、药物合成方面的生产中，有利于提高催化效率，进而提高生产效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1
ATGAAGCTACTCTCTCTGACCGGTGTGGCTGGTGTGCTTGCGACTTGCGTTGCAGCCACTCCTTTGGTGAAGCGTCTACCTTCCGGTTCGGACCCTGCCTTTTCGCAGCCCAAGTCGGTGCTCGATGCGGGTCTGACCTGCCAGGGTGCTTCGCCATCCTCGGTCTCCAAACCCATCCTTCTCGTCCCCGGAACCGGCACCACAGGTCCACAGTCGTTCGACTCGAACTGGATCCCCCTCTCAACGCAGTTGGGTTACACACCCTGCTGGATCTCACCCCCGCCGTTCATGCTCAACGACACCCAGGTCAACACGGAGTACATGGTCAACGCCATCACCGCGCTCTACGCTGGTTCGGGCAACAACAAGCTTCCCGTGCTTACCTGGTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTCTTCCCCAGTATCAGGTCCAAGGTCGATCGACTTATGGCCTTTGCGCCCGACTACAAGGGCACCGTCCTCGCCGGCCCTCTCGATGCACTCGCGGTTAGTGCACCCTCCGTATGGCAGCAAACCACCGGTTCGGCACTCACCACCGCACTCCGAAACGCAGGTGGTCTGACCCAGATCGTGCCCACCACCAACCTCTACTCGGCGACCGACGAGATCGTTCAGCCTCAGGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTACCTCTTCAACGGAAAGAACGTCCAGGCACAGGCCGTGTGTGGGCCGCTGTTCGTCATCGACCATGCAGGCTCGCTCACCTCGCAGTTCTCCTACGTCGTCGGTCGATCCGCCCTGCGCTCCACCACGGGCCAGGCTCGTAGTGCAGACTATGGCATTACGGACTGCAACCCTCTTCCCGCCAATGATCTGACTCCCGAGCAAAAGGTCGCCGCGGCTGCGCTCCTGGCGCCGGCAGCTGCAGCCATCGTGGCGGGTCCAAAGCAGAACTGCGAGCCCGACCTCATGCCCTACGCCCGCCCCTTTGCAGTAGGCAAAAGGACCTGCTCCGGCATCGTCACCCCCTGA
SEQ ID NO.2
ATGAAGTTGTTGAGTTTGACTGGTGTTGCCGGTGTCCTTGCTACCTGTGTCGCCGCTACCCCTTTGGTTAAGAGATTGCCTAGTGGTTCCGATCCTGCTTTTAGTCAACCAAAGTCTGTTTTGGACGCCGGTCTTACTTGTCAGGGAGCAAGTCCATCTTCCGTTTCTAAACCTATTTTGCTTGTCCCAGGTACTGGAACTACAGGTCCTCAATCATTTGATAGTAACTGGATTCCATTGTCCACTCAGCTTGGATACACACCTTGCTGGATCTCACCACCTCCATTCATGTTGAACGACACACAAGTTAATACCGAATACATGGTCAATGCAATTACTGCTTTGTATGCCGGTAGTGGAAACAATAAGTTGCCTGTTCTTACTTGGTCTCAAGGTGGATTGGTCGCTCAGTGGGGTCTTACATTTTTCCCATCTATCAGATCCAAGGTTGATAGATTGATGGCATTTGCTCCTGACTATAAAGGTACTGTCTTGGCAGGACCATTGGATGCCCTTGCAGTTTCAGCCCCTAGTGTCTGGCAACAGACCACTGGTTCCGCCTTGACAACCGCACTTAGAAACGCTGGTGGATTGACACAAATTGTTCCAACTACAAATCTTTACTCAGCTACCGATGAGATCGTTCAACCTCAGGTCTCTAACTCCCCATTGGACTCAAGTTATCTTTTCAACGGTAAAAATGTTCAAGCTCAGGCCGTCTGTGGTCCTTTGTTTGTTATTGATCATGCTGGATCTTTGACTTCCCAATTCTCATACGTTGTCGGAAGATCCGCTTTGAGATCAACCACTGGTCAGGCAAGATCTGCTGATTATGGAATTACCGACTGTAACCCTTTGCCAGCTAATGATCTTACTCCAGAACAAAAGGTTGCTGCCGCAGCTTTGCTTGCTCCTGCCGCAGCTGCCATCGTTGCCGGTCCTAAACAAAATTGCGAGCCAGACTTGATGCCTTACGCAAGACCATTCGCAGTCGGAAAAAGAACATGCTCAGGTATTGTCACTCCATAA
SEQ ID NO.3
MKLLSLTGVAGVLATCVAATPLVKRLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP
SEQ ID NO.4
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTN
NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKR
SEQ ID NO.5
LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP
SEQ ID NO.6
VPVAGHKGSVKATNGTDFQLPPLISSRCTPPSHPETTGDPDAEAYYINKSVQWYQAHGGNYTALIKRDTETVGGMTLDLPENPPPIPATSTAPS
SEQ ID NO.7
DTETVGGMTLDLPENPPPIPATSTAPS
SEQ ID NO.8
VPVAGHKGSVKATNGTDFQLPPLISSRCTPPSHPETTGDPDAEAYYINKSVQWYQAHGGNYTALIKR
SEQ ID NO.9
LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYEGSGNQKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQSTGSCLTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPQFVIGHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTSGQARSADYGITDCNPLPANELTPEQKVAAAALMAPIAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGCRTCSGIVTP
SEQ ID NO.10
GTTCCAGTCGCAGGACATAAGGGTTCTGTCAAAGCTACCAACGGTACAGATTTCCAGTTGCCACCTCTTATTTCTTCCAGATGTACTCCACCTTCACATCCTGAAACAACTGGAGATCCAGACGCAGAGGCTTACTATATTAACAAGTCCGTTCAATGGTACCAGGCTCACGGTGGAAATTATACCGCCTTGATCAAAAGAGATACTGAAACCGTTGGTGGAATGACATTGGACCTTCCTGAGAATCCACCTCCAATTCCTGCCACGTCGACTGCACCATCACTGCCTTCAGGATCTGATCCAGCTTTTAGTCAACCTAAGTCAGTGCTTGATGCTGGTTTGACATGCCAAGGTGCTTCTCCATCCTCTGTGAGCAAACCTATACTTCTGGTCCCGGGAACAGGAACTACTGGTCCACAATCTTTTGACTCCAATTGGATCCCCCTATCCACACAACTTGGTTATACTCCTTGTTGGATCTCGCCACCACCATTCATGTTGAATGATACACAGGTGAATACAGAATACATGGTTAATGCTATTACTGCCCTATACGAGGGGTCAGGTAACCAGAAGTTGCCAGTCTTAACTTGGAGTCAGGGTGGATTGGTTGCTCAATGGGGTCTGACGTTCTTCCCTTCCATCAGAAGTAAAGTTGACAGACTGATGGCATTTGCTCCCGATTACAAGGGTACAGTGCTTGCAGGACCATTGGACGCCTTGGCTGTTTCGGCTCCTTCAGTATGGCAACAATCTACTGGTAGCTGTCTAACTACAGCTTTGCGTAATGCTGGAGGCCTGACCCAAATTGTTCCTACCACGAACCTTTACTCTGCTACTGACGAGATCGTTCAGCCACAAGTGTCCAACTCCCCGTTAGACAGCTCTTATTTGTTTAACGGTAAAAACGTTCAAGCGCAGGCAGTTTGTGGACCCCAATTCGTAATCGGTCATGCTGGCTCACTGACTTCCCAGTTCTCGTACGTAGTCGGTAGATCCGCATTAAGGTCTACTTCTGGTCAAGCTCGTTCAGCTGACTATGGTATTACGGATTGTAATCCATTGCCTGCCAATGAATTGACCCCAGAGCAGAAGGTCGCTGCTGCCGCATTGATGGCTCCTATTGCCGCCGCTATTGTGGCCGGTCCTAAACAAAATTGTGAACCAGACCTCATGCCTTATGCAAGACCCTTTGCAGTTGGTTGTAGGACATGTTCCGGTATTGTTACTCCATAA
SEQ ID NO.11
GTTCCAGTTGCTGGTCATAAGGGTTCTGTTAAAGCTACTAACGGTACTGATTTCCAATTGCCACCTTTGATTTCTTCTAGATGTACTCCACCTTCTCATCCAGAGACTACTGGAGATCCAGATGCTGAAGCTTACTACATCAACAAGTCTGTTCAATGGTACCAAGCTCACGGTGGTAACTACACTGCTTTGATTAAAAGAGATACTGAGACTGTTGGTGGTATGACTTTGGATTTGCCAGAAAACCCACCTCCAATTCCTGCTACGTCGACTGCTCCATCTTTGCCTTCTGGTTCTGATCCAGCTTTTTCTCAACCTAAGTCTGTTTTGGATGCTGGTTTGACTTGTCAAGGTGCTTCTCCTTCTTCTGTTTCTAAACCAATTTTGTTGGTTCCTGGTACTGGTACTACTGGTCCACAATCTTTCGATTCTAACTGGATCCCTTTGTCTACTCAATTGGGTTACACTCCATGTTGGATTTCTCCTCCACCTTTCATGTTGAACGATACTCAAGTTAATACTGAGTACATGGTTAACGCTATTACTGCTTTGTATGAAGGTTCTGGTAATCAAAAGTTGCCAGTTTTGACTTGGTCCCAAGGTGGTTTGGTTGCTCAATGGGGTTTGACTTTCTTTCCTTCTATCAGATCTAAGGTTGATAGATTGATGGCTTTTGCTCCAGATTATAAAGGTACTGTTTTGGCTGGTCCTTTGGATGCTTTGGCTGTTTCTGCTCCATCCGTTTGGCAACAATCTACTGGTTCTTGTTTGACTACTGCTTTGAGAAACGCTGGTGGTTTGACTCAAATCGTTCCTACTACTAATTTGTACTCTGCTACTGATGAGATTGTTCAACCACAAGTTTCTAACTCTCCTTTGGATTCTTCTTATTTGTTCAACGGTAAAAATGTTCAAGCTCAAGCTGTTTGTGGTCCACAATTTGTTATTGGTCACGCTGGTTCTTTGACTTCTCAATTCTCTTACGTTGTTGGTAGATCTGCTTTGAGATCTACTTCTGGTCAAGCTAGATCTGCTGATTATGGTATTACTGATTGTAACCCATTGCCTGCTAATGAGTTGACTCCTGAACAAAAGGTTGCTGCTGCTGCTTTGATGGCTCCAATTGCTGCTGCTATTGTTGCTGGTCCAAAACAAAATTGTGAACCTGATTTGATGCCATACGCCAGACCTTTCGCCGTTGGATGTAGAACCTGTAGTGGAATCGTTACCCCTTAG
SEQ ID NO.12
VPVAGHKGSVKATNGTDFQLPPLISSRCTPPSHPETTGDPDAEAYYINKSVQWYQAHGGNYTALIKRDTETVGGMTLDLPENPPPIPATSTAPSLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYEGSGNQKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQSTGSCLTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPQFVIGHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTSGQARSADYGITDCNPLPANELTPEQKVAAAALMAPIAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGCRTCSGIVTP
SEQ ID NO.13
DTETVGGMTLDLPENPPPIPATSTAPSLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYEGSGNQKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQSTGSCLTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPQFVIGHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTSGQARSADYGITDCNPLPANELTPEQKVAAAALMAPIAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGCRTCSGIVTP
SEQ ID NO.14
DTETVGGMTLDLPENPPPIPATSTAPSLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAG
SGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPS
VWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQ
AVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVA
AAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP
SEQ ID NO.15
CTACCTTCCGGTTCGGACCCTGCCTTTTCGCAGCCCAAGTCGGTGCTCGATGCGGGTCTGACCTGCCAGGGTGCTTCGCCATCCTCGGTCTCCAAACCCATCCTTCTCGTCCCCGGAACCGGCACCACAGGTCCACAGTCGTTCGACTCGAACTGGATCCCCCTCTCAACGCAGTTGGGTTACACACCCTGCTGGATCTCACCCCCGCCGTTCATGCTCAACGACACCCAGGTCAACACGGAGTACATGGTCAACGCCATCACCGCGCTCTACGCTGGTTCGGGCAACAACAAGCTTCCCGTGCTTACCTGGTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTCTTCCCCAGTATCAGGTCCAAGGTCGATCGACTTATGGCCTTTGCGCCCGACTACAAGGGCACCGTCTCGCCGGCCCTCTCGATGCACTCGCGGTTAGTGCACCCTCCGTATGGCAGCAAACCACCGGTTCGGCACTCACCACCGCACTCCGAAACGCAGGTGGTCTGACCCAGATCGTGCCCACCACCAACCTCTACTCGGCGACCGACGAGATCGTTCAGCCTCAGGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTACCTCTTCAACGGAAAGAACGTCCAGGCACAGGCCGTGTGTGGGCCGCTGTTCGTCATCGACCATGCAGGCTCGCTCACCTCGCAGTTCTCCTACGTCGTCGGTCGATCCGCCCTGCGCTCCACCACGGGCCAGGCTCGTAGTGCAGACTATGGCATTACGGACTGCAACCCTCTTCCCGCCAATGATCTGACTCCCGAGCAAAAGGTCGCCGCGGCTGCGCTCCTGGCGCCGGCAGCTGCAGCCATCGTGGCGGGTCCAAAGCAGAACTGCGAGCCCGACCTCATGCCCTACGCCCGCCCCTTTGCAGTAGGCAAAAGGACCTGCTCCGGCATCGTCACCCCCTGA
SEQ ID NO.16
GATACTGAGACTGTTGGTGGTATGACTTTGGATTTGCCAGAAAACCCACCTCCAATTCCTGCTACGTCGACTGCTCCATCTTTGCCTTCTGGTTCTGATCCAGCTTTTTCTCAACCTAAGTCTGTTTTGGATGCTGGTTTGACTTGTCAAGGTGCTTCTCCTTCTTCTGTTTCTAAACCAATTTTGTTGGTTCCTGGTACTGGTACTACTGGTCCACAATCTTTCGATTCTAACTGGATCCCTTTGTCTACTCAATTGGGTTACACTCCATGTTGGATTTCTCCTCCACCTTTCATGTTGAACGATACTCAAGTTAATACTGAGTACATGGTTAACGCTATTACTGCTTTGTATGAAGGTTCTGGTAATCAAAAGTTGCCAGTTTTGACTTGGTCCCAAGGTGGTTTGGTTGCTCAATGGGGTTTGACTTTCTTTCCTTCTATCAGATCTAAGGTTGATAGATTGATGGCTTTTGCTCCAGATTATAAAGGTACTGTTTTGGCTGGTCCTTTGGATGCTTTGGCTGTTTCTGCTCCATCCGTTTGGCAACAATCTACTGGTTCTTGTTTGACTACTGCTTTGAGAAACGCTGGTGGTTTGACTCAAATCGTTCCTACTACTAATTTGTACTCTGCTACTGATGAGATTGTTCAACCACAAGTTTCTAACTCTCCTTTGGATTCTTCTTATTTGTTCAACGGTAAAAATGTTCAAGCTCAAGCTGTTTGTGGTCCACAATTTGTTATTGGTCACGCTGGTTCTTTGACTTCTCAATTCTCTTACGTTGTTGGTAGATCTGCTTTGAGATCTACTTCTGGTCAAGCTAGATCTGCTGATTATGGTATTACTGATTGTAACCCATTGCCTGCTAATGAGTTGACTCCTGAACAAAAGGTTGCTGCTGCTGCTTTGATGGCTCCAATTGCTGCTGCTATTGTTGCTGGTCCAAAACAAAATTGTGAACCTGATTTGATGCCATACGCCAGACCTTTCGCCGTTGGATGTAGAACCTGTAGTGGAATCGTTACCCCTTAG。
Claims (10)
1. 一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体，其特征在于，所述南极假丝酵母脂肪酶B突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
2. 编码如权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种重组基因工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。
5.一种转基因细胞系，其特征在于，含有权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3所述的重组载体。
6.一种南极假丝酵母脂肪酶B突变体的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1：将权利要求2所述核苷酸序列插入载体质粒，获得重组质粒；
S2：将S1得到的重组质粒转化到感受态细胞中；
S3：将S2所述感受态细胞进行抗性培养，获得单克隆菌落，菌落扩繁；
S4：S3扩繁后的菌落进行发酵培养。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述载体质粒为pD915。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述感受态细胞为毕赤酵母属真菌、巴斯德毕赤酵母中的任意一种。
9.含有权利要求1所述南极假丝酵母脂肪酶B突变体的食品、洗涤剂、皮革、纺织品和化妆品。
10.权利要求1所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体在生物柴油生产、精细化工、药物合成方面的应用。
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|---|---|---|---|---|
| US20060275760A1 (en) * | 2002-09-13 | 2006-12-07 | Eui-Sung Choi | Method for screening of a lipase having improved enzymatic activity using yeast surface display vector and the lipase |
| CN102660517A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-09-12 | 上海交通大学 | 热稳定性提高的脂肪酶突变体及其构建方法 |
| WO2013010783A1 (en) * | 2011-07-15 | 2013-01-24 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| CN112342204A (zh) * | 2020-11-27 | 2021-02-09 | 江苏阿尔法药业有限公司 | 一种达比加群中间体的酶催化合成方法及脂肪酶 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 温露文;徐岩;喻晓蔚;: "理性设计提高酯合成催化反应脂肪酶的热稳定性", 微生物学通报, no. 07, pages 2106 * |
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