CN113897365A - 一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域；本发明提供的里氏木霉cbh1基因启动子突变体，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本发明还提供了里氏木霉重组菌株，所述重组菌株中含有上述里氏木霉cbh1基因启动子突变体。本发明构建的里氏木霉cbh1基因启动子突变体可以提高驱动β‑甘露聚糖酶表达的效果，利用本发明的里氏木霉cbh1基因启动子突变体构建的β‑甘露聚糖酶表达菌株可以显著提高β‑甘露聚糖酶的产量。

Description

一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用。
背景技术
丝状真菌具有强大的蛋白质合成分泌能力，广泛应用于工业酶的生产，在医药蛋白的生产中也具有良好的应用前景。里氏木霉(Trichoderma reesei)是生产纤维素酶的主要微生物，其胞外蛋白产量可达到80g/L以上，其中纤维二糖水解酶I约占60％-70％，这一高表达强度使该酶编码基因的启动子Pcbh1成为驱动里氏木霉中重组蛋白表达的首选。
里氏木霉中纤维素酶的表达受到多种转录因子的组合调控。其中，XYR1是关键的转录激活因子，而碳分解代谢物阻遏因子CRE1具有显著的负调控作用。此外，转录因子ACE2、ACE3和HAP2/3/5复合物对cbh1的表达具有正调控作用，而ACE1等转录因子对其表达有负调控作用。在cbh1基因启动子上，存在多个上述转录因子的结合位点。有研究将cbh1基因启动子中的转录激活因子结合位点进行优化，可以有效提高启动子的效率。此外，纤维素酶转录激活因子XYR1的氨基酸突变A824V可使其具有持续激活能力，使纤维素酶的表达摆脱对纤维素、乳糖等诱导物的依赖(Derntl et al.,Biotechnol Biofuels,2013,6(1):62)。
β-1,4-甘露聚糖是植物细胞壁的主要组分之一。β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)能够以内切的方式水解β-甘露聚糖中的糖苷键，释放出甘露寡糖等产物。β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂，在畜禽和水产动物的养殖中有助于降解豆粕等饲料原料中的抗营养因子，促进动物生长，具有重要的应用价值。此外，β-甘露聚糖酶还可应用于食品工业中甘露寡糖的制备等。目前，β-甘露聚糖酶在里氏木霉表达宿主中的产量仍有待提升。
发明内容
本发明的目的是提供一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明构建的里氏木霉cbh1基因启动子突变体可以提高驱动β-甘露聚糖酶表达的效果，利用本发明的里氏木霉cbh1基因启动子突变体构建的β-甘露聚糖酶表达菌株可以显著提高其表达的β-甘露聚糖酶的产量。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体，所述启动子突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供上述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体的构建方法，包括以下步骤：
将里氏木霉cbh1启动子核苷酸序列的-824bp至-774bp GGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAA替换为GGCTAAATGCGACATCTTAGCC；将核苷酸序列的-737bp的T替换为A；将核苷酸序列的-725bp至-686bp GTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCAC替换为GGCTAATTCCAACATCTTAGCC；将核苷酸序列的-532bp至-526bp GACATTC替换为GGCTAAG，设计合成所述里氏木霉cbh1基因启动子突变体。
本发明还提供上述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体在构建β-甘露聚糖酶表达菌株中的应用。
进一步地，所述菌株为里氏木霉菌株。
进一步地，所述β-甘露聚糖酶为草酸青霉β-甘露聚糖酶。
本发明还提供一种基因表达盒，所述基因表达盒含有上述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体。
本发明还提供里氏木霉重组菌株，所述重组菌株含有上述的基因表达盒。
本发明还提供上述里氏木霉重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
将所述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体连接到载体质粒中，构建基因表达盒；
(1)制备得到出发菌株的原生质体；
(2)向所述原生质体中加入步骤(1)构建的基因表达盒进行转化，分离纯化，再经验证得到正确的转化子；
(3)将正确的转化子接种到培养基上，培养得到所述重组菌株。
本发明还提供上述的里氏木霉重组菌株在生产β-甘露聚糖酶中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明提供的经设计改造的启动子突变体能够实现β-甘露聚糖酶的高效表达。本发明所构建的启动子突变体驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株在纤维素培养基发酵144h时，β-甘露聚糖酶产量为343.73U/mL，高于未改造的cbh1基因启动子以及构建的启动子突变体Pc_IR_DI_Z_IR、Pcbh1XdC-2驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株的β-甘露聚糖酶的生产水平。在以1％纤维素和1％葡萄糖作为共同碳源的培养基进行发酵时，本发明的启动子突变体驱动β-甘露聚糖酶表达的效果更加显著。
(2)本发明提供了一株里氏木霉重组菌株及其构建方法，实验证实该菌株在葡萄糖培养基发酵72h时β-甘露聚糖酶酶活为184.11U/mL，同时该菌株在纤维素培养基发酵96h时β-甘露聚糖酶酶活为447.12U/mL，均显著高于出发菌株。本发明构建了一种提高里氏木霉蛋白质生产水平的基因表达系统并证明了其应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pM5p质粒载体结构示意图；
图2为出发菌株QP4及使用未改造启动子Pcbh1驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株在纤维素培养基发酵144h的β-甘露聚糖酶产量；
图3为不同启动子突变体驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株在纤维素培养基发酵的β-甘露聚糖酶产量；
图4为不同启动子突变体驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株在以1％纤维素和1％葡萄糖作为共同碳源的培养基发酵的β-甘露聚糖酶产量；
图5为使用突变体驱动β-甘露聚糖酶表达，并且过表达XYR1突变体的菌株在纤维素培养基发酵的β-甘露聚糖酶产量；
图6为使用突变体驱动β-甘露聚糖酶表达，并且过表达XYR1突变体的菌株在葡萄糖培养基发酵的β-甘露聚糖酶产量。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例所用培养基及储存液：
基本培养基(/L)：葡萄糖20g、(NH4)2SO45 g、KH2PO415 g、MgSO4·7H2O 0.6g、CaCl20.6 g，蛋白胨2g，10000×微量元素母液100μL，115℃灭菌30min；10000×微量元素母液(/L)：FeSO4·7H2O 50g、MnSO4·H2O 17g、ZnSO4·2H2O 14g、CaCl2·6H2O20g；分单孢培养基(/L)：葡萄糖20g、(NH4)2SO45 g、KH2PO415 g、MgSO4·7H2O 0.6g、CaCl20.6 g，蛋白胨2g，10000×微量元素母液100μL，0.1％(v/v)Triton X-100，2％(w/v)琼脂粉，115℃灭菌30min；生孢培养基(PDA)：称取去皮土豆200g，切碎后，加入不超过1L的水煮沸30min，经8层纱布过滤，取滤液加20g葡萄糖，定容1L，添加2％(w/v)琼脂粉，115℃灭菌30min；原生质体转化上层培养基(/L)：山梨醇182g、葡萄糖10g、柠檬酸三钠二水3g、(NH4)2SO46 g、MgSO4·7H2O 1g、KH2PO410 g、琼脂糖0.6％、10000×微量元素母液100μL，115℃灭菌30min；原生质体转化下层培养基(/L)：葡萄糖10g、柠檬酸三钠二水3g、(NH4)2SO46 g、MgSO4·7H2O 1g、1.2％(w/v)琼脂粉、微量元素母液100μL。115℃灭菌30min。
培养尿嘧啶缺陷型菌株的培养基在配制时均需加入0.1％(w/v)尿嘧啶。
以下实施例所用试剂：
南京诺唯赞公司
Figure BDA0003371394710000041
Max Super-Fidelity DNAPolymerase、2×Taq MasterMix以及ClonExpress II One Step Cloning Kit；SIGMA公司细胞壁裂解酶Lysingenzymes from Trichoderma；OMEGA公司质粒提取及琼脂糖胶回收试剂盒；北京全式金生物技术有限公司pEASY-Basic Seamless Cloning andAssembly Kit；Takara公司实时荧光定量PCR试剂TB
Figure BDA0003371394710000051
Premix Ex TaqTM II；鼎国昌盛生物科技有限公司GoldviewTM核酸染料；生工生物工程(上海)股份有限公司改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒。
以下实施例所用仪器：
PCR仪(BIO-GENER)；高速冷冻离心机(Eppendorf)；琼脂糖凝胶紫外成像系统(Major Science)；叠加式振荡培养箱(旻泉)；超微量分光光度计(Quawell)；加热磁力搅拌器(EMS-9A)；电热恒温水浴槽(DK-8D)；pH计(Sartorius)；LC480罗氏荧光定量PCR仪；组织细胞破碎仪(Bullet Blender)；荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)；电泳仪(DYY-11B)；微孔板分光光度计(BioTeK)；高压灭菌锅(德强仪器)；电热鼓风干燥箱(GFL-125)；循环水式多用真空泵(拓赫机电科技)等。
以下实施例中所用菌株来源为：
里氏木霉QP4：里氏木霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株是在里氏木霉QM9414(美国模式菌种收集中心保藏号ATCC 26921)的基础上通过敲除pyr4基因得到的(钟立霞等，化工学报，2016,67(6):2510-2518)。
里氏木霉PX3：该菌株是在里氏木霉QM9414的基础上通过敲除pyr4基因，然后使用里氏木霉cdna1基因启动子过表达824位的丙氨酸突变为缬氨酸的转录激活因子XYR1突变体XYR1A824V得到的，已在专利CN202111041885.6中予以公开。
启动子片段Pc_IR-DI_Z-IR，按照Kiesenhofer等的描述(Appl EnvironMicrobiol,2018,84:e01742-17)，根据GenBank登录号为KY780479的核苷酸序列进行合成。
本发明使用了基因工程和分子生物学领域常规的技术和方法。本领域的技术人员可以在本发明提供的实施方式的基础上采用本领域其它常规技术、方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下述具体实施例阐述了一种提高里氏木霉蛋白质生产水平的基因表达系统，包括里氏木霉cbh1基因启动子突变体的构建以及使用其驱动草酸青霉来源的β-甘露聚糖酶表达的菌株，以及结合XYR1突变体的过表达提高β-甘露聚糖酶产量的方法。在实际应用中，在本发明所构建的里氏木霉蛋白质生产水平的基因表达系统并不限于表达草酸青霉来源的β-甘露聚糖酶，还可以表达其他菌株来源的蛋白，如淀粉酶、果胶酶、木聚糖酶等。
下面结合实例对本发明的内容作具体阐述。
实施例1启动子突变体片段的扩增
选择里氏木霉纤维二糖水解酶I编码基因cbh1的5′上游-829bp至-1bp序列，定义为启动子Pcbh1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。将cbh1启动子-829bp中XYR1结合位点替换为其他启动子来源的结合能力更强的XYR1结合位点，包括xyn1、egl1启动子来源的XYR1的结合位点，并移除抑制因子CRE1的结合位点，具体操作为将里氏木霉cbh1启动子核苷酸序列的-824bp至-774bp GGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAA替换为GGCTAAATGCGACATCTTAGCC；将核苷酸序列的-737bp的T替换为A；将核苷酸序列的-725bp至-686bp GTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCAC替换为GGCTAATTCCAACATCTTAGCC；将核苷酸序列的-532bp至-526bp GACATTC替换为GGCTAAG，设计合成得到启动子Pcbh1XdC-1，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
此外，还设计合成得到启动子Pcbh1XdC-2，其除了包含Pcbh1XdC-1的上述序列特征外，还将Pcbh1中-206bp至-175bp TTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCC替换为GGCTAAATGCGACATCTTAGCC，将-148bp的A替换为T。Pcbh1XdC-2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，使用引物sA-F(Eco)和sA-R(Eco)扩增获得Pcbh1启动子，用于后续基因表达盒的构建。
使用体外化学合成方法获得启动子突变体Pcbh1XdC-2的DNA片段，以其为模板，使用引物Psx-F和sA-R(Eco)扩增获得Pcbh1XdC-2启动子，用于后续基因表达盒的构建。
以Pcbh1XdC-2片段为模板，使用引物Psx-F和Psx-up-R扩增获得Pcbh1XdC-1启动子前半部分序列；以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，使用引物Psx-dn-F和sA-R(Eco)扩增获得未经改造的启动子后半部分序列。这两段序列用于后续的Pcbh1XdC-1启动子驱动目的基因表达盒的构建。
作为对照，化学合成启动子突变体Pc_IR-DI_Z-IR的DNA片段，以其为模板，使用引物IR-F(Eco)和sA-R(Eco)扩增获得Pc_IR-DI_Z-IR启动子，用于后续基因表达盒的构建。
上述扩增过程使用的引物序列为：
Psx-F：ACTACCCTCTCCACGTGCCAATGGCTAAATGCGACATCTTAGC(SEQ ID No.6)
Psx-up-R：AGTTTCAACTCAATCTTTTGCCTGTTCAGTGCCGACTTACA(SEQ ID No.7)
Psx-dn-F：AGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCC(SEQ ID No.8)
sA-F(Eco)：CTCATTACTACCCTCTCCCAATGGCTAAAAGTACATA(SEQ ID No.9)
sA-R(Eco)：GCCGATGAGTACAACATGATGCGCAGTCCGCGGTTG(SEQ ID No.10)
IR-F(Eco)：CTCATTACTACCCTCTCCCAATGGCTAAATGCGACATC(SEQ ID No.11)
以上PCR使用南京诺唯赞公司Phanta
Figure BDA0003371394710000071
Max Super-Fidelity DNAPolymerase，PCR扩增反应程序为：95℃预热3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30-60s，循环32次；72℃彻底延伸10min。
实施例2使用启动子突变体驱动β-甘露聚糖酶表达的表达盒的构建
pM5p载体的构建：使用pM5p质粒载体构建来自草酸青霉的β-甘露聚糖酶Man5A的基因表达盒，该酶氨基酸序列的GenBank登录号为EPS31069.1。pM5p载体的图谱如图1所示，包含里氏木霉pyr4基因的上游序列(pyr4 upstream)和下游序列(pyr4downstream)，二者之间存在来自草酸青霉的man5A基因及其终止子Tman，以及用作筛选标记的乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶编码基因pyrG。在pyr4上游序列和man5A基因序列之间，引入了Eco72I的酶切位点序列。
使用限制性内切酶Eco72I酶切质粒pM5p，使用一步克隆试剂盒进行单片段以及多片段的克隆，分别将不同的启动子片段Pcbh1、Pcbh1XdC-1、Pcbh1XdC-2和Pc_IR-DI_Z-IR连接在pM5p质粒的Eco72I位置，转化大肠杆菌DH5α。对大肠杆菌转化子进行PCR验证和测序，将验证正确的转化子进行培养之后，提取质粒，使用PmeI酶切，切胶回收得到4种用于里氏木霉转化的man5A基因表达盒。
实施例3使用启动子突变体驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株的构建
使用原生质体转化方法，将实施例2获得的man5A基因表达盒分别转化入QP4菌株。表达盒上两端的pyr4基因上游序列和下游序列作为同源臂，通过同源重组将表达盒定点整合在pyr4基因位点。
原生质体的制备方法为：
1.准备含有0.1％(w/v)尿嘧啶的PDA培养基平板10个，用镊子夹取单层玻璃纸覆于PDA培养基表面。取80μL新鲜孢子悬液于玻璃纸上，用涂布棒涂布均匀，避免产生气泡。用封口膜将培养基平板封口，避免污染。置30℃培养箱16h。
2.在超净台中称取裂解酶溶于缓冲液S1(/L：218.6g山梨醇，13.6g KH2PO4，pH6.5)中，配制5‰(w/v)的裂解液。
3.将长有菌丝的玻璃纸转至新的空白平板中，每两张玻璃纸间加3mL裂解液，注意驱除气泡。封口后静置于30℃培养箱1h，使菌丝体充分裂解。
4.用镊子将裂解液中的玻璃纸取出(尽量不要带出菌丝体)，用5mL去头吸头将裂解液吹打均匀。
5.在冰上过滤裂解液。用灭菌的带有五层擦镜纸的漏斗过滤收集裂解液，4℃离心机中2500rpm离心10min，弃上清。加5mL预冷的缓冲液S2(/L：182.2g山梨醇，7.35g CaCl2，1.21g Tris，pH 7.5)重悬沉淀，4℃离心机中2500rpm离心10min，弃上清。
6.加入200μL预冷的S2，用吸头缓慢将沉淀吹打均匀，在显微镜下观察制备的原生质体的形态及密度，置于冰上保存备用。
原生质体的转化方法为：
1.在冰上配制转化体系。200μL原生质体中缓慢均匀地分别加入12μL实例2构建的4种基因表达盒，立即均匀加入60μLT1(/L：250g聚乙二醇6000，7.35g CaCl2，1.21g Tris，pH 7.5)，轻震混匀后于冰上静置20min。
2.于上述体系中加入2mLT1，轻震混匀后室温静置5min。
3.加入4mL S2终止反应。
4.将上层培养基加热融化，冷却至50℃-60℃时，缓慢均匀加入第3步得到的体系。
5.将第4步中的混合体系均匀倾倒至凝固有下层培养基的平板中。凝固后用封口膜封口，置于30℃培养箱培养。
6.待转化平板上单个转化子生长出时，挑取转化子到分单孢培养基上，等待生孢后划线进行单孢纯化，提取基因组DNA用PCR进行验证。
石英砂小量提取里氏木霉基因组DNA的方法为：
1.取少许孢子悬液于分装有650μL基本培养基的无菌1.5mL离心管中。30℃，200rpm培养24h-48h，使菌丝生长至适当浓度。
2. 12000rpm离心10min，弃上清。
3.加入500μL抽提缓冲液(/L：24.228g Tris，14.61g NaCl，9.3g EDTA，20g SDS，pH 8.5)，100mg石英砂，在Bullet Blender组织细胞破碎仪中8档震荡1min。
4. 65℃水浴10min。
5.加入200μL 7.5mM乙酸铵溶液，置冰上8min。
6. 4℃，12000rpm离心10min，将上清转至新的1.5mL离心管中，加入450μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min。
7. 4℃，12000rpm离心10min，弃上清。加500μL 70％(v/v)乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心1min，弃上清，再离心30s，吸走残余液体，开盖在室温静置10min，使残留乙醇挥发。加入30-50μL ddH2O溶解沉淀，-20℃保存备用。
以提取得到的转化子的基因组DNA为模板，使用位于pyr4上游同源臂外侧的引物pyr4-UF(P19)和位于man5A基因内部的Man-yz-R(#)进行PCR验证，正确的转化子应能扩增出大小约3.0kb的条带。同时，使用位于pyr4上游同源臂外侧的引物pyr4-UF(P19)和位于pyr4位置原有hph基因内部的QP4-hph-R1进行PCR，已分离纯化的菌株应扩增不出条带。
上述验证引物的序列为：
pyr4-UF(P19)：TTGCCCTCTACGCTGAAAATAG(SEQ ID No.12)
Man-yz-R(#)：GAGCTGATGCCAGCCCGGCCAACA(SEQ ID No.13)
QP4-hph-R1：TTCTACACAGCCATCGGTCCAGA(SEQ ID No.14)
获得验证正确的菌株后，将使用Pcbh1、Pcbh1XdC-1、Pcbh1XdC-2和Pc_IR-DI_Z-IR驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株分别命名为Pcbh1、PXdC1、PXdC2和PIR。对以上菌株通过荧光定量PCR测定基因组中man5A基因拷贝数，结果均为单拷贝。
实施例4使用突变体驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株产酶能力的测定
将实施例3中构建的菌株的孢子悬液涂布到PDA培养基上，30℃恒温培养箱中培养生孢。用生理盐水将PDA上的新鲜孢子洗脱下来，将孢子悬液按终浓度为每毫升106个接种于基本培养基中，置于30℃，200rpm的摇床中培养24-27h，获得种子液。用去头吸头吸取5mL到50mL发酵培养基中，置于30℃，200rpm的摇床中培养，取不同时间点的发酵液在4℃，9000rpm条件下离心，取上清测定其β-甘露聚糖酶活力。设置3个平行摇瓶重复，计算其酶活力的平均值及标准差。
发酵培养基包括：纤维素发酵培养基(/L)：结晶纤维素20g、CaCl21 g、MgSO4·7H2O0.6g、KH2PO45 g、(NH4)2SO45 g、玉米浆20g，121℃灭菌30min；葡萄糖-纤维素发酵培养基(/L)：葡萄糖10g、纤维素10g、CaCl21 g、MgSO4·7H2O 0.6g、KH2PO45 g、(NH4)2SO45 g、酵母粉20g，115℃灭菌30min。
β-甘露聚糖酶活力测定方法为：将粗酶液用0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.8)稀释至合适倍数，在25mL比色管里加入500μL稀释后的酶液，加入1.5mL用0.2M醋酸－醋酸钠缓冲液溶解的1％(w/v)槐豆胶底物，充分混匀。50℃反应30min后，加入3mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂终止反应。在空白对照试管中先加入底物和DNS试剂，再加入500μL对应的稀释酶液，混匀。沸水浴10min后迅速冷却，加入20mL蒸馏水，定容至25mL，将比色管上下颠倒混匀。取200μL于酶标管，用酶标仪读取540nm波长下OD值。根据甘露糖标准曲线，计算粗酶液的β-甘露聚糖酶活力。将在上述条件下，1分钟催化生产1μmol甘露糖的酶量定义为1个活力单位(U)。
如图2所示，在纤维素培养基中发酵144h，出发株QP4仅表达少量里氏木霉自身的β-甘露聚糖酶，而未改造启动子Pcbh1驱动草酸青霉β-甘露聚糖酶表达的菌株的β-甘露聚糖酶产量为181.27U/mL。
如图3所示，对不同启动子突变体驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株在纤维素培养基发酵48h、96h、144h的β-甘露聚糖酶活力进行了测定。与未改造的Pcbh1启动子相比，由启动子突变体Pc_IR-DI_Z-IR、Pcbh1XdC-1、Pcbh1XdC-2驱动草酸青霉β-甘露聚糖酶表达的菌株的β-甘露聚糖酶产量均有提高，其中Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株PXdC1在发酵144h的β-甘露聚糖酶产量最高，为349.88U/mL。
与启动子突变体Pc_IR-DI_Z-IR仅对激活因子XYR1的结合位点进行优化不同，Pcbh1XdC-1还去除了碳分解代谢物阻遏因子CRE1的结合位点，推测具有一定的抗阻遏能力。对启动子突变体Pc_IR-DI_Z-IR和Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株在以1％纤维素和1％葡萄糖为碳源的培养基发酵12h、24h、48h、72h、96h的β-甘露聚糖酶活力进行了测定。如图4所示，在葡萄糖-纤维素培养基中，启动子突变体Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达的菌株PXdC1在各时间点的β-甘露聚糖酶产量均显著高于Pc_IR-DI_Z-IR驱动表达的菌株PIR，表明Pcbh1XdC-1启动子的确具有一定的抗阻遏能力，驱动基因表达的效果更好。
实施例5使用启动子突变体驱动β-甘露聚糖酶表达，并且过表达XYR1突变体的菌株的构建
使用实施例2构建的使用启动子Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达的表达盒，以菌株PX3为出发菌株进行原生质体转化。同实施例3，在制备得到PX3菌株的原生质体后，通过原生质体的转化、转化子的分离纯化、基因组提取后同样使用引物pyr4-UF(P19)和Man-yz-R(#)验证得到将表达盒单拷贝定点插入到pyr4位点的正确转化子，最后将其孢子涂布到PDA培养基上，恒温培养箱中培养生孢。将所获得的使用启动子Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达，并且过表达XYR1突变体的菌株命名为PXdC1X。
实施例6使用突变体驱动β-甘露聚糖酶表达，并且过表达XYR1突变体菌株产酶能力的测定
按照实施例4所描述的发酵方法和β-甘露聚糖酶酶活测定方法，测定了实施例5中构建的使用启动子突变体Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达，并且过表达XYR1突变体的菌株PXdC1X的β-甘露聚糖酶产量。如图5所示，在实施例4所描述的纤维素培养基中，PXdC1X菌株发酵96h时，发酵液中β-甘露聚糖酶活力为447.12U/mL，比未过表达XYR1突变体的菌株PXdC1高出63％。
进一步考察了以葡萄糖为唯一碳源的培养基中PXdC1X菌株的产量。使用基本培养基作为种子培养基，发酵方法与实施例4中的描述相同，发酵培养基的组分为(/L)：葡萄糖20g、CaCl21 g、MgSO4·7H2O 0.6g、KH2PO45 g、(NH4)2SO45 g、酵母粉20g，115℃灭菌30min。如图6所示，PXdC1X菌株在葡萄糖培养基发酵72h时β-甘露聚糖酶酶活为184.11U/mL，而未过表达XYR1突变体的菌株PXdC1的产量仅为3.39U/mL。
以上结果说明，使用启动子突变体Pcbh1XdC-1驱动β-甘露聚糖酶表达，并且过表达XYR1突变体可以实现β-甘露聚糖酶在里氏木霉中的高效表达。不仅纤维素培养基中β-甘露聚糖酶产量相对于使用未改造启动子Pcbh1时大幅提升，在葡萄糖为唯一碳源的培养基中也可获得较高水平的β-甘露聚糖酶产量。使用葡萄糖为碳源进行发酵，有利于降低培养基原料成本，以及进一步通过流加补料等方法继续提高酶的产量。以上在里氏木霉中提高β-甘露聚糖酶产量的方法也可推广至其他工业酶、医药蛋白等蛋白质的重组表达生产。
未改造的Pcbh1启动子核苷酸序列(SEQ ID No.1)：
CCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATC。
改造后的Pcbh1XdC-1启动子核苷酸序列(SEQ ID No.2)：
CCAATGGCTAAATGCGACATCTTAGCCTAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTATTTAGCCAACGGCTTGGCTAATTCCAACATCTTAGCCGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGGCTAAGAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATC。
改造后的Pcbh1XdC-2启动子核苷酸序列(SEQ ID No.3)：
CCAATGGCTAAATGCGACATCTTAGCCTAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTATTTAGCCAACGGCTTGGCTAATTCCAACATCTTAGCCGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGGCTAAGAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCGGCTAAATGCGACATCTTAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCTAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATC。
草酸青霉β-甘露聚糖酶基因man5A的核苷酸序列(SEQ ID No.4)：
ATGTTGTACTCATCGGCGATCTTGCTGTTGGCCGGGCTGGCATCAGCTCAGGTGGCGGAATATGGCCAGTGTGGCGGAAAAGGATGGTCGGGCAGCACAACGTGCCAGTCTCCATACACCTGTCAATACCAGAATGACTGGTACAGTCAATGCTTGCCAGGTATGTTGTGTCTTGCCATGAAGAAACACAGATGATGCCCAGTACCACTGACCCGTTGCGGTCCGATAGGAACAGGATCGGGTGGCGCGACAACCACCACCACGACCACCACCACCGCCAAGACAACGGTGACCACCACATCGGTCAAGTCGACAACGACTGCGCCAACCAAGACGACGACAACCACCTCGGGTCCGATATCAACCTCCACCGGCTTCGCTCACACCAACGGTCTCAACTTCACCATCGATGGCGAGACGAGCTACTTTGCCGGATCCAACTCGTACTGGATTGGCTTCCTGACCAACAATGCCGACGTCGACTTGGTCATGCAACACCTGAGCTCCTCGGGGCTGCGCATTCTGCGCGTCTGGGGATTCAACGATGTCAACACGATCCCCTCCGCCGGCACCGTCTGGTTCCAGCATCTTGCGGGCGGCAGCGCCACCATCAACACCGGTGCCGATGGCCTGCAGCGTCTTGATTATGTCGTCTCCTCGGCCGAGAAACACGGCATCAAGCTCATCATCAACTTTGTGAACAATTGGTCCGATTACGGTGGTATTAACGCGTACGTCAACGCTTTTGGCGGCAGTGCGACCACCTGGTACACCAACACCGCGGCGCAGACCGCCTACAAAAACTACATCAAGGCTGTGGTTTCGCGGTACATCTCATCTCCGGCCGTCTTTGCGTGGGAGTTGGCCAATGAGCCTCGCTGCAAGGGCTGCGACACCTCCGTCATCTATGACTGGGTCAAGGCGACTAGCCAATATATCAAATCACTCGACCCGAAGCACATGGTCACCATTGGCGATGGTAAGTTCAACTCGCGTCCGACTGAAGAAACCCCAGAGAGAATGCTCTGCCAGCTCTTTTGCTTCCAGTCTACATAATCTGGAAATTTCCACTGACGATCCTTTTCCTGCTCTTTGACAGAGGGATTCGGCCTGACGACCGAGTCTGACGGAAGCTACCCCTTCAGCTTCTCCGAGGGACTGGACTTTTCCAAGAACCTAGGCATCAGTACCATTGACTTTGGAACTTTCCATCTGTACCCATCGAGCTGTGAGTAATAACTGTTTTTTGATCATCATTTGACTTCAGTCTCCCCATCTCACAACGGCTGGGAGTTGTGACTAATCTCTTTTTGTTTCAATTCTCCAACAGGGGGCACAAGCAGTGACTGGGGCAATCTCTGGGTCAAAGCCCACGGGGACGCCTGTGCTGCGGCGGGTAAGCCCTGCTTGTTTGAGGAGTATGGCTACCCTTCCGACCACTGCACCATCGAGGCGGCCTGGCAGAAGACGGCCCTTAACACCAAGGGTGTCGCTGCTGATCTGTACTGGCAGTACGGAGATACCCTGAGTTACGGTCAAACTTCAGACGATGGATACACGATTTACTACGGATCCAGTGACTTTACCTGCCTGGTGACGAATCATGTCGCTGCGATCTGA。
转录激活因子XYR1的突变体XYR1A824V的氨基酸序列(SEQ ID No.5)：
MLSNPLRRYSAYPDISSASFDPNYHGSQSHLHSINVNTFGNSHPYPMQHLAQHAELSSSRMIRASPVQPKQRQGSLIAARKNSTGTAGPIRRRISRACDQCNQLRTKCDGLHPCAHCIEFGLGCEYVRERKKRGKASRKDIAAQQAAAAAAQHSGQVQDGPEDQHRKLSRQQSESSRGSAELAQPAHDPPHGHIEGSVSSFSDNGLSQHAAMGGMDGLEDHHGHVGVDPALGRTQLEASSAMGLGAYGEVHPGYESPGMNGHVMVPPSYGAQTTMAGYSGISYAAQAPSPATYSSDGNFRLTGHIHDYPLANGSSPSWGVSLASPSNQFQLQLSQPIFKQSDLRYPVLEPLLPHLGNILPVSLACDLIDLYFSSSSSAQMHPMSPYVLGFVFRKRSFLHPTNPRRCQPALLASMLWVAAQTSEASFLTSLPSARSKVCQKLLELTVGLLQPLIHTGTNSPSPKTSPVVGAAALGVLGVAMPGSLNMDSLAGETGAFGAIGSLDDVITYVHLATVVSASEYKGASLRWWGAAWSLARELKLGRELPPGNPPANQEDGEGLSEDVDEHDLNRNNTRFVTEEEREERRRAWWLVYIVDRHLALCYNRPLFLLDSECSDLYHPMDDIKWQAGKFRSHDAGNSSINIDSSMTDEFGDSPRAARGAHYECRGRSIFGYFLSLMTILGEIVDVHHAKSHPRFGVGFRSARDWDEQVAEITRHLDMYEESLKRFVAKHLPLSSKDKEQHEMHDSGAVTDMQSPLSVRTNASSRMTESEIQASIVVAYSTHVMHVLHILLADKWDPINLLDDDDLWISSEGFVTATSHAVSAVEAISQILEFDPGLEFMPFFYGVYLLQGSFLLLLIADKLQAEASPSVIKACETIVRAHEACVVTLSTEYQRNFSKVMRSALALIRGRVPEDLAEQQQRRRELLALYRWTGNGTGLAL。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 山东大学
<120> 一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体及其构建方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 829
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccaatggcta aaagtacata agttaatgcc taaagaagtc atataccagc ggctaataat 60
tgtacaatca agtggctaaa cgtaccgtaa tttgccaacg gcttgtgggg ttgcagaagc 120
aacggcaaag ccccacttcc ccacgtttgt ttcttcactc agtccaatct cagctggtga 180
tcccccaatt gggtcgcttg tttgttccgg tgaagtgaaa gaagacagag gtaagaatgt 240
ctgactcgga gcgttttgca tacaaccaag ggcagtgatg gaagacagtg aaatgttgac 300
attcaaggag tatttagcca gggatgcttg agtgtatcgt gtaaggaggt ttgtctgccg 360
atacgacgaa tactgtatag tcacttctga tgaagtggtc catattgaaa tgtaagtcgg 420
cactgaacag gcaaaagatt gagttgaaac tgcctaagat ctcgggccct cgggccttcg 480
gcctttgggt gtacatgttt gtgctccggg caaatgcaaa gtgtggtagg atcgaacaca 540
ctgctgcctt taccaagcag ctgagggtat gtgataggca aatgttcagg ggccactgca 600
tggtttcgaa tagaaagaga agcttagcca agaacaatag ccgataaaga tagcctcatt 660
aaacggaatg agctagtagg caaagtcagc gaatgtgtat atataaaggt tcgaggtccg 720
tgcctccctc atgctctccc catctactca tcaactcaga tcctccagga gacttgtaca 780
ccatcttttg aggcacagaa acccaatagt caaccgcgga ctgcgcatc 829
<210> 2
<211> 782
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaatggcta aatgcgacat cttagcctaa ttgtacaatc aagtggctaa acgtaccgta 60
tttagccaac ggcttggcta attccaacat cttagccgtt tgtttcttca ctcagtccaa 120
tctcagctgg tgatccccca attgggtcgc ttgtttgttc cggtgaagtg aaagaagaca 180
gaggtaagaa tgtctgactc ggagcgtttt gcatacaacc aagggcagtg atggaagaca 240
gtgaaatgtt ggctaagaag gagtatttag ccagggatgc ttgagtgtat cgtgtaagga 300
ggtttgtctg ccgatacgac gaatactgta tagtcacttc tgatgaagtg gtccatattg 360
aaatgtaagt cggcactgaa caggcaaaag attgagttga aactgcctaa gatctcgggc 420
cctcgggcct tcggcctttg ggtgtacatg tttgtgctcc gggcaaatgc aaagtgtggt 480
aggatcgaac acactgctgc ctttaccaag cagctgaggg tatgtgatag gcaaatgttc 540
aggggccact gcatggtttc gaatagaaag agaagcttag ccaagaacaa tagccgataa 600
agatagcctc attaaacgga atgagctagt aggcaaagtc agcgaatgtg tatatataaa 660
ggttcgaggt ccgtgcctcc ctcatgctct ccccatctac tcatcaactc agatcctcca 720
ggagacttgt acaccatctt ttgaggcaca gaaacccaat agtcaaccgc ggactgcgca 780
tc 782
<210> 3
<211> 772
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaatggcta aatgcgacat cttagcctaa ttgtacaatc aagtggctaa acgtaccgta 60
tttagccaac ggcttggcta attccaacat cttagccgtt tgtttcttca ctcagtccaa 120
tctcagctgg tgatccccca attgggtcgc ttgtttgttc cggtgaagtg aaagaagaca 180
gaggtaagaa tgtctgactc ggagcgtttt gcatacaacc aagggcagtg atggaagaca 240
gtgaaatgtt ggctaagaag gagtatttag ccagggatgc ttgagtgtat cgtgtaagga 300
ggtttgtctg ccgatacgac gaatactgta tagtcacttc tgatgaagtg gtccatattg 360
aaatgtaagt cggcactgaa caggcaaaag attgagttga aactgcctaa gatctcgggc 420
cctcgggcct tcggcctttg ggtgtacatg tttgtgctcc gggcaaatgc aaagtgtggt 480
aggatcgaac acactgctgc ctttaccaag cagctgaggg tatgtgatag gcaaatgttc 540
aggggccact gcatggtttc gaatagaaag agaagcggct aaatgcgaca tcttagcctc 600
attaaacgga atgagctagt aggctaagtc agcgaatgtg tatatataaa ggttcgaggt 660
ccgtgcctcc ctcatgctct ccccatctac tcatcaactc agatcctcca ggagacttgt 720
acaccatctt ttgaggcaca gaaacccaat agtcaaccgc ggactgcgca tc 772
<210> 4
<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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tatggccagt gtggcggaaa aggatggtcg ggcagcacaa cgtgccagtc tccatacacc 120
tgtcaatacc agaatgactg gtacagtcaa tgcttgccag gtatgttgtg tcttgccatg 180
aagaaacaca gatgatgccc agtaccactg acccgttgcg gtccgatagg aacaggatcg 240
ggtggcgcga caaccaccac cacgaccacc accaccgcca agacaacggt gaccaccaca 300
tcggtcaagt cgacaacgac tgcgccaacc aagacgacga caaccacctc gggtccgata 360
tcaacctcca ccggcttcgc tcacaccaac ggtctcaact tcaccatcga tggcgagacg 420
agctactttg ccggatccaa ctcgtactgg attggcttcc tgaccaacaa tgccgacgtc 480
gacttggtca tgcaacacct gagctcctcg gggctgcgca ttctgcgcgt ctggggattc 540
aacgatgtca acacgatccc ctccgccggc accgtctggt tccagcatct tgcgggcggc 600
agcgccacca tcaacaccgg tgccgatggc ctgcagcgtc ttgattatgt cgtctcctcg 660
gccgagaaac acggcatcaa gctcatcatc aactttgtga acaattggtc cgattacggt 720
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gcggcgcaga ccgcctacaa aaactacatc aaggctgtgg tttcgcggta catctcatct 840
ccggccgtct ttgcgtggga gttggccaat gagcctcgct gcaagggctg cgacacctcc 900
gtcatctatg actgggtcaa ggcgactagc caatatatca aatcactcga cccgaagcac 960
atggtcacca ttggcgatgg taagttcaac tcgcgtccga ctgaagaaac cccagagaga 1020
atgctctgcc agctcttttg cttccagtct acataatctg gaaatttcca ctgacgatcc 1080
ttttcctgct ctttgacaga gggattcggc ctgacgaccg agtctgacgg aagctacccc 1140
ttcagcttct ccgagggact ggacttttcc aagaacctag gcatcagtac cattgacttt 1200
ggaactttcc atctgtaccc atcgagctgt gagtaataac tgttttttga tcatcatttg 1260
acttcagtct ccccatctca caacggctgg gagttgtgac taatctcttt ttgtttcaat 1320
tctccaacag ggggcacaag cagtgactgg ggcaatctct gggtcaaagc ccacggggac 1380
gcctgtgctg cggcgggtaa gccctgcttg tttgaggagt atggctaccc ttccgaccac 1440
tgcaccatcg aggcggcctg gcagaagacg gcccttaaca ccaagggtgt cgctgctgat 1500
ctgtactggc agtacggaga taccctgagt tacggtcaaa cttcagacga tggatacacg 1560
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<210> 5
<211> 940
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Leu Ser Asn Pro Leu Arg Arg Tyr Ser Ala Tyr Pro Asp Ile Ser
1 5 10 15
Ser Ala Ser Phe Asp Pro Asn Tyr His Gly Ser Gln Ser His Leu His
20 25 30
Ser Ile Asn Val Asn Thr Phe Gly Asn Ser His Pro Tyr Pro Met Gln
35 40 45
His Leu Ala Gln His Ala Glu Leu Ser Ser Ser Arg Met Ile Arg Ala
50 55 60
Ser Pro Val Gln Pro Lys Gln Arg Gln Gly Ser Leu Ile Ala Ala Arg
65 70 75 80
Lys Asn Ser Thr Gly Thr Ala Gly Pro Ile Arg Arg Arg Ile Ser Arg
85 90 95
Ala Cys Asp Gln Cys Asn Gln Leu Arg Thr Lys Cys Asp Gly Leu His
100 105 110
Pro Cys Ala His Cys Ile Glu Phe Gly Leu Gly Cys Glu Tyr Val Arg
115 120 125
Glu Arg Lys Lys Arg Gly Lys Ala Ser Arg Lys Asp Ile Ala Ala Gln
130 135 140
Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln His Ser Gly Gln Val Gln Asp Gly
145 150 155 160
Pro Glu Asp Gln His Arg Lys Leu Ser Arg Gln Gln Ser Glu Ser Ser
165 170 175
Arg Gly Ser Ala Glu Leu Ala Gln Pro Ala His Asp Pro Pro His Gly
180 185 190
His Ile Glu Gly Ser Val Ser Ser Phe Ser Asp Asn Gly Leu Ser Gln
195 200 205
His Ala Ala Met Gly Gly Met Asp Gly Leu Glu Asp His His Gly His
210 215 220
Val Gly Val Asp Pro Ala Leu Gly Arg Thr Gln Leu Glu Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ala Met Gly Leu Gly Ala Tyr Gly Glu Val His Pro Gly Tyr Glu Ser
245 250 255
Pro Gly Met Asn Gly His Val Met Val Pro Pro Ser Tyr Gly Ala Gln
260 265 270
Thr Thr Met Ala Gly Tyr Ser Gly Ile Ser Tyr Ala Ala Gln Ala Pro
275 280 285
Ser Pro Ala Thr Tyr Ser Ser Asp Gly Asn Phe Arg Leu Thr Gly His
290 295 300
Ile His Asp Tyr Pro Leu Ala Asn Gly Ser Ser Pro Ser Trp Gly Val
305 310 315 320
Ser Leu Ala Ser Pro Ser Asn Gln Phe Gln Leu Gln Leu Ser Gln Pro
325 330 335
Ile Phe Lys Gln Ser Asp Leu Arg Tyr Pro Val Leu Glu Pro Leu Leu
340 345 350
Pro His Leu Gly Asn Ile Leu Pro Val Ser Leu Ala Cys Asp Leu Ile
355 360 365
Asp Leu Tyr Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ala Gln Met His Pro Met Ser
370 375 380
Pro Tyr Val Leu Gly Phe Val Phe Arg Lys Arg Ser Phe Leu His Pro
385 390 395 400
Thr Asn Pro Arg Arg Cys Gln Pro Ala Leu Leu Ala Ser Met Leu Trp
405 410 415
Val Ala Ala Gln Thr Ser Glu Ala Ser Phe Leu Thr Ser Leu Pro Ser
420 425 430
Ala Arg Ser Lys Val Cys Gln Lys Leu Leu Glu Leu Thr Val Gly Leu
435 440 445
Leu Gln Pro Leu Ile His Thr Gly Thr Asn Ser Pro Ser Pro Lys Thr
450 455 460
Ser Pro Val Val Gly Ala Ala Ala Leu Gly Val Leu Gly Val Ala Met
465 470 475 480
Pro Gly Ser Leu Asn Met Asp Ser Leu Ala Gly Glu Thr Gly Ala Phe
485 490 495
Gly Ala Ile Gly Ser Leu Asp Asp Val Ile Thr Tyr Val His Leu Ala
500 505 510
Thr Val Val Ser Ala Ser Glu Tyr Lys Gly Ala Ser Leu Arg Trp Trp
515 520 525
Gly Ala Ala Trp Ser Leu Ala Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Glu Leu
530 535 540
Pro Pro Gly Asn Pro Pro Ala Asn Gln Glu Asp Gly Glu Gly Leu Ser
545 550 555 560
Glu Asp Val Asp Glu His Asp Leu Asn Arg Asn Asn Thr Arg Phe Val
565 570 575
Thr Glu Glu Glu Arg Glu Glu Arg Arg Arg Ala Trp Trp Leu Val Tyr
580 585 590
Ile Val Asp Arg His Leu Ala Leu Cys Tyr Asn Arg Pro Leu Phe Leu
595 600 605
Leu Asp Ser Glu Cys Ser Asp Leu Tyr His Pro Met Asp Asp Ile Lys
610 615 620
Trp Gln Ala Gly Lys Phe Arg Ser His Asp Ala Gly Asn Ser Ser Ile
625 630 635 640
Asn Ile Asp Ser Ser Met Thr Asp Glu Phe Gly Asp Ser Pro Arg Ala
645 650 655
Ala Arg Gly Ala His Tyr Glu Cys Arg Gly Arg Ser Ile Phe Gly Tyr
660 665 670
Phe Leu Ser Leu Met Thr Ile Leu Gly Glu Ile Val Asp Val His His
675 680 685
Ala Lys Ser His Pro Arg Phe Gly Val Gly Phe Arg Ser Ala Arg Asp
690 695 700
Trp Asp Glu Gln Val Ala Glu Ile Thr Arg His Leu Asp Met Tyr Glu
705 710 715 720
Glu Ser Leu Lys Arg Phe Val Ala Lys His Leu Pro Leu Ser Ser Lys
725 730 735
Asp Lys Glu Gln His Glu Met His Asp Ser Gly Ala Val Thr Asp Met
740 745 750
Gln Ser Pro Leu Ser Val Arg Thr Asn Ala Ser Ser Arg Met Thr Glu
755 760 765
Ser Glu Ile Gln Ala Ser Ile Val Val Ala Tyr Ser Thr His Val Met
770 775 780
His Val Leu His Ile Leu Leu Ala Asp Lys Trp Asp Pro Ile Asn Leu
785 790 795 800
Leu Asp Asp Asp Asp Leu Trp Ile Ser Ser Glu Gly Phe Val Thr Ala
805 810 815
Thr Ser His Ala Val Ser Ala Val Glu Ala Ile Ser Gln Ile Leu Glu
820 825 830
Phe Asp Pro Gly Leu Glu Phe Met Pro Phe Phe Tyr Gly Val Tyr Leu
835 840 845
Leu Gln Gly Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ile Ala Asp Lys Leu Gln Ala
850 855 860
Glu Ala Ser Pro Ser Val Ile Lys Ala Cys Glu Thr Ile Val Arg Ala
865 870 875 880
His Glu Ala Cys Val Val Thr Leu Ser Thr Glu Tyr Gln Arg Asn Phe
885 890 895
Ser Lys Val Met Arg Ser Ala Leu Ala Leu Ile Arg Gly Arg Val Pro
900 905 910
Glu Asp Leu Ala Glu Gln Gln Gln Arg Arg Arg Glu Leu Leu Ala Leu
915 920 925
Tyr Arg Trp Thr Gly Asn Gly Thr Gly Leu Ala Leu
930 935 940
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actaccctct ccacgtgcca atggctaaat gcgacatctt agc 43
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtttcaact caatcttttg cctgttcagt gccgacttac a 41
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtcggcact gaacaggcaa aagattgagt tgaaactgcc 40
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcattacta ccctctccca atggctaaaa gtacata 37
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccgatgagt acaacatgat gcgcagtccg cggttg 36
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcattacta ccctctccca atggctaaat gcgacatc 38
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgccctcta cgctgaaaat ag 22
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagctgatgc cagcccggcc aaca 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttctacacag ccatcggtcc aga 23

Claims (9)

1.一种里氏木霉cbh1基因启动子突变体，其特征在于，所述启动子突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种如权利要求1所述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将里氏木霉cbh1启动子核苷酸序列的-824bp至-774bpGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAA替换为GGCTAAATGCGACATCTTAGCC；将核苷酸序列的-737bp的T替换为A；将核苷酸序列的-725bp至-686bp GTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCAC替换为GGCTAATTCCAACATCTTAGCC；将核苷酸序列的-532bp至-526bpGACATTC替换为GGCTAAG，设计合成所述里氏木霉cbh1基因启动子突变体。
3.如权利要求1所述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体在构建β-甘露聚糖酶表达菌株中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌株为里氏木霉菌株。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶为草酸青霉β-甘露聚糖酶。
6.一种基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒含有权利要求1所述的启动子突变体。
7.里氏木霉重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求6所述的基因表达盒。
8.一种如权利要求7所述的里氏木霉重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的里氏木霉cbh1基因启动子突变体连接到载体质粒中，构建基因表达盒；
(2)制备得到出发菌株的原生质体；
(3)向所述原生质体中加入步骤(1)构建的基因表达盒进行转化，分离纯化，再经验证得到正确的转化子；
(4)将正确的转化子接种到培养基上，培养得到所述重组菌株。
9.如权利要求7所述的里氏木霉重组菌株在生产β-甘露聚糖酶中的应用。
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