CN114752507A - 拟康宁木霉smf2在防治植物细菌性病害中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及拟康宁木霉SMF2在防治植物细菌性病害中的应用。所述拟康宁木霉SMF2的保藏编号为CCTCC NO:M209031。本发明还提供了拟康宁木霉SMF2的次级代谢产物康宁霉素在防治植物细菌性病害中的应用，以及康宁霉素的制备方法。本发明公开的拟康宁木霉SMF2是一种重要的生防木霉，能高效合成次级代谢产物康宁霉素，康宁霉素对多种病原真菌和革兰氏阳性病原细菌具有显著的拮抗作用，可以有效防治由细菌引起的植物病害。特别是可有效抑制稻黄单胞菌稻致病变种和稻黄单胞菌稻生致病变种的生长，对其引起的水稻白叶枯病害和水稻细菌性条斑病害都具有显著的防治效果。

Description

拟康宁木霉SMF2在防治植物细菌性病害中的应用
技术领域
本发明涉及拟康宁木霉SMF2在防治植物细菌性病害中的应用，属于植物病害生物防治技术领域。
背景技术
植物细菌性病害是农作物优质高产的重要制约因素之一，每年造成直接经济损失高达数千亿美元。化学农药防治和作物育种是防治植物细菌性病害的重要手段，但由于化学农药所带来的环境污染和作物育种周期长等特点的限制，使得环境友好型生物防治技术的建立成为研究的焦点。微生物生物防治技术具有高效、无污染且土壤定值能力强等特点，符合农业可持续发展的要求，已逐渐成为植物细菌性病害防治的重要手段。目前，应用较多的生防菌株以假单胞菌、芽孢杆菌和放线菌等生防细菌为主，主要是通过分泌抗生性次级代谢产物达到有效防治植物细菌性病害的目的，如卡那霉素B(carbazomycin B)和星形孢菌素(staurosporine)等。但生防真菌在防治植物细菌性病害中的应用报道相对较少，急需建立植物细菌性病害生物防治新策略。
水稻作为三大主要粮食作物之一，在全球100多个国家被广泛种植，年产量在75亿吨左右。但是，水稻种植区病虫害的爆发导致水稻减产，严重威胁全球的粮食安全与经济发展。其中，稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)引起的水稻白叶枯病害和水稻细菌性条斑病害是两种最重要的水稻细菌性病害，也是全球重要的检疫性病害，在亚洲、非洲、澳大利亚以及拉丁美洲等水稻种植区广为流行，每年造成水稻减产25～30％，严重时50～60％，甚至绝产，严重威胁粮食安全和经济发展。Xoo和Xoc都是薄壁菌门、假单胞细菌目、黄单胞属革兰氏阴性细菌，极生鞭毛有助于游动，主要以单体形式存在，形态为杆状、两端近圆形，长度为0.7μm～2.0μm，宽度为0.4μm～0.7μm。Xoo与Xoc都能通过gum基因簇调控胞外多糖的生物合成并促进生物膜的形成，进而使其黏附于水稻叶片的表面。然后通过不同方式侵入水稻叶片(Xoo主要通过水孔或伤口，而Xoc主要通过气孔或伤口)，分泌多种细胞壁降解酶破坏水稻叶片的细胞壁结构，如纤维素酶或果胶酶等，便于其进入水稻表皮细胞或细胞间隙，从而获取水稻体内的营养物质并进行繁殖。此外，通过hrp基因簇编码的III型分泌系统将各种致病效应蛋白分泌到水稻细胞中以克服水稻所产生的免疫反应。最终，造成水稻叶片萎蔫、卷曲、坏死等症状，严重的会造成整个水稻叶片呈现枯黄状态甚至导致整株死亡。
水稻白叶枯病害和水稻细菌性条斑病害难以防治，一方面由于病原菌主要定殖于水稻叶片内部，而杀菌剂主要是叶面喷施难以进入叶片内部直接作用于病原菌；另一方面由于病原菌具有鞭毛能及时通过游动躲避不利于的环境并趋向有利的环境，同时，病原菌产生的胞外多糖、生物膜等包裹于病原菌表面起到自我保护作用，有效阻断杀菌剂与病原菌的直接接触并避免外界不利环境因素造成损伤。
木霉是一类典型的生防真菌，广泛存在于土壤、根际、叶际或腐烂的木材等生态环境中，但不是所有木霉都具有生防潜力。现在被广泛研究和应用的木霉主要包括哈茨木霉、绿色木霉和康宁木霉等，主要通过竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导植物抗性作用等方式有效防治植物病害。其中，依赖于细胞壁降解酶类(CWDEs)的重寄生作用是木霉抑制病原真菌生长的主要作用机制，如纤维素酶、几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶等。此外，抗生作用也是木霉发挥其生防作用的重要机制之一，可通过产生蒽醌、吡喃酮、koninginins、peptaibols、heptelidic acid和viridins等抗生性次级代谢产物有效抑制立枯丝核菌、灰葡萄孢和大丽轮枝菌等11种病原真菌的生长。但是，在现有的生物防治新策略中木霉主要被用于防治植物真菌病害，尤其缺少防治植物细菌病害的应用。
发明内容
本发明针对现有植物细菌性病害生物防治的不足，提供一种拟康宁木霉SMF2在防治植物细菌性病害中的应用。可用于农业生产，特别是能够有效降低水稻白叶枯病害和水稻细菌性条斑病害的危害。
拟康宁木霉SMF2在防治植物细菌性病害中的应用，所述拟康宁木霉SMF2的保藏编号为CCTCC NO:M209031。
根据本发明优选的，所述植物细菌性病害为由黄单胞菌引起的植物细菌性病害。
进一步优选的，所述植物为水稻，所述植物细菌性病害为水稻白叶枯病或水稻细菌性条斑病。
本发明还提供了拟康宁木霉SMF2在制备防治植物细菌性病害菌剂中的应用，所述拟康宁木霉SMF2的保藏编号为CCTCC NO:M209031。
本发明还提供一种防治植物细菌性病害的菌剂，所述菌剂包括保藏编号为CCTCCNO:M209031的拟康宁木霉SMF2。
进一步优选的，所述菌剂包括保藏编号为CCTCC NO:M209031拟康宁木霉SMF2的次级代谢产物康宁霉素。
根据本发明优选的，所述拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素的制备方法，包括步骤如下：
(1)将拟康宁木霉SMF2在PDA固体培养基上进行活化；
(2)将活化后的拟康宁木霉SMF2转接至PDA液体培养基中进行种子培养，得到种子培养液；
(3)从种子液中提取得到代谢产物粗提物，再将代谢产物粗提物分离和纯化后，得到拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述PDA固体培养基的组分如下：马铃薯200份，葡萄糖20份，离子水1000份，琼脂糖1.5重量份，均为重量份；
所述活化的条件为25～30℃培养45～50h。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述PDA液体培养基的组分如下：马铃薯200份，葡萄糖20份，离子水1000份，均为重量份；
所述种子培养的条件为25～30℃，150～200rpm振荡培养8～15天。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述提取的具体方法为：
利用直径为0.5cm的圆形打孔器，取拟康宁木霉SMF2菌株的菌丝边缘部位，转接至含有PDA液体培养基的锥形瓶中，在28℃、180rpm振荡培养12天，然后经擦镜纸过滤，去除菌丝，留滤液；将滤液在10000rpm下，离心10min，取离心后的上清液，添加到SPE C18吸附柱内，静置过滤，向SPE C18吸附柱内添加2mL甲醇溶液，溶解被吸附的物质，最后经0.22μm有机滤膜过滤，得到代谢产物粗提物。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述纯化的具体方法为：通过高效液相色谱进行分离和纯化，流动相为甲醇：水＝84：16(V:V)，流速1mL/min，取峰时间为14～29min。
根据本发明优选的，所述应用为将拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素配置成25～35μg/mL的溶液后，根部灌施2～3天。
本发明未详尽之处，均可采用现有技术。
有益效果
1、本发明公开的拟康宁木霉SMF2是一种重要的生防木霉，能高效合成次级代谢产物康宁霉素，康宁霉素对多种病原真菌和革兰氏阳性病原细菌具有显著的拮抗作用，可以有效防治由细菌引起的植物病害。特别是可有效抑制稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonasoryzae pv.oryzae，Xoo)和稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola，Xoc)的生长，对其引起的水稻白叶枯病害和水稻细菌性条斑病害都具有显著的防治效果。
2、本发明所述的拟康宁木霉SMF2和应用方法，能够减少农药的用量，降低农产品中农药的残留，符合目前对无公害农产品生产的迫切需求。
附图说明：
图1是NB固体培养基条件下，拟康宁木霉SMF2对稻黄单胞菌稻致病变种和稻黄单胞菌稻生致病变种的拮抗活性检测；
图中：WT为拟康宁木霉SMF2野生型菌株，Xoo为稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)，Xoc:为稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonasoryzae pv.oryzicola,Xoc)。
图2是NB液体培养基条件下，拟康宁木霉SMF2对稻黄单胞菌稻致病变种和稻黄单胞菌稻生致病变种的拮抗活性检测；
图中：WT为拟康宁木霉SMF2野生型菌株，Xoo为稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)，Xoc:为稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonasoryzae pv.oryzicola,Xoc)。
图3是拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素的提取与分析。
图4是拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素抑制稻黄单胞菌稻致病变种和稻黄单胞菌稻生致病变种的生长的最小浓度测定；
图中：A为康宁霉素对Xoo的最小抑制浓度MIC，B为康宁霉素对Xoc的最小抑制浓度MIC，CK-为不含康宁霉素的甲醇阴性对照。
图5是拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素最小抑制浓度条件下，透射电镜对稻黄单胞菌稻致病变种和稻黄单胞菌稻生致病变种的细胞形态观察；
图中，A为Xoo细胞形态，B为Xoc细胞形态，1为不添加康宁霉素和甲醇，2为添加1×MIC的康宁霉素，3为不添加康宁霉素的甲醇阴性对照。
图6是拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素最小抑制浓度条件下，防治水稻白叶枯病害和水稻细菌性条斑病害的效果评估。
图中：A为康宁霉素防治水稻白叶枯病害，B为康宁霉素防治水稻细菌性条斑病害，CK为不添加康宁霉素和甲醇，CK-为不添加康宁霉素的甲醇阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中所述拟康宁木霉SMF2菌株，2009年2月24日保藏于中国典型微生物培养中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号为CCTCC NO:M209031。已经在中国专利文献CN102071148A中公开。
实施例1拟康宁木霉SMF2的培养
拟康宁木霉SMF2菌株的培养方法，具体步骤如下：
(1)将菌种保藏号为CCTCC NO:M209031的拟康宁木霉SMF2菌株接种于PDA固体培养基上，在28℃培养48h，得到活化后的拟康宁木霉SMF2；
(2)将活化后的拟康宁木霉SMF2转接至PDA液体培养基中，在28℃、180rpm下培养12天，得到拟康宁木霉SMF2种子培养液。
所述PDA固体培养基的组分如下：马铃薯200份，葡萄糖20份，离子水1000份，琼脂糖1.5重量份，均为重量份。所述PDA液体培养基的组分如下：马铃薯200份，葡萄糖20份，离子水1000份，均为重量份。
实施例2拟康宁木霉SMF2抑制Xoo和Xoc生长
将实施例1中活化后的拟康宁木霉SMF2分别转接至含有Xoo的NB固体培养基和含有Xoc的NB固体培养基上(Xoo和Xoc的OD600均为0.01)，在28℃下静置培养6天，观察拟康宁木霉SMF2对Xoo或Xoc产生抑菌圈的情况，以仅含有Xoo或Xoc的NB固体培养基作为对照组，结果如图1所示。
将将实施例1中活化后的拟康宁木霉SMF2分别转接至含有Xoo的NB液体培养基和含有Xoc的NB固体培养基中(Xoo和Xoc的OD600均为0.01)，在28℃、180rpm下培养48h，测定Xoo或Xoc的细胞数量，以仅含有Xoo或Xoc的NB液体培养基作为对照组，结果如图2所示。
NB液体培养基的组分如下：牛肉浸膏3g，细菌蛋白胨5g，酵母提取物2g，蔗糖10g，加去离子水定容至1L，pH＝7.0，搅拌均匀并分装，121℃灭菌30min。
NB固体培养基的组分为在每100mL的NB液体培养基中额外添加1.5g琼脂。
由图1可知，与对照组相比，从第2天开始拟康宁木霉SMF2能对Xoo和Xoc产生明显的抑菌圈，表明拟康宁木霉SMF2能有效抑制Xoo和Xoc的生长。
由图2可知，与对照组相比，拟康宁木霉SMF2共培养条件下Xoo和Xoc的细胞数量在48h时显著减少，表明拟康宁木霉SMF2能有效抑制Xoo和Xoc的生长。
实施例3提取拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素
拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素的提取方法，具体如下：
a、液体提取方法
(1)将实施例1中的拟康宁木霉SMF2种子培养液经三层擦镜纸过滤，去除菌丝，留滤液；
(2)将滤液在10000rpm下离心10min，取上清液；
(3)取20mL离心后的上清液，添加到SPE C18吸附柱内，静置过滤；
(4)向SPE C18吸附柱内添加2mL甲醇溶液溶解被吸附的物质，最后将溶液经0.22μm有机滤膜过滤，得到代谢物粗提物，4℃保存备用。
b、固体提取法
(1)利用直径为0.5cm的圆形打孔器，取实施例1中活化后拟康宁木霉SMF2菌株的菌丝边缘部位，转接至含有1×107个Xoo的15mL NB固体培养基平板上，28℃，静置培养6天；
(2)将NB固体培养基浸泡于200mL无水乙醇中48h，三层擦镜纸过滤，去除固体培养基，留滤液；
(3)将了滤液在10000rpm下离心10min，取上清液，50℃烘干，2mL甲醇溶解，将溶液经0.22μm有机滤膜过滤，得到代谢物粗提物，4℃保存备用。
c、将步骤a或b得到的代谢物粗提物，通过高效液相色谱进行分离和纯化，流动相为甲醇：水＝84：16(V:V)，流速1mL/min，取峰时间为14～29min，得到拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素，结果如图3所示。
由图3可知，拟康宁木霉SMF2能高效合成康宁霉素。
实施例4康宁霉素抑制Xoo和Xoc生长
将实施例3中的康宁霉素配制成10mg/mL母液，然后稀释成浓度为52μg/mL、54μg/mL、56μg/mL、58μg/mL和60μg/mL的梯度溶液，分别添加至含有Xoo的NB液体培养基和含有Xoc的NB固体培养基中(Xoo和Xoc的OD600均为0.01)，同时以添加等量体积甲醇的含有Xoo的NB液体培养基和含有Xoc的NB固体培养基(Xoo和Xoc的OD600均为0.01)作为对照，在28℃、180rpm下培养30min，测定Xoo和Xoc的细菌数量，明确康宁霉素对Xoo和Xoc的最小抑制浓度MIC，结果如图4所示。
康宁霉素对Xoc的最小抑制浓度MIC是通过牛津杯法测定得到，对Xoo的最小抑制浓度MIC是通过每2h测定一次OD600值得到。
向含有Xoo的NB液体培养基和含有Xoc的NB液体培养基中(Xoo和Xoc的OD600均为0.01)分别加入1×MIC的康宁霉素，在28℃、180rpm下振荡培养4、8、12、24h，6000rpm离心5min，三蒸水清洗三次，取2μL洗净的菌悬液滴于铜网片1min，吸水纸吸干并用醋酸铀染色30s，通过透射电镜观察Xoo或Xoc的细胞形态，结果如图5所示。
由图4可知，康宁霉素对Xoo和Xoc的最小抑制浓度分别为54μg/mL和58μg/mL。而阴性对照组，同等体积的甲醇无法抑制Xoo和Xoc的生长，表明拟康宁木霉SMF2能通过分泌康宁霉素有效抑制Xoo和Xoc的生长。
由图5可知，在1×MIC的康宁霉素处理后Xoo和Xoc的细胞膜机构被破坏，而阴性对照组，同等体积的甲醇对Xoo和Xoc的细胞膜机构没有影响，表明拟康宁木霉SMF2分泌的康宁霉素主要通过作用于病原菌细胞膜并破坏其结构，导致病原菌因细胞内溶物外泄而死亡。
实施例5康宁霉素防治水稻白叶枯病害和水稻细菌性条斑病害
水稻白叶枯病害分析方法：水稻易感病品种WH26温室(白天16h，夜间8h，28℃，湿度70％)种植4周，按照0.5×MIC的康宁霉素根部灌施2天，剪叶接种OD600＝0.5的Xoo菌悬液，14天后统计病斑长度，不添加康宁霉素的水稻为对照组，结果如图6A所示。
水稻细菌性条斑病害分析方法：水稻易感病品种WH26温室(白天16h，夜间8h，28℃，湿度70％)种植4周，按照0.5×MIC的康宁霉素根部灌施2天，叶面注射OD600＝0.5的Xoc菌悬液，8天后统计病斑长度，不添加康宁霉素的水稻为对照组，结果如图6B所示。
由图6可知，对照组水稻白叶枯病害的病斑长度是21.95±0.99cm，根部灌施0.5×MIC的康宁霉素处理后水稻白叶枯病害的病斑度是3.31±0.53cm，阴性对照组甲醇处理后水稻白叶枯病害的病斑长度是21.05±1.23cm；同时，对照组水稻细菌性条斑病害的病斑长度是2.63±0.33cm，根部灌施0.5×MIC的康宁霉素处理后水稻白叶枯病害的病斑度是0.79±0.18cm，阴性对照组甲醇处理后水稻白叶枯病害的病斑长度是2.17±0.16cm，表明康宁霉素能有效抑制水稻白叶枯病害和水稻细菌性条斑病害。

Claims (10)

1.拟康宁木霉SMF2在防治植物细菌性病害中的应用，所述拟康宁木霉SMF2的保藏编号为CCTCC NO:M209031。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物细菌性病害为黄单胞菌引起的植物细菌性病害。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻，所述植物细菌性病害为水稻白叶枯病或水稻细菌性条斑病。
4.拟康宁木霉SMF2在制备防治植物细菌性病害菌剂中的应用，所述拟康宁木霉SMF2的保藏编号为CCTCC NO:M209031。
5.一种防治植物细菌性病害的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括保藏编号为CCTCC NO:M209031的拟康宁木霉SMF2。
6.如权利要求5所述的防治植物细菌性病害的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括保藏编号为CCTCC NO:M209031拟康宁木霉SMF2的次级代谢产物康宁霉素。
7.如权利要求6所述的防治植物细菌性病害的菌剂，其特征在于，所述拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素的制备方法，包括步骤如下：
(1)将权利要求1所述的拟康宁木霉SMF2在PDA固体培养基上进行活化；
(2)将活化后的拟康宁木霉SMF2转接至PDA液体培养基中进行种子培养，得到种子培养液；
(3)从种子液中提取得到代谢产物粗提物，再将代谢产物粗提物分离和纯化后，得到拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PDA固体培养基的组分如下：马铃薯200份，葡萄糖20份，离子水1000份，琼脂糖1.5重量份，均为重量份；
所述活化的条件为25～30℃培养45～50h；
步骤(2)中，所述PDA液体培养基的组分如下：马铃薯200份，葡萄糖20份，离子水1000份，均为重量份；
所述种子培养的条件为25～30℃，150～200rpm振荡培养8～15天。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述提取的具体方法为：
利用直径为0.5cm的圆形打孔器，取拟康宁木霉SMF2菌株的菌丝边缘部位，转接至含有PDA液体培养基的锥形瓶中，在28℃、180rpm振荡培养12天，然后经擦镜纸过滤，去除菌丝，留滤液；将滤液在10000rpm下，离心10min，取离心后的上清液，添加到SPE C18吸附柱内，静置过滤，向SPE C18吸附柱内添加2mL甲醇溶液，溶解被吸附的物质，最后经0.22μm有机滤膜过滤，得到代谢产物粗提物；
所述纯化的具体方法为：通过高效液相色谱进行分离和纯化，流动相为甲醇：水＝84：16(V:V)，流速1mL/min，取峰时间为14～29min。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为将拟康宁木霉SMF2次级代谢产物康宁霉素配置成25～35μg/mL的溶液后，根部灌施2～3天。
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