CN112592259A - 一类化合物、其合成基因簇及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一类化合物、其合成基因簇及应用。所述化合物包括前体化合物aspergildienes A‑D和二倍半萜化合物aspergilols A‑D，aspergilols A‑D具有抗肿瘤活性。通过基因组挖掘在曲霉属真菌094102中得到由萜类合成酶基因Au11189和细胞色素P450酶基因Au11188组成的生物合成基因簇SAC11189。使用米曲霉表达系统对基因簇中各个基因进行表达，得到4个结构新颖的二倍半萜化合物aspergilols A‑D。体外细胞毒活性测试结果表明aspergilols A‑D对多株肿瘤细胞表现出不同程度的抑制活性，为开发新颖的抗肿瘤药物提供了可能的候选化合物。

Description

一类化合物、其合成基因簇及应用
技术领域
本发明属于微生物药物领域，具体涉及一类化合物、其合成基因簇及应用。
背景技术
癌症对人类的生命健康造成了巨大威胁，根据国家癌症中心2019年的统计数据，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，且发病率和死亡率均呈现逐年上升态势，严峻的防控形势使新颖抗肿瘤药物的开发和研制变得更为紧迫。
天然产物是抗肿瘤药物的重要来源，约一半的抗肿瘤药物都直接或间接来源于天然产物，包括萜类、生物碱、多酚等(Newman,D.J,&Cragg,G.M.Natural products assources of new drugs from 1981to 2014.Journal of Natural Products,2016,79,629-661.)。二倍半萜化合物是萜类化合物的一小类，目前发现的该类化合物仅有1800多种，占萜类化合物总数的不到2％(Zeng,T.；Liu,Z.；Zhuang,J.；Jiang,Y.；He,W.；Diao,H.；Lv,N.；Jian,Y.；Liang,D.；Qiu,Y.；Zhang,R.；Zhang,F.；Tang,X.；Wu,R.TeroKit:adatabase-driven web server for terpenome research.Journal of ChemicalInformation and Modeling,2020,60(4),2082–2090.)。这些化合物具有多种多样的化学结构，并且表现出广泛的生物活性，如细胞毒、抗炎、抗菌和抗病毒活性等。
自然界的二倍半萜化合物主要来源于海绵和丝状真菌，少部分来源于植物(Huang,A.C.；Kautsar,S.A.；Hong,Y.J.；Medema,M.H.；Bond,A.D.；Tantillo,D.J.；Osbourn,A.Unearthing a sesterterpene biosynthetic repertoire in theBrassicaceae through genome mining reveals convergent evolution.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,2017,114(29),E6005–E6014.)。现代基因组测序技术和生物信息学分析工具揭示了隐性的萜类合成基因簇，为新颖二倍半萜的发现提供了更多可能。
菌株094102是分离自海南文昌红树林的曲霉属真菌，其次级代谢产物类型丰富，包括具有良好抗肿瘤活性的二倍半萜类化合物ophiobolins(Tian,W.；Deng,Z.；Hong,K.The biological activities of sesterterpenoid-type ophiobolins.Marine Drugs,2017,15(7),1–21.)全基因组测序结果表明该菌株中存在大量隐性的萜类合成基因簇，显示出合成新颖萜类化合物的巨大潜力。
异源表达是激活沉默基因簇表达的手段之一，在新颖天然产物挖掘中发挥了重要作用。对于真菌次级代谢产物合成基因簇，米曲霉表达系统是常用的有效异源表达宿主，不少萜类化合物、聚酮类化合物和非核糖体多肽合成基因簇都在该系统中得到了成功表达(Narita,K.；Minami,A.；Ozaki,T.；Liu,C.；Kodama,M.；Oikawa,H.Total biosynthesis ofantiangiogenic agent(-)-terpestacin by artificial reconstitution of thebiosynthetic machinery in Aspergillus oryzae.The Journal of OrganicChemistry,2018,acs.joc.7b03220.)。本发明通过异源表达使隐性基因激活获得4个具有抗肿瘤活性的新颖二倍半萜类化合物aspergilols A-D，这些化合物及其抗肿瘤用途均未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一类新颖的化合物及其基因簇，本发明目的还包括提供该化合物及其基因簇在抗肿瘤中的应用，同时还提供该化合物的合成及分离方法与应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一类化合物，所述化合物结构式如下式I-IV任一种，R＝H或OH，
Figure BDA0002834937800000021
R为H时，所述化合物为前体化合物aspergildienes A-D；R为OH时，所述化合物为具有抗肿瘤活性的二倍半萜化合物aspergilols A-D。aspergildienes A-D进行后修饰得到二倍半萜化合物aspergilols A-D。
本发明还提供合成上述化合物的基因簇。所述基因簇命名为SAC11189，来源于曲霉属真菌Aspergillus ustus 094102，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M208153；该基因簇SAC11189由二倍半萜合成酶基因(Au11189)和上游CYP450基因(Au11188)组成，分别具有序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中碱基序列。
本发明还提供合成上述化合物的体系，包括：
(1)合成上述化合物的基因簇，包括基因Au11188和Au11189及其功能等同体；所述合成相关基因或其功能等同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上(如图1)；
(2)表达上述基因簇的载体，包括pTAex3-Au11189和pAdeA-Au11188的一个或多个；
(3)合成上述化合物的微生物菌株，包括丝状真菌、酵母、链霉菌、芽孢杆菌或大肠杆菌中任一种；
(4)培养微生物菌株的DPY液体培养基。
首先，本发明构建米曲霉转化子Ao-AuS1生产前体化合物aspergildienes A-D：
①所述生产aspergildienes的微生物为米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1；表达载体的启动子为α-淀粉酶启动子，序列如SEQ ID NO.3所示；
②使用原生质体转化方法得到含有二倍半萜合成酶基因(Au11189)的米曲霉转化子Ao-AuS1，该菌株可以产生前体化合物aspergildienes A-D，这些化合物可以被进一步修饰为具有抗肿瘤活性的化合物aspergilols A-D；
③该合成体系，包含基因Au11189或其功能等同体(同功能基因)。
其次，本发明构建米曲霉转化子Ao-AuS2生产抗肿瘤化合物aspergilols A-D：
①所述生产aspergilols的菌株Ao-AuS2在Ao-AuS1的基础上进行构建，表达载体的启动子为α-淀粉酶启动子，序列如SEQ ID NO.3所示；
②该菌株可以对aspergildienes A-D进行后修饰得到抗肿瘤化合物aspergilolsA-D；
③该合成体系包含基因Au11189和Au11188或它们的功能等同体(同功能基因)。
本发明还提供上述合成体系合成的化合物的生产和分离方法。使用DPY液体培养基进行基因的诱导表达和产物积累，其成分为：2％糊精、1％多聚蛋白胨、0.5％酵母浸粉、0.5％KH2PO4和0.05％MgSO4·7H2O。
所述二倍半萜产物为胞内产物，因此发酵后收集菌丝使用丙酮进行产物提取，减压浓缩得到浸膏；使用青岛海洋200-300目硅胶柱对浸膏进行粗分离，使用半制备HPLC进行进一步分离得到化合物aspergilols A-D。
包括：
(1)收集体系合成的化合物的菌丝体，加入等体积丙酮浸泡，超声破碎1h，重复三次，过滤得到丙酮-水层；减压浓缩去除丙酮后，水溶液采用等体积的正己烷萃取3次；合并所有正己烷层，减压浓缩获得粗提物；
(2)将步骤(1)得到的粗提物采用硅胶(100-200目)拌样，硅胶(200-300目)装填硅胶柱；使用极性相似的溶剂进行洗脱；
(3)收集合并步骤(2)含有目标化合物的洗脱液，减压浓缩后用1mL丙酮重新溶解，过滤后进行HPLC半制备分离纯化；使用乙腈为流动相，检测波长为210nm，分离纯化得到前体化合物aspergildienes A-D(式I-IV，R＝H)；使用乙腈和水为流动相，洗脱程序为：0–20min：85％-100％乙腈；21-27min：100％乙腈；28-32min：100％-85％乙腈，流速为4mL/min，检测波长为210nm，分离纯化得到化合物aspergilols A-D(式I-IV，R＝OH)。
本发明通过抗肿瘤活性实验证实所合成的新化合物aspergilols A-D具有抗肿瘤的功能，而前体化合物aspergildienes A-D可以进行后修饰得到抗肿瘤化合物aspergilols A-D，因此化合物式I-IV(R＝H或OH)可用于制备抗肿瘤药物中，为开发新颖的抗肿瘤药物提供了可能的候选化合物。而合成该化合物的基因簇及合成该化合物的体系在制备抗肿瘤药物中，也具有重要意义。
本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物，包括抗肿瘤有效量的式I-IV所示结构的化合物中的至少一种，还包含药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍。
本发明具有如下优点：
(1)本发明使用米曲霉异源表达系统成功激活了来源于焦曲霉094102的沉默基因簇SAC11189；
(2)通过上述沉默基因簇的激活得到4个结构新颖的二倍半萜类化合物aspergilols A-D；
(3)生物活性测试结果表明aspergilols A-D均具有抗肿瘤活性，有成为抗肿瘤先导化合物的潜力。
附图说明
图1是基因簇SAC11189示意图。
图2是本发明所用到载体的示意图。
图3是米曲霉转化子的PCR验证图；其中，Maker是DSBio 1kb ladder plus；lane 1扩增基因为Au11189，对应转化子Ao-AuS1；lane 2-3分别为基因Au11189和Au11188，对应转化子Ao-AuS2。
图4-5是本发明的化合物1-8的GC-MS图谱。
图6是本发明的化合物1-8的结构图。
图7是本发明的化合物1-4的HPLC图。
图8-10是本发明的化合物1的核磁图谱，其中图8为氢谱，图9为碳谱，图10中A为HSQC、B为1H-1H COSY、C为HMBC、D为NOESY；下述化合物核磁图谱顺序均与此一致。
图11-13是本发明的化合物2的核磁图谱。
图14-16是本发明的化合物3的核磁图谱。
图17-19是本发明的化合物4的核磁图谱。
图20是本发明的化合物5-8的HPLC图谱。
图21-23是本发明的化合物5的核磁图谱。
图24-26是本发明的化合物6的核磁图谱。
图27-29是本发明的化合物7的核磁图谱。
图30-32是本发明的化合物8的核磁图谱。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步阐述本发明的细节。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中寡核苷酸引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，脱氧核酸序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司完成。所用限制性内切酶均来自NEB公司，多片段克隆试剂盒购买于上海翊圣生物科技有限公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α购买于上海唯地生物技术有限公司。质粒提取、凝胶回收和酶切体系回收采用Omega Bio-Tek公司试剂盒，按说明书方法操作。所用抗生素购买于Biosharp公司，培养基用糊精购自生工生物工程(上海)股份有限公司，多聚蛋白胨购买于北京索莱宝科技有限公司，酵母浸粉购买于安琪酵母，其余成分来自于国药集团化学试剂有限公司。所用到的所有化学试剂都购自武汉申试化工有限公司。
本发明通过基因组挖掘在曲霉属真菌094102中得到由萜类合成酶基因Au11189和细胞色素P450酶基因Au11188组成的生物合成基因簇SAC11189。使用米曲霉表达系统对基因簇中各个基因进行表达，得到4个结构新颖的二倍半萜化合物aspergilols A-D。体外细胞毒活性测试结果表明aspergilols A-D对多株肿瘤细胞表现出不同程度的抑制活性，为开发新颖的抗肿瘤药物提供了可能的候选化合物。
实施例中所用到的引物如下表1所示：
表1引物列表
Figure BDA0002834937800000061
【实施例1】米曲霉转化子Ao-AuS1的构建
将菌株094102的孢子接种于真菌Ⅱ号液体培养基，28℃，220rpm培养2d，收集20mg左右菌丝加入到底部装有少量玻璃珠的2mL核酸提取管中(需高温灭菌，避免外源基因干扰)。加入500μL无菌水，在核酸提取仪中震荡1min后加入酚：氯仿：异戊醇溶液500μL，涡旋混匀后12000rpm离心10min，取上层水层作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。
参考SAC11189的序列，设计引物对11189F和11189R用于扩增基因Au11189。使用MCLAB 2×High-Fidelity Master Mixon分别进行PCR反应，每个目的基因反应体系50μL，成分如下：高保真酶25μL，引物各2μL，DNA模板1μL，超纯水20μL。PCR扩增条件为：95℃，3min预变性；95℃，30s变性；58℃，30s退火；72℃，2min延伸，循环次数为30次；72℃，10min后延伸。将PCR反应扩增后的体系进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，与预先用内切酶EcoR I线性化的载体pTAex3进行连接并转化至E.coli DH5α中，利用氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记，挑取克隆子提取质粒并进行测序得到正确的表达载体pTAex3-Au11189。
通过原生质体转化的方法进行重组质粒pTAex3-Au11189的转化，待米曲霉转化子长出后，用枪头将其挑至精氨酸缺陷型平板上，待其直径长到2cm左右，用枪头取适量的菌体用上述基因组DNA提取方法提取gDNA，进行PCR验证。由于Au11189全长基因较大，不容易扩增，因此设计验证引物11189-verifyR仅扩增其前半段达到验证目的(图3)。
结论：使用Ao-AuS1的gDNA作为模板，能扩增出基因Au11189片段，说明米曲霉转化子Ao-AuS1构建成功。
【实施例2】米曲霉转化子Ao-AuS1发酵及代谢产物检测
将实施例1中获得的米曲霉转化子接种于100mL DPY液体培养基中，28℃，220rpm培养7d，用纱布收集菌丝体。菌丝体加入等体积丙酮过夜浸泡，超声破碎1h，重复三次，通过布氏漏斗过滤得到丙酮-水层。减压浓缩去除丙酮后，水溶液采用等体积的正己烷萃取3次；合并所有正己烷层，减压浓缩获得粗提物。使用1mL正己烷重新溶解粗提物并过滤，进行GC-MS检测(图4-5)。
结论：基因簇SAC11189中，萜类合成酶Au11189催化产生4个二倍半萜烯化合物1-4(m/z 340)，这些化合物可以作为前体化合物被后修饰酶进一步氧化为有活性的终产物。
【实施例3】前体化合物1-4的分离及结构确认
将实施例1中得到的米曲霉转化子Ao-AuS1接种于28L DPY液体培养基中，28℃，220rpm培养7天，收集菌丝体，按照实施例2中所述方法处理得到粗提物。将得到的约20g粗提物重新溶解在少量正己烷中，使用青岛海洋100-200目硅胶进行拌样，200-300目硅胶装填硅胶柱。使用正己烷进行洗脱，用玻璃试管收集洗脱液，每管8mL左右，进行GC-MS检测确定组分。合并含有目标二倍半萜烯化合物的洗脱液，减压浓缩后用1mL丙酮重新溶解，过滤后进行HPLC半制备分离纯化(图7)。
通过MS、一维和二维NMR等手段，确定了前体化合物1-4的结构，其理化性质与波谱数据如下：
化合物1：8.9mg，无色油状，EIMS(m/z):340.3；根据核磁共振数据确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物，命名为aspergildiene A；
化合物2：10.2mg，无色油状，EIMS(m/z):340.3；根据核磁共振数据确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物，命名为aspergildiene B；
化合物3：18.2mg，无色油状，EIMS(m/z):340.3；根据核磁共振数据确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物，命名为aspergildiene C；
化合物4：3.6mg，无色油状，EIMS(m/z):340.3；根据核磁共振数据确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物，命名为aspergildiene D.
表2化合物1-2的1H(400MHz)和13C NMR数据(100MHz,CDCl3)
Figure BDA0002834937800000091
表3化合物3-4的1H(400MHz)和13C NMR数据(100MHz,CDCl3)
Figure BDA0002834937800000101
最终确定前体化合物1-4的结构如式I-IV所示，其中R＝H。
【实施例4】米曲霉转化子Ao-AuS2的构建
以实施例1得到的基因组DNA为模板，设计引物对11188F和Au11188R对基因Au11188进行PCR扩增，具体操作方法参见实施例1。切胶回收目的片段后与预先用内切酶Xba I线性化的载体pAdeA进行连接并转化至E.coli DH5α中，利用氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记，挑取克隆子提取质粒并进行测序得到正确的表达载体pAdeA-Au11188。
使用菌株Ao-AuS1进行原生质体制备，PEG4000介导转化pAdeA-Au11188。待米曲霉转化子长出后，用枪头将其挑至腺嘌呤缺陷型平板上，待其直径长到2cm左右，挑取部分菌丝进行PCR验证(图3)。
结论：以转化子Ao-AuS2的gDNA为模板进行PCR扩增，可以扩增出基因Au11189片段和基因Au11188，说明转化子Ao-AuS2构建成功。
【实施例5】米曲霉转化子Ao-AuS2发酵及代谢产物检测
将实施例4中获得的米曲霉转化子Ao-AuS2接种于100mL DPY液体培养基中，28℃，220rpm培养10d，用纱布收集菌丝体。用实施例2中相同方法进行菌丝处理得到粗提物并进行GC-MS检测(图4-5)。
结论：转化基因Au11188后，菌株Ao-AuS2催化产生了4个m/z 356的化合物5-8，推测为前体化合物1-4(m/z 340)的氧化产物。
【实施例6】化合物5-8的分离及结构确认
将实施例4中得到的米曲霉转化子Ao-AuS2接种于20L DPY液体培养基中，28℃，220rpm培养7天，收集菌丝体，按照实施例2中所述方法处理得到粗提物。将得到的约20g粗提物重新溶解在少量正己烷中，使用青岛海洋100-200目硅胶进行拌样，200-300目硅胶装填硅胶柱。洗脱剂正己烷/乙酸乙酯(v/v，100:0，100:1，50:1，20:1，10:1，5:1)进行梯度洗脱，每个梯度洗脱200mL，用玻璃试管收集洗脱液，每管8mL左右。经过HPLC液相检测后进行相同组分样品混合，减压浓缩后用1mL丙酮重新溶解，过滤后进行HPLC半制备分离纯化得到化合物5-8(图20)。
通过MS、一维和二维NMR等手段，确定了化合物5-8为化合物1-4的氧化产物，其理化性质与波谱数据如下：
化合物5：21.9mg，白色粉末，EIMS(m/z):356.3；根据核磁共振数据确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物，命名为aspergilol A；
化合物6：46.0mg，白色粉末，EIMS(m/z):356.3；根据核磁共振数据确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物，命名为aspergilol B；
化合物7：58.8mg，无色油状，EIMS(m/z):356.3；根据核磁共振数据确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物，命名为aspergilol C；
化合物8：23.4mg，无色油状，EIMS(m/z):356.3；根据核磁共振数据确认了其平面结构，经SCI finder搜索确认该化合物为新结构的化合物，命名为aspergilol D；
表4化合物5-6的1H(400MHz)和13C NMR数据(100MHz,CDCl3)
Figure BDA0002834937800000121
表5化合物7-8的1H(400MHz)和13C NMR数据(100MHz,CDCl3)
Figure BDA0002834937800000131
最终确定化合物5-8的结构如式I-IV所示，其中R＝OH。
【实施例7】细胞毒活性检测化合物5-8的抗肿瘤活性
细胞毒实验中，选用CCK-8法对乳腺癌细胞株MCF-7、三阴乳腺癌细胞株MDA-MB231、肝癌细胞株HepG2进行测定，使用SRB法对Bel-7402细胞进行测定。
将对数生长期细胞用胰酶消化，之后用含10％胎牛血清RPMI 1640培养基调整细胞浓度至2×104个细胞/ml，按照每孔190μL细胞悬液接种在96孔培养板中，37℃，5％CO2培养24h。药物处理孔加入10μL样品溶液，使其终浓度为5μg/mL；阴性对照组加入含等体积溶媒的培养基，37℃，5％CO2培养48h。
对于CCK-8法，给药48h后弃去培养基，再向每孔加入100μL提前用无血清培养基稀释好并混匀的CCK-8试剂(CCK-8:无FBS培养基＝1:15)，避光操作，再将培养板放在培养箱内孵育0.5-1h。以阴性对照组OD值为1.0时为宜终止培养，用酶标仪扫描实验孔板，测定其OD510值并进行计算。
对于SRB法，给药48h后弃去培养基，轻轻加入100μL 4℃预冷的50％TCA固定细胞。先静置5min，然后再移至4℃放置1h。倒掉固定液，蒸馏水洗涤5次去除TCA，空气干燥1h。每孔加入0.4％SRB溶液80μL，室温染色30min。弃染液，1％醋酸洗涤5次充分去除未结合的SRB，空气干燥。加入150μL 10mM Tris-base(pH 10.5)溶解，微型振荡器上振荡5min，用酶标仪测定OD510值并进行计算。
结果如表11所示，化合物5对乳腺癌细胞株MCF-7、三阴乳腺癌细胞株MDA-MB231、肝癌细胞株HepG2和Bel-7402均有明显的抑制增殖的作用，化合物6仅对乳腺癌细胞株MCF-7和肝癌细胞株Bel-7402有明显的抑制增殖的作用，而化合物7和8具有中等强度的Bel-7402细胞毒性。
表6活性化合物的细胞毒性(48h,IC50,μg/mL)
Figure BDA0002834937800000141
注：“-”表示化合物对测试细胞株没有抑制作用。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一类化合物、其合成基因簇及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1930
<212> DNA
<213> Au11188基因(Au11188 gene)
<400> 1
atggatattt acgtcgtcgg gccattcgga cacgcgatgg atctcctgcc taatccgacg 60
aggcccttca gcggccggct tcatggtgtg ccctcccatt cttgtagaaa aaggccgcag 120
acagctaaac aaggaaagag ctctccgccc tcgccctgca gcgaccccag ctggtcatca 180
caacactagg cgctcttctt cttgccgcgt tctatctctt gccgtcaaag gatccttaca 240
atctgaagag gataccaatg gtctcccgct cgcgggttct cgatgcctat cggtccggcg 300
tatggtggcg attcatcctc ccgcggtttt atccgtacat acacgaggga tatctcaagg 360
tatcgccact gcaatcatgc tcccttgtcc cagcaggctc tgatacgcat cagtacagca 420
ccaaggacag gccctttagg gtctggcttg cacagttcca gatatgggtc tatatcctgc 480
ccctgaaata tctgcctctg gtcaagaacc agggcattac cgagttaagc ctgcgagact 540
tcattgacaa ggtgcgcttc tcacagccaa gcgggatctc tttgttaacc gcggacaggc 600
gacttctgcc cagctctcca gcgggagctt tgacactttt gaagtgcagg ttggctcgaa 660
gctgctcaac gggaacctca tcgacatcaa gcccattgtg cagacccgga cggagcagat 720
ccttgagcgc gtcattggga ggcccaggga gtggcgcagg ttcaacattc gcgccctcag 780
cgtgcaggtc gtgaagcacg tctcggcccg catcgctttc ggcgaagccc tcgcggacaa 840
ccctgggttc ctcgatgcca tggagcgcta ctcactgaat gtcatcccct acaccctggt 900
gttccggtat tttaacctcg ggcccttgcg gtacccgctc ctctacctga ttcacttgcg 960
ccagcgacag acccttgctg tcgccacccg ctacgtcacc gacctcattg ccgaacgaca 1020
gcgcaaagag aaggagcacc gcttggacgg tgatgagagg cctgtcgact gcattcagtg 1080
gtctatggat caggatatcc ccgacgaaca aaaggccccc gaggctgtcg cccatcgcct 1140
ccttcacatt tctgccgccc tcatcgacgc gcccattaca agcatgatga acgtgctcgc 1200
cgacatcatc tcgtatgcgc gcgacgaggt ccttgatgat ctgcgcgccg agattgtcga 1260
gtgcctcgcc gagttcgatg gcgcatggac cgaagcctcc atggcaaaga tgaagaagct 1320
cgattcgttc ttccaggaat ccttccgaat gacctcgggc ctcatccctt gtacgtccat 1380
ttggctccaa tcgccccttt cctgctcatt tttctcctag tgactggctg gcgcctcatc 1440
aaagccgact gcttccgctt tgacaacgac cttgtcctcc ccagaggttc cacgatcgta 1500
ttcccgacgc agtgcattca gctggaccca aacatctacc ccaaccctga caagttcgac 1560
tacctgcgct tctaccgcat gaaggagcat acccaaagca cagatgcccg tacaggcaag 1620
gaggttccac gccacgagtg gctcaggtat gctgatcatc tactcccagg gccattgatc 1680
ctcccactgt catatccgaa atgaggtcta acggcacttc actagcttcg gccatggccg 1740
ccaggcatgt ccaggccggt tttactctat ccgcctcctc aagaccatcc tcggcgagat 1800
gatgctccgc tatgacattc gctatgccgg cggcgatcga ccacgcccac cgatgatcga 1860
cctcgaacca atcctggcgc cggatacatc cgtcgagctg gagtttcgag tccggcagaa 1920
cgtgacatga 1930
<210> 2
<211> 2379
<212> DNA
<213> Au11189基因(Au11189gene)
<400> 2
atggacgcgg cactgcgtga tatctgccag ctcagcgatc cctgtgatcc gcgcagcttt 60
gagcctccga tcaaggactt cttctgcatc tatcccatgt accgctctcg ctacgaggcc 120
aaggccattc aaggatcaaa tgagtttctc gatggttgga acaaagcgat tgaaaaggac 180
ggattgagaa acgatgggcg cccgtttctg ggttgcaaca caatctacgg aaactacgtt 240
gcatgggcgt atccagagtg tcttccagag cgggcagcac atgtggcggc gtactgcgac 300
tggggattct tctgggacgg ttagtagggt cttttcttct atagacaggc attgacgaac 360
ctttgctttg cagatgctac cgacgccatg tcgatggaga aaaaccacga ggccaccaag 420
gatcttatcc ttactataat gtcaacggtg gggattggtc agaagcacga gccgcttctg 480
gcggtcaata agcttgtcgt gccttttgtg ctgaacaagc tcgctggaac ggacggggat 540
cttgggctaa accacatgaa ggcgtggaag gcccatctcg atggccaggc caggagctca 600
catgccaaca tgtcttggga ggagctcaag cagcatcggc tggttgaggg aggcccagag 660
taagcaaaac agtcagctgc atccgctcgc acgctaattc tgccagatgg gccattcgac 720
tcggagcgtg gggcgccggg attcggtgca ccgcagagga gattgagtca gtacgggaga 780
taatcgatat tgggggcatt gctggagtct tggccaacga ctactacagc ttcaacaagg 840
agtttgatga gcactcccga gcaggcacga tagagcggat gcagaacgga gtggccctgc 900
tgatgcggga atatggctac agcgaagagg aggcgcgcga gatcctgaaa aaggagatca 960
ataagatgga gcagcagttc atggacatgt acctgacctg gttgaacggc cctgttcaaa 1020
agtctcgcgg cctgatccag tatttgacca tggtcctttg tctctactcg ggcacaatgt 1080
tctggatggc ccacggcgcg aggtaccacc gcaccgatct cattaccaca gcagaggatc 1140
gggctacgat tattgggaag tgccaggggg acgcttttcg cgtaatggag ggatatcctc 1200
cgccaaaggg gctgaagcgg acggccagct ccccagagtc agcacccaaa cggagggctt 1260
caaaagcgaa caatatcaac caaagcaatg gacgtggcgg tgatcccatg gtcgcctttt 1320
caggtccctt cgtgaaggct ccaagccatg tacgtgtcgc tcctgggctg tatttgtgca 1380
ctgacctgac cgagatagat ctgcgatgct ccgtacgagt acatcgactc tctccaatcc 1440
aagaacatgc gtgacaagtt catcaacatc ctcaactcct ggctgaacgt gccgtccgac 1500
tcgctgcaaa tcatcaaaaa cattgtccag atgttgcaca actcatcatt aatgtacgcc 1560
ccttgtatgc gctgagttgt tctagcccta attttccagg cttgacgaca ttgaagacgc 1620
ctctcctctc cgtcgaggcc aaccggcaac ccacattttc tacggcgcca gccagaccat 1680
caacagcgcc aactttagct acgtcaagac ggtcatcgag gccactcacc ttaagaaccc 1740
gcaatgtctg caaatcttcc tcgaggaagt cagcgacctc caccgcggtc agagcctcga 1800
cctgcactgg cgccaccacg gccgttgccc gacgacagac gagtacatta tgatggtcga 1860
caacaagact ggcgggctct tccgtctgat ggcccgtctg atggaagccg aatcgccctc 1920
tcccataacg actccccatc tcagccgcct cctcaccctg ataggtcgct actaccaaat 1980
ccgagatgac tatatgaatc ttacttcagc tgatgtcagt cctcgtgtat tttcttttcc 2040
caatatttac taacaatagc caagtatacc acaaagaagg gctattgcga agacctcgac 2100
gagggcaaat tctcgctccc cctcatccac ctcctcctcc acacctcgtg cccggaccgg 2160
atcacttccg ctctatacaa ccgcgtccca tcgacaggtc tgcaggacga ggtcaagacg 2220
tatatcctgg acgctatgca gtctgcgcgt acatttgaat acgttcgtga ggtgctgtcg 2280
catttgcacg gggagattat gaagacgctg gatgaggctg agaagacgtt ggggattaac 2340
aatggggttc ggatgttgtt ggttgggttg gggctgtag 2379
<210> 3
<211> 604
<212> DNA
<213> α-淀粉酶启动子pamy(α-amylase promoter)
<400> 3
tcatggtgtt ttgatcattt taaattttta tatggcgggt ggtgggcaac tcgcttgcgc 60
gggcaactcg cttaccgatt acgttagggc tgatatttac gtaaaaatcg tcaagggatg 120
caagaccaaa gtagtaaaac cccggagtca acagcatcca agcccaagtc cttcacggag 180
aaaccccagc gtccacatca cgagcgaagg accacytcta ggcatcggac gcaccatcca 240
attagaagca gcaaagcgaa acagcccaag aaaaaggtcg gcccgtcggc cttttctgca 300
acgctgatca cgggcagcga tccaaccaac accctccaga gtgactaggg gcggaaattt 360
aaagggatta atttccactc aaccacaaat cacagtcgtc cccggtattg tcctgcagaa 420
tgcaatttaa actcttctgc gaatcgcttg gattccccgc ccctggccgt agagcttaaa 480
gtatgtccct tgtcgatgcg atgtatcaca acatataaat actagcaagg gatgccatgc 540
ttggaggata gcaaccgaca acatcacatc aagctctccc ttctctgaac aataaacccc 600
acag 604
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgactagta gatcctctag atcatggtgt tttgatcatt tta 43
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccatctgtg gggtttattg ttcagag 27
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaccccacag atggatattt acgtcgtcgg gccattcgg 39
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagctactac agatctcatg tcacgttctg ccggactcga aac 43
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatctgtagt agctcgtgaa gggtggag 28
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgactagta gatcctctag aatctccttt tgctttctgc cgagctgcct 50
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccacagcaag ctccgaattc atggacgcgg cactgcgtga 40
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actacagatc cccgggtacc ctacagcccc aacccaacca acaac 45
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgtccattg ctttggttga ta 22

Claims (8)

1.一类化合物，其特征在于：所述化合物结构式如下式I-IV，其中R为H或OH，
Figure FDA0002834937790000011
2.一种合成权利要求1所述化合物的基因簇，其特征在于：所述基因簇为SAC11189，包括基因Au11188和Au11189及其功能等同体；Au11188和Au11189基因序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.一种合成权利要求1所述化合物的体系，其特征在于：包括，
(1)权利要求2所述的基因簇，其合成相关基因或其功能等同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上；
(2)表达权利要求2所述基因簇的载体，包括pTAex3-Au11189和pAdeA-Au11188的一个或多个，启动子为α-淀粉酶启动子，其序列如SEQ ID NO.3所示；
(3)合成所述化合物的微生物菌株，包括丝状真菌、酵母、链霉菌、芽孢杆菌或大肠杆菌中任一种；
(4)培养微生物菌株的DPY液体培养基，其成分包括糊精、多聚蛋白胨、酵母浸粉、KH2PO4和MgSO4·7H2O。
4.一种权利要求3所述体系合成的化合物的分离纯化方法，其特征在于：包括，
(1)收集权利要求3所述体系合成的化合物的菌丝体，加入等体积丙酮浸泡，超声破碎1h，重复三次，过滤得到丙酮-水层；减压浓缩去除丙酮后，水溶液采用等体积的正己烷萃取3次；合并所有正己烷层，减压浓缩获得粗提物；
(2)将步骤(1)得到的粗提物采用硅胶拌样，硅胶装填硅胶柱；使用极性相似的溶剂进行洗脱；
(3)收集合并步骤(2)含有目标化合物的洗脱液，减压浓缩后用1mL丙酮重新溶解，过滤后进行HPLC半制备分离纯化；使用乙腈为流动相，检测波长为210nm，分离纯化得到前体化合物aspergildienes A-D(式I-IV，R＝H)；使用乙腈和水为流动相，洗脱程序为：0–20min：85％-100％乙腈；21-27min：100％乙腈；28-32min：100％-85％乙腈，流速为4mL/min，检测波长为210nm，分离纯化得到化合物aspergilols A-D(式I-IV，R＝OH)。
5.权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求2所述的合成化合物的基因簇或权利要求3所述的合成化合物的体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括抗肿瘤有效量的权利要求1所述的式I-IV所示结构的化合物中的至少一种。
8.如权利要求7所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于：还包含药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍。
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