CN112409154B - 土曲霉酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用 - Google Patents

土曲霉酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及土曲霉酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用，所述土曲霉酮具有式I所示结构：
Figure 492910DEST_PATH_IMAGE001
式I。本发明提供了一个抗肿瘤活性化合物，该化合物由转录因子gene2382过表达突变菌株土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR‑e3产生，与野生型菌株相比，此化合物在突变株中产量提高了近6倍，该化合物对人肝癌细胞Hep G2具有有效的抑制活性，可用于治疗肝癌和结肠癌等疾病，具有广阔的应用前景。此外，将基因过表达技术应用于天然产物挖掘为开发真菌次级代谢产物资源提供了强有力的技术支持。

Description

土曲霉酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及土曲霉酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用。
背景技术
近几十年来，随着对海洋资源的开发利用，海洋药源活性天然产物逐渐成为国际上一个生机勃勃的热点研究领域。海洋真菌因代谢产物丰富、易于大规模培养以及便于进行分子操作等优势成为活性天然产物来源的主力军。土曲霉家族真菌在真菌种群中占据着重要地位，其产生的次级代谢产物结构类型多样，包括聚酮类、萜类、肽类、生物碱类等，多样的结构类型赋予了它们丰富的生物活性，许多化合物都具有显著的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等活性，对人类重大常见疾病具有较好的预防和治疗作用，已经成为发现先导药物的重要来源。近年来，随着DNA测序技术及生物信息学技术的快速发展，研究者发现，在真菌基因组中存在着庞大的生物合成基因簇，但是在实验室常规的培养条件下，大部分生物合成基因簇处于不表达或低水平表达状态。为了进一步挖掘真菌的生物合成潜力，将基因组挖掘技术应用于真菌天然产物资源的开发成为发现天然产物的新策略。该方法基于基因组信息指导，利用基因敲除、过表达、异源表达等分子生物学手段获得真菌突变株，通过发酵培养获得差异代谢产物，充分开发真菌生物合成潜能，从而筛选得到更多结构新颖的活性天然产物，为天然产物来源的药物开发提供重要的化合物基础。
本发明涉及通过利用分子生物学技术将一株海兔来源土曲霉A. terreus RA2905中土曲霉生物合成基因簇中的转录因子编码基因terR进行过表达，获得过表达突变株并进行发酵培养，进而通过天然产物分离提取技术制备土曲霉酮，与野生型菌株相比，该化合物的产量有大幅度提高，此外，该化合物具有优良的抗肿瘤活性，可以显著抑制肿瘤的增殖，诱导细胞凋亡，用于治疗肝癌和结肠癌等疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供土曲霉酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
土曲霉酮是从土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3中制备获得，土曲霉酮具有式I所示结构：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
式I
土曲霉A. terreus RA2905的转录因子terR过表达菌株为土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3，于2020年8月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No. 20245，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供一种式Ⅰ化合物的制备方法包括以下步骤：
（1）构建土曲霉RA2905的转录因子terR的过表达盒；
（2）构建土曲霉RA2905的terR过表达突变工程菌；
（3）突变株发酵培养
将构建成功的突变株接入海水大米培养基中，每瓶接入10mL孢子液，共发酵50瓶，28°C，静止培养7d；海水大米培养基中为大米100 g，海水50 ml。
所述孢子液制备方法是将土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3接种马铃薯蔗糖培养基中，于37℃静止培养5天产生分生孢子，用马铃薯液体培养基洗下孢子，经纱布过滤获得的孢子液，用培养基调整孢子浓度为108个/ml；
（4）本发明式Ⅰ化合物的分离纯化
发酵结束后，将步骤（3）得到的发酵培养物使用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到粗浸膏，然后再用甲醇萃取2次，最后，将浸膏合并，合并后的浸膏先后使用正相硅胶柱及高效液相色谱分离获得式Ⅰ化合物。
（5）式Ⅰ化合物细胞毒活性测试
按照常规方法，采用MTT法对式Ⅰ化合物进行细胞毒活性测试。测试细胞株包括人肺癌细胞A549，人宫颈癌细胞Hela，人肝癌细胞Hep G2，人乳腺癌细胞MCF-7，人结肠癌细胞HCT-116。以阿霉素为阳性对照。观察Hoechst染色结果，实验重复三次，计算化合物对肿瘤细胞的IC50 值。
本发明的优点在于：
本发明提供了一个抗肿瘤活性化合物，该化合物由转录因子terR过表达工程菌株（土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3）产生，产量大幅度提高，高达到25 mg/g，野生菌株产量为4.5 mg/g。且本项目制备的土曲霉酮对人肝癌细胞Hep G2具有有效的抑制活性。由于该化合物可以显著抑制肿瘤的增殖，诱导细胞凋亡，可用于治疗肝癌和结肠癌等疾病，具有广阔的应用前景。此外，将基因过表达技术应用于天然产物挖掘为开发真菌次级代谢产物资源提供了强有力的技术支持。
附图说明
图1是突变菌株土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3和野生菌株土曲霉酮的HPLC检测图。
图2是式Ⅰ化合物对Hep G2细胞的Hoechst染色结果图。注：左图为对照，右图为式Ⅰ化合物。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
本发明土曲霉酮途径特异性转录因子terR过表达菌株CGMCC No. 20245的构建
（1）构建海洋土曲霉 RA2905的转录因子terR的表达盒
a.通过BLAST算法鉴定海洋来源真菌RA2905基因组中土曲霉酮途径特异性转录因子TerR。
b.以海兔附生真菌土曲霉RA2905野生型菌株基因组为模板扩增terR基因的编码区和终止子序列，以T-AfpyrG质粒为模板扩增烟曲霉乳清苷-5-磷酸脱羧酶基因（pyrG），以质粒pIG1783为模板扩增磷酸甘油醛脱氢酶的启动子（PGPDA），利用融合PCR技术以PyrG-PGPDA-terR编码区和终止子的顺序，融合上述三个片段片段获得过表达盒（所用引物SGPF2GTACAGTGACCGGTGACTCTTTCTG；SGPR GGTGATGTCTGCTCAAGCGGGGTAG；terRR1GCTGCGGAAGGCGCTGAGTA；terRR2 TCCCTTCATACCTCGCTTTA；GPDterRF CTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCATGGGCGCCGGCTGGCCCCT； PyrGF gcctcaaacaatgctcttcaccc；pyrgGPDR CAGAAAGAGTCACCGGTCACTGTACGTCTGAGAGGAGGCACTGATGC）。
（2）把过表达盒转化原生质体，构建转录因子terR基因过表达菌株
a.酶裂解法制备土曲霉原生质体。将土曲霉野生菌株接种土豆固体培养基在37℃静置培养4天产生分生孢子，用生理盐水冲洗获得孢子液, 调整孢子浓度为108个/ml。然后，将土曲霉RA 2905孢子液接种至100 mL GPY液体培养基中，于28℃，150 rpm摇床培养12h。过滤菌丝，将其加入配置好的酶解液中37℃酶解4h，于显微镜下观察原生质体生成情况，待酶解充分后，使用2层擦镜纸过滤收集原生质体备用。GPY液体培养基组成：葡萄糖 20g/L, 蛋白胨 10g/L, 酵母提取物 10g/L。酶解液：Lysing Enzymes from Trichodermaharzianum from Sigma (L- 1412) 50mg/ml，1.2 M NaCl，Driselase fromBasidiomycetes sp. (Sigma D-9515) 2.5mg/ml。
b.过表达盒转化原生质体。将150μl原生质体与800 ng过表达盒DNA混合，加入150μl的浓度为50%的PEG溶液，混匀置于冰上。将该溶液与10ml复苏上层培养基混匀，倒入凝固的复苏下层培养基中。待复苏上层培养基凝固后，将平板封口，置于37℃恒温培养箱中培养，48h后观察转化子生长情况。复苏下层培养基组成：蔗糖：1M，土豆液体 200 ml/L，琼脂1.5 %。复苏上层培养基组成：蔗糖：1M，土豆液体 200 ml/L，琼脂0.5 %。
c.转化子验证。将生长出的单克隆转化子挑取培养，提取基因组，通过PCR验证转化子。所用验证引物为SGPF2和terR2。
通过上述步骤成功构建了过表达菌株土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3，于2020年8月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo. 20245，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本发明式Ⅰ化合物的分离纯化
（1）突变株发酵培养
将构建成功的突变株土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3接入海水大米培养基（大米100 g/瓶，海水50 ml/瓶）中，每瓶接入10mL孢子液，共发酵50瓶，28℃，静止培养7d。
所述孢子液制备方法是将土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3接种马铃薯蔗糖培养基中，于37℃静止培养5天产生分生孢子，用马铃薯液体培养基洗下孢子，经纱布过滤获得的孢子液，用培养基调整孢子浓度为108个/ml；
（2）化合物的提取分离
发酵结束后，将步骤（1）得到的发酵培养物用乙酸乙酯萃取3次；然后，用二氯甲烷/甲醇（2:1）浸泡，浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩得到粗浸膏。将浸膏先进行快速减压正相硅胶柱色谱分离，分别以石油醚/乙酸乙酯和乙酸乙酯/甲醇为流动相，梯度洗脱共得到六个组分 (Fr.1−Fr.6)。Fr.4 经正相常压硅胶柱层析，以CH2Cl2/MeOH为流动相获得四个组分 (Fr.4.1−Fr.4.4)。其中，Fr.4.4经过反向硅胶柱层析分离获得式Ⅰ化合物15.8 g。
所得式Ⅰ化合物的结构确证数据：
Figure 295341DEST_PATH_IMAGE001
Terrein.黄色油状物; [α]20 D +123.2 (c 0.5, MeOH); 1H NMR (500 MHz,DMSO-d 6): 6.72 (1H, dq, J = 15.9, 6.9 Hz, H-7), 6.37 (1H, dd, J = 15.9, 1.9Hz, H-6), 6.01 (1H, s, H-2), 5.80 (1H, d, J = 7.5 Hz, 5-OH), 5.69 (1H, d, J =6.5 Hz, 4-OH), 4.50 (1H, dd, J = 7.3, 2.7 Hz, H-5), 3.88 (1H, dd, J = 6.4,2.7 Hz, H-4), 1.88 (3H, dd, J = 6.9, 1.7 Hz, H-8). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6):δ C 204.5 (C, C-1), 169.1 (C, C-3), 139.9 (CH, C-6), 125.1 (CH, C-2), 124.6(CH, C-7), 81.1 (CH, C-5), 76.8 (CH, C-4), 19.1 (CH3, C-8). ESI-MS m/z 309.2[2M + H]+。
实施例3
本发明式Ⅰ化合物细胞毒活性测试
按照文献方法，采用MTT或SRB法对式Ⅰ化合物进行细胞毒活性测试。测试细胞株包括人肺癌细胞A549，人宫颈癌细胞Hela，人肝癌细胞Hep G2，人乳腺癌细胞MCF-7，人结肠癌细胞HCT-116。以阿霉素为阳性对照。观察Hoechst染色结果，实验重复三次，计算化合物对肿瘤细胞的IC50 值。
结果表明，式Ⅰ化合物对Hep G2具有较好的抑制作用，其IC50为100 nM，其Hoechst染色结果如图2所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 闽江学院
<120> 土曲霉酮的制备方法及其作为抗肿瘤药物的应用
<130> 7
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtacagtgac cggtgactct ttctg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtgatgtct gctcaagcgg ggtag 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgcggaag gcgctgagta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcccttcata cctcgcttta 20
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctaccccgct tgagcagaca tcaccatggg cgccggctgg cccct 45
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcctcaaaca atgctcttca ccc 23
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cagaaagagt caccggtcac tgtacgtctg agaggaggca ctgatgc 47

Claims (2)

1.一种土曲霉酮的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）突变株发酵培养
将土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3接种马铃薯蔗糖培养基中，于37℃静止培养5天产生分生孢子，用马铃薯液体培养基洗下孢子，经纱布过滤获得的孢子液，用培养基调整孢子浓度为108个/ml；然后，接种孢子于海水大米培养基中，每瓶接入10 mL孢子液，共发酵50瓶，28℃，静止培养7d；
（2）土曲霉酮的分离纯化
发酵结束后，将步骤（1）得到的发酵培养物过滤，使用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到粗浸膏，将浸膏先后使用正相硅胶柱及高效液相色谱分离获得所述土曲霉酮；
所述土曲霉酮具有式I所示结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式I；
所述土曲霉（Aspergillus terreus）OEterR-e3于2020年8月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.20245。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述马铃薯蔗糖培养基为土豆200g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；海水大米培养基为大米100 g，海水50 ml。
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