CN112939865A - 一种大环内酰胺化合物FW05328-d及其高效发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种大环内酰胺化合物FW05328‑1的结构类似物FW05328‑d，并进一步公开一种利用氨基酸诱导高效发酵该结构类似物的方法。本发明所述大环内酰胺化合物FW05328‑d为已开发的大环内酰胺化合物FW05328‑1的结构类似物，所述化合物FW05328‑d在结构上比化合物FW05328‑1在10位上少一个‑OH，其物质结构及化学性能更为稳定，更加适宜于规模化生产。本发明所述大环内酰胺化合物FW05328‑d经抗肿瘤活性测试，证明该化合物具有抗小鼠黑色素瘤细胞株、人食管癌细胞株、人结肠癌细胞株活性，具有较好的医药价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种大环内酰胺化合物FW05328-1的结构类似物FW05328-d，并进一步公开一种利用氨基酸诱导高效发酵该结构类似物的方法。
背景技术
随着医疗技术的不断进步，越来越多的医学难题得到攻克，人类寿命得到较大程度的延长。但是，癌症依然是人类需要克服的重大医疗难题之一，无论是在发达国家还是发展中国家，癌症都是死亡率最高的疾病，并且其发生率和死亡率仍不断增高。目前，癌症的主要治疗手段包括手术、放射性疗法以及抗肿瘤药物治疗，尤其是抗肿瘤药物治疗，随着全球癌症发病率的持续增长将推动抗肿瘤药物市场的快速发展。
在抗肿瘤药物的研发中，常常通过对已有的抗肿瘤化合物进行结构修饰获得结构类似物，以减轻毒性、提高选择性或扩大抗肿瘤谱，如顺铂(CDDP)自70年代成为抗肿瘤药物之后，人们开始尝试制备CDDP的衍生物以减轻其毒性和扩大抗癌谱，目前其衍生物第3代抗癌药物奥沙利铂已成为治疗晚期大肠癌的一线药物。同样，喜树碱的水溶性半合成衍生物Topotecan(TPT)和Irinotecan(CPT-11)已被开发为治疗卵巢癌和结肠癌的特效抗肿瘤药物。对已有抗肿瘤化合物的结构修饰可通过化学合成方法改造化合物，或通过合成生物学对化合物产生菌进行基因改造，从而获得新的化合物衍生物。但是，利用化学合成方法围绕核心骨架进行衍生化修饰有一定的瓶颈，且化学合成方法污染较大；而利用合成生物学方法改造化合物需具备一定的前提条件，如挖掘鉴定化合物的基因元件，并对化合物的生物合成途径进行解析。
大环内酰胺化合物FW05328-1化合物是福建省微生物研究所于2017年从海洋小单孢菌FIM05-328的微生物次级代谢产物中分离到一个新结构的26元多烯大环内酰胺类化合物，该化合物具有较为优良的抗人食管鳞癌细胞株活性(详见中国专利CN107287131A)。但由于其多烯类结构，FW05328-1性质不稳定，易发生结构转换和降解，已报道的大环内酰胺类化合物Micromonolactam、Salinilactam A也呈现出同样的性质，这给化合物FW05328-1的制备尤其是规模化制备带来较大的困难。因此，对于化合物FW05328-1的结构类似物的研究具有积极的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种大环内酰胺化合物FW05328-1的结构类似物FW05328-d，所述化合物FW05328-d结构在10位上较FW05328-1少-OH，因而较FW05328-1具备更优的化学稳定性，抗肿瘤活性研究发现该化合物具有抗小鼠黑色素瘤细胞株、人食管癌细胞株、人结肠癌细胞株活性；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种基于氨基酸诱导高效发酵所述化合物FW05328-d的方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种大环内酰胺化合物FW05328-d，其具有如下所示的结构：
本发明还公开了一种高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，包括将海洋小单孢菌接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述海洋小单孢菌菌株，其分类命名为Micromonospora sp.FIM-MA181224，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.17139。
具体的，所述发酵培养基中含有质量浓度为0.005-0.01wt％的3-氨基丁酸。
具体的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.6-2.0％，葡萄糖0.3-0.6％，蛋白胨0.4-0.6％，黄豆饼粉0.20-0.30％，酵母粉0.15-0.25％，K2HPO4·3H2O0.03-0.06％，(NH4)2SO4 0.03-0.06％，CaCO3 0.08-0.12％，海盐0.8-1.2％，3-氨基丁酸0.005％-0.01％，调pH值6.2-6.8。
优选的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.8％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉0.25％，酵母粉0.2％，K2HPO4·3H2O 0.05％，(NH4)2SO40.05％，CaCO3 0.1％，海盐1％，3-氨基丁酸0.0075％，自来水配制，调pH值为6.6。
具体的，所述发酵培养步骤的条件为：以3.0-5.0％的接种量将摇瓶种子液接种于摇瓶发酵培养基，于30-34℃、转速240-270r/min培养4-6d后放瓶，经HPLC法测定发酵液中FW05328-d含量。
优选的，所述发酵培养步骤的条件为：以4.0％的接种量将摇瓶种子接种于摇瓶发酵培养基，于32℃、260r/min培养5d后放瓶，经HPLC法测定发酵液中FW05328-d含量。
具体的，所述方法还包括将所述菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤；所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.0-2.0％，葡萄糖0.4-0.6％，蛋白胨0.4-0.8％，酵母粉0.4-0.6％，(NH4)2SO40.04-0.06％，K2HPO4·3H2O 0.03-0.06％，CaCO30.15-0.25％，海盐1.4-2.0％，自来水配制，调pH值pH7.0-7.4。
优选的，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.5％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，(NH4)2SO40.05％，K2HPO4·3H2O 0.05％，CaCO3 0.20％，海盐1.6％，自来水配制，调pH值为pH7.2。
具体的，所述摇瓶种子液培养步骤的条件为：将新鲜斜面挖块接入所述种子培养基，于30-32℃、控制转速220-260r/min培养68-80h，得到摇瓶种子培养液。
优选的，所述摇瓶种子液的培养步骤为：将培养好的新鲜斜面按0.5cm×0.5cm挖块接入种子培养基，30℃、240r/min培养72h得到摇瓶种子培养液。
具体的，所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤；所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.5-3.5％，L-天冬素0.04-0.06％，KNO3 0.08-0.12％，K2HPO4·3H2O 0.04-0.06％，NaCl 0.04-0.06％，MgSO4·7H2O 0.04-0.06％，CaCO3 0.08-0.12％，琼脂1-2％，调pH值pH7.0-7.4。
优选的，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0％，L-天冬素0.05％，KNO3 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.05％，NaCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCO30.1％，琼脂1.5％，调pH值7.2。
具体的，所述高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，还包括将所述化合物FW05328-d进行纯化的步骤，具体包括：将收集的发酵液离心得到菌丝体，以1.5-2.0倍体积丙酮((1:1，V:V))提取，40℃减压浓缩去除丙酮得到浸膏，浸膏以适当的蒸馏水溶解后，用HP20大孔树脂吸附，去离子水洗脱后乙醇梯度洗脱，HPLC跟踪检测，合并含有组分FW05328-d的部分，采用Ailgent SB C18
制备柱，65％甲醇水为洗脱液，控制流速10ml/min进行等度洗脱，HPLC跟踪检测，收集含有FW05328-d的部分，真空离心浓缩得到该化合物。
本发明还公开了所述大环内酰胺化合物的结构类似物FW05328-d用于制备抗肿瘤药物的用途。
本发明所述大环内酰胺化合物FW05328-d为已开发的大环内酰胺化合物FW05328-1的结构类似物，所述化合物FW05328-d在结构上比化合物FW05328-1在10位上少一个-OH，其物质结构及化学性能更为稳定，更加适宜于规模化生产。
本发明所述大环内酰胺化合物FW05328-d基于微生物发酵法制备，通过添加氨基酸诱导合成，所述化合物FW05328-d在Micromonospora sp.FIM-MA181224发酵液中的产量达到177.4mg/L，具备一定的产业化前景。
本发明通过在发酵培养基中添加氨基酸获得已有抗肿瘤化合物的新结构类似物的方法，相较传统的化学合成方法而言，该方法获得机构类似物的产量高且污染小；相较合成生物学改造化合物的方法而言，本方法无需对其基因元件及生物合成途径具备详尽的了解，更适宜于规模化生产。
本发明所述大环内酰胺化合物FW05328-d经抗肿瘤活性测试，证明该化合物具有抗小鼠黑色素瘤细胞株、人食管癌细胞株、人结肠癌细胞株活性，具有较好的医药价值。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为大环内酰胺化合物FW05328-d的紫外吸收图谱；
图2为大环内酰胺化合物FW05328-d的HR-TOF-MS图谱；
图3为大环内酰胺化合物FW05328-d的1H-NMR图谱；
图4为大环内酰胺化合物FW05328-d的13C-NMR图谱；
图5为大环内酰胺化合物FW05328-d的1H-1HCOSY图谱；
图6为大环内酰胺化合物FW05328-d的HSQC谱图；
图7为大环内酰胺化合物FW05328-d的HMBC谱图；
图8为大环内酰胺化合物FW05328-d的NOESY谱图；
图9为大环内酰胺化合物FW05328-d的ROESY谱图；
图10为大环内酰胺化合物FW05328-d的HMBC和1H-1H COSY相关分析图。
具体实施方式
本发明下述实施例中，对于发酵液中大环内酰胺化合物FW05328-1的含量检测采用现有技术中已知的HPLC-DAD方法，具体包括：Agilent 1260 InfinityⅡHPLC系统，DAD检测器，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm、5μm)，柱温：40℃，检测波长298nm，流动相：33％乙腈，流速：1.0mL/min。
本发明下述实施例中使用的海洋小单孢菌菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC NO.17139，保藏日期为2019年01月07日。
实施例1化合物FW05328-d的摇瓶发酵
将保存的海洋小单孢菌菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224于高氏天冬素固体培养基上35℃培养15d，得到海洋小单孢菌Micromonospora sp.FIM-MA181224的新鲜斜面。
将海洋小单孢菌Micromonospora sp.FIM-MA181224的新鲜斜面挖块(0.5cm×0.5cm)接种于摇瓶种子培养基，于30℃、240r/min培养72h得到摇瓶种子培养液。将摇瓶种子按4％接种量接种于摇瓶发酵培养基，于32℃、260r/min培养5d后放瓶，经HPLC法测定发酵液中FW05328-d含量。
种子培养基配制方法：可溶性淀粉15g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，酵母粉5g，(NH4)2SO40.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，CaCO3 2g，海盐16g，自来水1L，调pH值为pH7.2。
发酵培养基配制方法：可溶性淀粉18g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，黄豆饼粉2.5g，酵母粉2.0g，K2HPO4·3H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，CaCO3 1.0g，海盐10g，3-氨基丁酸0.075g，自来水1L，调pH值为6.6。
摇瓶发酵放瓶后，经HPLC法测定菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224应用上述各培养基进行发酵，发酵液中FW05328-d含量。结果显示，本实施例发酵条件下，化合物FW05328-d在Micromonospora sp.FIM-MA181224发酵液中的产量达到177.4mg/L。
实施例2化合物FW05328-d的纯化制备
取上述实施例1中海洋小单孢菌菌株Micromonospora sp.FIM-MA181224发酵产物10L，4500rpm条件下离心，得到菌丝体，菌丝体用1.5倍体积丙酮(1：1，V：V)提取，提取液在低于40℃减压浓缩去除丙酮得到浸膏(5g)，将浸膏用适当的蒸馏水溶解后，用HP20大孔树脂吸附，用3倍柱体积去离子水洗脱，再用30％-75％的酒精浓度梯度洗脱，HPLC检测跟踪，分别合并含有组分FW05328-d的部分。
随后选择反向C18填料，径高比1：3的预装柱，将上述物质吸附于中压反向C18柱上，采用甲醇水40％-80％梯度洗脱，HPLC检测跟踪，分别合并含有组分FW05328-d的部分。
随后选用Ailgent SB C18
制备柱，采用65％甲醇水，流速10ml/min等度洗脱，最终获得FW05328-d组分产物，真空离心浓缩获得该物质。
实施例3化合物FW05328-d的结构鉴定
上述得到的化合物FW05328-d为淡黄色无定型粉末。结合质谱、紫外光谱和核磁共振等数据，鉴定了目标化合物FW05328-d的结构。
如图1所示的紫外吸收谱，UV(MeOH)，λmax：294nm。
如图2所示的HR-TOF-MS图谱，HR-ESI-MS(m/z 490.2946[M+Na]+；分子式为C29H41NO4；计算其不饱和度为10。
如图3所示的1H-NMR(600MHz,in DMSO-d6)图谱，可见高场区显示2组双峰甲基氢信号[δ1.03(3H,d,J＝6.6Hz)和δ1.11(3H,d,J＝7.0Hz)]和2组单峰甲基氢信号[δ1.56(3H,s)和δ1.72(3H,s)]，低场区有多组烯氢质子信号和1组活泼氢质子信号δ7.55(IH,d,J＝9.6Hz)。
结合如图4所示的13C-NMR(150MHz,in DMSO-d6)谱图和DEPT135谱分析，可见29个碳信号，其包括3个季碳信号δ165.5,134.5和131.6，其中δ165.5为酰氨羰基碳信号，δ134.5,131.6为烯季碳信号；19个次甲基碳信号δ141.3,139.8,139.0,138.8,136.6,135.9,132.5,130.4,129.7,129.2,129.0,127.5,124.6,122.9,75.7,69.0,63.6,46.4和43.9，其中δ141.3,139.8,139.0,138.8,136.6,135.9,132.5,130.4,129.7,129.2,129.0,127.5,124.6,122.9为14个烯碳信号，δ75.7,69.0,63.6,46.4这4个为与杂原子相连的碳信号；3个亚甲基碳信号δ46.6,42.6和40.5；以及4个甲基碳信号δ21.4,19.0,18.0和13.6。
如图5所示的1H-1HCOSY图谱中，可以发现H-2–H-3–H-4–H-5–H-6–H-7–H-8–H-9–H-10–H-11–H-12–H-13–H-14–H-15–H-16之间顺次相关，以及H-20–H-21–H-22–H-23–H-24–H-25–NH之间顺次相关。
再结合如图6所示的HSQC谱图，可推出如下碳骨架片断：C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12-C13-C14-C15-C16，C20-C21-C22-C23-C24-C25-NH。
如图7所示的HMBC谱图中，可见H-26与C-24/C-25相关，H-27与C-7/C-8/C-9相关，H-28与C-16/C-17/C-18相关，H-29与C-18/C-19/C-20相关，H-10-OH与C-10/C-11相关，H-13-OH与C-12/C-13/C-14相关，以及H-NH与C-1/C-25/C-26相关。
上述大环内酰胺化合物FW05328-d的NOESY谱图、ROESY谱图以及HMBC和1H-1H COSY相关分析图分别如图8-10所示。
通过对上述核磁数据、不饱和度、分子式和化学位移的分析，得出化合物FW05328-d的化学结构见下，氢和碳的化学位移列于表1。
表1化合物ZW-B的1H NMR和13C NMR数据
经
网络搜索，未发现有与其相同结构的化合物，因而确定FW05328-d化合物是一个新结构的26元多烯大环内酰胺类化合物。上述化合物FW05328-d与已知大环内酰胺化合物FW05328-1相比较，其10位上较FW05328-1少1个-OH，结构性能更为稳定。
实施例4化合物FW05328-d抗肿瘤活性测定
应用MTT细胞增殖法检测样品对人肿瘤细胞体外增殖的影响，将化合物FW05328-d溶解于DMSO中，常氧条件下200μg/ml开始，3倍稀释，8个浓度。将小鼠黑色素瘤细胞B16、人食管癌细胞Eca-109，人结肠癌细胞COLO205消化、计数，配制细胞悬液(B16，Eca-109 5.0×104个/ml，COLO205 6.0×104个/ml)，96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液，96孔细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；用培养基稀释FW05328-d至所需工作浓度，每孔加入100μl相应的含药培养基，同时设立阴性对照组、阳性对照组；96孔细胞培养板分别置于37℃，5％CO2常氧培养箱培养48小时；将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值；计算各组别抑制率。通过对抑制率的换算，使用SPSS软件计算出IC50值，计算结果见下表2。
抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-实验组)/(阴性对照组OD值)×100％。
结果如表1所示，本发明新结构化合物FW05328-d具有抗小鼠黑色素瘤细胞株、人食管癌细胞株、人结肠癌细胞株活性。
表2 FW05328-d的肿瘤细胞毒活性
| 药物 | B16 | Eca-109 | COLO205 |
| FW05328-d(μg/ml) | 80.71 | 73.29 | 76.691 |
从上表数据可知，所述化合物FW05328-d具有抗小鼠黑色素瘤细胞株、人食管癌细胞株、人结肠癌细胞株活性，具有较高的医药价值。已发现的化合物FW05328-1在体外对人食管鳞癌细胞株EC109具有优良的抑制活性，相较而言，新结构化合物FW05328-d可能具有更为广泛的抗肿瘤活性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种大环内酰胺化合物FW05328-d，其特征在于，其具有如下所示的结构：
2.一种高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，其特征在于，包括将海洋小单孢菌接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤；
所述海洋小单孢菌菌株，其分类命名为Micromonospora sp.FIM-MA181224，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.17139。
3.根据权利要求2所述高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，其特征在于，所述发酵培养基中含有质量浓度为0.005-0.01wt％的3-氨基丁酸。
4.根据权利要求2或3所述高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.6-2.0％，葡萄糖0.3-0.6％，蛋白胨0.4-0.6％，黄豆饼粉0.20-0.30％，酵母粉0.15-0.25％，K2HPO4·3H2O 0.03-0.06％，(NH4)2SO40.03-0.06％，CaCO3 0.08-0.12％，海盐0.8-1.2％，3-氨基丁酸0.005％-0.01％，调pH值6.2-6.8。
5.根据权利要求2-4任一项所述高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，其特征在于，所述发酵培养步骤的条件为：以3.0-5.0％的接种量将摇瓶种子液接种于摇瓶发酵培养基，于30-34℃、转速240-270r/min培养4-6d后放瓶。
6.根据权利要求2-5任一项所述高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤；所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.0-2.0％，葡萄糖0.4-0.6％，蛋白胨0.4-0.8％，酵母粉0.4-0.6％，(NH4)2SO4 0.04-0.06％，K2HPO4·3H2O 0.03-0.06％，CaCO30.15-0.25％，海盐1.4-2.0％，自来水配制，调pH值pH7.0-7.4。
7.根据权利要求6所述高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，其特征在于，所述摇瓶种子液培养步骤的条件为：将新鲜斜面挖块接入所述种子培养基，于30-32℃、控制转速220-260r/min培养68-80h，得到摇瓶种子培养液。
8.根据权利要求2-7任一项所述高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤；所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.5-3.5％，L-天冬素0.04-0.06％，KNO3 0.08-0.12％，K2HPO4·3H2O 0.04-0.06％，NaCl 0.04-0.06％，MgSO4·7H2O 0.04-0.06％，CaCO3 0.08-0.12％，琼脂1-2％，调pH值pH7.0-7.4。
9.根据权利要求2-8任一项所述高效发酵所述大环内酰胺化合物FW05328-d的方法，其特征在于，还包括将所述化合物FW05328-d进行纯化的步骤，具体包括：将收集的发酵液离心得到菌丝体，以1.5-2.0倍体积丙酮提取，40℃减压浓缩去除丙酮得到浸膏，浸膏以适当的蒸馏水溶解后，用HP20大孔树脂吸附，去离子水洗脱后乙醇梯度洗脱，HPLC跟踪检测，合并含有组分FW05328-d的部分，采用Ailgent SB C18制备柱，65％甲醇水为洗脱液，控制流速10ml/min进行等度洗脱，HPLC跟踪检测，收集含有FW05328-d的部分，真空离心浓缩得到该化合物。
10.权利要求1所述大环内酰胺化合物FW05328-d用于制备抗肿瘤药物的用途。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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